TUGAS FITOKIMIA REVIEW JURNAL INTERNASIONAL “Preliminary
phytochemical screening and in vitro antibacterial activity of Bauhinia variegata Linn. against human pathogens”
OLEH : MOHAMMAD ZULFIKHAR A (152210101068) (152210101068) KELAS
:B
FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS JEMBER 2017
1. Pendahuluan Saat ini, peningkatan jumlah agen infeksi menjadi lebih tahan terhadap senyawa antimikroba komersial. Kebutuhan untuk mengembangkan obat baru memerlukan strategi yang bervariasi, bioprospection metabolit sekunder yang dihasilkan oleh tanaman obat adalah salah satunya. Namun, manusia kini dihadapkan pada masalah global resistensi yang muncul di hampir semua patogen. Bauhinia variegata. (Leguminosae), dikenal sebagai Kanchanar dalam bahasa Hindi, adalah pohon berukuran medium yang tumbuh melimpah di saluran Sub-Himalaya hingga ke Assam, Timur Tengah dan India Selatan. Berbagai bagian tanaman yaitu, daun, kuncup bunga, bunga, batang, kulit batang, biji dan akar digunakan dalam pengobatan demam, sebagai tonik, diare, disentri, wasir, edema, pencahar, obat cacing, antileprotic di penyakit kulit, penyembuhan luka, antigoitrogenic, antitumor, obesitas, stomatitis, obat penawar untuk keracunan ular, dispepsia, perut kembung dan sebagai karminatif. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk melakukan evaluasi praklinis dari beberapa spesies tanaman obat populer, yaitu, screening biologis dan fitokimia Penelitian ini dilakukan untuk mempelajari skrining fitokimia dan antibakteri B. variegata (Daun, kulit batang, bunga) yang dapat digunakan sebagai salah satu parameter untuk standarisasi simplisia.
2. Bahan dan Metode Semua bahan kimia dan pelarut yang digunakan dalam percobaan adalah kelas analitis. a. Koleksi Tanaman dan Identifikasi Bagian tanaman segar dikumpulkan secara acak dari kebun raya herbal dari Bhopal, Madhya Pradesh, India. Identitas taksonomi tanaman B. variegata dikonfirmasi oleh ahli botani Dr SS Khan (Voucher Spesimen No: SP / 101 / LGOB / 2006), Departemen Botani, Safia Ilmu College, Bhopal, Madhya Pradesh, India. Bahan tanaman segar dicuci di bawah air leding, dikeringkan dan kemudian dihomogenisasi menjadi bubuk halus dan disimpan dalam botol kedap udara.
b. Persiapan Ekstrak Bahan tanaman yang dikeringkan ditumbuk menjadi bubuk halus menggunakan penggiling. Timbang 50 g bahan bubuk kemudian diekstraksi dan di pisahkan dalam separating funnel aparatus dengan menggunakan pelarut 250 mL Metanol 50%. Ekstrak yang diperoleh masing-masing pelarut disaring melalui kertas saring Whatman No. 1 dan dipanaskan dalam water bath. Zat kehijauan-coklat lengket diperoleh dan disimpan dalam lemari es sampai digunakan.
c. Protokol untuk Pengukuran Fitokimia Pendahuluan Penyaringan Tes skrining standar ekstrak metanol dilakukan untuk berbagai konstituen tanaman. Ekstrak kasar disaring untuk ada atau tidak adanya metabolit sekunder seperti alkaloid, senyawa steroid, senyawa fenolik, flavonoid, saponin, tanin menggunakan prosedur standar.
1. Uji untuk Karbohidrat dan Glikosida 1.1.Uji Molish Sebanyak 2 mL filtrat dengan dua tetes larutan alkohol
α-naphthol
ditambahkan, campuran di aduk ad homogeny. satu mL asam sulfat pekat ditambahkan
perlahan-lahan
di
sepanjang
tabung
reaksi
dan
didiamkan. Jika ada cincin ungu menunjukkan adanya karbohidrat. 1.2.Uji Fehling Satu mililiter filtrat dipanaskan dalam water bath dengan ditambahkan 1 mL masing-masing larutan Fehling A dan B. jika warna merah demgan penambahan fehling A menunjukkan adanya gula. 1.3.Deteksi Glikosida Uji Borntrager, 200 ekstrak kasar mg dicampur dengan 2 ml asam sulfat encer dan 2 mL dari 5% larutan klorida, rebus selama 5 menit yang menyebabkan oksidasi Antrhroquinone, yang mengindikasikan keberadaan glikosida.
2. Uji untuk Protein dan Asam Amino 2.1.Uji Biuret Sebuah alikuot 2 mL filtrat ditambah dengan satu tetes 2% Tembaga sulfat. Kemudian ditambah 1 mL etanol (90 %) dan pelet kalium hidroksida. warna pink di lapisan etanol menunjukkan adanya protein. 2.2.Uji Ninhidrin Dua tetes larutan ninhidrin ditambahkan ke 1 mL filtrat berair. Trjadinya perubahan warna ungu menunjukkan adanya asam amino.
3. Uji untuk Alkaloid 3.1. Uji Mayer Ekstrak kasar dicampur dengan reagen (iodida kalium merkuri) Mayer. Terbentuk endapan, menunjukkan adanya alkaloid. 3.2. Uji Dragondroff Ekstrak kasar dicampur dengan reagen Dragondroff (Kalium bismut iodida). Endapan coklat kemerahan yang terbentuk menunjukkan adanya alkaloid.
4. Uji untuk Fitosterol Pada tes kloroform, 0,5 g ekstrak ditambah dengan 10 mL kloroform dan disaring. Filtrat digunakan untuk menguji keberadaan fitosterol dan triterpenoid. Ekstrak direfluks dengan larutan alkohol kalium hidroksida sampai terjadi saponifikasi. Campuran diencerkan dan diekstraksi dengan eter. Lapisan eter diuapkan dan residu diuji untuk mengetahuhi kandungan fitosterol. Residu dilarutkan dalam beberapa tetes asam asetat encer, anhidrida asetat 3 mL diikuti oleh beberapa tetes asam sulfat pekat. Perubahan warna menjadi warna hijau kebiruan menunjukkan adanya fitosterol.
5. Tes Untuk Senyawa Steroid dan Triterpenoid 5.1.Uji Salkowski Ekstrak kasar dicampur dengan beberapa tetes asetat anhidrat. Kemudian dipanaskan dan didinginkan. Ditambahkan H 2 SO 4 pe ka t
dari sisi tabung tes. Adanya cincin cokelat di persimpangan dua lapisan dibentuk. Lapisan berubah hijau atas yang menunjukkan adanya steroid dan pembentukan warna merah tua menunjukkan adanya triterpenoid. 5.2. Uji Lieberman Ekstrak kasar dicampur dengan kloroform dan beberapa tetes H 2SO4 pekat, dikocok dengan dan didiamkan selama beberapa waktu. Warna merah muncul di lapisan bawah menunjukkan adanya steroid dan pembentukan lapisan berwarna kuning menunjukkan adanya triterpenoid.
6. Tes Untuk Flavanoids 6.1.Tes Untuk Flavanoids Bebas Lima mL etil asetat ditambahkan ke dalam larutan 0,5 g ekstrak dalam air. Aduk ad homogen kemudian diperiksa. Adanya warna kuning di lapisan organik menandakan positif terdapat flavonoid bebas. 6.2.Uji Timbal Asetat Larutan 0,5 g ekstrak dalam air, ditambahkan sekitar 1 mL dari 10 % timbal asetat. Terjadinya endapan kuning menunjukkan adanya flavanoids. 6.3.Reaksi dengan Natrium Hidroksida Larutan encer natrium hidroksida ditambahkan ke dalam larutan 0,5 g ekstrak dalam air. Pembentukan warna kuning menunjukkan adanya flavanoids.
7. Tes Untuk Saponin Pada uji Froth, 0,5 ekstrak g dilarutkan dalam 10 mL air suling selama 30 detik. Tabung uji bertutup dan dikocok dengan kuat selama sekitar 30 detik Tabung reaksi diamati selama 30 menit. Jika “honey comb” buih di atas permukaan cairan stabil selama 30 menit, sampel diduga mengandung saponin.
8. Uji Untuk Tannin 8.1.Uji Klorida Sebagian dari ekstrak dilarutkan dalam air. Larutan disaring dan ditambahkan 10% Larutan klorida. Kemudian diamati perubahan warna hitam kebiruan menunjukkan adanya tannin. 8.2. Uji Formalin sekitar 0,5 g ekstrak dalam 5 mL air, ditambahkan tiga tetes formalin dan enam tetes asam klorida encer. Campuran yang dihasilkan dipanaskan sampai mendidih selama 1 menit dan didinginkan. Endapan yang terbentuk (Jika ada) dicuci dengan air panas, alkohol hangat, dan 5% Kalium hidroksida. Endapan residu berwarna setelah dicuci, menunjukkan adanya phlobatannins. 8.3. Uji Untuk Phlobatanins Terjadi endapan merah ketika ekstrak air dari bagian tanaman direbus dengan 1% asam klorida menunjukkan adanya phlobatannin. 8.4. Tes Kompleks Besi Dimodifikasi larutan 0,5 g ekstrak tanaman di 5 mL air ditambahakan setetes asam asetat dan 1 g natrium kalium tartrate . Campuran dipanaskan dan disaring untuk menghilangkan endapan. Larutan 0,25% besi amonium sitrat ditambahkan ke filtrat sampai tidak ada perubahan dari warna yang diperoleh dan kemudian direbus. Warna endapan ungu kehitaman, yang tidak larut dalam amonia encer, menunjukkan adanya pirogalol tanin. 8.5. Uji Untuk Senyawa Fenolik Ferri ferrosianida reagen untuk uji fenolat: 10% Besi klorida (FeCl 3 ) (Aq) dicampur dengan sianida besi (FECN6) (1 g / 100 mL atau 0,1 g / 10 mL), 0,1 g klorida dan 0,1 g Potassiu m ferrisianida (K 3 F 3 CN 3 ) dengan melarutkannya dalam 10 mL air suling. Ditambahkan dengan ekstrak dan dipanaskan pada suhu 110 ° C. Perubahan warna menjadi biru menunjukkan adanya fenolat.
9. Tes Untuk Minyak dan Lemak 9.1.Tes Stain sedikit ekstrak kasar ditekan antara dua kertas filter; noda di kertas filter menunjukkan adanya minyak. 9.2.Uji Saponifikasi sedikit minyak mentah ekstrak ditambahkan beberapa tetes 0,5 N alkohol kalium hidroksida kemudian ditambahkan fenolftalein secara terpisah dan dipanaskan dalam water bath selam 1 jam. Pembentukan sabun menunjukkan adanya minyak dan lemak.
d. Penentuan Aktivitas Antibakteri 1.
Strain Bakteri Tiap hydromethanolic ekstrak daun, kulit batang dan bunga B. variegata dengan konsentrasi 1000 mg / mL.750 mg / mL. 500 mg /mL dan 250 mg / mL diuji terhadap bakteri gram Bacillus subtilius positif ( B. subtilius) (ATCC 11778). S. aureus (ATCC 25923), Streptococcus epidermidis (S. epidermidis) (ATCC 24.676) dan Gram-negatif E. coli (ATCC 25922),
Shigella
flexneri
(S.
flexneri) (ATCC 11435),
Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) (ATCC 17440) untuk aktivitas antimikroba. Strain bakteri diperoleh dari National Chemical Laboratory, Pune, Sayandia. Tiap bakteri ditumbuhkan dalam kaldu nutrisi pada suhu 37°C dan ditumbuhkan dalam agar nutrien slants pada suhu 4 °C. 2.
Persiapan Inokulum (Media Muller Hinton) Salah satu koloni tunggal dari setiap jenis mikroorganisme (dari agaragar nutrisi) diambil dengan loop steril, dan dipindahkan ke dalam 10 ml kaldu nutrisi steril. Kultur kaldu diinkubasi dalam shaker inkubator pada 37°C selama 16-20 jam.
3.
Antibakteri Uji Bioassay Difusi Disk Aktivitas antimikroba ekstrak metanol tanaman diuji terhadap tiga mikroorganisme dengan menggunakan metode difusi agar seperti yang direkomendasikan oleh Institute Laboratorium Klinis. Media nutrien agar disiapkan menggubakan agar nutrien(Merck) 20 g /L dalam air suling. Nilai pH media
disesuaikan 7.0, kemudian diautoklaf dan
dibiarkan dingin hingga 45 °C. Media ditambah dengan 10 CFU / mL dandisiapkan inokulum. Selanjutnya, media (75-80 ml) dituangkan ke dalam cawan petri dan diberi label (diameter = 14 cm) kemudian dibiarkan membeku. disk ditambahkan empat konsentrasi yang berbeda yaitu, 1 000 mg / mL, 750 mg / mL, 500 mg / mL dan 250 mg / mL ekstrak tanaman (w / v; mg / mL). Kemudian diinokulasi dan diinkubasi 24 jam pada suhu 37°C. Aktivitas antibakteri ditunjukkan ketika zona inhibisi yang jelas terdapat di sekitar cakram. Diameter zona inhibisi diukur dan hasilnya dinyatakan sebagai mean dari tiga percobaan independen. Tes ini diulang tiga kali. Setiap ekstrak dilarutkan dalam 99,9% Dimethyl sulfoxide (Sigma- Aldrich Amerika Serikat) didapatkan konsentrasi 100 mg / L. Antibiotik standar (5 ug) Gram positif (TE-tetrasiklin, OF- ofloksasin, AZ-azitromisin, PC piperacillin) dan Gram negatif FU-nitrofurantoin, GM-gentamisin, CX-sefotaksim, NF-norfloxaci, (5 ug / disc) yang disiapkan sebagai kontrol positif. Dimethyl sulfoxide (99,9%) digunakan sebagai kontrol negatif
3. Hasil penelitian Hasil tes fitokimia mengungkapkan adanya flavonoid, saponin, alkaloid, asam lemak, tanin glikosida di ekstrak metanol B. variegata (Tabel 1). Tabel 1
Skrining phytochemical ekstrak pelarut B. variegata L. (daun, kulit batang dan bunga ).
No
Senyawa
Reagen
BVL
BVB
BVF
1
Carbohydrates
Tes Fehlings
+
+
+
Tes Molish
+
-
-
2
Glycosides
Borntrager
+
+
+
3
Alkaloids
Uji Dragendorff
-
+
+
Uji Mayer
-
-
+
4
Phytosterol
Khloroform
-
-
-
5
Senyawa steroidal
Uji Salkowski
-
-
-
Uji Lieberman
-
-
-
6
Saponins
Tes Rothf
-
+
+
7
Tannin
Uji Ferric Klorida
+
+
+
Tes Formaldehyde
+
+
+
Test untuk Phlobatanins
+
+
+
8
minyak dan Lemak
Tes Spot
+
-
+
9
Flavonoids
Tes untuk Flavonoid Bebas
+
+
+
Tes Lead Asetat
+
+
+
Hidroksida
+
+
+
10
Psenyawa henolic
Uji ferric klorida
+
+
+
11
Protein dan asam amino
Tes Biuret
+
+
+
Tes Ninhydrin
+
+
+
+: positif -: negatif, BVL: Daun B. variegata, BVB: B. variegata kulit batang, BVF: B. variegata bunga
4. Pembahasan Obat herbal memiliki sifat kuratif karena adanya berbagai zat kimia yang kompleks komposisi yang berbeda, yang ditemukan sebagai metabolit sekunder dalam satu atau lebih bagian dari tanaman ini. Laporan kami sebelumnya pada skrining fitokimia menunjukkan bahwa nilai obat tanaman terletak pada phytocomponents bioaktif yang terdapat dalam tanaman. Tes fitokimia mengungkapkan adanya flavonoid, saponin, alkaloid, asam lemak, tanin glikosida dalam ekstrak metanol. Senyawa konstituen fitokimia adalah sumber yang baik sebagai antimikroba dan aktivitas antioksidan. Kesimpulannya, ekstrak B. variegata memiliki spektrum yang luas dari aktivitas terhadap bakteri yang bertanggung jawab atas penyakit umum. Hasil pendahuluan diperoleh dalam percobaan ini membuka jalan untuk mengeksplorasi potensi pengembangan senyawa baru yang akan diluncurkan di pasar farmasi untuk mengatasi resistensi antibiotik di dunia.