Pruebas Pruebas de tintes de reducción: de azul de metileno y resazurina
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De: Atherton, HV y Newlander, JA 1977. Química y pruebas de productos productos lácteos. 4 ed. AVI, Westport, CT.
Prueba de reducción de azul de metileno La prueba de reducción de azul de metileno se basa en el hecho de que el color impartido a la leche mediante la adición de un colorante como el azul de metileno va a desaparecer más o menos rápidamente. La eliminación eliminación del oxígeno de la leche y la formación formación de la reducción de sustancias durante el e l metabolismo metabolismo de las bacterias hace que el co lor desaparezca. Los organismos organismos responsables de consumo consumo de oxígeno oxígeno son las las bacterias. A pesar de ciertas especies de bacterias tienen una influencia mucho más que otros, en general se supone que cuanto mayor sea el número de bacterias en la leche, más rápido que el oxígeno se consume, ya su vez vez el más rápido desaparecerá el color. Por lo tanto, el momento de la reducción se toma como una medida del número de organismos en la leche, aunque en realidad es probable que sea más una verdadera medida de las reacciones metabólicas total de procedimiento en la superficie celular de las bacterias. La prueba de reducción de azul de metileno ha perdido mucha de su popularidad debido a su baja correlación correlación con otros procedimientos de bacterias. Esto es especialmente especialmente cierto en aquellas muestras que demuestran la multiplicación de las especies de amplia psychrotropic. Aparato.-El equipo necesario consiste en tubos de ensayo con tapones de goma, una pipeta o cazo se graduó de entregar 10 ml de leche y un baño de agua para mantener las muestras a 35 º a 37 º C. El baño debe contener un volumen volumen de agua suficiente para calentar las muestras a 35 º C en 10 minutos después de las trompas de entrar en el agua y debe tener algún medio de protección de las muestras de la luz durante el período de incubación. Si una cámara de aire caliente caliente se utiliza, las muestras muestras se debe calentar a 35 º C en un baño de agua caliente ya que el aire se calienta la leche con demasiada lentitud.
Secos los comprimidos contienen tiocianato de azul de metileno y se puede obtener desde cualquiera de las casas de suministros suministros habituales habituales de laboratorio. Ellos deben ser ser certificados por la la Comisión de Normalización Normalización de manchas biológicas. La solución solución se prepara mediante tratamiento en autoclave o hervir un momento 200 ml de agua destilada en un resistente a la luz (ámbar) (á mbar) frasco tapado y luego añadir una pastilla azul de metileno en el matraz de agua caliente. El comprimido debe ser totalmente disuelta antes de la la
disolución se enfría. enfría. La solución puede ser almacenada en el frasco frasco tapado, ámbar o un frasco de color ámbar en la la oscuridad. Solución deben prepararse cada semana. semana. Procedimiento en las pruebas.-Los procedimientos son los siguientes.
(1) Esterilice todos los objetos de cristal y tapones de goma, ya sea en un autoclave o en agua hirviendo. Asegúrese de que todos los los objetos de vidrio está químicamente químicamente limpia. (2) Medida 1 ml de la solución de tiocianato de metileno azul en un tubo de ensayo. (3) Añadir 10 ml de leche y el tapón. (4) Los tubos se pueden colocar en el baño de agua inmediatamente o se puede almacenar en el refrigerador refrigerador a 0o a 4o C para un momento más más adecuado de incubación. Cuando esté listo para realizar la prueba, la temperatura te mperatura de las muestras deben ser llevados a 35 ° C en 10 minutos. (5) Cuando la temperatura llega a 36o C, lentamente invierta los tubos varias veces para asegurar la formación formación de crema uniforme. uniforme. No agite los los tubos. Registre este tiempo como el comienzo del período período de incubación. Cubierta para impedir impedir la entrada de luz. (6) Compruebe las muestras para la decoloración deco loración después de 30 minutos de incubación. Hacer lecturas posteriores en intervalos de una hora después. (7) Después de cada lectura, retire los tubos se decolora y luego, lentamente, hacer una inversión completa de tubos restantes. (8) Registro de la reducción del tiempo en horas completas entre la inversión pasada y la decoloración. Por ejemplo, si la muestra muestra se sigue azul después después de L 5 horas, pero se decolora (blanco) en la lectura de 2,5 horas, el tiempo de reducción de azul de metileno se registraría como como 2 horas. Decoloración se considera completo cuando las cuatro quintas partes del color ha desaparecido. Clasificación.-La clasificación clasificación propuesta pro puesta está en la lista.
Clase 1. Excelente, no se se decolora en 8 horas. Clase 2. Bueno, se decolora en menos de 8 horas, horas, pero no menos menos de 6 horas. Clase 3. Feria, se decolora en menos menos de 6 horas, pero no menos de 2 horas. horas. Clase 4. Pobres, se decolora decolora en menos de 2 horas. horas. Factores que afectan la prueba.-Muchos factores afectan la prueba de reducción de azul de metileno y por lo tanto los pasos de la operación debe ser uniforme.
Dado que el contenido de oxígeno debe ser utilizado antes de que el color desaparece, cualquier manipulación que aumenta aumenta el oxígeno afecta a la la prueba. Leche fría contiene contiene más oxígeno que la leche caliente, verter la leche de ida y vuelta de un recipiente a otro, aumenta la cantidad, y en el ordeño de oxígeno mucho tiempo puede ser absorbido. El tipo tipo de organismos afecta la tasa de reducción. Los coliformes coliformes parecen ser los organismos más rápida reducción, seguida de cerca por Streptococcus lactis, algunos de los estreptococos fecales y ciertos micrococos. micrococos. Bacterias termodúricos termodúricos y psicotrópicas reducir el azul de metileno muy muy lentamente en todo caso. Un gran número de leucocitos afectan afectan a la reducción del tiempo de lo material. La luz acelera la la reducción y por lo tanto, las pruebas pruebas deben estar cubiertos. La concentración del tinte debe ser uniforme como un aumento de la concentración aumenta el tiempo de reducción. El aumento de la temperatura temperatura de incubación aumenta la actividad de las bacterias y por lo tanto, se acorta el tiempo de reducción. El descreme de las muestras de ensayo provoca pro voca una serie de organism org anismos os que se elimina del cuerpo de la leche y la la trajo a la superficie con el aumento de la grasa. Este factor hace que las variaciones en el tiempo de reducción, ya que las bacterias no se distribuyen equitativamente. La precisión precisión de la prueba es el aumento, reducción del tiempo tiempo de reducción y decoloración más unif u niforme orme si las muestras son periódicamente invertido durante la incubación.
La prueba de resazurina La prueba se lleva a cabo resazurina similar a la prueba de reducción de azul de metileno con la sentencia de la calidad basado ya sea en el color que se produce después de un período determinado de incubación o en el tiempo requerido para reducir el tinte a un determinado punto final. Numerosas modificaciones modificaciones han sido propuestas. Los dos dos más más utilizados son el "de una hora de prueba" y la "triple lectura de la prueba", tomada después de una, dos y tres horas de incubación. Otras modificaciones modificaciones tienen un valor en aplicaciones específicas. El procedimiento para realizar la prueba de r esazurina es el siguiente: Prepare una soluci so lución ón de resazurina disolviendo una tableta de resazurina (contenido de colorante / comprimido, de aproximadamente 11 mg, certificado por la Comisión manchas biológicas) en 200 ml de agua destilada caliente como se hizo hizo en la prueba de azul de metileno metileno . Coloque un ml de solución de colorante en un tubo de ensayo estéril, a continuación, añadir 10 ml de muestra. Tapar el tubo, colocar en la incubadora y, cuando la temperatura alcanza los 36o C, invierta para mezclar la leche y el colorante. Incubar a 36o C. Los tubos son examinados y clasificados al final de una hora en el "de una hora de prueba" o al final de tres intervalos intervalos
sucesivos por hora en la la "prueba de triplereading". Las siguientes relaciones relaciones de color y calidad son generalmente aceptadas: Color de muestra: calidad de la leche 1. Azul (sin cambio cambio de color): Excelente Excelente Dos, a lo profundo del azul malva: Bueno Bue no 3. Profundidad de color malva de color color rosa oscuro: Feria Feria 4. Profundidad de color rosa a rosa blanquecino: Malo Malo 5. Blanco: Malo La prueba de resazurina puede ser una u na valiosa herramienta para ahorrar tiempo si se realiza correctamente e interpretadas de manera inteligente, pero debe ser complementado por el examen microscópico. Los resultados resultados sobre la fiabilidad de las las pruebas resazurina son contradictorios. Un estudio en la comparación de la prueba con el método de resazurina Raza microscópicas en 235 muestras encontradas de la la prueba de confianza. Otros informes informes afirman que la prueba de resazurina es un índice índice fiable de la calidad bacteriológica de la la leche. Una crítica importante del método es que la reducción del tiempo de resazurina de leche refrigerada, ya sea embotellada o 20 ° 37 ° C es demasiado largo para ser de valor en la evaluación de deterioro bacteriológico de la leche almacenada. a lmacenada. Notas de los métodos estándar que bajo ninguna circunstancia los resultados de azu l de metileno sea o pruebas resazurina resazurina ser informada en términos términos del número de bacterias. Los dos procedimientos de reducción de medio de contraste se describen con más detalle en el capítulo 15 de la decimotercera decimotercera edición de los métodos estándar elaborado e laborado por la Asociación Americana de Salud Sa lud Pública.
