BAB II TINJAUAN PUSTAKA
A. Prinsip Prinsip dan Te Teori Elektro Elektrofore foresis sis
Elektrofore Elektroforesis sis adalah metode pemisahan pemisahan berdasarkan berdasarkan perbedaan mobilitas mobilitas analit menunjukkan dalam medan listrik diterapkan. metode elektroforetik dapat diterapkan untuk pemisahan dari suatu sampel dengan variety luas, termasuk protein, asam nukleat, asam amino amino dan karboh karbohidr idrat. at. pemisa pemisahan han dapat dapat dilaku dilakukan kan pada pada analis analisis is serta serta skala skala prepar preparati atif. f. keuntungan utama atas metode khromatografi cair adalah efisiensi yang lebih tinggi dari pemisahan elektroforesis. ele ktroforesis. hal ini terutama berlaku bagi molekul besar.(Andreas Manz, et.al, 2!" Elektro Elektrofor foresis esis adalah adalah perger pergeraka akan n partik partikel el bermuat bermuatan an listri listrik k atau atau moleku molekull dalam dalam medium konduktif di ba#ah pengaruh medan listrik diterapkan. media konduktif biasanya buffer berair, juga disebut sebagai elektrolit atau run penyangga. campuran analit dimasu dimasukka kkan n ke dalam dalam medium medium yang yang mengan mengandu dung ng jangka jangka penyang penyangga ga dan medan medan listrik listrik diterapkan. $alam contoh yang ditunjukkan pada gambar 2.! campuran analit mengandung molekul bermuatan negatif. berdasarkan atas permohonan dari medan listrik, anion mulai bergerak menuju elektroda positif (anoda". perbedaan muatan dan ukuran menyebabkan mobilitas yang berbeda dan dengan demikian pemisahan komponen sampel yang berbeda. sama, sama, ion bermua bermuatan tan positi positiff berger bergerak ak menuju menuju katoda katoda dalam dalam medan medan listrik listrik ditera diterapka pkan. n. (Andreas Manz, et.al, 2!"
1
%ambar. 2.!. &rinsip &emisahan Elektroforesis (Andreas Manz, e t.al, 2!" &emisahan elektroforesis dapat dilakukan dalam larutan bebas atau dalam larutan yang mengandung matriks non'konduktif seperti agarosa atau poliakrilamid gel. gratis pemisahan berbasis solusi, capilaries bore sempit digunakan. pemisahan ion analit terjadi karena perbedaan dalam mobilitas, perbedaan yaitu di tuntut untuk rasio ukuran. dua analit hanya dapat dipisahkan jika mereka memiliki biaya yang berbeda untuk rasio ukuran. pemisahan analit dalam gel juga didasarkan pada perbedaan dalam mobilitas. tambahan, gel memiliki efek pemisahan. compoundes besar terbelakang lebih dari senya#a yang lebih kecil. ini berarti bah#a dalam elektroforesis gel dua senya#a dengan biaya dua rasio ukuran yang sama dapat dipisahkan selama mereka berbeda dalam ukuran. (Andreas Manz, et.al, 2!" Elektroforesis adalah teknik pemisahan komponen atau molekul bermuatan berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah medan listrik. ecara luas teknik ini diklasifikasikan dalam tiga kelompok yakni elektroforesis free boundary, elektroforesis #ilayah dan elektroforesis kontinu ()opkar, 2*". &rinsip elektroforesis, jika suatu fase zat bermuatan, diberi beda potensial, fase tersebut akan berpindah sepanjang medium yang kontinu ke arah katoda atau anoda sesuai dengan muatan partikel. $asar elektroforesis adalah pembentukan suatu ketidakhomogenen
2
atau gradasi konsentrasi sepanjang sistem. )oloid, protein enzim menunjukan mobilitas elektroforesis spesifik dan titik isoelektrik yang dapat digunakan untuk identifikasi zat'zat spesifik. &emisahan dapat dilakukan bila senya#a'senya#a yang telah terpisah tidak secara spontan bercampur kembali akibat serkulasi konvektif. )eterbatasan elektroforesis free boundry dapat diatasi secara parsial dengan melakukan kromatografi pendahuluan sebelum proses elektroforesisnya sendiri. +ni dilakukan dengan mencampurkan larutan buffer dan memvariasikan konsentrasi non elektrolit yang larut, kemudian biarkan menyerap vertikal pada tabung elektroforesis yang akan digunakan, sehingga terbentuk gradien perbedaan kerapatan akibat gravitasi. $i pihak lain bila perpindahan elektroforesis dilakukan pada suatu medium berpori, #ilayah perpindahannya tidak dipengaruhi oleh gradien kerapatan dan temperatur. &ada medium tersebut aliran cairan dalam tabung berbanding terbalik terhadap kuadrat dari jari'jari penampang melintang tabung. )ertas saring, agar, kanji, gelatin, butiran'butiran kaca umumnya digunakan karena memiliki rongga'rongga kapiler. )ertas penyaringlah yang paling sering digunakan karena pemisahan yang sempurna dapat dilakukan dan mudah dikelola. &emisahan dapat dilakuakan baik horizontal maupun vertikal dan
interferensi
anomali
paling
kecil
pada
boundary.
&ada
umumnya
istilah
elektrokromatografi digunakan untuk pemisahan berdasarkan perbedaan transfor fisik zat terlarut yang bermuatan didalam medium kertas akibat pengaruh gradien potensial ()opkar, 2*". Metode pemisahan elektroforesis didasarkan pada interaksi partikel'partikel bermuatan oleh medan listrik. &artikel bermuatan listrik negatiaf akan bergerak kekutub positif (anoda". ebaliknya , partikel bermuatan listrik positif akan bergerak kekutub negative (katoda". ementara partikel netral tidak bergerak . adi medan listrik menyebabkan pemisahan pada metode elktroforesis. (umar -endayana, &h.$, 2"
3
/eknik ini dapat digunakan dengan memanfaatkan muatan listrik yang ada pada makromolekul, misalnya $0A yang bermuatan negatif. ika molekul yang bermuatan negatif dile#atkan melalui suatu medium, kemudian dialiri arus listrik dari suatu kutub ke kutub yang berla#anan muatannya maka molekul tersebut akan bergerak dari kutub negatif ke kutub positif. )ecepatan gerak molekul tersebut tergantung pada muatan terhadap massanya serta tergantung pula pada bentuk molekulnya. &ergerakan ini dapat dijelaskan dengan gaya 1orentz, yang terkait dengan sifat'sifat dasar elektris bahan yang diamati dan kondisi elektris lingkungan(icardson dkk. !3*"4 Efisiensi pemisahan elektroforesis diatur oleh dua faktor utama4 mobilitas elektroforesis analit dan aliran elektroosmosis (E56" dari solusi missal .(Andreas Manz, et.al, 2!" a. Mobilitas elektroforesis Mobilitas elektroforesis 7ep merupakan parameter spesifik untuk senya#a yang diberikan. menentukan dari kecepatan suatu senya#a dalam medan listrik diterapkan. senya#a dengan berbeda dapat dipisahkan satu sama lain. b. Efisiensi &emisahan dan esolusi Efisiensi dan resolusi pada pemisahan elektroforesis dipengaruhi oleh aliran elektroforesis
(E56".
mobilitasnyata
7appdarisuatu
analitditentukan
olehjumlah
darimobilitaselektroforetiknya7ep dan mobilitaselektroosmosis7 EOF .(Andreas Manz, et.al, 2!". Jenis – Jenis Elektroforesis
4
Metode elektroforesis merupakan salah satu metode pemisahan konvensional yang telah mengalami perkembangan teknik dan metode yang lebih canggih atau modern sebagai penyempurnaan
dari
metode
koinvensional
yang
sebelumnya. Adapun jenis'jenis
elektroforesis yang dikenal 2 (dua" kelompok teknik elektroforesis, yaitu4 a. /anpa ada pengemban padat atau matriks (Elektroforesis lapisan gerak 8 moving boundary" Misalnya Elektroforesis /iselius dimana penentuan mobilitas dan titik isoelektrik suatu protein. Molekul protein yang diselidiki ada diseluruh larutan dan posisinya sebagai fungsi #aktu. )ekurangan dari alat ini adalah mahal dan pemamfaatan kurang. b. $engan pengemban padat atau matriks seperti4 ' Elektroforesis 9one (Elektroforesis #ilayah" ' Elektroforesis )ertas ' Elektroforesis selulosa asetat ' Elektroforesis gel
!. Elektroforesis 9one (Elektroforesis :ilayah" Elektroforesis #ilayah, ada berbagai faktor yang mempengaruhi laju perpindahan elektroforesis #ilayah, faktor'faktor yang mempengaruhi pergerakan ion'ion adalah mobilitas ion, tipe resolusinnya, macam larutan buffernya, p- yang digunakan, kuat ion zat terlarut, temperatur, ada atau tidaknya fenomena elektroforesis atau elektroosmosis. Medium yang umum digunakan adalah kertas saring, selulosa, asetat, gel seperti kanji, poliakrelimida dan bubuk gel ()opkar, 2*". /ujuan dari teknik elektroforesis ini adalah untuk uji kemurnian preparat, penentuan komponen dalam campuran, penentuan bobot molekul, dan penentuan perubahan mobilitas atau konformasi. 2. Elektroforesis )ertas )isah teknik pemisahan $0A80A ini bera#al dari sekelompok ilmu#an biokimia di a#al tahun !3;'an yang sedang meneliti mekanisme molekular $0A80A hidrolisis. aat itu, tepatnya tahun !3;2, Markham dan mith mempublikasikan bah#a hidrolisis 0A
5
terjadi melalui mekanisme pembentukan zat antara (intermediate" posfat siklik, yang kemudian menghasilkan nukleosida 2<'monoposfat dan =<'monoposfat. /ernyata mereka menggunakan suatu peralatan yang dapat memisahkan komponen campuran reaksi hidrolisis tadi, salah satunya yaitu nukleotida >siklik? yang memba#a pada kesimpulan bah#a hidrolisis 0A terjadi melalui pembentukan intermediate posfat siklik. &eralatan itu dinamakan >elektroforesis>, yang dibuat dari kertas saring :hatman nomor =, sebuah tangki kecil dan berbagai larutan penyangga (buffer". 0ukleotida yang sudah terhidrolisis ditaruh di atas kertas saring, kemudian arus listrik dialirkan melalui kedua ujung alat elektroforesis. Arus listrik yang dialirkan ini ternyata dapat memisahkan campuran kompleks reaksi tadi menjadi komponen'komponennya, ini akibat adanya perbedaan minor antara struktur molekul 0A yang belum terhidrolisis, zat antara (intermediate" dan hasil reaksi (nukleosida 2<'monoposfat dan nukleosida =<'monoposfat" yang menyebabkan mobilitas alias pergerakan mereka pada kertas saring berbeda'beda kecepatannya. )arena pada akhir proses elektroforesis
komponen tersebut
terpisah'pisah, sehingga
dapat
mengisolasi
dan
mengidentifikasi setiap komponen tersebut. Elektroforesis kertas adalah jenis elektroforesis yang terdiri dari kertas sebagai fase diam dan partikel yang terlarut sebagai fase gerak, terutama ion'ion kompleks. &emisahan ini terjadi akibat adanya gradasi konsentrasi sepanjang system pemisahan. &ergerakan partikel dalam kertas tergantung pada muatan atau valensi zat terlarut, luas penampang, tegangan yang digunakan, konsentrasi elektrolit, kekuatan ion, p-, viskositas, dan adsorbsivitas zat terlarut. =. Elektroforesis /irai (elektroforesis kontinu", Elektroforesis kontinu yaitu suatu elektroforesis yang dilakukan secara kontinu. uatu tirai dari kertas saring digunakan yang mana terendam dalam suatu larutan buffer.
6
uatu aplikator digunakan untuk meneteskan sampel. ampel masuk dalam aplikator dari suatu resevoir sampel. )edua ujung kertas saring dalam bentuk alur tercelup dalam dua ruang elektroda. $engan pemberian tegangan, partikel zat terlarut mulai bergerak dan komponen terpisahkan dalam berbagai permukaan. @. Elektroforesis %el (%E"
Elektroforesi gel merupakan salah satu teknik utama dalam biologi molekular. &rinsip dasar teknik ini adalah bah#a $0A, 0A, atau protein dapat dipisahkan oleh medan listrik. $alam hal ini, molekul'molekul tersebut dipisahkan berdasarkan laju perpindahannya oleh gaya gerak listrik di dalam matriks gel. 1aju perpindahan tersebut bergantung pada ukuran molekul bersangkutan. Elektroforesis gel biasanya dilakukan untuk tujuan analisis, namun dapat pula digunakan sebagai teknik preparatif untuk memurnikan molekul sebelum digunakan dalam metode'metode lain seperti spektrometer massa, &, kloning, sekuensing $0A, atau immuno-blotting yang merupakan metode'metode karakterisasi lebih lanjut.
%el yang digunakan biasanya merupakan polimer bertautan silang ( crosslinked " yang porositasnya dapat diatur sesuai dengan kebutuhan. Bntuk memisahkan protein atau asam nukleat berukuran kecil ($0A, 0A, atau oligonukleotida", gel yang digunakan biasanya merupakan gel poliakrilamida, dibuat dengan konsentrasi berbeda'beda antara akrilamida dan zat yang memungkinkan pertautan silang (cross-linker ", menghasilkan jaringan poliakrilamida dengan ukuran rongga berbeda'beda. Bntuk memisahkan asam nukleat yang lebih besar (lebih besar dari beberapa ratus basa", gel yang digunakan adalah agarosa (dari ekstrak rumput laut" yang sudah dimurnikan.
$alam proses elektroforesis, sampel molekul ditempatkan ke dalam sumur ( well " pada gel yang ditempatkan di dalam larutan penyangga, dan listrik dialirkan kepadanya.
7
Molekul'molekul sampel tersebut akan bergerak di dalam matriks gel ke arah salah satu kutub listrik sesuai dengan muatannya. $alam hal asam nukleat, arah pergerakan adalah menuju elektrodapositif, disebabkan oleh muatan negatif alami pada rangka gula'fosfat yang dimilikinya. Bntuk menjaga agar laju perpindahan asam nukleat benar'benar hanya berdasarkan ukuran (yaitu panjangnya", zat seperti natrium hidroksida atau formamida digunakan untuk menjaga agar asam nukleat berbentuk lurus. ementara itu, protein didenaturasi dengan deterjen (misalnya natrium dodesil sulfat, $" untuk membuat protein tersebut berbentuk lurus dan bermuatan negatif.
etelah proses elektroforesis selesai, dilakukan proses pe#arnaan ( staining " agar molekul sampel yang telah terpisah dapat dilihat. Etidium bromida, perak, atau pe#arna Cbiru oomassieC (Coomassie blue" dapat digunakan untuk keperluan ini. ika molekul sampel berpendar dalam sinar ultraviolet (misalnya setelah Cdi#arnaiC dengan etidium bromida", gel difoto di ba#ah sinar ultraviolet. ika molekul sampel mengandung atom radioaktif, autoradiogram gel tersebut dibuat.
&ita'pita (band " pada lajur'lajur (lane" yang berbeda pada gel akan tampak setelah proses pe#arnaanD satu lajur merupakan arah pergerakan sampel dari CsumurC gel. &ita'pita yang berjarak sama dari sumur gel pada akhir elektroforesis mengandung molekul'molekul yang bergerak di dalam gel selama elektroforesis dengan kecepatan yang sama, yang biasanya berarti bah#a molekul'molekul tersebut berukuran sama. CMarkaC atau penanda (marker " yang merupakan campuran molekul dengan ukuran berbeda'beda dapat digunakan untuk menentukan ukuran molekul dalam pita sampel dengan meng'elektroforesis marka tersebut pada lajur di gel yang paralel dengan sampel. &ita'pita pada lajur marka tersebut
8
dapat dibandingkan dengan pita sampel untuk menentukan ukurannya. arak pita dari sumur gel berbanding terbalik terhadap logaritma ukuran molekul.
$0A dapat ditentukan ukurannya dengan melakukan migrasi didalam gel agarose atau gel poliakrilamid. Migrasi $0A didalam gel ini biasa disebut dengan elektroforesis. Bntuk dapat divisualisasikan, maka $0A yang ada di gel harus di#arnai dengan ethidium bromida kemudian dilihat diatas sinar B. $0A merupakan molekul bermuatan negatif, sehingga bila diletakkan di medan listrik, $0A akan bergerak (migrasi" dari kutub negatif ke kutub positif. &ergerakan kecepatannya tergantung dari 4 a b c
Bkuran molekul $0A )erapatan media gel yang dilalui $0A Arus listrik yang diberikan ebelum dilakukan elektroforesis, suspensi $0A harus dicampur dengan penyangga
muatan per#arna loading buffer (dye", yang berfungsi untuk 4 ! 2 =
Menambah densitas, sehingga $0A berada dibagian ba#ah dari sumur &er#arna untuk memudahkan meletakkan contoh $0A kedalam sumur. $apat bergerak ke arah anoda dengan laju yang dapat diperkirakan.
Manfaat elektroforesis gel antara lain untuk mengetahui ukuran fragmen $0A dari produk &, memisahkan produk $0A dari hasil digesti yang berbeda ukuran, kemudian di' seFuencing, dan juga untuk pemurnian atau purifikasi $0A. Elektroforesis dapat diaplikasikan untuk berbagai macam kegiatan sebagai berikut. a. Membandingkan gen homolog dari sspesies yang berbeda, mengetahui susunan sekuens berbagai genom b. $0A 6ingerprinting c. Mendeteksi kelainan genetik. d. Mendeteksi lokasi dan jumlah m0A dalam sel atau jaringan tertentu
9
e. Mengetahui aktivitas gen selama perkembangan berbagai tipe sel organisme atau percobaan perlakuan gen f. Mempelajari evolusi tingkat molecular g. Mengetahui variasi genetik yang ada di alam h. Menentukan atau mengidentifikasi berat molekul $0A, 0A, dan protein
i. j.
tertentu. Mengidentifikasi persamaan dan perbedaan genetik antar individu Mengetahui jumlah fragmen $0A yang diklon dalam rekombinan $0A
plasmid k. Menganalisa fragmen $0A yang diamplifikasi le#at &
Gel Media
Elektroforesis %el poliakrilamida termasuk salah satu elektroforesis yang umum digunakan selain elektroforesis gel Agarosa dan memiliki kelebihan yaitu 4 mudah atau cepat pengerjaanya, murah harganya, pemisahan suatu makromolekul biologic, biaya pemisahan yang sangat besar. Menurut tenesh dalam /itra#ani (!33" teknik elektroforesis dapat dibedakan menjadi dua cara, yaitu 4 elektroforesis larutan (moving boundary electrophoresis" dan elektroforesis daerah (zone electrophoresis". &ada teknik elektroforesis larutan, larutan penyangga yang mengandung makro'molekul ditempatkan dalam suatu kamar tertutup dan dialiri arus listrik. )ecepatan migrasi dari makro'molekul diukur dengan jalan melihat terjadinya pemisahan dari molekul (terlihat seperti pita" di dalam pelarut. edangkan teknik elektroforesis daerah adalah menggunakan suatu bahan padat yang berfungsi sebagai media penunjang yang berisi (diberi" larutan penyangga. Media penunjang yang biasa dipakai adalah gel agarose, gel pati, gel poliakrilamida dan kertas sellulose poliasetat. Adapaun menurut argent G %eorge (!3H;" elektroforesis daerah disebut sebagai elektroforesis gel dengan dua buah model yaitu horizontal dan vertikal. Metode yang biasa digunakan adalah
10
model horizontal, karena mempunyai beberapa keuntungan yaitu peralatan yang digunakan sangat sederhana, relatif murah dan pemisahan untuk enzim tertentu dapat menghasilkan pemisahan yang lebih baik. %el yang digunakan dalam elektroforesis ada = macam4 !. %el poliakrilamida denaturasi, berfungsi dalam penanda oligonukleotida dan menganalisis pemanjangan primer. 2. %el alkalin agarosa, berfungsi untuk memisahkan rantai $0A yang berukuran besar. =. %el agarosa formaldehid denaturasi, berfungsi untuk menyediakan sistem elektroforesis 0A pada Bkuran tandar ($avis dkk. !33@4 !;!".
%el agarosa merupakan turunan desulfonated agar'agar, suatu senya#a yang dapat diisolasi dari membran sel ganggang. untuk persiapan gel, agarosa dilarutkan dalam buffer yang dipilih, dipanaskan sampai titik didih dan dituangkan ke dalam tangki elektroforesis. pada pendinginan gelasi terjadi. pori'pori di agarosa gel cukup besar mulai dari !; nm konsentrasi !I (! mg m1'!" sampai ; nm 6B0$ konsentrasi ,!I (!, mg8m1'!". pori'pori besar hanya terbatas untuk protein berat molekul yang sangat tinggi atau asam nukleat. untuk sebagian analit, agarosa gel nonrestrictive. %el &oliakrilamida disiapkan oleh co'polimerisasi akrilamida dan agen cross' linking, 00 metilen ' bisacrylamide dalam buffer elektroforesis dipilih. ukuran pori dan sifat pengayakan maka molekul &A gel tergantung pada konsentrasi total serta tingkat silang I &ergerakan $0A pada elektroforesis dipengaruhi oleh beberapa faktor sebagaberikut4 !. Bkuran molekul $0A. Molekul $0A kecil akan melintasi gel lebih cepat karena ruang gerak yang tersedia untuk melintasi gel lebih banyak.
11
2.
)onsentrasi gel. )onsentrasi agarosa yang semakin tinggi menyebabkan molekul'molekul $0A sukar mele#ati gel. )onsentrasi gel tinggi mempermudah $0A berukuran kecil mele#ati gel, sedangkan konsentrasi gel rendah mempermudah molekul $0A berukuran besar
untuk melintasi gel. =. Jentuk Molekul Molekul yang berbentuk supercoil atau elips akan bergerak lebih cepat mele#ati gel. @. $ensitas muatan Molekul dengan densitas tinggi akan lebih cepat bergerak dibandingkan molekul dengan densitas yang rendah. $ensitas merupakan jumlah muatan per unit volume molekul. ;. &ori'pori gel. &ori'pori yang lebih besar akan mempermudah pergerakan $0A mele#ati gel, sedangkan pori'pori yang lebih kecil akan lebih sulit dilalui oleh molekul $0A. . oltase. oltase tinggi akan menyebabkan cepatnya pergerakan molekul $0A. -al tersebut dikarenakan oleh tingginya muatan positif yang ditimbulkan. H. 1arutan buffer. Juffer dengan kadar ion tinggi akan menaikkan konduktansi listrik sehingga migrasi $0A akan lebih cepat. ;. Elektroforesis )apiler (E" Elektroforesis kapiler
adalah
metode elektroforesis
yang digunakan
untuk
memisahkan asam amino, protein, lipid, karbohidrat, dan nukleotida dengan resolusi tinggi yang dilakukan pada pipa kapiler
berisi
buffer.Elektroforesis kapiler
merupakan
pengembangan konsep elektroforesis konvensional. )onsep dasar elektroforesis kapiler adalah tidak sedikit molekul berada dalam larutan sebagai partikel bermuatan (ion", baik bermuatan positif (kation" maupun bermuatan negatif (anion". )alau medan listrik diberikan kepada larutan molekul bermuatan tersebut maka masing'masing ion bergerak menuju
12
elektroda yang berla#anan muatannya. )ation menuju katoda sebaliknya anion menuju anoda. ifat kelistrikan inilah yang sebenarnya merupakan konsep dasar elektroforesis (umar -endayana, &h.$, 2". Elektroforesis konvensional diperlukan media tempat pemisahan, misalnya kertas atau gel yang masing'masing ujung tercelup dalam larutan buffer. uplikan berupa campuran (misalnya campuran protein" diteteskan pada bagian tengah media tersebut. alah satu larutan buffer dihubungkan melalui elektroda platina atau batang karbon dengan kutub negatif arus searah dan larutan buffer lainnya dihubungkan melalui elektroda platina atau batang karbon dengan kutub positif arus searah. 5leh karena itu komponen'komponen campuran bermuatan listrik maka komponen'komponen
campuran tersebut bermigrasi
ketika arus listrik searah dialirkan. )omponen'komponen yang bermuatan positif bergerak menuju katoda (kutub negatif". ebaliknya komponen'komponen yang bermuatan negatif bergerak menuju anoda (kutub positif". edangkan komponen'komponen yang netral tidak bergerak. -asil pemisahan elektroforesis konvensional ditunjukan oleh adanya noda'noda ber#arna sepanjang media pemisah(umar -endayana, &h.$, 2". Elektroforesis konvensional mudah dilakukan menggunakan peralatan sederhana. Akan tetapi hasil pemisahan seringkali tidak memuaskan, noda yang satu dengan yang lain kadang'kadang sukar dibedakan karena tumpang tindih sebagai akibat
dari noda'noda
tersebut yang terlalu melebar. )endala lain dari elektroforesis konvensional ini adalah tidak dapat mendeteksi konsentrasi cuplikan yang rendah. elain itu #aktu yang diperlukan untuk melakukan satu analisis terlalu lama. Bntuk mempercepat pemisahan bisa diusahakan dengan cara menambah tegangan listrik arus searah tapi hasilnya tetap kurang efisien. -al ini disebabkan tegangan listrik yang tinggi dapat menimbulkan panas sehingga menurunkan efisiensi pemisahan(umar -endayana, &h.$, 2".
13
Elektroforesis konvensional nampaknya tidak dapat diharapkan lebih banyak lagi untuk pemisahan campuran yang lebih banyak lagi untuk pemisahan campuran yang lebih komplek dengan hasil yang lebih efesien dan cuplikan yang sangat sedikit dengan konsentrasi sangat rendah. Bntuk menanggulangi kendala'kendala yang terdapat pada elektroforesis konvensional ini maka telah diadakan modifikasi peralatan dan muncullah istilah elektroforesis kapiler(umar -endayana, &h.$, 2".
B. Instrumentasi Elektroforesis ! Elektroforesis %el
Sebuah
ruang
elektroforesis
dengan
waduk
penyangga
dan
therostat pendingin dan koponen utaa yang diperlukan untuk elektroforesis gel! peisahan dapat dilakukan se"ara #ertikal atau hori$ontal! "atu daya eberikan tegangan typi %allally 200&500 ' dengan arus listrik "of 400 (rtikel )aru 100! elektroda di"elupkan ke dala waduk penyangga di setiap sisi gel! untuk sebagian peisahan bioolekuler* p+ So"hen bahwa analit beruatan negatif! sehingga analit berigrasi ke arah pada anoda. eluruh instrumen dalam kotak isolasi untuk melindungi pengguna dari tegangan tinggi . uang elektroforesis mengandung matriks gel direndam dalam buffer elektrolit. gel vertikal dapat dipolimerisasi dalam tabung kaca atau &erspeK dengan ,; sampai ! cm id dan = sampai ! cm panjangnya. alternatif gel dapat berperan sebagai lempengan persegi panjang tipis di mana beberapa sampel dapat dijalankan secara paralel. gel slab dapat dipolimerisasi pada foil lembam untuk pemisahan horizontal atau dituangkan ke dalam tangki vertikal. ketebalan gel slab adalah sekitar !'= mm. minigel yang memiliki panjang
14
dan lebar sekitar *cm K * cm, tapi gel lebih besar hingga @ K 2 cm juga umumnya digunakan.Bntuk pemisahan vertical,ampel dilarutkan dalam gliserol atau sukrosa solusi kepadatan tinggi untuk mencegah mereka dari pencampuran dengan penyangga di upper.
BAB III KESIMPULAN
. Elektroforesis adalah metode pemisahan berdasarkan perbedaan mobilitas analit
menunjukkan dalam medan listrik diterapkan. metode elektroforetik dapat diterapkan untuk pemisahan dari suatu sampel dengan variety luas, termasuk protein, asam nukleat, asam amino dan karbohidrat. !. Metode pemisahan elektroforesis didasarkan pada interaksi partikel'partikel bermuatan oleh medan listrik. &artikel bermuatan listrik negatiaf akan bergerak kekutub positif (anoda". ebaliknya , partikel bermuatan listrik positif akan bergerak kekutub negative (katoda". ementara partikel netral tidak bergerak . adi medan listrik menyebabkan pemisahan pada metode elektroforesis. ". enis'jenis elektroforesis adalah elektroforesis zona (#ilayah", elektroforesis kertas, elektroforesis %el, dan elektroforesis kapiler #. %el media dalam elektroforesis gel (%E" adalah gel agarosa dan %el poliakrilamida $. Elektroforesis digunakan untuk meneliti $0A dalam berbagai bidang, misalnya 4di bidang kepolisian teknik ini digunakan nuntuk pemeriksaan $0A, setiap orang memiliki karakteristik khusus, misalnya sidik jari.
15
%A&TA' PUSTAKA
Andreas Manz, et.al, 2!, L Bioanalytical Chemistry” published by +mperial ollege &ress, 1ondon Martin, . !33. %el electrophoresis4 nucleid acids. Jios scientific &ublisher, 5Kford4 Kvi !H; hlm. ichardson, b. , p. . Javerstock and m. Adams !3*. Allozyme electro- phoresis. A handbook for animal sys' tematics and population studies. Aca' demic press, inc. an diego 4 @! pp. ambrook, j. G d. :. ussell. 2!. Molecular cloning4 a laboratory manual vol 2. =rd ed. old spring harbour laboratory press, ne# york4 Kvii =.@''!@.;= !.@@ othe, g. M. !33;. Electrophoresis o enzymes. pringer ' verlag. Jerlin heidelberg4 2H* pp. -lm. .M. )opkar. 2*. )onsep $asar )imia Analitik. Bniversitas +ndonesia. akarta. umar -endayana , &-.$. 2, L !imia "emisahan #etode kromatograi dan Elektrooresis #odern $ &/. emaja osdakarya. :olfe, . 1. !33;. +ntroduction to cell and molecular biology. :ard#orth &ublishing ompany, Jelmont4 Kvii *2 hlm.
16
