Evani Nurbaeti 3A PMKL
Validasi Metode Analisis Mikrobiologi
• Definisi : Validasi Metode Analisis adalah proses pembuktian atau konfirmasi pengujian yang obyektif di Laboratorium, dan bahwa metode itu memenuhi persyaratan yang telah ditentukan, yang sesuai dengan tujuan penggunaannya
Tujuan : • Mengevaluasi kinerja metode : kepekaan, selektivitas, akurasi, presisi, dll., sekaligus menguji kelemahan dan keterbatasan metode • Menguji faktor-faktor yang dapat mempengaruhi kinerja metode dan mengetahui besarnya pengaruh itu terhadap hasil analisis • Melakukan verifikasi atau membuktikan kinerja metode analisis baku yang diadopsi/digunakan diadopsi/digunakan laboratorium laboratorium
Syarat : • Menggunakan instrumen dan peralatan yang terkalibrasi • Dilaksanakan oleh pesonel yang kompeten
Jenis Validasi Metode • Validasi primer dilakukan jika laboratorium laboratorium menggunakan metode analisis “baru” hasil pengembangan , atau metode yang di modifikasi terhadap suatu metode standard. • Validasi sekunder dilakukan untuk verifikasi, jika laboratorium menggunakan atau mengadopsi metode standard yang telah divalidasi.
Parameter Validasi metode analisis mikrobiologi • Akurasi – Kecermatan • Presisi ( repeatability, reproducibility reproducibility dan intermediate precision) – Keseksamaan
• Sensitivitas – Kepekaan • Selektivitas dan Spesifisitas • Linearitas • Rentang Hitung yang diterima ( acceptable ) (batas atas dan batas bawah dari rentang perhitungan) • Robustness (Ketangguhan) metode
Pedoman Validasi • The United States Pharmacopeia (USP) 27, 2004 • International Conference on Harmonization, 1996 • Method Validation of Microbiological Methods, guidance note : C & B and ENV 002, Singapore Accreditation Council, July 2002. • Water quality – Guidance on Validation of Microbiological Methods, Technical Report, ISO/TR 13843 : 2000. • Procedure for The Estimation and Expression of Measurement Uncertainty in Chemical Analysis, Nordic Committee on Food Analysis, NMKL, No.5, 1997. • APHA Standard methods for the Examination of Water and Wastewater, 20th ed., 1998.
Metode Analisis Mikrobiologi • Kualitatif : Uji langsung terhadap mikroba indicator Metode kultur untuk identifikasi makroskopik dan mikroskopik Metode alternatif ( Dye-reduction Test, Electrical Methods, ATP Determination) Metode Cepat deteksi mikroba spesifik dan toksinnya (metode imunokimia, metode biologi molekuler) • Kuantitatif : Angka Lempeng Total ( Total Plate Count ) MPN (Most Probable Number) Uji potensi antibiotik Uji sterilitas
Uji koefisien fenol (uji desinfektan dan antiseptik) Uji efektivitas pengawet
Tahap Persiapan Validasi Sebelum validasi dilakukan, hendaknya laboratorium menyediakan atau menyiapkan beberapa hal : 1. Mikroorganisme target atau acuan (lihat SR-02 : persyaratan tambahan untuk akreditasi laboratorium, Pengujian Kimia dan Biologi SNI 17025, DP.01.16, Januari 2004) 2. Peralatan dan Instrumen ukur yang telah dikalibrasi 3. Personel yang kompeten 4. Program Statistika untuk menghitung, mengevaluasi dan menginterpretasikan hasil pengujian
Akurasi (Kecermatan) Definisi : • Akurasi adalah kemampuan metode untuk mengukur dan mendeteksi nilai actual atau nilai sebenarnya dari mikroorganisme target dalam sampel • Akurasi merupakan ukuran ketepatan atau kedekatan hasil pengujian dengan hasil yang sebenarnya.
Presisi (Keseksamaan) Definisi • Presisi adalah tingkat kesesuaian antara hasil pengujian individual dengan hasil rata-rata pengujian berulang pada sampel yang homogen dengan kondisi pengujian yang sama • Presisi : keterulangan ( Repeatability ), ketertiruan (reproducibility ), keseksamaan antara (intermediate precision)
Sensitifitas dan Spesifisitas
Definisi • Sensitifitas (Kepekaan) : Kemampuan metode untuk mendeteksi/mengukur mikroorganisme target dalam jumlah sekecil mungkin • Spesifisitas (Kemenjenisan): Kemampuan metode untuk mendeteksi/mengukur mikroorganisme tertentu secara cermat dan seksama dengan adanya mikroorganisme asing atau bahan/matriks lain.
Linearity (Kelinieran) (untuk penetapan potensi antibiotika) Definisi • Keliniearan adalah kemampuan metode analisis yang menunjukkan bahwa larutan sampel yang berada dalam rentang konsentrasi memiliki respon analit yang proporsional dengan konsentrasi, secara langsung ataupun melalui transformasi matematika Cara pengujian • Kurva baku disiapkan dan dianalisis 3 kali dengan konsentrasi antara 50 – 150% kadar aktual (FDA), untuk penentuan kadar dalam sampel, tiga larutan baku digunakan : 80, 100 dan 120% konsentrasi target
Robustness (Ketangguhan) metode • Pengujian Ketangguhan sebenarnya harus dilakukan pada saat fase pengembangan metode dan tergantung pada faktor-faktor yang berpengaruh pada pengujian • Jika pengujian sangat peka terhadap perubahan dalam kondisi analisis,maka kondisi pengujian hendaknya dikendalikan atau dilakukan dengan penuh kehatihatian • Jenis keragaman kondisi pengujian yang harus diperhatikan : – Stabilitas sampel – Pengaruh suhu inkubasi – Pengaruh waktu inkubasi – Kondisi aerobik atau anaerobik (untuk pengujian mikroba tertentu) – Pengaruh jenis media (nutrisi), dll
• Hasil pengujian dievaluasi secara Statistika menggunakan ANOVA atau Algoritma dari Yate
