TUJUAN Agar mahasiswa dapat melakukan pengujian kualitas air secara mikrobiologi berdasarkan nilai MPN coliform. D. DASAR TEORI Air merupakan komponen esensial bagi kehidupan jasad hidup. Akan tetapi dapat juga merupakan suatu substansia yang membawa malapetaka, karena air dapat membawa mikroorganisme patogen dan zat-zat kimia yang bersifat racun (Tarigan, 1988). Bakteri coliform sebagai suatu kelompok dicirikan sebagai bakiteri berbentuk batang gram negatif, tidak membentuk spora, aerobik, dan anaerobik fakultatif yang memfermentasi laktose dengan menghasilkan asam dan gas dalam waktu 48 jam pada suhu 35° C (Pelczar.et al.,1988).
Istilah “mikroorganisme indikator” sebagaimana digunakan dalam analisis air mengacu pada sejenis mikroorganisme yang kehadirannya di dalam air merupakan bukti bahwa air tersebut terpolusi oleh bahan tinja dari manusia atau hewan berdarah panas. Artinya terdapat peluang bagi berbagai macam organisme patogenik,yang secara berkala terdapat dalam saluran pencernaan, untuk masuk ke dalam air tersebut. Beberapa ciri penting suatu organisme indikator ialah : 1) Terdapat dalam air tercemar dan tidak ada dalam air yang tidak tercemar. 2) Terdalam dalam air bila ada pathogen. 3) Jumlah mikroorganisme indikator berkorelasi dengan kadar polusi. 4) Mempunyai kemampuan bertahan hidup yang lebih besar daripada patogen. 5) Mempunyai sifat yang seragam dan mantap. 6) Tidak berbahaya bagi manusia dan hewan. 7) Terdapat dalam jumlah yang lebih banyak daripada patogen. 8) Mudah dideteksi dengan teknik-teknik laboratorium yang sederhana. Diantara organisme-organisme yang dipelajari, yang hampir memenuhi semua persyaratan suatu organisme indikator yang ideal ialah ialah Escherichia Escherichia coli dan kelompok baktericoli lainnya. Bakteri-bakteri tersebut dianggap sebagai indikator polusi tinja yang dapat diandalkan (Pelczar.et al.,1988). Sejumlah bakteri dianggap sebagai bakteri pengganggu dalam air karena menimbulkan rasa bau, warna, dan rasa, di samping juga membentuk endapan persenyawaan tak dapat larut di dalam pipa-pipa sehingga mengurangi atau menyumbat aliran air. Aksi merusak pada beberapa mikroorganisme adalah sebagai berikut : Bakteri pembuat lendir : menghasilkan keadaan berlendir
Bakteri besi
: Mengubah persenyawaan besi yang dapat larut menjadi bentuk yang tak dapat larut yang akan menghambat aliran air dalam pipa. Bakteri sulfur : Membentuk asam sulfat dengan hidrogen sulfide, yang dapat membuat air menjadi sangat asam dan berbau tidak enak. Algae : Menyebabkan kekruhan,perubahan warna, serta bau dan rasa tidak enak (Pelczar.et al.,1988). Untuk mengetahui jumlah sel bakteri golongan coliform yang terdapat dalam sampel air, dilakukan Metode Jumlah Perkiraan terdekat atau Most atau Most Probable Number . Penggunaan media selektif dan diferensial sangat membantu mempercepat usaha pemeriksaan air guna mendeteksi organism coliform. Pemeriksaan tersebut terdiri dari 3 langkah berurutan: 1) Uji Pendugaan ( Presumptive Presumptive Test ) 2) Uji Lanjutan (Confirmed (Confirmed Test ) 3) Uji Pelengkap (Complete (Complete Test ) Uji ini dilakukan dengan cara menginokulasi tabung-tabung berisi kaldu laktose dengan contoh air. Bila air yang diperiksa mempunyai kualitas mikrobiologis yang baik maka tidak akan terbentuk asam ataupun gas di dalam kaldu laktose (Pelczar.et al.,1988). Pengujian-pengujian ini digunakan untuk mendeteksi keberadaan bakteri golongan coliform yang merupakan indikator terkontaminasinya lingkungan perairan oleh fecal (feces hewan mamalia). Bakteri coliform adalah golongan bakteri intestinal, yaitu hidup dalam saluran pencernaan manusia. Bakteri coliform adalah bakteri indikator keberadaan bakteri patogenik lain. Lebih tepatnya, sebenarnya, bakteri coliform fekal adalah bakteri indikator adanya pencemaran bakteri patogen. Penentuan coliform fekal menjadi indikator pencemaran dikarenakan jumlah koloninya pasti berkorelasi positif dengan keberadaan bakteri patogen. Selain itu, mendeteksi Coliform jauh lebih murah, cepat, dan sederhana daripada mendeteksi bakteri patogenik lain (Dad,2000). Jadi, coliform adalah indikator kualitas air. Makin sedikit kandungan coliform, artinya, kualitas air semakin baik. Kelompok bakteri coliform antara lain Eschericia lain Eschericia coli, Enterrobacter aerogenes, dan dan Citrobacter Citrobacter fruendii.Keberadaan fruendii.Keberadaan bakteri ini dalam air minum juga menunjukkan adanya bakteri patogen lain, misalnya Shigella Shigella,, yang bisa menyebabkan diare hingga muntaber (Kompas Cyber Media, 2003 dalam Kompas.com). Menurut Supardi dan Sukamto (1999), bakteri coliform dapat dibedakan menjadi dua bagian, yaitu. 11) Coliform fekal, misalnya E. misalnya E. coli coli,, merupakan bakteri yang berasal dari kotoran hewan atau manusia. 22) Coliform non-fekal, misalnya E. misalnya E. aeroginosa aeroginosa,, biasanya ditemukan pada hewan atau tanaman yang telah mati.
Beberapa macam mikroorganisme patogen yang mengkontaminasi air, antara lain: 1) Salmonella typhi, typhi, adalah bakteri gram negatif berbentuk batang, tidak membentuk spora namun bersifat patogen, baik pada manusia ataupun hewan. Dap at menyebabkan demam typhoid (typoid
fever). Sebenarnya penyakit demam typoid dapat dipindahkan dengan perantara makanan yang terkontaminasi dan dengan kontak langsung dengan si penderita. Namun yang paling umum sebagai fakta penyebab adalah air. Air dapat terkontaminasi oleh bakteri ini karena kesalahan metode pemurnian air atau kontaminasi silang (Cros contaminant) antara pipa air dengan saluran air limbah (Tarigan, 1988). 2) Clostridium prefringens adalah bakteri gram positif pembentuk spora yang sering ditemukan dalam usus manusia, tetapi kadang-kadang juga ditemukan di luar usus manusia (tanah, debu, lingkungan dan sebagainya). 3) Escherichia coli adalah bakteri gram negatif berbentuk batang yang tidak membentuk spora dan merupakan flora normal di dalam usus. E.coli termasuk bakteri komensal yang umumnya bukan patogen penyebab penyakit namun bilamana jumlahnya melampaui normal maka dapat pula menyebabkan penyakit. E. Coli merupakan salah satu bakteri coliform. 4) Leptospira merupakan bakteri berbentuk spiral dan lentur yang merupakan penyebab penyakit leptosporosis. Penyakit ini merupakan penyakit zoonosis atau penyakit hewan yang bisa berpindah ke manusia. Pada umumnya penyebaran bakteri ini adalah pada saat banjir. 5) Shigella dysentriae adalah basil gram negatif, tidak bergerak. Bakteri ini menyebabkan penyakit disentri (mejan). Spesies lain seperti S. Sonnei dan S. Paradysentriae juga menyebabkan penyakit disentri (Dwijoseputro, 1976). 6) Vibrio comma adalah bakteri yang berbentuk agak melengkung, gram negatif dan monotrik. Bakteri ini menyebabkan penyakit kolera yang endemis di indonesia dan sewaktu-waktu berjangkit serta memakan banyak korban (Dwijoseputro, 1976). http://linda-haffandi.blogspot.com/2011/11/uji-kualitas-air-berdasar-nilai-mpn.html
PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang Kuantitasi mikroba menunjukan jumlah koloni yang mampu di bentuk oleh mikroba
tertentu. Beberapa koloni bakteri ini, bagi tubuh manusia akan menyebabkan penyakit. Seteril dari bakteri untuk maknan terutama minuman, sangat perlu di ketahui demi menjaga kesehatan. Air minum dari berbagai tempat memepunyai jenis-jenis bakteri yang tidak sama untuk air minum hasil penyulingan diharapkan sudah terbebas dari bakteri (Dwidjoseputro, 1994). Pertumbuhan sering kali dinyatakan secara singkat sebagai kemampuan untuk menghasilkan 2 sel baru dan hidup. Sel dikatakan hidup bila dapat menghasilkan sel baru. Bila tidak mempunyai kemampuan ini lagi, Maka sel dinyatakan tidak hidup lagi atau mati. Analisis pertumbuhan bakteri dapat dilakukan dengan beberapa cara yaitu, membandingkan jumlah sel, berat kering, konsentrasi protein atau nitrogen dan kekeruhan (Dwidjoseputro, 1994). Perhitungan jumlah mikroba dapat dilakukan dengan perhitungan langsung maupun tidak langsung. Perhitungan secara langsung dapat mengetahui beberapa jumlah mikroorganisme pada suatu bahan, pada suatu saat tertentu tanpa memberikan perlakuann terlebih dahulu,
sedangkan jumlah mikroorganisme yang diketahui dari cara tidak langsung terlebih dahulu harus memeberikan perlakuan tertentu sebelum dilakukan perhitungan. Perhitungan secara langsung dapat dilakukan dengan beberapa cara antara lain adalah memebuat preparat dari suatu bahan (preparat sederhana di warnai atau tidak di warnai) dan penggunaan ruang hitung (counting chamber), sedangkan perhitungan cara tidak langsung hanya untuk mengetahui jumlah mikroorganisme dalam suatu bahan yang masih hidup saja. (Dwidjoseputro, 1994). Oleh karena itu yang melatar belakangi percobaan ini ialah agar pratikan dapat mengetahui tentang teknik-teknik perhitungan mikroba dan salah satunya yaitu metode MPN dan mengerti tentang perhitungan mikroba pad prinsip percobaan metode MPN serta hal yang berkaitan dengan bakteri koliform pada percobaan yang dilakukan. 1.2 Tujuan Untuk mengetahui prinsip metode MPN
Untuk mengetahui fungsi dari media EMBA, BGLBB, LB Untuk mengetahui proses terjadinya gelembung pada tabung durham di setiap uji percoban MPN
BAB II TINJAUAN PUSTAKA
Perhitungan secara tidak langsung ada beberapa cara yaitu : perhitungan pada cawan petri (total plate count) TPC, perhitungan melalui pengenceran, perhitungan jumlah terkecil atau terdekat (MPN metode), dan kalorimeter (cara kekeruhan atau turbidimetri). Metode MPN terdiri dari tiga tahap, yaitu uji pendugaan (presumtive test), uji konfirmasi (confirmed test), dan uji kelengkapan (completed test). Dalam uji tahap pertama, keberadaan coliform masih dalam tingkat probabilitas rendah; masih dalam dugaan. Uji ini mendeteksi sifat fermentatif coliform dalam sampel. Metode perhitungan MPN sering digunakan dalam pengamatan untuk menghitung jumlah bakteri yang terdapat di dalam tanah seperti Nitrosomonas dan Nitrobacter. Kedua jenis bakteri ini memegang peranan penting dalam meningkatkan pertumbuhan dan produksi tanaman, sehubungan dengan kemampuannya dalam mengikat N2 dari udara dan mengubah amonium menjadi nitrat (Dwidjoseputro, 1994). Output metode MPN adalah nilai MPN. Nilai MPN adalah perkiraan jumlah unit tumbuh (growth unit) atau unit pembentuk koloni (colony forming unit) dalam sampel. Namun pada umumnya, nilai MPN juga diartikan sebagai perkiraan jumlah individu bakteri. Satuan yang digunakan, umumnya per 100 mL atau per gram. Metode MPN memiliki limit kepercayaan 95 persen sehingga pada setiap nilai MPN, terdapat jangkauan nilai MPN terendah dan nilai MPN tertinggi (Dwidjoseputro, 1994). Bakteri coliform adalah golongan bakteri intestinal, yaitu hidup dalam saluran pencernaan manusia. Bakteri coliform adalah bakteri indikator keberadaan bakteri patogenik lain. Lebih tepatnya, sebenarnya, bakteri coliform fecal adalah bakteri indikator adanya pencemaran bakteri patogen. Penentuan coliform fecal menjadi indikator pencemaran dikarenakan jumlah koloninya pasti berkorelasipositif dengan keberadaan bakteri patogen. Selain itu, mendeteksi coliform jauh lebih murah, cepat, dan sederhana daripada mendeteksi bakteri patogenik lain (Dwidjoseputro, 1994). Salah satu anggota kelompok coliform adalah E.coli. Karena E.coli adalah bakteri coliform yang ada pada kotoran manusia, maka E.coli sering disebut sebagai coliform fekal. Pengujian coliform jauh lebih cepat jika dibandingkan dengan uji E.coli karena hanya memerlukan uji penduga yang merupakan tahap pertama uji E.coli (Dwidjoseputro, 1994). Istilah bakteri indikator sanitasi dikenal dalam bidang mikrobiologi pangan. Bakteri indikator sanitasi adalah bakteri yang keberadannya dalam pangan menunjukkan bahwa air atau makanan tersebut pernah tercemar oleh kotoran manusia yang mengingat banyaknya jumlah mikroorganisme ini, maka perlu dilakukan suatu uji pemeriksaan terhadap bahan pangan tersebut agar aman dikonsumsi.Bakteri-bakteri indikator sanitasi umumnya adalah bakteri yang lazim terdapat dan hidup pada usus manusia sehingga dengan adanya bakteri tersebut pada air atau makanan dapat menunjukkan bahwa dalam satu atau lebih tahap pengolahan air atau makanan pernah mengalami kontak dengan kotoran yang berasal dari usus manusia dan oleh sebab itu
kemungkinan terdapat bakteri patogen lain yang berbahaya. Ada tiga jenis bakteri yang dapat digunakan untuk menunjukkan adanya masalah sanitasi, yaitu Escherichia coli, kelompok Streptococcus (Enterococcus) fecal , dan Clostridium perfringens(Hastowo, 1992). Pengukuran kuantitatif populasi mikroorganisme sangat diperlukan untuk berbagai macam penelaahan mikrobiologis. Terdapat berbagai macam cara untuk menghitung jumlah mikroorganisme, akan tetapi secara mendasar, ada dua cara yaitu secara langsung dan secara tidak langsung. Ada beberapa cara perhitungan secara langsung, antara lain adalah dengan membuat preparat dari suatu bahan (preparat sederhana diwarnai atau tidak diwarnai) dan penggunaan ruang hitung (counting chamber ). Sedangkan perhitungan cara tidak langsung hanya untuk mengetahui jumlah mikroorganisme pada suatu bahan yang masih hidup saja (viabel count ). Dalam pelaksanaannya, ada beberapa cara yaitu : perhitungan pada cawan petri (total plate count /TPC), perhitungan melalui pengenceran, perhitungan jumlah terkecil atau terdekat ( MPN methode), dan kalorimeter (cara kekeruhan atau turbidimetri) (Hastowo, 1992). Berbagai macam uji mokrobiologis dapat dilakukan terhadap bahan pangan, meliputi uji kuantitatif mikroba untuk menentukan daya tahan suatu makanan, uji kualitatif bakteri patogen untuk menenetukan tingkat keamanan dan uji indikator untuk menentukan tingkat sanitasi makanan tersebut. Pengujian yang dilakukan terhadap tiap bahan pangan tidak sama tergantung berbagai faktor, seperti jenis dan komposisi bahan pangan (Hastowo, 1992). Metode MPN (Most Probable Number) untuk uji kualitas mikrobiologi air dalam praktikum digunakan kelompok Coliform sebagai indikator. Kelompok Coliform mencakup bakteri yang bersifat aerobik dan anaeorobik fakultatif, batang gram negatif dan tidak membentuk spora. Coliform memfermentasikan laktosa dengan pembentukkan asam dan gas dalam waktu 48 jam pada suhu 35°C (Hastowo, 1992). Dalam metode MPN digunakan medium cair, berbeda dengan metode cawan yang menggunakan medium padat (Agar). Perhitungan dilakukan berdasarkan jumlah tabung yang positif, yaitu yang ditumbuhi oleh mikroba setelah inkubasi pada suhu dan waktu tertentu. Pengamatan tabung positif dapat dilihat dengan timbulnya kekeruhan atau terbentuk gas dalam tabung durham (Lay, 1992). Pendekatan lain untuk enumerasi bakteri hidup adalah dengan metode MPN. Metode MPN didasarkan pada metode statistik (teori kemungkinan). Metode MPN ini umumnya digunakan untuk menghitung jumlah bakteri pada air khususnya untuk mendeteksi adanya bakteri koliform yang merupakan kontaminan utama sumber air minum. Ciri-ciri utamanya yaitu bakteri gram negatif, batang pendek, tidak membentuk spora, memfermentasi laktosa menjadi asam dan gas yang dideteksi dalam waktu 24 jam inkubasi pada 37º C. Sampel ditumbuhkan pada seri tabung sebanyak 3 atau 5 buah tabung reaksi untuk setiap kelompok. Apabila dipakai 3 tabung maka disebut seri 3, dan jika dipakai 5 tabung maka disebut 5 seri. Media pada tabung adalah Lactose Broth yang diberi indikator perubahan pH dan ditambah tabung durham. Pemberian sampel pada tiap seri tabung berbeda-beda. Untuk sampel sebanyak 10 ml ditumbuhkan pada media LBDS (Lactose Broth Double Stegth) yang memiliki komposisi Beef
extract (3 gr), peptone (5 gr), lactose (10 gr) dan Bromthymol Blue (0,2 %) per liternya. Untuk sampel 1 ml dan 0,1 ml dimasukkan pada media LBSS (Lactose Broth Single Stegth) yang berkomposisi sama tapi hanya kadar laktosa setengah dari LBDS yaitu 5 gr (Lay, 1992). MPN (most Probable Number). Metode hitungan cawan dengan menggunakan medium padat, tetapi pada metode MPN dengan menggunakan medium cair di dalam tabung reaksi. Perhitungan MPN berdasarkan pada jumlah tabung reaksi yang positif, yakni yang ditumbuhi oleh mikroba setelah inkubasi pada suhu dan waktu tertentu. Pengamatan tabung yang positif dapat dilihat dengan mengamati timbulnya kekeruhan atau terbentuknya gas di dalam tabung kecil (tabung durham) yang diletakkan pada posisi terbalik, yaitu untuk jasad renik yang membentuk gas. Untuk setiap pengenceran pada umumnya dengan menggunakan 3 atau 5 seri tabung. Lebih banyak tabung yang digunakan menunjukkan ketelitian yang lebih tinggi, tetapi alat gelas (tabung reaksi) yang digunakan juga lebih banyak (Dwidjosepuutro, 2005). Perhitungan bakteri hidup dilakukan dengan cara seri pengenceran. Cara ini secara luas digunakan untuk menghitung bakteri hidup dalam berbagai cairan seperti air, susu, biakan cair dan sebagainya. Serentetan pengenceran dibuat untuk kemudian ditanam dalam medium pembiakan bulyon agar dan setelah inkubasi jumlah koloni dihitung. Setelah dikonversi sesuai dengan pengencerannya, akan diketahui jumlah bakteri per milliliter. Karena pengenceran dikerjakan secara lipat ganda atau secara desimal, maka angka yang diperoleh hanya angka perkiraan, yang biasa disebut Most Probable Number (MPN) (Irianto, 2006). Prinsip untama dari metode MPN ini adalah mengencerkan sampel sampai tingkat tertentu sehingga didapatkan konsentrasi mikroorganisme yang pas/sesuai dan jika ditanam dalam tabung menghasilkan frekuensi pertumbuhan tabung positif “kadang-kadang tetapi tidak selalu”. Semakin besar jumlah sampel yang dimasukkan (semakin rendah pengenceran yang dilakukan) maka semakin sering tabung positif yang muncul. Semakin kecil jumlah sampel yang dimasukkan (semakin tinggi pengenceran yang dilakukan) maka semakin jarang tabung reaksi positif yang muncul. Jumlah sampel/pengenceran yang baik adalah yang menghasilkan tabung positif “kadang-kadang tetapi tidak selalu”. Semua tabung positif yang dihasilkan sangat tergantung dari probabilitas sel yang terambil oleh pipet saat memasukkannya kedalam media. Oleh karena itu homogenisasi sangat mempengaruhi metode ini. Frekuensi positif (ya) atau negative (tidak) ini menggambarkan konsentrasi mikroorganisme pada sampel sebelum diencerkan (Dwidjoseputro, 2005). Dalam metode MPN pengenceran sampel harus lebih tinggi daripada pengenceran pada hitungan cawan, sehingga beberapa tabung yang berisi medium cair yang diinokulasikan dengan larutan hasil pengenceran tersebut mengandung 1 jasad renik, beberapa tabung mungkin mengandung lebih dari 1 sel, sedangkan tabung yang lain mengandung sel sama sekali. Dengan demikian setelah inkubasi diharapkan terjadi pertumbuhan pada beberapa tabung, yang dinyatakan sebagai tabung positifm sedangkan tabung lainnya negatif (Waluyo, 2004). Metode MPN biasanya digunakan untuk menghitung jumlah mikroba di dalam sampel yang berbentuk cair, meskipun dapat juga digunakan untuk sampel yang berbentuk padat dengan
terlebih dahulu membuat suspense 1:10 dari sampel tersebut. Kelompok jasad renik yang dapat dihitung dengan metode MPN juga bervariasi tergantung dari medium yang digunakan untuk pertumbuhan (Dwidjoseputro, 2005). Lebih lanjut mengenai metode MPN, dari setiap pengenceran masing-masing dimasukkan 1 ml masing-masing ke dalam tabung yang berisi medium, dimana untuk setiap pengenceran digunakan 3 atau 5 seri tabung. Setelah inkubasi pada suhu dan waktu tertentu, dihitung jumlah tabung yang positif. Kriteria tabung positif atau tidak ditandai dengan timbulnya kekeruhan atau gas pada tabung durham. Misalnya pada pengnceran pertama, 3 tabung menghasilkan pertumbuhan positif, pada pengenceran ke 2 tabung positif, pada pengenceran ke 3 satu tabung positif, dan pada pengenceran teakhir tidak ada tabung yang positif. Kombinasinya menjadi 3,2,1,0 dan jika diambil 3 pengenceran pertama kombinasinya menjadi 3,2,1. Angka kombinasi ini kemudian dicocokkan dengan table MPN, kemudian nilai MPN sampel dapat dihitung sebagai berikut : MPN sampel = Nilai MPN dari table x
1 Pengenceran tabung tengah
BAB III METODOLOGI PERCOBAAN
3.1 Waktu dan Tempat Pada pratikum mikrobilogi ini berjudul tentang perhitungan jumlah mikroba dengan
menggunakan metode MPN yang dilaksanakan pada hari rabu, pada tanggal 20 April 2011 pada pukul 10.00-12.00 WITA dan dilanjutkan pengamatan pada pada hari kamis, pada tanggal 21 April 2011 pada pukul 05.00-06.00 WITA. dan dilanjutkan pengamatan ke dua pada pada hari sabtu, pada tanggal 23 April 2011 pada pukul 08.00-10.00 WITA. Dan di lanjutkan pengamatan ke tiga pada pada hari senin, pada tanggal 25 April 2011 pada pukul 12.00-12.30 WITA. Bertempat di Laboratorium Mikrobiologi dan Bioteknologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Mulawarman Samarinda. 3.2 Alat dan Bahan 3.2.1 Alat
Botol sampel Rak tabung reaksi Tabung reaksi Tabung durham Blue tip Mikropipet Bunsen Korek Cawan petri Jarum inokulasi/ose Vortex Pipet volume Inkubator Laminar air flow Autoclave Pensil Almunium foil Penyemprot alkohol 3.2.2 Bahan Lactose Borth (LB) Brilliant Green lactose Bile Broth (BGLBB) Eosin Methylene Blue Agar (EMBA) Alkohol 70%
Garm fisiologi Kertas label Tisu Air galon (minum) Air sungai Air sumur Air PDAM NaCl 45 ml 3.3 Cara kerja 3.3.1 Uji penduga
1. 2.
Disiapkan Alat dan Bahan. Disiapkan 5 tabung reaksi setiap seri pengenceran yang d i pilih.
3. 4.
Dimasukan 5 ml sampel air minum pada setiap tabung reaksi seri pengenceran 10. Dimasukan 0,5 ml sampel pada seri pengenceran 1 .
5. 6.
Dimasukan 0,5 ml sampel pada larutan NaCl 4,5 ml . -1 Dimasukan 0,5 ml campuran NaCl tadi pada setiap tabung reaksi seri pengenceran 10 .
7.
Dimasukan 0,5 ml larutan NaCl 4,5 ml yang telah dilarutkan sampel pada larutan NaCl 4,5 ml -2
untuk pengenceran 10 . 8. 9.
-2
Dimasukan campuran NaCl 4,5 ml tadi pada setiap seri tabung reaksi pengenceran 10 . 0 Diinkubasi dalam suhu 35 C selama 24 jam dan sebelumnya diberi label pada setiap
pengenceran yang dilakukan. 10. Diamati perubahan pada tabung reaksi. 11. Dihitung jumlah bakteri yang terdapat pada sampel. 3.3.2 Uji penegas 1.
Disiapkan alat dan bahan.
2.
Dipijarkan jarum ose dan dimasukan ke dalam tabung reaksi pada uji penduga pada pengenceran
3.
10. Dimasukan jarum ose pada yang elah dimasukan ke dalam pengenceran 10 ke dalam media
4.
BGLBB. Dipijarkan lagi jarum ose dan di ulangi perlakuan yang sama hingga ke lima tabung reaksi setiap
5.
seri pengenceran yang di lakukan. Diberi label pada setiap seri tabung reaksi pengenceran yang dilakukan.
6. 7.
Diinkubasi pada suhu 35 C selama 24 jam. Diamati gas yang terbentuk pada tabung durham.
8.
Dihitung jumlah bakteri yang terdapat pada sampel. 3.3.3 Uji pelengkap
1. 2.
Disiapkan alat dan bahan. Dipijarkan jarum ose pada lampu bunsen.
0
3.
Dimasukan jarum ose pada tabung reaksi pengenceran ke 10.
4.
Digoresakan jarum ose yang telah di masukan padapengenceran 1o pada media EMBA yang terdapat pada cawan petri dan di gunakan pada kolom yang tersedia hingga ke lima seri tabung
pengnceran 10. 5. Dipijarkan lagi jarum osedan di lakukanperlakuan yang sama hingga ke lima tabung reaksi 6.
setiap seri pengenceran yang di lakukan. Diberi label.
7. 8.
Diinkubasi pada suhu 35 C selama 24 jam. Diamati setiap cawan petri yang terdapat bakteri E.coli.
9.
Dihitung jumlah bakteri yang terdapat pada sampel.
0
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Hasil Pengamatan 4.1.1 Tabel Hasil Pengamatan Metode MPN Media
Seri
Pengamatan
Nilai
MPN
MPN -1
-2
10
1
10
10
LB
4
4
3
1
33
3300
GLBB
3
4
1
2
26
2600
EMBA
0
0
0
0
-
-
Tabel
4.2 Perhitungan 4.2.1 Perhitungan Media LB (lactose Borth)
MPN Count : Nilai MPN Tabel x (pengenceran tabung tengah)
10
: 33 x 10 -1 10 : 3300 Cfu/100 ml 4.2.2 Perhitungan Media GLBB (green lactose bile borth) MPN Count : Nilai MPN Tabel x
10
(pengenceran tabung tengah) : 26 x 10 -1 10 : 2600 Cfu/100 ml 4.2.3 Perhitungan Media EMBA (eosin methylene blue agar) MPN Count : Nilai MPN Tabel x (pengenceran tabung tengah) : 0 x Cfu 100 ml : 0 Cfu/100 ml
4.3 Pembahasan
10
Metode MPN (Most Probable Number ) adalah metode yang digunakan untuk menghitung koliform di dalam air dengan menggunakan pengujian fermentasi dalam tabung. Tiga pengujian itu diantaranya adalah uji penduga (Presumtive Test ), uji penegas (Confirmed Test), dan uji pelengkap (Completed Test) Output metode MPN adalah nilai MPN. Nilai MPN adalah perkiraan jumlah unit tumbuh (growth unit) atau unit pembentuk koloni dalam sampel (Dwidjoseputro, 1994). Metode MPN ini umumnya digunakan untuk menghitung jumlah bakteri pada air khususnya untuk mendeteksi adanya bakteri koliform yang merupakan kontaminan utama sumber air minum. Ciri-ciri utamanya yaitu bakteri gram negatif, batang pendek, tidak membentuk spora, memfermentasi laktosa menjadi asam dan gas yang dideteksi dalam waktu 24 jam inkubasi pada 37º C (Dwidjoseputro, 1994). E.coli adalah bakteri koliform yang ada pada kotoran manusia, maka E.coli sering disebut sebagai coliform fekal. Bakteri coliform adalah golongan bakteri intestinal, yaitu hidup dalam saluran pencernaan manusia dan merupakan bakteri indikator keberadaan bakteri patogenik lain. Lebih tepatnya, sebenarnya bakteri coliform fecal adalah bakteri indikator adanya pencemaran bakteri patogen. Penentuan coliform fecal menjadi indikator pencemaran dikarenakan jumlah koloninya pasti berkorelasi positif dengan keberadaan bakteri patogen. Selain itu, mendeteksi coliform jauh lebih murah, cepat, dan sederhana daripada mendeteksi bakteri patogenik lain (Dwidjoseputro, 1994). Media Lactose broth (LB) digunakan sebagai media untuk mendeteksi kehadiran coliform dalam air, makanan, dan produk susu, sebagai kaldu pemerkaya (pre-enrichment broth) untuk Salmonella dan dalam mempelajari fermentasi laktosa oleh bakteri pada umumnya. Pepton dan ekstrak beef menyediakan nutrien esensial untuk memetabolisme bakteri. Laktosa menyediakan sumber karbohidrat yang dapat difermentasi untuk organisme koliform. Pertumbuhan dengan pembentukan gas adalah presumptive test untuk coliform. Lactose broth dibuat dengan komposisi 0,3% ekstrak beef; 0,5% pepton; dan 0,5% laktosa (lay, 1992) Media EMBA (Eosin Methylene Blue Agar) mempunyai keistimewaan mengandung laktosa dan berfungsi untuk memilah mikroba yang memfermentasikan laktosa seperti Staphylcoccus. aureus, P. aerugenosa, dan Salmonella. Mikroba yang memfermentasikan laktosa menghasilkan koloni dengan inti berwarna gelap dengan kilap logam. Sedangkan mikroba lain yang dapat tumbuh koloninya tidak berwarna. Adanya eosin dan methylene blue membantu mempertajam perbedaan tersebut. Namun demikian, jika media ini digunakan pada tahap awal karena kuman lain juga tumbuh terutama P. Aerugenosa dan Salmonella sp. dan dapat menimbulkan keraguan. Bagaiamanapun media ini sangat baik untuk mengkonfirmasi bahwa kontaminan tersebut adalah E.coli. Agar EMB (levine) merupakan media padat yang dapat digunakan untuk menentukan jenis bakteri E.coli dengan memberikan hasil positif dalam tabung. EMB yang menggunakan eosin dan methylene blue sebagai indikator memberikan perbedaan yang nyata antara koloni yang meragikan laktosa dan yang tidak. Medium tersebut mengandung
sukrosa karena kemempuan bakteri E.coli yang lebih cepat meragikan sukrosa daripada laktosa (Hastowo, 1992). Media BGBB (Brilliant Green Bile Broth) digunakan untuk mengkonfirmasi hasil tes positifdugaan. Brilliant Green Bile Broth (BGBB) juga disebut sebagai Brilliant Green Lactose Bile Broth
(BGLBB).
Enzimatik Intisari dari Gelatin adalah sumber karbon dan nitrogen digunakan untuk kebutuhanpertumbuhan umum di Brilliant Green lactose Bile Broth. O xbile dan Brilliant Green menghambat bakteriGram p ositif dan bakteri Gram negatif banyak, selain E.coli. Laktosa merupakan sumber karbohidrat.Bakteri yang fermentasi laktosa dan mengh asilkan gas yang terdeteksi Penggunaan utama dari media ini adalah untuk mengidentifikasi keberadaan E.coli pada makanan. Selama inkubasi 24 jam pada suhu 37 °C E.coli akan memfermentasi laktosa dalam kaldu dengan produksi gas dan Gas ini akan terkumpul dalam sebuah tabung durham terbalik (Hastowo, 1992). Uji Penduga ( Presumptive Test ) : satu seri yang berisi 9 atau 12 tabung yang berisi Lactose Broth dan tabung durham diinokulasikan dengan sampel air untuk menguji apakah air tersebut mengandung bakteri yang bisa memfermentasikan laktosa yang memproduksi gas. Jika setelah inkubasi gas timbul pada Lactose Broth, diduga ada bakteri coliform di sampel air tersebut. Uji penduga merupakan tes pendahuluan tentang ada tidaknya kehadiran bakteri coliform berdasarkan terbentuknya asam dan gas yang disebabkan karena fermentasi laktosa oleh bakteri golongan E.coli. Terbentuknya asam dilihat dari kekeruhan pada media laktosa, dan gas yang dihasilkan dapat dilihat dalam tabung durham yang berupa gelembung udara. Banyaknya kandungan bakteri Escherichia coli dapat dilihat dengan menghitung tabung yang menunjukkan reaksi positif terbentuknya asam dan gas dan dibandingkan dengan tabel MPN. dan jika tidak terbentuk gas dalam tabung durham, dihitung sebagai hasil negatif. Jumlah tabung yang positif dihitung pada masing-masing seri, MPN penduga dapat dihitung dengan melihat tabel MPN (Lay, 1992). Uji penguat atau pelengkap. Merupakan uji dari tabung yang positif terbentuk asam dan gas terutama pada masa inkubasi 1 x 24 jam, suspensi diinokulasikan pada media Eosin Methylen Blue Agar (EMBA) secara aseptik dengan menggunakan jarum inokulasi. Koloni bakteri Escherichia coli tumbuh berwarna merah kehijauan dengan kilap metalik (Lay, 1992). Uji penegas untuk menentukan bakteri Escherichia coli. Dari koloni yang berwarna pada uji penguat atau pelengkap. Uji penegas merupakan suatu uji sebelum dilakukanya uji pelengkap dimana digunakn media (BGLBB) Brilliant Green Lactose Bile Broth. Dimana pada media ini di lihat fermentasi laktosapada bakteri E.coli dengan terbentuknya asam dan gelembung. Pada uji penegas banyaknya kandungan bakteri E.coli dilihat dengan menghitung tabung yang terdapat gelembung di dalam tabung durham dan dihitung MON count dengan melihat hasil dari MPN tabel dikali sepuluh per pengenceran tengah dan dari hasil uji penegas akan disimpulkan dengan uji penguat atau pelengkap (Dwidjoseputro, 1994).
Hasil pengamatan pada perhitungan jumlah bakteri dengan menggunakan metode MPN diketahui, pada uji penduga digunkannya media lactose borth dengan sampel air minum yang digunakan diketahui seri pengamatan 10 terdapat empat gelembung, pengenceran 1 terdapat -1
-2
empat gelembung, pengenceran 10 terdapat tiga gelembung, dan pengenceran 10 terdapat satu gelembung. Pada MPN tabel diketahui 33 nilai MPN tabelnya dan dari perhitungan MPN count didapatkan hasi 3300 Cfu /100 ml. Pada uji penegas dengan menggunakan media Brilliant Green Lactose Bile Broth dapat diketahui seri pengamtannya pada pengenceran 10 terdapat lima gelembunng, pada pengencera 1 -1 terdapat empat gelembung, dan pada pengenceran 10 terdapat satu gelembung sedangkan pada -2
pengenceran 10 terdapat dua gelembung. Dari hasil pengenceran didapatkan hasl nilai MPNtabelnya 26, dengan perhitungan mencari Mpn count hasil yang didapat dari MPN-nya adalah 2600 Cfu/100 ml. Pada uji penguat atau pelengkap dari setiap seri pengenceran tidak didapatkan hasil adanya bakteri E.coli yang tumbuh pada sempel air minum. Jadi, hasil yang didapat adalah nihil atu tidak ada bakteri E.coli yang tumbuh. Faktor kesalahan pada percobaan perhitungan jumlah mikroba pada metode MPN. Trejadi pada cara penggoresan pada media EMBA yang tidak sesuai dengan alur dan melewati dari garis pembatas kolom, serta kurang hati-hati dalam melakukan percobaan sehingga terdapat tabung reaksi yang pecah akibat kecerobohan.
BAB V PENUTUP 5.1 Kesimpulan
Dari hasil pratikum mengenai “perhitungan jumlah mikroba dengan metode MPN” dapat disimpulka bahwa :
Prinsip dari metode MPN adalah suatu metode perhitungan jumlah mikroba yang menggunakn tiga tahap uji yaitu uji penduga , uji penegas/konfirmasi dan uji pelengkap yang didasarkan untuk mengetahui jumlah dari mikroba coliform. Fungsi dari media Eosin Methylene blue agar (EMBA) iaalh sebagi indikator untuk memberikan perbedaan yang nyata antara koloni yang memefermentasikan laktosa dan yang tidak. Sedangkan
fungsi dari media brilliant green laktose bile borth (BGLBB) ialah sebagai
pengkonfirmasi hasil tes positif uji penduga. Dan media lactose borth (LB) berfungsi sebagai media untuk mendeteksi keberadaan bakteri coliform dalam air.
Proses terjadinya gelembung pada tabung durham terjadi karena adanya fermentasi laktosa yang di lakukan oleh bakteri golongan E.coli sehingga terbentuk asam pada media yang tedapat laktosa, yang dapat di lihat dengan kekeruhan sehingga menghsilkan gas atau gelembung dara pada tabung durham 5.2 Saran Di harpkan prtikan harus melepas peralatan acsesoris seperti gelang dan cincin, agar tidak
mengganggu saat dalm http://itatrie.blogspot.com/2012/10/laporan-mikrobiologi-most-probable.html
Pendahuluan
Air merupakan materi esensial bagi kehidupan makhluk hidup, karena makhluk hidup memerlukan air untuk mempertahankan kelangsungan hidupnya. Secara umum fungsi air dalam tubuh setiap mikroorganisme adalah untuk melarutkan senyawa organik, menstabilkan suhu tubuh dan melangsungkan berbagai reaksi kimia tingkat seluler (Campbell dkk., 2002). Pemeriksaan air secara mikrobiologi sangat penting dilakukan karena air merupakan substansi yang sangat penting dalam menunjang kehidupan mikroorganisme yang meliputi pemeriksaan secara mikrobiologi baik secara kualitatif maupun kuantitatif dapat dipakai sebagai pengukuran derajat pencemaran (Ramona dkk., 2007). Pemeriksaan derajat pencemaran air secara mikrobiologi umumnya ditunjukkan dengan kehadiran bakteri indikator seperti coliform dan fecal coli (Ramona dkk., 2007).Bakteri coliform sebagai suatu kelompok dicirikan sebagai bakteri berbentuk batang gram negatif, tidak membentuk spora, aerobik , dan anaerobik fakultatif yang memfermentasi laktose dengan menghasilkan asam dan gas dalam waktu 48 jam pada suhu 35° C (Pelczar,1988).
Kelompok bakteri coliform antara lain Eschericia coli, Enterrobacter aerogenes,dan Citrobacter fruendii. Keberadaan bakteri ini dalam air minum juga menunjukkan adanya bakteri patogen lain, misalnya Shigella, yang bisa menyebabkan diare hingga muntaber (Kompas Cyber Media, 2003 dalam Kompas.com). Menurut Supardi dan Sukamto (1999), bakteri coliform dapat dibedakan menjadi dua bagian, yaitu: 1) Coliform fekal, misalnya E. coli, merupakan bakteri yang berasal dari kotoran hewan atau manusia. 2) Coliform non-fekal, misalnya E. aeroginosa, biasanya ditemukan pada hewan atau tanaman yang telah mati. Jadi, coliform adalah indikator sedikit kandungan coliform,maka kualitas air semakin baik.
kualitas
air. Semakin
Uji kualitas air terdiri dari 3 step utama, yaitu: Uji penduga, Uji penguat dan Uji pelengkap. Dalam uji penduga di gunakan lactose broth, sedangkan untuk contoh lainya yang banyak mengandung bakteri asam laktat, misalnya susu, di gunakan brilliant green lactose bile broth (BGLBB). Bakteri asam laktat dapat memfermentasi laktosa dan membentuk gas, hingga dapat mengakibatkan pembacaan uji positif yang salah. BGLBB merupakan medium selektif yang mengandung asam bile sehingga dapat o menghambat bakteri gram positif termasuk coliform. Inkubasi di lakukan pada suhu 35 C selama 24-48 jam. Tabung di nyatakan positif bila terebentuk gas sebanyak 10 % atau lebih dari volume di dalam tabung Durham. Jumlah tabuung yang positif di hitung pad masing-masing seri. MPN penduga dapat di hitung dengan melihat table MPN 7 tabung. Uji Penguat. Terbentuknya gas dalam Lactose Broth atau dalam BGLBB tidak selalu menunjukan bakteri E.Colli karena mikroba lainya mugkin juga ada yang dapat memfermentasikan laktosa dengan membentuk gas, misalnya bakteri asam laktat dan beberapa kahmir tertentu. Oleh karena itu perlu di lakukan uji penguat pada agar EMB. Dengan Menggunakan jaarum ose, contoh dari tabung MPN yang menunjukan uji penduga positif (terbentuk gas) masing-masing di inokulasikan pada agar cawan EMB dengan cara goresan o kuadran. Semua tabung di inkubasikan pada suhu 35 C selam 24 jam. Jumlah cawan EMB pada masing-masing pengenceran yang menunjukan adanya pertumbuhan Coliform, baik fekal maupun non fekal dihitung dan MPN penguat dapat di hitung dari table MPN. Pengujian selanjutnya dilanjutkan dengan uji pelengkap untuk menentukan bakteri Escherichia coli. Dari koloni yang berwarna pada uji penguat diinokulasikan ke dalam medium Lactose Broth dan medium agar miring Nutrient Agar (NA), dengan jarum inokulasi o secara aseptik. Diinkubasi pada suhu 37 C selama 1 x 24 jam. Bila hasilnya positif terbentuk asam dan gas pada Lactose Broth, maka sampel positif mengandung bakteri Escherichia coli.
Dari media agar miring NA dibuat pewarnaan Gram dimana bakteri Escherichia colimerupakan Gram negatif berbentuk batang pendek.
Tujuan
Tujuan dari praktikum Uji Kualitas Air adalah untuk menguji kualitas air kolam secara mikrobiologi dengan uji Coliform.
Alat dan bahan
Alat-alat yang digunakan dalam praktikum Uji Kualitas Air yaitu: Tabung reaksi, Tabung durham, Bunsen, Inkubator, Cawan petri, Oase, Mikroskop, Pipet mikro, Preparat, Kertas saring, Corong, Erlenmeyer, Botol semprot. Bahan-bahan yang digunakan diantaranya: Sample air kolam, Media Lactosa Broth,EMBA ( Eosin Metilen Blue Agar ), Kristal ungu, Aquades, Iodium 1%, Alkohol 96%, Safranin.
Prosedur
Uji penduga dilakukan pada hari Jum’at, 16 Maret 2012. Yang pertama dilakukan adalah mengambil sample air kolam dan menyaringnya. Setelah itu, menyiapkan 15 tabung reaksi yang dibagi menjadi 3 seri yaitu 5 tabung Double Strength 10 ml, 5 tabung Single Strength 1 ml, dan 5 tabung Single Strength 0,1 ml. Pada masing-masing tabung sudah berisi media Lactosa Broth dan 1 tabung durham di dalamnya. Tabung dibalik perlahan agar tidak terdapat gelembung udara. Masukkan sample air kedalam masing-masing tabung dengan metode sterilisasi agar tidak terkontaminasi. Setelah selesai Inkubasi selama 24 jam. Uji Penguat dilakukan pada hari Sabtu, 17 Maret 2012. Sebelum melakukan uji penguat, terlebih dahulu melihat hasil uji penduga. Indikator yang dilihat adalah gelembung udara pada tabung durham, jika pada tabung durham terdapat gelembung udara, dugaan positif ada mikroba didalam sample air. Gelembung yang terbentuk dihitung dan dilihat pada table MPN. Cawan petri yang berisi EMBA ( Eosin Metilen Blue Agar ) disiapkan, kemudian oase yang akan digunakan dicelupkan ke dalam alkohol lalu dibakar pada bunsen, lalu ditunggu beberapa saat dan oase dicelupkan ke dalam sampel lalu digoreskan kedalam cawan petri yang telah berisi EMBA. Setelah 24 jam hasilnya diamati, terbentuk atau tidaknya warna hijau metalik. Uji pelengkap (pewarnaan gram) dilakukan pada hari senin, 19 Maret 2012. Pertama, kaca preparat dibersihkan lalu preparat ditetesi dengan sedikit aquades dan diolesi dengan bakteri. Lalu difiksasi beberapa saat, kemudian diteteskan pewarna Kristal ungu dan dibiarkan selama 1 menit lalu dibilas dengan aquades. Kemudian ditetesi dengan iodium 1%, tunggu selama 1 menit dan dibilas kembali menggunakan aquades. Selanjutnya ditetesi dengan alkohol 96%,
tunggu selama 1 menit lalu dibilas dengan aquades. Tahap terakhir ditetesi dengan safranin, tunggu selama 45 detik dan dibilas dengan aquades. Kemudian bakteri diamati pada mikroskop lalu dilihat warna dan bentuk bakterinya. Data Hasil
Tabel 1 Hasil pengamatan uji kualitas air pada sampel air kolam Uji
Hasil Pengamatan
Uji Penduga
Terbentuk gelembung pada semua tabung
Uji Penguat
Tidak terbentuk warna hijau metalik
Uji Pelengkap
Bentuk bakteri : Basil Warna bakteri : Merah muda
Pembahasan
Metode MPN ( Most Probable Number ) untuk uji kualitas air saat praktikum menggunakan coliform sebagai indikator. Kelompok Coliform mencakup bakteri yangaerobic dan anaerobic fakultatif, berbentuk batang atau basil, gram negative dan tidak membentuk spora. Coliform memfermentasikan laktosa dengan membentuk asam dan gas CO2 dalam waktu inkubasi selama 24 jam dan diletakkan pada suhu 37ºC. Hasil yang diperoleh dari uji penduga yaitu pada tabung berlabel Double Strength,Single Strength 1 ml, dan Single Strength 0,1 ml terbentuk gelembung pada tabung durham yang mengindikasikan adanya coliform pada air sampel dengan indeks MPN per 100 mlsebesar lebih dari 2400. . Uji selanjutnya ialah uji penguat, uji ini dilakukan pada media EMBA ( Eosin Metilen Blue Agar ). Larutan sampel pada tabung berlabel Double Strength, Single Strength 1 ml, dan Single Strength 0,1 ml yang telah diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37ºC diambil dengan oase dengan cara dicelupkan lalu dioleskan ke dalam EMBA. Uji positif dapat dilihat dari terbentuknya warna hijau metalik atau tidak. Hasil praktikum menunjukkan bahwa pada uji penguat hasil yang diperoleh negatif karena tidak terbentuk warna hijau metalik pada EMBA. Uji yang terakhir ialah uji pelengkap, pada uji ini dilakukan pewarnaan gram untuk mengetahui bentuk dari bakteri yang terdapat pada sampel. Prosedur pewarnaan gram yang dilakukan sama seperti pewarnaan gram yang telah dilakukan sebelumnya. Adapun fungsi-fungsi penambahan warna pada pewarnaan bakteri gram yaitu, pewarna Kristal unguditambahkan sebagai pemberi warna awal, iodium ditambahkan untuk memperkuat ikatan pada dinding sel sehingga warna yang dilihat dapat terlihat lebih jelas, alkohol ditambahkan sehingga pada bakteri gram negatif yang mengandung peptidoglikan. Safranin ditambahkan untuk memberikan kompleks warna merah pada bakteri gram negatif sehingga bakteri gram negatif menjadi berwarna merah sedangkan pada bakteri gram positif pewarna safranin tidak berpengaruh sehingga bakteri gram positif tetap berwarna ungu.
Setelah dilakukan pewarnaan gram dan diamati pada mikroskop, bakteri yang teramati yaitu bakteri berbentuk basil dan berwarna merah muda sehingga dapat dikatakan terdapat bakteri E.Colli. Kesimpulan
Berdasarkan hasil praktikum Uji Kualitas Air dapat disimpulkan bahwa pada air kolam terdapat bakteri E.Colli. Tidak terbentuknya warna hijau metalik pada uji penguat disebabkan ketidakjelasan warna pada saat pengamatan, sehingga warna hijau metalik tidak terlihat. Standar Air Minum, menurut standar WHO semua sampel tidak boleh mengandung E. coli dan sebaiknya juga bebas dari bakteri coliform. Standar WHO dalam setiap tahun, 95% dari sampel-sampel tidak boleh mengandung coliform dalam 100 ml, tidak ada sampel yang mengandung E. coli dalam 100 ml, Tidak ada sampel yang mengandung coliform lebih dari 10 dalam 100 ml, tidak boleh ada coliform dalam 100 ml dan dua sampel yang berurutan (AOAC,2000). Bakteri coliform adalah golongan bakteri intestinal, yaitu hidup dalam saluran pencernaan manusia. Bakteri coliform adalah bakteri indikator keberadaan bakteri patogenik lain. Lebih tepatnya, sebenarnya, bakteri coliform fekal adalah bakteri indikator adanya pencemaran bakteri patogen. Penentuan coliform fekal menjadi indikator pencemaran dikarenakan jumlah koloninya pasti berkorelasi positif dengan keberadaan bakteri patogen. Selain itu, mendeteksi Coliform jauh lebih murah, cepat, dan sederhana daripada mendeteksi bakteri patogenik lain (Dad,2000). Contoh bakteri coliform adalah, Esherichia coli dan Entereobacter aerogenes. Jadi, coliform adalah indikator kualitas air. Makin sedikit kandungan coliform, artinya, kualitas air semakin baik. Berdasarakan latar belakang itulah maka praktikum ini penting untuk dilaksanakan. Hasil pemeriksaan MPN Coliform metode tabung ganda dinyatakan dengan jumlah perkiraan terdekat kuman golongan coli yang terdapat dalam 100 ml contoh air atau 100 gr contoh makanan (MPN). Untuk contoh air yang bukan air minum, biasanya pemeriksaan rutin laboratorium, hanya bertujuan untuk mengetahui derajat kontaminasi dari bekteri atau untuk menentukan sumber polusi. Pemeriksaan MPN Coliform metode tabung ganda didasarkan bahwa bakteri golongan coli dapat meragikan laktosa, membentuk asam atau gas. Untuk itu digunakan metode ini : 1. Tes Perkiraan (Presumtive Test) Perbenihan yang diperlukan adalah lactose broth yang single strength (SS) dan Double Strength (DS). LBDS dipakai untuk pengenceran yang lebih besar (10 ml) dan LBSS dipakai untuk pengenceran yang lebih kecil ( 1 ml dan 0,1 ml). Sedangkan jumlah tabung yang dipakai ada bermacam-macam kombinasi, seperti: No. Jumlah Tabung Volume Air 1. 5 tabung LB DS 10 ml contoh air 5 tabung LB SS 1 ml contoh air 5 tabung LB SS 0,1 ml contoh air 2. 5 tabung LB DS 10 ml contoh air 1 tabung LB SS 1 ml contoh air 1 tabung LB SS 0,1 ml contoh air 3. 3 tabung LB DS 10 ml contoh air
3 tabung LB SS 1 ml contoh air 3 tabung LB SS 0,1 ml contoh air Sesudah masing-masing tabung diisi dengan contoh air dengan menggunakan pipet ukur o secara aseptis, kemudian disimpan kedalam lemari pengeram (incubator) dengan suhu 35-37 C selama 1 x 24 jam. Tiap-tiap tabung yang menunjukkan peragian (keruh) dan adanya gas, maka tabung itu diperkirakan mengandung kuman golongan Coli, atau positif. Dari tabung ini perlu diteruskan pada tes penegaan (Confirmatory Test). 2. Tes Penegasan (Confirmatory Test) Pembenihan yang dipakai adalah B.G.L.B. Adapun yang diperiksa adalah semua tabung yang positif (keruh + gas) pada Lactose Broth. Pindahkan dengan jarum ose dari tiap-tiap tabung o yang positif ke B.G.L.B kemudian masukkan ke dalam incubator 35-37 C selama 1 x 24 jam. Tabung yang menunjukkan keruh dan gas dianggap positif. Hasil pemeriksaan pada tes penegasan ini dapat dibaca dalam tabel PTD/MPN Coliform, sesuai dengan jumlah tabung yang dipergunakan. Misalnya dalam tabel kita mendapatkan angka MPN = 5, ini berarti bahwa dalam 100 ml contoh air terdapat 5 kuman golongan Coli. 3. Tes Lengkap (Complete Test) Pembenihan yang dipakai adalah : Endo agar plate atau EMB agar plate Pepton untuk indol Metil red Vogas Proskauer Citrat media Tes ini ditunjukkan untuk menentukan jenis dari coliform misalnya E. Coli, A.aerogenesis, E. freundii, dan lain-lain dengan melihat hasil peragian kuman (test biokimia) pada media : Media E. Coli A. aerogenesis Indol + Metil red + Vogas Proskauer + Citrat + B. TUJUAN Tujuan dari pemeriksaan MPN Coliform pada makanan dan air terutama contoh air yang sudah mendapat pengolahan proses desinfeksi, ialah mencari atau menentukan adanya bakteri golongan Coli atau E.Coli dalam contoh makanan dan air yang diperiksa, selain itu juga untuk mengetahui korelasi antara jumlah bakteri koliform dengan kualitas air sampel. C. MANFAAT Manfaat dari praktikum ini adalah parktikan mampu menganalisa kualitas air dengan metode MPN (Most Probable Number) dengan menghitung jumlah k oliform yang ditemukan. LATAR BELAKANG 1. Metode MPN Metode MPN terdiri dari tiga tahap, yaitu uji pendugaan (presumtive test), uji konfirmasi (confirmed test), dan uji kelengkapan (completed test). Dalam uji tahap pertama, keberadaan coliform masih dalam tingkat probabilitas rendah; masih dalam dugaan. Uji ini mendeteksi sifat fermentatif coliform dalam sampel. Karena beberapa jenis bakteri selain coliform juga memiliki
sifat fermentatif, diperlukan uji konfirmasi untuk mengetes kembali kebenaran adanya coliform dengan bantuan medium selektif diferensial. Uji kelengkapan kembali meyakinkan hasil tes uji konfirmasi dengan mendeteksi sifat fermentatif dan pengamatan mikroskop terhadap ciri-ciri coliform: berbentuk batang, Gram negatif, tidak-berspora. (Fardiaz,1989). Output metode MPN adalah nilai MPN. Nilai MPN adalah perkiraan jumlah unit tumbuh (growth unit) atau unit pembentuk-koloni (colony-forming unit) dalam sampel. Namun, pada umumnya, nilai MPN juga diartikan sebagai perkiraan jumlah individu bakteri. Satuan yang digunakan, umumnya per 100 mL atau per gram. Jadi misalnya terdapat nilai MPN 10/g dalam sebuah sampel air, artinya dalam sampel air tersebut diperkirakan setidaknya mengandung 10 coliform pada setiap gramnya. Makin kecil nilai MPN, maka air tersebut makin tinggi kualitasnya, dan makin layak minum. Metode MPN memiliki limit kepercayaan 95 persen sehingga pada setiap nilai MPN, terdapat jangkauan nilai MPN terendah dan nilai MPN tertinggi. (FDA, 1989). 2. Bakteri Coliform Bakteri coliform adalah bakteri indikator keberadaan bakteri patogenik lain. Lebih tepatnya, sebenarnya, bakteri coliform fekal adalah bakteri indikator adanya pencemaran bakteri patogen. Penentuan coliform fekal menjadi indikator pencemaran dikarenakan jumlah koloninya pasti berkorelasi positif dengan keberadaan bakteri patogen. Selain itu, mendeteksi Coliform jauh lebih murah, cepat, dan sederhana daripada mendeteksi bakteri patogenik lain. Contoh bakteri coliform adalah, Esherichia coli dan Entereobacter aerogenes. Jadi, coliform adalah indikator kualitas air. Makin sedikit kandungan co liform, artinya, kualitas air semakin baik. (FRIEDHEIM, 2001). Banyaknya kontaminan dalam air memerlukan standar tertentu untuk menjamin kebersihannya. Air yang terkontaminasi oleh bakteri patogen saluran cerna sangat berbahaya untuk diminum. Hal ini dapat dipastikan dengan penemuan organisme yang ada dalam tinja manusia atau hewan dan yang tidak pernah terdapat bebas di alam. Ada beberapa organisme yang termasuk kategori ini, yaitu bakteri coliform (E. coli), Enterococcus faecalis, Clostridium sp. Di Indonesia, bakteri indikator air terkontaminasi adalah E. coli. Terdapatnya bakteri coliform dalam air minum dapat menjadi indikasi kemungkinan besar adanya organisme patogen lainnya. Bakteri coliform dibedakan menjadi 2 tipe, yaitu faecal coliform dan non-faecal coliform. E. coli adalah bagian dari faecal coliform. Keberadaan E. coli dalam air dapat menjadi indikator adanya pencemaran air oleh tinja. E. coli digunakan sebagai indikator pemeriksaan kualitas bakteriologis secara universal dalam analisis dengan alasan; a) E. coli secara normal hanya ditemukan di saluran pencernaan manusia (sebagai flora normal) atau hewan mamalia, atau bahan yang telah terkontaminasi dengan tinja manusia atau hewan; jarang sekali ditemukan dalam air dengan kualitas kebersihan yang tinggi, b) E. coli mudah diperiksa di laboratorium dan sensitivitasnya tinggi jika pemeriksaan dilakukan dengan benar, c) Bila dalam air tersebut ditemukan E. coli, maka air tersebut dianggap berbahaya bagi penggunaan domestik, d) Ada kemungkinan bakteri enterik patogen yang lain dapat ditemukan bersama-sama dengan E. coli dalam air tersebut Bakteri pembusuk ini dimasukkan ke dalam golongan bakteri Coliform, salah satu yang termasuk didalamnya adalah Escherichia coli. Bakteri coliform ini menghasilkan zat ethionine yang pada penelitian menyebabkan kanker. Bakteri-bakteri pembusuk ini juga memproduksi
bermacam-macam racun seperti Indole, skatole yang dapat menimbulkan penyakit bila berlebih didalam tubuh. (GAUSE, G. F. 1946). Bakteri coliform merupakan parameter mikrobiologis terpenting kualitas air minum. Kelompok bakteri coliform terdiri atas Eschericia coli, Enterobacter aerogenes, Citrobacter fruendii, dan bakteri lainnya. Meskipun jenis bakteri ini tidak menimbulkan penyakit tertentu secara langsung, keberadaannya di dalam air minum menunjukkan tingkat sanitasi rendah. Oleh karena itu, air minum harus bebas dari semua jenis coliform. Semakin tinggi tingkat kontaminasi bakteri coliform, semakin tinggi pula risiko kehadiran bakteri-bakteri patogen lain yang biasa hidup dalam kotoran manusia dan hewan. Salah satu contoh bakteri patogen-yang kemungkinan terdapat dalam air terkontaminasi kotoran manusia atau hewan berdarah panas-adalah Shigella, yaitu mikroba penyebab gejala diare, deman, kram perut, dan muntah-muntah. (Official Chemical Method, 1979). Jenis bakteri coliform tertentu, misalnya E coli O:157:H7, bersifat patogen dan juga dapat menyebabkan diare atau diare berdarah, kram perut, mual, dan rasa tidak enak badan (Dad,2000). http://kana-hapaki.blogspot.com/2013/03/laporan-pemeriksaan-mpn-coli_23.html
Uji kualitas air dilakukan untuk mengetahui kualitas dari air yang akan kita analisis. Metode yang digunakan ialah MPN (Most Probable Number) atau APN (Angka Paling Mungkin). MPN merupakan metode yang paling sederhana yang digunakan untuk menguji kualitas air. Uji kualitas air terdiri dari beberapa uji yakni uji penduga, uji penguat dan uji pelengkap. Air sangat perlu untuk duji sebelum dikonsumsi atau diminum karena air dapat menjadi sumber penyebaran penyakit. Uji penduga merupakan uji positif untuk menentukan bakteri koliform. Media yang digunakan ialah media lactose broth. Bakteri dapat menggunakan laktosa sebagai sumber karbon, namun ada pula sebagian bakteri enteric yang tidak dapat melakukannya. Kaldu laktosa mengandung surface tension depressant yang menekan pertumbuhan bakteri gram positif dan memacu bakteri gram negative terutama bakteri koliform. Hasil uji penguat yang positif atau meragukan menyatakan bahwa sampel air tidak layak untuk diminum. Uji penguat memerlukan media selektif dan diferensial seperti eosin-biru metilen atau endo agar yang akan diinokulasi dari tabung laktosa yang positif. Uji pelengkap, uji ini merupakan tahap akhir analisis bakteri dari contoh air. Uji pelengkap dilakukan dengan pewarnaan gram (Sunatmo 2009). Metode MPN (Most Probable Number) untuk uji kualitas air saat praktikum menggunakan koloform sebagai indicator. Kelompok koliform mencakup bakteri yang aerobic dan anaerobic fakultatif, berbentuk batang atau basil, gram negative dan tidak membentuk spora. Koliform memfermentasikan laktosa dengan membentuk asam dan gas CO 2 dalam
waktu inkubasi selama 48 jam dan diletakkan pada suhu 37ºC (Hadieotomo 1993). Uji yang dilakukan pada metode ini ialah uji penduga, uji penguat dan uji pelengkap. Uji penduga dilakukan dengan menginkubasi air sampel yang telah dimasuukan ke dalam tabung reaksi yang berisi media lactose broth dan tabung Durham, hasil yang diperoleh yakni pada tabung berlabel DS, SS1, dan SS2 terbentuk gelembung pada tabung durham yang mengindikasikan adanya koliform pada air sampel dengan indeks MPN per 100 mL sebesar lebih dari 2400. Uji selanjutnya ialah uji penguat, uji ini dilakukan pada media EMBA (Eosin Metilen Blue Agar). Larutan sampel pada tabung berlabel DS, SS 1, dan SS2 yang telah diinkubasi selama 48 jam pada suhu 37ºC diambil dengan ose dengan cara dicelupkan lalu dioleskan ke dalam EMBA, uji positif dapat dilihat dari terbentuknya warna hijau metalik atau tidak. Hasil praktikum menunjukkan bahwa pada uji penguat hasil yang diperoleh negative karena tidak terbentuk warna hijau metalik pada EMBA. Uji yang terakhir ialah uji pelengkap, pada uji ini dilakukan pewarnaan gram untuk mengetahui bentuk dari bakteri yang terdapat pada sampel. Pewarnaan gram dilakukan pada kultur murni yang telah disediakan dan kultur buatan sebelumnya. Prosedur pewarnaan gram yang dilakukan sama seperti pewarnaan gram yang telah dialkukan sebelumnya. Adapun fungsi-fungsi penambahan warna pada pewarnaan bakteri gram yakni, pewarna ungu Kristal ditambhakan sebagai pemberi warna awal, yodium ditambahkan untuk memperkuat ikatan pada dinding sel sehingga warna yang dilihat dapat terlihat lebih jelas, alkohol ditambahkan sehingga pada bakteri gram negative yang mengandung polipeptida, lipid terekstraksi dari dinding sel, pori-pori mengembang dan kompleks ungu Kristal dan yodium (UK-Y) keluar dari sel, sehingga sel menjadi tidak berwarna, sedangkan pada bakteri gram positif dinding selnya mengalami dehidrasi, pori-pori menciut, daya rembes sensing sel dan membrane menurun sehingga kompleks UK-Y tidak dapat keluar dari sel, sehingga sel tetap berwarna ungu. Terakhir yaitu pewarna safranin yang memberikan kompleks warna merah pada bakteri gram negative sehingga bakteri gram negative menjadi berwarna merah sedangkan pada bakteri gram positif pewarna safranin tidak berpengaruh sehingga bakteri gram positif tetap berwarna ungu. Setelah dilakukan pewarnaan gram dan diamati pada mikroskop, bakteri yang teramati dari kultur murni ialah berbentuk basil dan berwarna merah muda sehingga dapat dikatakan terdapat bakteri e-colli, sedangkan pada kultur dari sampel air selokan bakteri yang teramati
berbentuk kokus dan bewarna merah muda sehingga dapat dikatakan air sampel tidak mengandung bakteri e-colli. SIMPULAN Berdasarkan praktikum uji kualitas air dengan metode MPN (Most Probable Number) diperoleh hasil yakni air sampel yang berasal dari air selokan tidak mengandung bakteri e-colli. Metode MPN (Most Probable Number) untuk uji kualitas air saat praktikum menggunakan Coliform sebagai indikator. Kelompok Coliformmencakup bakteri yang aerobic dan anaerobic fakultatif, berbentuk batang atau basil, gram negative dan tidak membentuk spora. Coliform memfermentasikan laktosa dengan membentuk asam dan gas CO2 dalam waktu inkubasi selama 48 jam dan diletakkan pada suhu 37ºC. Uji yang dilakukan pada metode ini ialah uji penduga dan uji penguat. Uji penduga dilakukan dengan menginkubasi air sampel yang telah dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang berisi medium Lactose Broth dan tabung Durham, hasil yang diperoleh yakni pada tabung reaksi -1 -2 -3 10 , 10 , dan 10 terbentuk gelembung pada tabung durham yang mengindikasikan adanya Coliform pada sampel aquades dan air sungai. Uji selanjutnya ialah uji penguat, uji ini dilakukan pada medium BGLB (Brilliant Green Lactose Broth). Larutan sampel pada tabung reaksi yang telah diinkubasi selama 48 jam pada suhu 37ºC diambil dengan jarum ose dengan cara dicelupkan lalu dioleskan ke dalam medium BGLB , uji positif dapat dilihat dari terbentuknya warna hijau metalik atau tidak. Hasil praktikum menunjukkan bahwa pada uji penguat hasil yang diperoleh positif karena terbentuk warna hijau metalik pada BGLB. BGLB berfungsi sebagai penghambat pertumbuhan flora mikroba yang tidak diharapkan. Media BGLB merupakan media yang akan berwarna hijau metalik jika terdapat reaksi fermen dengan media. Warna ini berasal dari adanya koloni koliform yang bereaksi dengan BGLB. Eschercia coli merupakan bakteri fermentasi, seringkali menghasilkan warna hijau metalik mengkilap. Bakteri yang menfermentasi dengan lambat akan menghasilkan koloni berwarna merah muda. Sesuai hasil pengamatan, pada medium BGLB yang berisikan air sungai dengan nilai 190/100 ml air dan air galon dengan nilai 58/100 ml air. Pada medium EC yang berisikan air sungai dengan nilai 271/100 ml air dan air galon dengan nilai 20/100 ml air, dari kedua hasil pengamatan di atas dapat diketahui bahwa air tersebut tidak dapat dikonsumsi, karena menurut standar kesehatan, kualitas air yang bagus untuk dikonsumsi ialah air yang mengandung maksimal 10/100 ml air koloni bakteri patogen atau lebih baik lagi jika tidak terdapat bakteri patogen. Sesuai hasil pengamatan, dapat diketahui jumlah bakteri patogen untuk spesies Coliform yang lebih banyak terdapat di air galon karena kurang sterilnya alat penyaringan atau pemurnian air sehingga bakteri patogennya pun tetap terikut saat pengambilan air galon. Spesies bakteri Eschercia coli banyak ditemukan pada air sungai karena seperti yang kita ketahui air sungai merupakan salah satu tempat berbagai macam pembuangan seperti pembuangan sampah, pembuangan limbah, termasuk pembuan gan feses. Metode untuk menduga jumlah bakteri dalam suatu produk, dapat menggunakan metode hitungan mikroskopis, metode hitungan cawan dan penentuan angka paling memungkinkan (MPN). Organisme yang mati maupun hidup dapat dihitung dengan metode hitungan mikroskopis, akan tetapi pada MPN hanya organisme hidup yang dapat dihitung. Metode MPN
adalah metode untuk menghitung jumlah mikroba dengan menggunakan medium cair dalam tabung reaksi yang pada umumnya setiap pengenceran menggunakan 3 atau 5 seri tabung dan perhitungan yang dilakukan merupakan tahap pendekatan secara statisitik.
