Centro Azúcar 2/2001
Determinación de azúcares reductores en miel final por Cromatografía Líquida de Alta Resolución
Lourdes Casas Cardoso, Vladimir Cabrera Díaz, Raúl Fajardo García; Facultad de Química y Farmacia, UCLV Recibido: octubre/2000 Aprobado: febrero/2001
Se describe un método de Cromatografia Líquida de Alta Resolución (HPLC) que permite cuantificar los azúcares reductores reductores (glucosa y fructosa) en las mieles finales. Para ello fue necesario realizar una reacción de derivatización en la que se utilizó como reactivo el clorohidrato de fenilhidracina. Luego se procedió a seleccionar las condiciones de trabajo, para lo cual se eligió una columna RP-18 y una mezcla de acetonitrilo: agua (40:60), como fase móvil. El sistema de detección utilizado fue un detector de fotodiodos a la longitud de onda de 370 nm. Mediante el uso del HPLC del HPLC se se observaron diferencias significativas en rerlación con los resultados obtenidos por métodos convencionales convencionales.. Palabras claves: Azúcares reductores, reductores, Cromatografía Líquida de Alta Resolución A High Performance Liquid Chromatography Chromatography method allowing quantification of the glucose and fructose present in finals sugar cane syrup, is described in this paper. These substances were eluted for RP-18 column using acetonitrile with water (40:60) and detected UV-VIS spectrophotometrically by pre-column derivatization with chlorohidrate of fenilhydrazine. Through Through this method, the deviation of values obtained with conventional methods can be readily observed. Key words: Sugar reducers, High Performance Liquid Chromatography
INTRODUCCIÓN La sociedad moderna tiene la necesidad de fomentar la producción de los alimentos llamados orgánicos, que no son otra cosa que productos obtenidos sobre la base de una agricultura orgánica, en la que toda la agrotecnia es natural y por lo tanto no se utilizan fertilizantes químicos ni herbicidas, sino abonos orgánicos, control de plagas por vía biológica y laboreo con preservación del medio. En los últimos años en algunos países se ha comenzado la producción de azúcar orgánica, la que ha alcanzado precios elevados en comparación con el precio del azúcar crudo normal.
En la Universidad Central “Marta Abreu” de Las Villas, el Centro de Estudio de Termoenergética Termoenergética Azucarera (CETA) opera la Planta Piloto Pil oto “José Martí” que produce azúcar orgánica, por lo que es necesario establecer un riguroso control del azúcar que se obtiene allí para garantizar la calidad del producto, pero no siempre se dispone de las técnicas más confiables para cumplir con este control. La presencia de azúcares reductores libres afecta la calidad del azúcar crudo y de la melaza, pues en general y bajo determinadas condiciones, sufren transformaciones hacia compuestos no asimilables en mucho mayor grado que los disacáridos. 4,5
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Conocer la concentración de los azúcares reductores contribuye a evaluar los diferentes productos y subproductos dentro del proceso fabril, por lo que es necesario contar con técnicas analíticas de elevada exactitud, precisión y sensibilidad para su cuantificación; más aún si se tiene en cuenta que se trata de alimentos orgánicos en los que es mucho más riguroso el control de la calidad.
fenilhidracina. Para ello se coloca una muestra de 0,2 g de glucosa y fructosa patrón, respectivamente, en dos tubos de ensayo. A cada uno se añade 0,2 g de clorohidrato de fenilhidracina, 0,3 g de acetato de sodio y 2 mL de agua destilada. Se tapan los tubos con tapones agujereados y se colocan juntos en un cubilete con agua hirviente. Bajo esas condiciones la osazona de la fructosa precipita en 2 minutos y la de la glucosa en 4 ó 5 minutos. Después se sacan del agua caliente a los 30 minutos y se enfrían a temperatura ambiente.
Los métodos cromatográficos son en la actualidad una herramienta imprescindible para la determinación rápida y específica de azúcares. Esto supone una notable mejora frente a los análisis tradicionales donde las interferencias presentes en la matriz y el consumo elevado de tiempo suponen serios inconvenientes.
Para comprobar la formación del derivado se toma una alícuota de 10,0 µL y se aplica sobre una placa de silicagel (de 5x5 cm), previamente activada. Esta se introduce en una cámara cromatográfica que contiene al eluyente, cloroformo/metanol/agua en proporción 10:10:1 y que se encuentra saturada con sus vapores.
La Cromatografia Líquida de Alta Resolución (HPLC) es una técnica que se ha venido usando en la industria azucarera por más de una década. Esta técnica permite la separación, identificación y estimación cuantitativa del azúcar presente en un rango de productos de la casa azucarera, tales como: jugo de caña de azúcar, jarabe, azúcar crudo y melaza.
Las determinaciones analíticas se realizan en un cromatógrafo líquido de alta resolución, marca Knauer con un detector espectrofotométrico de fotodiodos de la firma LKB, modelo 2140, dotado de 180 fotodiodos. Se utiliza una columna de octadecilsilano ODS 2 Spherisorb ODS 2, a 25 0C (15 cm x 0,46 mm de d.i. y 5 µ m de diámetro de las partículas del relleno), que son, sin dudas, las de mayor uso en la actualidad. Como fase móvil se emplea una mezcla de acetonitrilo:agua en proporción 40:60, y con una velocidad de flujo de 0,2 mL/min.
Para utilizar el HPLC con fase reversa (RP-18) y detector UV-VIS, es necesario realizar una previa derivatización de los azúcares por reacción primaria. Al menos se requiere un grupo metoxi u otro menos polar para que la selectividad se vuelva importante. Existe una gran variedad de métodos que se han desarrollado para la determinación de monosacáridos, 1,2,3 los cuales permiten su análisis en diferentes matrices complejas, con el empleo de fases móviles acuosas, en presencia de acetonitrilo como modificador.
Se realizan, además, determinaciones de reductores por el método de Eynon-Lane, que es la técnica que se utiliza a diario en los centrales, con el objetivo de compararlas con los resultados obtenidos por HPLC.
En este trabajo se describe un método por Cromatografía Líquida en Fase Reversa (RPHPLC) que permitió cuantificar los azúcares reductores presentes en las mieles finales de la Planta Piloto “José Martí” de la UCLV.
El análisis estadístico de los resultados se efectuó utilizando el SPSS .
MATERIALES Y MÉTODOS
Debido a las condiciones de equipamiento existentes (columna RP-18 y detector UV-VIS) es imprescindible derivatizar los azúcares para poderlos analizar por HPLC. El clorohidrato de
La derivatización pre-columna se realiza utilizando como reactivo el clorohidrato de
DISCUSIÓN DE LOS RESULTADOS
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fenilhidracina presenta el inconveniente de que los dos reductores a determinar: glucosa y fructosa, forman la misma osazona. Sin embargo, el estudio de la mezcl a de reacción por Cromatografía de Capa Delgada (CCD) permite corroborar que dicha reacción es cuantitativa, ta l como se muestra en el cromatograma que aparece en la figura 1. Figura 1. Cromatrograma
La reacción de formación del derivado es la siguiente:
H
H C H C
O OH
+ 3 C 6H5 NHNH2
R
C
N
NHC 6 H5
C
N
NHC 6 H5
+ NH3 + C 6 H 5 NH 2 + 2 H2O
R
La tabla 1 muestra los cromatogramas obtenidos, bajo las condiciones cromatográficas descritas, para una muestra de glucosa y fructosa derivatizada.
En ambos derivados se observa un pico a un tiempo de retención de 7,9 minutos con una altura muy superior al pico de 1,7 minutos que aparece en el cromatograma de la glucosa. Al analizar las características cromatográficas del pico de 7,9 minutos para los dos derivados, se observa que presentan la misma simetría y ancho en la semialtura. Al enriquecer el derivado de glucosa con el de la fructosa se obtuvo un cromatograma cuyo pico a 7,9 minutos coincidía con las características cromatográficas anteriormente descritas, con la diferencia de que su altura era aún mayor. También se comprobó que el espectro correspondiente a ese pico es similar al espectro que se le realizó a la osazona en el espectrómetro UV-VIS . De todo este análisis cualitativo se infiere que este pico se corresponde con el derivado.
Tabla 1. Resultados obtenidos de los cromatogramas de glucosa y fructosa derivatizadas
Estudio sobre algunos parámetros de validación de la técnica HPLC
Con el objetivo de seleccionar la longitud de onda de trabajo para la técnica de HPLC se realizó un espectro a este derivado en la región comprendida entre 190–420 nm, utilizando para ello un espectrofotómetro UV-VIS VITROSPEC III modelo 80. 2097-62 LKB. Este espectro presenta dos máximos de absorción, uno a 270 nm y el otro a 370 nm, siendo este último el de mayor intensidad, por lo que se escoge esa longitud de onda para realizar las determinaciones.
Análisis de los derivados obtenidos
Linealidad
Los datos obtenidos de la curva de calibración para los 2 reductores bajo estudio aparecen en la tabla 2: 19
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Tabla 2. Resultados de la curva de calibración de la glucosa y fructosa respectivamente
f: factores respuesta h: altura del pico
En la tabla 3 se observa que las ecuaciones estimadas para los derivados de la glucosa y fructosa presentan coeficientes de correlación de 0,999, lo que refleja el grado de relación entre las variables concentración y altura. Tabla 3. Resultados obtenidos del procesamiento estadístico con ayuda del SPSS
proporcionalidad. Esto se verifica, ya que la probabilidad de la sig de t es mayor que 0,025, en ambos casos.6 Al examinar el valor del intercepto (a) y el de la pendiente (b) para la recta de regresión del derivado de la fructosa, se observa que están comprendidos respectivamente dentro de los límites de confianza de la curva de regresión que corresponde al derivado de la glucosa. Este resultado es lógico, ya que ambas rectas de calibración son estadísticamente idénticas, pues, aunque se partió de diferentes azúcares, el proceso de derivatización conduce al mismo producto. Además, estas rectas de calibración fueron efectuadas con el mismo procedimiento analítico y con series de concentraciones similares. Precisión Repetibilidad del método
En la tabla 4 se muestran los resultados obtenidos al repetir el análisis, este procedimiento incluye todo el tratamiento, desde la preparación hasta la lectura instrumental.
Ambas ecuaciones cumplen con el test de linealidad, ya que los valores de probabilidad de la significación de b son menores que 0,025. El CVf es menor que el 5 %, para ambas curvas, lo que indica que los factores respuesta son cercanos entre sí y cercanos al valor de la pendiente. Además, el Sb relativo es menor que el 2 % para las dos curvas.
Tabla 4. Parámetros estadísticos del estudio de la repetibilidad del método
Los límites de confianza del término independiente de cada recta incluyen al cero, por lo que se cumple la condición de 20
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Teniendo en cuenta que el método analítico requiere un tratamiento previo de la muestra, además de ser una matriz compleja, consideramos que el C.V. es adecuado. Este valor es < 3 %, que es el criterio establecido según lo reportado en la literatura.6
Tabla 6. Resultados obtenidos por el método HPLC y Eynon-Lane en miel final
Reproducibilidad del método
En la tabla 5 se expresan los resultados obtenidos del análisis en días diferentes. Tabla 5. Parámetros estadísticos del estudio de la repetibilidad del método
El análisis del C.V. obtenido es < 5 %, lo que permite inferir que la reproducibilidad del método es adecuada. Teniendo en cuenta los resultados del estudio de precisión se considera que el método es preciso.
Al analizar los resultados obtenidos por ambos métodos de análisis se ha encontrado que existen diferencias significativas entre ellos. La causa de estas diferencias radica en que existen interferencias en la matriz que no se eliminan antes de emplear el método de Eynon-Lane. La técnica de RP-HPLC no presenta estos inconvenientes, y aunque el equipamiento es muy caro en comparación con los métodos tradicionales que se utilizan en los Complejos Agro Industriales azucareros, no se debe perder de vista que en este caso se está trabajando con productos orgánicos, donde el control del proceso debe ser muy riguroso.
Exactitud
Se realizó un Test de student para determinar si el valor medio hallado en 10 réplicas y el valor verdadero difieren significativamente para un nivel de significación del 5 %. Al realizar el procesamiento la sig t (0,607), resultó ser mayor que 0,025, cumpliéndose así con el parámetro de exactitud.
Análisis de muestras reales
Según las condiciones de trabajo previamente seleccionadas, y teniendo en cuenta el cumplimiento de algunos de los parámetros de validación estudiados, se aplicó esta técnica a la determinación de reductores en miel final. El método de cuantificación empleado fue el del patrón externo. Los resultados obtenidos por este método y por Eynon-Lane se muestran en la tabla 6. 21
CONCLUSIONES 1. Se comprobó por CCD que el clorohidrato de fenilhidracina puede ser utilizado en la derivatización de los azúcares reductores para su posterior determinación por RPHPLC con detector espectrofotométrico. 2. La técnica propuesta para el análisis de azúcares reductores (fructosa y glucosa) en las mieles finales, cumple con los parámetros de linealidad y precisión. 3. Las diferencias que existen entre los valores reales y los determinados por la técnica convencional, muestran la necesidad de encontrar, para quienes no poseen HPLC, técnicas alternativas de análisis rutinario con menor error.
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FUENTES DE INFORMACIÓN CONSULTADAS . 1. Díaz, H. F.: “Determinación de sacarosa, glucosa y fructosa en jugo de caña de azúcar por HPLC ”, Revista Industrial y Agrícola de Tucumán , 69 (1-2): 87-92, 1992. 2. Jansen, Ch.: “New Developments in HPLC of Carbohydrates Mono-and Disaccharides”, Chemical Abstract, Labor Praxis, 13(1/2) , 56, 58-60 (German) 1989, Section:80 (Organic Analytical Chemistry). 3. Sorensen, Susanne H. et al.: “A novel HPLC Method for the Simultaneous Quantification of Monosaccharides and Disaccharides Used in Tests of Intestinal Function and Permeability”, Chemical Abstract, Clin. Chim. Acta, Section: 9 (Biochemical Methods) 221(1-2): 115-25 (English), 1993. 4. Otero, M.A.; A.Torres; A. Reyes: “Efecto inhibitorio de las melanoidinas sobre el crecimiento de Candida utilis” en 2do Seminario Internacional de Azúcar y Derivados de la caña, La Habana, abril 10-13, 1990. 5. Trudgill, P. W.: “The Microbial Metabolism of Furans” en Microbial Series Microbial Degradation of Organic Compounds , p. 295, ed. P.W. Trudgill, Elsevier Publishers, London, 1984.
X Simposio de Ingeniería Eléctrica: SIE 2001 Del 10 al 12 de mayo, en la Universidad Central «Marta Abreu» de Las Villas, en Santa Clara, Cuba Temáticas: Automatización: Instrumentación. Sistemas distribuidos de medición y control. Teoría y métodos de control. Aplicaciones de inteligencia artificial. Optimización energética de instalaciones. Robotica. Electrónica: Instrumentación electrónica. Ingeniería biomédica. Equipos médicos. Procesamiento digital de señales. Audio, televisión y vídeo, ASIC´s. Telecomunicaciones: Redes de comunicaciones. Sistemas de transmisión y comunicación telefónica. Comunicaciones móviles y personales. Radiopropagación y antenas, Comunicaciones vía satélite. Electroenergética: Máquinas eléctricas. Accionamiento eléctrico. Sistemas eléctricos de potencia Protecciones eléctricas. Sistemas de energía no convencional y alternativas. Instalaciones eléctricas industriales. Enseñanza asistida por computadoras: Aprendizaje automático. Multimedia. Hiperlibros. Universidad Virtual Cuota de inscripción: 150,00 USD. Se pagará en el momento de la ac reditación en el evento. Comité organizador: Dr. Francisco Herrera Fernández Teléfono: (53) (422) 81632 FAX: (53) (422) 81608
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