Vectores de expresión Están diseñados para producir muchas copias de una proteína seleccionada en una célula huésped. Para usar este tipo de vector, el gen a expresar se clona en una secuencia de reconocimiento del sitio de clonación múltiple, múltiple, lo que sitúa el gen adyacente un promotor vírico (ej. T7) y un operador (ej. lac). Después de introducir los plásmidos recombinantes en la célula huésped, se induce la expresión añadiendo un inductor gratuito al medio, lo que activa el gen produciendo grandes cantidades de la proteína codificada. El vector de expresión pET es un sistema que utiliza una célula huésped modificada genéticamente. La célula huésped contiene el gen vírico de la RNA polimerasa T7 bajo control del promotor y del operador lac , lo que hace que sea inducible con el IPTG. Este sistema combina un promotor fuerte con una regulación muy estricta. Utiliza como gen selectivo al gen de resistencia a la ampicilina.
Vectores de clonación Plásmido Proceden de moléculas de DNA extracromosómico que se encuentran de de manera natural, se replica de manera autónoma dentro de las células bacterianas. Permiten la producción de muchas copias de DNA. Uno de estos plásmidos es pUC18 que tiene como característica : Es pequeño de alrededor de 2686 pb, tiene un origen de replicación, puede producir hasta 500 copias, un sitio de múltiple clonación, un gen reportero lacZ y un gen selectivo Amp selectivo Amp.. Generalmente transportan hasta 10 kb.
Fago Para ser utilizado el tercio central del cromosoma puede ser reemplazado por el DNA foráneo, sin que ello afecte la capacidad del fago de infectar células y formar calvas. Los vectores de λ recombinantes
se empaquetan in vitro en las cápsides proteicas del fago, y se introducen en células huésped bacterianas. Dentro de las bacterias, los vectores se replican y forman muchas copias del fago infectivo, lisan las células huésped bacterianas formando muchas claras en las placas conocidas como calvas, de las que se puede recuperar el DNA clonado. Los vectores fágicos pueden transportar insertos de hasta 20 kb. No transportan insertos pequeños.
Vectores en Procariontes
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Cósmidos Son vectores híbridos construidos utilizando partes del cromosoma de lambda y de plásmidos. Los cósmidos contienen la secuencia cos del fago lambda, necesaria para el empaquetamiento del DNA del fago dentro de la cubierta proteica, y secuencias plasmídicas necesarias para la replicación. También requieren genes resistentes a antibióticos de origen plásmidicos, que ayudan a identificar las células células huésped que contienen los cósmidos recombinantes. Después de insertar los fragmentos de DNA, los cósmidos recombinantes se empaquetan en la cápside proteica lambda para formar partículas infectivas. Dentro de la célula huésped bacteriana, el cósmido se replica como un plásmido. Los cósmidos pueden transportar casi 50 kb de DNA. El cósmido pjB8 contiene un origen bacteriano, una sola secuencia cos, gen de resistencia a la ampicilina amp y una región que contiene sitios de clonación múltiple. Puesto a que este vector es pequeño puede aceptar segmentos de DNA exógeno de 33 a 46 kb de longitud.
Cromosomas artificiales bacterianos Estos vectores tienen una gran capacidad de clonación de hasta 300 kb, denominado cromosoma artificial bacteriano (BAC), basado en el plásmido de fertilidad (factor F) de bacterias. Estos vectores tienen genes de replicación y número de copias del factor F, e incorporan al menos un marcador de resistencia a antibióticos y un sitio de clonación multiple con diversas secuencias de reconocimientos reconocimientos para enzimas de restricción. Adémas esta flanqueado por regiones promotoras que pueden utilizarse para generar moléculas de RNA y expresar el gen clonado. pBAC 108L Es un BAC con diversos sitios sitios de restricción únicos para la inserción de DNA exógeno. Las marcadas como T7 y Sp6 son regiones promotoras que permiten la expresión de los genes clonados entre estas regiones.
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YAC
Plásmido Ti
Retrovirus
Mediado por transposones
cromosomas artificiales de “YAC” (yeast artificial chromosome) un YAC tienen telómeros en sus extremos, un origen de replicación autónomo ARS y un centrómero. Estos componentes están unidos a genes marcadores de selección y un grupo de secuencias de reconocimiento de enzimas de restricción para insertar DNA exógeno. El tamaño de los cromosomas de levadura va de 230 kb a más de 1900 kb, lo que permite clonar insertos de DNA de 100 a 1000 kb. El cromosoma artificial pYAC3 contiene secuencias teloméricos TEL, un centrómero CEN, procedente del cromosoma del cromosoma 4 de levadura y un origen de replicación ori. TRP1 y URA3 son genes de levadura que sirven de marcadores de selección para los brazos izquierdos y derecho del cromosoma. Sitios de restricción SUP4. BamH1 flanquea un segmento espaciador. El corte con SnaB1 y BamH1 rompe el cromosoma artificial en dos brazos.
La transferencia de genes a plantas superiores utiliza vectores plásmidicos de Agrobacterium tumifaciens infecta las plantas y produce tumorales (denominadas agalla de la corona) en muchas especies de plantas. La formación de los tumores se asocia a la presencia de un plásmido inductor de tumores (Ti) un segmento del plásmido conocido como T-DNA, transfiere genoma. T-DNA contiene genes que controlan la formación del tumor y la síntesis de moléculas necesarias (genes exógenos). Al quitarle la región T, ya no causará la enfermedad, pero servirá como vector, este es conocido como: plásmido Ti. A este se le agregan genes de resistencia (gen selectivo). Y se hace crecer en tejidos meristemáticos.
Un vector retroviral consiste en secuencias províricas que contiene el gen de interés, para permitir la incorporación de ambos en las células diana (células animales). El vector también contiene promotores de genes virales y celulares, tales como el promotor de CMV, para potenciar la expresión del gen de interés en las células diana. Cuenta con enzimas como: la retrotranscriptasa y la que inserta el material genético (Integrasa). Ya que no se sabe donde se inserta el material genético representa un problema Por lo tanto se han desarrollado dos estrategias: Entrega directa, consiste en que las partículas virales con el material terapéutico y se inyecta directamente al paciente. Entrega basada en células, se hace un explante, tomar los tejidos del organismo, luego se transforman las células y ya transformadas, se vuelven a inyectar al paciente.
Un segmento del DNA puede saltar de una zona a otra del genoma, dicho segmento se llama transposón o elemento genético transponible. El gen que codifica para la enzima transpososasa, que hace la transposición, es la que logra que el elemento P se pase de un lado a otro, el gen se ubica en el plásmido helper. El vector que acompaña al vector helper debe tener los extremos del elemento p y en medio se puede poner genes de interés.
Los
levadura
Vectores en Eucariontes
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Después de que ambos plásmidos son inyectados la transpsosasa corta en los sitios P e integra la secuencia al azar en el DNA.
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Trasfección de celulas Químicos Mediado por liposomas: En un reactivo de lipofección, dentro de la bicapa de fosfolípidos se envuelve el material genético que se desea insertar, estos liposomas van a entrar por endocitosis y con esa endocitosis al degradarse la pared celular para liberar el material genético. Gradiente de calcio: Crea un gradiente de concentración para estas moléculas, por lo que tienen el potencial para difundirse hacia el interior de la célula
Físicos Transferencia de genes por lasser: El lasser mediante un electrodo altera la diferencia de potencial de la célula y eso hace que esta para recobrar su potencial abra canales. Biobalistica El tejido vegetal es tratado con celulasas y degradar la pared celular y que solo quede el protoplasto. Una partícula de Au se rodea del DNA que se quiere insertar. Y por afinidad de cargas va a estar unido, y mediante una pistola de partículas, se meterán a las células por bombardeo. Microinyección: Consiste en introducir el material genético directamente al núcleo de la célula. Electropolación: Consiste en provocar un aumento significativo de la conductividad eléctrica y la permeabilidad de la membrana plasmática celular mediante un campo eléctrico aplicado externamente.
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Biológicos Virus Al quitar los genes que causan la virulencia se remplazan por los genes exógenos de interés. Para que estas células entren con una célula diana tienen que tener el mismo receptor de la célula diana y se inyecta el material genético de interés.
