-© -lt
(P>
K p>
espontáneam ente se vuelve a form ar el enlace fosfodiéster, regenerándose tanto la hélice de DNA com o la DNA topoisom erasa no alterada
Mecanismos de replicación del DNA
2 79
resultado de ello, la replicación del DNA podrá ocurrir con la rotación de única mente un corto tramo de hélice -la zona que se halla justo por delante de la hor quilla. El problem a análogo a éste que aparece durante la transcripción del DNA, se resuelve de una forma similar a la descrita. Un segundo tipo de DNA topoisomerasa (la topoisomerasa II) forma una unión covalente con ambas cadenas de la hélice de DNA al mismo tiempo, ge nerando transitoriamente una rotura en las dos cadenas del DNA. Estas enzimas se activan por determinadas zonas del cromosoma en las que dos dobles hélices se cruzan entre sí. Cuando la topoisomerasa se une a un lugar de cruce como éste, (1) rompe una de las dobles hélices, de forma reversible, generando una “puer ta”, (2) hace que la otra doble hélice pase a través de esta rotura, y (3) vuelve a unir las cadenas de DNA que había roto y se separa del DNA. De esta forma, las DNA topoisomerasas de tipo II pueden separar de forma eficiente dos círculos de DNA entrelazados (Figura 6-55). Esta misma reacción evita que se generen los graves problemas de embrollamiento que, de otra forma, aparecerían durante la replicación del DNA. Por ejemplo, se han aislado unas células de levadura mutantes que producen, en lugar de la topoisomerasa II normal, una versión que se inactiva a 37°C. Cuando las levaduras mutantes se calientan hasta esta tem pera tura, sus cromosomas se entrelazan de forma que en el proceso de la mitosis no pueden separarse. La utilidad de la topoisomerasa II para desenmarañar los cro mosomas puede ser fácilmente comprendida por cualquiera que haya intentado deshacer un lío de un hilo de pescar sin la ayuda de unas tijeras.
dos dobles hélices de DNA circular están entrelazadas
una DNA topoisom erasa de tipo II se une de manera covalente y reversible a las dos cadenas del DNA, interrum piendo la doble hélice verde y generando una "pu erta" proteica
la puerta de la topoisom erasa se abre y se cierra, dejando pasar la otra hélice de DNA
La replicación del DNA en los eucariotas es básicam ente similar a la de los procariotas37 La mayoría de lo que conocemos respecto a la replicación del DNA procede de es tudios sobre sistemas multienzimáticos purificados a partir de bacterias y de bac teriófagos, que son capaces de realizar in vitro la replicación del DNA. El desarro llo de estos sistemas en los años 1970 fue facilitado en gran manera gracias a la disponibilidad de mutantes en diversos genes de replicación que pudieron utili zarse para identificar y purificar las correspondientes proteínas de replicación. Mucho menos es lo que se conoce acerca de los detalles de la enzimología de la replicación del DNA en eucariotas, sobre todo debido a lo difícil que resulta obtener mutantes deficientes en procesos de replicación. Sin embargo, los m e canismos básicos de la replicación del DNA, incluyendo la geometría de la hor quilla de replicación y los com ponentes de la máquina de replicación multiproteica, son similares en los eucariotas y en los procariotas (véase Figura 8-35). La principal diferencia estriba en que el DNA eucariota no se replica en forma de DNA desnudo sino en forma de cromatina, en la cual el DNA está estrechamente asociado a unas proteínas denominadas histonas. Tal como se describe en el Ca pítulo 8, estas histonas forman unas estructuras parecidas a discos sobre las que se enrolla el DNA eucariota, generando una unidad estructural repetitiva deno minada nucleosoma. Los nucleosomas están distribuidos a lo largo del DNA, a intervalos de 200 pares de bases, lo cual puede explicar por qué en los eucariotas los fragmentos de Okazaki se sintetizan sobre la cadena retrasada a intervalos de entre 100 y 200 nucléotidos en lugar de a intervalos de entre 1000 y 2000 nucleótidos como ocurre en las bacterias. Los nucleosomas también pueden actuar como barreras que frenan ligeramente el movimiento de las moléculas de DNA polimerasa, lo cual puede explicar por qué las horquillas de replicación se des plazan a una décim a parte de la velocidad a la que se desplazan las horquillas de replicación en las bacterias.
Resumen Una DNA polim erasa autocorrectora cataliza la polim erización d e nucleótidos en dirección 5 ’ a 3 copiando un patrón d e DNA con una fid elid a d notable. Puesto qu e las dos cadenas d e una doble h élice d e DNA son antiparalelas , esta síntesis 5 ’ a 3 ’
280
Capítulo 6 : Mecanismos genéticos básicos
las 2 dobles hélices de DNA circular se han separado ©
la reación inversa de la unión covalente de la topoisom erasa restaura una doble hélice intacta
Figura 6 -55 DNA topoisom erasa II. Ejemplo de una reacción de “paso a través de la hélice de DNA”, catalizada por una topoisomerasa de tipo II. A diferencia de la topoisomerasa de tipo I, estas enzimas requieren la hidrólisis de ATP, y algunas de ellas puede introducir en el DNA tensión superhelicoidal (véase pág. 468). En eucariotas las topoisomerasas de tipo II se hallan exclusivamente en células proliferantes; en parte por esta razón, se utilizan como populares dianas para fármacos anticancerosos.
d el DNA sólo p u ed e o cu rrir d efo rm a continua en una d e las dos cadenas (la cadena conductora) d e la horquilla d e replicación. E n la cadena retrasada se sintetizan p e queños fragm en to s d e DNA m ediante un proceso d e “pesp u nte”. D ebido a q u e la DNA polim erasa autocorrectora no p u ed e iniciar la síntesis d e una cadena d e DNA, estos fragm en to s d e DNA sobre la cadena retrasada se inician m ediante cortas m o léculas d e cebador d e RNA, las cuales serán elim inadas m ás tarde y substituidas p o r DNA. La replicación d el DNA req u iere la cooperación d e m uchas proteínas, en tre las cuales se en cu en tra n : (1) una DNA polim erasa y una DNA prim asa, q u e catalizan la polim erización d e nucleósidos trifosfato, (2) DNA belicosas y proteínas desestabilizadoras d e la hélice, q u e colaboran en a b rir la h élice d e DNA q u e se va a copiar, (3) una DNA ligasa y una enzim a q u e degrada los cebadores d e RNA, uniendo los fragm entos d e DNA d e la cadena retrasada sintetizados d e fo rm a discontinua, (4) u na DNA topoisom erasa q u e actúan solventando problem as d e enrollam iento y en m arañam iento d e la hélice, y (5) proteínas iniciadoras q u e se u n en a secuencias d e term inadas d e DNA en el origen d e la replicación y catalizan la form ación d e una horquilla d e replicación en este lugar. En el luga r d e origen d e la replicación, se fo r m a u na estructura proteína-DNA especializada q u e entonces carga una DNA b eli cosa sobre el DNA patrón. Entonces se agregan otras proteínas fo rm a n d o u na “m á qu in a d e replicación” m ultienzim ática, q u e cataliza la síntesis d el DNA.
Recombinación genética38 En las dos secciones anteriores hemos estudiado los mecanismos a través de los cuales las secuencias de DNA de las células se mantienen con muy pocos cam bios, de generación en generación. A pesar de que esta estabilidad genética es crucial para la supervivencia a corto plazo, a largo plazo la supervivencia de los organismos puede depender de la variación genética, mediante la cual la célula puede adaptarse a las variaciones del ambiente. Así, una propiedad importante del DNA en las células es su capacidad de éxperimentar reordenaciones que pueden hacer variar tanto las com binaciones particulares de genes que se hallan presentes en el genoma de cualquier individuo como el programa y el nivel de expresión de estos genes. Estas reordenaciones de DNA están generadas m e diante la recom binación genética. Se conocen dos grandes tipos de procesos de recom binación genética: la recom binación general y la recom binación específi ca de lugar. En la recombinación general, el intercambio génico se produce entre se cuencias homologas del DNA, generalmente localizadas sobre dos copias del mismo cromosoma. Uno de los ejemplos más importantes al respecto es el in tercambio de secciones entre cromosomas homólogos en el transcurso de la meiosis. Este “entrecruzamiento” (“crossing-over”) se produce entre crom oso mas que se hallan estrechamente superpuestos durante las primeras etapas de la formación de óvulos y espermatozoides (se estudia en el Capítulo 20), y per mite que diferentes versiones (alelos ) del mismo gen se presenten y sean proba das en com binación con otros genes, lo cual increm enta la posibilidad de que por lo menos algunos miembros de una población sobrevivan en un ambiente cambiante. A pesar de que la meiosis sólo se produce en los eucariotas, la venta ja de este tipo de intercambio de genes es tan grande que el apareamiento y la reordenación de los genes mediante la recom binación general se han extendido también a las bacterias. La recombinación específica de lugar no se produce únicamente entre DNA homólogos. Por el contrario, el intercambio se produce entre cortas secuencias de nucleótidos (sobre una o ambas moléculas de DNA que participan) reconoci das específicamente por una enzima de recom binación específica de lugar. Así pues, la recom binación específica de lugar altera las posiciones relativas de las secuencias de nucleótidos en los genomas. En algunos casos, estos cambios es tán diseñados y organizados, tal como ocurre cuando un virus bacteriano inte-
Recombinación genética
dos dobles hélices hom ologas de DNA
m oléculas de DNA que se han entrecruzado Figura 6-56 Recombinación general. La rotura y nueva unión de dos dobles hélices homólogas da lugar a dos moléculas de DNA “entrecruzadas”.
281
grado en un crom osom a bacteriano es inducido a dejar el cromosoma bajo con diciones de estrés (véase Figura 6-80); en otros casos, los cambios son aleatorios, como sucede cuando la secuencia de DNA de un elemento transponible se in serta de forma aleatoria en un lugar del cromosoma. Al igual que para la replicación del DNA, la mayor parte de lo que sabemos acerca de la bioquímica de la recom binación genética procede de estudios reali zados sobre organismos sencillos, especialmente sobre E. coli y sobre virus.
m oléculas de DNA que se han entrecruzado
La recom binación general está guiada por interacciones de apareamiento de bases entre cadenas complementarias de dos moléculas homologas de DNA39 La recom binación general implica la existencia de unos intermediarios del in tercambio entre cadenas de DNA, difíciles de entender. A pesar de que la vía exacta que se sigue en el proceso de recom binación general puede ser ligera mente distinta en organismos diferentes, detallados análisis genéticos de virus sobre el apareamiento de bacterias y de hongos sugieren que el resultado gene ral de este proceso de recom binación siempre es el mismo: (1) dos moléculas homologas de DNA se “entrecruzan”, es decir, sus dobles hélices se rompen y los dos extremos rotos se unen con los extremos opuestos formando de nuevo dos dobles hélices intactas, pero cada una de ellas compuesta por partes de cada una de las dos moléculas iniciales de DNA (Figura 6-56). (2) El lugar de inter cambio (es decir, el lugar de la Figura 6-56 en el que la doble hélice de color rojo se une a la doble hélice verde) se puede producir en cualquier lugar de la secuen cia de nucleótidos de las dos moléculas de DNA que participan en el proceso. (3) En el lugar de intercambio, una cadena de una de las moléculas de DNA queda unida mediante apareamiento de bases a la otra molécula de DNA, generándose
unión heterodúplex, donde las cadenas procedentes de dos hélices de DNA diferentes form an Dares de bases Figura 6-57 Una unión heterodúplex. Esta estructura junta dos moléculas de DNA en el lugar donde se han entrecruzado. Este tipo de unión tiene, a menudo, varios cientos de nucleótidos de longitud.
proteína recBCD +
llllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllll iiim im iiiM iiim iiim iiM iiiiim i UNIÓN AL FINAL DE LA DOBLE HÉLICE Y POSTERIOR DESPLAZAMIENTO
n yr \
m inim i)' ........ ........m i.............m im m i......................i.......... m im ili.............i..... ninn \ lugar de reconocim iento lazo de cadena sencilla de DNA, que se va desplazando
ROTURA POR LA SECUENCIA DE RECONOCIMIENTO
........ m im i...............il1" .......m im im i................................m in...... i..... uni.......ninnimi
5'/^ 3'
i........................................... ..................................... 5'
3' 282
Capítulo 6 : Mecanismos genéticos básicos
DESPLAZAMIENTO DEL "PELO" DE UNA SOLA CADENA
Figura 6 -58 Una form a de iniciar un proceso de recom binación. La RecBCD es una enzima necesaria para que se produzca la recom binación general en E. coli. La proteína entra en el DNA desde uno de sus extremos y, entonces, utiliza energía derivada de la hidrólisis de moléculas de ATP que se hallan unidas para autopropulsarse en una dirección determinada a lo largo del DNA a una velocidad aproximada de unos 300 nucleótidos por segundo. En un lugar especial de reconocim iento (una secuencia de DNA de 8 nucleótidos desperdigada por el cromosom a de E. coli) se corta el lazo que ha sido generado por la proteína recBCD y que se va desplazando, y entonces, tal com o se muestra en la figura, se genera un “pelo” monocadena que sobresale de la doble hélice. Este “pelo” puede iniciar el proceso de recom binación genética apareándose con una hélice homologa (véase Figura 6-59).
EE
—
—
—
--
ii
-
ii
ii
____
+
____
muesca
____
____ —
—
____
m i m i
M i M lllll
_
-
— ——
—
ii
k/ ...
_
EE
II ____
-* —
-l i n i 1111L
m i n
.........
—
-m
m i m i m i m i
in n i
_ _
una de las cadenas queda al descubierto
111 ■11
—
M in M in
EE
intercam bio inicial entre cadenas
...
< -
_
_
-
—
--
una unión solapada (que normalmente se denomina unión heterodúplex ) entre las dos dobles hélices (Figura 6-57). La región heterodúplex puede tener una longitud de varios cientos de bases apareadas; más adelante se explicará cómo se forman estas uniones. (4) En el lugar de intercambio no se altera la secuencia de nucleótidos; el proceso de rotura y unión ocurre de una forma tan precisa, que ni se pierde ni se gana un sólo nucleótido. A pesar de esta precisión la re com binación general crea moléculas de DNA cuya secuencia es nueva: la unión heterodúplex puede contener un pequeño número de errores en el apareamien to de bases, y lo que es más importante, habitualmente los dos DNA que se en trecruzan no son exactam ente el mismo a cada lado de la unión. El m ecanism o general de recom binación asegura que sólo se produzcan in tercam bios entre dos regiones de doble hélice de DNA que presenten secuencias notablem ente homólogas. La formación de una unión heterodúplex requiere esta homología ya que en ella participa una larga región de apareamiento entre bases complementarias entre una cadena de una de las dobles hélices originales y una cadena de la otra doble hélice. Pero, ¿cómo se forma esta región heterodú plex y cómo se reconocen entre sí las dos regiones del DNA en la zona de entrecruzamiento? Por lo que sabemos, el proceso de reconocimiento ocurre median te interacciones directas de apareamiento de bases. La formación de pares de bases entre cadenas complementarias de dos moléculas de DNA dirige el proceso de recom binación general, permitiendo que éste ocurra únicamente entre largas regiones de DNA cuyas secuencias se hallen apareadas.
Figura 6 -59 El intercam bio inicial de cadenas entre dos dobles hélices homólogas de DNA que están sufriendo un proceso de recom binación general. La formación de una muesca en una cadena del DNA libera dicha cadena, la cual invade la segunda hélice y forma una corta región de apareamiento entre bases. Solamente pueden aparearse de esta forma, y por lo tanto iniciar un proceso de recom binación general, dos moléculas de DNA cuya secuencia de nucleótidos sea com plementaria. Se sabe que existen algunas enzimas que pueden catalizar cada uno de los pasos mostrados en la figura (véanse Figuras 6-58 y 6-62).
La recom binación general puede iniciarse en una m uesca de una cadena de la doble hélice de DNA40 Cada una de las dos cadenas de una molécula de DNA se halla enrollada de for ma helicoidal alrededor de la otra. Por consiguiente, solamente se pueden pro ducir largas interacciones entre bases de dos dobles hélices si primero se genera una muesca (nick) en una cadena de una de ellas que permita los procesos de desenrollamiento y nuevo enrollamiento de las cadenas, procesos necesarios para que se produzca un heterodúplex con otra molécula de DNA. Por esta m is ma razón, cualquier intercambio de cadenas entre dos dobles hélices de DNA re quiere al m enos dos muescas, una en una de las cadenas de cada una de las dos dobles hélices que interactúan. Finalmente, para que se produzca la unión hete rodúplex que se muestra en la Figura 6-57, cada una de las cuatro cadenas pre sentes se ha de cortar para que pueda unirse a otra cadena diferente. En la re com binación general, estos procesos de formación de las muescas y nueva unión están coordinados de forma que únicamente se producen cuando se ha llan presentes dos hélices de DNA que presentan dos largas regiones de secuen cia complementaria. A partir de diferentes fuentes resulta evidente que para que se inicie el pro ceso de recom binación general es suficiente con que se produzca una sola
Recombinación genética
283
muesca en una cadena de una molécula de DNA. Por ejemplo, agentes químicos o tipos de radiación que introducen una muesca en una cadena, desencadenan un proceso de recom binación genética. Además, se ha demostrado que una de las proteínas especiales que son necesarias para que se produzca la recom bina ción en E. coli -la proteína RecBCD- produce muescas en las cadenas sencillas de las moléculas de DNA. La proteína RecBCD tam bién es una DNA helicasa que hidroliza ATP y se desplaza a lo largo de la hélice de DNA exponiendo tran sitoriamente sus cadenas. Combinando sus actividades nucleasa y helicasa, la proteína RecBCD genera un “pelo” de una sola cadena en la doble hélice de DNA (Figura 6-58). En la Figura 6-59 se muestra de qué forma este “pelo” puede iniciar una interacción de apareamiento de bases entre dos dobles hélices com plementarias que se hallen estiradas.
Las reacciones de hibridación del DNA proporcionan un modelo sencillo para la fase de apareamiento de bases en la recom binación general41 En su forma más sencilla, la reacción central de apareamiento de bases de la re com binación general puede ser simulada en un tubo de ensayo permitiendo que una doble hélice de DNA se forme de nuevo a partir de sus cadenas separadas. Este proceso, denominado renaturalización del DNA o hibridación del DNA tie ne lugar cuando una rara colisión al azar yuxtapone secuencias nucleotídicas complementarias de dos cadenas sencillas de DNA, lo cual permite la formación de una corta zona de doble hélice entre ellas. Este proceso relativamente lento de nucleación de la hélice viene seguido de un proceso “en cremallera” muy rá pido, en el que la doble hélice crece aumentando al máximo el número de inter acciones entre pares de bases (Figura 6-60). La formación, de esta manera, de una doble hélice requiere que las cadenas de DNA se hallen en una conformación abierta, desplegada. Por esta razón, las reacciones de hibridación in vitro se desarrollan a elevadas temperaturas o en presencia de disolventes orgánicos como la formamida; estas condiciones per miten “fundir” las cortas hélices en horquilla que se forman cuando se producen interacciones entre pares de bases en una cadena que se pliega sobre sí misma. Las células bacterianas no pueden soportar condiciones tan severas como éstas, por lo que para abrir las hélices utilizan una proteína desestabilizadora de la hé lice, la proteína SSB. Esta proteína es esencial en E. coli tanto para la replicación del DNA com o para la recom binación general; se une fuertemente de forma co operativa al esqueleto de azúcar-fosfato de cualquier región de una sola cadena de DNA, colocándola en una conformación extendida con sus bases asequibles, (véase Figura 6-46), En esta conformación extendida, una cadena de DNA puede formar pares de bases tanto con una molécula de nucleósido trifosfato (en el
284
Capítulo 6 : Mecanismos genéticos básicos
Figura 6 -60 Hibridación del DNA. Se vuelven a formar dobles hélices de DNA a partir de sus cadenas separadas a través de reacciones que dependen de la colisión al azar de dos cadenas complementarías (véase pág. 322). Muchas de estas colisiones no son productivas, com o se muestra a la izquierda, pero algunas de ellas dan lugar a cortas regiones en las que se producen apareamiento entre bases (nucleación del DNA). Entonces, un rápido proceso “en crem allera” com pleta cada hélice. Cada cadena de DNA puede utilizar este proceso de “prueba y error” para encontrar su pareja com plementaria entre los millones de cadenas de DNA no apareadas. Al parecer, todos los procesos de recom binación general se inician mediante un reconocim iento de cadenas complementarias mediante este sistema de “prueba y error”.
Figura 6-61 Estructura de la proteina RecA. Se muestra una cadena de tres monómeros de RecA, con la posición del ATP marcada en rojo. Las esferas b lan ca s muestran las posiciones posibles que ocupan los filamentos de DNA de cadena sencilla, de forma que cada tres nucleótidos (tres esferas) interaccionarian con cada monómero de RecA. (De R.M. Story, I.T. W eber y T.A. Steitz. N ature 256:318-325,1992. © 1992 Macmillan Magazines Ltd.)
proceso de replicación del DNA) como con secciones complementarias de otra cadena de DNA (en el proceso de recom binación genética). Cuando las reaccio nes de hibridación se desarrollan in vitro bajo condiciones que reproducen las del interior de la célula, la pro teína SSB actúa a una velocidad 1000 veces supe rior a la de la nucleación de la hélice de DNA, esto es, a la velocidad general del proceso de formación de la doble hélice.
La proteína RecA permite a una molécula de una sola cadena de DNA aparearse con una región homóloga de una doble hélice en E. c o li42 El proceso de recom binación genética general es algo más complejo que las sim ples reacciones de hibridación descritas anteriormente. En el curso de la recom binación general una hebra de DNA derivada de una doble hélice puede invadir otra doble hélice (véase Figura 6-59). En E. coli, este proceso requiere la partici pación de la proteína RecA, producida por el gen recA, gen que en 1965 fue iden tificado como esencial para la recom binación entre cromosomas. Largamente perseguido por los bioquímicos, en 1976 este escurridizo producto gènico fue fi nalmente purificado hasta homogeneidad y pudo ser caracterizado en detalle (Figura 6-61). Como proteína desestabilizadora de la doble hélice (SSB), la protei na RecA se une fuertemente a una cadena de DNA, formando agregados alta mente cooperativos, dando lugar a un filamento nucleoproteico. Este filamento tiene algunas propiedades características. Por ejemplo, tiene más de un lugar de unión al DNA, por lo que puede unirse simultáneamente y m antener juntas a una cadena sencilla y a una doble hélice de DNA. Estos lugares permiten a la proteína RecA catalizar una reacción de varias etapas (denominada sinapsis) entre una doble hélice de DNA y una región homóloga de una cadena de DNA. La etapa crucial de la sinapsis ocurre cuando una región de homología es identi ficada mediante un apareamiento inicial de bases entre secuencias complemen tarias de nucleótidos. En este caso en la etapa de nucleación participa una es tructura de triple cadena en la que el DNA de cadena sencilla forma aparea mientos no habituales de bases con el surco mayor del DNA de doble hélice (Figura 6-62). Esta interacción inicia al proceso de apareamiento mostrado previamente en la Figura 6-59, y de esta forma inicia el intercam bio de cadenas entre dos dobles hélices recom binantes de DNA. Diversos estudios in vitro su gieren que la proteina SSB de E. coli coopera con la proteína RecA facilitando estas reacciones.
Recombinación genética
285
DNA DE ENTRADA
estructura de tres hebras
Una vez se ha producido el proceso de sinapsis, la corta región heterodúplex formada por cadenas procedentes de dos moléculas diferentes de DNA se alarga mediante una migración de las cadenas dirigida por una proteína, que también está catalizada por la proteína RecA. La migración de la bifurcación o de las ca denas (branch migration) puede producirse en cualquier punto en el que dos cadenas sencillas de DNA de la misma secuencia intenten emparejarse con la misma cadena complementaria; una región no apareada de una de las cadenas sencillas de DNA desplazará a otra cadena sencilla que se halle apareada, de for ma que el punto de la bifurcación se desplazará sin que varíe el número total de pares de bases del DNA. El punto de bifurcación tiende a desplazarse espontá neam ente en ambas direcciones, de forma que no resultaría sencillo que el pro ceso de recom binación se completara de forma eficiente (Figura 6-63A). Debido a que la proteína RecA cataliza la migración unidireccional del punto de bifurca ción, fácilmente se produce una región heterodúplex de varios cientos de pares de bases de longitud (Figura 6-63B). La catálisis de la migración de la bifurcación depende de otra propiedad de la proteína RecA. Además de presentar dos lugares de unión al DNA, la proteína RecA es una ATPasa DNA-dependiente con un lugar adicional para unir e hidrolizar ATP. Cuando la proteína está unida a ATP se asocia mucho más fuertemen te con DNA que cuando está unida a ADP. Además, las moléculas RecA unidas a ATP se unen preferentem ente a un extremo de un filamento de proteínas RecA, y entonces el ATP se hidroliza a ADP. Los filamentos de proteínas RecA que se forman sobre el DNA pueden entonces presentar muchas de las propiedades di nám icas de unión que presentan los filamentos del citoesqueleto formados a partir de actina o de tubulina (discutidas en el Capítulo 16); por ejemplo, esta ca dena proteica presenta la habilidad de girar como una noria, de forma unidirec cional, a lo largo de una cadena de DNA, lo cual puede dirigir la reacción de mi gración de la bifurcación, tal como se muestra en la Figura 6-63B.
5'
3'
5'
3'
llllllllllllllllllllllllllír.ülUIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII
5'
3'
5'
3' ^ rffTTrrn1111rrrnn 111111ntffl
í i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i!i i ìli il i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i
dirección del ensamblaje de las proteínas RecA 3'
X
/ - "
linilllllllllllllnlü lllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllll
(A) MIGRACIÓN ESPONTÁNEA DE LAS CADENAS
286
(B) MIGRACIÓN DIRIGIDA POR PROTEÍNA
Capítulo 6 : Mecanismos genéticos básicos
Figura 6-62 Sinapsis de DNA catalizada por la proteína RecA. Experimentos in vitro indican que entre estructuras de una sola cadena de DNA recubierta de proteínas RecA {rojo) y una doble hélice {verde), se forman diferentes tipos de complejos. En primer lugar, se forma un complejo sin que se produzca apareamiento de bases que se transforma en un complejo con apareamiento de bases en cuanto se encuentra una región de secuencia homologa. Probablemente este com plejo es inestable ya que está formado por una forma de DNA poco usual, y genera un DNA heterodúplex (una hebra verde y la otra roja) más una hebra sencilla desplazada de la hélice original {verde); así, la estructura mostrada en este diagrama migra hacia la izquierda enrollando el DNA de “entrada” y produciendo el DNA “de salida”. El resultado neto es un intercambio de hebras idéntico al descrito anteriorm ente en la Figura 6-59. (Adaptado de S.C. West, Annu. Rev. B iochem . 61:603-640, 1992. © Annual Reviews Inc.)
Figura 6 -63 Dos tipos de migración de las cadenas, observados en experimentos in vitro. (A) La migración espontánea es un tipo de proceso en el que las cadenas se mueven arriba y abajo, de forma aleatoria, con lo que progresa muy poco sobre distancias largas. Por el contrario, la migración dirigida por la proteína RecA (B) se produce a una velocidad uniforme y en una sola dirección; puede estar dirigida por el ensamblaje polarizado del filamento de proteínas RecA sobre la cadena sencilla de DNA, la cual ocurre en la dirección indicada. Además, en la recombinación participan helicasas que catalizan la migración de cadenas dirigida por proteínas, incluso cón más eficiencia.
La recom binación genética general habitualm ente supone un intercam bio cruzado de cadenas o entrecruzamiento43 Parece que el paso más difícil y más lento del proceso de recom binación génica general es el intercambio de una cadena sencilla entre las dos dobles hélices (véase Figura 6-59). Tras este intercambio inicial, parece que la ampliación de la región de apareamiento y el establecimiento de otros intercambios entre cade nas de las dos dobles hélices que se hallan en estrecho contacto son procesos rá pidos. Durante estos procesos, a menudo se produce la eliminación de una pe queña cantidad de nucleótidos y la resíntesis local de DNA, de forma parecida a como ocurre en los procesos de reparación del DNA. Debido al elevado número de posibilidades que pueden darse, es fácil que diferentes organismos puedan seguir diferentes pasos en este punto. En la mayoría de los casos, sin embargo, se forma una importante estructura intermediaria, un in te rc a m b io c ru z a d o d e c a d e n a s o e n tre c r u z a m ie n to (cross-strand exchange), en la que participan las dos hélices de DNA. En la Figura 6-64 se muestra una de las vías más sencillas a través de la cual se puede formar esta estructura. En el intercambio cruzado de cadenas (también denominado “unión de Holliday ”) las dos hélices homologas de DNA que inicialmente se aparearon se mantienen unidas mediante el intercambio mutuo de dos de las cuatro cadenas presentes, una de cada hélice. Para mantener esta estructura no es necesario que se rompan pares de bases; la estructura presenta dos propiedades impor tantes: (1) el punto de intercambio entre las dos dobles hélices homologas de DNA (en la Figura 6-64, el lugar donde las dos cadenas se cruzan) puede migrar rápidamente en una u otra dirección siguiendo las hélices, mediante una migra ción de doble cadena; (2) el intercambio cruzado de cadenas consta de dos pares de cadenas: uno de cadenas cruzadas y el otro de cadenas no cruzadas. Sin em bargo, la estructura puede isomerizar al sufrir la serie de movimientos de rota ción que se muestran en la Figura 6-65, de forma que las dos cadenas que origi nalmente no se entrecruzaban ahora sí que se entrecruzan, y viceversa. Con el fin de regenerar dos hélices de DNA separadas y de concluir así el proceso de apareamiento, las dos cadenas entrecruzadas se han de cortar. Si las dos cadenas entrecruzadas se cortan antes de la isomerización del entrecru zamiento, las dos hélices originales de DNA se separan en forma casi inaltera da, habiéndose intercam biado un fragmento muy corto de DNA de una sola ca dena. Sin embargo, si las dos cadenas entrecruzadas se cortan después del proceso de isomerización, un trozo de cada una de las dos hélices originales quedará unido, mediante una unión heterodúplex, a una zona de la otra hélice de DNA: en otras palabras, las dos hélices de DNA se habrán entrecruzado (véa se Figura 6-65). La isomerización de las cadenas cruzadas puede ocurrir espontáneamente a una cierta velocidad, pero también puede estar dirigida enzimaticamente o re gulada por las células de alguna otra forma. Probablemente, durante la meiosis se produce algún tipo de control, cuando las dos dobles hélices de DNA que se emparejan se constriñen en una elaborada estructura denominada complejo sinaptonémico (como se discute en el Capítulo 20).
dos hélices hom ologadas de DNA
i FORMACIÓN DE UNA I MUESCA E INTERCAMBIO ’ DE CADENAS
■FORMACIÓN DE UNA I MUESCA E INTERCAMBIO ♦ DE CADENAS
I UNIÓN DE LAS ♦ CADENAS ROTAS
X
dos m oléculas de DNA unidas por un entrecruzam iento de cadenas Figura 6 -64 Form ación de un entrecruzam iento de cadenas. Existen muchas vías diferentes que pueden conducir desde un entrecruzamiento entre cadenas (véase Figura 6-59) a un intercambio de cadenas, aunque en la figura se muestre una sola de ellas.
La conversión génica se produce combinando procesos de recom binación general y de síntesis limitada de DNA44 Una ley fundamental de la genética dice que la contribución genética de cada uno de los padres al hijo es idéntica: se hereda un juego completo de genes del padre y otro de la madre. Así, cuando una célula diploide entra en meiosis produciendo cuatro células haploides (véase Capítulo 20), exactamente la mitad de los genes de estas células han de proceder de la madre (los genes que la célula diploide heredó de la madre) y la otra mitad, del padre (los genes que la célula di ploide heredó del padre). En un animal pluricelular, como es el caso del hombre, no es posible com probar directam ente si se cumple esta predicción, pero en
Recombinación genética
287
Figura 6-6 5 Isomerización de un entrecruzam iento de cadenas. Si no se ha producido la isomerización, el corte de las dos cadenas cruzadas finaliza el intercam bio sin que se haya producido entrecruzamiento. Si se produce isomerización (etapas B y C), el proceso de corte de las dos cadenas produce dos moléculas de DNA que se han entrecruzado (abajo). Por consiguiente, se cree que la isomerización es necesaria para que el proceso de rotura y nueva unión de dos dobles hélices homólogas de DNA dé lugar a una recom binación general. La etapa A ya se ha ilustrado antes (véase Figura 6-64).
cíos crom osom as hom ólogos
A
otros organismos, como en los hongos, en los que es posible recuperar y anali zar cada una de las cuatro células hijas producidas por meiosis a partir de una única célula, se pueden encontrar m uchos casos en los que aparentemente se han violado las reglas genéticas estándar. Por ejemplo, ocasionalmente la m eio sis produce tres copias de la versión materna (alelos) de un gen y una sola copia del alelo paterno, lo cual pone de manifiesto que una de las dos copias del alelo paterno ha sido cambiada a una copia del alelo materno. Este fenómeno se co noce com o conversión gènica. A menudo ocurre en asociación con los procesos de recom binación genética general, y se cree que es importante en la evolución de ciertos genes (véase Figura 8-74). Parece ser que la conversión gènica tiene unas consecuencias directas sobre los mecanismos de recombinación general y de reparación del DNA. Durante la meiosis, se forman uniones heterodúplex en los lugares de entrecruzamiento de crom osom as homólogos maternos y paternos. Si las secuencias m aternas y paternas son ligeramente diferentes, la unión heterodúplex puede incluir algunos errores de apareamiento de bases. Estos errores en la doble héli ce pueden ser corregidos por la maquinaria de reparación del DNA, la cual pue de eliminar los nucleótidos de la cadena paterna y reemplazarlos por nucleótidos com plem entarios a los de la cadena materna, o viceversa. La consecuencia de ese sistema de reparación será una conversión gènica. También se puede dar una conversión gènica mediante otros mecanismos, pero todos ellos requieren la existencia de algún tipo de proceso de recom binación que una entre sí dos co pias de dos secuencias de DNA fuertemente relacionadas. Debido a que se gene ra una copia extra de una de las dos secuencias de DNA, en el proceso también ha de participar una pequeña parte de biosíntesis de DNA. Estudios genéticos muestran que norm alm ente la conversión gènica afecta a pequeñas zonas de DNA, y que en m uchos casos únicamente se cam bia una parte de un gen. La conversión gènica tam bién puede ocurrir en células en mitosis, aunque esto sólo se produce raramente. Tal como ocurre en células en meiosis, proba blem ente los procesos de conversión gènica que se producen en las células en mitosis aparecen com o consecuencia de procesos de reparación de aparejamiento de bases en el DNA heterodúplex. En la Figura 6-66 se ilustra otro m eca nismo que probablem ente se produce en células en mitosis y en células en meiosis.
FORMACIÓN DE UNA ESTRUCTURA DE INTERCAMBIO DE CADENAS CRUZADAS
D I CORTE DE LAS DOS j CADENAS DE DNA CRUZADAS
Los m ecanism os de corrección de errores pueden evitar la recom binación genética promiscua entre dos secuencias de DNA mal apareadas45 Como hemos discutido antes, la recom binación general se dispara cuando dos cadenas de DNA de secuencia complementaria se emparejan formando un hete rodúplex entre dos dobles hélices (véase Figura 6-64). Experimentos llevados a cabo in vitro con proteina RecA purificada muestran que puede ocurrir el em pa rejamiento de forma eficiente incluso cuando las secuencias del DNA no se apa reen bien -p or ejemplo, cuando sólo un promedio de cuatro de cada cinco nu cleótidos formen parejas de bases. Siendo así, ¿de qué forma pueden las células de vertebrados evitar la recom binación general promiscua entre los varios cen
288
Capítulo 6 : Mecanismos genéticos básicos
crom osom as que se han entrecruzado
lugar del gen X en el que los alelos rojo y verde son diferentes muesca
/_______ 3'
hélice de DNA 5' 3' hélice de DNA la DNA polimerasa desplaza una cadena de la hélice roja; entonces, esta hebra se aparea con la hélice verde
etapa 1
la DNA polimerasa se para, el exceso de DNA de cadena sencilla es degradado por nucleasas y todos los cortes reparados
etapa 2
la replicación norm al del DNA produce tres alelos rojos y un alelo verde del gen X
etapa 3
F ig u ra6-66 Proceso de recom binación general que puede causar conversión génica. El proceso empieza cuando se produce una muesca en una de las cadenas de la hélice de DNA roja. En la etapa 1 la DNA polimerasa inicia la síntesis de una copia extra de una de las cadenas de la hélice roja, desplazando la copia original com o una hebra sencilla. Esta hebra sencilla se aparea con la región homóloga de la hélice verde, com o se muestra en la Figura 6-59. En la etapa 2 , la corta región no apareada de la cadena verde producida en la etapa 1 es degradada, com pletándose la transferencia de secuencias de nucleótidos. El resultado normalm ente se observa en el siguiente ciclo celular, después de que la replicación del DNA haya separado las dos cadenas no apareadas (etapa 3). Como se describe en el texto, la reparación de errores de apareamiento de pares de bases en una unión heterodúplex también produce conversión génica.
RESULTADO NETO: UN ALELO VERDE DEL GEN X SE HA CONVERTIDO EN UN ALELO ROJO
tenares de copias de DNA de secuencias estrechamente relacionadas que se ha llan repetidas en sus genomas (véase pág. 423) ? A pesar de que no conocemos la respuesta a esta pregunta, diversos estudios en bacterias y levaduras han demostrado que los mismos sistemas de corrección de errores de apareamiento que eliminan los errores de replicación (véase Figura 6-50) también interrumpen los procesos de recombinación genética general entre secuencias de DNA que se emparejan de forma imperfecta. Se conoce, por ejem plo, que los genes homólogos de las dos bacterias estrechamente relacionadas Es cherichia coli y Salmonella typhimurium generalmente no se recombinan, a pesar de que, como sabemos, sus secuencias de nucleótidos son idénticas en un 80%; sin embargo, cuando el sistema de corrección de errores de apareamiento se halla inactivado por mutación, la frecuencia de estos procesos de recombinación interespecies se incrementa unas 1000 veces. Así, sabemos que el sistema de correc ción de errores de apareamiento reconoce normalmente las bases mal apareadas de un intercambio de cadenas inicial e impide los pasos posteriores necesarios para que se produzca la rotura y nueva unión de las dos hélices emparejadas. Este mecanismo protege el genoma bacteriano de cambios de secuencia que, de otra forma, se producirían mediante recombinación con moléculas de DNA que oca sionalmente entran en la célula. Se cree que en las células de vertebrados, que contienen muchas secuencias de DNA estrechamente relacionadas, este mismo tipo de sistema de corrección ayuda a impedir que se produzcan procesos de re combinación promiscua que, de otra forma, mezclarían el genoma (Figura 6-67).
Enzimas de recom binación específica de lugar ponen y quitan del genoma secuencias especiales de DNA46 A diferencia de la recom binación general, la recombinación genética específica de lugar está guiada por una enzima de recom binación que reconoce secuen-
Recombinación genética
289
,secuencias repetidas, sim ilares pero no idénticas,
c
LA DETECCION DE UN ERROR ABORTA EL APAREAMIENTO E IMPIDE LA RECOMBINACIÓN INTERCAMBIO DE CADENAS
OCURRE RECOMBINACION SI LA CORRECCIÓN DE ERRORES FALLA
+
cias específicas de nucleótidos presentes en una o en ambas moléculas de DNA que se recom binan. No es necesario que se produzca un apareamiento de bases entre las moléculas de DNA que se recombinan, e incluso cuando éste se produ ce, la unión heterodúplex que se forma es tan sólo de unos cuantos pares de ba ses de longitud. Separando y volviendo a unir moléculas de DNA de doble hebra en lugares determinados, este tipo de recom binación permite que varios tipos de secuencias de DNA se desplacen dentro y entre cromosomas. La recom binación específica de lugar fue descubierta como el sistema m e diante el cual un virus bacteriano, el bacteriófago lambda, traslada su genoma dentro y fuera del crom osom a de E. coli. En su estado integrado el virus está es condido en el crom osom a bacteriano y se replica como parte del DNA del hués ped. Cuando el virus entra en una célula, se sintetiza una enzima codificada por el genoma del virus, la llamada integrasa lam bda . Esta enzima cataliza un proce so de recom binación que se inicia cuando múltiples copias de la proteína inte grasa se unen fuertemente a una secuencia especial del DNA del cromosoma cir cular del bacteriófago. Ahora, el complejo resultante DNA-proteína puede unirse a otra secuencia especial de DNA del cromosoma bacteriano, uniendo estrecha mente entre sí el crom osom a de la bacteria y del bacteriófago. Entonces, la inte grasa cataliza las reacciones necesarias de corte y empalme, utilizando una corta región de homología de secuencia para formar en el punto de unión una dimi nuta unión heterodúplex (Figura 6-68). La integrasa se parece a una DNA topoisomerasa en que forma una unión covalente reversible con el DNA en el lugar en el que rompe la cadena de DNA. El mismo tipo de m ecanism o de recom binación específica de lugar puede realizarse a la inversa por el bacteriófago lambda, permitiéndole salir de su lu gar de integración en el crom osom a de E. coli para multiplicarse rápidamente en la célula bacteriana. Esta reacción de eliminación está catalizada por un complejo de la enzim a integrasa y otra proteína del bacteriófago, la cual se sin tetiza por el virus únicam ente cuando la célula huésped está estresada. Si los lugares reconocidos por una enzima de recombinación como ésta se sueltan, en tonces el DNA comprendido entre ellos en lugar de ser eliminado será invertido (véase Figura 9-57). Muchas otras enzimas que catalizan procesos de recombinación específica de lugar se parecen a la integrasa lambda en que requieren una corta región de secuencias idénticas de DNA sobre las dos regiones de la hélice de DNA que se
290
Capítulo 6 : Mecanismos genéticos básicos
Figura 6 -67 La corrección de errores impide que se produzca recom binación general a partir de genomas desestabilizados que contienen secuencias repetidas. Estudios en bacterias y levaduras sugieren que el sistema de corrección de errores descrito previamente en la Figura 6-50 tiene la función adicional descrita aquí.
crom osom a circular del bacteriófago lambda
c
crom osom a bacteriano
LA INTEGRASA SE UNE
secuencias de lugar de unión com plejo proteico de la integrasa lambda
CATALISIS DE ROTURAY NUEVA UNIÓN DE LA DOBLE HEBRA
LA INTEGRASA SE DISOCIA
Figura 6 -6 8 La inserción de DNA del bacteriófago lam bda en el crom osom a bacteriano. En este ejemplo de recom binación específica de lugar la enzima integrasa lambda se une a una secuencia de DNA “de unión” de cada cromosoma, mientras hace cortes que generan cortas secuencias homólogas de DNA; entonces la integrasa cam bia las hebras y las une, formando una unión heterodúplex de 7 pares de bases de longitud. Cada una de las reacciones de rotura de cadenas y de unión de cadenas requiere nuevas uniones, que están producidas por la DNA topoisomerasa, mientras que la energía de rotura de un enlace fosfodiéster se alm acena en una unión covalente transitoria entre el DNA y la enzima (véase Figura 6-64).
DNA del bacteriófago integrado en el crom osom a bacteriano
van a unir. Debido a este requerimiento, cada una de las enzimas de esta clase es relativamente exigente respecto a las secuencias de DNA que recombina, de for ma que puede esperarse que catalice un proceso determinado de unión que sea útil para el virus, el plásmido, el elemento transponible o la célula que la presen te. Estas enzimas pueden utilizarse como herramientas en animales transgénicos para estudiar la influencia de determinados genes sobre el comportamiento celular, com o se ilustra en la Figura 6-69. Las enzimas de recom binación específica de lugar que cortan y vuelven a unir dos dobles hélices de DNA, a menudo lo hacen de una manera reversible: com o el caso del bacteriófago lambda, el mismo sistema enzimàtico que une dos moléculas de DNA tam bién puede separarlas de nuevo, recuperando de forma precisa la secuencia de ambas moléculas originales de DNA. Por ello, este tipo de recom binación se denomina recombinación conservativa específica de lugar para distinguirla de la recombinación transposicional específica de lugar, mecanísticam ente diferente, que exponemos a continuación.
La recom binación transposicional puede insertar un elemento genético móvil en cualquier secuencia de DNA47 Muchas secuencias móviles de DNA, incluyendo muchos virus y elementos transponibles, codifican integrasas que insertan su DNA en un cromosoma a tra vés de un mecanismo diferente del que utiliza el bacteriófago lambda. Como la integrasa lambda, cada una de estas enzimas reconoce una secuencia específica de DNA del elemento genético móvil cuya recom binación cataliza. A diferencia de la enzima de lambda, sin embargo, estas enzimas no requieren una secuencia de DNA “diana” específica y no forman ninguna unión heterodúplex. En lugar de ello, introducen cortes en ambos extremos de la secuencia lineal de DNA del elemento genético móvil y catalizan un ataque directo de estos extremos de DNA sobre la molécula de DNA diana, rompiendo dos enlaces fosfodiéster cer canos de la molécula diana. Debido a como están construidos estos cortes, en la molécula de DNA recom binante quedan dos pequeños huecos de una sola héli-
Recombinación genética
291
unidad de transcripción
gen de interés sin el prom otor
lugares reconocidos por la enzima de recom binación
ACTIVACION TEMPORAL DE LA ENZIMA DE
gen m arcador crom osom a
(A)
prom otor
lugar de term inación
proteína marcadora INCREMENTO BREVE DE TEMPERATURA DURANTE EL DESARROLLO EMBRIONARIO
(B)
el gen de interés activo proteina a pai del gen de inte PROLIFERACION CELULAR
células ocasionales pierden el gen m arcador y expresan el gen de interés
cada una de las células de un clon de células que ha perdido el gen m arcador expresará el gen de interés
ce, una a cada extremo del elemento móvil; estos huecos son rellenados por una DNA polimerasa, completándose así el proceso de recombinación. Tal como se ilustra en la Figura 6-70, este mecanismo genera una corta duplicación de la se cuencia de DNA diana adyacente; estas duplicaciones flanqueantes constituyen el sello que permite reconocer un proceso de recombinación específica de lugar, de este tipo. A partir del bacteriófago Mu se ha purificado en forma activa una integrasa de este tipo. Como la integrasa del bacteriófago lambda, realiza todas las operaciones de corte y empalme sin necesidad de ninguna fuente de energía (como el ATP). Existen enzimas semejantes a ésta en organismos tan diversos com o las bacterias, las moscas del vinagre y los humanos -com o discutire mos más adelante, todos estos organismos contienen elementos genéticos m ó viles.
Resumen Los m ecanism os d e recom binación genética perm iten q u e gra nd es zonas d el DNA d e doble h élice p ueda n desplazarse d e un crom osom a a otro. Existen dos grandes clases d e sistem as d e recom binación. En la recom binación gen eral, las reacciones iniciales se basan en extensas interacciones en tre pares d e bases d e cadenas d e las dos dobles hélices d e DNA qu e se recom binan. Como resultado d e ello, solam ente se p rod uce recom binación gen era l en tre dos m oléculas d e DNA q u e sean hom ólogos, y a u n q u e el proceso traslada secciones d e DNA en tre crom osom as, norm alm ente no altera ni la secuencia n i el orden d e los gen es en el crom osom a. P or otra parte, la re com binación específica d e lu ga r altera las posiciones relativas d e las secuencias d e nucleótidos en los crom osom as, debido a q u e las reacciones d e apaream iento d e p en d en d el reconocim iento, m ediado p o r una proteína, d e las dos secuencias d e DNA q u e se recom binan, d e fo rm a q u e no es necesaria la p resencia d e una larga se cu en cia hom ólogo. Los m ás com unes son dos tipos d e m ecanism os d e recom bina ción específicos d e luga r: (1) recom binación conservativa específica d e lugar, que p rod uce un h eterodúplex m uy corto y p o r lo tanto req u iere alguna zona d e secu en cia d e DNA q u e sea la m ism a en las dos m oléculas d e DNA, y (2) la recom binación transposicional específica d e lugar, q u e no prod uce heterodúplex y habitualm ente no requ iere n in gu n a secuencia específica sobre el DNA diana.
292
Capítulo 6 : Mecanismos genéticos básicos
Figura 6 -69 Utilización de una enzima de recom binación específica de lugar para activar un gen en un grupo de células en un animal transgénico. La molécula de DNA mostrada ha sido diseñada de forma que el gen de interés sólo se transcribe cuando se activa una enzima de recombinación específica de lugar, la cual elimina el gen marcador y une el promotor cerca del gen de interés. La enzima de recom binación está codificada por otra molécula de DNA (no se muestra en la figura) que se ha diseñado de forma que sólo se produzca la enzima cuando aumenta la temperatura. Ambas moléculas de DNA se introducen en los cromosom as del mismo animal transgénico. Cuando la temperatura de este animal se incrementa de forma transitoria, se produce un breve increm ento masivo de la síntesis de la enzima de recombinación, la cual produce una reorganización del DNA en una célula ocasional, eliminándose el gen marcador y activándose simultáneamente en gen de interés. (B) La estrategia puede utilizarse para activar perm anentem ente un gen de interés en pequeños clones de células de un animal en desarrollo. Los clones pueden ser identificados por la pérdida del producto del gen marcador el cual, por ejemplo, puede variar la pigmentación de la célula. Así pues, esta técnica permite estudiar el efecto de la expresión de cualquier gen de interés en un grupo de células de un animal intacto.
DNA vírico
¡ntegrasa la ¡ntegrasa corta la secuencia m óvil de DNA
HCT crom osom a diana 5'
la muesca es rellenada por la reparación del DNA DNA vírico integrado 3'
cromosoma
diana
(A)
LOH 5' ataque del DNA vírico sobre el DNA diana
3'
O — C-
—c —o
i
H
5'3'
3' 5'
y
cortas repeticiones de la secuencia de DNA diana
Virus, plásmidos y elementos genéticos transponibles48 En la descripción que hemos realizado de los mecanismos genéticos básicos, h e mos destacado su ventaja selectiva para la célula. Hemos visto que la supervi vencia de la célula a corto plazo depende por completo del mantenimiento de la información genética mediante el proceso de reparación del DNA, mientras que la multiplicación de la célula requiere que se produzca una replicación del DNA rápida y exacta. En una escala de tiempo más larga, la aparición de variantes ge néticas, de las que depende la evolución de las especies, está grandemente facili tada por la reordenación de los genes y las ocasionales redisposiciones de se cuencias del DNA generadas por la recom binación genética. Ahora vamos a examinar un grupo de elementos que al parecer actúan como parásitos, alteran do en su propio beneficio los mecanismos genéticos de la célula. Estos elem en tos genéticos son interesantes en sí mismos. Además, como pueden utilizar a fondo el metabolismo de la célula huésped para poder multiplicarse, se usan como poderosas herramientas para estudiar la maquinaria normal de la célula. Muchas secuencias de DNA pueden replicarse de forma independiente del resto del genoma. Estas secuencias presentan diferentes grados de independencia de sus células huésped. De ellas, los cromosomas de los virus son los más inde pendientes porque tienen un revestimiento proteico que les permite moverse li bremente de una célula a otra. En diferentes grados, los virus están estrechamente relacionados con los plásmidos y con los elementos transponibles, que son secuen cias de DNA que carecen de revestimiento, por lo que son más dependientes de las células huésped y han de replicarse dentro de una única célula y su descenden cia. Todavía más primitivas son algunas secuencias de DNA, de las que se sospe cha que son móviles porque se encuentran repetidas muchas veces en cada cro mosoma celular. Sin embargo, se desplazan o se multiplican tan raramente que no está claro si deben ser consideradas como elementos genéticos independientes. Empezamos la discusión con los virus, que son los elementos móviles mejor conocidos. Seguiremos con las propiedades de los plásmidos y de los elementos transponibles, algunos de los cuales tienen un gran parecido con los virus y, de hecho, pueden haber sido sus antecesores. Las secuencias de DNA muy repetiti vas de los cromosomas de vertebrados, se discuten en el Capítulo 8.
Los virus son elem entos genéticos móviles49
nuevo enlace fosfodiéster
0-C ' ,o
^
protón del agua
cO
i oo
(B) Figura 6 -7 0 Recombinación transposicional específica de lugar. (A) Generalidades de los procesos de rotura y nueva unión de una hebra que conducen a la integración del DNA lineal de doble hebra de un retrovirus {rojo) en un crom osom a de una célula animal {azul). En una etapa endonucleasa inicial, la enzima integrasa hace una muesca en una hebra a cada uno de los extremos de la secuencia de DNA vírico, exponiendo un grupo 3 ’-OH que sobresale. Cada uno de estos extremos 3 ’-OH dirige el ataque de un enlace fosfodiéster sobre la cadena opuesta de un lugar seleccionado al azar de un cromosom a diana. Ello inserta la secuencia de DNA vírico en el crom osom a diana, dejando cortas muescas a cada lado, que son rellenadas por procesos de reparación del DNA. Debido a que la m uesca se llena, este tipo de m ecanism o produce cortas repeticiones de la secuencia de DNA diana (de entre 3 y 12 nucleótidos de longitud, en negro, dependiendo de la enzima integrasa) a cada lado del segmento de DNA integrado. (B) Una visión a nivel atómico del ataque por un extremo de una cadena de DNA de (A) a un enlace fosfodiéster del DNA diana {azul). Este m ecanism o se parece al usado en la maduración del RNA y es claram ente diferente de la actividad sem ejante a topoisomerasa de la integrasa lambda. (Adaptado de K. Mizuuchi,/. Biol. Chem . 267:2127321276, 1992.)
Los virus fueron descritos por primera vez como agentes causantes de enferm e dades, que se pueden multiplicar únicamente en el interior de células y que, en virtud de su diminuto tamaño, atraviesan los filtros ultrafinos que retienen in-
Virus, plásmidos y elementos genéticos transponibles
293
cluso las bacterias más pequeñas. Antes de la utilización del microscopio, la na turaleza de los virus era oscura, aunque se sospechaba que podían ser genes desnudos que de alguna manera habían adquirido la capacidad de desplazarse de una célula a otra. El desarrollo de la ultracentrifugación, hacia los años 1930, hizo posible la separación de los virus de los componentes de las células hués ped, y a principios de los años 1940 se generalizó la idea de que todos los virus contienen ácidos nucleicos. La idea de que los virus realizan funciones sem ejan tes a las de los genes se confirmó gracias a estudios realizados en virus de bacte rias (bacteriófagos). En 1952 se demostró que el DNA del bacteriófago T4, pero no su proteína, penetra en la célula huésped bacteriana e inicia los procesos de replicación que conducen a la producción de varios cientos de virus dentro de cada célula infectada. Estas observaciones hicieron considerar a los virus como elementos genéti cos rodeados de una cubierta protectora que les permite desplazarse de una cé lula a otra. A menudo, la multiplicación vírica per se es letal para las células den tro de las que se produce; en muchos casos, la célula infectada, repleta de virus, se rompe (se lisa) permitiendo así a los virus hijos acceder a células vecinas. Mu chas de las m anifestaciones clínicas de la infección vírica reflejan este efecto citolítico de los virus. Por ejemplo, tanto los granitos de herpes formados por el vi rus del herpes com o las lesiones causadas por la viruela reflejan la rotura de las células epiteliales de un área local de la piel. El tipo de ácido nucleico de un virus, la estructura de su envoltura, la mane ra que tiene de entrar en la célula huésped y su mecanismo de replicación den tro de la célula huésped, varían considerablemente de un tipo de virus a otro.
La cubierta exterior de un virus puede ser una cápside proteica o una envoltura m em branosa50 Inicialm ente se pensó que la cubierta externa de los virus estaba formada por un sólo tipo de molécula proteica. Se creía que las infecciones víricas empezaban por la separación del crom osom a vírico (su ácido nucleico) de la cubierta protei ca, y que a continuación se producía la replicación del cromosoma dentro de la célula huésped, generándose muchas copias idénticas. Después de la síntesis de nuevas copias de la envoltura proteica específica del virus sobre moléculas de RNA m ensajero codificadas por el virus, podía producirse la formación de partí culas víricas hijas mediante el ensam blaje espontáneo de esta cubierta proteica rodeando los cromosomas víricos hijos (Figura 6-71). Ahora se sabe que estas ideas sobresimplifican extraordinariamente la di versidad de ciclos vitales víricos que existen. Por ejemplo, la proteína de cubierta que rodea el ácido nucleico de la mayoría de los virus (la cápside) contiene más de un tipo de cadena polipeptídica, a menudo dispuesta en varias capas (Figura 6-72). En muchos virus, además, la cápside proteica está recubierta a su vez por una m em brana formada por una bicapa lipídica que contiene proteínas. Mu chos de estos virus recubiertos adquieren su envoltura durante el proceso de brote de la m em brana plasmática (Figura 6-73). Este proceso de gemación per mite a las partículas víricas abandonar la célula sin romper la membrana plas m ática y, por lo tanto, sin matar a la célula. En la Figura 6-74 se presentan electronmicrografías que enfatizan las diferencias que existen entre las envolturas víricas.
Los genomas víricos se presentan en una gran variedad de form as víricas y pueden ser tanto de DNA como de RNA51 Como hem os visto anteriormente la doble hélice de DNA es estable y fácil de re parar. Si una cadena de un polinucleótido se estropea de forma accidental, su cadena complementaria permite que la alteración pueda ser corregida de forma adecuada. Sin embargo, este proceso de reparación no es importante para el caso de los pequeños cromosomas víricos que tan sólo contienen varios cientos
294
Capítulo 6 : Mecanismos genéticos básicos
DNA
célula
..proteína de la cubierta PENETRACIÓN EN UNA CÉLULA Y LIBERACIÓN DEL DNA
TRANSCRIPCIÓN
REPLICACIÓN
TRADUCCIÓN
proteína de la cubierta ENSAMBLAJE DE LAS PARTÍCULAS VÍRICAS HIJAS Y SALIDA DE LA CÉLULA J
Figura 6-71 El ciclo vital vírico m ás sencillo. El virus hipotético mostrado aquí está formado por una pequeña molécula de DNA de doble cadena, que codifica una sola proteína de la cápside vírica. Ninguno de los virus conocidos es tan sencillo.
de nucleótidos. La probabilidad de ser alterados accidentalmente es muy peque ña comparada con el riesgo que tiene un genoma celular que contiene millones de nucleótidos. Así pues, la información genética de un virus puede almacenarse y transpor tarse en varios tipos de formas no usuales, como el RNA en lugar del DNA. Un crom osom a vírico puede ser una cadena sencilla de RNA, una hélice de doble
cápside que contiene _ el crom osom a vírico (nucleocápside)„
proteínas transm em brana de la envoltura vírica la nucleocápside induce el ensam blaje de las proteínas de envoltura
GEMACION
bicapa lipidica
100 nm
(B)
Virus, plásmidos y elementos genéticos transponibles
Figura 6 -7 2 Cápsides de algunos virus, a escala. (A) Virus del tomate
achaparrado peludo; (B) poliovirus; (C) virus de simio 40 (SV40); (D) virus necrosante satélite del tabaco. Las estructuras de todas estas cápsides han sido determinadas por cristalografía de rayos X y se conocen a nivel atómico. (Por cortesía de Robert Grant, Stephan Crainic y lames M. Hogle.)
Figura 6 -73 Adquisición de una envoltura vírica. (A) Electron-
micrografia electrónica de un corte ultrafino de una célula animal de la que están saliendo por gemación varias copias de un virus con envoltura (virus Semliki forest). (B) Visión esquemática del ensamblaje de la envoltura y del proceso de gemación. Mientras que la bicapa lipidica que rodea la cápside es parasitada directamente a partir de la membrana plasmática de la célula huésped, las únicas proteínas de esta bicapa lipidica están codificadas por el genoma vírico. (Por cortesía de M. Olsen y G. Griffiths).
295
Figura 6 -7 4 Las envolturas de los virus. (A) Electronmicrografías con tinción negativa, (todas a la misma escala) de partículas víricas. (A) B acteriófag o T4, un virus de DNA, muy grande, que infecta a E. coli. El DNA se halla en la cabeza del bacteriófago y es “inyectado” a la bacteria a través de la cola cilindrica. (B) Virus X d e la p atata, un virus vegetal filamentoso que contiene un genoma de RNA. (C) A denovirus, un virus de DNA que puede infectar célula humanas. La superficie externa de este virus está formada por una cápside proteica. (D) Virus d e la gripe, un virus animal muy grande que tiene DNA y cuya cápside proteica está rodeada por una envoltura de tipo bicapa lipídica, que contiene una especie de espinas de glucoproteínas víricas. (A por cortesía de James Paulson; B por cortesía de Graham Hills; C por cortesía de Mei Lie Wong; D por cortesía de R.C. Williams y H.W. Fisher.)
cadena de RNA, una cadena circular sencilla o una cadena sencilla y lineal de DNA. Además, a pesar de que algunos cromosomas víricos son dobles hélices li neales, tam bién son habituales dobles hélices circulares de DNA y dobles hélices lineales más complejas. Por ejemplo, algunos virus tienen moléculas proteicas unidas covalentemente a los extremos 5 ’ de sus cadenas de DNA; las dobles héli ces de DNA de los poxvirus, muy grandes, tienen sus cadenas opuestas unidas covalentemente por sus extremos a través de uniones fosfodiéster (Figura 6-75).
Los crom osom as víricos codifican enzimas implicadas en la replicación de su ácido nucleico52 Cada tipo de genoma requiere trucos enzimáticos especiales para su replicación, y de esta forma, ha de codificar no sólo la proteína de la envoltura sino también una o más de las enzimas que necesita para la replicación del ácido nucleico vírico. La cantidad de información que un virus transporta al interior de una célula para asegurar su replicación selectiva varía notablemente. Por ejemplo, el DNA del bacteriófago T4, un virus relativamente grande, contiene unos 300 genes, en-
RNA de una sola hebra
DNA de una sola hebra
RNA de doble hebra
DNA de una sola hebra circular
DNA de doble hebra con los extrem os soldados
O
DNA de doble hebra circular
DNA de doble hebra
DNA de doble hebra con proteínas term inales unidas covalentem ente
Figura 6-75 Dibujo esquem ático de diversos tipos de genomas víricos. Los virus más pequeños sólo contienen unos cuantos genes, y pueden presentar un genoma de DNA o de RNA; los virus mayores contienen cientos de genes y tienen un genoma de DNA de doble cadena. Algunos ejemplos de estos tipos de virus : h eb ra sen cilla d e RNA -virus del mosaico del tabaco, bacteriófago R17, polivirus; d o b le h eb ra d e RNA -reovirus; h eb ra sen cilla d e DNA -parvovirus; h eb ra sen cilla circu lar d e DNA -bacteriófagos M 13, <))X174; d o b le h eb ra circu lar d e DNA -SV40 y poliomavirus; DNA d e d o b le h eb ra -bacteriófago T4, herpes virus; DNA d e d o b le h eb ra con p roteín as term in ales a so cia d a s cov alen tem en te -adenovirus; DNA d e d o b le h eb ra con extrem os so ld a d os cov alen tem en te -poxvirus. Los extremos peculiares de algunas de estas moléculas de DNA (así como sus formas circulares) superan la dificultad de la replicación de los últimos nucleótidos del final de la cadena de DNA (véanse págs. 362 y 389).
296
Capítulo 6 : Mecanismos genéticos básicos
100 nm
tre los cuales al menos 30 aseguran la rápida replicación del cromosoma T4 en su célula huésped, E. cotí (Figura 6-76). La replicación del DNA de T4 presenta la característica especial de que en su DNA se incorpora 5-hidroximetil-C en lugar de C. La composición de bases poco usual del DNA de T4 hace que se pueda dis tinguir fácilmente del DNA del huésped, y así protegerse selectivamente de la ac ción de nucleasas tam bién codificadas en el genoma de T4, las cuales degradan pues únicamente el DNA de E. cotí. Otras proteínas alteran las moléculas de RNA polimerasa de la célula huésped de modo que a diferentes estadios de infección transcriben diferentes juegos de genes del bacteriófago, de forma apropiada a las necesidades del fago. Los virus más pequeños de DNA, como el virus del simio SV40 y el diminuto bacteriófago M13, transportan una cantidad de información genética mucho menor. Estos virus dependen mucho más de las enzimas de la célula huésped, para llevar a cabo la síntesis de su DNA, parasitando la mayoría de las proteínas de replicación del DNA de la célula huésped. Sin embargo, la mayoría de los vi rus de DNA codifican proteínas que inician selectivamente la síntesis de su DNA, reconociendo una secuencia especial de nucleótidos en el virus que actúa como origen de replicación. Este hecho es esencial ya que así el virus puede superar las señales celulares de control que, de otro modo, harían que el DNA vírico se re plicara de acuerdo con el DNA de la célula huésped, es decir, duplicándose tan sólo en cada ciclo celular. Todavía no comprendemos cómo las células eucariotas consiguen regular la síntesis de su DNA. Los mecanismos utilizados por los virus para escaparse de esta regulación -lo s cuales resultan mucho más accesi bles para ser estudiados- pueden suponer avances en el estudio de estos m eca nismos reguladores. Los virus RNA presentan unos requerimientos muy especializados para su replicación, ya que para reproducir sus genomas, han de copiar las moléculas de RNA, lo cual significa polimerizar nucleósidos trifosfato sobre un patrón de RNA. Normalmente las células no tienen enzimas que lleven a cabo estas reacciones, por lo que para poder replicarse, incluso los pequeños virus RNA han de codifi car sus propias enzimas polimerasa dependientes de RNA. A continuación va mos a estudiar con más detalle algunos mecanismos de replicación de varios ti pos de virus.
Tanto los virus RNA como los virus DNA se replican mediante la form ación de cadenas com plem entarias53
subunidades de la DNA topoisom erasa DNA helicasa DNA primasa DNA helicasa DNA polimerasa subunidades de la DNA polim erasa 50
m iles de pares de nucleótidos
100 -
DNA ligasa
150-
proteína de unión a DNA de una sola hebra subunidad de la DNA topoisom erasa
Figura 6 -7 6 El crom osom a del bacteriófago T4, m ostrando la situación de los m ás de 30 genes que intervienen en la replicación del DNA de T4. El genoma del bacteriófago T4 está formado por más de 169 000 pares de nucleótidos que codifican más de 300 proteínas diferentes.
La replicación de los genomas de los virus RNA, como en el caso de la replica ción del DNA, tiene lugar a través de la formación de cadenas complementarias. En la mayoría de los casos de virus RNA, este proceso está catalizado por enzi mas RNA polimerasas RNA-dependientes (replicasas). Estas enzimas están codi ficadas por el cromosoma RNA vírico y a menudo se incorporan a las partículas víricas hijas, de forma que en cuanto uno de estos virus penetra en una célula, inmediatamente se empieza a replicar el RNA vírico. En todos los casos, las re plicasas se hallan empaquetadas dentro de la cápside de los virus llamados virus RNA de cadena negativa, como es el caso del virus de la gripe y el virus de la esto matitis vesicular. Los virus de cadena negativa se denominan de esta manera porque la cadena que infecta no codifica proteínas, sino que es su cadena com plementaria la que transporta las secuencias codificantes. Por ello, la cadena que infecta no puede actuar en ausencia de una replicasa que ya esté formada previamente. Por el contrario, el RNA de los virus RNA de cadena positiva, como es el caso de los polivirus, pueden actuar como mRNA, y producir una replicasa en cuanto entra en la célula; por ello el genoma desnudo es, en si mismo, infec cioso. La síntesis del RNA vírico siempre empieza en el extremo 3 ’ del RNA patrón, empezando en el extremo 5 ’ de la nueva molécula de RNA vírico y progresando en dirección 5 ’ a 3 ’ hasta que alcanza el extremo 5 ’ del RNA patrón. Para la sínte sis del RNA vírico no existen mecanismos correctores de errores, y las frecuen-
Virus, plásmidos y elementos genéticos transponibles
297
cias de error son similares a las que se presentan en la transcripción del DNA (al rededor de un error por cada 104 nucleótidos sintetizados). Ésta no es una defi ciencia demasiado importante ya que el cromosoma RNA es relativamente cor to. Por ello, los genomas de todos los virus RNA son más cortos que los de los grandes virus DNA. Todos los virus DNA comienzan su replicación en un origen de replicación en el que se une una proteína iniciadora especial que atrae a las enzimas de re plicación de la célula huésped (Figura 8-34). Sin embargo, existen muchos pro cesos diferentes de replicación. La complejidad de estos diferentes esquemas de replicación refleja, en parte, los problemas de replicar los extremos de una molé cula lineal sencilla de DNA, utilizando una DNA polimerasa que no puede em pezar la síntesis sin un cebador (véanse págs. 270-271). Los virus DNA han solu cionado este problema de maneras muy diversas: algunos tienen genomas circulares de DNA, los cuales, pues, no tienen extremos; otros tienen genomas li neales de DNA que repiten sus secuencias terminales o que acaban en un lazo; otros tienen unas proteínas terminales especiales que actúan directamente de cebadores de la DNA polimerasa (véase Figura 6-75).
Los virus utilizan la m aquinaria de tráfico intracelular de sus células huésped54 Todos los virus tienen una cantidad limitada de ácido nucleico en su genoma, por lo que han de parasitar procesos de la célula huésped para la mayoría de las etapas de su producción. De hecho, debido a que habitualmente los productos víricos se sintetizan en grandes cantidades durante la infección y debido tam bién a que durante su ciclo vital los virus siguen una ruta secuencial a través de los compartimientos de la célula huésped, las células infectadas por virus se han utilizado como importantes modelos para trazar las rutas de transporte intrace lular y para estudiar qué reacciones biosintéticas esenciales están compartimentalizadas en las células eucariotas. Los virus recubiertos que afectan a las células animales, en los cuales el ge noma está incluido en una m em brana de bicapa lipidica, han utilizado la compartimentalización de la célula hasta un grado especialmente preciso. Seguir el ciclo vital de un virus recubierto es hacer un “tour” a través de la célula. Un ejemplo bien estudiado es el virus Semliki forest, que consiste en un genoma de cadena sencilla de RNA rodeado por una cápside formado por una envoltura eicosaédrica (20 caras) dispuesta de forma regular y compuesta por muchas copias de una proteína (denominada proteina C). La nucleocápside (genoma + cápside) está rodeada por una bicapa lipidica situada muy cerca, que contiene única mente tres tipos de cadenas polipeptídicas, codificadas por el RNA vírico. Estas proteínas de envoltura forman heterotrímeros situados en la bicapa lipidica y
proteínas proteina C de envoltura de la cápside (A)
298
bicapa lipidica
Capítulo 6 : Mecanismos genéticos básicos
20 nm
Figura 6 -7 7 Estructura del virus Semliki forest. Dibujo esquem ático de una sección transversal (A) y visión tridimensional propuesta (B) del virus. (C) Reconstrucción tridimensional de la superficie del virus obtenida por micrografías crioelectrónicas de especím enes no contrastados. El virus tiene una masa total de 46 millones de daltons. (B, adaptado de S.C. Harrison, Curr. Opin. Struct. Biol. 2:293-299, 1992. Current Science; C, por cortesía de Stephen Fuller.)
apside
__
la nucleocápside ensam bla O ï» las proteínas de la envuelta
virus hijos
inserción de las proteínas de envoltura en la m em brana plasm ática
glucosilación de las proteínas envoltura ha concluido
que interactúan con la proteína C de la nucleocápside, uniendo la membrana con la nucleocápside (Figura 6-77). Las zonas glucosiladas de las proteínas de envoltura siempre están situadas en el exterior de la bicapa lipídica, y cada trí mero forma una “espina” que al microscopio electrónico se ve sobresaliendo de la superficie del virus (Figura 6-77C). La infección se inicia cuando una proteína de envoltura del virus se une a una proteína de una célula normal que actúa como su receptor en la membrana plasmática de la célula huésped. Entonces el virus utiliza el proceso endocítico normal de la célula para entrar en ella mediante endocitosis mediada por recep tor, y es liberado a los endosomas vecinos (como se discute en el Capítulo 13). Sin embargo, en lugar de ser transferido desde los endosomas a los lisosomas, el virus se escapa de los endosomas gracias a las propiedades especiales de una de sus proteínas de envoltura. Al pH ácido del endosoma esta proteína hace que la envoltura vírica se fusione con la mem brana del endosoma, liberando la nucleo cápside desnuda en el citosol. La nucleocápside pierde su cubierta en el citosol, liberando el RNA vírico, que entonces es traducido por los ribosomas de la célula huésped produciendo una RNA polimerasa codificada por el virus. Esta enzima, a su vez, produce muchas copias del RNA vírico, algunas de las cuales actúan como moléculas de mRNA dirigiendo la síntesis de proteínas estructurales del virus -la proteína C de la cápside y las tres proteínas de la envoltura. Las proteínas de la cápside y de la envoltura, recién sintetizadas, siguen vías separadas a través del citoplasma. Las proteínas de la envoltura, como las pro teínas de la mem brana plasmática de la célula huésped, son sintetizadas en los ribosomas que se hallan unidos al ER rugoso; por el contrario, la proteína de la cápside, como las proteínas citosólicas de la célula, se sintetiza por ribosomas que no se hallan unidos a membrana. Las proteínas recién sintetizadas de la cápside se unen al RNA vírico recientemente replicado, formando nuevas nucle-
Virus, plásmidos y elementos genéticos transponibles
F ig u ra 6 -7 8 Ciclo vital del virus Semlild forest. El virus parasita la célula huésped para la mayor parte de sus procesos biosintéticos.
299
ocápsides. Las proteínas de la envoltura, por el contrario, son insertadas en la mem brana del ER, donde son glucosiladas, transportadas hasta el complejo de Golgi y liberadas a la membrana plasmática (Figura 6-78). Finalm ente las nucleocápsides víricas y las proteínas de la envoltura se en cuentran en la membrana plasmática. Como resultado de una interacción espe cífica con un grupo de proteínas de envoltura, la nucleocápside forma una gema cuya envoltura contiene proteínas de envoltura embebidas en lípidos de la célu la huésped. Por último, la gema se libera, de forma que aparece un nuevo virus independiente de la célula. El agrupamiento de las proteínas de la envoltura mientras se ensamblan alrededor de la nucleocápside durante la gemación víri ca hace que las proteínas plasmáticas de la célula huésped queden excluidas de la partícula vírica final.
Diferentes virus recubiertos geman a partir de diferentes m em branas celulares55 Todas las proteínas de envoltura víricas son proteínas transmembrana que son sintetizadas en el ER. Como otras proteínas del ER, transportan señales que las dirigen a determinadas m embranas de la célula (véase Capítulo 13). Su localiza ción final determina el lugar en que se producirá la gemación de los virus. Las lí neas celulares epiteliales, por ejemplo, pueden formar láminas celulares polari zadas cuando se cultivan sobre superficies apropiadas como filtros porosos recubiertos de colágena. Cuando estas células polarizadas, que mantienen dife rentes dominios de m em brana plasmática basolateral y apical son infectadas por virus, algunos de ellos (como el virus de la gripe) geman exclusivamente a partir de la m em brana plasmática apical mientras que otros (como el virus de Semliki forest y el virus de la estomatitis vesicular) geman exclusivamente a par tir de la m em brana plasmática basolateral (Figura 6-79). Esta polaridad de ge mación indica que las proteínas de envoltura presentan señales de direccionamiento apical o basolateral, las cuales dirigen las proteínas a un solo dominio de la superficie celular; las proteínas, a su vez, hacen que el virus se ensamble en este dominio. Otros virus tienen proteínas de envoltura con diferentes tipos de señales de direccionamiento. Por ejemplo, Herpes virus es un virus de DNA que se replica
el virus de la gripe gema únicam ente a partir de la m em brana plasm ática apical
300
Capítulo 6 : Mecanismos genéticos básicos
Figura 6-79 Dos virus recubiertos que geman a partir de dos dominios de la m em brana plasm ática diferentes. Las electronmicrografías muestran que un tipo de virus recubierto gema a partir de la membrana apical mientras que el otro lo hace a partir de la membrana plasmática basolateral de la misma célula epitelial mantenida en cultivo. Estas células crecen con su superficie basai en contacto con la placa de cultivo. El área marcada en cada esquema corresponde a la electronmicrografía que se indica. (Micrografías por cortesía de E. Rodríguez-Bouland y D.D. Sabatini.)
el virus de la estom atitis vesicular gema únicam ente a partir de la m em brana plasmática basolateral
en el núcleo, donde se ensambla la nucleocápside, y luego adquiere una envol tura mediante gemación a través de la membrana nuclear interna en el lumen del retículo endoplasmático; así pues, las proteínas de la envoltura han de ser transportadas específicamente desde la membrana del retículo endoplasmático a la m em brana interna nuclear, probablemente vía la bicapa lipídica que rodea los poros nucleares. Por el contrario, flavivirus gema directamente en el lumen del retículo endoplasmático y bunyavirus gema en el complejo de Golgi, lo cual indica que sus proteínas de envoltura transportan señales para su retención en el retículo endoplasmático y en las membranas del Golgi respectivamente. Tras la gemación, las partículas recubiertas de los virus herpes, flavivirus y bunyavi rus quedan solubles en el lumen del retículo endoplasmático y del Golgi, y se desplazan hacia la superficie celular exactamente como si fueran proteínas de secreción; en la red trans del Golgi se incorporan a vesículas de transporte y son secretados de la célula por el proceso de secreción constitutiva (discutido en el Capítulo 13).
Los cromosom as víricos pueden integrarse en los cromosom as del huésped56 No siempre el resultado final de la entrada de un cromosoma vírico en una célula es su inmediata multiplicación produciendo un gran número de virus hijos. Mu chos virus entran en un estado de latencia en el que sus genomas se hallan pre sentes en la célula huésped pero en forma inactiva, de forma que no producen progenie. La latencia vírica se descubrió cuando se observó que la exposición de bacterias aparentemente no infectadas por virus a los rayos ultravioleta inducía la formación de progenie de bacteriófagos. Experimentos posteriores demostra ron que estas bacterias lisogénicas contienen en su cromosoma un cromosoma vírico latente pero completo. Estos cromosomas víricos integrados reciben el nombre de provirus. Los bacteriófagos que pueden integrar su DNA en los cromosomas bacteria nos se conocen como bacteriófagos temperados. El ejemplo prototípico es el b ac teriófago lambda, que ya hemos estudiado. Normalmente, cuando lambda in fecta una célula huésped E. coli adecuada, se multiplica produciendo varios cientos de partículas hijas que son liberadas cuando la célula bacteriana se lisa; este proceso se denomina infección lítica. Más raramente, los extremos libres de las moléculas de DNA infectantes se unen formando un DNA circular que queda integrado en el cromosoma circular huésped de E. coli mediante un proceso de recom binación específico de lugar. La bacteria lisogénica resultante, que trans porta el crom osom a provírico lambda, se multiplica norm alm ente hasta que se som ete a una agresión am biental, tal com o la exposición a luz ultravioleta o a radiaciones ionizantes. La debilitación resultante de la célula induce al virus integrado a dejar el crom osom a del huésped y a com enzar un ciclo normal de replicación vírica. De esta forma, el provirus integrado no ha de perecer n ece sariam ente con la célula huésped lesionada sino que tiene la oportunidad de escapar hacia otras células de E. coli (Figura 6-80).
La síntesis continuada de algunas proteínas víricas puede transform ar a las células en cancerosas57 Las células animales, así como las bacterias, pueden ofrecer una alternativa de crecim iento lítico a los virus. Las células permisivas permiten a los virus DNA multiplicarse líticamente, lo cual destruye la célula. Las células no permisivas permiten entrar a los virus DNA pero no les permiten multiplicarse líticamente; en un pequeño porcentaje de estas células, el cromosoma vírico puede integrarse en el genoma de la célula huésped, donde es replicado con el cromosoma hués ped, o puede formar un plásmido -u n a molécula circular de DNA- que se replica de una forma controlada sin matar a la célula. Algunas veces estas infecciones no permisivas producen un cambio genético en la célula huésped, llevándola a
Virus, plásmidos y elementos genéticos transponibles
301
célula bacteriana crom osom a huésped bacteriófago £ lambda
f
ADSORCION DE LA CELULA HUÉSPED E INYECCIÓN DEL DNA
EL DNA ADOPTA FORMA CIRCULAR
INTEGRACION DEL DNA EN EL CROMOSOMA HUÉSPED
SINTESIS DE LAS PROTEÍNAS VIRICAS NECESARIAS PARA LA FORMACIÓN DE LOS NUEVOS VIRUS
O REPLICACION RAPIDA DEL DNA VÍRICO UBRE Y EMPAQUETAMIENTO EN PARTÍCULAS VÍRICAS
° is
A EL DNA VÍRICO INTEGRADO SE REPLICA JUNTO CON EL CROMOSOMA HUÉSPED PRODUCIENDO NUEVAS COPIAS DE DNA VÍRICO INTEGRADO VIA LISOGENICA
?
LA LISIS CELULAR LIBERA UN GRAN NÚMERO DE VIRUS LIBRES
VIA LITICA
proliferar de una forma descontrolada, transformándose pues en su equivalente canceroso. En este caso, el virus DNA se denomina virus DNA tumoral y el pro ceso transformación neoplásica mediada por virus. Los virus tumorales de DNA más extensamente estudiados son dos papovavirus, el SV40 y el polioma. Su ca pacidad transformante se atribuye a algunas proteínas víricas que cooperan diri giendo las células quiescentes a proliferar -e s decir, dirigen las células de la fase G0 a la fase S. En las células permisivas, el cambio a la fase S (la fase del ciclo ce lular en la que se sintetiza el DNA) hace que el virus disponga de todas las enzi mas replicantes de la célula huésped, enzimas que son necesarias para la síntesis del DNA vírico. La síntesis de estas proteína víricas por un provirus en una célula no permisiva se produce superando algunos de los mecanismos normales de control del crecim iento de la célula y de toda su descendencia. De esta manera se sabe que algunos virus de DNA tumorales que infectan a humanos contribuyen al desarrollo de algunos tipos de cánceres humanos (aunque se sabe que en la gran mayoría de cánceres humanos no participan virus tumorales).
Los virus tum orales RNA son retrovirus58 Para uno de los grupos de virus RNA, el de los llamados virus tumorales RNA, la infección de una célula permisiva conduce a menudo a una liberación no letal (por gemación) de virus hijos a partir de la superficie de la célula y simultánea-
302
Capítulo 6 : Mecanismos genéticos básicos
F ig u ra6-80 Ciclo vital del bacteriófago lam bda. El genoma lambda contiene unos 50 000 pares de nucleótidos y codifica unas 50 proteínas. Su DNA de doble cadena puede presentarse en forma lineal y en forma circular. Tal com o muestra la figura, en la bacteria E. co li el bacteriófago se puede multiplicar por vía lítica o por vía lisogénica. Cuando el bacteriófago se hace crecer en estado lisogénico, una lesión de la célula hace que el DNA vírico integrado (provirus) salga del cromosom a huésped e inicie el crecim iento lítico. La entrada y salida del DNA del crom osom a son acontecim ientos de recom binación genética específicos de lugar, catalizados por la proteína integrasa de lambda (véase Figura 6 -6 8 ).
Figura 6-81 Transcriptasa inversa. (A) Estructura tridimensional de la enzima de HIV-1 (el virus del SIDA), determinada por cristalografía de rayos X. (B) Visión esquemática de un modelo sobre su actividad sobre un RNA patrón. Nótese que el dominio polimerasa RNAsa H {am arillo) tiene un dominio RNAsa {rojo) unido covalentemente que degrada una hebra de RNA en una hélice RNA/DNA. Esta actividad ayuda a la polimerasa a convertir la hélice híbrida inicial en una doble hélice de DNA. (A, por cortesía de hebra Tom Steitz; B, adaptado a partir de L A de DNA Kohlstaedt et al., Science 256:1783-1790, 1992. © 1992 theAAAS.)
hebra de RNA patrón el lugar activo de la imerasa sintetiza una hebra de DNA "pu lg a r"
"dedos"
\
dirección del desplazam iento de la enzima
el lugar activo de la RNAsa H degrada la hebra de RNA (A)
mente a un cambio genético en la célula infectada que la transforma en cance rosa. El m ecanismo a través del cual los virus RNA pueden generar una altera ción genética permanente no quedó aclarado hasta que se descubrió la enzima transcriptasa inversa, la cual transcribe las cadenas de RNA de estos virus a DNA com plem entario que se integra en el genoma de la célula huésped. Los vi rus tumorales RNA -en tre los que se cuentan el primer virus tumoral bien co nocido, el virus del sarcom a de Rous- son miembros de una gran clase de virus conocida como re tro v iru s . Estos virus se denominan de esta manera porque en una parte de su ciclo vital revierten los procesos normales de transcripción del DNA a RNA. La enzima tr a n s c r ip ta s a in v e rs a es una DNA polimerasa poco habitual que puede utilizar como patrón tanto RNA como DNA (Figura 6-81); está codificada por el RNA del retrovirus y se halla empaquetada dentro de cada cápside vírica durante la producción de nuevas partículas víricas. Cuando el RNA de una sola cadena del retrovirus entra en la célula, la transcriptasa inversa transportada en el interior de la cápside primero hace una copia en DNA de la cadena de RNA, dando lugar a una hélice híbrida DNA-RNA que es utilizada por la misma enzi ma para generar una doble hélice de dos cadenas de DNA. Los dos extremos de
DNA
INTEGRACION DE LA COPIA DE DNA EN EL CROMOSOMA
Figura 6-82 Ciclo vital de un retrovirus. El genoma del retrovirus consiste en una molécula de RNA de unos 8500 nucleótidos; en cada partícula vírica se hallan empaquetadas dos de estas moléculas. La enzima transcriptasa inversa es una DNA polimerasa que primero produce una copia de DNA a partir de la molécula del RNA vírico y luego produce una segunda cadena de DNA sobre la primera copia de DNA, generando así una copia de doble hélice de DNA a partir del genoma de RNA. La integración de este DNA de doble cadena en el cromosoma huésped, catalizada por una proteína vírica es necesaria para la síntesis de nuevas moléculas de RNA vírico por la RNA polimerasa de la célula huésped.
DNA integrado
DNA LA TRANSCRIPTASA INVERSA PRODUCE UNA DOBLE HÉLICE DNA/RNA Y UNA DOBLE HÉLICE DNA/DNA
t 1
RNA DNA
I 1
TRANSCRIPCION RNA
RNA
muchas
TRADUCCION proteína de la cápside 1
DE LA ENVOLTURA
proteína de la envoltu
/TiJ, —
ENSAMBLAJE DE MUCHAS PARTÍCULAS VÍRICAS, CADA UNA CONTENIENDO TRANSCRIPTASA INVERSA
ra
transcriptasa inversa
Virus, plásmidos y elementos genéticos transponibles
303
la molécula de DNA lineal del virus son reconocidos por una integrasa codifica da por el virus, que cataliza la inserción del DNA vírico en prácticamente cual quier sitio del crom osom a celular del huésped (véase Figura 6-70). El siguiente paso del proceso de infección es la transcripción del DNA vírico integrado m e diante una RNA polimerasa de la célula huésped, produciendo grandes cantida des de moléculas de RNA víricos idénticas al genoma original. Finalmente, estas moléculas de RNA son traducidas generando una cápside, una envoltura y pro teínas con actividad transcriptasa inversa. Estas proteínas se empaquetan con el RNA generando nuevas partículas víricas que salen de la célula por gemación de la membrana plasmática (véase Figura 6-82). Tanto los virus tumorales RNA como los DNA transforman las células porque la presencia permanente del DNA vírico en la célula produce la síntesis de nuevas proteínas que alteran el control de la proliferación de la célula huésped. Los genes que codifican estas proteínas se denominan oncogenes. A diferencia de los virus tumorales DNA, cuyos oncogenes típicamente codifican proteínas víricas esen ciales para la multiplicación del virus, los oncogenes transportados por los virus tumorales RNA son versiones modificadas de genes normales de la célula hués ped que no son necesarias para la replicación del virus. Dado que en la cápside del retrovirus únicamente se puede empaquetar una cantidad limitada de RNA, a menudo las secuencias oncogénicas adquiridas reemplazan una parte esencial del genoma del retrovirus. En los Capítulos 15 y 24 discutiremos de qué forma los oncogenes víricos han proporcionado indicios importantes sobre las causas y sobre la naturaleza del cáncer y de los m ecanismos normales que controlan el crecimiento y la división en los animales pluricelulares. También discutiremos de qué manera la integración al azar del DNA vírico en los genomas puede alterar los genes normales, afectando así el comportamiento celular (véase Figura 24-24).
El virus del SIDA es un retrovirus59 En 1982 apareció una nueva enfermedad de transmisión sexual que fue asociada a una forma no habitual de cáncer (el sarcoma de Kaposi) y una gran variedad de infecciones no habituales. Ambos problemas reflejan una severa deficiencia del sistema inmunitario -específicam ente de los linfocitos T colaboradores (T helpers)- por lo que la enfermedad se denominó síndrome de inmunodeficiencia adquirida, SIDA (Acquired Immune Deficiency Syndrome, AIDS). Cultivando linfocitos de pacientes en una fase inicial de la enfermedad, se aisló un retrovirus que ahora se sabe que es el agente causal del SIDA, enfermedad que se ha dise minado rápidamente com o una epidemia y que amenaza con causar la muerte de millones de personas en todo el mundo. El retrovirus, llamado virus de la inmunodeficiencia humana (HIV, de Hu man Immunodeficiency Virus) entra en los linfocitos T colaboradores uniéndose a una proteína de membrana plasmática funcionalmente importante denomi nada CD4 (discutida en el Capítulo 23). El virus HIV tiene dos características que le hacen especialmente mortífero. En primer lugar, el virus acaba matando las células T colaboradoras que infecta en lugar de vivir en simbiosis con ellas como hacen la mayoría de los demás retrovirus, y las células T colaboradoras son de vital im portancia en nuestra defensa contra la infección. En segundo lugar, el provirus tiende a permanecer en un estado de latencia en los cromosomas de una célula infectada sin producir virus hasta que es activado por un suceso raro y desconocido; esta habilidad de esconderse complica enorm emente cualquier intento de tratar la infección con fármacos antivíricos. La mayoría de la investigación actual sobre el SIDA intenta entender el ciclo vital de HIV. Ya se ha determinado la secuencia completa de nucleótidos del RNA vírico. Ello ha hecho posible identificar y estudiar cada una de las proteínas que codifica. Se está utilizando la estructura tridimensional de su transcriptasa inversa (véase Figura 6-81) para colaborar en el diseño de nuevos fármacos que inhiban la enzima. En la Figura 6-83 se presenta un mapa genético de HIV que muestra los nueve genes de este retrovirus.
304
Capítulo 6 : Mecanismos genéticos básicos
ne f
v if I vpr I
I vpu
c a p e ru z a
extrem os repetidos
3'
pot
Algunos elementos transponibles están estrecham ente relacionados con los retrovirus60 Debido a que muchos virus pueden entrar y salir de los cromosomas de sus célu las huésped, se cree que cualquier cromosoma grande debe contener varios pro virus. Probablemente estos genomas tam bién contienen diversas secuencias móviles de DNA, que no forman partículas víricas y que no pueden abandonar la célula. Estos elementos transponibles tienen una longitud media que oscila desde algunos cientos a varios miles de pares de bases, y normalmente en cada célula hay múltiples copias de ellos. Estos elementos pueden ser considerados como diminutos parásitos que están escondidos en los cromosomas. Ocasional mente, cada elemento transponible puede activarse para desplazarse a otro lugar del DNA de la misma célula, un proceso denominado transposición catalizado por su propia enzima de recom binación específica de lugar. Estas integrasas, también denominadas transposasas, a menudo están codificadas en el DNA del propio elemento de transposición. La mayoría de los elementos transponibles se desplazan muy raramente (la mayoría de los elementos de las bacterias, tan sólo una vez cada 105 generaciones celulares aproximadamente), por lo que a menudo resulta difícil distinguirlos de partes no móviles del cromosoma. No se conoce si la activación de su desplazamiento es muy rápida o no. Las transposiciones se pueden producir por varios mecanismos. Una gran familia de elementos transponibles utilizan un mecanismo que es indéntico a una parte del ciclo vital de un retrovirus. Estos elementos, denominados retrotransposones, están presentes en organismos tan diversos como las levaduras, las moscas y los mamíferos. Uno de los retrotransposones m ejor conocidos es el denominado elemento Tyl de las levaduras. La primera etapa de su transposi ción es la transcripción de todo el elemento transponible, produciendo una copia RNA del elemento, que tiene una longitud de más de 5000 nucleótidos. Este transcrito codifica una enzima transcriptasa inversa que hace una copia de la molécula de RNA a DNA de doble cadena a través de un intermediario híbrido RNA/DNA que imita los primeros estadios del proceso de infección por un retrovirus (véase Figura 6-82). La analogía continúa ya que la molécula de DNA circular utiliza una integrasa para integrarse en un lugar del cromosoma seleccionado al azar. A pesar del enorme parecido con el retrovirus, el elemento Tyl no tiene una envoltura proteica funcional, por lo que sólo puede desplazarse por el interior de una célula y de su progenie.
Figura 6-83 Mapa del genoma del HIV. El genoma consta de unos 9000 nucleótidos y contiene nueve genes, cuyas localizaciones se señalan en verde y en rojo. Tres de los nueve genes (los verdes) son com unes a todos los retrovirus: g a g codifica proteínas de cápside, en v codifica proteínas de envoltura y p o l codifica la transcriptasa inversa (véase Figura 6-81) y la integrasa (véase Figura 6-70). El genoma HIV es extraordinariamente com plejo, ya que contiene seis pequeños genes (en rojo) además de los tres (en verde) que normalmente son necesarios para el ciclo vital del retrovirus. Al m enos algunos de estos pequeños genes codifican proteínas que regulan la expresión de genes víricos y es tentador especular que es esta complejidad extra lo que hace a HIV tan mortífero. Como indican las lín eas rojas, para producir las proteínas Rev y Tat hace falta que se produzca maduración del RNA (splicing, véase Figura 8-7).
Otros elem entos transponibles se transfieren directamente a sí mismos desde un lugar a otro del genoma61 A diferencia de lo que ocurre con los retrotransposones, muchos elementos transponibles parecen no poder existir libres fuera del cromosoma del huésped; las transposasas que catalizan sus desplazamientos pueden actuar sobre el DNA del elemento transponible siempre que éste esté integrado en el cromosoma del huésped. La transposasa se une a una corta secuencia que está repetida en una orientación opuesta a cada extremo del elemento, permitiendo así que estos ex tremos se puedan unir mientras se cataliza el posterior proceso de recombina-
Virus, plásmidos y elementos genéticos transponibles
305
DNA PRODUCIDOS
DNA INICIALES cortas secuencias repetidas invertidas interm ediarios transitorios
k
k
elem ento transponible en el crom osom a dador A
■MMMn
5'
3' Á crom osom a diana B
smmm&sme
+
L
ción. Para el caso de algunos elementos transponibles, el mecanismo de trans posición difiere únicam ente en que la molécula lineal de DNA que se va a inte grar ha de ser eliminada de una molécula de DNA más larga, dejando una mues ca en el crom osom a vacante (Figura 6-84). Posteriormente, esta muesca se vuelve a soldar, pero en el proceso a menudo la secuencia de DNA es alterada, lo cual produce una m utación en el antiguo lugar del cromosoma. Otros elem entos transponibles se replican cuando se desplazan. En el caso mejor estudiado, en primer lugar se genera una conexión covalente entre el ele mento transponible y un lugar diana seleccionado al azar; entonces esta cone xión dispara la síntesis localizada de DNA que genera una copia del elemento transponible replicado insertada en un nuevo lugar del cromosoma, mientras que la otra copia permanece en el lugar original (Figura 6-85). El mecanismo está estrecham ente relacionado con el m ecanismo no replicativo que acabamos de describir y comienza casi de la misma manera; de hecho, algunos elementos transponibles se pueden desplazar mediante ambos sistemas. Además de desplazarse por sí mismos, todos los tipos de elementos transpo nibles pueden, de forma ocasional, desplazar o reordenar secuencias de DNA vecinas del genoma de la célula huésped. Por ejemplo, frecuentemente generan deleciones de secuencias adyacentes de nucleótidos, o las transportan a otros lugares. La presencia de elementos transponibles hace que las reordenaciones de las secuencias del DNA de los cromosomas sean mucho menos estables de lo que se había creído previamente, y probablemente los elementos transponibles son responsables de muchos cam bios evolutivos importantes del genoma (como se discute en el Capítulo 8). ¿También son importantes los elementos transponibles desde el punto de vista evolutivo como los precursores más antiguos de los virus? A pesar de que casi con toda seguridad los precursores de los retrovirus fueron retrotransposones, todos los elementos transponibles actuales dependen muy claramente de los mecanismos basados en las reacciones del DNA. Sin embargo, se cree que células muy primitivas debieron tener genomas de RNA en lugar de DNA, de forma que hemos de contemplar el metabolismo del RNA como el origen último de los virus.
Probablem ente la mayoría de los virus evolucionaron a partir de plásmidos62 Incluso los virus más grandes, dependen en gran medida de sus células huésped para la biosíntesis: por ejemplo, no se conoce ningún virus que sea capaz de sin tetizar sus propios ribosomas o de generar el ATP que necesita. Evidentemente, por tanto, las células han debido desarrollarse antes que los virus. Probablemen te, los precursores de los primeros virus fueron pequeños fragmentos de ácido nucleico que desarrollaron la capacidad de multiplicarse de forma independien te de los crom osom as de sus células huésped. Estos elementos de replicación in dependiente, llamados plásmidos, pueden replicarse indefinidamente fuera del cromosoma huésped. Existen plásmidos de DNA y plásmidos de RNA y, como ocurre con los virus, contienen una secuencia especial de nucleótidos que actúa
306
Capítulo 6 : Mecanismos genéticos básicos
crom osom a dador vuelto a unir 5' -
3' ^
-p
-
cortas secuencias repetidas de DNA diana en el crom osom a B
Figura 6 -84 Desplazamiento directo de un elemento transponible de un lugar a otro de un crom osom a. Los elementos transponibles de este tipo pueden ser reconocidos por sus “secuencias de DNA repetidas invertidas” (en n a ra n ja ) de sus extremos. Diferentes experimentos demuestran que la repetición de estas secuencias, las cuales pueden ser de tan sólo 20 nucleótidos, es todo lo que necesitan para sufrir una transposición mediante una transposasa especial asociada con el elemento. El m ecanism o mostrado aquí está estrecham ente relacionado con el utilizado por un retrovirus para integrar su DNA de doble hebra en un crom osom a (compárese con la Figura 6-70). A pesar de que la hendidura izquierda del crom osom a dador se llena, a menudo el proceso altera la secuencia de DNA, generando una mutación en el lugar dador (no se muestra).
como origen de replicación. Sin embargo, a diferencia de los virus, los plásmidos no pueden sintetizar una envoltura proteica y por lo tanto no pueden desplazar se fácilmente de una célula a otra. Los primeros plásmidos RNA debieron parecerse a los viroides encontrados en algunas células vegetales. Estas pequeñas moléculas circulares de RNA de tan sólo 300 o 400 nucleótidos de longitud se replican a pesar de que no codifican ninguna proteína. Al no tener envoltura proteica, los viroides existen como m o léculas de RNA desnudo y únicamente pasan de una planta a otra cuando las su perficies de las células dadora y aceptora se hallan alteradas, de forma que no existe una barrera de membrana para el paso de los viroides. Puede esperarse que bajo la presión de la selección natural, estos elementos de replicación inde pendiente adquirieran secuencias de nucleótidos de la célula huésped que les facilitaran su propia multiplicación, entre las que habría secuencias que codifi can proteínas. En efecto, algunos plásmidos actuales son bastante complejos, codificando proteínas y moléculas de RNA que regulan su replicación y proteí nas que controlan su separación en células hijas. Los mayores plásmidos cono cidos son cadenas circulares de doble hélice de DNA de más de 100 000 pares de bases de longitud. Probablemente, el primer virus apareció cuando un plásmido RNA adquirió un gen que codificaba una proteína de cápside. Sin embargo, una cápside puede contener una pequeña cantidad de ácido nucleico; así pues, un virus está limita do al número de genes que puede contener. Destinados a conseguir la máxima utilidad de su limitado genoma, algunos pequeños virus evolucionaron solapan do genes, estrategia según la cual una zona de la secuencia de nucleótidos que codifica una proteína, es utilizada (en la misma o en otra pauta de lectura) para codificar una segunda proteína. Otros virus desarrollaron cápsides mayores, con lo que pudieron acomodar mayor número de genes. Dotados de su habilidad única de transferir secuencias de ácidos nucleicos a través de barreras de especie, los virus jugaron casi con toda seguridad un im portante papel en la evolución de los organismos que infectaron. Muchos de ellos se recom binaron frecuentemente con el genoma de su célula huésped y con algún otro genoma, y de esta forma, pudieron tomar al azar pequeñas piezas del crom osom a del huésped y trasladarlas a otras células o a otros organismos. Además, las copias integradas del DNA vírico (provirus) han llegado a convertir se en una parte normal del genoma de la mayoría de los organismos. Como ejemplos de provirus como éstos pueden citarse la familia de bacteriófagos lambda y el llamado retrovirus endógeno, encontrado en numerosas copias en el genoma de los vertebrados. El DNA vírico integrado puede ser alterado de for ma que ya no pueda producir un virus completo pero que todavía pueda codifi car proteínas, algunas de las cuales pueden ser útiles para la célula huésped. Así pues, tal com o ocurre con el proceso de la reproducción sexual, los virus pueden acelerar la evolución facilitando el mezclado de los acervos de genes. El proceso por el cual las secuencias de DNA se transfieren entre genomas de diferentes célula huésped mediante un virus, se denomina transducción del DNA. Algunos virus que transducen DNA con frecuencias particularmente altas, son utilizados en investigación para trasladar genes de una célula a otra. Los vi rus y sus parientes próximos, los plásmidos y los elementos transponibles, tam bién son importantes para la biología celular en muchos otros aspectos. Gracias a su relativa simplicidad, por ejemplo, los estudios sobre su reproducción han progresado de una forma extraordinariamente rápida y han iluminado muchos de los mecanismos genéticos básicos de la célula. Además, tanto los virus como los plásmidos han sido elementos cruciales en el desarrollo de la tecnología del DNA recombinante, que describiremos en el Capítulo 7.
Resumen Los virus son partículas infecciosas form adas p o r una m olécula d e DNA o d e RNA (el genom a vírico) em paquetada en una cápside proteica, la cual, en el caso d e los
Virus, plásmidos y elementos genéticos transponibles
elem ento genético transponible en un crom osom a
DNA crom osóm ico com plejo proteico form ado
serie de com plicados procesos en los cuales la secuencia de DNA transponible es replicada e insertada en un nuevo lu g a r.
disociación
Figura 6 -85 Desplazamiento replicativo de un elemento transponible en el interior de un crom osom a. El elemento que se muestra se replica durante la transposición, de forma que su movimiento tiene lugar sin que el elemento se escinda de su lugar original. Las dos secuencias repetidas invertidas de DNA que normalmente flanquean los dos extremos de los elementos transponibles, se indican en n aran ja. Al iniciarse la transposición, la transposasa corta una de las dos cadenas de DNA a cada extremo del elem ento transponible, y entonces el elemento actúa com o patrón para la síntesis de DNA. Esta síntesis empieza por la adición de nucleótidos a los extremos 3 ’ de las secuencias de DNA del cromosoma. Se conocen más detalles de este proceso, pero son demasiado com plejos para poder ser ilustrados aquí.
307
virus recubiertos, está rodeada por una membrana del tipo de una bicapa lipídica. Tanto la estructura del genoma vírico como sus sistema de replicación varía consi derablemente de un tipo de virus a otro. Un virus puede multiplicarse únicamente en el interior de una célula huésped, cuyos mecanismos genéticos controla en bene ficio de su propia reproducción. Un resultado habitual de la infección vírica es la lisis de la célula infectada, con liberación de partículas víricas infecciosas. En algu nos casos, sin embargo, el cromosoma vírico se integra en un cromosoma de la célu la huésped, donde es replicado como un provirus con el genoma huésped. Se cree que muchos virus han evolucionado a partir de plásmidos, que son moléculas de DNA o de RNA autorreplicantes pero sin la capacidad de envolverse por sí solas en una cubierta proteica. Los elementos transponibles son secuencias de DNA que se diferencian de los virus en que únicamente son capaces de multiplicarse en el interior de su célula huésped y en las células descendientes de ella; como los plásmidos, no pueden exis tir deforma establefuera de las células pero a diferencia de los plásmidos, normal mente se replican como una parte integrante de un cromosoma. Sin embargo, algu nos elementos transponibles están estrechamente relacionados con los retrovirus y pueden desplazarse de un sitio a otro del genoma mediante la transcripción inversa de un intermediario de RNA A pesar de que tanto los virus como los elementos transponibles pueden considerarse como parásitos, muchas de las reordenaciones de las secuencias de DNA que ellos generan son importantes para la evolución de las células y de los organismos.
Bibliografia G en eral Judson, H.F. The Eighth Day of Creation: Makers of the Re volution in Biology. New York: Simon & Schuster, 1979. Lewin, B. Genes IV. Oxford, NY: Oxford University Press, 1990. Stent, G.S.; Calendar, R. Genetics: An Introductory Narrati ve, 2nd ed. San Francisco: W.H. Freeman, 1978. Watson, J.D.; Gilman, M.; Witkowski, ].; Zoller, M. Recombi nant DNA, 2nd ed. New York: W.H. Freeman, 1992. C itas 1. Chamberlin, M. Bacterial DNA-dependent RNA poly merases. In The Enzymes, 3rd ed., Vol. 15B (P. Boyer, ed.), pp. 61-108. New York: Academic Press, 1982. Gralla, ].D. Promoter recognition and mRNA initiation by Escherichia coli Esc70. Methods Enzymol. 185:3754,1990. Kerppola, T.K.; Kane, C.M. RNA polymerase: regulation of transcript elongation and termination. FASEB J. 5(13):2833-2842, 1991. 2. Collado-Vides, J.; Magasanik, B.; Gralla, J.D. Control site location and transcriptional regulation in Escherichia coli. Microbiol. Rev. 55(3):371-394, 1991. Murphy, S.; Moorefield, B.; Pieler, T. Common mecha nisms of promoter recognition by RNA polymerases II and III. Trends Genet. 5(4): 122-126, 1989. Travers, A.A. Structure and function of E. coli promoter DNA. Crc Crit. Rev. Biochem. 22(3): 181-219, 1987. 3. McClain, W.H. Transfer RNA identity. FASEB J. 7(1):7278,1993. Rich, A.; Kim, S.H. The three-dimensional structure of transfer RNA. Sci. Am. 238(l):52-62,1978. Sprinzl, M.; Hartmann, T.; Weber, J.; Blank, J.; Zeidler, R. Compilation of tRNA sequences and sequences of tRNA genes. Nucleic Acids Res. 17 Suppl.:l-172,1989.
308
Capítulo 6 : Mecanismos genéticos básicos
4. Cavarelli, ].; Moras, D. Recognition of tRNAs by aminoacyl-tRNA synthetases. FASEB J. 7(l):79-86,1993. Freist, W. Mechanisms of aminoacyl-tRNA synthetases: a critical consideration of recent results. Bioche mistry 28(17):6787-6795, 1989. Schimmel, P. Aminoacyl tRNA synthetases: general scheme of structure-function relationships in the polypeptides and recognition of transfer RNAs. Annu. Rev. Biochem. 56:125-158, 1987. 5. Crick, F.H.C. The genetic code. III. Sci. Am. 215(4):55-62, 1966. The Genetic Code. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., Vol. 31, 1966. Wong, J.T. Evolution of the genetic code. Microbiol. Sci. 5(6):174-181,1988. 6. Brimacombe, R. RNA-protein interactions in the Esche richia coli ribosome. Biochimie 73(7-8):927-936, 1991. Stem, S.; Powers, T.; Changchien, L.-M.; Noller, H.F. RNAprotein interaction in 30S ribosomal subunits: folding and function of 16S rRNA. Science 244(4906):783-790, 1989. Yonath, A.; Wittman, H.G. Challenging the three-di mensional structure of ribosomes. Trends Biochem. Sci. 14(8):329-335, 1989. 7. Nierhaus, K.H. The allosteric three-site model for the ri bosomal elongation cycle: features and future. Bio chemistry 29{2l):4997-5008, 1990. Noller, H.F. Peptidyl transferase: protein, ribonucleoprotein, or RNA?/. Bacteriol. 175(17):5297-5300, 1993. Watson, J.D. The involvement of RNA in the synthesis of proteins. Science 140:17-26, 1963. 8. Craigen, W.J.; Lee, C.C.; Caskey, C.T. Recent advances in peptide chain termination. Mol. Microbiol. 4(6):861865,1990. Tate, W.P.; Brown, C.M. Translational termination: “stop” for protein synthesis or “pause” for regulation of gene expression. Biochemistry 31(9):2443-2450,1992.
9. Gualerzi, C.O.; Pon, C.L. Initiation of mRNA translation in prokaryotes. Biochemistry 29(25):5881-5889,1990. Hunt, T. The initiation of protein synthesis. Trends Biochem. Sci. 5:178-181,1980. 10. Jacques, N.; Dreyfus, M. Translation initiation in Esche richia coli: old and new questions. Mol. Microbiol. 4(7):1063-1067,1990. Kozak, M. Comparison of initiation of protein synthesis in procaryotes, eucaryotes, and organelles. Microbiol. Rev. 47:1-45,1983. Kozak, M. Structural features in eukaryotic mRNAs that modulate the initiation of translation. /. Biol. Chem. 266(30): 19867-19870, 1991. Yoon, H.; Donohue, T.F. Control of translation initiation in Saccharomyces cerevisiae. Mol. Microbiol. 6(11): 1413-1419, 1992. 11. Hesketh, J.E.; Pryme, I.F. Interaction between mRNA, ri bosomes and the cytoskeleton. Biochem. /. 277 (Pt 1):1-10,1991.. Rich, A. Polyribosomes. Sci. Am. 209(6):44-53,1963. Ryazanov, A.G.; Ovchinikov, L.P.; Spirin, A.S. Develop ment of structural organization of protein-synthesi zing machinery from prokaryotes to eukaryotes. Biosystems 20(3):275-288,1987. 12. Hershey, J.W.B. Overview: phosphorylation and transla tion control. Enzyme 44(1-4): 17-27,1990. Lindahl, L.; Hinnebusch, A. Diversity of mechanisms in the regulation of translation in prokaryotes and lo wer eukaryotes. Curr. Opin. Genet. Dev. 2(5):720-726, 1992. Merrick, W.C. Mechanism and regulation of eukaryotic protein synthesis. Microbiol. Rev. 56(2):291-315, 1992. 13. Riis, B.; Rattan, S.I.; Clark, B.F.; Merrick, W.C. Eukaryo tic protein elongation factors. Trends Biochem. Sci. 15(11): 420-424, 1990 Soli, D. The accuracy of aminoacylation-ensuring the fi delity of the genetic code. Experientia 46(11-12):10891096,1990. Thompson, R.C. EFTu provides an internal kinetic stan dard for translational accuracy. Trends Biochem. Sci. 13:91-93,1988. 14. Jiménez, A. Inhibitors of translation. Trends Biochem. Sci. 1:28-30,1988. Lord, J.M., Hartley, M.R.; Roberts, L.M. Ribosome inac tivating proteins of plants. Semin. Cell Biol. 2(1):1522, 1991. Perentesis, J.P.; Miller, S.P.; Brodley, J.W. Protein toxin inhibitors of protein synthesis. Biofactors 3(3):173184,1992. 15. Campbell, J.H. An RNA replisome as the ancestor of the ribosome./. Mol. Evol.32(l):3-5, 1991. Lake, J.A. Evolving ribosome structure: domains in archaebacteria, eubacteria, eocytes and eukaryotes. Annu. Rev. Biochem. 54:507-530,1985. Orgel, L.E. RNA catalysis and the origin of life. J. Theor. Biol. 123:127-149, 1983. 16. Barnes, D.E.; Lindahl, T.; Sedgwick, B. DNA repair. Curr. Opin. Cell Biol. 5(3):424-433,1993. Friedberg, E.C. DNA Repair. San Francisco: W.H. Free man, 1985. Wevrick, R.; Buchwald, M. Mammalian DNA-repair ge nes. Curr. Opin. Genet. Dev. 3(3):470-474,1993.
Bibliografía
17. Behe, M.J. Histone deletion mutants challenge the mo lecular clock hypothesis. Trends Biochem. Sci. 15(10): 374-376,1990. Wilson, A.C.; Carlson, S.S.; White, T.J. Biochemical Evo lution. Annu. Rev. Biochem. 46:573-639,1977. Wilson, A.C.; Ochman, H.; Prager, E.M. Molecular time scale for evolution. Trends Genet. 3:241-247,1987. 18. Drake, J.W. Comparative rates of spontaneous muta tion. Nature 221:1132, 1969. Drake, J.W. Spontaneous mutation. Annu. Rev. Genet. 25:125-146, 1991. 19. Ohta, T.; Kimura, M. Functional organization of genetic material as a product of molecular evolution. Nature 233:118-119, 1971. (Las frecuencias de mutación li mitan el número máximo de genes en el organismo.) Smith, K.C. Spontaneous mutagenesis: experimental, gene tic and other factors. Mutat. Res. 277(2):139-16,1992. Vulliamy, T.; Mason, P.; Luzzatto, L. The molecular basis of glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency. Trends Genet. 8(4):138-143,1992. 20. Loomis, W.F. Similarities in eukaryotic genomes. Comp. Biochem. Physiol. 95B (l):21-27,1990. 21. Lindahl, T. Instability and decay of the primary structu re of DNA. Nature 362(6422):709-715,1993. Schrodinger, E. What Is Life? Cambridge, UK: Cambrid ge University Press, 1945. 22. Kornberg, A.; Baker, T.A. DNA Replication, 2nd ed. New York: W.H. Freeman, 1992. (Los Capítulos 4 y 6 des criben las DNA polimerasas; el Capítulo 9 describe la DNA ligasa; el Capítulo 21 abarca la enzimología de la reparación del DNA.) 23. Hoeijmakers, J.H. Nucleotide excision repair I: from E. coli to yeast. Trends Genet. 9(5):173-177,1993. Hoeijmakers, J.H. Nucleotide excision repair II: from E. coli to mammals. Trends Genet. 9(6):211-217,1993. Sanear, A.Z.; Sanear, G.B. DNA repair enzymes. Annu. Rev. Biochem. 57:29-67,1988. 24. Elledge, S.J.; Zhou, Z.; Allen, J.B. Ribonucleotide reduc tase: regulation, regulation, regulation. Trends Bio chem. Sci. 17(3):119-123,1992. Walker, G.C. Inducible DNA repair systems. Annu. Rev. Biochem. 54:425-457,1985. Witkin, E.M. RecA protein in the SOS response: milesto nes and mysteries. Biochimie 73(2-3):133-141,1991. 25. Perutz, M.F. Frequency of abnormal human haemoglo bins caused by C->T transitions in CpG dinucleoti des./. Mol. Biol. 213(2):203-206,1990. 26. Baker, T.A.; Wickner, S.H. Genetics and enzymology of DNA replication in Escherichia coli. Annu. Rev. Genet. 26:447-477, 1992. Kornberg, A.; Baker, T.A. DNA Replication, 2nd ed. New York: W.H. Freeman, 1992. So, A.G.; Downey, K.M. Eukaryotic DNA replication. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 27(1-2):129-155,1992. 27. Linn, S. How many pols does it take to replicate nuclear DNA? Cell 66(2): 185-187,1991. Meselsohn, M.; Stahl, F.W. The replication of DNA in E. coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 44:671-682,1958. Young, M.C.; Reddy, M.K.; von Hippel, P.H. Structure and function of the bacteriophage T4 DNA polymerase holoenzyme. Biochemistry31 (37) :8675-8690,1992. 28. Inman, R.B.; Schnos, M. Structure of branch points in repli cating DNA presence of single-stranded connections in lambda DNA branch points./. Mol Biol. 56:319-325,1971.
309
29.
30.
31.
32.
33.
34.
35.
36.
37.
Ogawa, T.; Okazaki, T. Discontinuous DNA replication. Annu. Rev. Biochem. 49:421-457, 1980. Thommes, P.; Hubscher, U. Eukaryotic DNA replica tion. Enzymes and proteins acting at the fork. Eur. J. Biochem. 194(3):699-712,1990. Echols, H.; Goodman, M.F. Fidelity mechanism in DNA replication. Annu. Rev. Biochem. 60:477-511,1991. Fersht, A.R. Enzymatic editing mechanisms in protein synthesis and DNA replication. Trends Biochem. Sci. 5:262-265,1980. Goodman, M.F.; Creighton, S.; Bloom, L.B.; Petruska, J. Biochemical basis of DNA replication fidelity. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 28(2) :83-126, 1993. Crouch, R.J. Ribonuclease H: from discovery to 3D structure. New Biol. 2(9):771-777,1990. Kaguni, L.S.; Lehman, I.R. Eukaryotic DNA polymeraseprimase: structure, mechanism and function. Biochim. Biophys. Acta 950(2):87-101, 1988. Rowen, L.; Kornberg, A. Primase, the dnaG protein of Escherichia coli: an enzyme which starts DNA chains. /. Biol. Chem. 253:758-764,1978. Lohman, T.M. Helicase-catalyzed DNA unwinding. /. Biol. Chem. 268(4):2269-2272, 1993. Meyer, R.R.; Laine, P.S. The single-stranded DNA-binding protein of Escherichia coli. Microbiol. Rev. 54(4):342-380, 1990. Thommes, P.; Hubscher, U. Eukaryotic DNA helicases: essential enzymes for DNA transactions. Chromoso ma 101(8):467-473, 1992. Kong, X.-P.; Onrust, R.; O’Donnell, M.; Kuriyan, I. Three-dimensional structure of the beta subunit of E. coli DNA polymerase III holoenzyme: a sliding DNA clamp. Ce//69(3):425-437,1992. Alberts, B.M. Protein machines mediate the basic gene tic processes. Trends Genet. 1:26-30,1985. Nossal, N.G. Protein-protein interactions at a DNA rep lication fork: bacteriophage T4 as a model. FASEB J. 6(3):871-878, 1992. Stukenberg, P.T.; Studwell-Vaughan, P.S.; O’Donnell, M. Mechanism of the sliding beta-clamp of DNA polyme rase III holoenzyme./. Biol. Chem. 266(17):11328-11334, 1991. Barras, F.; Marinus, M.G. The great GATC: DNA méthy lation in E. coli. Trends Genet. 5(5):139-143,1989. Heywood, L.A.; Burke, J.F. Mismatch repair in mamma lian cells. Bioessays 12(10):473-477, 1990. Modrich, P. Methyl-directed DNA mismatch correction. /. Biol. Chem. 264(12):6597-6600, 1989. Echols, H.Nucleoprotein structures initiating DNA re plication, transcription, and site-specific recombina tion./. Biol. Chem. 265(25):14697-14700,1990. Georgopoulos, C. The E. coli dnaA initiation protein, a pro tein for all seasons. Trends Genet. 5(10):319-321,1989. Salas, M. Protein-priming of DNA replication. Annu. Rev. Biochem. 60:39-71, 1991. Drlica, K. Bacterial topoisomerses and the control of DNA supercoiling. Trends Genet. 6(12):433-437, 1990. Sternglanz, R. DNA topoisomerases. Curr. Opin. Cell Biol. l(3):533-535, 1989. Wang, J.C. DNA topoisomerases: why so many? /. Biol. Chem. 266(11):6659-6662, 1991. Gruss, C.; Sogo, J.M. Chromatin replication. Bioessays 14(l):l-8, 1992.
310
Capítulo 6 : Mecanismos genéticos básicos
38.
39.
40.
41.
Wang, T.S.-F. Eukaryotic DNA polymerases. Annu. Rev. Biochem. 60:513-552,1991. Roeder, G.S. Chromosomes synapsis and genetic re combination: their roles in meiotic chromosome se gregation. Trends Genet. 6(12):385-389, 1990. Sadowski, P.D. Site-specific genetic recombination: hops, flips and flops. FASEB J. 7(9):760-767,1993. Whitehouse, H.L.K. Genetic Recombination: Under standing the Mechanisms. New York: Wiley, 1982. Camerini-Otero, R.D.; Hsieh, P. Parallel DNA triplexes, homologous recombination, and other homologydependent DNA interactions. Cell 73 (2) :217-223, 1993. Smith, G.R. Homologous recombination in E. coli: mul tiple pathways for multiple reasons. Cell 58(5) :807809, 1989. West, S.C. Enzymes and moleclar mechanisms of gene tic recombination. Annu. Rev. Biochem. 61:603-640, 1992. Lloyd, R.G.; Sharpies, G.J. Genetic analysis of recombina tion in prokaiyotes. Curr. Opin. Genet. Dev. 2(5):683690,1992. Lohman, T.M. Escherichia coli DNA helicases: mecha nisms of DNA unwinding. Mol. Microbiol. 6(1):5-14, 1992. Weinstock, G.M. General recombination in Escherichia coli. In Escherichia coli and Salmonella Typhimurium: Cellular and Molecular Biology (F.C. Neidhardt, ed.), pp. 1034-1043. Washington, DC: Ameri can Society for Microbiology, 1987. Bradley, S.G. DNA reassociation and base composition.
Society for Applied Bacteriology Symposium Series 8:11-26, 1980. Gotoh, O. Prediction of melting profiles and local helix sta bility for sequenced DNA. Adv. Biophys. 16:1-52,1983. Wetmur, J.G.; Davidson, N. Kinetics of renaturation of DNA./. Mol. Biol. 31:349-370, 1968. 42. Eggleston, A.K.; Kowalczykowski, S.C. An overview of homologous pairing and DNA strand exchange pro teins. Biochimie 73(2-3):163-176, 1991. Kowalczykowski, S.C. Biochemical and biological func tion of Escherichia coli RecA protein: behavior of mu tant RecA proteins. Biochimie 73(2-3):289-304, 1991. Roca, A.I., Cox, M.M. The RecA protein: structure and func tion. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 25(6):415-456, 1990. 43. Holliday, R. The history of the DNA heteroduplex. Bioes says 12(3): 133-142, 1990. Kowalczykowski, S.C. Biochemistry of genetic recombina tion: energetics and mechanism of DNA strand exchan ge. Annu. Rev. Biophys. Biophys. Chem. 20:539-575,1991. Messelsohn, M.S.; Radding, C.M. A general model for ge netic recombination. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72:358361,1975. 44. Fogel, S.; Mortimer, R.K.; Lusnak, K. Mechanisms of meiotic gene conversion or “wanderings on a foreign strand.” In The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces Cerevisiae: Life Cycle and Inehritance (J.N. Strathern, ed.), pp. 289-340. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1981. Kobayashi, I. Mechanisms for gene conversion and ho mologous recombination: the double-strand break repair model and the successive half crossing-over model. Adv. Biophys. 28:81-133,1992.
45.
46.
47.
48.
49.
50.
51.
52.
53.
Kourilsky, P. Molecular mechanisms of gene conversion in higher cells. Trends Genet. 2:60-62,1986. Radman, M. Mismatch repair and the fidelity of genetic recombiantion. Genome 31 (l):68-73,1989. Rayssiguier, C.; Thaler, D.S.; Radman, M. The barrier to recombination between Escherichia coli and Salmo nella typhimurium is disrupted in mismatch repair mutants. Nature 342(6248) :396-401,1989. Landy, A. Dynamic, structural, and regulatory aspects of lambda site-specific rcombination. Annu. Rev. Biochem. 58:913-949,1989. O’Gorman, S.; Fox, D.T.; Wahl, G.M. Recombinase-mediated gene activation and site-specific integration in mammalian cells. Science 251(4999): 1351-1355,1991. Stark, W.M.; Boocock, M.R.; Sherratt, D J. Catalysis by site-specific recombinases. Trends Genet. 8(12):432439,1992. Mizuuchi, K. Transpositional recombination: mecha nistic insights from studies of mu and other ele ments. Annu. Rev. Biochem. 61:1011-1051,1992. Borg, D.E.; Howe, M.M., ed. Mobile DNA. Washington, DC: American Society for Microbiology, 1989. Joklik, W.K., ed. Virology, 2nd ed. Norwalk, CT: Apple ton & Lange, 1985. Levine, a. Viruses. New York: Scientific American Li brary, 1992. Hershey, A.D.; Chase, M. Independent functions of viral protein and nuclec acid in growth of bacteirphage. /. Gen. Physiol. 36:39-56,1952. Brock, T.D. The Emergence of Bacterial Genetics. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1990. (El Capítulo 6 ofrece una perspectiva his tórica de la investigación sobre bacteriófagos.) Fields, B.N., ed. Virology. New York: Raven Press, 1985. (Los Capítulos 3 y 4 discuten la estructura de la cápside vírica y las membranas víricas, respectivamente.) Simons, K.; Garoff, H.; Helenius, A. How an animal virus gets into and out its host cell. Sci. Am. 246(2) :58-66,1982. Fields, B.N., ed. Virology. New York: Raven Press, 1985. (El Capítulo 5 resume los tipos de genomas víricos.) Gierer, A; Schramm, G. Infectivity of ribonucleic acid from tobacco mosaic virus. Nature 177:702-703,1956. Strauss, E.G.; Strauss, J.H. RNA viruses: genome structu re and evolution. Curr. Opin. Genet. Dev. 1(4):485493,1991. Borowiec, JA ; Dean, F.B.; Bullock, PA ; Hurwitz, J. Binding and unwinding-how T antigen engages the SV40 origin of DNA replication. G?//60(2):181-184,1990. Carlson, K.; Overvatn, A. Bacteriophage T4 endonuclea ses II and IV, oppositely affected by dCMP hydroxymethylase activity, have different roles in the degra dation and in the RNA polymerase-dependent replication of T4 cytosine containing DNA. Genetics 114(3):669-685,1986. Cohen, S.S. Virus-induced Enzymes. New York: Colum bia University Press, 1968. David, C.; Gargouri-Bouzid, R.; Haenni, A.-L. RNA repli cation of plant viruses containing an RNA genome. Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 42:157-227,1992.
Bibliografía
54.
55.
56.
57.
58.
59. 60.
Kornberg, A.; Baker, TA. DNA Replication, 2nd ed. New York: W.H. Freeman, 1992. (Los Capítulos 17 y 19 describen la replicación de los fagos DNA y virus ani males.) Kielian, M.; Jungerwirth, S. Mechanisms of enveloped virus entry into cells. Mol. Biol. Med. 7(1):17-31,1990. White, J.M. Membrane fusion. Science 258(5084):917924.1992. Zhao, H.; Garoff, H. Role of cell surface spikes in alphavirus budding./. Virol. 66(12):7089-7095,1992. Griffiths, G.; Rottier, P. Cell biology of viruses that as semble along the biosynthetic pathway. Semin. Cell Biol. 3(5):367-381,1992. Campbell, A.M. Thirty years ago in genetics: prophage insertion into bacterial chromosomes. Genetics 133(3):433-438, 1993. Friedman, D.I. Interaction between bacteriophage lambda and its Escherichia coli host. Curr. Opin. Ge net. Dev. 2(5):727-738,1992. Tooze, J. DNA Tumor Viruses. Molecular Biology of Tu mor Viruses, 2nd ed., Part 2. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1980. (El Capí tulo 4 describe la transformación por los virus SV40 y polioma.) zur Hausen, H. Viruses in human cancers. Science 254(5035):1167-1173,1991. Baltimore, D. Viral RNA-dependent DNA polymerase. Nafure 226:1209-1211,1970. Varmus, H. Retroviruses. Science 240:1427-1435,1988. Whitcomb, J.M.; Hughes, S.H. Retroviral reverse tran scription and integration: progress and problems. Annu. Rev. Cell Biol. 8:275-306,1992. Gallo, R.C.; Montagnier, L. The chronology of AIDS re search. Nature 326(6112):435-436,1987. Boeke, J.D.; Chapman, K.B. Retrotransposition mecha nisms. Curr. Opin. Cell Biol. 3(3):502-507, 1991. Corees, V.G.; Geyer, P.K. Interactions of retrotransposons with the host genome: the case of the gypsy ele ment of Drosophila. Trends Genet. 7(3):86-90,1991. Sandmeyer, S.B. Yeast retrotransposons. Curr. Opin. Genet. Dev. 2(5):705-711,1992.
61. Gierl, A.; Frey, M. Eukaryotic transposable elements with short terminal inverted repeats. Curr. Opin. Ge net. Dev. l(4):494-497,1991. Haniford, D.B.; Chaconas, G. Mechanistic aspects of DNA transposition. Curr. Opin. Genet. Dev. 2(5):698704.1992. Mizuuchi, K. Mechanism of transposition of bacterio phage mu: polarity of the strand transfer reaction at the initiation of transposition. Cell 39:395-404,1984. 62. Levine, A. Viruses. New York: Scientific American Li brary, 1992. (El Capítulo 10 discute la evolución de los virus.) Novick, R.P. Plasmids. Sci. Am. 243(6):102-127,1980. Symons, R.H. The intriguing viroids and virusoids: what is their information content and how did they evolve? Mol. Plant-Microbe Interact. 4(2):111-121,1991.
311
Tecnología del DNA recombinante
__________
«■ ■ lü
m' • ’ ■
F rag m en tació n , sep aració n y secuenci ación de m oléculas de DNA H ibridación de ácidos nucleicos
V . rÚ '
''
Clonaje de DNA Ingeniería de DNA
Hasta principios de los años 70, el DNA era la molécula de la célula que planteaba más dificultades para su análisis bioquímico. Enormemente larga y químicamen te monótona, la secuencia de nucleótidos del DNA tan sólo podía ser estudiada a través de caminos indirectos -tales como la determinación de la secuencia de las proteínas o del RNA, o el análisis genético. Actualmente la situación ha cambiado por completo. De ser la macromolécula celular más difícil de analizar, el DNA ha pasado a ser la más fácil de estudiar. Hoy en día es posible separar regiones deter minadas del DNA, obtenerlas en cantidades prácticamente ilimitadas y determi nar su secuencia de nucleótidos a una velocidad de varios cientos de nucleótidos al día. Mediante variaciones sobre estas mismas técnicas, un gen puede ser alte rado (sometido a ingeniería) y ser transferido a células en cultivo o (con más difi cultad) a la línea germinal de animales, donde el gen modificado se incorpora como parte funcional y permanente del genoma. Estos adelantos técnicos han tenido un impacto espectacular en la biología celular, permitiendo el estudio de las células y sus macromoléculas mediante sistemas que antes eran inimaginables. Por ejemplo, han proporcionado la m a nera de determinar las funciones de muchas proteínas recién descubiertas y de sus dominios y de desenmarañar los complejos mecanismos que regulan la ex presión génica en eucariotas. También han hecho posible disponer de grandes cantidades de proteínas minoritarias que regulan el desarrollo y la proliferación celular. A nivel comercial resulta muy prometedor el uso de técnicas de este tipo para la producción a gran escala de hormonas proteicas y de vacunas que antes eran disponibles únicamente con un gran coste y trabajo. La tecnología del DNA recom binante constituye una mezcla de técnicas, al gunas de las cuales son nuevas y otras han sido adoptadas de otros campos de la ciencia, como la genética microbiana (véase Tabla 7-1). Las más importantes son: 1.
la rotura específica del DNA mediante nucleasas de restricción, que facilita enorm em ente el aislamiento y la manipulación de los genes individuales;
2.
la secuenciación rápida de todos los nucleótidos de un fragmento purifica do de DNA, que hace posible determinar los límites precisos de un gen y de la secuencia de aminoácidos que codifica;
3.
la hibridación de los ácidos nucleicos que hace posible localizar secuencias determinadas de DNA o de RNA, con una gran exactitud y sensibilidad, uti lizando la capacidad que tienen estas moléculas de unirse a secuencias complementarias de otros ácidos nucleicos;
313
4.
el clonaje del DNA, mediante el cual se puede conseguir que un fragmento de DNA se integre en un elemento génico autorreplicante (plásmido o vi rus) que habita en una bacteria, de tal manera que una molécula simple de DNA puede ser reproducida generando muchos miles de millones de co pias idénticas; y
5.
la ingeniería genética, mediante la cual se pueden alterar secuencias de DNA produciendo versiones modificadas de los genes, los cuales se pue den reinsertar en células u organismos.
En este capítulo se describirá cóm o la tecnología del DNA recombinante ha creado nuevas vías de aproximación experimental que han revolucionado el es tudio de la biología celular.
^ 5' 4 gK i } 0
Hpa I
GlH Z H U 3'
CORTE
Fragmentación, separación y secuenciación de moléculas de DNA1 Antes de los años 70 parecía imposible aislar un gen de un cromosoma. A dife rencia de las proteínas, los genes no existen en las células como entidades inde pendientes, sino como regiones de una molécula de DNA de gran tamaño. Aun que las moléculas de DNA se pueden fragmentar m ecánicamente al azar en pequeños trozos, un fragmento que contenga un gen aislado será uno entre cientos de miles de otros fragmentos, indiferenciables por su tamaño. ¿Cómo se puede purificar un gen? Debido a que todas las moléculas de DNA están forma das por una m ezcla aproximadamente equivalente de los mismos cuatro núcleotidos no pueden separarse, como se hace con las proteínas, según procedimien-
Eco Rl ■ 0 E H aK x H x H ^ 3' 3' ® { Z K i K a } Q [ g> 5, CORTE
Hind III
3'4ZHZ lK^lH]l H 3 & 5 CORTE
T abla 7-1 Algunas d e las e tap as prin cip ales del d esarrollo de la tecn ología del DNA reco m b in a n te
1869 1944
1953
M iesch er aisló por primera vez el DNA. Avery demostró que es el DNA y no la proteína el que contiene la
información genética durante la transformación bacteriana. W atson y C rick propusieron el modelo de la doble hélice para la estructura del DNA, basado en los resultados de rayos X de Franklin y Wilkins.
1957
K o m b erg descubrió la DNA polimerasa, la enzima que ahora se utiliza
1961
M arm u r y D oty descubrieron la renaturalización del DNA, estableciendo
para producir sondas de DNA marcadas. la especificidad y la posibilidad de las reacciones de hibridación de los ácidos nucleicos. 1962 A rber proporcionó la primera evidencia de la existencia de las nucleasas de restricción del DNA, que condujo a su posterior purrificación y utilización en la caracterización de la secuencia del DNA por parte de N athan s y H. Sm ith. 1966 N irenberg, O ch o a y K h oran a dilucidaron el código genético. 1967 G ellert descubrió la DNA ligasa, la enzima utilizada para unir fragmentos de DNA. 1972-1973 Se desarrollaron las técnicas de clonaje del DNA en los laboratorios de B oyer, C ohen, B erg y colaboradores, en la Universidad de Stanford y en la Universidad de California en San Francisco. 1975 S ou th ern desarrolló la hibridación tras transferencia sobre gel, para la detección de secuencias específicas de DNA. 1975-1977 S anger y B arrell y M axam y Gilbert desarrollaron métodos rápidos de secuenciación del DNA. 1981-1982 P alm iter y B rin ster produjeron un ratón transgénico; Spradling y Rubin produjeron moscas del vinagre transgénicas. 1985 M ullís y colaboradores inventaron la reacción en cadena de la polimerasa (PCR, de Polimerase Chain Reaction).
3 '4 1 ] [ aH I H I H I H í } 5' CORTE
Figura 7-1 Secuencias de nucleótidos del DNA reconocidas por cuatro nucleasas de restricción ampliamente utilizadas. Como ocurre en estos
ejemplos, estas secuencias suelen tener seis pares de bases y ser ''palindrómicas” (esto es, las secuencias de ambas hebras son iguales entre sí si se gira la hélice 180 grados alrededor del centro de la corta región de hélice que es reconocida). Las enzimas cortan las dos cadenas de DNA en el lugar de la secuencia de reconocimiento o cerca de ella. En el caso de algunas enzimas como Hpa I, el corte libera extremos romos; en otros casos como por ejemplo Eco RI, Hind III y Pst I, el corte es escalonado y crea extremos cohesivos. Las nucleasas de restricción se obtienen de varias especies de bacterias: Hpa I de Hemophilus parainfluenzae, Eco RI de Escherichia coli, Hind III de Hemophilus influenzae y Pst I es de
Providencia stuartii. 314
Capítulo 7 : Tecnología del DNA recombinante
P stI
tos basados en su diferente carga, composición o propiedades de unión. Ade más, aunque fuera posible diseñar un procedimiento de aislamiento, la cantidad de DNA necesaria para aislar un gen en cantidad útil para experimentos poste riores sería muy elevada. La solución a todos estos problemas apareció con el descubrimiento de las endonucleasas de restricción. Estas enzimas, que pueden aislarse de bacterias, cor tan la molécula de DNA de doble cadena en lugares discretos definidos por la se cuencia de nucleótidos, produciendo fragmentos de DNA de doble cadena de ta maños definidos. Distintas especies de bacteria fabrican diferentes endonucleasas de restricción con distintas especificidades de secuencia, y es relativamente fácil encontrar una endonucleasa de restricción que libere un fragmento de DNA que incluya a un determinado gen. El tamaño del fragmento liberado puede ser utiliza do para purificar parcialmente el gen de una mezcla. Más importante aún, el frag mento de DNA sirve, frecuentemente, como material de partida para la produc ción del gen muy puro en cantidades ilimitadas mediante clonaje del DNA. Empezaremos esta sección explicando cómo se utilizan las endonucleasas de restricción para producir fragmentos de DNA, y cómo estas moléculas de DNA (y otras) se separan en función de su tamaño. A continuación expondre mos cómo, después de purificar y amplificar el fragmento de DNA mediante clo naje, se puede determinar la secuencia en que se encuentran los nucleótidos en la molécula, mediante la secuenciación.
Las endonucleasas de restricción cortan las moléculas de DNA en secuencias nucleotídicas específicas2 Muchas bacterias producen unas enzimas denominadas nucleasas de restric ción, que las protegen, degradando las moléculas de DNA que han sido trans portadas al interior de las bacterias por los virus. Cada enzima reconoce una secuencia específica del DNA de entre cuatro y ocho nucleótidos. Cuando estas secuencias se presentan en el genoma de la propia bacteria, están “camufladas” gracias a la mediación de un residuo A o de un residuo C; cuando estas secuen cias se presentan en un DNA extraño, generalmente no se hallan metiladas y son por tanto atacadas por la nucleasa de restricción. Se han purificado muchas nu cleasas de restricción de diferentes especies bacterianas y actualmente existen más de 100 de estas enzimas comercializadas, la mayoría de las cuales reconocen diferentes secuencias de nucleótidos. Algunas endonucleasas de restricción cortan el DNA generando secuencias cortas de DNA de cadena sencilla en los extremos del fragmento (Figura 7-1). Este tipo de extremos se denomina cohesivo pues es complementario en secuen cia al que genera la misma endonucleasa de restricción en cualquier otro frag mento (Figura 7-2). Los extremos cohesivos permiten unir fácilmente fragmentos de DNA obtenidos con la misma endonucleasa de restricción (o con otra que genere los mismos extremos cohesivos). Las moléculas de DNA producidas me diante la unión de dos o más fragmentos de DNA se denominan moléculas de DNA recombinantes, y han hecho posible nuevas aproximaciones al estudio de los procesos biológicos.
T A AT
1 I I I r r m í-
AT AT
TTTTT
I I I I I I I I I 3
................ ... ■ ■ ■ T T AA
AA T T
i i i rt
t t t t
T T AA ■ ■ ■ M
I I
IT
AATT
5: I I I I I ! ! ! ! I I I I I 35' TT AA
T A AT
.............. i i i g: AT AT t
t
t t
t
g;
T T AA
' ' 1 ' IIJ-LL % Figura 7-2 Muchos tipos de nucleasas de restricción producen fragmentos de DNA con extrem os cohesivos. Los fragmentos de DNA que tengan los mismos extremos cohesivos se pueden unir mediante apareamiento de bases complementarias entre sus extremos cohesivos, tal com o se ilustra en la figura. En este ejemplo, los dos fragmentos de DNA que se unen entre sí fueron producidos por la nucleasa de restricción Eco RI (véase Figura 7-1).
Los mapas de restricción m uestran la distribución de pequeñas secuencias nucleotídicas a lo largo del cromosom a3 Una nucleasa de restricción determinada cortará cualquier doble hélice de DNA extraída de una célula, generando una serie de fragmentos de DNA (conocidos como fragmentos de restricción). Comparando los tamaños de los fragmentos de restricción generados a partir de una región génica determinada tras el trata miento con una combinación de diferentes nucleasas de restricción, se puede construir un m apa de restricción de esta región que muestre la localización de cada punto de corte (de restricción) en relación con los puntos de restricción ve cinos (Figura 7-3). Dado que cada nucleasa de restricción reconoce diferentes
Fragmentación, separación y secuenciación de moléculas de DNA
315
m olécula de DNA de 10kb
EXPERIMENTO
r
el corte con las nucleasas de restricción A y B conjuntam ente genera tres fragm entos
CONCLUSIÓN: La enzima A corta cerca de un extremo de la molécula. La enzima B puede cortar tanto en el mismo extremo como cerca del otro extremo. El tamaño de los fragmentos generados por ambas enzimas actuando conjuntamente elimina la primera alternativa y permite concluir que el orden de corte de las nucleasas de restricción es el que se muestra aquí.
el corte con la nucleasa de restricción B genera dos fragm entos
el corte con la nucleasa de restricción A genera dos fragm entos
B 5kb - 10kb
2kb 2kb! 3kb! 5kb !
2kb 8kb s u m a = 10kb
3kb I 7kb ! s u m a = 10kb
s u m a = 10kb
secuencias cortas de DNA, un mapa de restricción refleja la disposición de se cuencias de nucleótidos específicas en la región. Esto significa que se pueden comparar diferentes regiones de DNA (comparando sus mapas de restricción), sin tener que determinar sus secuencias de nucleótidos. Por ejemplo, comparando los mapas de restricción que se presentan en la Figura 7-4, podemos determinar que las regiones del cromosoma que codifican las cadenas de hemoglobina en el hombre, en el orangután y en el chimpancé han permanecido fundamentalmente inalteradas durante los entre 5 y 10 millones de años transcurridos desde que es tas especies divergieron por primera vez. Los mapas de restricción también son importantes para el clonaje del DNA y para la ingeniería genética, permitiendo localizar un gen de interés en un fragmento de restricción determinado y facili tando así su aislamiento. 0Í1 a b
c
hum ano a
chim pancé
I I
chim pancé pigm eo
U d
b
c
g
m m m m m m sm m m m
orangután
i g
a b e
gorila
d d*
c
I
m i
g
b
i
-■ 11
hbm íhmfg
0
a d
ef
i
h b ihef i g
g
i i ■m m u m a m mm
d
o mf
i
c
g
d
I
I.......
I
I
I
II
d
II
.
h b ¡ he
a
d
e hb m ih m f g i hbmihc ma
d
¡
i MHu i r
I^ h IM
I I
ié u i i i i i
fe
I 1
II
g^b g
f e
I J M
I I
g
f
)
e
I I
b e g
f
i 'i
i
ih f
m
i h
bmih
ma
d
cb g
f
I
III
I
JWI I I I
gtall
II
I
II I
I
b
h
f
I
h
I
bmihf
11
I g g f I II
g
a
................ I
b
d
__L _____________ _____________ J 10
d
I¡ ¡
hbm ihc ma
I g g li r
I \^m\ÍIC I I
ii
mapa de
restricción,
Ig g M
hbmíhmfg
...............II
dianas de
restricción
hbm ihc ma
1 ' g g íír ) i
c g
0
,
I
.1....1...... , I
gibón
0
mf
Figura 7-3 Mapa de restricción. Sencillo ejemplo que ilustra cómo se distribuyen los lugares de corte de diferentes nucleasas de restricción (conocidos como ), unos respecto a otros, sobre moléculas de DNA de doble hélice, dando lugar a un (kb = kilobases; una abreviatura que designa tanto 1000 nucleótidos como 1000 pares de nucleótidos.)
0Í2
mf
IJ
3kb
^
™
f
b h c
II
M / \™
d
I
I
b
g
a
f
l i l i
_____ ____ 1_____________ I_____________
20 m iles de pares de nucleótidos de DNA
30
L__________
40
Figura 7-4 Mapas de restricción de DNA hum ano y de DNA procedente de varios prim ates, de un grupo de genes que codifican la hemoglobina. En cada mapa, los dos indican las posiciones del DNA que corresponden a los dos genes de la a-globina. Cada letra representa un punto de corte de una nucleasa de restricción diferente. Como en la Figura 7-3, la localización de cada uno de los cortes se determinó comparando los tamaños de los fragmentos de DNA generados al tratar los DNA con las diferentes nucleasas de restricción tanto de forma individual como en distintas combinaciones. Es de destacar que el chimpancé, el primate más próximo al hombre, presenta el mapa de restricción más parecido, mientras que el gibón, que de los considerados es el más alejado, presenta el mapa más divergente -incluyendo tres inserciones de DNA. (Por cortesía de Elisabeth Zimmer y Alian Wilson.)
cuadrados rojos
316
Capítulo 7 : Tecnología del DNA recombinante
Figura 7-5 La electroforesis en gel es una poderosa técnica que permite separar moléculas de DNA en función de su tam año. En los tres ejemplos que se presentan aquí, la electroforesis va de arriba a abajo, de forma que las moléculas mayores de DNA -y por ello de movimiento más len to- están cerca de la parte superior del gel. En (A) se utiliza un gel de poliacrilamida de poros pequeños para fraccionar moléculas de DNA de cadena única. En el rango de tamaños de 10 a 500 nucleótidos, pueden separarse unas de otras las moléculas cuyo tamaño se diferencia en tan sólo un nucleótido. En este ejemplo, los carriles del 1 al 4 representan los productos de cuatro reacciones diferentes de secuenciación de DNA. El DNA a secuenciar se ha replicado artificialmente a partir de un extremo fijo hacia un punto variable de terminación, produciendo una serie de réplicas parciales de longitud variada. (En la Figura 7-8 se explica cómo se obtiene este conjunto de réplicas parciales.) En el carril 1 se encuentran las réplicas parciales que terminan en G; en el carril 2 las que terminan en A; en el carril 3 aquellas terminadas en T; y en el carril 4 las que terminan en C. Debido a que las moléculas de DNA del experimento se encuentran marcadas radiactivamente sus posiciones se pueden determinar mediante autorradiografía, como se muestra. En (B) se utiliza un gel de agarosa de poros de tamaño medio para separar moléculas de DNA de doble hebra. Este método es más utilizable en el rango de tamaños de 300 a 10 000 pares de nucleótidos. Estas moléculas de DNA son fragmentos de restricción producidos a partir del genoma de un virus bacteriano, y se han detectado mediante la fluorescencia que emiten después de ser teñidos con bromuro de etidio. En (C) se ha utilizado la técnica de electroforesis en gel de agarosa de campo pulsante para separar 16 cromosomas diferentes de levadura (S. cerevisiaé) cuyo tamaño oscila entre 220 000 y 2 500 000 pares de nucleótidos. El DNA se ha teñido como en (B). Sobre este tipo de geles se pueden separar moléculas de DNA de tamaños tan grandes como 107 pares de nucleótidos. (A, por cortesía de Leander Lauffer y Peter Walter; B, por cortesía de Ken Kreuzer; C, de D. Vollrath y R.W. Davis, N ucleicA cids Res. 15:7876, 1987. Con autorización de Oxford University Press.)
carriles 1 2
3
4 —
200
1 N» -
d i
■ r
h b
paros do nucleótidos
T/
fnnr « 5 9 !* »
w L r m im
»
I
-1 0 0 0 (B>
jM
m
■
millones
16 —
Las moléculas de DNA de diferentes tamaños pueden separarse mediante la electroforesis en gel4
Fragmentación, separación y secuenciación de moléculas de DNA
■2.5
12 — 4— 157 iE r '*«iii ■
Durante los primeros años de la década de 1970 se descubrió que se podía deter minar con exactitud la longitud y la pureza de las moléculas de DNA utilizando los mismos métodos de electroforesis en gel que se habían demostrado útiles para el análisis de las cadenas proteicas. Actualmente el proceso es más sencillo que para las proteínas; dado que en las moléculas de ácido nucleico cada nucleó tido presenta una única carga negativa, no es necesario utilizar el detergente cargado negativamente SDS que se requiere para conseguir que las moléculas de proteína se muevan de una manera uniforme hacia el electrodo positivo. Para el caso de fragmentos de DNA menores de 500 nucleótidos de largo, existen geles de poliacrilamida especialmente diseñados que permiten la separación de m olé culas que se diferencien en un solo nucleótido de longitud (Figura 7-5A). No obstante, los poros de los geles de poliacrilamida son demasiado pequeños para permitir que moléculas largas de DNA puedan atravesarlos; para separar estas moléculas en función de su tamaño, se utilizan geles mucho más porosos formados por soluciones diluidas de agarosa (un polisacárido aislado de algas marinas) (Fi gura 7-5B). Ambos métodos de separación de DNA son ampliamente utilizados tanto con finalidad analítica como preparativa. Una variación reciente de la electroforesis en agarosa, llamada electroforesis en gel de campo pulsante, hace posible la separación de moléculas enormes de DNA. La electroforesis en gel ordinaria no consigue separar estas moléculas por que el campo eléctrico uniforme las extiende adoptando configuraciones ser penteantes que viajan a través del gel a una velocidad que es independiente de su longitud. Pero, alteraciones frecuentes en la dirección del campo eléctrico fuerzan a las moléculas a reorientarse para poderse desplazar. Este proceso de reorientación es más lento cuanto mayor es la molécula y por ello las moléculas progresivamente más largas se van retrasando respecto a las más cortas. Por ello,
-6 0 0 0
1— 950 000
13 —
pares de nucleótidos
5 2|1 4 §
10*
£ 11p
-610000
5-
8 -1 9—1
I - 220 000
-5 0
tC)
317
fragm ento de restricción de DNA purificado
. 1 II 1 1 1 1 1 1 1 II 1 1 I II 1 1 1 1 1 1 II II 1 1 1 1 1 1 1 II 1 1 1
fragm ento de restricción de DNA purificado
32( P ‘ P
desnaturaliza e híbrida con una mezcla de nucleótidos
P ■ S iS iS ® ■
------------- > '
\
DNA m arcado en los extrem os 5‘ m ediante la acción de la polinucleótido quinasa y ATP marcado con 32P
,, + una nucleasa de restricción corta la hélice de DNA en dos fragm entos de tam año diferente añadir DNA polimerasa y nucleótidos marcados
®1M .1. 1 1
+ ■■
1.1.1.M. 1..
* 3'
........................ 5'
1
................ 3' . .
la DNA polim erasa incorpora nucleótidos marcados, de form a que genera una población de m oléculas de DNA que contienen ejem plos marcados de todas las secuencias de ambas hebras (A)
5'
3' el fragm ento deseado de DNA, con una sola hebra marcada en un extrem o (B)
Las m oléculas purificadas de DNA pueden ser marcadas in vitro con radioisótopos o con marcadores químicos5 Para añadir distintas marcas a las moléculas de DNA aisladas se utilizan funda mentalm ente dos sistemas. El primero utiliza una enzima de E. coli, la DNA poli merasa I , para insertar un gran número de nucleótidos radiactivos (habitual mente marcados con 32P) o compuestos químicos en cada molécula de DNA (Figura 7-6A) generando así “sondas de DNA” altamente marcadas para las reac ciones de hibridación de ácidos nucleicos (véase más adelante). El segundo m é todo utiliza la enzima polinucleótido quinasa de bacteriófagos para transferir un único 32P marcado desde el ATP hasta extremo 5’ de cada cadena de DNA (Figura 7-6B). Dado que la quinasa incorpora un sólo 3ZP en cada hebra de DNA, estas cadenas de DNA no son lo suficientemente radiactivas como para utilizarlas com o sondas; pero dado que sólo están marcadas en uno de sus extremos, son extraordinariamente útiles para la secuenciación del DNA y para el estudio de las huellas del DNA (“footprinting”), tal como explicaremos a continuación.
Capítulo 7 : Tecnología del DNA recombinante
® 3
separación por electroforesis en gel
en geles de campo pulsante los cromosomas enteros tanto bacterianos como de levaduras aparecen como bandas discretas y pueden ser aislados e identificados en base a su tamaño (Figura 7-5C). Un cromosoma típico de mamífero, de 108 pa res de bases, es demasiado grande para poderlo aislar aun con este método, pero sí que pueden aislarse e identificarse grandes regiones si el DNA cromosómico se corta primero con endonucleasas de restricción que reconocen secuencias muy poco frecuentes (por ejemplo, una vez cada 106 o 107 pares de bases). Evidentemente, en los geles de agarosa o de poliacrilamida las bandas de DNA serán invisibles a menos que el DNA esté marcado o teñido de alguna m a nera. Un método sensible de tinción del DNA consiste en sumergir el gel después de la electroforesis en el colorante bromuro de etidio que, cuando se halla unido al DNA, es fluorescente con luz ultravioleta (Figura 7-5B y C). Un método de de tección incluso más sensible que éste consiste en la incorporación de un radio isótopo a la molécula de DNA antes de la electroforesis; habitualmente se utiliza el 32P ya que puede ser incorporado en los fosfatos del DNA y emite partículas p muy energéticas que son fáciles de detectar por autorradiografía (Figura 7-5A).
318
1.1 I I í Ú.i.i.T.1. lll.l 1 I..I.I 1 1 1 ).! ! 1 ■• ; 1
Figura 7-6 Para m arcar con radiactividad las moléculas de DNA, se utilizan rutinariam ente dos procedimientos. (A) La DNA polimerasa I marca todos los nucleótidos de una molécula de DNA, y por lo tanto puede utilizarse para generar sondas de DNA muy marcadas radiactivamente. (B) La polinucleótido quinasa marca únicam ente los extremos 5 f de las hebras de DNA; así pues, cuando después de marcar se fracciona la molécula de DNA mediante nucleasas de restricción, tal com o se muestra en la figura, pueden obtenerse fácilm ente moléculas que contengan una única hebra marcada en el extremo 5’. El método en (A) se emplea para producir también moléculas de DNA no radiactivo que contienen un marcador químico específico que puede ser detectado con un anticuerpo adecuado (véase Figura 7-18).
lugar de rotura
fra gm e nto inicial de DNA de una sola hebra m arcado con 3ZP en su extrem o 5'
T
( p) TGCÁCTTGAACGCATGCT
C
G
A
18
un procedim iento quím ico que rom pe la cadena por los residuos A genera fragm entos radiactivos de diferentes longitudes
17 15
16
14 13 12
11
10
TGCACTTGAACGC TGCT
9
TGCACTTGA CGCATGCT ( ? ) - TGCAC1TG ACGCATGCT
0 gel
(A)
TGC CTTGAACGCATGCT
fragm entos radiactivos
I____________
fragm entos no marcados __________ I
estos fragm entos son separados por electroforesis en gel en función estrictam ente de su long itud; por autorradiografía se detectarán únicam ente los fragm entos radiactivos
(B) la secuencia de DNA, leída directam ente desde la parte in fe rio r del gel a la superior, es
TG CACTTGAACGCATG CT 1
18
Los fragmentos aislados de DNA pueden ser rápidamente secuenciados6 A finales de los años 70 se desarrollaron métodos que permitieron determinar de manera simple y rápida la secuencia nucleotídica de cualquier fragmento de DNA purificado. Como resultado de ello, se han obtenido las secuencias de DNA completas de muchos cientos de genes de mamíferos, incluyendo los que codi fican la insulina, la hemoglobina, el interferón y el citocromo c. La cantidad de información respecto a secuencias de DNA es muy grande (muchos millones de nucleótidos) por lo que deben utilizarse ordenadores para almacenarla y anali zarla. Se han determinado varias secuencias continuas de DNA de más de 105 pares de nucleótidos; entre ellas se encuentran el genoma entero del virus de Epstein-Barr (que infecta a humanos y causa la infección de mononucleosis) y el genoma entero de cloroplasto vegetal, así como el cromosoma completo de la levadura. Se han descrito dos potentes métodos de secuenciación del DNA: en la Figura 7-7 se describe el método químico, y en la Figura 7-8 el método enzimà tico. Este último método, basado en la síntesis in vitro de DNA en presencia de nucleósidos trifosfato terminadores de cadena, se ha convertido en el método más común para secuenciar el DNA. Estos dos métodos de secuenciación del DNA son tan rápidos y seguros que, tal como se ha indicado anteriormente, el sistema más fácil y exacto de determi nar la secuencia de aminoácidos de una proteína consiste en determinar la se cuencia de nucleótidos de su gen: se genera un clon de cDNA a partir del mRNA apropiado (ver más adelante), se determina la secuencia de nucleótidos y se uti liza el código genético como diccionario para traducir esta secuencia en una se cuencia de aminoácidos. Aunque en principio existen seis pautas diferentes de lectura por medio de las cuales la secuencia de DNA se puede traducir a proteína (tres por cada hebra), generalmente se reconoce la correcta por ser la única que no presenta un gran número de codones de terminación (Figura 7-9). Habitual mente se determina una pequeño trozo de la secuencia de aminoácidos de la proteína purificada para confirmar la secuencia determinada a partir del DNA. A medida que se han perfeccionado los métodos de determinación de secuen cia de DNA, los científicos han empezado a vislumbrar la posibilidad de determinar la secuencia completa del genoma humano, unos 3 x 109 pares de bases. Debido a que dicha secuencia contendría la secuencia de todos los RNA y de todas las proteí-
Fragmentación, separación y secuenciación de moléculas de DNA
Figura7-7 Método químico de secuenciación de DNA. (A) El proceso se inicia con la obtención de un conjunto de moléculas de DNA de doble cadena marcadas en un extremo por el método descrito en la Figura 7-6B. En la primera etapa las cadenas de la doble hélice se disocian y se someten a un tratamiento suave con un agente químico que destruye una de las cuatro bases (en este caso los residuos A). Debido a que el tratamiento es suave sólo se rompe una A por molécula, al azar. Esto genera una colección de fragmentos de DNA de diferentes longitudes, que reflejan los lugares en que se encontraban las A en el DNA original. Los fragmentos se separan en un gel y se detectan por autorradiografía: solamente los fragmentos que poseen un extremo 5’ terminal fosfato 32P aparecen en el gel y su tamaño indica la distancia desde el extremo marcado hasta la base A. (B) Para determinar la secuencia completa, se realizan procedimientos similares a cuatro muestras separadas de la misma molécula de DNA marcada en su extremo 5’, utilizando compuestos químicos que rompan el DNA de forma preferente por T en la primera muestra, por C en la segunda, por G en la tercera y por A en la cuarta. Los fragmentos resultantes son separados en carriles paralelos del mismo gel, como los que se muestran en la Figura 7-5A, obteniéndose un patrón de bandas de DNA radiactivas a partir de las cuales se lee la secuencia de DNA. El nucleótido más cercano al extremo 5’ de la secuencia se determina mirando el gel al nivel 1 (en la parte inferior del gel) y observando en qué carril aparece la banda (T). El mismo procedimiento se utiliza para determinar el nivel 2, luego para el 3 y así sucesivamente, hasta obtener la secuencia completa. La ilustración presenta el método de manera idealizada; en realidad los tratamientos químicos son menos específicos de lo que se muestra.
319
(A)
pequeña cantidad de didesoxirribonucleósido trifosfato (ddATP)
precursores desoxirribonucleósido ------C^A" trifosfato normales » T-4G (dATP, dCTP, dGTP y tj A7-G^Ct dTTP) AA a W t G rG§
cebador para la DNA polimerasa
J
la incorporación (infrecuente) de didesoxirribonucleósido bloquea el crecim iento posterior de la m olécula de DNA
_GCTACCTGCATGGA ¡CG ATGG ACGTACCTCTG AAGCG ! m olécula de DNA de una sola hebra a secuenciar (B)
5' GCATATGTCAGTCCAG 3' 3' CGTATACAGTCAGGTC 5'
DNA de doble hebra
GCAT A
GCAT GCAT
+ ddTTP GCAT
A TGTCA
GCAT
ATGTCA GTCC A
GCAT
+ ddCTP
At ATGT ATG TCAG t
GCAT GCAT GCAT
ATGTc ATGTCAGTC ATGTCAGTCC
+ ddGTP GCAT GCAT GC A T
ATg ATGTCAg ATGTCAGTCCAG
__________ I
ñas posibles que se necesitan para configurar un ser humano, su conocimiento nos proveería de un “diccionario del ser humano”, que podría facilitar el futuro estudio de la célula y de los tejidos. La secuenciación del DNA a esta escaía implica necesa riamente el desarrollo de métodos de secuenciación automatizados que reduzcan considerablemente el costo de la secuenciación al menos en cinco veces.
Las huellas del DNA revelan los lugares donde las proteínas se unen a la molécula de DNA7 Se puede utilizar una modificación de una técnica de secuenciación de DNA para determinar las secuencias nucleotídicas reconocidas por las proteínas de unión al DNA. Algunas de estas proteínas juegan un papel central en la determi nación de la activación de algunos genes en una célula determinada, mediante su unión a secuencias de DNA reguladoras, las cuales habitualmente se localizan fuera de la regiones codificadoras del gen. Para entender cómo actúan estas pro teínas, es importante identificar las secuencias específicas de DNA a las que se
320
Capítulo 7 : Tecnología del DNA recombinante
secu en ciar se utiliza por la DNA polim erasa com o m olde en la síntesis
in vitro, de una serie de réplicas parciales que com ien zan siem pre en el m ism o sitio, pero que term in an en puntos diferentes a lo largo de la cad en a de DNA. La clave de este m étod o radica en la utilización de d id esoxirribonucleósid os trifosfato, que no tien en el grupo d esoxirribosa 3 ’-OH, presente en los nu cleótid os norm ales; cuand o un nu cleótid o m odificado de esta form a se incorpora a una cad en a de DNA, b loq u ea la ad ición del nu cleótid o siguiente. En el ejem p lo que se m uestra, el didesoxi ATP (ddATP) com p ite co n un exceso
de una sola 3' CGTATACAGTCAGGTC 5' DNA hebra 5' GCAT 3' cebador marcado + DNA polimerasa + exceso de dATP dTTP dCTP dGTP + ddATP
Figura 7-8 Método enzimàtico de secuenciación de DNA. (A) El DNA a
de desoxi ATP (dATP), de m odo que cada cad en a de DNA sintetizad a en el tubo de ensayo por la DNA polim erasa I term inará al azar en un a A diferente de la secu en cia. E sta reacció n genera, por tanto, una escalera de fragm entos de DNA sim ilar a la m ostrad a a n terio rm en te por el m étod o quím ico (Figura 7-7); estos fragm entos se d etectarán gracias a un m areaje (quím ico o radiactivo) que incorpora o b ien el oligonucleótido (naranja) o uno de los d esoxirribonu cleósid o trifosfatos [verde) usados para extend er la cad ena de DNA. (B) Para d eterm inar la secu en cia com p leta, se utilizan cuatro n u cleósid o trifosfatos term inad ores de cad en a [rojo) diferentes en cuatro reaccio n es de síntesis separadas, sobre el m ism o m olde de DNA. Cuando los productos de estas cuatro reaccio n es se analizan en cuatro carriles paralelos en un gel de poliacrilam ida, la secu en cia de DNA puede d educirse de un a m anera análoga a com o se hace en el m étod o quím ico d escrito en la Figura 7-7B.
(A) dirección de lectura de la secuencia de la cadena superior de DNA — *■ N- ile leu phe arg val ile arg pro thr arg asn phe thr arg -C pautas 3 de 2 N- tyr phe ile ser ser asn ser thr leu asn ala lys leu his leu thr -C lectura 1 N- leu phe tyr phe glu 9 phe asp leu lys arg glu thr ser leu asn -C DNA
5'
3'
TTATTTTATTTCG AG TAATTCG ACCTTAAACGCG AAACTTCACTTAAC AATAAAATAAAG CTCATTAAG CTG GAATTTGCG CTTTG AAG TG AATTG
3’
5'
lys ile glu leu leu glu val lys phe ala phe ser H I ,YS val N pautas -1 C- B de -2 C- ile lys asn arg thr ile arg gly HI val ar9 phe lys val HI ar9 N lectura jj-3 C- asn ^ ^ | lys ser thr asn ser arg leu arg ser val glu ser leu ser -N -*-----dirección de lectura de la secuencia de la cadena inferior de DNA
pautas de lectura
dirección de lectura de la secuencia de la cadena superior de DNA T ir 3 1 11H H I I .I I TTTT7
IT
I l t I il
DNA pautas de -2 lectura N | || | | dirección de lectura de la secuencia de la cadena inferior de DNA L
500 pares de bases
región del DNA protegida por la proteína que se une al DNA (A)
ROTURA ALEATORIA POR UNA NUCLEASA O POR DESNATURALIZACIÓN Y SEPARACIÓN POSTERIOR DE LAS CADENAS
3|£wmhi *
* * * wmmmmmmmmm
wmmmmmíimfflfflm ■■■■■■■■■■■■■■i
fam ilia de m oléculas de DNA de una sola cadena, marcadas en su extrem o 5' SEPARACIÓN POR ELECTROFORESIS EN GEL
principio del gel
sin la proteína con la proteína
&
huella Fragmentación, separación y secuenciación de moléculas de DNA
de la secuencia de DNA puede codificar seis diferentes secuencias de aminoácido, dado que cada una de las tres pautas de lectura de cada hebra se puede utilizar para codificar un polipéptído. La secuencia de nucleótídos siempre se lee en sentido 5’-a-3’, y codifica un polipéptído desde su extremo amino (N) a su extremo carboxilo (C). En una secuencia de nucleótídos al azar se debería encontrar una secuencia de terminación para la síntesis de protema cada 21 aminoácidos de media (una vez cada 63 nucleótídos). En esta muestra de 48 nucleótídos cada una de esas señales (codones de terminación) se han coloreado en verde, únicamente la pauta de lectura 2 no contiene ninguno. (B) Búsqueda en una secuencia de 1700 pares de bases de DNA de una posible secuencia codificante de proteína. La información se representa como en (A), en verde para cada codón de terminación. Todas las posibles regiones entre señales de inicio y terminación de síntesis de proteína (véase pág. 249) se representan como barras rojas. Sólo la pauta de lectura 1 codifica una proteína, de 475 aminoácidos de longitud. Figura 7-10 Técnica de las huellas de DNA(DNAfootprinting). (A) Este
*<
"hu ella " en la que no se observa fragm entación
Figura 7-9 Localización de las regiones de secuencia de DNA que codifican una proteína. En principio, cualquier región
método requiere de una molécula de DNA marcada radiactivamente en un extremo (véase Figura 7-6B). La proteína que se muestra se une fuertemente a una secuencia específica de DNA de siete nucleótídos de longitud, protegiendo así a estos siete nucleótídos del agente que fragmentará la cadena. Si se desarrolla esta misma reacción sin la proteína que se une al DNA, en el gel se puede observar un escalonado completo de bandas (no se muestra). (B) Un registro real de huella utilizado para determinar el lugar de unión para una proteína humana que estimula la transcripción de determinados genes eucariotas. Estos resultados permiten localizar el lugar de unión unos 60 nucleótídos en dirección 5’ a partir del lugar de inicio de la síntesis del RNA. El agente que se utilizó para fraccionar la cadena fue una pequeña molécula con hierro que normalmente corta en cada enlace fosfodiéster con aproximadamente la misma frecuencia. (B, por cortesía de Michele Sawadogo y Robert Roeder.)
321
unen. El método estándar utilizado con esta finalidad es el denominado huella en el DNA (DNA footprinting). Se marca con 32P un fragmento puro de DNA por uno de sus extremo (véase Figura 7-6B) y a continuación se corta con una nucleasa o con un reactivo que produzca cortes al azar en los enlaces fosfodiéster de la doble hélice del DNA. Los subfragmentos resultantes de la hebra marcada se separan en un gel y se detectan por autorradiografía, de forma que se puede com parar el patrón de bandas de un DNA fragmentado en presencia de una pro teina que se una a él con el patrón del mismo DNA fragmentado en ausencia de tal proteína. Cuando la proteína se halla presente, cubre los nucleótidos de la zona del DNA a la que se une, protegiendo la rotura de los enlaces fosfodiéster. En consecuencia, los fragmentos marcados que contienen el lugar de unión del DNA a la proteína desaparecerán, dejando un hueco en el patrón del gel llamado “huella” (footprint) (Figura 7-10A). En la Figura 7-10B se muestra la huella de una proteína que activa la transcripción de un gen eucariota.
Resumen La tecnología del DNA recombinante ha revolucionado el estudio de la célula. El desarrollo de esta tecnología no fu e nunca previsto ni planeado. Por el contrario, es el fruto de la confluencia de multitud de nuevas habilidades de los investigadores trabajando en distintas áreas para manipular las secuencias de DNA, que en un momento dado se hacen lo suficientemente poderosas como para permitir a los in vestigadores aislar cualquier gen deseado, y, después de su amplificación, determi nar su estructura en detalle, tanto a nivel génico como de sus productos. Elementos esenciales de esta tecnología son la capacidad de trocear los cromosomas en fra g mentos con extremos conocidos, y los métodos de separación y secuenciación de di chos fragmentos. La fragmentación del cromosoma se realiza mediante enzimas producidas por bacterias y que éstas usan para destruir las moléculas de DNA invasoras. Estas enzimas, denominadas endonucleasas de restricción, se purifican y se utilizan para cortar el DNA de doble cadena en secuencias cortas específicas. Los fragmentos resultantes de DNA se pueden separar unos de otros en función de su tamaño mediante electroforesis, desplazando la mezcla de fragmentos a través de los poros de un geL En ciertas condiciones se pueden separar moléculas de DNA que difieran en únicamente una base, y visualizarlas como bandas discretas. Los métodos de secuenciación utilizan estos potentes métodos de separación: después de la electroforesis, se determina la secuencia de nucleótidos de una molécula de DNA a partir del patrón de bandas de DNA marcado que se observa cuando uno de sus extremos está marcado y el otro termina aleatoriamente en un nucleótido se leccionado único (A, G ,Co T).
Hibridación de ácidos nucleicos8 Cuando una solución acuosa de DNA se calienta a 100°C o se expone a un pH muy alto (pH > 13), se rompen las bases complementarias que normalmente mantienen unidas entre sí a las dos cadenas de la doble hélice y la doble hélice se disocia rápidamente en dos hebras separadas. Durante muchos años se con sideró que este proceso, llamado desnaturalización del DNA, era irreversible. Sin embargo, en 1961 se descubrió que si se mantienen hebras complementarias de DNA a 65°C durante un período prolongado, forman de nuevo una doble hélice (proceso denominado renaturalización o hibridación del DNA). Reacciones de hibridación similares a ésta se producen entre dos cadenas cualesquiera de áci do nucleico de una sola hebra (DNA:DNA, RNA:RNA o RNA:DNA) siempre que ambas cadenas tengan una secuencia de nucleótidos complementaria. En esta sección se explicará cómo se pueden utilizar estas reacciones específicas de hi bridación para detectar y caracterizar secuencias nucleotídicas específicas tanto en moléculas de RNA com o de DNA.
322
Capítulo 7 : Tecnología del DNA recombinante
crom osom a que contiene 1 copia del gen A
crom osom a que contiene 5 copias del gen A
fragm entación y desnaturalización del DNA crom osom ico fragm entos de DNA de una sola hebra
adición de una sonda de DNA ^ clonada y radiactiva, ^ e incubación para pe rm itir que se produzca la hibridación
adición de una nucleasa que destruye toda la sonda de una sola cadena ^ no hibridada
>5* \ r
la cantidad de radiactividad que permanece en las m oléculas de doble cadena híbridas constituye una medida del núm ero de copias del gen en el crom osom a original Figura 7-11 Medida del nüm ero de copias de un determ inado gen en una m uestra de DNA, mediante hibridación de DNA. En estos experimentos se utiliza un fragmento de DNA de una sola hebra, al que habitualm ente se denomina so n d a d e DNA. La sonda puede estar marcada de forma especial de modo que pueda ser distinguida del enorme exceso de DNA cromosóm ico. En este ejemplo, la marca es un isótopo radiactivo; alternativamente, com o marca se pueden utilizar nucleótidos marcados químicamente (véase Figura 7-18).
exón 1
exón 2
¡ntrón
DNA genóm ico clonado
secuencia intrónica
3' 5 '1 5'
V
RNA m ensajero
DESNATURALIZACION DEL DNA E HIBRIDACIÓN CON RNA 5' DNA 13‘ RNA
DNA degradado
control de DNA —----- —— no tratado
EL TRATAMIENTO CON LA NUCLEASA S1 DEGRADA LAS MOLÉCULAS DE ÁCIDO NUCLEICO DE UNA SOLA HEBRA
F ig u ra7-12 Uso de la técn ica de hibridación de ácidos nucleicos p ara determ inar la región de un fragmento clonado que está presente en una molécula de RNA. El método mostrado se basa en el uso de una nucleasa que únicamente corte la cadena de DNA no apareada con RNA. Tal como se muestra, se determinan las posiciones de los intrones en los genes eucariotas; de la misma forma se puede determinar el inicio y final de una molécula de RNA.
“ . texwm- exon 2~ *5o
mmmm- eXÓn 1
gel de agarosa alcalino
La hibridación de ácidos nucleicos proporciona un método sensible para la detección de secuencias determinadas de nucleótidos9 La velocidad de form ación de la doble hélice está limitada por la velocidad a la que colisionan las dos cadenas com plem entarias del ácido nucleico, la cual depende de la concentración de las cadenas en la solución. Por lo tanto, la ve locidad de hibridación puede utilizarse para determinar la concentración de cualquier secuencia determinada de DNA o de RNA en el seno de una m ezcla de otras secuencias. Este ensayo requiere un fragmento puro de una cadena sencilla de DNA cuya secuencia sea complementaria a la del ácido nucleico (DNA o RNA) que se desea detectar; el DNA se puede obtener por clonaje o, si la secuencia es corta, se puede sintetizar por métodos químicos. En cualquier caso, el fragmento de DNA debe estar marcado (mediante radioisótopo o por un m é todo químico) de forma que durante el curso de la reacción de hibridación se pueda seguir su incorporación a moléculas de doble cadena. La molécula de DNA de cadena sencilla utilizada de esta forma como indicador se denomina sonda de DNA (probe); una sonda de DNA puede comprender desde 5 hasta m i les de nucleótidos de longitud. Las reacciones de hibridación mediante sondas de DNA son tan sensibles y selectivas que pueden utilizarse para detectar secuencias complementarias cuya concentración sea incluso de una sola molécula por célula (Figura 7-11). Así, es posible determinar el número de copias de una secuencia particular de DNA (la contenida en la sonda) que se hallan presentes en el genoma celular. Se puede utilizar esta misma técnica para buscar genes relacionados pero no idénticos; por ejemplo, una vez ha sido clonado un gen interesante a partir de ratones o gallinas, se puede utilizar una parte de esta secuencia para localizar el gen co rrespondiente en humanos. Alternativamente, la sondas de DNA pueden utilizarse en reacciones de hibri dación con RNA en lugar de DNA, para detectar cuándo una célula está expresan do un gen determinado. En este caso, se hibrida una sonda de DNA que contiene parte de la secuencia del gen, con RNA purificado a partir de la célula en cuestión, con el fin de determinar si el RNA celular contiene moléculas complementarias al
Hibridación de ácidos nucleicos
323
DNA de la sonda, y si es así, qué cantidad. En métodos más elaborados, la sonda de DNA se trata con nucleasas específicas después de la hibridación para deter minar las regiones exactas de la sonda que se han apareado con moléculas de RNA de la célula. De esta forma se pueden determinar los lugares de principio y final para la transcripción del RNA; de la misma manera se pueden identificar de form a precisa los límites de las regiones de los transcritos primarios que son cor tadas y eliminadas durante la maduración por corte y em palm e (splicing) (véase Figura 7-12). Durante el desarrollo embrionario un gran número de genes se expresan o se reprimen siguiendo patrones elaborados. La hibridación de sondas de DNA con RNA de la célula permite determinar cuándo un gen particular se expresa o no; además, cuando la expresión de un gen se altera, se puede determinar si el cam bio es debido a controles que actúan sobre la transcripción, sobre la madu ración del RNA o sobre la traducción de las moléculas de mRNA maduro a proteí na. La utilización de los métodos de hibridación se halla tan extendida en la bio logía celular que es difícil imaginar cóm o se podría haber estudiado sin ellos la estructura y la expresión génica.
Las transferencias Northern y Southern facilitan la hibridación con moléculas de ácidos nucleicos separadas electroforéticamente10 A menudo las sondas de DNA se utilizan en com binación con la electroforesis en gel para detectar moléculas de ácidos nucleicos que tengan una secuencia com plementaria a toda o a una parte de la sonda. Antes de llevar a cabo la reacción de hibridación, la electroforesis separa las diferentes moléculas de RNA o de DNA de una mezcla, de acuerdo con su tamaño; podremos estar seguros de que la hibridación fue específica si con la sonda se marcan moléculas de un único o de muy pocos tamaños. Además, la información obtenida respecto al tamaño puede ser muy valiosa en sí misma. Un ejemplo servirá para ilustrar este punto. Supongamos que se desea determinar la naturaleza del defecto de un ratón mutante que produce cantidades anormalmente bajas de albúmina, una proteí na que segrega el hígado a la sangre, normalmente en grandes cantidades. En primer lugar, habrá que recolectar muestras de tejido hepático idénticas de un ratón m utante y de uno normal (este último servirá de control); las células se disgregan con un detergente fuerte para inactivar las nucleasas celulares, que en caso contrario podrían degradar los ácidos nucleicos. A continuación, se separa el RNA y el DNA de los otros com ponentes celulares: las proteínas presentes se desnaturalizan com pletam ente y se eliminan mediante extracciones continua das con fenol -u n potente solvente orgánico que es parcialmente miscible en agua; los ácidos nucleicos, que permanecen en la fase acuosa, se precipitan con alcohol para separarlos de las moléculas pequeñas de la célula. Entonces se se para el DNA del RNA aprovechando su diferente solubilidad en alcohol y se de grada cualquier ácido nucleico contam inante de los tipos que no queremos es tudiar, mediante tratamiento con enzimas altamente específicas -tanto RNasas como DNasas. Para analizar los RNA que codifican la albúmina, mediante una sonda de DNA que reconozca a este RNA, se utiliza una técnica llamada transferencia Northern (Northern blotting). Primero, mediante electroforesis en gel las dife rentes moléculas de RNA intacto se separan en bandas, tanto de los hígados mutantes com o de los normales. Entonces, para hacer que las moléculas de RNA sean accesibles a las sondas de DNA, se hace una réplica del gel mediante la transferencia de las moléculas de RNA desde el gel de la electroforesis hasta una hoja de papel de nitrocelulosa o de nailon. Las moléculas de RNA que se hibridan con la sonda de DNA radiactiva (por contener parte de la secuencia normal del gen de la albúmina) se localizan mediante la incubación del papel con una solución que contenga la sonda y detectando la sonda hibridada por autorradio grafía, o mediante métodos químicos (Figura 7-13). Dado que las moléculas pe queñas de ácidos nucleicos se desplazan más rápidamente a través del gel que
324
Capítulo 7 : Tecnología del DNA recombinante
filtro de nitrocelulosa con ácidos nucleicos fuertem ente unidos
bloque de papel absorbente filtro de nitrocelulosa
RNA o DNA no m arcado
patrones de RNA marcados, utilizados com o m arcadores de tam año
gel de agarosa
ÁCIDOS NUCLEICOS SEPARADOS DE ACUERDO CON SU TAM AÑO, MEDIANTE ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA
esponja solución tam pón ÁCIDOS GRASOS SEPARADOS, TRANSFERIDOS A UN PAPEL DE NITROCELULOSA POR SUCCIÓN DEL TAMPÓN A TRAVÉS DEL GEL Y DEL PAPEL
Figura 7-1 3 Detección de moléculas de RNA o de DNA de una secuencia específica, mediante hibridación sobre filtro. En un gel de electroforesis se
pueden fraccionar tanto mezclas de moléculas de RNA de cadena sencilla {transferencia Northern) como moléculas de DNA de doble cadena producidas por digestión con una nucleasa de restricción (transferencia Southern). Todas las moléculas, separadas, se transfieren a una membrana di nailon o de nitrocelulosa, por capilaridad. El filtro se expone a la sonda de DNA marcado durante un tiempo prolongado, en condiciones en que se favorece la hibridación. Posteriormente el filtro es lavado intensamente de forma que sólo aquellas moléculas de RNA o de DNA que están inmovilizada en el filtro y que hibridan con la sonda, queden marcadas, las cuales aparecen como bandas en el filtro. En el caso de la transferencia Southern es necesario separar las dos hebras de DNA en el filtro antes del proceso de hibridación, lo que se consigue exponiendo el DNA a condiciones alcalinas desnaturalizantes después de la electroforesis.
FILTRO CON LOS ÁCIDOS NUCLEICOS SEPARADOS HIBRIDADOS CON LA SONDA MARCADA bolsa de plástico sellada
sonda marcada DESPUÉS DE ELIMINAR LA SONDA MARCADA, LAS BANDAS COMPLEMENTARIAS A LA SONDA SE REVELAN MEDIANTE MÉTODOS DE DETECCIÓN ESPECÍFICOS DEL MARCAJE
posición / de los ( marcadores de tam año
bandas detectadas
las más grandes, se puede determinar el tamaño de las moléculas de RNA de cada una de las bandas que se unen a la sonda, utilizando como referencia la migración de moléculas de RNA de tamaño conocido (patrones de RNA). De esta m anera se puede descubrir que las células hepáticas del ratón afectado fabrican albúmina de tamaño normal y en cantidades normales; alternativamente podría ocurrir que el RNA de la albúmina se detectara en cantidades muy reducidas. Otra posibilidad sería que el RNA de la albúmina mutante fuese anormalmente corto, y por lo tanto, se desplazara a través del gel muy rápidamente. En este caso la transferencia del gel se podría volver a estudiar mediante sondas de DNA más selectivas que revelasen qué zona del RNA está ausente. Para caracterizar la estructura del gen de la albúmina en el ratón afectado se utiliza un método análogo, llamado transferencia Southern (Southern blotting) que en lugar de analizar en RNA, estudia el DNA. En primer lugar, mediante nucleasas de restricción se corta el DNA aislado generando fragmentos que se pue dan separar fácilmente. A continuación, los fragmentos se separan de acuerdo con su tamaño mediante electroforesis en gel y mediante transferencia e hibri dación se identifican los fragmentos que son complementarios a la sonda de DNA para la albúmina, tal como se ha descrito para el caso del RNA (véase Figu ra 7-13). Repitiendo este procedimiento pero utilizando diferentes nucleasas de restricción, se puede construir un m apa de restricción de la región del genoma que codifica la albúmina. Sobre este mapa se puede determinar si el gen de la al búmina ha sido reordenado en los ratones afectados -p o r ejemplo, mediante la
Hibridación de ácidos nucleicos
325
lugares de corte (dianas) de la nucleasa de restricción (A) DNA
t
t
cortar, desnaturalizar e hibridar cortar, desnaturalizar e hibridar
(B)
(C)
duplicación de secuencia
en A, B y C, la sonda RFLP ( r — detecta fragm entos de DNA de diferentes tam años
deleción o inserción de una secuencia corta de DNA, pero sin embargo no es po sible detectar de este modo la presencia de sustituciones de una única base.
El análisis de los polimorfismos de longitud de los fragmentos de restricción (RFLP) facilita el análisis genético de los grandes genom as11 Los genomas de gran tamaño se pueden mapar tanto física como genéticamen te. Los m a p a s físico s se basan en el análisis directo de las moléculas de DNA que constituyen cada cromosoma. Incluyen tanto mapas de restricción como colec ciones ordenadas de clones genómicos de DNA (véase Figura 7-29), que se pueden considerar como representaciones incompletas o parciales del mapa físico com pleto que sería la secuencia lineal continua de todos los nucleótidos que forman el genoma. Los m a p a s g e n é tico s d e lig a m ie n to , a diferencia de los anteriores, se ba san en la frecuencia de entrecruzamiento de dos o más características que sirven de marcadores en el cruzamiento. Un marcador genético puede ser cualquier lugar en el genoma que, cuando varía, produce variaciones apreciables en el individuo que lo porta haciéndolo distinguible del resto de la población. Si la modificación es muy poco frecuente se la denomina mutación; si es común, se la denomina polimorfismo. Los mapas genéticos de ligamiento se construyen siguiendo el pa trón de heredabilidad de tales variantes genéticas. Tradicionalmente, los mapas de ligamiento han dependido de la identifica ción de m utaciones por sus características fenotípicas como el color de los ojos o los grupos sanguíneos. Recientem ente los métodos del DNA recombinante han permitido utilizar com o marcadores genéticos pequeñas secuencias de DNA que pueden diferir entre individuos de la población sin producir ningún efecto detectable en el organismo. Uno de los marcadores genéticos de este tipo más utilizados se basa en que pequeños cambios en la secuencia de DNA pueden modificar los patrones de corte de las endonucleasas de restricción. Por ejemplo, una substitución de una base en una región del cromosoma puede alterar una secuencia de reconocim iento de una endonucleasa de restricción, produciendo importantes diferencias en las longitudes de ciertos fragmentos de restricción del DNA en esa zona. Asimismo pueden variar las longitudes de los fragmentos de restricción debido a pequeñas inserciones o delecciones que afecten a un número reducido de bases. A estas pequeñas diferencias entre individuos se las denom ina p o lim o rfis m o s d e lo n g itu d d e lo s fra g m e n to s d e re s tric c ió n (R FL P, de Restriction Fragment Length Polymorphism). Un RFLP es tanto más útil cuan to más frecuente sea la población, ya que existe una probabilidad mayor de que los padres de un cierto individuo porten marcadores diferenciables. Ésta es una de las razones de que la base de los marcadores RFLP más útiles sean las secuen cias cortas repetidas que se encuentran en número muy variable en los diferentes individuos (Figura 7-14). Los RFLP son útiles para el mapaje genético gracias a que las diferencias de tamaño de fragmentos que un individuo hereda se detectan con gran facilidad
326
Capítulo 7 : Tecnología del DNA recombinante
Figura 7-14 Algunos de los cambios de la secuencia de DNA que producen un polimorfismo de longitud de los fragmentos de restricción (RFLP). (A) En muchos individuos de la población, una nucieasa de restricción corta en tres lugares distintos el DNA cromosóm ico que se muestra, produciendo dos fragmentos de DNA; uno de los cuales puede detectarse por hibridación con una sonda DNA mediante transferencia Southern. (B) En otros ejemplos del mismo cromosom a se observa que el cambio de un nucleótido en la secuencia reconocida por la nucleasa de restricción evita que ésta actúe en la diana central. En estos casos la sonda marcada detecta un fragmento de DNA de tamaño mayor com o un RFLP. (C) Aún más, en otros cromosom as se ha producido una duplicación de parte de la secuencia de modo que se produce un aumento en el tamaño del fragmento de DNA detectado con la sonda marcada. Este tipo de RFLP es común en regiones que contienen secuencias cortas muy repetidas, tales como GTGTGT....; el número de veces que se repite la secuencia corta es muy variable en la población, de forma que cada individuo contiene un número diferente (de 4 a 40) de repeticiones en cada locus concreto. A este tipo de repeticiones se las conoce como m icrosatélites o VNl'R (de V ariable N u m ber o f T án d em R epeat: nú m ero v ariab le d e repeticion es en tándem ).
lugares de corte (dianas) de la nucleasa de restricción osom a 3m (crom m aterno)
ELECTROFORESIS EN GEL Y TRANSFERENCIA SOUTHERN CON SONDA DE DNA MARCADA
paterno)
r~ r
la diana de restricción desaparecida crea un RFLP
3p
CORTAR EL DNA CON UNA NUCLEASA DE RESTRICCIÓN
3m
3m □ □
3p fragm ento detectado por la sonda de DNA
la sonda detecta diferentes fragm entos de DNA para las regiones hom ologas de los crom osom as m aterno y paterno, revelando un RFLP
Figura 7 -15 Detección de un RFLP por transferencia Southern. En este ejemplo se utiliza el método para diferenciar los cromosom as paterno y materno en una región del cromosom a 3 de un individuo. Una variante de este método utiliza PCR (véase Figura 7-32) para amplificar selectivamente la región de DNA apropiada, antes del tratamiento con la nucleasa de restricción. En ese caso los fragmentos de restricción son mucho más abundantes que otros fragmentos de DNA de la muestra y se pueden visualizar directam ente tiñendo el gel, evitando la necesidad de transferencia e hibridación con sondas marcadas.
mediante transferencia Southern utilizando una sonda DNA complementaria a dicha región (Figura 7-15). Además, los RFLP permiten relacionar el mapa gené tico con el mapa físico: por un lado sirven como verdaderos marcadores genéti cos, com o el color de ojos; por otro lado las sondas DNA que permiten detectar los son secuencias DNA que se pueden localizar con relativa facilidad en el mapa físico mediante hibridación de DNA. Si se localizan dos marcadores genéticos en dos cromosomas diferentes, la heredabilidad de ambos es independiente, es decir la probabilidad de coheredabilidad es de 50:50. Esto también es cierto para aquellos marcadores que se encuentren en los extremos opuestos de un mismo cromosoma, debido a la elevada probabilidad de que se separen a causa de la alta frecuencia de entrecruzamiento que tiene lugar en la meiosis, durante la formación de oocitos y de esperma. Cuanto más cercanos se encuentren en el cromosoma tanto mayor es la probabilidad de no ser separados por entrecruzamientos entre ellos y por lo tanto ser coheredados por la progenie (ligados). Mediante el estudio de la coheredabilidad en grandes grupos familiares de un gen de interés (por ejemplo, algún gen relacionado con determinada enfer medad) y un gran número de RFLP individuales, se pueden identificar ciertos RFLP que cohereden frecuentemente con dicho gen (ello requiere el estudio de gran nú mero de individuos, como se explica en la Figura 7-16). Por tanto, se pueden locali zar las secuencias de DNA que rodean a dicho gen. A partir de ahí es posible, en al gunos casos, identificar incluso el DNA del propio gen, mediante técnicas que se describen más adelante (véase Figura 7-30). De este modo se han conseguido iden tificar los genes responsables de algunas enfermedades humanas, permitiendo que sean analizadas en detalle las proteínas que codifican. Está claro (véase Figura 7-16) que cuanto más próximo se localice un m arca dor RFLP al gen mutante de interés, tanto más fácil resulta localizar sin am bi güedades dicho gen. Para facilitar dicho estudio se está realizando un gran es fuerzo para establecer un m apa de alta resolución de distribución de RFLP del genoma humano, con miles de marcadores RFLP espaciados 106 nucleótidos de media. Dos marcadores separados esta distancia deberían coheredarse una media de 99 de cada 100 casos. Con dicho tipo de mapa será relativamente fácil utilizar en humanos estudios de ligamiento genético para localizar un gen que ha sido identificado sólo por el efecto de su mutación, permitiendo su localiza ción en uno o en unos cuantos clones genómicos muy grandes de una librería genómica ordenada. Su aislamiento podría realizarse entonces rápidamente.
Las moléculas sintéticas de DNA facilitan el diagnóstico prenatal de enfermedades genéticas12 Al mismo tiempo que los microbiólogos desarrollaban las técnicas de clonaje del DNA, los químicos orgánicos m ejoraron los métodos para sintetizar cadenas Hibridación de ácidos nucleicos
327
par de crom osom as m aterno con la enferm edad
par de crom osom as paterno sano
fi fi
fi H
oocito ■
■esperma
gen defectuoso causante de la enferm edad m arcador RFLP únicamente en esta copia del crom osom a
fi fi
f if i
f if i
fi fi
1
fi
fi fi
+ enferm edad — m arcador RFLP
+ + PRUEBAS REALIZADAS EN 7 NIÑOS
CONCLUSION: el gen causante de la enferm edad cohereda con el m arcador RFLP de la madre enferm a en el 75% de la progenie que padece la enferm edad. Si se observa la m isma correlación en otras fam ilias que sufren esta enferm edad el gen causante de ella se localizará en este crom osom a, en una posición cercana al m arcador RFLP. cortas de DNA. Actualmente estos oligonucleótidos de DNA se fabrican de forma rutinaria mediante máquinas que, en una noche, pueden construir autom ática mente cualquier secuencia de hasta 120 nucleótidos de largo. Esta capacidad para fabricar moléculas de DNA de secuencia deseada hace posible rediseñar genes a voluntad, lo cual constituye una herramienta importante de la ingeniería genética como se explicará más adelante. Otro uso importante de dichos oligo nucleótidos sintéticos es el de sondas marcadas para detectar las secuencias genómicas correspondientes mediante hibridación de DNA. Mediante el empleo de diferentes temperaturas en la reacción de hibridación es posible escoger la severidad de la hibridación: por encim a de cierta temperatura sólo hibridarán aquellas secuencias que sean idénticas, lo que permite detectar genes mutantes, de gran utilidad en el diagnóstico prenatal de enfermedades hereditarias. Más de 3000 enfermedades genéticas humanas son atribuibles a defectos en genes. La mayoría de estas mutaciones son recesivas: únicamente son perjudi ciales en los individuos que heredan de ambos padres la copia defectuosa del gen. Un objetivo importante de la medicina moderna consiste en la identifica ción, antes del nacimiento, de los fetos que portan las dos copias defectuosas del gen, de forma que si lo desea, la madre puede interrumpir el embarazo. En la anemia falciforme, por ejemplo, se conoce cuál es la alteración exacta de nucleó tidos del gen mutante (la secuencia GAG se halla cambiada por GTG en la hebra de DNA que codifica la cadena |3de la hemoglobina). Para el diagnóstico prenatal de esta alteración se sintetizan dos oligonucleótidos de DNA -u n o correspon diente a la secuencia del gen normal en la región de la mutación y el otro corres pondiente a la secuencia mutante. Manteniendo esta cortas secuencias (de aproximadamente 20 nucleótidos) y seleccionando una temperatura de hibrida ción a la que sólo sean estables las hélices perfectamente apareadas, estos oligo nucleótidos se pueden utilizar como sondas para distinguir entre las dos formas del gen. Así pues dichos oligonucleótidos pueden utilizarse como sondas m arca das para diferenciar entre dos formas del gen mediante transferencia Southern del DNA aislado de células fetales recolectadas mediante amniocentesis. Un feto portador de dos copias del gen de la cadena p se detectará fácilmente pues sólo presentará hibridación con el oligonucleótido complementario a la secuencia de DNA mutante. El diagnóstico supone el aislamiento de DNA de células fetales obtenidas mediante am niocentesis y la utilización de las sondas de oligonucleó-
328
Capítulo 7 : Tecnología del DNA recombinante
Figu ra7-16 Análisis de entrecruzam iento genético utilizando un m arcador RFLP. En el ejemplo se estudia la coheredabilidad de un fenotipo humano (en este caso una enfermedad genética) con un marcador RFLP. Si los individuos que heredan la enfermedad también heredan casi siempre el marcador RFLP, el gen que causa la enfermedad y el marcador RFLP estarán probablemente próximos en el cromosoma, como se muestra en la figura. Para demostrar que un ligamiento es estadísticamente significativo se han de analizar cientos de individuos. Es de destacar que el ligamiento no será absoluto excepto si el marcador RFLP se localiza en el mismo gen. En los demás casos el RFLP y la enfermedad genética se separarán con una cierta frecuencia debido al entrecruzamiento meiótico durante la formación del oocíto o del esperma: es lo que ha ocurrido en el caso del par de cromosom as de la derecha.
tidos sobre una transferencia Southern. Un feto afectado se puede reconocer porque su DNA se hibridizará únicamente con el oligonucleótido que es com ple mentario de la secuencia del DNA mutante. En el caso de muchas otras anomalías genéticas no se conoce la variación exacta de la secuencia de nucleótidos. Sin embargo, es posible el diagnóstico prenatal de un número cada vez mayor de estas anomalías mediante transferen cia Southern para analizar las variaciones específicas del genoma humano (RFLP en la Figura 7-16) que, según se sabe, están íntimamente unidas al gen de fectuoso. Se pueden utilizar métodos similares para determinar la susceptibilidad in dividual a sufrir una determinada enfermedad. Por ejemplo, individuos que han heredado copias anómalas de ciertos genes presentan un riesgo superior de pa decer ciertas formas de cáncer, por lo que deben tomar medidas preventivas para incrementar en lo posible sus posibilidades de disfrutar de una vida sana.
La hibridación poco rigurosa permite identificar genes relacionados de forma indirecta13 Durante la evolución aparecen nuevos genes mediante m ecanism os de dupli cación y divergencia de genes antiguos y mediante la reutilización de regiones de genes antiguos para generar nuevas com binaciones. Por esta razón, muchos genes tienen una familia de parientes próximos en alguna parte del genoma, y es probable que algunos de ellos tengan una función relacionada. Se requieren métodos laboriosos para aislar los clones de DNA correspondientes al primer miembro de una fam ilia génica de este tipo. Sin embargo, utilizando las secuen cias de este primer gen como sondas de DNA, se pueden aislar de una forma re lativamente sencilla otros genes que producen proteínas que tienen funciones relacionadas. Dado que es improbable que los nuevos genes tengan secuencias
sonda de DNA de cadena sencilla^ para el gen A
mezcla de m oléculas de DNA de una sola hebra
\
y
E
JL hibridación en form am ida al 50%, a 42°C
hibridación en form am ida al 50%, a 35°C
únicam ente A form a una doble hélice estable
tanto A com o C y E form an dobles hélices estables
HIBRIDACION RIGUROSA
HIBRIDACION POCO RIGUROSA
Hibridación de ácidos nucleicos
Figura 7-1 7 Com paración de las condiciones de hibridación rigurosas (stringent) y poco rigurosas (reduced stringency). En la reacción de la izquierda (condiciones rigurosas), la solución se ha colocado pocos grados por debajo de la temperatura a la que desnaturaliza una hélice de DNA perfecta (su tem p eratu ra d e fu sión ), de forma que las hélices imperfectas que se pueden formar bajo las condiciones poco rigurosas de hibridación de la derecha son inestables. Para encontrar genes que no son idénticos pero que están relacionados con el gen A, se utilizan las condiciones de hibridación poco rigurosa de la derecha.
329
espaciador
O
O
O
O — P— O — P— O — P— O
O"
O-
O"
nucleósido trifosfato m odificad o
OH
H
Figura 7-18 Un m arcador químico para las sondas de DNA. El nucleótido modificado que se muestra puede ser incorporado al DNA por la DNA polimerasa, de forma que la molécula de DNA se puede utilizar como sonda y detectarse de forma eficiente. La base del nucleótido que se muestra es un análogo de la timina, en la que se ha reemplazado el grupo metilo en T con un espaciador unido al esteriode vegetal digoxigenina. Se puede visualizar mediante un anticuerpo específico unido a un marcador visible como un colorante fluorescente. Otras moléculas, com o la biotina por ejemplo, se pueden unir a los nucleótidos, y se detectan de un modo similar.
idénticas, las hibridaciones con la sonda de DNA se realizan en condiciones “poco rigurosas” (reduced stringency) -definidas como aquellas condiciones que permiten apareamientos imperfectos con la secuencia de la sonda, forman do una doble hélice estable (Figura 7-17). A pesar de que la utilización de condi ciones poco rigurosas de hibridación conlleva el riesgo de obtener una señal fal sa de una región aleatoria que presente una corta secuencia homologa en una secuencia de DNA no relacionada, estos falsos positivos se pueden eliminar m e diante una investigación más profunda. Este método constituye una de las utilidades más potentes de la tecnología del DNA recom binante. Por ejemplo, esta aproximación ha permitido aislar una familia com pleta de proteínas de unión al DNA que actúan como directores de la expresión génica durante el desarrollo embrionario en Drosophila. Esta técni ca tam bién ha hecho posible el aislamiento de miembros de esta misma familia génica de otros organismos, incluyendo el hombre.
Las técnicas de hibridación in situ perm iten localizar secuencias específicas de ácidos nucleicos en los crom osom as y en las células14 Los ácidos nucleicos, como otras macromoléculas, ocupan posiciones muy de terminadas en las células y en los tejidos, de forma que cuando estas moléculas se extraen por homogeneización, se pierde una gran cantidad de información potencial. Por ello, se han desarrollado técnicas en las que, de forma similar a como se utilizan los anticuerpos marcados, se utilizan in situ sondas de ácido nucleico para localizar secuencias determinadas de ácidos nucleicos, tanto en cromosomas com o en determinados tipos celulares. Estas técnicas se denomi nan hibridación in situ. Sondas altamente marcadas con isótopos radiactivos pueden ser hibridadas con cromosomas que hayan sido expuestos brevemente a un pH muy elevado para romper los pares de bases de su DNA. Así pueden vi sualizarse las regiones crom osóm icas que han fijado la sonda durante la hibrida ción. Originalmente estos métodos se desarrollaron utilizando sondas DNA muy radiactivas, que se detectaban mediante autorradiografía. Sin embargo es posi ble mejorar la resolución espacial del método si se utilizan sondas de DNA mar cadas quím icam ente en lugar de radiactivamente. Para ello las sondas se sinteti zan con nucleótidos especiales que incorporan cierta cadena lateral (Figura 7-18), y las sondas hibridadas se detectan mediante anticuerpos (u otros ligandos) que reconocen especificam ente dicha cadena lateral (Figura 7-19). También se han desarrollado métodos de hibridación in situ para poner de manifiesto la distribución de moléculas de RNA determinadas en células en el in-
330
Capítulo 7 : Tecnología del DNA recombinante
Figura 7-19 Hibridación in situ para localizar genes específicos en los crom osom as. En la figura se han utilizado seis sondas diferentes para determinar la posición de su secuencia nucleotídica en el cromosoma 5 en metafase. Las sondas estaban marcadas químicamente y se han detectado mediante anticuerpos marcados con fluorocromos. Se muestran las dos copias del cromosoma 5 alineadas. Cada sonda detecta dos puntos en cada cromosoma dado que un cromosoma metafásico tiene su DNA replicado y por ello contiene dos hélices de DNA idénticas (véase Figura 8-4). (Cortesía de David C. Ward.)
Figura 7-2 0 Hibridación in situ para la localización de RNA en los tejidos.
100 pin
terior de tejidos. En este caso los tejidos no se exponen a pH alto para que el DNA cromosomico se mantenga en forma de doble hebra y no pueda unirse a la sonda. En lugar de ello, el tejido se fija suavemente de manera que el RNA se mantenga de tal forma que pueda hibridarse cuando el tejido se incube con una sonda de DNA complementaria. De esta forma se pueden observar los cambios de patrón de ex presión gènica en los tejidos. Por ejemplo, en el embrión de Drosophila estos pa trones han proporcionado nuevas ideas sobre los mecanismos que diferencian las células que se hallan en posiciones diferentes durante el desarrollo (Figura 7-20).
Autorradiografía de una sección de un embrión muy joven de D rosop h ila que se ha sometido a hibridación in situ utilizando una sonda radiactiva de DNA com plem entaria de un gen que participa en el desarrollo de los segmentos. La sonda se ha hibridado con el RNA del embrión, y el patrón de distribución de los granos de plata expuestos revela que el RNA sintetizado sobre el gen (llamado ftz) se localiza en bandas alternas de tres o cuatro células de grosor, a lo largo del embrión. En este estadio del desarrollo (blastodermo celular), el embrión contiene unas 6000 células. (De E. Hafen, A. Kurioway W.J. Gehring, Cell 37:833-841,1984 © Cell Press.)
Resumen En las reacciones de hibridación de ácidos nucleicos, las cadenas sencillas de DNA o de RNA colisionan al azar unas con otras, probando rápidamente miles de millones de posibles apareamientos. En condiciones severas de hibridación (una combinación de solvente y temperatura en las que una doble hélice perfecta es estable), dos cadenas se aparearán form ando una molécula "híbrida” solamente si sus secuencias son muy complementarias. La enorm e especificidad de la reacción de hibridación perm ite que se pueda m arcar cualquier molécula sencilla de DNA o RNA y utilizarla como sonda para encontrar su cadena complementaria incluso en una célula o extracto celular que contenga millones secuencias de DNA o RNA diferentes. Frecuentemente se utili zan sondas de este tipo para detectar los ácidos nucleicos que corresponden a genes determinados, tanto para facilitar su purificación y caracterización a partir de ex tractos celulares, como para localizarlos en el interior de las células, tejidos y organis mos. Asimismo, utilizando reacciones de hibridación poco rigurosas, se puede utili zar una sonda preparada a partir de un gen de un organismo dado para detectar los genes que están relacionados evolutivamente -tanto en el mismo organismo, donde los genes relacionados form arían parte de una fam ilia gènica, como en otros organis mos, donde pondría de manifiesto la historia evolutiva de dicha secuencia.
Clonaje de DNA15 Mediante las técnicas de clonaje de DNA un fragmento de DNA que contiene un gen de interés se inserta en el genoma de DNA purificado de un elemento gené tico autorreplicante -generalm ente un virus o un plásmido. Por ejemplo, es po sible unir, en el tubo de ensayo, un fragmento de DNA que contiene un gen hu mano con el cromosoma de un virus bacteriano, e introducir la nueva molécula de DNA recombinante en una célula bacteriana. A partir de una única molécula recom binante que infecta a una única bacteria, los mecanismos de replicación normales del virus pueden producir más de 1012 moléculas de DNA vírico idénti cas cada día, amplificando así el DNA humano insertado. El plásmido o virus usado de esta forma se conoce como vector de clonaje, y se dice que el DNA pro pagado mediante inserción en él se ha clonado.
Clonaje de DNA
331
plásm ido de DNA circular
plásm ido de DNA lineal con los extrem os cohesivos
A A TT CORTE MEDIANTE UNA NUCLEASA DE RESTRICCIÓN TTA A
UNION COVALENTE POR ACCIÓN DE LA DNA LIGASA plásm ido que contiene un inserto de DNA crom osom ico
uno de los muchos fragm entos de DNA producidos al cortar un crom osom a de DNA con la m isma nucleasa de restricción
Se puede construir una librería de DNA utilizando vectores víricos o vectores plasm ídicos16 Para clonar un gen se empieza construyendo una librería de DNA (una genoteca) -u n a colección de fragmentos de DNA clonado, incluyendo (probablemente) al menos un fragmento que contenga el gen de interés. La genoteca puede cons truirse utilizando como vector tanto virus como plásmidos, y en general se m an tiene en una población de células bacterianas. Los principios básicos de los m é todos utilizados para clonar genes son los mismos para cualquier tipo de vector utilizado, aunque pueden diferir en algunos detalles. Para simplificar, en este ca pítulo ignoraremos estas diferencias, e ilustraremos los métodos en referencia al clonaje en plásmidos. Los vectores plasm ídicos utilizados para el clonaje de genes son pequeñas moléculas circulares de DNA de doble cadena, derivadas de grandes plásmidos que aparecen de forma natural en bacterias. Generalmente suponen una peque ña parte del total del DNA de la célula huésped, pero pueden ser separados fácil mente gracias a su m enor tamaño respecto a las moléculas de DNA de los cro mosomas, las cuales son mucho mayores y sedimentan por centrifugación. Para utilizar los plásmidos circulares de DNA como vectores de clonaje, una vez puri ficados se cortan con una nucleasa de restricción para generar moléculas linea les. El DNA de la célula que se va a utilizar en la construcción de la genoteca tam bién es cortado con la misma nucleasa de restricción, y los fragmentos de restricción resultantes (entre los que se encuentran los que contienen el DNA que va a ser clonado) se añaden a los plásmidos cortados y se cierran, formando moléculas circulares de DNA recombinante. Estas moléculas recombinantes, que contienen insertos de DNA ajeno, son unidas covalentemente mediante la enzima DNA ligasa (Figura 7-21). El siguiente paso en la preparación de la genoteca consiste en introducir las moléculas circulares de DNA recombinante en bacterias que se han hecho tem poralmente permeables al DNA; se dice que estas células han sido transfectadas con el plásmido. A medida que estas células crecen y se dividen, los plásmidos recombinantes también se van replicando y produciendo un número enorme de copias de DNA circulares que contienen el DNA ajeno (Figura 7-22). Muchos plás midos bacterianos transportan genes que les confieren resistencia a los antibióti cos, una propiedad que puede utilizarse para seleccionar las células que han sido Figura 7 -22 Purificación y amplificación de una secuencia específica de DNA por clonaje de DNA en una bacteria. Cada bacteria que contiene un plásmido recom binante se desarrolla en una colonia de células idénticas, visible como un punto sobre placas de agar nutritivo. Inoculando la colonia de interés en un cultivo líquido se puede obtener un gran número de moléculas de DNA plasmídicas, cada una de las cuales contiene el mismo fragmento de DNA insertado.
332
Capítulo 7 : Tecnología del DNA recombinante
molécula de DNA recom binante. Los extremos cohesivos producidos por muchas nucleasas de restricción permiten que dos fragmentos de DNA se unan mediante interacciones entre pares de bases complementarias (véase Figura 7-2). Los fragmentos de DNA unidos de esta manera pueden soldarse de forma covalente a través de una reacción muy eficiente catalizada por la enzima DNA ligasa. En este ejemplo, se forma un plásmido recombinante que contiene un inserto de DNA cromosómico.
un gran núm ero de plásm idos, cada uno de los cuales contiene un inserto de DNA d ife r e n te
n n n H e In e m a l e s
células bacterianas captación del DNA ♦
bacterias sembradas en un m edio que contiene antibiótico
solam ente son resistentes al antibiótico y crecen las bacterias que portan un plásm ido
ensayo para las colonias que contienen el clon de DNA que interesa. Estas colonias se inoculan en un gran cultivo
purificación del DNA plasm ídico
mRNA -A A A A A A A UNION DEL CEBADOR 3’ SE HACE UNA COPIA EN DNA MEDIANTE LA TRANSCRIPTAS A INVERSA
TTTTTTT 3' 5' TTTTTTT
TRATAMIENTO CON ALCALI PARA DEGRADAR EL RNA d .—
el extrem o 3' del cDNA form a lazos en horquilla
■ TTTTTTT 5' LA DNA POLIMERASA UTILIZA ESTOS BUCLES EN HORQUILLA COMO CEBADORES PARA SINTETIZAR UNA CADENA COMPLEMENTARIA
m m 'f
TTTTTTT
TRATAMIENTO CON NUCLEASA S1 PARA ROMPER EL BUCLE /X A A A /^A A TTTTTTT copia de cDNA de doble cadena realizada a partir de un mRNA original
Figura 7-23 Síntesis de cDNA. Se obtiene una copia en DNA (cDNA) de una molécula de mRNA mediante la enzima transcriptasa inversa (véase pág. 303), formándose así una hélice híbrida DNA/RNA. El tratamiento del híbrido DNA/RNA con álcali degrada selectivamente el RNA hasta nucleótidos. La cadena sencilla de cDNA que perm anece es copiada por la DNA polimerasa formando una doble hélice de cDNA. Tal com o se indica, tanto la transcriptasa inversa como la DNA polimerasa requieren un cebador para poder iniciar la síntesis. En el caso de la transcripción inversa se utiliza un pequeño oligonucleótido, en este ejemplo se ha hibridado un oligo(dT) con la larga cola poli-A característica del extremo 3 ’ de la mayoría de mRNA. Es de destacar que la mayor parte de las moléculas de cDNA producidas carecen de extremos cohesivos; las moléculas que poseen extremos romos se pueden clonar mediante diferentes procedimientos que son similares (pero menos eficientes) a los descritos en la Figura 7-21.
transfectadas con éxito; si la bacteria se hace crecer en presencia del antibiótico, solamente sobrevivirán las células que contengan los plásmidos. Cada una de las bacterias que fue transfectada contendrá, en general, un fragmento de DNA inser tado diferente; este inserto será heredado por toda las células de la progenie de la bacteria que formarán una pequeña colonia en una placa de cultivo. La colección de muchas pequeñas bacterias supervivientes contiene la li brería de DNA, formada por un gran número de insertos de DNA diferentes. El problema es que sólo unas cuantas de ellas tendrán insertos de DNA con el gen de interés. Es necesario identificar dichas bacterias a fin de recuperar el DNA de interés en forma pura y en cantidades útiles. Antes de describir cómo puede ha cerse esto, es necesario describir una segunda estrategia en la construcción de librerías de DNA muy utilizada en el clonaje de genes.
Dos tipos de librerías de DNA cumplen diferentes propósitos17 El procedimiento de cortar el genoma completo de una célula mediante una nucleasa de restricción, tal como se acaba de describir, en ocasiones recibe el nombre de aproximación de la “perdigonada” al clonaje de genes. Produce una gran cantidad de fragmentos de DNA -para una célula de mamífero, del orden de un millón- que generarán por tanto millones de colonias diferentes de células transfectadas. Cada una de estas colonias estará compuesta por un clon derivado de una sola célula an tecesora, y por lo tanto, contendrá un plásmido recombinante con un inserto de la misma secuencia de DNA genómico. Se dice que un plásmido como éste contiene un clon de DNA genómico, y la colección completa de plásmidos se denomina una librería de DNA genómico. Sin embargo, debido a que el DNA genómico se ha cortado al azar en pequeños fragmentos, únicamente algunos de estos frag mentos contendrán genes enteros; muchos de ellos tan sólo contendrán una parte de un gen y la mayoría de los clones de DNA genómico obtenidos del DNA de una célula eucariota superior contendrán DNA no codificante, el cual, como se verá en el Capítulo 8, constituye la mayor parte del DNA de estos genomas.
Clonaje de DNA
333
gen A exón
gen B
DNA. „„ cromosomico
gen A i
_
DNA no transcrito
¡ntrón
TRANSCRIPCION
DIGESTION POR UNA NUCLEASA DE RESTRICCIÓN
transcritos deRNA 1 MADURACION DEL RNA
fragm entos de DNA
1111;1JJJJ
11111
gen B
1 ____ * % & & & & ___I
i i i i i i i i i i 1H H E H H H 1 111
11J JJJJjj J iiM1 mRNA
CLONAJE DE DNA I
I
\
\
TRANSCRIPCIÓN INVERSA Y CLONAJE
, 1■^
f ililí ......j¡¡
jin n
clones de DNA genómico
clones de cDNA
Una estrategia alternativa consiste en iniciar el proceso de clonaje seleccio nando las secuencias de DNA que se transcriben a RNA, y que, por lo tanto, pro bablem ente corresponden a genes. Ello se realiza mediante la extracción del mRNA (o de una subfracción purificada del mRNA) de las células, y a continua ción, haciendo una copia de DNA com plem entario (cDNA) de cada una de las moléculas de mRNA presentes; esta reacción está catalizada por la enzima transcriptasa inversa de retrovirus, la cual sintetiza una cadena de DNA sobre un mol de de RNA, Las moléculas de DNA de una sola cadena sintetizadas por la transcriptasa inversa se transforman en moléculas de DNA de doble cadena mediante la DNA polimerasa, y estas moléculas se insertan en vectores víricos o plasmídi cos y se clonan (Figura 7-23). Cada uno de los clones obtenidos de esta forma se denom ina clon de cDNA, y la colección com pleta de clones derivados de una preparación de mRNA constituye una librería de cDNA. Existen importantes diferencias entre los clones de DNA genómico y los clones de cDNA. Los clones genómicos representan una muestra al azar de todas las se cuencias de DNA de un organismo, y salvo muy raras excepciones, será el mismo independientemente del tipo celular que se haya utilizado para prepararlo. Por el contrario, los clones de cDNA sólo contienen las regiones del genoma que se han transcrito a mRNA; las células de diferentes tejidos contienen diferentes juegos de moléculas de mRNA, por lo que se obtendrá una librería de cDNA diferente en fun ción del tipo celular empleado para su construcción.
Los clones de cDNA contienen secuencias codificantes continuas18 La utilización de una librería de cDNA para el clonaje de genes tiene varias ventajas. Así, algunas células especializadas producen grandes cantidades de determinadas proteínas y en estos casos la cantidad de mRNA que codifica esta proteína se pro duce en un exceso tal que la librería de cDNA preparada a partir de estas células estará muy enriquecida en las moléculas cDNA que codifican esta proteína, lo cual facilita la identificación del clon deseado en la librería (Figura 7-24). Por ejemplo, la hemoglobina se fabrica en grandes cantidades en los eritrocitos en de sarrollo; por ello los genes de globinas fueron de los primeros en ser clonados.
334
Capítulo 7 : Tecnología del DNA recombinante
Figura 7-24 Diferencias entre clones de cDNA y clones genómicos. En este ejemplo, el gen A se transcribe muy poco mientras que el gen B lo hace frecuentemente, y ambos genes contienen intrones [verde). En los clones de DNA genómicos se incluyen tanto los intrones com o el DNA no transcrito, de forma que muchos clones contendrán sólo una parte de la secuencia codificante de un gen. En los clones de cDNA no hay secuencias de intrones ya que se han eliminado en el proceso de maduración del RNA para formar el mRNA, y por ello contienen una secuencia codificante continua.
La característica más importante de los clones de cDNA es que contienen la secuencia ininterrumpida de un gen. Frecuentemente los genes eucariotas con sisten en pequeñas secuencias cortas de DNA codificante (exones) separadas por regiones largas de DNA no codificante (intrones); la producción del mRNA supo ne la eliminación de las secuencias no codificantes del transcrito de RNA inicial y la unión entre sí de todas las secuencias codificantes. Ni las células bacterianas ni las levaduras realizan estas modificaciones sobre el RNA producido a partir de un gen de una célula eucariota. Así pues, si la intención del proceso de clonaje estri ba tanto en deducir la secuencia de aminoácidos de una proteína a partir de la del DNA, como en producir grandes cantidades de la proteína expresando el gen clonado en una bacteria o en una levadura, es mucho mejor partir del cDNA. Las librerías genómicas (genotecas) y las librerías de cDNA constituyen re cursos inagotables ampliamente utilizados en investigación. Hoy en día, muchas de estas librerías son tam bién asequibles comercialmente.
Pueden prepararse librerías de cDNA a partir de poblaciones seleccionadas de m oléculas de mRNA19 Cuando se prepara cDNA a partir de células que expresan el gen de interés a ni veles extremadamente altos, la mayoría de los clones pueden contener la se cuencia del gen, la cual puede así seleccionarse con un esfuerzo mínimo. Para el caso de genes transcritos de forma menos abundante, antes de hacer la librería de cDNA pueden utilizarse diversos métodos para enriquecer la población de RNA con el mRNA de interés. Por ejemplo, si se dispone de un anticuerpo contra la proteína, puede utilizarse para precipitar selectivamente los polirribosomas aislados (véanse págs. 253-254) que contengan las cadenas en crecim iento del polipéptido de que se trate. Como estos ribosomas también contienen el mRNA que codifica la proteína, el precipitado estará enriquecido en el mRNA deseado, en un factor de aproximadamente 1000 veces. El procedimiento de la hibridación substractiva supone una potente alter nativa para enriquecer la mezcla con una secuencia particular de nucleótidos, antes de proceder al clonaje de los cDNA. Este procedimiento de selección puede utilizarse, por ejemplo, si se dispone de dos tipos celulares estrechamente rela cionados procedentes de organismos de la misma especie, pero tales que sólo uno de ellos produzca la proteína o proteínas de interés. Fue utilizado inicial mente para identificar proteínas receptoras de superficie presentes en los linfocitos T y no presentes en los linfocitos B. También puede utilizarse cuando una cé lula que expresa la proteína tiene una mutante que no la expresa. El primer paso del proceso consiste en sintetizar las moléculas de cDNA utilizando el mRNA del tipo celular que fabrica la proteína de interés. A continuación, estos cDNA se hibridan con un gran exceso de moléculas de mRNA del segundo tipo celular. El es caso número de secuencias de cDNA que no encuentran pareja de mRNA com plementaria, y que por lo tanto probablemente representan las secuencias de mRNA que únicamente están presentes en el primer tipo celular, son purificadas por un procedimiento bioquímico sencillo (una columna de hidroxiapatita) que separa las moléculas de ácidos nucleicos de cadena sencilla de las de doble cade na (Figura 7-25). Además de constituir un poderoso sistema para clonar los genes cuyos productos están restringidos a un determinado tipo celular especializado, las librerías de cDNA preparadas tras hibridación substractiva son útiles para de finir las diferencias de expresión génica entre dos tipos celulares relacionados.
Para identificar los clones de interés en una librería de DNA puede utilizarse tanto una sonda de DNA como un ensayo para la proteína expresada20 A menudo la etapa más difícil del proceso de clonaje de genes consiste en iden tificar las escasas colonias de la librería que contienen los fragmentos de DNA de interés. Esto es especialmente cierto en el caso de librerías genómicas, en las
Clonaje de DNA
linfocitos T
linfocitos B
m
im
(•) • ® mRNA de los linfocitos T LA TRANSCRIPTASA ^5 = 1 = ^ INVERSA SINTETIZA DNA
mRNA de los linfocitos B
I DEGRADACIÓN ^ = 1 = = ^ ALCALINA DEL mRNA copias de cDNA
HIBRIDACION CON EXCESO DE m RNA PROCEDENTE DE LOS LINFOCITOS B ■ — cDNA de los escasos mRNA presentes únicam ente en los linfocitos T
UNA COLUMNA DE HIDROXIAPATITA ELIMINA TODOS LOS HÍBRIDOS DNA/RNA
cDNA purificados que corresponden a los mRNA característicos de los linfocitos T Figura 7-25 Hibridación substractiva. Aquí la técnica se utiliza para purificar clones de cDNA raros que corresponden a mRNA, presentes en linfocitos T pero no en linfocitos B. Como ambos tipos celulares están muy relacionados, muchos de los mRNA serán comunes a ambos tipos celulares; el método de hibridación substractiva es, por ello, una potente herramienta para obtener preparaciones enriquecidas en las moléculas especializadas que diferencian ambas células.
335
disco de papel absorbente
INCUBAR CON LA SONDA Y LAVAR colonias que contienen el plásmido de interés EXPONER EL PAPEL A LA PELÍCULA FOTOGRÁFICA
sonda de DNA marcada
DNA unido al papel
placa de petri con colonias de bacterias que contienen plásmidos recombinantes
RECOGER EL DISCO DE PAPEL DE LA PLACA PARA OBTENER LA RÉPLICA DE LAS COLONIAS
LISADO DE LAS BACTERIAS Y DESNATURALIZACIÓN DEL DNA
Figura 7-26 Una técnica eficiente que norm alm ente se utiliza para en contrar las colonias bacterianas que contienen un clon de cDNA determ inado. Se hace una réplica del cultivo presionando un disco de papel
absorbente contra la superficie. Esta réplica se trata con álcali (para romper las células y desnaturalizar el DNA plasmídico) y se híbrida con una sonda radiactiva de DNA. Las colonias que se han hibridado con la sonda se detectan por autorradiograffa (véase también Figura 7-22). que para identificar un determinado gen de mamífero se ha de identificar una célula bacteriana de entre un millón de células. La técnica utilizada más frecuen tem ente consiste en una forma de hibridación in situ, que aprovecha la exquisita especificidad de las interacciones entre pares de bases que se producen entre dos moléculas complementarias de ácidos nucleicos. Se transfieren (blotting) a un fil tro colonias crecidas en placas de cultivo, de forma que quedan adheridos algu nos miembros de cada colonia bacteriana. Estas colonias adheridas, conocidas como réplicas, se tratan con álcali y se incuban con una sonda radiactiva de DNA que contiene parte de la secuencia del gen que va a ser seleccionado (Figura 7-26). Si es necesario, de esta forma se pueden estudiar millones de clones bacterianos hasta encontrar uno que hibride con la sonda. Para encontrar el clon que interesa es necesario disponer de la sonda ade cuada. Cómo construirla dependerá de la información de que se disponga del gen a clonar. En muchos casos, la proteína de interés ha sido identificada m e diante estudios bioquímicos y purificada en pequeñas cantidades. Una cantidad tan pequeña como unos cuantos microgramos de la proteína pura es suficiente para determinar la secuencia de los 30 primeros aminoácidos. Utilizando el código genético, a partir de esta secuencia de aminoácidos se puede deducir la secuencia correspondiente de nucleótidos (con algunas ambigüedades que corresponden a aquellos aminoácidos que son codificados por diferentes codones). Entonces, utili zando métodos químicos, se sintetizan dos juegos de oligonucleótidos escogidos para reconocer diferentes zonas de la secuencia de nucleótidos predicha del gen (Figura 7-27). Aquellas colonias de células que hibriden con ambos nucleótidos son buenos candidatos para contener el gen deseado, y se aíslan para una carac terización posterior (véase más adelante). Las sondas tam bién se pueden obtener de otras formas. Si se dispone de an ticuerpos que reconozcan la proteína producida por el gen, es posible marcarlos y utilizarlos com o sonda para encontrar aquel clon que sea productor de la pro teína, y por ello que contendrá el gen buscado. También se puede usar como sonda cualquier otro ligando capaz de unirse a la proteína codificada por el gen:
336
Capítulo 7 : Tecnología del DNA recombinante
posición de las colonias deseadas detectadas por autorradiog rafia
región conocida de una secuencia de am inoácidos H2N — Gly Val Arg M et Asp Trp Asn Tyr Glu Pro Leu Ser Thr Trp Glu M et Asn Gln Trp Phe Val Arg Ala - COOH codones posibles 5' GGA GGC GGG GGU
GUA GUC GUG GUU
AGA AUG GAC UGG AAC UAC GAA CCA UUA AGC AAU UAU GAG CCC UUG AGU AGG GAU CCG CUA UCA CGA ccu CUC ucc CGC CUG UCG CGG CUU UCU CGU
ACA UGG GAA AUG AAC CAA UGG UUC GUA AGA UUU GUC AGG AAU CAG ACC GAG GUG CGA ACG GUU CGC ACU CGG CGU
GCA GCC GCG GCU
regiones de secuencia codificante con m enor am bigüedad oligonucleótidos sintéticos usados com o sondas
A U G G A y U G G A A jU A yG A Q C C
UG GGA q AUGAA[|CA q UGGUU
(16 posibilidades)
(8 posibilidades)
si codifica un proteína receptora, por ejemplo, el ligando que normalmente se une es un buen candidato a sonda específica. Siempre que sea necesario detectar la proteína codificada por el gen y el propio gen, es necesario construir un tipo de librería de cDNA especial. Se pre para utilizando vectores víricos o plasmídicos especiales, denominados vectores de expresión, que permiten la síntesis de grandes cantidades de la proteína codi ficada por el DNA exógeno en las bacterias transfectadas.
La traducción in vitro facilita la identificación del clon de DNA correcto21 Cualquier método que se utilice para aislar clones específicos a partir de librerías genómicas o librerías de cDNA detecta muchos falsos positivos. Se necesita, pues, una dosis suplementaria de ingenio para discriminar entre estos clones y los auténticam ente positivos. La tarea se facilita cuando el clon deseado codifica una proteína que ha sido bien caracterizada mediante otros sistemas. En este caso, se comprobará, mediante diferentes métodos, si alguno de los fragmentos de DNA clonados codifica la proteína apropiada. Por ejemplo, el DNA clonado se puede insertar en un vector de expresión, de modo que la proteína se produzca en grandes cantidades en bacterias. Asimismo se puede obtener la molécula de RNA correspondiente del DNA clonado, ya sea mediante síntesis in vitro con RNA polimerasa purificada (véase Figura 7-36), o mediante una técnica denominada selección de híbridos. En este último método se mezcla RNA celular en un gran exceso con moléculas de una sola hebra del DNA candidato, y los híbridos DNA/RNA se utilizan para poder aislar las moléculas de mRNA complementarias de la mezcla. El mRNA purificado de esta forma se utiliza para la síntesis de prote ína en un sistema libre de células con aminoácidos radiactivos, y la proteína ra diactiva producida se caracteriza y se compara con la esperada a partir del clon DNA buscado. La coincidencia de resultados en alguna de estas aproximaciones es la que nos permitirá concluir que el fragmento de DNA clonado codifica la proteína buscada.
Figura 7 -27 Selección de regiones de una secuencia de am inoácidos conocida p ara h acer sondas sintéticas de oligonucleótidos. De hecho, una secuencia de nucleótidos determinada codifica una sola proteína, pero la degeneración del código genético significa que varias secuencias de nucleótidos diferentes codifican la misma proteína, y es imposible anticipar cuál de ellas será la correcta. Debido a que es deseable utilizar como sonda una mezcla de oligonucleótidos con una proporción de la secuencia correcta de nucleótidos tan alta com o sea posible, se escogen las secuencias con menos indeterminaciones, como se muestra en la figura. En este ejemplo se deben sintetizar los 8 oligonucleótidos muy similares que se indican, que se usarán com o sonda sobre una librería de DNA, y la mezcla de los 16 oligonucleótidos se utilizará para verificar por hibridación todos los posibles clones positivos de la primera búsqueda, a fin de encontrar los que codifican la proteína deseada. Cada oligonucleótido se m arca en el extremo 5 ’ después de ser sintetizado por métodos químicos (véase Figura 7-6B); alternativamente, el oligonucleótido se puede marcar en el propio proceso de síntesis mediante la incorporación de un nucleótido modificado (véase Figura 7-18).
La selección de clones de DNA solapados permite “cam inar” por el crom osom a hasta un gen vecino de interés22 Muchos de los genes más interesantes -p or ejemplo los que controlan el desarro llo- se conocen tan sólo a través de análisis genéticos de imitantes en organismos tales como la mosca del vinagre Drosophila y el nemátodo Caenorhabditis elegans. Los productos proteicos de estos genes son conocidos y pueden hallarse en canti dades muy pequeñas en unas cuantas células, o producirse únicamente durante un determinado estadio del desarrollo. Sin embargo, es posible establecer mapas cromosómicos que reflejen las posiciones relativas de los diferentes genes en el
Clonaje de DNA
337
♦PREPARAR UNA SONDA DEL EXTREMO DEL CLON A
clon A
♦EMPLEAR LA SONDA PARA IDENTIFICAR EL NUEVO CLON clon B RESULTADO: UNA COLECCION DE CLONES DE DNA SOLAPADOS Y ORDENADOS QUE CUBREN TODA LA REGIÓN CROMOSOMICA
♦ PREPARAR UNA SONDA DEL EXTREMO DEL CLON B t EMPLEAR LA SONDA PARA IDENTIFICAR EL NUEVO CLON SU S-----------------------------n ___ ; ♦ etc. clon C ■
clon D
♦
etc.
gen clonado previam ente o m arcador genético I
DNA crom osom ico
/
nuevo gen de interés
dirección del "paseo" por el crom osom a
cromosoma a partir de estudios de ligamiento (véase Figura 7-16). Cuando un gen mapado se ha clonado, se pueden identificar los clones de una librería de DNA genóm ico que corresponden a genes vecinos, utilizando una técnica co nocida como '‘cam in ar por el crom osom a”. Una vez identificados éstos, se ca racterizan m ediante las técnicas descritas en este capítulo a fin de identificar su estructura y su función. El proceso de “caminar por el cromosoma” se inicia a partir de un clon de DNA o un marcador RFLP del que se sabe que está muy próximo al gen de interés. Un extremo de este clon se utiliza para preparar una sonda DNA que se usará para localizar clones genómicos mediante hibridación. Después de aislar este segundo clon se utiliza el extremo más alejado del anterior para preparar una se gunda sonda DNA, que también se utilizará para aislar nuevos clones genómicos. De este modo se puede ir caminando por el cromosoma, clon a clon, en pasos de unos 30 000 pares de bases o más, en ambas direcciones {Figura 7-28). Pero, ¿cómo se puede determinar cuándo se ha acabado el gen de interés (identificado originalmente mediante una mutación deletérea), dado que el cam i no recorrido generalmente es demasiado largo para poder determinar la secuencia completa de DNA? En el caso de organismos muy utilizados en experimentación como moscas del vinagre, nemátodos, Arabidopsis, levaduras y ratones, la prueba definitiva se obtiene al introducir la forma correcta del gen en un individuo mu íante, produciendo un organismo transgénico (véase Figuras 7-45 y 7-49). Si la mutación original era recesiva, el individuo transgénico debe recuperar la función normal. En otras ocasiones, como en el caso del estudio de los genes humanos, no es posible obtener transgénicos y por ello se aplican criterios menos severos, como se describe más adelante (véase Figura 7-30).
Figura 7 -28 Utilización del solapamiento de clones de DNA para encontrar un nuevo gen, mediante la técnica de “cam inar por el crom osom a”. Para aumentar la
velocidad del proceso, resulta óptimo utilizar moléculas de DNA clonadas muy largas. Para localizar el clon siguiente mediante el procedimiento de “caminar por el DNA”, se purifica un fragmento corto de DNA (y se marca radiactiva o químicamente) de uno de los extremos del clon identificado anteriormente: si se utiliza el extremo derecho, por ejemplo, el avance se realizará hacia la derecha, como se ilustra en el ejemplo. La utilización de pequeños fragmentos del extremo del clon reduce la probabilidad de que la sonda contenga secuencias de DNA repetidas que hibridarían con numerosos clones de diferentes regiones del genoma, con lo que se interrumpiría el “paseo”.
clones en vectores cósm idos Figura 7-29 Clones de DNA genómicos solapados. La colección de
clones en YAC ::í=
crom osom a 3
±
sup5
unc-32 300 000 pares de bases
338
Capítulo 7 : Tecnología del DNA recombinante
clones que se muestran cubren una pequeña región del cromosoma del gusano nemátodo Caenorhabditis elegans y representa un 0,3 % del genoma total. (Adaptado de J. Sulston et al., Nature 356:37-41,1992. © 1992 MacMillan Magazines Ltd.)
gen hum ano m utado, localizado en algún lugar de este m illón de pares de bases ETAPA 1 m arcador RFLP X
m arcador RFLP Y solapam iento de clones de DNA
ensamblaje de una librería de clones ordenados: se obtienen clones de DNA
secuencias de DNA conservadas en el ratón /
'
\
\
\
\
secuencias de DNA conservadas que codifican un mRNA adecuado ETAPA 4'
(-_____H
II
■
II
gen cuya secuencia está alterada en los hum anos que presentan el fenotipo m utante etapa
5
m
.
Se están construyendo librerías genómicas de clones ordenados para organismos seleccionados23 Será mucho más sencillo identificar genes mutantes a medida que se conozca más completa y sistemáticamente la secuencia del genoma normal. Utilizando métodos relacionados con los descritos para “caminar por el cromosoma”, ha sido posible or denar (mapar) un juego casi completo de grandes clones genómicos a lo largo de los cromosomas de la bacteria E. coli, la levadura Saccharomyces cerevisiae, la mosca del vinagre Drosophila, la planta Arabidopsis y el nemátodo C. elegans. Estos grandes clones, cada uno de los cuales tiene aproximadamente 30 000 pares de bases de lon gitud, se han preparado en vectores del bacteriófago lambda llamados cósmidos, los cuales se han diseñado especialmente para aceptar únicamente grandes insertos de DNA. Son necesarios algunos miles de clones cósmidos para cubrir todo el genoma de un organismo como C. elegans o Drosophila. Para mapar todo el genoma huma no siguiendo este sistema, se tendrían que ordenar más de 100 000 de estos clones cósmidos, lo cual, aunque es técnicamente posible, llevaría mucho tiempo. Además, se pueden clonar fragmentos de DNA humano más de 10 veces más largos que los clones cósmidos (300 000 hasta 1,5 millones de pares de bases) en forma de cromo somas artificiales en células de levadura {YAC, de Yeast Artificial Chromosomes, cro mosomas artificiales de levadura); en principio el genoma humano se puede mapar con 10 000 clones de este tipo (véase Figura 8-5). Sin duda, en un futuro próximo serán asequibles un conjunto de clones ge nómicos de librerías de DNA centralizadas para el uso de todos los investigado res. Para cada organismo de los que se estudian habitualmente existirá una li brería completa, en la que cada inserto de DNA estará catalogado de acuerdo con su cromosoma de origen, y numerado secuencialmente con respecto a la posición de todos los demás fragmentos de DNA derivados del mismo crom oso ma. Así, se podrá empezar a “caminar por un cromosoma”, simplemente obte niendo de la librería todos los clones que cubren la región del genoma que con tiene el gen mutante de interés.
Clonaje de DNA
Figura 7-30 Clonaje posicional. El procedimiento requiere la utilización de un gen humano mutante cuya herencia pueda detectarse en muchos grupos familiares gracias al fenotipo que causa dicha mutación. Etapa 1, mapaje genético: se identifican marcadores RFLP, que coheredan con el fenotipo mutante, y se utilizan para posicionar el gen en margen de unas 106 pares de bases (una megabase, alrededor del 1% de la longitud de un cromosoma humano típico). Etapa 2,
genómico que cubran la totalidad de la región comprendida entre dos marcadores RFLP que flanquean el gen. Etapa 3, búsqueda de secuencias de DNA conservadas: se identifican las porciones de cada clon DNA que hibridan con DNA de ratón; únicamente las regiones del cromosoma humano cuya secuencia de nucleótidos sea importante, estarán suficientemente conservadas durante la evolución para formar una hélice híbrida de DNA (una de las hebras de DNA humano y la otra de DNA de ratón). Etapa 4, búsqueda de mRNA adecuados: las secuencias de DNA que más probablemente contienen el gen mutante son el subconjunto de secuencias de DNA conservadas que codifican mRNA en los tejidos en los que se expresa el fenotipo mutante. Etapa 5, búsqueda de diferencias entre
las secuencias de DNA de los genes mutantes. Cuando se analizan las mutaciones deletéreas de un gen humano típico, alrededor de 1 de cada 10 resulta ser una delección fácilmente detectable por análisis Southern como una cambio del tamaño de un fragmento de restricción. Por esta razón, generalmente se empieza estudiando el DNA de muchos pacientes humanos que padezcan la misma enfermedad, utilizando sondas identificadas en la etapa 4, buscando cambios de este tipo. Si la mutación no es detectable como una delección, para identificar al gen de interés se deberán utilizar otros métodos más laboriosos que sean capaces de detectar cambios de una sola base.
339
El clonaje posicional de DNA revela la presencia de genes de funciones imprevistas24 Miles de enfermedades genéticas humanas son debidas a alteraciones en un solo gen. La comprensión que tenemos de dichas enfermedades está siendo revolu cionada por la tecnología del DNA, que permite clonarlo y secuenciarlo, revelan do los defectos precisos de cada paciente. De esta forma se ha podido demostrar que la causa de la distrofia muscular de Duchennne es una proteína anómala del citoesqueleto en las células musculares, y que la fibrosis quística es debida a un canal de cloro anómalo en las células epiteliales. Estos conocimientos permiten afinar el diagnóstico, y diseñar nuevos tratamientos. A pesar de que las técnicas que se han utilizado para aislar diferentes genes humanos han diferido dependiendo de la enfermedad que producen, reciente mente se ha desarrollado una aproximación que permitirá aislar cualquier gen humano responsable de un rasgo o causante de una enfermedad. Se ha denomi nado clonaje posicional pues parte de un mapa de ligamiento que permite loca lizar el gen en el genoma (Figura 7-30). Cuando esta aproximación es directa puede suponer la dedicación de 10 a 100 personas en un año para aislar un gen. Será mucho más sencillo una vez que se disponga de tecnologías de secuenciación de DNA mucho más rápidas y automáticas, y que se conozca la secuencia completa del DNA del genoma humano: el mapaje genético indicará inmediata mente qué genes son los primeros candidatos, permitiendo su análisis directo en los pacientes individuales. Es probable que se puedan analizar de este modo las funciones de miles de genes humanos.
Mediante una reacción de polimerización en cadena se pueden clonar segmentos de DNA en un tubo de ensayo25 La asequibilidad de DNA polimerasas purificadas y de oligonucleótidos de DNA sintetizados quím icam ente ha hecho posible clonar rápidamente secuencias determinadas de DNA, sin necesidad de utilizar ninguna célula viva. La técnica, denominada reacción en cadena de la polim erasa (PCR, de Polymerase Chain Reaction) permite amplificar más de mil millones de veces un DNA obtenido a partir de una región seleccionada de un genoma, siempre y cuando previamente se conozca al m enos una parte de su secuencia de nucleótidos. En primer lugar se utilizan porciones de la secuencia que rodean la región que va a ser amplifica da, para diseñar dos oligonucleótidos sintéticos de DNA, cada uno de los cuales es com plem entario de cada una de las cadenas de la doble hélice de DNA, y que corresponden a sitios opuestos de la región a amplificar. Estos oligonucleótidos se utilizan como cebadores para la síntesis in vitro de DNA, catalizada por una DNA polimerasa, y determinan los extremos del fragmento final de DNA que se obtiene (Figura 7-31). El principio de la técnica PCR se ilustra en la Figura 7-32. Cada ciclo de re acción requiere un breve calentam iento para separar las dos cadenas del DNA genóm ico de doble hélice (etapa 1). El éxito de la técnica depende del uso de una DNA polimerasa especial aislada de una bacteria termòfila y que es mucho más estable a temperaturas elevadas que la polimerasa común, de modo que no se desnaturaliza por calentam ientos repetidos. El enfriamiento posterior del DNA en presencia de un gran exceso de los dos oligonucleótidos permite su hi bridación específica con las secuencias complementarias de DNA (etapa 2). La mezcla se incuba con DNA polimerasa y los cuatro desoxirribonucleósidos tri fosfato, de forma que las regiones del DNA que se hallan en dirección 3' de los cebadores, se sintetizan selectivamente (etapa 3). Para conseguir una amplifica ción específica del DNA se requieren 20 o 30 ciclos de reacciones. Cada ciclo dura aproximadamente 5 minutos, y un procedimiento automático permite el clonaje en un sistema libre de células de un fragmento de DNA, en pocas horas, comparado con el tiempo de varios días que se requiere para el clonaje por los métodos estándar.
340
Capítulo 7 : Tecnología del DNA recombinante
cadenas de DNA com plem entarias separadas
K
si
m z — z2— Z ~ z iz — 3 3'
X pares de nucleótidos Figura 7-31 Inicio de la reacción en cadena de la polim erasa (PCR) para la amplificación de secuencias específicas de nucleótidos in vitro. El DNA aislado de células se calienta para separar su dos cadenas complementarias. Estas cadenas se hibridan con un gran exceso de dos oligonucleótidos (de 15 a 20 nucleótidos de longitud) sintetizados por métodos químicos y que son idénticos a secuencias que distan entre sí X nucleótidos (donde X varía generalmente entre 50 y 2000 nucleótidos). Los dos oligonucleótidos actúan como cebadores para la síntesis in vitro de DNA catalizada por la DNA polimerasa, que copia la secuencia de DNA que hay entre ambos oligonucleótidos.
separación de las cadenas de DNA y unión del cebador
separación de las cadenas de DNA y unión del cebador
síntesis de DNA
separación de las cadenas de DNA y unión del cebador /
etc.
^3
/
^
'
etc.
fragm ento de DNA crom osóm ico
PRIMER CICLO (2 m oléculas de DNA de doble cadena)
SEGUNDO CICLO (4 m oléculas de DNA de doble cadena)
TERCER CICLO (8 m oléculas de DNA de doble cadena)
Figura 7-3 2 Amplificación por PCR. El método PCR produce, en cada ciclo de síntesis de DNA, una cantidad doble de la precedente, de una molécula de tamaño único. Cada ciclo está formado por tres etapas, como se describe en el texto. Después de muchos ciclos de reacción la población de moléculas de DNA está dominada por un fragmento de DNA único, de X pares de bases, siempre que la muestra de DNA original contenga la secuencia que se esperaba que existiera entre los dos oligonucleótidos. En el ejemplo, tres ciclos de reacción han producido 16 cadenas de DNA, 8 de las cuales tienen la misma longitud {amarillo); pero después de tres ciclos más, 240 de las 256 cadenas serán de X nucleótidos de longitud.
El método PCR es extremadamente sensible: en una muestra puede detectar una sola molécula de DNA. De una forma similar se pueden analizar cantidades traza de RNA, transformando este RNA en secuencias DNA mediante la acción de la transcriptasa inversa. La técnica de clonaje mediante PCR está substituyen do con rapidez a la de transferencia Southern para el diagnóstico de enfermeda des genéticas y para la detección de infecciones víricas muy tenues. También constituye una técnica prometedora para la medicina forense, ya que permite analizar cantidades pequeñas de sangre u otros tejidos -tan pequeñas como una sola célula- e identificar a la persona de la que procede por sus características genéticas (Figura 7-33).
Resumen E l clonaje d e DNA perm ite seleccionar u na copia d e cu a lq u ier secuencia d e RNA o d e DNA en tre m illones d e otras secuencias d e u na célula, produciendo cantidades ilim itadas d e ella en fo rm a p u ra . Las secuencias d e DNA son am plificadas después d e corta r el DNA crom osóm ico con u na nucleasa d e restricción e insertar los fra g m entos d e DNA resultantes en el crom osom a d e u n elem ento genético autorreplicante (un plásm ido o u n virus). Cuando se utiliza u n plásm ido com o vector, la “li b rería genóm ica d e DNA” resultante se m antiene en el in terior d e m illones d e células bacterianas, cada u na d e las cuales porta u n fragm en to d iferen te d e DNA clonado. La colonia portadora d el fragm en to d e interés se identifica m ediante h i bridación con u na sonda DNA, o, después d e exp resa r el g en o el fragm en to génico clonado en la célula huésped, m ediante un sistem a q u e detecte el producto génico deseado. Las células d e la colonia identificada se d ejan p ro lifera r produciendo gra nd es cantidades d el fragm en to d e DNA deseado.
Clonaje de DNA
341
huella genética por PCR VNTR1 VNTR2 VNTR3
II
II
|1 i
individuo A
1
1
I____ I
I____ I
I____ I
3 pares de crom osom as hom ólogos
(B)
El procedimiento que se utiliza para aislar clones de DNA cuya secuencia co rresponda a la de un mRNA es el mismo, con la excepción de que, en vez de utilizar fragmentos genómicos al azar, el material de partida es un DNA obtenido mediante copia de un mRNA, denominado cDNA. A diferencia de los clones genómicos, los clones de cDNA carecen de secuencias intrónicas, siendo por ello los clones de elec ción para expresar y caracterizar el producto proteico de un gen. El método PCR es una nueva form a de clonaje de DNA que se realiza en un sis tema libre de células, utilizando una DNA polimerasa termoestable purificada. Este tipo de amplificación de DNA supone un conocimiento previo de la secuencia génica pues son necesarios dos oligonucleótidos sintéticos que flanqueen la secuen cia a amplificar. Sin embargo, el método de clonaje por PCR tiene la ventaja de ser mucho más rápido y sencillo que los métodos de clonaje estándar.
Ingeniería de DNA26 Los métodos que se han descrito hasta el momento en este capítulo permiten en principio determinar la organización y la secuencia nucleotídica de cualquier cromosoma, incluyendo aquellos que forman el genoma humano. En esta sec ción se describirán variaciones y modificaciones de dichos métodos que han re volucionado el estudio de las funciones de los genes, los RNA y las proteínas.
342
Capítulo 7 : Tecnología del DNA recombinante
Figura 7-33 Uso de PCR en m edicina forense. (A) Si se utilizan dos oligonucleótidos que flanquean un microsatélite particular, o secuencia VNTR (véase Figura 7-14C), para amplificar un DNA por PCR, se obtienen diferentes bandas de DNA para cada individuo. Una de estas bandas contiene la secuencia VNTR repetida que fue heredada de la madre y la otra contiene la secuencia VNTR repetida que fue heredada del padre. (B) La gran cantidad de bandas de DNA obtenidas de un conjunto de diferentes reacciones PCR, cada una de las cuales amplifica el DNA de una secuencia VNTR diferente, pueden utilizarse como “huella genética” para identificar a cada individuo de forma casi exclusiva. El material de partida en la reacción PCR puede ser un simple cabello olvidado en la escena de un crimen.
Se pueden construir moléculas de DNA de cualquier secuencia uniendo fragmentos de DNA27 Como hemos visto, las moléculas de DNA recombinante se obtienen general mente usando la enzima DNA ligasa para unir dos moléculas de DNA con extre mos cohesivos compatibles. En el caso de la construcción de una librería de DNA, uno de los fragmentos de DNA es el vector, derivado de un plásmido bacte riano o de un virus, mientras que el otro es un fragmento cromosómico o una molécula de cDNA (véase Figura 7-21). Esta molécula de DNA recombinante puede, a su vez, ser usada como vector para clonar moléculas de DNA adiciona les y, paso a paso, repitiendo el proceso de clonaje, es posible unir diferentes moléculas de DNA. Así es posible construir moléculas de DNA que son distintas de cualquiera que exista de forma natural (Figura 7-34). Los sintetizadores automáticos de oligonucleótidos son capaces de producir cualquier molécula de DNA de hasta 100 nucleótidos. Su secuencia es determinada por el experimentador; estas moléculas pueden unirse unas con otras por medio de etapas de clonaje sucesivas en diferentes com binaciones, a fin de producir largas moléculas de DNA. Sin embargo, en la mayor parte de los casos las secuen cias de DNA de interés para el biólogo celular son las que codifican dominios pro teicos que ya existen en la naturaleza. Es posible usar la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) tanto para amplificar secuencias nucleotídicas naturales como para rediseñar sus extremos, de forma que puedan amplificarse y unirse eficientemente dos secuencias naturales cualquiera (Figura 7-35). Actualmente en muchos casos es más fácil producir nuevas moléculas de DNA mediante PCR y clonajes sucesivos que unan segmentos de DNA seleccionados que a partir de fragmentos sintetizados químicamente.
Es posible producir grandes cantidades de moléculas de RNA homogéneas mediante transcripción de DNA in vitro28 Las moléculas de RNA puras son de utilidad en numerosos estudios de biología celular. En el caso de que el RNA codifique una proteína, disponer de grandes
secuencia codificante A
secuencias codificantes a unir secuencia codificante B
SEPARACIÓN DE HEBRAS Y UNION DE CEBADORES PCR CON COLAS 5' ( < i ) QUE CONTIENEN DIANAS DE RESTRICCIÓN □ 3'
51i 'l;"
Figura 7 -3 4 El clonaje seriado de DNA puede utilizarse para unir una serie de fragmentos de DNA procedentes de diferentes genes. Todas las moléculas que se representan son de doble hebra. Después de cada etapa de inserción de DNA, el plásmido es clonado para purificar y amplificar la nueva molécula recom binante. El plásmido recom binante es cortado con una nucleasa de restricción y utilizado como vector para el siguiente fragmento de DNA.
5'
3*
MUCHOS CICLOS DE PCR PRODUCEN COPIAS DE LAS SECUENCIAS A Y B CON LOS EXTREMOS MODIFICADOS DESEADOS
CORTAR LOS EXTREMOS CON LA NUCLEASA DE RESTRICCIÓN
UNION DE LOS FRAGMENTOS.
unión exacta de la secuencia codificante A con la secuencia codificante B
Ingeniería de DNA
Figura 7 -35 La “m anufactura” de los extrem os de los fragmentos de DNA facilita la precisión de su unión. La reacción PCR permite modificar los extremos de cualquier fragmento de DNA que va a ser amplificado, para facilitar su clonaje. Los oligonucleótidos sintéticos usados aquí com o cebadores contienen extremos 5 ’ elegidos para crear una diana de corte para una nucleasa de restricción particular.
34 3
cantidades de esa especie pura facilitará el estudio, por ejemplo, de la madura ción del RNA y de la síntesis de la proteína; si el RNA tiene una función catalítica, esta actividad podrá ser analizada en sistemas libres de células. Sin embargo, un gran núm ero de los RNA celulares se encuentran en pequeñas cantidades, y es muy difícil su purificación de los muchos miles de otros RNA presentes en un ex tracto celular. La ingeniería genética proporciona el mejor sistema de purificar especies puras de RNA, gracias a hacer accesible moldes de DNA puros que per m iten producir cualquier molécula de RNA. Esta técnica utiliza RNA polimerasas víricas que son especialmente eficientes. Para preparar el molde de DNA apropiado, se clona el DNA que codifica el RNA de forma que se una a un segundo fragmento de DNA que contenga la señal de inicio (promotor) para la RNA polimerasa vírica. Esta molécula de DNA recombinante pura se mezcla con la RNA polimerasa vírica y los cuatro ribonucleósidos trifosfato utilizados en la síntesis de RNA. Durante una incubación a 37°C se produce gran cantidad del RNA deseado mediante transcripción in vitro (Figura 7-36).
molécula de DNA de doble hebra, construida por ingeniería genética
prom otor víríco
secuencia que especifica el RNA CORTE CON UNA NUCLEASA DE RESTRICCIÓN
(
INCUBACIÓN CON RNA POLIMERASA MÁS NUCLEÓSIDO TRIFOSFATOS
Utilizando vectores de expresión es posible producir grandes cantidades de proteínas celulares m inoritarias29 Hasta hace muy poco, las únicas proteínas de una célula que podían estudiarse con facilidad eran las relativamente más abundantes. A partir de varios cientos de gramos de células se puede purificar una proteína abundante -q u e constitu ya el 1% o más de la proteína total™ mediante pasos cromatográficos secuenciales, llegando a obtener quizás 0,1 g (100 mg) de proteina pura. Esta cantidad de proteína es suficiente para realizar una secuenciación de aminoácidos conven cional, para desarrollar un análisis detallado de su actividad biológica o enzimà tica (si es conocida) y para generar anticuerpos que puedan ser utilizados para localizar la proteína en el interior de la célula. Además, si se consigue obtener cristales apropiados (lo cual normalmente constituye una tarea difícil), será po sible determinar la estructura tridimensional de la proteína mediante técnicas de difracción de rayos X. De esta manera, se han analizado la estructura y la fun ción de muchas proteínas abundantes, entre las que se hedían la hemoglobina, la tripsina, algunas inmunoglobulinas y la lisozima. La inm ensa mayoría de los miles de proteínas diferentes de una sola célula eucariota, incluidas algunas de las proteínas más interesantes, se hallan presen tes en cantidades muy reducidas. Resulta extremadamente difícil, cuando no es imposible, obtener más de unos cuantos miligramos de material puro de la m a yoría de estas proteínas minoritarias. Una de las contribuciones más trascen dentales del clonaje del DNA y de la ingeniería genética a la biología celular es que han hecho posible la manufactura en grandes cantidades de cualquiera de las proteínas celulares, incluyendo las minoritarias. En principio es posible producir grandes cantidades de una proteina pura si se sintetiza gran cantidad de mRNA que codifica dicha proteína y después se traduce en un sistema libre de células que contenga los numerosos componentes necesa rios para la síntesis de proteínas, incluyendo ribosomas, RNA de transferencia, en zimas de traducción, etc. Esta aproximación se usa en ocasiones aunque es mucho más eficiente producir tanto el mRNA como la proteina en una célula viva, utilizan do un vector de expresión (Figura 7-37). Este vector está diseñado para producir grandes cantidades de mRNA estable que será traducido eficientemente a proteína en el interior de la bacteria, levadura, o célula de mamífero. A fin de evitar que la elevada síntesis de la proteína extraña interfiera con el crecimiento de la célula transfectada, los vectores de expresión se suelen diseñar de modo que la síntesis de la proteína extraña se inicie poco antes de recolectar las células (Figura 7-38). Debido a que la proteína deseada fabricada por un vector de expresión se pro duce en el interior de la célula, ha de purificarse del resto de las proteínas de la cé lula huésped mediante cromatografía, tras la lisis celular; pero debido a que se halla en cantidades importantes (entre un 1% y un 10% del total de la proteína celular), habitualmente la purificación puede conseguirse fácilmente en unas cuantas eta-
344
Capítulo 7 : Tecnología del DNA recombinante
3' I ELIMINAR EL DNA I Y LA PROTEÍNA moléculas
|
de RNA
puraS
Figura 7-36 Se pueden obtener in vitro grandes cantidades de cualquier molécula de RNA usando una RNA polim erasa vírica. Para utilizar estas enzimas extraordinariamente eficientes es necesario que en el molde de DNA esté construido de forma que la corta secuencia de DNA que especifica el promotor vírica sea adyacente a la secuencia de DNA que codifica la molécula de RNA que se va a sintetizar. Como se indica, el extremo 3' del RNA se determina al cortar el molde DNA con una nucleasa de restricción de diana única.
Figura 7 -37 Producción de grandes cantidades de una proteína por clonaje de una secuencia codificante de una proteína en un vector de expresión plasmídico. El plásmido se ha construido de forma que contiene un promotor muy activo, capaz de dirigir la síntesis de una gran cantidad del mRNA que codifica la proteína, en las células transfectadas.
pas. Existe una gran variedad de vectores de expresión, cada uno de los cuales está construido para que actúe en el tipo celular en el que se va a producir la proteína. De esta forma, las células pueden ser inducidas a fabricar grandes cantidades de proteínas útiles desde el punto de vista médico -com o insulina y hormona del cre cimiento humanas, interferón y antígenos víricos para producir vacunas. De forma más general, estos métodos hacen posible producir proteínas en cantidades sufi cientemente grandes para poder estudiar detalles de su estructura y de su función, que antes estaban reservados únicamente a unas cuantas proteínas.
Los genes marcadores perm iten analizar la función de las secuencias de DNA reguladoras30 La transcripción de un gen está controlada por secuencias de DNA reguladoras que no se transcriben. Estas secuencias determinan qué células expresarán el gen y bajo qué condiciones, como se explica en el Capítulo 9. En eucariotas superiores dichas secuencias se pueden encontrar situadas a muchos miles de pares de bases por delante o por detrás de las secuencias que se transcriben, y actúan en dife rentes com binaciones controlando la expresión gènica. Las secuencias de DNA reguladoras de un gen se pueden identificar mediante una manipulación que supone reemplazar parte de la secuencia codificante por otra diferente (denomi nada secuencia marcadora ) seleccionada, debido a que la proteína que codifica se detecta con facilidad mediante tinción citologica simple o ensayo enzimàtico. Las secuencias reguladoras se identificarán uniendo diferentes regiones de se cuencia anterior o posterior del gen a la secuencia marcadora. Cuando se transfecten células con estas moléculas de DNA recombinante el nivel de expresión de la proteína marcadora, el momento en que se produce ésta y la especificidad celular, reflejarán la función de las secuencias reguladoras que contiene cada construcción de DNA (Figura 7-39).
vector de expresión plasm ídico, DNA de doble hebra
secuencia lugar de dél p ro m o to r. clonaje CORTAR CON UNA NUCLEASA DE RESTRICCION
INSERTAR LA SECUENCIA DE DNA QUE CODIFICA LA PROTEÍNA
TRANSFECTAR CELULAS CON EL DNA RECOMBINANTE
RNA sobre-expresado
proteína sobre-expresada
tiem po a
Los organismos im itantes revelan m ejor la función de un gen31 Supongamos que se ha clonado un gen que codifica una proteína recién descu bierta. ¿Cómo podremos descubrir la función que desarrolla esta proteína en la célula? Éste es un problem a actualm ente muy habitual en biología celular, pero sorprendentem ente difícil de resolver, ya que ni la estructura tridim ensio nal de la proteína ni la secuencia com pleta de nucleótidos de su gen son sufi cientes para determ inar la función de la proteína. Además, muchas proteínas -tales com o las que tienen funciones estructurales en la célula o las que nor m alm ente forman parte de un gran com plejo enzim àtico- carecen de una acti vidad obvia cuando están separadas de los otros com ponentes de su unidad funcional.
?.S°C
«C
ÜNA
Mélicas^
Figura 7 -38 Producción de grandes cantidades de una proteína utilizando un vector de expresión plasmídico. En este ejemplo se han transfectado bacterias con la secuencia codificante de una enzima, la DNA helicasa (flecha); la transcripción de esta secuencia codificante se encuentra bajo el control de un promotor vírico que es activo únicam ente a temperaturas de 37°C o superiores. Se ha analizado la proteína celular total por electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS, tanto de bacterias cultivadas a 25°C (no se produce helicasa), com o de las mismas bacterias cultivadas a 42°C durante dos horas. (Fotografía cortesía de Jack Barry.)
Ingeniería de DNA
345
(A) MOLÉCULAS DE DNA ORIGINALES secuencia codificante de la proteina X
norm al \
1 . / secuencias . . reguladoras que determ inan la expresión del gen X recom binada ■BE 1 2
lugar de la . * de . deinicio . DMA síntesis RNA
secuencia codificante de la proteína m arcadora Y 1 i g g l j S p v ¡¡¡P § 1 ' 1Ü 1 3
(B) MOLÉCULAS DNA RECOMBINANTES A ANALIZAR 3 2
PATRÓN DE EXPRESIÓN DEL GEN X células ___ 'A B C D E F
CM
patrón norm al de expresión del gen X PATRÓN DE EXPRESIÓN DEL GEN MARCADOR Y
PATRON DE EXPRESION DEL GEN MARCADOR Y
i 1
.
1
1
(C) CONCLUSIONES
-la secuencia reguladora 3 activa el gen X en las células B -la secuencia reguladora 2 activa el gen X en las células D, E y F -la secuencia reguladora 1 inactiva el gen X en las células D
Una aproximación que ya hemos com entado (véase Capítulo 4), consiste en inactivar la proteína a estudiar mediante un anticuerpo específico y observar cómo esto afecta a las células. A pesar de que esta estrategia proporciona una poderosa vía para estudiar la función proteica, para el caso de un proteína intracelular el efecto es transitorio ya que el anticuerpo microinyectado se diluye du rante la proliferación celular o es destruido por degradación intracelular. Asi mismo, muchos anticuerpos -incluso los que se unen fuertemente a alguna región de la proteína diana- son incapaces de bloquear la función de la proteína. Las aproximaciones genéticas proporcionan una solución convincente a este problema. Los organismos mutantes que carecen de una determinada pro teína pueden indicar rápidamente cuál es la función de la molécula normal. Aun son más útiles los m utantes que sintetizan una versión de la proteína que es sen sible a la temperatura, es decir, que se inactiva por un pequeño aumento (o dis minución) de la temperatura del medio, pues en esos mutantes la anomalía pue de ser manifestada o no simplemente modificando la temperatura. Antes del desarrollo de la tecnología del clonaje de DNA se identificaron numerosos genes mediante esta aproximación, determinando los procesos afectados por la muta ción. La aproximación genética ha sido aplicable de forma más general a los or ganismos que se reproducen muy rápidamente -co m o las bacterias, las levadu ras, los gusanos nem átodos y las moscas del vinagre. Tratando estos organismos con agentes que alteran su DNA (mutágenos ), se pueden aislar rápidamente un gran número de m utantes y detectar y aislar los que presentan un defecto parti cular que interese. Por ejemplo, mediante el estudio de poblaciones de bacterias tratadas con un mutágeno que detenga la síntesis de DNA cuando las bacterias se transfieren desde 30°C hasta 42°C, se aislaron m uchos mutantes sensibles a la temperatura en los genes que codifican las proteínas bacterianas necesarias para la replicación del DNA. Posteriormente, estos mutantes fueron utilizados para identificar y caracterizar las proteínas correspondientes responsables de la replicación del DNA. De una forma similar se ha utilizado la aproximación gené tica para demostrar la función de las enzimas implicadas en las principales rutas
346
Capítulo 7 : Tecnología del DNA recombinante
Figura 7-39 Uso de una proteina m arcadora para localizar las regiones de DNA reguladoras que determinan el patrón de expresión de un gen. En este ejemplo la secuencia codificante de la proteina X se reemplaza por la secuencia codificante de la proteína Y, y se le añaden diferentes com binaciones de fragmentos de DNA que contienen secuencias candidatas a ser reguladoras. Se mide la capacidad de expresión de las moléculas recom binantes en una colección de células de mamífero transfectadas. En los estudios sobre células eucariotas se suelen utilizar dos genes marcadores, la enzima (3-galactosidasa (|3-gtìf) y la cloranfenicol acetil transferasa (CAT). Ambas son enzimas bacterianas y su presencia se mide fácilmente mediante ensayos de actividad enzimàtica simples y muy sensibles sin que interfieran las enzimas del huésped.
metabólicas de bacterias, así como para descubrir numerosos productos génicos responsables del desarrollo ordenado del embrión de Drosophila. Los humanos no nos reproducimos rápidamente, ni tampoco somos tratados intencionadamente con mutágenos. Además, cualquier humano que presente un defecto serio en algún proceso esencial, como el de la replicación del DNA, morirá antes de nacer. No obstante, en la población humana aparecen espontáneamente algunas mutaciones que son compatibles con la vida -por ejemplo defectos en lisosomas o en receptores de la superficie celular, específicos de tejido. El análisis de los fenotipos de los individuos afectados, conjuntamente con estudios de sus células cultivadas, han aportado pruebas únicas sobre importantes funciones celulares. A pesar de que estos imitantes son extremadamente escasos, se ponen de manifiesto de forma muy eficaz debido a una característica específica de los humanos: los indi viduos imitantes llaman la atención sobre sí mismos buscando cuidados médicos especiales.
Pueden fabricarse “a medida” células y organismos que contengan genes alterados32 A pesar de que normalmente no resulta difícil obtener mutantes deficientes en un determinado proceso, como pueden ser los procesos de la replicación del DNA o del desarrollo del ojo, el encontrar una mutación que suponga el defecto de una proteína determinada puede suponer muchos años de trabajo. Recientemente la tecnología del DNA recombinante ha hecho posible una aproximación genética di ferente a este problema, mediante la cual se parte de una proteína y se genera una célula o un organismo mutante en el que la proteína (o su expresión) sea anómala. Dado que esta nueva aproximación invierte la dirección tradicional del análisis ge nético (del gen a la proteína), habitualmente se la denomina genética inversa. La genética inversa parte de una proteína que haya sido aislada de una célula y que presente propiedades interesantes. Si el punto de partida es una proteína, se clona el gen que la codifica y se determina su secuencia de nucleótidos. Posterior mente se altera la secuencia bioquímicamente, creando un gen mutante que codi fique una versión alterada de la proteína. El gen mutante se transfiere a un célula, en la que puede integrarse a un cromosoma mediante recombinación genética y pasar a formar parte de la dotación permanente del genoma celular. Si el gen se expresa, la célula y todos sus descendientes sintetizarán una proteína alterada. Si la célula original utilizada para la transferencia del gen es un huevo fe cundado, se podrá obtener un organismo completo que contenga el gen m utan te. Algunos de estos organismos transgenicos transmitirán el gen alterado a su progenie com o una parte de su línea germinal. Actualmente se realizan de forma rutinaria transformaciones genéticas de este tipo sobre organismo tan complejos como la m osca del vinagre y algunos mamíferos (Figura 7-45). De hecho es téc nicam ente posible transformar de esta forma incluso organismos humanos, si bien estos experimentos no se realizan por temor a las aberraciones imprevisi bles que pueden darse en tales individuos.
Los genes se pueden rediseñar para que produzcan proteínas de cualquier secuencia que se desee33 Con la finalidad de facilitar los estudios de genética inversa, es posible modificar tanto la secuencia codificante de un gen como sus regiones de regulación de modo que se modifiquen tanto las propiedades de la proteína, como la cantidad de ella que se sintetiza o el tipo celular en que se produce. Para alterar los genes de forma más sutil (a menudo es deseable que la proteína que codifican difiera de la original en un solo o en unos cuantos am inoáci dos) son necesarias técnicas especiales. El primer paso consiste en la síntesis química de una corta molécula de DNA que contenga la porción alterada de la secuencia nucleotídica del gen. Este oligonucleótido sintético de DNA se híbrida con un plásmido de DNA de una sola cadena que contenga la secuencia de DNA
Ingeniería de DNA
347
cebador sintético constituido por un oligonucléotido sintético que contiene la secuencia mutante deseada cadena sencilla del gen norm al plásm ido de DNA
SUSTITUCION DE NUCLEÓTIDOS
INSERCIÓN DE NUCLEÓTIDOS
LA CADENA SE COMPLETA MEDIANTE LA ACCIÓN DE LA DNA POLIMERASA Y LA DNA LIGASA I
t
OOOOOOOIOOOOOOOO
0000000000000000
proteína con un am inoácido cam biado
proteína norm al
que se quiera alterar, utilizando condiciones que permitan el apareamiento im perfecto de cadenas de DNA (Figura 7-40). El oligonucléotido sintético se utiliza ahora como cebador para la síntesis de DNA mediante la DNA polimerasa, gene rándose así una doble hélice de DNA que incorpora al gen la secuencia alterada. A continuación, el gen modificado se inserta en un vector de expresión de forma que la proteína rediseñada se pueda sintetizar en gran cantidad, suficiente para estudios detallados. Utilizando esta técnica se pueden cambiar determinados aminoácidos de una proteína y analizar qué parte de la cadena polipeptídica es importante en procesos tan importantes como su plegamiento, las interacciones proteína-ligando o la catálisis enzimàtica.
Habitualmente las proteínas de fusión son de gran utilidad para analizar la función proteica34 En una proteína se suelen encontrar regiones de pocos aminoácidos que son res ponsables de determinar su localización en la célula, o su estabilidad después de ser sintetizada. Estas regiones específicas de la proteína se pueden identificar fu sionándolas con una proteína marcadora, fácilmente detectable, que carezca de dichas regiones, y siguiendo su comportamiento en la célula (Figura 7-41). Estas proteínas de fusión se producen mediante las técnicas del DNA recombinante que se han descrito previamente. Por ejemplo, numerosas proteínas nucleares contie nen una o más secuencias cortas específicas que actúan de señal para su importa ción por el núcleo, después de ser sintetizadas en el citosol. Se han conseguido identificar dichas regiones uniendo artificialmente, mediante la técnica de fusión gènica, diferentes regiones de proteínas nucleares a una proteina citoplasmàtica.
348
Capítulo 7 : Tecnología del DNA recombinante
00000000« # 1®»1«®00000000 proteína con am inoácidos suplem entarios insertados
Figura 7-40 Utilización de oligonucleótidos sintéticos para modificar las regiones de los genes que codifican proteínas. Únicamente se muestran dos de los muchos tipos de cambios que se pueden generar mediante la ingeniería genética, utilizando sistemas com o éste. Por ejemplo, con un oligonucléotido apropiado se puede substituir más de un aminoácido cada vez, o se pueden eliminar uno o más aminoácidos. Como se indica, dado que por este procedimiento sólo se altera una de las dos cadenas del DNA del plásmido recombinante, únicam ente la mitad de las células transfectadas acabarán conteniendo el plásmido que presente el gen mutante deseado. Nótese que en la figura no se ilustra la mayoría de la secuencia del plásmido.
región funcional de la proteina X
Figura 7-41 Dos estrategias p ara el estudio de la función de las proteínas que utilizan ingeniería genética. En la
epítopo añadido a la proteina X \
proteína marcadora región funcional de la proteina X añadida a la proteína marcadora ESTRATEGIA A: AÑADIR UNA FUNCIÓN A UNA PROTEÍNA MARCADORA el estudio del efecto de la región transferida sobre la proteína marcadora perm ite determ inar la función de dicha región
1
1
1
i
r x i
■
epítopo añadido a la proteina X ESTRATEGIA B: ELIMINAR UNA FUNCIÓN DE UNA PROTEÍNA NORMAL la determ inación del com portam iento del epítopo en la célula perm ite estudiar la función de la región mutada de la proteína
estrategia A, se añade una nueva función a una proteína marcadora mediante su unión a un pequeño fragmento de la proteína normal X. En la estrategia B, se realizan pequeñas modificaciones a la proteína normal X, y su comportamiento es seguido, a fin de compararlo con el de la proteína normal, gracias a la detección de un pequeño epítopo añadido en uno de sus extremos. Ambas estrategias se han utilizado para analizar la estructura y la función de las señales de transporte al núcleo que se encuentran en las proteínas nucleares (véase Capítulo 12).
Sin embargo, no es posible transferir en forma de una secuencia corta de aminoácidos todas las señales importantes que contienen las proteínas, a una proteína marcadora. Por ejemplo, la señal responsable del transporte al lisosoma desde el complejo de Golgi, de las enzimas lisosomales recién sintetizadas consiste en una “región señal”, cuya formación requiere que la enzima lisosomal se pliegue correctam ente de forma que zonas distantes en la secuencia queden localizadas próximas en el espacio. Para identificar estos casos se puede utilizar la estrategia de m areaje de epítopos. También se ha de producir una proteína de fusión, pero en este caso a la proteína normal se le añade un péptido corto de 8 a 12 aminoácidos (el “epítopo”) que es reconocido por un anticuerpo -d e ahí su nombre. Así, mediante el uso del anticuerpo anti-epítopo, es posible seguir las proteínas de fusión en las células incluso en presencia de una gran cantidad de proteína normal, siendo por tanto posible determinar el efecto sobre la locali zación celular de cualquier alteración de aminoácidos en la proteína de fusión (estrategia B en la Figura 7-41).
Los genes normales son fácilm ente reemplazables por imitantes, tanto en bacterias como en algunos eucariotas inferiores35 A diferencia de los eucariotas superiores (que son pluricelulares y diploides), las bacterias, las levaduras y el hongo filamentoso Dictyostelium existen general mente como células individuales haploides. En estos organismos es posible substituir, con elevada frecuencia, un gen normal por otro introducido en forma de molécula de DNA artificial, mediante recombinación homóloga (véase pág. 281), de forma que es fácil producir células en las que el gen mutante substituya al gen normal (Figura 7-42A). De esta forma es posible que las células produzcan
gen norm al X (A) REEMPLAZAMIENTO GÉNICO
I I I crom osom a
gen m utante X
(B) ADICION GÉNICA Ì
EL GEN MUTANTE REEMPLAZA EL GEN NORMAL
EL GEN MUTANTE SE INSERTA EN UN NUEVO LUGAR DEL CROMOSOMA
I
sólo es activo el gen m utante
Ingeniería de DNA
i 1 ambos genes son activos
Figura 7 -4 2 Reemplazamiento y adición génicos. Es posible reinsertar,
en los cromosomas de un organismo, un gen que ha sido alterado. En bacterias y en organismos haploides como la levadura, frecuentemente se reemplaza el gen normal, en un proceso denominado reemplazamiento génico (A); en estos casos sólo permanece en la célula el gen mutante. En los eucariotas superiores es más frecuente el fenómeno de adición génica que el de reemplazamiento génico; en esos casos la célula u organismo transformados contienen el gen mutado además del gen normal.
349
una forma alterada de la proteina o de la molécula de RNA en lugar de la forma normal de la molécula. Si el gen mutante es completamente inactivo y su pro ducto gènico realiza una función esencial, la célula morirá; pero en aquellos ca sos en los que la mutación sea menos severa, pueden usarse para reemplazar al gen normal, de forma que la célula mutante sobreviva, aunque el proceso para el que se requiere el gen sea anómalo. Con frecuencia el mutante de elección es uno que presente un producto sensible a la temperatura, que funcione normal m ente a una temperatura pero que se inactive cuando las células sean colocadas a una temperatura superior o inferior. La capacidad de realizar reemplazamientos génicos en eucariotas superiores, unido a la potencia del análisis gènico estándar en estos organismos haploides, es la causa que explica en gran parte por qué los estudios sobre estos organis mos han sido tan importantes para desentrañar aquellos procesos que son co munes a todos los eucariotas. Los reemplazamientos génicos son mucho menos frecuentes en eucariotas superiores por razones que aún se desconocen.
Genes desarrollados por ingeniería genética pueden crear m utaciones dom inantes específicas en los organismos diploides36 Los eucariotas superiores, como los mamíferos o la mosca del vinagre, son di ploides, es decir, tienen dos copias de cada cromosoma. Además, la transfección con un gen modificado conduce generalmente a una adición gènica más que a un reemplazamientg gènico: el gen modificado se inserta en una posición al azar en el genoma, de modo que la célula (o el organismo) acaba con un gen mutado además de sus copias normales (Figura 7 -42B). Dado que en el caso de eucariotas superiores es mucho más fácil obtener una adición gènica que un reemplazamiento gènico, podría ser enormemente útil el poder generar m u ta c io n e s d o m in a n te s n e g a tiv a s, de forma que un gen modificado fuera capaz de inactivar a sus copias normales en la célula. Una aproximación ingeniosa y prometedora consigue este objetivo aprovechando la especificidad de la reacción de hibridación entre dos cadenas complementarias de ácido nucleico. Normalmente sólo se transcribe a RNA una de las dos hebras de una zona determinada de la doble hélice de DNA, siempre la misma para cada gen. Si m ediante la ingeniería genética se fabrica un gen clonado de tal m a nera que sólo se transcriba la hebra opuesta del DNA, el resultado será un RNA a n tise n tid o que presentará una secuencia complementaria a la de los transcri tos de RNA normales. Cuando se sintetiza en cantidades suficientes, a menudo
gen norm al X
crom osom a
ADICION GÈNICA
gen X alterado para producir RNA antisentido
TRANSCRIPCION RNA norm al
RNA antisentido
T
doble hélice de RNA
LA FORMACIÓN DE UNA DOBLE HÉLICE RNA/RNA IMPIDE LA SÍNTESIS DE LA PROTEÍNA PRODUCTO DEL GEN NORMAL X
350
Capítulo 7 : Tecnología del DNA recombinante
figura 7-43 Estrategia del RNA .uitisentido para obtener muíanles jiegativos dominantes. Los genes rnutantes que se han construido de forma que se produzca RNA ¿ntisentido, es decir la secuencia de I*NA complementaria a la producida jjor el gen normal X, pueden hacer que ¿e forme RNA de doble cadena en el interior de la célula. Si se produce una ^ran cantidad de RNA antisentido, j>odrá hibridar -e inactivar- una gran piarte del RNA normal del gen X. Ji pesar de que en el futudo es posible ¿ue de esta forma se puedan inactivar ^enes en la actualidad ha dado buenos resultados con algunos genes i
n o con otros.
com plejo de proteina norm al
ACTIVO
com plejo de proteina m utante
com plejo de proteína norm al y m utante
INACTIVO
INACTIVO
el RNA antisentido se hibridará con el RNA “con sentido” fabricado por los genes normales, inhibiendo así la síntesis de la proteína correspondiente (Figura 7-43). Un método similar consiste en sintetizar cortas moléculas de ácido nucleico por métodos químicos o enzimáticos, e inyectarlas (o introducirlas de alguna otra forma) en la célula, bloqueando de nuevo (aunque sólo temporalmente) la pro ducción de la proteína correspondiente. Por razones desconocidas la aproximación del RNA antisentido frecuente mente fracasa en la inactivación del gen deseado. Una estrategia alternativa para obtener una mutación dominante negativa se basa en el hecho de que muchas proteínas actúan como parte de grandes complejos proteicos. Para inactivar es tos complejos basta incluir en ellos un elemento no funcional. Así pues, diseñan do un gen que produzca grandes cantidades de una proteína mutante que sea inactiva pero que se una al complejo, es posible conseguir una célula en que todos los complejos sean inactivos a pesar de la presencia tanto de formas normales como imitantes de la proteína (Figura 7-44). Si una proteína es necesaria para la supervivencia de la célula (o del organis mo), un mutante dominante negativo morirá, haciendo imposible analizar la función de la proteína. Para evitar este problema, se puede acoplar el gen mutan te a secuencias de control que permitan la producción de la proteína mutante sólo en ciertas condiciones -p or ejemplo, en respuesta a un incremento de tem peratura o a la presencia de moléculas señal específicas. Aquellas células o orga nismos que contengan mutantes dominantes negativos inducibles pueden ser privados de la función de la proteína normal en cualquier momento y estudiar el efecto producido. Es muy probable que en el futuro, las técnicas para producir mutantes dominantes negativos para inactivar genes específicos sean utilizadas ampliamente para determinar las funciones de las proteínas en los organismos superiores.
Figura 7 -44 Efecto dominante negativo de una proteina. En el ejemplo, un gen se modifica para producir una proteína mutante que impida que las copias normales de la misma proteína realicen su función. En este caso la proteína normal ha de formar un com plejo de varias subunidades para ser activo, y la proteína mutante bloquea la función, pues al unirse al com plejo lo hace inactivo. De esta forma una única copia de un gen mutante localizado en cualquier parte del genoma puede inactivar los productos normales producidos por otras copias génicas.
Genes sometidos a ingeniería genética se pueden insertar de form a perm anente en la línea germinal de un ratón o de la m osca del vinagre, produciendo animales transgénicos37 La última prueba de la función de un gen alterado consiste en reinsertarlo en un organismo y estudiar qué efectos produce. Idealmente, parece que lo m ejor sería reemplazar el gen normal por el gen alterado, de forma que pueda analizarse la función de la proteína mutante en ausencia de la proteína normal. Como se ha descrito previamente, esto sólo puede conseguirse plenam ente en el caso de algunos organismos haploides, pero en el caso de los eucariotas superiores, los fenóm enos de integración que conduzcan a un reemplazamiento de genes ocurren muy raramente. El DNA extraño puede, por el contrario, integrarse fá cilm ente al azar en el genoma. Por ejemplo, en mamíferos los fragmentos linea les de DNA introducidos son rápidamente unidos por sus extremos mediante enzimas celulares, formando largos tándems que normalmente son integrados en el crom osom a aleatoriamente. A este respecto, los oocitos fecundados de m a mífero se comportan como las demás células de mamífero. Un oocito de ratón al
Ingeniería de DNA
351
RATÓN
DROSOPHILA
oocito fecundado [O
em brión tem prano
MICROINYECCION DEL GEN DE INTERÉS INSERTADO EN LA SECUENCIA DE DNA DE UN ELEMENTO TRANSPONIBLE
MICROINYECCION DEL GEN DE INTERÉS, EN FORMA DE DNA LINEAL, EN EL PRONÚCLEO MASCULINO
Figura 7-45 Comparación entre los procesos estándar utilizados para obtener ratones y Drosophila transgénicos. En estos ejemplos, el gen inyectado en el oocito del ratón da lugar a un cambio en el color de la piel mientras que el gen inyectado en el embrión de la mosca da lugar a un cambio de color en el ojo. En ambos organismos se ha encontrado que algunos de los animales transgénicos tienen insertos de DNA en más de un lugar del cromosoma.
em brión INTRODUCCIÓN DE VARIOS EMBRIONES DE ESTE TIPO EN UN RATÓN PSEUDOPREÑADO
células germ inales prim ordiales ALGUNOS EMBRIONES SE CONVIERTEN EN MOSCAS CUYAS CÉLULAS GERMINALES CONTIENEN EL GEN DE INTERÉS
TODAS LAS MOSCAS SUPERVIVIENTES SE CRUZAN PARA BUSCAR EL GEN EN LAS CÉLULAS GERMINALES
TRAS UNA BIOPSIA, SE ESTUDIA LA PRESENCIA DEL GEN EN LAS CÉLULAS SOMÁTICAS DE LOS DESCENDIENTES, Y EN LOS RATONES SELECCIONADOS QUE SE HAN CRUZADO, SE ESTUDIA LA PRESENCIA DEL GEN EN SUS CÉLULAS GERMINALES
RATON TRANSGENICO copias del gen, ordenadas en tándem , se insertan al azar en un crom osom a de cada célula
embrión to " transformado con
el yen f;s
DROSOPHILA TRANSGENICA
gen gen gen gen
una copia sencilla del gen se inserta al azar en un crom osom a de cada célula gen
cadena de genes ordenados en tándem
extrem os DNA del elem ento transponible
/ ------------------
que se le han inyectado 200 copias de una molécula lineal de DNA, probable mente dará lugar a un ratón que contendrá en algún lugar aleatorio de uno de sus cromosomas un tándem de copias del gen inyectado (Figura 7-45). Si el cro mosoma modificado tam bién se halla presente en las células de la línea germi nal (oocitos y espermatozoides), el ratón pasará a su descendencia los genes que ha adoptado: los animales que han sido alterados de forma permanente de esta manera se denominan o rg a n is m o s tra n s g é n ic o s , y a los genes extraños, tr a n s g en es. Generalmente el gen normal tam bién está presente, por lo que sólo se manifestarán los efectos dominantes de la modificación. A pesar de ello, los ani males transgénicos han aportado información muy valiosa para entender cómo
352
embrión normal
Capítulo 7 : Tecnología del DNA recombinante
I_________
200 iim
Figura 7 -46 Rescate genético. Comparación entre una larva de D rosop h ila normal y dos larvas mutantes que contienen genes ftz defectuosos. Una de las larvas con un gen defectuoso iftz~) ha sido transformada mediante la inyección, en un huevo de uno de sus ancestros, de un clon de DNA que contiene el gen ftz de secuencia normal. Esta secuencia de DNA añadida se ha integrado de forma permanente en uno de los cromosom as de la mosca, de forma que se hereda y expresa fielmente. El gen ftz es necesario para el desarrollo normal de la mosca, y la adición de este gen al genoma provoca la recuperación de los segmentos de la larva, que habían desaparecido en el organismo ftz Para detalles de la técnica utilizada para conseguir animales transgénicos, véase Figura 7-45. (Por cortesía de Walter Gehring.)
preparación del gen m odificado por ingeniería genética DNA clonado del gen diana I
ELIMINAR LA REGIÓN CENTRAL Y REEMPLAZARLA " CON EL GEN neo i
w m ~m | AÑADIR EL GEN tk
el gen neo confiere el gen tk confiere resistencia a la droga X sensibilidad a la droga Y (B) fenóm eno infrecuente de recom binación hom ologa
(A) fenóm eno frecuente de recom binación no hom ologa
.
I
.
, i ; ............
CULTIVAR CÉLULAS EN PRESENCIA DE AM BAS DROGAS X E Y gen diana inactivado resistencia a' la droga X
i
; . .i
sensibilidad a la droga Y ___ J
LA CELULA MUERE
i
resistencia a / la ausencia del gen tk la droga X confiere a la células resistencia a la droga Y
Figura 7-47 Inactivación génica selectiva por recom binación homóloga en el ratón. DNA clonado de ratón se modifica por ingeniería genética de modo que se le inserta un gen bacteriano, denominado neo, que, tras integración en un crom osom a de ratón, confiere a las células la resistencia a una droga (droga X) que en caso contrario resultaría letal. En un extremo del DNA clonado de ratón se añade un gen vírico, el gen tk. La integración de tk en un crom osom a de ratón hace sen sibles a las células a otra droga (droga Y). La mayor parte de las inserciones que tienen lugar en el crom osom a son al azar, y casi siempre incluyen am bos extremos del DNA modificado (A). Si se seleccionan las células, poco frecuentes, capaces de crecer en presencia de a m b a s drogas, se obtendrán colonias de células en las que se ha incorporado, por recom binación homóloga, el centro del DNA modificado sin los extremos; muchas de estas células mostrarán un reemplazamiento génico similar al mostrado en (B).
LA CELULA SOBREVIVE
se regulan los genes de mamífero y cómo ciertos genes (denominados oncoge nes) producen cáncer. Tam bién es posible producir moscas del vinagre transgénicas, en las que co pias únicas de un gen se han insertado al azar en el genoma de Drosophila. En este caso la estrategia consiste en insertar primero el fragmento de DNA entre las dos secuencias terminales de un elemento transponible particular de Dro sophila, denominado elemento P. Las secuencias terminales del elemento P le permiten integrarse en los cromosomas de Drosophila si la enzima transposasa del elemento P tam bién se halla presente (véase pág. 305). Por lo tanto, para ha cer moscas del vinagre transgénicas, el DNA adecuadamente modificado se in yecta en un embrión muy joven de la m osca del vinagre con un plásmido que contenga el gen que codifica la transposasa. Normalmente, cuando se hace esto y com o resultado del proceso de transposición, el gen inyectado entra en la línea germinal en forma de una copia única (Figuras 7-45 y 7-46).
cerebro m edio
cerebelo
El direccionamiento gènico hace posible obtener ratones transgénicos que carecen de determinados genes38 Si se introduce una molécula de DNA que contiene un gen de ratón mutado en una célula de ratón, frecuentemente se inserta al azar en el cromosoma, pero una vez de cada mil, reemplazará una de las dos copias del gen normal por re com binación homologa. Aprovechando estos fenómenos infrecuentes “de direc cionam iento gènico” (gene targeting) es posible inactivar cualquier gen en una célula de ratón por reemplazamiento gènico. Este método se completa con el proceso en dos etapas que se describe a continuación, permitiendo la obtención de un ratón con un gen defectuoso. En primer lugar, el fragmento de DNA que contiene el gen mutante deseado (o parte del gen) se transfecta en una línea especial de células germinales pluri-
Ingeniería de DNA
Figura 7 -48 Ratón transgénico en que se han eliminado, por recom binación homóloga, am bas copias de un gen del factor de crecim iento Wnt-1. (A) Sección de cerebro de un embrión normal. (B) Sección de cerebro de un embrión mutante, que carece de cerebelo y de la mayor parte del cerebro medio, y morirá in útero. (Fotografías cortesía de Mario Capecchi.)
353
discos de hoja incubados con Agrobacteria m odificada por ingeniería genética durante 24 h.
discos tom ados de hoja de tabaco
el m edio selectivo sólo perm ite proliferar a las células vegetales que han adquirido el DNA de la bacteria
callos
tallos m edio inductor de tallos crecim iento de la plántula enraizada planta adulta que porta el transgén que estaba originalm ente en la bacteria célula bacteriana
transgen de ínteres
célula vegetal
citoplasm a
gen m arcador seleccionable
plásm ido recom binante en A grobacterium repeticiones de 25 pares de nucleótidos del T-DNA
(B)
crom osom a vegetal
EL DNA SE EXTRAE DEL PLÁSMIDO EN FORMA LINEAL Y SE TRANSFIERE DIRECTAMENTE A LA CÉLULA VEGETAL, DONDE SE INTEGRARÁ EN EL CROMOSOMA VEGETAL
potentes derivadas del embrión (denominadas células madre embrionarias o cé lulas ES -d e Embrionic Stem Cells), que crecen en cultivo celular. Tras un perío do de proliferación celular, las escasas colonias de células en las que se ha podi do producir un reemplazamiento génico, se aíslan mediante doble selección con drogas (Figura 7-47). De entre ellas se identifican las colonias correctas median te PCR o transferencia Southern: contendrán secuencias de DNA recombinante en las que el fragmento insertado ha reemplazado todo o parte de una copia del gen normal. En la segunda etapa, células individuales de la colonia identificada se recogen con una micropipeta y se inyectan en un embrión temprano de ra tón. Las células madre embrionarias transfectadas colaboran con las células del embrión huésped para formar el ratón de apariencia normal (véase Figura 2132); una gran parte de estos animales quiméricos, incluyendo en casos favora bles células de la línea germinal, proceden de las células madre modificadas arti-
354
Capítulo 7 : Tecnología del DNA recombinante
Flgura 7 -49 Procedimiento utilizado para obtener una planta transgénica. (A) Esquema del proceso. Se corta un disco de una hoja y se cultiva en presencia de A grobacteria portadora de un plásmido que contiene tanto un marcador seleccionable com o el transgén deseado. Las células de la periferia del disco, heridas, secretan substancias que atraen A grobacteria, la cual les inyecta el DNA. Sólo sobreviven aquellas células que expresan el marcador selectivo, es decir aquellas que han recibido el DNA adecuado, y formarán un callo. Manipulando los factores de crecim iento que recibe el callo se puede inducir la formación de tallos que enraizarán y se desarrollarán dando lugar a una planta adulta portadora del transgén. (B) Preparación del plásmido recom binante y su transferencia a la célula de la planta. Un plásmido de A grobacterium , portador de la secuencia de T-DNA se modifica para incluir un marcador seleccionable (por ejemplo, el gen de resistencia a kanamicina) y el transgén deseado, entre los 25 pares de bases repetidos del T-DNA. Cuando A grobacteriu m reconoce una célula vegetal, inyecta una cadena de DNA en ef citoplasma de la célula utilizando el mecanismo que normalm ente transfiere la secuencia de T-DNA.
ficialmente. Estos animales se cruzan para obtener machos y hembras, cada uno de los cuales son heterocigotos para el reemplazamiento génico (es decir, tienen una copia normal y una copia mutante del gen). Cuando se cruzan estos dos ra tones, una cuarta parte de su descendencia debe ser homocigota respecto al gen modificado. El estudio de estos homocigotos permite examinar la función del gen modificado en ausencia del gen normal. La capacidad de preparar ratones transgénicos que carecen de un gen normal conocido ha sido un gran avance, y actualmente esta técnica se utiliza ampliamente para analizar las funciones de diversos genes de mamífero (Figu ra 7-48).
Las plantas transgénicas son importantes tanto para la biología celular como para la agricultura39 Cuando una planta sufre un daño en muchos casos puede reparar el daño m e diante un proceso por el cual células diferenciadas se “desdiferencian”, proliferan y rediferencian en otros tipos celulares. En algunos casos las células desdife renciadas pueden llegar a formar un meristemo apical, que puede generar una planta completamente nueva, incluyendo los gametos. Esta notable plasticidad de las células vegetales puede ser utilizada para generar plantas transgénicas a partir de células cultivadas. Cuando se cultiva un trozo de tejido de una planta en un medio estéril que contiene nutrientes y factores de crecimiento adecuados, muchas de las células son estimuladas a crecer indefinidamente de una forma desorganizada, produ ciendo una masa de células relativamente indiferenciadas denominada callo. Si se manipulan adecuadamente los nutrientes y los reguladores del crecimiento, es posible inducir la formación de meristemos apicales y radiculares en el callo, pudiendo, en muchas especies, regenerar la planta completa. Los cultivos de callos se pueden disociar también m ecánicam ente en células aisladas, que crecerán y se dividirán como un cultivo en suspensión. En un gran número de plantas -en tre las que se incluyen el tabaco, la petunia, la zanahoria, la patata y Arabidopsis- a partir de células aisladas se pueden obtener pequeños grupos de células (un clon), a partir de los cuales se puede regenerar una planta completa. Del mismo modo que se puede obtener un ratón transgénico por m a nipulación genética de células embrionarias en cultivo, pueden obtenerse plan tas transgénicas a partir de células vegetales aisladas cultivadas, transfectadas con DNA (Figura 7-49). La capacidad de producir plantas transgénicas ha acelerado el progreso en muchas áreas de la biología celular vegetal. Ha jugado un papel importante, por ejemplo, en el aislamiento de receptores para los reguladores del crecimiento y en el análisis de los mecanismos de morfogénesis y de expresión génica en plan tas. Ha abierto nuevas posibilidades en agricultura que pueden beneficiar tanto al agricultor como al consumidor. Ha hecho posible, por ejemplo, modificar el contenido de lípidos, almidón y proteínas de reserva almacenadas en las sem i llas, aumentar la resistencia de las plantas a plagas y virus, y crear plantas modi ficadas que toleran hábitats extremos como márgenes de concentración de sal o suelos encharcados. La mayor parte de los avances en la comprensión del desarrollo animal pro cede de estudios sobre la mosca del vinagre Drosophila y del nemátodo Caenorhabditis elegans, que son abordables para el análisis genético extensivo así como para la manipulación experimental. Los progresos en la biología del desarrollo de las plantas han sido mucho más lentos comparativamente. La mayor parte de los organismos que se han encontrado más adecuados para el análisis genético tie nen ciclos vitales largos y genomas enormes, lo cual ha hecho de su estudio gené tico clásico y molecular una labor que requiere mucho tiempo y esfuerzo. Por ello se ha dedicado especial atención a una planta pequeña de crecimiento rápi do, Arabidopsis thaliana, que tiene grandes ventajas para ser escogida como “planta modelo” (véase Figura 21-93).
Ingeniería de DNA
355
Resumen La tecnología del DNA recombinante ha revolucionado el estudio de la célula. Las técnicas de ingeniería del DNA pueden utilizarse para crear cualquier gen mutante e insertarlo en el cromosoma de las células, de forma que pase a ser una parte per manente del genoma. Si la célula utilizada para esta transferencia de genes es un huevo fecundado (para un animal) o una célula vegetal totipotente en cultivo, se obtendrán organismos transgénicos que expresarán el gen mutante y lo pasarán a su progenie. Es especialmente importante para el biólogo celular la posibilidad que proporciona esta tecnología de alterar células de manera específica -permitiendo discernir el efecto que tiene sobre una célula el cambio de una sola proteina que ha sido mutada intencionadamente por técnicas de “genética inversa”. Las consecuencias prácticas de la tecnología del DNA recombinante también abarcan otras posibilidades. Se pueden utilizar las bacterias, las levaduras o inclu so células de mamífero para, mediante ingeniería genética, producir una proteína en grandes cantidades, lo cual hace posible analizar en detalle la estructura y la Junción de esta proteína, o utilizar la proteína como una vacuna o como un fárm a co con finalidad médica.
Bibliografia Citas 1. Sambrook, J.; Fritsh, E.F.; Maniatis, T. Molecular Clo ning: A Laboratory Manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. Watson, J.D.; Tooze, J. The DNA Story: A Documentary History of Gene Cloning. New York: W.H. Freeman, 1981. Watson, J.D.; Tooze, J.; Kurtz, D.T. Recombinant DNA: A Short Course. New York: W.H. Freeman, 1983. 2. Kessler, C.; Manta, V. Specificity of restriction endonu cleases and DNA modification methyltransferases-a review (Edition 3). Gene92:1-248, 1990. 3. Danna, K.J. Determination of fragment order through partial digests and multiple enzyme digests. Methods Enzymol. 65:449-467, 1980. Nathans, D.; Smith, H.O. Restriction endonucleases in the analysis and restructuring of DNA molecules. Annu. Rev. Biochem. 44:273-293, 1975. 4. Andrews, A.T. Electrophoresis, 2nd ed. Oxford, UK: Cla rendon Press, 1986. Evans, G.A. Physical mapping of the human genome by pulsed field gel analysis. Curr. Opin. Genet. Dev. 1:7581,1991. Southern, E.M. Gel electrophoresis of restriction frag ments. Methods Enzymol. 68:152-176, 1979. 5. Lehman, I.R. DNA polymerase I of Escherichia coli. In The Enzymes, Vol. 14A (P.D. Boyer, ed.), pp. 16-38. New York: Academic Press, 1981. Richardson, C.C. Polynucleotide kinase from Escheri chia coli infected with bacteriophage T4. Nucleic Acids Res. 2:815, 1971. Rigby, P.W.; Dieckmann, M.; Rhodes, C.; Berg, P. Labe ling deoxyribonucleic acid to high specific activity in vitro by nick translation with DNA polymerase I. /. MolBiol. 113:237-251,1977. 6. Griffin, H.G.; Griffin, A.M. DNA sequencing. Recent in novations and future trends. Appi. Biochem. Biotech. 38:147-159, 1993.
356
Capítulo 7 : Tecnología del DNA recombinante
Maxam, A.M.; Gilbert, W. A new method for sequencing DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:560-564, 1977. Maxam, A.M.; Gilbert, W. Sequencing end-labeled DNA with base-specific chemical cleavages. Methods Enzymol. 65:499-560,1980. Prober, J.M.; Trainor, G.; Dam, R.; et al. A system for ra pid DNA sequencing with fluorescent chain termina ting dideoxynucleotides. Science 238:336-341,1987. Sanger, F.; Nicklen, S.; Coulson, A.R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5463-5467,1977. 7. Cartwright, I.L.; Kelly, S.E. Probing the nature of chro mosomal DNA-protein contacts by in vivo footprinting. Biotechniques 11:188-203, 1991. Galas, D.J.; Schmitz, A. DNAse footprinting: a simple method for the detection of protein-DNA binding specificity. Nucleic Acids Res. 5:3157-3170,1978. Tullius, T.D. Physical studies of protein-DNA complexes by footprinting. Annu. Rev. Biophys. Biophys. Chem. 18:213-237,1989. 8. Schildkraut, c.L.; Marmur, J.; Doty, P. The formation of hybrid DNA molecules and their use in studies of DNA homologies. J. Mol. Biol. 3:595-617,1961. Wetmur, J.G. Hybridization and renaturation kinetics of nucleic acids. Annu. Rev. Biophys. Bioeng. 5:337-361, 1976. Wetmur, J.G. DNA probes: applications of the principles of nucleic acid hybridization. Critical Review in Bio chem. Mol. Biol. 26:227-259,1991. 9. Berk, A.J.; Sharp, P.A. Sizing and mapping of early ade novirus mRNAs by gel electrophoresis of SI endonu clease digested hybrids. Cell 12:721-732,1977. Gerhard, D.S.; Kawasaki, E.S.; Bancroft, F.C.; Szabo, P. Localization of a unique gene by direct hybridization. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:3755-3759, 1981. Pardue, M.L.; Gall, J.G. Molecular hybridization of ra dioactive DNA to the DNA of cytological prepara tions. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 64:600-604, 1969. Wallace, R.B.; Shaffer, J.; Murphy, R.F.; et al. Hybridiza tion of synthetic oligodeoxyribonucleotides to <|>X174 DNA: the effect of a single base pair mismatch. Nu cleic Acids Res. 6:3543-3557,1979.
10. Alwine, J.C.; Kemp, D.J.; Stark, G.R. Method for delection of specific RNAs in agarose gels by transfer to diabenzylozymethyl-paper and hybridization with DNA probes. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74:5350-5354, 1977. Southern, E.M. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. /. Mol. Biol. 98:503-517, 1975. Thomas, P.S. Hybridization of denatured RNA and small DNA fragments transferred to nitrocellulose. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77:5201-5205,1980. 11. Chang, C.; Meyerowitz, E.M. Plant genome studies: re striction fragment length polymorphism and chro mosome mapping information. Curr. Opin. Genet Dev. 1:112-118, 1991. Kidd, K.K. Progress towards completing the human lin kage map. Curr. Opin. Genet. Dev. 1:99-104,1991. Pourzand, C.; Cerutti, P. Genotypic mutation analysis by RFLP/PCR. Mutat. Res. 288:113-121, 1993. 12. Gilbert, F.; Marinduque, B. DNA prenatal diagnosis. Curr. Opin. Obstet. Gynecol. 2:226-235,1990. Lathe, R. Synthetic oligonucleotide probes deduced from amino acid sequence data. Theoretical and practical considerations. J. Mol. Biol. 183:1-12,1985. 13. McGinnis, W.; Garber, R.L.; Wirz, J.; et al. A homologous protein-coding sequence in Drosophila homeotic ge nes and its conservation in other metazoans. Cell 37:403-408, 1984. 14. Stephenson, E.C.; Pokrywka, N.J. Localizatino of bicoid message during Drosophila oogenesis. Curr. Top. Dev. Biol. 26:23-34,1992. Trask, B.J. Gene mapping by in situ hybridization. Curr. Opin. Genet. Dev. 1:82-87,1991. 15. Ausubel, F.M.; Brent, R.; Kingston, R.E.; et al., eds. Curret Protocols in Molecular Biology. New York: Wiley, 1993. Drlica, K. Understanding DNA and Gene Cloning. New York: Wiley, 1984. 16. Cohen, S.N. The manipulation of genes. Sei. Am. 233(l):24-33, 1975. Foster, T.J. Plasmid-determined resistance to antimi crobial drugs and toxic metal ions in bacteria. Micro biol. Rev. 47:361-409,1983. Hanahan, D. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids./. Mol. Biol. 166:557-580,1983. Novick, R.P. Plasmids. Sei. Am. 243(6):102-127,1980. 17. Lennon, G.G.; Lehrach, H. Hybridization analyses of arrayed cDNA libraries. Trends Genet. 7:314-317, 1991. Maniatis, T., et al. The isolation of structural genes from libraries of eucaryotic DNA. Cell 15:687-701,1978. 18. Okayama, H.; Berg, P. High-efficiency cloning of fulllength cDNA. Mol. Cell Biol. 2:161-170,1982. Southern, E.M. Genome mapping: cDNA approaches. Curr. Opin. Genet. Dev. 2:412-416, 1992. 19. Calvet, J.P. Molecular approaches for analyzing differ ential gene expression: differential cDNA library construction and screening. Pediat. Nephrol. 5:751757,1991. Hedrick, S.M.; Cohen, D.I.; Nielsen, E.A.; Davis, M.M. Isolation of cDNA clones encoding T cell-specific membrane-associated proteins. Nature 308:149-153, 1984. 20. Yang, J.; Ye, J.; Wallace, D.C. Computer selection of oligo nucleotide probes from amino acid sequences for use in gene library screening. Nucleic Acids Res. 12:837843,1984. Young, R.A.; Davis, R.W. Efficient isolation of genes using antibody probes. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80:1194-1198, 1983. Bibliografía
21. Hope, IA ; Struhl, K. GCN4 protein, synthesized in vitro, binds HIS3 regulatory sequences: implications for general control of amino acid biosynthetic genes in yeast. Cell 43:177-188,1985. Ricciardi, R.P.; Miller, J.S.; Roberts, B.E. Purification and mapping of specific mRNAs by hybridization-selection ana cell-free translation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:4927-4931,1979. 22. Stubbs, L. Long-range walking techniques in positional cloning strategies. Mammalian Genome 3:127-142, 1992. 23. Burke, D.T. The role of yeast artificial chromosomes in generating genome maps. Curr. Opin. Genet. Dev. 1:69-74,1991. Carrano, A.V.; de Jong, P.J.; Branscomb, E.; et al. Con structing chromosome- and region-specific cosmid maps of the human genome. Genome 31:1059-1065, 1989. Coulson, A.; Kozono, Y.; Lutterbach, B.; et al. YACs and the C. elegans genome. Bioessays 13:413-417,1991. Hauge, B.M.; Hanley, S.; Giraudat, J.; et al. Mapping the Arabidopsis genome. Symp. Soc. Exper. Biol. 45:45-56, 1991. 24. Harris, A.; Argent, B.E. The cystic fibrosis gene and its product CFTR. Semin. Cell Biol. 4:37-44,1993. Hyser, C.L. Unraveling the mysteries of Duchenne and Becker muscular dystrophy. Mol. Chem. Neuropathol. 10:15-20,1989. Wicking, C.; Williamson, B. From linked marker to gene. Trends Genet. 7:288-293,1991. 25. Allen, R.W.; Wallhermfechtel, M.; Miller, W.V. The appli cation of restriction fragment length polymorphism mapping to parentage testing. Transfusion 30:552564,1990. Bottema, C.D.; Sommer, S.S. PCR amplification of spe cific alleles: rapid delection of known mutations and polymorphisms. Mutat. Res. 288:93-102, 1993. Nelson, D.L. Appliations of polymerase chain reaction methods in genome mapping. Curr. Opin. Genet. Dev. 1:62-68,1991. Pourzand, C.; Cerutti, P. Genotypic mutation analysis by RFLP/PCR. Mutat. Res. 288:113-121, 1993. Saiki, R.K.; Gelfand, D.H.; Stoffel, S.; et al. Primer-direc ted enzymatic amplification of DNA with a thermos table DNA polymerase. Science 239:487-491,1988. 26. Olson, M.V. The human genome project. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:4338-4344, 1993. Szostak, J.W. In vitro genetics. Trends Biochem. Sci. 17:89-93,1992. 27. Itakura, K.; Rossi, J.J.; Wallace, R.B. Synthesis and use of synthetic oligonucleotides. Annu. Rev. Biochem. 53:323-356,1984. 28. Melton, D.A.; Krieg, P.A.; Rebagliati, M.R.; et al. Efficient in vitro synthesis of biologically active RNA and RNA hybridization probes from plasmids containing a bacteriophage SP6 promoter. Nucleic Acids Res. 12:7035-7056,1984. 29. Abelson, J.; Butz, E., eds. Recombinant DNA. Science 209:1317-1438,1980. Baibas, P.; Bolivar, F. Design and construction of ex pression plasmid vectors in E. coli. Methods Enzymol. 1985:14-37,1990. Gilbert, W.; Villa-Komaroff, L. Useful proteins from re combinant bacteria. Sci. Am. 242(4):74-94,1980. Mille, L.K. Baculoviruses: high-level expression in insect cells. Curr. Opin. Genet. Dev. 3:97-101,1993. Rose, A.B.; Broach, J.R. Propagation and expression of cloned genes in yeast: 2-micron circle-based vectors. Methods Enzymol. 185:234-279,1990. 357
30. Alam, J.; Cook, J.L. Reporter genes: application to the study of mammalian gene transcription. Anal. Bio chem. 188:245-254, 1990. Bellen, H.J.; Wilson, C.; Gehring, W.J. Dissecting the complexity of the nervous system by enhancer detec tion. Bioessays 12:199-204,1990. 31. Jockusch, B.M.; Zurek, B.; Zahn, R.; Westmeyer, A.; Fuchtbauer, A. Antibodies against vertebrate microfi lament proteins in the analysis of cellular motility and adhesion./. Cell Sci. S14:41-47,1991. Lederberg, J.; Lederberg, E.M. Replica plating and indi rect selection of bacterial mutants. J. Bacteriol 63:399-406,1952. Nusslein-Volhard, C.; Weischaus, E. Mutations affecting segment number and polarity in Drosophila. Nature 287:795-801, 1980. 32. Kaiser, K. From gene to phenotype in Drosophila and other organisms. Bioessays 12:297-301,1990. Landei, C.P.; Chen, S.; Evans, G.A. Reverse genetics us ing transgenic mice. Annu. Rev. Physiol. 52:841-851, 1990. Provost, G.S.; Kretz, P.L.; Hamner, R.T.; et al. Transgenic systems for in vitro mutation analysis. Mutat. Res. 288:133-149, 1993. 33. Baase, W.A.; Eriksson, A.E.; Zhang, X.J.; et al. Dissection of protein structure and folding by directed mutage nesis. Faraday Discuss. 93:173-181, 1992. Sharon, J.; Kao, C.Y.; Sompuram, S.R. Oligonucleotidedirected mutagenesis of antibody combining sites. Int. Rev. Immunol. 10:113-127, 1993. 34. Garoff, H. Using recombinant DNA techniques to study protein targeting in the eucaryotic cell. Annu. Rev. Cell Biol. 1:403-445, 1985. Kelly, J.H.; Darlington, G.J. Hybrid genes: molecular ap proaches to tissue-specific gene regulation. Annu. Rev. Genet. 19:273-296,1985.
358
Capitulo 7 : Tecnologia del DNA recombinante
35. Leclerc, D.; Brakier-Gingras, L. Study of the function of Escherichia coli ribosomal RNA through site-directed mutagenesis. Biochem. Cell Biol. 68:169-179,1990. Scherer, S.; Davis, R.W. Replacement of chromosome segments with altered DNA segments constructed in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:4951-4955,1979. Struhl, K. The new yeast genetics. Nature 305:391-397, 1983. 36. Herskowitz, I. Functional inactivation of genes by domi nant negative mutations. Nature 329:219-222,1987. Weintraub, H.; Izant, J.G.; Harland, R.M. Anti-sense RNA as a molecular tool for genetic analysis. Trends Genet. 1:22-25, 1985. 37. Boyd, A.L.; Samid, D. Review: molecular biology of transgenic animals. J. Anim. Sci. 71 (S3): 1-9, 1993. Palmiter, R.D.; Brinster, R.L. Germ line transformation of mice. Annu. Rev. Genet. 20:465-499,1986. Rubin, G.M.; Sprading A.C. Genetic transformation of Drosophila with transposable element vectors. Sci ence 218:348-353, 1982. Smith, P.A.; Corces, V.G. Drosophila transposable ele ments: mecanisms of mutagenesis and interactions with the host genome. Adv. Genet. 29:229-300,1991. 38. Babinet, C.; Morello, D.; Renard, J.P. Transgenic mice. Genome 31:938-949,1989. Gossen, J.; Vijg, Transgenic mice as model systems for studying gene mutations in vivo. Trends Genet. 9:2731,1993. Gridley, T. Insertional versus targeted mutagenesis in mice. New Biol. 3:1025-1034,1991. 39. Davey, M.R.; Rech, E.L.; Mulligan, B.J. Direct DNA trans fer to plant cells. Plant Mol. Biol. 133:273-285, 1989. Walden, R.; Schell, J. Technique in plant molecular biology-progress and problems. Ear. J. Biochem. 192:563-576, 1990.
El núcleo celular
T
— n
.
ii
m■,
„
t-'t
* ~
El DNA cromosómico y su empaquetamiento La estructura global de los cromosomas Replicación del cromosoma Síntesis v procesamiento del RNA Organización y evolución del genoma nuclear
El DNA de una célula eucariota se halla confinado en el núcleo, que ocupa alre dedor del 10% del volumen celular. El núcleo está delimitado por una envoltura nuclear formada por dos membranas concéntricas. Estas membranas están per foradas a intervalos por poros nucleares, a través de los cuales se produce el transporte activo de determinadas moléculas entre el núcleo y el citoplasma. La envoltura nuclear está conectada directamente con la membrana del retículo endoplásmico y se mantiene por dos redes de filamentos intermedios: una de nominada lámina nuclear, formada por una fina lámina que recubre la m em brana nuclear interna, mientras que la otra, organizada de forma m enos regular, rodea la mem brana nuclear externa (Figura 8-1) Como ocurre con los procariotas actuales, muy probablemente los ances tros de las células eucariotas carecían de núcleo; sólo podemos especular por qué apareció durante la evolución un compartimiento nuclear separado, que aísla al DNA de la actividad del citoplasma. Dos características especiales de las células eucariotas nos sugieren posibles explicaciones. Una de ellas es la existen cia del citoesqueleto, compuesto principalmente por microtúbulos y filamentos de actina, responsable del movimiento de la célula. Las bacterias, cuyo DNA se encuentra en contacto directo con el citoplasma, carecen de dichos filamentos y
DNA y proteínas asociadas (crom atina) retículo endoplasm ático
nucléolo
centrosom a filam entos interm edios
poro nuclear
m icrotúbulos
lám ina nuclear m em brana nuclear externa envoltura nuclear mem brana nuclear interna
18-1 Sección transversal de un a celular típico. La envoltura ir está formada por dos »ranas de las cuales la exterior es iua con la membrana del retículo »lasmático (véase también Figura Las bicapas lipídicas de las »ranas nucleares interna y ia están asociadas en los poros ires. Dos redes de filamentos íedios [verde) proporcionan te mecánico a la envoltura ir; los filamentos del interior del ) forman una fina lámina ir. El espacio interior del retículo ilasmático (lumen del ER) se ha ado en amarillo.
359
se desplazan m ediante estructuras externas como los flagelos. Por ello, una de las funciones de la envoltura nuclear de los eucariotas podría ser la de proteger las largas y frágiles moléculas de DNA de las fuerzas mecánicas generadas por los filamentos citoplasmáticos. U na segunda característica diferencial de las células eucariotas es la existen cia de un procesamiento del RNA previo a su traducción a proteína. En las célu las procariotas la síntesis del RNA (transcripción) y la síntesis de proteínas (tra ducción ) tienen lugar simultáneamente: los ribosomas traducen el extremo 5’ de la molécula de RNA mientras todavía se está transcribiendo su extremo 3 ’. Por ello existen pocas oportunidades de modificar el RNA antes de ser traducido a proteína. En eucariotas, por el contrario, la transcripción (nuclear) está separada tanto temporal com o espacialmente de la traducción (citoplasmática). Los transcritos de RNA en el núcleo se empaquetan inmediatamente en complejos ribonucleoproteicos y son sometidos al proceso de maduración (“splicing”) del RNA, en el cual se eliminan algunas zonas de la secuencia de nucleótidos. Las proteínas de em paquetamiento se desprenden cuando ha finalizado la madura ción del RNA, y éste es transportado desde el núcleo al citosol, donde los riboso mas empiezan a traducir el RNA a proteína (véase Figura 8-2). Tal como se verá más adelante, el proceso de maduración del RNA es una etapa intermedia im portante en la transmisión de información genética en eucariotas. Para la célula supone un cierto número de ventajas, incluyendo la capacidad de permitir que un mismo gen codifique más de una proteína. Todo ello podría ayudar a explicar por qué las células eucariotas tienen un núcleo en el que se puede desarrollar la maduración del RNA en ausencia de interferencias por parte de los ribosomas (Figura 8-3). En este capítulo se describirá cómo las proteínas empaquetan el DNA en cromosomas, cóm o éstos se pliegan y se organizan en el núcleo, y cómo se repli can durante cada ciclo de división celular. Posteriormente se discutirá la síntesis y el procesam iento de RNA, y finalmente se describirá cómo se organiza la infor m ación en el genoma eucariota, y cóm o se ha alcanzado dicha organización du rante la evolución. La envoltura nuclear se analiza en detalle en el Capítulo 12 en relación con el transporte selectivo de macromoléculas desde y hacia el núcleo. Allí tam bién se presenta un esquema hipotético de cómo podría haber evolucio nado el compartimiento nuclear (véase Figura 12-5).
m em brana plasmática
NÚCLEO
V r\ M a
TRANSCRIP CIÓN DEL DNA RNA
,1
MADURACIÓN POR CORTE Y EMPALME DEL,
TRANSPORTE DELRNA TRADUCCIÓN DEL RNA MENSAJERO
Figura 8-2 Síntesis de proteínas (DNA —»RNA —>proteína) en eucariotas. Las
células eucariotas han desarrollado numerosos compartimientos rodeados de membrana que separan los diferentes grupos de reacciones enzimáticas, lo que las hace más eficientes. El núcleo es uno de estos compartimientos. La envoltura nuclear mantiene a los ribosomas funcionales fuera del núcleo, evitando que los transcritos de RNA sean traducidos a proteínas, hasta que hayan sido procesados extensamente y transportados al exterior del núcleo, al citosol. Así pues, las etapas de maduración y de transporte del RNA se interponen entre la transcripción del DNA y la traducción del RNA.
Figura 8-3 La envoltura nuclear m antiene el com partim iento nuclear libre de orgánulos citoplasmáticos.
2 |im 360
Capítulo 8 : El núcleo celular
Esta imagen obtenida con el microscopio electrónico muestra una sección ultrafina de un huevo de erizo de mar, con un núcleo contrastado de una forma extraordinariamente uniforme y un citoplasma densamente lleno de orgánulos. (Por cortesía de David Begg y Tim Hunt.)
El DNA cromosómico y su empaquetamiento1 Durante los primeros 40 años de este siglo los biólogos descartaban la posibili dad de que el DNA de los cromosomas eucariotas contuviera la información ge nética, debido fundamentalmente a que creían que los ácidos nucleicos estaban formados únicamente por una secuencia repetida de cuatro nucleótidos (tal como AGCTAGCTAGCT...). Sin embargo, actualmente sabemos que una m olé cula de DNA es un polímero lineal extraordinariamente largo y no ramificado, que contiene muchos millones de nucleótidos organizados siguiendo una se cuencia regular pero no al azar, y que la información genética de una célula está contenida en el orden lineal de los nucleótidos de su DNA. El código genético está escrito con “palabras” de tres nucleótidos (codones, cada uno de los cuales especifica un aminoácido, como se describe en Capítulo 6) que solventan el pro blema de acumular una gran cantidad de información genética en un reducido espacio: cada millón de “letras” (nucleótidos) ocupa una distancia lineal de sólo 3.4 x 105 nm (0,034 cm) y un volumen de alrededor de 106 nm3 (10~15 cm 3). Cada molécula de DNA se empaqueta en un c ro m o s o m a ; el total de infor mación genética contenida en los cromosomas de un organismo constituye su g e n o m a . El genoma de la bacteria E. coli está formado por 4,7 x 106 parejas de nucleótidos de DNA, en una única molécula de DNA de doble hélice (un crom o soma). Por el contrario, el genoma humano está formado por 3 x 109 parejas de nucleótidos, en 24 cromosomas (22 autosomas diferentes y 2 cromosomas se xuales diferentes), es decir está formado por 24 moléculas de DNA distintas -cad a una de las cuales contiene entre 50 x 106 y 250 x 106 pares de bases de DNA. Las moléculas de DNA de ese tamaño tienen una longitud de entre 1,7 y 8.5 cm cuando están desenrolladas, y una vez se han eliminado las proteínas crom osóm icas pueden romperse debido al menor efecto mecánico. En los organismos diploides, como nosotros mismos, existen dos copias de cada tipo de cromosoma, uno heredado de la madre y el otro procedente del pa dre (con la excepción de los cromosomas sexuales en los machos, en los que el crom osom a Y procede del padre y el X de la madre). Así, una célula humana típi ca contiene 46 cromosomas y 6 x 109 parejas de nucleótidos de DNA. Otros ma míferos presentan genomas de un tamaño similar a éste. Teóricamente, esta cantidad de DNA se podría empaquetar en un cubo de 1,9 |¿m de lado. A efectos comparativos, 6 x 109 letras en este libro podrían ocupar más de un millón de páginas, y sería necesario un espacio unas 1017veces mayor. En esta sección se considerarán las relaciones que existen entre las m olécu las de DNA, los genes y los cromosomas, analizando cómo se pliega el DNA for mando una estructura com pacta y ordenada -e l crom osom a- que aún así per mite el acceso a su información genética. Es importante recordar que los cromosomas de una célula cambian su estructura y actividad en función de la fase del ciclo celular: en mitosis, o fase M, se encuentran muy condensados y son transcripcionalmente inactivos; en la otra fase, mucho más larga, del ciclo celu lar, denominada interfase, están mucho menos condensados y son activos diri giendo continuam ente la síntesis de RNA.
Cada molécula de DNA que form a un cromosom a ha de contener un centròmero, dos telómeros y varios orígenes de replicación2 Para que una molécula de DNA forme un cromosoma funcional debe ser capaz de algo más que de dirigir la síntesis de RNA: ha de ser capaz de propagarse, transmitiéndose eficazmente de una generación a la siguiente. Ello requiere tres tipos de secuencias especializadas en el DNA, cada una de las cuales sirve para unir las proteínas que guían los mecanismos de replicación y la segregación de los cromosomas. Estudiando levaduras, cuyos cromosomas de pequeño tamaño son sencillos de manipular con los métodos del DNA recombinante, se han po dido identificar las secuencias de DNA mínimas necesarias para estas funciones. Se han identificado dos de los tres elementos anteriores estudiando pequeñas
El DNA cromosómico y su empaquetamiento
361
moléculas de DNA circular que se pueden replicar como plásmidos en células de la levadura Saccharomyces cereuisiae. Para poderse replicar, estas moléculas necesitan una secuencia de nucleótidos específica que actúa como o rig e n de re p lic a c ió n d el DNA; como se verá más adelante, es posible identificar los nu merosos orígenes de replicación presentes en cada cromosoma de levadura por la capacidad que confieren a una molécula de DNA que contenga uno de ellos, de replicarse independientemente del crom osoma huésped. Un segundo ele mento de secuencia denominado c e n tr ò m e r o es el responsable de unir la m olé cula de DNA que lo contiene al huso mitótico durante la división celular. Cada uno de los cromosomas de levadura contiene un solo centròmero. Cuando esta secuencia se inserta en un plásmido, asegura que cuando la célula se divida, cada una de las células hijas recibirá una de las dos réplicas de la molécula de DNA del plásmido recién duplicado. El tercer elem ento imprescindible es el te ló m e ro ; es necesario que exista uno de ellos en cada extremo del cromosoma lineal. Si un cromosoma circular que contenga un centròm ero y un origen de replicación se rompe en un punto, de forma que aparecen dos extremos de DNA libres, continúa teniendo la capa cidad de duplicarse y de unirse al huso mitótico, pero puede llegar a perderse en las células de la progenie. Ello es debido a que la replicación de ambas cadenas en la horquilla de replicación requiere la presencia de una secuencia adyacente a la secuencia a replicar que actúe de molde para un cebador de RNA (véase Fi gura 6-44). Dado que nunca podrá haber un patrón de este tipo para los últimos nucleótidos de una molécula de DNA lineal, serán necesarios mecanismos espe ciales para impedir que en cada ciclo celular estas hebras de DNA se vayan acor tando. Este problema de la “replicación del extrem o”, lo han resuelto las bacte rias y muchos virus teniendo como cromosoma una molécula circular de DNA. Las células eucariotas han desarrollado una secuencia telomérica especial situa da en los extremos de cada cromosoma. Esta secuencia repetida sencilla es am plificada periódicamente por una enzima especial, denominada telomerasa, lo cual com pensa la pérdida de algunos nucleótidos del DNA telomérico que se produce en cada ciclo celular y permite que el cromosoma lineal se replique completamente. En la Figura 8-4 se resumen las funciones de los tres elementos de secuencia del DNA que son necesarios para que un cromosoma lineal de levadura se trans mita íntegro de generación en generación. Estos elementos de secuencia son re lativamente cortos (típicamente menos de 1000 pares de bases cada uno) y por ello solamente utilizan una pequeña fracción de la capacidad de almacenar in formación del cromosoma. Son los tres mismos tipos de elementos que al pare cer son necesarios para mantener un crom osoma en las células humanas, a pe-
secuencia^ telom érica
Gi
RI
91
Gì II
secuencia — del origen de replicación
secuencia _ centrom érica
li
11
burbuja de replicación 362
Capítulo 8 : El núcleo celular
li
II
cinetocoro
II
crom osom as hijos en células separadas
Figura 8-4 Funciones de las tres secuencias de DNA necesarias para producir un crom osom a eucariota lineal estable. Cada crom osom a tiene muchos orígenes de replicación, un centròmero y dos telómeros. El centròmero mantiene unidas las dos copias del cromosom a y las une -a través de un com plejo de proteínas denominado cinetocoro- al huso mitótico, de forma que durante la mitosis se distribuye una copia a cada célula hija. En la parte superior de los diagramas se indican las fases del ciclo celular correspondientes a las diferentes fases de replicación y segregación del cromosoma.
VECTOR CROMOSOMICO ARTIFICIAL DE LEVADURA A
ORI CEN t *
DNA HUMANO
Sü, EcoR1
BamH1 BamH1 DIGESTION CON Bam HI Y EcoR1
brazo izquierdo
brazo derecho
fragm entos crom osóm icos grandes
Figura 8-5 Construcción de un crom osom a artificial de levadura (YAC, de “yeast artificial chrom osom e”). Un vector YAC permite el clonaje de moléculas de DNA de gran tamaño. TEL, CEN y ORI son respectivamente las secuencias del telómero, centróm ero y del origen de replicación de DNA de la levadura Saccharom yces cerevisiae. Bam HI y EcoRl son las nucleasas de restricción que cortan la doble hélice de DNA. Las secuencias denominadas A y B codifican enzimas que se utilizan como marcadores que se pueden seleccionar para permitir el aislamiento rápido de las células de levadura transformadas portadoras de un crom osom a artificial. (Adaptado de D.T. Burke, G.F. Carie y M.V. Olson. Science 2 3 6 : 806-812, 1987. © 1987 AAAS.)
Jl________ :_________________ II_________________ I
5,6 x 103 pares de nucleótidos
hasta 106 pares de nucleótidos 3,9 x 103 pares de nucleótidos
CROMOSOMA ARTIFICIAL DE LEVADURA CON DNA HUMANO INSERTADO
sar de que hasta el momento en el hombre sólo se han caracterizado bien las se cuencias teloméricas. Aunque la versión de levadura de dichas secuencias no es funcional en células de eucariotas superiores, los métodos de DNA recombinante han permitido unir los elementos de secuencia de levadura a moléculas de DNA humano, que entonces pueden replicarse en células de levadura como cro m osom as artificiales. De esta forma se pueden utilizar células de levadura para preparar librerías de DNA genómico humano (véase pág. 339) en las que cada clon DNA (propagado como un cromosoma artificial) puede contener alrededor de 1 millón de pares de bases de secuencia de DNA humano (Figura 8-5).
La mayor parte del DNA cromosóm ico no codifica proteínas esenciales ni RNA3 Parece que en los genomas de los organismos superiores existe un gran exceso de DNA. Desde mucho tiempo antes de que fuera posible examinar directamen te la secuencias de nucleótidos del DNA fue evidente que las cantidades relativas de DNA del genoma haploide de diferentes organismos no estaban sistem ática mente relacionadas con la complejidad del organismo. Las células humanas, por ejemplo, contienen alrededor de 700 veces más DNA que la bacteria E. coli mientras que algunos anfibios y células de plantas contienen 30 veces más DNA que las células humanas (véase Figura 8-6). Además el contenido de DNA de los genomas de diferentes especies de anfibios puede variar hasta 100 veces. Los genetistas de poblaciones intentaron estimar qué cantidad del DNA de los organismos superiores codifica proteínas esenciales o moléculas de RNA, b a sándose en la siguiente aproximación indirecta. Cualquier gen está, inevitable mente, sometido a un riesgo de mutación -u n fenómeno accidental que altera, al azar, determinados nucleótidos. Mientras mayor sea el número de genes de un organismo tanto mayor será la probabilidad de que se produzca una muta ción en al m enos uno de ellos. Debido a que muchas mutaciones destruyen la función del gen en el que se producen, la tasa de mutación fija un límite del nú mero de genes esenciales de los que cualquier organismo puede depender para
El DNA cromosómico y su empaquetamiento
363
m icoplasm a BACTERIAS 1—
E. co li levadura h o n g o s km m m m m PLANTAS in s e c t o s
guisante azucena I I
D rosophila
MOLUSCOS
tiburón PECES CARTILAGINOSOS f l l f i i f i í
t e le ó s t e o s m m m m im m m m rana
tritón
a n f ib io s
REPTILES ^ ¡ § PÁJAROS
hum ano MAMÍFEROS Él
105
I
I I ! I I I!
106
I
I I I ! I ¡I
107
I
I
I NI !
108
I
I
Mi l !
109
I
I I f i I íl
núm ero de pares de nucleótidos por genom a haploide
1010
i"" i I ' I ! II
1011
su supervivencia: si son demasiados, el desastre es casi seguro, como sería el caso de una com pleja máquina que dependiera de muchos componentes que pueden fallar. Con este argumento y con la velocidad de mutación observada se concluye que sólo un pequeño porcentaje del genoma de los mamíferos está im plicado en la regulación o codificación de proteínas esenciales. Posteriormente veremos que esta conclusión está apoyada por otras evidencias. La consecuencia más importante de la argumentación anterior es que, aun que el genoma de mamífero contiene en principio una cantidad de DNA sufi ciente para codificar alrededor de 3 millones de proteínas de tamaño medio (3 x 109 nucleótidos), la fidelidad limitada con la que se mantienen las secuencias de DNA implica que ningún mamífero (ni cualquier otro organismo) puede estar formado por más de unas 60 000 proteínas esenciales. Así pues, desde el punto de vista genético, los humanos no pueden ser más de 10 veces más complejos que la mosca del vinagre Drosophila, de la que se ha estimado que tiene unos 5000 genes esenciales. Cualquiera que sea la misión del DNA no esencial que se halla presente en los crom osom as de los organismos superiores (se discutirá más adelante), los datos que se muestran en la Figura 8-6 dejan claro que, para una célula, el pre sentar una gran cantidad de DNA extra no representa ninguna limitación impor tante. Más aún, frecuentem ente las regiones codificantes esenciales están inte rrumpidas por largas secuencias de DNA no codificante.
Cada gen produce una molécula de RNA4 La función primaria del genoma es codificar moléculas de RNA. Regiones selec cionadas de la secuencia de nucleótidos de DNA son copiadas en forma de se cuencias complementarias de RNA, el cual o bien codifica una proteína (si es mRNA), o forma un RNA "estructural”, como las moléculas de RNA de transpor te (tRNA) o de RNA ribosomal (rRNA). Cada región de la hélice de DNA que pro duce una molécula de RNA funcional constituye un gen. En los eucariotas superiores son habituales los genes de más de 100 000 pa res de nucleótidos, y algunos contienen más de 2 millones de pares de nucleóti dos (Tabla 8-1); sin embargo, para codificar una proteína de tamaño medio (for mada por 300 o 400 aminoácidos) solamente son necesarios 1000 pares de bases. La mayor parte del DNA extra está formado por largas secuencias de DNA no codificante interrumpidas por fragmentos relativamente cortos de DNA codi-
364
Capítulo 8 : El núcleo celular
Figura 8 -6 No existe relación entre la cantidad de DNA y la complejidad del organismo. La cantidad de DNA del genoma haploide varía en un rango de 100 000 veces desde el procariota de menor tamaño -e l m icoplasm a- a las células más voluminosas de algunas plantas y anfibios. Es de destacar que el tamaño del genoma humano (3 x 109 pares de nucleótidos) es mucho menor que el de muchos organismos que parecen ser más sencillos.
Tabla 8-1 Tamaño de algunos genes humanos en miles de nucleótidos
P-globina Insulina Proteina quinasa C Albúmina Catalasa Receptor LDL Factor VIII Tiroglobulina Distrofina*
Tamaño del gen
Tamaño del mRNA
Número de intrones
1,5 1,7 11 25 34 45 186 300 más de 2000
0,6 0,4 1,4 2,1 1,6 5,5 9 8,7 17
2 2 7 14 12 17 25 36 más de 50
* Una forma anómala de este gen causa la distrofia muscular de Duchenne. El tamaño del gen especificado corresponde tanto a la región que se transcribe como a las re giones de DNA reguladoras próximas (compilado de datos suministrados por Victor McKusick).
ficante. Las secuencias codificantes se denominan exones y las secuencias inter medias (no codificantes) se denominan intrones. Durante el proceso de conver sión de las moléculas de RNA (transcritas desde un gen y por ello denominadas transcritos primarios de RNA), a moléculas de mRNA, se eliminan las secuencias intrónicas (véase Figura 8-2); este proceso se denomina maduración del RNA (“RNA splicing”), que se discutirá más adelante. Los grandes genes están formados por una larga secuencia de exones e in trones alternos; la mayor parte del gen está formado por secuencias intrónicas. Además, cada gen contiene secuencias reguladoras que son responsables de ase gurar que el gen se transcribe en el momento y en el tipo celular adecuado. En el Capítulo 9 se discutirá el funcionamiento de dichas secuencias reguladoras. Mu chas secuencias reguladoras se encuentran localizadas por delante (“upstream”, en dirección 5 ’) del lugar donde se inicia la transcripción del RNA, pero también se pueden localizar por debajo, (“downstream”, en dirección 3 ’) del lugar donde finaliza la transcripción del RNA, o incluso en los intrones y exones. En la Figura 8-7 se ilustra esquem áticam ente un cromosoma típico de vertebrados, y se deta lla la organización de uno de sus muchos genes.
crom osom a de 1,5 x 108 pares de nucleótidos; contiene aproxim adam ente 3000 genes JL 1 ■
0,5% del cromosoma; contiene 15 genes 1 H 1 ■
J
II
■
I
1 1
1 1 1 I I I
1
L_ " “ '1
un gen de 105 pares de nucleótidos
l
1
1 1
JL I l . 1 II
1 ..... 1
1 1
1 1
1 1
exon TRANSCRIPCIÓN DEL DNA
región de DNA reguladora
1
| ■ \
1
I
transcrito prim ario de RNA
t
1
MADURACIÓN DEL RNA mRNA
El DNA cromosómico y su empaquetamiento
f
secuencia intrónica secuencia exónica
Figura 8-7 Organización de los genes en un crom osom a típico de vertebrado. Unas proteínas que se unen a las regiones reguladoras del DNA condicionan que un determinado gen se transcriba o no; aunque en el esquema se han representado las secuencias reguladoras en dirección 5 ’ del gen, también pueden localizarse en el interior de los intrones, en los exones o en la región situada en dirección 3 ’ del gen. Las secuencias de los intrones son eliminadas del transcrito primario de RNA que codifica una proteína, produciéndose una molécula de RNA m ensajero (mRNA). Los valores que se indican en la figura acerca del número de genes por cromosom a son una estima mínima.
365
La com paración entre secuencias de DNA de organismos relacionados perm ite diferenciar entre regiones de DNA de secuencia conservada y no conservada5 Las m ejoras técnicas en la determinación de la secuencia de nucleótidos de lar gas cadenas de DNA permiten esperar que en un plazo no muy largo se podrá disponer de la secuencia completa de los 3 x 109 nucleótidos del genoma huma no. Como el 90% de esta secuencia no es importante puede ser crucial disponer de algún medio para identificar la pequeña proporción de secuencia que sí lo es. Una aproximación al problema se basa en la observación de que las secuencias importantes han sido conservadas durante la evolución, mientras que las no im portantes son libres de mutar al azar. La estrategia, entonces, sería comparar las secuencias humanas con aquellas regiones homologas de genomas relaciona dos, como por ejemplo el de ratón. Se cree que los seres humanos y los ratones divergieron a partir de un ancestro común hace alrededor de 80 x 106 años, tiem po suficiente para que se hayan producido por mutaciones aleatorias el cambio de aproximadamente dos de cada tres nucleótidos. De este modo las únicas re giones que se habrían mantenido similares en ambos organismos (regiones con servadas) serían aquellas en las que una mutación produciría la pérdida de una función importante, haciendo que los animales que la portaran estuvieran en desventaja y fueran eliminados de la población por selección natural. Así pues, en general, las regiones no conservadas representan DNA no codificante -tanto entre genes com o entre secuencias intrónicas- cuya secuencia no es crítica para ninguna función, mientras que las regiones conservadas representan exones funcionalmente importantes y regiones reguladoras. El estudio comparativo de las secuencias de DNA revela los resultados de un largo experimento natural, y permite detectar las regiones de mayor interés de los genomas. Los resultados obtenidos apoyan la conclusión de que solamente el 10% de las secuencias del genoma de vertebrados son vitales para el organismo.
Las histonas son las principales proteínas estructurales en los crom osom as eucariotas6 Si un crom osom a estuviera formado únicamente por DNA extendido, sería difí cil de imaginar cómo se podría replicar o segregar entre células hijas sin ser da ñado severamente. De hecho, el DNA de todos los cromosomas se encuentra empaquetado en una estructura muy com pacta con la ayuda de proteínas espe cializadas. Tradicionalmente las proteínas de los eucariotas que se unen al DNA se clásifican en dos grupos: las histonas y las proteínas cromosómicas no-histonas. El com plejo formado por el DNA crom osóm ico y las dos clases de proteínas se denomina crom atina. Las histonas están presentes en grandes cantidades (al rededor de 60 millones de moléculas de cada tipo por célula, en comparación con las aproximadamente 10 000 moléculas por célula de cada una de las proteí na de unión al DNA) de forma que en la cromatina la masa total de histonas es aproximadamente igual a la de DNA. Las histonas son proteínas relativamente pequeñas, con una proporción muy elevada de aminoácidos cargados positivamente (lisina y arginina). La car ga positiva ayuda a las histonas a unirse firmemente al DNA, el cual está muy cargado negativamente, independientemente de su secuencia de nucleótidos. Es probable que las histonas no se disocien casi nunca del DNA; parece que deben influir sobre cualquier reacción que se produzca en los cromosomas. Los cinco tipos de histonas de las células eucariotas se clasifican en dos gru pos principales -la s histonas nucleosómicas y las histonas Hl. Las histonas nucleosómicas son pequeñas proteínas (102-135 aminoácidos) responsables del plegado del DNA en los nucleosomas, como se discute más adelante. Estas cua tro histonas se denominan H2A, H2B, H3 y H4. H3 y H4 se cuentan entre las proteínas más conservadas de las conocidas (Figura 8-8). Este grado de conser vación sugiere que en la función de estas histonas participan casi todos sus ami-
366
Capítulo 8 : El núcleo celular
1S G R G K
extrem o am ino
T *"
a c e t i!
K T*~ aceti! G L G K
a c e t iI
G G A K T *~
a c e t iI
R H R K V G G R
SG
L
D N I Q q
r
T RAL R R IA p K
L , Y E E T R GVL K
ETY T
VA
RIv N
n W YAL KTVT AMu iK R Q f
Gy l t r g
G G 102
e x t r e m o c a r b o x ilo
Figura 8-8 Secuencia de aminoácidos de la histona H4. Los aminoácidos se han designado por sus abreviaciones de una sola letra, y los que están cargados positivamente se han señalado en color. Como ocurre con las otras tres histonas nucleosómicas, en la célula se modifica de forma reversible una “cola” del extremo amino terminal mediante la acetilación de determinadas Usinas, lo que elimina la carga positiva de la lisina. Se muestra la secuencia del gen de vaca, aunque en el guisante la secuencia es la misma excepto por una valina que está sustituida por una isoleucina y una lisina por una arginina.
noácidos, de modo que cualquier cambio en cualquier posición resulta deleté reo para la célula. Esta suposición se ha podido verificar en levaduras, en las que es posible mutar in vitro una histona dada e introducirla en el genoma de la le vadura en lugar del gen normal. Como se predijo, se observó que la mayor parte de las mutaciones eran letales; algunas que no lo eran producían cambios en el patrón normal de expresión génica (discutido en el Capítulo 9). Las histonas H1 son mayores (formadas por unos 220 aminoácidos) y han sido menos conserva das evolutivamente que las histonas nucleosómicas.
La asociación de las histonas con el DNA conduce a la form ación de los nucleosomas, las partículas unitarias de la crom atina7 Si se desenrollara la doble hélice de DNA de cada uno de los cromosomas huma nos, la cadena resultante podría rodear el núcleo de la célula miles de veces. Las histonas cumplen un papel primordial en el empaquetamiento de forma orde nada de esta enorm em ente larga molécula de DNA en el interior de un núcleo de tan sólo unos cuantos micrómetros de diámetro. Su papel en el empaqueta miento del DNA es importante por una segunda razón. Como se ha podido ver, no todo el DNA del crom osom a está empaquetado de la misma forma; parece que la manera en la que se encuentra empaquetada una determinada región del genoma en la cromatina de un determinado tipo celular influye en la actividad de los genes que contiene. Nuestra comprensión de la estructura de la cromatina recibió un fuerte im pulso con la descripción de la unidad fundamental de empaquetamiento, cono cida por nucleosoma, que confiere a ésta el aspecto de una “cadena de cuentas” cuando se observa al microscopio electrónico después de tratamientos que des hacen los empaquetamientos de orden superior (Figura 8-9). La larga “cadena” de DNA puede romperse en “cuentas” de nucleosoma por digestión mediante enzimas que degradan el DNA, como por ejemplo con la enzima bacteriana nucleasa m icrococal (las enzimas que degradan tanto el DNA como el RNA se de nominan nucleasas, las enzimas que solamente degradan el DNA se denominan desoxirribonucleasas, o DNasas). Una digestión corta con nucleasa micrococal sólo degrada el DNA existente entre los nucleosomas. El resto se encuentra pro tegido de la digestión y permanece como fragmentos de DNA de doble cadena de unos 146 pares de nucleótidos de longitud, unidos a un complejo específico de 8 histonas nucleosómicas (el octámero de histonas). Los nucleosomas obteni dos por este método se han conseguido cristalizar y analizar mediante difrac ción de rayos X. Cada partícula tiene una forma de disco, con un diámetro de al rededor de 11 nm y contiene dos copias de cada una de las 4 histonas nucleosómicas, H2A, H2B, H3 y H4. Este octám ero de histonas forma un núcleo proteico alrededor del cual la hélice de DNA de doble cadena da dos vueltas (véa se Figura 8-10).
50 mn El DNA cromosómico y su empaquetamiento
Figura 8-9 Nucleosomas observados al m icroscopio electrónico. Estas electronmicrograffas muestran fibras de cromatina, antes y después de ser expuestas a tratamientos que descomprimen o “descondensan” la estructura nativa, produciendo la forma de “cadena de cuentas”. La estructura nativa conocida com o fibra de 30 nm (se discute más adelante) se muestra en (A). La forma descondensada de “cadena de cuentas” de la crom atina se muestra en (B), a los mismos aumentos. En la Figura 8-30 se presentan dibujos esquemáticos de las relaciones existentes entre estas dos formas de la cromatina. Estas electronmicrograffas fueron tomadas por medio de modificaciones del procedimiento explicado en la Figura 8-45. (A, por cortesía de Barbara Hamlako; B, por cortesía de Victoria Foe.)
367
(B)
DNA espaciador
form a en "cadena de cuentas" de la crom atina
historias de centro del nucleosoma
LA NUCLEASA DIGIERE EL DNA ESPACIADOR
unidad repetida de 200 pares de nucleótidos cuenta nucleosóm ica liberada
ti
núcleo histónico octam érico *
DISOCIACIÓN
i H2A
JL
T
11 nm 1
DISOCIACION A ELEVADA CONCENTRACIÓN DE SAL
^3
DNA dúplex de 146 pares de bases
\
r
H2B
H3
H4
En la crom atina no digerida, el DNA se extiende como una doble hélice con tinua entre los nucleosomas. Cada nucleosoma está separado del siguiente por una región de DNA espaciador, de longitud variable entre 0 y 80 pares de nucleó tidos. Los nucleosomas se repiten a intervalos de 200 pares de nucleótidos (véa se Figura 8-10). Así pues, un gen eucariota de 10 000 nucleótidos de longitud po dría estar asociado a 50 nucleosomas, y cada célula humana, con 6 x 109 pares de bases, puede contener unos 3 x 107 nucleosomas.
La posición de los nucleosom as en el DNA viene determinada por la tendencia del DNA a form ar bucles estrechos y por la presencia de otras proteínas de unión al DNA8 Experimentos in vitro con cromatina aislada sugieren que en condiciones fisio lógicas los octám eros de histonas generalmente permanecen fijos en una posi ción determinada del DNA, puesto que su intensa unión al DNA evita su desliza miento a uno y otro lado a lo largo de la hélice del DNA. Existen dos factores principales que determinan la posición de los nucleosomas sobre el DNA. Uno es la dificultad de doblar la doble hélice en dos vueltas cerradas alrededor del octámero de histonas, un proceso que requiere una compresión importante del surco estrecho de la hélice. Dado que las secuencias ricas en A-T en el surco estrecho se comprimen más fácilmente que las ricas en G-C, cada octámero de histona tiende a colocarse por sí mismo en el DNA de forma que incremente al máximo la riqueza en A-T del surco estrecho de la hélice de DNA (Figura 8-11). Así pues, un segmento de DNA que contenga regiones cortas ricas en A-T, sepa radas por vueltas enteras de DNA, será mucho más fácil de doblar alrededor del nucleosom a que una región de DNA que no tenga estas propiedades. Esto pro368
Capítulo 8 : El núcleo celular
F ig u ra8-10 Naturaleza del nucleosoma. En (A) se observan dos orientaciones de la estructura tridimensional del octámero de histonas; el modo en que el DNA se enrolla a su alrededor se representa por un tubo azul (su p erior) y por una serie de líneas paralelas {inferior). Dos dímeros H2A-H2B {azul} flanquean un tetrámeros H3-H4. Así, el octámero de histonas está compuesto por dos de cada una de las histonas H2A, H2B, H3 y H4, con una masa total de 100 000 daltons. (B) El nucleosoma está formado por dos vueltas com pletas de DNA (83 pares de bases por vuelta) alrededor de un núcleo octam érico de histonas, más el DNA separador adyacente. La parte del nucleosoma que hasta ahora hemos denominado “cuenta” nucleosóm ica se libera de la cromatina por digestión del DNA con nucleasa micrococal. En cada “cuenta” de nucleosoma, alrededor de 146 pares de nucleótidos de doble hélice de DNA (alrededor de 1,8 vueltas) permanecen enrollados alrededor de un núcleo octamérico de histonas. (A, cortesía de Evangelos Moudrianakis.)
Figura 8-11 Curvatura del DNA en un nucleosoma. La hélice de DNA da dos vueltas alrededor del octám ero de histonas. Este diagrama está dibujado aproximadamente a escala para ilustrar cóm o se comprime el surco m enor en la parte interior del giro. Debido a ciertas características estructurales de la molécula de DNA, las parejas A-T tienden a acomodarse preferencialmente en el surco menor.
pares AT preferentem ente aquí (surco m enor interno) núcleo de histonas del nucleosom a (octám ero de histonas)
DNA de nuc eosoma
bablem ente explica el caso de localizaciones muy precisas de nucleosomas so bre el DNA, como es el caso de los genes de rRNA 5S, cada uno de los cuales tie ne un único nucleosoma en una posición única. Si se mezcla in vitro el DNA de genes rRNA 5S con una mezcla de las cuatro histonas nucleosómicas puras, se produce la formación de nucleosomas en la misma posición en que se encuen tran in vivo. Sin embargo, parece que para la mayor parte de las secuencias de DNA del cromosoma no existe una localización preferencial de los nucleosomas; el nucleosoma puede ocupar cualquiera de una serie de posiciones posibles en la secuencia de DNA. El segundo factor que influye en el posicionamiento de los nucleosomas es la presencia de otras proteínas unidas íntimamente al DNA que evitan la forma ción de nucleosomas. Por esta razón algunas regiones del DNA carecen de nu cleosomas, incluso en regiones de miles de pares de bases de longitud. Estas re giones pueden detectarse mediante el tratamiento del núcleo celular con cantidades muy pequeñas de una desoxirribonucleasa I (DNasa I), enzima que a estas bajas concentraciones sólo digiere las secuencias de DNA libres de nucleo somas y no los cortos segmentos de DNA espaciador que se hallan entre ellos. Frecuentem ente estos lugares hipersensibles a nucleasas coinciden con las re giones reguladoras de los genes (Figura 8-12). La primera evidencia que apoyó esta hipótesis procedió de experimentos realizados con el virus de simio SV40, cuyo cromosoma, circular, está organizado utilizando las histonas producidas por la célula huésped. En el cromosoma de SV40 se localiza frecuentemente una región de 300 pares de bases libre de nucleosomas situada muy cerca de las se cuencias en las que se inicia la síntesis del DNA y RNA vírico. Aunque en esta re gión se unen varias proteínas de unión a DNA específicas de secuencia, no lo protegen de la degradación por nucleasas como lo hace el nucleosoma, razón por la cual es una zona sensible a DNasa I. Por defecto el DNA en las células eucariotas se encuentra asociado com ple tam ente con nucleosomas, y muchas de las regiones libres de nucleosomas es tán generadas por acción de las proteínas de regulación génica como parte del proceso de activación de la transcripción del DNA (discutida en el Capítulo 9). En aquellos lugares en los que los nucleosomas se sitúan de forma precisa, po dría haber existido una presión selectiva para mantener el DNA espaciador ad yacente libre de nucleosomas, para facilitar su reconocimiento por las proteínas de unión a DNA específicas de secuencia.
Habitualmente los nucleosomas se empaquetan con la histona H 1 formando estructuras regulares de orden superior9 El DNA espaciador que conecta nucleosomas adyacentes puede ser de longitud variada dado que los nucleosomas se posicionan en función de la flexibilidad lo cal de la hélice de DNA y de la distribución de otras proteínas unidas a secuen-
El DNA cromosómico y su empaquetamiento
I______
H1
U
J\
H3 H4 H2AH2B
^
\
H1
103 pares de nucleótidos Figura 8 -1 2 Localización de los sitios hipersensibles a nucleasas de las regiones reguladoras de los genes activos. Los genes mostrados codifican histonas (H l, H2A, H2B, H3 y H4) en D rosophila. Las fle c h a s h orizon tales representan cada uno de los genes en la dirección de la transcripción del DNA, que siempre tiene lugar desde el extremo 5 ’ al extremo 3 ’ del transcrito. Aunque los lugares hipersensibles a la nucleasa {flechas rojas verticales) se suelen presentar en los extremos 5 ’ de un gen, como se ilustra aquí, pueden encontrarse en cualquier otra posición (véase Figura 9-34).
36 9
30 nm
(B) 2
d as específicas del DNA. A pesar de que en la mayor parte del DNA crom osomi co se forman largas cadenas de nucleosomas, en una célula viva es poco proba ble que la cromatina se disponga en la forma de “collar de cuentas”. En lugar de ello, los nucleosomas se empaquetan uno sobre otro adoptando disposiciones regulares en las que el DNA se encuentra incluso más condensado. Así pues, si se observan al m icroscopio electrónico núcleos celulares sometidos a lisis suave, se aprecia cómo la mayor parte de la cromatina se encuentra organizada en fi bras de un diámetro de alrededor de 30 nm, que es considerablemente superior al diámetro de la cromatina en forma de “collar de cuentas”. En la Figura 8-13 se representa uno de los modelos que se han propuesto para explicar de qué forma los nucleosomas están empaquetados en la fibra de cromatina de 30 nm. Tales modelos representan una estructura idealizada, dado que tanto la variación de longitud del DNA espaciador producida por las preferencias de situación de los nucleosomas, como la presencia ocasional de secuencias de DNA libres de nu cleosomas producirán irregularidades en la estructura de la fibra de 30 nm (véa se Figura 8-14). Se cree que las moléculas de histona H l, de las que existen seis subtipos muy relacionados en una célula de mamífero, son responsables del em paqueta miento de los nucleosomas formando la estructura de fibra de 30 nm. En la m o lécula de la histona H l se puede diferenciar una región globular central, muy conservada evolutivamente, unida a los “brazos” amino y carboxilo terminales, menos conservados. Cada molécula de histona H l se une a través de su región globular a un lugar único del nucleosoma, mientras que los brazos entran en contacto con otros lugares de las histonas del núcleo o de los nucleosomas adya centes, permitiendo que se empaqueten de forma repetida regularmente (Figura 8-15).
Resumen Un gen se d efin e com o una secuencia nucleotídica en una m olécula d e DNA q u e a c túa com o u na u nida d fu n cio n a l p ara la producción d e una m olécula d e RNA. Un crom osom a está fo rm a d o p o r una m olécula única d e DNA lineal m uy larga qu e contiene una serie num erosa d e genes. Una m olécula d e DNA crom osóm ico contie n e asim ism o otros tres tipos d e secuencias d e nucleótidos fu n cion alm en te im por tantes: orígenes d e replicación y telóm eros, q u e perm iten la correcta replicación del DNA, y el centròm ero, q u e es necesario p ara u n ir la m olécula d e DNA al huso mitótico, asegurando su segregación precisa en las células hijas. E l genom a haploide hum ano contiene 3 x 109 p ares d e nucleótidos, distribuidos en 2 2 autosom as y 2
Figura 8-13 La ñbra de crom atina de 3 0 nm . Modelo propuesto para explicar cómo la forma de “cadena de cuentas” de la cromatina se empaqueta en la fibra de 30 nm, observada en microscopia electrónica (véase Figura 8-9A) en (A) vista superior, y en (B) vista lateral. Este tipo de empaquetamiento sólo requiere una molécula de histona H l por nucleosoma (no mostrado en la figura). Aunque se conoce la posición en que se une la histona H l al nucleosoma (véase Figura 8-15), se desconoce su posición en esta fibra. (Véase tam bién Figura 8-14.)
Figura 8 -14 Regiones libres de nucleosomas en la fibra de 30 nm. Sección esquemática de la cromatina mostrando la interrupción de su estructura regular por regiones cortas en las que el DNA cromosóm ico es extraordinariamente sensible a la digestión por DNasa I. En cada uno de esos sitios hipersensibles a nucleasas, parece que un nucleosom a ha sido desplazado del DNA por una o más proteínas de unión a DNA específicas de secuencia. En el Capítulo 9 se discute de qué forma son capaces estas proteínas de unirse fuertemente al DNA.
proteínas de unión a DNA específicas
370
Capítulo 8 : El núcleo celular
crom osom as sexuales. Se cree qu e sólo una p equ eñ a parte d e este DNA codifica p ro teínas. En células eucariotas el DNA se en cu en tra unido a una m asa igual d e histonas, fo rm a n d o una unida d repetitiva d e partículas d e DNA y proteína denom inadas nucleosom as. El nucleosom a está form ad o p o r un núcleo octam érico d e proteínas his tonas a lrededo r d el cual el DNA da dos vueltas. La fa cilid a d con la q u e u n segm ento d e DNA p u ed e doblarse suficientem ente p ara envolver el núcleo d e histonas d ep en d e d e su secuencia nucleotídica. A unque hay excepciones, los nucleosom as se suelen em paquetar jun tos, con la ayuda d e m oléculas d e la histona H l, adoptando dispo siciones regulares qu e fo rm a n una fib ra d e 3 0 nm
La estructura global de los cromosomas Habiendo descrito el DNA y las proteínas a partir de las que se organiza el cro mosoma, a continuación abordaremos la organización del cromosoma en una escala mayor. Si un cromosoma humano se estirara de forma que llegara a pre sentar en toda su longitud la estructura de fibra de 30 nm, alcanzaría aproxima damente 0,1 cm de longitud, y podría rodear el núcleo celular más de 100 veces. Es evidente que debe existir un nivel de com pactación superior. El DNA no sólo se empaqueta con histonas en nucleosomas espaciados regularmente, que a su vez se empaquetan en la fibra de 30 nm, sino que es empaquetado y organizado por otras proteína en una serie de subdominios de diferente naturaleza. Este em paquetamiento de orden superior es uno de los aspectos más fascinantes y menos conocidos de la cromatina. Aunque las bases moleculares son aún un misterio, se cree que este empaquetamiento tiene un papel crucial en la regula ción de la transcripción génica. En esta sección se explicará lo que se conoce de la estructura de nivel superior de la cromatina y se examinarán las evidencias que demuestran su importancia funcional.
Los cromosom as plumulados contienen bucles de crom atina descondensada10 Aunque empaquetados en forma de cromatina, la mayor parte de los crom oso mas en las células interfásicas (no en mitosis) son demasiado finos y enm araña dos para que se puedan visualizar con claridad. Sin embargo, en algunos casos excepcionales, es posible observar la estructura completa de un cromosoma in terfásico. Por ejemplo, los cromosomas de los oocitos en crecimiento apareados en la meiosis (huevos inmaduros) son muy activos en cuanto a síntesis de RNA, y suelen presentar grandes y esponjosos bucles de cromatina recubiertos de RNA recién transcrito empaquetado en complejos de RNA-proteína. Debido a este forro del DNA, estos c ro m o s o m a s p lu m u la d o s son claramente visibles in cluso al microscopio óptico, con el que se ve que están organizados en una serie de grandes bucles de cromatina que se extienden a partir de un eje cromosómico lineal (Figura 8-16). En la Figura 8-17 se representa esquemáticamente la estructura del cromoso ma plumulado. Desde el eje del cromosoma se extienden grandes bucles de cro matina descondensada. Mediante experimentos de hibridación de ácidos nuclei cos se ha podido demostrar que cada bucle siempre contiene los mismos genes, y que permanece extendido de la misma forma durante el crecimiento del oocito. Otros experimentos han demostrado que la mayor parte del DNA del bucle se está transcribiendo activamente en RNA. Sin embargo, la mayor parte de la cro matina no se encuentra en los bucles sino que permanece muy condensada en los cromómeros, que generalmente no se transcriben. Se ha propuesto un modelo general de cromosoma basado en estos estudios, en el que las fibras de 30 nm se extenderían perpendicularmente al eje mayor del cromosoma (Figura 8-18). Los cromosomas plumulados son un buen ejemplo de una característica re currente de la cromatina que se analizará en esta sección -cuando la cromatina
La estructura global de los cromosomas
núcleo globular COOH h 2n
histona H1
nucleosom a H l SE UNE A UNA REGIÓN ESPECÍFICA DEL NUCLEOSOMA
EL EMPAQUETAMIENTO DE LOS NUCLEOSOMAS ESTÁ MEDIADO POR LA HISTONA H1
Figura 8-1 5 Mecanismo por el cual se cree que la histona H l ayuda a em paquetar los nucleosomas adyacentes. El núcleo globular de Hl se une a cada nucleosom a cerca del lugar donde la doble hélice de DNA entra y sale del octám ero de histonas. Cuando está presente la histona H l, quedan protegidos de la digestión con nucleasa micrococal 166 pares de bases del DNA, respecto a los 146 pares de bases de los nucleosom as que carecen de Hl (véase Figura 8-10).
371
« ¿I
Figura 8 -16 Micrografia óptica de un crom osom a piumuiado de un oocito de anfibio. En una fase inicial de la diferenciación, cada cromosom a se replica para empezar la meiosis, y los cromosomas homólogos replicados se aparean formando esta estructura muy extendida que contiene un total de cuatro cromátidas. El estado de cromosomas en escobillón puede persistir durante meses o años mientras el oocito elabora posteriormente un acúmulo de mRNA y de otros materiales que serán utilizados para su desarrollo en un nuevo individuo. (Cortesía de Joseph G. Gali.)
v . -fV j
p w
i__
___ ___ ________ j
0,1 mm
se transcribe activamente se encuentra en una estructura extendida; cuando la crom atina está condensada, es inactiva; y las unidades estructurales de regula ción son regiones grandes, dominios bien definidos.
H------------------------------------------- 0,5 mm CROMOSOMAS PLUMULADOS APAREADOS
quiasma
bucle
REGIÓN DE UN SOLO CROMOSOMA
Figura 8 -17 Estructura de un crom osom a plumulado. El conjunto de cromosom as plumulados en muchos anfibios contiene un total de aproximadamente 10 000 bucles cromatínicos diferentes, quedando el DNA restante muy condensado en los crom óm eros. Cada bucle corresponde a una secuencia particular de DNA. Cada célula contiene cuatro copias de cada bucle, dado que cada uno de los cromosom as consiste en dos cromátidas hermanas muy juntas, como se muestra en la parte superior del esquema. Esta estructura en cuatro hebras es muy característica de esta fase del desarrollo del oocito (la fase diploténica de la meiosis, véase Figura
20-9).
PEQUEÑA REGION DEL CROMOSOMA MOSTRANDO LAS CROMÁTIDAS HERMANAS crom atina espadadora entre diferentes crom óm eros
372
Capítulo 8 : El núcleo celular
crom óm ero form ado de crom atina m uy condensada
También se pueden apreciar dominios estructurales organizados en la crom atina interfásica en los cromosomas politénicos11 Por una especialización (diferente a la descrita en los cromosomas plumulados), tam bién es posible visualizar la estructura de la cromatina en ciertas células de insectos. Muchas de las células de las larvas de mosca crecen hasta alcanzar ta maños enormes después de repetidos ciclos de síntesis de DNA que no van se guidos de división celular. Las células gigantes resultantes contienen miles de veces la dotación normal de DNA. Una célula con una dotación de DNA mayor de la normal, y, como es habitual, con más cromosomas de lo normal, se deno mina poliploide. Sin embargo en algunos tipos celulares de la larva de la mosca, todas las copias de los cromosomas se disponen de forma contigua formando un único cromosoma politénico gigante. El hecho observado en algunas células gi-
brazo derecho del crom osom a 3
do m in io en bucle
proteínas que form an el eje del cro m osom a
Figura 8 -1 8 Modelo de estructura del crom osom a. Se muestra una sección de un crom osom a plegado formando una serie de dominios en bucle, cada uno de los cuales posiblemente contiene entre 20 000 y 100 000 pares de nucleótidos en forma de DNA de doble cadena condensado en la fibra de cromatina de 30 nm.
cro m osom a X crom osom as m itóticos norm ales a la m ism a escala
«
región en que los dos crom osom as hom ólogos se han separado
brazo izquierdo del fruy 1 cro m o so m a 3 ; ’
brazo derecho d e ll cro m o so m a 2
brazo izquierdo del cro m osom a 2
JV*
%
20 pm
ML
fe «
La estructura global de los cromosomas
Figura 8 -19 Dibujo detallado de todo el conjunto de crom osom as politénicos de una glándula salival de Drosophila. Estos cromosom as han sido extendidos para su visualización, aplastándolos contra un portaobjetos. D rosop h ila tiene cuatro pares de cromosomas, y en el esquem a se encuentran las cuatro parejas. Pero cada cromosom a está íntim am ente apareado con su homólogo, (de modo que aparece com o una estructura única), lo cual no ocurre en la mayor parte de los núcleos (excepto en meiosis). Normalmente los cuatro cromosom as politénicos se encuentran unidos por regiones próximas a los centróm eros que se agregan formando un “crom ocentro” único de gran tamaño (región coloreada)-, en esta preparación, sin embargo, el crom ocentro se ha roto en dos partes por efecto del proceso de extensión empleado. (Modificado de T. S. Painter,/. Hered. 25 : 465-476,1934.)
373
gantes de insectos que pasan directamente de un estado politénico a un estado poliploide demuestra que la estructura básica de un cromosoma politénico debe ser similar a la de un cromosoma normal. Los crom osom as politénicos son fácilm ente visibles al microscopio óptico debido a su gran tamaño y a que al disponerse las diferentes cadenas de cro m atina una al lado de otra con gran precisión, aumenta mucho el diámetro del crom osom a y evita el enrollam iento. Son cromosomas interfásicos activos transcripcionalmente, com o los cromosomas plumulados. La politenia se ha es tudiado especialménte en las células de las glándulas salivares de la larva Dro sophila, en las cuales el DNA se ha replicado a lo largo de 10 ciclos sin separa ción de las cromátidas hermanas de forma que se alinean 1024 (= 210) cadenas idénticas (Figura 8-19). En los cromosomas politénicos observados con microscopia óptica son visi bles bandas oscuras e interbandas claras (Figura 8-20). Cada una de las bandas e interbandas corresponde a un conjunto de 1024 secuencias idénticas de DNA dispuestas en paralelo. Alrededor del 85% del DNA de los cromosomas politéni cos corresponde a las bandas, y el 15% restante a las interbandas. La cromatina de las bandas se tiñe más que la de las interbandas debido a su mayor grado de empaquetamiento (Figura 8-21). Se estima que, dependiendo de su tamaño, cada una de las bandas contiene de 3000 a 300 000 pares de bases por fibra de cromatina. Dado que cada una de las bandas puede reconocerse por su tamaño y su posición, se han numerado para disponer de un mapa del cromosoma poli ténico. En el genoma de Drosophila se conocen aproximadamente 5000 bandas y 5000 interbandas.
Los diferentes dominios de la crom atina de los cromosomas politénicos pueden em paquetarse y desempaquetarse como una unidad12 Mucho antes de que se conociera la estructura de la cromatina, estudios sobre los cromosomas politénicos revelaron que la transcripción gènica va acom paña da de un cam bio importante en el em paquetamiento del DNA, dado que es fre cuente que bandas crom osóm icas concretas se descondensen cuando los genes que contienen se activan, y se vuelvan a condensar cuando estos genes se hacen quiescentes. En cada mom ento se pueden identificar las regiones de un cromosoma poli ténico que son transcritas, marcando las células durante un corto período de tiempo con el precursor radiactivo uridina-3H y localizando por autorradiografía los RNA transcritos (Figura 8-22). Este análisis revela que las regiones cromosó micas más activas están descondensadas, formando los puffs cromosómicos, fácilmente observables.
10 nm Figura 8 -20 Micrografía obtenida con el m icroscopio óptico de una porción de crom osom a politénico de una glándula salival de D r o so p h ila . Se pueden apreciar con claridad los diferentes patrones reconocibles en bandas cromosómicas. Las bandas son regiones que presentan elevadas concentraciones de cromatina. Se encuentran en los cromosomas interfásicos y constituyen una característica especial de los cromosomas politénicos gigantes. (Por cortesía de Joseph G. Gall.)
Figura 8-21 Electronm icrografía de un corte ultraflno de una pequeña porción de un crom osom a politénico de D r o so p h ila . Se pueden distinguir claramente unas bandas de distinto grosor (B) separadas por interbandas (I) formadas por cromatina menos condensada. (Por cortesía de Viekko Sorsa.)
374
Capítulo 8 : El núcleo celular
Uno de los principales factores que controlan la actividad de los genes de los cromosomas politénicos de Drosophila es la hormona esteroidea ecdisona, cuyos niveles aumentan y disminuyen periódicamente durante el desarrollo lar vario, induciendo la transcripción de los diferentes genes que codifican las pro teínas que necesita la larva del insecto para cada muda y para la fase de pupa. A medida que el organismo pasa a través de las distintas fases del desarrollo, surgen nuevos puffs y desaparecen los anteriores, al ser activadas y desactivadas las unidades de transcripción, y se producen diferentes RNA y proteínas (Figura 8-23). Del estudio de los puffs, especialmente cuando son relativamente peque ños y aún se pueden distinguir las bandas de los cromosomas, parece deducirse que la mayoría de puffs provienen del desenrollamiento de una única banda crom osóm ica (Figura 8-24). El estudio de electronmicrografías de secciones ultrafinas de estos puffs muestra cómo el DNA de la cromatina está mucho menos condensado que en la fibra de cromatina de 30 nm. Estas observaciones sugie ren que la cromatina de una banda puede descondensar como una unidad du rante la transcripción.
Es probable que tanto las bandas como las interbandas de los cromosom as politénicos contengan genes13 El hecho de que el patrón de las bandas e interbandas de los cromosomas polité nicos de Drosophila sea fijo sugirió a los primeros citogenetistas que cada banda podría corresponder a un gen único. Los estudios de frecuencia mutacional que han permitido a los genetistas estimar que Drosophila tendría alrededor de 5000 genes, un número aproximadamente igual al número de bandas cromosómicas, apoyan esta hipótesis. Además, cuando se realizaron experimentos intensivos de aislamiento de mutantes correspondientes a una pequeña región de cromosoma que contiene alrededor de 50 bandas, se aislaron 50 genes esenciales. Aunque con estas técnicas no es posible determinar si un determinado gen se encuentra en una banda o en una interbanda, las observaciones sugieren que una banda de tamaño medio podría contener las secuencias de DNA codificantes de una proteína esencial. Resultados más recientes, y el hecho de que en los análisis genéticos descri tos anteriormente no se habrían tenido en cuenta aquellos genes que no son
50 pm
Figura 8 -2 2 Síntesis de RNA a lo largo de un crom osom a politénico gigante. En esta autorradiografía de un cromosom a (de la glándula salival del insecto C hiron om u s tentans) marcado con uridina-3H, se aprecian los lugares de síntesis de RNA com o zonas cubiertas con granos de plata oscuros, en proporción a su actividad. (De C. Pelling, C h ro m o so m a 15:71-122, 1964.)
Figura 8 -23 Puffs crom osóm icos. Serie temporal de fotografías que muestran cómo se forman y desaparecen los “puffs” en los cromosomas politénicos de D rosop h ila m elan ogaster, durante el desarrollo larvario. Se muestra una región del brazo izquierdo del cromosom a 3. Presenta 5 grandes “puffs” en las células de la glándula salival, cada uno de los cuales es activo durante un corto período de tiempo. La serie de cambios que se muestran en la figura tienen lugar durante un período de 22 horas, y siguen un patrón reproducible durante el desarrollo del organismo. (Por cortesía de Michael Ashburner.)
La estructura global de los cromosomas
375
esenciales para la supervivencia en el laboratorio (donde los depredadores no existen y se facilitan tanto la comida como el apareamiento), hacen improbable la veracidad de la hipótesis “una banda un gen”. Por ejemplo, se ha clonado un fragmento continuo de 315 000 pares de bases del genoma de Drosophila, y se han usado zonas de este fragmentos para localizar todos aquellos mRNA produ cidos en esta región. Así se localizaron 3 veces más mRNA que bandas corres pondían a esa región del genoma, indicando que cada banda contiene probable m ente varios genes. Además, en los cromosomas politénicos se ha mostrado directamente que se produce mRNA tanto de bandas como de interbandas. Aunque aún és motivo de controversia, se ha propuesto que en los cromoso mas politénicos el DNA se organiza en bucles de forma similar a como lo hace en los cromosomas plumulados. De acuerdo con este modelo la formación de puffs correspondería a la descondensación de uno o más de los dominios en bucle. Independientemente de que este modelo sea correcto o no, los resultados ante riores muestran que al menos algunos cromosomas interfásicos se encuentran organizados en una estructura de dominios secuenciales perfectamente defini dos, cada uno de los cuales contendría típicamente un pequeño número de ge nes cuya transcripción estaría regulada de forma coordinada. Podría ser que to dos los cromosomas interfásicos se encontraran empaquetados en estructuras ordenadas de acuerdo con los mismos principios.
síntesis de RNA
t_______!
10 |im
Figura 8-2 4 Autorradiografía de un puff aislado de un crom osom a politénico. En la porción de cromosoma que se destaca se está produciendo síntesis de RNA, por lo cual presenta mareaje con uridina- ’H. (Por cortesía de José Bonner.)
La crom atina está menos condensada en las regiones que son transcripcionalm ente activas14 Estudios de los puffs de los cromosomas politénicos sugieren que la estructura de la cromatina de los genes transcritos se encuentra descondensada selectiva mente. Apoyan esta sugerencia experimentos de diferente naturaleza. Cuando se aíslan núcleos de células de vertebrados y se exponen a la enzima DNasa I, al rededor del 10 % del genoma se degrada preferencialmente. Aunque una peque ña parte de estas secuencias degradadas corresponden a los lugares hipersensibles que se han descrito anteriormente, la mayor parte corresponde a genes que se estaban transcribiendo: por ejemplo, en diferentes tipos celulares del mismo
Figura 8-25 Digestión de la crom atina con DNasa I. La enzima corta en primer lugar por los lugares hipersensibles a las nucleasas (no visibles aquí, véase Figura 8-12) y luego degrada de forma selectiva DNA tanto de los genes que se transcriben activamente como de los que han sido activados pero aún no han comenzado a transcribirse.
crom atina condensada norm alm ente
376
Capítulo 8 : El núcleo celular
organismo se degradan diferentes secuencias de DNA en función de qué genes se estaban transcribiendo en estos tipos celulares. Cabe remarcar que incluso aquellos genes que se transcriben muy pocas veces en cada generación celular, son sensibles a la acción de la nucleasa, lo que indicaría que es más un estado especial de la cromatina que el proceso de transcripción de DNA en sí mismo lo que hace a estas regiones especialmente accesibles a la digestión (Figura 8-25). La crom atina en este estado accesible se denomina crom atina activa, y parece que su estructura está alterada de forma que el empaquetamiento de los núcleosomas es menor.
La crom atina activa es bioquím icam ente diferente15 ¿Qué diferencia la cromatina activa de la inactiva? La respuesta a esta pregunta requerirá la purificación y caracterización de las proteínas cromosómicas que son propias de cada una de ellas. Se han realizado algunos avances hacia esa meta con el desarrollo de métodos bioquímicos diseñados para aislar cromatina activa basándose en su estado relativamente descondensado. El análisis de las proteínas cromosómicas de la fracción de cromatina activa sugiere lo siguiente: (1) la histona H1 parece unirse con menos fuerza a al menos algún tipo de cro matina activa; algunos subtipos particulares de esta histona podrían estar repre sentados preferentemente. (2) Aunque en la cromatina activa las cuatro histonas nucleosómicos están presentes en cantidades normales, parecen estar altamente acetiladas cuando se comparan con las mismas histonas de la cromatina inactiva. (3) La histona nucleosóm ica H2B parece estar menos fosforilada en la cromatina inactiva. (4) La cromatina activa está muy enriquecida en una forma variante menor de la histona H2A que se encuentra en muchas especies, incluida Drosophila y el hombre. (5) Los nucleosomas de la cromatina activa se unen se lectivamente a dos pequeñas proteínas cromosómicas similares, denominadas HMG 14 y HMG 17. De acuerdo con su presencia exclusivamente en la crom ati na activa estas proteínas del “grupo de elevada movilidad” (HMG, de High-Mobility-Group) se encuentran en cantidad suficiente para unirse a 1 de cada 10 nucleosomas de la crom atina total; además, su secuencia de aminoácidos ha sido muy conservada durante la evolución, lo que implica que cumplen funcio nes importantes.
heterocromatina periférica
2 imi
La estructura global de los cromosomas
Figura 8 -2 6 La heterocrom atina es inactiva transcripcionalm ente. Autorradiografía de una sección ultrafina de un núcleo celular de una célula que ha sido marcada con un pulso de uridina-3H para marcar los lugares donde se produce la síntesis del RNA (granos de plata). Las áreas b lan cas son regiones de heterocromatina, que tiende a empaquetarse en la región interior de la envoltura nuclear. Normalmente la heterocromatina suele teñirse de oscuro en las electronmicrografías (por ejemplo, véase Figura 8-71), pero debido al método especial de preparación de esta muestra han quedado de color claro. Como se puede observar, la mayor parte de la síntesis de RNA tiene lugar en la eucromatina que rodea las áreas de heterocromatina. (Por cortesía de Stan Fakan.)
377
Todos o alguno de estos cambios podrían jugar un papel importante en el desem paquetam iento de la cromatina de los genes activos, contribuyendo a ha cer el DNA accesible como molde para la síntesis de RNA; sin embargo son nece sarios más resultados experimentales para poder comprobar esta idea. En el Ca pítulo 9 se exponen los mecanismos que pueden controlar la transición entre crom atina activa e inactiva.
crom osom a
l------------- 1
centrom ero
La heterocrom atina está muy condensada y es transcripcionalm ente inactiva16 Los estudios realizados en los años 30 con microcopia óptica diferenciaron entre dos tipos de cromatina en el núcleo interfásico: una forma altamente condensa da denominada heterocrom atina y todo el resto, que está menos condensada, denominada eucrom atina. La heterocromatina fue identificada originalmente porque permanece extraordinariamente compactada durante la interfase; pos teriormente se encontró que era transcripcionalmente inactiva (Figura 8-26). En una célula típica en interfase, aproximadamente el 10% del genoma se encuen tra empaquetado en heterocromatina. Actualmente parece claro, por lo que se ha descrito anteriormente, que la eucromatina existe al menos bajo dos formas: alrededor del 10% está en la forma de crom atina activa, que es la menos conden sada, mientras el resto es eucrom atina inactiva, que está más condensada que la eucromatina activa pero menos que la heterocromatina. Así pues se cree que la heterocromatina podría ser una clase especial de cromatina inactiva en trans cripción que podría tener otras funciones. Por ejemplo, en mamíferos y en muchos otros eucariotas superiores el DNA que rodea a cada centròmero está formado por secuencias de nucleótidos simples y repetidas. Este DNA satélite constituye la mayor parte de la heterocromatina en dichos organismos.
crom átida Figura 8 -27 Dibujo de un crom osom a metafásico típico. Cada cromátida hija contiene una de las dos moléculas hijas idénticas de DNA que se han generado previamente en el ciclo celular por la replicación del DNA.
Los crom osom as m itóticos están formados por crom atina en su form a más condensada17 Con excepción de unos cuantos casos muy especializados, como son los crom o somas plumulados y politénicos descritos anteriormente, la mayor parte de los cromosomas en interfase están demasiado extendidos, son tan delgados, y están tan entremezclados que no son detectables. Por el contrario, los cromosomas de casi todas las células son perfectam ente visibles durante la mitosis, cuando se empaquetan formando unas estructuras mucho más condensadas. Este empa quetamiento, que reduce una longitud de DNA de 0,5 cm a alrededor de 5 |im, hace posible que el huso mitótico segregue los cromosomas en las células hijas sin romperlos. Esta condensación está acompañada de la fosforilación de todas las histonas H1 de la célula en cinco de sus residuos de serina. Debido a que la histona H1 colabora en el em paquetamiento de los nucleosomas (véase Figura 8-15), parece probable que su fosforilación desempeñe un papel causal en la condensación de los cromosomas. La Figura 8-27 muestra un crom osom a m itótico típico durante la metafase m itótica. Las dos moléculas de DNA hijas producidas por replicación del DNA durante la fase S del ciclo de división celular, están plegadas por separado, for mando dos crom osom as herm anos (denominados cromátidas hermanas) m an tenidos juntos por sus centrómeros. Normalmente, estos cromosomas mitóticos están cubiertos por diversas moléculas, entre las que se cuentan grandes cantidades de ribonucleoproteínas. Una vez eliminada esta envoltura, en las electronmicrografías se puede observar que cada cromátida está organizada en bucles de crom atina que proceden de un eje central (Figuras 8-28 y 8-29). Algu nos experim entos demuestran que el orden en que aparecen determinadas ca racterísticas visibles de un crom osom a m itótico representa, aproximadamente, el orden de los genes a lo largo de la molécula de DNA. Para ilustrar el modo tan organizado com o se pliega y em paqueta la larga hélice de DNA, en la Figura 8-30 se ha representado cada cromátida como una serie de dominios en bucle
378
Capítulo 8 : El núcleo celular
cromátida 1
Figura 8-2 8 Electronm icrografía de barrido de una región cercan a a un extrem o de un crom osom a m itótico típico. Se cree que cada protuberancia representa la parte superior de un dominio en forma de bucle. Es de destacar que es posible diferenciar claramente las dos cromátidas hermanas tal como se han representado en la Figura 8-27. (De M.P. Marsden y U.K. Laemmli, Cell 17: 849-858, 1979, © Cell Press.)
Figura 8 -2 9 ElectronmicrografTa de una sola crom átida de un crom osom a m itótico. El crom osom a (de un insecto) fue tratado para revelar los bucles de fibras crom atínicas que proceden de un eje central de la cromátida. Estas micrografías apoyan la idea de que en todos los cromosom as la crom atina está doblada en series de dominios en forma de bucle (véase Figura 8-18). (Por cortesía de Victoria Foe.)
Figura 8 -3 0 Modelo del em paquetamiento de la crom atina. Ilustración esquem ática de algunos de los muchos grados de empaquetamiento de la crom atina que se han postulado para explicar el alto grado de em paquetamiento del cromosom a metafàsico.
crom atina en la form a de "cadena de cuentas" o "cuentas ensartadas
nucleosom as com pactados en form a de fibra de crom atina de 30 nm
sección del crom osom a en una form a extendida
30 nm
t
300 nm i
sección condensada de un crom osom a metafàsico
crom osom a metafàsico com pleto
La estructura global de los cromosomas
700 nm
1400 nm
379
*
tVií
é é
at
Il • § *
i
#
II
16
1
muy próximos, organizados en una hélice compacta; también se representan es quemáticam ente todas las etapas de empaquetamiento que podrían preceder a esta estructura. Se cree que la forma condensada de la cromatina que constituye los crom o somas mitóticos es similar a la de la heterocromatina en su grado de compactación. No es sorprendente que se haya determinado que los cromosomas m itóti cos son inactivos transcripcionalmente: la síntesis de RNA cesa cuando el cromosoma se condensa. Probablemente la condensación de la cromatina impi de el acceso de la RNA polimerasa al DNA, aunque también podrían estar impli cados otros factores.
Cada uno de los crom osom as m itóticos presenta un patrón característico de grandes dominios estructurales18 El conjunto de los 46 crom osom as humanos en mitosis se denomina el cariotipo humano. Métodos de tinción ideados durante los últimos 25 años han per mitido la identificación inequívoca de cada uno de los cromosomas. Algunos de estos métodos requieren la tinción de los cromosomas mitóticos con colorantes que son fluorescentes únicam ente cuando se fijan a ciertos tipos de secuencias de DNA. Aunque estos colorantes tienen una especificidad muy baja y parecen distinguir sobre todo entre el DNA rico en pares de bases A-T (bandas G) y el DNA rico en pares de bases G-C (bandas R), dan lugar en cada crom osoma mitótico a un atractivo patrón reproducible de finas bandas (véase Figura 8-31). De esta forma cada crom osom a se puede identificar y numerar, como se ilustra en la Figura 8-32. Se sabe que tanto las bandas G como las R contienen genes. Estas bandas no están relacionadas con las descritas previamente en los crom o somas politénicos de insectos, que se cree corresponden a regiones de cromati na condensada; en los cromosomas mitóticos humanos, toda la cromatina está condensada y las bandas se forman por la unión selectiva de ciertos colorantes. Mientras que en una banda de un cromosoma politénico parece haber sólo unos cuantos genes, una banda típica de un cariotipo humano contiene algunos cen tenares de ellos. Examinando los cromosomas humanos durante las primeras etapas de la mitosis, cuando están m enos condensados que en la metafase, ha sido posible establecer que la dotación haploide total contiene por lo menos 2000 bandas di feren ciabas de DNA rico en pares de bases A-T. Estas bandas se fusionan pro gresivamente a medida que avanza la condensación durante la mitosis, dando lugar a un número menor de bandas más gruesas. Las bandas de los cromosomas mitóticos se han detectado en especies tan diversas como la mosca y el hombre. Además, el patrón de bandas exacto de un determinado crom osom a ha permanecido inalterado durante largos períodos de tiempo; por ejemplo, se han localizado cromosomas con un patrón de bandas com parable al humano, en chimpancés, en gorilas y en orangutanes (aunque en
380
Capítulo 8 : El núcleo celular
9
16
Figura 8-31 Micrografías de fluorescencia de tres parejas de crom osom as hum anos mostrando el patrón de bandas. En (A) los cromosomas fueron teñidos con el colorante Hoescht 33258 específico del par de bases A-T que tiñe las bandas G, y en (B) con el colorante olivomicina, específico del par de bases G-C que tiñe las bandas R. Las barras indican la posición del centròmero. Obsérvese que estos patrones de las bandas son el reverso el uno del otro, ya que las bandas que son claras en (A) son oscuras en (B), y viceversa. Las bandas G también se tiñen con el método de Giemsa -d e ahí su n om bre- mientras que las bandas R deben su nombre al hecho de ser el patrón “reverso” de las bandas G. (De K.F. Jorgenson, J.H. Van de Sande, y C.C. Lin, C h rom osom a 6 8 : 287-302, 1978.)
Figura 8 -32 Mapa estándar del patrón de bandas de cada crom osom a del cariotipo hum ano. Este mapa se determinó en la etapa de prometafase mitótica. Los cromosom as del 1 al 22 están ordenados según su tamaño; una célula diploide contiene dos de cada uno de estos cromosom as, además de dos cromosom as X (hembra) o un X y un Y (macho). Las 850 bandas que se muestran en el esquema son bandas G, que se tiñen con reactivos que parecen ser específicos para las secuencias ricas en A-T. Las p rotu b eran cias co lo rea d a s en verde sobre los cromosom as 13, 14, 15, 21 y 22 indican la posición de los genes que codifican los RNA ribosómicos grandes; las lín eas verdes marcan la posición de cada centròmero. (Adaptado de U. Franke, Cytogenet. Celi Genet. 3 1 :2 4 32, 1981.)
el hombre se ha producido la fusión de dos cromosomas, lo cual ha dado lugar a los 46 cromosomas que presenta a diferencia de los 48 de las otras especies cita das). Esto sugiere que la organización espacial de los cromosomas que ponen de manifiesto las bandas puede ser de gran importancia para la función cromosómica. El porqué de la existencia de estas bandas constituye un misterio. Incluso las más finas de ellas representadas en la Figura 8-32 podrían contener más de un millón de pares de nucleótidos, que es casi el tamaño de un genoma bacte riano, y es de esperar que la composición media de pares de bases sea aleatoria en estos grandes fragmentos de DNA.
Resumen Los cromosomas se descondensan generalm ente d urante la interfase, d efo rm a qu e es difícil discernir su estructura. Existen notables excepciones, como p or ejemplo los especializados cromosomas plum ulados de los oocitos d e vertebrados o los crom o somas polifónicos d e células secretoras gigantes de insectos. Los estudios de ambos tipos d e cromosomas interfásicos sugieren q u e cada una d e las largas moléculas de DNA d e un cromosoma está dividida en un gra n núm ero d e dom inios discretos q ue se pliegan d e m anera diferente. Tanto en los cromosomas plum ulados como en los politénicos las regiones qu e están sintetizando activamente RNA son las m enos condensadas. De fo rm a similar, como se estima p o r la sensibilidad a núcleos as, alrede d o r del 10% del DNA de las células en interfase d e vertebrados se encuentran en una conform ación relativamente deseondensada qu e se correlaciona con la transcrip ción del DNA en dichas zonas. Esta 4ícrom atina activa” es bioquím icam ente distinta d e las regiones más condensadas, inactivas, d e la cromatina.
La estructura global de los cromosomas
381
Todos los cromosomas adquieren una conformación altamente condensada durante la mitosis. Cuando se tiñen deforma específica, los cromosomas mitóticos presentan una estructura en bandas que permite reconocer sin ambigüedades a cada uno de los cromosomas; estas bandas contienen millones de pares de nucleótidosyson el reflejo de una hetereogeneidad de la estructura del cromosoma que aún no se comprende.
Replicación del cromosoma Antes de que una célula se divida, ha de realizar una copia de cada uno de sus cromosomas, proceso que realiza durante una parte de la interfase denominada fase de síntesis de DNA o fase S del ciclo celular; a la parte del ciclo celular que precede a la fase S se le denomina Gap 1 (de “intervalo”) o Gp y a la que le sigue Gap 2, o G2 (véase Figura 17-3). En una célula eucariota típica la fase S dura apro ximadamente 8 horas. Al final, cada cromosoma se ha replicado produciendo dos copias completas, que permanecen unidas por sus centrómeros hasta la fase M que le sigue poco después (Figura 8-27). La duplicación de los cromosomas re quiere tanto la replicación de la larga molécula de DNA de cada cromosoma como el ensamblaje de un nuevo conjunto de proteínas cromosómicas sobre este DNA, formando la cromatina. En el Capítulo 6 se discute la enzimología de la re plicación del DNA y se describe la estructura de la horquilla de replicación, en la que se produce la síntesis de DNA siguiendo un mecanismo semiconservativo (véanse Figuras 6-48 y 6-49). En el Capítulo 17 se considera cómo está regulado el inicio de la fase S, en el seno de una discusión más general sobre el control del ci clo celular. En la presente sección describimos el patrón de fases de la replicación de los cromosomas eucariotas y su relación con la estructura del cromosoma.
Secuencias específicas de DNA actúan como orígenes de replicación19 En el Capítulo 6 se vio que se han caracterizado los orígenes de replicación en bacterias com o secuencias específicas de DNA que permiten a la maquinaria de replicación del DNA unirse a la doble hélice y desplazarse en direcciones opues tas, formando las horquillas de replicación. Por analogía, es de esperar que los orígenes de replicación eucariota también sean secuencias específicas de DNA. Como se m encionó previamente, la búsqueda de orígenes de replicación en los cromosomas eucariotas ha sido especialmente fructífera en las células de la le vadura Saccharomyces cerevisiae. Los potentes métodos que se han desarrollado para su aislamiento se basan en el uso de unas células mutantes de levadura que carecen de un gen esencial, de forma que sólo sobrevivirán en el medio selectivo si se les agrega un plásmido que porte una copia funcional del gen perdido. Cuando se introduce en la célula de levadura un plásmido bacteriano que porta el gen esencial, no será capaz de replicarse independientemente del cromosoma huésped porque el origen de replicación bacteriano no funciona en la célula de levadura. Si se insertan fragmentos al azar de genoma de levadura en un plásmi do bacteriano, una pequeña fracción de las moléculas recom binantes portará un origen de replicación de levadura, y por ello será capaz de replicarse en células de levadura. Aquellas células mutantes de levadura que porten dicho plásmido podrán proliferar en medio selectivo pues se les ha aportado una copia funcio nal del gen normal (Figura 8-33). Las secuencias de DNA identificadas por su presencia en plásmidos aislados de estas células se han denominado secuencias de replicación autónom a (ARS, de Autonomously Replicating Sequences). Re cientem ente se han aislado un cierto número de ARS, demostrándose que se tra ta de auténticos orígenes de replicación cromosómicos, justificando la estrategia que se ha seguido en su aislamiento. Se ha demostrado que una secuencia de 11 nucleótidos, la secuencia central consenso, es esencial para la función de origen de replicación en levadura; todos
382
Capítulo 8 : El núcleo celular
segm ento de DNA de levadura que contiene una secuencia ARS
fragm ento de DNA de levadura, seleccionado al azar
¡
vector plam ídico que contiene el gen de la histidina
ARS /
V HIS
introducción del DNA plasm ídico en células de levadura que carecen del gen de histidina y que, por lo tanto, no pueden crecer en ausencia de histidina
Figura 8-33 Estrategia utilizada para identificar secuencias de replicación autónoma en levaduras. U na secu en cia de DNA id entificad a de esta form a se d en om in ó in icialm en te secu en cia de rep licació n au tón om a o ARS, pues c ap acita al plásm ido que la co n tien e a replicarse lib rem en te en la célula hu ésped sin n ecesid ad de incorp orarse en sus crom o som as.
m edio selectivo sin histidina
células transform adas obtenidas con una frecuencia baja en las que ei DNA del plásm ido se ha integrado en el crom osom a de la levadura
células transform adas obtenidas con una frecuencia elevada en las que los círculos de DNA plasm ídico se replican independientem ente del crom osom a huésped
origen de replicación de SV40
1 \'■ . {¡„i:::-.: los orígenes de replicación conocidos contienen copias casi idénticas de dicha secuencia, espaciadas en una región de unos 100 nucleótidos. Estas secuencias de DNA son reconocida por un gran complejo de proteínas que parece que está implicado en el proceso de iniciación. Aunque se han identificado algunas pro bables secuencias de origen de replicación en eucariotas, hasta el momento no se conocen las proteínas que se unen a ellas.
DNA
---- -
aSS
0
—
—
antígeno T
00 m
CAMBIO CON FORM ACION AL EN EL ANTÍGENO T
Un sistema eucariota libre de células replica el cromosoma de un virus de simio20 En una bacteria un complejo multienzimático que incluye la DNA polimerasa, la DNA primasa y la DNA helicasa desplaza la horquilla de replicación (véase Figu ras 6-48 y 6-49); este complejo se ensambla en el origen de replicación a través de una reacción que requiere la presencia de una proteína iniciadora que se une específicam ente al origen de replicación en el DNA (véase Figura 6-52). Se han hechos numerosos intentos para reconstruir el sistema de replica ción eucariota en el tubo de ensayo. Para ello sería necesario identificar todas las enzimas necesarias y describir la función de cada una de ellas en la horquilla de replicación. El sistema de replicación in vitro que m ejor ha funcionado por el momento permite la replicación del virus de simio SV40. Este virus parasita la célula huésped, usando de esta célula todo lo necesario para su replicación, con excepción de una proteína, el antígeno T de SV40, una proteína multifuncional de gran tamaño que permite al virus evitar los controles normales y por ello re plicarse más deprisa que la célula huésped. Al origen de replicación de SV40 se unen dos hexámeros del antígeno T, reconociendo el exterior de la doble hélice. Después, en un proceso que no se comprende bien, el antígeno T unido cambia de conformación separando las dos hebras de DNA del origen. Esta interesante proteína tiene una tercera función: utilizando la energía de hidrólisis del ATP ac túa como DNA helicasa, desplazándose a lo largo del DNA y separando las dos hebras a su paso, formando una burbuja de replicación (Figura 8-34). Los com ponentes celulares de la maquinaria de replicación se ensamblan en la burbuja formando dos horquillas de replicación que se desplazan desde el origen en di recciones opuestas.
Replicación del cromosoma
— 2 ¡ADP]
Figura 8-34 Iniciación de la replicación del DNA del genoma del virus SV40. La p roteín a de in iciació n (antígeno T) es cod ificad a por el virus, y reco n o ce e sp ecíficam en te los orígenes de rep licació n víricos. D espués de abrir la d oble h élice de DNA en el origen, el antígeno T actúa com o u n a DNA helicasa, d esplazánd ose desde el origen y al m ism o tiem p o abriend o la doble h élice. A con tin u ació n los co m p o n en tes celu lares de la m aqu inaria de rep licación se en sam blan en la b u rb u ja de rep licación form ando las horqu illas de rep licación (véase Figura 8-35).
383
patrón de la cadena guía DNA polimerasa 5 (sobre el patrón de la cadena guía)
DNA helicasa (antígeno T u hom ólogo celular) proteínas de unión a la cadena sencilla de DNA
DNA polim erasa a (sobre el patrón de la cadena retrasada)
Aunque la horquilla de replicación es similar a la que se encuentra en proca riotas, los experimentos con SV40 han mostrado que en eucariotas existen al menos dos tipos diferentes de DNA polimerasa: DNA polimerasa a (alfa) en la cadena retrasada, y la DNA polimerasa delta 8 (delta) en la cadena guía (Figura 8-35). En los procariotas, sin embargo, en ambas hebras de la horquilla de repli cación actúa un mismo tipo de DNA polimerasa (véase Figura 6-48). Todavía no se ha descubierto la proteína que normalmente inicia la replica ción de los cromosomas de mamífero. Por ello se desconoce si actúa en la hor quilla com o el antígeno T, a modo de DNA helicasa, o bien, si como en los pro cariotas, se necesita una proteína iniciadora específica y la DNA helicasa.
Los orígenes de replicación de los cromosomas eucariotas se activan en grupos21 En el Capítulo 6 se describe cómo, en las bacterias, se inician dos horquillas de replicación en cada origen y cómo avanzan en direcciones opuestas, desplazán dose a una velocidad de alrededor de 500 nucleótidos por segundo hasta que se ha replicado la totalidad del DNA circular del cromosoma. El tamaño del genoma bacteriano es pequeño, de modo que las dos horquillas permiten duplicar todo el crom osom a en menos de 40 minutos. Dado el tamaño muy superior de la mayor parte de los cromosomas eucariotas, parece poco probable que su re plicación se inicie en un único origen. En los primeros años de la década de 1960 se desarrolló un método que per mitió el estudio del m ecanismo general de replicación del cromosoma eucariota. Se hacen crecer células humanas en cultivo, exponiéndolas durante períodos cortos de tiempo a timidina-3H, con lo que se consigue que el DNA sintetizado durante ese tiempo sea fuertemente radiactivo. La distribución del DNA radiac tivo se determina por autorradiografía: se obtiene el DNA de las células median te lisis suave, se extiende sobre un portaobjetos de vidrio y se recubre con una emulsión fotográfica. Los tiempos de mareaje utilizados son cortos, de modo que la horquilla de replicación recorre sólo unos cuantos micrómetros, lo cual se pone de manifiesto al microscopio óptico en forma de líneas de granos de plata a lo largo de la molécula de DNA, a pesar de que ésta no es visible al microscopio óptico. De este modo es posible determinar tanto la velocidad de replicación como la dirección en la que se desplazan las horquillas de replicación (Figura 8-36). A partir de las velocidades estimadas mediante diferentes tiempos de
384
Capítulo 8 : El núcleo celular
Figura 8-35 Horquilla de replicación en mamíferos. Esta horquilla se ha esquematizado de forma que destaque la homología con la horquilla de replicación bacteriana descrita en el Capítulo 6 . Aunque ambas horquillas utilizan los mismos componentes básicos, la horquilla de mamíferos difiere en dos aspectos importantes. En primer lugar, se emplean dos DNA polimerasas, una para la cadena guía y otra para la retrasada. Es bastante probable que la polimerasa de la cadena guía esté adaptada a mantener una unión fuerte con el DNA, mientras que la polimerasa de la cadena retrasada debe ser capaz de soltarse del molde y volverse a unir cuando se sintetiza el nuevo fragmento de Okazaki. En segundo lugar, la DNA primasa de mamíferos es una subunidad de la DNA polimerasa de la cadena retrasada, mientras que en bacterias está asociada con la DNA helicasa.
— 50 p m ------------------------ ►] ____________________ r'- - ^
DNA
origen de replicación PULSO DE 10 MINUTOS DE MARCAJE CON TIMIDINA-3H (A)
granos de plata
burbuja de replicación
LA "C AZA" EN EL MEDIO NO MARCADO DURANTE 10 MINUTOS REDUCE LOS NIVELES DE PRECURSOR INCORPORADO
burbuja de replicación
mareaje, se deduce que la horquilla de replicación se desplaza a unos 50 nucleótidos por segundo. Esta velocidad es una décima parte de la velocidad estimada de desplazamiento de la horquilla de replicación en bacterias, lo cual probable mente refleja la dificultad que supone replicar el DNA estrechamente empaque tado en la cromatina. Tal como se ha comentado anteriormente, se cree que un cromosoma hu mano de tamaño medio está formado por una molécula de DNA de unos 150 m i llones de pares de nucleótidos. La replicación de una molécula de este tamaño a partir de una horquilla de replicación que se desplazara a una velocidad de 50 nucleótidos por segundo, requeriría 0,02 x 150 x 106 = 3 x 106 segundos (alrede dor de 800 horas). Como se esperaba, los experimentos antes descritos revelaron que en cada crom osom a eucariota en replicación actúan numerosas horquillas de replicación que se desplazan simultáneamente. Más aún, existen regiones del cromosoma que presentan numerosas horquillas de replicación muy juntas, mientras que otras regiones del mismo cromosoma no presenta ninguna. Otros experimentos posteriores han demostrado lo siguiente: (1) los orígenes de repli cación tienden a ser activados en grupos de entre 20 y 80 unidades (denomina dos unidades de replicación ). (2) A lo largo de la fase S se van activando nuevas unidades de replicación hasta que todo el DNA está replicado; (3) Dentro de una unidad de replicación, los orígenes de replicación están espaciados a intervalos de entre 30 000 y 300 000 pares de nucleótidos; posiblemente exista un único origen de replicación por bucle de la cromatina. (4) Como ocurre en las bacte rias, las horquillas de replicación se forman por parejas y se desplazan en senti dos opuestos desde un punto de origen común dando lugar a una burbuja de re plicación; dichas horquillas se detienen sólo cuando se encuentran con otra burbuja de replicación en crecimiento o cuando alcanzan un extremo del cro mosoma. De esta manera muchas horquillas de replicación pueden actuar de forma independiente sobre cada cromosoma y formar de este modo dos hélices hermanas completas de DNA (véase Figura 8-36).
Figura 8 -36 Los experim entos que dem ostraron el patrón de desplazamiento de las horquillas de replicación durante la fase S. El DNA de nueva síntesis en las células humanas en cultivo se marcó brevemente con un pulso de timidina tritiada (timidina-3H) de elevada actividad específica. En el experimento que se ilustra en (A) las células se Usaron y el DNA se extendió sobre un portaobjetos de vidrio que fue recubierto por una emulsión fotográfica. Tras algunos meses de exposición se reveló la emulsión, y apareció una línea de granos de plata sobre el DNA radiactivo. El experimento en (B) es igual que el de A pero después del mareaje las células se incubaron en un medio libre de radiactividad, con lo cual el DNA sintetizado quedó marcado menos intensam ente. Se observó que las parejas de trazas oscuras en (B) presentaban regiones de menor mareaje en direcciones opuestas, demostrando el desplazamiento bidireccional de la horquilla de replicación a partir de un origen de replicación com ún (véase Figura 6-51). En esta figura se presenta el DNA coloreado en rojo únicam ente como una ayuda para la interpretación del autorradiograma; el DNA no marcado no es visible en estos experimentos. Se cree que una horquilla de replicación sólo se detiene cuando encuentra otra horquilla desplazándose en dirección opuesta o cuando alcanza el extremo de un cromosoma; de esta forma se replica la totalidad del DNA.
Regiones distintas del mismo cromosom a se replican en diferente m om ento22 La replicación del DNA en la región situada entre dos orígenes de replicación, requiere tan sólo alrededor de 1 hora para completarse, según las estimas reali zadas de las mayores distancias conocidas entre orígenes de replicación y la ve locidad de desplazamiento de la horquilla de replicación. Sin embargo, en las células de mamífero la fase S dura alrededor de 8 horas. Esto implica que no to dos los orígenes de replicación son activados simultáneamente y que cada uni dad de replicación (que contiene un grupo de entre 20 y 80 orígenes de replica ción) esté replicando sólo durante una pequeña parte de la fase S.
Replicación del cromosoma
385
¿Existe una activación al azar de las diferentes unidades de replicación, o bien existe un orden definido de replicación de las diferentes regiones del genoma? Un experimento que puede responder a esta pregunta consiste en el marea je de poblaciones celulares sincronizadas, con el análogo de la timidina bromodesoxiuridina (BrdU), durante diferentes períodos de tiempo a lo largo de la fase S. Posteriormente, en la fase M, se pueden reconocer las regiones del crom oso ma mitótico que han incorporado BrdU en su DNA gracias a su distintas propie dades de tinción, o mediante el uso de anticuerpos anti-BrdU. Los resultados muestran que diferentes regiones de cada cromosoma se replican en un orden reproducible durante la fase S (Figura 8-37). Además, como era de esperar a partir de la observación de grupos de horquillas de replicación visualizados por autorradiografía, el momento en que se realiza la replicación está coordinado en grandes regiones de cromosoma.
La crom atina muy condensada se replica tardíamente en la fase S, m ientras que la crom atina activa se replica tem prano23 Parece que el orden en que se activan los orígenes de replicación depende, al menos en parte, de la estructura de la cromatina en la que se encuentren. Se describió, por ejemplo, que durante la interfase la heterocromatina permanece en una conform ación muy condensada (similar a la cromatina mitótica), m ien tras que la crom atina activa adquiere una conformación descondensada que probablem ente es necesaria para permitir la síntesis de RNA. La heterocromati na se replica muy tardíamente en la fase S, sugiriendo que el orden de replica ción está relacionado con el empaquetamiento del DNA en la cromatina. Esta sugerencia está de acuerdo con el orden en que se replican los dos cromosomas X en una célula de hem bra de mamífero. A pesar de que ambos cromosomas contienen esencialm ente las mismas secuencias de DNA, únicamente uno de ellos es activo transcripcionalm ente mientras que el otro no lo es (se discute en el Capítulo 9). Casi todo el crom osom a X inactivo se encuentra condensado en heterocromatina y su DNA se replica tardíamente al final de la fase S, mientras que su homólogo activo está menos condensado y se replica a lo largo de toda la fase S. Estos hechos apoyan la hipótesis de que las regiones del genoma cuya cromatina está m enos condensada durante la interfase, y por ello son más acce sibles a la maquinaria de replicación, se replican primero. Experimentos de autorradiografía muestran que las horquillas de replicación se desplazan a velocida des similares a lo largo de toda la fase S, de forma que el grado de condensación de la crom atina afectaría al tiempo de iniciación de las horquillas de replicación pero no a su velocidad una vez formadas. La relación que se ha sugerido entre la estructura de la cromatina y el m o mento en el que se produce la replicación del DNA se apoya asimismo en estu dios en los que se ha medido el momento en el que se replican determinados ge nes. Los resultados muestran que en todas las células estudiadas, los genes constitutivos, que están siempre activos, se replican muy temprano en la fase S en todas las células estudiadas. Por el contrario, los genes que sólo son activos en unos cuantos tipos celulares generalmente se replican temprano en la fase S en las células en que son activos y más tarde en las que son inactivos.
Las unidades de replicación tardías coinciden con las bandas ricas en A-T en los cromosom as m etafásicos24 Parece que muchas de las unidades de replicación corresponden a distintas bandas crom osóm icas que se hacen visibles mediante varios procesos de fija ción y tinción usados para obtener los cariotipos. Como se ha descrito previa mente, en el com plem ento haploide de cromosomas de una célula de mamífero, durante las primeras fases de la mitosis se pueden distinguir unas 2000 bandas oscuras, las bandas ricas en A-T (bandas G), separadas por un número igual de bandas claras ricas en G-C (bandas R). Es curioso que las bandas ricas en A-T y
386
Capítulo 8 : El núcleo celular
5 |im
Figura 8 -37 Diferentes regiones de un crom osom a se replican en diferentes mom entos de la fase S. Estas micrografías, obtenidas con el microscopio óptico, muestran cromosomas mitóticos teñidos en los que se ha marcado de forma diferencial el DNA en replicación durante intervalos definidos de la fase S. En estos experimentos, las células se hicieron crecer en presencia de BrdU (un análogo de timidina) y en ausencia de timidina para marcar el DNA uniformemente. Después las células fueron expuestas a pulsos breves de timidina en ausencia de BrdU durante la fase S temprana, media o tardía. Dado que el DNA sintetizado durante el pulso con timidina es DNA de doble hélice con timidina en una cadena y BrdU en la otra, se tiñe más intensam ente que el otro DNA (que contiene BrdU en las dos cadenas) y se visualiza com o bandas brillantes (flec h a s) en estos negativos. Las líneas discontinuas conectan posiciones similares de las tres copias del cromosom a mostrado. (Por cortesía de Elton Stubblefield.)
las bandas ricas en G-C se repliquen en diferentes momentos de la fase S. Expe rimentos como el descrito en la Figura 8-37 sugieren que la mayor parte de las bandas ricas en G-C se replican durante la primera mitad de la fase S mientras que la mayor parte de las bandas ricas en A-T lo hacen en la segunda mitad de la fase S. Se ha sugerido que los genes de expresión constitutiva se encuentran localizados fundamentalmente en las bandas ricas en G-C, mientras que los ge nes de expresión específica de tipo celular -la gran mayoría de los cuales serán inactivos en muchas células- están situados en las bandas ricas en A-T. Como se com entó previamente, actualmente constituye un completo misterio por qué el genoma de los mamíferos ha de estar segregado en estos grandes bloques al ternos de cromatina -m uchos de ellos de un tamaño similar a un genoma bacte riano. También se desconoce cuántos de los orígenes de replicación presentes en una unidad de replicación se activan al mismo tiempo. Un posibilidad es que la cromatina de las unidades de replicación tardías permanezca condensada aún después del final de la fase M, y sólo se descondense en la segunda mitad de la fase S, permitiendo sólo entonces el acceso simultáneo a todos sus orígenes de replicación. En este caso, la replicación “todo o nada” del DNA de una unidad de replicación podría ser el reflejo de la descondensación en bloque de grandes dominios de cromatina.
El patrón ordenado de activación de los orígenes de replicación puede contribuir a la mem oria de la célula25 En huevos en división de muchas especies, en los cuales se encuentran alm ace nadas grandes cantidades de los com ponentes de la cromatina (como las histonas) que se precisan para fabricar un nuevo núcleo, la fase S es extremadamente breve. Como se ilustra en la Figura 8-38, una corta fase S implica el uso de un número excepcionalmente grande de orígenes de replicación espaciados a inter valos de sólo unos cuantos miles de pares de nucleótidos (a diferencia de las de cenas o centenares de miles de pares de nucleótidos que separan los orígenes de replicación durante el desarrollo más tardío). El hecho de que cualquier DNA ex traño introducido en el interior de un huevo de rana fecundado se replique, pa rece indicar que posiblemente en ese modelo celular no se requiera una secuen cia específica de DNA para formar un origen de replicación. Así pues, la replicación del DNA puede considerarse como un proceso po tencialm ente muy rápido que en algunas células está sujeto a un complejo siste ma de regulación que restringe la iniciación de las horquillas de replicación, de modo que diferentes regiones del genoma se replican en diferentes momentos. Se ha sugerido, por ejemplo, que la cromatina que se replica temprano se en sambla en parte con una serie de proteínas cromosómicas especiales que se han producido durante la fase G1( de modo que cuando una región cromosómica se ha descondensado formando cromatina activa, su replicación temprana hace que reclute proteínas que le ayudarán a m antener su estado descondensado de una generación a la siguiente. Desde este punto de vista, el momento en que se produce la replicación del DNA contribuiría al proceso de la memoria celular que facilita la transcripción continua de los genes expresados.
Figura 8 -38 En núcleos embrionarios en división rápida actúan un gran núm ero de orígenes de replicación. En estas electronmicrografías de cromatina descondensada de un embrión temprano de D rosophila, se observa que las burbujas de replicación [flechas) están muy próximas. En este embrión los períodos entre algunas divisiones nucleares sucesivas son de unos 10 minutos. Debido a que los orígenes de replicación utilizados son muy próximos (distan sólo unos cuantos miles de nucleótidos), sólo se requiere alrededor de un minuto para replicar el DNA existente entre ellos. (Por cortesía de Victoria Foe.)
Replicación del cromosoma
387
Factores unidos a la crom atina aseguran que cada región del DNA sólo se replique una vez26 En una fase S normal, el genoma se ha de replicar completo y una sola vez. Tal com o se ha descrito previamente, en muchas células eucariotas el proceso de replicación del DNA es asincrónico y puede durar bastante tiempo. Debido a que los orígenes de replicación se activan en diferentes momentos en diferentes regiones del cromosoma, hacia la parte media y final de la fase S, algunos ya han sido replicados completamente mientras otros aún no han empezado a hacerlo. Así pues se plantea un importante problema de “registro” durante las etapas media y final de la fase S. Aquellos orígenes de replicación ya utilizados se han duplicado, y son, al menos respecto a sus secuencias de DNA, esencialmente iguales a los que aún no se han activado. Sin embargo, en cada fase S cada ori gen de replicación debe ser utilizado una sola vez. ¿Cómo se puede controlar este proceso? Algunos experimentos de fusión celular han aportado importantes claves para la com prensión del problema. Cuando se fusionan células en fase S con células en fase G,, se induce la síntesis de DNA en el núcleo de las células en fase Gp lo cual sugiere que la transición de fase G, a S está mediada por un activador de la síntesis de DNA, que difunde. Por el contrario, cuando las células en fase S se fusionan con células en fase G2 (es decir, células que acaban de completar la fase S), en el núcleo G2 no se induce la síntesis de DNA. Dado que la síntesis de DNA continúa inalterada en el núcleo en fase S, implica que el núcleo en G2 es incapaz de iniciar nuevos procesos de replicación porque todo su DNA se en cuentra bloqueado de alguna forma. Por ejemplo, un inhibidor que no difunde de la replicación puede haberse unido fuertemente al DNA. Un inhibidor de es tas características que se uniera a la crom atina recién formada en la cola de las horquillas de replicación podría explicar el hecho de que el DNA replicado una vez no volviera a hacerlo dentro de la misma fase S (véase Figura 8-39A). Otra alternativa igualmente plausible consistiría en la existencia de unas proteínas iniciadoras o “factores permisivos”, unidas débilmente al DNA, que serían nece sarias para la replicación y que se destruirían o inactivarían por el paso de la horquilla de replicación (Figura 8-39B). Sea cual sea la naturaleza del bloqueo de la re-replicación del DNA, ha de ser eliminado en el momento de la mitosis (o un poco antes), ya que tras la división celular, el DNA del núcleo G, que aparece en las células hijas ya no está protegido de la replicación. Se ha podido observar que los fragmentos de DNA bacteriano que se repli can cuando se inyectan en un huevo fertilizado de rana pueden quedar afecta-
(A)
MODELO DE UNIÓN DE UN INHIBIDOR
(B)
Figura 8 -39 Dos m ecanism os que se han propuesto para explicar el bloqueo de la re-replicacidn. Este bloqueo, que protege al DNA replicado de una posterior replicación en el mismo ciclo celular, es crucial para marcar las zonas ya replicadas, pero se desconoce su naturaleza molecular. Normalmente, el bloqueo termina durante la mitosis, aunque en algunos tipos celulares especializados (las células salivares gigantes de D rosophila, por ejemplo) se elimina el bloqueo sin necesidad de mitosis, haciendo posible la formación de cromosomas p olitén icos gigantes. (A) Modelo basado en la adición de un inhibidor a toda la cromatina ya replicada; (B) modelo basado en la presencia de una proteína iniciadora, o “factores permisivos”, que actuarían una única vez y que deberían unirse al DNA sólo durante la mitosis.
MODELO DE SUPRESION DE UN ACTIVADOR proteínas iniciadoras unidas débilm ente
DNA
DNA
Sy hélices de DNA hijas de la crom atina protegida
proteína iniciadora inactiva
DNA sin proteínas iniciadoras
G2
LA MITOSIS PERMITE QUE SE UNAN AL DNA OTRAS PROTEÍNAS INICIADORAS
LA MITOSIS ELIMINA EL INHIBIDOR
= - # 4 = 1 el DNA del núcleo en fase Gi se puede volver a replicar
388
Capítulo 8 : El núcleo celular
el DNA del núcleo en fase Gi se puede volver a replicar
dos por un bloqueo de la re-replicación. Así pues, el mecanismo responsable del bloqueo no puede depender de un origen de replicación altamente específico. El bloqueo no afecta al virus SV40, probablemente debido a que su antígeno T su ministra tanto las funciones de iniciador com o de DNA helicasa, substituyendo a los com ponentes celulares análogos y evadiendo de este modo los controles a los que están sujetos.
A medida que el DNA se replica, se van ensamblando nuevas histonas en la crom atina27 En cada ciclo celular son necesarias una gran cantidad de histonas, aproximada mente la misma cantidad en masa que el DNA sintetizado, para formar la nueva cromatina. Por esta razón, muchos organismos poseen varias copias de cada uno de los genes de las histonas. Por ejemplo, en las células de vertebrado se en cuentran alrededor de 20 copias de un grupo de secuencias, cada uno de los cuales contiene los cinco genes de las histonas. A diferencia de lo que sucede con m uchas proteínas, que se sintetizan conti nuam ente a lo largo de toda la interfase, las histonas se sintetizan mayoritariam ente en la fase S, durante la que el nivel de los mRNA de histonas se increm en ta unas 50 veces com o resultado del efecto combinado de un aumento de la velocidad de transcripción y una reducción de su velocidad de degradación. De bido a un m ecanismo que depende de las propiedades especiales de su extremo 3 ’ (se discute en el Capítulo 9) cuando la síntesis de DNA termina al final de la fase S (o cuando se añaden inhibidores que detienen la síntesis de DNA prema turamente), los mRNA de las histonas mayores se degradan en cuestión de m i nutos. Por el contrario, las moléculas de histona son notablemente estables y pueden sobrevivir toda la vida de la célula. La estrecha relación entre la síntesis de DNA y la de histonas puede ser debida a un mecanismo de retroalimentación que controle los niveles de histonas libres asegurando que éste sea el adecuado para la cantidad de DNA de nueva síntesis. Cuando las histonas se han ensamblado en nucleosomas, raramente, o nun ca, liberan el DNA al que están unidas. Sin embargo, a medida que la horquilla de replicación avanza, ha de atravesar de alguna forma los nucleosomas pater nos, los cuales parecen estar adaptados a permitir el paso a su través tanto para la transcripción como para la replicación. Según una de las hipótesis propues tas, cada nucleosom a se dividiría durante la replicación del DNA en dos “medios nucleosom as”, permitiendo el acceso de la DNA polimerasa al DNA nucleosómico desenrollado (Figura 8-40). El DNA de nueva síntesis cercano a una horquilla de replicación hereda las histonas paternas, pero tam bién necesita de una cierta cantidad de histonas de nueva síntesis para completar su empaquetamiento en cromatina (véase Figura 8-40). Existen algunas evidencias que sugieren que un ensamblador de nucleo somas viajaría con la horquilla de replicación, empaquetando el DNA recién sin tetizado, en cuanto emerge de la maquinaria de replicación. La cromatina de nueva síntesis requiere, sin embargo, al menos una hora para estar completa mente madura; hasta este momento, por ejemplo, las histonas nuevas son más sensibles de lo normal a enzimas que son capaces de modificarlas. Desconoce mos cuáles son las diferencias químicas entre la cromatina madura y la inmadu ra, pero se cree que la maduración implica tanto modificaciones covalentes de las histonas com o unión de otras proteínas a la cromatina.
Los telómeros son secuencias cortas, repetidas, ricas en G, que se añaden al extremo de los cromosomas por acción de la telomerasa28 Como ya se ha descrito, la DNA polimerasa no puede replicar completamente el extremo de una molécula lineal de DNA de un modo ordinario, y ello ha conduciclo al desarrollo de unas secuencias de DNA especiales llamadas telómeros, situadas en el extremo de los cromosomas eucariotas. Estas secuencias que son similares
Replicación del cromosoma
389
r e g ió n c e n tr a l d e l n u c le o s o m a
D N A de d o b le cadena
EL N U C L E O S O M A SE D IV ID E Y L A S D O S V A L V A S ( M IT A D E S ) DE S U N Ú C L E O SE S E P A R A N
C U A N D O P A S A L A H O R Q U IL L A DE R E P L IC A C IÓ N SE F A B R IC A N N U E V A S C A D E N A S DE D N A
n ue vas cade nas de D N A
la s d o s m ita d e s d e la z o n a c e n tr a l d e l n u c le o s o m a s e e n c u e n tr a n u n id a s a u n a d e la s m o lé c u la s h ija s d e D N A
r e p lic a c ió n
E L N U C L E O S O M A SE V U E L V E A E N S A M B L A R
p ro n to o tro o c tá m e ro de h is to n a s se u n ir á a e s ta m o lé c u la d e D N A h ija fo rm a n d o un n u e v o n u c le o s o m a
entre sí en organismos tan diferentes como los protozoos, los hongos, las plantas y los mamíferos, consisten en muchas copias de secuencias cortas, en tándem, que contienen bloques de G. En humanos esta secuencia es GGGTTA. El problema de replicar los extremos de los cromosomas está resuelto de manera ingeniosa por acción de la enzima telom erasa. Esta enzima reconoce la cadena rica en G de una secuencia telomérica repetida y la alarga en dirección 5’ a 3 ’. En ausencia de una cadena de DNA complementario, la telomerasa sinteti za una copia de la secuencia repetida empleando un molde RNA que es un com ponente de la propia enzima. La enzima contiene, por tanto, la información ne cesaria para m antener las características de la secuencia telomérica. Después de varios ciclos de extensión por la telomerasa, se puede completar la replicación del extremo del crom osom a empleando dichas extensiones como molde para la síntesis de la cadena complementaria por la DNA polimerasa (Figura 8-41). Dado que el proceso de recorte y recuperación de las secuencias del telómero está equilibrado sólo aproximadamente, cada extremo de cromosoma contiene un número variable de repeticiones en tándem, que, en general, son de varios cientos de pares de bases de longitud.
Resumen
Estudios in v itro del virus de simio SV40 como sistema modelo sugieren que tanto en las células eucariotas como en las procariotas la replicación del DNA se inicia con la unión al DNA de una DNA helicasa, mediada por una proteína iniciadora que, a su vez, se halla unida al origen de replicación. En el origen de replicación se forma una burbuja de replicación por efecto de dos horquillas de replicación que se alejan una de la otra. En los eucariotas superiores, parece que durante la fase S los orígenes de replicación vecinos se activan en grupos, denominados unidades de re plicación, cuyos orígenes se hallan separados unos 100 000 nucleótidos de media. Dado que la horquilla de replicación se desplaza a unos 50 nucleótidos por segun do, sólo se necesitaría una hora para la síntesis de DNA de una unidad de replica ción. A través de una fase S típica de 8 horas se van activando las diferentes unida390
Capítulo 8 : El núcleo celular
Figura 8 -40 Modelo especulativo que m uestra cóm o se podría abrir un nucleosoma para perm itir la replicación del DNA. Después de que pase la horquilla de replicación, el nucleosom a se reensamblaría. De este modo las histonas del núcleo permanecerían en todo momento unidas al DNA. A pesar de que según el diagrama los viejos nucleosom as se heredan intactos por la hélice de DNA sintetizada sobre la cadena conductora, existen evidencias de que el nucleosom a se ha heredado intacto por cualquiera de las dos hebras hermanas de la molécula de DNA. Asimismo, éste es solamente uno de los muchos modelos diferentes posibles.
cadena paterna ] TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTG ] AACCCCx 5' cadena recién sintetizada, incompleta LA TELOMERASA SE UNE □ TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTG síntesis por □ AACCCC ^A C ( acción de la 5' telomerasa LA TELOMERASA ALARGA LOS EXTREMOS 3‘ telomerasa con RNA patrón unido (síntesis de DNA sobre un molde RNA) rG G G G T T G G G G T T G G G G T T G G G G T T G G G G □ AACCCC
5'
TERMINACION DE LA CADENA RETRASADA POR LA DNA POLIMERASA (síntesis de DNA sobre un molde DNA) J TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTG GGGTTGGGGTTG UAACCCC
CCCCAACCCCAACCCC
DNA polimerasa
des de replicación siguiendo una secuencia determinada en parte por la estructura de su cromatina, siendo las regiones más condensadas de la cromatina las últimas en iniciar su replicación. La correspondencia entre unidades de replicación y las bandas que contienen millones de pares de bases observadas en los cromosomas mitóticos eucariotas sugieren que las unidades de replicación podrían correspon der a dominios estructurales diferentes de la cromatina interfásica. Después de que pase la horquilla de replicación, la estructura de la cromatina se recupera mediante la adición a las antiguas histonas heredadas por las molécu las de DNA hijas, de nuevas histonas y de otras proteínas cromosómicas. Se produce un bloqueo local de la re-replicación, de naturaleza desconocida, que impide que se produzca una nueva replicación de las regiones ya replicadas, hasta que el cromo soma pase por una mitosis; este bloqueo es necesario para asegurar que cada re gión de DNA se replique una sola vez en cada fase S. La replicación de los extremos de los cromosomas se resuelve con una estructu ra terminal especializada (el telómero) y una enzima (la telomerasa) que extiende esta estructura utilizando un molde RNA que es parte de la propia telomerasa.
Figura 8-41 R eplicación del telóm ero. La figura resume las reacciones implicadas en la formación de las secuencias repetidas ricas en G que forman los extremos de los cromosomas (telómeros) de diversos organismos eucariotas, tal como sugieren los experimentos realizados en el ciliado T etrahym en a. La cadena incompleta recién sintetizada es copiada en la cadena retrasada de la horquilla de replicación (véase Figura 6-41). Como se ha indicado, la telomerasa es un com plejo de proteína y RNA que contiene un patrón de RNA para la síntesis de una secuencia telomérica rica en G. Estas repeticiones son GGGTTG en T etrahym ena, pero son GGGTTA en humanos y G,.3A en la levadura S accharom yces cerevisiae. Se cree que la cadena retrasada se com pleta con la acción de la DNA polimerasa a, que porta la actividad primasa en una de sus subunidades (véase Figura 8-35).
Síntesis y procesamiento del RNA Hasta aquí hemos considerado de qué forma se organizan los cromosomas en grandes complejos de DNA y proteínas, y cómo se duplican estos complejos an tes de que una célula se divida. Sin embargo, la principal función de un crom o soma es actuar como un molde para la síntesis de moléculas de RNA, ya que sólo así la célula puede utilizar la información genética almacenada en los crom oso mas. En la célula se produce una gran cantidad de síntesis de RNA: la velocidad a la que se incorporan los nucleótidos al RNA durante la interfase es 20 veces m a yor que la velocidad a la que se incorporan al DNA durante la fase S. La síntesis de RNA, también denominada transcripción del DNA, es un pro ceso muy selectivo. En la mayoría de las células de mamífero sólo se copian a se cuencias de RNA funcionales (RNA mensajero maduro o RNA estructural) alrede dor del 1% de las secuencias de nucleótidos del DNA. La selección tiene lugar a dos niveles, que se abordarán, por ese orden en esta sección: (1) se transcribe sólo una parte de la secuencia de DNA, produciendo RNA nucleares, y (2) tan sólo una pequeña porción de las secuencias de nucleótidos de los RNA nucleares so brevive todas las etapas del proceso de maduración del RNA que preceden a la exportación de las moléculas de RNA al citoplasma. Comenzaremos describiendo las RNA polimerasas, las enzimas que catalizan toda la transcripción del DNA.
Síntesis y procesamiento del RNA
391
subunidad ß' de E. co li (1407 am inoácidos) h 2n I
H2N
M
II I M lib-1
COOH
lili
levadura
H2N
COOH
DE
D rosophila
1 BU.
__
EDOOO3000 cooH
Las RNA polímerasas intercam bian subunidades cuando inician cada cadena de RNA29 Como se describió someram ente en el Capítulo 6, la transcripción se inicia cuando la molécula de RNA polimerasa se une a una secuencia prom otora del DNA de doble hélice. A continuación, en una etapa de iniciación compleja no bien comprendida, las dos cadenas de DNA se separan localmente formando un complejo abierto. En esta etapa la cadena molde queda expuesta, y puede ini ciarse la síntesis del RNA complementario. Entonces la polimerasa empieza a desplazarse a lo largo de la cadena molde, extendiendo la cadena de RNA en cre cimiento en la dirección 5 ’ a 3 ’ mediante la adición secuencial de ribonucleótidos trifosfato, hasta que alcanza una señal de paro (terminación o stop) momento en el que la cadena de RNA formada y la molécula de RNA polimerasa se separan del DNA. Cada molécula de RNA representa, pues, una copia en cadena sencilla de la secuencia nucleotídica de una cadena de DNA de una región relativamente pequeña del genoma (véase Figura 6-2). Este segmento transcrito de DNA se de nomina unidad de transcripción. Generalmente las RNA polímerasas están formadas por múltiples cadenas polipeptídicas de pesos moleculares de 500 000 daltons o más. Las enzimas de bacterias y de eucariotas están relacionadas evolutivamente (Figura 8-42). Debido a que la enzima bacteriana ha resultado más fácil de estudiar, sus propiedades proporcionan una base para la comprensión de sus enzimas homologas euca riotas. La enzima de E. coli contiene 4 subunidades diferentes: a, p, P‘, y o; existen dos copias de la subunidad a y una de cada una de las demás. Se ha determinado la secuencia de aminoácidos de cada una de estas subunidades a partir de la de term inación de la secuencia de nucleótidos de su gen. La subunidad sigma (a) de la polimerasa de E. coli juega un papel específico en la iniciación de la transcripción; permite a la enzima encontrar las secuencias promotoras a las que se ha de unir. Después de que se sinteticen alrededor de 8 nucleótidos de una molécula de RNA, la subunidad o se libera (etapa 4 en la Fi gura 8-43), y en su lugar se unen a la polimerasa una serie de factores de elonga-
Figura 8-4 2 Origen com ún de las RNA polím erasas bacterianas y eucariotas. La similitud de las secuencias de aminoácidos entre la subunidad ß’ de la RNA polimerasa de E. coli y la subunidad mayor de la RNA polimerasa II eucariota sugiere un origen evolutivo com ún para las enzimas de bacterias y de células eucariotas. Se cree que la subunidad ß’ se une al DNA. Las secuencias de las regiones destacadas com o b arras verdes tienen una homología superior al 70% entre levadura y D rosophila, y más del 40% entre D rosop h ila y E. coli. Una secuencia única de función desconocida (de siete aminoácidos) se repite 26 veces en el extremo carboxilo de la subunidad de levadura y más de 40 veces en la subunidad de D rosop h ila (lo cual se indica aquí mediante círcu los verdes). Estas repeticiones se fosforilan com o parte del proceso que inicia la síntesis de una cadena de RNA en eucariotas (véase Figura 9-30). (De A.L. Greenleaf et al., en RNA Polymerases and the Regulation of Transcription [W.S. Reznikoff et al., eds.l, pp. 459-464, New Yorl, Elsevier, 1987.)
subunidad o
\
form a inicial de la RNA polimerasa DNA com plejo cerrado
com plejo abierto Figura 8-43 Diagrama esquemático de las etapas de la iniciación de la síntesis de RNA (transcripción del DNA) catalizada por la RNA polimerasa. Las etapas que se indican se han descrito gracias a estudios realizados sobre la enzima de E. coli. Se muestra una molécula de DNA que contiene una secuencia promotora para la polimerasa de E. coli. La enzima forma en primer lugar un com plejo cerrado en el que las dos cadenas de DNA permanecen completamente apareadas. En la siguiente etapa, la enzima cataliza la separación de las dos cadenas un poco más de una vuelta de la hélice de DNA, formando un com plejo abierto en el que el molde queda expuesto para el inicio de la cadena de RNA. Sin embargo la polimerasa que lleva unida la subunidad c se comporta como si estuviera fijada al promotor: parece incapaz de avanzar con la elongación de la cadena de RNA y frecuentemente revierte al complejo cerrado liberando una corta cadena de RNA. Tal como se indica, la conversión a una polimerasa activa que alarga la cadena de RNA requiere la liberación de los factores de iniciación (la subunidad o en el caso de la enzima de E. coli) y generalmente supone la unión de otras proteínas que actúan como factores de elongación.
392
Capítulo 8 : El núcleo celular
UNION DE LOS FACTORES DE ELONGACIÓN
LIBERACION DE LA SUBUNIDAD g
form a de la RNA polimerasa en fase de elongación 4
SINTESIS M ASIVA DE RNA
ción -q u e son importantes para el crecimiento y la terminación de la cadena. Los factores de elongación incluyen algunas proteínas que, aunque bien carac terizadas, tienen funciones aún no comprendidas completamente. El inicio de la transcripción es un punto de control importante mediante el cual la célula pue de regular la expresión de un gen; por esta razón se discutirá en detalle en el Ca pítulo 9.
En las células eucariotas, el RNA se sintetiza por tres RNA polim erasas diferentes30 El mecanismo de la transcripción del DNA es similar en células eucariotas y en células procariotas como E. coli, pero la maquinaria es considerablemente más compleja en los eucariotas. En eucariotas tan diversos como levadura y el hom bre, por ejemplo, hay tres tipos de RNA polimerasas, cada uno de los cuales es responsable de la transcripción de diferentes grupos de genes. Estas enzimas -denom inadas RNA polimerasas I, II y III- son estructuralmente similares entre sí y tienen algunas subunidades en común aunque otras subunidades son caracte rísticas de cada una de ellas. Cada una de estas enzimas es más compleja que la RNA polimerasa de E. coli y se cree que están formadas por 10 o más cadenas polipeptídicas. Otra diferencia importante entre la enzima bacteriana y la eucariota es que, mientras la enzima bacteriana purificada puede unirse directamente al promotor, las polimerasas eucariotas requieren la presencia de proteínas de ini ciación adicionales que se unan al DNA antes de que la enzima pueda hacerlo. Es por ello que hasta 1979 no fueron accesibles sistemas con todos los componentes necesarios para hacer posible el estudio in vitro de los mecanismos de iniciación en células eucariotas. Dado que las proteínas de iniciación y sus interacciones con las polimerasas están íntimamente relacionadas con el control del inicio de la transcripción, se discutirán en detalle en el Capítulo 9. Inicialmente, las tres RNA polimerasas eucariotas se diferenciaron entre sí por sus diferencias químicas durante la purificación así como por su sensibilidad a a-amanitina, una toxina aislada a partir del hongo venenoso Amanita phalloides. La RNA polimerasa I no se ve afectada por la a-am anitina, la RNA polimerasa II es muy sensible a la toxina y la RNA polimerasa III es moderadamente sensible. La sensibilidad de la síntesis de RNA a la a-am anitina es todavía un método habi tual para determinar qué polimerasa es la responsable de la transcripción de un determinado gen. Estos estudios indican que todos los genes cuyos mRNA serán traducidos posteriormente a proteína, son transcritos por la RNA polim erasa II. Las otras dos polimerasas transcriben exclusivamente RNA que tiene funciones catalíticas o estructurales principalmente como parte de la maquinaria de sínte sis de proteínas: la polim erasa I produce los RNA ribosómicos de gran tamaño y la polim erasa III produce una cierta variedad de RNA de pequeño tamaño y muy estables -incluyendo el pequeño RNA ribosómico 5S y los RNA de transferencia. Sin embargo, la mayor parte de los RNA pequeños que forman las snRNP, que serán descritas más adelante cuando se considere el procesamiento de RNA, son transcritos por la RNA polimerasa II. Las células de mamífero contienen típicamente alrededor de 20 000 a 40 000 moléculas de cada una de las RNA polimerasas, y los resultados de estudios rea lizados con células en cultivo muestran que las concentraciones de dichas enzi mas están reguladas individualmente de acuerdo con la velocidad de crecim ien to celular.
La RNA polim erasa II transcribe algunas secuencias de DNA m ucho más frecuentem ente que otras31 Dado que la RNA polimerasa II es la que sintetiza todos los precursores de mRNA y por ello determina qué proteínas sintetizará una célula, la mayor parte de la descripción que sigue se centrará en sus actividades y en las características de sus productos. Aunque los experimentos realizados con polimerasas purifíca
Síntesis y procesamiento del RNA
lo pm Figura 8 -4 4 Un núcleo celular típico visualizado m ediante microscopía electrónica utilizando el procedimiento descrito en la Figura 8-45. Se puede observar cóm o sale del núcleo Usado una gran cantidad de cromatina. Sólo la cromatina más externa de esta maraña estará suficientem ente descondensada como para que sea posible observarla con detalle a mayor aumento. (Por cortesía de Victoria Foe.)
393
das y factores de transcripción in vitro son esenciales para establecer el m eca nismo de la transcripción, también se pueden aprender muchos aspectos del patrón de transcripción de una célula, observando al microscopio electrónico genes en acción, con su RNA polimerasa “cazada” en el acto de transcripción. Electronmicrografías de secciones ultrafínas de núcleos interfásicos mues tran acúmulos granulares de cromatina (véase Figura 8-71), pero revelan muy poco acerca de cómo son transcritos los genes. Se obtienen imágenes mucho más informativas si se rompe el núcleo y se extiende la cromatina sobre una reji lla portamuestras del microscopio electrónico (Figuras 8-44 y 8-45). En el punto más alejado del núcleo Usado la cromatina está lo suficientemente descondensada como para poder observar las estructuras de fibras de cromatina en cuen tas ensartadas que se mostró previamente en la Figura 8-9B. Las moléculas de RNA polimerasa implicadas en la transcripción aparecen como partículas globulares unidas a una molécula de RNA. Habitualmente las partículas que representan moléculas de RNA polimerasa II activas se observan como unidades individuales, sin moléculas vecinas. Esto indica que la mayoría de los genes se transcriben con poca frecuencia a precursores de mRNA, de modo que la RNA polimerasa finaliza completamente la transcripción antes de que otra molécula la inicie de nuevo. Sin embargo, en ocasiones se ha observado que mu chas moléculas de RNA polimerasa (y sus transcritos de RNA asociados) se hallan juntas, formando un grupo. Estos grupos aparecen sobre los relativamente pocos genes que se transcriben con gran frecuencia (Figura 8-46). La longitud de las moléculas de RNA que se unen a estos grupos se incrementa en el sentido de la transcripción, produciendo un patrón característico. Este patrón define el lugar de inicio y de paro de la RNA polimerasa II para una unidad transcripcional espe cífica (Figura 8-47). Estudios bioquímicos han confirmado y ampliado los resultados obtenidos con la microscopía electrónica, llegándose a tres conclusiones principales : 1. Las moléculas de RNA polimerasa de células eucariotas, como ocurre con las de los procariotas, inician y terminan la transcripción en lugares especí ficos del cromosoma. 2. La longitud media de la molécula de RNA ya terminada, producida por la RNA polimerasa II en una unidad de transcripción, es de aproximadamente 7000 nucleótidos, aunque son bastante frecuentes las moléculas de RNA de longitudes que oscilan entre 10 000 y 20 000 nucleótidos. Estas longitudes, superiores a los 1200 nucleótidos de RNA necesarios para codificar una proteína media de 400 aminoácidos, ponen de manifiesto que la estructura de los genes eucariotas es peculiar, particularmente debido a la presencia de largos intrones, que, como se verá más adelante, son eliminados posterior mente del RNA. 3. Aunque la velocidad de crecimiento de la cadena observada para todos los RNA es de alrededor de 30 nucleótidos por segundo, diferentes sitios de i .
1 Jim
394
Capítulo 8 : El núcleo celular
gota que contiene células a baja concentración de sales
+ detergente + polianión
rápidam ente se recubren con una solución concentrada de sacarosa recipiente / " d e plástico isado celular
los núcleos se lisan lentam ente y la crom atina se descondensa centrifugación restos celulares núcleos lisados lim pios
rejilla con los núcleos lisados
contrastado y éi'T'ñTm som breado con metales pesados o b se rv a ció n de la cro m atin a ai rr1i c r o s c o ¡j i o e íe c t r' o ri íe o
Figura 8-45 Método para exam inar la crom atina de un núcleo celular mediante m icroscopia electrónica. Los núcleos son primero lisados, se eliminan los restos celulares y la cromatina se extiende sobre una rejilla.
Figura 8-46 Electronmicrografía de una región de crom atina portadora de un gen que está siendo transcrito a una frecuencia extraordinariamente elevada. Se pueden observar muchas moléculas de RNA polimerasa II con sus transcritos en crecimiento. La dirección de la transcripción es de izquierda a derecha (véase Figura 8-47). (De V.E. Foe, L. E. Wilkinson y C.D. Laird, Cell 9:131-146,1976. © 1976 Cell Press.)
Tabla 8-2 Población de moléculas de mRNA de una célula de mamífero típica Copias p o r célu la de ca d a secu en cia de mRNA
Clase abundante Clase intermedia Clase poco frecuente
12 000 300 15
N úm ero de secu en cias de mRNA diferentes de ca d a clase
X X X
4 500 11000
N úm ero total de m oléculas de mRNA de ca d a clase
= = =
transcrito de RNA unido dirección de desplazam iento \ de la polim erasa y de crecim iento de la cadena de RNA
48 000 150 000 165 000
La clasificación de los mRNA en sólo tres clases discretas es bastante arbitraria; en muchas cé lulas se observa una distribución más continua en cuanto a abundancia se refiere. Sin embargo, en una célula se pueden observar un total de 10 000 a 20 000 especies diferentes de mRNA, es tando la mayor parte de ellas presentes a concentraciones muy bajas (de 5 a 15 moléculas por célula). La mayor parte del RNA citoplasmático es rRNA, y sólo del 3 al 5% es mRNA, una rela ción consistente con la presencia de alrededor de 10 ribosomas por molécula de mRNA. Este tipo particular de célula de mamífero contiene en su citoplasma alrededor de 360 000 molécu las de mRNA.
inicio para RNA polimerasa II tienen diferentes frecuencias de iniciación, de forma que ciertos genes se transcriben con frecuencias más elevadas que otros. Como se indica en la Tabla 8-2, la mayoría de los genes que se transcriben sólo forman unas cuantas moléculas de mRNA.
RNA poli •JPfe
J
rr \
señal inicio
D N A de de Figura 8 -47 Unidad de transcripción idealizada. El esquema muestra cómo la imagen obtenida con el microscopio electrónico (véase Figura 8-46) demuestra tanto la dirección de la transcripción com o los lugares de inicio y final de la unidad.
Los precursores de los RNA m ensajeros son modificados covalentemente en sus dos extremos32 En las células eucariotas el mRNA se produce en varias etapas. Las moléculas de RNA recién sintetizadas en el núcleo por la RNA polimerasa II se denominan transcritos primarios-, a todos estos transcritos se les dio el nombre de RNA hete rogéneo nuclear (hnRNA) por la gran variabilidad que existía en el tamaño del RNA, en contraste con el menor tamaño y más uniforme de las secuencias de RNA que codifican proteínas. En seguida veremos que la mayor parte de esta va riabilidad se debe a la presencia de largas secuencias intrónicas en los transcri tos primarios. Estos transcritos son modificados en sus extremos 5’ y 3 ’ a medida que se sintetizan, de una forma característica que los diferencia claramente de los producidos por las otras RNA polimerasas. Estas modificaciones se utilizarás posteriormente en el citoplasma como señales de que dichos transcritos han de ser traducidos a proteínas. En primer lugar, al extremo 5 ’ de la m olécula de RNA (el primer extremo sin tetizado durante la transcripción) se le añade una caperuza (cap) mediante la adición de un nucleótido G metilado. Esta modificación (capping) ocurre casi inmediatamente, después de que se hayan sintetizado tan sólo unos 30 nucleótidos, y supone la condensación del grupo trifosfato de una molécula de GTP con un difosfato del extremo 5 ’ del transcrito inicial (Figura 8-48). Posteriormente, esta caperuza 5’ jugará un papel importante en la iniciación de la síntesis de Figura 8 -48 Reacciones de formación de la caperuza en el extrem o 5’ de los transcritos de la RNA polim erasa II. El extremo en caperuza final contiene un nuevo enlace 5 ’-5 ’ entre el residuo 7-metil G cargado positivamente y el extremo 5 ’ del transcrito RNA (véase Figura 6-26). Se cree que al menos algunas de las enzimas necesarias para este proceso están unidas a la RNA polimerasa II, ya que a los transcritos de las RNA polimerasas I y III no se les añaden caperuzas, y a que esta reacción tiene lugar muy poco después de iniciarse la transcripción de la cadena de RNA. La letra N se utiliza para representar cualquiera de los cuatro ribonucleótidos, aunque el nucleótido que suele iniciar una cadena de RNA suele ser una purina (A o G). (De A.J. Shatkin, B ioessays 7 :2 1 5 -2 1 1 ,1987. © ICSU Press.)
Síntesis y procesamiento del RNA
extrem o 5' del transcrito mRNA 5' 3' pppNpNp "¡■"■i
p p N p N pi a
E33
^
pp¡
G pppN pN pi añadir un grupo de m etilo a la base
©
CH 3 —GpppNpNp
CH3
añadir un grupo de m etilo a la ribosa
©
-G pppN pN p I
CH3
395
factor de elongación RNA polimerasa II | 7 lugar de inicio del RNA
transcrito de RNA naciente
Figura 8-49 Síntesis de un transcrito prim ario de RNA (un precursor de mRNA) por la RNA polim erasa II. Este
lugar de unión de las colas poli-A
DNA
FORMACION DE LA CAPERUZA
ELONGACION DE LA CADENA 5' cap
© Gppp
CORTE
©Gppp
EL CRECIMIENTO DE LA CADENA CONTINÚA, PERO EL TRANSCRITO CARECE DE CAPERUZA EN EL EXTREMO 5' Y ES DEGRADADO RÁPIDAMENTE
ADICION DE COLAS POLI-A
©Gppp « !____ I
5' cap
TERMINACION .AP^AAAAA4 oh
3' l____________________ poli A
transcrito prim ario de RNA (precursor de mRNA)
proteínas; además, parece que esta caperuza proteje al transcrito de RNA en cre cimiento de su degradación. En muchos transcritos de RNA polimerasa II, el extremo 3’ se define no por el final de la transcripción sino por una segunda modificación, según la cual el transcrito en crecimiento es cortado en un lugar específico y al extremo 3 ’ cortado se le añade una c a d e n a d e poli-A mediante la acción de una polimerasa diferente. La señal para el corte consiste en la aparición en la cadena de RNA de la secuen cia AAUAAA localizada entre 10 y 30 nucleótidos por delante del lugar de corte, además de unas secuencias poco caracterizadas por detrás del lugar de corte. In mediatamente después del corte, una enzima polimerasa de poli-A añade de 100 a 200 residuos de ácido adenílico (en forma de poli-A) al extremo 3’ de la cadena de RNA completando el tr a n s c r ito p rim a rio d e RNA. Sin embargo, la polimerasa continúa transcribiendo de forma infructuosa durante cientos o miles de nu cleótidos, hasta que se produce el final de la transcripción en alguno de los lu gares de term inación posteriores; probablem ente, la molécula extra de RNA generada de esta forma carecerá de la caperuza en 5 ’ y será degradada rápida mente (Figura 8-49). La cola poli-A parece tener varias funciones. (1) Como se describirá des pués, colabora en la exportación del mRNA maduro desde el núcleo; (2) se cree que influye en la estabilidad de al menos algunos mRNA en el citoplasma; (3) pa rece servir como una señal de reconocim iento para el ribosoma que se requiere para una traducción eficiente del mRNA. Esta última función -e n combinación con la caperuza 5 ’- podría permitir a un ribosoma determinar si el mRNA está intacto antes de consumir energía y precursores al iniciar su traducción. Aunque los transcritos de la RNA polimerasa II suponen más de la mitad del RNA que sintetiza una célula, como se verá más adelante estos transcritos son
396
Capítulo 8 : El núcleo celular
diagrama se inicia con una polimerasa que acaba de empezar la síntesis de una cadena de RNA (etapa 4 de la Figura 8-43). El reconocimiento de una señal de poliadenilación provoca el corte de la cadena en crecimiento y la poliadenilación. En las levaduras, la polimerasa termina la síntesis poco después, pero en las células eucariotas superiores frecuentemente continúa la transcripción durante miles de nucleótidos más. Parece que cuando la RNA polimerasa ha poliadenilado el transcrito, cambia sus propiedades; ya no es capaz de seguir cortando y poliadenilando las secuencias posteriores, y tiene una mayor probabilidad de responder a las señales de terminación de la cadena y de liberarse. La hipótesis más simple, que se presenta en la figura, es que después del corte del transcrito se libere un factor de elongación (o más de uno) de la polimerasa.
Tabla 8-3 Datos seleccionados sobre cantidades de RNA en una célula de mamífero típica
Precursores del rRNA nuclear
Cantidad constante (porcentaje del RNA celular total)
Porcentaje de la síntesis de RNA total
4
39
1 rRNA citoplasm ático
71
-
hnRNA nuclear
7
- 58
mRNA citoplasm ático
3
-
RNA pequeños estables (la m ayor parte tRNA)
15
3
Los datos incluidos en la tabla proceden del análisis de una línea celular de fibroblastos de ra tón (células L) en cultivo. Cada célula contiene 26 pg de RNA (5 x 1010 nucleótidos de RNA), de los cuales alrededor del 14% están localizados en el núcleo celular. (Así pues, el núcleo contie ne unas dos veces más DNA que RNA.) Durante la interfase, cada minuto polimerizan a RNA una media de 200 x 106 nucleótidos, lo cual corresponde aproximadamente a 20 veces la veloci dad de síntesis de DNA durante la fase S. Hay que destacar que aunque la mayor parte del RNA sintetizado sea hnRNA, la mayor parte se degrada en el núcleo. Como resultado de ello, el mRNA producido a partir del hnRNA es sólo una fracción minoritaria del RNA total de la célula. (Modificado de B.P. Brandhorst y E.H. McConkey,/. Mol. Biol. 85:451-563,1974.)
inestables, y por lo tanto de vida corta. Así pues, el hnRNA del núcleo celular y el mRNA citoplasmático, derivado de él, sólo constituyen una pequeña parte del total de RNA de una célula (Tabla 8-3). A pesar de que su concentración es relati vamente baja, estas moléculas de RNA se pueden purificar de forma eficiente gracias a la presencia de sus largas colas de poli-A. Cuando se hace pasar una mezcla de RNA celular total a través de una columna cromatográfica llena de poli dT unido a un soporte sólido, el apareamiento complementario de las bases entre T y A hace que las moléculas que presentan colas poli-A queden retenidas en la columna; posteriormente, estas moléculas unidas pueden liberarse para su análisis. Este procedimiento se utiliza ampliamente para separar las moléculas de hnRNA y de mRNA de las de RNA ribosómico y de RNA de transferencia, pre dominantes en la célula. Únicam ente tienen caperuzas 5 ’ y colas poli-A los transcritos de la RNA polimerasa II. Esto parece deberse a que tanto la reacción de formación de la cape ruza como la de adición de poli A son llevadas a cabo por enzimas que se unen selectivamente a la RNA polimerasa II. Así pues, si un gen que normalmente se transcribe por la polimerasa II, se separa de su promotor mediante métodos de DNA recom binante y se une a un promotor reconocido por la RNA polimerasa I o por la polimerasa III, los transcritos de RNA producidos por dichas polimerasas no serán modificados por adición de caperuzas o poliadenilados. Los requeri mientos para la formación de la caperuza y para la poliadenilación de los pre cursores de los mRNA podría explicar por qué en los eucariotas estos RNA son sintetizados por un tipo específico de RNA polimerasa.
El procesamiento del RNA elim ina largas secuencias nucleotídicas del interior de las moléculas de RNA33 El descubrimiento en 1977 de los genes interrumpidos fue completamente ines perado. Estudios previos realizados en bacterias mostraron que sus genes esta ban formados por una cadena continua de nucleótidos, necesarios para codifi car la secuencia de aminoácidos de una proteína, y no parecía existir ninguna
Síntesis y procesamiento del RNA
397
razón obvia para que un gen tuviera que estar organizado de otra manera. Los primeros indicios de que los genes de células eucariotas no eran continuos como los genes bacterianos se produjeron cuando los nuevos métodos que permitieron comparar con precisión las secuencias de DNA y de mRNA se aplicaron a los mRNA producidos por un adenovirus humano (un virus DNA de gran tamaño). La región del DNA vírico responsable de la codificación de estos RNA contenía secuencias que no se encontraban en los RNA maduros. Rápidamente se descar tó la posibilidad de que ésta fuera una característica propia de los virus, ya que se encontraron resultado similares en el gen de la (3-globina y en el de la ovoalbúmina de vertebrados. Como se ha citado previamente, las secuencias presentes en el DNA y omitidas en el RNA se conocen como intrones, mientras que las presentes en ambas moléculas se denominan exones (véanse Figuras 8-50 y 8-51). Antes del descubrimiento de los intrones era un misterio el significado del hnRNA y su relación con el mRNA. Se conocía desde hacía tiempo que la mayor parte del RNA sintetizado por la RNA polimerasa II era degradado con rapidez en el núcleo. Las moléculas de hnRNA de células en cultivo pueden ser m arca das radiactivamente por exposición breve a uridina-3H y seguidas durante un largo período de tiempo. Este tipo de experimento mostró que el tamaño medio de las moléculas de hnRNA en la población marcada decrece con rapidez, desde una media de 7000 nucleótidos, hasta alcanzar el tamaño de las moléculas de mRNA citoplasmáticas (una media de 1500 nucleótidos) después de sólo 30 m i nutos; aproximadamente al mismo tiempo, moléculas de RNA marcadas radiac tivamente empezaban a abandonar el núcleo como moléculas de mRNA. Sin embargo, tan sólo el 5% de la masa del hnRNA marcado alcanzaba alguna vez el citoplasma; el resto se degradaba en pequeños fragmentos en el núcleo a lo lar go de un período de una hora. Parecía un extraño derroche. El misterio se hizo aún mayor cuando se supo que a pesar de que las moléculas de hnRNA se ha cían cada vez más cortas, m antenían su caperuza 5’ y su cola poli-A en 3 ’. El descubrimiento de los intrones aportó la explicación de este misterio; el transcrito primario de RNA es una copia completa del gen, que contiene tanto las secuencias de los exones como de los intrones, y estas últimas se eliminan del interior del transcrito de RNA produciendo una molécula de mRNA que co difica directamente una proteína (véase Figura 3-15). Las secuencias codifican tes de RNA de cada extremo de la secuencia de un exón se unen con las del exón adyacente eliminado las secuencias de intrón comprendidas entre ellas, siguien do una reacción denominada m aduración del RNA por corte y empalme (RNA splicing). La maduración del RNA tiene lugar en el núcleo, fuera del alcance de los ribosomas; el RNA se exporta al citoplasma únicamente cuando el procesa miento ya ha terminado. Debido a que muchos genes de mamífero contienen mucha más cantidad de secuencia de intrones que de exones (véase Tabla 8-1, pág. 365), la madura ción del RNA puede explicar la conversión de moléculas de hnRNA muy largas en moléculas de mRNA citoplasmático mucho menores. Antes de discutir la distribución de los intrones en los genes eucariotas y al gunas de sus consecuencias para la función celular, es necesario explicar de qué forma la maquinaria enzimàtica de la maduración del RNA reconoce y elimina las secuencias de los intrones.
Los transcritos hnRNA son inm ediatam ente recubiertos por proteínas y snRNP34 A diferencia de lo que ocurre en las bacterias, en los eucariotas parece que el RNA recién sintetizado se condensa inmediatamente formando una serie de partículas ribonucleoproteicas muy próximas. Cada una de ellas está formada por unos 500 nucleótidos de RNA recubiertos de un abundante complejo de pro teínas que actúa empaquetando y condensando todos los transcritos de RNA en crecimiento, de una forma que recuerda a los complejos de DNA y proteínas de los nucleosomas. Estas partículas hnRNP (de Heterogeneous Nuclear Ribonu-
398
Capítulo 8 : El núcleo celular
Figura 8 -50 Prim era evidencia de la existencia de intrones en los genes eucariotas. La evidencia fue aportada
por la técnica de los “bucles R” mediante la cual al microscopio electrónico se visualizan complejos de mRNA y DNA apareados. Se purifica un mRNA extraordinariamente abundante, como el de la (3-globina o el de la ovoalbúmina, a partir de las células especializadas que lo producen. Cuando esta preparación de mRNA de cadena sencilla se híbrida, en una solución apropiada, con un fragmento de DNA clonado de doble cadena que contiene el gen que codifica el mRNA, el RNA puede desplazar una de las cadenas del DNA e hibridarse en las regiones en las que exista una complementariedad de secuencia, formando regiones de hélice DNA-RNA. Las regiones de DNA que no se hibridan con las secuencias de RNA se visualizan claramente como bucles de DNA de doble cadena. Cada uno de estos bucles (numerados del 1 al 6) corresponden a un intrón de la secuencia del gen.
Figura 8-51 Región transcrita del gen de la (3-globina hum ana. Se indica la secuencia de la cadena de DNA que corresponde a la secuencia de mRNA, con la secuencia correspondiente al transcrito primario limitada por una línea de color verde y los nucleótidos de las tres regiones codificantes (exones) som b rea d o s en am a rillo . Es de destacar que el exón 1 comprende una secu en cia líd er 5 ’, y que el exón 3 comprende una secu en cia 3 ’ no trad u cid a; aunque estas secuencias se hallan en el mRNA no codifican aminoácidos. Se han recuadrado los nucleótidos GT y AG, muy conservados, en el inicio y final de los intrones (véase Figura 8-53); también se señala con un recuadro el lugar de corte del transcrito primario y la señal de poliadenilación cerca del extremo 3 ’ del gen (AATAAA, véase Figura 8-49).
cleoprotein Partióles, partículas ribonucleoproteicas nucleares heterogéneas) re sultantes pueden ser purificadas después de tratar ligeramente los núcleos con ribonucleasas a concentraciones suficientes para degradar sólo el RNA espacia dor que existe entre ellas. Cada partícula tiene un diámetro de unos 20 nm, que es el doble del de un nucleosoma, y el núcleo proteico, mucho más complejo y menos caracterizado, está formado al menos por ocho proteínas distintas. A ex cepción de las histonas, las proteínas que forman este núcleo son las más abun dantes del núcleo de la célula. Algunas de ellas contienen un dominio de unos 80 aminoácidos, repetido frecuentemente, y común a muchas otras proteínas de unión a RNA. Las partículas hnRNP suelen distorsionarse por las técnicas clásicas de pre paración de extensiones de cromatina para la observación al microscopio elec trónico de genes en fase de transcripción (véase Figura 8-45). Sin embargo estas micrografías revelan la existencia sobre muchos transcritos de RNA de unas par tículas especialmente estables y menos frecuentes, cuya posición sugiere que juegan un papel en la maduración del RNA. Estas partículas se generan muy rá pidamente sobre secuencias específicas de RNA -e n las uniones intrón-exón o cerca de ellas- y, cuando el transcrito crece, estas partículas se unen en parejas dando lugar a un complejo mayor que se cree es el espliceosoma (de “splicing”, maduración), que cataliza la maduración del RNA (Figura 8-52). Análisis bioquímicos han revelado que en el núcleo se encuentran muchos com plejos de proteínas con pequeñas moléculas de RNA (generalmente RNA de 250 nucleótidos o menos). A estos complejos se les denomina arbitrariamente RNA U l, U 2 ,..., U12. Estos com plejos conocidos como ribonucleoproteínas nu cleares pequeñas (snRNP, de Small Nuclear RiboNucleoProteins y pronunciado “snurps”) recuerdan a los ribosomas, pues cada uno de ellos contiene un con junto de proteínas que está acomplejado con una molécula de RNA estable. Sin embargo son mucho menores que los ribosomas -250 000 daltons frente a los 4,5 millones de daltons de un ribosom a- y tienen una relación proteína/RNA algo superior. Algunas proteínas se encuentran en diferentes partículas mientras que otras son específicas de un solo tipo de ellas. Este hecho se pudo demostrar por primera vez en el suero de enfermos de lupus eritomatoso sistèmico, enfer medad en la que se fabrican anticuerpos dirigidos contra una o más proteínas de sus snRNP: por ejemplo, se localizó un anticuerpo que reconocía las partículas snRNP U l, U2, U5 y U4/U6, y ahora sabemos que todas estas partículas tienen una proteína en común. Parece que las snRNP individuales reconocen secuencias específicas del áci do nucleico mediante la complementariedad de bases RNA-RNA. Algunas están implicadas en la maduración del RNA; se sabe que una de ellas está implicada en la reacción de corte que genera el extremo 3 ’ de los RNA de histonas recién sintetizados, mientras que las funciones de las otras es desconocida. La eviden cia de que las snRNP participan en la maduración del RNA procede de experi mentos de procesamiento de RNA in vitro, así como de análisis de levaduras mutantes en alguno de los com ponentes de la snRNP.
Síntesis y procesamiento del RNA
CCCTGTGGAGCCACACCCTAGGGTTGGCCA ATCTACTCCCAGGAGCAGGGAGGGCAGGAG CCAGGGCTGGGCATAAAAGTCAGGGCAGAG CCATCTATTGCTTACATTTGCTTCTGACAC AACTGTGTTCACTAGCAACTCAAACAGACA CCATGGTGCACCTGACTCCTGAGGAGAAGT CTGCCGTTACTGCCCTGTGGGGCAAGGTGA ACGTGGATGAAGTTGGTGGTGAGGCCCTGG IgIgGTTGGTATCAAGGTTACAAGACAGGT TTAAGGAGACCAATAGAAACTGGGCATGTG
GAGACAGAGAAGACTCTTGGGTTTCTGATA GGCACTGACTCTCTCTGCCTATTGGTCTAT TTTCCCACCCTTAGGCTGCTGGTGGTCTAC CCTTGGACCCAGAGGTTCTTTGAGTCCTTT GGGGATCTGTCCACTCCTGATGCTGTTATG GGCAACCCTAAGGTGAAGGCTCATGGCAAG AAAGTGCTCGGTGCCTTTAGTGATGGCCTG GCTCACCTGGACAACCTCAAGGGCACCTTT GCCACACTGftGTGAGCTGCACTGTGACAAG
CTGCACGTGGATCKTGAGRACTTCAGGrlTG AGTCTATGGGACCCTTGATGTTTTCTTTCC CCTTCTTTTCTATGGTTAAGTTCATGTCAT AGGAAGGGGAGAAGTAACAGGGTACAGTTT AGAATGGGAAACAGACGAATGATTGCATCA GTGTGGAAGTCTCAGGATCGTTTTAGTTTC TTTTATTTGCTGTTCATAACAATTGTTTTC TTTTGTTTAATTCTTGCTTTCTTTTTTTTT CTTCTCCGCAATTTTTACTATTATACTTAA TGCCTTAACATTGTGTATAACAAAAGGAAA TATCTCTGAGATACATTAAGTAACTTAAAA AAAAACTTTACACAGTCTGCCTAGTACATT ACTATTTGGAATATATGTGTGCTTATTTGC ATATTCATAATCTCCCTACTTTATTTTCTT TTATTTTTAATTGATACATAATCATTATAC ATATTTATGGGTTAAAGTGTAATGTTTTAA TATGTGTACACATATTGACCAAATCAGGGT AATTTTGCATTTGTAATTTTAAAAAATGCT TTCTTCTTTTAATATACTTTTTTGTTTATC TTATTTCTAATACTTTCCCTAATCTCTTTC TTTCAGGGCAATAATGATACAATGTATCAT GCCTCTTTGCACCATTCTAAAGAATAACAG TGATAATTTCTGGGTTAAGGCAATAGCAAT ATTTCTGCATATAAATATTTCTGCATATAA ATTGTAACTGATGTAAGAGGTTTCATATTG CTAATAGCAGCTACAATCCAGCTACCATTC TGCTTTTATTTTATGGTTGGGATAAGGCTG GATTATTCTGAGTCCAAGCTAGGCCCTTTT GCTAATCATGTTCATACCTCTTATCTTCCT CCCACAGCTCCTGGGCAACGTGCTGGTCTG TGTGCTGGCCX^TCACTTTGGCAAAGAATT CACCCCACCAGTGCAGGCTGCCTATCAGAA AGTGGTGGCTGGTGTGGCTAATGCCCTGGC
CCACAAGTATCACTAAGCTCGCTTTCTTGC TGTCCAATTTCTATTAAAGGTTCCTTTGTT CCCTAAGTCCAACTACTAAACTGGGGGATA TTATGAAGGGCCTTGAGCATCTGGATTCTG CCTAATAAAAAACATTTATTTTCATTGCAA TGATGTATTTAAATTATTTCTGAATATTTT ACTAAAAAGGGAATGTGGGAGGTCAGTGCA TTTAAAACATAAAGAAATGATGAGCTGTTC AAACCTTGGGAAAATACACTATATCTTAAA CTCCATGAAAGAAGGTGAGGCTGCAACCAG CTAATGCACATTGGCAACAGCCCCTGATGC CTATGCCTTATTCATCCCTCAGAAAAGGAT TCTTGTAGAGGCTTGATTTGCAGGTTAAAG TTTTGCTATGCTGTATTTTACATTACTTAT TGTTTTAGCTGTCCTCATGAATGTCTTTTC
(A)
I-----------------1 200 nm
(B) 5' p | ” \ exón intrón
DNA
\ exón
Las secuencias intrónicas se elim inan de las moléculas de RNA en form a de lazo35 Los intrones tienen un tamaño que oscila desde 80 hasta más de 10 000 nucleóti dos. A diferencia de los exones, su secuencia de nucleótidos exacta no parece ser importante. Así pues los intrones han acumulado una gran cantidad de muta ciones durante la evolución; en muchos casos es posible alterar la mayor parte de la secuencia de un intrón sin que la funcionalidad del gen se vea afectada. Todo ello ha llevado a la idea de que las secuencias intrónicas no tienen ninguna función sino que son "chatarra” genética, hipótesis que se discutirá con detalle al final del capítulo. Las únicas secuencias de los intrones que están muy conser vadas son las que son necesarias para su eliminación. Así pues, en cada uno de los extremos de un intrón existen secuencias consenso que son casi idénticas en todos los intrones conocidos, y que no se pueden alterar sin afectar gravemente el proceso de maduración normal del transcrito de RNA. En la Figura 8-53 se muestran estas secuencias de frontera del lugar de corte 5’ (lugar dador) y del lugar de corte 3' (lugar aceptor) de los intrones de eucariotas superiores. Las re acciones de corte y posterior empalme se han de realizar con una gran precisión, ya que un error en un solo nucleótido haría variar la pauta de lectura de la se cuencia del mRNA resultante, produciendo un m ensaje sin sentido. La vía por la que se eliminan las secuencias intrónicas de los transcritos pri marios de RNA se ha deducido mediante estudios in vitro en los cuales se prepa ra, mediante la transcripción con RNA polimerasa purificada de un fragmento de DNA adecuado, una especie única de RNA que contiene un único intrón (véa se Figura 7-36). Cuando se añaden estas moléculas de RNA a un extracto celular, empieza la maduración a través de una reacción enzimàtica en dos etapas, las cuales requieren una incubación prolongada con ATP, la presencia de determi nadas proteínas en el extracto, las partículas snRNP U l, U2, U5, y U4/U6, y una serie de proteínas adicionales; estos com ponentes se ensamblan formando un gran com plejo ribonucleoproteico, el espliceosoma. La caracterización de las especies de RNA que aparecen como intermediarios durante la reacción y de las partículas snRNP necesarias llevó al descubrimiento de que el intrón se escinde en forma de lazo, siguiendo las vías de maduración que se muestran en las Figu ras 8-54 y 8-55. Se han descrito algunas funciones individuales para algunas de las snRNP. Por ejemplo snRNP U l se une al lugar de corte 5 ’ del intrón guiado por la complementariedad de secuencia del RNA U l con la secuencia de nueve nucleótidos consenso (véase Figura 8-53). Debido a que el RNA es capaz de actuar como una secuencia del intrón
secuencia 5' del exón ir
C A 5' — o A G GU o A G U A G secuencia consenso 5' para el lugar de corte 5' ("lu gar dador" 400
secuencia 3' del exón
-------------- 11--------------
U U U U U U U U U U U C G o o o o o o o o o o o N o AG o — 3' C C C C C C C C C C C U A punto de ram ificación A
Capítulo 8 : El núcleo celular
secuencia consenso 3' para el lugar de corte 3' ("lugar aceptor")
Figura 8 -5 2 Espliceosom as. (A) Electronmicrografías de cromatina descondensada mostrando grandes com plejos ribonucleoproteicos ensamblados en los lugares de corte 5 ’ y 3 ’ formando el espliceosoma. A partir de un gen codificante de una proteína del corion de Drosophila, se están produciendo transcritos RNA, de modo que se han determinado las posiciones de los lugares de corte sobre el transcrito primario de RNA. Como se observa en el esquema (B) la mayor parte de los transcritos de RNA tienen una o dos grandes partículas RNP cerca de sus extremos 5 ’. En la parte inferior se muestra un esquema del gen. Cuando en un transcrito se presentan dos partículas [círculos abiertos de (B)], tienen un tamaño medio de 25 nm y se presentan en las proximidades de los lugares de corte 5 ’ y 3 ’ de la pequeña secuencia intrónica (228 nucleótidos), cerca del extremo 5 ’ de los transcritos. Frecuentem ente, los transcritos más maduros, y más largos de los dos genes presentan una partícula de mayor tamaño [círculos verdes en (B)] en la región del intrón, que probablem ente es el resultado de la asociación estable de las dos partículas menores y que representa el espliceosoma ensamblado. Dado que en algunas ocasiones (incluyendo el ejemplo mostrado en esta figura) el proceso de corte y eliminación de los intrones tiene lugar mientras el extremo 3 ’ de la molécula está siendo transcrito, probablem ente para que se dé este proceso no es necesaria la presencia de la cola poli-A en el extremo 3 ’. Debido a las condiciones utilizadas para la obtención de la cromatina, la mayor parte de las proteínas hnRNP han sido eliminadas de los transcritos de la micrografía. (Adaptado de Y.N. Osheim, O.L. Miller y A.L. Beyer, Cell 4 3 :1 4 3 -1 5 1 ,1985. © Cell Press.)
Figura 8-53 Secuencia consenso para los lugares de corte 5’ y 3 ’ usados en la maduración del RNA en los eucariotas superiores. La secuencia indicada corresponde a la de la cadena de RNA; los dinucleótidos casi invariantes, GU y AG, de ambos extremos del intrón se han destacado en amarillo (véase también Figura 8-51).
lugar de corte 5' U1 snRNP
U2 u z ssnRNP rm rc r
lugar de corte 3'
E , APA 2 CORTE POR EL LUGAR DE CORTE 3' V UNIÓN DE LOS EXONES secuencia del ¡ntrón liberado en form a de lazo (será 13' degradado del núcleo) OH mRNA m aduro (secuencias exónicas unidas)
enzima, tanto el RNA como los com ponentes proteicos del espliceosoma po drían ser los responsables de catalizar el corte y la formación de las uniones covalentes necesarios en la maduración del RNA.
Figura 8-54 Mecanismo de m aduración por corte y empalm e del RNA La maduración del RNA está catalizada por el espliceosoma formado por la unión de las snRNP U l, U2, U5 y U4/U6 (mostradas como círcu los verdes) y de otros com ponentes (no mostrados). Después del ensam blaje del espliceosoma, la reacción tiene lugar en dos etapas: en la etapa 1 un nucleótido A especial de la secuencia intrónica situado cerca del lugar de corte 3 ’ reacciona con la secuencia de corte del lugar 5 ’, la cual es cortada; el extremo 5 ’ cortado de la secuencia del intrón se une covalentem ente a este nucleótido A, formando un nucleótido ramificado, com o se aprecia en la Figura 8-55. En la etapa 2, el extremo 3 ’-OH del primer exón que estaba expuesto en la primera etapa, se añade al inicio del segundo exón, cortando la molécula por el lugar de corte 3 ’; las dos secuencias exónicas quedan unidas y el intrón se libera en forma de lazo. El com plejo com pleto del espliceosom a sedim enta a 60S, lo que indica que es casi tan grande com o un ribosoma. Estas reacciones de maduración tienen lugar en el núcleo y producen moléculas de mRNA a partir de los transcritos primarios de RNA (moléculas precursoras de los mRNA).
Habitualmente de cada transcrito de RNA se elim inan muchas secuencias intrónicas36 Debido a que el espliceosoma parece reconocer fundamentalmente una secuen cia consenso que delimita la frontera del intrón (y estas secuencias consenso son similares para todas las secuencias de intrón), el lugar de corte 5’ (lugar dador) del extremo de un intrón se puede unir al lugar de corte 3 ’ (lugar aceptor) de cual quier otro intrón. Así pues, cuando se crea artificialmente una molécula de RNA, con lugares dadores y aceptores de diferentes intrones insertados, frecuentemen te el RNA existente entre ellos es reconocido por el espliceosoma y eliminado. A la vista de este resultado, es sorprendente que los genes de los vertebrados contengan hasta 50 intrones (véase Tabla 8-1, pág. 365). Si durante la madura ción del RNA se desaparea cualquiera de los lugares de corte 5 ’ con cualquiera de los 3 ’, podrían perderse algunas secuencias codificantes del mRNA, con con secuencias desastrosas. Sin embargo la maquinaria de maduración del RNA pre viene, de alguna forma, estos errores, garantizando que cada lugar de corte 5 ’ sólo se aparee con el lugar de corte 3 ’ más próximo situado en sentido 5’-3’ en la
Figura 8-55 Estructura de la cadena ramificada de RNA que se form a durante la m aduración del RNA. El nucleótido A mostrado en a m a r illo en la figura es el nucleótido que se destaca en la Figura 8-54. La ramificación se forma en la primera etapa de la reacción de maduración ilustrada allí, cuando el extremo 5 ’ del intrón se acopla covalentemente al 2 ’-OH de la ribosa del nucleótido A localizado a unos 30 nucleótidos del extremo 3 ’ de la secuencia del intrón. La cadena ramificada permanece en el intrón escindido y es responsable de su forma en lazo (véase Figura 8-54).
Síntesis y procesamiento del RNA
extrem o 3' de la secuencia del intrón 401
inicio AUG
transcrito prim ario de RNA secuencia secuencia paro de un exón de un intrón
D3 A3 D1
D5 A5
A l D2 A2 D4 A4
D6 A6 D7
im i ¡¡|i¡¡|¡ A A A - OH A7
^----------------------------- -8000 nucle ótido s-----------------------------------^ SECUENCIAS INTRONICAS ELIMINADAS POR LA MADURACIÓN DEL RNA inicio
paro
I_____ I
(+ )G p p p - I Í ^ ^ M M A A A -O H 5' 3'
mRNA
TRADUCCION
H2N ~ | ! COOH ovoalbúm ina
proteína
secuencia lineal del RNA (Figura 8-56). Se desconoce cómo se produce este apa reamiento secuencial de los lugares de corte, aunque se cree que el ensamblaje del espliceosoma, ya durante el crecim iento del transcrito de RNA (véase Figura 8-52), juega un papel importante en cuanto a asegurar el apareamiento correcto de los lugares de corte. Además, existen evidencias de que la conformación tridi mensional adoptada por las secuencias de intrones y exones en el transcrito de RNA es importante. Sin embargo, se verá en el Capítulo 9 que este patrón de m a duración sencillo 5 ’-3’ puede modificarse por mecanismos de control especiali zados que permitirían a un gen único producir diferentes mRNA y de esta forma diferentes proteínas.
El estudio de la talasem ia revela de qué form a la maduración del RNA puede perm itir que las proteínas evolucionen37 Las técnicas del DNA recombinante han hecho de los mutantes humanos un re curso cada vez más importante para los estudios genéticos de los mecanismos ce lulares. Por ejemplo, existe un grupo de enfermedades genéticas humanas deno minadas síndrom es de talasem ia, que en el individuo afectado producen un nivel anormalmente bajo de hemoglobina -la proteína transportadora del oxígeno en la sangre. En más de 50 de estos mutantes se ha determinado la alteración de la secuencia del DNA; en una gran parte de ellos se presentan alteraciones en el pa trón de la maduración del RNA. Así, se ha detectado que un cambio de un núcleotido puede inactivar un lugar de corte. Sorprendentemente, a partir del análisis de los mRNA producidos en estos individuos mutantes se ha observado que la pérdi da de un lugar de corte no evita la eliminación de ese intrón sino que en muchos casos el lugar de corte complementario se une a un lugar de corte “críptico” situa do en las proximidades; frecuentemente se generan una serie de maduraciones alternativas, de modo que en lugar de producirse una sola proteína se generan una serie de proteínas alteradas (véase Figura 8-57). Otros cambios de un nucleótido crean un nuevo lugar de corte cambiando una secuencia de un intrón o exón en una secuencia consenso de maduración. Estos resultados apoyan la idea de que en los eucariotas superiores la maduración del RNA es un proceso flexible, y sugieren que las variaciones del patrón de maduración causadas por mutaciones al azar podrían ser una vía importante en la evolución de genes y organismos.
402
Capítulo 8 : El núcleo celular
Figura 8 -56 M aduración del transcrito prim ario de RNA del gen de la ovoalbúmina de gallina. El esquema muestra la eliminación ordenada de siete intrones, necesaria para obtener una molécula de mRNA funcional. El lugar de corte 5’ (lugar dador) se señala con una D y el lugar de corte 3 ’ (lugar aceptor) con una A.
(A) TRANSCRITO PRIMARIO DE LA ß-GLOBINA DE UN ADULTO NORMAL exon
exon
1
2
AAAA
intrones
se form a un m RNA norm al a partir de los tres exones
II I
■ AAAA
T
_____
X \
A mRNA con el exón 2 m ayor A
(C) CAMBIO DE UN SOLO NUCLEÓTIDO QUE DESTRUYE UN LUGAR DE CORTE NORMAL Y PERMITE LA APARICIÓN DE LUGARES DE CORTE "CRÍPTICOS" ALTERNATIVOS I
(B) EL CAMBIO DE UN NUCLEÓTIDO GENERA OTRO LUGAR DE CORTE
.n
/\
i
_
' AAAA
AAAA
m RNA con un exón extra insertado entre los exones 2 y 3
(D) CAMBIO DE UN NUCLEOTIDO QUE DESTRUYE UNA SEÑAL DE POLIADENILACIÓN
varios m RNA con un exón 1 acortado o alargado
AAAA mRNA con una región 3' no traducida anorm alm ente larga
i
r
__
ii
4
AAAA
■i
I
mRNA con el exón 3 alargado
Probablem ente la maduración del RNA catalizada por el espliceosom a evolucionó a partir de mecanismos de automaduración38 El descubrimiento del intermediario en lazo en la maduración nuclear de los RNA confundió inicialmente a los biólogos moleculares. ¿Por qué se utiliza esta vía com pleja cuando aparentemente parece más simple unir los lugares de corte 5 ’ y 3’ en una primera etapa, y luego cortar y volver a unir? La respuesta parece encontrarse en la manera como evolucionó el espliceosoma. Como se ha explicado en el Capítulo 1, se cree que las primeras células utili zaban moléculas de RNA -e n lugar de proteínas- como catalizadores principales y que alm acenaban la información genética en moléculas de RNA -e n lugar de moléculas de DNA. Posiblemente, en aquellos tiempos las reacciones de corte y empalme de RNA catalizadas por RNA jugaron un importante papel; aún existen algunos intrones que presentan capacidad de autorrecorte -p or ejemplo, en los genes nucleares de rRNA de Tetrahymena, en el bacteriófago T4, y en algunos genes mitocondriales y de cloroplastos. Una secuencia intrónica con automadu ración se puede identificar en el tubo de ensayo incubando una molécula de RNA pura que contenga la secuencia intrónica y observando la reacción de m a duración; también se puede identificar a partir de la propia secuencia del RNA, dado que una gran parte de ésta ha de ser conservada para que al plegarse forme una superficie catalítica en la molécula del RNA. Se pueden diferenciar dos gru pos principales de intrones con capacidad de automaduración. Los intrones del grupo /, que inician la reacción de automaduración uniendo un nucleótido G a la secuencia del intrón; la G es activada formando el grupo que romperá el pri mero de los enlaces fosfodiéster cortado durante el proceso de maduración (el enlace del lugar de corte 5 ’). En los intrones del grupo II el grupo atacante es un residuo A especialmente reactivo, y se genera un intermediario en lazo. El resto de los mecanismos de la reacción son similares. Se cree que ambos representan vestigios de mecanismos muy primitivos (Figura 8-58). Al parecer durante la evolución del proceso de maduración del RNA nuclear, se ha conservado la vía de reacción utilizada por los intrones de automaduración del tipo II, siendo reemplazada la función catalítica por un espliceosoma independien te. Así, los pequeños RNA U1 y U2 podrían ser, por ejemplo, los remanentes de las
Síntesis y procesamiento del RNA
Figura 8 -57 Ejemplos de procesam iento anorm al del transcrito prim ario de la (i-globina en hum anos con (3-talasemia. El lugar afectado por la mutación se ha señalado con una ca b e z a negra d e flec h a . Las ca ja s co lo rea d a s en azu l oscu ro representan los tres exones normales, mostrados previamente en la Figura 8-51, y las lín eas con tin u as rojas unen los lugares de corte 5 ’ y 3 ’ utilizados en la maduración del transcrito primario de RNA producido por el gen. Las ca jas c o lo rea d a s d e a zu l claro indican nuevas secuencias que debido a la mutación quedan incluidas en la molécula final de mRNA. Hay que destacar que cuando una mutación elimina un lugar de corte normal, aparecen uno o más lugares de corte “crípticos” alternativos, que se aparean con el lugar de corte remanente, com o ocurre en (C). (De S.H. Orkin en The Molecular Basis of Blood Diseases [G. Stanatoyannopoulos et al. eds.], pp. 106-126. Philadelphia: Saunders, 1987.)
403
Grupo I de intrones de automaduración
secuencia \ del intrón secuencia secuencia 3' de un exón T 5' de un exón' \ HCRA m olécula de RNA 5^ precursora
secuencia 5' de un exón
interm ediario transitorio
r
\\
//
U
OH □3'
Figura 8-5 8 Las dos clases conocidas de intrones de autom aduración. Los intrones del grupo I unen un nucledtido G libre a un lugar específico para iniciar el proceso (véase Figura 3secuencia 21). Los intrones del grupo II usan, 3’ de un exón para el mismo propósito, un nucleótido A especialm ente reactivo I .. .I 31 de la propia secuencia del intrón. Se han dibujado los dos mecanism os resaltando sus similitudes. En ambos mecanism os participan proteínas que contribuyen a acelerar la reacción, pero la catálisis está producida por el RNA del intrón. El mecanism o utilizado por los intrones del grupo II forma un lazo, recordando la vía catalizada por el espliceosoma (comparar con la Figura 8-54). (De T.R. Cech, Cell 4 4 :2 0 7 -2 1 0 ,1 9 86. © Cell lazo Press.)
Grupo II de intrones de automaduración
secuencia intrónica escindida secuencia de los exones unidos
/, ( \ \
[
A V
5T
secuencias catalíticas que originalmente estuvieron presentes en los intrones. Pro bablemente al desaparecer las funciones catalíticas de los intrones y pasar al espli ceosoma desaparecieron también las limitaciones a la evolución de las secuencias intrónicas, permitiendo que muchas de ellas evolucionaran rápidamente.
El transporte de los mRNA al citoplasm a se retrasa hasta que la m aduración se ha completado39 Se cree que las moléculas de mRNA maduras son reconocidas por proteínas re ceptoras del com plejo del poro nuclear y transportadas activamente al citoplas ma (discutido en el Capítulo 12). Por el contrario, las principales proteínas de las partículas hnRNP y varias de las moléculas de procesamiento unidas al RNA es tán confinadas en el núcleo, aunque ocasionalm ente algunas de ellas pasan al citoplasma con el mRNA antes de ser separadas rápidamente y devueltas al nú cleo (Figura 8-59).
ribosom a
proteínas citoplasm áticas de unión al RNA
C ITO SO L
poro nuclear
iteri am bii »de
■
__________ i 200 nm
404
Capítulo 8 : El núcleo celular
Figura 8-59 Transporte de moléculas de mRNA a través de los poros nucleares. (A) Ilustración esquemática del cam bio que al parecer ocurre en las proteínas unidas a la molécula de RNA cuando se desplazan hacia el exterior del núcleo. (B) Electronmicrografía de una gran molécula de mRNA producida en una glándula salival de insecto; aparentemente, esta molécula (flecha) ha sido “cazada” en el mom ento en que salía del núcleo al citoplasma. (B, de B J. Stevens y H. Swift, /. Cell B iol 3 1 :5 5 -7 7 ,1 9 6 6 , con permiso de copyright de The Rockefeller University Press.)
Estudios realizados en mutantes de levadura sugieren que para los RNA que contienen intrones este proceso sólo es posible cuando ha finalizado com pleta mente la maduración del RNA. Cuando una mutación crea un defecto en la m a quinaria de maduración, los precursores del mRNA no procesados permanecen en el núcleo, mientras que los mRNA que no necesitan maduración (lo que in cluye la mayor parte de los mRNA en esta sencilla célula eucariota), son trans portados normalmente al citoplasma. Esta observación es consistente con la idea de que los RNA son retenidos por los com ponentes de los espliceosomas, que al parecer forman grandes agregados en el interior de los núcleos eucariotas. Estos agregados podrían actuar com o “islas de maduración” (Figura 8-60); aunque se desconoce cómo están formados y cómo funcionan, podrían ser aná logos al nucléolo, una estructura nuclear mucho mayor en tamaño y más conspi cua, y de la que se conoce m ejor su organización y su función. El nucléolo es el lugar donde se procesan las moléculas de RNA ribosómico (rRNA) a partir de un precursor de mayor tamaño, las cuales se ensamblan en los ribosomas por unión de proteínas ribosomales. Antes de discutir la estructura del nucléolo, es necesario considerar cómo se sintetizan los precursores de los rRNA a partir de los genes de rRNA.
Los RNA ribosómicos y los RNA de transferencia se sintetizan sobre conjuntos de genes idénticos dispuestos en tándem40 Muchas de las proteínas mayoritarias de una célula diferenciada, como por ejemplo la hemoglobina de los eritrocitos o la mioglobina de la fibra muscular, son sintetizados a partir de genes que están presentes en una sola copia por genoma haploide. Estas proteínas son abundantes porque cada una de las muchas moléculas de mRNA transcritas a partir del gen puede ser traducida generando unas 10 moléculas por minuto. Normalmente esto producirá en cada nueva ge neración celular más de 10 000 moléculas de pro teína por molécula de mRNA. Sin embargo, este proceso de amplificación no es posible para la síntesis de los RNA que forman los ribosomas, ya que las moléculas de RNA son el producto fi nal del gen. Para poder construir sus 10 millones de ribosomas, cada célula euca riota superior ha de sintetizar en cada generación celular más de 10 millones de copias de cada uno de los tipos de moléculas RNA ribosómicas. De hecho la cé lula puede producir cantidades adecuadas de estos rRNA gracias a que dispone de múltiples copias de los genes rRNA que codifican RNA ribosómicos. Incluso E. coli necesita siete copias de los genes rRNA para mantener las ne cesidades celulares de ribosomas. Las células humanas contienen alrededor de 200 copias de genes rRNA por genoma haploide, dispersas en pequeños grupos sobre cinco cromosomas diferentes, mientras que Xenopus contiene alrededor de 600 copias en un grupo único situado en un solo cromosoma. En las células eucariotas, las copias múltiples de cada uno de los genes de rRNA, altamente conservados, se localizan organizadas en tándem en las que cada gen (de 8000 a 13 000 nucleótidos de longitud, dependiendo del organismo) se encuentra sepa rado del adyacente por una secuencia de DNA no transcrita denominada DNA espaciador, el cual puede variar mucho en cuanto a tamaño y a secuencia. Como se verá posteriormente las copias múltiples de los genes organizados en tándem tienden a coevolucionar. La organización en tándem de los genes rRNA es fácil de visualizar en pre paraciones de cromatina extendida, debido a su organización repetida y a que son transcritos con gran frecuencia. Las moléculas de RNA polimerasa y los transcritos asociados a ellas están tan densamente empaquetados (aproximada mente 100 por gen) que los transcritos se observan situados perpendicularmen te al eje de la molécula de DNA, de forma que cada unidad de transcripción pre senta el aspecto de un “árbol de navidad” (Figura 8-61). Tal como se ha citado anteriormente (véase Figura 8-47), la parte más estrecha de dichos “árboles” co rresponde al lugar donde se inicia la transcripción, donde los transcritos son más cortos, mientras que el otro extremo de la unidad de transcripción del gen
Síntesis y procesamiento del RNA
i_____________ i 10 Jim Figura 8-60 Posibles “islas de m aduración” (splicingislands). Inmunofluorescencia de un núcleo de fibroblasto humano con un anticuerpo monoclonal que detecta las partículas snRNP implicadas en la maduración de los precursores de las moléculas de mRNA. Las partículas snRNP se presentan com o grandes agregados, que podrían actuar com o “islas de maduración”. El anticuerpo detecta proteínas específicas que están presentes en algunas de las snRNP que actúan en el espliceosoma. (Por cortesía de N. Ringertz.)
405
Figura 8-61 Transcripción de los genes rRNA organizados en tándem, visualizados con el m icroscopio electrónico. En la im agen superior, a menor aumento, se observa claramente el patrón alterno de genes en transcripción activa y de DNA espaciador no transcrito. Al parecer las partículas mayores del extremo 5 ’ de cada uno de los transcritos de cada rRNA (im agen in ferior) representan el inicio del ensam blaje del ribosoma; las moléculas de RNA polimerasa también son claramente visibles como series de puntos a lo largo del DNA. (Fotografía superior de V.E. Foe, C oid Spring H arbor Symp. Quant. Biol. 42: 723-740, 1978; fotografía inferior por cortesía de Ulrich Scheer.)
wam18 rRNA queda claramente definido por la desaparición súbita de las moléculas de RNA polimerasa y de sus transcritos. Los genes rRNA son transcritos por la RNA polimerasa /; cada gen produce el mismo transcrito. En humanos, este transcrito se conoce como rRNA 45S y tiene una longitud de 13 000 nucleótidos. Antes de que abandone el núcleo formando parte de partículas ribosómicas ensambladas, el rRNA 45S es cortado producien do una copia de cada uno de los rRNA 28S (alrededor de 5000 nucleótidos), de los rRNA 18S (alrededor de 2000 nucleótidos) y de los rRNA 5,8S (aproximadamente 160 nucleótidos). Al obtenerse los tres rRNA a partir del mismo transcrito se ase gura una producción equilibrada de ellos. La secuencia remanente de cada trans crito primario (unos 6000 nucleótidos) se degrada en el núcleo (Figura 8-62). Se cree que estas secuencias extra podrían jugar un papel temporal en el ensamblaje del ribosoma, que se inicia rápidamente con la unión de algunas proteínas al transcrito rRNA 45S en el núcleo. Otro conjunto de genes organizados en tándem y separados por DNA espa ciador no transcrito es el que codifica el rRNA 5S de la subunidad ribosómica grande (el único rRNA que se transcribe de forma aislada). Los genes de rRNA 5S sólo tienen 120 pares de nucleótidos de longitud y, como ocurre con un gran nú-
RNA 45S precursor del rRNA ppp-
I - OH
-13 000 nucleótidos_^ regiones de la secuencia PROCESAMIENTO nucleotídica que se DEL RNA degradan rRNA 18S
rRNA 5,8S
rRNA 28S
5' 3' - ■ rRNA 5S producido 5' 3' en otro lugar incorporado en la subunidad ribosóm ica pequeña 406
Capítulo 8 : El núcleo celular
incorporado en la subunidad ribosóm ica grande
Figura 8 -62 Patrón de procesam iento de la molécula precursora RNA 45S en tres RNA ribosómicos separados. Casi la mitad de las secuencias nucleotídicas de este precursor se degradan en el núcleo.
mero de genes que codifican RNA de pequeño tamaño (especialmente los genes de tRNA), son transcritos por la RNA polimerasa III. En el hombre existen alrede dor de 2000 genes de rRNA 5S organizados en tándem en un único grupo situado lejos de los otros genes rRNA. Se desconoce la razón de que este tipo de rRNA se transcriba de forma aislada.
El nucléolo es una m áquina productora de ribosom as40 La transcripción continua de múltiples copias génicas asegura un aporte adecua do de moléculas de rRNA, que son rápidamente empaquetadas con las proteínas ribosomales formando ribosomas. El empaquetamiento se realiza en el núcleo, en una estructura de gran tamaño y bien diferenciada denominada el nucléolo. El nucléolo contiene grandes bucles de DNA procedentes de varios cromosomas, cada uno de los cuales contiene uno o más grupos de genes rRNA. Cada uno de estos grupos se denomina región organizadora nucleolar. Los genes son trans critos con gran frecuencia por la RNA polimerasa I. El inicio del empaquetamien to de los rRNA puede observarse al microscopio electrónico: el extremo 5’ de cada transcrito se une a un gránulo rico en proteína (véase Figura 8-61). Estos gránulos, los cuales no se ha observado que interaccionen con ningún otro tipo de transcrito, representan probablemente la primera interacción RNA-proteína que tiene lugar en el nucléolo. La función biosintética del nucléolo se puede poner de manifiesto por marea je radiactivo mediante pulsos cortos con uridina-3H. Después de varios pulsos, se parados por intervalos en los que se incuba con un medio no marcado, se pueden separar los genes rRNA del cromosoma mediante fraccionamiento subcelular, y se puede conseguir un aislamiento del nucléolo marcado, en forma bastante pura (Figura 8-63). Estos experimentos han mostrado que el transcrito de 45S es empa quetado formando un gran complejo con proteínas procedentes del citoplasma donde se sintetizan todas las proteínas de la célula. En esta etapa se incorporan tanto la mayor parte de las 80 proteínas que forman el ribosoma como el rRNA 5S. Para el procesamiento del rRNA 45S y para dirigir el proceso de ensamblaje son necesarias otras moléculas. Así pues, el nucléolo contiene otras proteínas de unión al RNA y ciertas partículas ribonucleoproteicas (incluyendo snRNP U3), las cuales, según parece, colaboran en la construcción de los ribosomas. Cuando las subunidades ribosómicas son exportadas al citoplasma en su forma definitiva, es tos componentes permanecen en el núcleo. Un componente especialmente nota ble de estos complejos es la nucleolina, una proteína de unión a RNA, abundante y bien caracterizada, que al parecer sólo recubre transcritos ribosómicos; esta proteí na se tiñe con plata, tal como ocurre con el nucléolo. A medida que se procesa, la molécula de rRNA 45S va perdiendo algo de RNA y de proteína y luego se divide formando los diferentes precursores de las
10 crom osom as ¡nterfásicos descondensados contribuyen a la form ación del nucléolo con sus bucles de DNA productores de rRNA
Figura 8-63 El nucléolo.
ROTURA MECÁNICA núcleo aislado con bucles crom osóm icos rotos envoltura nuclear Síntesis y procesamiento del RNA
Representación muy esquemática de una célula humana, en la que se muestran las aportaciones a un único gran nucléolo de los bucles de cromatina que contienen los genes de rRNA de 10 cromosom as diferentes. Los nucléolos purificados resultan muy útiles para los estudios bioquím icos de la función nucleolar; para obtener estos nucléolos, los bucles de la crom atina se han de separar m ecánicam ente de sus cromosomas, tal com o se muestra en el dibujo.
nucléolo
407
Figura 8 -6 4 Función del nucléolo en la síntesis de los ribosomas. El bucle de DNA organizador nucleolar gen rRNA TRANSCRIPCIÓN
proteínas ribosómicas producidas en el citoplasma rRNA 5S producido fuera del nucléolo
partícula ribonucleo-^'"' proteica mayor
&
*
Oo
precursor de rRNA 45S ?
fe Vw/s >
NUCLÉOLO
* ;% - — RNA y proteína reciclados, implicados en el procesamiento
subunidad mayor; inmadura /
NUCLEO
subunidad mayor / CITOSOL
subunidad menor
EL TRANSPORTE Y LA ACTIVACIÓN GENERAN RIBOSOMAS FUNCIONALES rRNA 18S subunidad 40S
rRNA 5,8S rRNA 5S rRNA 28S subunidad 60S
subunidades ribosómicas: mayor y m enor (Figura 8-64). A los 30 minutos del pulso de m areaje radiactivo, emergen del núcleo y aparecen en el citoplasma ce lular las primeras subunidades ribosómicas pequeñas maduras, con su rRNA 18S. El ensam blaje de la subunidad ribosómica mayor madura, con sus rRNA 28S, 5,8S y 5S, tarda alrededor de una hora en aparecer; por ello, el nucléolo con tiene más subunidades ribosómicas grandes incompletas que subunidades pe queñas incompletas. Las últimas etapas de la maduración ribosómicas sólo se producen cuando estas subunidades son transferidas al citoplasma. Este retraso evita que ribosomas funcionales puedan tener acceso en el núcleo a las moléculas de hnRNA, to davía procesadas de forma incompleta.
El nucléolo es un subcom partim iento nuclear muy organizado41 A la vista de lo que se conoce actualmente sobre la función del nucléolo, es posi ble explicar parte de su estructura. Al microscopio óptico, el gran nucléolo esfe roidal es la estructura más patente del núcleo de una célula no mitótica. Fue es tudiado con detenimiento por los primeros citólogos de tal modo que en una revisión aparecida en 1898 ya se pudieron citar unas 700 referencias. En la déca da de 1940, los citólogos habían demostrado que el nucléolo contiene elevadas concentraciones de RNA y de proteínas; pero su función principal en la síntesis del RNA ribosóm ico y en el ensam blaje de los ribosomas no fue descubierta has ta los años 60.
408
Capítulo 8 : El núcleo celular
transcrito rRNA 45S se empaqueta en una gran partícula ribonucleoproteica que contiene muchas proteínas ribosómicas procedentes del citoplasma. Mientras permanece en el nucléolo, ciertas regiones de esta partícula son eliminadas a medida que se transforma en las subunidades ribosómicas inmaduras mayor y menor. Se cree que estas dos subunidades sólo alcanzan su forma funcional final cuando son transportadas individualmente a través de los poros nucleares hacia el citoplasma celular.
heterocromatina periférica envoltura nuclear
nucléolo
com ponente fib rila r denso com ponente granular centro fib rila r (A)
2 (jm
Al microscopio electrónico se pueden observar algunos de los detalles de la organización nucleolar. A diferencia de los orgánulos citoplasmáticos, el nucléo lo carece de membrana que lo delimite; en vez de ello, parece estar constituido por la unión específica que forman entre sí, como una gran malla y de una m a nera aún desconocida, los precursores ribosómicos no terminados. En una electronmicrografía representativa en el núcleo se pueden distinguir tres regiones parcialmente diferenciadas (Figura 8-65): (1) un componente débilmente con trastado, el centro fibrilar, que contiene DNA que no está siendo transcrito acti vamente, (2) un componente fibrilar denso que contiene moléculas de RNA en proceso de transcripción; y (3) un componente granular, que contiene precurso res de las partículas ribosomales maduras. El tamaño del nucléolo refleja su actividad, y por ello varía notablemente en los diferentes tipos celulares y puede variar dentro de una misma célula. Por ejemplo, el nucléolo es muy pequeño en ciertas células vegetales en estado de latencia, pero puede ocupar hasta el 25% del volumen nuclear total en células que estén produciendo cantidades de proteína anormalmente elevadas. Las di ferencias de tamaño se deben en gran medida a las variaciones del componente granular, que probablemente está regulada a nivel de la transcripción génica ribosómica: la cromatina extendida observada con el microscopio electrónico muestra que tanto la fracción de genes ribosómicos activados como la velocidad a la que se transcribe cada gen pueden variar según las circunstancias.
(B)
1 pm
Figura 8 -65 Electronm icrografía de una sección ultrafina de un nucléolo de un fibroblasto hum ano, mostrando sus tres zonas diferentes. (A) Vista del núcleo entero. (B) Imagen a mayor aumento del nucléolo. (Por cortesía de E.G. Jordán y M.J. McGovern.)
Después de cada mitosis, el nucléolo se ensam bla de nuevo en determinados cromosom as42 El aspecto del nucléolo cam bia espectacularmente durante las distintas fases del ciclo celular. A medida que la célula se aproxima a la mitosis, el nucléolo dismi nuye de tamaño y luego, cuando los cromosomas se condensan y se detiene to talmente la síntesis de RNA, desaparece: en general las células metafásicas no tienen nucléolo. Cuando se inicia de nuevo la síntesis de RNA ribosómico, al fi nal de la mitosis (en la telofase), reaparecen diminutos nucléolos en las localiza ciones cromosómicas de los genes de RNA ribosómico (Figura 8-66). En el hombre, los genes de RNA ribosómico están localizados cerca del ex tremo de cada uno de los 5 cromosomas distintos que se muestran en la Figura
Síntesis y procesamiento del RNA
409
8-32 (es decir, en 10 de los 46 cromosomas de una célula diploide). Por consi guiente, después de la mitosis de una célula humana se forman 10 pequeños nu cléolos aunque rara vez se pueden observar ya que crecen rápidamente y se fu sionan formando el gran nucléolo típico de la célula interfásica (Figura 8-67). ¿Qué sucede con el RNA y con las proteínas componentes del nucléolo que se ha disgregado durante la mitosis? Parece que por lo menos una parte de estos com ponentes queda distribuida sobre la superficie de todos los cromosomas metafásicos y es transportada a los núcleos de las dos células hijas. Cuando, du rante la telofase, los cromosomas se descondensan, estos componentes núcleolares “viejos” ayudan a restablecer los nucléolos que aparecen nuevamente.
Los crom osom as ocupan territorios discretos en el núcleo interfásico43 Como acabam os de ver, cuando se forma el nucléolo, determinados genes, loca lizados en diferentes cromosomas, se encuentran reunidos. ¿Están las otras par tes del crom osom a tam bién ordenadas no-al azar en el núcleo? Esta pregunta, planteada por los científicos de finales del siglo diecinueve, todavía no ha sido respondida satisfactoriamente. Existe un cierto orden en la configuración que siempre tienen los cromoso mas al finalizar la mitosis. Justo antes de que la célula se divida, los cromosomas son atraídos hacia cada uno de los dos polos de huso mitótico, mediante microtúbulos unidos a los centrómeros; así pues, los centrómeros marcan el camino, y los brazos distales de los cromosomas (terminados en los telómeros) lo siguen des pués. En muchos núcleos interfásicos, los cromosomas tienden a retener esta orientación, denominada orientación Rabí, durante toda la interfase, con sus cen trómeros dirigidos hacia un polo del núcleo y sus telómeros dirigidos hacia el polo opuesto (Figura 8-68A). En algunos casos, el núcleo está orientado de forma espe cífica en la célula: en el embrión temprano de Drosophila, por ejemplo, todos los centrómeros se dirigen hacia la cara apical (Figura 8-68B). Estas orientaciones nu cleares fijas podrían tener importantes efectos sobre la polaridad celular, aunque es difícil diseñar experimentos que permitan estudiar esta posibilidad. En muchas células los cromosomas no se pueden distinguir entre sí durante la interfase. Por ello, es difícil asegurar cómo están realmente dispuestos. Sin embargo, los cromosomas politénicos gigantes de la larva de Drosophila son una excepción de este principio. En este caso, las bandas cromosómicas se pueden observar con la suficiente claridad com o para determinar las posiciones especí ficas de determinados genes en los núcleos intactos, mediante secciones ópticas y técnicas de reconstrucción. Los resultados de estos análisis sugieren que el conjunto de los cromosomas interfásicos no están muy ordenados: aunque se tiende a m antener la orientación Rabí, frecuentemente ocurre que dos células aparentem ente idénticas presentan distribuciones diferentes de cromosomas.
50(íftt 41 0
Capítulo 8 : El núcleo celular
Figura 8 -66 Cambios morfológicos del nucléolo de una célula hum ana durante el ciclo celular. En este diagrama sólo se ha representado el núcleo celular. En muchas células eucariotas la membrana nuclear se rompe durante la mitosis, lo cual se ha indicado con líneas discontinuas.
Figura 8-67 Fusión nucleolar. Micrografías obtenidas con el microscopio óptico, de fibroblastos humanos en cultivo, mostrando varias etapas de la fusión de los nucléolos. (Por cortesía de E.G. Jordán y J. McGovern.)
Figura 8 -6 8 Orientación polarizada de los crom osom as en las células interfásicas del embrión tem prano de D r o so p h ila . (A) Diagramas de la orientación Rabí, con todos los telómeros apuntando hacia el polo opuesto. En el embrión, cada núcleo se alarga, tal como se muestra en la figura. (B) Micrografía a poco aumento del embrión de Drosophila en el estado de blastodermo celular. Los cromosomas de cada núcleo interfásico se han teñido con un colorante fluorescente. Hay que destacar que la región más teñida (el cromocentro), que contiene las regiones centroméricas de cada uno de los cuatro cromosom as (véase Figura 8-19), está orientada hacia la superficie exterior del embrión y por ello se dirige hacia la membrana apical de cada una de las células. (Por cortesía de John Sedat.)
VISTA LATERAL DEL NÙCLEO
VISTA DESDE EL EXTREMO DEL CENTRÒMERO
telóm eros j centróm eros envoltura nuclear (A)
El análisis de los cromosomas politénicos indica también que cada crom o soma ocupa su propio territorio en el núcleo interfásico -e s decir, que los dife rentes cromosomas no están entremezclados completamente (Figura 8-69). Otros experimentos han mostrado que los cromosomas no politénicos también tienden a ocupar regiones concretas y restringidas en el núcleo interfásico. Ex perimentos de hibridación in situ con una sonda de DNA apropiada, por ejem plo, pueden seguir un solo cromosoma en células híbridas de mamífero en culti vo (Figura 8-70). Parece que la mayor parte del DNA de cada cromosoma ocupa únicamente una pequeña porción del núcleo interfásico, lo cual sugiere que cada crom osom a permanece condensado y organizado mientras permite que al gunas zonas de su DNA sean activas en la síntesis de RNA.
em brión
¿Está muy ordenado el núcleo?44 El interior del núcleo no es una mezcla al azar de todos sus componentes: RNA, DNA y proteínas. Ya hemos descrito que el nucléolo está organizado como una máquina eficiente de construcción de ribosomas, y que aparentemente algunos grupos de com ponentes de espliceosomas están organizados en islas de madu ración del RNA (véase Figura 8-60). El orden también es apreciable al observar electronmicrografías de las regiones situadas alrededor de los poros nucleares: la cromatina que se encuentra unida a la membrana nuclear interna (cromatina extraordinariamente condensada y por ello claramente Visible en las electronmi crografías) está excluida de una región considerable de las proximidades y alrede dor de los poros nucleares, delimitando una vía entre el citoplasma y el núcleoplasma (véase Figura 8-71). Además, en algunos casos se ha encontrado que los poros nucleares están bien organizados en la envoltura nuclear (véase Figura 8-72). Este orden podría ser el reflejo de la organización propia de la lámina nuclear a la que el poro está unido. ¿Existe en el interior del núcleo un esqueleto, análogo al citoesqueleto, sobre el que se organicen los componentes nucleares? Muchos biólogos celulares creen
Síntesis y procesamiento del RNA
(B)
40 ¡am
Figura 8 -69 Pareja de imágenes estereoscópicas tridimensionales de la disposición de los crom osom as politénicos de un núcleo sencillo de las glándulas salivales de D r o so p h ila . La estructura esférica es el nucléolo; la posición de cada crom osom a se representa por una línea que recorrería el eje del cromosom a. Los telómeros tienden a situarse en la superficie de la envoltura nuclear opuesta a la zona en la que se sitúa el nucléolo, donde se agrupan todos los centrómeros. Los cromosom as de estos núcleos no quedan enmarañados nunca, pero sus pliegues precisos y su disposición respecto a los cromosomas vecinos varía de un núcleo a otro. Aparte de esto, los núcleos son idénticos. (Para ser miradas con los ojos cruzados; por cortesía de Mark Hochstrasser y John Sedat.)
411
IAl
(C)
6 niii
que sí. La matriz nuclear o andamio se ha definido como el material insoluble que permanece en el núcleo después de una serie de etapas bioquímicas de ex tracción. Se ha demostrado que algunas de las proteínas que lo constituyen unen secuencias de DNA denominadas regiones SAR o MAR (de regiones asociadas a la matriz (Matrix-Associated Regions) o regiones asociadas al andamio (ScaffoldAssociated Regions). Se ha postulado que estas secuencias de DNA serían las que forman la base de los bucles de los cromosomas (véase Figura 8-18). Mediante es tos lugares de unión de los cromosomas, la matriz podría ayudar a ordenar los cromosomas, localizando genes, y regular la transcripción y replicación del DNA dentro del núcleo. Sin embargo aún se debate si la matriz celular es una estructu ra presente o no en células intactas, debido a que sus componentes estructurales todavía no se han podido identificar completamente.
Figura 8 -70 Mareaje selectivo de un crom osom a en el núcleo de una célula de mamífero en cultivo, durante la interfase. En (A) y (B), a la derecha se muestra un núcleo interfásico libre de restos citoplasmáticos, mientras que a la izquierda se ven cromosom as mitóticos procedentes de una segunda célula. (A) Resultados de la hibridación in situ (usando una sonda fluorescente) para detectar un cromosoma humano en una línea celular híbrida hom bre-hám ster. En (B) se muestra la misma preparación pero con todo el DNA marcado con un segundo colorante fluorescente. (C) Dibujo esquemático del cromosoma humano en el núcleo interfásico mostrado en (A), a una escala ligeramente superior. (A y B por cortesía de Joyce A. Kobori y David R. Cox.)
Resumen La RNA polim erasa, enzim a q u e cataliza la transcripción del DNA, es una molécula com pleja fo rm a d a p o r m uchas cadenas polipeptídicas. En las células eucariotas existen tres RNA polim erasas denom inadas I, II y III, relacionadas evolutivamente entre sí y con la RNA polim erasa bacteriana, y q u e presentan algunas subunidades en com ún. Se cree qu e después d e iniciar la transcripción, cada enzim a libera una o m ás subunidades y se u n e a otras enzimas necesarias p ara el crecimiento, la term i nación y la m odificación d e la cadena d e RNA. La m ayor parte del mRNA d e las células se produce p o r un proceso complejo q u e se inicia con la síntesis del RNA heterogéneo nuclear (hnRNA). La RNA polim e rasa II produce el transcrito prim ario hnRNA. Posteriormente se le añade un nucleó-
Figura 8-71 Electronm icrografía del núcleo de una célula de m am ífero. Es de destacar que la cromatina condensada que rodea la envoltura nuclear está excluida de las regiones próximas a los poros nucleares. (Por cortesía de Larry Gerace.)
envoltura nuclear
poro
nuclear
Táminu cromatina condensada
núcleo 412
Capítulo 8 : El núcleo celular
tido especial a su extremo 5 ' y es cortado y poliadenilado en su extrem o 3 ’. H abi tualmente, las m oléculas d e RNA modificadas están sujetas a uno o más procesos de recorte d e las secuencias intrónicas, en los cuales estas secuencias son eliminadas del hnRNA p o r una reacción catalizada p o r una gran partícula ribonucleoproteica denom inada espliceosoma. En este proceso d e m aduración, se elim ina la mayor parte d e la masa del transcrito prim ario de RNA, y se degrada en el núcleo. Como resultado d e ello, a u n qu e la tasa de producción d e hnRNA supone típicamente la m itad d e la síntesis del RNA total, el mRNA producido representa sólo alrededor del 3% d e la cantidad de RNA presente en cualquier mom ento en la célula. A diferencia d e los genes qu e codifican proteínas, transcritos p o r la RNA polim erasa II, los genes qu e codifican la mayor parte de los RNA estructurales son transcritos p or las RNA polim erasas I y III. Generalm ente estos genes están p resen tes en el genom a en múltiples copias y están organizados en grupos de genes en tán dem . La RNA polim erasa III produce una gam a de moléculas de RNA pequeños y es tables, entre las qu e se hallan los tRNA y el pequeño RNA 5S del ribosoma. La RNA polim erasa I produce la gra n molécula precursora d e rRNA (RNA 45S) qu e contiene los rRNA mayores. Con la excepción de los ribosomas de cloroplastos y mitocondrias, todos los ribosomas celulares se ensam blan en el nucléolo -u n orgánulo in tranuclear form ad o alrededor de los genes d e rRNA organizados en tándem, qu e se encuentran reunidos a pesar de estar situados en diferentes cromosomas.
Organización y evolución del genoma nuclear Gran parte de la historia evolutiva se halla grabada en los genomas de los orga nismos actuales y se puede descifrar a partir de un análisis cuidadoso de sus se cuencias de DNA. Hasta el momento se han secuenciado decenas de millones de nucleótidos y ya podemos empezar a intuir cómo han evolucionado durante cientos de millones de años los genes que codifican ciertas proteínas. Los estu dios sobre cambios ocasionales que ocurren en los cromosomas actuales pro porcionan claves adicionales para comprender los mecanismos que se han pro ducido por un cambio evolutivo en el pasado. En esta sección se considerarán algunos de los principios generales que han surgido a partir de estos estudios de genética molecular, haciendo énfasis en la organización y evolución del genoma nuclear de los eucariotas superiores.
I______________ !
1 |tm
Figura 8-7 2 Electronm icrograffa obtenida por criofractura de la envoltura nuclear alargada de una espora de helecho. Se destaca la
disposición ordenada en líneas paralelas de los complejos de poros nucleares. En las envolturas nucleares de otras células se han descrito tanto grupos concentrados de poros nucleares como áreas extraordinariamente libres de ellos, especialmente orientados con respecto a otras estructuras de la célula. (Por cortesía de Don H. Northcote; de K. Roberts y D. H. Northcote, Microsc.
Acta 7 1 :1 0 2 -1 2 0 ,1 9 7 1 .)
Los genomas se van ajustando de forma precisa por mutaciones puntuales y se remodelan radicalmente o aum entan de tamaño por recom binación genética45 Las secuencias de nucleótidos del DNA se han de replicar con precisión, y se han de conservar. En el Capítulo 6 se explican los elaborados mecanismos de la replicación y de la reparación del DNA que permiten que las secuencias de DNA se hereden con una fidelidad extraordinaria; sólo cambian al azar aproximadamen te un par de nucleótidos por mil cada 200 000 años. Pero incluso siendo así, en una población de 10 000 individuos cada substitución posible de nucleótidos será ensayada unas 50 veces en el transcurso de un millón de años, lo cual es un corto lapso de tiempo en relación al de evolución de las especies. La mayor parte de la variabilidad creada de esta forma será desventajosa para el organismo y en la población será seleccionada en contra. Por el contrario, cuando una variante poco frecuente sea ventajosa será rápidamente propagada por selección natural. En consecuencia, puede esperarse que en cualquier especie dada la función de la mayoría de los genes se irá optimizando por mutación puntual al azar y selec ción. Las mutaciones puntuales son un mecanismo eficiente para el ajuste preciso del genoma, y los progresos evolutivos a largo plazo han de depender de cam bios genéticos más radicales. La recom binación genética provoca grandes re ajustes del genoma con una frecuencia sorprendente: el genoma puede expan-
Organización y evolución del genoma nuclear
413
dirse o contraerse por duplicación o deleción; sus diferentes zonas se pueden translocar de una región a otra generando nuevas combinaciones. Las zonas que com ponen los genes -lo s exones y los elementos reguladores- se pueden mez clar com o si fueran módulos independientes generando proteínas que tienen funciones completamente nuevas. Además, las copias duplicadas de los genes tienden a divergir por mutaciones posteriores y se especializan en funciones su tilm ente diferentes. Por estos sistemas el genoma puede evolucionar volviéndose cada vez más complejo y sofisticado. En un mamífero, por ejemplo, existen m úl tiples formas variantes de casi todos los genes: diferentes genes de actinas para los diferentes tipos de células contráctiles, diferentes genes de opsinas para la percepción de las luces de diferentes colores, diferentes genes de la colágena para los diferentes tipos de tejidos conjuntivos, etc. La expresión de cada gen está regulada de acuerdo a sus funciones precisas y específicas. Además, la secuenciación del DNA pone de manifiesto que muchos genes comparten segm en tos modulares parecidos, pero aparte de ello, son muy diferentes: se encuentran con frecuencia motivos de secuencia comunes en proteínas no relacionadas de otra forma. La recom binación genética, proceso en el que un cromosoma intercambia material genético con otro, es fundamental para crear estas familias de genes y de segmentos génicos. En el Capítulo 6 se discutieron los mecanismos molecula res tanto de la recom binación general como de la recombinación específica. Aquí se considerarán algunos de sus efectos sobre el genoma.
Las secuencias repetidas en tándem de DNA tienden a perm anecer inalteradas46 Habitualmente las duplicaciones génicas se atribuyen a raros accidentes catali zados por alguna de las enzimas que median procesos recombinantes. Sin em bargo, los eucariotas superiores poseen un eficiente sistema enzimàtico capaz de unir los dos extremos de una molécula de DNA rota, por lo que tanto las du plicaciones com o las inversiones, deleciones y translocaciones de segmentos de DNA tam bién pueden ocurrir como consecuencia de una unión errática de frag mentos de cromosomas que se habían roto, de alguna forma, en más de un lu gar. Cuando varias secuencias duplicadas de DNA se unen cabeza con cola, se dice que están repetidas en tándem. Cuando aparece una primera repetición en tándem, se puede extender rápidamente a grandes series de repeticiones en tán dem mediante fenóm enos de entrecruzamiento desigual aún entre cromátidas hermanas, dado que la gran cantidad de secuencias apareables es un substrato ideal para la recom binación general (Figura 8-73). La duplicación de DNA segui da de entrecruzamiento secuencial desigual produce la amplificación del DNA, un proceso que frecuentem ente contribuye a la formación de cáncer increm en tando el número de copias de ciertos genes (proto-oncogenes) que facilitan la aparición de cáncer (véase Figura 24-27). Los genes repetidos en tándem aumentan y disminuyen de número debido a entrecruzamiento desigual (véase Figura 8-73). Por lo tanto, podría esperarse que sólo se mantengan en grandes cantidades por selección natural si las copias extra son beneficiosas para el organismo. Ya hemos hablado de los cientos de genes repetidos en tándem que codifican el precursor mayor del RNA ribosómico; estas copias de genes son necesarias para mantener la demanda de nuevos ribosomas de las células en crecimiento. De manera similar, los vertebrados tie nen grupos de genes repetidos en tándem que codifican otros RNA estructura les, incluyendo el rRNA 5S, los snRNA U1 y U2, y algunos grupos de genes repeti dos de las histonas que producen grandes cantidades de las histonas necesarias durante cada fase S. Se podría esperar que en el transcurso de la evolución las secuencias de los genes que m antienen una disposición en tándem -y del DNA espaciador no transcrito entre ellos- podrían derivar de forma especial. Al existir muchas co pias del mismo gen, podría existir poca selección contra mutaciones al azar que
414
Capítulo 8 : El núcleo celular
DNA repetido en tándem
Figura 8-73 Una familia de genes repetidos organizados en tándem gana y pierde copias con frecuencia debido a procesos de entrecruzam iento desigual entre los crom osom as herm anos que contienen los genes. Este fenóm eno es frecuente debido a que las largas regiones de secuencia de DNA homólogo son un buen substrato para el proceso de recom binación genética general (discutido en el Capítulo 6 ).
genes - repetidos en tándem
conversion I
expansión
m utación
expansion contracción
) conversion conversion conversion
etc. (A) HOMOGENEIZACIÓN POR RECOMBINACIÓN DESIGUAL ENTRE CROMOSOMAS HERMANOS
(B) HOMOGENEIZACION POR CONVERSIÓN GÈNICA
alterasen una o algunas de las copias del gen; además, muchos de los cambios de nucleótidos ocurridos en las largas regiones no transcritas podrían no tener consecuencias funcionales. Sin embargo, generalmente las secuencias de los ge nes repetidos en tándem y sus DNA espaciadores son casi idénticos. Se cree que dos son los mecanismos responsables de este hecho. Primero, fenómenos recu rrentes de entrecruzamiento desigual pueden causar la expansión o la contrac ción de las disposiciones en tándem, y simulaciones por ordenador demuestran que esto tiende a mantener las mismas secuencias (Figura 8-74A). Segundo, la conversión génica -proceso por el cual una porción de secuencia de DNA cambia al copiar una secuencia similar presente en un lugar diferente del genoma, como se describe en el Capítulo 6 (Figura 8-74B )- puede actuar homogeneizando las secuencias de DNA relacionadas. Aunque la conversión génica no requiere que los genes estén repetidos en tándem, en los eucariotas superiores parece que es más frecuente entre aquellos que se encuentran próximos. El desplazamiento de una copia de un gen dispuesto en tándem hasta otra localización crom osóm ica lo protegerá de ambas influencias homogeneizadoras. Así pues, la translocación génica accidental es una etapa importante en la evolución de nuevos genes: permite a la secuencia translocada evolucionar in dependientemente, de modo que pueda adquirir nuevas funciones que puedan beneficiar al organismo.
Figura 8 -7 4 Dos procesos que contribuyen a m antener iguales entre sí a todas las secuencias de DNA organizadas en tándem . (A) El continuo increm ento y reducción del número de copias génicas en una organización en tándem, producidos por la recom binación desigual (véase Figura 8-73) tiende a homogenizar todas las secuencias génicas asociadas. (B) En la conversión génica una copia del gen actúa como molde, pasando la totalidad o parte de su secuencia a una segunda copia del gen. En los eucariotas superiores este proceso se presenta casi exclusivamente entre copias de genes situadas próximas en el cromosoma; en los eucariotas inferiores com o hongos, donde se ha estudiado con mayor detalle, no está restringido a genes próximos.
La evolución de la fam ilia de los genes de la globina muestra que las duplicaciones al azar contribuyen a la evolución de los organismos47 Además de generar nuevos conjuntos de genes repetidos en tándem, las dupli caciones de DNA han jugado un papel general más importante en la evolución de nuevas proteínas. La familia de los genes de las globinas proporciona un buen ejemplo de ello, pues su historia evolutiva ha sido especialmente estudia da. Las inconfundibles homologías en cuanto a la secuencia de aminoácidos y a la estructura que existe entre los genes actuales de globina indican que todos ellos han de derivar de un gen ancestral común a pesar de que algunos de ellos ocupen ahora localizaciones ampliamente separadas en el genoma de los m am í feros. Considerando las diferentes formas de la proteína en organismos pertene cientes a diferentes niveles de la escala filogenética, podemos reconstruir algu nos de los fenómenos del pasado que han dado lugar a las diversas formas de hemoglobina transportadoras de oxígeno. Una molécula como la hemoglobina debe necesariam ente permitir a los organismos pluricelulares que la posean cre cer hasta adquirir un gran tamaño, puesto que los grandes animales no pueden
Organización y evolución del genoma nuclear
4 15
confiar la oxigenación adecuada de sus tejidos exclusivamente a la difusión del oxígeno a través de la superficie corporal. A consecuencia de ello se encuentran moléculas similares a la hemoglobina en todos los vertebrados y en algunos in vertebrados. La molécula transportadora de oxígeno más primitiva es una cade na polipeptídica de globina de unos 150 aminoácidos, que se encuentra en mu chos gusanos marinos, en insectos y en peces primitivos. Sin embargo, la molécula de hemoglobina de los vertebrados superiores está compuesta por dos tipos de cadenas de globina. Parece que hace unos 500 millones de años, duran te la evolución de los peces superiores ocurrieron unas mutaciones y duplicacio nes génicas. Estos fenóm enos establecieron inicialmente dos genes de globinas ligeramente diferentes, que codificaban las cadenas de hemoglobina a y (3 en el genoma de cada individuo. En los vertebrados superiores cada molécula de he moglobina es un complejo de dos cadenas a y dos cadenas p (Figura 8-75). Esta estructura es mucho más eficiente que una sola molécula de globina. Los cuatro lugares de unión al oxígeno de la molécula a 2$¿ interaccionan entre sí. Esta inte racción provoca un cambio alostérico cooperativo en la molécula cuando capta y libera oxígeno, que permite a la hemoglobina tomar y liberar el oxígeno con una eficiencia muy superior a la de la versión de cadena única. Más tarde, durante la evolución de los mamíferos, aparentemente el gen de la cadena P sufrió una mutación y duplicación, dando lugar a una segunda cade na del tipo P que se sintetiza específicamente en el feto. La molécula de hemoglo bina resultante tiene una afinidad superior por el oxígeno que la hemoglobina del adulto y, por lo tanto, colabora en la transferencia de oxígeno desde la madre al feto. Posteriormente, el gen de esta nueva cadena de tipo p mutó y nuevamente se duplicó, produciendo dos nuevos genes, e y y, produciéndose la cadena e de forma más temprana durante el desarrollo (formando a ^ ) que la cadena y fetal, que forma a 2y2 (véase Figura 9-52). Aún más tarde, durante la evolución de los primates, hubo una duplicación de la cadena p, dando lugar al gen 8 de la globina y con él a una forma minoritaria de la hemoglobina (cc282) que sólo se encuentra en los primates adultos (Figura 8-76). Cada uno de estos genes duplicados se ha ido modificando por mutaciones puntuales que afectan a las propiedades de la molécula final de la hemoglobina, y por cambios en las regiones reguladoras que determinan el momento y el nivel de expresión del gen. El resultado final de los procesos de duplicación génica que han dado lugar a la variedad de cadenas de globina se puede ver claramente en los genes que surgieron a partir del gen p original, los cuales están dispuestos como series de secuencias homologas de DNA localizadas a unos 50 000 pares de nucleótidos una de otra. En otro crom osom a humano se localiza una agrupación similar pero para los genes derivados del gen a globina. Dado que los grupos de los ge nes a y P de las globinas se encuentran en cromosomas diferentes en aves y m a míferos pero en el mismo crom osom a en la rana Xenopus, se cree que el fenó meno de translocación separó los genes hace aproximadamente 300 millones de años (véase Figura 8-76). Probablemente estas translocaciones contribuyeron a la estabilización de los genes duplicados con funciones distintas mediante su protección de los procesos homogeneizadores que actúan sobre genes muy pró ximos y de secuencia similar (véase Figura 8-74). En los conjuntos génicos de la a y P globina existen varias secuencias de DNA de la globina duplicadas que no son genes funcionales. Son ejemplos de pseudogenes. Tienen una gran semejanza con genes funcionales pero han sido inutiliza dos mediante mutaciones que impiden su expresión. La existencia de dichos pseudogenes no es sorprendente, pues no es de esperar que cada duplicación gé nica conduzca al desarrollo de un nuevo gen funcional. Además, las secuencias de DNA no funcional no se eliminan rápidamente del DNA, como indica la gran cantidad de DNA no codificante presente en los genomas de mamíferos, tal como se ha descrito previamente. Cuando se hayan comparado las secuencias de DNA de muchas familias gé nicas en muchos animales de complejidad creciente, podremos conocer una parte importante de nuestra historia evolutiva (véase también la Figura 7-4).
416
Capítulo 8 : El núcleo celular
la globina de cadena única une una m olécula de oxígeno
lugar de u del oxígeno al grupo hemo
EVOLUCION DE UNA SEGUNDA CADENA DE GLOBINA POR DUPLICACIÓN GÉNICA SEGUIDA DE MUTACIÓN
globina de cuatro cadenas que une cuatro m oléculas de oxígeno de form a cooperativa Figura 8-75 Com paración de la estructura de las globinas de cadena única y de cuatro cadenas. La globina de cuatro cadenas mostrada es la hemoglobina, que es un com plejo de dos cadenas de globina a y dos (3. La globina de cadena sencilla forma, en algunos invertebrados, un dímero que se asocia cuando une oxígeno, lo que representaría un intermediario en la evolución de las globinas de cuatro cadenas.
Los genes que codifican nuevas proteínas se pueden crear mediante la recom binación de exones45 El papel de la duplicación de DNA en la evolución no está limitado a la gene ración de grandes familias génicas. También puede ser importante en la genera ción de genes sencillos. La proteínas codificadas por los genes creados de esta forma pueden ser reconocidos por la presencia de dominios proteicos similares repetidos, los cuales pueden estar unidos covalentemente entre sí, formando se ries. Por ejemplo, las inmunoglobulinas (Figura 8-77) y las albúminas, así como muchas proteínas fibrosas (como las colágenas) están codificadas por genes que han evolucionado por duplicaciones repetidas de una secuencia de DNA pri mordial. En genes que han evolucionado de esta manera, y también en muchos otros genes, a menudo ocurre que cada exón codifica una unidad proteica plegada in dividual, o dominio. Se cree que la organización de las secuencias codificantes del DNA en forma de estos exones separados por largos intrones, ha facilitado de forma notable la evolución de nuevas proteínas. Por ejemplo, las duplicaciones necesarias para formar un solo gen codificante de una proteína con dominios re petidos pueden ocurrir por rotura y reunión del DNA en cualquiera de los largos intrones o en cualquier punto de un exón codificante de un dominio proteico útil; si no hubiera intrones, en el gen original sólo podría haber unos cuantos lu gares en los cuales un intercambio por recombinación entre moléculas hermanas de DNA podría duplicar el dominio. Los intrones, al permitir que la duplicación tenga lugar potencialmente en muchos puntos en lugar de tan sólo unos cuantos, incrementan en gran medida la probabilidad de que ocurra un fenómeno de du plicación favorable. Por esta misma razón, la presencia de intrones incrementa en gran medida la probabilidad de que un fenómeno de recombinación fortuito genere un híbrido funcional al unir dos secuencias de DNA inicialmente separadas que codifican distintos dominios proteicos de forma que ambos dominios se conserven en la proteína híbrida que codifica el nuevo gen (véase Figura 8-81, por ejemplo). En muchas proteínas actuales se pueden ver los resultados esperados de estas re combinaciones (véase Figura 3-43). Así, se cree que la gran separación entre los exones que codifican dominios individuales en los eucariotas superiores acelera el proceso por el cual los fenómenos de recombinación genética al azar generan nuevas proteínas útiles. Esto podría ayudar a explicar el éxito de la evolución de estos organismos tan complejos.
crom osom a 16 I
varios genes a \
I
crom osom a 11 l
i
£
YG YA
\
l
§
7/
P
Figura 8-76 Esquema evolutivo de las cadenas de globina portadoras de oxígeno en la sangre de los animales. El esquema hace énfasis en la familia de las globinas (i. Una duplicación reciente del gen de la cadena y produjo Y ; y y\ que son cadenas fetales de tipo (3 con funciones idénticas. En la parte superior de la figura se muestran las localizaciones de los genes de globina en el genoma humano.
cadena pesada
/
La mayoría de las proteínas se han originado probablemente a partir de genes altam ente fragmentados48 El descubrimiento, en 1977, de los genes fragmentados, fue inesperado. Hasta entonces todos los genes que se habían analizado con detalle eran genes bacte rianos, los cuales no tienen intrones. Las bacterias tampoco tienen núcleo ni sis temas de membranas internas, tienen genomas más pequeños que el de las cé lulas eucariotas y tradicionalmente se considera que se parecen a las células más sencillas a partir de las que han derivado las células eucariotas. No es sorpren dente que la mayoría de los biólogos pensaran inicialmente que los intrones eran un rasgo extraño y aparecido tardíamente en la línea de los eucariotas. Sin embargo, ahora parece más probable que los genes fragmentados tengan un ori gen muy antiguo y que las bacterias hayan perdido sus intrones después de que hayan evolucionado sus proteínas. La idea de que los intrones son muy antiguos es compatible con los concep tos actuales de la evolución proteica mediante recombinación de prueba y error de exones que codifican distintos dominios proteicos. Además, se han obtenido evidencias del antiguo origen de los intrones mediante el examen del gen que codifica la ubicua triosafosfato isomerasa. La triosafosfato isomerasa desempeña un papel esencial en el metabolismo de todas las células, catalizando la inter-
Organización y evolución del genoma nuclear
Figura 8 -77 Esquema representando una molécula de anticuerpo (inmunoglobulina). Esta molécula es un com plejo de dos cadenas pesadas y dos ligeras, idénticas entre sí. Cada una de las cadenas pesadas contiene cuatro dominios similares unidos covalentemente, mientras que las cadenas ligeras contienen dos de estos dominios. Cada dominio está codificado por un exón diferente, y se cree que todos ellos han evolucionado por duplicaciones seriadas a partir de un exón ancestral único.
417
(A)
50 am inoácidos
posición de los intrones en el maíz T I
H2N
f I
A
? I
i
? I
A
T I
A
T II
A
T I
A
Y I
COOH
posición de los intrones en los vertebrados
(B)
progenote
eubacterias que form aron los cloroplastos y las m itocondrias M
I
S. cerevisiae (levadura)
A spergillus (hongo)
maíz (planta)
vertebrados (animales)
conversión entre el gliceraldehído-3 fosfato y la dihidroxiacetona fosfato -u n paso central en la glucolisis y en la gluconeogénesis (véase Figura 2-21). Compa rando la secuencia de aminoácidos de esta enzima de varios organismos es posi ble deducir que la enzima evolucionó antes de la divergencia de los procariotas y los eucariotas, a partir de un ancestro común; las secuencias de aminoácidos humanas y bacterianas son idénticas en un 46%. El gen que codifica la enzima tiene 6 intrones en los vertebrados (pollo y humano) cinco de los cuales están precisamente en la misma posición que en el maíz. Esto implica que estos cinco intrones estaban presentes en el gen antes de que se separaran las plantas y los animales en la genealogía eucariota, hace un tiempo estimado de 109 años (Figu ra 8-78). En general, los diminutos organismos unicelulares están sometidos a una fuerte presión selectiva para reproducirse mediante división celular a la máxima velocidad permitida por las concentraciones de nutrientes y por el entorno. Por esto, han de minimizar la cantidad de DNA innecesario que deben sintetizar en cada ciclo de división. Para grandes organismos que viven de la depredación -e n los que el tamaño es una ventaja- y para los organismos pluricelulares en ge neral -e n los que las velocidad de división celular está limitada por otros requeri m ientos- no existe esta fuerte presión selectiva para eliminar el DNA superfluo del genoma. Este argumento puede ayudar a explicar por qué las bacterias han perdido sus intrones mientras que los eucariotas los han mantenido. Esto tam bién explica por qué el hongo pluricelular Aspergillus tiene cinco intrones en el gen de la triosafosfato isomerasa mientras que Saccharomyces, muy similar, no tiene ninguno. ¿Cuál es el m ecanism o por el que se pierden los intrones? La pérdida preci sa de intrones por deleciones al azar de pequeños fragmentos de DNA debe ocurrir muy raramente, mientras que la pérdida precisa y selectiva de intrones no es rara en las células eucariotas (y posiblem ente fue también frecuente en los ancestros de las bacterias actuales). Mientras que la mayoría de los vertebrados tienen sólo un gen de la insulina, con dos intrones, las ratas poseen un segundo gen, vecino al anterior, con un sólo intrón. Este segundo gen parece surgir m e diante duplicación génica, relativamente reciente y con la consiguiente pérdida
418
Capítulo 8 : El núcleo celular
Figura 8-7 8 El antiguo origen de los genes fragmentados. (A) Comparación entre la estructura de los exones del gen de la triosafosfato isomerasa de las plantas y de los animales. Las posiciones de los intrones que son idénticas en el maíz (grano) y en los vertebrados se han marcado con cabezas de flecha verdes, y las que son diferentes, con cabezas de flecha azules. Dado que se estima el tiempo de divergencia entre plantas y animales en mil millones de años, los intrones deben compartir el mismo origen. (B) Esbozo de cóm o puede haber evolucionado un gen determinado. Las secuencias exónicas se muestran en rojo y las intrónicas en gris. El gen ilustrado codifica una hipotética proteína necesaria para todas las células. Como la triosa fosfato isomerasa, esta proteína debe haber evolucionado alcanzando su estructura tridimensional final antes de que los linajes de las eubacterias, arquebacterias y eucariotas se separaran de una célula antecesora común -designada como “progenote”. La línea discontinua verde m arca los momentos aproximados en que se produjeron fenóm enos de endosimbiosis que dieron lugar a las mitocondrias y a los cloroplastos (véanse págs. 21-22). (A, de W. Gilbert, M. Marchionni y G. McKnight, Cell 46: 151-154, 1987. © Cell Press.)
Tabla 8-4 Las tres familias principales de elementos transponibles Estructura
Genes en el elemento completo
Sistemas de desplazamiento
Ejemplos
codifica transposasa
se desplaza como DNA, ya sea por escisión o siguiendo la vía replicativa
elemento P (Drosophila) Ac-Ds (maíz) Tn3 e ISl (E. coli) Tam3 (dragón)
codifica una transcriptasa inversa y se parece a un retrovirus
se desplaza vía un intermediario de RNA producido por el promotor en el LTR
Copia (Drosophila) Ty (levadura) THE-1 (humanos) Bsl (maíz)
codifica una transcriptasa inversa
se desplaza vía un intermediario de RNA que probablemente está producido por un promotor vecino
elemento F (Drosophila) L1 (humanos) Cin4 (maíz)
cortas repeticiones invertidas en cada extremo
repeticiones terminales largas y repetidas de forma directa (LTR*) en los extremos i rrl Poli-A en el extremo 3’ del transcrito de RNA; a menudo en el extremo 5 ’ está truncado
Estos elementos tienen una longitud de entre 2000 y 12 000 pares de nucleótidos; cada familia contiene muchos miembros, de los que en esta tabla se relacionan algunos. *LTR, de long Terminal repeats.
de uno de sus intrones. Dado que la pérdida de intrones requiere la unión exacta de las secuencias de DNA codificantes, se supone que este nuevo gen surgió a partir de una incorporación poco frecuente en el genoma de una copia de DNA del mRNA del gen apropiado, del cual se habían eliminado con precisión los in trones. Actualmente sabemos que los RNA mensajeros se pueden copiar en DNA a través de la actividad de la transcriptasa inversa (véase pág. 303), y se cree que las enzimas de recom binación podrían permitir ocasionalmente que estas co pias se aparearan con la secuencia original, la cual luego sería “corregida” a una forma libre de intrones por un proceso de conversión génica. Este mecanismo de pérdida de intrones se ha podido demostrar en el laboratorio empleado las potentes técnicas de análisis genético disponibles en S. cerevisiae. Las transcriptasas inversas no se requieren en las vías genéticas más impor tantes, pero son producidas en las células por elementos transponibles específi cos (véase Tabla 8-4), así como por todos los retrovirus. Como se verá más ade lante, la producción de copias DNA de fragmentos de genoma mediante transcripción inversa ha contribuido de diferentes formas a la evolución de los genomas de los organismos superiores.
Una fracción mayoritaria del DNA de los eucariotas superiores está formada por secuencias de nucleótidos repetidas y no codificantes49 Los genomas de las células eucariotas no sólo contienen intrones, sino que tam bién presentan un gran número de copias de otras secuencias de DNA, aparen temente no esenciales, que no codifican proteínas. La presencia de estas se cuencias repetidas de DNA en los eucariotas superiores se puso de manifiesto en primer lugar mediante una técnica de hibridación que mide el número de copias génicas. En este proceso el genoma se rompe m ecánicamente en cortos frag mentos de DNA de doble hélice, de aproximadamente 1000 pares de nucleóti dos, y estos fragmentos se desnaturalizan produciéndose cadenas sencillas de DNA. La velocidad con la cual los fragmentos de DNA de cadena sencilla de la mezcla se vuelven a unir formando fragmentos de doble hebra, en condiciones en las que la conformación de la doble hélice es estable, depende de cuánto tiempo tarde cada fragmento en encontrar una secuencia complementaria con la que aparearse, lo que a su vez depende de la concentración de los fragmentos
Organización y evolución del genoma nuclear
41 9
5' 3'
A T A A A C T A T A A A C T A T A A A C T I. . . . ._ J ...... .. I: , „ ........ J 1........... "I [ ......... I T A T T T G A T A T T T G A T A T T T G A
DNA
Figura 8-79 DNA satélite. Se muestra
3' 5'
adecuados en la mezcla. Generalmente esta reacción es muy lenta. Por ejemplo, el genoma haploide de una célula de mamífero formará aproximadamente 6 mi llones de fragmentos de 1000 nucleótidos cada uno; cualquier fragmento cuya secuencia se halle en una sola copia tendrá que colisionar al azar con 6 millones de cadenas no complementarias para encontrar la suya. Cuando el DNA de una célula humana se analiza de esta forma en condicio nes que requieran un emparejamiento perfecto (condiciones de elevada severi dad, véase Figura 7-17), alrededor del 70 % de las hebras de DNA se aparean tan lentam ente com o se podría esperar para una gran colección de fragmentos de secuencia única (no repetida), requiriendo varios días para un apareamiento completo. Pero el 30% restante de las hebras se unen mucho más rápidamente. Estas hebras contienen secuencias que están repetidas muchas veces en el geno ma, y por lo tanto colisionan con una hebra complementaria de una forma rela tivamente rápida. La mayoría de estas secuencias de DNA altamente repetidas no codifican proteínas, y son de dos tipos: aproximadamente una tercera parte son DNA satélites repetidos en tándem, de los que trataremos a continuación, y el resto son DNA repetidos intercalados. La mayoría de estas últimas secuencias de DNA derivan de unas cuantas secuencias de DNA transponibles que se han multiplicado hasta dar lugar a un alto número de copias en el genoma humano.
Las secuencias de DNA satélite no tienen ninguna función conocida59 Normalmente, las hebras de DNA que en un experimento tipo como el que se acaba de describir forman doble hebra más rápidamente son repeticiones en tándem muy largas de una secuencia de nucleótidos corta (Figura 8-79). La uni dad repetitiva de una secuencia de este tipo puede estar compuesta de tan sólo uno o dos nucleótidos; sin embargo, muchas de las repeticiones son largas, y en mamíferos están formadas típicam ente por variantes de una corta secuencia or ganizada en repeticiones de unos cuantos centenares de nucleótidos. Estas re peticiones en tándem de una secuencia sencilla se denominan DNA satélites de bido a que las primeras secuencias de este tipo que fueron descubiertas tenían una proporción poco habitual de nucleótidos, lo que hizo posible su aislamiento del grueso del DNA celular como un com ponente minoritario (o “satélite”). Ge neralmente las secuencias de DNA satélite no se transcriben y muy a menudo están localizadas en la heterocromatina asociada con las regiones centroméricas de los cromosomas. En algunos mamíferos, un solo tipo de secuencia satélite constituye el 10% o más del DNA, e incluso puede llegar a ocupar un brazo ente ro de un cromosoma, de tal modo que la célula contiene millones de copias de la secuencia repetida básica. Parece que las secuencias satélite de DNA han cambiado en el curso de la evolución de una forma extraordinariamente rápida, e incluso han cambiado sus posiciones en los cromosomas. Por ejemplo, cuando se comparan dos cro mosomas mitóticos homólogos de cualquier humano, algunas de las secuencias de DNA satélite se encuentran dispuestas de manera notablemente diferente en los dos cromosomas. Además, en contraste con el alto grado de conservación de las secuencias de DNA de cualquier parte del genoma, generalmente existen marcadas diferencias en las secuencias del DNA satélite de dos especies íntima mente relacionadas. Todavía no se ha encontrado ninguna función para las se cuencias de DNA satélite: por el momento, los experimentos diseñados para de mostrar que estas secuencias participan en el apareamiento de cromosomas o en la organización nuclear no han conseguido revelar ningún tipo de evidencia 420
Capítulo 8 : El núcleo celular
una secuencia sencilla de DNA satélite de D rosophila. Consiste en muchas repeticiones de una secuencia de siete nucleótidos organizadas en serie, y se presentan en millones de copias por genoma haploide de D rosophila.
en este sentido. Por lo tanto se ha sugerido que estas secuencias repetidas son una forma extrema de secuencias “de DNA egoísta”, cuyas propiedades asegu ran su propia retención en el genoma pero que no hacen nada para ayudar a la supervivencia de las células que los contienen. Otras secuencias que habitual mente se consideran como egoístas son los elementos transponibles, que expli camos a continuación.
La evolución de los genomas se ha acelerado mediante al menos tres tipos de elem entos transponibles51 Generalmente los genomas contienen muchas variedades de elementos trans ponibles. Estos segmentos de DNA fueron descritos por primera vez en el maíz, y varios de ellos han sido secuenciados y caracterizados. Los elementos trans ponibles de eucariotas se han estudiado muy ampliamente en Drosophila, don de se conocen más de 30 variedades, que oscilan entre 2000 y 10 000 pares de nucleótidos de longitud y están presentes en número de entre 5 y 10 copias por célula diploide. Se pueden distinguir al menos tres grandes clases de elementos transponi bles en función de las peculiaridades de organización de su secuencia (Tabla 8-4). Algunos elementos se desplazan de un lugar a otro entre cromosomas, en forma de DNA, mientras que muchos otros se mueven vía un intermediario de RNA, como se describe en el Capítulo 6. En cualquier caso se pueden multiplicar y extender desde un lugar de un genoma a multitud de otros puntos, compor tándose algunas veces como parásitos perjudiciales para la salud. Parece que los elementos transponibles constituyen al m enos el 10% de los genomas de los eucariotas superiores. Aunque la mayoría de estos elementos se desplazan sólo muy raramente, el movimiento de otros elementos tiene un im portante efecto sobre la variabilidad de las especies. Por ejemplo, más de la m i tad de las mutaciones espontáneas examinadas en Drosophila son debidas a la inserción de un elemento transponible en o cerca del gen mutado. Las mutaciones pueden ocurrir cuando un elemento se inserta en un gen o cuando se desplaza a cualquier otro lugar. Todos los elementos transponibles conocidos provocan una “duplicación específica de lugar” corta, a consecuencia de su propio m ecanismo de inserción (véase Figura 6-70); generalmente cuando los elem entos transponibles salen, dejan parte de esta duplicación - a menudo acompañado de otros cambios locales en la secuencia (Figura 8-80). Así, un ele m ento transponible entra y sale de los cromosomas, provocando una variedad de adiciones y deleciones de secuencias cortas de nucleótidos. Los elem entos transponibles tam bién contribuyen a la diversidad del geno m a de otro modo. Cuando dos elem entos transponibles que son reconocidos por la misma enzima de recom binación específica de lugar (transposasa ), se in tegran en puntos vecinos del cromosoma, el DNA situado entre ellos puede ser un substrato para la transposición de la transposasa. Ello proporciona una vía particularm ente efectiva para la duplicación y barajado de los exones (exon
crom osom a 123456789
elem ento transponible + A BCDEF
INSERCIÓN DEL ELEMENTO TRANSPONIBLE EN UN NUEVO LUGAR DEL CROMOSOMA 123456ABCDEF56789 duplicación de la secuencia del lugar de inserción
CAMBIOS DE SECUENCIA PROVOCADOS POR EL ELEMENTO TRANSPONIBLE
1 2 3 4 5 8 A 5 6789
1 2 3 4 5 6 5 6 7 89
1234566556789
12 5 6 7 8 9
escisión incom pleta del elem ento transponible
escisión precisa dejando la duplicación
escisión con secuencia extra invertida
escisión con deleción
Organización y evolución del genoma nuclear
Figura 8-80 Algunos cambios producidos en el DNA cromosómico por los elementos transponibles. La inserción de los elementos transponibles siempre provoca una pequeña duplicación de la secuencia del lugar de inserción, de entre 3 a 12 pares de bases, dependiendo del elemento transponible. Las enzimas de recombinación específica de lugar asociadas con el elemento transponible pueden producir su eliminación del cromosoma, proceso en el que frecuentemente no se recupera la secuencia del DNA cromosómico original, como se muestra en los cuatro ejemplos.
421
elem entos transponibles exón 1A
exón 3A GEN A que contiene dos elem entos transponibles sim ilares en los intrones
term inales repetidos
fragm ento del GEN A
ESCISION ANO M ALA DEL EXON 2A POR UNA TRANSPOSASA QUE RECONOCE LOS TERMINALES REPETIDOS exón 2A exón 1B exón 2B exón 3B \ / fragm ento h— I I 1 i del GEN B INSERCION EN EL INTERIOR DEL GEN B
exón 1B exón 2B
\
\
I
■
exón 2A I— +
exón 3B /
A
I
GEN B con un exón extra
shuffling), por lo que estos elementos pueden ayudar a crear nuevos genes (Fi gura 8-81).
Los elem entos transponibles afectan frecuentem ente a la regulación génica52 Se ha observado que, con frecuencia, las redistribuciones de las secuencias de DNA provocadas por los elem entos transponibles alteran el momento, el nivel, o el patrón espacial de expresión de los genes cercanos, sin afectar la secuencia de la proteína o del RNA que codifica el gen. Esto puede cambiar un aspecto sutil del desarrollo del animal o planta, como la forma de un ojo o de una flor. Podría esperarse que la mayoría de estos cam bios en la regulación génica fueran perju diciales para un organismo, pero algunos de ellos podrían aportar nuevos bene ficios y de esta manera se extenderían en la población por selección natural. Los efectos sobre la regulación génica son comunes, en parte, debido a que el movimiento de un elemento transponible suele arrastrar con él nuevas se cuencias que actúan como lugares de unión para proteínas de unión a DNA es pecíficas de secuencia, incluyendo transposasas y las proteínas que regulan la transcripción del DNA del elemento transponible. Por lo tanto, estas secuencias pueden actuar como secuencias reguladoras denominadas increm entadores o activadores (enhancers) (véase pág. 451), y afectar la transcripción de genes lo calizados en las proximidades. Frecuentem ente estos efectos son la causa de la evolución de las células cancerosas, en las que se pueden crear oncogenes por la transposición de tales secuencias reguladoras en las proximidades de un protooncogén, com o se describirá en el Capítulo 24. La organización de los genomas de los eucariota superiores, con largas se cuencias de DNA no codificante intercaladas con secuencias comparativamente cortas de DNA codificante, proporciona un cómodo “campo de juego” para la integración y supresión de secuencias de DNA móviles. Dado que la transcrip ción génica puede estar regulada desde distancias de decenas o miles de pares de nucleótidos de un promotor, podría esperarse que muchos de los cambios resultantes en el genoma afectaran a la expresión génica; por el contrario, cabe esperar que relativamente pocos cam bios rompieran los cortos exones que con tienen las secuencias codificantes. ¿Este gran exceso de DNA no codificante de los eucariota superiores puede haberse visto favorecido por la selección durante la evolución a consecuencia de la flexibilidad reguladora que proporciona a los organismos que presentan una gran variedad de elementos transponibles? Lo que se conoce sobre los sistemas reguladores que controlan los genes de los organismos eucariotas superiores es consistente con esta posibilidad. Al parecer los amplificadores, como los exones,
422
Capítulo 8 : El núcleo celular
Figura 8-81 Ejemplo de barajado de exones que puede estar provocado por los elementos transponibles. Cuando ocurre que dos elementos del mismo tipo (DNA rojo) se insertan uno cerca del otro en el cromosoma, los m ecanismos de transposición pueden usar los extremos de dos elementos diferentes (en lugar de los dos extremos del mismo elemento) y de esta forma se desplazará el DNA que había entre ellos a un nuevo sitio del cromosoma. Dado que los intrones son relativamente más largos que los exones, es frecuente la inserción de un nuevo exón en el interior de un intrón preexistente.
actúan como módulos diferentes; la actividad de un gen depende de la suma de influencias recibidas por su promotor a partir de un conjunto de amplificadores (véase Figura 9-44). Al desplazar estos módulos activadores por todo el genoma, los elem entos transponibles pueden permitir que la regulación gènica sea opti mizada para la supervivencia de los organismos a largo plazo.
Las “explosiones de transposición” provocan cambios catastróficos en los genomas e incrementan la diversidad biológica53 Otro rasgo único que caracteriza a los elementos transponibles como mutágenos es su tendencia a sufrir largos períodos quiescentes durante los cuales permane cen fijos en sus posiciones cromosómicas, seguidos por un período de intenso movimiento. Su transposición, y por consiguiente su acción mutagénica, se activa de vez en cuando en unos cuantos individuos de una población de organismos. Estos cambios catastróficos en los genomas, denominados explosiones de trans posición (transposition bursts), pueden implicar transposiciones casi simultáneas de varios tipos de elementos transponibles. Las explosiones de transposición fueron observadas por vez primera en las plantas de maíz que estaban sujetas a rotura crom osóm ica repetida. Tam bién fueron observadas en cruces entre cier tas cepas de moscas -u n fenómeno conocido como disgénesis híbrida. Cuando ocurren en la línea germinal, inducen múltiples cambios en el genoma de la pro genie individual de la m osca o la planta. Mediante el cambio simultáneo de varias propiedades de un organismo, las explosiones de transposición increm entan la probabilidad de que dos nuevos rasgos que son útiles conjuntam ente pero de nulo valor selectivo por sí mismos, aparezcan en un individuo de una población. En varios tipos de plantas existen evidencias de que las explosiones de transposición pueden ser activadas por es trés ambiental severo, creando una variedad de organismos de la progenie m o dificados al azar, algunos de los cuales pueden adaptarse mejor a las nuevas condiciones que sus padres. Parece que, al m enos en estas plantas, ha evolucio nado un m ecanismo de activación de los elementos transponibles para que ac túen com o mutágenos y creen un amplio rango de organismos variantes cuando esta variación es más necesaria. Así, los elementos transponibles no son necesa riamente parásitos desorganizadores; por el contrario, ocasionalmente pueden actuar como simbiontes útiles que colaboran en la supervivencia, a largo plazo, de las especies cuyos genomas habitan.
Aproximadamente un 10% del genoma humano consiste en dos familias de elementos transponibles54 El DNA de los primates es especial, al menos en un aspecto: contiene un elevado número de copias de dos secuencias de DNA transponibles que parecen haber invadido nuestros cromosomas. Ambas secuencias se desplazan mediante un proceso mediado por RNA que requiere de la presencia de una transcriptasa in versa. Uno de ellos es el elem ento transponible L l, que se parece al elemento F de Drosophila, y al elemento Cin4 del maíz; al parecer codifica una transcriptasa inversa (véase Tabla 8-4, pág. 419). Los elementos transponibles han evoluciona do en general con sistemas de control por retroalimentación que limitan severa m ente su número en cada célula (salvando por lo tanto a la célula de un desastre potencial); sin embargo, el elemento L l en los humanos constituye aproximada mente un 4 % de la m asa total del genoma. Menos habitual incluso es la secuencia Alu, que es muy corta (aproximada mente 300 pares de nucleótidos) y que se desplaza igual que un elemento trans ponible, creando duplicaciones específicas de lugar cuando se inserta. Sin em bargo, derivó a partir de un gen de RNA 7SL, internamente delecionado de una célula huésped, el cual codifica el com ponente RNA de la partícula de reconoci miento de señal (SRP) que actúa en la síntesis proteica (véase Figura 12-39); por lo tanto no está claro si la secuencia Alu se tiene que considerar como un eleOrganización y evolución del genoma nuclear
428
mentó transponible o com o un pseudogén móvil, poco habitual. Está presente en aproximadamente 500 000 copias por genoma haploide y constituye un 5% del DNA humano; por lo tanto está presente, en promedio, una vez cada 5000 pares de nucleótidos. El DNA Alu es transcrito a partir del promotor del RNA 7SL, un promotor de la polimerasa III que es interno al transcrito, de tal modo que cuando se desplaza transporta la información necesaria para su propia transcripción. Sin embargo, para poder desplazarse precisa tomar prestada una actividad transcriptasa inversa. Las comparaciones de la secuencia y de las posiciones de las secuencias se mejantes a L1 y Alu en diferentes mamíferos sugieren que estas secuencias se han multiplicado hasta el elevado número de copias actuales, bastante recientemente (Figura 8-82). Es difícil imaginar que estas secuencias tan abundantemente repe tidas en nuestro genoma no tengan efectos importantes en la expresión de los muchos genes cercanos. Por ejemplo, ¿cuántas de nuestras cualidades exclusiva mente humanas se deben a estos elementos parásitos?
Resumen Las secuencias d e DNA fun cion ales d e los genom as de los eucariotas superiores p a recen estar construidas a partir de pequeños módulos genéticos de al m enos dos ti pos. Los módulos d e secuencias codificantes están com binados en m ultitud d e f o r m as produciendo proteínas, m ientras q u e los módulos d e secuencias reguladoras están repartidos a lo largo d e grandes extensiones d e secuencias no codificantes y regulan la expresión d e los genes. Tanto las secuencias codificantes como las regu ladoras típicam ente se organizan en módulos, m enores a unos cuantos cientos de nucleótidos, y en conjunto sólo suponen una p equ eñ a fracción del total d e DNA. En los genom as se produce una gra n variedad de procesos d e recom binación genética, q u e provocan la duplicación y translocación al azar d e las secuencias de DNA. Algunos d e estos cam bios crean duplicados d e genes enteros, de los qu e p u e d en evolucionar nuevas funciones. Otros producen nuevas proteínas mezclando exones o m odificando la expresión de viejos genes al exponerlos a nuevas secuen cias reguladoras. Este tipo d e m ezcla de secuencias, d e gra n importancia para la evolución d e los organismos, se ve m uy facilitada p o r la estructura partida d e los genes d e los eucariotas superiores y p o r el hecho d e q u e estos genes están frecu en te m ente controlados p o r secuencias reguladoras alejadas. En los genom as existen m uchos tipos d e elementos transponibles. Colectiva mente, constituyen m ás del 10% de la m asa del genom a d e Drosophila y d e los ver tebrados. Ocasionalmente, en las células germ inales ocurren “explosiones d e trans posición” q u e provocan m uchos cam bios hereditarios en la expresión génica del individuo. Se cree qu e los elementos transponibles han jugado un papel evolutivo especial en la generación de la diversidad d e los organismos.
Bibliografía Citas 1. Adolph, K.W., ed. Chromosomes and Chromatin, Vols. 1-3. Boca Raton, FL: CRC Press, 1988. Felsenfeld, G. DNA. Sei. Am. 253(4):58-67, 1985. Hsu, T.C. Human and Mammalian Cytogenetics: A His torical Perspective. New York: Springer-Verlag, 1979. Stewart, A. The funcional organization of chromosomes and the nucleus-a special issue. Trends Genet. 6:377379, 1990. 2. Burke, D.T.; Carle, G.F.; Olson, M.V. Cloning of large segments of exogenous DNA into yeast by means of artificial chromosome vectors. Science 236:806-812, 1987.
424
Capítulo 8 : El núcleo celular
secuencias A lu humanas
secuencias B1 de ratón
500 000 copias
100 000 copias
'C 2 0
ë 40
60
Figura 8-82 Patrón de evolución propuesto para las abundantes secuencias Alu humanas. En el genoma de ratón se encuentra Bl, un elemento transponible similar a Alu. Se cree que ambas secuencias de DNA transponibles han evolucionado a partir del gen RNA 7SL. Sin embargo, basados en la distribución y homología de secuencia de estos elementos altamente repetidos, se cree que el mayor incremento del número de copias ha tenido lugar independientemente en el ratón y en el hombre. (Adaptado de P.L. Deininger y G.R. Daniels, Trends Gen. 2:76-80, 1986.)
DePamphilis, M.L. Origins of DNA replication that func tion in eucaryotic cells. Curr. Opin. Cell Biol. 5:434441,1993. Murray, A.W. Chromosome structure and behavior. Trends Biochem. Sei. 10:112-115,1985. Price, C.M. Centromeres and telomeres. Curr. Opin. Cell Biol. 4:379-384,1992. 3. Gall, J.G. Chromosome structure and the C-value para dox./. Cell Biol. 91:3s-14s, 1981. Ohta, T.; Kimura, M. Functional organization of genetic material as a product of molecular evolution. Nature 233:118-119, 1971. 4. Ruby, S.W.; Abelson, I. Pre-mRNA splicing in yeast. Trends Genet. 7:79-85, 1991. 5. Wilson, A.C.; Ochman, H.; Prager, E.M. Molecular time scale forevolution. Trends. Genet. 3:241-247, 1987.
6. Grunstein, M. Histones as regulators of genes. Sci. Am. 267(4):68-74B, 1992. Isenberg, I. Histones. Ann«. Rev. Biochem. 48:159-191,1979. Smith, M.M. Histone structure and function. Curr. Opin. Cell Biol. 3:429-437,1991. Wells, D.E. Compilation analysis of histones and histo ne genes. Nucleic Acids Res. 1 4 :rll9 -rl4 9 ,1986. 7. Chromatin. Cold Spring Harbor Symp. Quant Biol, Vol. 42,1978. Kornberg, R.D.; Klug, A. The nucleosome. Sci. Am. 244(2) :52-64,1981. McGhee, J.D.; Felsenfeld, G. Nucleosome structure. Annu. Rev. Biochem. 49:1115-1156,1980. Richmond, T.J.; Finch, J.T.; Rushton, B.; Rhodes, D.; Klug, A. Structure of the nucleosome core particle at 7A resolution. Nature 311:532-537,1984. 8. Gross, D.S.; Garrard, W.T. Nuclease hypersensitive sites in chromatin. Annu. Rev. Biochem. 57:159-198,1988. Simpson, R.T. Nucleosome position in vivo and in vitro. Bioessays 4:172-176,1986. Svaren, J.; Chalkley, R. The structure and assembly of active chromatin. Trends Genet. 6:52-56,1990. Travers, A.A. DNA bending and nucleosome position ing. Trends Biochem. Sci. 12:108-112,1987. Zhang, L.; Gralla, J.D. In situ nucleoprotein structure in volving origin-proximal SV40 DNA control elements. Nucleic Acids Res. 18:1797-1803,1990. 9. Hansen, J.C.; Ausio, J. Chromatin dynamic and the mo dulation of genetic activity. Trends Biochem. Sci. 17:187-191,1992. Pederson, D.S.; Thoma, F.; Simpson, R. Core particle, fi ber, and trancriptionally active chromatin structure. Annu. Rev. Cell Biol. 2:117-147,1986. Swedlow, J.R., Agard, D.A.; Sedat, J.W. Chromosome structure inside the nucleus. Curr. Opin. Cell Biol. 5:412-416,1993. Zlatanova, J.; Yaneva, J. Histone Hl-DNA interactions and their relation to chromatin structure and func tion. DNA Cell Biol. 10:239-248,1991. 10. Bellini, M.; Lacroix, J.-C.; Gall, J.G. A putative zinc-bind ing protein on lampbrush chromosome loops. EMBO J. 12:107-114,1993. Bostock, C.J.; Sumner, A.T. The Eucaryotic Chromoso me, pp. 347-374. Amsterdam: North-Holland, 1978. Callan, H.G. Lampbrush chromosomes. Proc. R. Soc. Lond. (Biol.) 214:417-448,1982. Reznik, N A ; Yampol, G.P.; Kiseleva, E.V.; Khristolyubova, N.B.; Gruzdev, A.D. Functional and structural units in the chromomere. Genetica 83:293-299,1991. 11. Agard, D A ; Sedat, J.W. Three-dimensional architecture of a polytene nucleus. Nature 302:676-681,1983. Beermann, W. Chromosomes and genes. In Developmen tal Studies on Giant Chromosomes (W. Beermann, ed.), pp. 1-33. New York: Springer-Verlag, 1972. Zhimulev, I.F.; Belyaeva, E.S. Chromomeric organizaton of polytene chromosomes. Genetica 85:65-72,1991. 12. Ashbumer, M.; Chihara, C.; Meltzer, P.; Richards, G. Tempo ral control of puffing activity in polytene chromosomes. Cold SpringHarbor Symp. Quant. Biol 38:655-662,1974. Lamb, M.M.; Daneholt, B. Characterization of active trans cription units in Balbiani rings of Chironomous tentans. Cell 17:835-848,1979.
Bibliograffa
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
Thummel, C.S. Puffs and gene regulation-molecular in sights into the Drosophila ecdysone regulatory hie rarchy. Bioessays 12:561-568,1990. Bossy, B.; Hall, .L.M.; Spierer, P. Genetic activity along 315 kb of the Drosophila chromosome. EMBO J. 3:2537-2541,1984. Friedman, T.B.; Owens, K.N.; Burnett, J.B.; Saura, A.O.; Wallrath, L.L. The faint band/interband region 28C2 to 28C4-5H of the Drosophila melanogaster salivary gland polytene chromosomes is rich in transcripts. Mol. Gen. Genet. 226:81-87,1991. Judd, B.H.; Young, M.W. An examination of the one cistron: one chromomere concept. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 38:573-579,1974. Croston, G.E.; Kadonaga, J.T. Role of chromatin structu re in the regulation of transcription by RNA polyme rase II. Curr. Opin. Cell Biol. 5:417-423,1993. Nacheva, GA; Guschin, D.Y.; Preobrazhenskaya, O.V.; et al. Change in the pattern of histone binding to DNA upon trancriptional activation. Cell 58:27-36,1989. Svaren, J.; Horz, W. Histones, nucleosomes and trans cription. Curr. Opin. Genet. Dev. 3:219-225,1993. Allis, C.D., et al. hvl is an evolutionarily conserved H2A variant that is preferentially associated with active genes./. Biol. Chem. 261:1941-1948,1986. Bradbury, E.M. Reversible histone modifications and the chromosome cell cycle. Bioessays 14:9-16,1992. Tremethick, D.J.; Drew, H.R. High mobility group pro teins 14 and 17 can space nucleosomes in vitro. J. Biol. Chem. 268:11389-11393,1993. Turner, B.M. Histone acetylation and control of gene expression./. Cell Sci. 99:13-20,1991. Brown, S.W. Heterochromatin. Science 151:417-425,1966. Pimpinelli, S.; Bonaccorsi, S.; Gatti, M.; Sandler, L. The peculiar genetic organization of Drosophila hete rochromatin. Trends Genet. 2:17-20,1986. Georgiev, G.P.; Nedospasov, SA.; Bakayev, V.V. Supranucleosomal levels of chromatin organization. In The Cell Nucleus (H. Busch, ed.), Vol. 6, pp. 3-34. New York: Academic Press, 1978. Kitsberg, D.; Selig, S.; Cedar, H. Chromosome structure and eukaryotic gene organization. Curr. Opin. Genet. Dev. 1:534-537,1991. Marsden, M.; Laemmli, U.K. Metaphase chromosome structure: evidence for a radial loop model. Cell 17:849-858,1979. Bickmore, W A ; Sumner, A.T. Mammalian chromosome banding-an expression of genome organization. Trends Genet. 5:144-148,1989. Holmquist, G. DNA sequences in G-bands and R-bands. In Chromosomes and Chromatin Structure (K.W. Adolph, ed.), Vol. 2, pp. 75-122. Boca Raton, FL: CRC Press, 1988. Lewin, B. Gene Expression, Vol. 2: Eucaryotic Chromo somes, 2nd ed ., pp. 428-440. New York: Wiley, 1980. DePamphilis, M.L Origins of DNA replication that function in eukaryotic cells. Curr. Opin. Cell Biol 5:434-441,1993. Marahrens, Y.; Stillman, B. A yeast chromosomal origin of DNA replication defined by multiple functional elements. Science 255:817-823,1992. Struhl, K.; Stinchcomb, D.T.; Sherer, S.; Davis, R.W. High-frequency transformation of yeast: autono mous replication of hybrid DNA molecules. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:1035-1039,1979.
20. Dodson, M.; Dean, F.B.; Bullock, P.; Echols, H.; Hurwitz, J. Unwinding of duplex DNA from the SV40 origin of replication by T antigen. Science 238:964-967, 1987. Stillman, B.; Bell, S.P.; Dutta, A.; Marahrens, Y. DNA repli cation and the cell cycle. Ciba Found. Symp. 170:147156; discussion 156-160,1992. 21. Bonifer, C.; Hecht, A.; Saueressig, H.; Winter, D.M.; Sippel, A.E. Dynamic chromatin: the regulatory domain organization of eukaryotic gene loci. J. Cell. Biochem. 47:99-108, 1991. Huberman, J.A.; Riggs, A.D. On the mechanism of DNA replication in mammalian chromosomes. /. Mol. Biol. 32:327-341, 1968. 22. Craig, J.M.; Bickmore, W.A. Chromosome bands-flavours to savour. Bioessays 15:349-354,1993. Stubblefield, E. Analysis of the replication pattern of Chinese hamster chromosomes using 5-bromodeoxyuridine suppression of 33258 Hoechst fluorscence. Chromosoma 53:209-221, 1975. 23. Lima-de-Faria, A.; Jaworska, H. Late DNA synthesis in heterochromatin. Nature 217:138-142, 1968. 24. Bickmore, W A; Sumner, A.T. Mammalian chromosome banding-an expression of genome organization. Trends Genet. 5:144-148,1989. 25. Mechali, M.; Kearsey, S. Lack of specific sequence re quirement for DNA replication in Xenopus eggs com pared with high sequence specificity in yeast. Cell 38:55-64, 1984. Riggs, A.D. DNA methylation and late replication prob ably aid cell memory, and type I DNA reeling could aid chromosome folding and enhancer function. Phil. Trans. R. Soc. Lond. (Biol.) 326:285-297,1990. 26. Blow, J.J. Preventing re-replication of DNA in a single cell cycle: evidence for a replication licensing factor. /. Cell Biol. 122:993-1002, 1993. Coverley, D.; Downes, C.S.; Romanowski, P.; Laskey, R.A. Reversible effects of nuclear membrane permeabilization on DNA replication: evidence for a positive licensing factor./. Cell Biol. 122:985-992, 1993. Rao, P.N., Johnson, R.T. Mammalian cell fusion: studies on the regulation of DNA synthesis and mitosis. Na ture 225:159-164, 1970. Wanka, F. Control of eukaryotic DNA replication at the chromosomal level. Bioessays 13:613-618, 1991. 27. Almouzni, G.; Clark, D.J.; Mechali, M.; Wolffe, A.P. Chromatin assembly on replicating DNA in vitro. Nu cleic Acids Res. 18:5767-5774, 1990. Russev, G.; Hancock, R. Assembly of new histones into nucleosomes and their distribution in replicating chro matin. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 79:3143-3147,1982. 28. Blackburn, E.H. Telomeres. Trends Biochem. Sei. 16:378381,1991. Blackburn, E.H.; Szostak, J.W. The molecular structure of centromeres and telomeres. Annu. Rev. Biochem. 53:163-194, 1984. Vogt, P. Potential genetic functions of tandem repeated DNA sequence blocks in the human genome are ba sed on a highly conserved “chromatin folding code.” Hum. Genet. 84:301-336, 1990. 29. Chamberlin, M. Bacterial DNA-dependent RNA poly merases. In The Enzymes, 3rd ed. (P. Boyer, ed.), Vol. 15B, pp. 61-108. New York: Academic Press, 1982. Gill, S.C.; Yager, T.D.; von Hippel, P.H. Thermodynamic analysis of the transcription cycle in E. coli. Biophys. Chem. 37:239-250,1990. 426
Capitulo 8 : El nücleo celular
30.
31.
32.
33.
34.
35.
36.
37.
Kerppola, T.K.; Kane, C.M. RNA polymerase: regulation of transcript elongation and termination. FASEB J. 5:2833-2842, 1991. Chambon, P. Eucaryotic nuclear RNA polymerases. Annu. Rev. Biochem. 44:613-638, 1975. Geiduschek, E.P.; Tocchini-Valentini, G.P. Transcription by RNA polymerase III. Annu. Rev. Biochem. 57:873914, 1988. Sentenac, A. Eucayotic RNA polymerases. CRC Crit. Rev. Biochem. 18:31-91, 1985. Young, R.A. RNA polymerase II. Annu. Rev. Biochem. 60:689-715, 1991. Foe, V.E.; Wilkinson, L.E.; Laird, C.D. Comparative orga nization of active transcription units in Oncopeltus fasciatus. Cell 9:131-146, 1976. Lewin, B. Gene Expression, Vol. 2: Eucaryotic Chromo somes, 2nd ed., pp. 708-719. New York: Wiley, 1980. Miller, O.L. The nucleolus, chromosomes, and visualiza tion of genetic activity. J. Cell Biol. 91:15s-27s, 1981. Nevins, J.R. The pathway of eukaryotic mRNA forma tion. Annu. Rev. Biochem. 52:441-466, 1983. Proudfoot, N.J. How RNA polymerase II terminates transcription in higher eukaryotes. Trends Biochem. Sci. 14:105-110, 1989. Wickens, M. How the messenger got its tail: addition of poly (A) in the nucleus. Trends Biochem. Sci. 15:277281, 1990. Crick, F. Split genes and RNA splicing. Science 204:264271,1979. Dreyfuss, G.; Matunis, M.J.; Pinol-Roma, S.; Burd, C.G. hnRNP proteins and the biogenesis of mRNA. Annu. Rev. Biochem. 62:289-321,1993. Hickey, D.A.; Benkel, B.F.; Abukashawa, S.M. A general model for the evolution of nuclear pre-mRNA introns./. Theor. Biol. 137:41-53,1989. Dreyfuss, G.; Swanson, M.S.; Pinol-Roma, S. Heteroge neous nuclear ribonucleoprotein particles and the pathway of mRNA formation. Trends Biochem. Sci. 13:86-91, 1988. Guthrie, C. Messenger RNA splicing in yeast: clues to why the spliceosome is a ribonucleoprotein. Science 253:157-163, 1991. Guthrie, C.; Patterson, B. Spliceosomal snRNAs. Annu. Rev. Genet. 22:387-419, 1988. Samarina, O.P.; Krichevskaya, A.A.; Georgiev, G.P. Nu clear ribonucleoprotein particles containing messen ger ribonucleic acid. Nature 210:1319-1322, 1966. Steitz, J.A. “Snurps.” Sci. Am. 258(6):56-63, 1988. Balvay, L.; Libri, D.; Fiszman, M.Y. Pre-mRNA secon dary structure and the regulation of splicing. Bioes says 15:165-169, 1993. Padgett, R.A.; Grabowski, P.J.; Konarska, M.M.; Seiler, S.; Sharp, P.A. Splicing of messenger RNA precursors. Annu. Rev. Biochem. 55:1119-1150, 1986. Aebi, M.; Weissman, C. Precision and orderliness in splicing. Trends Genet. 3:102-107, 1987. Goguel, V.; Liao, X.; Rymond, B.C.; Rosbash, M. U1 snRNP can influence 3'-splice site selection as well as 5'-splice site selection. Genes Dev. 5:1430-1438, 1991. Orkin, S.H.; Kazazian, H.H. The mutation and poly morphism of the human p-globin gene and its su rrounding DNA. Annu. Rev. Genet. 18:131-171, 1984.
38. Cech, T.R. The generality of self-splicing RNA: relation ship to nuclear mRNA splicing. Cell 44:207-210,1986. Saldanha, R.; Mohr, G.; Belfort, M.; Lambowitz, A.M. Group I and group II introns. FASEB J. 7:15-24,1993. 39. Brown, J.D.; Plumpton, M.; Beggs, J.D. The genetics of nuclear pre-mRNA splicing: a complex story. Antonie Van Leeuwenhoek 62:35-46,1992. Green, M.R. Pre-mRNA processing and mRNA nuclear export. Curr. Opin. Cell Biol. 1:519-525,1989. Jimdnez-Garcia, L.F.; Spector, D.L. In vivo evidence that transcription and splicing are coordinated by a re cruiting mechanism. Cell 73:47-59,1993. Spector, D.L. Nuclear organization of pre-mRNA pro cessing. Curr. Opin. Cell Biol. 5:442-447,1993. 40. Long, E.O.; Dawid, I.B. Repeated genes in eucaryotes. Annu. Rev. Biochem. 49:727-764,1980. Miller, O.L. The nucleolus, chromosomes, and visual ization of genetic activity. J. Cell Biol. 91:15s-27s, 1981. Williams, S.M.; Robbins, L.G. Molecular genetic analysis of Drosophila rDNA arrays. Trends Genet. 8:335-340, 1992. 41. Fischer, D.; Weisenberger, D.; Scheer, U. Assigning func tions to nucleolar structures. Chromosoma 101:133-140, 1991. Hadjiolov, A.A. The Nucleolus and Ribosome Biogen esis. New York: Springer-Verlag, 1985. Jordan, E.G.; Cullus, C.A., eds. The Nucleolus. Cambrid ge, UK: Cambridge University Press, 1982. Larson, D.E.; Zahradka, P.; Sells, B.H. Control points in eucaryotic ribosome biogenesis. Biochem. Cell Biol. 69:5-22,1991. 42. Anastassova-Kristeva, M. The nucleolar cycle in man. /. Cell Sci. 25:103-110,1977. McClintock, B. The relation of a particular chromosomal element to the development of thenucleoli in Zea Mays. Z. Zellforsch. Mikrosk. Anat. 21:294-323,1934. 43. Haaf, T.; Schmid, M. Chromosome topology in mam malian interphase nuclei. Exp. Cell Res. 192:325-332, 1991. Hochstrasser, M.; Sedat, J.W. Three-dimensional orga nization of Drosophila melanogaster interphase nu clei. II. Chromosome spatial organizaton and gene regulation./. Cell Biol. 104:1471-1483,1987. Manuelidis, L. A view of interphase chromosomes. Sci ence 250:1533-1540,1990. 44. Dessev, G.N. Nuclear envelope structure. Curr. Opin. Cell Biol. 4:430-435,1992. Gasser, S.M.; Laemmli, U.K. A glimpse at chromosome order. Trends Genet. 3:16-22,1987. Gerace, L.; Burke, B. Functional organization of the nu clear envelope. Annu. Rev. Cell Biol. 4:335-374,1988. 45. Doolittle, R.F. Proteins. Sci. Am. 253(4):88-99,1985. Holland, S.K.; Blake, C.C. Proteins, exons, and molecu lar evolution. Biosystems 20:181-206,1987. 46. Kourilsky, P. Molecular mechanisms for gene conver sion in higher cells. Trends Genet. 2:60-63,1986. Roth, D.B.; Porter, T.N.; Wilson, J.H. Mechanisms of nonhomologous recombination in mammalian cells. Mol. Cell. Biol. 5:2599-2607,1985. Smith, G.P. Evolution of repeated DNA sequences by unequal crossover. Science 191:528-535,1976.
Bibliografía
47.
48.
49.
50.
51.
52.
53.
54.
Stark, G.R.; Wahl, G.M. Gene amplification. Annu. Rev. Biochem. 53:447-491,1984. Dickerson, R.E.; Geis, I. Hemoglobin: Structure, Func tion, Evolution, and Pathology. Menlo Park, CA: Benjamin-Cummings, 1983. Efstratiadis, A., et al. The structure and evolution of the human ß-globin gene family. Cell 21:653-668,1980. Anderson, C.L.; Carew, W.A.; Powell, J.R. Evolution of the Adh locus in the Drosophila willistoni group: the loss of an intron, and shift in codon usage. Mol. Biol. Evol. 10:605-618,1993. Doolittle, W.F. RNA-mediated gene conversion? Trends Genet. 1:64-65,1985. Nyberg, A.M.; Cronhjort, M.B. Intron evolution: a statis tical comparison of two models. /. Theor. Biol. 157:175-190,1992. Britten, R.J.; Kohne, D.E. Repeated sequences in DNA. Science 161:529-540,1968. Jelinek, W.R.; Schmid, C.W. Repetitive sequences in eu karyotic DNA and their expression. Annu. Rev. Bio chem. 51:813-844,1982. Craig-Holmes, A.P.; Shaw, M.W. Polymorphism of hu man constitutive heterochromatin. Science 174:702704,1971. Hsu, T.C. Human and Mammalian Cytogenetics: A His torical Perspective. New York: Springer-Verlag, 1979. John, B.; Miklos, G.L.G. Functional aspects of satellite DNA and heterochromatin. In Rev. Cytol. 58:1-114,1979. Orgel, L.E.; Crick, F.H.C. Selfish DNA: the ultimate para site. Nature 284:604-607,1980. Berg, D.E.; Howe, M.M., eds. Mobile DNA..Washington, DC: American Society for Microbiology, 1989. Döring, H.-P., Starlinger, P. Molecular genetics of transposable elements in plants. Annu. Rev. Genet. 20:175200,1986. Finnegan, D.J. Eukaryotic transposable elements and genome evolution. Trends Genet. 5:103-107,1989. McClintock, B. Controlling elements and the gene. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 21:197-216,1956. Coen, E.S.; Carpenter, R. Transposable elements in An tirrhinum majus: generators of genetic diversity. Trends Genet. 2:292-296,1986. O’Kane, C.J.; Gehring, W.J. Detection in situ of genomic regulatory elements in Drosophila. Proc. Natl Acad. Sci. USA 84:9123-9127,1987. Gerasimova, T.I.; Mizrokhi, L.J.; Georgiev, G.P. Transpo sition bursts in genetically unstable Drosophila mela nogaster. Nature 309:714-716,1984. McClintock, B. The significance of responses of the ge nome to challenge. Science 226:792-801,1984. Walbot, V.; Cullis, C.A. Rapid genomic change in higher plants. Annu. Rev. Plant Physiol. 36:367-396,1985. Deininger, P.L.; Daniels, G.R. The recent evolution of mammalian repetitive DNA elements. Trends Genet. 2:76-80,1986. Ruffner, D.E.; Sprung, C.N.; Minghetti, P.P.; Gibbs, P.E.; Dugaiczyk, A. Invasion of the human albumin-a-fetoprotein gene family by Alu, Kpn, and two novel re petitive DNA elements. Mol. Biol. Evol. 4:1-9,1987. Weiner, A.M.; Deininger, P.L.; Estratiadis, A. Nonviral retroposons: genes, pseudogenes, and transposable elements generated by the reverse flow of genetic in formation. Annu. Rev. Biochem. 55:631-661,1986.
427
Patrones de expresión génica dependientes de posición, en cuatro embriones transgénicos diferentes de D rosophila. Cada embrión tiene, insertada en su genoma, una sola copia de una gen de la p-galactosidasa bacteriana. Dependiendo del crom osom a en el que se haya producido la inserción, distintos activadores cercanos de D rosop h ila hacen que el gen se exprese siguiendo un patrón que corresponde a (A) tráquea y mesoectodermo, (B) sistema nervioso, (C) células gliales del sistema nervioso central más un patrón repetitivo en cada segmento, o (D) músculo. (Por cortesía de Yuh-Nung Jan.)
El control de la expresión genica Motivos estructurales de unión a DNA en las proteínas de fea • •Cómo funcionan los , y, * interruptores geneticos Estructura de la cromatina ■ A í i i * /• y el control de la expresión gènica Mecanismos genéticos qi originan tipos celulares mtnnntnli
El DNA de un organismo codifica todas las moléculas de RNA y de proteína n e cesarias para la construcción de sus células. Sin embargo, la descripción com pleta de la secuencia de DNA de un genoma -tanto los pocos millones de nucleótidos de una bacteria como los escasos miles de millones de nucleótidos del genoma hum ano- no nos permitiría reconstruir un organismo, como tampoco podríamos reconstruir una obra de Shakespeare a partir de una lista de palabras inglesas. En ambos casos el problema radica en saber cómo se utilizan los ele mentos de secuencia de DNA o las palabras de la lista. ¿En qué condiciones se produce cada uno de los productos génicos y, una vez producido, qué hace? En este capítulo se abordará la primera parte de este problema -las reglas que determinan que en cada célula sólo se expresen específicamente una selec ción de genes. Los mecanismos que controlan la expresión de los genes actúan a varios niveles, que trataremos aquí. Sin embargo, el capítulo se inicia con una introducción a algunos de los principios básicos del control gènico en los orga nismos pluricelulares.
I™
Controles . * • ■ po sti -transcnpcionales MI -•'íáral
Introducción al control génico Los distintos tipos celulares de un organismo superior suelen diferir profunda mente tanto en estructura como en función. Si comparamos, por ejemplo, una neurona de mamífero con un linfocito, observaremos que las diferencias son tan grandes que se hace difícil imaginar que ambas células contienen el mismo genoma. Por esta razón y porque la diferenciación celular suele ser irreversible, los biólogos inicialmente sospecharon que durante el proceso de diferenciación de las células los genes se deberían perder de modo selectivo. Sin embargo, actual mente sabemos que la diferenciación celular depende generalmente de cambios en la expresión génica y no de la pérdida de genes.
Los distintos tipos celulares de un organismo pluricelular contienen el mismo DNA1 Los tipos celulares de un organismo pluricelular se diferencian unos de otros porque sintetizan y acumulan distintos juegos de moléculas de RNA y de proteí nas. Ello lo consiguen sin alterar de modo irreversible su DNA. La mejor eviden cia de la conservación del genoma durante la diferenciación celular proviene de una serie de experimentos clásicos con ranas. Cuando se inyecta el núcleo de una
42$
sección de zanahoria
masa celular en proliferación
células separadas en un m edio líquido enriquecido
clon organizado de células en división
célula totalm ente diferenciada de rana en un huevo cuyo núcleo ha sido elimi nado, el núcleo “dador” inyectado es capaz de programar el huevo receptor para que produzca un renacuajo normal. El renacuajo contiene un espectro completo de células diferenciadas, las cuales han adquirido sus secuencias de DNA a partir del núcleo de la célula dadora original, lo cual significa que la célula dadora dife renciada no ha perdido ninguna secuencia importante de DNA. En experimen tos realizados con varias plantas se ha llegado a una conclusión similar. En estos experimentos se cultivaron fragmentos de tejido diferenciado en un medio de cultivo sintético y de estos fragmentos se disociaron células individuales. A m e nudo cada una de estas células es capaz de regenerar una planta adulta entera (Figura 9-1). Otra prueba de que durante el desarrollo de los vertebrados ni se pierden ni se reorganizan grandes bloques de DNA proviene de la comparación de los pa trones de bandas que se detectan en los cromosomas mitóticos condensados de distintos tipos celulares (véase Figura 8-32). Según este criterio, parece que los conjuntos de cromosomas de todas las células diferenciadas del cuerpo humano son idénticos. Además, la comparación de los genomas de diferentes células, ba sados en técnicas de DNA recombinante, muestran, por lo general, que los cam bios de expresión génica que subyacen al desarrollo de los organismos pluricelu lares no van acompañados de cam bios en las secuencias de DNA de los genes correspondientes (para una excepción importante de este principio, véase Figu ra 23-27).
Distintos tipos celulares sintetizan distintos conjuntos de proteínas2 Un primer paso para tratar de entender la diferenciación celular podría consistir en averiguar cuántas diferencias existen entre dos tipos celulares dados. Aunque la respuesta a esta cuestión fundamental todavía se nos escapa, podemos hacer algunas afirmaciones generales: 1. Muchos procesos son comunes a todas las células. Por lo tanto, dos células cualesquiera de un organismo presentarán muchas proteínas en común. Entre ellas se encuentran algunas proteínas abundantes que suelen ser fá ciles de analizar, como por ejemplo las proteínas estructurales principales del citoesqueleto y de los cromosomas, algunas de las proteínas esenciales para las m embranas del retículo endoplasmático y del complejo de Golgi y las proteínas ribosomales. Muchas proteínas poco abundantes, como las distintas enzimas implicadas en las reacciones centrales del metabolismo, también son com unes a todos los tipos celulares. 2. Algunas proteínas son abundantes en las células especializadas en las que actúan pero no se pueden detectar en ningún otro tipo celular, aunque se utilicen métodos muy sensibles. La hemoglobina, por ejemplo, sólo se pue de detectar en los eritrocitos. 3. Si se comparan las, aproximadamente, 2000 proteínas más abundantes (las que se hallan presentes en más de 50 000 copias por célula) de distintos ti pos celulares del mismo organismo, utilizando electroforesis bidimensional en geles de poliacrilamida, sorprendentemente se detectan muy pocas
430
Capítulo 9 : El control de la expresión génica
em brión joven
planta joven
zanahoria
Figura 9-1 Regeneración de una planta com pleta a partir de una única célula diferenciada. En muchos tipos de plantas, las células diferenciadas retienen la capacidad de “desdiferenciación” de modo que una sola célula puede generar un clon de células descendientes, que después podrá dar lugar a una planta entera.
diferencias. Tanto si se comparan dos líneas celulares en cultivo (por ejem plo líneas de células musculares y nerviosas) como si se escogen células de dos tejidos de roedor (por ejemplo el hígado y el pulmón), la inmensa m a yoría de las proteínas que se detectan en ambos tipos celulares se sinteti zan en proporciones que difieren en menos de cinco veces; en los dos tipos celulares sólo aparecen en cantidades muy diferentes un pequeño porcen taje de las proteínas. Estudios sobre el número de secuencias de mRNA distintas de una célula sugieren que cada célula típica de un eucariota superior sintetiza entre 10 000 y 20 000 proteínas distintas. La mayoría de ellas son demasiado escasas para que puedan ser detectadas a partir de extractos celulares mediante electroforesis bidimensional en gel de poliacrilamida. Si estas proteínas celulares menores difie ren entre las diferentes tipos celulares en la misma magnitud en la que difieren las proteínas abundantes, lo cual es lo más probable, es posible que el número de proteínas diferentes suficientes para crear grandes diferencias de morfología y comportamiento celular sea bastante pequeño (quizá sólo de varios cientos).
Una célula puede cam biar la expresión de sus genes como respuesta a señales externas3 La mayor parte de las células especializadas de un organismo pluricelular son capaces de alterar su patrón de expresión gènica como respuesta a señales extracelulares. Por ejemplo, si se expone una célula del hígado a una hormona glucocorticoide, se increm enta dramáticamente el nivel de producción de algunas proteínas específicas. Los glucocorticoides se liberan durante períodos de ayuno o de ejercicio intenso e indican al hígado la necesidad de producir más glucosa a partir de aminoácidos u otras pequeñas moléculas; el conjunto de las proteínas cuya producción se induce incluye enzimas como la tirosina aminotransferasa, que contribuye a convertir tirosina en glucosa. La producción de estas proteínas recupera sus niveles normales cuando la hormona desaparece. Otros tipos celulares responden a los glucocorticoides de diferente manera. Por ejemplo, los adipocitos reducen la producción de tirosina aminotransferasa, mientras que otros tipos celulares no responden a los glucocorticoides de ningu na forma. Estos ejemplos ilustran una característica general de la especialización celular -frecuentem ente diferentes tipos celulares responden en diferente forma a la misma señal extracelular. Subyaciendo a esta especialización existe una serie de rasgos que no cambian, y que confieren a cada tipo celular sus pro piedades características. Estos rasgos reflejan la expresión constante de diferen tes conjuntos de genes.
La expresión gènica se puede regular en muchas de las etapas de la vía que conduce desde el DNA al RNA y a las proteínas4 Si las diferencias que existen entre los distintos tipos de células dependen de los genes concretos que estas células expresan, ¿a qué nivel se ejerce el control de la expresión gènica? La vía que conduce desde el DNA a las proteínas está formada por muchas etapas, y en principio todas ellas se pueden regular. Así, las células pueden controlar la síntesis de proteínas (1) regulando el momento y la frecuen cia de la transcripción de genes concretos (control transcripcional), (2) contro lando el modo de maduración o procesamiento de los transcritos primarios de RNA (control del procesamiento del RNA), (3) seleccionando los mRNA madu ros que van a ser exportados al citoplasma (control del transporte de RNA), (4) seleccionando los mRNA citoplasmáticos que van a ser traducidos por ribosomas (control traduccional), (5) desestabilizando selectivamente algunas m olé culas de mRNA citoplasmàtico (control de la degradación de los mRNA), o (6) activando, inactivando o ubicando de modo selectivo las proteínas ya sintetiza das (control de la actividad proteica) (Figura 9-2).
Introducción al control gènico
431
m R N A inactivo
NUCLEO
DNA.
transcritos prim arios . de RNA _
1 control transcripcional
CITOPLASMA control de la degradación de los mRNA
mRNA
2
control del procesam iento del RNA
mRNA
3 del I control
1
I transporte I del RNA
control traduccional
control de la actividad proteica
6
proteina
proteina inactiva
Para la mayoría de genes, los controles transcripcionales son los más impor tantes. Esto tiene sentido ya que de todos los posibles puntos de control ilustra dos en la Figura 9-2 solamente el control transcripcional asegura que no se sinte ticen intermediarios superfluos. A continuación se describirán los componentes de DNA y proteínas que regulan la iniciación de la transcripción génica. Al final del capítulo se describirán los otros mecanismos que permiten regular la expre sión de los genes.
Resumen El genoma de una célula contiene en la secuencia de su DNA la información para producir miles de proteínas y moléculas de RNA diferentes. Una célula expresa, tí picamente, sólo algunos de sus genes, y los diferentes tipos celulares de los organis mos pluricelulares se forman porque expresan diferentes conjuntos de genes. Ade más, las células pueden cambiar el patrón de expresión de sus genes en respuesta a cambios en su ambiente, tales como señales que provengan de otras células. Aun que todas las etapas implicadas en la expresión de un gen pueden en principio estar reguladas, el punto de control más importante en la mayoría de los genes es la ini ciación de la trascripción a RNA.
Motivos estructurales de unión a DNA en las proteínas de regulación génica5 ¿Cómo puede una célula determinar cuáles de sus miles de genes se han de transcribir? Como se ha expuesto en el Capítulo 8, la transcripción de cada gen está controlada por una región de DNA próxima al lugar donde se inicia la trans cripción. Algunas regiones reguladoras son simples y actúan como interruptores activados por una señal única. Otras regiones reguladoras son complejas y actúan a modo de minúsculos microprocesadores, respondiendo a una variedad de se ñales, que interpretan e integran para decidir si activan o no el gen vecino. Sean simples o complejos, estos dispositivos interruptores constan de dos tipos de com ponentes fundamentales : (1) cortas secuencias de DNA definidas, y (2) pro teínas de regulación génica que las reconocen y se unen a ellas. Iniciaremos la discusión de las proteínas de regulación génica describiendo cóm o fueron descubiertas.
Las proteínas de regulación génica se descubrieron utilizando técnicas de genética bacteriana6 Los análisis genéticos realizados en bacterias durante los años cincuenta aporta ron las primeras evidencias de la existencia de proteínas de regulación génica capaces de activar o desactivar conjuntos específicos de genes. Unos de estos re guladores, el represor lambda, está codificado por un virus bacteriano, el bacte riófago lambda. El represor inactiva los genes del virus que codifican los compo-
432
Capítulo 9 : El control de la expresión génica
Figura 9-2 Seis etapas en las que se puede controlar la expresión génica en los eucariotas. En este capítulo sólo se com entan las etapas de la 1 a la 5. La regulación de la actividad proteica (etapa 6 ) se describe en el Capítulo 5; ésta incluye activación e inactivación reversible por fosforilación proteica así com o inactivación irreversible por degradación proteolítica.
nentes proteicos de las nuevas partículas víricas y por ello capacitan al genoma vírico para permanecer en el cromosoma bacteriano como un pasajero silencioso, multiplicándose con la bacteria cuando las condiciones son favorables al creci miento bacteriano (véase Figura 6-80). El represor lambda fue de las primeras proteínas de regulación génica que se caracterizaron, y continúa siendo una de las mejor conocidas como se verá más adelante. Otros reguladores bactérianos responden a condiciones nutricionales inactivando conjuntos de genes que co difican grupos de enzimas del metabolismo que ya no se necesitan. Por ejemplo, el represor lac, la primera de estas proteínas bacterianas que se descubrió, inac tiva la producción de proteínas implicadas en el metabolismo de la lactosa cuando ésta no se encuentra disponible en el medio. La primera etapa hacia la comprensión de la regulación de los genes fue el aislamiento de cepas de bacteria y de bacteriófago lambda imitantes incapaces de inactivar determinados grupos de genes. En aquel tiempo se propuso, y pos teriormente se demostró, que la mayoría de esos imitantes eran deficitarios en proteínas que actuaran como represores específicos de esos grupos de genes. Debido a que estas proteínas, como la mayoría de las proteínas reguladoras, se encuentran en pequeñas cantidades, su aislamiento fue muy difícil y largo. Se purificaron mediante fraccionamiento de extractos celulares en series de colum nas cromatográficas (véanse págs. 176-179). Una vez aisladas, se observó que las proteínas se unían a secuencias de DNA próximas a los genes que regulaban. Las secuencias de DNA que reconocían fueron determinadas mediante una combi nación de genética clásica, secuenciación de DNA y experimentos de huella en el DNA (descritos en el Capítulo 7).
El exterior de la hélice de DNA puede ser leído por proteínas7 Tal como se ha descrito en el Capítulo 3, el DNA de un cromosoma está formado por una doble hélice muy larga (Figura 9-3). Las proteínas reguladoras deben re conocer secuencias específicas en el interior de esta estructura. En un principio se pensó que para ser capaces de distinguir una secuencia de DNA de la otra, es tas proteínas deberían acceder a los enlaces de hidrógeno entre pares de bases en el interior de la doble hélice. Sin embargo, actualmente se sabe que las proteí nas reguladoras pueden reconocer la información acerca de la secuencia de DNA desde el exterior de la doble hélice, sin necesidad de abrirla. El borde de cada par de bases está expuesto en la superficie de la doble hélice, presentando un patrón característico de aceptores y dadores de enlaces de hidrógeno y parches hidrofóbicos reconocibles por proteínas, tanto en el surco mayor como en el menor (Figura 9-4). Pero, únicamente en el surco mayor los patrones son únicos para cada uno de los cuatro apareamientos de bases (Figura 9-5). Ésta es la ra zón de que la mayoría de las proteínas de regulación génica se unan al surco m a yor, como se verá. A pesar de que los rasgos más importantes reconocidos por las proteínas re guladoras son los grupos dadores y aceptores de enlaces de hidrógeno, no son los únicos; la secuencia de nucleótidos determina asimismo la geometría global de la doble hélice.
* !í-"
Y r'S * -i m m -4* * ‘Á • * ' 7
%
surco m enor
;V •»
v
# ,#L*
surco m ayor
%0
J*r ‘ y # r : %\
V..« m
v m
% :é
n
f
i
La geom etría de la doble hélice de DNA depende de la secuencia de nucleótidos8 Durante los 20 años siguientes al descubrimiento de la doble hélice del DNA en 1953, se pensó que el DNA tenía siempre la misma estructura monótona, con exactamente 36° de giro de hélice entre pares de nucleótidos adyacentes (10 pa res de bases por vuelta de la hélice) y una geometría helicoidal uniforme. Sin embargo esta visión, que procedía del estudio estructural de mezclas de DNA heterogéneo, cambió cuando se resolvieron las primeras estructuras tridimen sionales de secuencias cortas de DNA mediante cristalografía de rayos X y espec troscopia NMR. Mientras que los primeros estudios mostraban una imagen me-
Motivos estructurales de unión a DNA en las proteínas de regulación génica
Figura 9 -3 Estructura de doble hélice del DNA. Se señala el surco
mayor y el menor en el exterior de la doble hélice. Los átomos se han coloreado como sigue: carbono, azul oscuro; nitrógeno, azul claro; hidrógeno, blanco; oxígeno, rojo; fósforo, amarillo.
433
surco mayo/-
surco menor surco m ayor
CH'í
OP'H-N
Figura 9-4 Cómo es posible reconocer los apaream ientos de bases a partir de sus bordes sin necesidad de abrir la doble hélice. Se muestran las cuatro configuraciones posibles de pares de bases, con los dadores de enlaces de hidrógeno indicados en azul, los aceptores de enlace de hidrógeno en rojo y los propios enlaces de hidrógeno como series de líneas rojas cortas y paralelas. Los grupos metilo que forman protuberancias hidrofóbicas se han indicado en a m arillo, y los átomos de hidrógeno que están unidos a carbono y son por tanto inaccesibles a los enlaces de hidrógeno se señalan en b lan co.
surco m enor
dia de una molécula de DNA idealizada, los últimos mostraron que cualquier se cuencia nucleotídica presenta irregularidades locales, como pares de bases incli nados o ángulos de giro mayores o menores a 36°. Estos rasgos únicos pueden ser reconocidos por las proteínas reguladoras. Un caso especialmente remarcable de estructura distinta a la más común es la que se observa en el caso de secuencias nucleotídicas que producen la curva tura de la doble hélice. Algunas secuencias (por ejemplo, AAAANNN, donde N puede ser cualquier base excepto A) forman una doble hélice con una irregulari dad pronunciada que produce una curvatura moderada; si esta secuencia se re pite a intervalos de 10 nucleótidos en una larga molécula de DNA las curvaturas se suman y estas moléculas aparecen inusualmente curvadas cuando se obser van con el m icroscopio electrónico (Figura 9-6).
surco m ayor
surco m enor CLAVE: = H aceptor de enlaces de hidrógeno = H dador de enlaces de hidrógeno ( ^ ) = átom o de hidrógeno = grupo m etilo
434
Capítulo 9 : El control de la expresión gènica
Figura 9-5 Un código de reconocim iento del DNA. El borde de cada base, visto directam ente desde el surco mayor o desde el surco menor, contiene un patrón distintivo de aceptores y dadores de enlaces de hidrógeno y de grupos metilo. Cada uno de los cuatro apareamientos de bases posibles proyecta un patrón de rasgos únicos. Sin embargo desde el surco menor se confunden los patrones para G-C y C-G y para A-T y T-A. El código de colores es el mismo que se ha utilizado en la Figura 9-4.
Fig u ra9-6 Electronm icrografía de fragmentos de hélices de DNA muy curvadas. Los fragmentos de DNA
300 nm
Un rasgo relacionado e igualmente importante de la estructura del DNA es la deformabilidad de la doble hélice. Para una proteina que debe reconocer y unirse a una secuencia concreta de DNA, debe existir un apareamiento estrecho entre el DNA y la proteína, y frecuentemente la conformación normal del DNA se distorsiona para aumentar este apareamiento (Figura 9-7). El coste energético de tal distorsión depende de la secuencia nucleotídica. En el Capítulo 8 ya se dis cutió un caso similar en relación con el ensamblaje del nucleosoma: algunas se cuencias de DNA soportan m ejor que otras la curvatura que se requiere para ro dear el nucleosoma. De una manera similar, algunas proteínas reguladoras inducen una curvatura brusca en el DNA cuando se unen a él (Figura 9-8). En general, dichas proteínas reconocen secuencias de DNA que se curvan con faci lidad.
Secuencias cortas de DNA son componentes fundamentales de los interruptores genéticos9 Ya hemos visto cómo se puede detectar una secuencia nucleotídica específica como un patrón de rasgos estructurales en la superficie de la doble hélice del DNA. Secuencias nucleotídicas particulares, cada una de ellas con una longitud de m enos de 20 pares de bases, actúan como componentes fundamentales de los interruptores genéticos, al actuar como lugares de reconocim iento para la unión de proteínas de regulación génica específicas. Se han identificado cente nares de estas secuencias de DNA, cada una de ellas reconocida por una única proteína reguladora o por una serie de ellas muy relacionadas. En la Tabla 9-1 se listan algunos ejemplos de estas proteínas junto con las secuencias que recono cen. Ahora volvamos a las proteínas de regulación génica -e l segundo com po nente fundamental de los interruptores genéticos- que reconocen cortas se cuencias de DNA específicas contenidas en una doble hélice mucho mayor.
proceden del pequeño DNA circular mitocondrial de un tripanosoma. A pesar de que los fragmentos sólo tienen unos 200 pares de bases, muchos de ellos se han doblado hasta formar un círculo completo. Un DNA normal de este tamaño sólo podría doblarse hasta producir arcos de una cuarta parte de una estas circunferencias (una curvatura ligera y uniforme hacia la derecha). (De J. Griffith, M. Bleyman, C.A. Rauch, P.A. Kitchin y P.T. Englund, Celi 46:717724, 1986. © Celi Press.)
Figura 9-7 Deformación del DNA inducida por la unión de proteínas.
La figura muestra los cambios en la estructura del DNA, desde la forma regular de B-DNA (A) a una forma distorsionada de B-DNA (B), que se observa cuando una proteina reguladora bien conocida (el represor del bacteriófago 434) se une a secuencias específicas de DNA. La facilidad con la que esta secuencia de DNA se deforma afecta frecuentemente a la afinidad con la que la proteína se une a ella.
Las proteínas de regulación génica contienen motivos estructurales que pueden leer secuencias de DNA10 En biología, el reconocimiento molecular generalmente se basa en el ajuste exacto entre las superficies de dos moléculas, y el estudio de las proteínas de re gulación génica ha suministrado algunos de los ejemplos más evidentes de este principio. Una proteína de regulación génica reconoce una secuencia de DNA específica porque la superficie de la proteína es complementaria a la superficie de la molécula de DNA, con sus rasgos estructurales característicos en esa re gión. En la mayoría de los casos la proteína establece un gran número de contac tos con el DNA, incluyendo enlaces de hidrógeno, enlaces iónicos e interaccio-
Motivos estructurales de unión a DNA en las proteínas de regulación génica
.f#■ Figura 9 -8 Curvatura del DNA inducida por la unión de la proteina activada por catabolito (CAP). CAP es
una proteína reguladora de E. coli. Si la proteína no está unida la hélice de DNA es recta.
435
Tabla 9-1 Algunas proteínas reguladoras y las secuencias de DNA que reconocen
Bacterias
N om bre
S ecuen cia de DNA recon ocid a*
represorlac
AATTGTGAGCGGATAACAATT TT AACACT CGCCT AT T GT T AA T GT GAGT T AGCT CAC T ACACTCAATCGAGTGA T AT CACCGCCAGAGGT A AT AG T GG C G GT C T C C AT C GGAG G A C T G T C C T C C G GC C T C C T G AC A G GAG GC CATGTAATT GTACATTAA ATGACTCAT TACTGAGTA AACGGGTTAA T T GCCCAAT T GGGATTAGA CCCTAATCT GG GC GG C CC GC C ATGCAAAT T ACGT TT A TGATAG ACTATC
CAP represor lambda
Levaduras
GAL4 MAT oc2 GCN4
Drosophila
Krüppel Bicoid
Mamíferos
Spl Oct-1 GATA-1
* Cada una de las proteínas de esta tabla puede reconocer un conjunto de secuencias de DNA estrechamente relacionadas entre sí, pero por conveniencia en la tabla sólo se indica una se cuencia para cada proteína.
nes hidrofóbicas. Aunque cada uno de los contactos es débil, los 20 o más con tactos que se establecen en la interfase DNA-proteína actúan conjuntam ente asegurando una interacción que es altamente específica y muy fuerte (Figura 9-9). De hecho, las interacciones DNA-proteína se encuentran entre las interac ciones moleculares más fuertes y específicas de las conocidas en biología. Aunque cada uno de los ejemplos de reconocimiento proteína-DNA es úni co en sus detalles, los estudios de cristalografía de rayos X y de espectroscopia
proteína de unión a DNA
Figura 9-9 Unión de una proteína reguladora al surco m ayor del DNA.
Sólo se muestra un tipo de contacto sencillo. Típicamente la superficie de interacción entre la proteína y el DNA ha de presentar 20 o más de estos contactos, implicando diferentes aminoácidos, de forma que cada uno de ellos contribuye a la energía de unión de la interacción proteína-DNA.
azúcar-fosfato de la doble hélice
436
Capítulo 9 : El control de la expresión gènica
Figura 9-1 0 El motivo estructural de unión a DNA hélice-giro-hélice. El
f V
X
motivo se muestra en (A), donde cada círculo blanco representa el carbono central de un aminoácido. La hélice a carboxilo terminal {rojo) se denomina hélice de reconocimiento ya que participa en el reconocimiento de las secuencias específicas en el DNA. Como se muestra en (B) esta hélice se ajusta al surco mayor del DNA donde entra en contacto con las bases apareadas (véase también Figura 9-4).
/V
/ %
V ,
/ f.V
\
\
nh2
hélice de reconocim iento
/ COOH
i»
(A)
(B)
NMR de alrededor de 30 complejos de proteínas reguladoras con sus secuencias específicas han mostrado que la mayor parte de dichas proteínas contienen uno de entre una pequeña serie de motivos estructurales de unión a DNA. Cada uno de estos motivos utiliza tanto hélices a como láminas (3 para unirse al surco mayor del DNA; este surco, como ya se ha visto, contiene suficiente información para permitir distinguir una secuencia de DNA de cualquier otra. El ajuste es tan bue no que es tentador especular que las dimensiones de las unidades estructurales básicas de los ácidos nucleicos y de las proteínas evolucionaron juntas para per mitir que estas moléculas se pudieran ajustar mejor.
El motivo hélice-giro-hélice es uno de los motivos de unión a DNA más simples y comunes11 El primer motivo estructural de unión a DNA que se descubrió fue el hélice-girohélice. Identificado originalmente en proteínas bacterianas, se ha encontrado en centenares de proteínas de unión a DNA tanto eucariotas como procariotas. Consta de dos hélices a conectadas por una corta cadena de aminoácidos, que forma el “giro”. Las dos hélices se mantienen en un cierto ángulo fundamental mente por interacciones entre ambas hélices. La hélice más próxima al extremo carboxilo se denomina la hélice de reconocimiento pues se adapta al surco mayor del DNA; las cadenas laterales de sus aminoácidos, que difieren de una proteína a otra, juegan un papel muy importante en el reconocimiento de las secuencias de DNA específicas a las que se une la proteína (Figura 9-10). Aparte de la región de hélice-giro-hélice la estructura de las proteínas que contienen este motivo varía enormemente (Figura 9-11). Así pues, cada proteína
Figura 9-11 Algunas proteínas hélice-giro-hélice de unión al DNA.
Todas las proteínas se unen al DNA como dímeros en los que las dos copias de la hélice de reconocimiento (cilindro rojo) están separadas por exactamente una vuelta de la doble hélice (3,4 nm). La segunda hélice del motivo hélice-giro-hélice se ha coloreado en azul, como en la Figura 9-10. El represor lambda y la proteína ero controlan la expresión de genes del bacteriófago lambda, y el represor de triptófano y la proteína activadora de catabolito (CAP), controlan grupos de genes de E. coli.
3,4 nm
represor del triptófano
proteína ero de lambda
fragm ento de la proteína represora de lambda
Motivos estructurales de unión a DNA en las proteínas de regulación gènica
fragm ento de CAP
DNA
presenta su motivo hélice-giro-hélice al DNA de una forma única, un rasgo que se cree que aumenta la versatilidad del motivo hélice-giro-hélice al aumentar el número de secuencias de DNA con el motivo se pueden reconocer. Además, en la mayoría de estas proteínas partes de la cadena polipeptídica que están fuera del dominio hélice-giro-hélice tam bién establecen contactos importantes con el DNA, ayudando a obtener interacciones ajustadas muy finamente. El grupo de proteínas hélice-giro-hélice que aparece en la Figura 9-11 de muestra un rasgo común a muchas proteínas de unión a secuencias específicas de DNA. Se unen com o dímeros simétricos a secuencias de DNA que están for madas por dos “medios-lugares” muy similares, también organizados simétrica mente (Figura 9-12). Esta disposición permite que cada monómero proteico es tablezca un conjunto casi idéntico de contactos e incrementa enormemente la afinidad de unión: como primera aproximación, al duplicar el número de con tactos se duplica la energía libre de la interacción pero se eleva al cuadrado la constante de afinidad.
5' T
CGTGCGTGTTG
I I I I I II
II
3'
I I I I I I I I
3' A T T G T G G C A C G
A
A C 5'
Figura 9-12 Una secuencia específica de DNA reconocida por la proteína ero del bacteriófago lambda. Los
nucleótidos coloreados en verde se encuentran dispuestos simétricamente, permitiendo que cada mitad de la secuencia específica sea reconocida de la misma manera por una subunidad de una proteína dimérica, también mostrada en verde.
Las proteínas de homeodominios son una clase especial de proteínas hélice-giro-hélice12 Poco después de que se descubrieran las primeras proteínas de regulación génica en bacterias, análisis genéticos en la m osca del vinagre Drosophila permitie ron descubrir una clase de genes importantes, los genes selectores homeóticos, que juegan un papel importante organizando el desarrollo de la mosca. Como se describirá en el Capítulo 21, se ha demostrado que estos genes también partici pan de forma destacada en el control del desarrollo de animales superiores. Mu taciones en estos genes producen el cambio de una parte del cuerpo de una m osca en otra parte, demostrando que las proteínas que codifican controlan in terruptores del desarrollo. Cuando se determinaron las secuencias de algunos de los genes selectores hom eóticos a principios de la década de 1980, se demostró que cada uno de ellos contenía una secuencia casi idéntica de unos 60 aminoácidos que definía este tipo de proteína y a la que se denominó homeodominio. Al resolverse la es tructura tridimensional del homeodominio se descubrió que sostenía un motivo hélice-giro-hélice similar al de las proteínas reguladoras bacterianas, aportando una de las primeras indicaciones de que los principios de la regulación génica establecidos en bacterias tam bién son válidos para los organismos superiores. Sólo en Drosophila, se han descrito más de 60 proteínas homeodominio y se han identificado proteínas con homeodominio en prácticamente todos los organis mos que se han estudiado, desde la levadura hasta el hombre. En la Figura 9-13 se muestra la estructura del homeodominio unido a su se cuencia de DNA específica. Mientras que el motivo hélice-giro-hélice de las pro-
438
Capítulo 9 : El control de la expresión génica
Figura 9-13 Un homeodominio unido a su secuencia específica en el DNA. El homeodominio se pliega en
tres hélices que se empaquetan estrechamente por interacciones hidrofóbicas (A). La región que contiene las hélices 2 y 3 se parece mucho al motivo estructural hélicegiro-hélice, con la hélice de reconocimiento (rojo) estableciendo contactos importantes con el surco mayor (B). Por ejemplo, la asparagina de la hélice 3 entra en contacto con una adenina tal como se muestra en la Figura 9-9. También se establecen contactos con pares de bases en el surco menor mediante un brazo flexible unido a la hélice 1. El homeodominio mostrado aquí procede de una proteína reguladora de levadura, pero es casi idéntico a dos homeodominios de Drosophila que interaccionan con el DNA de forma similar. (Adaptado de C. Wolberger et al., Cell 67: 517-528,1991. © Cell Press.)
25 H O O C — Nv r:
K
23
3
,v Q.
.K
X —
Figura 9 -1 4 Un tipo de proteína con dedo de zinc. Esta proteína pertenece
25
1 NH2
HOOC
C(
>©v
; C
19
E R S /
F 10
\ /
(A)
E 12
teínas reguladoras bacterianas está frecuentem ente inmerso en diferentes regio nes estructurales, el motivo hélice-giro-hélice de los homeodominios está siem pre rodeado por la misma estructura (que forma el resto del homeodominio), lo cual sugiere que el motivo es presentado al DNA siempre de la misma forma b á sica. Además, estudios estructurales muestran que proteínas de levaduras y de Drosophila con homeodominio reconocen el DNA casi de la misma forma, a pe sar de que existe una identidad entre ellos de sólo 17 de los 60 aminoácidos.
Existen diferentes tipos de motivos de unión a DNA en forma de dedos de zinc13 El motivo hélice-giro-hélice está formado exclusivamente por aminoácidos. Sin embargo, un segundo grupo importante de motivos de unión a DNA utiliza una o más moléculas de zinc como elem ento estructural. Aunque todos los motivos que utilizan zinc se han denominado dedos de zinc (zinc fingers), esto se refie re sólo a su aspecto en diagramas esquem áticos que datan de su descubrim ien to inicial (Figura 9-14A). Estudios estructurales posteriores han permitido de mostrar que realm ente se trata de diferentes grupos, de entre los que sólo se describiremos. El primer tipo fue descubierto inicialm ente en la proteína que activa la transcripción del RNA ribosomal eucariota. Se trata de una estructura
a la familia de proteínas con dedos de zinc Cys-Cys-His-His, llamadas así por los aminoácidos que unen el zinc. Este dedo de zinc procede de una proteína de rana, de función desconocida. (A) Dibujo esquemático de la secuencia de aminoácidos del dedo de zinc. (B) La estructura tridimensional del dedo de zinc está formada por una lámina p antiparalela (aminoácidos 1 al 10), seguida de una hélice a (aminoácidos 12 al 24). Los cuatro aminoácidos que unen el zinc (Cys 3, Cys 6, His 19 e His 23) mantienen fuertemente unido un extremo de la hélice a al otro extremo de la lámina p. (Adaptado de M.S. Lee et al., Science 245: 635-637,1989. © 1989 the AASS.)
Figura 9-1 5 Unión a DNA de una proteina con dedo de zinc. (A) La
estructura de un fragmento de una proteína reguladora del ratón unida a su secuencia específica en el DNA. Esta proteína reconoce el DNA a través de tres dedos de zinc del tipo Cys-CysHis-His (véase Figura 9-14) organizados en repetición directa. (B) Los tres dedos de zinc tienen secuencias de aminoácidos similares y entran en contacto con el DNA de forma similar. Tanto en (A) como en (B) el átomo de zinc de cada dedo se ha representado como una pequeña esfera. (Adaptado de N. Pavletich y C. Pabo, Science 252: 819-817,1991. © 1991 thè AAAS.)
COOH COOH
(A)
(B)
Motivos estructurales de unión a DNA en las proteínas de regulación génica
439
Figura 9 -16 Una proteina con dedo de zinc de la familia de los receptores intracelulares, unida a su secuencia específica de DNA. Éste es un ejemplo
de una proteina con dedo de zinc del tipo Cys-Cys-Cys-Cys, denominada así por los aminoácidos que unen el átomo de zinc. Se muestra un dímero de la proteína de unión al DNA (rojo), y se han eliminado todas las cadenas laterales excepto las coloreadas en amarillo, que forman contactos con el DNA (verde). (Adaptado de B.F. Luisi et al., Nature 352:497-505,1991. © 1991 Macmillan Magazines Ltd.; fotografía cortesía de Jay Thomas.)
simple, formada por una hélice a y una lámina (3, mantenidas unidas por el zinc (Figura 9-14B). Este tipo de dedo de zinc se encuentra frecuentem ente agrupa do con otros dedos de zinc adicionales, organizados uno detrás de otro de modo que la hélice a pueda contactar con el surco mayor del DNA, formando una serie casi continua de hélice a a lo largo del surco. De esta forma se obtiene una interacción DNA-proteína fuerte y específica a través de la repetición de una unidad estructural básica (Figura 9-15). Una ventaja particular de este m o tivo es que la fuerza y especificidad de la interacción DNA-proteína se pudo ajustar durante la evolución m ediante cam bios en el número de repeticiones de los dedos de zinc. Resulta difícil de imaginar cóm o podrían organizarse en for ma de dominios repetidos cualquiera de los otros motivos que se discuten en esta sección. El otro tipo de dedos de zinc se encuentra en la gran familia de proteínas re ceptoras intracelulares (descritas en el Capítulo 15). Forma una estructura dife rente (similar al motivo procariota hélice-giro-hélice) en el que dos hélices a se m antienen juntas m ediante dos átomos de zinc. De forma similar a las proteínas hélice-giro-hélice, forman dímeros que permiten a una de las dos hélices a de cada subunidad interaccionar con el surco mayor del DNA (Figura 9-16). Aun que la estructura de los dos tipos de dedos de zinc es diferente, comparten dos rasgos importantes: ambas utilizan zinc como elemento estructural y ambas uti lizan la hélice a para reconocer el surco mayor del DNA.
Las láminas p también pueden reconocer el DNA14 En los motivos de unión a DNA descritos hasta el momento tan sólo se utiliza ban hélices a como estructura capaz de reconocer secuencias específicas de DNA. Sin embargo, un grupo de proteínas reguladoras ha desarrollado una es trategia de reconocim iento diferente y no menos ingeniosa. En este caso la in formación sobre la superficie del surco mayor es leída por una lámina (3 de dos hebras, con las cadenas laterales de los aminoácidos extendidas desde la lámina hacia el DNA, com o se muestra en la Figura 9-17. Como en el caso del reconoci miento mediante hélice a, este motivo en lámina (3 puede reconocer muchas se cuencias de DNA diferentes; la secuencia de DNA exacta reconocida depende de los aminoácidos que formen la lámina (3.
El motivo cremallera de leucina está implicado tanto en el reconocimiento del DNA como en la dimerización15 Muchas proteínas reguladoras reconocen el DNA como dímeros, probablemen te debido a que, como se ha visto, se trata de una forma simple de alcanzar una elevada especificidad de unión (véase Figura 9-12). Habitualmente, la región de
440
Capítulo 9 : El control de la expresión génica
Figura 9 -17 La proteína represora bacteriana met. La proteína represora €00 H
HOOC
la proteína responsable de la dimerización es diferente a la que es responsable de la unión al DNA (véase Figura 9-11). Sin embargo, un motivo com bina ambas funciones de una forma elegante y económ ica, el motivo del cremallera de leu cina. Se denomina así por la forma en que dos hélices a, una de cada monómero, se m antienen unidas formando un corto enrollamiento (descrito en el Capí tulo 3). Las hélices se m antienen unidas por interacciones entre las cadenas laterales hidrofóbicas de algunos aminoácidos (frecuentemente leucinas), que se extienden desde un lado de cada hélice. Exactamente después del dominio de dimerización, las dos hélices a se separan una de otra formando una estructura en forma de Y, lo que permite a sus cadenas laterales contactar con el surco m a yor del DNA. Así pues el dímero pinza la doble hélice como una pinza de tender ropa en un tendedero (Figura 9-18). Las proteínas reguladoras que contienen una cremallera de leucina pueden formar tanto homodímeros, en los que los dos monómeros son idénticos, como heterodímeros, en los que los monómeros son diferentes. Debido a que los heterodímeros se forman típicamente a partir de proteínas con especificidad de unión al DNA diferente, la capacidad de la cremallera de leucina de formar heterodímeros increm enta enormemente el repertorio de especificidades de unión a DNA que pueden presentar estas proteínas. Por ejemplo, en la Figura 9-19 se muestran tres posibles especificidades de secuencia que se podrían obtener con sólo dos monómeros, mientras que se podrían obtener seis a partir de única mente tres m onómeros, y así sucesivamente. Éste es un ejemplo de control com binatorio, en el que son las com binaciones de proteínas, más que las proteínas individuales, las que controlan un proceso celular. Es uno de los mecanismos más importantes que utilizan las células eucariotas para controlar la expresión génica. Como se discutirá más adelante, la formación de complejos heterodiméricos entre proteínas reguladoras es uno de los varios posibles mecanismos com binatorios para el control de la expresión génica. Existen numerosos tipos de proteínas con cremalleras de leucina, y no todas ellas pueden formar heterodímeros con cualquier otra. De otra manera, la canti dad de interrelaciones entre los circuitos de regulación génica de una célula se ría tan grande com o para producir el caos. Que un heterodímero se forme o no
bacteriana met regula los genes que catalizan la síntesis de metionina. Cuando este aminoácido es abundante, se une al represor causando un cambio en la estructura de la proteína que le permite unirse fuertemente al DNA, inactivando la síntesis de las enzimas. (A) Para poder unirse fuertemente al DNA, el represor met ha de estar acomplejado con S-adenosil metionina, mostrada en rojo. Se muestra en verde una subunidad de la proteína dimérica, y la otra se muestra en azul. Las dos láminas p que se unen al DNA están formadas por una cadena de cada subunidad, mostradas en azul oscuro y verde oscuro. (B) Diagrama simplificado del represor met unido al DNA, que muestra cómo las láminas P de doble hebra del represor se unen al surco mayor del DNA. Para una mayor claridad se han omitido las otras regiones del represor (A, adaptado de W. Somers y S. Phillips, Curr. Opin. Struc. Biol. 1: 89-98,1991, © Current Sciences; B, adaptado de S. Phillips, Nature 359: 387-393,1992. © 1992 Macmillan Magazines Ltd.)
Figura 9-18 Un dímero en crem allera de leucina unido al DNA. Dos dominios de unión al DNA en forma de hélice a {abajo) dimerizan a través de la región de la cremallera de leucina (“leucine zipper”) (arriba) formando una estructura en Y invertida. Cada uno de los brazos de la Y está formado por una hélice a simple, una de cada monómero, que entrá en contacto con la secuencia específica de DNA en el surco mayor. Cada una de las hélices a se une a una mitad de la estructura simétrica del DNA. (Adaptado de T.E. Ellenberger et al., Cell 71:1223-1237,1992. © Cell Press.)
Motivos estructurales de unión a DNA en las proteínas de regulación génica
441
DNA
depende de cómo se ajusten las superficies hidrofóbicas de las dos hélices a que forman la cremallera, lo que a su vez depende de la secuencia de aminoácidos de las dos regiones de la cremallera. Así, cada proteína de la célula que tenga una cremallera de leucina sólo podrá formar dímeros con una pequeña fracción de otras proteínas con cremalleras de leucina.
El motivo hélice-bucle-hélice también está implicado en la dimerización y la unión al DNA16
Figura 9-19 La heterodimerización de proteínas con crem alleras de leucina perm ite alterar su especificidad de unión al DNA. Los homodímeros de cremallera de leucina se unen a secuencias de DNA simétricas, como se muestra en los dibujos de la izquierda y del centro. Estas dos proteínas reconocen diferentes secuencias de DNA, como se indica por las regiones coloreada en rojo y azu l en el DNA. Estos dos monómeros diferentes se pueden com binar formando un heterodímero que ahora reconoce una molécula de DNA híbrida com puesta por una región roja y una azul.
Otro motivo importante de unión al DNA, relacionado con el dedo de leucina, es el motivo hélice-bucle-hélice (HLH, de Helix-Loop-Helix), que no se ha de con fundir con el hélice-giro-hélice descrito previamente. Un motivo HLH está for mado por una hélice a corta conectada por un bucle a una hélice a más larga, La flexibilidad del bucle permite que una de las hélices se doble y quede alineada con la otra. Como se observa en la Figura 9-20, esta estructura de dos hélices se une tanto al DNA com o al motivo HLH de otra proteína con motivo HLH. Del mismo modo que las proteínas con dedo de leucina, esta segunda proteína pue de ser la misma (obteniéndose un homodímero) o diferente (obteniéndose un heterodímero), y es la hélice a que sale de la superficie de dimerización la que establece contactos específicos con el DNA. Algunas de las proteínas HLH carecen de la extensión de hélice a responsa ble de la unión al DNA. Estas proteínas truncadas pueden formar heterodímeros con proteínas con motivo HLH completo, pero los heterodímeros son incapaces de unirse estrecham ente al DNA ya que sólo pueden formar la mitad de los con tactos necesarios, Así pues, la heterodimerización aporta a la célula tanto un medio de crear dímeros con una especificidad de secuencia de DNA híbrida, como un útil m ecanism o de control que permitiría a una célula inactivar proteí nas reguladoras específicas (Figura 9-21).
Aún no es posible predecir la secuencia de DNA que es reconocida por una proteína reguladora17 Los motivos de unión a DNA que se han descrito previamente aportan un sopor te estructural desde el que se extienden las cadenas laterales de los aminoácidos contactando con pares de bases específicos en el DNA. Sería razonable pregun-
6
mm UBI!»
y
r
442
Capítulo 9 : El control de la expresión gènica
Mm jg?
Figura 9-2 0 Un dímero de proteína hélice-bucle-hélice unido al DNA. Los cuatro monómeros se mantienen unidos en un haz de cuatro hélices: cada monómero contribuye con dos hélices a conectadas mediante un bucle flexible de pro teína [rojo). A las dos hélices a que se proyectan desde el ovillo se une una secuencia de DNA específica. (Adaptado de FerreD’Amare et al., N ature 363:38-45,1993. © 1993 Macmillan Magazines Ltd.)
hom odím ero HLH activo
heterodím ero HLH inactivo
tarse si se trata de un código de apareamiento aminoácido-par de bases sencillo: por ejemplo, ¿es siempre el par de bases G-C el que se une a un cierto am inoáci do? La respuesta parece ser no. En el Capítulo 3 se describió que a partir de sólo 20 aminoácidos era posible obtener superficies de prácticamente cualquier for ma y naturaleza química, y una proteína reguladora utiliza diferentes com bina ciones de las cadenas laterales de sus aminoácidos para crear una superficie que sea exactam ente complementaria a la de la secuencia de DNA que reconoce. Pa rece por lo tanto que un mismo par de bases puede ser reconocido de muchas formas. Sin embargo, es posible que pronto los biólogos moleculares puedan entender suficientemente bien el reconocim iento de DNA-proteína como para poder diseñar proteínas que reconozcan cualquier secuencia de DNA.
Figura 9-21 Regulación inhibidora por las proteínas HLH truncadas. El
motivo HLH es responsable tanto de la dimerización como de la unión a DNA. A la izquierda, un homodímero HLH reconoce una secuencia simétrica de DNA. A la derecha, la unión de una proteína HLH completa a una proteína HLH truncada que carece de la hélice a de unión al DNA forma un heterodímero incapaz de unirse fuertemente al DNA. Si la proteina truncada está presente en exceso puede bloquear la homodimerización de la proteína completa y de este modo impedir su unión al DNA.
Un ensayo de movilidad en gel permite detectar con gran facilidad proteínas que se unen a una secuencia específica de DNA18 Los análisis genéticos que fueron la clave para aislar las proteínas reguladoras de bacterias, levaduras y Drosophila son muchas veces imposibles de llevar a cabo en vertebrados. Por ello, el aislamiento de las proteínas de regulación génica de los vertebrados tuvo que esperar al desarrollo de diferentes aproximaciones ex perimentales. Muchas de ellas se basan en la detección en un extracto celular de una proteína de unión a DNA que reconoce específicamente una secuencia de la que se sabe es importante para controlar la expresión de un gen particular. La forma más común de detectar proteínas de unión a secuencias específicas de DNA es usar una técnica que se basa en el efecto que tiene la unión de una pro teína sobre la migración de moléculas de DNA en un gel, bajo un campo eléctriUna molécula de DNA está fuertemente cargada negativamente, por lo que cuando se somete a un campo eléctrico se desplaza con rapidez hacia el electro do positivo. En geles de poliacrilamida las moléculas de DNA se separan en base a su tamaño debido a que las moléculas menores son capaces de penetrar con mayor facilidad que las mayores en la fina malla del gel. La presencia de m olécu las de proteína unidas a las moléculas de DNA provocarán un desplazamiento más lento del DNA a través del gel; en general la movilidad del DNA se reducirá tanto más cuanto mayor sea el tamaño de la molécula de proteína unida. Este fe nómeno es la base del análisis de retraso en gel (gel-mobility shift assay), que per mite detectar incluso trazas de proteínas de unión a DNA específicas de secuen cia. En este ensayo se utiliza un fragmento corto de DNA, de longitud y secuencia determinadas (producido por clonaje de DNA o por síntesis química) que es marcado radiactivamente y se mezcla con un extracto celular; la mezcla se carga en un gel de poliacrilamida y se analiza por electroforesis. Si el fragmento de DNA corresponde a una región cromosómica en la que, por ejemplo, se unen va rias proteínas de unión a secuencias específicas, la autorradiografía revelará una serie de bandas de DNA, cada una de las cuales sufrirá un retraso distinto, lo que representa diferentes complejos DNA-proteína. Las proteínas responsables de
Motivos estructurales de unión a DNA en las proteínas de regulación génica
443
fragm ento de DNA frag m e nto de DNA radiactivo + extracto radiactivo celular
** O
C1 C4 C2 — C5 " C3
(A)
© resultado del gel
C6 DNA libre
C1 — i****: , i mwitw
C2 — C3 —
I
I
— C4 — C5 — C6 - DNA libre
(B) número de fracción eluida de la columna con una concentración creciente de sales
cada una de las bandas de retraso en el gel se pueden ir separando unas de otras mediante fraccionam iento del extracto celular (véase Figura 9-22).
La cromatografía de afinidad de DNA facilita la purificación de proteínas de unión a secuencias específicas de DNA19 Una vez se conoce la secuencia de DNA reconocida por una proteína regulado ra, es posible utilizar un método de purificación particularmente potente, deno minado crom atografía de afinidad de DNA. Por métodos químicos se sintetiza un oligonucleótido de doble cadena de la secuencia adecuada, y se une a una matriz porosa insoluble, com o por ejemplo la agarosa; la matriz con el oligonu cleótido unido se utiliza para construir una columna que unirá selectivamente las proteínas que reconozcan la secuencia de DNA (Figura 9-23). De esta forma se han conseguido sin gran esfuerzo purificaciones tan grandes como de 10 000 veces. Aunque en los eucariotas superiores muchas de las proteínas que se unen a secuencias específicas de DNA están presentes en unos cuantos miles de copias en cada célula (y generalmente sólo representan un 1/50 000 de la proteína total de la célula), mediante cromatografía de afinidad es posible aislar suficiente can tidad de proteína pura como para obtener una secuencia parcial del extremo amino terminal. A partir de esta secuencia se puede sintetizar un oligonucleótido que puede utilizarse como sonda para identificar el clon de cDNA correspondien te, ya que hibridará especificamente con la secuencia que codifica la proteína (descrito en el Capítulo 7). El clon permite conocer la secuencia de aminoácidos completa y producir la proteína en cantidades ilimitadas. En algunos casos, el clon cDNA que codifica una proteína de unión a DNA específica de secuencia, se ha obtenido de una forma más directa utilizando un segundo método aún más potente que la cromatografía de afinidad a DNA. Este método se inicia con una genoteca de cDNA construida con un vector de expre sión apropiado (descrito en el Capítulo 7). Una colonia individual dé bacterias (si el vector de expresión es un plásmido), o una placa de lisis (si el vector usado es un virus) producirá grandes cantidades de la proteína que codifica el cDNA
444
Capítulo 9 : El control de la expresión gènica
Figura 9 -22 Análisis de retraso en gel. El principio del ensayo se muestra esquemáticamente en (A). Se mezcla un extracto de una línea celular productora de anticuerpos con un fragmento de DNA marcado radiactivamente, que contiene alrededor de 160 nucleótidos de una secuencia de DNA reguladora de un gen que codifica la cadena ligera del anticuerpo producida por la línea celular. El efecto de las proteínas del extracto sobre la movilidad del fragmento de DNA se analiza por electroforesis seguida de autorradiografía. Los fragmentos de DNA libres se desplazan rápidamente hacia la base del gel, mientras que los que se unen a proteínas son retardados; la observación de 6 bandas de retraso sugiere que en el extracto existen 6 diferentes proteínas de unión a DNA específicas de secuencia (indicadas como C1 a C6). (Para una mayor simplicidad los fragmentos de DNA con más de una proteína unida se han omitido en la figura.) En (B), el extracto fue fraccionado por una técnica cromatográfica estándar y cada fracción se mezcló con el fragmento radiactivo de DNA y se cargó en un carril de un gel de poliacrilamida, analizándose como en (A). (B, modificado de C. Scheidereit, A. Heguy y R.G. Roeder. 51: 783793,1987. © Cell Press.)
{arriba)
Cell,
todas las proteínas celulares ETAPA 1
columna con una matriz que contiene DNA de muchas secuencias diferentes
el lavado con soluciones de baja salinidad eluye las proteínas que no se unen a DNA
el lavado con soluciones de salinidad media eluye muchas proteínas que se unen a DNA
proteínas de unión a DNA de la etapa 1 ETAPA 2
columna con una matriz que contiene sólo — GGGCCC CCCGGG
el lavado con soluciones de salinidad media eluye todas las proteínas no específicas para GGGCCC CCCGGG el lavado con soluciones de salinidad elevada eluye las escasas proteínas que reconocen específicamente GGGCCC CCCGGG
que contiene. Para localizar la colonia que produce la proteína buscada se utiliza como sonda el oligonucleótido que contiene la secuencia de unión específica, marcado radiactivamente, para hibridar réplicas en filtros de miles de colonias individuales (véase Figura 7-26). Se seleccionan las pocas colonias que produz can la proteína que se une específicamente al oligonucleótido marcado, se puri fican y se analizan para localizar la que produce la proteína buscada. Debido a que estas técnicas han sido desarrolladas recientemente, sólo se han podido caracterizar algunos de los muchos cientos de proteínas de unión a DNA específicas de secuencia que se cree están presentes en las células de los eucariotas superiores.
Figura 9-23 Cromatografía de afinidad de DNA. En la primera etapa todas las proteínas que pueden unir DNA se separan del resto de las proteínas celulares en una columna que contiene una gran cantidad de secuencias diferentes de DNA La mayoría de las proteínas de unión a secuencias específicas de DNA tienen en general una afinidad débil por el DNA (no específica) y son retenidas en la columna. Esta afinidad es debida fundamentalmente a interacciones iónicas, de forma que las proteínas pueden ser eluidas de la columna mediante soluciones de una concentración salina moderada. En una segunda etapa, la mezcla de proteínas de unión a DNA se pasa a través de una columna que contiene exclusivamente DNA de una secuencia particular. Típicamente la mayoría de proteínas de unión a DNA se unirán, débilmente, mediante interacciones inespecíficas. Éstas serán eluidas de nuevo mediante soluciones de salinidad moderada, dejando en la columna aquellas proteínas (generalmente una o muy pocas) que se unen específicamente, y por ello firmemente, a la secuencia de DNA particular. Estas proteínas retenidas se pueden eluir utilizando soluciones de elevada concentración de sales.
Resumen Las proteínas de regulación génica reconocen cortas secuencias específicas de DNA de doble hélice y de ese modo determinan cuáles de los miles de genes de una célula se han de transcribir. Se han identificado centenares de proteínas de regulación génica en un amplia variedad de organismos. Aunque cada una de estas proteínas tiene una serie de rasgos únicos, muchas se unen al DNA como homodímeros o heterodímeros que reconocen al DNA mediante uno de entre un pequeño número de motivos estructurales, que incluyen el motivo hélice-giro-hélice, el homeodominio, los dedos de zinc, las cremalleras de leucina y el motivo hélice-bucle-hélice. La secuencia de aminoácidos que se pliega en el dominio de reconocimiento determina la secuencia de DNA que será reconocida. Se han desarrollado algunas potentes técnicas para identificar y purificar las proteínas de unión a secuencias específicas de DNA.
Cómo funcionan los interruptores genéticos20 En la sección anterior se han descrito los componentes básicos de los interrup tores genéticos -las proteínas de regulación génica y las secuencias específicas de DNA que estas protema reconocen. En esta sección se discutirá cómo actúan estos componentes para activar e inactivar genes como respuesta a una variedad de señales. Cómo funcionan los interruptores genéticos
445
Hace sólo 40 años la idea de que los genes se podían activar e inactivar fue revolucionaria. Este concepto fue un gran avance, y nació del estudio de cómo las bacterias eran capaces de adaptarse a cambios en la composición del medio de crecim iento. Estudios paralelos realizados con el bacteriófago lambda llega ron a muchas conclusiones similares y contribuyeron a establecer las bases de lo que sabemos actualmente respecto a cómo se regula la expresión de los genes. A las células eucariotas se aplican los mismos principios aunque la enorme com plejidad de la regulación génica en los organismos superiores, combinada con la complicación de que el DNA en dichos organismos se encuentra empaquetado en forma de cromatina, crea nuevas posibilidades para el control, como se verá más adelante. Comenzaremos, sin embargo, con el ejemplo más sencillo -u n in terruptor abierto/cerrado en bacterias que responde a una señal única.
El represor de triptófano es un interruptor simple que activa y desactiva genes en bacterias21 El crom osom a de la bacteria E. coli, un organismo unicelular, está formado por una molécula de DNA circular de alrededor de 5 x 106 pares de nucleótidos. Este DNA es suficiente para codificar 4000 proteínas, aunque simultáneamente sólo se fabrican algunas de estas proteínas. E. coli regula la expresión de muchos de sus genes de acuerdo con la disponibilidad de fuentes de alimento que son acce sibles en el medio. Son cinco los genes que en E. coli codifican la producción del aminoácido triptófano, y están organizados en un grupo en el cromosoma, transcribiéndose desde un único promotor como una larga molécula de mRNA (Figura 9-24). Tal como se ha descrito en el Capítulo 6, el promotor es la secuen cia de DNA específica que dirige la unión de la RNA polimerasa al DNA, abrien do la doble hélice e iniciando la síntesis de una molécula de RNA. Sin embargo, cuando hay triptófano presente en el medio y éste penetra en la célula (por ejemplo cuando la bacteria se encuentra en el tracto digestivo de un animal que acaba de ingerir proteínas), estas enzimas ya no se necesitan y su producción se detiene. Actualmente conocem os con gran detalle las bases moleculares de este in terruptor. Dentro del promotor que dirige la transcripción de los genes biosintéticos de triptófano se encuentra un o p e ra d o r. Este operador es simplemente una corta secuencia de DNA regulador, de secuencia definida, que es reconoci da por una proteína reguladora hélice-giro-hélice denominada r e p r e s o r del tr ip tó fa n o (véase Figura 9-11). El promotor y el operador se encuentran organi zados de forma que cuando el operador está unido al represor del triptófano se bloquea el acceso de la RNA polimerasa al promotor, de modo que se impide la expresión de las enzimas productoras de triptófano (Figura 9-25). Este bloqueo está regulado de una forma ingeniosa: la proteína represora sólo puede unirse al DNA del operador cuando se ha unido a su vez a dos moléculas del am inoáci do triptófano. Como se ve en la Figura 9-26, la unión de triptófano desplaza los motivos hélice-giro-hélice del represor de modo que se pueden presentar de manera apropiada en el surco mayor del DNA; sin triptófano, los motivos que dan en el interior de la proteína y la proteína es incapaz de unirse al operador. Así pues, el represor del triptófano es un dispositivo simple que controla la pro ducción de las enzimas biosintéticas del triptófano, activando o desactivando dicha producción en función de la disponibilidad de triptófano libre. A este p ro m o to r I---------- 1 ’ 1 11 I
E
D
C
B
E. coli. Estos cinco genes se
A crom osom a de E. c o li
I 1'
m olécula de mRNA
,
I \ # _______ #
\
\ A
enzim as de la biosíntesis del trip tó fa n o
446
Capítulo 9 : El control de la expresión génica
\ #
Figura 9-24 Los genes agrupados que codifican la síntesis del triptófano en
transcriben como una sola molécula de mRNA, rasgo que permite que su expresión sea regulada de manera coordinada. Los grupos de genes transcritos como un único mRNA son comunes en bacterias. A cada uno de esos grupos se le denomina un operón.
prom otor
operador
A #
Figura 9 -25 Activación y desactivación de los genes para el triptófano. Si el nivel de triptófano en
+1
- 35
represor inactivo RNA polimerasa
inicio de transcripción
triptófano
ñ
________ -
T
represor activo
m RNA! LOS GENES ESTÁN ACTIVOS
LOS GENES ESTAN INACTIVOS
modo de regulación se le denomina control negativo ya que la forma activa de la proteína de unión a DNA desactiva los genes, y a las proteínas reguladoras que actúan de este modo se las denomina represores transcripcionales o proteí
nas represoras génicas.
Los activadores transcripcionales activan los genes22 En el Capítulo 6 se vio que la RNA polimerasa de E. coli puede unirse a un pro motor e iniciar la transcripción del DNA Sin embargo, algunos promotores bac terianos son poco funcionales por sí mismos, ya sea porque son poco reconoci dos por la RNA polimerasa o porque ésta tiene dificultades en abrir la hélice de DNA en el inicio de la transcripción. En cualquier caso estos promotores de es casa función pueden recuperar la función normal mediante proteínas regulado ras que se unen en un lugar próximo del DNA, contactando con la RNA polime rasa de forma que increm entan enorm em ente la probabilidad de que se inicie el transcrito. Este modo de regulación se denomina control positivo porque la for ma activa de la proteína de unión al DNA activa los genes, y las proteína regula doras que funcionan de este modo se denominan activadores transcripcionales o
proteínas activadoras génicas. Como en el caso del control negativo por un represor transcripcional, un ac tivador transcripcional puede actuar como un interruptor genético simple. Por ejemplo, la proteína activadora bacteriana CAP (de Catabolite Activator Protein, proteína activadora por catabolito), activa los genes que capacitan a E. coli para
el interior de la célula es bajo, la RNA polimerasa se une al promotor y transcribe los cinco genes del operón de triptófano (trp). Sin embargo, si el nivel de triptófano es alto, el represor de triptófano se activa uniéndose al operador, impidiendo la unión de la RNA polimerasa al promotor. Siempre que el nivel de triptófano se reduzca, el represor libera su triptófano y se inactiva, permitiendo que la polimerasa inicie la transcripción de estos genes.
Figura 9 -2 6 La unión del triptófano a la proteína represora del triptófano cam bia la conform ación del represor.
El cambio conformacional capacita a esta proteína reguladora para unirse fuertemente a una secuencia específica de DNA y bloquear la transcripción de los genes que codifican las enzimas necesarias para la producción de triptófano (el operón trp). En la figura se muestra la estructura tridimensional de esta proteína bacteriana con motivos hélice-giro-hélice, tanto unida al triptófano como libre, determinada por difracción de rayos X. La unión del triptófano aumenta la distancia entre las dos hélices de reconocimiento del homodímero, permitiendo al represor adaptarse estrechamente al operador. (Adaptado de R. Zhang y et al., Nature 327:591-597,1987. © 1987 Macmillan Magazines Ltd.)
triptófano
Cómo funcionan los interruptores genéticos
447
(A)
REGULACIÓN NEGATIVA
una proteina activadora unida impide la transcripción
(B)
REGULACION POSITIVA
una proteina activadora unida permite la transcripción proteina activadora unida
proteina represora unida
RNA polimerasa
GEN INACTIVO UN LIGANDO SE UNE A LA p r o t e ìn a
REGULADORA Y LA SEPARA DEL DNA
LA ADICION DEL LIGANDO ACTIVA EL GEN PORQUE SEPARA LA PROTEÍNA REPRESORA
proteina LA ADICIÓN DEL LIGANDO DESACTIVA EL GEN PORQUE SEPARA LA PROTEÍNA ACTIVADORA
GEN INACTIVO UN LIGANDO SE UNE A LA PROTEÍNA REGULADORA CAPACITÁNDOLA PARA UNIRSE AL DNA
LA ELIMINACION DEL LIGANDO ACTIVA EL GEN PORQUE SEPARA LA PROTEÍNA REPRESORA
represor inactivo LA ELIMINACION DEL LIGANDO DESACTIVA EL GEN PORQUE SEPARA LA PROTEÍNA ACTIVADORA
usar fuentes alternativas de carbono cuando la glucosa, su fuente preferida, no es accesible. La disminución de los niveles de glucosa en el medio induce un in crem ento del nivel de la molécula señalizadora intracelular AMP cíclico (cAMP), que se une a la proteína CAP, capacitándola para unirse a secuencias de DNA es pecíficas próximas a ciertos promotores, y de este modo activa los genes adecua dos. En este caso la expresión del gen diana es inducida o reprimida en función de que los niveles de cAMP sean altos o bajos respectivamente. En la Figura 9-27 se resumen las diferentes maneras en que se puede controlar un gen por control positivo o negativo. Los activadores y los represores transcripcionales tienen un diseño similar en muchos aspectos. Por ejemplo, tanto el represor del triptófano como el acti vador transcripcional CAP presentan un motivo hélice-giro-hélice y requieren la presencia de un pequeño cofactor para unirse al DNA. De hecho, se sabe que al gunas proteínas bacterianas (incluyendo CAP y el represor del bacteriófago lambda) actúan com o activadoras o como represoras en función de la posición exacta de la secuencia de DNA que reconocen en relación al promotor: si el lugar de unión a la proteína solapa el promotor, la polimerasa no puede unirse y la pro teína actúa com o represor (Figura 9-28).
Un activador transcripcional y un represor transcripcional controlan el operón lac23 Es posible diseñar interruptores genéticos más complicados combinando con troles negativos y positivos. Por ejemplo, el operón lac en E. coli, a diferencia del operón trp, está controlado por controles transcripcionales negativos y po sitivos: el represor lac y la proteína CAP respectivamente. El operón lac codifica las proteínas necesarias para transportar el disacárido lactosa al interior de la célula para su utilización m etabólica. CAP, com o ya se ha visto, capacita a la
448
Capítulo 9 : El control de la expresión génica
proteina
Figura 9-27 Resumen de los m ecanism os que utilizan las proteínas reguladoras de genes p ara controlar la transcripción en los procariotas. (A) Regulación negativa; (B) regulación positiva. Obsérvese que la adición de un ligando inductor puede activar un gen ya sea separando del DNA a una proteína represora de genes (panel superior izquierdo), o capacitando a una proteína activadora de genes para que se una al DNA {panel inferior derecho). Del mismo modo, la adición de un ligando inhibidor puede desactivar un gen separando del DNA a una proteína activadora de genes (panel superior derecho) o capacitando a una proteína represora de genes para que se una al DNA (panel inferior izquierdo).
Figura 9-28 Algunas proteínas reguladores bacterianas actúan bien activadores o como represores de la transcripción dependiendo del emplazamiento concreto de sus secuencias de unión al DNA. Un ejemplo de ello es el represor del bacteriófago lambda. La proteína actúa como un activador transcripcional aportando un contacto favorable a la RNA polimerasa [arriba). En la parte inferior de la figura el operador se localiza un par de bases más próximo al promotor, y en vez de ayudar a la polimerasa, ahora compite con ésta por la unión al DNA. El represor lambda reconoce a su operador mediante un motivo hélice-giro-hélice, como se muestra en la Figura 9-11.
bacteria para utilizar fuentes de carbono alternativas a la glucosa, como por ejemplo la lactosa. Sería sin embargo inútil para CAP inducir el operón lac si no hubiera lactosa disponible, y el represor lac asegura que el operón lac esté inac tivo en ausencia de lactosa. Esta organización permite al operón lac responder integrando dos señales diferentes, de forma que sólo se activa cuando las condi ciones son las adecuadas: no debe de haber glucosa pero sí lactosa. Cualquier otra de las tres combinaciones posibles de señales mantiene al operón inactivo (Figura 9-29). La lógica simple de este interruptor genético atrajo la atención de los biólo gos desde hace 50 años. Como se ha explicado anteriormente, las bases molecu lares de este interruptor fueron descubiertas gracias a una combinación de ge nética y bioquímica y aportó los primeros detalles sobre cómo se realiza el control de la expresión de los genes. Aunque en los organismos superiores se utilizan las mismas estrategias para controlar la expresión génica, los interrupto res genéticos son mucho más complejos.
represor de lam bda
RNA polim erasa
operador
prom otor la transcripción es activada por el represor de lambda
operador 1-------------- 1-------prom otor la transcripción es reprim ida por el represor de lam bda
La regulación de la transcripción en las células eucariotas es compleja24 El mecanismo de interruptor sensible a dos señales que controla el operón lac es elegante y sencillo. Sin embargo, es difícil imaginar la complejidad que se añade al sistema cuando se han de tener en cuenta muchas más señales que pueden
lugar de unión lugar de de la RNA unión polimerasa de CAP (prom otor)
lugar de inicio para la síntesis de RNA
operador
gen lacZ
-80 -40 1 40 80 i_____ ,_____ i_____ ,_____ i_____ ,_____ i_____ ,_____ i pares de nucleótidos + GLUCOSA + LACTOSA
OPERÓN INACTIVO porque CAP no está unida
1 represor
+ GLUCOSA - LACTOSA GLUCOSA LACTOSA -G LU C O S A + LACTOSA
Stti i C A P ^ ^ i^ ppü
represor
OPERÓN INACTIVO porque el represor lac está unido
j¡
CAP
OPERÓN INACTIVO tanto porque el represor lac está unido com o porque la proteína CAP no lo está
RNA polimerasa
Figura 9-29 Control dual del operón loe. Los niveles de glucosa y de lactosa controlan el inicio de la transcripción del operón lac a través de sus efectos sobre la proteína represora de lac y sobre CAP. La adición de lactosa incrementa la concentración de alolactosa, que se une a la protema represora y la separa del DNA. La adición de glucosa reduce el nivel de AMP cíclico; como la proteína represora CAP ya no tiene AMP cíclico unido, la proteína CAP se libera del DNA y el operón se activa. En la Figura 9-8 se muestra cómo la proteína CAP induce una curvatura en el DNA al unirse; aquí no se muestra para simplificar el esquema. LacZ, el primer gen del operón lac, codifica la enzima P-galactosidasa, que rompe la lactosa en galactosa y glucosa.
OPERON ACTIVO
i RNA I
Cómo funcionan los interruptores genéticos
440
regular la transcripción del operón: el espacio necesario para colocar secuencias reguladoras desbordaría rápidamente todo el espacio disponible ¿Cómo han conseguido los eucariotas superar estas limitaciones y crear interruptores gené ticos más complejos? La regulación de la transcripción en los eucariotas difiere de la de las bacte rias en dos aspectos fundamentales. En primer lugar, las RNA polimerasas euca riotas no pueden iniciar la transcripción por sí mismas. Requieren la presencia de una serie de proteínas, denominadas factores generales de transcripción, que han de ensamblarse en el promotor antes de que la transcripción pueda iniciar se. Este proceso de ensam blaje presenta múltiples etapas en las que la velocidad de inicio de la transcripción puede aumentar o disminuir como respuesta a se ñales de regulación, y m uchos proteínas reguladoras eucariotas actúan influyen do en estas etapas. En segundo lugar, muchas proteínas reguladoras de eucario tas pueden actuar incluso cuando se encuentran unidas al DNA a miles de nucleótidos de distancia del promotor que regulan, lo que significa que un de terminado promotor puede estar controlado por un número casi ilimitado de se cuencias reguladoras dispersas por el DNA. A continuación consideraremos es tas dos características de la regulación génica eucariota.
Las RNA polimerasas eucariotas requieren factores de transcripción generales25 El descubrimiento inicial de que las RNA polimerasas eucariotas purificadas no podían iniciar la transcripción in vitro llevó al descubrimiento y purificación de proteínas adicionales, los denominados fa c to re s g e n e ra le s d e tra n s c rip c ió n , necesarios para este proceso. Estas proteínas no son simplemente subunidades perdidas de la polimerasa; tienen que ensamblarse formando un complejo so bre el DNA en el lugar promotor con el fin de poder reclutar a la RNA polimerasa en ese lugar. La Figura 9-30 muestra cómo se cree que se ensamblan los factores genera les de transcripción en los promotores utilizados por la RNA polimerasa II (Pol II), la polimerasa que transcribe la gran mayoría de los genes eucariotas. El proceso de ensam blaje se inicia con la unión de TFIID a la secuencia TATA, una secuencia corta de DNA de doble cadena formada esencialmente por nucleóti dos T y A. La secuencia TATA es un com ponente de casi todos los promotores utilizados por Pol II y se encuentra localizada típicamente 25 nucleótidos por delante del lugar de inicio de transcripción. TFIID está compuesto por muchas subunidades; la responsable de reconocer la secuencia TATA se denomina TBP (de TATA Binding Protein) (Figura 9-31). Una vez se ha unido TFIID a su lugar de unión en el DNA, los demás factores de transcripción y la RNA Pol II también se unen. Después de que la RNA Pol II se haya unido al promotor, se ha de separar del com plejo de factores generales de transcripción para poder iniciar la trans-
Figura 9-30 Ensamblaje de los factores generales de transcripción necesarios para la iniciación de la transcripción por la RNA polim erasa II. En la primera etapa TFIID se une específicam ente a la secuencia TATA. A continuación TFIIB se une al com plejo, seguido por la RNA polimerasa II (Pol II) acom pañada de TFIIF. A continuación TFIIE y TFIIH se unen al com plejo. En presencia de ATP, TFIIH fosforila Pol II, con lo que se activa la función polimerasa y se inicia la transcripción. El lugar de fosforilación es una larga cola polipeptídica que se extiende desde la subunidad mayor de Pol II. En los mamíferos está formada por 52 repeticiones de la secuencia de aminoácidos YSPTSPS (véase Figura 8-42) y las que son fosforiladas son las cadenas laterales de los aminoácidos serina (S) y treonina (T) de esta secuencia. Los factores generales de transcripción han sido muy conservados evolutivamente: por ejemplo, algunos de ellos, aislados a partir de células humanas, pueden ser reemplazados por los equivalentes de levadura.
450
Capítulo 9 : El control de la expresión génica
inicio de la transcripción TATA A
TFIID
TFIIB
actividad proteína quinasa (TFIIH)
SE INICIA LA TRANSCRIPCION
h 2n
Figura 9-31 Estructura tridimensional de TBP. La estructura
COOH
cripción. Una etapa clave en el inicio de la transcripción es la realizada por TFIIH, una subunidad de la cual es una quinasa que fosforila Pol II. Al menos en algunos promotores parece que esta fosforilación libera la polimerasa y permite que se inicie la transcripción. Las otras dos RNA polimerasas que se encuentran en eucariotas, RNA poli merasa I (Pol I) y RNA polimerasa III (Pol III), tam bién requieren una serie de factores generales de transcripción. Aunque TBP es necesario para las tres poli merasas, los demás factores son diferentes de los que se ensamblan en los pro motores Pol II, y la unión de TBP en los promotores Pol I y Pol III no depende de una secuencia TATA en el DNA.
de esta subunidad de TFIID recuerda una silla de montar que se adapta a la doble hélice de DNA. Aunque la proteína presenta una gran simetría, está formada por una única cadena polipeptídica. Es probable que originalmente esta proteína fuera un dímero, y que el gen codificante del monómero original se duplicara y fusionara a lo largo de la evolución. TBP reconoce el DNA mediante un motivo diferente a los discutidos en este capítulo. No se conoce ninguna otra proteína que se una al DNA de la misma forma, lo que quizás sea un reflejo del papel único de TBP en la célula: participa en el inicio de la transcripción de todos los genes. Aunque no se muestra en la figura, el DNA es deformado severamente por la unión de TBP. Esta deformación -dos rizos separados por una zona de DNA desenrollado- puede ser una marca que ayude a atraer a los demás factores generales de transcripción. (Adaptado de D.B. Nikolov et al., Nature 360:4045,1992. © 1992 Macmillan Magazines Ltd.)
Los incrementadores o activadores controlan los genes a distancia26 Resultó una gran sorpresa para muchos biólogos la demostración, en 1979, de que DNA situado a miles de nucleótidos de distancia de un promotor eucariota puede activar la transcripción desde el promotor. Actualmente se sabe que estas secuencias increm entadoras o activadoras (enhancers) actúan como lugares de unión de proteínas reguladoras que activan o incrementan la transcripción y que este tipo de “acción a distancia” es más la regla que la excepción para las proteínas reguladoras en las células eucariotas. Este fenómeno tam bién ocurre,
NtrC
Figura 9 -3 2 Activación gènica a distancia. (A) NtrC es una proteína de
RNA polimerasa bacteriana en un com plejo cerrado '*?
increm entador o activador
^
m V %v * : ^
i* *
i .ü’ *
“V * ,* -
}&*) 1
interm ediario de activación en bucle
(A)
«
prom otor
GEN ACTIVO
Cómo funcionan los interruptores genéticos
20 nm
regulación gènica bacteriana que activa la transcripción facilitando la transición entre el complejo cerrado y el abierto de la RNA polimerasa (descrito en el Capítulo 8). Aunque no es frecuente en las RNA polimerasas bacterianas, la transición que estimula NtrC requiere la hidrólisis de ATP. (B) Se puede ver en las micrografías de microscopia electrónica la interacción de NtrC y RNA polimerasa, así como el bucle de DNA que las separa. Aunque la activación gènica mediante bucles de DNA es poco frecuente en bacterias, es típica de las proteínas reguladoras eucariotas. (B, cortesía de Harrison Echols.)
451
aunque con menor frecuencia, en procariotas. ¿Cómo pueden ejercer su función estas proteínas a tales distancias? Se han propuesto muchos modelos, pero parece que el más simple sería el más correcto. El DNA existente entre el incrementador y el promotor se doblaría permitiendo que las proteínas unidas al increm enta dor interactuaran directamente con uno de los factores generales de transcrip ción o con la propia RNA polimerasa (Figura 9-32). El DNA actuaría como una cuerda, provocando que las proteínas unidas al incrementador, incluso a miles de nucleótidos de distancia, colisionen repetidamente con las proteínas unidas al promotor. Éste es el mismo efecto que se esperaría obtener incrementando la concentración local de proteína en el promotor (Figura 9-33).
Una región de control eucariota está formada por un promotor y por las secuencias de DNA reguladoras27 Debido a que las proteínas reguladoras pueden controlar la transcripción inclu so cuando se encuentran unidas al DNA lejos del promotor, las secuencias de DNA que controlan la expresión de un gen pueden estar dispersas sobre largas extensiones de DNA. Aquí se utiliza el término región de control del gen para in dicar las secuencias de DNA necesarias para iniciar la transcripción del gen, y las necesarias para regular la frecuencia con que tiene lugar esa iniciación. Así pues, un promotor eucariota consta de un prom otor, donde se ensamblan los factores generales de transcripción y la polimerasa, más todas las secuencias regulado ras a las que se unen las proteínas reguladoras para controlar la velocidad de ese proceso de ensam blaje sobre el promotor (Figura 9-34). En eucariotas superiores no es inusual encontrar las secuencias reguladoras a distancias tan largas com o 50 000 pares de bases, aunque la mayor parte de las secuencias de DNA actúan com o DNA “espaciador” y no son reconocidas por ninguna proteína reguladora. En este capítulo utilizamos el término gen para in dicar el DNA que se transcribe en RNA (véase Figura 9-34), aunque según la idea clásica de gen debería incluir tam bién la región de control. Las diferentes defini ciones proceden de los modos distintos en que históricamente se han ido identi ficando los genes, y los descubrimientos modernos han complicado el sentido de este térm ino -m á s adelante, en este mismo capítulo, volveremos a esta idea. Aunque muchas proteínas reguladoras se unen a secuencias incrementadoras y activan la transcripción génica, algunas actúan como reguladores negati vos, como se verá más adelante. En contraste con el pequeño número de facto res generales de transcripción, que son proteínas abundantes y se ensamblan en los promotores de todos los genes transcritos por Pol II, existen miles de diferen-
452
Capítulo 9 : El control de la expresión génica
F ig u ra9-33 La unión de dos proteínas a lugares distantes de la doble hélice de DNA puede aum entar considerablemente la probabilidad de que ambas proteínas interactúen.
(A) La unión de una proteina a la otra mediante una asa de DNA de 500 pares de nucleótidos aumenta su frecuencia de colisión. En la figura, la intensidad de azul refleja la probabilidad de que la proteína roja se encuentre en cada una de las posiciones del espacio respecto de la proteína blanca. (B) La flexibilidad del DNA es tal que una secuencia cualquiera forma un pliegue de 90°, de vértice redondeado, cada 200 pares de nucleótidos aproximadamente. Así, cuando dos proteínas están unidas por sólo 100 pares de nucleótidos, su contacto queda relativamente restringido. En estos casos, la interacción proteica es mucho más fácil si los dos lugares de unión para las proteínas están separados por una distancia múltiple de 10 pares de nucleótidos, la cual sitúa a ambas proteínas sobre la misma cara de la hélice de DNA (que contiene 10 nucleótidos por vuelta) y, por lo tanto, en el interior del bucle de DNA, donde más fácilmente pueden interactuar. (C) Concentración efectiva teórica de la proteína roja en la posición donde está unida la proteína blanca, en función de la separación entre ambas. (C, cortesía de Gregory Bellomy, modificación de M.C. Mossing y M.T. Record, Science 233:889-892,1986. © 1986 thè AAAS.)
factores generales de proteínas de regulación gènica transcripción
1
DNA espaciador
1
TATA i prom otor
proteínas de regulación gènica
pQ|
4
i
transcrito de RNA la región de control del gen X
>
tes proteínas reguladoras. Estas proteínas varían de gen a gen, y cada una se en cuentra presente en cantidades muy pequeñas en cada célula. Muchas de ellas reconocen su secuencia específica de unión utilizando uno de los motivos es tructurales de unión a DNA que hemos descrito previamente. Estas proteínas permiten que cada gen pueda ser activado o desactivado específicamente. En cada tipo celular de un eucariota superior existe una colección diferente de pro teínas reguladoras.
Muchas proteínas activadoras aceleran el ensamblaje de los factores generales de transcripción28 La mayoría de las proteínas reguladoras que activan la transcripción de los ge nes -e s decir la mayor parte de las proteínas activadoras gén icas- tienen un di seño modular que consta de al m enos dos dominios. Habitualmente uno de ellos contiene uno de los motivos estructurales capaces de reconocer una se cuencia reguladora específica en el DNA que hemos descrito previamente. En el caso más sencillo existe sólo otro dominio que entra en contacto con la m aqui naria de transcripción y acelera la frecuencia de inicio de transcripción. Este tipo de diseño modular fue demostrado mediante experimentos en los cuales me-
(A) dom inio acídico activador dom inio de GAL4 de unión al DNA
proteína GAL4
gen lacZ
TATA RNA
(B)
í>
proteína quim érica lexAGAL4
lugar de unión al DNA de GAL4
8
lugar de unión al DNA de lexA
TATA
GEN INACTIVO
TATA RNA
Cómo funcionan los interruptores genéticos
Figura 9-34 Región de control de un gen eucariota típico. El promotor es la secuencia de DNA donde se ensamblan los factores generales de transcripción y la polimerasa. El rasgo más importante del promotor es la caja TATA, una corta secuencia de pares de bases A-T y T-A que es reconocida por el factor general de transcripción TFIID. El punto de inicio de la transcripción está localizado típicamente a 25 pares de bases por debajo de la secuencia TATA. Las secuencias reguladoras actúan como lugares de unión para las proteínas reguladoras, cuya presencia en el DNA afecta la velocidad de iniciación de la transcripción. Estas secuencias se pueden encontrar adyacentes al promotor, muy lejanas por delante de él o incluso por detrás. Se cree que los bucles de DNA permitirían que las proteínas situadas en cualquiera de estas posiciones interactuaran con las proteínas que se ensamblan en el promotor. Mientras que los factores generales de transcripción son similares para todos los genes transcritos por la RNA polimerasa II, las proteínas reguladoras y las posiciones de sus secuencias de unión en relación con el promotor son distintas para cada gen.
Figura 9-35 Estructura modular de una proteina de activación gènica. Esquema de un experimento de cambio de dominios proteicos que revela que las funciones de unión a DNA y de activación de la transcripción residen en diferentes dominios de la proteina activadora gènica GAL4 de levaduras. Es posible reconstituir un activador funcional a partir de una porción del extremo carboxilo de la proteína GAL4 si se fusiona, mediante técnicas de fusión gènica, con el dominio de unión a DNA de ima proteina reguladora bacteriana (la proteína lexA). Cuando la proteina híbrida resultante, levadura-bacteria, es producida en células de levadura, activará la transcripción de los genes de levadura que presenten insertada en su proximidad la secuencia de reconocimiento de la proteína bacteriana. (A) La activación normal del gen por la proteina GAL4. (B) La proteína reguladora quimérica requiere la secuencia de unión a DNA de lexA para su actividad. Normalmente GAL4 es responsable de activar la transcripción de los genes de levadura que codifican las enzimas que convierten galactosa en glucosa. Para los experimentos que se muestran en la figura se fusionaron la región de control de esos genes con el gen lacZ de E coli, que codifica la enzima P-galactosidasa (véase Figura 9-29). (3-galactosidasa es una enzima muy fácil de detectar, y por ello es un marcador conveniente para seguir los niveles de expresión determinados por una región de control gènico; lacZsirve como un gen marcador (véase pág. 345).
453
Figura 9 -36 Modelo para la acción de los activadores acídicos. La proteína activadora génica GAL4, unida al DNA en la vecindad del promotor, facilita la incorporación de TFIIB al naciente com plejo de factores generales de transcripción. Las proteínas activadoras unidas al DNA incrementan la velocidad de transcripción hasta 1000 veces, lo que es consistente con una afinidad débil y no específica entre el activador y los factores generales de transcripción (un cam bio en la afinidad de 1000 veces corresponde a un AG de ~4 kcal/mol, que puede alcanzarse por unos cuantos enlaces no covalentes débiles).
diante técnicas de ingeniería genética se crearon proteínas híbridas que conte nían el dominio de activación de una proteína fusionado con el dominio de unión a DNA de otra proteína diferente (Figura 9-35). En una de las clases de proteínas activadoras génicas, el dominio de activa ción presenta en su superficie un grupo de aminoácidos cargados negativamen te (acídicos). Estos activadores acídicos actúan acelerando el ensamblaje de los factores generales de transcripción en el promotor. En principio, cualquiera de las etapas de ensam blaje que se muestran en la Figura 9-30 puede ser la etapa li mitante en el proceso de inicio de la transcripción. En algunos promotores la etapa limitante es la entrada de TFIIB en el complejo, y se cree que los activado res acídicos contribuyen a superar esta limitación facilitando al ensamblaje de TFIIB en el complejo (Figura 9-36). Otras proteínas activadoras parecen actuar uniendo TFIID al DNA, mientras que otras pueden activar la transcripción por diferentes mecanismos. En principio, el proceso de ensam blaje en el promotor podría tener más de una etapa limitante, y el nivel máximo de transcripción podría depender de va rios activadores génicos unidos a la región anterior, de modo que cada uno de ellos aceleraría una etapa diferente. Así, no resulta difícil comprender cómo va rias proteínas reguladoras, cada una de ellas unida a una secuencia reguladora diferente, podrían controlar la transcripción de un gen eucariota. Pero, indepen dientemente de cuál sea el m ecanismo preciso de acción, para que una proteína reguladora pueda influir en la transcripción de su promotor diana ha de estar unida directa o indirectamente al DNA.
Las proteínas represoras pueden inhibir la transcripción de diferentes formas29 Las proteínas activadoras eucariotas actúan de una manera similar en principio a la que hemos descrito para los activadores génicos bacterianos: catalizan la ac ción de la polimerasa contactando con la maquinaria de transcripción. Sin em bargo, no todas las proteínas reguladoras eucariotas activan la transcripción. Tal como hemos indicado, muchas de ellas actúan como proteínas represoras géni cas impidiendo la transcripción. A diferencia de los represores bacterianos mu chas de estas proteínas no actúan compitiendo con la polimerasa por el acceso al DNA. A pesar de que su mecanismo preciso aún no está completamente esta blecido, parece que diferentes represores tienen diferentes mecanismos de ac ción, tres de los cuales se describen en la Figura 9-37. Además de las proteínas represoras que actúan sobre genes individuales, las células eucariotas pueden utilizar otros mecanismos para impedir la expresión de los genes en grandes regiones del cromosoma. Este mecanismo se basa en la modificación de la estructura de la cromatina, lo cual se discutirá más adelante.
Las proteínas reguladoras de genes de células eucariotas frecuentemente se ensamblan formando pequeños complejos sobre el DNA30 Aunque algunas proteínas reguladoras de células eucariotas puede actuar inde pendientemente, la mayoría de ellas forman parte de un complejo formado por 454
Capítulo 9 : El control de la expresión génica
Figura 9 -37 Tres m aneras de actuar de las proteínas represoras eucariotas. En el primero (A) las
(A) union com petitiva al DNA
del activador (B)
1
bloqueo de la superficie de activación
TATA
lugar de unión lugar de unión del activador del represor lugar de unión del represor
lugar de unión del activador
proteínas activadoras y represoras compiten por la unión a la misma secuencia de DNA regulador. En la segunda (B) ambas proteínas pueden unir DNA, pero el represor forma un complejo con el dominio de activación del activador, evitando que entre en contacto con la maquinaria de transcripción. En el tercero (C) el represor interacciona con un naciente complejo de factores generales de transcripción, impidiendo que el proceso de ensamblaje continúe. En la Figura 9-21 se ilustra un cuarto mecanismo de control negativo: la inactivación de activadores génicos por heterodimerización.
(C) interacción directa con los factores generales de transcripción TATA diferentes polipéptidos, cada uno de los cuales tiene una función distinta. Fre cuentem ente el complejo se ensambla únicamente en presencia de la secuencia de DNA adecuada. Por ejemplo, en algunos casos bien estudiados, dos proteínas reguladoras con una baja afinidad una de la otra cooperan para unirse a una se cuencia de DNA, secuencia a la que son incapaces de unirse por sí mismas inde pendientemente. Una vez unidas al DNA, el dímero expone una superficie que es reconocida por una tercera proteína portadora de un dominio de activación que activa la transcripción (Figura 9-38). Este ejemplo ilustra un principio gene ral importante: interacciones proteína-proteína que son demasiado débiles para ensamblar las proteínas en solución pueden ser suficientes para producir el en sam blaje sobre el DNA; de esta forma la secuencia de DNA actuaría como un centro de nucleación para el ensamblaje de complejos de proteínas. Una proteína reguladora determinada puede participar en más de un tipo de complejo regulador. Una proteína puede actuar en un caso como parte de un complejo que activa la transcripción, y en otro caso como parte de un complejo que la inhibe (véase Figura 9-38). Así pues, individualmente las proteínas regula doras eucariotas no tienen ninguna función activadora o represora pero actúan como unidades reguladoras que se utilizan para construir complejos cuya fun ción final dependerá del ensamblaje de todos sus componentes. Ya hemos visto cómo la formación de los heterodímeros de proteínas regu ladoras en solución suponía un mecanismo de control combinatorio de la ex presión de los genes. El ensam blaje de pequeños complejos de proteínas regula doras sobre el DNA es un segundo mecanismo de control com binatorio (véase Figura 9-38).
(A) EN SOLUCIÓN
(B) EN DNA TRANSCRIPCION REPRESORA GEN ACTIVO
Cómo funcionan los interruptores genéticos
GEN INACTIVO
Figura 9 -3 8 A menudo, las proteínas reguladoras de genes eucariotas se ensamblan sobre el DNA formando pequeños complejos. En (A) se
muestran cinco proteínas reguladoras de genes. La naturaleza de la función del complejo que forman depende de la especificidad de la secuencia de DNA que nuclea su ensamblaje. En (B) un complejo activa la transcripción gènica mientras que otro complejo reprime la transcripción. Nótese que la proteína dibujada en verde forma parte tanto del complejo de activación como del de represión.
455
anterior
posterior
^Soo ooooófl <555oooo oooo
To°
Bicoid
*£0000000000
Figura 9-39 Distribución no uniforme de cuatro proteínas reguladoras en un embrión tem prano de Drosophila. En este estadio el
embrión es un sincitio, con muchos núcleos en un citoplasma común. Aunque no está claro en estos dibujos, todas las proteínas se concentran en los núcleos.
Hunchback
Los complejos interruptores genéticos que regulan el desarrollo de Drosophila están formados por módulos menores31 Dado que las proteínas reguladoras se pueden situar en muchos lugares a lo lar go de largas distancias en el DNA, que pueden ensamblarse formando com ple jos en cada uno de estos lugares y que los complejos pueden influir de diferentes maneras sobre el ensam blaje ordenado de los factores generales de transcrip ción en el promotor, podría existir un número casi ilimitado de posibilidades de crear interruptores genéticos com plejos para el control de la expresión de los ge nes eucariotas. Un ejemplo especialmente interesante de un complejo de ese tipo, un inte rruptor genético de múltiples com ponentes, es el que controla la transcripción del gen de Drosophila even-skipped (eve), la expresión del cual juega un papel importante en el desarrollo del embrión de Drosophila. Si el gen se inactiva por mutación, muchas partes del embrión no se forman, y el embrión muere en una fase temprana del desarrollo. Tal com o se discute en el Capítulo 21, en la etapa más temprana del desarrollo en la que se expresa eve, el embrión es una única célula gigante que contiene múltiples núcleos y un solo citoplasma común. El ci toplasma no es uniforme, sino que contiene una mezcla de proteínas regulado ras que se distribuyen no uniformemente a lo largo del eje del embrión, suminis trando información posicional para distinguir entre una parte del embrión y otra (Figura 9-39). (En el Capítulo 21 se describe cómo se establecen estas diferen cias.) Aunque inicialm ente los núcleos son idénticos, rápidamente empiezan a expresar genes diferentes ya que están expuestos a diferentes proteínas regula doras. Por ejemplo, el núcleo próximo al extremo anterior del embrión en desa rrollo está expuesto a un conjunto de proteínas reguladoras diferente al que in fluye en el núcleo del extremo posterior del embrión. Las secuencias de DNA regulador del gen eve están diseñadas para “leer" las concentraciones de las proteínas reguladoras en cada posición a lo largo del eje del embrión, interpretando esta información, de forma que el gen eve se expre sa en siete franjas, cada una de las cuales tiene una anchura de cinco a seis nú cleos, y situadas con precisión sobre el eje anteroposterior del embrión (Figura 9-40). ¿Cómo se ha podido procesar esta información? A pesar de que los deta lles moleculares aún no son conocidos, del estudio de eve y de otros genes de Drosophila con una regulación similar ya se han podido extraer algunos princi pios generales. La región reguladora del gen eve es muy larga (aproximadamente 20 000 pa res de nucleótidos). Está formada por una serie de módulos reguladores simples, cada uno de los cuales contiene múltiples secuencias reguladoras y es responsa ble de una franja de expresión de eve en el embrión. Esta organización modular se demuestra en experimentos en los que un módulo concreto (por ejemplo, el que especifica la franja 2) se extrae de su posición normal delante del gen, se si túa delante de un gen marcador y se reintroduce en el genoma de Drosophila (Figura 9-41A). Cuando se examinan embriones en desarrollo derivados de las
456
Capítulo 9 : El control de la expresión gènica
Figura 9-40 Las siete franjas de la proteína codificada por el gen evenskipped (eve) en un embrión de Drosophila en desarrollo. Dos horas y media después de la fecundación, el huevo se fijó y tiñó con anticuerpos que reconocen la proteína Eve [verde) y anticuerpos que reconocen la proteína Giant [rojo). Cuando las proteínas Eve y Giant se encuentran presentes a la vez, la tinción aparece amarilla. En este momento del desarrollo el huevo contiene aproximadamente 4000 núcleos. Tanto la proteína Eve como Giant se encuentran situadas en el núcleo, y las franjas de eve tienen una anchura de unos cuatro núcleos. En la Figura 9-39 se muestra el patrón de tinción de la proteína Giant. (Cortesía de Michael Levine).
m ódulo de la franja 3
m ódulo de m ódulo de la franja 2 la franja 7 TATA
(A)
m ódulo de la franja 2
TATA
gen eve
gen lacZ
m oscas portadoras de la construcción de DNA, se observa la expresión del gen marcador exactam ente en la posición de la franja 2 (Figura 9 -4 IB). Experimen tos similares a éste demuestran la existencia de otros módulos reguladores, cada uno de los cuales especifica una de las otras seis franjas.
El gen eve de Drosophila está regulado por controles combinatorios32 El estudio detallado del módulo regulador de la franja 2 ha dado indicios de cómo “lee” e interpreta la información posicional. Esta región contiene secuen cias de reconocim iento para dos proteínas reguladoras (Bicoid y Hunchback) que activan la transcripción de eve, y para otras dos proteínas reguladoras (Krüppel y Giant) que reprimen su transcripción (Figura 9-42). (Las proteínas re guladoras de Drosophila suelen tener nombres descriptivos que reflejan el feno tipo que resulta de la inactivación por mutación del gen que las codifica.) Las concentraciones relativas de estas cuatro proteínas determinan qué complejos se formarán en el módulo de la franja 2 que activan la transcripción del gen eve. La Figura 9-43 muestra las distribuciones de las cuatro proteínas reguladoras en la región del embrión de Drosophila donde se forma la franja 2. Aunque no se conocen los detalles exactos, es probable que para inactivar el módulo de la franja 2 sea suficiente que cualquiera de los dos represores esté unido al DNA, mientras que para activarlo al máximo sea necesario que se unan am bos activa dores Bicoid y Hunchback. Así pues, esta unidad integra las cuatro inform acio nes posicionales de forma que el módulo de la franja 2 se activa (y en conse cuencia se activa la transcripción del gen eve) sólo en aquellos núcleos en los que los niveles tanto de Hunchback como de Bicoid son elevados y no exista ni Krüppel ni Giant. Esta com binación de activadores y represores sólo ocurre en una región del embrión temprano; así pues, en cualquier otro caso el módulo de la franja 2 está inactivo (y por ello es silencioso). Previamente hemos descrito dos mecanismos de control combinatorio de la expresión génica -heterodim erización de las proteínas reguladoras en solución (véase Figura 9-19) y ensam blaje de com binaciones de proteínas reguladoras en pequeños com plejos en el DNA (véase Figura 9-38). Es bastante probable que ambos mecanism os participen en la compleja regulación de la expresión de eve.
y m ódulo de la franja 2: 480 pares de nucleótidos Krüppel y su lugar de unión
Bicoid y su lugar de unión
Giant y su lugar de unión
Hunchback y su lugar de unión
Cómo funcionan los interruptores genéticos
Figura 9-41 Experimento demostrativo de la construcción m odular de la región reguladora de
eve. (A) Se tomó una región de 480 pares de nucleótidos de la región reguladora de eve y se insertó por delante de un promotor que controla la síntesis de |}-galactosidasa (el producto del gen lacZ de E. cotí). (B) Cuando se introdujo esta construcción artificial en el genoma de embriones de Drosophila, los embriones expresaron P-galactosidasa (detectable mediante tinción histoquímica) precisamente en la posición de la segunda de las siete franjas de eve (C). (B y C, cortesía de Stephen Small y Michael Levine.)
Figura 9-42 Detalle del módulo de la franja 2 de eve. El segmento de la región
de control de eve identificado en la figura anterior contiene secuencias reguladoras, cada una de las cuales une alguna de cuatro proteínas reguladoras. A partir de experimentos genéticos sabemos que estas cuatro proteínas son responsables de la expresión correcta de la franja 2 de eve. Por ejemplo, las moscas deficientes en lós dos activadores Bicoid y Hunchback no expresan la franja 2 de eve de forma eficiente. Cuando las moscas son deficientes en cualquiera de los dos represores, Giant y Krüppel, la franja 2 se hace más amplia cubriendo una zona anormalmente grande del embrión. Las regiones de unión a DNA para estas proteínas se han determinado a partir de su clonaje, sobrexpresión en E. cotí, purificación y experimentos de determinación de huella en el DNA (footprinting), tal como se ha descrito en el Capítulo 7. El diagrama superior muestra que en algunos casos las secuencias de unión se pueden solapar de forma que las proteínas pueden competir por su unión al DNA Por ejemplo, se cree que la unión de Krüppel y Bicoid en el lugar situado más a la derecha es mutuamente excluyente.
457
aquí se form a la franja 2 de eve
I----------------1
__
Giant \
H unchback©
^
Krüppel 0
Bicoid
anterior posición a lo largo del em brión
p o s te rio r-*-
Además, la regulación del módulo de la franja 2 descrita ilustra un tercer tipo de control combinatorio. Dado que las secuencias reguladoras del módulo de la franja 2 se encuentran repetidas y dispersas por todo el DNA, se pueden unir si multáneamente muchos conjuntos de proteínas reguladoras, influyendo así al promotor del gen. El promotor integra sobre la transcripción las influencias de todas las proteínas unidas (Figura 9-44). La regulación de la expresión de eve es un ejemplo extremo de control com binatorio. Siete com binaciones de proteínas reguladoras -u n a combinación para cada fran ja- activan la expresión de eve, mientras que muchas otras com bi naciones (todas las que se encuentran en las regiones entre franjas) mantienen el gen silencioso. Se cree que los otros módulos de franja tienen un diseño simi lar al descrito para el módulo de franja 2, siendo capaces de leer información posicional suministrada por otras com binaciones de proteínas reguladoras. La re gión de control completa ocupa 20 000 pares de nucleótidos y es capaz de unir más de 20 proteínas distintas. Así pues, una región compleja y grande está cons truida a partir de una serie de módulos de menor tamaño, cada uno de los cua les está formado por una serie de secuencias cortas de DNA reconocidas por proteínas reguladoras específicas. Un requerimiento importante de esta estrate gia es la ausencia de relaciones entre los módulos: el estado de uno de los módu los no influye sobre el de los restantes. Se desconoce cómo se consigue este ais lamiento molecular. Sin embargo, de esta forma un único gen puede responder a una enorme cantidad de señales combinadas.
Figura 9-43 Distribución de las proteínas reguladoras responsables de asegurar que eve se exprese en la franja 2. La distribución de estas proteínas se determinó mediante tinción de un embrión de D rosophila con anticuerpos dirigidos contra cada una de las cuatro proteínas (Figura 939). La expresión de ev e en la franja 2 ocurre sólo en la posición donde los dos activadores (Bicoid y Hunchback) están presentes y los dos represores (Giant y Krüppel) ausentes. Por ejemplo, en embriones de moscas que carecen de Krüppel la franja 2 se expande en dirección posterior. De una manera similar, la franja 2 se expande en dirección posterior si las secuencias de unión a DNA de Krüppel se inactivan mediante mutación y esta región se reintroduce en el genoma. El propio gen eve codifica una proteína reguladora que, después de que se establezca su patrón de distribución en siete franjas, regula a su vez la expresión de otros genes de D rosophila. A medida que progresa el desarrollo, el embrión se subdivide en regiones cada vez más finas que darán lugar finalmente a las diferentes partes del cuerpo de una m osca adulta, tal com o se describe en el Capítulo 21.
En mamíferos las regiones de control también están formadas a partir de módulos reguladores sencillos33 Se ha estimado que un cierto porcentaje de la capacidad de codificación de un genoma de mamífero está dedicado a la síntesis de proteínas que actúan como
com plejo activador fuerte
c o m p le jo \V ^ J débil de ' proteínas activadoras
458
com plejo de proteínas reguladoras silencioso
RNA polimerasa y factores generales de transcripción
TATA
Capítulo 9 : El control de la expresión gènica
Figura 9-44 Integración en un prom otor. Varios grupos de proteínas reguladoras pueden actuar conjuntam ente influyendo sobre un promotor, como hacen en el módulo de la franja 2 de eve ilustrada previamente en la Figura 9-42. Aún no se conoce en detalle cómo se consigue la integración de numerosas señales.
reguladores de la transcripción génica. Esto es un reflejo de los complejos con troles que regulan la expresión de los genes en los mamíferos. Por ejemplo, es frecuente encontrar un gen con una región de control con una longitud de 50 000 pares de nucleótidos, en la que muchos módulos, cada uno de los cuales contiene un cierto número de secuencias reguladoras que unen proteínas regu ladoras, se encuentran separados por largas secuencias de DNA espaciador. Uno de los ejemplos m ejor conocidos de región reguladora com pleja en m a míferos es la del gen de P-globina humano, que se expresa exclusivamente en los eritrocitos y en un momento determinado de su desarrollo. La expresión del gen está controlada por un conjunto complejo de proteínas reguladoras, algunas de las cuales actúan como activadores y otras como represores (Figura 9-45). Se cree que las concentraciones (o actividades) de muchas de estas proteínas regu ladoras cam bian durante el desarrollo, y que sólo una com binación particular de todas ellas induce la transcripción del gen. Como se verá más adelante, el gen de la P-globina se encuentra sometido a un segundo nivel de control, superior, que implica cambios en la estructura de la cromatina.
A su vez, la actividad de una proteína de regulación génica puede estar regulada34 La estrategias de regulación del gen eve y del gen humano de la P-globina son si milares en cuanto a que la región de control responde a una amplia serie de pro teínas reguladoras. Sin embargo, el caso de Drosophila es poco frecuente en cuanto a que es la distribución espacial de las proteínas reguladoras en el cito plasma la responsable de controlar la expresión del gen. Ya se ha dicho que el em brión temprano de Drosophila es una única célula gigante que contiene miles de núcleos en un citoplasma común y que las proteínas reguladoras se encuentran distribuidas en complejos patrones espaciales de forma que distintos núcleos es tán expuestos a diferentes concentraciones de las proteínas. Estas proteínas regu ladoras entran al núcleo activando o reprimiendo directamente la transcripción de sus genes diana. En muchos embriones de otros organismos los diferentes nú cleos se hallan en células diferentes, y la información posicional extracelular debe o bien pasar a través de la membrana plasmática o bien, más a menudo, generar señales en el citosol que puedan llegar a influir en el genoma. El mecanism o por el que las señales extracelulares comunican su m ensaje a través de la m em brana plasmática se describe en el Capítulo 15. Aquí sólo abor daremos las etapas finales de las cascadas de señalización intracelular activada por señales extracelulares -la s etapas en las que se modifican las proteínas regu ladoras. En m uchos casos la proteína reguladora se encuentra en el interior de la célula en una forma inactiva, que otra señal puede modificar, activándola. Por
Cómo funcionan los interruptores genéticos
Figura 9-45 Modelo para el control del gen de p-globina humano. El diagrama muestra algunas de las proteínas reguladoras que se cree que controlan la expresión durante el desarrollo de los eritrocitos (véase Figura 9-52). Algunas de las proteínas mostradas, como CP1, se encuentran en muchos tipos celulares, mientras que otras, como GATA-1, son propias de algunos tipos celulares, incluyendo a los eritrocitos, y por ello se cree que contribuyen a la expresión específica de tipo celular de los genes de P globina. Tal como se indica con las flechas de dos cabezas, algunas de las secuencias de GATA-1 se solapan con las de otras proteínas reguladoras; se cree que la ocupación de estos lugares por GATA-1 excluye la unión de otras proteínas. (Adaptado de B. Emerson, En ‘Gene Expression: General and Cell-Type Specific’ [M. Karin ed.] pp. 116-161. Boston: Birkhauser, 1993.)
459
SÍNTESIS DE LA PROTEINA
DESENMASCARAMIENTO FOSFORILACIÓN DE ADICIÓN DE UNA LA PROTEINA SEGUNDA SUBUNIDAD
UNION A U N LIGANDO
INACTIVA
ESTIMULACIÓN DE LA ENTRADA AL NÙCLEO
O Ô U /1 Ö Q inhibidor
k
h'
1 subunidad de unión al DNA subunidad de activación
ACTIVA
1
\ ___ /
c
proteina inhibidora
nùcleo
/m>v
(A)
(B)
(C)
(E)
(D)
ejemplo, la proteína puede ser activada por fosforilación catalizada por una pro teína quinasa, o puede liberarse de un complejo que de otro modo mantendría a la proteína reguladora secuestrada en el citosol impidiendo su entrada al núcleo. En la Figura 9-46 se ilustran estas y otras formas de controlar la actividad de las proteínas reguladoras.
Las bacterias utilizan subunidades intercambiables de la RNA polimerasa para colaborar en el control de la transcripción génica35 Ya hemos resaltado la importancia de las proteínas reguladoras que se unen a las secuencias reguladoras de DNA e indican al aparato transcripcional si se ha de iniciar o no la síntesis de la cadena de RNA. Aunque éste es el principal m ecanis mo de control del inicio de la transcripción tanto en eucariotas como en proca riotas, algunas bacterias y sus virus utilizan una estrategia adicional basada en las subunidades de la RNA polimerasa intercambiables. Como se describió ya en el Capítulo 8 , la subunidad sigma (a) es necesaria para que la RNA polimerasa reco nozca un promotor. Algunas bacterias producen diferentes subunidades sigma, cada una de las cuales puede interactuar con el núcleo de la RNA polimerasa y di rigirla específicamente hacia diferentes promotores. Esta estrategia permite des activar un gran grupo de genes y activar otro simplemente reemplazando una subunidad sigma por otra. La estrategia es eficiente pues evita la necesidad de ac tuar sobre los genes uno a uno, y es utilizada frecuentemente por los virus para activar conjuntos de genes rápida y secuencialmente (Figura 9-47).
RNA polim erasa con el factor sigm a de la bacteria
(F) Figura 9-46 Algunos mecanism os de regulación de la actividad de las proteínas reguladoras en las células eucariotas. (A) La proteína reguladora de genes sólo se sintetiza cuando es necesaria y sufre una proteolisis rápida que evita su acumulación. (B) Activación por unión a un ligando. (C) Activación por fosforilación. (D) Formación de un com plejo con otra proteína que actúa com o dominio activador de la transcripción. (E) Desenmascaram iento de un dominio de activación por fosforilación de una proteína inhibidora. (F) Estimulación de la entrada al núcleo por eliminación de una proteína inhibidora que m antenía a la proteína incapaz de entrar al núcleo.
RNA polim erasa con la subunidad vírica semejante a sigma
28
I________________________I
genes tem pranos
34
I_______________________ I
genes medios
I_____________ ___________ I
genes tardíos
Figura 9-47 Subunidades intercambiables de la RNA polim erasa com o estrategia de control de la expresión génica en virus bacterianos. El virus bacteriano SPO l, que infecta a la bacteria B. subtilis, utiliza la polimerasa bacteriana para transcribir sus genes tempranos. Uno de los genes tempranos, denominado 28, codifica un factor similar a la subunidad sigma que se une a la RNA polimerasa, desplazando a la subunidad sigma bacteriana. Esta nueva forma de polimerasa inicia específicam ente la transcripción de los genes “medios” de SPO l. Uno de los genes medios codifica otra subunidad similar a la subunidad sigma, desplazando a su vez al factor producto del gen 28 y dirigiendo ahora la RNA polimerasa a la transcripción de los genes “tardíos”. Este último grupo de genes codifica las proteínas que empaquetarán el crom osom a vírico en una cubierta vírica y lisarán la célula. Así pues, esta estrategia permite que se expresen una serie de genes víricos en un orden particular, permitiendo un control rápido, controlado temporalm ente, de la replicación vírica.
460
Capítulo 9 : El control de la expresión génica
CAGATT GAAACGT CGCGGCQ3AAAACAAAATCAACAAA CAGATT GAAACGT CGTGGCC4 AAAACAAAATCAACAAA
En un cierto sentido, los eucariotas utilizan una estrategia similar al dispo ner de tres RNA polimerasas (I, II, y III), que comparten algunas de sus subunidades. Por contraste, los procariotas utilizan el mismo núcleo básico de RNA polimerasa, que modifican con diferentes subunidades sigma.
Figura 9 -48 Com paración entre partes de la región reguladora situada en dirección 5 ’ a p artir del gen engrailed de dos especies de
Los interruptores genéticos han evolucionado gradualmente
Drosophila melanogastery de Drosophila virilis, señalándose en rojo
Drosophila. Se presenta la comparación de las secuencias de
Hemos visto que las regiones de control de los genes eucariotas se distribuyen so bre largos fragmentos del DNA, mientras que las de los procariotas están próxi mas al inicio de transcripción. Sin embargo, algunas proteínas reguladoras proca riotas reconocen secuencias de DNA localizadas a muchos pares de nucleótidos del promotor. El ejemplo del bucle de DNA en E. coli mostrado en la Figura 9-32 se parece al mecanismo por el cual las proteínas reguladoras eucariotas actúan a distancia. De hecho, éste caso fue uno de los primeros ejemplos de formación de bucles en el DNA implicados en la regulación de los genes e influyó en gran medi da en los estudios posteriores de las proteínas de regulación génica eucariotas. Parece probable que el desarrollo de los interruptores génicos en estructu ras densamente empaquetadas a partir de interruptores mayores sea la respues ta a una presión evolutiva de las bacterias hacia el m antenimiento de un genoma de pequeño tamaño. (Este mismo argumento se ha utilizado para justificar la ausencia de intrones en las bacterias, como se ha visto en el Capítulo 8.) Sin em bargo, esta compresión tiene un coste, y es el de imaginar cómo pueden modifi carse con facilidad para incluir nuevos niveles de control. La forma extendida de las regiones de control eucariota, con módulos reguladores discretos separados por largas secuencias de DNA espaciados, podrían facilitar el mezclado de los módulos durante la evolución, tanto para crear nuevos circuitos reguladores como para modificar los ya existentes. Desentrañar la historia evolutiva de las regiones de control representa un reto fascinante, y muchas de las claves podrán encontrarse el las secuencias de DNA actuales (Figura 9-48).
las secuencias con un 90% de identidad. En la parte superior se indica a modo de ejemplo la secuencia real de un fragmento comparado. Las secuencias conservadas señalan posiblemente los lugares donde se deben unir importantes proteínas reguladoras, mientras que los bucles indican lugares donde han ocurrido inserciones o deleciones de nucleótidos, ya que estas dos especies han evolucionado desde un ancestro común hace alrededor de 60 millones de años. (Por cortesía de ludith A. Kassis y Patrick H. O’Farrell.)
Resumen La transcripción d e cada uno d e los genes en las células es activada o desactivada p o r proteínas d e regulación génica. E n procariotas estas proteínas se u n en h a bi tualm ente a secuencias específicas d e DNA próxim as al luga r d e inicio d e la trans cripción p o r la RNA polim erasa y, dependiendo d e la naturaleza d e la proteína re guladora y d e la localización precisa d e su secuencia d e unión, p u ed en tanto
Cómo funcionan los interruptores genéticos
461
activar com o rep rim ir la transcripción d el gen. Sin em bargo, la flexib ilid a d d e la d oble h élice d e DNA p erm ite q u e proteínas unidas en lugares distantes influyan en la RNA polim erasa en el luga r prom otor, a l doblarse el DNA q u e los separa. Esta a c ción a distancia es m uy com ún en las células eucariotas, en las q u e proteínas regu ladoras unidas a secuencias distantes m iles d e nucleótidos del prom otor controlan la expresión d el gen. A unque las RNA polim erasas procariotas pueden iniciar la transcripción p o r sí m ism as, las polim erasas eucariotas requieren el ensam blaje previo sobre el lugar prom otor d e factores generales d e transcripción. Estos factores se ensam blan en un cierto orden, q u e se inicia con la unión d el TFIID a la secuencia TATA, una secuencia d e DNA situada justo p o r delante d e m uchos lugares d e inicio d e la RNA polim erasa. E l proceso d e ensam blaje ordenado d e los factores gen erales d e transcripción p re senta varias etapas en las q u e se p u ed e regu la r la iniciación d e la transcripción, y se cree q u e m uchas proteínas reguladoras d e los genes eucariotas actúan facilitando (control positivo) o lim itando (control negativo) este proceso d e ensam blaje. M ientras q u e la transcripción d e u n determ inado gen procariota sólo está con trolada p o r u na o dos proteínas reguladoras, la regulación de los gen es eucariotas es m ucho m ás com pleja, d e acuerdo con el gra n tam año d e su genom a y la gra n va ried a d d e tipos celulares q u e presentan. P or ejem plo, la región d e control d el gen eve d e D rosophila com prende 2 0 000 pares d e nucleótidos d e DNA y tiene secu en cias d e unión p ara m ás d e 2 0 proteínas reguladoras. A lgunas d e estas proteínas son activadores transcripcionales, m ientras q u e otras son represores transcripcionales. Estas proteínas se u n en a secuencias reguladoras organizadas en una serie d e m ó dulos reguladores dispersos a lo largo d el DNA.
Estructura de la cromatina y el control de la expresión gènica36 Como se describió en el Capítulo 8, los genomas de las células eucariotas se en cuentran muy compactados, consiguiéndose que las largas moléculas de DNA quepan en el interior de la célula y puedan ser m anejadas fácilmente. El primer nivel de com pactación es el enrollamiento del DNA alrededor de las histonas formando los nucleosomas. El segundo nivel de compactación consiste en que los nucleosomas se empaquetan en fibras de 30 nm. Finalmente, en la heterocromatina, confinada a determinadas regiones del genoma que en interfase muestran una estructura extraordinariamente condensada, se observa un orden de empaquetamiento todavía superior. ¿Cómo pueden acceder al DNA del interior de esta estructura densamente empaquetada los factores generales de transcripción y las proteínas regulado ras? Y, ¿cómo afecta el empaquetamiento de la cromatina al control de la expre sión génica? En esta sección veremos que de los estudios de la estructura de la cromatina y sus efectos sobre la expresión génica se han podido extraer dos principios generales. En primer lugar, los nucleosomas no son ningún obstáculo serio ni para las proteínas reguladoras ni para las RNA polimerasas. Los incrementadores pueden actuar a pesar de ellos, las histonas que bloquean un pro motor pueden ser desplazadas y, una vez ha comenzado la transcripción, Poi II puede transcribir a través de los nucleosomas sin desorganizarlos. Incluso las polimerasas bacterianas, que no encuentran nucleosomas in vivo, pueden transcribir a su través, lo cual sugiere que el nucleosoma está construido de modo que pueda ser atravesado con facilidad (Figura 9-49). El segundo principio general es que algunas formas de em paquetamiento del DNA de orden superior hacen el DNA inaccesible tanto para las proteínas reguladoras como para los factores generales de transcripción. Así el empaquetamiento del DNA en estruc turas de orden superior juega un papel clave en el control de la expresión génica en eucariotas, sirviendo para m antener silenciosas grandes secciones del geno ma -e n algunos casos de forma reversible y en otros de forma irreversible.
462
Capítulo 9 : El control de la expresión génica
DNA
dim ero H2A-H2B
RNA polimerasa entrando en el /e / nucleosoma n
J (B)
(A)
dim ero H3-H4
(C)
’Ü
(D)
RNA polimerasa abandonando el nucleosom a
Figura 9-49 Modelo hipotético para explicar la capacidad de las RNA polim erasas p ara transcribir a través de los nucleosom as sin provocar su desplazamiento. La polimerasa
primero desplaza un dímero H2A-H2B (véase Figura 8-10), lo que permite su entrada en el nucleosoma. En la siguiente etapa, la polimerasa empujaría el DNA, alejándolo del dímero H3-H4 que se encuentra a continuación, continuando la transcripción. El dímero H2A-H2B desplazado es recapturado por el nucleosoma, y se desplaza el otro dímero H2A-H2B situado simétricamente, permitiendo repetir el proceso y la salida de la polimerasa del nucleosoma. (De K.E. van Holde et al., /. Biol. Chem. 267:2837-2840,1992.)
La transcripción del DNA que está empaquetado en nucleosomas se puede activar37 En la sección anterior vimos un modelo sencillo de cómo la transcripción de un gen era activada por una proteína reguladora (véase Figura 9-36). ¿Cómo se ha de modificar dicho modelo para tener en cuenta la presencia de los nucleosomas ? Para empezar por el principio, ¿de qué forma afectan los nucleosomas la unión de las proteínas activadoras a las secuencias reguladoras en el DNA? En algunos casos las secuencias reguladoras se encuentran en cortas regiones libres de nu cleosomas, de forma que no existe ningún impedimento para esta interacción. No se sabe cómo ciertas regiones se m antienen libres de nucleosomas, aunque, como ya se describió en el Capítulo 8, ciertas regiones de DNA son demasiado rí gidas y no admiten la torsión necesaria para la formación del nucleosoma. Sin embargo, en otros casos la secuencia reguladora se encuentra empaquetada en un nucleosoma, lo cual no impide que al menos algunas proteínas activadoras puedan reconocerla y unirse a ella. La proteína reguladora, una vez unida, parece desestabilizar el nucleosoma, que entonces se desensambla al menos parcial mente. Aún se desconoce qué tipos de proteínas reguladoras pueden conseguir este efecto y cómo tiene lugar. En cambio, los factores generales de transcripción parecen incapaces de en samblarse sobre un promotor empaquetado en un nucleosoma. De hecho, este grado de empaquetamiento podría haber evolucionado al menos en parte en el sentido de asegurar que no se produzca una iniciación de la transcripción, débil o banal (es decir iniciación sin la unión previa de una pro teína activadora). Sin embargo, parece que la unión de una proteína activadora a miles de nucleótidos de distancia podría desplazar, aparentemente, un nucleosoma del promotor y entonces sería posible el ensam blaje de los factores generales de transcripción. El desplazamiento podría ocurrir bien como consecuencia de una actividad dis tinta de la proteína activadora, o ser una consecuencia indirecta de los contactos que la proteína activadora establece con los factores generales de transcripción para facilitar su ensam blaje en el DNA (Figura 9-50).
Algunas formas de la cromatina impiden la transcripción38 Aunque se puede transcribir DNA empaquetado en nucleosomas, en algunas formas especiales de cromatina el DNA parece ser inaccesible a las proteínas ac tivadoras. Se cree que estas formas inactivas de la cromatina, que incluyen a la
Estructura de la cromatina y control de la expresión gènica
463
lugar de unión del activador
proteina activadora
cromatina especialmente condensada denominada heterocromatina (descrita en el Capítulo 8), contienen proteínas especiales que hacen que su DNA sea es pecialm ente inaccesible. Observaciones realizadas en la levadura S. cerevisiae ilustran cómo algunos tipos de crom atina pueden impedir la transcripción de un gen. El gen ADE2, cuya expresión es fácilm ente detectable, se expresa constantem ente en su posi ción normal del cromosoma. Sin embargo, cuando se transloca experimental mente al extremo de un crom osom a su transcripción se detiene, aunque la célu la contenga todas las proteínas que se requieren para transcribirlo. El DNA próximo al extremo de los cromosomas (los telómeros) está empaquetado en una forma de crom atina especialmente inaccesible, y se cree que ese tipo de empaquetam iento es el responsable de m antener al gen ADE2 translocado inac tivo, proceso denominado silenciamiento. El silenciamiento de genes localiza dos cerca del extremo del cromosoma se extiende por unos 10 000 pares de nucleótidos y se ha observado en muchos genes además de ADE2; el efecto de silenciam iento parece reducirse gradualmente a medida que se incrementa la distancia desde el telómero. El m ecanismo de silenciamiento no es conocido, pero parece que supone un ensam blaje cooperativo de proteínas en el DNA que, una vez establecido, es heredable a través de la replicación del DNA (véase Figu ra 9-51A). El silenciamiento del gen ADE2 es un ejemplo de un efecto de posición, en el que la actividad de un gen es dependiente de su posición en el genoma. Los efectos de posición se detectaron en primer lugar en Drosophila (Figura 9- 5IB), pero en la actualidad ya se han descrito en muchos otros organismos, y se cree que son un reflejo de los diferentes grados de empaquetamiento de la cromatina en diferentes puntos del cromosoma, y de la tendencia de estos estados a exten derse incluyendo a los genes situados en las proximidades. Posteriormente, cuando analicemos los mecanismos de la memoria celular, volveremos a esta idea.
464
Capítulo 9 : El control de la expresión gènica
Figura 9-5 0 Un modelo que explicaría el desplazamiento de los nucleosomas durante la iniciación de la transcripción en eucariotas. Una proteína activadora unida poseería una segunda actividad de eliminación de los nucleosomas del promotor, exponiéndolo a los factores generales de transcripción que podrían ensamblarse. En un modelo distinto, no mostrado aquí, el desplazamiento de los nucleosomas ocurre como consecuencia de la inducción del ensamblaje de los factores generales de transcripción; la proteína activadora, por ejemplo, puede permitir el ensam blaje inicial de los factores generales de transcripción en presencia de un nucleosom a y, una vez ensamblados, estos factores desestabilizarían el nucleosoma. Se conoce muy poco el mecanismo subyacente al desplazamiento de los nucleosomas. Las histonas pueden sencillam ente soltarse del DNA, o, de acuerdo con un modelo alternativo, permanecer unidas a él (véase Figura 8-40).
telóm ero
telóm ero
I—
colonia bianca de células de levadura
#
gen A D E 2en su posición norm al en el crom osom a
\
gen ADE2 próxim o al telóm ero
c olonia roja de células de levadura con sectores blancos
Antes de que los genes de globina de mamífero puedan transcribirse, puede ser necesaria una etapa de descondensación39 Otro ejemplo de cómo la crom atina condensada puede evitar la expresión génica procede de los estudios de los grupos de genes de (3 globina de pollos y de hu manos. Los cinco genes del grupo, que se extienden sobre 50 000 pares de nucleótidos de DNA, se transcriben exclusivamente en células eritroblásticas (es decir, células sanguíneas del linaje de los eritrocitos). Asimismo, cada gen es activado en una etapa diferente del desarrollo (Figura 9-52) y en diferentes órganos: el gen de e globina se expresa en el saco vitelino embrionario, el y en el saco vitelino y en el hígado fetal, y el 8 y el (3 inicialmente en la médula ósea adulta. Previa mente hemos descrito (véase Figura 9-45) una serie de proteínas necesarias para activar al gen humano de la (3 globina en el momento y lugar adecuados; cada uno de los otros genes de globina tiene una serie de proteínas reguladoras simi lares, muchas de las cuales son comunes a varios de ellos. Sin embargo, además de la regulación individual de cada uno de los genes de globina, parece que el grupo de genes está sujeto a otro control de activación/inhibición que supone cambios globales en la estructura de la cromatina. Algunas de las primeras evidencias de estos cambios proceden de estudios de los genes de globina a digestión por DNasal en núcleos aislados. En células en las que los genes de globina no se expresan, el DNA de dichos genes es resis tente a DNasal, lo cual indica que se encuentra empaquetado en forma de cro matina condensada. En cambio, en células eritroblásticas todo el grupo es sensi ble a la DNasal, lo que es un indicio de que la estructura de la cromatina localm ente ha cambiado, haciendo al DNA más accesible a la enzima. El DNA se encuentra aún empaquetado en nucleosomas, pero se han perdido los niveles de em paquetamiento de orden superior. Este cambio en el grado de empaqueta-
Estructura de la cromatina y control de la expresión génica
Figura 9-51 Efectos de posición en la expresión génica. (A) El gen ADE2 de levadura en su posición cromosóm ica normal se expresa en todas las células de levadura. Cuando se desplaza a una posición próxima al extremo del cromosom a de levadura, el gen se silencia en muchas pero no en todas las células de la población. La ausencia del producto génico de ADE2 provoca un bloqueo en la vía biosintética de adenina, con lo que se acumula un pigmento rojo. La célula fundadora de la colonia que presenta varios sectores tenía el gen ADE2 inactivo, por lo que la mayor parte de la colonia es roja. Normalmente las colonias de levadura son blancas. Las secciones b lan cas en los bordes de la colonia roja son clones de células en las que el gen ADE2 se ha activado espontáneam ente. La presencia de estos sectores indica que los estados activos o inactivos del gen ADE2 son heredables cuando el gen se encuentra próximo al telómero, un tem a que se discute en la próxima sección. (B) Los efectos de posición se pueden observar también en el caso del gen w hite de D rosophila. Las m oscas salvajes poseedoras de un gen w hite tienen los ojos rojos. Si el gen w hite se inactiva por mutación, los ojos se vuelven blancos (de ahí el nom bre del gen). En moscas con una inversión crom osóm ica que desplaza al gen w hite cerca de la región heterocrom atínica, las m oscas tienen los ojos moteados, con manchas rojas y blancas. Las m anchas blancas representan células en las que el gen w hite es silencioso, y las manchas rojas representan áreas en las que se expresa el gen w hite. Se cree que las diferencias se deben a lo lejos que se expanda la heterocrom atina durante el desarrollo temprano del ojo. Como en el caso del gen ADE2 de levadura, una vez establecido, el estado de expresión de w hite es heredable, produciendo grupos de muchas células que expresan w hite y grupos de células en las que w hite es silencioso. (De L.L. Sandell y V.A. Zakian, Trends Cell Biol. 2: 10-14, 1992.)
465
100 000 pares de nucleótidos locus de grupo de genes del tipo control de la de la p globina región ' £ ■
iG 1'A m
5 p
m ii
gen de la (3 globina (A)
miento del DNA ocurre aun antes de que se inicie la transcripción de los genes de globinas, sugiriendo que los genes están regulados en dos etapas. En la pri mera etapa, la crom atina que contiene el grupo de genes de globina se descon densa, lo cual al parecer facilita el acceso de algunas de las proteínas reguladoras al DNA. En la segunda etapa, las proteínas reguladoras restantes se ensamblan en el DNA y dirigen la transcripción de cada uno de los genes (Figura 9-53). Se cree que los cambios extensos que sufre la estructura de la cromatina pro pios de la primera etapa requieren una región de DNA denominada región de control del locus o LCR (de Locus Control Región), que se encuentran a bastante distancia por delante del grupo de genes (véase Figura 9-52). Ha sido posible es tablecer la importancia de la LCR a partir del estudio de ciertos pacientes con un tipo concreto de talasemia, una forma severa de anemia. Se ha visto que en estos pacientes el locus de p globina se mantiene silencioso en las células eritroblásticas, a pesar de tener el gen de p globina y las regiones reguladores intactas; el de fecto consiste en la deleción de ciertas zonas que eliminan total o parcialmente la LCR. Asimismo, el gen de P globina en las células eritroblásticas se mantiene re sistente a DNasal, lo que indica que es incapaz de seguir el proceso normal de descondensación propio del desarrollo de las células eritroblásticas. Experimentos posteriores utilizando ratones transgénicos han confirmado el gran efecto que LCR tiene sobre la expresión de los genes de globina. Por ejemplo, cuando el gen de P globina humano y sus regiones reguladoras (las mostradas en la Figura 9-45) se insertan en diferentes regiones del genoma del ratón, el gen se expresa en un nivel bajo, dependiendo del lugar de inserción. Este com portam iento es típico de los genes de mamífero, e indica que la posi ción del gen afecta su expresión (Tabla 9-2). Cuando se incluye la LCR con el gen, el gen de P globina se expresa a un nivel elevado en las células eritroblásti cas independientemente del lugar de inserción, indicando que la LCR puede su perar los efectos de posición. Aunque se han identificado algunas proteínas que se unen a LCR, se desco noce cuál es el mecanism o que modifica la estructura del locus completo de la p globina. En la siguiente sección exponemos algunas de las ideas que podrían ex plicar cómo se producen estos cambios.
No se conocen los mecanismos que forman la cromatina activa El modelo hipotético para explicar la activación global de las globinas, que se es quematiza en la Figura 9-53, implica que en los eucariotas existen proteínas de unión a secuencias específicas de DNA que actúan descondensando la cromatina en un área local del cromosoma que podría tener decenas de miles de pares de nucleótidos de longitud. Alternativamente, los cambios en la estructura de la cro matina observados en los genes activos podrían ser una consecuencia automáti ca, más que un requisito previo, del ensamblaje de factores de transcripción, de la RNA polimerasa, o de ambos, en un promotor. Hemos visto que el ensamblaje de los factores generales de transcripción en los promotores parece acompañarse de cambios en la distribución de los nucleosomas en el lugar de ensamblaje; po siblemente esta pequeña perturbación se pueda transmitir a largas distancias por algún mecanismo de propagación desconocido.
466
Capítulo 9 : El control de la expresión gènica
12
24
36 | 12 NACIMIENTO
24 36 48 edad en semanas
Figura 9-52 El grupo de los genes del tipo de la (3 globina de hum anos. (A) La región crom osóm ica grande comprende 100 000 pares de nucleótidos, y contiene los cinco genes de globina y una región de control del locus (descrita en el texto). (B) Variaciones de la expresión de los genes del tipo de la p globina durante varias fases del desarrollo de los humanos. Cada una de las cadenas de globina codificadas por estos genes se com bina con una cadena de la a globina formando la hemoglobina de los glóbulos rojos. (A, según F. Grosveld, G.B. van Assendelft, D.R. Greaves, y G. Kollias, Cell 51:975-985, 1987. © Cell Press.)
I
ETAPA 1 SE ALTERA LA ESTRUCTURA DE LA CROMATINA
ETAPA 2 SE ACTIVA EL GEN RNA polimerasa
proteína reguladora
\
RNA
Figura 9-53 Las dos etapas por las cuales se activan algunos genes, incluidos los del grupo de genes de las globinas. En la etapa 1 se modifica la estructura de una gran región de la cromatina, descondensándose en preparación para la transcripción. En la etapa 2 , las proteínas reguladoras (representadas en este esquema simplificado por una única proteína) se unen a lugares específicos de la cromatina induciendo la síntesis del RNA (transcripción).
T abla 9 -2 L a exp resión de u n gen transferid o a u n ra tó n gen eralm en te p resen ta efectos de posición del cro m o so m a , co n diferentes niveles de actividad g én ica en an im ales tran sgén ico s derivados de fo rm a independiente P o rce n ta je del to tal de mRNA en
Gen endógeno Animal transgénico 1 Animal transgénico 2 Animal transgénico 3 Animal transgénico 4
Saco vitelino
Hígado
20 3,4 4,8 4,4 0,4
5 1 30 13 0,4
E stó m ag o C ereb ro
0,1 0,1 1,3 4,7 0
C opias génicas p o r célu la
0 0 0 0 0
2 4 4 4 12
En estos experimentos llevados a cabo con el gen de la alfa--fetoproteína de ratón, el fragmento de DNA inyectado en el huevo del ratón fertilizado incluye 14 000 pares de nucleótidos de secuencia 5’-flanqueante, donde se localizan tres incrementadores (enhancers) que afectan la expresión de este gen. Se utilizó la técnica de hibridización para comparar el nivel de mRNA producido por el gen inyectado con el que normalmente produce el gen endógeno de la alfa-fetoproteína en los teji dos fetales indicados. (Datos de R.E. Hammer et al., Science 235:53,1987.)
Tengan o no los eucariotas proteínas capaces de descondensar dominios de la cromatina, es valioso especular acerca de cómo podrían hacerlo estas proteí nas. Actualmente sólo podemos imaginar este mecanismo. En la Figura 9-54 se esquematizan tres posibilidades. Se trata de tres modelos muy distintos, lo cual es un indicio de lo lejos que estamos de comprender la transición entre la cro matina activa e inactiva.
La tensión superhelicoidal del DNA permite la acción a distancia40 Uno de los tres modelos que se recogen en la Figura 9-54 implica la existencia de cambios topológicos en un bucle cerrado de DNA de doble cadena que conduce a
crom atina norm al en el dom inio en bucle
P U N T O DE E N T R A D A DE L A P R O T E ÍN A Q UE SE D E S P L A Z A
A L T E R A C IÓ N DE L A CRO M ATIN A, CA TA LIZA D A POR PRO TEÍNA
P U N T O DE GIRO A C T IV O D E L D O M I N I O DE CRO M ATIN A CO NSTREÑID A
LA TENSIÓ N SUPERH ELICO IDAL ALTER A LA CRO M ATIN A
L U G A R DE L A N U C L E A C I O N P A R A EL E N S A M B L A J E O DESENSAM BLAJE DE P R O T E ÍN A S DE C U B IERT A S O B R E LA CRO M ATIN A
Figura 9-5 4 Tres modelos propuestos p ara explicar la influencia a gran distancia de una región dominio de control sobre la actividad gènica. Se postula que el bucle de crom atina mostrado representa un dominio crom osóm ico en bucle completo (descrito en el Capítulo 8 ), que puede contener más de 100 000 pares de nucleótidos de DNA. Cada modelo propone una función diferente para el lugar LCR. El m ecanism o actual causante de los efectos a gran distancia es desconocido, y se podrían proponer otros mecanism os.
LA G A N A N C IA O P É R D ID A DE P R O T E Í N A S DE C U B IE R T A A L T E R A L A E S T R U C T U R A DE L A CRO M ATIN A
crom atina activa
Estructura de la cromatina y control de la expresión génica
467
DNA con un extrem o libre
DNA con los extrem os fijos
desenrollam iento de 10 pares de bases del DNA (una vuelta de la hélice)
desenrollam iento de 10 pares de bases del DNA (una vuelta de la hélice)
la hélice de DNA ha de girar una vuelta
(A)
la hélice de DNA form a un sobreenrollam iento
la formación de DNA sobreenrollado, una conformación que adopta el DNA en res puesta a una tensión superhelicoidal. El DNA sobreenrollado se ha podido estudiar especialmente en pequeñas moléculas circulares, como los cromosomas de algu nos virus y plásmidos. Sin embargo, estas mismas consideraciones se pueden apli car a cualquier región de DNA cuyos extremos sean incapaces de rotar libremente -com o por ejemplo en un bucle de cromatina anclado firmemente a la base. En la Figura 9-55 se ilustra una manera sencilla de visualizar las limitaciones topológicas que provoca el sobreenrollamiento del DNA. En un DNA de doble cadena cuyos extremos estén fijos se forma un sobreenrollamiento para com pensar cada 10 pares de nucleótidos que se han abierto (desenrollado) en la héli ce; la formación de este sobreenrollamiento es favorable energéticamente pues permite al resto de las regiones en las que las bases aún permanecen apareadas recuperar el giro normal de la hélice. En bacterias como E. coli existe un tipo especial de DNA topoisomerasa II, de nominada DNA girasa, que, empleando la energía de hidrólisis del ATP, sobreenro11a constantemente el DNA, manteniéndolo siempre bajo tensión. Estos sobreenrollamientos son sobreenrollamientos negativos, y tienen el sentido de giro opuesto a los sobreenrollamientos positivos que se muestran en la Figura 9-55 y que se for man cuando una región de la doble hélice se abre. Así, cuando se abre una región de la doble hélice de DNA en una bacteria, más que crearse un sobreenrollamiento positivo, lo que ocurre es que se elimina un sobreenrollamiento negativo. Dado que durante este proceso se reduce la tensión superhelicoidal del DNA, la apertura de la doble hélice de DNA en E. coli es energéticamente favorable comparada con la apertura de la doble hélice de un DNA que no esté sobreenrollado. Las DNA topoisomerasas de tipo II eucariotas eliminan tensión superheli coidal más que producirla (se describe en el Capítulo 8). Por ello, la mayor parte del DNA de una célula eucariota no está bajo tensión. Sin embargo el desenrolla miento de la doble hélice está asociado con la etapa de iniciación de la trans cripción. Además, una molécula de RNA polimerasa en movimiento (así como otras proteínas que desenrollan el DNA) tenderá a generar tensión superhelicoi dal positiva en el DNA por delante y tensión superhelicoidal negativa por detrás (Figura 9-56). Así, estos efectos topológicos podrían generar tales fuerzas en un
DNA
f j
molécula de proteína
SOBREENROLLAMIENTO NEGATIVO se facilita la apertura de la hélice 468
Capítulo 9 : El control de la expresión gènica
SOBREENROLLAMIENTO POSITIVO se dificulta la apertura de la hélice
Figura 9-55 La tensión superhelicoidal del DNA origina su sobreenrollamiento. (A) En el caso de una molécula de DNA con un extremo libre (o con un corte que actúe como un pivote de giro), la doble hélice de DNA gira una vuelta cada 10 pares de nucleótidos que se abren. (B) Si se impide la rotación, la tensión superhelicoidal que se genera en el DNA abre la hélice. Una forma de acomodar esta tensión es incrementar el giro de la hélice de forma que haya 11 pares de nucleótidos en vez de 10 por vuelta de hélice, como en el ejemplo; sin embargo, la doble hélice de DNA resiste dicha deformación doblándose en bucles sobreenrollados. De este modo se forma un sobreenrollamiento en el DNA por cada 10 pares de bases abiertas. El sobreenrollamiento formado aquí es un sobreen ro lla m ien to positivo (véase Figura 9-56).
Figura 9-56 Sobreenrollamiento de un segmento de DNA debido a una proteína que patrulla la doble hélice de DNA. Los dos extremos del DNA que se muestran son incapaces de rotar uno respecto al otro libremente, y se asume que la proteína que se desplaza tam bién es incapaz de rotar libremente. En estas condiciones el movimiento de la proteína causará la acumulación de un exceso de vueltas de hélice por delante y un déficit de vueltas por detrás, como se muestra en la figura. Las evidencias experimentales sugieren que una molécula de RNA polimerasa en movimiento produce sobreenrollamiento de este modo; la tensión superhelicoidal que genera por delante hace más difícil abrir la doble hélice, pero esta tensión ha de facilitar la liberación del DNA de los nucleosomas ya que la separación del DNA de las histonas del núcleo del nucleosoma ayuda a relajar la tensión superhelicoidal positiva.
lugar concreto que se propagaran a través de todo un dominio de la cromatina. Sin embargo aún se desconoce si algún fenómeno de este tipo está implicado en los cambios a gran escala de la estructura de la cromatina.
Resumen Los genomas de los organismos eucariotas están empaquetados en la cromatina. Algunas formas de cromatina están tan condensadas que los genes que contienen son silenciosos transcripcionalmente. A pesar de que se desconocen los detalles de este tipo de empaquetamiento, se cree que podría tratarse de un mecanismo utiliza do por las células para silenciar grandes regiones de sus genomas. En algunos casos es posible revertir este silenciamiento, activándose los genes que contenían, pero la manera en que ocurre es también desconocida. En formas de cromatina menos condensada el DNA se encuentra aún empa quetado en forma de nucleosomas. Los nucleosomas posicionados en el punto de inicio de la transcripción bloquean el ensamblaje de losfactores generales de trans cripción. Estos nucleosomas parecen desplazarse, por un mecanismo desconocido, cuando la transcripción se activa por proteínas reguladoras.
Mecanismos genéticos que originan tipos celulares especializados41 Aunque los organismos unicelulares han de ser capaces de activar y desactivar genes, los organismos pluricelulares además requieren interruptores genéticos capaces de generar y mantener sus diferentes tipos celulares. En particular, cuando una célula de un organismo pluricelular se diferencia hacia un tipo celu lar determinado, generalmente la elección de destino se mantiene a lo largo de muchas generaciones celulares, lo que significa que los cambios de expresión génica implicados en la elección deben recordarse. Este fenómeno de memoria celular es un requisito previo para la creación de tejidos organizados y para el mantenim iento de tipos celulares diferenciados. Por el contrario, los cambios simples de la expresión de los genes tanto en eucariotas como en procariotas son temporales; por ejemplo, el represor de triptófano reprime la expresión de los genes del triptófano en la bacteria únicamente en presencia de triptófano; en cuanto desaparece del medio los genes son activados de nuevo, y los descen dientes no tendrán memoria de que sus antecesores fueron expuestos al triptó fano. Sin embargo, incluso en los procariotas es posible heredar algunos cam bios en la expresión génica. En esta sección examinaremos de qué forma los mecanismos de regulación génica pueden combinarse entre sí para formar interruptores que, una vez acti vados, sean recordados por las sucesivas generaciones celulares. Empezaremos considerando algunos de los mecanismos genéticos m ejor conocidos de diferen ciación celular que actúan en bacterias y en levaduras.
Los cambios de fase de las bacterias son provocados por reorganizaciones del DNA42 Hemos visto que en las células eucariotas la diferenciación generalmente no im plica cambios detectables en las secuencias de DNA. En cambio, en algunos pro cariotas se pueden alcanzar patrones de regulación génica hereditarios a base de reorganizaciones específicas del DNA que activan o desactivan a genes concre tos. Dado que todos los cambios que se producen en una secuencia de DNA son copiados con exactitud en las replicaciones posteriores del DNA, cualquier esta do de actividad génica alterado se heredará por toda la progenie de la célula en la que se ha dado la reorganización. En principio, algunas de estas reorganiza ciones son reversibles y en tales casos, si consideramos períodos de tiempo sufi cientem ente largos, se establecen patrones de actividad génica alternante.
Mecanismos genéticos que originan tipos celulares especializados
469
segm ento que se invierte prom otor
H2
represor
prom otor H1
proteína H1 En la bacteria Salmonella se presenta un mecanismo de diferenciación celu lar de este tipo, conocido por cam bio de fase, que ha sido muy estudiado. Aun que en eucariotas superiores no existe el modo de diferenciación equivalente, sí tiene un efecto importante sobre ellos, ya que es el mecanismo que utilizan algu nas de las bacterias causantes de enfermedades para no ser detectadas por el sis tema inmune. El cambio de la expresión génica en Salmonella se produce por la inversión esporádica de un segmento específico de DNA de 1000 pares de nucleótidos que afecta la expresión de la proteína de la superficie celular flagelina, para la que la bacteria tiene dos genes. La inversión está catalizada por una enzi ma de recom binación específica de lugar, lo que cambia la orientación de un promotor situado en el interior de los 1000 pares de nucleótidos que se invierten. Con el promotor en una de las orientaciones la bacteria sintetiza un tipo de flage lina; con el promotor en la otra orientación la bacteria sintetiza el otro tipo de fla gelina (Figura 9-57). Dado que las inversiones se dan muy raramente, cuando se producen se generan clones enteros de bacterias con un tipo u otro de flagelina. Probablem ente este fenóm eno del cambio de fase evolucionó porque pro tege a la población bacteriana contra la respuesta inmune de sus huéspedes ver tebrados. Si el huésped fabrica anticuerpos contra un tipo de flagelina, las esca sas bacterias cuya flagelina sea distinta debido a una inversión génica podrán sobrevivir y multiplicarse. Las bacterias que se aíslan de los medios naturales suelen presentar cambios de fase para uno o varios rasgos fenotípicos, pero generalmente estas “inestabili dades” se eliminan en las cepas estándar del laboratorio. Sólo se han estudiado unos cuantos mecanismos subyacentes a este proceso y no todos consisten en in versiones de segmentos de DNA. Por ejemplo, una bacteria que provoca una en fermedad humana de transmisión sexual común (Neisseria gonorrhoeae) evita el ataque inmune mediante una variación hereditaria de las propiedades de su su perficie, que se genera por conversión génica (descrito en el Capítulo 6) más que por inversión génica. Este mecanismo depende de la proteína de recombinación RecA, y transfiere secuencias de DNA desde “cassettes génicas” silenciosas a un gen que se expresa; este mecanismo tiene la ventaja de que genera más de 100 va riantes de una proteína mayoritaria de la superficie bacteriana.
En levaduras, algunas proteínas reguladoras determinan la identidad del tipo celular43 Debido fundamentalmente a su gran facilidad de crecimiento y de manipula ción genética, las levaduras se han analizado con gran detalle como organismo
470
Capítulo 9 : El control de la expresión génica
Figura 9-57 Cambios en la expresión génica mediante inversiones de DNA en bacterias. Transcripción alternante de dos genes de flagelina en una bacteria S alm on ella, causada por un suceso sencillo de recombinación específica de lugar que invierte un pequeño segmento de DNA que contiene un promotor, de modo que en la orientación (A) activa la transcripción del gen H2 de flagelina así como la proteína represora que bloquea la expresión del gen de flagelina H l. Cuando el promotor se invierte (B), deja de activar al gen H2 y al represor, y el gen H l que ahora está libre de represión, se expresa. El mecanism o de recom binación se activa raramente (alrededor de una vez en 105 divisiones celulares). Así, la producción de uno u otro tipo de flagelina tiende a ser hereditaria en cada clon de células.
modelo para el estudio de los mecanismos de control génico en eucariotas. La levadura com ún de panadero, Saccharomyces cerevisiae, ha sido especialmente útil por su capacidad de diferenciarse en tres tipos celulares, aunque el m ecanis mo difiere en algunos aspectos básicos del que usan las células de plantas y ani males. S. cerevisiae es un eucariota unicelular que puede existir tanto en estado haploide como diploide. Las células diploides se forman por un proceso deno minado apaream iento, en el que dos células haploides se fusionan. Para que dos células haploides se puedan aparear han de diferir en su tipo de aparea miento (sexo). En Saccharomyces cerevisiae, existen dos tipos de apareamiento, a y a, especializados en el apareamiento mutuo. Cada uno de allos produce un molécula señal específica (factor de apareamiento) que difunde, y una proteína receptora. Estas moléculas capacitan a la levadura, respectivamente, para com u nicarse y para reconocerse y fusionarse con células del tipo contrario. Las célu las diploides resultantes, denominadas a / a, presentan características propias que las distinguen de los tipos parentales: no son aptas para el apareamiento pero pueden formar esporas (esporular), generando células haploides por meiosis en situaciones de carencia de nutrientes. Los m ecanismos por los cuales se establecen y mantienen estos tres tipos de células ilustran algunas de las estrategias que se han descrito previamente para cambiar el patrón de expresión génica. El tipo de apareamiento de la célula ha ploide viene determinado por un único locus genético, el locus del tipo de apa reamiento (MAT, de Mating-Type Locus), que en la célula de tipo a codifica una única proteína reguladora, a l, y en una célula de tipo a codifica dos proteínas reguladoras, a l y a2. La proteína a l no tiene ningún efecto sobre la propia célu la de tipo a, pero lo tendrá sobre la célula diploide resultante del apareamiento: mientras tanto la célula de tipo a fabrica la proteína reguladora por defecto. En cambio, la proteína a2 actúa en la célula a como un represor transcripcional que reprime los genes específicos de a, mientras que a l actúa como un activador transcripcional que activa los genes específicos de a. Cuando se fusionan las cé-
proteínas reguladoras producidas por el locus M AT
conjunto de genes controlados por M A T
tipo celular
MCM1 aSG xSG
(haploide)
hSG
a1
(sin efecto)
ACTIVO | INACTIVO H ACTIVO
MCM1
/------- IVI'
«2
aSG
m I
r a1
I
(haploide)
aq
y
MCM1
f m a2
1 INACTIVO
aSG hSG
ACTIVO
MCM1 t
1
a2
t. 1 C T
> i a2
a1
aSG
EH
a/a (diploide)
xSG a2
»
■ INACTIVO INACTIVO
a1
Mecanismos genéticos que originan tipos celulares especializados
hSG
INACTIVO
Figura 9-5 8 Control del tipo celular en levadura. El tipo celular en
levaduras está controlado por tres proteínas reguladoras (al, a2 y al) producidas por el locus MAT. Se transcriben diferentes grupos de genes en las células haploides de tipo a, a y diploides (tipo a / a). Las células haploides expresan una serie de genes específicos de célula haploide (hSG) y o bien un grupo de genes específicos de a (aSG) o de a (aSG). Las células diploides no expresan ninguno de estos genes. Las proteínas a l, a2, y al controlan muchos genes diana en cada tipo de célula mediante su unión, en diferentes combinaciones, a las secuencias reguladoras situadas por delante de estos genes. Es de destacar que la proteína a l es activadora, mientras que a2 es represora, y ambas actúan en combinación con una proteína reguladora ubicua denominada MCM1. En la célula diploide, a2 y al forman un heterodímero que desactiva un grupo distinto de genes (entre los que se incluye el gen que codifica la proteína activadora al) de los que inactivaba a2 y MCM1. Este ejemplo relativamente simple de control génico es un buen ejemplo de control combinatorio de la expresión génica (véase Figura 9-38). Las proteínas al y a2 reconocen en ambos casos su secuencia de unión mediante un homeodominio (véase Figura 9-13).
471
lulas de los dos tipos de apareamiento la com binación de las proteínas regula doras a l y íx2 genera un patrón de expresión génica completamente distinto al de cualquiera de las células progenitoras. En la Figura 9-58 se esquematiza el mecanism o por el cual los genes específicos del tipo de apareamiento se expre san en cada uno de los tres tipos celulares. Se trata de uno de los primeros ejem plos de control génico combinatorio y aún es uno de los mejor conocidos a nivel molecular. Aunque en muchos laboratorios las cepas de S. cerevisiae se mantienen es tables durante muchas generaciones, algunas cepas aisladas del medio natural cambian repetidamente entre los tipos celulares a y a por un mecanismo de re organización génica que recuerda el de cambio de fase en N. gonorrhoeae, aun que el m ecanism o en detalle parece ser particular de levadura. En cada uno de los extremos del locus MAT del crom osom a de la levadura existe un locus silen cioso que codifica las proteínas reguladoras específicas del tipo de apareamien to: en un lado codifica a l y a2, y en el otro a l. En cada división celular sucesiva el gen activo en el locus MAT es eliminado y substituido por una nueva copia del locus silencioso del tipo de apareamiento opuesto. Este mecanismo se ha deno minado mecanismo cassette pues el cambio supone eliminar un gen de la posi ción “activa” y su substitución por otro. El cambio es reversible porque aunque el gen original en el locus MAT se elimina, queda siempre una copia silenciosa en el genoma. Nuevas copias de DNA realizadas a partir de los genes silenciosos actúan como cassettes desechables que serán insertadas alternativamente en el locus MAT que actúa com o “cabezal lector” (Figura 9-59). Resultados de tests genéticos sugieren que las cassettes silenciosas se m an tienen inactivas por el mismo mecanism o que silencia los genes localizados en el extremo de los cromosomas de levadura (véase Figura 9-51 A): el DNA en un locus silencioso parece estar empaquetado en forma de cromatina inactiva.
Dos proteínas fágicas que se reprimen mutuamente su síntesis determinan el estado del bacteriófago lambda44 La observación de que a partir de la información génica de un sólo núcleo som á tico se pueda desarrollar un vertebrado o una planta elimina la posibilidad de que los cam bios irreversibles en el DNA sean la causa principal de la diferencia ción de las células eucariotas superiores (a pesar de que éstos constituyen una parte esencial del proceso de diferenciación de los linfocitos -descrito en el Ca-
gen silencioso tip o a
----------------- 1
locus M A T
I----------------- 1
gen silencioso tipo a
I----------------- 1
se inserta la cassette a nueva
se inserta una cassette a nueva 472
Capítulo 9 : El control de la expresión génica
Figura 9-59 Modelo de las cassettes para la alternancia de tipo de apaream iento en la levadura. El cambio de cassettes se da por un proceso de conversión génica que se dispara cuando la nucleasa realiza un corte de doble cadena en una secuencia específica del DNA en el locus MAT. A continuación se elimina el DNA cerca del corte y se substituye por una copia de la cassette silenciosa del tipo de apareamiento opuesto.
pítulo 23). Aunque, en principio, los cambios reversibles de secuencias de DNA, similares a los descritos en los casos de Salmonella y de las levaduras, pueden ser responsables de algunos de los cambios hereditarios de expresión génica que se observan en los organismos eucariotas superiores, actualmente no dispone mos de ninguna evidencia que demuestre su existencia. Sin embargo, existen otros mecanismos, como los que ya se han descrito en este capítulo, que son capaces de producir un patrón de expresión génica here ditario que presente una serie de estados discretos estables. En las células euca riotas no se comprende completamente ninguno de estos mecanismos, pero los estudios sobre el bacteriófago lambda han aportado mucha información a nivel molecular, de un interruptor genético que puede alternar, “flip-flop", entre dos estados estables, lo que podría ser un modelo de interruptor que también actua ra en el desarrollo de los eucariotas superiores. Previamente hemos descrito que este virus bacteriano puede permanecer integrado en el DNA de una célula de E. coli en condiciones favorables, de forma que se replica automáticamente cada vez que la bacteria se divide, en lugar de multiplicarse en el citoplasma y matar a su huésped. El cambio entre estos dos estados viene mediado por dos proteínas codificadas por el genoma vírico. El genoma consta de unos 50 genes que en los dos estados se transcriben siguiendo patrones muy diferentes. Por ejemplo, en un virus que se ha de integrar se pro ducirá la proteína integrasa, necesaria para insertar el DNA del virus en el geno ma de la bacteria y al mismo tiempo se han de reprimir la producción de las pro teínas víricas implicadas en la replicación del virus. Una vez se ha escogido entre uno de los dos patrones de expresión, éste se m antiene estable. No podemos aquí detenernos en los detalles de este complejo sistema regu lador de la expresión génica, pero destacaremos algunas de sus características generales. En el corazón del sistema se encuentran dos proteínas reguladoras de genes sintetizadas por el virus: la proteína represora lam bda (proteína el), des crita anteriormente, y la proteína ero. Estas proteínas bloquean cada una de ellas la síntesis de la otra, organización que permite únicamente dos estados po sibles. En el estado 1 (el estado de profago ) el represor lambda ocupa el opera dor, bloqueando la síntesis de represor y tam bién activando su propia síntesis. En el estado 2 (el estado Utico) la proteína ero ocupa un lugar diferente en el ope rador, bloqueando la síntesis del represor y activando su propia síntesis (Figura 9-60). En el estado de profago la mayor parte del DNA del virus integrado de for ma estable no se transcribe; en el estado lítico este DNA se transcribe extensa mente, se replica, se empaqueta en nuevos bacteriófagos, y se libera cuando se lisa la célula huésped. Cuando la bacteria huésped va creciendo bien, el virus tiende a adoptar el estado 1, permitiendo que el DNA del virus se vaya multiplicando rápidamente, conjuntam ente con el cromosoma huésped. Cuando se daña la célula huésped, un virus integrado se transforma del estado 1 al estado 2, se multiplica en el cito plasma de la célula y se escapa rápidamente de ella. Esta conversión está induci da por proteínas reguladoras bacterianas que inactivan la proteína represora. Sin embargo, en ausencia de tales interferencias el represor de lambda bloquea tanto la producción de la proteína ero como activa su propia síntesis, y este bu cle de retroalimentación positiva es el que ayuda a mantener el estado de profa-
estado estable 1: estado de profago se sintetiza la proteína represora de lambda
estado estable 2: estado lítico se sintetiza la proteína ero
11 \ ACTIVO operador INACTIVO ^ ¡U H H H B R N A
\
represor de lambda
INACTIVO
a
operador RNA
i ACTIVO
\
proteína Q _ @ ero W
Mecanismos genéticos que originan tipos celulares especializados
Figura 9-60 Versión simplificada del sistema regulador de tipo interruptor, que determina el estilo de crecimiento del bacteriófago lambda en la célula huésped E. coli. En el estado estable 1 (estado de profago) el bacteriófago sintetiza la proteína represora en grandes cantidades, que activa su propia síntesis e inactiva la síntesis de varias proteínas del fago, entre las que se cuenta la proteína ero. En el estado estable 2 (estado lítico) el bacteriófago sintetiza la proteína ero en grandes cantidades, la cual inactiva la síntesis del represor, de forma que se sintetizan muchas proteínas víricas y comienza la replicación libre del DNA del virus en la célula de E. coli, produciendo finalmente numerosas partículas víricas y matando la célula. Este ejemplo muestra cómo dos proteínas reguladoras pueden combinarse en un circuito produciendo dos estados estables. Como se muestra en la Figura 9-11, tanto el represor lambda como la proteína ero reconocen el operador mediante un motivo hélice-giro-hélice.
473
el efecto de la señal puntual es recordado por todas las células descendientes
Figura 9-61 Diagrama esquemático que m uestra cóm o un bucle de retroalim entación positiva puede generar m em oria celular. La proteína A es una proteína reguladora que activa su propia transcripción. Todos los descendientes de la célula original recordarán que la célula progenitora recibió la señal que inició la producción de la proteína.
una señal puntual activa la expresión la proteína A de la proteina A no se sintetiza ya que norm alm ente es necesaria para su propia transcripción
go estable. Los bucles de retroalimentación positiva son un rasgo característico de muchos circuitos de memoria celular (Figura 9-61). Un principio general importante que se deriva del caso del bacteriófago lambda es que se puede conseguir un sofisticado patrón de comportamiento con un escaso número de proteínas reguladoras de genes que afectan recíprocam en te su síntesis y su actividad. Sabemos que las células eucariotas utilizan variacio nes de esta sencilla estrategia para establecer y mantener patrones de expresión génica hereditarios. Por ejemplo, algunas proteínas reguladoras implicadas en el establecim iento del plan de desarrollo de Drosophila (descrito en el Capítulo 21), estimulan su propia transcripción, de modo que se crea un bucle de retroali mentación positiva que estimula su síntesis continuada; al mismo tiempo estas proteínas reprimen la transcripción de los genes que codifican otras proteínas reguladoras importantes.
La expresión de una proteína reguladora crítica puede disparar la expresión de una batería de genes situados por debajo (en dirección 3’)45 En general se trata de una com binación de proteínas reguladoras, más que de una proteína única, la que determina dónde y cuándo se ha de transcribir un gen eucariota. Pero aunque el control sea combinatorio, una única proteína puede ser decisiva para cam biar una célula de una vía de desarrollo o estado de dife renciación a otro. Un ejemplo notable procede de los estudios de diferenciación de una fibra muscular in vitro. Una fibra muscular esquelética de mamífero típica es extremadamente lar ga y contiene m uchos núcleos. Se forma por fusión de muchas células precurso ras denominadas mioblastos. La fibra muscular madura se diferencia de otras células por un gran número de proteínas características, que incluyen tipos es pecíficos de actina, miosina, tropomiosina y troponina (todas ellas forman parte del sistema contráctil), creatina fosfoquinasa (propia del metabolismo típico de las células musculares), y receptores de acetilcolina (que hacen a la membrana sensible a la estimulación nerviosa). En mioblastos proliferantes estas proteínas específicas de músculo y sus mRNA están ausentes o se encuentran presentes en baja concentración. Cuando los mioblastos empiezan a fusionarse unos con otros, todos estos genes se activan en un proceso coordinado que es parte de la transformación general que presenta su patrón de expresión génica. Todo este programa de diferenciación del músculo puede desencadenarse en fibroblastos de la piel en cultivo y en algunos otros tipos celulares introdu-
474
Capítulo 9 : El control de la expresión génica
F ig u ra9-62 Efecto de la expresión de la proteína MyoD en fibroblastos. Como se muestra en la micrografía de inmunofluorescencia, los fibroblastos de la piel se han convertido en células musculares por efecto de la expresión inducida experimentalmente del gen myoD. Los fibroblastos crecieron en cultivo, y fueron transfectados tres días antes de la observación con un 20 pm plásmido recombinante que contiene la secuencia codificante de myoD. Aunque sólo un porcentaje pequeño de los fibroblastos incorpora el DNA y produce la proteína MyoD, estas células se fusionan formando miotúbulos alargados, que se muestran teñidos con anticuerpos que detectan una proteína específica del músculo. Las células teñidas están mezcladas con una capa confluente de fibroblastos, cuyos núcleos se pueden apreciar en la imagen. Cultivos control transfectados con otro plásmido no contienen células musculares.
ciendo cualquier gen que codifica uno de los miembros de una familia de proteí nas hélice-bucle-hélice -las denominadas proteínas miogénicas (por ejemplo MyoD, Myf5 o m iogenina)- que normalmente se expresan únicamente en fibras musculares (Figura 9-62). En el DNA adyacente a muchos genes específicos de músculo se pueden detectar secuencias de unión a estas proteínas. A partir de estudios con ratones transgénicos parece que el modo de acción de MyoD y Myf5 implica la activación de miogenina: si se elimina el gen de miogenina por inserción genómica dirigida, las células musculares no pueden diferenciarse. Es probable que tanto los fibroblastos como otros tipos celulares que se convierten en fibras musculares por las proteínas miogénicas hayan acumulado una serie de proteínas reguladoras que pueden cooperar con las proteínas m io génicas activando los genes específicos del músculo. Desde este punto de vista sería una combinación de proteínas reguladoras, más que una simple proteína, la que determinaría la diferenciación celular. Esta idea es consistente con el h e cho de que algunos tipos celulares no se convierten en fibras musculares por ac ción de miogenina o proteínas relacionadas; dichas células, probablemente no habrían acumulado las otras proteínas reguladoras necesarias. A continuación veremos cómo el control combinatorio tiene implicaciones importantes tanto para la evolución como para el desarrollo de los organismos pluricelulares.
El control génico combinatorio es la norma en los eucariotas46 Ya hem os discutido cómo pueden actuar de modo combinado múltiples proteí nas reguladoras controlando la expresión de un determinado gen. Sin embargo,
Figura 9 -6 3 La im portancia p ara el desarrollo del control com binatorio.
célula em brionaria
IZQUIERDA
DERECHA
V©/ célula B
célula A
INDUCCIÓN DE LAS PROTEÍNAS REGULADORAS ( 4 ) A © @ ; . © © ' © ©
célula G
....A
A
célula H
célula I
Y ( 5)
...
A
@ ®
célula J
célula K
célula L
célula M
Mecanismos genéticos que originan tipos celulares especializados
Este esquema muestra cómo las combinaciones de unas cuantas proteínas reguladoras pueden generar muchos tipos celulares diferentes durante el desarrollo. En este esquema simple la decisión de sintetizar una de un par de proteínas reguladoras (representadas por círculos numerados) se toma después de cada división celular. Siendo conscientes de su posición en el embrión, la célula hija situada hacia la izquierda del embrión siempre escoge sintetizar la proteína par, mientras que la situada hacia la derecha en el embrión sintetizarán la impar. Se asume que la producción de cada proteína reguladora es autoperpetuante (contribuyendo así a la memoria celular). Así pues, las células en un clon en crecimiento contendrían un número creciente de proteínas reguladoras. Es de destacar que en este ejemplo, puramente hipotético, se han generado ocho tipos celulares (G a N) con cinco proteínas reguladoras diferentes. Si se continúa el esquema, se pueden llegar a especificar 10 000 tipos celulares con sólo 25 proteínas reguladoras diferentes.
célula N
475
com o demuestra el ejemplo de las proteínas miogénicas, el control com binato rio significa aún más: no sólo cada uno de los genes está regulado por la acción de numerosas proteínas reguladoras, sino que cada proteína reguladora partici pa en el control de muchos genes. Además, aunque algunas proteínas regulado ras com o MyoD o miogenina son específicas de un único tipo celular, es más frecuente que una proteína reguladora determinada esté activa en una variedad de tipos celulares, en diferentes partes del cuerpo y en distintos momentos del desarrollo. En la Figura 9-63 se ilustra esquem áticam ente cómo el control génico combinatorio hace posible generar una gran cantidad de complejidad biológica con un número relativamente reducido de proteínas reguladoras. El control combinatorio permite que una proteína reguladora dada no tenga necesariam ente una función única y claramente definida, como por ejemplo la de activación de un grupo determinado de genes o la de determinación de un cierto tipo celular. En lugar de ello, puede tener diferentes funciones que se sola pan con las de las otras proteínas reguladoras. Estas proteínas se podrían com parar con las palabras de un idioma: se utilizan con diferentes sentidos en una variedad de contextos y raramente se utilizan aisladas; una combinación ade cuada es la que contiene la información necesaria para especificar un proceso de regulación génica. Una consecuencia del control génico com binatorio es que el efecto de aña dir una nueva proteína reguladora a una célula dependerá de la historia anterior de la célula, pues esta historia determina qué proteínas reguladoras se encuen tran ya presentes en la célula. Así durante el desarrollo una célula puede acumu lar una serie de proteínas reguladoras que pueden no alterar la expresión génica. Cuando se expresa el último miembro de la com binación requerida de proteínas reguladoras, se completa el m ensaje regulador, provocando grandes cambios en el patrón de expresión génica. Este modelo, como ya hemos visto, puede expli car el fenóm eno de transformación dramático de un fibroblasto en una fibra muscular por la adición de una única proteína reguladora. Asimismo podría ju s tificar la diferencia, descrita en el Capítulo 21, entre los procesos de determina ción celular, por los cuales una célula queda determinada a seguir una cierta ruta de diferenciación y un destino, y el proceso de diferenciación celular por el cual una célula determinada expresa su carácter especializado. Un rasgo esen cial de estas ideas es que, una vez que se empieza a expresar una proteína regu ladora, puede actuar manteniendo su propia expresión, contribuyendo de este modo a la memoria celular como se discutirá de nuevo más adelante. El control génico combinatorio tiene otra importante consecuencia para la evolución. Dado que las proteínas reguladoras no son exclusivas de un circuito de regulación o de un gen diana particular, cambio sutiles en ellas pueden pro ducir cam bios substanciales en el comportamiento de las células.
Se hereda un cromosoma X inactivo47 Hemos visto anteriormente que las proteínas reguladoras pueden producir pa trones de expresión génica heredables tanto en células eucariotas como proca riotas. En la Figura 9-61 se ilustra un posible mecanismo, basado en un bucle de retroalimentación positiva en el control de la expresión de un gen. Exclusiva mente en eucariotas existe un mecanismo adicional, que permite que se herede el patrón de organización de la cromatina. Posiblemente el ejemplo más dramá tico al respecto sea la inactivación de uno de los dos cromosomas X en las célu las de las hembras de mamífero. Los cromosomas X e Y son los cromosomas sexuales de los mamíferos: todas las células femeninas contienen dos cromosomas X, mientras que las masculi nas contienen un cromosoma X y un cromosoma Y. Probablemente debido a que una dosis doble de los productos del cromosoma X podría resultar letal, las células femeninas han desarrollado un m ecanismo para mantener inactivado perm anentem ente en cada célula uno de los dos cromosomas X. En el ratón esto ocurre entre el tercero y el sexto días de desarrollo, cuando, en cada célula uno
476
Capítulo 9 : El control de la expresión génica
célula de un em brión tem prano X „.
en este clon sólo es activo el crom osom a X m
Xm
Figura 9-64 Inactivación del X. Herencia clonal de un cromosoma X condensado e inactivo, que tiene lugar en las hembras de los mamíferos.
en este clon sólo es activo el crom osom a Xp
de los dos cromosomas X, al azar, se condensa en forma de heterocromatina. Este cromosoma se puede ver al microscopio óptico durante la interfase como una estructura diferente conocida como corpúsculo de Barr, localizado cerca de la membrana nuclear, y se replica al final de la fase S. La mayor parte de su DNA no se transcribe. Este cromosoma X inactivo se hereda fielmente, por lo que cada hembra es un mosaico compuesto de grupos clónales de células en los que sólo es activo el cromosoma X heredado del padre (Xp) y otro número aproxima damente igual de grupos de células en las que únicamente es activo el cromoso ma X heredado de la madre ( X J . En general, en el animal adulto tanto las células que expresan Xp como las que expresan X,,, se distribuyen en pequeños grupos, lo cual refleja la tendencia de las células hijas de permanecer cerca unas de las otras durante las últimas etapas del desarrollo embrionario y del crecimiento (Figura 9-64). El proceso de condensación que forma la cromatina condensada (hetero cromatina) en un cromosoma X tiene la tendencia a producirse de forma conti nua a lo largo del cromosoma. Ello se ha demostrado mediante estudios utili zando animales imitantes en los que uno de los cromosomas X se ha unido a una porción de un autosoma (un cromosoma no sexual). En estos cromosomas híbridos a menudo sucede que algunas regiones del autosoma que son adyacen tes al cromosoma X inactivado se encuentran condensadas en heterocromatina de forma que los genes que contienen se encuentran inactivados de una manera hereditaria. Esto sugiere que la inactivación del cromosoma X se produce m e diante un proceso cooperativo, que puede imaginarse como una especie de “cristalización” de la cromatina que se extiende desde un lugar de nucleación si tuado en el cromosoma X De hecho, se ha localizado genéticamente un único
Mecanismos genéticos que originan tipos celulares especializados
477
1 2 3 4 5
1 2 3 4 5 lím ite
I I I I ] I
1 2 3 4 5
...l....... ........ ....... ......... .......
I
I
pronto en el em brión en desarrollo, se form a la heterocrom atina y se extiende sobre la eucrom atina vecina hasta distancias diferentes en diferentes células 1 2 3 4 5
1 2 3 4 5
2 3 4 5
' "í I I "
proliferación de la célula heterocrom atina eucrom atina clon de células con el gen 1 inactivo (A)
clon de células con los genes 1, 2 y 3 inactivos
(B)
centro de inactivación en el crom osom a X: fragmentos rotos de cromosoma X no sufren inactivación a menos que incluyan dicho centro. Una vez se ha establecido la estructura condensada de la cromatina, un pro ceso desconocido hace que la estructura sea heredada de esta forma durante to das las sucesivas replicaciones del DNA. Sin embargo este cambio no es absolu tam ente permanente ya que el crom osom a X inactivado se reactiva en el proceso de formación de las células germinales en la hembra.
Los genes de Drosophila y de levadura también pueden inactivarse por características hereditarias de su estructura cromatínica48 Hemos descrito dos ejemplos de efectos de posición sobre la expresión génica -u n o en Drosophila y otro en levadura- que se parecen en diferentes aspectos a la inactivación del crom osom a X (véase Figura 9-51). En ambos casos, una forma específicam ente condensada de crom atina impide la expresión de algunos ge nes, y en am bos casos el estado de condensación de la cromatina es hereditario. En las moscas que presentan reordenaciones cromosómicas, fenómenos de separación y reagrupamiento que sitúan la mitad de una región de heterocro matina cerca de una región de eucromatina tienden a inactivar los genes eucromatínicos cercanos. La situación es análoga a la fusión de un autosoma de m a mífero con un crom osom a X inactivado, tal como se acaba de describir; los fenómenos de inactivación son muy similares a éstos: la zona de inactivación se expande desde el punto de separación del crom osoma hasta cubrir uno o más genes. Además, mientras que el grado del efecto de expansión es diferente en di ferentes células, la zona inactivada establecida en una célula embrionaria se he reda de una manera estable por toda la progenie celular (Figura 9-65). El ejem plo de efecto de posición que se describe en la Figura 9-51 también comparte algunos rasgos con la inactivación del crom osom a X, como son el efecto de ex pansión y la heredabilidad del estado de condensación de la cromatina. Aún no ha sido probado que la inactivación del cromosoma X y los efectos de posición observados en m oscas tengan un m ecanismo común, pero el para lelismo entre ellos es notable. La identificación y clonaje recientemente de algu nos genes de Drosophila y de levadura necesarios para el efecto de posición per mitirá descubrir, probablemente, los mecanismos moleculares implicados en estos fenómenos. En la Figura 9-66 se muestra un esquema hipotético de cómo podría explicarse el efecto de expansión y la naturaleza hereditaria del estado de condensación de la cromatina. Independientemente de su base molecular, el empaquetamiento de deter minadas regiones del genoma formando cromatina condensada es un tipo de mecanismo regulador que no se presenta en las bacterias. El fenómeno crucial de esta forma de regulación génica exclusiva de los eucariotas es el almacén de
478
clon de células sin ningún gen inactivo
Capítulo 9 : El control de la expresión génica
Figura 9-65 Fenóm eno de variegación por efecto de posición en D r o so p h ila . (A) Normalmente, la heterocromatina (rojo) no ocupa las regiones adyacentes de eucromatina [verde] debido a la existencia de límites especiales de secuencias, de naturaleza desconocida. Sin embargo, en algunas moscas que heredan ciertas translocaciones cromosóm icas, este límite no está presente. (B) Durante las primeras fases del desarrollo de estas moscas, la heterocromatina se extiende sobre el DNA cromosóm ico vecino, alcanzando diferentes distancias en células diferentes. Pronto, esta expansión se detiene, pero el patrón establecido de heterocromatina se hereda, de tal modo que se producen grandes clones de células descendientes que presentan los mismos genes vecinos condensados en forma de heterocromatina, y por lo tanto, inactivos (de aquí la apariencia “variegada” de algunas de estas moscas; véase Figura 9-51B). Este fenómeno se asem eja en muchos aspectos a la inactivación del cromosom a X que se produce en los mamíferos.
gen activo
gen inactivo
Ae
REPLICACION DEL DNA
REPLICACION DEL DNA
se agregan mas proteínas m ediante una unión cooperativa
LOS DOS GENES HIJOS SON INACTIVOS
' y o proteína libre
no se unen proteínas
LOS DOS GENES HIJOS SON ACTIVOS
una memoria estable de estados génicos en una estructura cromatínica heredi taria, en lugar de tratarse de un mecanismo de retroalimentación estable de ge nes autorreguladores de proteínas reguladoras que pueden difundir de un lado a otro del núcleo. Se desconoce si los m ecanismos de este tipo actúan sólo en grandes regiones inactivas de los cromosomas o si también pueden hacerlo a n i vel de uno o de unos cuantos genes.
Cuando las células de vertebrados se dividen, pueden heredar el patrón de metilación del DNA49 Los nucleótidos del DNA pueden ser modificados de forma covalente, y en verte brados la metilación de citosina parece constituir un mecanism o importante para distinguir genes activos de los que no lo son. La molécula de 5-metilcitosina (5-metil C), tiene la misma relación con la citosina que la timidina con el uracilo, y de m anera similar no afecta al apareamiento de bases (Figura 9-67). La metila ción en el DNA de vertebrados está restringida a los nucleótidos citosina (C) en la secuencia CG, que está apareada exactamente con la misma secuencia (en di rección opuesta) de la otra hebra de la hélice del DNA. Consecuentemente, un sencillo mecanism o permite que un patrón preexistente de m etilación del DNA se herede directamente por las moléculas de DNA hijas. Una enzima llamada metilasa de mantenimiento actúa preferentemente sobre las secuencias CG apa readas previamente con una secuencia CG metilada. A consecuencia de ello, el patrón preexistente de metilación de la cadena parental de DNA actúa como un molde para la metilación de las cadenas de DNA hijas, haciendo que el patrón sea heredado directamente a través de la replicación del DNA (Figura 9-68). Las bacterias producen enzimas que han sido muy útiles para el estudio de la metilación en las células de vertebrados. Utilizan la metilación en A o en C en una secuencia específica a fin de protegerse de la acción de sus propias nucleasas de restricción. Por ejemplo, la nucleasa de restricción Hpall, corta la secuen cia CCGG siempre y cuando la C central no esté metilada. Así la susceptibilidad de una molécula de DNA a ser cortada por la Hpall puede utilizarse para detec tar si determinados puntos del DNA están mediados o no. La heredabilidad de los patrones de metilación en vertebrados se puede estudiar en células en culti vo utilizando en primer lugar enzimas metiladoras bacterianas para introducir grupos metilo en las citosinas, y después utilizando nucleasas de restricción para seguir la heredabilidad de dichos grupos. La enzima utilizada normalmente para introducir bases 5-metil C en secuencias determinadas CG es la enzima Hpall metilasa, que normalmente protege a la bacteria contra su propia nuclea-
Figura 9 -6 6 Esquema general que perm ite la herencia directa de estados de expresión de genes durante la replicación del DNA. En este modelo
hipotético, porciones de un grupo de proteínas reguladoras de la expresión gènica, que se unen entre sí de forma cooperativa, se transfieren directamente desde la hélice paterna de DNA (arriba a la izquierda) a ambas hélices hijas. Entonces, el grupo de proteínas heredado de cada una de las hélices hijas provoca que se unan a él otras copias de la misma proteína reguladora. Como la unión es cooperativa, el DNA sintetizado a partir de una hélice paterna de DNA idéntica a la anterior, pero que no presenta las proteínas unidas (arriba a la derecha), permanecerá libre de ellas. Si estas proteínas unidas inactivan la transcripción de un determinado gen, el estado inactivo del gen se heredará directamente, como en el ejemplo. Si la unión cooperativa de las proteínas requiere secuencias específicas de DNA, estos fenómenos estarán limitados a regiones de control gènico específicas; sin embargo, si la unión se puede propagar a todo lo largo del cromosoma, podría explicar el efecto de expansión asociado con los estados heredables de la cromatina que se discute en el texto.
citosina
5-m etilcitosina
Figura 9-67 Form ación de 5-m etilcitosina por metilación de una citosina en la doble hélice del DNA. En los vertebrados este fenómeno está
restringido a citosinas (C) escogidas que forman parte de la secuencia CG.
Mecanismos genéticos que originan tipos celulares especializados
479
CH3
I
m etilación 3'
T G C A T A G C A
5'
5' 3'
A C G T A T C G T
T G C A T A G C A
3' 5'
!
no reconocido por una enzima m etilante de m antenim iento 5' 3'
reconocido por una enzima m etilante de m antenim iento
A C G T A T C G T T G C A T A G C A
3' 5.
sa de restricción. Si se utiliza esta enzima para metilar la C central de la secuen cia CCGG de una molécula clonada de DNA que luego se introduce en una célu la de vertebrado, se puede demostrar que el patrón de metilación se mantiene como hemos descrito: cada secuencia individual mediada CG se mantiene a lo largo de muchas divisiones, mientras que las secuencias CG no metiladas per m anecen sin metilar. La existencia de la metilasa de m antenimiento explica la herencia automáti ca de nucleótidos 5-metil C, pero dado que normalmente no metila DNA no m e diado previamente, no puede explicar cómo se añadió el primer grupo metilo a un organismo vertebrado. Si se inyecta DNA completamente carente de metila ción a un huevo de ratón fertilizado, se añadirán grupos metilo a casi cada se cuencia CG (con una importante excepción que se discutirá más adelante). Se cree que este efecto es debido a otra actividad metilasa de establecimiento pre sente en el huevo. Como se verá, la metilación de novo también ocurre durante los procesos de diferenciación de células especializadas, aunque se desconoce cómo se realiza.
En las células de los vertebrados la metilación del DNA refuerza las decisiones del desarrollo50 Aunque en un principio se propuso que la metilación del DNA podría jugar un papel dominante en la generación de los diferentes tipos celulares de mamífe ros, actualmente se le reconoce un papel más sutil. En algunos invertebrados, incluyendo a Drosophila, el DNA no está metilado y sin embargo el proceso de diversificación de los diferentes tipos celulares parece ser similar entre Droso phila y los vertebrados. Algunas observaciones apoyan la idea de que la metila ción del DNA en vertebrados está relacionada con la inactivación génica, pero que sólo es un mecanism o de refuerzo de una decisión adoptada previamente por otro m ecanismo. Así pues experimentos con la enzima Hpall demuestran que en general el DNA de los genes inactivos está más fuertemente metilado que el de los genes activos. Sin embargo, cuando un gen que estaba inactivo se activa durante el desarrollo pierde parte de su metilación únicamente después de ha ber sido activado. De manera similar, el crom osom a X femenino descrito ante riormente, primero se condensa e inactiva, y sólo posteriormente incrementa el nivel de metilación de sus genes. Entonces, ¿qué hace la metilación? Y, ¿cuál es su utilidad para el organismo? Tenemos al menos dos indicios importantes al respecto. Primero, se puede pre parar el DNA correspondiente a un gen de actina específico de músculo en dos formas, una completamente metilada y otra sin metilar. Cuando estas dos versio nes del gen se introducen en células musculares en cultivo, ambas se transcriben
Capítulo 9 : El control de la expresión génica
ch3
I
CH'
480
ch3
m etilación
A C G T A T C G T 5' _
3'
■ s ■ - — 3' HHHHHHIHÜSHHI5'
T G C A T A G C A
CH3
Figura 9 -68 De qué form a se pueden heredar con precisión los patrones de metilación del DNA. En los DNA de vertebrados, una gran cantidad de las bases de citosina de la secuencia CG están metiladas (véase Figura 9-67). Dada la existencia de una enzima metilante dirigida por grupos metilo (la metilasa de m antenimiento), una vez se ha establecido un determinado patrón de m etilación del DNA, cada punto de metilación se hereda en el DNA descendiente, tal como se muestra en esta figura. Esto implica que los cambios en los patrones de m etilación del DNA se pueden perpetuar en toda la progenie de una célula.
proteínas
factores generales
GEN ACTIVO
GEN INACTIVO PERO "EN GOTEO"
Figura 9-69 De qué forma la metilación del DNA puede ayudar a inactivar genes. La unión de las proteínas reguladoras y de los factores generales de transcripción cerca de un promotor activo impide la metilación del DNA por un mecanismo desconocido. Si la mayoría de estas proteínas de unión al DNA específicas de secuencia se disocian, como ocurre cuando el gen se inactiva, la secuencia de DNA puede metilarse, lo que impedirá que se unan otras proteínas e inactivará completamente el gen.
GEN COMPLETAMENTE INACTIVO
a la misma elevada velocidad. Sin embargo, cuando se introducen en fibroblas tos, que normalmente no transcriben el gen, el gen no metilado es transcrito a ni vel bajo pero mucho más alto que el del gen exógeno metilado o que el del gen endógeno del fibroblasto (que también está metilado), que no se transcriben en absoluto. Segundo, a partir de experimentos bioquímicos se ha podido identificar en vertebrados una proteína que se une fuertemente al DNA y que contiene nucleótidos 5-metil C agrupados. Se cree que la unión de esta proteína empaqueta el DNA metilado de tal forma que lo hace especialmente resistente a la activación por la maquinaria de transcripción . Estos experimentos sugieren que la metila ción del DNA se utiliza en vertebrados fundamentalmente para asegurar que cuando un gen se inactiva quede completamente inactivado (Figura 9-69). Los experimentos realizados para comprobar si una secuencia de DNA que se transcribe con gran frecuencia en un tipo celular determinado de vertebrado lo hace o no en otro tipo celular han demostrado diferencias de velocidad de transcripción entre dos tipos celulares del orden de más de 106 veces. Genes inac tivos de vertebrados se transcriben mucho m enos que genes inactivos de bacte rias, en los que las mayores diferencias conocidas en cuanto a la velocidad de transcripción entre genes expresados y no expresados son de aproximadamente 1000 veces. La metilación del DNA podría ser la responsable de al menos una parte de esta diferencia. Además, com o se verá más adelante, la metilación del DNA es necesaria para al m enos un tipo de memoria celular.
La actividad genómica heredable requiere la metilación del DNA51 La células de mamíferos son diploides, conteniendo un grupo de genes heredado del padre y otro de la madre. Se han encontrado pocos casos en los que la expre sión de un gen dependa de si se ha heredado del padre o de la madre. Este fenó meno se ha denominado actividad genómica heredable o mareaje del genoma (genomic imprinting). Aunque no fue descubierto de ese modo, se han observado ejemplos notables en experimentos con ratones transgénicos. Por ejemplo, es po sible obtener ratones transgénicos en los que una de las dos copias normales del gen que codifica el factor de crecimiento similar a la insulina-2 (IGF-2, de Insulinlike Growth Factor-2”) se ha inactivado por mutación. Este ratón, heterocigoto, se
Mecanismos genéticos que originan tipos celulares especializados
481
desarrolla normalmente si el gen defectivo Igf-2 procede de la madre, pero pre sentan graves anomalías, creciendo solamente la mitad de lo que es normal, si el gen defectivo Igf-2 procede del padre. La explicación se obtuvo del análisis poste rior de estos ratones transgénicos y de ratones normales. Tanto en los ratones normales como en los transgénicos sólo se transcribe la copia del gen Igf-2 pater no, mientras que el gen obtenido de la madre es silencioso: se dice en este caso que el gen obtenido de la madre ha sido marcado fimprintedj. Aunque los mecanismos de mareaje del genoma no están claros, es muy pro bable que participe la metilación del DNA. Así, en ratones transgénicos defectivos en la metilasa de mantenimiento, el mareaje del gen Igf-2 materno no se produce lo que nos indica que el mecanismo que permite diferenciar las copias materna y paterna del gen Igf-2 implica la metilación del DNA. También es muy interesante el hecho de que los ratones que carecen de metilasa de mantenimiento mueran en el estado de embriones tempranos. Esto podría ser la consecuencia de un mareaje del genoma defectuoso, pero también se podría argüir que el fallo primario fuese la imposibilidad de reforzar las decisiones del desarrollo por metilación del DNA, lo que conduciría a que los miles de genes inactivos que existen en una célula de vertebrados mantuvieran una velocidad de transcripción mínima.
En los mamíferos, las islas ricas en CG están asociadas con alrededor de 40 000 genes52 Debido al funcionamiento de la vía de reparación de DNA, los residuos C media dos en el genoma tienden a ser eliminados en el curso de la evolución. La des anim ación accidental de una C no metilada da lugar a U, base que habitualmen te no está presente en el DNA, por lo que es reconocida fácilmente por la enzima de reparación de DNA, la uracilo DNA glucosilasa, eliminada y luego reemplaza da por una C (se describe en el Capítulo 6). Pero la desaminación accidental de una 5-m etil C no puede ser reparada de este modo, porque el producto de la desam inación es una T que, por lo tanto, no se puede diferenciar de los otros re siduos T no m utantes del DNA. Aunque existe un sistema especial de reparación para eliminar estos mutantes T (véase pág. 267), muchas de estas desanimacio nes no son detectadas, por lo que los residuos C del genoma que están mediados tienden a mutar a T durante la evolución. A lo largo de la evolución más de tres de cada cuatro CG se han perdido por este sistema, dejando a los vertebrados con una deficiencia notable en este dinucleótido. Las secuencias CG que todavía existen están distribuidas de una for ma desigual por el genoma; en determinadas regiones, de 1000 a 2000 pares de bases de longitud, las secuencias CG están presentes a densidades de entre 10 y 20 veces su densidad media en todo el genoma; estas zonas reciben el nombre de islas CG. Estas islas, con algunas notables excepciones, parecen mantenerse no mediadas en todos los tipos celulares. Se ha observado que rodean los pro motores de los llamados genes de mantenimiento (housekeeping genes) -genes
isla CG
¡ntrones
gen de la dihidrofolato reductasa
RNA
DNA
■►3'
gen de la hipoxantina fosforribosil transferasa
DNA
X
RNA
3'
3:342-347, 1987.)
gen de proteína ribosom al
& LJ
1
11
~
^RNA_^ ^
10 000 pares de nucleótidos
482
Figura 9 -70 Las islas CG que rodean a los prom otores en tres genes constitutivos de mam íferos. Los recuadros a m a rillo s muestran la longitud de cada isla. Obsérvese tam bién que, com o ocurre con la mayoría de los genes de mamífero, los exones (rojo oscu ro) son cortos en relación con los intrones (rojo claro). (Adaptado de A.P. Bird, Trends Genet.
Capítulo 9 : El control de la expresión gènica
DNA
DNA DE UN ANCESTRO DE LOS INVERTEBRADOS M ili! i ; :11! 1 ! I lil'liif llll 1:1111=I lllit ¡lilljilll'll ll! I flilP liliÍÍÍÍ!jll
I í i Ti
¡ i !flmnuTllt! 98íHSBUllt ii Htsm iIBi8U8iJílljni|PI|:: u I! L i ü i ._..... AL.....— l.ií_
Figura 9-71 Un m ecanism o que explica tanto las m arcadas deficiencias de secuencia CG com o la presencia de islas CG en los genomas de los vertebrados. Las líneas negras
marcan la localización de un dinucleótido CG no metilado en la secuencia de DNA, mientras que las líneas rojas marcan la localización de un dinucleótido CG metilado.
5'
1000 pares de nucleótidos
isla CG
que codifican el elevado número de proteínas que son esenciales para la viabilidad celular y que, por lo tanto, se expresan en muchas células (Figura 9-70). Además, muchos de los genes específicos de tejidos, que codifican proteínas necesarias sólo en determinados tipos de células, también están asociados con las islas CG. La distribución de las islas CG puede explicarse si se asume que la metilación CG fue adoptada en vertebrados como un mecanismo de evitar el inicio de la transcripción en los segmentos inactivos del genoma (Figura 9-71). En células de la línea germinal de vertebrados -e l linaje celular que da lugar a oocitos y a esperm atozoides- la mayor parte del genoma está inactivo y metilado. Durante largos períodos de tiempo de evolución, sus secuencias CG metiladas se han perdido por medio de fenómenos de desaminación accidental que no han sido reparados correctam ente. Sin embargo, las secuencias CG de las regiones que rodean los promotores de muchos genes, incluyendo sus genes de m anteni miento, se m antienen no metiladas en las células de la línea germinal, y por lo tanto pueden ser reparadas después de fenómenos de desaminación espontá nea. Estas regiones se han conservado como islas CG. El genoma de mamífero (aproximadamente 3 x 109 pares de nucleótidos) contiene un número estimado de 40 000 islas CG. La mayoría de las islas marcan los extremos 5’ de la unidad de transcripción y por lo tanto, probablemente del gen. Puesto que es posible clonar específicamente el DNA situado alrededor de las islas CG, esta técnica proporciona un buen método para encontrar nuevos genes.
Resumen La gran cantidad de tipos celulares de los animales y de las plantas se genera por medio de mecanismos que provocan que en diferentes células se transcriban dife rentes genes. Muchas células animales especializadas pueden mantener sus carac teres típicos cuando crecen en cultivo, por lo que los mecanismos reguladores de la expresión génica que están implicados en la generación de estos tipos celulares han de ser estables y heredables, dotando a la célula de una memoria de la historia de su desarrollo. Los procariotas y las levaduras proporcionan modelos de sistemas que son accesibles para estudiar los mecanismos de la regulación génica. Algunos de estos mecanismos pueden ser relevantes en la generación de tipos celulares espe cializados de los eucariotas superiores. Uno de estos mecanismos implica una interacción competitiva entre dos (o más) proteínas patrón de regulación génica, cada una de las cuales estimula su propia síntesis e inhibe la síntesis de la otra: esto crea un mecanismo de flip-flop que hace alternar a la célula entre dos patrones de expresión alternativos. Los bucles de retroalimentación positiva directa o indirecta, que permiten a las proteínas reguladoras mantener su propia síntesis, son un me canismo general de la memoria celular. En los eucariotas la transcripción está controlada generalmente por combina ciones de proteínas reguladoras. Se cree que cada tipo celular en un eucariota supe rior contiene una combinación especial de proteínas reguladoras que aseguran la Mecanismos genéticos que originan tipos celulares especializados
483
expresión de exclusivamente los genes apropiados para ese tipo de célula. Una pro teína reguladora se puede expresar en diferentes circunstancias y en general está implicada en el control de muchos genes. Además de las proteínas de regulación que difunden, en los eucariotas también se utilizan ciertos estados de compactación de la cromatina, heredables, para regu lar la expresión génica. En vertebrados también participa la metilación del DNA, especialmente para reforzar las decisiones sobre expresión de los genes que se han tomado previamente por otros mecanismos.
Controles post-transcripcionales Aunque las formas predominantes de regulación de la mayoría de los genes son los controles de la iniciación de la transcripción génica, otros controles pueden actuar posteriormente en la vía del RNA a la proteína modulando la cantidad de producto génico que se produce. Aunque estos c o n tro le s p o s t-tra n s c rip c io n a le s, que actúan después de que la RNA polimerasa se haya unido al promotor y haya iniciado la transcripción, son m enos frecuentes que los controles transcripcionales, son cruciales para muchos genes. Parece como si cada una de las etapas que pueda ser regulada en la expresión génica, será regulada en alguna circunstancia para algunos genes. Consideraremos las variantes de regulación post-transcripcional en un or den temporal, de acuerdo con la secuencia de procesos con los que se va encon trando una molécula de RNA desde que comienza la transcripción (Figura 9-72).
La atenuación de la transcripción causa una terminación temprana de algunas moléculas de RNA53 En bacterias la expresión de ciertos genes es inhibida por la terminación prema tura de la transcripción, en un fenómeno denominado a te n u a c ió n d e la tr a n s c rip c ió n . En algunos de estos casos la cadena de RNA naciente adopta una es tructura que provoca interacciones con la RNA polimerasa que abortan su transcripción. Cuando se requiere el producto génico, ciertas proteínas regula doras se unen a la cadena de RNA naciente e interfieren con la atenuación, per mitiendo de ese modo que se termine la transcripción. En los eucariotas la atenuación de la transcripción ocurre según una varie dad de mecanismos. Por ejemplo, tanto en adenovirus como en HIV (el virus causante del SIDA), las proteínas que se ensamblan en el promotor parecen po der determinar si la polimerasa puede pasar a través de ciertos lugares de ate nuación más adelante. Estas proteínas pueden diferir de una célula a otra, y la célula puede controlar el grado de atenuación para genes particulares.
La maduración alternativa del RNA puede producir diferentes formas de proteína a partir de un mismo gen54 Tal como se ha descrito en el Capítulo 8, muchos genes se transcriben en primer lugar en forma de precursores largos de mRNA que son recortados por una serie de etapas de procesamiento, al final de las cuales se obtiene la molécula madura de mRNA. Una de esas etapas es la maduración del RNA por corte y empalme (RNA splicing), en la que se eliminan las secuencias intrónicas del precursor del mRNA. Frecuentem ente una célula puede madurar un precursor de diferentes formas, de modo que se pueden obtener polipéptidos finales diferentes a partir de un mismo gen -según un proceso que se denomina m a d u ra c ió n a lte rn a tiv a d el RNA (Figura 9-73). Una proporción substancial de los genes de los eucariotas superiores produce múltiples proteínas de este modo. Cuando existen diferentes posibilidades de maduración en varias posiciones del transcrito, un único gen puede producir docenas de proteínas diferentes. Sin embargo, las alternativas en el proceso de maduración son frecuentem ente mucho más limitadas, y sólo
484
Capítulo 9 : El control de la expresión génica
INICIO DE LA TRANSCRIPCIÓN POSIBLE ATENUACIÓN MADURACIÓN Y CORTE DEL EXTREMO 3' EXPORTACIÓN DESDE EL NÚCLEO
la t r a n s c r i p c i ó n se d etiene
s e cu e n c ia s " de m R N A no funcionales r e te n c ió n en el n ú c l e o
LOCALIZACION ESPACIAL EN EL CITOPLASMA POSIBLE EDICIÓN DEL RNA INICIO DE LA TRADUCCIÓN POSIBLE RECODIFICACIÓN TRADUCCIONAL POSIBLE ESTABILIZACIÓN DEL RNA
tra d u c ció n b lo q u e a d a
‘ R N A degradado
CONTINUA LA SÍNTESIS DE PROTEÍNA Figura 9-7 2 Posibles controles posttranscripcionales de la expresión génica. Es probable que en un gen
determinado sólo se utilice alguno de estos controles.
exón opcional
Figura 9-73 Cuatro patrones de m aduración alternativa de RNA. En
exones m utuam ente excluyentes
punto de m aduración interno
cada caso madura un solo tipo de transcrito de RNA de dos formas alternativas, produciendo dos mRNA distintos (1 y 2). Los recuadros azul oscuro indican secuencias exónicas que se presentan en ambos mRNA. Los recuadros azul claro indican secuencias exónicas que sólo se presentan en uno de los mRNA; estos recuadros están unidos por líneas rojas para indicar dónde se eliminan las secuencias intrónicas (amarillas). (Adaptado con permiso de A. Andreadis, M. E. Gallego, y B. NadalGinard, Annu. Rev.CellBiol. 3:207-242, 1987. © 1987 Annual Reviews, Inc.)
se pueden obtener algunos tipos de proteínas a partir de cada unidad de trans cripción. En algunos casos la maduración alternativa del RNA ocurre porque existe una “ambigüedad de intrón”: el mecanismo estándar de espliceosoma que eli mina los intrones (descrito en el Capítulo 8) es incapaz de distinguir claramente entre dos o más apareamientos alternativos de puntos de maduración 5’ y 3’, de tal modo que en diferentes ocasiones se toman diferentes decisiones de forma fortuita. Cuando ocurre este fenómeno de maduración alternativa constitutiva, se producen varias versiones de proteína codificada por el gen en todas las célu las en las que éste se expresa. Sin embargo, en m uchos casos la maduración alternativa del RNA no es constitutiva sino que está regulada. En los casos más simples la maduración al ternativa permite pasar de sintetizar proteínas no funcionales a proteínas fun cionales. Por ejemplo, la transposasa que cataliza la transposición del elemento P de Drosophila se produce en una forma funcional en células germinales y en una forma no funcional en células somáticas de la mosca, permitiendo al ele mento P extenderse por el genoma de la m osca sin causar daños en las células somáticas. La diferencia en la actividad del elemento transponible viene provo cada por una secuencia intrónica del RNA de la transposasa que sólo se elimina en la células germinales. La maduración del RNA se puede regular tanto negativamente, mediante una molécula reguladora que evita que la maquinaria de maduración acceda a una secuencia de maduración determinada en el RNA, o positivamente, m e diante una proteína reguladora que dirige la maquinaria de maduración hacia una secuencia de procesamiento que de otra forma quedaría oculta (Figura 9-74). En el caso de la transposasa de Drosophila, la etapa clave del procesa miento está bloqueada en las células somáticas por regulación negativa. Además de cambiar la producción de una proteína funcional por otra no funcional, o a la inversa, la regulación de la maduración del RNA puede generar versiones diferentes de la proteína en diferentes tipos celulares, de acuerdo con las necesidades de la célula. Por ejemplo, de este modo se produce en las células nerviosas una variante especializada de la proteína tirosina quinasa codificada por el proto-oncogén src (Figura 9-75). Las variantes específicas de tipo celular de otras proteínas se producen del mismo modo.
La determinación del sexo en Drosophila depende de una serie de procesos de maduración alternativa regulada del RNA55 En Drosophila la señal primaria que determina si a mosca se desarrollará como macho o hembra es la relación cromosomas X/autosomas. Individuos con una re-
Controles post-transcripcionales
485
TEJIDO 1
TEJIDO 2 represor
transcrito prim ario
(A) CONTROL NEGATIVO
CO \ / m aduración bloqueada
m aduración mRNA
mRNA
activador transcrito prim ario
(B) CONTROL POSITIVO
Figura 9 -74 Control negativo y positivo de la maduración alternativa del RNA. (A) Control negativo, en el que un represor se une a un transcrito primario en el tejido 2, evitando de ese modo que la maquinaria de maduración elimine la secuencia del intrón. (B) Control positivo, en el que la maquinaria de maduración es incapaz de eliminar una secuencia intrónica particular sin ayuda de una proteína activadora.
m aduración
sin m aduración mRNA
mRNA
lación cromosomas X/autosomas de 1 (normalmente dos cromosomas X y dos se ries de autosomas) se desarrollan como hembras, mientras que los que presentan una relación de 0,5 (normalmente un cromosoma X y dos series de autosomas) se desarrollan como machos. Esta relación parece determinarse de algún modo en las primeras fases del desarrollo y desde entonces es recordada por cada célula. Hay tres productos génicos cruciales que están implicados en la transmisión de la información sobre esta relación a muchos otros genes que especificarán los rasgos propios de machos y hembras (Figura 9-76). En la Figura 9-77 se indica que la de terminación del sexo en Drosophila depende de una cascada de fenómenos de maduración regulada del RNA, que implican a estos tres productos génicos. La determ inación del sexo en Drosophila aporta el ejemplo mejor conocido de una cascada de regulación basada en la maduración del RNA. No está claro por qué la m osca utiliza esta estrategia. Otros organismos (nemátodos, por ejemplo) utilizan un sistema com pletamente diferente para la determinación del sexo -basado en controles transcripcionales y traduccionales. Además, la vía de determinación de macho en Drosophila requiere que se produzcan continua m ente una serie de moléculas de RNA no funcionales, lo que parece ser un gasto innecesario. Se especula que esta cascada de maduración del RNA es un antiguo mecanism o de control, procedente de una etapa evolutiva en la que el RNA era la molécula biológica predominante y los controles de la expresión génica debían basarse com pletam ente en interacciones RNA-RNA.
Un cambio en el punto de rotura del transcrito de RNA y la adición de poli A pueden cambiar el extremo carboxilo terminal de una proteína56 En eucariotas el extremo 3 ’ de una molécula de mRNA no está determinado, como en bacterias, por la finalización de la síntesis de RNA por la RNA polimerasa. Por el contrario, está determinado por una reacción de rotura del RNA que
disposición de los exones que codifican proteína del gen src
1 :: j□ 2 3 1
I4l
A
1000
1
5 1
■6 ■ni mu 7 8 9 10 1112
DNA
pares de nucleótidos m ayoría de las células H2N
células nerviosas COOH
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 proteína Src de 533 am inoácidos 486
Capítulo 9 : El control de la expresión génica
H2N
COOH 2 3 A4 5 6 7 8 9 10 11 12 proteína Src de 539 am inoácidos
Figura 9-75 La m aduración alternativa regulada del RNA produce formas específicas del tipo celular de un producto gènico. Aquí se representa el proceso de generación de dos proteína quinasas ligeramente distintas a partir del gen src, porque la secuencia del exón A sólo se incluye en la forma propia de las células nerviosas. La forma neural de la proteína Src contiene un lugar de fosforilación extra y se cree que además tiene una actividad específica superior. En el esquema sólo se muestran los exones que codifican proteína (c o lo rea d os) (el exón 1, que forma la secuencia 5 ’ líder del mRNA, no se muestra). (Según J.B. Levy et al., Mol. C ellB iol. 7:4142-4145, 1987.)
está catalizada por otros factores mientras el transcrito se esta alargando (véase Figura 8-49). Una célula puede controlar el lugar de corte de modo que cambie el extremo carboxilo de la proteína resultante (que está codificado por el extre mo 3 ’ del mRNA). Un cambio de este tipo que ha sido bien estudiado es el que media el cam bio en la síntesis de moléculas de anticuerpo, de unidas a la mem brana a secre tadas, durante el desarrollo de los linfocitos B. Muy pronto durante la vida de una célula B, el anticuerpo que produce dicha célula se ancla en la membrana plasmática, y allí actúa com o receptor del antígeno. La estimulación por el antígeno hace que estas células se multipliquen y em piecen a secretar su anticuer po. La forma secretada del anticuerpo es idéntica a la forma unida a la m em bra na, excepto en cuanto a su extremo carboxilo terminal. En el caso de la forma unida a la membrana, en este extremo la proteína tiene una larga cadena de aminoácidos hidrofóbicos que atraviesa la bicapa lipídica de la membrana, mientras que en el caso de la forma secretada, presenta una cadena mucho más corta de aminoácidos hidrofílicos. Por lo tanto, el cambio de la forma unida a la membrana a la forma secretada requiere una secuencia diferente de nucleótidos en el extremo 3 ’ del mRNA; esta diferencia se consigue a través del cambio en la longitud del transcrito primario de RNA causado por un cambio en el lugar de corte del RNA, como se describe en la Figura 9-78.
La definición de gen se ha de modificar debido al descubrimiento de la maduración alternativa del RNA57 El descubrimiento de que habitualmente los genes eucariotas contienen intrones y de que sus secuencias codificantes se pueden unir de varias formas ha planteado nuevas cuestiones sobre la definición de lo que es un gen. El gen fue definido por primera vez en términos moleculares a principios de los años 40, a partir del trabajo sobre genética bioquímica del hongo Neurospora. Desde en tonces, un gen ha sido definido operacionalmente como una región del genoma que se segrega durante la meiosis como una sola unidad y que da lugar a un ras go definible en términos fenotípicos, tal como ojos rojos o blancos en Drosophi la o semillas lisas o rugosas en los guisantes. Los trabajos en Neurospora m ostra ron que la mayoría de genes corresponden a una región del genoma que dirige la síntesis de una sola enzima. Esto permitió enunciar la hipótesis de que un gen codifica una cadena polipeptídica. La hipótesis resultó ser extremadamente pro vechosa para la investigación posterior; a medida que se iban descubriendo más detalles sobre los mecanismos de la expresión génica, durante los años 60, se fue identificando un gen como una porción de DNA que es transcrito en RNA y que codifica una sola cadena polipeptídica (o un solo RNA estructural, como m olé culas de tRNA o de rRNA). El descubrimiento de los genes partidos a finales de los años 70 se pudo encajar fácilmente en la definición original de gen a condi ción de que se considerara que una cadena polipeptídica estuviera especificada por el RNA transcrito a partir de alguna secuencia de DNA. Sin embargo, ahora está claro que muchas secuencias de DNA de las células de los eucariotas superio res producen dos o más proteínas distintas mediante la maduración alternativa del RNA. Entonces, ¿cómo se tiene que definir un gen? En los casos relativamente raros en los que a partir de una sola unidad de transcripción se produzcan dos proteínas eucariotas muy diferentes, se conside ra que las dos proteínas están codificadas por genes distintos que se solapan en el cromosoma. Sin embargo, parece complicar la cuestión de forma innecesaria el considerar que la mayoría de las proteínas modificadas producidas por madu ración alternativa del RNA derivan de genes solapados. Una alternativa más ra zonable es la de modificar la definición original de gen y considerar como gen a cualquier secuencia de DNA que es transcrita como una única unidad y que co difica un conjunto de cadenas polipeptídicas relacionadas (isoformas proteicas). Esta definición de gen tam bién comprende a aquellas secuencias de DNA que codifican variantes producidas por procesos post-transcripcionales diferentes a
Controles post-transcripcionales
relación crom osom as X autosom as 1 I producto gènico
Sxl
M producto gènico
tra
i producto gènico
dsx
I
mosca m acho o hembra Figura 9-76 Determinación del sexo en Drosophila. Los productos génicos que se muestran actúan en una cascada secuencial para determinar el sexo de una mosca de acuerdo con la relación entre cromosomas X y autosomas. Los genes se denominan sex-lethal (Sxl), transformer (tra) y doublesex (dsx) debido a los fenotipos que resultan cuando son inactivados por mutación. La función de estos productos génicos es transmitir la información acerca de la relación cromosomas X/autosomas a los muchos otros genes que están implicados en la generación de los fenotipos relacionados con el sexo. Estos otros genes actúan como dos juegos alternativos: aquellos que especifican rasgos de hembra y aquellos que especifican los rasgos de macho (véase Figura 9-77).
487
transcrito prim ario de RNA de MACHO X : A = 0,5
GEN
transcrito prim ario de RNA de HEMBRA X : A = 1 lugar de corte bloqueado
lugar de corte regulado 3'
Sex-lethal (S>
j£_
¿
proteína producida no funcional
proteína Sxl funcional
O
lugar de corte regulado 3'
lugar de corte \fssw bloqueado a
tramformmíií
m
n
I proteina Tra funcional
proteína producida no funcional Tra-2 lugar de corte regulado 3'
a
O
lugar de corte activado
doublesex (dsx) proteína Dsx
400 aa
(
150 aa que son específicos de macho
proteína Dsx
wm c 400 aa
(
30 aa que son específicos de hembra
REPRIME LOS GENES DE DIFERENCIACIÓN DE HEMBRA
REPRIME LOS GENES DE DIFERENCIACIÓN DE MACHO
DESARROLLO DE MACHO
DESARROLLO DE HEMBRA
la maduración alternativa de RNA, tales como el desplazamiento de pauta en los ribosomas (ribosomal frameshifting), y la edición del RNA (RNA editing), que se describirán más adelante.
El transporte de RNA desde el núcleo puede ser regulado58 Parece ser que un transcrito primario de RNA es al menos diez veces más largo que la molécula de mRNA madura que se genera a partir de él por maduración por corte y empalme del RNA. Se ha estimado incluso que sólo una veinteava parte aproximadamente de la masa total del RNA fabricado abandona el núcleo celular. Por lo tanto, parece que una fracción substancial de los transcritos pri marios (quizás la mitad) pueden ser completamente degradados en el núcleo sin llegar a generar ninguna molécula de RNA que alcance el citoplasma. Los RNA descartados pueden ser aquellos a partir de cuya secuencia no se pueda fabricar ninguna molécula de mRNA; por otro lado, algunos RNA pueden representar moléculas potenciales de mRNA, funcionales únicamente en algunos tipos celu lares, no llegando en los otros a alcanzar el citoplasma. Esto puede conseguirse mediante su direccionam iento selectivo hacia la degradación intranuclear, o porque se les bloquea selectivamente la salida del núcleo. A pesar de que existen pocas evidencias sólidas para cualquiera de estos ti pos de control, cada uno de ellos es una posibilidad real. En particular, se sabe que la exportación de RNA a través de los poros nucleares es un proceso activo que requiere en muchos casos que los RNA tengan una caperuza especial en el extremo 5 ’ y una cadena poli-A en el extremo 3 ’ (descrito en el Capítulo 8). Re querimientos de este tipo tienen sentido pues mantienen lejos del citoplasma una serie de moléculas de RNA desechables (como por ejemplo las secuencias
488
Capítulo 9 : El control de la expresión gènica
Figura 9-77 La cascada de cambios en la expresión de genes que determ inan el sexo de una m osca depende de la maduración alternativa del RNA. Una relación entre cromosomas X y autosomas de 0,5 produce el desarrollo de un macho. Ser macho es la salida por “defecto” en la que ambos genes Sxl y ira se transcriben pero sus RNA son procesados constitutivamente para producir moléculas de RNA no funcionales, y el transcrito dsx madura para producir una proteína que inactiva los genes que especifican los rasgos de hembra. Una relación entre cromosomas X y autosoma de 1 dispara la vía de diferenciación en el embrión al activar temporalm ente un promotor en el gen Sxl que controla la síntesis de una proteína Sxl funcional. Sxl es una proteína reguladora de la maduración con dos lugares de acción: (1) se une a un transcrito Sxl producido constitutivamente, produciendo una maduración específica de hembra que contribuye a la producción continua de una proteína Sxl funcional, y (2) se une al RNA de ira que se produce constitutivamente, produciendo una maduración alternativa del transcrito, de forma que se produce una proteína reguladora Tra inactiva. La proteína Tra actúa como la proteína constitutiva Tra-2 produciendo la forma de maduración del RNA de dsx específica de hembra; éste codifica una forma femenina de la proteína Dsx, que inactiva específicamente los rasgos masculinos. Los com ponentes de esta vía fueron identificados inicialm ente a través del estudio de mutantes de D rosop h ila que tenían alterado su desarrollo sexual. El gen dsx obtuvo su nom bre (sexo doble o doublesex) de la observación de que las moscas que carecen de este producto génico expresan rasgos tanto masculinos como femeninos. Obsérvese que cuando tanto la proteína Sxl como Tra se unen a los lugares específicos en el RNA, Sxl es un represor que actúa negativamente bloqueando un corte, mientras que Tra actúa positivamente como activador que induce un corte (véase Figura 9-74).
el RNA se corta por el RNA se corta por aquí, dando lugar al aquí, dando lugar al transcrito largo transcrito corto punto de m aduración 5' punto de m aduración 3' (aceptor) \ (dador) | \\ |
DNA 5'
r
3'
5'
1 1 TRANSCRIPCIÓN _______ ; i ______
i
TRANSCRITO CORTO DE RNA
TRANSCRITO LARGO DE RNA
dador ÈBÉÉÉt&’rL>- - X , «J
codón de paro I dador | lA A A A A A
codón de paro II
codón de paro I
aceptor 1
... _
lA A A A A A 3'
m RNA
codón de paro II
]A A A A A A
3
no se elim ina la secuencia intrón porque se ha perdido la unión del aceptor de m aduración
secuencia intrónica elim inada por procesam iento del RNA mRNA
3'
3'
V
.
dador 1 ;
lA A A A A A 3'
TRADUCCIÓN
TRADUCCION ANTICUERPO UNIDO A MEMBRANA l-C O O H péptido term inal hidrofóbico
intrónicas eliminadas en el proceso de maduración). Sin embargo, tener los ex tremos adecuados no es suficiente para el transporte: cada molécula de mRNA permanece confinada en el núcleo hasta que todos los componentes del espliceosoma se han separado de él (Figura 8-54). Así pues, cualquier mecanismo que evite que se termine el proceso de maduración del RNA puede, en principio, blo quear la salida de estos RNA del núcleo.
Algunos RNA están localizados en regiones específicas del citoplasma59 Cuando una nueva molécula de mRNA eucariota pasa a través de un poro nu clear y alcanza el citoplasma, se encuentra con ribosomas que lo traducen en una cadena polipeptídica. Si la cadena de mRNA codifica una proteína que está destinada a la secreción o a expresarse en la superficie celular, será dirigida ha cia el retículo endoplasmático (ER) por una secuencia señal situada en el extre mo amino de la proteína; la secuencia señal será reconocida por el mecanismo de clasificación de proteínas de la célula en cuanto sea sintetizada. Este m eca nismo direcciona todo el com plejo, mRNA, ribosom a y proteína naciente, hacia la m em brana del ER, donde se sintetizará el resto de la cadena polipeptídica, com o se describe en el Capítulo 12. En los demás casos la proteína es sintetizada en ribosomas libres en el citoplasma, donde las señales presentes en la propia secuencia del polipéptido la pueden dirigir hacia otros compartimientos del in terior de la célula. Además existen otros casos en los que los mRNA son dirigidos hacia posicio nes intracelulares específicas por señales existentes en la propia secuencia de mRNA y antes de que sea traducida en una secuencia de aminoácidos. Estas se-
Controles post-transcripcionales
ANTICUERPO SECRETADO [ } - COOH péptido hidrofílico term inal
F ig u ra9-78 La regulación del punto de segm entación del RNA y la adición de poli A determ inan si la molécula de anticuerpo será secretada o perm anecerá unida a la m em brana.
En los linfocitos B no estimulados {izquierda) se produce un largo transcrito de RNA; la secuencia intrónica que se halla cerca de su extremo 3’ es eliminada por maduración del RNA dando lugar a una molécula de mRNA que codifica una molécula de anticuerpo que se unirá a membrana. Por el contrario, después de la estimulación por el antígeno (derecha) el transcrito primario de RNA es cortado por delante del lugar de maduración, junto a la secuencia del último exón. Como resultado de ello, algunas secuencias del intrón que es eliminado del transcrito largo permanecen como secuencias codificantes en el transcrito corto. Éstas son las secuencias que codifican la porción hidrofílica del extremo carboxilo terminal de la molécula de anticuerpo secretada.
* »
ñales se localizan generalmente en la región 3 ’ no traducida (UTR) de la molécu la de mRNA -la región comprendida entre el codón de paro de la traducción y el punto de inicio de la cadena poli-A (véase Figura 9-78). Un ejemplo notable de ello se produce en el huevo de Drosophila, en el que el mRNA que codifica la protema génica bicoide se une al citoesqueleto cortical del extremo anterior del huevo en desarrollo. Cuando se dispara la traducción de este transcrito por la fe cundación, se genera un gradiente de la proteína bicoide que tendrá un papel fundamental en el control del desarrollo de la parte anterior del embrión (mos trado en la Figura 9-39 y descrito con mayor detalle en el Capítulo 21). Algunos mRNA de las células somáticas se sitúan de manera similar. Por ejemplo, en los fibroblastos de mamífero en cultivo, el mRNA que codifica actina se localiza en el córtex rico en filamentos de actina debido a una señal UTR 3 ’, posiblemente debido a que es ventajoso para la célula situar los mRNA próximos a los lugares en los que se van a necesitar las proteínas que codifican. Esta forma de control génico post-transcripcional, donde el mRNA se sitúa en una parte de la célula, se ha conocido recientem ente y aún no está claro cuántos mRNA se sitúan de este modo. En la Figura 9-79 se ilustra el papel de las UTR en el localización de los mRNA en regiones particulares del citoplasma.
La edición del RNA puede cambiar el sentido del mensaje del RNA60 Los m ecanism os moleculares utilizados por las células han sido una continua fuente de sorpresas. Un ejemplo de ello es el fenómeno de m aduración trans de RNA, que ocurre en todos los transcritos en tripanosomas (el protozoo parásito responsable de la enfermedad del sueño). Todos los mRNA de los tripanosomas poseen una secuencia líder 5 ’ con caperuza que se transcribe aparte y que luego se añade al extremo 5 ’ de los transcritos RNA mediante maduración del RNA por corte y empalme de dos moléculas inicialmente no relacionadas entre sí. Esta maduración trans tam bién se utiliza para añadir un líder 5’ a varios mRNA de los nemátodos y para com binar los transcritos de RNA separados que forman la se cuencia codificante de algunas proteínas de mitocondrias y cloroplastos en las células de las plantas. La maduración por corte y empalme entre transcritos puede proporcionar un atajo para la evolución de nuevas proteínas; los pocos casos que se conocen de unión de exones de este modo pueden ser remanentes evolutivos de un proceso más extenso que predominó en las células ancestrales.
región reguladora de D rosophila
gen bacteriano para y j p 3 ' ß-galactosidasa a potnHiar (gen ¡acZ) ♦
SECUENCIA DE DNA RECOMBINANTE INSERTADA EN EL GENOMA DE DROSOPHILA transcrito de RNA sonda com plem entaria empleada para la hibridación in situ
(A) tres posibles destinos para la localización de m RNA en las células epiteliales de un em brión tem prano de Drosophila
UTR 3' deslocalizada
490
UTR 3' basal
UTR 3' apical
(C)
Capítulo 9 : El control de la expresión génica
Figura 9-79 Im portancia de la UTR en la localización de mRNA en regiones específicas del citoplasma. D rosop h ila puede ser transfectada con una molécula de DNA recom binante que codifica un mRNA en el que una secuencia marcadora bacteriana (codificando ß-galactosidasa) está unida a una secuencia UTR 3 ’ escogida. De acuerdo con la elección de la UTR 3 ’, en las células embrionarias el mRNA puede estar deslocalizado, localizado en su región basal o en su región apical. (A) La molécula de DNA recom binante utilizada para analizar los efectos de los diferentes UTR 3 ’. (B) La hibridación in situ (para las secuencias de ß-galactosidasa) muestra que la región UTR 3 ’ determina la localización del mRNA en la célula embrionaria. (C) Fotografía de un mRNA localizado apicalmente detectado por hibridación in situ. Las células que contienen este mRNA están organizadas en franjas a lo largo del eje del embrión (C, cortesía de David Ish-Horowitz).
Otro m ecanism o sorprendente es el proceso denominado edición del RNA que altera enorm em ente los transcritos de RNA. En este proceso, descubierto en transcritos que codifican proteínas en las mitocondrias de los tripanosomas, se insertan uno o más U (o se eliminan, aunque con m enor frecuencia) en re giones seleccionadas del transcrito, provocando grandes modificaciones tanto en la pauta de lectura original como en la secuencia, con lo que cam bia el senti do del m ensaje. En el caso de algunos genes, la edición es tan extensa que más de la mitad de la secuencia son nucleótidos U que se han insertado durante el proceso de edición. La inform ación que especifica exactamente cóm o se ha de editar el transcrito inicial de RNA está contenida en las moléculas de RNA de 40 a 80 nucleótidos de longitud que se transcriben por separado. Los denominados RNA guía tienen un extremo 5 ’ que es complementario en secuencia a un extre mo de la región del transcrito que se ha de editar; a continuación existe una se cuencia que especifica el conjunto de nucleótidos que se han de insertar en el transcrito y posteriormente una serie continua de nucleótidos U. El m ecanism o de edición es sorprendentem ente complejo, transfiriendo los nucleótidos U del extremo 3 ’ del RNA guía directam ente al transcrito, tal como se ilustra en la Fi gura 9-80. Tam bién se ha encontrado edición extensa de secuencias de RNA en las m i tocondrias de muchas plantas, de modo que casi cada mRNA se edita de una forma u otra. Sin embargo, en este caso las bases se cambian de C a U en el RNA, sin inserciones ni deleciones de nucleótidos. Frecuentem ente muchas de las C presentes en la molécula de mRNA están afectadas por la edición, cambiándose el 10 % o más de los aminoácidos que codifica el mRNA. Sólo podemos especular acerca de las razones que justifican que el tripanosoma o las mitocondrias de plantas hagan un uso tan extenso de la edición del RNA. Las sugerencias que parecen más razonables parten de la premisa de que el sistema genético mitocondrial es primitivo. Existen evidencias de que la edi ción está regulada de forma que se produzcan diferentes mRNA en diferentes condiciones, de modo que la edición del RNA debería entenderse como una for ma primitiva de cam biar la expresión de los genes. Los tripanosomas son euca-
C l
RNA guía
cola poli-U
Figura 9 -80 Edición del RNA en la m itocondria de los tripanosom as. Los
c
RNA guía 2 3' RNA guía 1
transcrito de RNA I l
I I I I III
I
APAREAMIENTO CON EL RNA GUÍA 1
lugares con nucleótidos U ausentes I
I I I
I I I I II I
I
I
nucleótidos en el RNA guía especificando nucleótidos U ausentes
I
EDICIÓN SEGUIDA POR EL APAREAMIENTO AL RNA GUÍA 2
C
RNA guía tienen en su extremo 3’ una serie de poly U, que ceden los nucleótidos U a determinados lugares del transcrito de RNA que no se aparean con el RNA guía; así la cola poly-U se va acortando a medida que se va produciendo la edición del RNA (no se muestra). La edición se inicia generalmente cerca del extremo 3’ y progresa hacia el extremo 5’ del transcrito de RNA, como se muestra, debido a que la “secuencia de anclaje” en el extremo 5’ de muchos RNA guía puede aparearse sólo con las secuencias editadas.
3'
I
I I I
II
EDICIÓN
nucleótidos U insertados
m RNA com pletam ente editado
Controles post-transcripcionales
491
riotas unicelulares muy antiguos que se separaron muy pronto de la línea evolu tiva que conduce a las plantas, a los animales y a las levaduras (véase Figura 116). Posiblemente, la versión extremada de la edición del RNA que tiene lugar en sus mitocondrias es un rasgo de las células primitivas de las que procede, en las cuales es probable que la mayor parte de la catálisis fuera realizada por molécu las de RNA en vez de por proteínas. La edición del RNA, en una versión mucho más reducida, también se produ ce en los mamíferos. El primer caso descrito corresponde al gen de la apolipoproteína B, en el que el proceso de edición del RNA crea dos tipos de transcritos: en uno de ellos el cam bio de C por U crea un codón de paro que produce una forma truncada de esta proteína de gran tamaño, y que se expresa de forma es pecífica de tejido. En otro caso un cambio en el centro de la molécula de mRNA cambia un solo aminoácido en un canal iónico del cerebro, alterando la permea bilidad del canal al Ca2+. En el caso de la apolipoproteína B la edición se realiza de una forma muy directa: una proteína se une a una secuencia específica del mRNA y cataliza la desaminación de C a U. Se desconoce si en los otros casos de edición del RNA en mamíferos y plantas este proceso está catalizado por proteí nas en esta misma forma, o si se utilizan cortos moldes de RNA como en tripa nosomas. A continuación describimos los controles que actúan sobre la traducción de los mRNA a proteínas.
Las células eucariotas y procariotas utilizan estrategias diferentes para especificar el lugar de inicio de la traducción en una molécula de mRNA61 En el mRNA de bacterias siempre se encuentra, unos cuantos nucleótidos por delante del codón de inicio AUG, una secuencia de seis nucleótidos muy conser vada, la secuencia Shine-Dalgarno. Esta secuencia se aparea con el RNA 16S de la subunidad ribosóm ica pequeña situando correctamente el codón de iniciación AUG en el ribosoma. Esta interacción es muy importante para una buena efi ciencia de iniciación y aporta a la célula bacteriana un mecanismo sencillo para regular la síntesis de proteínas. Muchos de los mecanismos de control traduccional en bacterias suponen el bloqueo de la secuencia Shine-Dalgarno, ya sea cubriéndola con una proteína unida o bien incorporándola en una región de apareamiento de bases en la molécula de mRNA. Los mRNA de eucariotas no contienen secuencias Shine-Dalgarno. En su lu gar, la selección de un codón AUG como inicio de la traducción viene determi nada fundamentalmente por la proximidad al extremo caperuza 5’ de la m olécu la de mRNA, que es el lugar por el que la subunidad ribosómica pequeña se une al mRNA e inicia la búsqueda de un codón de inicio AUG (descrito en el Capítulo 6). Los nucleótidos que rodean inmediatamente el lugar de inicio de la traduc ción tam bién influyen en la eficiencia con que será reconocido el codón AUG durante el proceso de búsqueda. Si este lugar de reconocimiento es suficiente m ente débil, las subunidades ribosómicas buscadoras ignorarán el primer co dón AUG y podrán escoger el segundo codón AUG en su lugar. Este fenómeno, denominado barrido impreciso (leaky scanning) es una estrategia empleada fre cuentem ente para producir dos o más proteínas a partir del mismo mRNA, que difieran en su extremo amino terminal. Por ejemplo, permite a algunos genes producir la misma proteína con y sin péptido señal unido a su extremo amino, de forma que la misma proteína se pueda dirigir a dos compartimientos celula res diferentes. Otra importante diferencia entre la traducción procariota y eucariota es que los ribosomas eucariotas se disocian rápidamente del mRNA cuando termina la traducción. Así, la reiniciación en un codón AUG interno de una pauta de lectu ra abierta es mucho m enos eficiente en eucariotas que en procariotas, juntando estas dos diferencias -la búsqueda que se realiza a partir del extremo 5’ y la ca pacidad limitada que tienen de empezar la traducción a partir de un codón AUG
492
Capítulo 9 : El control de la expresión génica
mRNA
m etionil-tR N A iniciador
1
subunidad ribosómica 60S
n
SINTESIS PROTEICA
elF-2 / activo \
subunidad ribosóm ica 40S
elF-2 inactivo
V
interno- se podría explicar por qué la inm ensa mayoría de los mRNA eucariotas codifican una única proteína y por qué habitualmente el primer codón AUG desde el extremo 5 ’ es el lugar de inicio de la traducción. Unos cuantos mRNA eucariotas y víricos inician su traducción mediante un mecanismo ligeramente diferente que supone la iniciación en el interior más que una búsqueda a partir del extremo. Estos mRNA contiene secuencias nucleotídicas complejas, denominadas lugares de entrada del ribosoma internos, donde se unen los ribosomas independientemente de la estructura caperuza 5’, ini ciando la transcripción en el primer codón AUG que encuentran. Los detalles de este m ecanismo son desconocidos.
GDP
Figura 9-81 El papel de eIF-2 en la iniciación de la síntesis de proteínas,
La fosforilación de un factor de iniciación regula la síntesis de proteínas62 Las células eucariotas reducen su velocidad de síntesis de proteínas en respuesta a una gran variedad de situaciones, que incluyen la carencia de factores de creci miento, la infección por virus, el choque térmico y la entrada en la fase M del ci clo celular. Se cree que la mayor parte de esta regulación es responsabilidad del factor de iniciación eIF-2, el cual es fosforilado por proteína quinasas específi cas, lo que reduce la velocidad de síntesis de proteínas. En la Figura 9-81 se esquematiza la función normal de eIF-2. Esta proteína forma un complejo con GTP e interviene en la unión del metionil-tRNA inicia dor a la subunidad ribosómica pequeña, que a su vez se unirá al extremo cape ruza 5’ y comenzará el barrido a lo largo del mRNA. Cuando se reconoce el co dón AUG, el GTP unido se hidroliza a GDP por acción de la proteína eIF-2, provocándose un cambio conformacional de ésta y liberándose de la subunidad ribosóm ica pequeña. En ese momento se une una subunidad ribosómica grande formando un ribosoma completo capaz de iniciar la síntesis de proteínas. Debido a que eIF-2 se une fuertemente a GDP, es necesaria la acción de una proteína de liberación del nucleótido de guanina (véase Figura 15-50), denomina da eIF-2B, para liberar el GDP de forma que eIF-2 pueda unir una nueva molécula de GTP y ser reutilizada (Figura 9-82A). La reutilización del eIF-2 no es posible cuando está fosforilado, pues en ese caso la unión de eIF-2 y eIF-2B es especial mente fuerte, lo que impide que se realice el intercambio de nucleótidos. En una célula existe mucha más cantidad de eIF-2 que de eIF-2B, de forma que incluso una pequeña fracción de eIF-2 puede atrapar a casi todo el eIF-2B accesible, con lo cual se evitaría la reutilización incluso del eIF-2 no fosforilado, lo que reduce en gran medida la síntesis de proteínas (Figura 9-82B). Cuando se reduce la actividad de un factor general de traducción, com o elF2, sería de esperar una reducción de la traducción de todos los mRNA por igual. Sin embargo, al contrario de lo esperado, la fosforilación de eIF-2 tiene efectos
Controles post-transcripcionales
493
proteina liberadora de nucleótido guanina, elF-2B elF-2 activo
O
Figura 9-82 El ciclo de eIF-2. (A) El reciclaje del factor eIF-2 mediante una enzima liberadora del nucleótido de guanina (eIF-2B). (B) La fosforilación de eIF-2 controla la síntesis de proteínas al secuestrar eIF-2B.
elF-2B
(B)
eIF-2
EL elF-2B, FORMANDO UN COMPLEJO INACTIVO
EN AUSENCIA DE elF-2B ACTIVO, eIF-2 EN EXCESO PERMANECE EN LA FORMA INACTIVA, UNIDA A GDP, Y LA SINTESIS DE PROTEÍNAS SE REDUCE MARCADAMENTE
selectivos, y se observa incluso activación de la traducción de mRNA específicos. Por ejemplo, este m ecanism o permite a las levaduras adaptarse al ayuno de cier tos nutrientes, m ediante la reducción de la síntesis de todas las proteínas excep to de aquellas que se necesitan para la síntesis de los nutrientes ausentes. Los detalles de este proceso se han estudiado en un mRNA específico de levaduras que codifica una proteína denominada GCN4, proteína reguladora necesaria para la activación de muchos genes que codifican proteínas importantes para la síntesis de aminoácidos. La proteína GCN4 se produce por una activación espe cífica de la traducción de su mRNA producida por una deficiencia de am inoáci dos en el medio, inducida por la fosforilación de eIF-2. La reducción de la activi dad de eIF-2 produce un aumento de la síntesis de la proteína GCN4 por un mecanism o com plejo basado en la com petición entre lugares de inicio de tra ducción correctos e incorrectos cerca del extremo 5’ del mRNA de GCN4. La regulación del nivel de eIF-2 tam bién es importante para las células de mamífero como parte del mecanismo por el cual pueden ser inducidas a entrar en un estado estable no proliferativo (denominado G0) en el que la velocidad de síntesis de proteínas de reduce a alrededor de una quinta parte de la velocidad habitual en las células proliferantes (descrito en el Capítulo 17).
Las proteínas que se unen a la región 5’ líder de los mRNA intervienen en el control traduccional negativo63 Algunas moléculas de mRNA ven bloqueada su traducción por proteínas repre soras de la traducción que se unen al extremo 5 ’ del mRNA cerca del extremo, donde debería iniciarse la traducción. Este tipo de mecanismo se denomina c o n tr o l tr a d u c c io n a l n e g a tiv o (Figura 9-83). Fue descubierto por vez primera en
Figura 9-83 Control traduccional negativo. Esta forma de control es ejercida por una proteína de unión a una secuencia específica de RNA que actúa com o un represor de la traducción. La unión de la proteina a una molécula de mRNA reduce la velocidad de traducción de este mRNA. Se conocen algunos casos de este tipo de control traduccional; la ilustración se refiere al mecanism o que induce la síntesis de ferritina (una proteína de almacenamiento de hierro) cuando la concentración de hierro libre en el citosol se reduce; la proteína represora de la traducción sensible a los niveles de hierro se denomina aconitasa (véase también Figura 9-86).
494
Capítulo 9 : El control de la expresión gènica
mRNA
1
AUG H2N proteína
PARO -1 -3 '
ZZ3COOH ACTIVO
PARO AUG -2 -3 ' no se sintetiza proteína INACTIVO proteína represora de la traducción
LA ESTABILIDAD DE LOS m RNA NATURALES VIDA MEDIA
secuencia codificante 3' UTR ESTABLE “ 1 AAA 3’ mRNA de (3 globina H AAA 3' mRNA de factor INESTABLE de crecim iento
©
mRNA de histona
LA SÍNTESIS DEL DNA MODULA SU ESTABILIDAD
> 10 horas 30 m inutos 1 hora cuando la célula está sintetizando DNA, pero 12 m inutos cuando la célula no sintetiza DNA
bacterias en las que permite a las proteínas ribosómicas presentes en exceso re primir la traducción de sus propios mRNA -constituyendo un mecanismo de re gulación por retroalimentación negativa. En las células eucariotas una forma de control negativo traduccional parti cularmente bieñ estudiada permite que la síntesis de la proteína ferritina, de al m acenam iento de hierro, se ajuste rápidamente al nivel de iones de hierro solu bles. La regulación por hierro depende de una secuencia de aproximadamente 30 nucleótidos en la secuencia líder 5 ’ de la molécula de mRNA de la ferritina. Este elemento de respuesta al hierro se pliega formando una estructura en forma de bucle que se une a una proteína represora de la traducción denominada aconitasa, que bloquea la traducción de cualquier secuencia de RNA que se encuentre por detrás (véase Figura 9-83). La aconitasa es una proteína que une hierro y la exposición de la célula al hierro produce su disociación del mRNA de la ferritina, liberando el bloqueo de la traducción e incrementando la producción de ferriti na hasta 100 veces.
Figura 9-84 Estabilidad del RNA. Tres RNA distintos con vidas medias muy diferentes. La degradación continua y rápida de las moléculas de mRNA que codifican varios factores de crecimiento permite que su concentración varíe con rapidez en respuesta a señales extracelulares. La vida media del RNA del factor de crecimiento viene determinada por una señal, que condiciona su rápida degradación, en la región 3’ no traducida (UTR 3’) (véase Figura 9-85). Las histonas son necesarias especialmente para construir la nueva cromatina formada durante la síntesis del DNA; un cambio notable en su estabilidad ayuda a confinar la síntesis de histonas a la fase S del ciclo celular.
La expresión génica puede estar controlada por variaciones de la estabilidad del mRNA64 La mayoría de los RNA de una célula bacteriana son muy inestables: tienen un período de vida media de aproximadamente 3 minutos. Debido a que los mRNA bacterianos se sintetizan y degradan con rapidez, las bacterias pueden adaptarse rápidamente a los cambios ambientales. Los mRNA de las células eucariotas son más estables. Algunos, como los que codifican la p-globina, tienen un período de vida media de más de 10 horas. Sin embargo, otros tienen un período de vida media de menos de 30 minutos. A m e nudo, los mRNA inestables codifican proteínas reguladoras, tales como factores de crecim iento y proteínas de regulación génica, cuyos niveles cam bian rápida m ente en las células (Figura 9-84). Muchos de estos mRNA son inestables debido a que contienen secuencias específicas que estimulan su degradación. Por ejem plo, cuando mediante técnicas de DNA recom binante se transfiere la secuencia larga rica en nucleótidos A y U en la región 3 ’ no traducida (UTR) de algunos mRNA inestables, a otros mRNA estables, éstos se vuelven inestables. Esta se cuencia rica en AU parece acelerar la degradación del mRNA estimulando la eli m inación de la cola poli-A que se encuentra en el extremo 3 ’ de muchos mRNA eucariotas. Contrariamente, otros mRNA inestables contienen lugares de reco nocim iento para endonucleasas específicas que cortan el mRNA en sus regiones UTR 3 ’ (Figura 9-85). La estabilidad de un mRNA puede cam biar en respuesta a señales extracelulares. Así por ejemplo, las hormonas esteroideas afectan a una célula no sólo in crementando la transcripción de determinados genes sino tam bién increm en tando la estabilidad de varios de sus mRNA. Por el contrario, la adición de iones hierro a las células reduce la estabilidad del mRNA que codifica la proteína re ceptora que se une a la proteína de unión al hierro transferrina, con lo que se re duce la producción del receptor. Parece ser que la desestabilización del mRNA del receptor de transferrina está mediada por la misma proteína de unión al
Controles post-transcripcionales
49»
DOS MECANISMOS EUCARIOTAS PARA LA DEGRADACION DEL mRNA
secuencia codificante 3' UTR 1------ 1AAAAA 3'
5' E
il 111 IKB ilW AAAAA 3'
secuencia rica en AU m □ .iiij::::::::;ia a a a a 3'
M A 3'
degradación una secuencia de 50 nucleótidos rica en AU y conservada evolutivam ente en la región UTR 3' favorece la elim inación de la cola poli-A, lo que hace que el mRNA sea inestable
degradación una secuencia repetida en la secuencia UTR 3' perm ite el corte de la región UTR 3' por una endonucleasa específica. Los fragm entos son degradados con rapidez
Figura 9-85 Control de la degradación del RNA. Determinadas secuencias especiales en la región 3’ no traducida (UTR) de los mRNA inestables son las responsables de su rápida degradación. Como se ha indicado, las secuencias ricas en AU que se encuentran en las UTR 3’ de muchos mRNA de vida corta son las responsables de la eliminación rápida de la cola poli-A, lo que hace inestable al mRNA. Otros mRNA contienen secuencias en su UTR 3’ que actúan como lugares de corte para endonucleasas específicas.
RNA que controla la traducción del mRNA de la ferritina. En este caso, la aconitasa se une a la UTR 3 ’ del mRNA del receptor de transferrina provocando un in cremento en la producción de receptor, probablemente al impedir la acción de secuencias que, de otra manera, activarían la degradación del mRNA. Cuando se añade hierro la aconitasa es liberada del mRNA con lo que se reduce la estabili dad de éste (Figura 9-86).
La degradación selectiva del mRNA está acoplada a la traducción65 El control de la estabilidad del mRNA en células eucariotas se comprende m ejor para el caso de los mRNA que codifican histonas. Estos mRNA tienen una vida media de aproximadamente 1 hora durante la fase S del ciclo celular (cuando se necesitan nuevas histonas) pero se degradan en cuestión de minutos cuando se detiene la síntesis de DNA. Si se inhibe la síntesis de DNA con una droga durante la fase S, los mRNA de las histonas se vuelven inestables inmediatamente, quizás porque la acumulación de histonas libres en ausencia de DNA que unir aumenta la velocidad de su degradación. La regulación de la estabilidad de las histonas depende de un corto tallo y un bucle 3 ’ que reemplaza la cola poli-A del extremo 3 ’ de otros mRNA (véase Fi gura 9-84). Después de que el mRNA de las histonas se haya sintetizado por la
CARENCIA DE HIERRO
aconitasa citosólica mRNA de ferritina
AAA 3' | bloqueo de la traducción NO SE SINTETIZA FERRITINA
SE SINTETIZA FERRITINA (A) 496
aconitasa citosólica mRNA del receptor \ de transferrina
AAA 3' | el mRNA es estable y se traduce
SE SINTETIZA RECEPTOR DE TRANSFERRINA
NO SE SINTETIZA RECEPTOR DE TRANSFERRINA (B)
Capítulo 9 : El control de la expresión gènica
Figura 9-86 Dos controles posttraduccionales controlados por hierro. En respuesta a un incremento en la concentración citosólica de hierro, una célula aumenta su síntesis de ferritina para unir el hierro extra (A) y reduce la síntesis de receptores de transferrina para reducir la importación de hierro (B). Ambas respuestas están mediadas por la misma proteína reguladora de respuesta al hierro, la aconitasa, que reconoce rasgos comunes en las estructuras en tallo y bucle de los mRNA que codifican la ferritina y el receptor de transferrina. Cuando la aconitasa une hierro, se disocia del mRNA. Debido a que el receptor de transferrina y la ferritina están reguladas por diferentes tipos de mecanismos, sus niveles responden de forma opuesta a las concentraciones de hierro, a pesar de estar regulados por la misma proteína sensible al hierro. (Adaptado de M.W. Hentze et al., Science 238:1570-1573, 1987; J.L. Casey et al., Science, 240: 924-928, 1988.)
RNA polimerasa II, una reacción de segmentación especial, que requiere un apareamiento de bases con un pequeño RNA de una partícula ribonucleoproteica crea este extremo 3 ’. Si por métodos de DNA recombinante se transfiere este extremo 3 ’ a otros mRNA, tam bién se vuelven inestables cuando se para la sínte sis de DNA. Por lo tanto, como ocurre en otros tipos de mRNA, la velocidad de degradación está fuertemente influida por señales próximas al extremo 3 ’, don de se cree que empieza la degradación del RNA. Si en medio de una secuencia codificante de un mRNA de una histona se in serta un codón de paro, el mRNA ya no se degrada rápidamente. Por lo tanto se ha sugerido que la nucleasa responsable de la degradación de los mRNA se une al ribosoma y que la mayor parte del mRNA de la histona ha de ser traducido an tes de que la nucleasa pueda empezar a digerir el extremo 3 ’ del mRNA. Esta h i pótesis podría explicar por qué la mayoría de los mRNA inestables se estabilizan selectivamente cuando las células se tratan con el inhibidor de la síntesis protei ca cicloheximida. El acoplamiento de la degradación del mRNA a la traducción puede ser un m ecanismo para asegurar que las moléculas de mRNA recién sin tetizadas en una célula eucariota no sean destruidas hasta que se hayan traduci do al m enos una vez.
El control citoplasmàtico de la longitud de las cadenas de poli-A puede afectar tanto a la traducción como a la estabilidad del mRNA66 La poliadenilación inicial de una molécula de RNA (descrita en el Capítulo 8) tiene lugar en el núcleo aparentemente de forma automática para casi todos los precur sores de mRNA eucariotas (siendo una excepción los mRNA de las histonas descri tos previamente). Una vez en el citoplasma, las colas poli-A de 200 nucleótidos de longitud de muchos transcritos, son recortadas paulatinamente durante algunos días. No se han observado colas poli-A más cortas de 30 residuos A, lo que sugiere que ésta sería la longitud mínima necesaria para la estabilidad del mRNA. Asimis mo, la longitud de algunas colas poli A está controlada específicamente, bien por adición selectiva de poli-A bien por eliminación selectiva de poli A (Figura 9-87A). Oocitos y huevos en maduración constituyen un ejemplo notable de control de la expresión gènica mediante adición de poli A a mRNA específicos. En estas células gigantes parecen estar inactivas muchas de las vías de degradación de mRNA, de forma que las células puedan fabricar grandes cantidades de mRNA como preparación para la fertilización. Muchos de los mRNA se almacenan con
subunidad ribosóm ica pequeña en el codón de iniciación
corte y adición de la cola poli-A mRNA
Figura 9-87 El control de la longitud de la cola poli-A afecta tanto a la estabilidad como a la traducción del mRNA. (A) la mayoría de los mRNA tiene colas poli-A que exceden la longitud mínima de 30 residuos A. Las colas de determinados mRNA pueden alargarse o cortarse específicamente en el citosol, lo cual influye en la traducción de estos mRNA. (B) Se ha propuesto un modelo para explicar la estimulación de la traducción que se observa al incrementar la longitud de la cola poli-A. Las subunidades ribosómicas grandes pueden ser recicladas directamente, una vez han acabado la cadena proteica, desde cerca del extremo 3’ de una molécula de mRNA al extremo 5’ para iniciar de nuevo la síntesis de una molécula de proteína, por proteínas especiales de unión a la secuencia poli-A {rojo).
| alargam iento de la cola poli-A
NÚCLEO CITOSOL
r
readición de poli-A a determ inados mRNA
conjunto de mRNA traducibles
pérdida gradual de poli-A de todos los mRNA
subunidad ribosóm ica grande LAS PROTEÍNAS UNIDAS A LA COLA POLI-A CATALIZAN LA ENTRADA DE LA SUBUNIDAD RIBOSÓMICA GRANDE
elim inación rápida de poli-A de determ inados mRNA
3'
| degradación rápida de mRNA (A)
Controles post-transcripcionales
(B)
inicio de la traducción por el ribosom a com pleto
497
colas poli-A de sólo 10 a 30 residuos A en sus extremos 3 ’ y en esta forma no se traducen. En ciertos momentos del desarrollo, cuando son necesarios los pro ductos codificados por estos mensajeros, se les añade poli A al extremo 3 ’, lo que estimula notablem ente la iniciación de su traducción. En la Figura 9-87B se ex plica cóm o la adición de poli A al extremo 3 ’ puede afectar al inicio de la traduc ción próximo al extremo 5 ’ del mRNA.
Algunos mRNA contienen señales de reconocim iento que interrumpen el proceso norm al de la traducción67 Los controles traduccionales descritos hasta el momento afectan la velocidad con la cual se inician las nuevas cadenas de proteína sobre una molécula de RNA. Normalmente, la traducción, una vez se ha iniciado, llega automáticamen te hasta el final, Sin embargo, existen casos especiales, en los que por un proceso denominado recodificación traduccional se puede modificar la proteína que fi nalm ente se produce. La forma de recodificación observada con mayor frecuencia es la de cambio de pauta de lectura traduccional. Este tipo de recodificación es muy frecuente en retrovirus, permitiéndoles sintetizar más de una proteína a partir de un mismo mRNA. Estos virus suelen producir tanto las proteínas de la cápside (proteínas Gag) como la transcriptasa inversa y la integrasa (proteínas Pol) a partir del mis mo transcrito de mRNA. Los virus necesitan muchas más copias de la proteína Gag que de la proteína Pol, y muchos de ellos consiguen ajustar sus produccio nes relativas teniendo los genes gag y pol en pautas de lectura diferentes, con un codón de paro al final de las secuencias codificantes de gag que puede ser elimi nado por un cam bio de pauta de lectura traduccional poco frecuente. El cambio de pauta de lectura ocurre exclusivamente en un codón particular y requiere una señal de recodificación, que parece que es un rasgo estructural de la secuen cia de RNA siguiente a este lugar (Figura 9-88) Principios similares a éste se utilizan en algunas otras formas de recodifica ción en lugares específicos del mRNA. Así pues, se han descrito señales de reco dificación que provocan un cambio de pauta de lectura de +1 en lugar del -1 que actúa en los RNA víricos y que se muestra en la Figura 9-88. En otras ocasiones la secuencia nucleotídica que rodea al codón de paro lo hace ser débil, de forma que se añaden aminoácidos adicionales al final de la cadena polipeptídica. Más sorprendente aún es el mecanism o descubierto recientemente que inserta el aminoácido modificado selenocisteína en una cadena proteica. La selenocisteína, que es esencial para la función de algunas enzimas, contiene un átomo de selenio en lugar del átomo de azufre de la cisterna y se encuentra unida a una molécula de tRNA especial. El tRNA tiene afinidad hacia una señal de recodifica ción presente en las moléculas de mRNA que codifican proteínas que utilizan selenocisteína. La selenocisteína se incorpora en codones UGA especiales, que en muchos otros casos podrían haber servido como codones de paro deteniendo la síntesis de proteínas.
RNA vírico RNA de RNA Q bucle b 5 ' - —| U U U U U A G G G h
l
- 3'
H2N - -| phe | leu | gty j —*- etc
proteina Gag
COOH
SIN CAMBIO DE PAUTA DE LECTURA (90% de los ribosom as)
498
|----------5 ' - - jU U U U U A G G 6
HvN ¿ h 2n
f£.
cam bio de pauta i—phe r —TT* de lectura d e -1, a. leu ara —►etc. .. Lí.-----1— D-a M continuación de la incorporación de leu proteína de fusión Gag-Pol
CON CAMBIO DE PAUTA DE LECTURA (10% de los ribosom as)
Capítulo 9 : El control de la expresión gènica
bCOOH
Figura 9-88 El cambio de pauta de lectura traduccional es necesario para producir la transcriptasa inversa y la integrasa de un retrovirus. La transcriptasa inversa vírica y la integrasa se producen por el corte de la gran proteína de fusión Gag-Pol, mientras que las proteínas de la cápside del virus se producen a partir del corte de la proteína Gag, más abundante. Tanto la proteína Gag como la proteína de fusión se inician en el mismo punto, pero la proteína Gag termina en un codón de paro de la misma pauta de lectura (no mostrado); el cambio de pauta de lectura indicado elimina este codón de paro, permitiendo la síntesis de la proteína de fusión más larga. El cambio de pauta de lectura ocurre debido a que ciertos rasgos de la estructura local del RNA (incluyendo un bucle de RNA que no se muestra) hacen que el tRNALeu unido al extremo carboxilo del polipéptido en crecim iento se deslice un nucleótido hacia atrás sobre el ribosoma, de modo que ya no se aparea con el codón UUA que ha especificado su incorporación, sino con el codón UUU; el siguiente codón en la nueva pauta de lectura (AGG) especifica una arginina en lugar de una glicina. La secuencia que se muestra procede del virus del SIDA, HIV. (Adaptado de T. Jacks et al., N ature 331:280-283, 1988.)
4 5'
3
cola
EL RI REGULA UNE AL
región activa
2
EL RNA I Y , EL RNA II FORMAN UNA HÉLICE PERFECTA
3'
73'
RNA i
5'
RNA II
form a activa de! RNA II
Es muy probable que las reacciones catalizadas por RNA tengan un origen muy antiguo68 Todos los mecanismos de control post-transcripcional descritos en esta sección dependen de que una determinada molécula de RNA sea reconocida específica mente para un tratamiento especial, como la maduración edición o degrada ción. En algunos casos este reconocim iento está realizado por proteínas espe cializadas de unión al RNA. Sin embargo, en otros casos, el reconocimiento de secuencias de RNA específicas es llevado a cabo por otras moléculas de RNA que utilizan el apareamiento RNA-RNA como parte de su mecanismo de reconoci miento. Por ejemplo, se sabe que los apareamientos RNA-RNA juegan un papel importante en la traducción, en la maduración del RNA en otras formas de pro cesam iento del RNA y en la edición del RNA que tiene lugar en tripanosomas. Intentando diseccionar los mecanismos de control post-transcripcional se ha entrado de lleno en el mundo del RNA. Las moléculas de RNA tienen otros papeles reguladores en la células. La es trategia del RNA antisentido para la manipulación experimental de células con siste en impedir que las células expresen un gen determinado (véase pág. 350) mimetizando un mecanismo normal del que se sabe que regula la expresión de algunos genes seleccionados en bacterias, y puede ser que la célula lo utilice más ampliamente de lo que hasta ahora se había creído. Un ejemplo bien conocido de este tipo de mecanism o es el que forma el control por retroalimentación de la iniciación de la replicación del DNA de una gran familia de plásmidos de DNA bacterianos. Este control limita el número de copias de plásmido que una célula puede contener, evitando que el plásmido mate a la célula por un exceso de re plicación (Figura 9-89). Los estudios de las reacciones catalizadas por el RNA son de un gran interés desde el punto de vista evolutivo. Tal como describimos en el Capítulo 1, parece que las primeras células carecían de DNA y podrían haber contenido pocas o ninguna proteína. Muchas de las reacciones catalizadas por RNA parecen ser fó siles moleculares -descendientes de la com pleja red de reacciones catalizadas por RNA que se cree dominaron el metabolismo hace 3,5 mil millones de años. La tecnología del DNA recom binante ha permitido que, utilizando RNA polimerasas, se puedan producir in vitro grandes cantidades de RNA puros de una se cuencia determinada cualquiera (véase Figura 7-36), haciendo posible estudiar la química detallada de las reacciones catalizadas por RNA. A partir de la com prensión de muchas de estas reacciones, los biólogos tienen la esperanza de ser capaces de trazar la vía por la cual evolucionó la primera célula viva.
Figura 9-89 Estrategia del RNA antisentido para regular el número de plásmidos en una bacteria. La interacción reguladora entre dos moléculas de RNA mantiene constante el número de copias de plásmido en la familia ColEl de los plásmidos de DNA bacteriano. El RNA I (de aproximadamente 100 nucleótidos de largo) es un RNA regulador que inhibe la actividad del RNA II (de aproximadamente 500 nucleótidos de largo) en la iniciación de la replicación del DNA del plásmido. La concentración del RNA I se incrementa en proporción al número de moléculas de DNA plasmídico en la célula, de modo que a medida que el número aumenta se inhibe su replicación. El RNA I tiene una secuencia complementaria a la del extremo 5’ del RNA II. En el RNA II, la secuencia 2 es complementaria tanto de la secuencia 1 como de la secuencia 3, y se desplaza de una a la otra mediante su unión al RNA I; por lo tanto el RNA I altera la conformación de la secuencia 4 inactivando el RNA II. (Según H. Masukata y J. Tomizawa, Cell 44:125136,1986.)
Resumen Muchos d e los pasos de la ruta qu e va desde el RNA hasta la proteína están regula dos p o r las células p ara controlar la expresión gènica. Se cree qu e la mayoría d e los genes están regulados en múltiples niveles, a u n qu e habitualm ente predom ina el
Controles post-transcripcionales
499
de
de
control la iniciación la transcripción (control transcripcional). Sin embargo, algunos genes son transcritos a un nivel constante y activados y desactivados exclu sivam ente p o r mecanismos reguladores post-transcripcionales. Estos procesos in cluyen (1) la atenuación del transcrito p o r su prem atura finalización, (2) selección alternativa del punto d e m aduración, (3) control d e la form ación del extremo 3 ’ p or ruptura y adición d e poli-A, (4) control del transporte desde el núcleo al citoplasma, (5) localización d e mRNA en lugares particulares d e la célula, (6) edición del RNA, (7) control d e la iniciación d e la traducción, (8) degradación regulada del mRNA, y (9) recodificación traduccional. La mayoría d e estos procesos d e control requieren el reconocimiento secuencias específicas o estructuras que sean reguladas en la m olécula d e RNA. Este reconocimiento se p u ed e llevar a cabo ya sea p o r una pro teína reguladora o p o r una m olécula reguladora de RNA.
de
de
Bibliograffa G eneral Branden, C.; Tooze, J. Introduction to Protein Structure. New York: Garland, 1991. Darnell, J.; Lodish, H.; Baltimore, D. Biologia celular y mole cular, 2.a ed. Barcelona: Ediciones Omega, S.A., 1993. Lewin, B. Genes, 4th ed. New York: Wiley, 1990. Schleif, R. Genetics and Molecular Biology. Reading, MA: Addison-Wesley, 1986. Stent, G.S.; Calendar, R. Molecular Genetics: An Introductory Narrative, 2nd ed. San Francisco: W.H. Freeman, 1978. Watson, J.D.; Hopkins, N.H.; Roberts, J.W.; Steitz, J.A.; Wei ner, A.M. Molecular Biology of the Gene, 4th ed. Menlo Park, CA: Benjamin-Cummings, 1987.
4.
C itas 1. Gurdon, J.B. The developmental capacity of nuclei ta ken from intestinal epithelium cells of feeding tadpo les./. Embryol. Exp. Morphol. 10:622-640,1962. Gurdon, J.B. The generation of diversity and pattern in animal development. Cell 68:185-199,1992. Nomura, K.; Komamine, A. Identification and isolation of single cells that produce somatic embryos at a high frequency in a carrot suspension culture. Plant Phy siol. 79:988-991,1985. Steward, F.C.; Mapes, M.O.; Mears, K. Growth and orga nized development of cultured cells. Am. J. Bot. 45:705-713,1958. Wareing, P.F.; Phillips, I.D.J. The Control of Growth and Differentiation in Plants, 3rd ed. Oxford, UK. Pergamon Press, 1986. 2. Garrels, J.I. Changes in protein synthesis during myogenesis in a clonal cell line. Dev. Biol 73:134-152, 1979. 3. Lucas, P.C.; Granner, D.K. Hormone response domains in gene transcription. Annu. Rev. Biochem. 61:11311173,1992. Miesfeld, R.L. The structure and function of steroid re ceptor proteins. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 24:101117, 1989. Pilkis, S.J.; Granner, D.K. Molecular physiology of the regulation of hepatic gluconeogenisis and glyucolysis. Annu. Rev. Physiol. 54:885-909,1992.
7.
500
Capítulo 9 : El control de la expresión gènica
5.
6.
8.
9.
Yamamoto, K. Steroid receptor regulated trancription of specific genes and gene networks. Annu. Rev. Genet. 19:209-252, 1985. Darnell, J.E., Jr. Variety in the level of gene control in eucaryotic cells. Nature 297:365-371,1982. Derman, E., et al. Transcriptional control in the produc tion of liver-specific mRNA’s. Cell 23:731-739, 1981. Ptashne, M. A Genetic Switch, 2nd ed. Cambridge, MA: Cell Press and Blackwell Press, 1992. Gilbert, W.; Müller-Hill, B. The lac operator is DNA. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 58:2415-2421, 1967. Jacob, F.; Monod, J. Genetic regulatory mechansism in the synthesis of proteins./. Mol. Biol. 3:318-356,1961. Kaiser, A.D. Mutations in a temperate bacteriophage af fecting its ability to lysogenize, E. coli. Virology 3:4261, 1957. Ptashne, M. Specific binding of th X phage repressor to XDNA. Nature 214:232-234,1967. Seeman, N.C.; Rosenberg, J.M.; Rich, A. Sequence speci fic recognition of double helical nucleic acids by pro teins. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 73:804-808, 1976. Crothers, D.M.; Steitz, T.A. Transcriptional activation by Escherichia coli CAP protein. In Transcriptional Re gulation (S.L. McKnight, K.R. Yamamoto, eds.). Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1992. Dickerson, R.E. DNA structure from A to Z. Methods Enzymol. 211:67-111,1992. Hagerman, P.J. Sequence-directed curvature of DNA. Annu. Rev. Biochem. 59:755-781,1990. Harrison, S.C. Molecular characteristics of the rgulatory switch in phages 434 and X. In Transcriptional Regu lation (S.L. McKnight, K.R. Yamamoto, eds.). Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1992. van der Vliet, P.C.; Verrijzer, C.P. Bending of DNA by transcription factors. Bioessays 15:25-32,1993. Miller, J.H.; Reznikoff, W.S., eds. The Operon. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1978. Mitchell, P.J.; Tijan, R. Transcriptional regulation in mammalian cells by sequence-specific DNA binding proteins. Science 245:371-378,1989. Verdier, J.-M. Regulatory DNA-binding proteins in ye ast: an overview. Yeast 6:271-297, 1990.
10. Harrison, S.C. A structural taxonomy of DNA-binding domains. Nature 353:715-719,1991. Pabo, C.O.; Sauer, R.T. Transcription factors: structural families and principles of DNA recognition. Annu. Rev. Biochem. 61:1053-1095,1992. Steitz, T.A. Structural studies of protein-nucleic acid in teraction: the sources of sequence-specific binding. Q. Rev. Biophys. 23:205-280,1990. Wright, P.E. Solution structures of DNA-binding do mains of eukaryotic trancription factors. In Trans criptional Regulation (S.L. McKnight, K.R. Yamamo to, eds.). Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1992. 11. Harrison, S.C.; Aggarwal, A.K. DNA recognition by pro teins with the heliz-turn-helix motif. Annu. Rev. Bio chem. 59:933-969,1990. Laughon, A.; Scott, M.P. Sequence of a Drosophila seg mentation gene: protein structure homology with DNA-binding proteins. Nature 310:25-31,1984. Sauer, R.T.; Yocum, R.R.; Doolittle, R.F.; Lewis, M.; Pabo, C.O. Homology among DNA-binding proteins suggests use of a conserved super-secondary structu re. Nature 298:447-451,1982. 12. Scott, M.P.; Tamkun, J.W.; Hartzell, G.W. The structure and function of the homeodomain. Biochim. Biophys. ACta 989:25-48,1989. Wiithrich, K.; Gehring, W. Transcriptional regulation by homeodomain proteins: structural, functional and genetic aspects. In Transcriptional Regulation (S.L. McKnight, K.R. Yamamoto, eds.). Cold Spring Har bor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1992. 13. Coleman, J.E. Zinc proteins: enzymes, storage proteins, transcription factors, and replication proteins. Annu. Rev. Biochem. 61:897-946,1992. Miller, I.; McLachlan, A.D.; Klug, A. Repetitive zinc-bin ding domains in the protein transcription factor IIIA from xenopus oocytes. EMBO J. 4:1609-1614,1985. Rhodes, D.; Klug, A. Zinc fingers. Sci. Am. 268(2):56-59, 62-65,1993. 14. Knight, K.L.; Sauer, R.T. Biochemical adn genetic analy sis of operator contacts made by residues within the beta-sheet DNA binding motif of Mnt repressor. EMBOJ. 11:215-223,1992. Schwabe, J.W.R. DNA between the sheets. Curr. Biol. 2:661-663,1992. 15. Alber, T. Protein-DNA interactions: how GCN4 binds DNA. Curr. Biol. 3:182-184,1993. Lamb, P.; McKnight, S.L. Diversity and specificity in transcriptional regulation: the benefits of heterotypic dimerization. Trends Biochem. Sci. 16:417-422,1991. Landschulz, W.H.; Johnson, P.F.; McKnight, S.L. The leu cine zipper: a hypothetical structure common to a new class of DNA-binding proteins. Science 240:17591764,1988. McKnight, S.L. Molecular zippers in gene regulation. Sci. Am. 264(4) :54-64,1991. O’Shea, E.; Rutkowski, R.; Kim, P.S. Evidence that the leucine zipper is a coiled coil. Science 243:538-542, 1989. 16. Benezra, R.; Davis, R.L.; Lockshon, D.; Turner, D.L.; Weintraub, H. The protein Id: a negative regulator of helixloop-helix DNA-binding proteins. Cell 61:49-59,1990. Garrell, J.; Campuzano, S. The helix-loop-helix domain: a common motif for bristles, muscles and sex. Bioes says 13:493-498,1991.
Bibliografía
Lassar, A.B.; Davis, R.L.; Wright, W.E.; et al. Functional activity of myogenic HLH proteins requires hetero oligomerization with E12/E47-like proteins in vivo. Cell 66:305-315,1991. Murre, C.; McGaw, P.S.; Baltimore, D. A new DNA bind ing and dimerization motif in immunoglobin enhan cer binding, daughterless, MyoD, and myc proteins. Cell 56:777-783,1989. Tapscott, S.J.; Weintraub, H. MyoD and the regultaion of myogenesis by helix-loop-helix proteins. J. Clin. Invest. 87:1133-1138,1991. 17. Pabo, C.O.; Sauer, R.T. Transcription factors: structural families and principles of DNA recognition. Annu. Rev. Biochem. 61:1053-1095,1992. 18. Fried, M.; Crothers, D.M. Equilibria and kinetic of lac repressor-operator interactions by polyacrylamide gel electrophoresis. Nucleic Acids Res. 9:6505-6525, 1987. Shaffer, C.D.; Wallrath, L.L.; Elgin, S.C.R. Regulating ge nes by packaging domains: bits of heterochromatin in euchromatin? Trends Genet. 9:35-37,1993. 19. Kadonga, J.T. Purification of sequence-specific binding proteins by DNA affinity chromatography. Methods Enzymol. 208:10-23,1991. Kadonaga, J.T. Affinity purification of sequence-specific DNA binding proteins. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 83:5889-5893,1986. Rosenfeld, P.J.; Kelly, T.J. Purification of nuclear factor I by DNA recognition site affinity chromatography. /. Biol. Chem. 261:1986. Vinso, C.R.; LaMarco, K.L.; Johnson, P.F.; Landschulz, W.H.; McKnight, S.L. In situ detection of sequencespecific DNA binding activity specificied by a recom binant bacteriophage. Genet. Dev. 2:801-806,1988. 20. Beckwith, J. The operon: an historical account. In Esche richia coli and Salmonella typhimurium: Cellular and Molecular Biology (F.C. Neidhart, J.L. Ingraham, K.B. Low, et al., eds.), Vol. 2, pp. 1439-1443. Washington, DC: American Society for Microbiology, 1987. Jacob, F.; Monod, J. Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins. J. Mol. Biol. 3:318-356, 1961. Ptashne, M. A Genetic Switch, 2d ed. Cambridge, MA: Cell Press and Blackwell Press, 1992. Yanofsky, C. Transcriptionall regulation: elegance in de sign and discovery. In Transcriptional Regulation (S.L. McKnight, K.R. Yamamoto, eds.). Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1992. 21. Sigler, P.B. The molecular mechanism of trp repression. In Transcriptional Regulation (S.L. McKnight, K.R. Yamamoto, eds.). Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1992. Yanofsky, C.; Crawford, I.P. The tryptopphan operon. In Escherichia coli and Salmonella typhimurium: Cellu lar and Molecular Biology (F.C. Neidhart, J.L. Ingra ham, K.B. Low, et al., eds.), Vol. 2, pp. 1231-1240. Washington, DC: American Society for Microbiology, 1987. 22. Bushman, F.D. Activators, deactivators and deactivated activators. Curr. Biol. 2:673-657,1992. Englesberg, E.; Irr, J.; Power, J.; Lee, N. Positive control of enzymes synthesis by gene C in the L-arabinose system./. Bacteriol. 90:946-957,1965.
501
Hoopes, B.C. McClure, W.R. Strategies in regulation of transcription initiation. In Escherichia coli and Sal monella typhimurium: Cellular and Molecular Bio logy (F.C. Neidhart, J.L. Ingraham, K.B. Low, et al., eds.), Vol. 2, pp. 1231-1240. Washington, DC: Ameri can Society for Microbiology, 1987. Johnson, A.D.; Poteete, A.R.; Lauer, G.; et al. Xrepressor and Cro-components of an efficient molecular switch. Nature 294:217-223,1981. Ptashne, M.; Jeffrey, A.; Johnson, A.D.; et al. How the X repressor and Cro work. Cell 19:1-11,1980. 23. Beckwith, J. The lactose operon. In Escherichia coli and Salmonella typhimurium: Cellular and Molecular Biology (F.C. Neidhart, J.L. Ingraham, K.B. Low, et al., eds.), Vol. 2, pp. 1444-1452. Washington, DC: Ameri can Society for Microbiology, 1987. Gralla, J.D. lac repressor. In Transcriptional Regulation (S.L. McKnight, K.R. Yamamoto, eds.). Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1992. 24. Beardsley, T. Smart genes. Sei. Am. 265(2) :86-95, 1991. Buratowski, S.; Sharp, P.A. Initiation of transcription by RNA polymerase II. In Transcriptional Regulation (S.L. McKnight, K.R. Yamamoto, eds.). Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1992. Johnson, P.F.; McKnight, S.L. Eukaryotic transcriptional regulatory proteins. Annu. Rev. Biochem. 58:799-839, 1989. Zawel, L.; Reinberg, D. Initiation of transcription by RNA polymerase II: a multi-step process. Prog. Nu cleic Acid Res. Mol. Biol. 44:68-108, 1993. 25. Geidsuschek, E.P.; Kassavetis, G.A. RNA polymerase III transcription complexes. In Transcriptional Regula tion (S.L. McKnight, K.R. Yamamoto, eds.). Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1992. Gill, G. Complexes with a common core. Curr. Biol. 2:565-567, 1992.
27.
28.
29.
Hernández, N. TBP, a universal eukaryotic transcription factor? Genes Dev. 7:1291-1308, 1993. Hisatake, K., et al. The p250 subunit of native TAT boxbinding factor TFIID is the cell-cycle regulatory pro tein CCG1. Nature 362:179-181, 1993. Peterson, M.G.; Tijan, R. Transcription: the tell-tail trig ger. Nature 358:620-621, 1992. Reeder, R.H. Regulation of transcription by RNA poly merase I. In Transcriptional Regulation (S.L. McK night, K.R. Yamamoto, eds.). Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1992. Roeder, R.G. The complexities of eukaryotic transcrip tion initiation: regulation of preinitiation complex assembly. Trends Biochem. Sei. 16:402-408, 1991. Ruppert, S.; Wang, E.H.; Tijan, R. Cloning and expres sion of human TAF„250: a TBP-associated factor im plicated in cell-cycle regulation. Nature 362:175-179, 1993. White, R.J.; Jackson, S.P. The TATA-binding protein: a central role in transcription by RNA polymerases I, II and III. Trends Genet. 8:284-288, 1992. 26. Drapkin, R.; Merino, A.; Reinberg, D. Regulation of RNA polymerase II transcription. Curr. Opin. Cell Biol. 5:469-476, 1993.
502
Capítulo 9 : El control de la expresión gènica
30.
Hochschild, A. Protein-protein interactions and DNA loop formation. In DNA Topology and Its Biological Effects (N.R. Cozzarrelli, J.C. Wang, eds.). Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1990. Kustu, S.; North, A.K.; Weiss, D.S. Prokaryotic transcrip tional enhancers and enhancer-binding proteins. Trends Biochem. Sei. 16:397-402,1991. Müller, H.-P.; Schaffner, W. Transcriptional enhancers can act in trans. Trends Genet. 6:300-304,1990. North, A.K.; Klose, K.E.; Stedman, K.M.; Kustu, S. Pro karyotic enhancer-binding proteins reflect eukaryote-like modularity: the puzzle of nitrogen regulatory protein C. J. Bacteriol. 175:4267-4273, 1991. Schleif, R. DNA looping. Annu. Rev. Biochem. 61:199223, 1992. Adhya, S. Multipartite genetic control elements: com munication by DNA looping. Annu. Rev. Genet. 23:227-250,1989. Johnson, P.F.; McKnight, S.L. Eukaryotic transcriptional re gulatory proteins. Annu. Rev. Biochem. 58:799-839,1989. Mitchell, P.J.; Tjian, R. Transcriptional regulation in mammalian cells by sequence-specific DNA-binding proteins. Science 245:371-378, 1989. Serfling, E.; Jasin, M.; Schaffner, W. Enhancers and eukar yotic gene transcription. Trends Genet. 1:224-230,1985. Brent, R.; Ptashne, M. A eukaryotic transcriptional acti vator bearing the DNA specificity of a prokaryotic re pressor. Cell 43:729-736, 1985. Greenblat, J. Protein-protein interactions as critical de terminants of regulated initiation and termination of transcription. In Transcriptional Regulation (S.L. McKnight, K.R. Yamamoto, eds.). Cold Spring Har bor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1992. Lin, Y-S.; Green, M.R. Mechanism of action of an acidic transcriptional activator in vitro. Cell 64:971-981, 1991. Ptashne, M.; Gann, A.A.F. Activators and targets. Nature 346:329-331, 1990. Goodbourn, S. Negative regulation of transcriptional initiation in eukaryotes. Biochim. Biophys. Acta 1032:53-77, 1990. Herschbach, B.M.; Johnson, A.D. Transcripted repression in eukaryotes. Annu. Rev. Cell Biol. 9:479-511,1993. Jackson, M.E. Negative regulation of eukaryotic trans cription./. Cell Sei. 100:1-7, 1991. Guarente, L. Mechanism and regulation of transcriptio nal activation in eukaryotes: conserved features from yeasts to humans. In Transcriptional Regulation (S.L. McKnight, K.R. Yamamoto, eds.). Cold Spring Har bor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1992. Herr, W. Oct-1 and Oct-2: differential transcriptional re gulation by proteins that bind to the same DNA se quence. In Transcriptional Regulation (S.L. McK night, K.R. Yamamoto, eds.). Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1992. Johnson, A. A combinatorial regulatory circuit in bud ding yeast. In Transcriptional Regulation (S.L. McK night, K.R. Yamamoto, eds.). Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1992. Martin, K.J.; Green, M.R. Transcriptional activation by viral immediate-early proteins: variations on a com mon theme. In Transcriptional Regulation (S.L. McK night, K.R. Yamamoto, eds.). Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1992.
Thompson, C.C.; McKnight, S.I. Anatomy of an enhan cer. Trends Genet. 8:232-236,1992. Yamamoto, K.R.; Pearch, D.; Thomas, J.; Miner, J.N. Combinatorial regulation at a mammalian composite respones element. In Transcriptional Regulation (S.L. McKnight, K.R. Yamamoto, eds.). Cold Spring Har bor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1992. 31. Pankratz, M.J.; Jackie, H. Making stripes in the Drosop hila embryo. Trends Genet. 6:287-292,1990. St. Johnston, D.; Nusslein-Volhard, C. The origin of pat tern and polarity in the Drosophila embryo. Cell 68:201-219,1992. Scott, M.P.; O’Farrell, P.H. Spatial programming of gene expression in early Drosophila embryogenesis. Annu. Rev. Cell Biol. 2:49-80,1986. Small, S.; Levine, M. The initiation of pair-rule stripes in the Drosophila blastoderm. Curr. Opin. Genet. Dev. 1:255-260,1991. 32. Jackie, H.; Sauer, F. Transcriptional cascades in Drosop hila. Curr. Opin. Cell Biol. 5:505-512,1993. Small, S.; Kraut, R.; Hoey, T.; Warrior, R.; Levine, M. Trancriptional regulation of a pair-rule stripe in Dro sophila. Genes Dev. 5:827-839,1991. 33. Crossley, M.; Orkin, S.H. Regulation of the beta-globin locus. Curr. Opin. Genet. Dev. 3:232-237,1993. Evans, T.; Felsenfeld, G.; Reitman, M. Control of globin gene transcription. Annu. Rev. Cell Biol. 6:95-124,1990. Higgs, D.R.; Wood, W.G. Understandig erythroid diffe rentiation. Curr. Biol. 3:548-550,1993. Minie, M.; Clark, D.; Trainor, C., et al. Developmental regulation of globin gene expression. /. Cell Sci. 16(Suppl.):15-20,1992. 34. Berk, A.J. Regulation of eukaryotic transcription factors by post-translational modification. Biochim. Biophys. Acta 1009:103-109,1989. Hunter, T.; Karin, M. The regulation of trancription by phosphorylation. Cell 70:375-387,1992. 35. Stragier, P.; Losick, R. Cascades of sigma factor revisi ted. Mol. Microbiol. 4:1801-1806,1990. 36. Grunstein, M. Histones as regulators of genes. Sci. Am. 267(4):68-74B, 1992. Komberg, R.D.; Lorch, Y. Chromatin structure and transcription. Annu. Rev. Cell Biol. 8:563-587,1992. Svaren, J.; Horz, W. Histones, nucleosomes and tran cription. A/m«. Rev. Cell Biol. 8:563-587,1992. Winston, F.; Carlson, M. Yeast SNF/SWI transcriptional activators and the SPT/SIN chromatin connection. Trends Genet. 8:387-391,1992. Wolffe, A. Chromatin: Structure and Function. San Die go, CA: Academic Press, 1992. 37. Croston, G.E.; Kadonaga, J.T. Role of chromatin structu re in the regulation of transcription by RNA polyme rase II. Curr. Opin. Cell Biol. 5:417-423,1993. Fedor, M.J. Chromatin structure and gene expression. Curr. Opin. Cell Biol. 4:436-443,1992. Grunstein, M. Nucleosomes: regulators of transcription. Trends Genet. 6:395-400,1990. Komberg, R.D.; Lorch, Y. Irresistible force meets immo vable object: transcription and the nucleosome. Cell 67:833-836,1991. Struhl, K. Gene expression: chromatin and transcription factors: who’s on first? Curr. Biol. 3:220-221,1993.
Bibliografía
Workman, J.L.; Taylor, I.C.A.; Kingston, R.E. Activation domains of stably bound GAL4 derivatives alleviate repression of promoters by nucleosomes. Cell 64:533-544,1991. 38. Aparicio, O.M.; Billington, B.L.; Gottschling, D.E. Modi fiers of position effect are shared between telomeric and silent mating-type loci in S. cerevisiae. Cell 66:1279-1287,1991. Gottschling, D.E.; Aparicio, O.M.; Billington, B.L.; Zakian, V.A. Position effect at S. cerevisiae telomees: re versible repression of Pol II transcription. Cell 63:751-762,1990. Henikoff, S. Position effect and related phenomena. Curr. Opin. Genet. Dev. 2:907-912,1992. Wilson, C.; Bellen, HJ.; Gehring, W.J. Position effects on eukaryotic gene expression. Annu. Rev. Cell Biol. 6:679-714,1990. 39. Dillon, N.; Grosveld, F. Transcriptional regulation of multigene loci: multilevel control. Trends Genet. 9:134-137,1993. Evans, T.; Felsenfeld, G.; Reitman, M. Control of globin gene transcription. Annu. Rev. Cell Biol. 6:95-124, 1990. Grosveld, F.; Antoniou, M.; Berry, M.; et al. The regula tion of human globin gene switching. Philos. Trans. R. Soc. Lond. (Biol.) 339:183-191,1993. Minie, M.; Clark, D.; Trainor, C.; et al. Developmental regulation of globin gene expression. /. Cell Sci. 16 (Suppl.):15-20,1992. 40. Ausio, J. Structure and dynamics of trancriptionally ac tive chromatin./. Cell Sci. 102:1-5,1992. Freeman, L.A.; Garrard, W.T. DNA supercoiling in chro matin structure and gene expression. Crit. Rev. Eukar. Gene Express. 2:165-209,1992. Hsieh, T.S. DNA tipoisomerases. Curr. Opin. Cell Biol. 4:396-400,1992. Wang, J.C. DNA topoisomerases: why so many? J. Biol. Chem. 266:6659-6662,1991. Svaren, J.; Chalkley, R. The structure and assembly of active chromatin. Trends Genet. 6:52-56,1990. 41. Gene expression and differentiation. Curr. Opin. Genet. Dev. 2:197-303,1992. 42. Berg, D.E.; Howe, M.M., eds. Mobile DNA. Washington, DC: American Society for Microbiology, 1989. Johnson, R.C. Mechanism of site-specific DNA inver sion in bacteria. Curr. Opin. Genet. Dev. 1:404-411, 1991. Meyer, T.F.; van Putten, J.P. Genetic mechanisms and biological implications of phase variation in pathoge nic neisseriae. Clin. Microbiol. Rev. 2 (Suppl.) :S139S145,1989. Pillus, L. An acquired state: epigenetic mechanisms in transcription. Curr. Opin. Cell Biol. 4:453-458,1992. Prescott, D.M. DNA gains, losses, and rearrangements in eukaryotes. Dev. Biol. 6:13-29,1989. Robertson, B.D.; Meyer, T.F. Genetic variation in patho genic bacteria. Trends Genet. 8:422-427,1992. van de Putte, P.; Goosen, N. DNA inversions in phages and bacteria. Trends Genet. 8:457-462,1992. 43. Dolan, J.W.; Fields, S. Cell-type-specific transcription in yeast. Biochim. Biophys. Acta 1088:155-169,1991. Herskowitz, I. A regulatory hierarchy for cell specializa tion in yeast. Nature 342:749-757,1989.
503
44.
45.
46.
47.
48.
49.
Johnson, A. A combinatorial regulatory circuit in bud ding yeast. In Transcriptional Regulation (S.L. Mc Knight, K.R. Yamamoto, eds.). Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1992. Ptashne, M. A Genetic Switch, 2d ed. Cambridge, MA: Cell Press and Blackwell Press, 1992. Ptashne, M.; Jeffrey, A.; Johnson, A.D.; et al. How the X repressor and Cro work. Cell 19:1-11, 1980. Scott, M.P.; O’Farrell, P.H. Spatial programming of gene expression in early Drosophila embryogenesis. Annu. Rev. Cell Biol. 2:49-80,1986. Braun, T.; Rudnicki, M.A.; Arnold, H.-H.; Jaenisch, R. Targeted inactivation of the muscle regulatory gene Myf-5 results in abnormal rib development and peri natal death. Cell 71:369-382, 1992. Hasty, P.; Bradley, A.; Morris, J.H.; et al. Muscle defi ciency and neonatal death in mice with a targeted mutation in the myogenin gene. Nature 364:501-506, 1993. Miller, J.B.; Everitt, E.A.; Smith, T.H.; Block, N.E.; Dominov, J.A. Cellular and molecular diversity in skeletal muscle development: news from in vitro and in vivo. Bioessays 15:191-196,1993. Nabeshima, Y.; Hanaoka, K.; Hayasaka, M.; et al. Myo genin gene disruption results in perinatal lethality because of severe muscle defect. Nature 364:532-535, 1993. Weintraub, H.; Davis, R.; Tapscott, S.; et al. The myoD gene family: nodal point during specification of the muscle cell lineage. Science 251:761-766, 1991. Buckingham, M. Making muscle in mammals. Trends Genet. 8:144-149, 1992. García-Bellido, A. Homeotic and atavie mutations in in sects. Am. Zool. 17:613-629, 1977. Giere, A. Molecular models and combinatorial princi ples in cell differentiation and morphogenesis. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 38:951-961, 1974. Johnson, P.F.; McKnight, S.L. Eukaryotic transcriptional regulatory proteins. Annu. Rev. Biochem. 58:799-839, 1989. Sprague, G.F., Jr. Combinatorial associations of regula tory proteins and the control of cell type in yeast. Adv. Genet. 27:33-62,1990. Ballabio, A.; Willard, H.F. Mammalian X-chromosome inactivation and the XIST gene. Curr. Opin. Genet. Dev. 2:439-447,1992. Lyon, M.F. X-inactivation: controlling the X chromoso me. Curr. Biol. 3:242-244,1993. Lyon, M.F. Epigenetic inheritance in mammals. Trends Genet. 9:123-128,1993. Lyon, M.F. Some milestones in the history of X-chromosome inactivation. Annu. Rev. Genet. 26:17-28, 1992. Riggs, A.D.; Pfeiffer, G.P. X-chromosome inactivation and cell memory. Trends Genet. 8:169-174,1992. Eissenberg, J.C. Position effects variegation in Drosophi la: towards a genetics of chromatin assembly. Bioes says 11:14-17,1989. Henikoff, S. Position-effect variegation after 60 years. Trends Genet. 6:422-426,1990. Barras, F.; Marinus, M.G. The great GATC: DNA methylation in £. coli. Trends. Genet. 5:139-143,1989. Holliday, R. Epigenetic inheritance based on DNA methylation. Exs 64:452-468, 1993.
504
Capítulo 9 : El control de la expresión gènica
50. Bird, A. The essentials of DNA methylation. Cell 70:5-8, 1992. Cedar, H. DNA methylation and gene activity. Cell 53:34,1988. Graessmann, M.; Graessmann, A. DNA methylation, chro matin structure and the regulation of gene expres sion. Exs 64:404-424,1993. Tate, P.H.; Bird, A.P. Effects of DNA methylation on DNA-binding proteins and gene expression. Curr. Opin. Genet. Dev. 3:226-231,1993. 51. Bird, A.P. Genomic imprinting: imprints on islands. Curr. Biol. 3:275-277,1993. Haig, D.; Graham, C. Genomic imprinting and the strange case of the insulin-like growth factor II recep tor. Cell 64:1045-1046, 1991. Li, E.; Bestor, T.H.; Jaenisch, R. Targeted mutation of the DNA methyltransferase gene results in embryonic lethality. Cell 69:915-926, 1992. Sasaki, H.; Allen, N.D.; Surani, M A DNA methylation and genomic imprinting in mammals. Exs 64:469-486,1993. 52. Antequera, F.; Bird, A. CpG islands. Exs 64:169-185,1993. 53. Jones, K.A. HIV frans-activation and transcriptional control mechanisms. New Biol. 1:127-135, 1989. Landrick, R.; Yanofsky, C. Transcription attenuation. In Escherichia coli and Salmonella typhimurium: Cellu lar and Molecular Biology (F.C. Neidhart, J.L. Ingra ham, K.B. Low, et al. eds.), Vol. 2, pp. 1276-1301. Washington, DC: American Society for Microbiology, 1987. Yanofsky, C. Operon-specific control by transcription attenuation. Trends Genet. 3:356-360,1987. 54. Black, D.L. Activation of c-src neuron-specific splicing by an unusual RNA element in vivo and in vitro. Cell 69:795-807,1992. Green, M.R. Biochemical mechanisms of constitutive and regulated pre-mRNA splicing. Annu. Rev. Cell Biol. 7:559-599,1991. Rio, D.C. RNA binding proteins, splice site selection, and alternative pre-mRNA splicing. Gene Express. 2:1-5,1992. 55. Baker, B.S. Sex in flies: the splice of life. Nature 340:521524,1989. 56. Peterson, M.L. Balanced efficiencies of splicing and cleavage-polyadenylation are required for mu-s and mum mRNA regulation. Gene Express. 2:319-327,1992. 57. Beadle, G. Genes and the chemistry of the organism. Am. Sci. 34:31-53,1946. 58. Izaurralde, E.; Mattaj, I.W. Transport of RNA between nucleus and cytoplasm. Semin. Cell Biol. 3:279-288, 1992. Maquat, L.E. Nuclear mRNA export. Curr. Opin. Cell Biol. 3:1004-1012,1991. 59. Davis, I.; Ish-Horowicz, D. Apical localization of pairrule transcripts requires 3' sequences and limits pro tein diffusion in the Drosophila blastoderm embryo. Cell 67:927-940,1991. Kislauskis, E.H.; Singer, R.H. Determinants of mRNA lo calization. Curr. Opin. Cell Biol. 4:975-978,1992. 60. Agabian, N. Trans splicing of nuclear pre-mRNAs. Cell 61:1157-1160, 1990. Chan, L. RNA editing: exploring one mode with apolipoprotein B mRNA. Bioessays 15:33-41,1993.
Sloof, P.; Benne, R. RNA editing in trypanosome mito chondria: guidelines for models. FEBS Lett. 325:146151,1993. Sollner-Webb, B. RNA editing. Curr. Opin. Cell Biol. 3:1056-1061,1991. 61. Fouillot, N.; Tlouzeau, S.; Rossignol, J.-M.; Jean-Jean, O. Translation of the hepatitis B virus P gene by ribosomal scanning as an alternative to internal initiation. /. Virol. 67:4886-4895,1993. Lindahl, L.; Hinnebusch, A Diversity of mechanisms in the regulation of translation in prokaryotes and lower eukaryotes. Curr. Opin. Genet. Dev. 2:720-726,1992. Oh, S.K.; Sarnow, P. Gene regulation: translational ini tiation by internal ribosome binding. Curr. Opin. Ge net. Dev. 3:295-300,1993. 62. Hinnebusch, A.G. Involvement of an initiation factor and protein phosphorylation in translational control of GCN4mRNA. Trends Biochem. Sci. 15:148-152,1990. Rhoads, R.E. Regulation of eukaryotic protein synthesis by initiation factors./. Biol. Chem. 268:3017-3020,1993. Sarre, T.F. The phosphorylation of eukaryotic initiation factor 2: a principle of translational control in mam malian cells. Biosystems 22:311-325,1989. 63. Melefors, O.; Hentze, M.W. Translational regulation by mRNA/protein interactions in eukaryotic cells: ferri tin and beyond. Bioessays 15:85-90,1993.
Bibliografía
64. Sachs, A.B. Messenger RNA degradation in eukaryotes. Cell 74:413-421,1993. Theil, E.C. Regulation of ferritin and transferrin recep tor mRNAs./. Biol. Chem. 265:4771-4774,1990. 65. Marzluff, W.F. Histone 3' ends: essential and regulatory functions. Gene Express. 2:93-97,1992. 66. Wickens, M. In the beginning is the end: regulation of poly(A) addition and removal during early develop ment. Trends Biochem. Sci. 15:320-324,1990. 67. Bock, A ; Forchhammer, K.; Heider, J.; Baron, C. Seleno protein synthesis: an expansion of the genetic code. Trends Biochem. Sci. 16:463-467,1991. Hatfield, D.; Oroszlan, S. The where, what and how of ribosomal frameshifting in retroviral protein synthesis. Trends Biochem. Sci. 15:186-190,1990. Weiss, R.B. Ribosomal frameshifting, jumping and readthrough. Curr. Opin. Cell Biol. 3:1051-1055,1991. 68. Eguchi, Y.; Itoh, T.; Tomizawa, J. Antisense RNA. Annu. Rev. Biochem. 60:631-652,1991. Noller, H.F.; Hoffarth, V.; Zimniak, L. Unusual resistan ce of peptidyl transferase to protein extraction proce dures. Science 256:1416-1419,1992. Weiner, A.M. mRNA splicing and autocatalytic introns: distant cousins or the products of chemical determi nism? Cell 72:161-164,1993.
505
Organización interna de la célula 10 E stru ctu ra de la m em b ran a : T ran sp orte de m oléculas pequeñas a través de la m em b ran a y base iónica de la excitabilidad de la m em b ran a 2 C om partim ientos intracelulares y clasificación de proteínas 13 Tráfico vesicular m ediante las ru tas se creto ra y end ocítica 14 Conversión energética: m itocondrias y cloroplastos 15 Transm isión de señales en tre células
16 El citoesqueleto El ciclo de división celular
18 Los m ecan ism os de la división celular
Electronmicrografía de vesículas sencillas y recubiertas de la cara interna de la membrana plasmática de una célula hepática de ratón. También se pueden observar numerosos filamentos de queratina. (De N. HirokawayJ. Heuser, Cell 30:395-406,1982.)
Simulación por ordenador de una bicapa de fosfolípidos de 0,8 nm en el agua. Los átomos de fósforo se muestran en verde, los de nitrógeno en azul oscuro, los de oxígeno lipídico en rojo, los grupos terminales de las cadenas en magenta y otros átomos de carbono en gris; los átomos de hidrógeno del carbono se han omitido. Las moléculas de agua se muestran en amarillo (oxígeno) y blanco (hidrógeno). (De R.M. Venable, Y. Zhang, B.J. Hardyy R.W. Pastor, Science262:223-228,1993.)
Estructura de la membrana
1 0 1.a bicapa lipidica Proteínas de membrana
Las membranas celulares son cruciales para la vida celular. La membrana plasmá tica rodea a la célula, definiendo su extensión y manteniendo las diferencias esen ciales entre el contenido de la célula y su entorno. Dentro de la célula eucariota, las membranas del retículo endoplásmico, del complejo de Golgi, de las mitocondrias y de otros orgánulos delimitados por membrana mantienen las diferencias carac terísticas entre los contenidos de cada orgánulo y el citosol. Los gradientes iónicos que se establecen a través de las membranas, generados por la actividad de proteí nas de membrana especializadas, pueden ser usados para sintetizar ATP, dirigir el movimiento transmembranoso de solutos seleccionados o, en células nerviosas y musculares, para producir y transmitir señales eléctricas. En todas las células, la membrana plasmática contiene también proteínas que actúan como sensores de señales externas, permitiendo que la célula cambie en respuesta a indicaciones ambientales; estas proteínas sensoras, o receptores, transfieren información, en lu gar de iones o de moléculas, a través de la membrana. Aunque realicen diferentes funciones, todas las membranas biológicas tie nen una estructura básica común: una finísima capa de moléculas lipídicas y proteicas, que se mantienen unidas fundamentalmente por interacciones no covalentes. Las membranas celulares son estructuras dinámicas, fluidas y la mayo ría de sus moléculas son capaces de desplazarse en el plano de la membrana.
Figura 10-1 Tres visiones de una membrana celular. (A) Electronmicrografía de una membrana plasmática (de un eritrocito humano) en sección transversal. (B y C) Dibujos esquemáticos que muestran en dos y tres dimensiones la membrana celular. (A, por cortesía de Daniel S. Friend.)
5 nm bicapa lipidica
(A)
molécula de proteina
(B)
molécula de lípido
molécula de proteína (C)
509
Las moléculas lipídicas están dispuestas en forma de una doble capa continua de unos 5 nm de grosor (Figura 10-1). Esta bicapa lipídica constituye la estructu ra básica de la m em brana y actúa de barrera relativamente impermeable al paso de la mayoría de moléculas hidrosolubles. Las moléculas proteicas, que normal m ente se hallan "disueltas” en la bicapa lipídica, median la mayoría del resto de funciones de la membrana, por ejemplo transportando moléculas específicas a través de ella o catalizando reacciones asociadas a la membrana, como la sínte sis de ATP. Algunas proteínas de mem brana actúan de eslabones estructurales que relacionan la m em brana plasmática con el citoesqueleto y/o con la matriz extracelular de las células adyacentes, mientras que otras proteínas actúan como receptores que reciben y transducen las señales químicas procedentes del entorno celular. Como podría esperarse, las membranas son estructuras asim é tricas: la com posición lipídica y proteica de sus caras interna y externa es dife rente reflejando las diferentes funciones realizadas por ambas superficies. En este capítulo consideraremos la estructura y la organización de los dos constituyentes principales de las m embranas biológicas -lo s lípidos y las proteí nas. Si bien prestaremos especial atención a la membrana plasmática, muchos de los conceptos son aplicables a las membranas internas. Las funciones de las membranas celulares se considerarán posteriormente. Su papel en la síntesis del ATP será discutido en el Capítulo 14; su papel en el transporte transmembranoso de pequeñas moléculas, en el Capítulo 11 y su papel en la transmisión celular de señales y en la adhesión celular, en los Capítulos 15 y 19. En los Capítulos 12 y 13 se discutirán las características de las m embranas internas de la célula (endomembranas) y el tráfico de proteínas a través y entre ellas.
La bicapa lipídica1 La bicapa lipídica ha sido establecida como la base universal de la estructura de la membrana celular. Es fácil de observar en una electronmicrografía convencio nal, aunque son necesarias técnicas especializadas, como difracción de rayos X y técnicas de criofractura, para revelar los detalles de su organización. La estructura en bicapa puede atribuirse a las propiedades especiales de las moléculas lipídicas, que hacen que dichas moléculas se ensamblen espontáneamente formando bicapas, incluso en sencillas condiciones artificiales.
Los lípidos de las membranas son moléculas antipáticas que espontáneamente forman bicapas1 Las moléculas lipídicas son insolubles en agua pero se disuelven fácilmente en disolventes orgánicos. Constituyen aproximadamente un 50 % de la masa de la mayoría de las membranas plasmáticas de las células animales, siendo casi todo el resto proteínas. Existen unas 5 x 106 moléculas lipídicas en una sección de bi capa lipídica de 1 |a.m x 1 |im, o aproximadamente 109 moléculas lipídicas en la m em brana plasmática de una célula animal pequeña. Todas las moléculas lipídi cas en las membranas celulares son anfipáticas (o anfifílicas) -e s decir, tienen un extremo hidrofílico ("que se siente atraído por el agua” o polar) y un extremo hidrofóbico (“que rehuye el agua” o no polar). Las más abundantes de estas molé culas son los fosfolípidos. Los fosfolípidos tienen una cabeza polar y dos colas hidrocarbonadas hidrofóbicas (Figura 10-2). Las colas suelen ser ácidos grasos, y pueden tener diferente longitud (normalmente contienen de 14 a 24 átomos de carbono). Normalmente una de las colas presenta uno o más dobles enlaces cis (es decir, es insaturada) mientras que la otra normalmente no tiene dobles enla ces (es decir, es saturada). Como se muestra en la Figura 10-2, cada doble enlace cis genera una suave curvatura en la cadena. Las diferencias de longitud y de gra do de saturación entre las colas hidrocarbonadas son importantes porque afec tan la capacidad de las moléculas de fosfolípidos para empaquetarse una contra otra y, por lo tanto, afectan la fluidez de la membrana (véase más adelante).
510
Capítulo 10: Estructura de la membrana
C O L IN A
grupo polar (hidrofílico) de la cabeza
1. 0 1 O—P—O“ [ 0 1 -C H — C H , I
I FO SFATO
I GU C ERO L
c
I I ' CH, I ‘ CH, I ‘
O
I I ' CH, I “ CH, I " CH,
CH2
CH,
CH,
CH,
CH,
CH,
CH,
CH
I I ' CH, I “
grupo no polar (hidrofóbico) de la cola
C=
CH,
CH,
I “ I " CH, I " CH
CH,
I ‘ I '
CH,
%
\
CH,
doble enlace
cis
\
CH, \ CH ,
\C'H , \ ‘
CH,
\C“H , \C-H , \C“H ,
CH,
I CH, I " CH, I CH, I “
\ ‘ CH,
CH,
(A )
(B)
(C)
Figura 10-2 Las zonas de una molécula de fosfolípido. La fosfatidilcolina, representada de forma esquemática (A), como fórmula química (B), como modelo espacial compacto (C) y en forma de símbolo (D). La curvatura debida al doble enlace cis está exagerada en los dibujos para hacerla más visible.
La forma y la naturaleza anfipática de las moléculas lipídicas es lo que deter mina que estas moléculas formen espontáneamente bicapas lipídicas en solu ción acuosa. Cuando las moléculas anfipáticas se encuentran rodeadas por to das partes por un ambiente acuoso, tienden a agregarse de tal manera que sus colas hidrofóbicas se esconden en el interior y sus cabezas hidrofílicas quedan expuestas al agua. Dependiendo de su forma, pueden conseguir esta disposi ción, de una de dos maneras: pueden formar micelas esféricas, con las colas ha cia el interior, o pueden formar láminas bimoleculares, o bicapas, con las colas hidrofóbicas escondidas entre dos capas de cabezas hidrofílicas (Figura 10-3). Debido a su forma cilindrica, la mayoría de los fosfolípidos de membrana for man espontáneamente bicapas en un entorno acuoso. Además, estas bicapas lipí dicas tienden a cerrarse sobre sí mismas formando compartimientos herméticos, eliminando así los bordes libres en los que las colas hidrofóbicas podrían estar en contacto con el agua. Por esta misma razón, los compartimientos formados por bi capas lipídicas tienden a cerrarse de nuevo después de haber sido rotos. Además de sus propiedades de autoensamblaje y de autosellado, una bicapa lipídica tiene otras características que hacen de ella una estructura ideal para constituir las membranas celulares. Una de las más importantes es su fluidez, que, como veremos, es crucial para muchas de sus funciones.
La bicapa lipídica es un fluido tridimensional2 Sorprendentemente, no fue hasta principios de los años 1970 que los investigadores reconocieron por primera vez que las distintas moléculas lipídicas pueden difundir libremente dentro de las bicapas lipídicas. La demostración inicial procede de unos estudios sobre bicapas lipídicas sintéticas. Dos tipos de estas bicapas sintéticas han
La bicapa lipídica
micela lipídica
*
agua
♦i bicapa lipídica
Figura 10-3 Micela de lípidos y bicapa lipídica vistas en sección transversal. Las moléculas de lípido forman, espontáneamente, estructuras como éstas en el agua. La forma de la molécula lipídica determina cuál de estas estructuras se forma. Las moléculas lipídicas en forma de cuña {arriba) forman micelas, mientras que las moléculas de fosfolípidos de forma cilindrica {abajo) forman bicapas.
511
resultado muy útiles en los estudios experimentales: ( 1) bicapas producidas en for ma de vesículas esféricas, denominadas liposomas, cuyo tamaño puede variar de 25 nm a 1 [im de diámetro según cual sea el sistema de preparación (Figura 10-4), y (2) bicapas planas, denominadas membranas negras, formadas a través de un agujero situado en una separación entre dos compartimientos acuosos (Figura 10-5). Se han utilizado diversas técnicas para medir el desplazamiento de las molé culas lipídicas y de sus diferentes regiones. Por ejemplo, se puede construir una molécula lipídica cuyo grupo de cabeza polar lleve una “marca de espín”, tal como un grupo nitroxilo (>N -0), que contiene un electrón desapareado cuyo es pín genera una señal paramagnética que se puede medir mediante espectrosco pia de resonancia de espín electrónico (ESR, de Electron Spin Resonance’). (Los principios de esta técnica son similares a los de la resonancia magnética nuclear, que se discuten en el Capítulo 4). Mediante el espectro ESR se puede medir el movimiento y la orientación de un lípido marcado dentro de una bicapa. Estos estudios demuestran que las moléculas de fosfolípido de las bicapas artificiales raramente migran de un lado a otro de la monocapa. Este proceso, denominado “flip-flop”, se produce menos de una vez al mes en cualquier molécula lipídica. Por otro lado, las moléculas lipídicas intercambian fácilmente su lugar con el de las moléculas vecinas dentro de una m onocapa (~107 veces por segundo). Ello da lugar a una rápida difusión lateral, con un coeficiente de difusión (D) de aproxi madamente lO-8 cm 2/segundo, lo cual significa que una molécula lipídica pro medio difunde la longitud de una gran célula bacteriana (~2 |¿m) en aproxima damente 1 segundo. Además, estos estudios indican que las moléculas lipídicas giran con gran rapidez alrededor de sus ejes longitudinales y que sus cadenas hidrocarbonadas son flexibles (Figura 10-6). Unos estudios similares han sido realizados con moléculas lipídicas m arca das, en m embranas biológicas aisladas y en células enteras relativamente senci llas com o micoplasmas, bacterias y glóbulos rojos (eritrocitos) anucleados. En general, los resultados de estos estudios son los mismos que los que se obtienen con bicapas artificiales, y demuestran que el componente lipídico de las m em branas biológicas es un líquido bidimensional en el que las moléculas constitu yentes son libres de moverse lateralmente; al igual que en las bicapas sintéticas, las moléculas de fosfolípido se hallan restringidas a su propia monocapa. Este confinam iento crea un problema para su síntesis. Los fosfolípidos son sintetiza dos sólo en una de las monocapas de la membrana, la cual se sintetiza principal mente en la m onocapa citosólica de la membrana del retículo endoplasmático (ER, de Endoplasmic Reticulum); si ninguna de estas moléculas recientemente formadas pudiera migrar hacia la otra mitad de la bicapa lipídica, no se podría formar más bicapa. Este problema se soluciona gracias a un tipo especial de en zimas unidas al ER llamadas translocadoras de fosfolípidos, que catalizan un rá pido flip-flop de fosfolípidos específicos desde la monocapa donde han sido sin tetizados hasta la m onocapa opuesta, como se discute en el Capítulo 12.
100 nm
(Ai
25 nm Figura 10-4 Liposomas. (A) E lectronm icrografía de vesículas de fosfolípidos (liposom as) en agua, sin fijar ni teñir. N ótese que la estructura bilam in ar de las vesículas es claram en te aparen te. (B) D ibujo de un pequeño liposom a esférico visto en secció n transversal. N orm alm ente los liposom as se utilizan com o m odelo de m em bran a en estudios experim entales. (A, por cortesía de Jean Lepault.)
difusión lateral
flip-flop (rara vez ocurre)
O bicapa lipídica (membrana negra) Figura 10-5 Representación en sección transversal de una bicapa lipídica sintética, denom inada m em brana negra. E sta b icap a planar se form a a través de un pequ eñ o agujero en u n a pared que separa dos com p artim iento s acu osos. Las m em branas negras se utilizan para m edir las propiedades de p erm eabilid ad de las m em bran as artificiales.
512
Capítulo 10: Estructura déla membrana
I
flexión
M
I
M
rotación
Figura 10-6 Movilidad de los fosfolípidos. Los tipos de m ovim ientos p osibles de las m olécu las de fosfolípido en un a b icap a lipídica.
La ñuidez de una bicapa lipídica depende de su composición3 La fluidez de las m embranas celulares es biológicamente importante. Algunos procesos de transporte y algunas actividades enzimáticas, por ejemplo, pueden detenerse cuando la viscosidad de la bicapa se incrementa experimentalmente mas allá de un nivel umbral. La fluidez de una bicapa lipídica depende tanto de su com posición como de la temperatura, como ha sido demostrado por estudios en bicapas sintéticas. Una bicapa sintética, producida a partir de un único tipo de fosfolípido, pasa de un estado líquido a un estado cristalino rígido (o gel) en un punto de congelación característico. Este cambio de estado recibe el nombre de transición de fase, y la temperatura a la que se produce es más baja (es decir, la mem brana resulta más difícil de congelar) si las cadenas hidrocarbonadas son cortas o tienen dobles enlaces cis. Una menor longitud de la cadena reduce la tendencia de las colas hidrocarbonadas a interaccionar entre sí, y los dobles en laces cis producen pliegues en las cadenas hidrocarbonadas que dificultan su empaquetamiento, de forma que las membranas permanecen fluidas a tem pe raturas más bajas (Figura 10-7). Bacterias, levaduras y otros organismos cuyas temperaturas varían con la de su entorno, controlan la composición de los áci dos grasos de sus lípidos de mem brana para mantener una fluidez relativamente constante; en caso de que la temperatura disminuya se sintetizan ácidos grasos con más dobles enlaces cis, de manera que evitan una pérdida de fluidez de la bicapa por efecto de la disminución de la temperatura. Sin embargo, la bicapa lipídica de muchas membranas celulares no está compuesta exclusivamente por fosfolípidos; habitualmente contienen además, colesterol y glucolípidos. Las membranas plasmáticas de eucariotas contienen cantidades especialmente elevadas de colesterol (Figura 10-8) -h asta una pro porción de más de una molécula de colesterol por cada molécula de fosfolípido. Las moléculas de colesterol refuerzan el carácter de barrera permeable de la b i capa lipídica. Se orientan en la bicapa con sus grupos hidroxilo próximos a las cabezas polares de las moléculas de fosfolípidos; sus anillos esteroides, planos y rígidos, interactúan con -y en parte inmovilizan- las regiones de las cadenas hi drocarbonadas que son más cercanas a los grupos polares de la cabeza, dejando el resto de la cadena más flexible (Figura 10-9). Al disminuir la movilidad de los primeros grupos CH2 de las cadenas hidrocarbonadas de las moléculas de fosfo lípidos, el colesterol hace a la bicapa lipídica más rígida en esta región y de ese modo disminuye la permeabilidad de la bicapa a moléculas solubles pequeñas. Aunque de esta manera el colesterol tiende a hacer menos fluidas las bicapas lipídicas, a las altas concentraciones en que se presenta en la mayoría de las membranas plasmáticas de eucariotas tam bién impide que las cadenas hidro carbonadas se junten y cristalicen. De esta manera, el colesterol inhibe posibles transiciones de fase.
(A)
La bicapa lipídica
• • • • •
• •
• •
• • • • •
•
cadenas hidrocarbonadas insaturadas con dobles enlaces cis
• • • • •
cadenas hidrocarbonadas saturadas rectas
Figura 10-7 Influencia de los dobles enlaces cis en las cadenas hidrocarbonadas. La presencia de
dobles enlaces hace más difícil el empaquetamiento de las cadenas, lo cual hace que la bicapa lipídica sea más difícil de congelar.
Figura 10-8 Estructura del colesterol.
La molécula de colesterol, representada mediante su fórmula (A), mediante un esquema (B) y mediante un modelo espacial compacto (C).
En la Tabla 10-1 se compara la composición lipídica de distintas membranas biológicas. Obsérvese que a menudo las membranas plasmáticas bacterianas es tán com puestas principalmente por un único tipo de fosfolípido y no contienen colesterol; la estabilidad m ecánica de estas membranas está asegurada por la pared celular que las recubre (véase Figura 11-14). Contrariamente, la com posi ción de la membrana celular de la mayoría de las células eucariotas es más va riada, conteniendo no sólo grandes cantidades de colesterol, sino también una mezcla de diferentes fosfolípidos. Cuatro grupos de fosfolípidos predominan en la membrana plasmática de muchas células de mamíferos: fosfatidilcolina, esfingomielina, fosfatidilserina y fosfatidiletanolamina. Las estructuras de estas moléculas se muestran en la Figura 10-10. Nótese que tan sólo la fosfatidilserina tiene una carga neta negativa, cuya importancia trataremos posteriormente; las otras tres moléculas son eléctricam ente neutras a pH fisiológico, presentando una carga negativa y otra positiva. En conjunto, estos cuatro fosfolípidos consti tuyen más de la mitad de la masa de lípidos de la mayoría de las membranas (véase Tabla 10-1). Otros fosfolípidos, tales como los fosfolípidos de inositol, son funcionalm ente importantes pero se hallan en cantidades relativamente peque ñas. En el Capítulo 15 se describe el papel crucial que desempeñan los fosfolípi dos de inositol en las señalización celular. Cabe preguntarse por qué la membrana plasmática eucariota contiene tal variedad de fosfolípidos, con grupos de cabeza que difieren en tamaño, forma y carga. Podemos empezar a comprender este porqué si pensamos en los lípidos de la m em brana como en un disolvente bidimensional de las proteínas de la membrana, al igual que el agua constituye un disolvente tridimensional para las proteínas en una solución acuosa. Como veremos, ciertas proteínas de m embra na únicam ente puedan actuar en presencia de grupos de cabeza de determina dos fosfolípidos, de la misma forma que muchas enzimas en solución acuosa re quieren un ion determinado para presentar actividad.
La bicapa lipídica es asimétrica4 En las m embranas plasmáticas que han sido analizadas, la composición lipídica de las dos mitades de la bicapa lipídica es m arcadamente diferente. En la m em brana del glóbulo rojo humano, la mayoría de las moléculas lipídicas que tienen colina -(C H 3)3N+CH2CH2OH- en su grupo de cabeza (que es, fosfatidilcolina y es-
Tabla 10-1 Composición lipídica aproximada de diferentes membranas celulares Porcentaje de lípido total en peso
'Cd
S cn JO "E, «3 G rt cd
X Ä
Lípido Colesterol Fosfatid il etan olam in a Fosfatidilserina Fosfatidilcolina Esfingom ielina Glucolipidos Otros
514
vcd £ iS a cd Ö cd
o
03 03 TD G 03 —, o3
£ , 6 0) S'
17
23
22
7 4 24 19 7
18 7 17 18 3 13
15 9
22
O£ Ü O + 5 £
3o 'S. o
3
6
0
17 5 40 5 trazas 27
70 trazas
35
2
10 8
39
28
trazas
8
Capítulo 10 : Estructura de la membrana
o 'c3 S C /3 O CO
0
21
• <3u -a c « a>
0 0 0
30
ifii w
grupos polares de cabeza región endurecida por el colesterol region más fluida
Figura 10-9 El colesterol en una bicapa lipídica. Dibujo esquemático de una molécula de colesterol interactuando con dos moléculas de fosfolípido en una de las láminas de una bicapa lipídica.
,o
Ci) \ H$
ÜKH;
CH_; I CH;
O
o O c= o c = o o co < oc O O o o < tu Q < O O
O
c h
2— C H — C H 2
O O c = o c= o O
c h
o co <
O Q O < UJ Q <
O o
O O
O O
O o
O o
O
OH 2
C H -- C H | CH
NH
CH
r
I
O co
O Q O '< 1X1 O <
fosfatidilserina
c h
O O c= o C==o cc o
o=
p— O O
2— -C H —
< oc CD o O O -< UJ Q <
fosfatidiletanolam ina
Ó
O
co < cc o O Q O < UJ O <
o
CH 2 CH;
!
í '~ 'i
1
O =
o (O < CC O o Q O ■< LU Q <
co < cc
• •
q
ó o, O O’
0= — o
0 = P — O O
2— C H — C H 2
CHj ch2
i
O ‘ P
CH3 L H ^ 1^ C H
(C->
H— C.— C..ÜO o ; l CHj
O
c h
CHì CH ^ l -CH
Figura 10-10 Cuatro de los principales fosfolípidos de las m em branas plasm áticas de las células de m am ífero. Obsérvese que
tanto en esta figura como en las siguientes, los diferentes grupos de la cabeza se representan mediante símbolos diferentes. Todas las moléculas lipídicas que se presentan derivan del glicerol excepto la esfingomielina que deriva de la serina.
I1
O co < ir
m w
fosfatidilcolina
< o Q Q.
O
UJ
O Q U < UJ o <
< O
O u
<£
H
esfingom ielina
fingomielina) se encuentran en la mitad exterior de la bicapa lipidica, mientras que la mayoría de moléculas de fosfolípido que contienen un grupo cimino pri mario terminal (fosfatidiletanolamina y fosfatidilserina) se hallan en la mitad in terior (Figura 10-11). Dado que la fosfatidilserina, de carga negativa, está locali zada en la m onocapa interior, existe una importante diferencia de carga entre las dos monocapas. La mayoría de las membranas de una célula eucariota, incluyendo la m em brana plasmática, se sintetizan en el retículo endoplasmático (ER) y es allí donde se genera la asimetría de los fosfolípidos por translocadores que trasladan especificamente moléculas de fosfolípidos de una monocapa a otra (se discute en el Capítulo 12). Esta asimetría lipidica puede ser funcionalmente importante. La enzima proteina quinasa C, por ejemplo, se activa en respuesta a variadas seña les extracelulares; se une a la cara citoplasmàtica de la membrana, donde se ha lla concentrada la fosfatidilserina, y requiere este fosfolípido cargado negativa mente para actuar. De modo similar los fosfolípidos de inositol se concentran en la cara citoplasmàtica de la mem brana plasmática de la célula eucariota. Estos fosfolípidos minoritarios son escindidos en dos fragmentos por enzimas especí ficas que son activadas por señales extracelulares. Ambos fragmentos actúan luego dentro de la célula como mensajeros solubles que permiten la difusión de la señal hacia el interior de la célula, como se discutirá en el Capítulo 15.
ESPACIO EXTRACELULAR
T rT tíT H H tT CITOSOL La bicapa lipídica
Figura 10-11 La distribución asim étrica de los fosfolípidos y de los glucolípidos en la bicapa lipídica de los glóbulos rojos hum anos. Los
símbolos utilizados para los fosfolípidos son los introducidos en la Figura 10-10. Además, los glucolípidos se han dibujado con grupos de cabeza polar de forma hexagonal (azul). Se cree que el colesterol (no dibujado) se distribuye casi a partes iguales en ambas monocapas.
En la superfìcie de todas las m em brana plasmáticas hay glucolípidos5 Las moléculas lipídicas que presentan una asimetría más marcada en cuanto a su distribución en las mem branas celulares son las moléculas lipídicas que contienen azúcares denominadas g lu co líp id o s. Estas asombrosas moléculas se encuentran exclusivamente en la mitad no citoplasmàtica de la bicapa lipidica, donde al parecer se autoasocian formando microagregados mediante la form a ción de enlaces de hidrógeno entre ellas. En la m em brana plasmática sus gru pos azúcar quedan al descubierto en la superficie de la célula (Figura 10-11), lo cual sugiere que deben desempeñar alguna función en las interacciones de la célula con su entorno. La distribución asim étrica de los glucolípidos en la bica pa resulta de la adición de grupos azúcar a las moléculas lipídicas en el lumen del com plejo de Golgi, el cual es topográficamente equivalente al exterior de la célula (se discute en el Capítulo 13). Los glucolípidos se presentan probablemente en las membranas plasmáti cas de todas las células animales, constituyendo aproximadamente un 5% de las moléculas lipídicas de la m onocapa exterior. Además se encuentran en algunas membranas intracelulares. Los glucolípidos más complejos, los g an g lió sid o s, contienen oligosacáridos con uno o más residuos de ácido siálico, lo que les pro porciona una carga neta negativa (Figura 10-12). Los gangliósidos son más abundantes en la mem brana plasmática de las células nerviosas, en donde cons tituyen aproximadamente un 5-10% de la masa lipidica total, aunque también se encuentran en casi todos los tipos celulares en cantidades mucho más reduci das. Hasta el momento se han identificado más de 40 gangliósidos diferentes. Por ahora no se dispone más que de indicios acerca de cuáles podrían ser las funciones de los glucolípidos. Una posible pista procede de su localización: en la m embrana plasmática de las células epiteliales, por ejemplo, los glucolípidos se encuentran confinados en la superficie apical, donde podrían ayudar a proteger la m em brana de las condiciones adversas que frecuentemente existen allí (como pH bajo y enzimas degradativas). Los glucolípidos con carga, como los gangliósi dos, pueden tener im portancia debido a sus efectos eléctricos: su presencia alte raría el campo eléctrico a través de la membrana y la concentración de iones -especialm ente Ca2+- en su superficie externa. Los glucolípidos pueden también
Gal J—káalNAcj
|n A N A )-I Gal J
[O le ]
OH
O
I
I
CH — C H — C H 2 CH
II
CH
(A) galactocerebrósido
516
NH
I
C— O
(B) gangliósido G mi
Capítulo 10 : Estructura de la membrana
(C) ácido siálico (NANA)
Figura 10-12 M oléculas de glucolípidos. Los galactocerebrósidos (A) son llamados g lu colíp id os neutros porque el azúcar que forma su grupo de cabeza no está cargado. Un gangliósido (B) siempre contiene uno o más residuos de ácido siálico (también llamado ácido iV-acetil neuramínico o NANA) cargados negativamente, cuya estructura se muestra en (C). Mientras que en bacterias y en plantas casi todos los glucolípidos derivan del glicerol, como la mayoría de fosfolípidos, en las células animales casi siempre se generan a partir de esfingosina, un alcohol amino derivado de la serina, com o en el caso del fosfolípido esfingomielina (véase Figura 10-10). Gal = galactosa; Glc = glucosa, GalNAc = Af-acetil galactosamina; estos tres azúcares no están cargados.
desempeñar un papel en el aislamiento eléctrico, ya que se hallan en gran canti dad en la mitad no citoplasmática de la bicapa de la membrana mielínica, que aísla eléctricamente los axones de la célula nerviosa. Además se cree que desem peñan alguna función en los procesos de reconocimiento celular. El gangliósido GM1 (véase Figura 10-12), por ejemplo, actúa como receptor de superficie celular para la toxina bacteriana que provoca la diarrea debilitante del cólera. La toxina del cólera únicamente se fija y penetra en aquellas células que tienen G M1 en su superficie, incluidas las células del epitelio intestinal. Su ingreso en la célula pro voca un incremento prolongado de la concentración intracelular de AMP cíclico (se discute en el Capítulo 15), la cual genera, en el intestino, un gran eflujo de Na+ y de agua. Aunque la fijación de las toxinas bacterianas no puede ser la función normal de los gangliósidos, estas observaciones sugieren que estos glucolípidos también pueden actuar como receptores de moléculas extracelulares habituales. Esta suposición se apoya en la evidencia creciente de que los glucolípidos pue den ayudar a las células a unirse a la matriz extracelular y a otras células, como discutiremos más adelante.
Resumen Las membranas biológicas están formadas por una doble capa continua de molé culas lipidicas, en la que están inmersas varias proteínas de membrana. Esta bica pa lipídica es fluida, y las distintas moléculas lipidicas pueden difundir rápida mente dentro de su propia monocapa. La mayoría de las moléculas lipidicas, sin embargo, casi nunca realizan deform a espontánea flip-flop de una monocapa a la otra. Las moléculas lipidicas de las membranas son anfipáticas y algunas de ellas (losfosfolípidos), cuando se colocan en agua, se unen espontáneamente entre sífo r mando bicapas; las bicapasforman compartimientos cerrados que tienen una gran tendencia a volverse a unir si se rompen. Existen tres clases principales de molécu las lipidicas de membrana -los fosfolípidos, el colesterol y los glucolípidos- y la composición lipídica de la monocapa externa es diferente a la de la interna, lo que refleja las diferentes funciones de las dos caras de una membrana celular. En las membranas plasmáticas de los diferentes tipos de células, al igual que en los diver sos compartimientos membranosos internos de las células eucariotas, se presentan diferentes mezclas de lípidos. Algunas proteínas unidas a la membrana necesitan lípidos con grupos polares específicos para actuar, lo que al parecer explicaría, al menos en parte, por qué las membranas eucariotas contienen tipos tan diversos de moléculas lipidicas.
Proteínas de membrana6 Aunque la estructura básica de las membranas biológicas está determinada por la bicapa lipídica, la mayoría de sus funciones específicas están desempeñadas por proteínas. Por consiguiente, la cantidad y el tipo de proteínas de una m em brana son muy variables: en la vaina de mielina, cuya función principal consiste en aislar los axones nerviosos, m enos de un 25% de la masa de la mem brana es proteína, mientras que en las membranas dedicadas a la transducción energéti ca (tales como las m embranas internas de las mitocondrias y de los cloroplastos) aproximadamente un 75% de su masa es proteína. La mem brana plasmática normal está situada entre ambos extremos, con aproximadamente un 50% de la masa total en forma de proteína. Debido a que las moléculas lipidicas son pe queñas en comparación con las proteicas, en todos los casos hay más moléculas lipidicas que proteicas -alrededor de 50 moléculas de lípidos por cada molécula de proteína en una mem brana que contenga un 50% de proteína en masa. Como los lípidos de membrana, es común que las proteínas de membrana lleven ado sadas cadenas de oligosacáridos. Así la superficie que la célula presenta al exte rior posee una gran cantidad de carbohidratos, lo que forma un glucocáliz o cu bierta celular (discutido más adelante). Proteínas de membrana
517
Las proteínas de m em brana pueden estar asociadas a la bicapa lipidica de varias m aneras7 Las distintas proteínas de membrana están asociadas a las membranas de dife rentes maneras, como se ilustra en la Figura 10-13. Muchas proteínas de m em brana atraviesan la bicapa lipidica, de forma que parte de su masa se sitúa a cada lado de la mem brana (ejemplos 1 y 2 de la Figura 10-13). Como sus vecinas lipídicas, estas proteínas transm em brana son antipáticas, tienen regiones que son hidrofóbicas y regiones hidrofílicas. Las regiones hidrofóbicas se sitúan en el interior de la m em brana y se relacionan con las colas hidrofóbicas de las molé culas lipídicas del interior de la bicapa. Las regiones hidrofílicas se hallan ex puestas al medio acuoso de ambos lados de la membrana. El carácter hidrofóbico de algunas de estas proteínas aumenta por la unión covalente de una o más cadenas de ácido graso que se encuentren insertadas en la mitad citoplasmàtica de la bicapa (véase el ejemplo 1 de la Figura 10-13). Otras proteínas de m embra na se localizan en el citosol y se asocian con la bicapa tan sólo a través de una o más cadenas de ácidos grasos a las que están unidas covalentemente, o por otro tipo de cadenas lipídicas llamadas grupos prenil (véase el ejemplo 3 de la Figura 10-13 y la Figura 10-14). Existen otras proteínas completamente expuestas a la superficie celular externa, ancladas a la bicapa únicamente por medio de una unión covalente (vía un oligosacárido específico) al fosfatidilinositol de la monocapa lipidica externa de la m em brana plasmática (véase el ejemplo 4 de la Figura 10-13). Las proteínas unidas a lípidos del ejemplo 3 se han generado como pro teínas solubles en el citosol y posteriormente se han trasladado directamente hacia las mem branas uniéndolas covalentemente a un grupo lipidico (Figura 1014). Las proteínas del ejemplo 4, sin embargo, se sintetizan como proteínas transm em brana de “paso único” en el ER; mientras permanecen en el ER, el seg mento transm em branoso de la proteína se escinde y se le añade un glucosilfosfatidilinositol (GPI, de glycosylphosphatidylinositol), de forma que la proteína queda unida a la superficie no citoplasmàtica de la membrana sólo por medio de este anclaje (véase Capítulo 12). Las proteínas que se unen a la membrana con un GPI de anclaje se distinguen fácilmente mediante el uso de la enzima fosfolipasa C específica para fosfatidilinositol, que separa específicamente estas proteínas de sus anclajes, separándolas así de la membrana. Algunas proteínas que no ocupan totalmente el interior hidrofóbico de la bi capa lipidica están unidas a una u otra cara de la membrana mediante interac ciones no covalentes con otras proteínas de membrana (véanse los ejemplos 5 y 6 de la Figura 10-13). Muchas de ellas pueden ser liberadas de la membrana m e diante procedimientos de extracción relativamente suaves, como la exposición a
bicapa lipidica
© 518
©
Capítulo 10 : Estructura de la membrana
Figura 10-13 Seis sistemas de asociación de las proteínas con la m em brana lipídica. Se cree que la mayoría de proteínas transm embrana atraviesan la bicapa com o una hélice a única ( 1 ) o en forma de múltiples hélices a (2 ); algunas de estas proteínas de “paso único” y de “paso múltiple” están unidas covalentemente a cadenas de ácidos grasos insertados en la monocapa citoplasmática (1). Otras proteínas de membrana están unidas a la membrana únicam ente a través de su unión covalente a un lípido, como una cadena de ácido graso o un grupo prenil de la m onocapa citoplasmática (3) o bien, menos habitualm ente, a través de un oligosacárido a un fosfolípido minoritario, el fosfatidilinositol, en la m onocapa nocitoplasmática (4). Finalmente, muchas proteínas están unidas a la m embrana tan sólo mediante interacciones no covalentes con otras proteínas de membrana (5) y (6 ). En la Figura 10-14 se ilustra cómo se forma la estructura de (3). Los detalles de estos diversos sistemas a través de los cuales las proteínas de m em brana se asocian con la bicapa lipídica, se discuten en el Capítulo 12.
(A)
proteína unida a la m em brana por una cadena de ácido graso
(B)
proteína unida a la m em brana por un grupo prenil
CH3
CITOSOL
=o
enlace am ida entre un grupo am ino term inal y un ácido graso
enlace tioéter entre una cisterna y un grupo prenil
bicapa lipidica
O
c —O(C) anclaje m iristil
(D) anclaje farnesil
Figura 10-14 La unión covalente de cualquiera de los dos tipos de grupos lipídicos puede ayudar a localizar una proteína soluble dentro de una membrana, después de su síntesis en el citosol. (A) Una cadena de ácido graso (mirístico o palmítico) se une a un grupo amino terminal de una glicina por medio de un enlace amida. (B) Un grupo prenil (sea farnesil o un grupo geranilgeranil más largo -ambos relacionados con el colesterol) se halla unido, mediante un enlace tioéter, a un residuo cisteína situado a cuatro residuos del carboxilo terminal. Tras esta prenilación, los tres aminoácidos terminales son separados de la cadena y el nuevo carboxilo terminal se metila antes de ser insertado en la membrana. Las estructuras de los dos lípidos que sirven de anclaje, se ilustran en la parte inferior: (C) un anclaje miristil (una cadena de ácido graso saturado de 14 carbonos), y (D) un anclaje farnesil (una cadena hidrocarbonada insaturada de 15 carbonos).
soluciones de muy alta o baja fuerza iónica o de pH extremo, que interfieren con las interacciones proteicas pero mantienen intacta la bicapa lipídica. De manera operacional a estas proteínas se les denomina proteínas periféricas de m em brana. Por el contrario las proteínas transmembrana, varias proteínas unidas a la bicapa por cadenas de ácidos grasos y algunas otras proteínas íntimamente unidas a la m embrana, no pueden ser liberadas por estos métodos, por lo que se les denomina proteínas integrales de membrana. Habitualmente la manera en que una proteína se asocia a la bicapa lipídica es un indicativo de la función de la proteína. Así, sólo las proteínas transm em brana pueden actuar en ambos lados de la bicapa o transportar moléculas a tra vés de ella. Algunos receptores celulares de superficie, por ejemplo, son proteí nas transm em brana que se unen a las moléculas señal en el espacio extracelular y generan diferentes señales intracelulares en el lado opuesto de la membrana plasmática. Por el contrario, las proteínas que sólo actúan en un lado de la b ica pa lipídica, generalmente están asociadas con la m onocapa lipídica o con el do minio proteico de aquel lado de la membrana. Por ejemplo, un grupo de proteí nas relacionadas con la señalización intracelular están unidas a la cara citosólica de la m em brana plasmática por uno o más grupos lipídicos a los que están covalentem ente unidas.
Se considera que, en la mayoría de proteínas transm em brana, las regiones de la cadena polipeptídica que cruzan la bicapa lipídica presentan una conform ación en hélice a 6,8 Una proteína transmembrana se orienta siempre en un único sentido dentro de la membrana. Este hecho refleja tanto la asimetría del sistema mediante el cual la proteína se ha sintetizado e insertado en la bicapa lipídica en el ER, como la diferencia entre las funciones que desempeñan los dominios citoplasmático y no citoplasmático de la proteína. Estos dominios están separados por segmentos de la cadena polipeptídica que atraviesan la membrana, se hedían en contacto con el ambiente hidrofóbico de la bicapa lipídica y están compuestos, en gran parte, por residuos de aminoácidos de cadena lateral no polar. Debido a que las uniones peptídicas son en sí mismas polares y dado que el agua no está presente
Proteínas de membrana
519
en este ambiente, todas las uniones peptídicas pertenecientes a la porción de la cadena embebida en la bicapa tienden a formar enlaces de hidrógeno entre sí. Este tipo de uniones se maximiza si la cadena polipeptídica forma una hélice a re gular al cruzar la bicapa; se cree que la mayoría de los segmentos de las cadenas polipeptídicas que atraviesan la membrana se hallan en esta conformación (Figu ra 10-15): en las p ro te ín a s tr a n s m e m b ra n a d e p a so ú n ico la cadena polipeptídica cruza una sola vez (véase el ejemplo 1 de la Figura 10-13), mientras que en las p ro te ín a s tr a n s m e m b ra n a d e m u ltip a so la cadena polipeptídica cruza múltiples veces la bicapa (véase el ejemplo 2 de la Figura 10-13). Una manera alternativa de que las uniones peptídicas puedan satisfacer sus requerimientos de enlaces de hi drógeno es que las múltiples hebras transmembrana de la cadena polipeptídica se dispongan en lámina P formando un “barril cerrado” (denominado barril p).
(A) GLUCOFORINA
(B) BACTERIORRODOPSINA COOH
0
0
50 100 núm ero de am inoácido
100
núm ero de am inoácido
200
Figura 10-16 Localización en una cadena polipeptídica, mediante el uso de gráficos de hidropatía, de potenciales segmentos en hélice a que atraviesan la membrana. La energía libre necesaria para transferir segmentos sucesivos de una cadena polipeptídica de un solvente no polar al agua se calcula a partir de la composición aminoacídica de cada segmento usando los datos de un modelo de componentes. Estos cálculos se realizan para segmentos de un tamaño fijo, (usualmente alrededor de 10 residuos de aminoácidos), comenzando con cada aminoácido sucesivo de la cadena. El “índice de hidropatía” del segmento se esquematiza en el eje Y como función de su localización en la cadena. Un valor positivo indica que se necesita energía libre para la transferencia hacia el agua (es decir, que el segmento es hidrofóbico) y el valor asignado es un índice de la cantidad de energía que se necesita. Los picos del índice de hidropatía aparecen en la posición de los segmentos hidrofóbicos de la secuencia de aminoácidos. Se ilustran dos ejemplos de las proteínas de membrana que se discuten posteriormente en este capítulo: (A) la glucoforina tiene un único segmento que atraviesa la membrana en hélice a y un pico correspondiente en el test de hidropatía; (B) la bacteriorrodopsina tiene siete segmentos que atraviesan la membrana en hélice a y siete picos correspondientes en el gráfico de hidropatía. (Adaptado de D. Eisenberg, Arinu. Rev. Biochem . 53:595-624,1984.)
520
Capítulo 10: Estructura de la membrana
núcleo hidrofóbico de la bicapa lipídica
Figura 10-15 Un segmento de una cadena polipeptídica que atraviesa la bicapa lipídica en form a de hélice a . En la figura sólo se ha dibujado el esqueleto del carbono a de la cadena polipeptídica, con los aminoácidos hidrofóbicos en verde y am arillo . El segmento polipeptídico que se muestra en la figura es una parte del centro de reacción fotosintético bacteriano que se ilustra en la Figura 10-33, cuya estructura fue determinada por análisis de difracción de rayos X. (Basado en datos de J. Deisenhofer et al., N ature 318:618-624,1985, y de H. Michel et al., EM BOJ. 5:1149-1158,1986.)
Esta estructura de multipaso transmembrana se observa en las porinas, unas proteínas que trataremos más adelante. La fuerte tendencia a formar el máximo número de enlaces de hidrógeno en ausencia del agua también implica que pro bablem ente la cadena polipeptídica que entra en la bicapa la atraviesa comple tamente antes de cambiar de dirección, ya que la curvatura de la cadena supon dría una disminución de las interacciones regulares de enlaces de hidrógeno. Probablemente por esta razón es por lo que todavía no se ha establecido ningún ejemplo de una proteína de membrana cuya cadena polipeptídica atraviese tan sólo parcialmente la bicapa lipídica. Como es muy difícil lograr que las proteínas transmembrana cristalicen, sólo unas cuantas han sido estudiadas en su totalidad por cristalografía de rayos X (discutida más adelante); pero de todas las demás proteínas transmembrana conocem os las estructuras tridimensionales plegadas. Las técnicas de clonaje y secuenciación del DNA, sin embargo, han revelado las secuencias de am inoáci dos de muchas proteínas transmembrana, y a partir de un análisis de la secuen cia proteica a menudo es posible predecir qué partes de la cadena polipeptídica atraviesan la bicapa lipídica en forma de hélice a. Los segmentos que contienen cerca de 20-30 residuos de aminoácidos con un alto grado de hidrofobicidad son bastante largos para atravesar la membrana de esta manera y a menudo pueden ser identificados por medio de un test de hidropatía (Figura 10-16). Como son suficientes 10 o menos residuos para atravesar una bicapa lipídica a modo de una hebra p extendida, la misma estrategia se usa para identificar los segmentos que atraviesan la m embrana formando un barril p. La gran mayoría de las proteínas transmembrana se hallan glucosiladas. En el caso de los glucolípidos, los residuos de azúcar se añaden en la luz del retículo endoplasmático y en la del complejo de Golgi (véanse Capítulos 12 y 13) por lo que las cadenas de oligosacárido se hallan siempre en el lado no citoplasmático de la membrana. Otro tipo de asimetría resulta del característico ambiente re ductor del citosol, que impide la formación de enlaces disulfuro (S— S) inter o intracatenarios entre los residuos cisterna del dominio citosólico. Estos enlaces se forman en el lado no citosólico de la membrana, donde pueden tener un pa pel importante estabilizando la estructura plegada de la cadena polipeptídica (Figura 10-17) o bien asociando la cadena con otras cadenas polipeptídicas.
Las proteínas de m em brana pueden solubilizarse y purificarse mediante detergentes9 En general, las proteínas transmembrana (y también algunas otras proteínas fuertemente unidas a la membrana) pueden ser solubilizadas únicamente por medio de agentes que rompan las asociaciones hidrofóbicas y destruyan la bica pa lipídica. De entre estos compuestos que alteran las propiedades bioquímicas de la membrana, los más útiles son los detergentes, pequeñas moléculas antipá ticas que tienden a formar micelas en el agua (Figura 10-18). Al mezclarlos con las membranas, los extremos hidrofóbicos de las moléculas de detergente se unen a las regiones hidrofóbicas de la zona externa de las proteínas de m em bra na, desplazando así las moléculas lipídicas. Puesto que el otro extremo de las molécula de detergente es polar, la unión detergente-proteína tiende a disolver en agua a las proteínas de mem brana (a pesar de que algunas moléculas lipídi cas intensamente asociadas a las proteínas quedan unidas a estos complejos; véa se Figura 10-19). Los extremos polares (hidrofflicos) de los detergentes pueden estar cargados (ser iónicos) como en el caso del dodecil sulfato sódico (SDS, de Sodium Dodecyl Sulfate”) o no cargados (ser no iónicos) como en el caso de los detergentes de tipo Tritón. En la Figura 10-20 se presenta la estructura de estos detergentes de uso común. Con detergentes iónicos fuertes como el SDS, pueden solubilizarse incluso las proteínas de membrana más hidrofóbicas, lo cual permite su análisis m e diante electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS (véase Capítulo 4), un pro cedimiento que ha revolucionado el estudio de las proteínas de membrana. Al
Proteínas de membrana
COOH
oligosacáridos hélice a transm em brana bicapa lipídica grupo sulfhidrilo
Figura 10-17 U na típica proteína transm em brana de “paso único”.
Nótese que la cadena polipeptídica atraviesa la bicapa lipídica en forma de hélice a dextrógira y que tanto las cadenas de oligosacárido como los enlaces disulfuro se hallan en la superficie no citosólica de la membrana. No se forman enlaces disulfuro entre los grupos sulfhidrilo localizados en el domino citoplasmático de la proteína, debido a que el ambiente reductor del citosol mantiene estos grupos en su forma reducida (-SH).
cola hidrofóbica 1L
_ar
grupo de cabeza hidrofílico
Figura 10-18 Micela de detergente en el agua, vista en sección transversal.
Las moléculas de detergente son antipáticas debido a que tienen un extremo polar y otro extremo no polar.
521
proteina de mem brana en una bicapa lipidica
micelas de detergente
m onom eros de detergente
Figura 10-19 Solubilización de proteínas de m em brana con un detergente suave. El detergente desbarata la estructura de la bicapa lipidica y coloca las proteínas en solución en forma de complejos proteína-lípido-detergente. Los fosfolípidos de la mem brana también se solubilizan por el detergente.
III
lèi com plejo hidrosoluble de proteína-lípido-detergente
micelas solubles m ixtas de lípido-detergente
unirse a sus “núcleos hidrofóbicos”, estos detergentes fuertes despliegan (des naturalizan) las proteínas, inactivándolas y por tanto, haciéndolas no utilizables para estudios funcionales. No obstante, las proteínas pueden ser fácilmente pu rificadas en su forma desnaturalizada por el SDS, y en algunos casos, al eliminar el detergente, las proteínas purificadas pueden ser renaturalizadas, con recupe ración de su actividad funcional. Muchas proteínas hidrofóbicas de mem brana pueden ser solubilizadas y posteriormente purificadas en forma activa, a veces completamente normal, mediante el uso de detergentes suaves, com o el Tritón X-100, que se une a los segmentos de la proteína que atraviesan la membrana. De esta manera se pue den reconstruir sistemas de proteínas de m em brana funcionalmente activos a partir de sus com ponentes purificados, lo que proporciona un poderoso medio de análisis de la actividad de dichos sistemas.
El lado citoplasm àtico de las proteínas de m em brana se puede estudiar en “fantasm as” de eritrocito10 Se tiene más información de la membrana plasmática del glóbulo rojo humano (Figura 10- 22) que de cualquier otra membrana eucariota, lo cual es debido a dis tintas causas. Los glóbulos rojos se pueden obtener en gran número (por ejemplo de los bancos de sangre) y están relativamente poco contaminados por otros ti pos celulares. Dado que no tienen ni núcleo ni orgánulos intracelulares, la única membrana que poseen es la membrana plasmática, de forma que puede ser ais lada sin contam inación de membranas internas, lo cual evita un grave problema que se presenta en las preparaciones de membrana de otros tipos celulares en los que la mem brana plasmática constituye menos del 5% del total de membrana de la célula. Exponiendo las células a un medio en el que la concentración de sal sea menor que la del interior celular, resulta fácil preparar membranas celulares de eritrocito, vacías o “fantasmas”. En estas condiciones el agua fluye hacia el inte rior de los eritrocitos, hinchándolos y rompiéndolos (lisis), liberando la hemoglo bina (la principal proteína no perteneciente a la membrana). Los fantasmas de membrana pueden ser estudiados mientras todavía están abiertos (en cuyo caso cualquier reactivo puede interaccionar con las moléculas por ambas caras de la membrana) o puede dejarse que se suelden de nuevo de modo que los reactivos que se utilizarán sólo puedan actuar sobre la cara externa. Además, y puesto que a partir de fantasmas de eritrocitos también se pueden preparar vesículas solda522
Capítulo 10 : Estructura de la membrana
( !I C H 3— c — CH cu, ch2
CH;> CH,
CH2 CH i— C — CH
hc^C \ : í i ! ! IC
i!
XH
X
CH? CHj CH.;: CH' ch2
CHj
\
ch2 1
ch2
CHj
1
CHj
1
i
CH
=S
óG jlfa to sódico (SDS)
Tritón X-100
Figura 10-20 Estructura de dos detergentes utilizados habitualmente. El dodecil sulfato sódico (SDS), un detergente aniónico, y el Tritón X-100, un detergente no iónico. La porción hidrofóbica de cada detergente se muestra en verde, y la porción hidrofílica en azul. Obsérvese que la zona marcada entre corchetes del Tritón X-100 se repite unas ocho veces.
Figura 10-21 Uso de detergentes suaves para solubilizar, purificar y reconstituir sistemas de proteínas de membrana funcionales. En este ejemplo se purifican moléculas funcionales de la ATPasa Na+-K+y se incorporan a vesículas de fosfolípidos. La ATPasa Na+-K+es una bomba iónica que se halla presente en la membrana plasmática de la mayoría de las células animales; utiliza la energía de hidrólisis del ATP para bombear Na+ hacia fuera de la célula y K+hacia el interior, como se discute en el Capítulo 11.
(Q00 ,0°
000
00o
“
ELIMINACION DEL DETERGENTE
'
ADICIÓN DE FOSFOLÍPIDOS (mezclados con detergente)
micelas de detergente + m onóm eros
O°°0 0000000° °
ATPasa Na+-K+ incorporada a una vesícula de fosfolipidos
das invertidas (Figura 10-23), es posible estudiar por separado los lados externo e interno (citoplasmático) de la membrana. El uso de los fantasmas de eritrocito soldados y no soldados hizo posible demostrar por primera vez que algunas pro teínas de membrana atraviesan la bicapa lipídica (véase más adelante) y que la composición lipídica de las dos mitades de la bicapa es diferente. Estos hechos, al igual que muchos principios básicos demostrados inicialmente en membranas de eritrocito, se han generalizado a las membranas de las células nucleadas. Figura 10-22 Electronmicrografía de barrido de eritrocitos humanos. Las células tienen una forma bicóncava y carecen de núcleo. (Por cortesía de Bernadette Chailley.)
Proteínas de membrana
523
Figura 10-23 Preparación de fantasmas de eritrocito, soldados y no soldados, y de vesículas “del derecho” y “del revés”. Tal como se ha
fantasm a soldado LISIS HIPOTÓNICA
Oq O
vesículas del derecho
O vesículas vueltas del revés
La “orientación” de una proteína de membrana puede determinarse de va rias maneras. Una de ellas consiste en utilizar un reactivo marcador (por ejem plo, uno que contenga una marca radiactiva o fluorescente) que se una covalen tem ente, y que sea soluble en agua, es decir, que no pueda penetrar en la bicapa, por lo que sólo se unirá a grupos específicos del lado asequible de la membrana. A continuación, se solubilizan las membranas con un detergente, se separan las proteínas por electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS. Las proteínas marcadas se detectan ya sea por su radiactividad (mediante autorradiografía sobre gel) o por su fluorescencia (exponiendo el gel a luz ultravioleta). Utilizando este sistema de mareaje vectorial es posible determinar cómo se halla orientada una proteína de m em brana en dicha membrana, detectada como una banda sobre el gel: por ejemplo, si se marca tanto desde el lado externo (cuando se marcan células intactas o fantasmas con la mem brana soldada) como desde el lado interno (citoplasmàtico, cuando se marcan vesículas invertidas), debe tratarse de una proteina transmembrana. Una vía alternativa a ésta consiste en exponer tanto la superficie externa como la superficie interna a enzimas proteolíticas que no atraviesen la membrana: si una proteína queda parcialmente dige rida por este tratamiento de ambas superficies, debe tratarse de una proteína transmembrana. Además, para determinar si una zona específica de una protei na transm em brana está expuesta a un lado u otro de la membrana, se pueden utilizar anticuerpos marcados que se unen únicamente a una determinada re gión de la proteína. Al estudiar las proteínas de la mem brana plasmática del glóbulo rojo huma no mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS, se detectan aproxi madamente 15 bandas proteicas principales, cuyos pesos moleculares oscilan entre 15 000 y 250 000. Tres de estas proteínas -la espectrina, la glucoforina y la banda 3- constituyen más del 60% (en peso) de la proteína total de la membra na (Figura 10-24). Cada una de estas tres proteínas está dispuesta en la mem brana de diferente manera. Por ello las utilizaremos como ejemplo de las tres maneras principales conocidas en que las proteínas se asocian con las m embra nas, no sólo en los glóbulos rojos, sino también en otros tipos celulares.
La espectrina es una proteina del citoesqueleto asociada no covalentemente a la cara citoplasm àtica de la m em brana del eritrocito11 Muchas de las moléculas de proteína asociadas con la membrana del eritrocito humano son proteínas periféricas de membrana asociadas con el lado citoplas màtico de la bicapa lipidica. La más abundante de estas proteínas es la espectri na, una barra larga, delgada y flexible, de aproximadamente 100 nm de longitud, que constituye aproximadamente el 25% de la masa total de las proteínas aso ciadas a la membrana (unas 2,5 x 105 copias por célula). Constituye el principal com ponente del entramado proteico (el citoesqueleto) que se extiende por el in-
524
Capítulo 10 : Estructura de la membrana
indicado, los eritrocitos se rompen en un único punto, produciendo fantasmas con un solo agujero. Las vesículas más pequeñas se producen rompiendo mecánicamente los fantasmas; la orientación de la membrana en estas vesículas puede ser tanto con la cara exterior original hacia el exterior o vuelta del revés, dependiendo de las condiciones iónicas utilizadas durante el procedimiento de rotura.
peso molecular
aproxim ado . espectrina a espectrina (3 anquirina
30 000 82 000
proteina ' banda 3 glucoforina proteina banda 4,1
43 000 ■
actina
100 oooS E
(B)
Figura 10-24 Patrón de electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS de las proteínas de la mem brana de glóbulos rojos humanos. El gel en (A) está teñido
con azul de Coomassie. El dibujo (B) indica la posición en el gel de algunas de las proteínas mayoritarias; la glucoforina se muestra en color rojo para distinguirla de la proteína banda 3. En el dibujo se han omitido otras bandas del gel. La gran cantidad de carbohidratos de las moléculas de glucoforina retarda su migración, por lo que se desplazan casi tan lentamente como las moléculas de la proteína banda 3, que son mucho mayores. (A, por cortesía de Ted Steck.)
CADENA a
COOH
H2N HOOC
■ yJ . I \
j.^dMJLsgJ^* NH2 unión flexible entre dom inios
dom inio de 106 am inoácidos de longitud
CADENA p (A)
Figura 10-25 Moléculas de espectrina de eritrocitos hum anos. La proteína
está dibujada esquemáticamente en (A) y tal como se ve al microscopio electrónico en (B). Cada heterodímero de espectrina consiste en dos cadenas polipeptídicas antiparalelas, flexibles y ligeramente entrelazadas, llamadas a y p, que se unen entre sí mediante múltiples enlaces no covalentes que se presentan incluso en ambos extremos. A la izquierda está el extremo “cabeza” fosforilado, donde se asocian dos dímeros, formando un tetràmero. Tanto la cadena a como la cadena P están compuestas principalmente de dominios repetidos de 106 aminoácidos de longitud. En (B) las moléculas de espectrina se han sombreado con platino. (A, adaptado de D.W. Speicher y V.T. Marchesi, Nature 311:177-180,1984; B, por cortesía de D.M. Shotton, con permiso de D.M. Shotton, B.E. Burkey D. Branton,/. Mol. Biol. 131:303-329, 1979, © Academic Press Inc. [London] Ltd.)
terior de la mem brana celular del eritrocito, manteniendo la integridad estructu ral y la forma bicóncava de su mem brana (véase Figura 10-22): si se extrae el citoesqueleto de los fantasmas de eritrocito en soluciones de baja fuerza iónica, la mem brana se fragmenta formando pequeñas vesículas. La espectrina es un heterodímero formado por dos grandes subunidades es tructuralmente similares (Figura 10-25). Los heterodímeros se autoasocian cabeza con cabeza, formando tetrámeros de 200 nm de largo. Las colas de cinco o seis tetrám eros se enlazan entre sí mediante su unión a filamentos cortos de actina y a otras proteínas citoesqueléticas (entre ellas, la proteina banda 4,1) formando un “com plejo de unión”. El resultado final es una red deformable que se extiende por toda la superficie citoplasm àtica de la m embrana (véase Figura 10-26). Este citoesqueleto basado en la espectrina permite al eritrocito resistir el estrés que sufre su m em brana a medida que es empujado a través de los estre chos capilares. Ratones y humanos que poseen anomalías genéticas en la espec trina, presentan anemia y sus glóbulos rojos son esféricos (en lugar de cóncavos) y anormalmente frágiles; la severidad de la anemia se increm enta con el grado de deficiencia de la espectrina. La proteína que es la principal responsable de sujetar el citoesqueleto de es pectrina a la m em brana plasmática del eritrocito se identificó mediante la unión de espectrina marcada radiactivamente a m embranas de glóbulos rojos de las que se habían retirado espectrina y otras proteínas periféricas. Estos experimen tos demostraron que la unión de la espectrina depende de una gran proteína intracelular de unión llamada anquirina, que se une tanto a la espectrina como al dominio citoplasmàtico de la proteina transmembrana banda 3 (véase Figura 10-26). La anquirina conecta algunas moléculas de la proteína banda 3 a la es pectrina, uniendo así la red de espectrina a la membrana; también reduce nota blem ente la velocidad de difusión de las moléculas de banda 3 en la bicapa lipi dica. El citoesqueleto de espectrina tam bién se une a la membrana a través de otro m ecanismo que depende de la proteína banda 4,1 mencionada con anterio ridad. Esta proteína, que se une a la espectrina y a la actina, también se une al dominio citoplasmàtico de la proteína banda 3 y a la glucoforina, la otra protei na transm em brana mayoritaria en los eritrocitos. Por debajo de la mem brana plasmática de las células nucleadas existe una red de citoesqueleto análoga a la descrita, pero mucho más elaborada y com pli cada. Esta red, que constituye la región cortical (o córtex) del citoplasma, es rica
Proteínas de membrana
actina
aduciría
com plejo de unión dim ero de espectrina actina
proteina banda 4,1
espectrina
tropom iosina (A)
anquirina
proteina
glucoforina
Figura 10-26 El citoesqueleto basado en la espectrina del lado citoplasm àtico de la m em brana del eritrocito hum ano. Dibujo esquemático (A) y electronmicrografía (B). La disposición que se muestra en (A) se ha deducido principalm ente a partir de estudios sobre las interacciones in vitro de proteínas purificadas. Los dímeros de espectrina asociados cabeza-concabeza forman tetrámeros que se hallan unidos formando una red por medio de com plejos de unión com puestos de cortos filamentos de actina (que contienen unos 13 monóm eros de actina), tropomiosina que probablemente determina la longitud de los filamentos de actina, proteína banda 4,1 y aducina (aumentado en la casilla de la iz q u ierd a). El citoesqueleto está unido a la m em brana mediante la unión indirecta de los tetrámeros de espectrina a algunas proteínas banda 3, a través de moléculas de anquirina y también por medio de la unión de la proteína banda 4,1 a la glucoforina (no se muestra). La electronmicrografía de (B) muestra el citoesqueleto de la cara citoplasm àtica de la m embrana del eritrocito después de su fijación y tinción negativa. La red de espectrina se ha estirado a propósito para permitir observar los detalles de su estructura; en la célula normal, la trama mostrada debe ocupar únicam ente una décima parte de esta área. (B, por cortesía de T. Byers y D. Branton, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 82:6153-6157,1985.)
en filamentos de actina que al parecer se unen a la membrana plasmática de nu merosas maneras. En el córtex de células nucleadas también existen proteínas estructuralmente homologas a la espectrina, a la anquitina y a la protema banda 4,1, pero su organización y función no son tan conocidas como lo son en los eri trocitos. El citoesqueleto cortical de células nucleadas y su interacción con la m em brana plasmática se discuten en el Capítulo 16.
La glucoforina atraviesa la bicapa lipídica del glóbulo rojo, formando una hélice a sencilla10 La glucoforina es una de las dos proteínas mayoritarias que se hallan expuestas en la superficie externa del glóbulo rojo humano y fue la primera proteína de mem brana de la que se pudo determinar su secuencia completa de am inoáci dos. Como la proteína modelo transm em brana de la Figura 10-17, la glucoforina es una pequeña glucoproteína transm em brana (131 residuos de aminoácido) de paso único que se halla colocada con la mayoría de su masa en la superficie ex terna de la membrana, donde se localiza su cola amino terminal hidrofílica. En esta zona de la proteína se hallan unidos todos los carbohidratos (aproximada mente unos 100 residuos de azúcar distribuidos en 16 cadenas laterales distintas de oligosacáridos), que representan el 60% de la masa total de la molécula. De hecho, la gran mayoría del total de carbohidratos de superficie del eritrocito (in cluyendo más del 90% del ácido siálico, y por lo tanto la mayor parte de la carga
526
Capítulo 10 : Estructura de la membrana
proteina banda 4,1 100 nm
CSpeMrináiJ:
proteína transm em brana
negativa de superficie de la célula) están unidos a m oléculas de glucoforina. El extrem o carboxilo term inal hidrofílico de la glucoforina está expuesto ha cia el citoplasm a, m ientras que existe un segm ento a-helicoidal hidrofóbico de unos 23 am inoácidos de longitud, que atraviesa la bicapa no polar (véase Figura 10-16A). A pesar de que en cada célula hay más de un millón de moléculas de gluco forina, todavía se desconoce la función de esta glucoproteína. De hecho, los in dividuos cuyos eritrocitos carecen de esta proteína parecen estar perfectamente sanos. Aunque la glucoforina es exclusiva de los glóbulos rojos, su estructura es representativa de una clase frecuente de proteínas de membrana que atraviesan la bicapa lipídica en forma de hélice oc. Por ejemplo, muchos receptores de su perficie pertenecen a esta clase de proteínas.
/
hielo
- bicapa lipídica FRACTURA CON CUCHILLA
La banda 3 de la m em brana celular del eritrocito es una proteína de m em brana multipaso que cataliza el cotransporte am ónico12 A diferencia de lo que sucede con la glucoforina, se sabe que la proteína banda 3 desempeña un papel importante en la función de la célula. Su nombre deriva de la posición relativa que ocupa respecto a las otras proteínas de m embrana en una electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS (véase Figura 10-24). Como la glucoforina, la banda 3 es una proteína transmembrana, pero de múltiple paso, que atraviesa la mem brana en una conformación altamente plegada: al parecer la cadena polipeptídica (aproximadamente 930 residuos de aminoácido de longitud) atraviesa la bicapa hasta 14 veces. Cada glóbulo rojo contiene apro ximadamente 106 cadenas polipeptídicas banda 3, que forman dímeros en la membrana. La principal función de los glóbulos rojos es la de transportar 0 2 desde los pulmones hasta los tejidos y ayudar al transporte de C 0 2 desde los tejidos hasta los pulmones. La proteína banda 3 es de importancia crucial en la segunda de estas funciones. El C 0 2es sólo levemente soluble en agua y por ello es transpor tado por el plasma sanguíneo en forma de bicarbonato (HCO¡), que se forma y se rompe dentro de los glóbulos rojos por una enzima que cataliza la reacción H20 + C 0 2 <-> HCO¡ + H\ La proteína banda 3 actúa como un transportador de aniones, que permite que el HCO3 cruce la mem brana intercambiándose con Cl_. Al hacer que la mem brana del eritrocito sea libremente permeable al HCO3, este transportador increm enta la cantidad de C 0 2que la sangre puede llevar hasta los pulmones. Tras aplicar la técnica de la criofractura (por la cual las células son congela das en nitrógeno líquido y el bloque resultante de hielo se fractura con una cu chilla) pueden verse al microscopio electrónico las proteínas banda 3 como par-
O cara de fractura E al descubierto
cara de fractura P al descubierto
Figura 10-27 Electronm icrografía obtenida tras criofractura. El dibujo
muestra cómo esta técnica ofrece imágenes del interior hidrofóbico de la mitad citoplasmàtica (o protoplasmàtica) de la bicapa (denominada cara P) y de la mitad externa de la bicapa (denominada cara E). Después del proceso de criofractura ilustrado aquí, las caras de fractura se metalizan con platino y carbón, por digestión se elimina el material orgánico y la réplica de platino resultante se observa al microscopio electrónico (véase también Figura 4-27).
Figura 10-28 Electronm icrografía de criofractura de glóbulos rojos hum anos. Obsérvese que la densidad
cara P
de las partículas intramembrana es superior en la cara protoplasmática (P) que en la cara externa (E). (Por cortesía de L. Engstrom y D. Branton.)
cara E
1 1IÍÍ1
Proteínas de membrana
5 27
plano de la fractura agua extracelular congelada citoplasm a congelado
cara de fractura P M M IM IH M I I t t O t l CITOSOL
m olécula de glucoforina
bicapa lipidica
cara de fractura E M I I I 1 M M M M IM M M AG UA EXTRACELULAR
tículas intramembrana diferenciadas. El plano de la fractura tiende a pasar a tra vés de la mitad hidrofóbica de los lípidos de la membrana, separando las m em branas en sus dos monocapas (Figura 10-27). Las caras de fractura expuestas se metalizan con platino, y la réplica de platino resultante se observa al m icrosco pio electrónico. Cuando se estudian de esta manera, las membranas celulares de los eritrocitos humanos aparecen salpicadas de partículas intermembrana de ta maño relativamente homogéneo (7,5 nm de diámetro) y distribuidas al azar (Fi gura 10-28). Se cree que estas partículas son principalmente moléculas de banda 3: cuando se reconstituyen bicapas lipídicas sintéticas con moléculas de proteí na banda 3 y las bicapas se fracturan, se observan estas típicas partículas inter membrana de 7,5 nm. La Figura 10-29 ilustra la razón por la que por criofractura de membranas celulares de glóbulos rojos se observan las moléculas de banda 3 pero probablem ente no las moléculas de glucoforina. En el Capítulo 11 se considera cómo una proteína transmembrana como la banda 3 puede, en principio, permitir el transporte pasivo de moléculas polares a través de la bicapa no polar. Pero para un detallado conocim iento de cómo funciona realmente una proteína transportadora se necesita la información exacta sobre su disposición tridimensional en la bicapa. La primera proteína de transporte en la mem brana plasmática de la que se conocieron estos detalles es una proteína denominada bacteriorrodopsina, que en la membrana plasmática de ciertas bacterias actúa como una bom ba de protones (H+) activada por la luz. La estructura de la bacteriorrodopsina es similar a la de muchas otras proteínas de m em brana y m erece que se le dedique un breve paréntesis aquí.
La bacteriorrodopsina es una bom ba de protones que atraviesa la bicapa en form a de siete hélices a 13 La “mem brana púrpura” de la bacteria Halobacterium halobium es una mancha especializada de la m em brana plasmática que contiene un único tipo de molé cula proteica, la bacteriorrodopsina (Figura 10-30). Cada molécula de bacterio rrodopsina contiene un único grupo que absorbe la luz, o cromóforo (denomi nado retinal], que da a la pro teína su color púrpura; el retinal está relacionado con la vitamina A y es idéntico al cromóforo encontrado en la rodopsina del bastoncito retiniano de los vertebrados (se discute en el Capítulo 15). El retinal está unido covalentemente a un residuo de lisina de la proteína; cuando es activado por un fotón de luz, el cromóforo excitado cambia inmediatamente de forma provocando una serie de pequeños cambios conformacionales en la proteína, lo que da lugar a la transferencia de uno o dos H+ desde el interior hasta el exterior
528
Capítulo 10 : Estructura de la membrana
Figura 10-29 Probables destinos de las moléculas de glucoforina y de la proteína banda 3 de la m em brana del eritrocito durante la criofractura. Cuando la bicapa lipidica se parte, o la mitad interior o la mitad exterior de cada proteina transm embrana es extraída de la m onocapa congelada a la que está asociada; la proteína tiende a permanecer en la m onocapa en la que se halla la mayor parte de su volumen. Por esta razón, las moléculas de la proteína banda 3 normalmente quedan asociadas a la cara de fractura interna (P); puesto que tienen suficiente masa por encim a del plano de fractura, pueden observarse como partículas intramembrana. Normalmente las moléculas de glucoforina perm anecen unidas a la cara de fractura exterior (E), pero se cree que sus colas citoplasmáticas tienen una masa insuficiente para que sean vistas.
Figura 10-30 Dibujo esquem ático de la bacteria Halobacterium halobium que m uestra las m anchas púrpura de m em brana que contienen las moléculas de bacteriorrodopsina. Estas bacterias, que viven en aguas salobres donde se hallan expuestas a grandes cantidades de luz solar, han desarrollado una gran cantidad de proteínas activadas por la luz, incluyendo la bacteriorrodopsina que es una bom ba de protones activada por la luz presente en su membrana plasmática.
Figura 10-31 Estructura tridimensional de una molécula de bacteriorrodopsina. La cadena
CITOPLASMA N ÚC LEO HIDRO FÓBICO DE LA BICAPA LIPÍDICA
3 nm crom óforo retinal
polipeptídica cruza la bicapa en forma de siete hélices a. Se muestra la localización del cromóforo y el probable camino que siguen los protones durante el ciclo de bombeo activado por la luz. Se cree que al ser activado por un fotón, el cromóforo pasa un H+ a la cadena lateral del ácido aspártico 85 (esfera rosa marcada 85). Posteriormente, se cree que otras tres transferencias de H+ completan el ciclo -desde el ácido aspártico 85 al espacio extracelular, desde el ácido aspártico 96 (esfera rosa marcada 96) al cromóforo y desde el citosol al ácido aspártico 96 (véase Figura 14-36). (Adaptado de R. •Henderson et al. /. Mol. Biol. 213:899929,1990.)
ESPACIO EXTRACELULAR
de la célula (véase Figura 14-36). Bajo luz brillante cada molécula de bacteriorrodopsina puede bom bear varios cientos de protones por segundo. La transferen cia de protones impulsada por la luz establece un gradiente de H+ a través de la membrana plasmática, que a su vez impulsa la síntesis de ATP por una segunda protema de la m em brana plasmática de la célula. Así la bacteriorrodopsina es parte de un transductor de energía solar que provee a la célula bacteriana de energía. Para poder comprender la función de una proteína transmembrana multipaso a nivel molecular, será necesario localizar con precisión cada uno de sus átomos, lo cual generalmente requiere estudios de difracción de rayos X de grandes cristales tridimensionales de la proteína. Dada sü naturaleza anfipática, estas proteínas son extremadamente difíciles de cristalizar. Sin embargo, las nu merosas moléculas de bacteriorrodopsina de la membrana púrpura están orde nadas en forma de un cristal bidimensional planar, lo que ha hecho posible de terminar su estructura tridimensional y su orientación en la membrana, hasta una resolución de 0,3 nm, por medio de una aproximación alternativa que usa una com binación de microscopía electrónica y análisis de difracción electróni ca. Este procedimiento (denominado cristalografía electrónica) es análogo al es tudio de los cristales tridimensionales de proteínas solubles mediante el análisis de la difracción de rayos X, aunque por dicho método se obtienen menos deta lles estructurales. Como se ilustra en la Figura 10-31, estos estudios han demos trado que cada molécula de bacteriorrodopsina está plegada en siete hélices a densamente empaquetadas (cada una de unos 25 aminoácidos) que pasan en ángulo más o m enos recto a través de la bicapa lipídica. La bacteriorrodopsina es un miembro de una gran superfamilia de proteínas de membrana, de estructuras similares pero con funciones diferentes. Así por ejemplo, la proteína receptora de luz, rodopsina, de los bastones de la retina de vertebrados y m uchos receptores proteicos celulares de superficie que se unen a moléculas mensajeras extracelulares, tam bién están plegados en siete hélices a
Proteínas de membrana
529
(B) m onóm eros de porina
m em brana bacteriana externa
COOH
transmembrana. Estas proteínas no actúan como transportadores sino como transductores de señales; cada una responde a una señal extracelular activando otra proteína dentro de la célula, la cual genera una señal química en el citosol, como se discute en el Capítulo 15.
Las porinas son proteínas transm em brana formadoras de canales que cruzan la m em brana en form a de un barril p14 Como se discutió con anterioridad, algunas proteínas transmembrana multipaso no tienen sus segmentos transmembrana organizados en forma de hélices a sino de una lámina (3 cerrada (un barril (3). Los ejemplos mejor estudiados de este tipo de proteínas son las porinas, que se encuentran en la membrana exter na de muchas bacterias. Estas proteínas pertenecen a un pequeño grupo de pro teínas transm em brana cuya estructura atóm ica ha sido determinada completa mente m ediante cristalografía de rayos X. Muchas bacterias, entre ellas E. coli, tienen una membrana externa que rodea su membrana plasmática (véase Figura 11-14). La membrana externa está perfora da por varias porinas formadoras de canales, lo que permite a determinados solu tos hidrofílicos de hasta 600 daltons difundir a través de la bicapa lipídica externa. Las porinas (y las proteínas formadoras de canales relacionadas estructuralmente con ellas de la membrana de mitocondrias y cloroplastos) tienen una lámina (3 en lugar de una hélice a como estructura transmembranosa primordial. La estructura atóm ica de una porina aislada de la membrana externa de una bacteria fotosintética se determinó mediante cristalografía de rayos X en 1990. Consiste de un trímero en el que cada monómero forma un barril (3 tubular, que atraviesa la bicapa lipídica y contiene un canal lleno de agua en su centro. El ba rril está formado a partir de 16 cadenas antiparalelas de lámina p, que se curvan lo suficiente como para formar una estructura cilindrica (Figura 10-32). Cadenas polares laterales revisten el interior del canal acuoso, mientras que cadenas no polares se proyectan desde el exterior del barril interactuando con el núcleo hidrofóbico de la bicapa lipídica.
530
Capítulo 10: Estructura de la membrana
Figura 10-32 Estructura tridimensional de un trím ero de porina de Rhodobacter capsulatus determ inado por cristalografía de rayos X. (A) Cada monómero consiste
en un barril P de 16 cadenas antiparalelas que forman un canal transmembrana lleno de agua. (B) Los monómeros se asocian apretadamente formando trímeros, los cuales poseen tres canales separados para la difusión de solutos pequeños a través de la membrana bacteriana externa. Una larga espiral de la cadena polipeptídica (se muestra en rojo), que conecta dos cadenas p, se proyecta hacia el interior del lumen de cada canal, estrechándolo hasta formar una sección transversal de 0,6 x 1 nm. (Adaptado de M.S. Weiss et al., FEBS Lett. 280: 379-382,1991.)
Figura 10-33 Estructura tridimensional del centro de reacción fotosintético de la bacteria
Rhodopseudomonas viridis. La citocrom o
subunidad M
subunidad L
núcleo hidrofóbico de la bicapa lipidica
estructura se determinó por análisis de difracción de rayos X de cristales de este complejo proteico transmembrana. El complejo está formado por cuatro subunidades, L, M, H y un citocromo. Las subunidades L y M forman el núcleo del centro de reacción y cada una contiene cinco hélices a que atraviesan la bicapa lipídica. La localización de varias coenzimas transportadoras de electrones se muestra en negro. (Adaptado de un dibujo de J. Richardson, basado en datos de J. Deisenhofer, O. Epp, K. Miki, R. Huber y H. Michel, Nature 318:618-624,1985.)
CITOSOL
subunidad H
Las proteínas de m em brana actúan a menudo como grandes com plejos15 Hasta la fecha la más compleja estructura de una protema transmembrana que ja más ha sido estudiada mediante cristalografía de rayos X es el centro de reacción fotosintético bacteriano, cuya estructura atómica se definió en 1985. Los resultados de este análisis fueron de importancia general en la biología de membranas por que demostraron por primera vez que múltiples polipéptidos pueden asociarse en una membrana formando una compleja maquinaria proteica (Figura 10-33). En el Capítulo 14 discutimos cómo actúan estos complejos fotosintéticos capturando la energía lumínica y usándola para bombear H+a través de la membrana. A menudo las proteínas de membrana están dispuestas formando grandes complejos, no sólo para captar varias formas de energía, sino también para transducir las señales extracelulares en intracelulares (lo cual se discute en el Capítulo 15).
Muchas proteínas de m em brana difunden en el plano de la m em brana16 Como ocurre con los lípidos de membrana, las proteínas no saltan (flip-flop ) a través de la bicapa, sino que giran alrededor de un eje aproximadamente per pendicular al plano de la bicapa (difusión rotacional). Además, muchas proteí nas de m em brana son capaces de desplazarse lateralmente por la membrana {difusión lateral). La primera evidencia de que algunas proteínas de la m em bra na plasmática son móviles en el plano de la membrana fue obtenida en 1970 mediante un experimento en el que se fusionaron artificialmente células de ra tón con células humanas, produciendo células híbridas (heterocariontes). Para
Proteínas de membrana
531
distinguir las proteínas de membrana plasmática de ratón de las humanas se utilizaron dos anticuerpos con distinto mareaje. Aunque al principio las proteí nas de ratón y las humanas estaban confinadas a su propia mitad del heterocarionte recién formado, las dos clases de proteínas difundieron y se mezclaron ocupando, a la media hora, toda la superficie del heterocarionte (Figura 10-34). Poco después se obtuvieron otras evidencias de la movilidad proteica de la membrana gracias al descubrimiento de los procesos llamados agrupamiento (patching) y form ación de caperuza (capping). Cuando los ligandos, como los anticuerpos, que tienen más de un lugar de unión (por ello llamados ligandos multivalentes) se unen a proteínas específicas de la superficie celular, las proteí nas tienden a agregarse, mediante enlaces cruzados, formando grandes grupos (patches), lo cual indica que las proteínas son capaces de desplazarse lateral mente por la bicapa lipídica. Una vez formados los agregados en la superficie de una célula capaz de moverse, como un leucocito, son trasladados activamente a uno de los polos celulares, formando una caperuza (o “cap”, Figura 10-35).
CÉLULA DE RATÓN
proteína de m em brana
CÉLULA HUMANA
proteína Y de m em brana proteina X de m embrana
proteína de FUSION CELULAR m em brana
adición de anticuerpos anti-X
AGRUPAMIENTO HETEROCARIONTE
anticuerpos (a ) contra proteínas de mem brana humana, marcados con rodam ina ( • )
anticuerpos ( A ) contra proteína de m em brana de ratón, marcados con fluorescencia ( • )
INCUBACIÓN A 37°C
tiem po = 40 m inutos Figura 10-34 Experim ento que m uestra la m ezcla de proteínas de m em brana plasm ática que se produce en células híbridas ratón-hum anas. Inicialmente las proteínas de ratón y las proteínas humanas están confinadas a sus propias mitades de la m em brana plasmática del heterocarionte recién formado, pero se van entremezclando. Los dos anticuerpos que se usan para visualizar las proteínas se pueden distinguir en un microscopio de fluorescencia dado que la fluoresceína es verde y la rodamina es roja. (Basado en observaciones de L.D. Frye y M. Edidin, J. Cell Sci. 7:319-335,1970, con la autorización de The Company of Biologists.)
532
Capítulo 10 : Estructura de la membrana
grupo de proteínas X
FORMACION DE UNA CAPERUZA
\ v 'j
caperuza de proteínas X
Figura 10-35 Agrupamiento y form ación de una caperuza de una proteína de la superficie celular en un leucocito. Los anticuerpos bivalentes entrecruzan las moléculas proteicas a las que se unen. Esto hace que estas moléculas formen grandes grupos, los cuales son arrastrados activamente hacia el extremo posterior de la célula y forman una “caperuza.” El centrosoma, que gobierna la polaridad antero-posterior de la célula, se muestra en n aran ja.
BLANQUEO
MARCA
tiempo (C)
BLANQUEO CON LÁSER
Figura 10-36 Medición de la velocidad de difusión lateral de una proteína de m em brana plasm ática, mediante la técnica FRAP. Una
área de blanqueo
aiiiiiiiiin RECUPERACIÓN
(A)
(B)
La velocidad de difusión lateral de las proteínas de membrana puede medir se utilizando la técnica de recuperación de fluorescencia después de fotoblanqueamiento (FRAP, de Fluorescence Recovery After Photobleaching). Habitualmente este método comporta el mareaje de la proteína de superficie que se pretende estudiar, con un ligando específico fluorescente, como un anticuerpo fluores cente. (Es importante que se utilicen los fragmentos monovalentes de los anti cuerpos, que sólo poseen un lugar de unión al antígeno, para evitar la formación de enlaces cruzados entre moléculas vecinas.) Luego, el ligando fluorescente es blanqueado en una pequeña área mediante un rayo láser, y se mide el tiempo que tardan las proteínas de membrana adyacentes que transportan moléculas de anticuerpo fluorescente no blanqueadas, hasta difundir en el área blanquea da (Figura 10-36). A partir de estas mediciones se pueden calcular los coeficien tes de difusión de la proteína de superficie celular que había sido marcada. Los valores de los coeficientes de difusión para las diferentes proteínas de membra na en células diferentes son muy variables, pero están típicamente comprendi dos entre una décima o una centésima parte de los valores correspondientes para las moléculas de fosfolípidos de la misma membrana.
Figura 10-37 Diagrama de una célula epitelial en el que se m uestra com o una proteina de m em brana plasm ática se halla confinada en un dominio particular de la m em brana. La proteina A (en la zona
apical de la membrana) y la proteina B (en la zona basai y basolateral) pueden difundir lateralmente en sus dominios respectivos pero no pueden entrar en el otro, en parte debido a la unión celular especial denominada unión estrecha o estanca. Igualmente, las moléculas lipídicas de la monocapa exterior (no citoplasmàtica) de la membrana plasmática, tampoco pueden difundir entre ambos dominios, pero los lípidos de la monocapa interior (citoplasmàtica) sí pueden hacerlo (no se muestra).
Proteínas de membrana
proteína específica se marca, sobre la superficie de la célula, con un anticuerpo monovalente fluorescente que se une solamente a esta proteína (para simplificar, no se muestran otras proteínas). Luego se blanquean los anticuerpos de una pequeña área utilizando un láser, la intensidad de la fluorescencia se va recuperando a medida que la moléculas blanqueadas difunden hacia el resto de la superficie celular y que las moléculas no blanqueadas difunden a la zona iluminada con el láser. (Vista lateral en Ay superficial en B.) (C) Gráfico que muestra la velocidad de recuperación. Cuanto mayor es el coeficiente de difusión de la proteína de membrana, mayor es la velocidad de recuperación.
proteina A
membrana plasmática apical
unión estrecha
membrana plasmática lateral
proteína
lámina basal
533
Figura 10-38 Tres dominios de la mem brana plasm ática de esperm a de cobaya, definidos m ediante anticuerpos monoclonales. (A) es
un esquema de esperma de cobaya y cada uno de los tres pares de micrografías (B), (C) y (D) muestra una tinción inmunofluorescente de superficie celular utilizando diferentes anticuerpos monoclonales (a la derecha) junto a una micrografía de contraste de fase de la misma célula (a la izquierda). El anticuerpo utilizado en (B) sólo marca la cabeza anterior del espermatozoide, el de (C) sólo marca la parte posterior de la cabeza y el de (D) sólo marca la cola. (Cortesía de Selena Carroll y Diana Myles.)
parte anterior de la cabeza parte posterior de la cabeza
cola
(A)
Las células pueden confinar a lípidos y a proteínas en dominios específicos de la m em brana17 El reconocim iento de que las membranas biológicas son fluidos bidimensionales constituyó un gran avance en la comprensión de la estructura y de la función de la membrana. Ha quedado claro, sin embargo, que la representación de la m em brana como un mar lipídico en el cual todas las proteínas flotan librem en te, es una sobresimplificación. Muchas células tienen sistemas que les permiten limitar sus proteínas de m em brana en dominios específicos de la bicapa lipídica continua. Por ejemplo, en células epiteliales como las que revisten el intestino o los túbulos del riñón, ciertas enzimas de la membrana plasmática y algunas pro teínas de transporte están limitadas a la superficie apical de la células mientras que otras proteínas se hallan confinadas a las superficies basal y lateral (Figura 10-37). Esta distribución asimétrica de las proteínas es a menudo esencial para la función del epitelio, como se discute en el Capítulo 11. La composición lipídi ca de estos dos dominios de membrana también es diferente, lo cual demuestra que las células epiteliales pueden evitar la difusión de las moléculas lipídicas y proteicas entre los dominios. Experimentos con lípidos marcados, no obstante, sugieren que sólo están confinadas de esta manera las moléculas lipídicas de la m onocapa externa. Se cree que la separación tanto de moléculas de proteína como de moléculas lipídicas se mantiene, al menos en parte, por las barreras formadas por un tipo específico de uniones intercelulares (llamadas uniones es trechas o estancas, discutidas en el Capítulo 19). Está claro que las proteínas de m em brana que forman estas uniones intercelulares no pueden difundir lateral mente entre las m em branas que están interactuando Una célula tam bién puede crear dominios de membrana sin utilizar uniones intercelulares. El espermatozoide de mamíferos, por ejemplo, es una célula aisla da que presenta varias zonas estructural y funcionalmente distintas delimitadas por una membrana plasmática continua. Cuando se observa un espermatozoide por microscopía de inmunofluorescencia utilizando diferentes anticuerpos que reaccionen con antígenos de superficie, se constata que la membrana plasmática presenta al menos tres dominios diferentes (Figura 10-38). En algunos casos, los antígenos son capaces de difundir dentro de los límites de su propio dominio; se desconoce cómo se evita que abandonen dichos dominios. En los dos ejemplos que se acaban de considerar, tanto la difusión de las moléculas de lípidos como la de proteínas están confinada a dominios especiali zados dentro de una mem brana plasmática continua. Las células también tie nen sistemas más drásticos para inmovilizar ciertas proteínas de membrana. Uno de ellos está claram ente representado en la membrana púrpura de Halobacterium. Allí las moléculas de bacteriorrodopsina se ensamblan formando grandes cristales bidimensionales en los que las moléculas proteicas individua les están relativamente fijas unas respecto a las otras; los grandes agregados de
534
Capítulo 10 : Estructura de la membrana
Figura 10-39 Cuatro sistemas mediante los cuales se puede restringir la movilidad lateral de determ inadas proteínas de m em brana plasmática. Las proteínas pueden autoensamblarse formando grandes agregados (como en el caso de la bacteriorrodopsina en la membrana púrpura de Halobacterium) (A); pueden estar trabadas por interacciones con agregados macromoleculares del exterior (B) o del interior (C) de la célula, o pueden interactuar con proteínas de la superficie de otra célula (D).
este tipo difunden muy lentamente. Un sistema más común de restringir la m o vilidad lateral de proteínas de mem brana específicas consiste en unirlas a en samblajes macromoleculares del interior o del exterior de la célula. Hemos visto cómo algunas proteínas de la mem brana del eritrocito están ancladas al citoesqueleto interior; en otros tipos celulares, las proteínas de la membrana plasmáti ca pueden anclarse al citoesqueleto o a la matriz extracelular o a ambos. En la Figura 10-39 se resumen los cuatro sistemas de inmovilizar proteínas específicas de membrana.
La superficie celular está recubierta con residuos de azúcar18 Las proteínas de membrana, por regla general, no sobresalen desnudas al exte rior celular, sino que están decoradas, cubiertas o escondidas por carbohidratos presentes en la superficie de todas las células eucariotas. Estos carbohidratos se encuentran en forma de cadenas de oligosacárido unidas covalentemente a las proteínas de mem brana (glucoproteínas) y a lípidos (glucolípidos) y como cade nas de polisacáridos de moléculas proteoglucanos integrales de membrana. Los proteoglucanos, que consisten en largas cadenas de polisacáridos unidas cova lentem ente a un núcleo proteico, se encuentran principalmente en el exterior celular como parte de la matriz extracelular (discutida en el Capítulo 19); pero en el caso de los proteoglucanos integrales de membrana, el núcleo proteico se extiende a través de la bicapa lipídica o está anclado a la bicapa mediante un glucosilfosfatidilinositol (GPI). El término cubierta celular o glucocáliz se utiliza a menudo para describir la zona de la superficie celular rica en carbohidratos. Esta zona puede ser visuali zada por medio de diversos colorantes, como el rojo de rutenio (Figura 10-40), o tam bién por su afinidad a proteínas que se unen a carbohidratos, llamadas lectinas, que pueden ser marcadas con una tinción fluorescente u otro marcador vi sible. A pesar de que la mayor parte de los carbohidratos están unidos a m olécu las intrínsecas de la membrana plasmática, habitualmente el glucocáliz contiene además glucoproteínas y proteoglucanos que han sido secretados al espacio ex-
glucocáliz
citoplasm a
núcleo
m em b ra n a plasm ática
Figura 10-40 La cubierta celular, o glucocáliz. Electromicrografía de la superficie de un linfocito contrastado con rojo de rutenio para mostrar la cubierta celular. (Por cortesía de A. M. Glauert y G. M. W. Cook.)
i_______ ) 200 nm
Proteínas de membrana
535
glucoproteína transm em brana
glucoproteína adsorbida
4 = residuo de azúcar cubierta celular (glucocáliz)
bicapa lipidica
tracelular y que luego son adsorbidos en la superficie celular (Figura 10-41). Mu chas de estas macromoléculas adsorbidas son com ponentes de la matriz extracelular, de forma que el límite donde termina la membrana plasmática y donde se inicia la matriz extracelular es sólo una cuestión semántica. Las cadenas laterales de oligosacáridos de las glucoproteínas y de los glucolípidos son extremadamente diversas en cuanto a la organización de sus azúcares. A pesar de que habitualmente contienen menos de 15 residuos glucídicos, estos residuos están a menudo ramificados y los azúcares pueden estar unidos entre sí mediante diversos enlaces covalentes. Esta distribución es claramente diferente de la de los residuos de aminoácidos de una cadena polipeptídica, que están unidos por uniones peptídicas idénticas. Al unirse entre sí, tres residuos glucídi cos pueden incluso formar cientos de trisacáridos diferentes. En principio la di versidad y la posición expuesta de estos polisacáridos en la superficie celular les hace especialmente indicados para tomar parte en procesos de reconocimiento celular, pero durante m uchos años ha existido poca evidencia de esta presunta función. Parecía ser que el papel de la cubierta celular podía ser meramente de protección frente a daño m ecánico y químico y de m antener objetos extraños y otras células a distancia, impidiendo indeseables interacciones proteína-proteína. De hecho, es probable que ésta sea una parte importante de su función. Re cientem ente, sin embargo, se ha determinado que las lectinas unidas a m em bra na plasmática reconocen oligosacáridos específicos de glucolípidos de la superficie celular, mediando así diversos procesos transitorios de adhesión célu la-célula, entre los cuales se cuentan los que ocurren en las interacciones esper ma-óvulo, coagulación sanguínea, recirculación de linfocitos y respuestas infla matorias.
Las selectinas son proteínas de m em brana que se unen a carbohidratos de la superficie celular y que median adhesiones celulares transitorias en el torrente sanguíneo19 Uno de los ejemplos m ejor comprendidos del reconocimiento proteína-carbohi drato se da en las respuestas inflamatorias, cuando los linfocitos (de la clase de nominada neutrófilos) son reclutados desde la sangre hacia una zona de infla mación en un tejido, usualmente para ayudar a combatir una infección local. Inicialmente, los neutrófilos se adhieren suavemente a las células endoteliales que limitan los vasos sanguíneos de la zona y posteriormente se adhieren más fuertemente y migran fuera de los vasos sanguíneos, arrastrándose entre las cé lulas endoteliales adyacentes. El inicio del proceso de adhesión implica el reco nocim iento proteína-carbohidrato. Los mediadores químicos locales liberados 536
Capítulo 10 : Estructura de la membrana
Figura 10-41 Diagrama simplificado de la cubierta celular (glucocáliz). La
cubierta celular está formada por las cadenas laterales de oligosacáridos de los glucolípidos y de las glucoproteínas integrales de membrana y por cadenas de polisacáridos de proteoglucanos integrales de membrana. Además, en muchas células los proteoglucanos y glucoproteínas adsorbidos (no mostrados aquí) contribuyen a la formación del glucocáliz. Nótese que todos los carbohidratos se hallan en la superficie no citoplasmática de la membrana.
neutrófilo glucoproteína glucolípido oligosacárido dom inio lectina dom inio semejante a EGF dom inios repetidos
proteina
o lípido
SELECTINA P
célula endotelial
(A) Figura 10-42 La interacción proteína-carbohidrato que inicia la adhesión transitoria de neutrófilos a las células endoteliales en las zonas de inflamación.
(A) El dominio lectina de una P-selectina se une al oligosacárido específico mostrado en (B), que está presente tanto en la glucoproteína de la superficie celular como en las moléculas de glucolípido. El dominio lectina de las selectinas es homólogo a los dominios lectina encontrados en muchas otras proteínas animales que se unen a carbohidratos; dado que la unión a sus ligandos glucídicos requiere Ca2+, se les llama lectinas de tipo C. En (C) se muestra la estructura tridimensional de uno de estos dominios lectina, determinado por cristalografía de rayos X; su enlace glucídico aparece de color azul. Gal = galactosa; GlcNAc = Nacetilglucosamina; Fue = fucosa; NANA = ácido siálico.
COOH
por las células en el lugar de la inflamación señalizan a las células endoteliales de la región para que expresen una glucoproteína transmembrana denominada P-selectina, que pertenece a la familia de moléculas de adhesión célula-célula llamada selectinas. Las selectinas contienen un dominio lectina de unión a car bohidratos, en el extremo de un ensanchado “tallo” proteico que se extiende desde la superficie celular (Figura 10-42A). El dominio de lectina de la P-selecti na reconoce el oligosacárido específico, como se muestra en la Figura 10-42B. Dado que este oligosacárido se expresa en las moléculas de glucolípido y de glu coproteína de la superficie de los neutrófilos, éstos se adhieren específicamente a las células endoteliales que limitan los vasos sanguíneos de la zona inflamada. La unión de cada dominio de lectina a su oligosacárido específico es de rela tivamente baja actividad y al parecer tanto la asociación como la posterior diso ciación de dicha unión, ocurren rápidamente. Ello permite a las selectinas unir a las paredes de los capilares las células sanguíneas en tránsito, permitiendo al mismo tiempo que las células adheridas, impulsadas por el flujo sanguíneo, se desplacen a lo largo del endotelio hacia la zona inflamada. Este desplazamiento continúa hasta que otro m ecanismo de adhesión célula-célula, mediado por un tipo distinto de proteínas transmembrana, denominadas integrinas (discutidas en el Capítulo 19), se activa y refuerza la adhesión, permitiendo a los neutrófilos detener sus movimiento y arrastrarse fuera de los capilares sanguíneos hacia el tejido. Cuando los linfocitos migran fuera del torrente sanguíneo hacia el nódulo linfático tiene lugar una secuencia de eventos de adhesión similar mediada por selectinas e integrinas (véase Figura 23-9). Diversas selectinas se expresan en la superficie de los leucocitos, plaquetas y células endoteliales, participando en una amplia gama de interacciones transi torias célula-célula dentro del torrente sanguíneo.
Proteínas de membrana
5 37
Resumen Mientras que la bicapa lipidien determina la estructura básica de las membranas biológicas, las proteínas son las responsables de la mayoría de las funciones de las membranas, actuando de receptores específicos, enzimas o proteínas de transporte y otras muchas Junciones. Muchas proteínas de membrana atraviesan la bicapa li pídica: en algunas de estas proteínas transmembrana la cadena de polipéptidos cruza la bicapa como una hélice a única (proteínas de paso único); en otras, inclui das las responsables del transporte transmembrana de iones y otras pequeñas mo léculas solubles en agua, la cadena polipeptídica cruza la bicapa varias veces, ya sea en series de hélices a o como láminas P en forma de un barril cerrado (proteínas de paso múltiple). Otras proteínas asociadas a la membrana no atraviesan la bica pa pero en cambio se hallan unidas a una cara u otra de la membrana. Muchas de estas proteínas se unen a proteínas transmembrana mediante interacciones no covalentes, pero otras están unidas por medio de la unión covalente a grupos lipidí eos. Como ocurre con las moléculas lipídicas de la bicapa, muchas proteínas de membrana son capaces de difundir rápidamente en el plano de la membrana. Por otro lado, las células tienen sistemas para inmovilizar proteínas específicas de membrana y para confinar tanto proteínas de membrana como moléculas lipídicas a dominios particulares de una bicapa lipídica continua. En la membrana plasmática de todas las células eucariotas, la mayoría de las proteínas que quedan al descubierto sobre la superficie celular y algunas de las moléculas lipídicas de la monocapa lipídica externa tienen cadenas de oligosacári dos unidas covalentemente. Algunas membranas plasmáticas también contienen moléculas integrales de proteoglucanos con cadenas de polisacáridos expuestas a la superficie. Esta cubierta de azúcares ayuda a proteger la superficie celular del daño mecánico y químico, y algunas de las cadenas de oligosacáridos son reconoci das por proteínas que se unen a carbohidratos de la superficie celular (lectinas) que intervienen en procesos de adhesión célula-célula específicos y transitorios.
Bibliografia General Bretscher, M.S. The molecules of the cell membrane. Sei. Am. 253(4):100-109, 1985. Gennis, R.B. Biomembranes: Molecular Structure and Func tion. New York: Springer-Verlag, 1989. Jain, M.K. Introduction to Biological Membranes, 2nd ed. New York: Wiley, 1988. Singer, S.J.; Nicolson, G.L. The fluid mosaic model of the structure of cell membranes. Science 175:720-731, 1972. Citas 1. Ceve, G.; Marsh, D. Phospholipid Bilayers: Physical Principles and Models. New York: Wiley, 1987. Quinn, P.J.; Cherry, R.J., eds. Structural and Dynamic Properties of Lipids and Membranes. London: Port land Press, 1992. Tanford, C. The Hydrophobic Effect: Formation of Mi celles and Biological Membranes. New York: Wiley, 1980. Vance, D.E.; Vance, J.E., eds. Biochemistry of Lipids, Li poproteins and Membranes, New Comprehensive Biochemistry, Vol. 20. New York: Elsevier, 1991. van Meer, G. Lipid traffic in animal cells. Annu. Rev. Cell Biol 5:247-275, 1989.
538
Capítulo 10: Estructura de la membrana
2. Bangham, A.D. Models of cell membranes. In Cell Membranes: Biochemistry, Cell Biology and Pathol ogy (G. Weissmann, R. Claiborne, eds.), pp. 24-34. New York: Hospital Practice, 1975. Devaux, P.F. Lipid transmembrane asymmetry and flipflop in biological membranes and in lipid bilayers. Curr. Opin. Struct. Biol. 3:489-494, 1993. Edidin, M. Rotational and lateral diffusion of membrane proteins and lipids: phenomena and function. Curr. Top. Membr. Transp. 29:91-127, 1987. Kornberg, R.D.; McConnell, H.M. Lateral diffusion of phospholipids in a vesicle membrane. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 68:2564-2568, 1971. 3. Bretscher, M.S.; Munro, S. Cholesterol and the Golgi ap paratus. Science 261:1280-1281, 1993. Chapman, D.; Benga, G. Biomembrane fluidity-studies of model and natural membranes. In Biological Membranes (D. Chapman, ed.), Vol. 5, pp. 1-56. Lon don: Academic Press, 1984. de Kruiff, B., et al. Lipid polymorphism and membrane function. In The Enzymes of Biological Membranes, Vol 1, Membrane Structure and Dynamics, 2nd ed. (A.N. Martonosi, ed.), pp. 131-204. New York: Plenum, 1985. Kimelberg, H.K. The influence of membrane fluidity on the activity of membrane-bound enzymes. In Dyna mic Aspects of Cell Surface Organization. Cell Surfa ce Reviews (G. Poste, G.L. Nicolson, eds.), Vol. 3, pp. 205-293. Amsterdam: Elsevier, 1977.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
Yeagle, P.L. Cholesterol and the cell membrane. Biochim. Biophys. Acta 822:267-287,1985. Bretscher, M. Membrane structure: some general prin ciples. Science 181:622-629,1973. Devaux, P.F. Protein involvement in transmembrane li pid asymmetry. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 21:417-439,1992. Newton, A.C. Interaction of proteins with lipid headgroups: lessons from protein kinase C. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 22:1-25,1993. Rothman, J.; Lenard, J. Membrane asymmetry. Science 195:743-753,1977. Hakomori, S. Glycosphingolipids. Sci. Am. 254(5):44-53, 1986. Weigandt, H. The gangliosides. Adv. Neurochem. 4:149223,1982. Branden, C.; Tooze, J. Introduction to Protein Structure, pp. 202-214. New York: Garland, 1991. Unwin, N.; Henderson, R. The structure of proteins in biological mebranes. Sci. Am. 250(2):78-94,1984. Chow, M.; Der, C.J.; Buss, J.E. Structure and biological effects of lipid modifications on proteins. Curr. Opin. Cell Biol. 4:629-636,1992. Cross, G.A. Glycolipid anchoring of plasma membrane proteins. Annu. Rev. Cell Biol. 6:1-39,1990. Englund, P.T. The structure and biosynthesis of glycosyl phosphatidylinositol protein anchors. Annu. Rev. Biochem. 62:121-138,1993. Jennings, M.L. Topography of membrane proteins. Annu. Rev. Biochem. 58:999-1027,1989. Singer, S.J. The structure and insertion of integral pro teins in membranes. Annu. Rev. Cell Biol. 6:247-296, 1990. Eisenberg, D. Three-dimensional structure of membra ne and surface proteins. Annu. Rev. Biochem. 53:595623,1984. Engelman, D.M.; Steitz, T.A.; Goldman, A. Identifying nonpolar transbilayer helices in amino acid sequences of membrane proteins. Annu. Rev. Biophys. Biophys. Chem.. 15:321-353,1986. Fasman, G.D.; Gilbert, W A The prediction of transmem brane protein sequences and their conformation: an evaluation. Trends Biochem. Sci. 15:89-92,1990. Kyte, J.; Doolittle, R.F. A simple method for displaying the hydropathic character of a protein. J. Mol. Biol. 157:105-132,1982. Popot, J.-L. Integral membranes protein structure: trans membrane a helices as autonomous folding domains. Curr. Opin. Struct. Biol. 3:512-540,1993. Helenius, A.; Simons, K. Solubilization of membranes by detergents. Biochim. Biophys. Acta 415:29-79, 1975. Montal, M. Functional reconstitution of membrane proteins in planar lipid bilayer membranes. In Tech niques of the Analysis of Membrane Proteins (C.I. Ragan, R J. Cherry, eds.), pp. 97-128, London: Chap man & Hall, 1986. Racker, E. Reconstitution of Transporters, Receptors and Pathological States. Orlando, FL: Academic Press, 1985. Silvius, J.R. Solubilization and functional reconstitution of biomembrane components. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 21:323-348,1992.
Bibliografía
10. Agre, P.; Parker, J.C., eds. Red Blood Cell Membranes: Structure, Function, Clinical Implications. New York: Marcel Dekker, 1989. Bretscher, M. Membrane structure: some general prin ciples. Science 181:622-629,1973. Marchesi, V.T.; Furthmayr, H.; Tomita, M. The red cell membrane. Annu. Rev. Biochem. 45:667-698,1976. Steck, T.L. The organization of proteins in the human red blood cell membrane. /. Cell Biol.62:1-19,1974. 11. Bennett, V.; Lambert, S. The spectrin skeleton: from red cells to brain./. Clin. Invest. 87:1483-1489,1991. Bennett, V.; Gilligan, D.M. The spectrin-based membra ne structure and micron-scale organization of the plasma membrane. Annu. Rev. Cell Biol. 9:27-66, 1993. Branton, D.; Cohen, C.M.; Tyler, J. Interaction of cytoskeletal proteins on the human erythrocyte membra ne. Cell 24:24-32,1981. Davies, K.A.; Lux, S.E. Heredity disorders of the red cell membrane skeleton. Trends Genet. 5:222-227,1989. Pumplin, D.W.; Bloch, R.J. The membrane skeleton. Trends Cell Biol. 3:113-117,1993. 12. Alper, S.L. The band 3-related anion exchanger (AE) gene family. Annu. Rev. Physiol. 53:549-564,1991. Jennings, M.L. Structure and function of te red blood cell anion transport protein. Annu. Rev. Biophys. Chem. 18:397-430,1989. Kopito, R.R. Molecular biology of the anion exchanger gene family. Int. Rev. Cytol. 123:177-199,1990. Reithmeier, R.A.F. The erythrocyte anion transporter (band 3). Curr. Opin. Struct. Biol. 3:515-523,1993. 13. Henderson, R., Baldwin, J.M.; Ceska, T.A.; Zemlin, F.; Beckmann, E.; Downing, K.H. Model for the structure of bacteriorhodopsin based on high-resolution elec tron cryo-microscopy. /. Mol. Biol. 213:899-929,1990. Henderson, R.; Unwin, P.N.T. Three-dimensional model of purple membrane obtained by electron micros copy. Nature 257:28-32,1975. Mathies, R.A.; Lin, S.W.; Ames, J.B.; Pollard, W.T. From femtoseconds to biology: mechanism of bacteriorhodopsin’s light-driven proton pump. Annu. Rev. Biophys. Biohys. Chem. 20:491-518,1991. Stoeckenius, W. The rhodopsin-like pigments of halobacteria: light-energy and signal transducers in an archaebacterium. Trends Biochem. Sci. 10:483-486, 1985. 14. Cowan, S.W. Bacterial porins: lessons from three highresolution structures. Curr. Opin. Struct. Biol. 3:501507,1993. Shirmer, T.; Rosenbusch, J.P. Prokaryotic and eukary otic porins. Curr. Opin. Struct. Biol. 1:539-545,1991. Schulz, G.E. Bacterial porins; structure and function. Curr. Opin. Cell Biol. 5:701-707,1993. Weiss, M.S.; Wacker, T.; Nestel, U.; et al. The structure of porin from rhodobacter capsulatus at 0.6 nm reso lution. FEBS Lett. 256:143-146,1989. 15. Deisenhofer, J.; Epp, O.; Mili, K.; Huber, R.; Michel, H. The structure of the protein subunits in the pho tosynthetic reaction centre of Rhodopseudomonas viridis at 3 A resolution. Nature 318:618-624,1985. Deisenhofer, J.; Michel, H. High-resolution structures of photosynthetic reaction centers. Annu. Rev. Biophys. Biophys. Chem. 20:247-266,1991.
539
Rees, D.C.; Komiya, H.; Yeates, T.O.; Allen, J.P.; Feher, G. The bacterial photosynthetic reaction center as a model for membrane proteins. Annu. Rev. Biochem. 58:607-634,1989. 16. de Pétris, S.; Raff, M.C. Normal distribution, patching and capping of lymphocyte surface immunoglobulin studied by electron microscopy. Nature New Biol. 241:257-259, 1973. Edidin, M. Molecular association and membrane do mains. Curr. Top. Membr. Transp. 36:81-96,1990. Frye, L.D.; Edidin, M. The rapid intermixing of cell sur face antigens after formation of mouse-human heterokaryons./. Cell Sei. 7:319-335,1970. Jacobson, K.; Ishihara, A.; Inman, R. Lateral diffusion of proteins in membranes. Annu. Rev. Physiol. 49:163175,1987. Sheetz, M.P. Glycoprotein mobility and dynamic do mains in fluid plasma membranes. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 22:417-431,1993. 17. Gumbiner, B.; Louvard, D. Localized barriers in the plama membrane: a common way to form domains. Trends Biochem. Sei. 10:435-438,1985. Jacobson, K.; Vaz, W.L.C. Domains in biological mem branes. Comm. Mol. Cell Biophys. 8:1-114,1992. Myles, D.G.; Primakoff, P. Sperm surface domains. In Hybridoma Technology in the biosciences and Medi cine (T.A. Springer, ed.), pp. 239-250. New York: Ple num, 1985.
540
Capitulo 10 : Estructura de la membrana
Simons, K.; van Meer, G. Lipid sorting in epithelial cells. Biochemistry 27:6197-6202,1988. Edidin, M. Patches, posts and fences: proteins and plasma membrane domains. Trends Cell Biol. 2:376-380,1992. 18. Drickamer, K.; Taylor, M.E. Biology of animal lectins. Annu. Rev. Cell Biol. 9:237-264,1993. Dwek, RA , et al. Analysis of glycoprotein-associated oli gosaccharides. Annu. Rev. Biochem. 6:65-100,1993. Parelch, R.B. Effects of glyucosylation on protein func tion. Curr. Opin. Struct. Biol. 1:750-754, 1991. Paulson, J.C. Glycoproteins: what are the sugar chains for? Trends Biochem. Sci. 14:272-276,1989. Sharon, N.; Lis, H. Carbohydrates in cell recognition. Sci. Am. 268(l):82-89,1993. 19. Bevilacqua, M.P.; Nelson, R.M. Selectins. J. Clin. Invest. 91:379-387, 1993. Cummings, R.D.; Smith, D.F. The selectin family of car bohydrate-binding proteins: structure and importan ce of carbohydrate ligands for cell adhesion. BioEssays 14:849-856,1992. Lasky, L.A. Selectins: interpreters of cell-specifc car bohydrate information during inflammation. Science 258:964-969,1992. Lawrence, M.B.; Springer, T.A. Leukocytes roll on a se lectin at physiologic flow rates: distinction from and prerequisite for adhesion through integrins. Cell 65:859-873, 1991.
Transporte de moléculas pequeñas a través de la membrana y base iónica de la excitabilidad de la membrana
V
.
'?s!!14SrS
Principios de transporte a través de membrana Proteínas transportadora y» transporte activo a través i de membrana Canales iónicos y propiedadt éct ricas de las membi i ranas
Debido a su interior hidrofóbico, la bicapa lipídica de una célula constituye una barrera altamente impermeable a la mayoría de las moléculas polares. Esta fun ción de barrera es de una im portancia crucial ya que permite a la célula m ante ner en su citosol ciertos solutos a concentraciones diferentes a las que están en el fluido extracelular y en cada uno de los compartimientos intracelulares en vueltos por una m embrana. Sin embargo, para poder utilizar esta barrera las cé lulas han tenido que desarrollar sistemas para transportar específicamente m o léculas hidrosolubles a través de sus membranas y así poder ingerir los nutrientes esenciales, excretar los productos residuales del metabolismo y regu lar las concentraciones intracelulares de iones. El transporte de iones inorgáni cos y de pequeñas m oléculas orgánicas hidrosolubles a través de la bicapa lipídi ca se consigue mediante proteínas transmembrana especializadas, cada una de las cuales es responsable de la transferencia de una molécula o un ion específi cos o de un grupo de moléculas o iones afines. Las células también pueden transportar a través de sus m embranas macromoléculas e incluso grandes partí culas, pero los mecanismos que intervienen en estos casos son muy diferentes de los utilizados para transferir pequeñas moléculas, por lo que se estudian en los Capítulos 12 y 13. La im portancia del transporte a través de las m embranas queda puesta de manifiesto por el hecho de que casi el 20% de los genes identifi cados hasta ahora en E. cotí están asociados a estos procesos de transporte. Iniciamos esta capítulo considerando algunos principios generales que guiarán nuestra discusión sobre la manera en que las pequeñas moléculas cru zan las m embranas celulares. Por lo tanto consideraremos las dos clases princi pales de proteínas de mem brana que median el transporte: las proteínas trans portadoras, las cuales tienen partes móviles que les permiten transportar moléculas específicas a través de la membrana, y las proteínas de canal, que for man un estrecho poro hidrofóbico que permite el desplazamiento pasivo de pe queños iones inorgánicos. Las proteínas transportadoras pueden acoplarse a una fuente de energía y catalizan un transporte activo; la com binación de una permeabilidad selectiva pasiva y un transporte activo genera grandes diferencias de com posición del citosol respecto al fluido extracelular (Tabla 11-1) o al fluido del interior de los orgánulos envueltos en membrana. Concretamente, generan do diferencias de concentración iónica a través de la bicapa lipídica, las m em branas celulares son capaces de almacenar energía potencial en forma de gra dientes electroquímicos, los cuales se utilizan para impulsar varios procesos de transporte, para transportar señales eléctricas en células excitables eléctrica mente y (en mitocondrias, cloroplastos y bacterias) para fabricar la mayor parte 541
Tabla 11 -1 Comparación de las concentraciones iónicas en el interior y el exterior de una célula de mamífero C om p on en te
C o n cen tració n in tracelu lar (mM)
C o n cen tració n extracelu lar (mM)
Cationes Na+ K+ Mg2+ Ca2+ H+
5-15 140 0,5 10-4 7 x 10-5 (10-72 M o pH 7,2)
145 5 1-2 4 x IO-5 (IO74 M o pH 7,4)
Aniones* Cl-
5-15
110
1-2
* Puesto que la célula debe tener la misma cantidad de cargas + que - (es decir, ha de ser eléctri camente neutra), además de Cl- la célula contiene muchos otros aniones que no se presentan en esta tabla; de hecho, la mayoría de los constituyenes celulares están cargados negativamente (HCOj, PO,,3-, proteínas, ácidos nucleicos, metabolitos que contienen grupos fosfato y carboxilo, etc.). Las concentraciones dadas para Ca2+ y Mg2t corresponden a las de los iones libres. En las células, hay un total de aproximadamente 20 mM Mg2+ y 1-2 mM Ca2+ pero en su mayor parte ambos cationes están unidos a proteínas y a otras substancias; en el caso del Ca2+, una elevada cantidad se encuentra almacenada en varios orgánulos.
del ATP celular. Centramos la discusión principalmente en el transporte a través de la m em brana plasmática pero, com o discutiremos en capítulos posteriores, en las otras m embranas de la célula eucariota existen mecanismos similares a los que describiremos. En la última parte de este capítulo centramos la atención principalmente en las funciones de los canales iónicos de las células nerviosas, ya que es en estas células donde las proteínas de canal adquieren el máximo ni vel de sofisticación, permitiendo que redes de células nerviosas desarrollen las extraordinarias características de las que es capaz el cerebro humano.
Principios de transporte a través de membrana1 Iniciamos esta sección describiendo las propiedades de permeabilidad de bicapas lipídicas sintéticas, libres de proteína. A continuación, introducimos algunos términos utilizados para describir los diversos tipos de transporte a través de m em brana y algunas estrategias para caracterizar las proteínas y los procesos que participan en ellos.
Las bicapas lipídicas libres de proteína son altam ente im perm eables a los iones2 Con tiempo suficiente, prácticam ente cualquier molécula acabará difundiendo a través de una bicapa lipídica libre de proteína a favor de su gradiente de con centración. Sin embargo, la velocidad a la que se produce esta difusión varia enorm em ente, dependiendo en parte del tamaño de la molécula y, principal mente, de su solubilidad relativa en aceite. En general, cuanto menor es la m olé cula y cuanto más soluble en aceite (es decir, cuanto más hidrofóbica o no polar es) más rápidamente difunde a través de una bicapa. Las moléculas pequeñas no polares tales como el 0 2 (32 daltons) y el C 0 2 (44 daltons), se disuelven fácil mente en las bicapas lipídicas y por lo tanto difunden con rapidez a través de ellas. Las moléculas polares no cargadas tam bién difunden rápidamente a través de una bicapa si su tamaño es suficientemente reducido. Por ejemplo, el agua (18 daltons), el etanol (46 daltons) y la urea (60 daltons) atraviesan rápidamente una bicapa; el glicerol (92 daltons) lo hace con menor rapidez, y la glucosa (180 daltons) prácticam ente no la atraviesa (Figura 11-1).
542
Capítulo 11: Transporte de moléculas pequeñas a través de la membrana
o2
MOLÉCULAS C 0 2 HIDROFÓBICAS n 2 benceno PEQUEÑAS MOLÉCULAS POLARES NO CARGADAS
H20 urea L glicerol
GRANDES MOLÉCULAS POLARES NO CARGADAS
glucosa sacarosa
IONES
¡ H+, Na- i j HCO3 , K+ ¡ Ca2\ Cl ! M g2+
*
c
<0
bicapa lipídica artificial Figura 11-1 Permeabilidad relativa de una bicapa lipídica sintética a diferentes tipos de moléculas. Cuanto menor sea la molécula y, lo que es más importante, cuanto m enor sea el número de enlaces de hidrógeno que establezca con el agua, más rápidamente difundirá a través de la membrana.
Por el contrario, las bicapas lipídicas son altamente impermeables a todas las moléculas cargadas (iones), por muy pequeñas que sean: la carga y el elevado grado de hidratación de tales moléculas les impiden penetrar en la fase hidrocarbonada de la bicapa. Así, las bicapas sintéticas son 109 veces más permeables al agua que a los iones, incluso a los de reducido tamaño como el Na+ o el K+ (Fi gura 11-2).
Existen dos clases principales de proteínas de transporte a través de m em brana: proteínas transportadoras y proteínas de canal1 Como las bicapas lipídicas sintéticas, las membranas celulares permiten el paso por simple difusión del agua y de las moléculas no polares. Sin embargo, las membranas celulares tam bién son permeables a diversas moléculas polares que atraviesan con gran lentitud las bicapas lipídicas sintéticas, tales como iones, azúcares, aminoácidos, nucleótidos y muchos metabolitos celulares. Unas pro teínas de mem brana especiales son las responsables de la transferencia de estos solutos a través de las membranas celulares. Estas proteínas, que reciben el nombre de proteínas de transporte a través de membrana, se presentan en m u chas formas y en todos los tipos de m embranas biológicas. Cada proteína está destinada al transporte de un tipo particular de moléculas (tales como iones, azúcares o aminoácidos) y con frecuencia únicamente de una cierta especie m o lecular de la clase. La especificidad de las proteínas de transporte fue sugerida por primera vez a mediados de los años 1950 gracias a unos estudios en los que se encontró que unas mutaciones en un solo gen suprimían la capacidad de las bacterias para transportar unos azúcares determinados a través de su membrana plasmática. Actualmente se han descubierto mutaciones similares en personas que sufren diversas enfermedades hereditarias, las cuales afectan al transporte de un soluto determinado en el riñón, en el intestino o en ambos tejidos. Por ejemplo, los individuos que presentan la enfermedad genética cistinuria son in capaces de transportar ciertos aminoácidos (incluyendo la cistina, el dímero for mado por la unión, a través de un enlace disulfuro, de dos cisternas) tanto desde la orina como desde el intestino hacia la sangre; de la acumulación de cistina en la orina resulta la formación de “piedras” de cistina en los riñones. Todas las proteínas de transporte a través de membrana que han sido estu diadas con detalle suficiente para poder establecer su orientación en la membra na, son proteínas transmembrana multipaso -e s decir, su cadena polipeptídica atraviesa la membrana varias veces. Se cree que estas proteínas establecen una vía continua de proteína a través de la membrana, permitiendo así el transporte de solutos específicos sin que lleguen a entrar en contacto directo con el interior hidrofóbico de la bicapa lipídica. Existen dos clases mayoritarias de proteínas de transporte de membranas: las proteínas transportadoras y las proteínas de canal. Las proteínas transporta doras (también denominadas transportadores, carriers o permeasas ) se unen al soluto específico que va a ser transportado y sufren una serie de cambios conformacionales que permiten la transferencia del soluto a través de la membrana. Por otro lado, las proteínas de canal no se unen al soluto sino que forman poros hidrofflicos que atraviesan la bicapa lipídica; cuando estos poros están abiertos permiten que determinados solutos (habitualmente iones inorgánicos de tamaño y carga apropiados) puedan pasar a su través, y por lo tanto atravesar la m embra na (Figura 11-3). No sorprende que el transporte a través de las proteínas de canal se produzca a velocidad mucho mayor que a través de proteínas de transporte.
perm eabilidad elevada
A h 2o
- -
----- ►
10 2
10 4 urea glicerol ----- ► triptófano ----- ► glucosa ----- ► - - 10"8
U-io-14
perm eabilidad baja Figura 11-2 Coeficientes de permeabilidad (cm/seg) p ara el paso de diversas moléculas a través de bicapas lipídicas sintéticas. El flujo de
un soluto a través de la bicapa es directamente proporcional a la diferencia de sus concentraciones a los dos lados de la membrana. Multiplicando esta diferencia de concentración (en moles /cm3) por el coeficiente de permeabilidad (cm/seg) se obtiene el flujo del soluto en moles por segundo por centímetro cuadrado de membrana. Por ejemplo, una diferencia de concentración de triptófano de 10-4 moles/cm3 (ÍO^/IO'3 L = 0,1 M) produciría un flujo de 10-4 mol/cm3x 10~7 cm/seg = 10~u moles/seg a través de 1 cm2 de membrana, es decir, de 6 x 104 moléculas/seg a través de 1 |j.m2 de membrana.
El transporte activo está mediado por proteínas transportadoras acopladas a una fuente energética1,3 Todas las proteínas de canal y muchas proteínas de transporte tan sólo permi ten que los solutos atraviesen la mem brana de forma pasiva (“cuesta abajo”) -u n proceso llamado transporte pasivo (o difusión facilitada). Si la molécula
Principios de transporte a través de membrana
543
bicapa lipidica lugar de unión al soluto
poro acuoso (B) PROTEÍNA DE CANAL
(A) PROTEÍNA TRANSPORTADORA transportada carece de carga, la dirección del transporte pasivo viene determi nada tan sólo por la diferencia de concentración a los dos lados de la membrana (su gradiente de concentración). Sin embargo, si el soluto tiene una carga neta, su transporte se ve influido tanto por su gradiente de concentración como por el gradiente eléctrico a través de la m em brana (el potencial de membrana). El gra diente de concentración y el gradiente eléctrico pueden combinarse para calcu lar la fuerza neta de dirección del flujo, o gradiente electroquímico, para cada soluto cargado. En el Capítulo 14 discutimos este aspecto más detalladamente. De hecho, casi todas la m em branas plasmáticas tienen una diferencia de poten cial (gradiente de voltaje) a través de ellas, siendo habitualmente el interior ne gativo con respecto al exterior. Esta diferencia de potencial favorece la entrada a las células de iones cargados positivamente y se opone a la entrada de iones car gados negativamente. Las células tam bién necesitan proteínas de transporte que bom been activa m ente ciertos solutos a través de la membrana en contra de su gradiente electro químico (“cuesta arriba”); este proceso, conocido como transporte activo, está siempre mediado por proteínas transportadoras. En el transporte activo la acti vidad bom beadora de la proteína de transporte es direccional ya que, tal como explicaremos más adelante, está acoplada a una fuente de energía metabólica como la hidrólisis del ATP o a un gradiente iónico. Así pues, el transporte media do por proteínas de transporte puede ser activo o pasivo, mientras que el trans porte mediado por proteínas de canal siempre es pasivo (Figura 11-4).
Figura 11-3 Visión esquem ática de dos clases de proteínas de transporte a través de m em brana. Se cree que las p roteín as tran sp ortad oras alternan dos conform aciones de forma que el lugar de unión al soluto es accesible secuencialm ente desde un lado de la bicapa, y luego desde el otro lado. Por el contrario, una p ro teín a d e c a n a l forma un poro lleno de agua que atraviesa la bicapa, a través del cual pueden difundir determinados iones.
La tecnología del DNA recom binante ha revolucionado el estudio de las proteínas de transporte a través de m em brana4 Debido a la dificultad de obtener cristales tridimensionales de las proteínas que atraviesan la m em brana varias veces para estudios de cristalografía de rayos X, no conocem os la estructura tridimensional detallada de las proteínas de trans porte a través de mem brana a las que nos referiremos. Por ello, no entendemos los mecanismos moleculares que estas proteínas utilizan para transportar deter-
m olécula transportada O ""
bicapa lipidica
O
proteína
(de canal
"O
cgcgo ogogo
proteina transportadora
/ ( ~ \ ") \ I ■c - ' I
/ \
/ '\
\ /
Í1 gradiente electroquím ico o o
difusión sim ple
544
difusión difusión mediada m ediada por i por canal transportador. TRANSPORTE PASIVO (DIFUSIÓN FACILITADA)
TRANSPORTE ACTIVO
Capítulo 11: Transporte de moléculas pequeñas a través de la membrana
Figura 11-4 Com paración entre un transporte pasivo a favor de un gradiente electroquímico y un transporte activo 'en con tra de un gradiente electroquímico. Mientras que la difusión simple y el transporte pasivo mediados por proteínas de transporte (difusión facilitada) ocurren espontáneamente, el transporte activo requiere de una entrada de energía metabólica. Únicam ente las proteínas transportadoras pueden realizar transporte activo, mientras que tanto las proteínas transportadoras com o las proteínas de canal pueden mediar difusión facilitada.
minados solutos a través de la bicapa lipídica. Sin embargo mediante otros m é todos se han obtenido importantes datos, especialmente mediante la tecnología del DNA recombinante. Una vez se ha clonado y secuenciado el DNA que codifica una proteína transportadora, se puede deducir la secuencia de aminoácidos de la cadena polipeptídica y se puede estimar el número de hélices a transmembrana mediante el análisis de gráficos de hidropatía (se discute en el Capítulo 10). Se pueden utilizar anticuerpos desarrollados contra péptidos sintéticos que corresponden a deter minados segmentos de la cadena polipeptídica para determinar qué segmentos se hallan expuestos a uno y otro lado de la membrana. Además, se puede alterar la secuencia de DNA que codifica zonas específicas de la proteína mediante mutagénesis específica de lugar, y el mRNA mutante correspondiente se puede in yectar a células de mamífero mantenidas en cultivo o a oocitos de Xenopus, donde dirigirá la síntesis de proteínas mutantes cuya actividad transportadora puede entonces estudiarse fácilmente. De esta forma, se pueden identificar los residuos de aminoácido y los segmentos de proteína que son funcionalmente importantes. Sin embargo, los resultados de estos estudios deben interpretarse con precaución ya que a veces una pequeña carga en una zona de la proteína puede tener grandes efectos en la conformación de toda la proteína y, por lo tanto, en su función, incluso aunque la zona alterada no participe directamente en la función estudiada. Sin embargo, como veremos, esta estrategia ha resulta do ser de una gran utilidad. La tecnología del DNA recombinante también ha contribuido de otra m ane ra al conocimiento de las proteínas de transporte a través de membrana. Cuando se ha aislado el DNA que codifica una proteína, generalmente resulta relativa mente sencillo utilizar este DNA como sonda para aislar secuencias de DNA re lacionadas que codifican proteínas homólogas. Estos estudios han revelado que el transporte a través de membrana está mediado por un número sorprenden temente pequeño de familias de proteínas, cuyos miembros tienen estructuras relacionadas entre sí y, probablemente, mecanismos de acción relacionados y un origen evolutivo común. Sin embargo una familia determinada puede con tener un gran número de proteínas diferentes, e incluso a menudo los miem bros de una familia pueden presentar muchas variantes (denominadas isoformas) producidas tanto por genes diferentes a través de transcritos de RNA procesados de forma diferente a partir de un mismo gen. En algunos casos las isoformas difieren en su actividad transportadora, en su momento de expresión durante el desarrollo, en su distribución tisular, en su localización en la célula o en cualquier combinación de estas propiedades. En otros casos, el sentido de esta heterogeneidad resulta poco claro. Antes de discutir con detalle las diferentes clases de proteínas transporta doras a través de membrana y los conocimientos conseguidos mediante estas técnicas, consideraremos brevemente otra clase de moléculas que pueden in crementar selectivamente la permeabilidad de las bicapas lipídicas. Estas molé culas proporcionan un ejemplo sencillo de alguno de los principios discutidos anteriormente.
ion transportado
Se pueden utilizar ionóforos como herramientas para incrementar la permeabilidad de las membranas a determinados iones5 Los iondforos son pequeñas moléculas hidrofóbicas que se disuelven en las bi capas lipídicas e incrementan su permeabilidad a determinados iones inorgá nicos. La mayoría de ellos están sintetizados por microorganismos (probable mente como armas contra competidores o contra presas). Son ampliamente utilizados por los biólogos celulares en estudios sobre membranas sintéticas, cé lulas o orgánulos celulares, como herramientas para incrementar la permeabili dad iónica de la membrana. Existen dos clases de ionóforos -transportadores móviles y form adores de canal (Figura 11-5). Ambos tipos actúan rodeando la carga del ion transportado de forma que pueda atravesar el interior hidrofóbico
Principios de transporte a través de membrana
form ador del canal
transportador m óvil
Figura 11-5 Un transportador iónico móvil y un ionóforo formador de canal. En ambos casos el flujo neto de
iones se produce únicamente a favor de gradiente electroquímico.
545
de la bicapa lipídica. Dado que los ionóforos no están acoplados a fuentes de energía, sólo permiten el movimiento neto de iones a favor de su gradiente elec troquímico. La valinomicina es un ejemplo de un transportador móvil. Se trata de un polímero en forma de anillo que transporta K+a favor de su gradiente electroquí mico, tomando K+ de un lado de la membrana, difundiendo a través de la bica pa, y liberando el K+al otro. El ionóforo A23187 constituye otro ejemplo de trans portador iónico móvil, pero transporta cationes divalentes como Ca2+ y Mg2+. Normalmente actúa como una lanzadera intercambiadora de iones, transpor tando dos H+ hacia el exterior de la célula por cada catión divalente que trans porta hacia el interior celular. Cuando una célula se expone a A23187, el Ca2+ en tra al citosol desde el líquido extracelular a favor de su enorme gradiente electroquímico. Por ello, este ionóforo se utiliza ampliamente en biología celular para increm entar las concentraciones de Ca2+ libre en el citosol, mimetizando así algunos mecanism os de señalización celular (discutidos en el Capítulo 15). La gramicidina A es un ejemplo de ionóforo formador de canal. Se trata de un péptido lineal de únicamente 15 residuos de aminoácido, todos ellos con una cadena lateral hidrofóbica, por lo que constituye el canal iónico más sencillo y m ejor caracterizado de los conocidos. Se cree que dos moléculas de gramicidina se unen, cola con cola, a través de la bicapa lipídica formando un canal trans membrana (Figura 11-6), que permite selectivamente que los iones monovalen tes fluyan a favor de sus gradientes electroquímicos. Estos dímeros son inesta bles y se están formando y disociando constantem ente, de forma que el tiempo medio de apertura de estos canales es alrededor de 1 segundo. Con un elevado gradiente electroquímico la gramicidina A puede transportar unos 20 000 catio nes por canal abierto cada milisegundo, lo cual es 1000 veces más de lo que pue de transportar una molécula de transportador móvil en el mismo tiempo. La gramicidina es sintetizada por ciertas bacterias, quizás para matar otros m icro organismos colapsando los gradientes de H\ Na+y K+, que son esenciales para la supervivencia de la célula; ha sido utilizada con éxito como antibiótico.
Resumen Las bicapas lipídicas son altamente impermeables a la mayoría de moléculas pola res. Para transportar pequeñas moléculas solubles en agua hacia el interior o hacia el exterior de las células o de los compartimientos intracelulares delimitados por membrana, las membranas celulares contienen varias proteínas de transporte, cada una de las cuales es responsable de transferir un determinado soluto o clase de solutos a través de la membrana. Existen dos clases de proteínas de transporte a través de membrana -transportadoras y de canal; ambas forman vías continuas de transporte a través de la bicapa lipídica. Mientras que el transporte mediado por proteínas transportadoras puede ser activo o pasivo, el mediado por proteínas de
546
Capítulo 11: Transporte de moléculas pequeñas a través de la membrana
Figura 11-6 Estructura de un canal de gramicidina. El canal está formado por la asociación de dos péptidos idénticos por sus extremos amino terminales. Cada cadena está plegada formando una hélice P como una lámina p enrollada. (A) Vista lateral y (B) vista superior. Los esqueletos peptídicos que rodean el canal se muestran en a z u l y en verde oscuro mientras que en verde claro se representa el espacio ocupado por las cadenas laterales hidrofóbicas que sobresalen. La bicapa lipídica se muestra en gris. (C) muestra el tamaño de los iones K+no hidratados mientras que (D) muestra una vista superior de una hélice a que atraviesa la membrana, para compararla con la hélice p. Nótese que la hélice a no forma poro, de manera que por sí sola no puede formar canal. (De S. Weinstein, B.A. Wallace, E.R. Blout, J.S. Morrow y W. Veatch, Proc. Nati. Acad. Sci. 76:4230, 1979.)
canal es siempre pasivo. Los ionóforos, pequeñas moléculas hidrofóbicas sintetiza das por microorganismos, pueden utilizarse en estudios de células u orgánulos como herramientas para incrementar la permeabilidad de las membranas celula res a determinados iones inorgánicos.
Proteínas transportadoras y transporte activo a través de membrana1,6 Km
El proceso por el cual una proteína transportadora transfiere una molécula de soluto a través de la bicapa lipídica se parece a una reacción enzima-substrato, y los transportadores implicados en este proceso se comportan com o enzimas es pecializadas ligadas a la membrana. Cada tipo de proteína transportadora tiene uno o más lugares de unión específicos para su soluto (substrato). Cuando el transportador está saturado (es decir, cuando todos estos lugares de unión están ocupados), la velocidad de transporte es máxima. Esta velocidad, indicada como Vmax, es característica del transportador. Cada proteína transportadora tiene ade más una constante característica de unión para su soluto, Kw igual a la concen tración del soluto cuando la velocidad de transporte es la mitad del valor máxi mo (Figura 11-7). Como con las enzimas, la unión del soluto puede ser bloqueada específicam ente por inhibidores competitivos (que compiten por el mismo lugar de unión y que pueden ser transportados o no por el transportador) o por inhibidores no competitivos (que se unen a algún otro lugar y que alteran específicam ente la estructura del transportador). Sin embargo, a diferencia de las reacciones enzima-substrato normales, el soluto transportado no suele ser modificado covalentemente por la proteína transportadora. Algunas proteínas de transporte simplemente transportan un soluto de un lado a otro de la membrana a una velocidad determinada por la Vmax y la KM; re ciben el nombre de transportadores sencillos o uniportes (uniporters). Otras, de cinética más compleja, actúan como transportadores acoplados (coupled transporters), en los que la transferencia de un soluto depende de la transferen cia simultánea o secuencial de un segundo soluto, ya sea en la misma dirección [transporte unidireccional o simporte (symport)] o en dirección opuesta [transporte de intercambio o antiporte (antiport)] (Figura 11-8). La mayoría de las células animales, por ejemplo, toman glucosa del fluido extracelular, donde la concentración del azúcar es alta en relación a la del citosol, mediante un trans porte pasivo a través de transportadores de glucosa que actúan como transporta dores sencillos. Existen varios de estos transportadores de glucosa, todos ellos pertenecientes a la misma familia de proteínas homólogas con 12 posibles hélices a transmembrana. En cambio, las células intestinales y las renales captan glucosa de la luz del intestino y de los túbulos del riñón respectivamente, donde la con centración del azúcar es baja. Estas células transportan la glucosa a través de su membrana plasmática mediante un transporte unidireccional con Na+. Como se
ion cotransportado
O
bicapa lipídica
UNIPORTE
| SIMPORTE
concentración de—► la molécula transportada
Figura 11-7 Comparación entre la cinética de la difusión simple y la de difusión mediada por transportador. Mientras que la velocidad de la primera siempre es proporcional a la concentración de soluto, la de la segunda alcanza un máximo (Vmax) cuando la proteína de transporte está saturada. Cuando el transporte se produce a mitad de la velocidad máxima, la concentración de soluto se aproxima a la constante de unión (KM) del transportador para el soluto y es análoga a la KMde una enzima para su substrato. La gráfica se refiere a un transportador que transporta un soluto; las cinéticas del transporte acoplado de dos o más solutos (véase el texto) son más complejas, aunque muestran básicamente el mismo fenómeno.
Figura 11-8 Tres tipos de transporte mediado por transportadores. El diagrama esquemático muestra proteínas transportadoras actuando como un transportador sencillo (uniporte), como un transportador acoplado unidireccional (simporte) y como un transportador acoplado de intercambio (antiporte).
ANTIPORTE
transporte acoplado
Proteínas transportadoras y transporte activo a través de membrana
547
soluto bicapa lipidica
pong
proteina transportadora que media la difusión facilitada
discute en el Capítulo 10, la proteína banda 3, del eritrocito humano es un trans portador aniónico que intercam bia Cl~ por HCOj. Aunque se desconocen los detalles moleculares, se cree que las proteínas transportadoras transfieren los solutos a través de la bicapa mediante un cambio conform acional reversible que alternativamente expone primero el lugar de unión al soluto a una cara de la m em brana y luego a la otra. En la Figura 11-9 se muestra un modelo esquemático de cómo puede actuar una proteína transpor tadora de este tipo. Actualmente se sabe que los transportadores son proteínas transm em brana de multipaso, por lo que es altamente improbable que actúen girando en el interior de la mem brana o como una lanzadera de una cara a otra a través de la membrana, com o se creía antes. Tal com o se explica más adelante, una m odificación relativamente peque ña del modelo mostrado en la Figura 11-9 es suficiente para unir la proteína transportadora a una fuente de energía (como la hidrólisis del ATP [véase Figu ra 11-11] o un gradiente iónico), y poder bom bear un soluto cuesta arriba, en contra de su gradiente electroquím ico. De hecho, el estudio comparado de al gunas proteínas transportadoras de bacteria y de células de mamífero coincide con la idea de que las diferencias necesarias en el diseño molecular entre una proteína transportadora que media un transporte activo y otra que trabaja de forma pasiva, son mínimas. Algunos transportadores, que en las bacterias utili zan energía almacenada en un gradiente de H+ a través de la membrana plas m ática bacteriana para dirigir la captación activa de diferentes azúcares, son estructuralm ente sim ilares a los transportadores pasivos de glucosa de las cé lulas anim ales; dada la im portancia de los azúcares com o fuente energética no resulta sorprendente que esta superfam ilia de transportadores de azúcares sea muy antigua. Empezamos nuestra discusión sobre el transporte activo considerando una proteína transportadora que desempeña un papel crucial en la generación y el mantenim iento de los gradientes de Na+ y de K+ a través de la membrana plas m ática de las células animales.
La bom ba de Na+-K+de la m em brana plasm ática es una ATPasa7 La concentración de K+ en el interior celular es típicamente de 10 a 20 veces más alta que en el exterior, mientras que ocurre lo contrario para el Na+ (véase Tabla 11-1, pág. 542). Estas diferencias de concentración se mantienen mediante una bom ba de Na+-K+ que se halla en la m em brana plasmática de prácticamente to das las células animales. La bom ba actúa como un transportador de intercambio (antiporte), bom beando de forma activa Na+hacia el exterior de la célula en con tra de su gradiente electroquímico y K+ hacia el interior. Como se explica más adelante, el gradiente de Na+ debido a la bom ba regula el volumen celular a tra vés de sus efectos osmóticos y tam bién se utiliza para dirigir el transporte de azúcares y de aminoácidos hacia el interior de la célula. Casi una tercera parte de toda la energía que consum e una célula animal típica se utiliza para impulsar esta bomba. En las células nerviosas eléctricam ente activas que, como veremos
548
Capítulo 11: Transporte de moléculas pequeñas a través de la membrana
Figura 11-9 Modelo hipotético que muestra de qué forma un cambio de conformación de una proteína transportadora podría mediar la difusión facilitada de un soluto. La proteína transportadora puede existir en dos estados de conformación diferentes: en el estado “pong” los lugares de unión para el soluto A son accesibles desde el exterior de la bicapa; en el estado “ping” estos mismos lugares de unión son accesibles desde el otro lado de la bicapa. Se propone que las transiciones entre ambos estados se producen al azar, de forma completamente reversible. Por lo tanto, si la concentración de A es mayor en el exterior de la bicapa, se unirá una mayor cantidad de A a la proteína transportadora de conformación “pong”, produciéndose un transporte neto de A a favor de su gradiente electroquímico.
lugar de unión al K+ y a la ouabaína gradiente electroquímico de sodio
O
gradiente electroquímico de potasio lugar de unión al IMa+ CITOSOL
Figura 11-10 La ATPasa de Na+-K+. Esta proteína transportadora bombea activamente Na* hacia el exterior y K+ hacia el interior de la célula, en contra de sus gradientes electroquímicos. Por cada molécula de ATP hidrolizada dentro de la célula, se bombean tres Na+hacia el exterior y dos K+hacia el interior. La ouabaína, inhibidor específico de la bomba, y el K+ compiten por el mismo lugar del lado externo de la ATPasa.
más adelante, durante la propagación del impulso nervioso ganan continua mente pequeñas cantidades de Na+y pierden pequeñas cantidades de K+, la can tidad de energía utilizada en la bom ba de Na+-K+ se acerca a los dos tercios de los requerimientos totales energéticos de la célula. Un progreso importante en el conocim iento de la bom ba de Na+-K+ se reali zó en 1957 gracias al descubrimiento de una enzima que hidroliza el ATP a ADP y fosfato y que necesita Na+ y K+ para su actividad óptima. Un dato importante que relacionó esta ATPasa de Na+-K+ con la bom ba de Na+-K+ fue la observación de que un inhibidor conocido de la bomba, la ouabaína, también inhibe la ATP asa. Pero la prueba crucial de que la hidrólisis del ATP proporciona de alguna manera la energía para impulsar la bom ba se obtuvo en unos estudios efectua dos con fantasmas de eritrocito en los que podían variarse las concentraciones de iones, ATP y fármacos a ambos lados de la membrana, observándose luego los efectos sobre el transporte iónico y sobre la hidrólisis del ATP. Se encontró que (1) el transporte de Na+ y de K+ está estrechamente acoplado a la hidrólisis del ATP, de tal modo que un proceso no puede producirse sin el otro; (2) el transporte iónico y la hidrólisis del ATP sólo pueden ocurrir cuando existe Na+y ATP dentro de los fantasmas, y K+ en el exterior; (3) la ouabaína únicamente tie ne efectos inhibidores cuando se encuentra fuera de los fantasmas, donde com pite por el centro de unión del K+; y (4) por cada molécula de ATP hidrolizada (cada molécula de ATPasa puede hidrolizar 100 moléculas de ATP por segundo), se bom bean tres Na+hacia el exterior y dos K+hacia el interior (Figura 11-10). Aunque estos experimentos suministraron evidencias concluyentes de que el ATP proporciona la energía necesaria para el bombeo de iones Na+y K+ a tra vés de la mem brana plasmática, no explicaban cómo se halla acoplada la hidró lisis del ATP al transporte iónico. Una explicación parcial se obtuvo con el ha llazgo de que durante el ciclo de bom beo el grupo fosfato terminal del ATP se transfiere a un residuo de ácido aspártico de la ATPasa y luego este grupo fosfato se hidroliza, com o se explica en la Figura 11-11. En fantasmas de eritrocito la bom ba Na+-K+ puede revertirse, produciendo ATP: cuando experimentalmente se increm entan los gradientes de Na+ y de K+ hasta el punto en que la energía almacenada en estos gradientes electroquími cos es mayor que la energía química de la hidrólisis dei m r , estos iones se des plazan a favor de sus gradientes electroquímicos y se sintetiza ATP a partir de ADP y fosfato por la ATPasa de Na+-K+. Así pues, la forma fosforilada de la ATPa sa (paso 2 en la Figura 11-11) puede relajarse ya sea donando su fosfato al ADP (del paso 2 al paso 1) o cambiando su conformación (del paso 2 al paso 3). El h e cho de que el exceso de la variación de energía libre se utilice para sintetizar ATP o para bombear Na+ hacia afuera del fantasma depende de las concentraciones relativas de ATP, ADP y fosfato y de los gradientes electroquímicos de Na+y de K\ La ATPasa de Na+-K+ se ha purificado y se ha visto que consiste en una gran subunidad catalítica transmembrana de multipaso (aproximadamente de 1000
Proteínas transportadoras y transporte activo a través de membrana
549
ESPACIO EXTRACELULAR |a p p |
@
m
CITOSOL
I
residuos de aminoácido de longitud) y en una glucoproteína más pequeña, de paso único, asociada a ella. La subunidad catalítica tiene centros de unión para Na+y para ATP en su superficie citoplasmática, y para K+en su superficie externa y durante el ciclo de bom beo se fosforila y desfosforila de forma reversible. La función de la glucoproteína es incierta, aunque se sabe que es necesaria para el transporte intracelular de la subunidad catalítica hasta la membrana plasmática. Se puede reconstituir una bom ba Na+-K+ funcional a partir del complejo purifi cado: la ATPasa se solubiliza en detergente, se purifica y se mezcla con los fosfolípidos adecuados; cuando se elimina el detergente, se han formado vesículas de m em brana que en presencia de ATP bom bean Na+ y K+ en direcciones opuestas (véase Figura 10-22).
La ATPasa de Na+-K+es necesaria para m antener el equilibrio osm ótico y estabilizar el volumen celular8 Debido a que la ATPasa de Na+-K+ bom bea tres iones cargados positivamente hacia el exterior de la célula por cada dos que bom bea hacia el interior, es electrogénica ; es decir, dirige una corriente neta a través de la membrana tendiendo a crear un potencial eléctrico, con el interior negativo en relación al exterior. Sin embargo, este efecto de la bom ba en sí mismo no contribuye más de un 10% al potencial de membrana. Como veremos, el 90 % restante depende tan sólo indi rectam ente de la bomba. Por otra parte, la ATPasa de Na+-K+ desempeña un papel más directo en la regulación del volumen celular: controla las concentraciones de solutos dentro de la célula, y por consiguiente regula las fuerzas osmóticas que pueden hacer que la célula se hinche o se retraiga (Figura 11-12). Como se explica en el Panel 11-1, las células contienen una gran concentración de solutos incluyendo nume rosas moléculas orgánicas cargadas negativamente (los denominados aniones 550
Capítulo 11: Transporte de moléculas pequeñas a través de la membrana
posterior fosforilación por ATP (2) en la cara citoplasmática de la ATPasa inducen a la proteína a un cam bio de conform ación que transfiere el Na+a través de la membrana y lo libera al exterior (3). A continuación, la unión de K* sobre la superficie exterior (4) y la consiguiente desfosforilación (5) devuelven a la proteína a su conform ación original, transfiriendo el K+ a través de la m em brana y liberándolo en el citosol (6). Estos cambios de conform ación son análogos a las transiciones ping pong que se muestran en la Figura 11-9, a excepción de que en este caso la fosforilación dependiente de Na+y la desfosforilación dependiente de K+de la proteína, que ocurren de una manera ordenada, permiten a la proteína realizar un trabajo útil. A pesar de que, para simplificar, se ha dibujado un solo lugar de unión al Na+y un solo lugar de unión al K+, en realidad la bom ba presenta tres lugares de unión al Na+y dos al K+. Además, aunque se ha demostrado que la ATPasa salta entre dos estados conform acionales, existen evidencias de que ello ocurre a través de series de cambios conform acionales más com plejos durante el ciclo real de bombeo.
crenado
norm al
hinchado
lisado
ERITROCITO concentración iónica del espacio extracelular
HIPERTÓNICA
ISOTONICA
HIPOTONICA
MUY HIPOTÓNICA
fijos ) y los cationes que las acompañan y que son necesarios para equilibrar la carga, todos los cuales generan un elevado gradiente osmótico que tiende a “chu par” agua hacia el interior de la célula. En las células animales este efecto es con trarrestado por un gradiente osmótico opuesto generado a causa de las elevadas concentraciones de iones inorgánicos -sobre todo de Na+y de Cl_- del medio ex tracelular. La ATPasa de Na+-K+ mantiene el equilibrio osmótico bombeando Na+ hacia el exterior, que vuelve a entrar a favor de su gradiente electroquímico; el Cl~ se mantiene en el exterior debido al potencial de membrana. La importancia de la ATPasa de Na+-K+ en el control del volumen celular se pone de manifiesto por el hecho de que las células animales se hinchan y pue den llegar a reventar si se tratan con ouabaína, que inhibe la ATPasa de Na+-K+. Evidentemente, las células disponen de otros sistemas de solucionar sus proble mas osmóticos. Las células vegetales y muchas bacterias están protegidas contra el hinchamiento excesivo y la rotura mediante paredes celulares semirrígidas que rodean sus membranas plasmáticas; en las amebas el exceso de agua que penetra por ósmosis se recoge en unas vacuolas contráctiles que vierten periódi cam ente su contenido al exterior (véase Panel 11-1). Pero para la mayoría de las células de los animales, la ATPasa de Na+-K+resulta crucial.
Figura 11-12 Respuesta de un eritrocito hum ano a cambios de la osmolaridad (también denominada tonicidad) del fluido extracelular.
Debido a que la membrana plasmática es libremente permeable al agua, el agua se desplazará hacia el interior o hacia el exterior de las células a favor de su gradiente de concentración, un proceso denominado ósmosis. Si las células se colocan en una solución hipotónica (por ejemplo, una solución que contenga una baja concentración de soluto, y por lo tanto una elevada concentración de agua), se producirá un movimiento neto de agua hacia el interior de las células, originando su hinchamiento y explosión (lisado). Contrariamente, si las células se colocan en una solución hipertónica, se encogerán.
Algunas bom bas de Ca2+ tam bién son ATPasas unidas a m em brana9 Las células eucariotas mantienen unas concentraciones de Ca2+ muy bajas en el citosol (-1 0 -7 M), en comparación con las concentraciones extracelulares de Ca2+, mucho más elevadas (~10~3 M). Así, una entrada de Ca2+, aunque sea pe queña, a la célula, increm enta significativamente la concentración de Ca2+ libre en el citosol. El flujo de Ca2+ a favor de gradiente de concentración en respuesta a señales extracelulares constituye una forma rápida de transmisión de estas se ñales a través de la m em brana plasmática. Por lo tanto el mantenimiento de un elevado gradiente de Ca2+ es importante para la célula. El gradiente de Ca2+ se mantiene en parte por la acción de bom bas de Ca2+ que existen en la membrana plasmática, las cuales transportan Ca2+ de forma activa hacia el exterior de la cé lula. Se sabe que una de estas bom bas es una ATPasa, mientras que la otra es un transportador de intercambio (antiporte) impulsada por el gradiente electroquí mico de Na+. La bom ba de Ca2+ m ejor conocida es una ATPasa unida a la membrana del retículo sarcoplasmático de las fibras musculares. El retículo sarcoplasmático -u n a tipo especializado de retículo endoplasm ático- forma una red de sacos tu bulares en el citoplasma de las células musculares que actúa como reservorio intracelular de Ca2+. (Cuando un potencial de acción despolariza la membrana de la célula muscular, se libera Ca2+ del retículo sarcoplasmático hacia el citosol, es timulando la contracción muscular, como se discute en el Capítulo 16.) La bom ba de Ca2+, que constituye alrededor del 90% de la proteína de membrana del orgánulo, es la responsable del bom beo del Ca2+ desde el citosol hacia el interior del retículo sarcoplasmático. (El retículo endoplasmático de las células no mus culares contiene una ATPasa dependiente de Ca2+ similar a ésta, aunque en m e nor cantidad, por lo que es más difícil de purificar.) Proteínas transportadoras y transporte activo a través de membrana
551
ORIGEN DE LA OSMOLARIDAD INTRACELULAR
&
•
0 3
L a s m a c r o m o lé c u la s p o r s í m is m a s c o n t r ib u y e n m u y p o c o a la o s m o la r id a d
C o m o r e s u lta d o d e l t r a n s p o r t e a c tiv o y d e lo s p r o c e s o s m e t a b ó lic o s , la c é lu la
d e l in t e r io r c e lu la r y a q u e , a p e s a r d e su g r a n t a m a ñ o , c a d a u n a d e e lla s c u e n ta c o m o
c o n tie n e u n a e le v a d a c o n c e n t r a c ió n d e p e q u e ñ a s m o lé c u la s o r g á n ic a s , ta le s
u n a s o la m o lé c u la y h a y r e la tiv a m e n t e p o c a s d e e lla s e n c o m p a r a c ió n c o n el n ú m e r o d e
c o m o a z ú c a r e s , a m in o á c id o s y
a tr a v é s d e la m e m b r a n a p la s m á tic a hac ia el in te r io r d e la c é lu la . Si n o so n b o m b e a d o s hacia
n u c le ó tid o s , p a r a las c u a le s la m e m b r a n a p la s m á t ic a e s im p e r m e a b le . C o m o
el e x te r io r y si n o e x is te n o tra s m o lé c u la s en el in te r io r d e la c é lu la q u e in te ra c tú e n c on e llo s
b io ló g ic a s e s tá n m u y c a r g a d a s y a t r a e n
la m a y o r ía d e e s to s m e t a b o lit o s e s tá n c a r g a d o s , t a m b ié n a t r a e n c o n t r a io n e s .
e q u ilib ra r s e m a n te n ie n d o la m is m a c o n c e n tra ció n
m u c h o s io n e s in o r g á n ic o s d e c a r g a o p u e s ta . D e b id o a su e le v a d o n ú m e r o , e s to s
T a n t o lo s p e q u e ñ o s m e t a b o lit o s c o m o s u s c o n t r a io n e s t ie n e n u n a r e p e r c u s ió n
c o n tr a io n e s c o n t r ib u y e n d e f o r m a im p o r t a n t e
im p o r t a n t e e n la o s m o la r id a d in tr a c e lu la r .
p e q u e ñ a s m o lé c u la s q u e h a y e n la c é lu la . S in e m b a r g o , la m a y o r ía d e m a c r o m o lé c u la s
a la o s m o la r id a d in tr a c e lu la r .
N o r m a lm e n t e la o s m o la r id a d d e l líq u id o e x tr a c e lu la r e s d e b id a p r in c ip a lm e n te a p e q u e ñ o s io n e s in o rg á n ic o s . E s to s io n e s se filtra n le n ta m e n te
in flu y e n d o en su d is trib u c ió n , p u e d e n lle g a r a d e n tr o y fu e r a d e la c é lu la . P e ro la p re s e n c ia en la c é lu la d e m a c r o m o lé c u la s c a rg a d a s y d e m e ta b o lito s q u e a tra e n a e s to s io n e s g e n e ra el e fe c to D o n n a n : h a c e q u e e n el e q u ilib rio , la c o n c e n tra c ió n to ta l d e io n e s in o rg á n ic o s (y p o r ta n to , su c o n trib u c ió n a la o s m o la rid a d ) s ea m a y o r d e n tr o q u e fu e ra d e la c é lu la .
EL PROBLEMA D e b id o a lo s f a c to r e s e n u n c ia d o s m á s a r r ib a , u n a c é lu la q u e n o c o n t r o le su o s m o la r id a d t e n d r á e n su in t e r io r u n a c o n c e n tr a c ió n t o t a l d e s o lu to s m a y o r q u e e n e l e x te r io r . C o m o r e s u lta d o d e e llo , la c o n c e n tr a c ió n d e a g u a s e r á m a y o r e n e l e x t e r io r q u e en e l in te r io r d e la c é lu la . E s ta d ife r e n c ia e n la c o n c e n tr a c ió n d e a g u a a t r a v é s d e la m e m b r a n a p la s m á tic a h a r á q u e el a g u a s e d e s p la c e c o n t in u a m e n t e h a c ia el in te r io r d e la c é lu la d e b id o a l p r o c e s o d e o s m o s is , c a u s a n d o su r o tu r a .
LA SOLUCIÓN L a s c é lu la s a n im a le s y la s b a c te r ia s c o n tr o la n
L a s c é lu la s v e g e ta le s e v ita n su
M u c h o s p r o to z o o s c o n s ig u e n n o h in c h a rs e
su o s m o la r id a d in t r a c e lu la r b o m b e a n d o a c t iv a m e n t e h a c ia e l e x t e r io r io n e s
h in c h a m ie n t o m e d ia n t e su p a r e d r íg id a , d e f o r m a q u e p u e d e n t o le r a r d ife r e n c ia s
d e a g u a a p e s a r d e q u e m a n t ie n e n u n a d if e r e n c ia o s m ó tic a a t r a v é s d e la m e m b r a n a
in o r g á n ic o s , c o m o e l N a +, d e f o r m a q u e su
o s m ó t ic a s a t r a v é s d e s u s m e m b r a n a s
p la s m á t ic a , e x p u ls a n d o a g u a p e r ió d ic a m e n te
c ito s o l c o n t ie n e u n a c o n c e n t r a c ió n to ta l d e io n e s in o r g á n ic o s m e n o r q u e la d e l flu id o
p la s m á tic a s : a p a r e c e u n a p r e s ió n in t e r io r q u e , e n e l e q u ilib r io , im p id e q u e e n t r e m á s
m e d ia n t e v a c u o la s c o n tr á c tile s e s p e c ia le s .
e x t r a c e lu la r , c o m p e n s a n d o a s í su e x c e s o d e s o lu to s o r g á n ic o s .
agua.
© 0
552
l0NES
Panel 11*1 Equilibrio del agua intracelular: el problema y su solución.
La ATPasa de Ca2+ puede ser analizada bioquímicamente mediante los mis mos métodos que los utilizados para la ATPasa de Na+-K+y se ha encontrado que ambas bombas actúan de una forma muy similar. En efecto, estudios de secuenciación de DNA indican que las ATPasas de Na+-K+ y de Ca2+ son proteínas homólogas. En cada caso, la gran subunidad catalítica se presenta en varias isoformas, se cree que tiene alrededor de 10 posibles hélices a que atraviesan la membrana y que se fosforila y desfosforila durante el ciclo de bombeo.
Algunas enzimas ligadas a membrana que sintetizan ATP son ATPasas de transporte que actúan en sentido opuesto10 Tanto la membrana plasmática de las bacterias como la membrana interna de las mitocondrias y la membrana tilacoidal de los cloroplastos presentan una enzima análoga a las dos ATPasas de transporte mencionadas anteriormente, pero que normalmente actúa en sentido opuesto. En lugar de ser la hidrólisis del ATP la que impulsa el transporte iónico, en este caso es un gradiente de H+ a través de estas membranas el que dirige la síntesis de ATP a partir de ADP y fos fato. Este gradiente de H+ se genera durante el proceso de transporte de electro nes de la fosforilación oxidativa (en bacterias aeróbicas y en mitocondrias) o mediante la bomba de H+ activada por la luz (bacteriorrodopsina) en Halobacterium. Como ocurre con las ATPasas de transporte, la enzima que normalmen te sintetiza ATP, llamada ATP sintasa, puede trabajar en ambas direcciones de pendiendo de las condiciones: puede hidrolizar ATP y bombear H+ a través de la membrana o puede sintetizar ATP cuando fluyen H+ a través de la enzima en la dirección opuesta. En la mayoría de las células, la ATP sintasa es responsable de la generación de la mayoría del ATP celular, como se discute en detalle en el Capítulo 14.
El transporte activo puede ser impulsado por gradientes iónicos11 Muchos sistemas de transporte activo no son impulsados directamente por la hidrólisis del ATP sino por la energía almacenada en gradientes iónicos. La ener gía libre liberada durante el desplazamiento de un ion inorgánico a favor de su gradiente electroquímico se utiliza como fuerza impulsora para bombear otros solutos en contra de sus gradientes electroquímicos. Así pues, todas estas proteí nas actúan como transportadores acoplados -algunos como transportadores unidireccionales, otros como transportadores de intercambio. En la membrana plasmática de las células animales el ion cotransportado cuyo gradiente electro químico proporciona la fuerza impulsora para el transporte activo de una se gunda molécula normalmente es el Na+. El Na+ que entra en la célula durante este transporte es bombeado hacia el exterior mediante la ATPasa de Na+-K+, la cual, al mantener el gradiente de Na+, impulsa indirectamente el transporte de las otras moléculas que se cotransportan con el Na+. (Por esta razón se dice que los transportadores impulsados por iones median transportes activos secunda rios, mientras que se dice que las ATPasas median transportes activos primarios.) Las células epiteliales del intestino y del riñón, por ejemplo, contienen varios sistemas de transporte unidireccional a través de la membrana plasmática que son impulsados por el gradiente de Na+. Cada sistema importa específicamente a la célula un pequeño grupo de azúcares o de aminoácidos relacionados. En es tos sistemas el soluto y el Na+ se unen a diferentes lugares de la proteína trans portadora; el Na+ tiende a entrar a la célula a favor de su gradiente electroquími co, por lo que, en cierto sentido, “arrastra” al azúcar o al aminoácido hacia el interior de la célula. Cuanto mayor sea el gradiente electroquímico de Na+, m a yor será la velocidad de entrada del soluto a la célula; por el contrario, si la con centración de Na+ en el fluido extracelular se reduce fuertemente, el transporte de soluto se detiene. En bacterias y en levaduras, así como en muchos orgánulos envueltos por membrana de las células animales, la mayoría de los sistemas de transporte acti
Proteínas transportadoras y transporte activo a través de membrana
553
vo impulsados por gradientes iónicos dependen del gradiente de H+y no del de Na+, lo cual refleja la predominancia en estas membranas de las ATPasas de H+ respecto a la práctica ausencia de ATPasas de Na+. El transporte activo de mu chos azúcares y aminoácidos en bacterias, por ejemplo, está impulsado por el gradiente de H+a través de la m em brana plasmática.
Las proteínas de transporte impulsado por Na+de la m em brana plasm ática regulan el pH citosólico12 La estructura y la función de la mayoría de las macromoléculas están notable mente influenciadas por el pH, y la mayoría de ellas actúan de forma óptima a un pH determinado. Por ejemplo, las enzimas lisosomales actúan mejor al bajo pH (~5) de los lisosomas mientras que las enzimas citosólicas actúan mejor a pH casi neutro (-7,2) del citosol. Por lo tanto, resulta crucial que las células contro len el pH de sus compartimientos intracelulares. La mayoría de la células tienen en su mem brana plasmática uno a varios ti pos de sistemas de transporte de intercambio impulsados por Na+, que regulan el pH intracelular (citosólico) (pH¡) manteniéndolo alrededor de 7,2. Estas proteí nas usan la energía almacenada en el gradiente de Na+ para reducir la acidez eli minando el exceso de iones H+ consumidos o producidos en la célula a conse cuencia de las reacciones que producen H+. Se utilizan dos mecanismos: los H+ son transportados directamente al exterior de la célula o se importa H C 03_ al in terior de la célula para neutralizar los H+del citosol. Uno de estos transportadores de intercambio que utiliza el primer mecanismo es un intercambiador de Na+-H+ que acopla la entrada de Na+a la salida de H+. Otro transportador, que utiliza una com binación de ambos mecanismos, es un intercambiador de Cl~-HCO~3 impul sado por Na+que acopla la entrada de Na+ y de H C 03 a la salida de Cl~ y H+ (de forma que entra NaHC03 y sale HC1). El transportador C1~-HC03 impulsado por Na+es dos veces más efectivo que el transportador de Na+-K+, en el sentido de que por cada Na+ que entra en la célula bom bea hacia el exterior un H+y neutra liza otro H+. Si existe HCOj asequible, como ocurre habitualmente, este trans portador es el más importante en la regulación del pH¡. Ambos transportado res de intercam bio están regulados por el pH¡, incrementando su actividad cuando el pH¡ desciende. En algunas células existe un tercer transportador dependiente de Na+ que desempeña un papel importante en la regulación del pH¡. Este transportador unidireccional de Na'-HCOj transporta un Na+ al interior de la célula con uno o varios iones H C 03. En contraste con los otros dos transportadores que acaba mos de describir, este simporte es electrogénico ya que su efecto neto es trans portar cargas negativas al interior de la célula. Cuanto menor es el voltaje en el interior de la célula, mayor es su transporte. En consecuencia, en las células que presentan este transportador -principalm ente las células de la glia del sistema nervioso- el pH¡ es sensible a cambios en el potencial de membrana. Parece que esta sensibilidad permite a estas células colaborar en la regulación del pH extracelular local del cerebro en respuesta a cambios de su actividad eléctrica. Un intercambiador de Ct-HCOj independiente de Na+, similar a la proteína banda 3 de la mem brana de los eritrocitos discutida en al Capítulo 10, también juega un papel importante en la regulación del pH¡ de algunas células nucleadas. Como los transportadores dependientes de Na+, el intercambiador de CL-HCOj está regulado por el pH¡, pero en este caso el desplazamiento de H C 03 se produ ce norm alm ente hacia el exterior de la célula, a favor de su gradiente de concen tración. La velocidad de eflujo de H C 03 y de influjo de Cl" incrementa cuando el pHj aumenta, disminuyendo así el pH¡ cuando el citosol empieza a ser demasia do alcalino. Como se discute en el Capítulo 13, el bajo pH de los lisosomas, así como el de los endosomas y de las vesículas de secreción, se mantiene por ATPasas de pendientes de H+que utilizan energía de hidrólisis de ATP para bombear H+desde el citosol hacia el interior de estos orgánulos.
554
Capítulo 11: Transporte de moléculas pequeñas a través de la membrana
En las células epiteliales, la distribución asim étrica de proteínas transportadoras perm ite el transporte transcelular de solutos13 En las células epiteliales, como las que participan en la absorción de los nutrien tes del intestino, las proteínas transportadoras se hallan distribuidas de manera asimétrica en la membrana plasmática y gracias a ello contribuyen al transporte transcelular de los solutos absorbidos. Tal como muestra la Figura 11-13, los transportadores unidireccionales acoplados a Na+localizados en el dominio apical (absortivo) de la membrana plasmática transportan nutrientes de forma activa hacia el interior de la célula, generando marcados gradientes de concentración, mientras que en el dominio basal y lateral (basolateral) existen otras proteínas de transporte, independientes de Na+, que permiten que los nutrientes abandonen la célula a favor de su gradiente de concentración. La ATPasa de Na+-K+que mantiene el gradiente de Na+a través de la membrana plasmática de estas células está locali zada en el dominio basolateral. Se cree que tanto las células renales como las intes tinales utilizan unos mecanismos parecidos a éste para bombear el agua desde un espacio extracelular a otro. En muchas de estas células epiteliales, la superficie de la mem brana plas mática se halla notablem ente incrementada mediante la formación de miles de microvilli, que se proyectan en forma de finas evaginaciones digitiformes de la superficie apical de cada célula (Figura 11-13). Estos microvilli pueden aumentar el área total de absorción de una célula más de 25 veces, incrementando así en gran medida su capacidad de transporte.
Algunas ATPasas transportadoras de m em brana son homólogas a las ATPasas transportadoras de eucariotas, que participan en la resistencia a drogas y en la fíbrosis quística: la superfamilia de transportadores ABC14 El último tipo de proteínas transportadoras que presentaremos es una familia de ATPasas transportadoras de una gran importancia clínica, a pesar de que sus
lum en del intestino
BAJO
m icrovilli del dom inio apical transporte unidireccional de glucosa dirigido por Na+
unión estrecha
dom inio lateral
epitelio intestinal
proteína transportadora que perm ite la difusión facilitada de glucosa dom inio basal fluido extracelular BAJO
Proteínas transportadoras y transporte activo a través de membrana
Figura 11-13 La distribución asim étrica de las proteínas transportadoras en la m em brana plasm ática de una célula epitelial intestinal da lugar al transporte transcelular de glucosa a través del epitelio intestinal. El proceso que se muestra genera el transporte de glucosa desde la luz del intestino hasta el fluido extracelular (desde donde pasa a la sangre). La glucosa se bombea hacia el interior de la célula a través del dominio apical de la membrana por un cotransporte unidireccional de glucosa impulsado por el Na+, y la glucosa pasa al exterior de la célula (a favor de su gradiente de concentración) mediante difusión facilitada, por una proteína transportadora de glucosa diferente, existente en los dominios basal y lateral. El gradiente de Na+que impulsa el transporte acoplado unidireccional (simporte) de glucosa se mantiene mediante la ATPasa de Na+-K+del dominio basolateral de la membrana plasmática, que mantiene baja la concentración intracelular de Na+. Las células adyacentes están conectadas entre sí mediante uniones impermeables (llamadas uniones estrechas o estancas), las cuales desempeñan una función dual en el proceso de transporte ilustrado aquí: impiden que los solutos atraviesen los epitelios entre las células, permitiendo así que el gradiente de concentración de glucosa se mantenga a través de la lámina de células, y también actúan como barreras de difusión en la membrana plasmática, confinando las diversas proteínas transportadoras a sus respectivos dominios de membrana (véase Figura 10-37).
555
Ì
lipopolisacárido porina lipoproteína peptidoglucano proteina soluble en el espacio periplasm ático proteina de transporte
bicapa lip id ica , externa 25 nm espacio peri- ------plasm ático bicapa / lip id ica ^ interna
funciones normales en las células eucariotas se han descrito muy recientem en te. La primera de estas proteínas en ser caracterizada se encontró en bacterias. Ya hem os mencionado que la membrana plasmática de todas las bacterias con tiene proteínas transportadoras que utilizan el gradiente de H+ a través de la m em brana para bom bear varios nutrientes hacia el interior de la célula. Muchas de ellas también tienen ATPasas de transporte que utilizan la energía de hidróli sis del ATP para importar varios tipos de azúcares, aminoácidos y pequeños péptidos. En bacterias como E. coli, que tienen doble membrana (Figura 11-14), las ATPasas de transporte se hallan localizadas en la membrana interna; existen m ecanism os auxiliares que permiten captar los nutrientes y cederlos a los trans portadores (Figura 11-15). Las ATPasas de transporte de la mem brana plasmática de las bacterias per tenecen a la familia de proteínas de transporte más amplia y diversa de las co nocidas. Se denom ina superfam ilia de transportadores ABC porque cada uno de sus miembros contiene un “cassette” de unión al ATP (ATP-Mnding cassette) altam ente conservado (Figura 11-16). Se han descrito más de 50 transportadores ABC y, aunque habitualm ente cada uno de ellos es específico de un substrato o de una clase de substratos determinados, la variedad de substratos transporta dos por esta superfamilia es enorme, incluyendo aminoácidos, azúcares, polisacáridos, péptidos e incluso proteínas. Mientras que la mayoría de los miembros de esta familia han sido descritos en procariotas, el número de transportadores
proteína form adora de canal (porina)
EX TER OR CELULAR
membrana interna es la membrana plasmática de la célula. Entre las bicapas lipídicas interna y externa existe un peptidoglucano rígido y muy poroso, compuesto de proteínas y polisacáridos, que constituye la pared celular bacteriana; está unido a moléculas lipoproteicas de la membrana externa y llena el espacio periplasmático (sólo se muestra una pequeña parte del peptidoglucano). Este espacio también contiene diversas moléculas proteicas solubles. Los filamentos dibujados a trazos verdes de la parte superior de la figura representan las cadenas de polisacárido de unas moléculas especiales de polisacárido que forman una monocapa externa en la membrana externa; para mayor claridad únicamente se han dibujado algunas de estas cadenas. Las bacterias que presentan doble membrana se denominan gram negativas porque no retienen el colorante azul oscuro utilizado en este procedimiento de tinción. Las bacterias que presentan una sola membrana (y finas paredes celulares), como los estafilococos y los estreptococos, retienen el colorante azul, por lo que son denominadas gram positivas; su única membrana es análoga a la membrana interna (plasmática) de las bacterias gram negativas.
Figura 11-15 Sistema auxiliar de transporte asociado con las ATPasas de transporte de bacterias con doble m em brana. El soluto difunde a través de proteínas formadoras de canal (llamadas porinas) de la membrana exterior y se unen a una proteína
MEMBRANA EXTERNA
p r o t e in a p e r ip la s m á t ic a
p r o t e in a p e r ip la s m á t ic a
q u é s e u n e a s u b s t r a to s , Y q u e s e u n e a s u b s tr a to s , u n id a a u n s o lu to
O
e n f o r m a lib r e
E S P A C IO P E R IP L A S M Á T IC O
M EMBRANA IN T E R N A (P L A S M Á T IC A )
556
Figura 11-14 Visión esquemática de una pequeña sección de la doble membrana de una bacteria E. coli. La
Capítulo 11: Transporte de moléculas pequeñas a través de la membrana
periplasmática que se une a substratos. Como resultado de ello, la proteína que se une al substrato sufre un cambio de conformación que le permite unirse a una proteína transportadora de la membrana plasmática, la cual toma el soluto y lo transfiere activamente a través de la bicapa mediante una reacción dirigida por la hidrólisis del ATP. Para mayor sencillez del dibujo, se ha omitido el peptidoglucano; su porosa estructura permite que tanto las proteínas que se unen a los substratos como los solutos solubles en agua se desplacen por difusión simple a través de él.
T abla 11-2 Algunas fam ilias de p ro teín as tran sp o rtad o ras Fam ilia*
M iem bros rep resen tativos
Transportadores de azúcares
transportadores pasivos de glucosa en células de mamífero algunos transportadores de azúcares impulsados por H+, en bacterias ATPasas de Na+-K+ ATPasas de Ca2+ ATPasa de resistencia a múltiples drogas (MDR) en células de mamífero ATPasas dependientes de proteínas de unión a substratos periplasmáticos, en bacteria ATPasa de resistencia a la cloroquina, en
ATPasas de transporte de cationes Transportadores ABC
P. falciparum
Transportadores de intercambio (antiporters) de aniones
exportadores de feromonas de acoplamiento sexual, en levadura bomba de péptidos, en la membrana del ER de vertebrados proteína reguladora transmembrana de fibrosis quística (CFTR) proteína banda 3 en eritrocitos intercambiador de aniones, en otras células
(CI--HCO3) Transportadores de intercambio de cationes Transportadores de intercambio de cationes/aniones Transportadores unidireccionales impulsados por Na+
intercambiador de Na+-H+ intercambiador de C1-HCOj dependiente de Na Transportador unidireccional de glucosa y Na+, en células intestinales Transportador unidireccional de prolina y Na+, en bacterias Transportador unidireccional de Na+-HCOj, en células gliales
dom inios de unión al ATP Figura 11-16 Dibujo esquem ático de un transportador ABC típico.
(A) Diagrama topològico. (B) Disposición hipotética de la cadena polipeptídica en la membrana. El transportador está compuesto por cuatro dominios: dos dominios muy hidrofóbicos, cada uno de ellos con seis posibles segmentos intramembrana que de alguna forma deben participar en el proceso de translocación, y dos dominios catalíticos que unen ATP (o “cassettes”). El algunos casos las dos mitades del transportador están formadas por un mismo polipéptido {como en la figura) mientras que en otros están formados por dos polipéptidos diferentes.
* Los miembros de una misma familia son similares entre sí en cuanto a secuencia de amino ácidos y, por lo tanto, se cree que han evolucionado a partir de una proteína ancestral común.
descritos en eucariotas es cada vez mayor. El primero en ser identificado se des cubrió gracias a su capacidad de bom bear drogas hidrofóbicas hacia el exterior de células eucariotas. Uno de estos transportadores es la proteúia de resistencia a m últiples drogas (MDR, de MultiDrug Resistance) cuya sobreexpresión en cé lulas cancerosas humanas puede hacerlas simultáneamente resistentes a una gran variedad de drogas citotóxicas no relacionadas químicamente que son am pliamente utilizadas en la terapia del cáncer. El tratamiento con una de estas drogas puede provocar la selección de las células que sobreexpresan la proteína transportadora MDR; el transportador bom bea la droga hacia el exterior de la célula, reduciendo así su toxicidad y confiriendo resistencia a la célula contra una gran variedad de agentes terapéuticos. En el protozoo Plasmodium falciparum se produce un fenómeno relacionado con éste e igualmente siniestro, que causa la malaria. Más de 200 millones de personas han sido infectadas por este parásito, que sigue siendo la mayor causa de muerte en humanos, matando más de un millón de personas cada año. El control de la malaria se ve entorpecido por el desarrollo de resistencia a la droga antimalárica cloroquina; se ha detecta do un P. falciparum resistente que ha amplificado el gen que codifica el trans portador ABC que transporta cloroquina hacia el exterior de la célula. El número de miembros conocidos de la superfamilia ABC de transportadores en las células eucariotas crece rápidamente, y la función normal de algunos de ellos va siendo cada vez más clara. En levaduras, un transportador ABC es el responsable
Proteínas transportadoras y transporte activo a través de membrana
557
de exportar una feromona de acoplamiento sexual (un péptido de 13 am inoáci dos) a través de la membrana plasmática de la célula de levadura. En la mayoría de las células de vertebrados, un transportador ABC de la membrana del retículo endoplasmático (ER) transporta activamente desde el citosol hasta el interior del ER una gran variedad de péptidos producidos por la degradación de proteínas. Se trata de la primera etapa de un proceso de gran importancia en la supervisión de las células por el sistema inmune (se discute en el Capítulo 23). Los fragmen tos de proteína transportados, una vez han entrado al ER, pueden ser transpor tados a la superficie celular donde son presentados para que los linfocitos T citotóxicos puedan reconocerlos; si resultan ser extraños al individuo (como por ejemplo si derivan de un virus del interior de la célula), los linfocitos T matan a la célula que los presenta. Otro miembro de la familia ABC ha sido descubierto mediante estudios de la enfermedad genética común denominada fibrosis quística. Esta enfermedad está causada por una mutación en un gen que codifica un transportador ABC que actúa como un canal de Cl~ en la membrana plasmática de las células epiteliales. El canal es poco habitual en cuanto a que para abrirse requiere la hidrólisis de ATP y la fosforilación dependiente de AMP cíclico. Debi do a que existen evidencias de que la proteína MDR también puede actuar como canal de Cl~ en algunas células (en este caso, no regulado por AMP cíclico sino por el volumen celular), parece claro que al menos algunos transportadores ABC pueden actuar como transportadores y como canales iónicos. Sin embargo, to davía resulta un misterio de qué forma los transportadores ABC pueden actuar de estas dos maneras tan diferentes y transferir a través de la membrana estos ti pos de moléculas tan distintos. En la Tabla 11-2 se resumen algunas de las familias de las proteínas trans portadoras de las que hemos tratado.
Resumen Las proteínas transportadoras se unen a determinados solutos y los transportan a través de la bicapa lipídica, mediante cambios conformacionales que exponen el lugar de unión al soluto secuencialmente a uno y luego al otro lado de la membra na. Algunas proteínas transportadoras simplemente transportan un soluto “cuesta abajo" mientras que otras pueden actuar como bombas transportando un soluto “cuesta arriba” en contra de su gradiente electroquímico, utilizando para ello ener gía de hidrólisis del ATP o un jlujo “cuesta abajo” de otro soluto (como el Na+) para impulsar las series de cambios de conformación necesarios. Estudios de clonaje y secuenciación de DNA muestran que las proteínas transportadoras pertenecen a un pequeño número de familias, cada una de las cuales contiene proteínas de secuen cias de aminoácidos similares que probablemente han evolucionado a partir de una proteína ancestral común, y que actúan a través de un mecanismo similar. La familia de ATPasas transportadoras de cationes, que incluye la ubicua bomba Na+K+, constituye un ejemplo importante de ello; cada una de estas ATPasas contiene una gran subunidad catalítica que secuencialmente es fosforilada y desfosforilada durante el ciclo de bombeo. La superfamilia de transportadores ABC es especial mente importante desde el punto de vista clínico: incluye proteínas que son respon sables de la fibrosis quística, y también proteínas que confieren resistencia a drogas en células cancerosas y en parásitos causantes de la malaria.
Canales iónicos y propiedades eléctricas de las membranas15 A diferencia de las proteínas transportadoras, las p ro te ín a s d e c a n a l forman po ros hidrofílicos que atraviesan la membrana. Una clase de proteínas de canal que se encuentra en prácticam ente todos los grupos de animales forma las unio nes comunicantes (gap junctions ) entre dos células adyacentes; cada membrana
558
Capítulo 11: Transporte de moléculas pequeñas a través de la membrana
plasmática contribuye de la misma forma a la formación del canal, que conecta los citoplasmas de ambas células. Estos canilles se discuten en el Capítulo 19, por lo que aquí no trataremos de ellos. Tanto las uniones comunicantes como las porinas, las proteínas formadoras de canal de las membranas externas de las bacterias, mitocondrias y cloroplastos (discutidas en el Capítulo 10), tienen po ros relativamente grandes y permisivos, que resultarían desastrosos si conecta ran directamente el interior de una célula con el espacio extracelular. Por el con trario, la mayoría de proteínas de canal de la membrana plasmática de las células animales y vegetales conectan el citosol con el exterior celular, por lo que necesariam ente han de tener poros estrechos altamente selectivos. Estas proteí nas están relacionadas específicamente con el transporte de iones inorgánicos, por lo que se denominan canales iónicos. Respecto a la eficiencia de transporte, los canales tienen ventaja sobre los transportadores ya que a través de cada ca nal pueden pasar más de 1 millón de iones cada segundo, lo cual es una veloci dad más de 1000 veces superior que el transporte mediado por cualquier trans portador conocido. Por otro lado, los canales iónicos no pueden estar acoplados a una fuente energética, de forma que el transporte que median siempre es pasi vo (“cuesta abajo”). Así, la función de los canales iónicos es permitir que iones inorgánicos específicos, mayoritariamente Na+, K+, Ca2+, o Cl~, puedan difundir a favor de su gradiente electroquímico a través de la bicapa lipídica. Esto no quie re decir, sin embargo, que el transporte a través de canales iónicos no esté regu lado. Por el contrario, veremos que la capacidad de regular el flujo de iones es esencial para la función de muchos tipos celulares. Concretamente, las células nerviosas se han especializado en la utilización de canales iónicos, y considera remos de qué forma utilizan una gran variedad de tales canales para recibir, conducir y transmitir señales.
Los canales iónicos son selectivos para el ion y fluctúan entre estados abiertos y cerrados15 Dos propiedades importantes diferencian los canales iónicos de los simples po ros acuosos. En primer lugar, presentan selectividad iónica, es decir, permiten que algunos iones puedan pasar y otros no. Esto sugiere que sus poros deben ser suficientemente estrechos en algunos lugares como para permitir que los iones entren en contacto íntimo con las paredes del canal, de tal manera que sólo los iones de tamaño y carga adecuados puedan atravesarlos. Se cree que para poder pasar a través de la parte más estrecha del canal, los iones que atraviesan los ca nales (en fila) tienen que deshacerse de la mayor parte o de todas las moléculas de agua que llevan asociadas; este hecho limita la velocidad máxima de paso. Así, cuando aumenta la concentración de un ion, el flujo de tal ion a través del canal aumenta proporcionalmente hasta que se alcanzan los niveles de satura ción, momento en que se llega a la velocidad máxima de transporte. La segunda diferencia importante entre los canales iónicos y los simples po ros acuosos consiste en que los canales iónicos no están abiertos continuam en te. En lugar de ello, tienen “puertas” que se abren brevemente y luego se cierran de nuevo, tal como se muestra esquemáticamente en la Figura 11-17. En la ma-
ABIERTO CERRADO
bicapa lipídica
superficie hidrofóbica
superficie hidrofílica
filtro selectivo a iones en el poro acuoso
Canales iónicos y propiedades eléctricas de las membranas
Figura 11-17 Dibujo esquem ático de un canal iónico típico, que fluctúa entre las conform aciones cerrada y abierta. Una proteína
transmembrana, vista en sección transversal, forma un poro acuoso a través de la bicapa lipídica, únicamente cuando la compuerta está abierta. Se cree que las paredes internas del poro se hallan recubiertas de cadenas laterales de aminoácidos polares, mientras que las cadenas laterales hidrofóbicas interactúan con la bicapa lipídica. El poro se estrecha hasta alcanzar, en una región determinada, dimensiones atómicas (el “filtro selectivo de iones”); esta región determina principalmente la selectividad iónica del canal.
559
regulados por voltaje
regulados por ligando (ligando extracelular)
regulados por ligando (ligando intracelular)
regulados m ecánicam ente
CERRADOS
a
A B IE R T O S C IT O S O L
yoría de los casos las puertas se abren en respuesta a estímulos específicos. Los principales tipos de estímulos que se sabe que causan la abertura de los canales iónicos son cambios en el voltaje a través de la membrana (canales regulados por voltaje), estimulaciones mecánicas (canales regulados mecánicamente) y la unión de un ligando (canales regulados por ligando). El ligando puede ser un mediador extracelular -específicam ente un neurotransmisor (canales regulados por trans misor) o un mediador intracelular, como un ion (canales regulados por ion), o un nucleótido (canales regulados por nucleótido ) (Figura 11-18). La actividad de muchos canales iónicos está regulada, además, por fosforilación y desfosforila ción de proteínas; este tipo de regulación se discute en el caso de los canales re gulados por nucleótido, en el Capítulo 15. Hasta ahora se han descrito más de 100 tipos de canales iónicos, y todavía se están descubriendo más. Son responsables de la excitabilidad eléctrica del mús culo y median la mayoría de formas de señales eléctricas en el sistema nervioso. Una célula nerviosa típica contiene 10 tipos diferentes o más de canales iónicos, localizados en diferentes dominios de su mem brana plasmática. Sin embargo, estos canales no sólo se presentan en células excitables eléctricamente, sino que tam bién se hallan en todas las células animales y vegetales y también en m icro organismos: por ejemplo, los canales iónicos son los responsables de propagar la respuesta de cerrar las hojas de la mimosa, y permiten que los paramecios unicelulares cam bien de dirección después de colisionar. Quizás los canales iónicos más comunes son los permeables principalmente al K+, que se encuentran en la membrana plasmática de casi todas las células ani males. Un importante subconjunto de estos canales se abre incluso en células no estimuladas (“en reposo”) por lo que habitualmente se les denomina canales de fuga de K+. Aunque este término se refiere a una gran variedad de canales de K+ diferentes, dependiendo del tipo celular de que se trate, tienen una función co mún: haciendo que la membrana plasmática sea mucho más permeable al K+que a cualquier otro ion, juegan un papel crítico en el mantenimiento del potencial de membrana -la diferencia de potencial que se presenta a través de todas las m em branas plasmáticas.
El potencial de m em brana de las células animales depende principalm ente de los canales de fuga de K+y del gradiente de K+ a través de la m em brana plasm ática15,16 Cuando existe una diferencia de carga eléctrica entre ambos lados de una m em brana, debido a un ligero exceso de iones positivos sobre los negativos en uno de los lados y un ligero defecto en el otro lado, aparece un p o te n c ia l d e m e m b ra n a .
560
Capítulo 11: Transporte de moléculas pequeñas a través de la membrana
Figura 11-18 Canales iónicos regulados. Dibujo esquemático de los diferentes sistemas a través de los cuales se pueden regular los canales iónicos.
Estas diferencias de carga pueden producirse tanto por un transporte activo electrogénico (véase pág. 550) como por difusión iónica pasiva. Veremos en el Capítulo 14 que la mayor parte del potencial de membrana de la mitocondria está generado por la bom ba electrogénica de H+ de la membrana interna de la mitocondria. Las bombas electrogénicas tam bién generan las mayor parte del potencial eléctrico a través de la mem brana plasmática de las células vegetales y de hongos. Sin embargo en las células animales típicas son los movimientos pa sivos de los iones los principales responsables del potencial eléctrico a través de la mem brana plasmática. Como se ha explicado anteriormente, la ATPasa de Na+-K+ ayuda a mantener el equilibrio osmótico a través de la mem brana plasmática, manteniendo baja la concentración intracelular de Na+. Como en el interior celular hay poco Na+, tie nen que existir otros cationes en cantidades abundantes que equilibren la carga de los aniones fijos celulares -las moléculas cargadas negativamente que están confinadas en el interior celular. Este papel de equilibrador de cargas está des empeñado principalmente por el K+, que es bombeado activamente al interior celular por la ATPasa de Na+-K+y que también puede desplazarse libremente h a cia el interior o el exterior de la célula a través de los canales de fuga de K+. Debi do a la presencia de estos canales, el K+ se mantiene prácticamente en un equili brio en el que la fuerza eléctrica, ejercida por un exceso de cargas negativas del interior de la célula, atrayendo el K+hacia el interior de la célula, equilibra la ten dencia del K+ a salir a favor de su gradiente de concentración. El potencial de m em brana es la manifestación de esta fuerza eléctrica y se puede calcular su va lor de equilibrio a partir del valor del gradiente de concentración del K\ Los ar gumentos siguientes pueden ayudar a aclarar este concepto. Supongamos que inicialmente no existe gradiente de voltaje a través de la membrana plasmática (el potencial de m embrana es cero) pero que la concentra ción de K+es elevada en el interior de la célula y baja en el exterior. El K+tenderá a salir de la célula a través de los canales de fuga del K+, impulsado por su gradiente de concentración. A medida que el K+vaya fluyendo hacia el exterior de la célula, dejará detrás suyo una carga neta negativa, creando así un campo eléctrico o po tencial de membrana que tenderá a impulsar de nuevo el K+hacia el interior de la célula. El reflujo neto de K+ cesará cuando el potencial de membrana alcance un valor tal que la fuerza eléctrica que genere sobre el K+ equilibre exactamente el efecto del gradiente de concentración de este ion -e s decir, cuando su gradiente electroquímico de K+ sea cero. Al mismo tiempo, los iones Cl_ se equilibran de manera similar a como ocurre con el K+, pero dado que su carga es negativa, el potencial de membrana mantiene la mayoría de estos iones fuera de la célula. Esta condición de equilibrio en la que no hay flujo neto de corriente eléctrica a través de la membrana, define el potencial de reposo de la membrana para esta célula ideal. Una fórmula sencilla pero muy importante, la ecuación de Nemst, expresa la condición de equilibrio de manera cuantitativa y, tal como se explica en el Panel 11-2, permite calcular el potencial de reposo teórico de la membrana si se conoce la relación de concentraciones iónicas interna y externa. Sin embar go, como la membrana plasmática de una célula real no es exclusivamente per meable a K+ y a Cl~, el potencial de reposo real generalmente no es exactamente igual al que predice la ecuación de Nemst para el K+y el Cl_.
Cuando se para la bom ba de Na+-K+, el potencial de reposo sólo decae lentam ente15’ 16 El número de iones que se han de desplazar a través de la membrana para gene rar el potencial de membrana es insignificante. Así se puede pensar que el po tencial de mem brana aparece debido a movimientos de carga que mantienen las concentraciones de los iones prácticam ente inalteradas, y que se produce por di ferencias muy leves del número de iones negativos y positivos que hay a las dos lados de la mem brana (Figura 11-19). Además, generalmente estos movimientos de carga son rápidos, del orden de tan sólo unos cuantos milisegundos o menos.
Canales iónicos y propiedades eléctricas de las membranas
561
LA ECUACION DE NERNST Y EL FLUJO DE IONES E l f l u j o d e c u a l q u i e r io n a t r a v é s d e u n a p r o t e ín a c a n a l d e
e s c e r o y n o s e p r o d u c e f l u j o n e to d e l io n a t r a v é s d e l c a n a l.
m e m b r a n a e s tá d i r i g i d o p o r e l g r a d i e n t e e l e c t r o q u í m i c o
El g r a d ie n t e d e v o lt a je (p o te n c ia l d e m e m b r a n a ) e n e l q u e s e
d e e s t e io n . E s te g r a d i e n t e r e p r e s e n t a la c o m b i n a c i ó n d e d o s
a lc a n z a e s t e e q u i l i b r i o , s e d e n o m i n a p o t e n c i a l d e e q u i l i b r i o
fa c to re s : e l g r a d ie n te d e v o lta je y el g r a d ie n te d e c o n c e n tr a c ió n
d e l io n . P u e d e c a l c u la r s e m e d i a n t e u n a e c u a c i ó n q u e s e r á
d e l io n a t r a v é s d e la m e m b r a n a . C u a n d o e s t a s d o s in f lu e n c ia s
d e d u c id a a c o n tin u a c ió n , lla m a d a e c u a c ió n d e N e r n s t.
s e e q u i l i b r a n u n a c o n o t r a , e l g r a d i e n t e e l e c t r o q u í m i c o d e l io n
La e c u a c i ó n d e N e r n s t e s :
v .B I m S ? zF
C¡
V = p o t e n c i a l d e e q u i l i b r i o e n v o lt i o s
donde
( p o t e n c i a l in t e r n o m e n o s e l p o te n c ia l e x te r n o )
C0 y C¡
= c o n c e n tr a c io n e s e x te r n a (d e " o u ts id e " ) e i n t e r n a d e l io n , r e s p e c t i v a m e n t e
R = c o n s t a n t e d e lo s g a s e s (2 c a l m o l ” 1 ° K “ 1) T = t e m p e r a t u r a a b s o lu t a ( ° K ) F = c o n s t a n t e d e F a r a d a y ( 2 ,3 x 1 0 4 c a l V ' 1 m o l-1 )
z=
v a l e n c ia ( c a r g a ) d e l io n
ln = l o g a r i t m o d e b a s e e
La e c u a c ió n d e N e r n s t p u e d e d e d u c ir s e d e la s ig u ie n t e f o r m a : U n a m o lé c u la e n s o lu c ió n (u n s o lu to ) s ie m p r e s e m u e v e d e s d e u n a r e g ió n d e e le v a d a c o n c e n t r a c ió n h a c ia u n a r e g ió n d e b a ja c o n c e n tr a c ió n , s im p le m e n t e d e b id o a la p r e s ió n d e lo s n ú m e r o s . C o n s e c u e n te m e n t e , el m o v im ie n t o a f a v o r d e g r a d ie n t e d e c o n c e n t r a c ió n v ie n e a c o m p a ñ a d o d e u n a v a r ia c ió n fa v o r a b le d e e n e r g ía lib r e (AG < 0 ), m ie n tr a s q u e el m o v im ie n t o e n c o n tr a d e g r a d ie n t e d e c o n c e n tr a c ió n v ie n e a c o m p a ñ a d o d e u n a v a r ia c ió n d e s f a v o r a b le d e e n e r g ía lib r e
(AG > 0 ). (El c o n c e p to d e e n e r g ía lib r e s e in t r o d u c e y d is c u te e n e l P a n e l 1 4 -1 , p á g s . 7 1 4 - 7 1 5 .) La v a r ia c ió n d e e n e r g ía lib r e p o r m o l d e s o lu to q u e s e h a d e s p la z a d o a t r a v é s d e la m e m b r a n a p la s m á tic a (AGconc) e s ig u a l a - f í T I n C 0 / C¡. S i el s o lu to e s u n io n , a l m o v e r s e h a c ia el in t e r io r d e u n a c é lu la a t r a v é s d e u n a m e m b r a n a e n la q u e s e m a n t ie n e u n v o lt a je V e n el in t e r io r r e s p e c to al e x te r io r , g e n e r a r á u n a v a r ia c ió n a d ic io n a l d e e n e r g ía lib r e (p o r m o l d e s o lu t o q u e s e h a y a d e s p la z a d o ) d e AGV0|t = zFV. E n el p u n to e n el q u e el g r a d ie n t e d e c o n c e n tr a c ió n y el d e v o lt a je s e h a lle n c o m p e n s a d o s e x a c t a m e n t e , AGconc + AGVO|t = 0 y la d is t r ib u c ió n d e l io n se h a lla r á e n e q u ilib r io a t r a v é s d e la m e m b r a n a . A s í
P a ra u n io n m o n o v a le n t e ,
RT 2 ,3
= 5 8 m V a 2 0 °C
y
6 1 ,5 m V a 3 7 °C
A s í p u e s , p a r a u n io n d a d o a 3 7 ° C , V = + 6 1 ,5 m V p a ra C 0 / C ¡ = 1 0 , m ie n t r a s q u e V = 0 p a r a C 0 / C ¡ = 1. P o r e je m p lo , el p o t e n c ia l d e e q u ilib r io d e l K ' ( V K) es d e 6 1 ,5 lo g 10( [ K * ] o / [K *]¡) m iliv o lt io s ( - 8 9 m V p a r a u n a c é lu la típ ic a c u a n d o [ K * ] 0 = 5 m M y [K *]¡ = 1 4 0 m M ) . A V K, n o e x is t e f lu jo n e to d e K * a t r a v é s d e la m e m b r a n a . D e f o r m a s im ila r , c u a n d o el p o te n c ia l d e m e m b r a n a a lc a n z a un v a lo r d e 6 1 ,5 lo g 10( ( N a ' ] u / [ N a *]¡), el p o te n c ia l d e e q u ilib r io d e l N a * ( l / Na), n o e x is tirá f lu jo n e to d e N a * . P a ra c u a lq u ie r p o te n c ia l d e m e m b r a n a p a r t ic u la r , l/M , la f u e r z a n e ta q u e t ie n d e a e m p u ja r h a c ia el e x t e r io r d e la c é lu la a un d e t e r m in a d o t ip o d e io n e s p r o p o r c io n a l a la d if e r e n c ia e n t r e l/ M y e l p o te n c ia l d e e q u ilib r io d e l io n : a s í, p a r a e l K 4 e s l/ M - VK y p a r a el N a * e s l/ M - l / Na. El n ú m e r o d e io n e s q u e f o r m a n la lá m in a d e c a r g a a d y a c e n t e a la m e m b r a n a e s d e s p r e c ia b le c o m p a r a d o c o n el n ú m e r o to t a l d e io n e s d e l in t e r io r d e la c é lu la . P o r e je m p lo , el d e s p la z a m ie n t o d e 6 0 0 0 io n e s N a * a t r a v é s d e 1 ii m 2 d e m e m b r a n a t r a n s p o r t a r á s u fic ie n te c a r g a p a r a c a m b ia r el p o te n c ia l d e m e m b r a n a u n o s
z F V - R T ln — = 0
1 0 0 m V . C o m o e x is t e n u n o s 3 x 1 0 7 io n e s N a * e n 1 u m 3 d e c ito s o l,
C;
e s te d e s p la z a m ie n t o d e c a r g a t e n d r á u n e fe c to d e s p r e c ia b le s o b r e lo s g r a d ie n t e s d e c o n c e n t r a c ió n a t r a v é s d e la m e m b r a n a .
y p o r ta n to l/=
zF
562
|n - ^ ° = 2 ,3 — lo g 10 C¡ zF 10
C¡
Panel 11-2 Deducción de la ecuación de Nernst.
+
-
+
-
+
- + 1
«
+ -
+
-
+
- +
+
- + - + - + - jfl +
-
+
-
+
- + i í ¡ ¿ j
+
-
+
-
+
-
+
- + - + - + - L¡í*¡ -
+
-
+ - ♦ - + - + *'f
-
+
- ♦ - « .
¡-:J
-
-
+
-
+
-
jíi
6
+
- + _ + _ + +l|ti
+ - + - + - + ,V ¿i + - + - + - +
- + _ + - + + - + - + -
- + _ + - + + ** + - +
+ - + - + - *í:i
- + - + - + -
- + - + - +■-
-♦-♦-♦♦SIN..
+ - + - ^ ijj -
+ -
+ -
+ -
equilibrio exacto de cargas a cada lado de la membrana; potencial de membrana ■ 0
_
“
■* ■”
+
“
♦ - + - + - + '?| Ef¡ “ + “ + “ ♦ "
- + — + —* + +•-+- + -+
+ -
+
- + - + - +
- + - + - + -í| ijS - + - * - * + - * - + - + ^ ^ + - + —♦ - +
-
+ _ + _
- + - + - + . «1 !?|_ - + - + - +
~ _ + _ + _ + ;" + “ + " + “
- + — + _ + -fL jb j~
_ + „ + „ + + _ + _ +. _ + ^
_ + _ + _
+
~ + ""+” + ~ + _ + _ + _ + " + . ” +
una pequeña cantidad de iones positivos (rojo) atraviesan la membrana de izquierda a derecha, dejando tras de sí sus contraiones negativos {rojo): este hecho provoca la aparición de un potencial de membrana diferente de cero
Resulta clarificador considerar qué le ocurre al potencial de m embrana si la ATPasa de Na+-K+ se inactiva de repente. Primero, se produce un bajada suave e inm ediata del potencial de mem brana. Esto se debe a que la bom ba es electrogénica y cuando se m antiene activa contribuye ligeramente a m antener el po tencial de m em brana ya que extrae tres Na+ por cada dos K+ que introduce en la célula. Sin embargo, al cerrar la bom ba no se elim inan los com ponentes principales del potencial de reposo, que com o se ha esbozado anteriorm ente está generado por un mecanismo de equilibrio del K+. Este desequilibrio persiste mientras se mantenga baja la concentración de Na+ en el interior de la célula y alta la de K+ en el exterior -norm alm ente varios minutos. No obstante, la m em brana plasmática es algo permeable a todos los iones pequeños, incluido el Na+. Así pues, si no funciona la ATPasa de Na+-K+ los gradientes iónicos mantenidos por la bom ba irán disminuyendo y el potencial de membrana establecido por la difusión a través de los canales de fuga de K+también irá disminuyendo. Cuando entra Na+ el equilibrio osmótico aumenta y entra agua a la célula (véase Panel 11-1, pág. 552). Pero si la célula no explota, se alcanzará un nuevo estado de re poso en el que el Na+, el K+ y el Cl~ se encontrarán en equilibrio a través de la membrana. En este estado el potencial de membrana es mucho menor que en la célula normal, con una bom ba Na+-K+activa. La diferencia de potencial a través de la membrana plasmática de una célula animal en reposo varía entre -20m V y -200m V, dependiendo del organismo y del tipo celular. A pesar de que el gradiente de K+ siempre tiene una influencia principal en este potencial, el gradiente de otros iones (y el efecto desequilibran te de las bom bas de iones) tam bién tiene un efecto significativo: cuanto más permeable sea la mem brana para un ion, mayor será la tendencia del potencial de m em brana a alcanzar el valor de equilibrio de este ion. En consecuencia, casi cualquier cambio de la permeabilidad de la membrana provocará un cambio en el potencial de la membrana. Ésta es la clave principal que relaciona la excitabi lidad eléctrica de las células con las actividades de los canales iónicos. Las células nerviosas o neuronas son especialistas de la excitabilidad eléctrica; la mayor parte de nuestros conocimientos sobre este tema proviene de estudios sobre estas células extraordinarias. Por lo tanto, para poder situar la excitabilidad eléctrica en su contexto, hemos de hacer una breve disgresión para revisar breve mente cómo está organizada una neurona típica.
Figura 11-19 Un pequeño flujo de iones transporta suficiente cantidad de carga para generar una gran variación del potencial de membrana. Los iones que incrementan el potencial de membrana se hallan situados en una fina capa superficial (< 1 nm) muy cerca de la membrana, que se mantiene unida a ella debido a su atracción eléctrica con los iones de carga opuesta (contraiones) del otro lado de la membrana. Para una célula típica, 1 microculombio de carga (6 x 1012iones monovalentes) por centímetro cuadrado de membrana transferidos de un lado a otro de la membrana genera una carga de aproximadamente 1V. Esto significa, por ejemplo, que en una célula esférica de 10 (im de diámetro, el número de iones K+que han de fluir hacia el exterior de la célula para generar una variación del potencial de membrana de 100 mV, únicamente es de 1/100 000 parte del total de iones K+ del citosol.
La función de una célula nerviosa depende de su estructura alargada15 La tarea fundamental de la neurona es recibir, conducir y transmitir señales. Para realizar estas funciones, normalmente las neuronas son extremadamente alargadas: una célula nerviosa de un ser humano, que se extienda desde la m é dula espinal hasta un músculo del pie, puede tener un metro de largo. Cada
Canales iónicos y propiedades eléctricas de las membranas
563
cuerpo o soma celular
dendritas
axón (desde menos de 1 mm hasta más de 1 m de largo)
ramificaciones terminales del axón
neurona consta de un cuerpo o soma celular (que contiene el núcleo) y un cierto número de largas y delgadas proyecciones que irradian desde este soma hacia el exterior. Generalmente tienen un largo axón, que conduce las señales desde el soma celular hacia dianas distantes y varias dendritas, más cortas y ramificadas, que se extienden desde el soma celular como antenas, proporcionando una ex tensa superficie que le permite a la neurona recibir señales procedentes de los axones de otras células nerviosas (Figura 11-20). Las señales también se reciben en el propio soma celular. Habitualmente el axón se divide en su extremo distal en numerosas ramas de forma que puede transmitir su m ensaje a muchas célu las diana simultáneamente. Además, la extensión de las ramificaciones de las dendritas puede ser muy grande -e n algunos casos lo suficiente como para que una sola neurona reciba hasta 100 000 contactos. A pesar del variado significado de las señales transportadas por las diferen tes clases de neuronas, la form a de estas señales es siempre la misma: cambios del potencial eléctrico a través de la mem brana plasmática de la neurona. La co m unicación tiene lugar debido a que una alteración eléctrica producida en una zona de la célula se propaga hacia otras zonas. Esta alteración se iría debilitando al aumentar la distancia a la que se propaga a partir del origen, a no ser que se gaste energía para amplificarla a medida que se propaga. En distancias cortas esta atenuación carece de importancia; de hecho muchas neuronas pequeñas conducen sus señales de m anera pasiva, sin amplificación. Para com unicacio nes a largas distancias, sin embargo, esta propagación pasiva es inadecuada. Así, las neuronas mayores utilizan un mecanism o de señalización activo que consti tuye uno de sus rasgos más sorprendentes: un estímulo eléctrico que sobrepasa una cierta intensidad umbral desencadena una explosión de actividad eléctrica que se propaga rápidamente a lo largo de la membrana plasmática de la neuro na y que se m antiene por una amplificación automática a lo largo de todo el re corrido. Esta onda viajera de excitación eléctrica, conocida como potencial de acción o impulso nervioso, puede transportar un mensaje sin atenuación desde un extremo de una neurona hasta el otro, a velocidades tan rápidas como 100 m/ seg o más. Los potenciales de acción son consecuencia directa de la acción de los canales regulados por voltaje, com o veremos a continuación
membrana polarizada
yS
cerrado
membrana despolarizada
564
Capítulo 11: Transporte de moléculas pequeñas a través de la membrana
Figura 11 -20 Diagrama esquemático de una neurona típica de vertebrado. Las flechas indican la dirección en la que se transportan las señales. El axón conduce las señales en sentido de alejarse del soma celular mientras que las múltiples dendritas reciben señales de los axones de otras neuronas. Las terminales nerviosas acaban sobre las dendritas o el soma celular de otras neuronas o sobre otros tipos celulares, como fibras musculares o células glandulares.
Figura 11-21 El canal de Na+ regulado por voltaje puede adoptar como mínimo tres conformaciones (estados). Fuerzas internas, representadas aquí como atracciones entre cargas de diferentes zonas del canal, estabilizan cada uno de los estados contra pequeñas desestabilizaciones, pero una colisión suficientemente violenta con otras moléculas puede ocasionar que el canal “salte” de uno a otro de estos estados. El estado de menor energía depende del potencial de membrana ya que las diferentes conformaciones tienen diferentes distribuciones de cargas. Cuando la membrana está en reposo (muy polarizada) la conformación de menor energía libre, y por tanto la más estable, es la cerrada. Cuando la membrana se encuentra despolarizada, la conformación abierta tiene una energía menor, por lo que el canal tiene una alta probabilidad de abrirse. Sin embargo, la energía libre de la conformación inactivada es todavía menor, por lo que, después de un período de tiempo aleatorio dedicado a este estado abierto, el canal se inactiva. Así pues, la conformación abierta corresponde a un estado metaestable que únicamente puede existir de forma transitoria. Las flechas en rojo indican la secuencia de alteraciones que se producen como consecuencia de una despolarización súbita mientras que la flecha en negro indica el retorno a la conformación original ya que es el estado de menor energía después de que la membrana se ha repolarizado.
CD
0
1
||i OD t>d trf 2 ro
cerrados
ÜD
abiertos ¡nactivados
0
2
cerrados
1
2
tiempo (milisegundos)
Los canales iónicos regulados por voltaje son los responsables d é la generación de potenciales de acción en células excitables eléctricam ente15,17 La membrana plasmática de todas las células excitables eléctricamente (no sólo de las neuronas sino también de las fibras musculares, células endocrinas y oocitos) presentan canales iónicos regulados por voltaje, que son los responsables de la generación de los potenciales de acción. Un potencial de acción se dispara por una despolarización de la mem brana -e s decir, por una variación del poten cial de membrana hasta un valor menos negativo. (Veremos más adelante de qué forma esta variación puede estar causada por la acción de un neurotransmisor). En las células nerviosas y en las fibras musculares esqueléticas, un estímulo que provoca una despolarización parcial de la membrana genera inmediatamente la apertura de los canales de Na+regulados por voltaje, lo cual permite que entre en la célula una pequeña cantidad de Na+ a favor de su gradiente electroquímico. El influjo de cargas positivas despolariza aún más la membrana, por lo que se abren más canales de Na+, que admiten más iones Na+, cuya entrada genera una mayor despolarización de la membrana. Este proceso continúa de una manera auto-amplificante hasta que el potencial de la región determinada de la m em brana haya variado desde su valor de reposo -d e aproximadamente -7 0 m Vhasta el potencial de equilibrio del Na+ -d e aproximadamente +50 m V- (véase Panel 11-2, pág. 562). En este punto, cuando la fuerza electroquímica neta im pulsora del flujo de Na+es casi cero, la célula podría alcanzar un nuevo estado de reposo con todos sus canales de Na+ abiertos permanentemente si la conform a ción abierta de los canales de Na+fuese estable. La célula se salva de este tipo de espasmo eléctrico permanente porque los canales de Na+ tienen un mecanismo de inactivación automática que hace que los canales se cierren rápidamente incluso cuando la membrana todavía está despolarizada. Los canales de Na+ permanecen en este estado inactivado, en el que no pueden volverse a abrir, hasta pasados algunos milisegundos después que el potencial de mem brana recupere su valor negativo inicial. En la Figura 11-21 se ilustran esquemáticamente estos tres estados distintos del canal de Na+ regulado por voltaje -cerrado, abierto, e inactivado. En la Figura 11-22 se indica la contribución de estas variaciones al aumento y la disminución del potencial de acción.
Canales iónicos y propiedades eléctricas de las membranas
Figura 11 -22 Un potencial de acción. Un potencial de acción se dispara por un breve pulso de corriente (mostrado en el gráfico superior) que despolariza parcialmente la membrana, como se muestra en el gráfico de potencial de membrana respecto al tiempo {gráfico intermedio). La curva en verde muestra que el potencial de membrana puede simplemente relajarse de nuevo hacia el potencial de reposo tras el estímulo despolarizador si la membrana no tuviera canales iónicos regulados por voltaje; este retorno relativamente suave del potencial de membrana a su valor inicial de -70 mV en ausencia de canales de Na+es automático debido al eflujo de K+a través de los canales de K+, el cual lleva a la membrana de nuevo al potencial de equilibrio de K+. La curva en rojo muestra el curso del potencial de acción causado por la apertura y posterior inactivación de los canales de Na+regulados por voltaje, cuyo estado se muestra en la parte inferior de la figura. La membrana no puede disparar un segundo potencial de acción hasta que los canales de Na+ hayan vuelto a la conformación cerrada (véase Figura 11-21); hasta este momento, la membrana se encuentra en un estado refractario a la estimulación.
565
(A)
propagación
Figura 11 -23 Propagación de un potencial de acción a lo largo de un axón. (A) muestra los voltajes que se registrarían en un conjunto de electrodos intracelulares colocados a intervalos en el axón. (B) muestra los cambios en los canales de Na+y los flujos de corriente (lín eas d e color m arrón) que dan lugar a la perturbación migratoria del potencial de membrana. La región del axón que presenta la m embrana despolarizada, está coloreada en rojo. Nótese que un potencial de acción sólo puede viajar a partir del lugar donde se produce la despolarización porque la inactivación de los canales de Na+impide que la despolarización se extienda hacia atrás. (Véase tam bién Figura 11-22.)
1 tiempo (milisegundos)
(B) vista instantánea a f = 0 propagación canales de Na+
cerrado
inactivado
abierto
cerrado
+ membrana
repolarizada
despolarizada
+ reposo
vista instantánea a f= 1 milisegundo propagación canales de Na+
membrana
cerrado
+
+
+
+
inactivado
abierto
cerrado
+ repolarizada
despolarizada
+
+
reposo
La descripción que hemos hecho hasta aquí del potencial de acción única mente afecta a una pequeña porción de la membrana plasmática. Sin embargo, la despolarización auto-amplificante de esta porción es suficiente para despola rizar regiones vecinas, en las cuales se produce este mismo ciclo. De esta m ane ra el potencial de acción se propaga desde un punto inicial de despolarización por toda la m em brana plasmática, como se muestra en la Figura 11-23. Además de la inactivación de los canales de Na+, en muchas células nervio sas actúa un segundo mecanism o que ayuda a la membrana plasmática activada
566
Capítulo 11: Transporte de moléculas pequeñas a través de la membrana
+
+
a recuperar más rápidamente su potencial negativo original, y así poder trans mitir un segundo impulso. Los canales de K+ regulados por voltaje se abren, de forma que el influjo transitorio de Na+ es rápidamente contrarrestado por un eflujo de K+, que en muy poco tiempo sitúa a la membrana en el potencial de equilibrio del K+ incluso antes de que se haya completado la inactivación de los canales de Na+. Estos canales de K+ responden a cambios del potencial de mem brana de forma muy semejante a como lo hacen los canales de Na+, aunque con una cinética ligeramente más lenta; por esta razón, a menudo se les denomina
canales de K+retardados. Los mecanismos electroquímicos del potencial de acción fueron estableci dos por primera vez gracias a unas famosas series de experimentos realizados en las décadas de 1940 y 1950. Debido a que las técnicas de estudio de los procesos eléctricos en células pequeñas todavía no se habían desarrollado, los experi mentos utilizaron las neuronas gigantes del calamar. A pesar de los muchos avances técnicos realizados desde entonces, la lógica de los análisis originales todavía continúa sirviendo de modelo hoy en día. En el Panel 11-3 se resumen algunos de los experimentos clave originales.
La mielinización incrementa la velocidad y la eficiencia de la propagación de los potenciales de acción en las células nerviosas15,18 Los axones de muchas neuronas de vertebrados se hallan aislados por una vaina de mielina, la cual incrementa notablemente la velocidad a la que el axón con duce un potencial de acción. La importancia de la mielinización se pone dramá ticamente de manifiesto por la enfermedad desmielinizante de la esclerosis múl tiple, en la que la vaina de mielina de algunas regiones del sistema nervioso centred se halla destruida por un mecanismo todavía desconocido; cuando esto ocurre, la velocidad de propagación de los impulsos nerviosos se reduce nota blemente, a menudo con consecuencias neurológicas devastadoras. La mielina está formada por células accesorias especializadas, denominadas células gliales -células de Schwann en los nervios periféricos y oligodendrocitos en el sistema nervioso central. Estas células gliales depositan, una sobre otra, capas de su propia membrana plasmática formando una apretada espiral alrededor del axón (Figura 11-24), aislando así la membrana del axón de forma que a su través casi no se escapa corriente. La vaina está interrumpida a intervalos regulares por nódulos de Ranvier, donde se concentran casi todos los canales de Na+ del axón. Debido a que las porciones del axón que están recubiertas por la vaina tienen excelentes propiedades de cable (se comportan eléctricamente mucho mejor que los extraordinariamente bien diseñados cables submarinos telegráficos), la despolarización de la membrana en un nòdulo se transmite de forma pasiva casi inmediatamente hasta el nòdulo siguiente, un proceso denominado conducción saltatoria. Este tipo de conducción tiene dos ventajas principales: los potencia les de acción viajan más rápidamente y se ahorra energía metabòlica ya que la excitación activa queda restringida a las reducidas regiones de la membrana plasmática del axón situadas en los nódulos de Ranvier.
El registro de zona indica que cada uno de los canales de Na* se abre siguiendo la ley del todo o nada15,19 Las membranas plasmáticas de las neuronas y de las fibras musculares esqueléti cas contienen muchos miles de canales de Na+regulados por voltaje, y la corrien te que atraviesa la membrana es la suma de las corrientes que fluyen a través de todos ellos. Esta corriente agregada puede ser registrada con un microelectrodo, tal como se describe en la Figura 11-23. Sin embargo, también es posible regis trar las corrientes que fluyen a través de canales individuales. Ello se consigue mediante la técnica del registro de zona (patch-clamp recording), un método que revolucionó el estudio de los canales iónicos permitiendo estudiar el trans-
Canales iónicos y propiedades eléctricas de las membranas
1. L o s p o t e n c ia le s d e a c c ió n s e r e g is tr a n c o n u n e le c t r o d o in t r a c e lu la r
m em brana plasm ática
El a x ó n g ig a n t e d e c a l a m a r t ie n e u n d iá m e t r o a p r o x im a d o d e 0 ,5 -1 m m y u n a lo n g itu d d e v a r io s c e n t ím e tr o s . E n el e je d e la c é lu la s e p u e d e in t r o d u c ir un e le c t r o d o e n f o r m a d e t u b o c a p ila r d e v id r io q u e c o n t ie n e u n a s o lu c ió n
1
c o n d u c t o r a , d e m a n e r a q u e s u p u n ta q u e d e s itu a d a d e n t r o d e l c it o p la s m a . C o n s u a y u d a , s e p u e d e m e d ir la d ife r e n c ia d e v o lt a je e n t r e e l in t e r io r y e l e x t e r io r d e la c é lu la — e s d e c ir , e l p o te n c ia l d e m e m b r a n a — c u a n d o u n p o te n c ia l d e a c c ió n p a s a r á p id a m e n t e p o r el e le c tr o d o . El p o te n c ia l d e a c c ió n s e d e s e n c a d e n a p o r u n a b r e v e d e s c a r g a e lé c tric a e n u n e x t r e m o d e l a x ó n . N o im p o r t a d e q u é e x t r e m o s e t r a t e , y a q u e la e x c ita c ió n p u e d e
J
potencial de acción
----- .-------—-------- -
i
axon
v ia ja r e n c u a lq u ie r d ir e c c ió n ; t a m p o c o im p o r t a la in te n s id a d d e la d e s c a r g a m ie n t r a s e x c e d a u n c ie r to u m b r a l: e l p o t e n c ia l d e a c c ió n e s " t o d o o n a d a " .
2 . El p o te n c ia l d e a c c ió n s ó lo d e p e n d e d e la m e m b r a n a p la s m á tic a d e la n e u r o n a y d e lo s g r a d ie n t e s d e N a + y K+ a tr a v é s d e e lla L o s tr e s io n e s m á s a b u n d a n t e s , t a n t o e n el in t e r io r c o m o e n el e x t e r io r d e l a x ó n , s o n N a +, K+ y C l_. C o m o e n o tr a s c é lu la s , la b o m b a d e N a +-K + m a n t ie n e u n g r a d ie n t e d e c o n c e n tr a c ió n : la c o n c e n tr a c ió n d e N a + e s u n a s 9 v e c e s m e n o r e n el in t e r io r d e l a x ó n q u e e n e l e x t e r io r , m ie n t r a s q u e la c o n c e n t r a c ió n d e K + e s 2 0 v e c e s m a y o r e n el in te r io r . ¿ Q u é io n e s s o n im p o r t a n t e s p a r a lo s p o te n c ia le s d e a c c ió n ? El a x ó n g ig a n t e d e l c a la m a r e s ta n g r a n d e y r o b u s to q u e e s p o s ib le e x t r a e r su c it o p la s m a , c o m o s e h a c e c o n la p a s ta d e n tíf r ic a d e u n t u b o
cánula para la perfusión \
axón gigante /
rodillo elástico
3 . En r e p o s o , la m e m b r a n a e s p r in c ip a lm e n t e p e r m e a b le al K +; s e v u e lv e t r a n s i t o r ia m e n t e p e r m e a b le al N a + d u r a n t e el p o te n c ia l d e a c c ió n E n r e p o s o , el p o t e n c ia l d e m e m b r a n a e s c e r c a n o al p o te n c ia l d e e q u ilib r io p a r a el K +. C u a n d o s e c a m b ia la c o n c e n tr a c ió n e x t e r n a d e K+, el p o te n c ia l d e r e p o s o c a m b ia b r u s c a m e n t e d e a c u e r d o c o n la e c u a c ió n d e N e r n s t p a r a el K+ (v é a s e P a n e l 1 1 - 2 ) . E n r e p o s o , p o r t a n t o , la m e m b r a n a e s p r in c ip a lm e n t e p e r m e a b le al K +: lo s c a n a le s d e f u g a d e K + c o n s tit u y e n la p r in c ip a l ru ta ió n ic a a t r a v é s d e la m e m b r a n a . S i s e v a r ía la c o n c e n t r a c ió n e x te r n a d e N a +, n o s e a lt e r a el p o te n c ia l
cánula
m em brana del axón gigante
d e K + , y s e s itú a in c lu s o m á s c e rc a d e l p o te n c ia l d e e q u ilib r io p a r a el K + q u e el p r o p io p o te n c ia l d e re p o s o : la m e m b r a n a ha p e r d id o su p e r m e a b ilid a d p a r a el N a + y t o d a v ía s e h a v u e lt o m á s p e r m e a b le al K+ q u e a n te s — e s d e c ir , lo s c a n a le s d e N a + se h a n c e r r a d o , y s e h a n a b ie r t o c a n a le s a d ic io n a le s d e K +.
,100%
Forma del potencial de acción cuando el m edio externo contiene el 100%, 50%, o el 33% de la concentración norm al de Na+.
p e r m e a b le p r in c ip a lm e n t e a l N a +: s e a b r e n lo s c a n a le s d e N a +. E n la s e g u n d a p a r te d e l p o te n c ia l d e a c c ió n , el p o te n c ia l d e m e m b r a n a v u e lv e a u n v a lo r n e g a t iv o q u e d e p e n d e d e la c o n c e n t r a c ió n e x t e r n a
El p o te n c ia l d e m e m b r a n a s e m a n tie n e c o n s ta n te e n el a x ó n , h a c ie n d o p a s a r u n a c o r r ie n te e lé c tr ic a a tr a v é s d e u n h ilo m e t á lic o d e s c u b ie r to y c o lo c a d o e n el e je d e l a x ó n ; c o n o tr o e le c tr o d o in tr a c e lu la r se p u e d e n s e g u ir las v a r ia c io n e s d e l p o te n c ia l d e la m e m b r a n a . C u a n d o la m e m b r a n a s e d e s p la z a b r u s c a m e n te d e su p o te n c ia l d e r e p o s o y se m a n t ie n e e n u n e s t a d o d e s p o la r iz a d o (A ), lo s c a n a le s d e N a + s e a b r e n r á p id a m e n t e h a s ta q u e la p e r m e a b ilid a d d e la m e m b r a n a p a r a el N a + e s m u c h o m a y o r q u e p a r a e l K +; e n to n c e s s e c ie r r a n d e n u e v o d e m a n e r a e s p o n tá n e a . L o s c a n a le s d e K + t a m b ié n s e a b r e n p e r o c o n un c ie r to r e tr a s o , d e m a n e r a q u e la p e r m e a b ilid a d p a r a el K + a u m e n t a c u a n d o c a e la p e r m e a b ilid a d p a r a el N a + (B ). S i a h o r a s e r e p ite m u y r á p id a m e n t e el e x p e r i m e n t o , h a c ie n d o v o lv e r b r e v e m e n t e la m e m b r a n a al p o te n c ia l d e r e p o s o y d e s p o la r iz á n d o la d e n u e v o , la r e s p u e s ta e s d ife r e n te : la d e s p o la r iz a c ió n p r o lo n g a d a h a h e c h o q u e lo s c a n a le s d e N a + e n tr e n e n u n e s t a d o in a c t iv a d o y la s e g u n d a d e s p o la r iz a c ió n n o p r o d u c e u n a s u b id a y u n a b a ja d a d e l p o te n c ia l d e m e m b r a n a s im ila r a la p r im e r a . La r e c u p e r a c ió n d e lo.s c a n a le s d e e s te
1 mm
de ^perfusión flu jo de liquido de perfusión t ■ ■ . líquido y
d e r e p o s o . S in e m b a r g o , la a ltu r a d e l p ic o d e l p o te n c ia l d e a c c ió n v a r ía m a r c a d a m e n t e , d e a c u e r d o c o n la e c u a c ió n d e N e r n s t p a r a el N a +. D u r a n te e l p o te n c ia l d e a c c ió n , p o r lo ta n t o , la m e m b r a n a p a r e c e s e r
4 . El v o lt a je c o n s t a n t e r e v e la c ó m o el p o te n c ia l d e m e m b r a n a c o n tr o la la a p e r t u r a y el c ie r r e d e lo s c a n a le s ió n ic o s
I_____ I
y d e s p u é s r e lle n a r lo c o n s o lu c io n e s a r t ific ia le s p u ra s d e N a +, K+ y C l_ o S 0 42 -. D e m a n e r a n o t a b le , si (y s ó lo si) la s c o n c e n t r a c io n e s d e N a + y K + e n el in t e r io r y el e x t e r io r d e l a x ó n s e a p r o x im a n a las e n c o n t r a d a s d e m a n e r a n a t u r a l, el a x ó n p r o p a g a p o t e n c ia le s d e a c c ió n d e f o r m a n o r m a l. La p a r te im p o r t a n t e d e la c é lu la e n la s e ñ a liz a c ió n e lé c tr ic a , p o r lo t a n t o , h a d e s e r la m e m b r a n a ; lo s io n e s im p o r t a n t e s s o n el N a + y K+; s u s g r a d ie n te s d e c o n c e n tr a c ió n a tr a v é s d e la m e m b r a n a h a n d e p r o p o r c io n a r u n a f u e n t e d e e n e r g ía lib r e s u fic ie n te p a r a im p u ls a r el p o te n c ia l d e a c c ió n , y a q u e s e s u p o n e q u e la s d e m á s f u e n t e s d e e n e r g ía m e t a b ò lic a h a n s id o e lim in a d a s m e d ia n t e la p e r fu s ió n .
axoplasma alfom brilla elastica
electrodo intracelular
10 m ili s e g u n d o s - q u e tr a n s c u r r e m ie n t r a s el p o te n c ia l d e m e m b r a n a s e m a n t ie n e r e p o la r iz a d o (e n r e p o s o ). En u n a x ó n s in v o lt a je c o n s t a n t e , la e s p ig a d e l p o te n c ia l d e a c c ió n e s tá p r o d u c id a p o r un a v a la n c h a d e N a + a t r a v é s d e lo s c a n a le s d e N a + a b ie r to s ; la in a c tiv a c ió n d e é s to s y la a p e r t u r a d e lo s d e K+ d e v u e lv e la m e m b r a n a al p o te n c ia l d e r e p o s o .
potencial de m em brana
ab ierto
20 “e o
cerrado
conductancia al K+
conductancia al Na+
e s t a d o s u p o n e u n in te r v a lo d e t ie m p o r e la tiv a m e n t e la r g o - d e
lÜISilliiPi 568
Panel 11-3 Algunos experimentos clásicos realizados en el axón gigante del calamar.
1 mm
vaina de m ielina capas de m ielina
nòdulo de Ranvier
axon
nùcleo ¡axoñV, Figura 11-24 Mielinización. (A) Esquema de un axón mielinizado de un nervio periférico. Cada célula de Schwann deposita su membrana plasmática de forma concéntrica alrededor del axón, formando un segmento de vaina de mielina de aproximadamente 1 mm de longitud. Para mayor claridad las capas de mielina no se han dibujado tan densamente compactadas como lo están en realidad (véase B). (B) Electronmicrografía de un corte de un nervio de la pata de una rata joven. Se observan dos células de Schwann: una {abajo) está empezando a mielinizar su axón, mientras que la otra ya ha formado una vaina de mielina casi madura. (B. de C. Raine, en Myelin [P. Morell, ed.]. New York: Plenum, 1976.)
porte a través de una única molécula proteica de canal situada en una pequeña porción de membrana que se halle cubriendo la punta de una micropipeta (Fi gura 11-25). Esta simple pero poderosa técnica permite estudiar las propiedades detalladas de los canales iónicos de cualquier tipo celular, y ello ha llevado a descubrir que incluso las células que no son excitables eléctricamente tienen ha bitualmente en su mem brana plasmática varios canales iónicos regulados. Mu chas de estas células, como las levaduras, son demasiado pequeñas para poder ser estudiadas por el método electrofísiológico tradicional de implantar un microelectrodo en el interior de la célula. El registro de zona indica que cada uno de los canales de Na+ regulados por voltaje se abre siguiendo la ley de todo o nada: los tiempos de apertura y cierre son aleatorios pero cuando el canal está abierto, siempre tiene la misma con ductancia, permitiendo que pasen unos 8000 iones por segundo a su través. Por lo tanto, la corriente agregada que atraviesa la membrana de una célula entera, a través de una gran población de canales de Na+, no indica el grado de apertura de un canal típico individual sino el número total de canales de su membrana que se hallan abiertos en un momento dado (Figura 11-26). El fenómeno de regulación por voltaje puede ser entendido en términos de simples principios físicos elementales. El interior de una neurona o de una fibra muscular en reposo tiene un potencial eléctrico de unos 50-100 mV más negati vo que el medio externo. Esta diferencia de potencial puede parecer pequeña, pero dado que se produce a través de una membrana plasmática de tan sólo 5 nm de grosor, el gradiente de voltaje resultante es de aproximadamente 100 000 V/cm. Por lo tanto, las proteínas de la mem brana están sujetas a un campo eléctrico muy grande. Estas proteínas, como todas las demás, presentan en su superficie varios grupos cargados y diversas uniones polarizadas entre sus átomos. Por consiguiente, el campo eléctrico genera fuerzas sobre su estructura molecular.
Canales iónicos y propiedades eléctricas de las membranas
569
succion suave
Figura 11 -25 Técnica de registro de zona. Debido a que la unión entre la
(A)
IB)
separar la m icropipeta de la célula para arrancar la zona de la m em brana
m icropipeta de vidrio unión íntim a canales ió n ic o s \
mem brana celular
fi-li.
O
1/
CITOSOL
Probablemente las variaciones del campo eléctrico de la membrana afectan de forma insignificante a muchas de las proteínas de membrana. Sin embargo, los canales iónicos regulados por voltaje pueden adoptar varias conformaciones al ternativas cuyas estabilidades dependen de la intensidad del campo eléctrico. Cada conform ación es estable frente a pequeñas alteraciones, pero puede saltar (“flip”) a otra conform ación si sufre una sacudida suficiente por los movimien tos térm icos aleatorios del entorno, alterándose la estabilidad relativa de las conform aciones abierta, cerrada e inactivada (véase Figura 11-21).
boca de la micropipeta y la membrana es muy intensa, la corriente únicam ente puede entrar o salir de la micropipeta atravesando los canales de la z o n a de membrana que recubre la boca de la micropipeta. Se utiliza un dispositivo electrónico que permite m antener el potencial de m embrana a un valor constante predeterminado mientras se registra la corriente iónica que atraviesa los canales individuales. La ventaja de trabajar con la zona de m embrana separada de la célula es que resulta más fácil alterar la com posición de la solución a cada lado de la membrana, para estudiar el efecto de diferentes solutos sobre el com portamiento del canal. La zona de membrana separada del resto de la célula también puede colocarse en la orientación opuesta, con la cara citoplasmática de la m em brana hacia el lumen de la pipeta (véanse también Figuras 4-54 y 4-55).
Los canales catiónicos regulados por voltaje están relacionados evolutiva y estructuralm ente20 Los canales de Na+ no constituyen el único tipo de canal catiónico regulado por voltaje que puede generar un potencial de acción: por ejemplo, los potenciales de acción de algunas fibras musculares, oocitos y células endocrinas no depen den de canales de Na+ sino de canales de Ca2+ regulados por voltaje. Además, en algunos tipos de células que norm alm ente no son eléctricamente activas se ha llan canales de Na+, de K+ o de Ca2+ regulados por voltaje, cuya función es desco nocida. En cada una de estas tres clases de canales catiónicos regulados por vol taje existe una sorprendente diversidad estructural y funcional, generada tanto
Figura 11 -26 Registros de corriente a través de un único canal de Na* regulado por voltaje. Se utiliza una diminuta zona de m embrana plasmática separada de una célula muscular de embrión de rata (véase Figura 11-25). La membrana fue despolarizada por un abrupto incremento de potencial, como se indica en (A). Los tres registros de corriente que se presentan en (B) provienen de tres experimentos realizados sobre la misma zona de membrana. Cada una de las variaciones mayores de corriente de (B) representan la apertura y el cierre de un solo canal. El estudio comparativo de los tres registros muestra que, a pesar de que los tiempos de apertura y cierre del canal varían considerablemente, la velocidad a la que la corriente fluye a través del canal abierto es prácticam ente constante. Las fluctuaciones menores del registro de corriente provienen principalmente de ruido eléctrico de fondo del aparato de medida. En (C) se muestra la suma de corrientes medidas en 144 repeticiones del mismo experimento. Esta corriente agregada es equivalente a la corriente de Na+habitual que se podría observar a través de una zona de membrana que contuviera 144 canales. Comparando (B) y (C) se puede observar que la variación temporal de voltaje de la corriente agregada refleja la probabilidad de que cualquier canal individual se encuentre en el estado abierto; esta probabilidad disminuye con el tiempo a medida que los canales de la membrana despolarizada adoptan su conform ación inactivada. (Datos de J. PatlakyR. Horn,/. Gen. Physiol. 79:333-351, 1982, con permiso de copyright de The Rockefeller University Press.)
570
Capítulo 11: Transporte de moléculas pequeñas a través de la membrana
(A) potencial de -40 m em brana -90 (mV) (B) corriente de la zona de m em brana (pA)
y»*". U ‘wssA1
WA
(C)
corriente agregada 0 40 80 tiem po (m ilisegundos)
bicapa lipidica COOH
HOOC
HOOC
(B)
por múltiples genes como por maduración alternativa de los transcritos de RNA producidos a partir de un mismo gen. Sin embargo, la secuencias de am inoáci dos conocidas de los canales de Na+, K+ y Ca2+regulados por voltaje muestran elevados grados de similitud, lo cual sugiere que todos ellos pertenecen a una gran superfamilia de proteínas relacionadas evolutiva y estructuralmente. Cada tipo de canal catiónico regulado por voltaje está compuesto de cuatro dominios proteicos homólogos (en el caso de los canales de Na+ y de Ca2+) o de cuatro subunidades idénticas (en el caso de los canales de K+). Se cree que estos cuatro dominios o subunidades se disponen a modo de costillas de un barril, ro deando un poro central, como se ilustra en la Figura 11-27. Los canales de K+ son especialmente adecuados para estudiar las relaciones entre la estructura y la fun ción de los canales catiónicos regulados por voltaje, ya que no están formados por una gran cadena polipeptídica sino por subunidades idénticas relativamente pequeñas. La secuencia de aminoácidos sugiere que cada una de las subunidades de un canal de K+ contiene seis hélices a que atraviesan la membrana, aunque, de forma sorprendente, parece que ninguna de ellas forma el poro que conduce los iones. Diversos estudios utilizando técnicas de DNA recom binante sobre proteínas de canal de K+ modificadas sugieren que un segmento de una cadena polipeptídica de 20 aminoácidos se extiende a través de la mem brana formando una lámina (3 antiparalela que bordea el poro: cuando se intercambia este ele m ento entre dos canales de K+ con diferentes propiedades de permeabilidad, se observa que las características de permeabilidad dependen únicamente de este segmento. Se ha utilizado una aproximación similar para identificar otras dos impor tantes regiones funcionales de las proteínas de canal de K+. Los 19 residuos amino terminales de al menos una de estas proteínas participan en la rápida inacti vación del canal. Si se altera esta región, la cinética de inactivación del canal cambia, y si la región se elimina completamente, se elimina la inactivación. Asombrosamente, en este último caso se puede recuperar la inactivación expo-
Canales iónicos y propiedades eléctricas de las membranas
Figura 11 -27 Modelo de la estructura dal canal de K+ regulado por voltaje. (A) Diagrama topològico mostrando los principales dominios funcionales de la cadena polipeptídica de una subunidad, con las seis posibles hélices a transmembrana marcadas del 1 al 6. Se cree que las subunidades, cada una de unos 600 aminoácidos, se ensamblan formando un poro transmembrana; en (B) sólo se muestran dos de ellas. En los canales de Na+y de Ca2+regulados por voltaje las 4 subunidades son dominios de una única larga cadena polipeptídica, pero se cree que su estructura general es similar a ésta. Parece que el segmento de 20 aminoácidos (que se muestra en rojo) situado en la región de unión entre las hélices 5 y 6 se extiende a través de la membrana como dos láminas P antiparalelas formando el poro, como se muestra en la figura. La cuarta hélice a (azul) tiene residuos cargados positivamente en casi cada tercera posición, lo cual al parecer le permite actuar como un sensor al voltaje. Al menos en algunos canales de K+el dominio amino terminal participa en la rápida inactivación del canal, como se ilustra en la Figura 11-28.
571
niendo la cara citoplasmàtica de la membrana plasmática a un pequeño péptido sintético correspondiente al amino terminal eliminado. Estos resultados sugieren que la región amino terminal de cada canal de K+ actúa como una pelota anclada mediante una corta cadena, que ocluye el extremo citoplasmàtico del poro en cuanto éste se abre (Figura 11-28); se cree que un mecanismo similar a éste actúa en la rápida inactivación de los canales de Na+ regulados por voltaje, aunque pa rece que en este caso participa un segmento diferente de la proteina. Finalmente, una de las hélices a transmembrana altamente conservadas en todos los canales catiónicos regulados por voltaje conocidos contiene residuos de aminoácido car gados positivamente, distribuidos de una forma espaciada regularmente (véase Figura 11-27A). Se cree que esta hélice podría actuar como sensor al voltaje en es tos canales: si se altera alguno de estos residuos cargados, también se altera la respuesta del canal al potencial de membrana. Se ha utilizado el mismo tipo de análisis, combinando la tecnología del DNA recom binante y las técnicas de electrofisiología, para caracterizar otras clase de canales iónicos. Estos canales no se abren en respuesta a cambios del potencial de mem brana sino a la unión de un neurotransmisor específico.
Figura 11 -28 El modelo de “bola y cadena” para la rápida inactivación de un canal de K+regulado por voltaje. Cuando la membrana se despolariza el canal se abre y empieza a conducir iones. Entonces, el canal abierto es susceptible de ocluirse (inactivarse) por la “bola” de 19 aminoácidos del extremo amino terminal, que está unida al propio canal mediante un segmento de cadena polipeptídica desplegado que actúa como una “cadena”. Para simplificar sólo se muestran dos bolas; de hecho existen 4 de ellas, una de cada subunidad. Se cree que un mecanismo similar a éste, utilizando un segmento diferente de la cadena polipeptídica, actúa en la inactivación del canal de Na+.
term inal nervioso neurotransm isor en vesículas hendidura sináptica _ canal regulado por * transm isor __célula diana postsináptica SINAPSIS QUÍMICA EN REPOSO
En las sinapsis quím icas los canales iónicos regulados por transm isor transform an señales químicas en señales eléctricas15 Las señales neuronales se transm iten de una célula a otra a través de lugares especializados de contacto conocidos como sinapsis. El m ecanismo habitual de transmisión es indirecto. Las células se hallan aisladas eléctricamente una de otra, estando la célula presináptica separada de la célula postsináptica por una estrecha hendidura sináptica. Un cambio del potencial eléctrico en la célula pre sináptica desencadena la liberación de una pequeña molécula señal conocida como neurotransm isor, el cual se almacena en vesículas sinápticas rodeadas de m em brana y se libera por exocitosis. El neurotransmisor difunde rápidamente a través de la hendidura sináptica y provoca un cambio eléctrico en la célula post sináptica a través de un canal iónico regulado por transmisor (Figura 11-29). Una vez el neurotransmisor ha sido secretado, es rápidamente eliminado, bien por enzimas específicas de la hendidura sináptica bien por recaptación -tanto por la terminal nerviosa que lo ha liberado como por las células gliales vecinas. La re captación está mediada por varios tipos de proteínas transportadoras de neuro transmisor dependientes de Na+. La rápida eliminación asegura la precisión es pacial y temporal de la señalización en la sinapsis: evita que el neurotransmisor afecte a las células vecinas y limpia la hendidura sináptica antes de que se pro duzca el nuevo pulso de liberación de neurotransmisor, de forma que a la célula postsináptica se le puede com unicar el ritmo, repetido y rápido, de los procesos señalizadores. Como veremos, la señalización a través de sinapsis químicas de este tipo es mucho más versátil y adaptable que el acoplamiento eléctrico direc to a través de uniones com unicantes en las sinapsis eléctricas (discutidas en el Capítulo 19), tam bién utilizadas por las neuronas aunque mucho menos fre cuentem ente.
572
Capítulo 11 : Transporte de moléculas pequeñas a través de la membrana
t
*
m em brana plasmática de la célula diana
SINAPSIS QUÍMICA ACTIVA Figura 11 -29 U na sinapsis química. Cuando un potencial de acción alcanza al terminal nervioso, estimula a dicho terminal a liberar su neurotransmisor; el neurotransmisor se halla contenido en vesículas sinápticas y se libera al exterior celular cuando las vesículas se fusionan con la membrana plasmática del terminal nervioso. El neurotransmisor liberado se une a los canales iónicos regulados por transmisor concentrados en la zona sináptica de la membrana plasmática de la célula diana, abriéndolos. El flujo de iones resultante altera el potencial de membrana de la célula diana, transmitiendo así una señal desde el nervio excitador.
Los canales iónicos regulados por transm isor están especializados en la rápida conversión de señales químicas extracelulares en señales eléctricas, en las sinapsis químicas. Los canales se hallan concentrados en la membrana plasmática de la célula postsináptica en la región de la sinapsis, y se abren transitoriamente en respuesta a la unión de moléculas de neurotransmisor, produciendo así un breve cambio de permeabilidad de la membrana (véase Fi gura 11-29). A diferencia de los canales regulados por voltaje responsables de los potenciales de acción, los canales regulados por transmisor son relativa mente insensibles al potencial de membrana y por ello no pueden por sí mis mos producir una excitación auto-amplificante. En lugar de ello producen cambios locales de permeabilidad y por tanto cambios del potencial de m em brana, de intensidad proporcional al número de moléculas de neurotransmisor liberadas en la sinapsis y al tiempo en que estas moléculas persistan en ella. Solamente se puede generar un potencial de acción a partir de este lugar si el potencial de membrana local se incrementa suficientemente como para abrir un número suficiente de canales catiónicos regulados por voltaje presentes en la misma membrana de la célula diana.
Las sinapsis químicas pueden ser excitadoras o inhibidoras15,21 Los canales iónicos regulados por transmisor difieren en algunos aspectos im portantes. En primer lugar, como los receptores, tienen un lugar de unión alta mente selectivo para el neurotransmisor liberado desde el terminal nervioso presináptico. En segundo lugar, como los canales, son selectivos al tipo de ion que dejan pasar a través de la membrana; ello determina la naturaleza de la res puesta postsináptica. Los neurotransm isores excitadores, como la acetilcolina, el glutamato y la serotonina, abren canales catiónicos que generan un influjo de Na+ que despolariza la membrana postsináptica hacia el potencial umbral que dispara un potencial de acción. Los neurotransm isores inhibidores como el ácido y-aminobutírico (GABA) y la glicina, por el contrario, abren canales de CL, lo cual suprime el disparo, polarizando la membrana postsináptica. Ya hemos discutido cómo la apertura de los canales iónicos despolariza una membrana. El efecto de la apertura de los canales de Cl” puede entenderse de la siguiente manera. La concentración de Cl- es mucho mayor fuera que dentro de la célula (véase Tabla 11-1, pág. 542). Por esta razón, la apertura de los canales de Cl- tenderá a hiperpolarizar la membrana al entrar más iones cloro cargados negativamente ál interior de la célula, a no ser que el potencial de membrana sea tan negativo que sea insuficiente para contrarrestar el elevado gradiente de Cl'. (De hecho, en muchas neuronas el potencial de equilibrio para el Cl- es cercano al potencial de reposo, o incluso es más negativo.) En aquel caso, la apertura de los canales de Cl- hace más difícil despolarizar la membrana y, por lo tanto, exci tar la célula. La importancia de los neurotransmisores inhibidores se demuestra por los efectos de las toxinas que bloquean su acción: la estricnina, por ejemplo, se une a los receptores de glicina bloqueands la acción de la glicina, lo cual cau sa espasmos, convulsiones y la muerte. No todas las señales químicas del sistema nervioso, sin embargo, actúan a través de canales iónicos regulados por ligando. Muchas de las moléculas señal que son secretadas por los terminales nerviosos, incluidos una gran variedad de neuropéptidos, se unen a receptores que regulan, indirectamente, canales iónicos. Estos receptores, denominados receptores relacionados con proteína G y receptores relacionados con enzimas se discuten en detalle en el Capítulo 15. Mientras que la señalización mediada por neurotransmisores excitadores e inhibidores que se unen a canales iónicos regulados por transmisor generalmente es inmediata, sim ple y breve, la señalización mediada por receptores relacionados con proteínas G y por receptores relacionados con enzimas tiende a ser mucho más lenta y más compleja, así como de consecuencias más duraderas.
Canales iónicos y propiedades eléctricas de las membranas
573
Los receptores de acetilcolina de las uniones neuromusculares son canales catiónicos regulados por transm isor22 El ejemplo m ejor estudiado de canales iónicos regulados por transmisor es el re ceptor de acetilcolina de las fibras musculares esqueléticas. Este canal se abre transitoriamente por la liberación de acetilcolina del terminal nervioso, en una sinapsis neurom uscular -u n a sinapsis especializada entre una neurona motora y una fibra muscular esquelética (Figura 11-30). Este tipo de sinapsis ha sido es tudiada intensam ente ya que es fácilmente accesible a los estudios electrofisiológicos, a diferencia de la mayoría de sinapsis del sistema nervioso central. El receptor de acetilcolina ocupa un lugar especial en la historia de los ca nales iónicos. Fue el primer canal iónico que fue purificado, el primero del que se conoció la secuencia com pleta de aminoácidos, el primero en ser reconstitui do funcionalm ente en bicapas lipídicas sintéticas y el primero para el que se re gistró la señal eléctrica de un solo canal abierto. Su gen también fue el primer gen de una proteína de canal que fue clonado y secuenciado. Al menos existen dos razones que explican el rápido progreso en la purificación y caracterización de este receptor. En primer lugar, existe una fuente extraordinariamente rica de este receptor en los órganos eléctricos de los peces eléctricos y de las rayas (estos órganos son músculos modificados diseñados para descargar un gran shock eléctrico sobre su presa). En segundo lugar, existen neurotoxinas (como la abungarotoxina ) en el veneno de ciertas serpientes, que se unen a dicho receptor con una elevada afinidad (ÁTa= 109 litros/mol) y especificidad, por lo que pueden ser utilizadas para purificarlo por cromatografía de afinidad. También se puede utilizar a-bungarotoxina fluorescente o marcada con radiactividad para localizar y cuantificar los receptores de acetilcolina. De esta forma, se ha visto que el re ceptor se halla densamente empaquetado en la zona de la sinapsis neuromuscu lar de la m em brana plasmática de las fibras musculares (unos 20 000 receptores/pm2), mientras que existen relativamente pocos de tales receptores en otros lugares de esta membrana. El receptor de acetilcolina de la fibra muscular esquelética está compuesto por cinco polipéptidos transmembrana, dos de un tipo y otros tres, codificados por cuatro genes diferentes. Los cuatro genes tienen una secuencia muy similar, lo cual implica que probablem ente han evolucionado a partir de un gen ances tral común. Cada uno de los dos polipéptidos idénticos del pentámero tiene lu gares de unión a la acetilcolina. Cuando dos moléculas de acetilcolina se unen al com plejo pentamérico, inducen un cam bio de conformación que abre el canal. El canal permanece abierto durante aproximadamente 1 milisegundo y enton ces se cierra; como los canales de Na+ regulados por voltaje, la forma abierta del canal receptor de acetilcolina tiene una vida media corta, y rápidamente salta a un estado cerrado, de menor energía libre (Figura 11-31). Posteriormente, las moléculas de acetilcolina se disocian del receptor y son hidrolizadas por una en zima específica (la acetilcolinesterasa) localizada en la sinapsis neuromuscular.
ocupado y cerrado 574
ocupado y abierto
Capítulo 11: Transporte de moléculas pequeñas a través de la membrana
fibra muscular
de Schwann
axón mielinizado
nervio
terminales axónicos
10 lift* Figura 11 -30 Electronm icrografía de barrido a bajo aum ento de una sinapsis neurom uscular de rana. Se muestra la terminación de un único axón sobre una fibra muscular esquelética. (De J. Desaki y Y. Uehara, 10:101-110,1981, con permiso de Chapman & Hall.)
J. Neurocytol
Figura 11 - 31 Tres conform aciones del receptor de acetilcolina. La unión de dos moléculas de acetilcolina abre este canal iónico regulado por transmisor. Sin embargo, incluso cuando se halla unido a acetilcolina, el receptor sólo se halla en la conformación abierta muy brevemente, antes de que el canal se vuelva a cerrar. Entonces la acetilcolina se disocia del receptor, lo cual permite al receptor volver a su conformación original.
lugares de acetilcolina
bicapa lipidica
canal
poro 4 nm CITOSOL com puerta
Una vez se ha liberado del neurotransmisor al que se había unido, el receptor de acetilcolina revierte a su estado inicial de reposo. Se ha determinado la forma general del receptor de acetilcolina y la dispo sición de sus subunidades, m ediante una com binación de m icroscopía electró nica y difracción de rayos X de ángulo pequeño sobre cristales bidim ensionales: las cinco subunidades están dispuestas en anillo formando un canal transm em brana lleno de agua, que consiste en un estrecho poro a través de la bicapa lipídica rodeado por zonas cilindricas de la molécula (Figura 11-32). En cada uno de los extremos del poro, unos grupos de residuos de aminoácido car gados negativamente ayudan a excluir los iones negativos y facilitan que los iones positivos de diámetro menor de 0,65 nm atraviesen el poro. El tráfico nor mal consiste principalmente en iones Na+ y K+, y algunos iones Ca2+. Así, a dife rencia de los canales catiónicos regulados por voltaje, este canal tiene una baja selectividad a los cationes y la contribución relativa de los diferentes cationes a la corriente a través de los canales depende fundamentalmente de sus concen traciones y de las fuerzas electroquímicas que los impulsan. Cuando la m em bra na de la fibra muscular se halla en su potencial de reposo, la fuerza neta de im pulso del K+ es cercana a cero ya que el gradiente de voltaje equilibra casi totalm ente el gradiente de concentración de K+a través de la m embrana (véase Panel 11-2, pág. 562). Para el Na\ por el contrario, el gradiente de voltaje y el gradiente de concentración actúan en la misma dirección, impulsando el ion al interior de la célula. (Lo mismo es válido para el Ca2+, pero la concentración extracelular de Ca2+ es mucho menor que la de Na+, de forma que el Ca2+ contribu ye muy ligeramente a la corriente de entrada total.) Así pues, la apertura de los canales receptores de acetilcolina provoca un gran influjo neto de iones Na+ (unos 30 000 iones por canal cada milisegundo). Este influjo causa una despola rización de la mem brana que señaliza al músculo a contraerse, como discutire mos más adelante.
Figura 11-32 Modelo de la estructura del receptor de acetilcolina. Cinco subunidades homólogas (a, a, p, y y 8) se combinan formando un poro acuoso transmembrana. El poro está constituido por un anillo de cinco hélices a transmembrana, una de cada subunidad. Probablemente el anillo de hélices a está rodeado por un aro de lámina (3 transmembrana formada por los otros segmentos transmembrana de las cinco subunidades. Parece que en su conformación cerrada el poro se halla ocluido por las cadenas laterales hidrofóbicas de cinco residuos de leucina, uno de cada hélice a, que forman una compuerta cerca del centro de la bicapa lipídica. Las cadenas laterales cargadas negativamente situadas a cada lado del poro aseguran que únicamente atravesarán el poro iones cargados positivamente. Las dos subunidades a contienen un lugar de unión a la acetilcolina; cuando la acetilcolina se une a los dos lugares de unión, el canal sufre un cambio de conformación que abre la compuerta, posiblemente gracias a un desplazamiento de los residuos de leucina. (Adaptado de N. Unwin, Cell/Neuron 72/10 [Supl.] 3141,1993 © Cell Press.)
Los canales iónicos regulados por transm isor son las dianas principales de la acción de drogas psicoactivas23 Los canales iónicos que se abren directamente en respuesta a los neurotransmisores acetilcolina, serotonina, GABA y glicina, contienen subunidades que son estructuralmente similares entre sí, lo cual sugiere que están relacionadas evolu tivamente y que probablemente forman poros transmembrana de la misma m a nera, aunque su especificidad para el neurotransmisor y su selectividad para el ion sean distintas. Los canales iónicos regulados por glutamato están formados por una familia distinta de subunidades, pero al parecer tienen un estructura ge neral similar. En cada caso, el canal está formado por subunidades polipeptídicas homólogas, las cuales probablemente forman un pentámero que se asemeja al receptor de acetilcolina (véase Figura 11-32). La comparación de las Figuras
Canales iónicos y propiedades eléctricas de las membranas
575
canales catiónicos regulados por voltaje
canales iónicos regulados por transm isor
uniones com unicantes (o de tipo "gap")
11 -27 y 11 -32 pone de manifiesto las diferencias entre estos canales y los canales catiónicos regulados por voltaje, los cuales están formados por un anillo de cua tro subunidades (o dominios). Quizá como resultado de ello, los canales regula dos por transmisor tienen poros más anchos y, por tanto, son menos estrictos en su selectividad a iones. Las uniones comunicantes, formadas por un anillo de seis subunidades, tienen poros más anchos que permiten el paso de iones inor gánicos y de pequeñas moléculas orgánicas (se discute en el Capítulo 19). Esta posible relación entre número de subunidades y la amplitud del poro se ilustra en la Figura 11-33. Cada uno de los tipos de canales iónicos regulados por transmisor tienen for mas alternativas de cada subunidad, codificadas por genes diferentes o genera das por la maduración alternativa del RNA del mismo producto génico. Todo ello se combina de diferente forma generando un conjunto de subtipos de canales ex traordinariamente diverso, con diferentes afinidades para el ligando, diferentes conductancias de canal, diferentes velocidades de apertura y cierre y diferentes sensibilidades a drogas y toxinas. Las neuronas de los vertebrados, por ejemplo, tienen canales iónicos regulados por acetilcolina que se diferencian de los de las fibras musculares en que habitualmente están formados por dos subunidades de un tipo y tres de otro; sin embargo existen al menos siete genes que codifican di ferentes versiones del primer tipo de subunidades y al menos tres que codifican diferentes versiones del segundo, con una diversidad añadida debida a la madu ración alternativa del RNA. Se pueden caracterizar diferentes subconjuntos de neuronas sensibles a acetilcolina, con diferentes funciones en el cerebro, debido a diferentes combinaciones de estas subunidades. Ello, en principio y con alguna utilización en la práctica, permite diseñar drogas que tengan como diana reduci dos grupos de neuronas o de sinapsis, influyendo así específicamente determina das funciones cerebrales. De hecho, los canales iónicos regulados por transmisor han sido durante mucho tiempo importantes dianas para las drogas. Un cirujano, por ejemplo, puede hacer que los músculos se relajen durante una operación blo queando los receptores de acetilcolina de las fibras musculares esqueléticas con curare, una droga vegetal que se utilizó originariamente por los indios sudameri canos para envenenar sus flechas. La mayoría de drogas utilizadas en el trata miento del insomnio, de la ansiedad, de la depresión y de la esquizofrenia, ejercen sus efectos sobre las sinapsis químicas y muchas de ellas actúan uniéndose a ca nales iónicos regulados por transmisor: tanto los barbituratos como los tranquili zantes, como el Valium y el Librium, por ejemplo, se unen a los receptores de GABA potenciando su acción inhibidora al permitir que concentraciones más ba jas de GABA abran los canales de Cl~. La nueva biología molecular de los canales revela la diversidad y los detalles de su estructura, permitiendo así diseñar una nueva generación de drogas psicoactivas que actuarán más selectivamente alige rando el sufrimiento de las enfermedades mentales. Los canales iónicos son los com ponentes moleculares básicos a partir de los cuales se construyen los elementos neuronales de la computación y la señaliza ción biológica. Para poder entrever como pueden llegar a ser de sofisticadas las funciones de estos elementos, consideramos ahora varios ejemplos que de muestran cóm o actúan conjuntam ente varios grupos de canales en la comuni cación sináptica entre células excitables eléctricamente. 576
Capítulo 11: Transporte de moléculas pequeñas a través de la membrana
Figura 11 -33 Tres clases de proteínas de canal. Posible relación entre el número de subunidades proteicas y el diámetro del poro. (Adaptado de B. Hille, Ionic Channels of Excitable Membranes, 2a. ed. Sunderland, MA: Sinauer, 1992.)
La transm isión neuromuscular implica la activación secuencial de al m enos cuatro grupos de canales iónicos regulados15 La importancia que tienen para las células excitables eléctricamente los canales iónicos regulados puede ilustrarse siguiendo el proceso por el cual un impulso nervioso estimula la contracción de una célula muscular. Esta respuesta aparen tem ente simple requiere la activación secuencial de al menos cuatro grupos de canales iónicos regulados -todos ellos en pocos milisegundos (Figura 11-34). 1. El proceso se inicia cuando un impulso nervioso llega al terminal nervioso y despolariza la membrana plasmática. La despolarización abre transito riamente los canales de Ca2+ regulados por voltaje de esta membrana. Dado que la concentración de Ca2+ fuera de la células es más de 1000 veces mayor que la concentración libre del interior de las células, el Ca2+ fluye hacia el interior del terminal nervioso. El incremento de la concentración de Ca2+ en el citoplasma del terminal dispara la liberación localizada de acetilcolina en la hendidura sináptica. 2. La acetilcolina liberada se une a los receptores de acetilcolina de la membra na plasmática postsináptica de la fibra muscular, abriendo transitoriamente los canales catiónicos que se hedían asociados a estos receptores. El influjo de Na+que se genera provoca una despolarización localizada de la membrana. 3.
La despolarización de la membrana plasmática de la fibra muscular abre los canales de Na+regulados por voltaje de esta membrana, permitiendo la entrada de más Na+, el cual despolariza la membrana. A su vez, esta despo larización abre más canales de Na+ regulados por voltaje, de forma que se forma una despolarización auto-propagante (un potencial de acción) que se extiende por toda la membrana plasmática (véase Figura 11-23).
4.
La despolarización generalizada de la membrana plasmática de la fibra muscular provoca la apertura transitoria de canales iónicos de regiones es pecializadas (los túbulos transversos [T] -discutidos en el Capítulo 16) de esta membrana. Esta apertura causa la apertura transitoria de canales de liberación de Ca2+de regiones adyacentes de la membrana del retículo sarcoplasmático, la cual provoca la liberación al citosol de Ca2+ almacenado en el retículo sarcoplasmático. Este incremento repentino en la concentra ción citosólica de Ca2+ provoca la contracción de las miofibrillas de la fibra muscular. Todavía no conocem os cuál es el mecanismo mediante el cual la activación de los canales de Ca2+ regulados por voltaje de la membrana del túbulo T conduce a la apertura de los canales de liberación de Ca2+ de
SINAPSIS NEUROMUSCULAR EN REPOSO CANAL DE Ca2+ REGULADO POR VOLTAJE
term inal nerviosa
UNION NEUROMUSCULAR ACTIVADA 1
( I Impulso
acetilcolina
CANAL CATIÓNICO REGULADO POR ACETILCOLINA
CANAL DE Ca2+ REGULADO POR VOLTAJE
CANAL DE Na+ REGULADO POR VOLTAJE
retículo sarcoplasm ático
Figura 11 -34 Sistema de canales iónicos de una sinapsis neuromuscular. Estos canales iónicos regulados son esenciales para la estimulación de la contracción muscular por un impulso nervioso. Los diferentes canales están numerados siguiendo la secuencia en la que se abren, tal como se describe en el texto.
m em brana plasmática m uscular
CANAL REGULADO DE LIBERACIÓN DE Ca2+
Canales iónicos y propiedades eléctricas de las membranas
5 77
Figura 11-35 Soma celular de una motoneurona de la médula espinal. Sobre el soma celular y las dendritas existen muchos miles de sinapsis formadas por terminaciones nerviosas. Estas sinapsis suministran señales de otras zonas del organismo controlando el desencadenamiento de potenciales de acción a lo largo del axón de esta gran célula.
dendritas
0,1 mm dendrita
term inaciones presinápticas cono o colina axónica
axón
vaina de m ielina
la m em brana del retículo sarcoplasmático. Sin embargo, ambas m embra nas se hallan en íntimo contacto y ambos tipos de canales se hallan juntos formando una estructura especializada (véase Figura 16-92). Por lo tanto, es posible que un cambio de conform ación inducido por voltaje del canal de Ca2+ de la m em brana plasmática abra directamente el canal de libera ción de Ca2+ del retículo sarcoplasmático a través de un acoplamiento m e cánico (se discute en el Capítulo 16). La activación de la contracción muscular por una neurona motora es comple ja, pero para que una neurona integre un elevado número de señales de entrada y las integre generando una señal de salida adecuada se requiere una interacción de canales iónicos incluso más sofisticada, como discutiremos a continuación.
El potencial postsináptico principal de una neurona representa la suma espacial y temporal de muchos pequeños potenciales postsinápticos15,24 En el sistema nervioso central una sola neurona puede recibir señales de miles de otras neuronas. Por ejemplo, sobre una neurona motora media de la médula es pinal realizan sinapsis varios miles de terminales nerviosos; su soma celular y sus dendritas están casi completamente cubiertos por ellas (Figura 11-35). Algunas de estas sinapsis transmiten señales desde el cerebro o desde la médula espinal; otras transportan información sensorial desde los músculos o desde la piel. La motoneurona puede com binar la información que recibe de todas estas fuentes y reacciona generando potenciales de acción o permaneciendo en reposo. De las muchas sinapsis que existen sobre una neurona, algunas tienden a excitarla y otras a inhibirla. El neurotransmisor liberado en una sinapsis excita dora causa una ligera despolarización de la mem brana postsináptica denomina da potencial postsináptico excitador (PSP, de postsinaptic potencial) mientras que el neurotransmisor liberado en una sinapsis inhibidora generalmente causa una pequeña hiperpolarización denominada PSP inhibidor. Como la membrana de las dendritas y del soma celular de la neurona contiene pocos canales de Na+
578
Capítulo 11: Transporte de moléculas pequeñas a través de la membrana
200 potenciales de acción presinápticos por segundo
tiem po (m ilisegundos) 400 potenciales de acción presinápticos por segundo
Figura 11 -36 Principio de la suma temporal. Cada potencial de acción presináptico que llega a una sinapsis produce un pequeño potencial postsináptico (PSP) {lineas negras). Cuando llegan sucesivamente varios potenciales de acción a una misma sinapsis, cada PSP producido se añade a la cola del PSP precedente, generando un PSP combinado principal {líneas verdes). Cuanto mayor es la frecuencia de llegada de potenciales de acción, mayor es el tamaño del PSP combinado.
tiem po (m ilisegundos) 800 potenciales de acción presinápticos por segundo
tiem po (m ilisegundos)
regulados por voltaje, generalmente un solo PSP no es suficiente para desenca denar un potencial de acción. Por el contrario, cada señal aferente queda refleja da fielmente en un PSP de una magnitud graduada, que decrece con la distancia a partir del lugar de la sinapsis. Si las señales llegan simultáneamente a varias sinapsis de la misma región del árbol dendrítico, el PSP total de esta zona será, a grandes rasgos, la suma de los PSP individuales, de forma que los PSP inhibido res contribuyen de manera negativa a esta suma total. Los PSP de las regiones vecinas se propagan pasivamente a otras regiones y convergen en el soma celu lar. Como el soma celular es relativamente pequeño comparado con el árbol dendrítico, el potencial de mem brana del soma celular y de sus alrededores in mediatos será más o m enos uniforme y estará compuesto por los efectos de to das las señales que llegan a la célula, cuya importancia dependerá de la distancia a la que se encuentra la sinapsis del soma celular. Se dice, por lo tanto, que el potencial postsináptico principal (PSP principal) del soma celular representa una sum a espacial de todos los estímulos recibidos. Si predominan las señales excitadoras, se generará una despolarización; si predominan las señales inhibi doras, se producirá una hiperpolarización. Mientras que la suma espacial com bina los efectos de las señales recibidas en diferentes lugares de la membrana, la sum a tem poral com bina los efectos de las señales recibidas en m omentos distintos. Si un potencial de acción llega a una sinapsis y desencadena la liberación de un neurotransmisor antes de que un PSP haya decaído completamente, el segundo PSP se añade a la cola remanente del primero. Si llegan muchos potenciales de acción siguiendo una sucesión rá pida, cada PSP se añade a la cola del PSP precedente construyendo un PSP prin cipal mantenido cuya magnitud refleja la velocidad de disparo de la neurona presináptica (Figura 11-36). Ésta es la esencia de la sumación temporal: traduce la frecuencia de las señales de entrada en magnitud de un PSP neto.
Canales iónicos y propiedades eléctricas de las membranas
579
(B)
(A)
100
ó"a
100
200
200
-70 tiem po (m ilisegundos)
Figura 11 -37 Codificación del PSP
tiem po (m ilisegundos)
Conjuntamente, las sumaciones temporal y espacial proporcionan los m e dios mediante los cuales las velocidades de descarga de muchas neuronas presinápticas controlan el potencial de mem brana (el PSP principal) del soma de una sola célula postsináptica. El último paso en la integración neuronal realizado por la célula postsináptica es la generación de una señal de salida, normalmente en forma de potenciales de acción, con el fin de retransmitir una señal a otras célu las. La señal de salida es un reflejo de la magnitud del PSP principal del soma ce lular. Sin embargo, mientras que el PSP principal es una variable graduada de manera continua, los potenciales de acción son de tipo todo o nada y de tamaño uniforme. La única variable existente en la señalización mediante potenciales de acción es el intervalo de tiempo entre un potencial de acción y el siguiente. Por lo tanto, para la transmisión a grandes distancias, la magnitud del PSP principal se traduce, o se codifica, en la frecuencia de descarga de los potenciales de ac ción (Figura 11-37). Esta codificación se consigue gracias a un grupo especial de canales iónicos regulados que se encuentran presentes a una densidad elevada en la base del axón, en un punto adyacente al soma celular, en una región cono cida como el cono o colina axónica (véase Figura 11-35).
La integración neuronal requiere la com binación de al menos tres tipos de canales de K+diferentes15,25 Hemos visto que la intensidad de la estimulación recibida por una neurona se codifica, en las transmisiones a larga distancia, como frecuencia de potenciales de acción que dispara la neurona: cuanto mayor sea la estimulación mayor es la frecuencia de los potenciales de acción. Los potenciales de acción se inician en el cono axónico, única región de cada neurona en la que los canales de Na+ re gulados por voltaje son completos. Sin embargo, para realizar esta función espe cial de codificación, la mem brana del cono axónico contiene como mínimo otros cuatro tipos de canales iónicos -tres de ellos selectivos para el K+y uno se lectivo para el Ca2+. Las tres variedades de canales de K+ presentan propiedades diferentes; nos referiremos a ellos con los nombres de canales de K+activados re tardados, tempranos y activados por Ca2+. Para comprender por qué son necesa rios varios tipos de canal, consideremos primero el comportamiento que se ob servaría si los únicos canales regulados por voltaje que existieran en la célula nerviosa fueran los canales de Na+. Por debajo de un cierto umbral de estimula ción sináptica, la despolarización de la mem brana del cono axónico sería insufi ciente para desencadenar un potencial de acción. Al aumentar gradualmente la estimulación, se cruzaría el umbral; los canales de Na+ se abrirían y se dispararía un potencial de acción. El potencial de acción terminaría de la manera habitual, por inactivación de los canales de Na+. Antes de que se pudiera disparar otro po tencial de acción, estos canales deberían recuperarse de su inactivación. Pero esto requeriría que el voltaje de la membrana volviera a un valor muy negativo,
580
Capítulo 11: Transporte de moléculas pequeñas a través de la membrana
principal en forma de frecuencia de descarga de potenciales de acción en un axón. Comparando (A) con (B) se observa que la frecuencia de descarga de cada axón aum enta con el increm ento del PSP principal; en (C) se resume la relación general entre ambos parámetros.
cosa que no se produciría mientras se mantuviera el intenso estímulo despolari zante (del PSP). Por consiguiente, se necesita otro tipo de canal para repolarizar la membrana después de cada potencial de acción y preparar a la célula para que inicie otro potencial de acción. Esta tarea la llevan a cabo los canales de K+ retardados, que ya vimos previamente al estudiar la propagación del potencial de acción (véase pág. 565). Estos canales están regulados por voltaje pero debido a la lentitud de su cinética sólo se abren durante la fase de descenso del poten cial de acción, cuando los canales de Na+están inactivos. Su apertura permite una salida de K+ que conduce la membrana de nuevo al potencial de equilibrio del K+. Este potencial es tan negativo que los canales de Na+se recuperan rápida mente de su estado inactivado. La repolarización de la membrana provoca tam bién el cierre de los propios canales de K+ retardados. Ahora el cono axónico se halla en condiciones basales, de forma que el estímulo despolarizante proceden te de las señales sinápticas aferentes es capaz de generar un nuevo potencial de acción. De esta manera la estimulación sostenida de las dendritas y del soma ce lular conduce a la descarga repetitiva del axón. Sin embargo, la descarga repetitiva no es suficiente por sí sola. La frecuencia de descarga tiene que reflejar la intensidad de la estimulación y un simple siste ma de canales de Na+ y de canales de K+ retardados es insuficiente para ello. Por debajo de un cierto nivel umbral de estimulación constante la célula no produci rá descargas en absoluto; por encima de este umbral empezará bruscamente a producir descargas a una velocidad relativamente rápida. Los canales de K+tem pranos solucionan este problema. Estos canales también están regulados por voltaje y se abren cuando se despolariza la membrana, pero su sensibilidad es pecífica al voltaje y las cinéticas de inactivación son tales que actúan reduciendo la velocidad de descarga a unos niveles de estimulación que están inmediata mente por encima del umbral necesario para generar la descarga. Así, ayudan a eliminar la discontinuidad en la relación entre la velocidad de descarga y la in tensidad de la estimulación. El resultado de ello es una velocidad de descarga que es proporcional a la intensidad del estímulo despolarizante dentro de un margen muy amplio (véase Figura 11-37). Normalmente, el proceso de codificación se modula posteriormente por los otros dos tipos de canales iónicos del cono axónico que se mencionaron al princi pio -los canales de Ca?+regulados por voltaje y los canales de K+activados por Ca?+. Estos canales actúan conjuntamente disminuyendo la respuesta de la célula a una estimulación constante invariable -u n proceso denominado adaptación. Los ca nales de Ca2+ son similares a los canales de Ca2+ que intervienen en la liberación del neurotransmisor de los terminales axónicos presinápticos; se abren cuando se dispara un potencial de acción, permitiendo la entrada de Ca2+al interior del axón. El canal de K+activado por Ca2+es estructural y funcionalmente diferente de cual quier otro tipo de canal descrito anteriormente. Se abre en respuesta a una eleva ción de la concentración de Ca2+ en la cara citoplasmática de la membrana de la célula nerviosa. Supongamos que se aplica un intenso estímulo despolarizante durante un largo período de tiempo, que desencadena un largo tren de potencia les de acción. Cada potencial de acción permite una breve entrada de Ca2+a través de los canales de Ca2+ regulados por voltaje, de modo que la concentración intracelular de Ca2+ aumenta gradualmente hasta un nivel elevado suficiente para abrir los canales de K+ activados por Ca2+. El aumento resultante de la permeabilidad de la membrana al K+ hace que la membrana sea más difícil de despolarizar, incre mentando el retraso entre un potencial de acción y el siguiente. De esta manera, una neurona que es estimulada continuamente durante un período de tiempo prolongado, disminuye gradualmente su capacidad de respuesta al estímulo cons tante. Este fenómeno, que también puede aparecer por otros mecanismos, permi te a una neurona, y de hecho al sistema nervioso en general, reaccionar de forma sensible a un cambio, incluso cuando el nivel basal de estimulación es muy eleva do. Ésta es una de las estrategias que nos permite, por ejemplo, sentir un contacto sobre el hombro e ignorar, en cambio, la presión constante de nuestros vestidos. En el Capítulo 15 discutimos con más detalle los procesos de la adaptación.
Canales iónicos y propiedades eléctricas de las membranas
581
Otras neuronas realizan integraciones diferentes, reaccionando a sus seña les de entrada de miles de maneras diferentes, lo cual refleja el diferente surtido de m iem bros de diferentes familias de canales iónicos que presentan en sus membranas. Por ejemplo, en el sistema nervioso de los vertebrados existen al m enos cinco tipos conocidos de canales de Ca2+ regulados por voltaje. La multi plicidad de genes permite generar una multitud de diferentes tipos de neuronas cuyo comportamiento eléctrico corresponda perfectamente a la tarea particular que ejecutan. Una de las propiedades cruciales de los sistemas nerviosos es la capacidad de aprender y de recordar, lo cual parece depender fundamentalmente de cam bios a largo plazo de determinadas sinapsis. Concluimos este capítulo conside rando un rem arcable tipo de canal iónico que participa de forma especial en al gunas formas de aprendizaje y memoria. Se halla localizado en muchas sinapsis del sistema nervioso central, donde está regulado tanto por voltaje como por el glutamato, neurotransmisor excitador. Tam bién es el lugar de acción de la droga psicoactiva fenciclidina, o polvo de ángel.
La potenciación a largo plazo en el hipocampo de los mamíferos depende de la entrada de Ca2+ a través de canales receptores de NMDA26 Prácticamente todos los animales pueden aprender, pero parece que los mamífe ros pueden hacerlo excepcionalmente bien (o eso es lo que a nosotros nos gusta creer). En el cerebro de los mamíferos, el hipocampo, una región del córtex cere bral, juega un papel especial en el aprendizaje: cuando es destruido en ambos la dos del cerebro se pierde notablemente la capacidad de generar nuevos recuer dos, aunque los que se establecieron previamente hace tiempo, permanecen. De manera correspondiente, algunas sinapsis del hipocampo presentan dramáticas alteraciones funcionales cuando se estimulan repetidamente. Potenciales de ac ción ocasionales y aislados de las células presinápticas no dejan vestigios durade ros, pero un corto estallido de descargas repetitivas provoca la potenciación a largo plazo (LTP, de Long-Term Potentiation), de manera que los siguientes po tenciales de acción aislados de las células presinápticas provocan una respuesta enorm em ente aumentada en las células postsinápticas. El efecto dura horas, días o semanas, dependiendo del número e intensidad de los trenes de descargas re petitivas. Solamente presentan este efecto de potenciación las sinapsis que fue ron activadas; las sinapsis de la misma célula postsináptica que permanecieron en reposo, no están afectadas. Sin embargo, si en el instante en el que la célula está recibiendo un tren de estimulación repetitiva a través de un conjunto de si napsis, un potencial de acción alcanza otra sinapsis de su superficie, esta sinap sis tam bién sufrirá una potenciación a largo plazo, incluso aunque un potencial de acción aislado que alcanzara esta misma sinapsis en otro momento no dejara tales huellas. La regla fundamental en el hipocampo parece ser que la potenciación a lar
go plazo ocurre siempre que una célula presináptica descarga (una o más veces) en el instante en que la membrana postsináptica se encuentra intensamente des polarizada (tanto por descargas repetitivas recientes sobre la misma célula post sináptica com o por otros motivos). Existen claras evidencias de que esta regla refleja el com portam iento de una clase particular de canales iónicos presentes en la m em brana postsináptica. El glutamato es el principal neurotransmisor ex citador del sistema nervioso central y en el hipocampo, como en otros lugares, la mayoría de las corrientes despolarizantes responsables de los PSP excitadores son debidas a canales iónicos regulados por ligando que actúan de una forma estándar. Sin embargo, la corriente tiene, además, un segundo componente mu cho más intrigante, mediado por una subclase distinta de canales iónicos regu lados por glutamato conocidos com o receptores NMDA debido a que se activan selectivamente por un análogo artificial del glutamato, el N-metil-D-aspartato. Los canales receptores NMDA están regulados de forma doble, abriéndose sólo
582
Capítulo 11: Transporte de moléculas pequeñas a través de la membrana
el glutam ato liberado por un term inal nervioso presináptico activado abre canales receptores de glutam ato no de NMDA, perm itiendo un influjo de Na+ que despolariza la m em brana postsináptica
la despolarización elim ina el Mg que bloquea los canales receptores de NMDA, lo cual (unidos a glutam ato) perm ite que entre Ca2+ a la célula postsináptica
m em brana polarizada
Mg receptor NMDA
receptor de glutam ato no de NMDA
m em brana despolarizada
cuando se satisfacen simultáneamente dos condiciones: el receptor ha de estar unido al neurotransmisor glutamato y la mem brana ha de estar intensamente despolarizada. La segunda condición es necesaria para liberar Mg2+, que normal mente bloquea el canal en reposo, y significa que los receptores NMDA sólo se activan cuando los canales convencionales regulados por glutamato se hallan activados y la mem brana despolarizada. Los receptores NMDA son críticos para la potenciación a largo plazo. Cuando se bloquean selectivamente mediante un inhibidor específico, la potenciación a largo plazo no aparece, aunque la trans misión sináptica continúa normalmente. Un animal tratado con este inhibidor se comporta normalmente pero es incapaz de aprender tareas del tipo que, se gún se cree, depende del hipocampo. ¿Cómo intervienen los receptores NMDA en estos efectos extraordinarios? La respuesta radica en que estos canales, cuando están abiertos, son altamente permeables al Ca2+, que actúa como mensajero intracelular cerca de su lugar de entrada al interior de la célula postsináptica, desencadenando los cambios loca les responsables de la potenciación a largo plazo. La potenciación a largo plazo se previene cuando se mantienen los niveles de Ca2+ artificialmente bajos en la célula postsináptica inyectando el quelante de Ca2+ EGTA, y puede ser inducida elevando transitoriamente la concentración extracelular de Ca2+hasta niveles ar tificialmente altos. La naturaleza de los cambios a largo plazo desencadenados por el Ca2+ es incierta, aunque parece que implican alteraciones estructurales de la sinapsis. Los cambios a largo plazo se inician en la célula postsináptica pero también afectan a la célula presináptica de forma que liberan más glutamato del normal cuando se activan posteriormente. La naturaleza de estos últimos cambios en la célula presináptica es incierta, pero parece claro que algún m ensaje puede pasar de forma retrógrada de la célula postsináptica a la presináptica cuando se indu ce la potenciación a largo plazo. La naturaleza de la señal retrógrada todavía es desconocida, aunque como candidatos se han sugerido el óxido nítrico y el monóxido de carbono. En la Figura 11-38 se presenta un modelo tentativo de algu nas de las etapas de la inducción de la potenciación a largo plazo. Además de los cambios a largo plazo de las células presinápticas, ilustrados en la Figura 11-38, tam bién se producen cambios a largo plazo en la célula postsináptica que con tribuyen a la potenciación a largo plazo. Existen evidencias de que los receptores NMDA juegan un papel importante en el fenóm eno relacionado con el aprendizaje, no sólo en el hipocampo sino tam bién en otras zonas del cerebro. En el Capítulo 21 veremos, además, que los receptores NMDA juegan un papel crucial en el ajuste del patrón anatómico de conexiones sinápticas en base a la experiencia durante el desarrollo del sistema nervioso. Así, los neurotransmisores liberados en las sinapsis, además de provocar se ñales eléctricas transitorias, tam bién pueden alterar las concentraciones de me-
Canales iónicos y propiedades eléctricas de las membranas
el increm ento de Ca2+ en el citosol induce a la célula postsináptica a producir una señal retrógrada que actúa sobre el term inal nervioso presináptico
la señal retrógrada produce un cam bio a largo plazo que perm ite al term inal liberar una m ayor cantidad de glutam ato cuando sea activado de nuevo
Figura 11 -38 Eventos de señalización en la potenciación a largo plazo.
583
Tabla 11-3 Algunas familias de canales iónicos Familia*
Subfamilias representativas
Canales catiónicos regulados por voltaje
canal de Na+regulado por voltaje canales de K+regulados por voltaje (incluyendo los retardados y los tempranos) voltajes de Ca2+regulados por canal canales catiónicos regulados por acetilcolina canales catiónicos regulados por serotonina canales catiónicos regulados por glutamato** canales de Cl~ regulados por GABA canales de Cl" regulados por glicina
Canales iónicos regulados por transmisor
'
,
.
excitadores
inhibidores
* Los miembros de una misma familia son similares en secuencia de aminoácidos y, por lo tan to, se cree que derivan de un ancestro común; dentro de las subfamilias, el parecido es habi tualmente mayor. ** Estos canales están formados por distintas familias de subunidades pero se cree que tienen una estructura global similar a la de los otros canales iónicos regulados por transmisor.
diadores intracelulares que conllevan cambios a largo plazo en la eficacia de la transmisión sináptica. Todavía no conocem os, sin embargo, de qué forma estos cambios se prolongan durante semanas, meses o durante toda la vida, a pesar del recambio normal de los constituyentes de la célula. En la Tabla 11-3 se resumen algunas de las familias de canales de las que h e mos tratado en este capítulo.
Resumen Las proteínas de canal forman poros acuosos a través de la bicapa lipídica y permi ten a los iones inorgánicos de un tamaño y carga adecuados atravesarla a favor de su gradiente electroquímico, a velocidades que son unas 1000 veces superiores a las conseguidas por cualquier transportador conocido. Estos canales iónicos están re gulados y habitualmente se abren deform a transitoria en respuesta a perturbacio nes específicas de la membrana, como un cambio en el potencial de membrana (ca nales regulados por voltaje) o la unión de un neurotransmisor (canales regulados por transmisor). En la mayoría de las células de animales, el canal retardado de K+desempeña un papel importante en la generación del potencial de reposo en la membrana plasmática. Los canales catiónicos regulados por voltaje son responsables de la ge neración de los potenciales de acción auto-amplificantes en las células excitables eléctricamente, como las neuronas yfibras musculares esqueléticas. Los canales iónicos regulados por transmisor convierten señales químicas en eléctricas en las sinapsis químicas: los neurotransmisores excitadores, como la acetilcolina y el glutamato, abren de forma transitoria canales catiónicos regulados por transmisor, despolarizando así la membrana postsináptica hacia el potencial de disparo, para iniciar un potencial de acción; los neurotransmisores inhibidores, como el GABA y la glicina, abren canales de Cl~ regulados por transmisor, suprimen la generación del potencial de acción al hacer la membrana postsináptica más pola rizada. Se cree que una subclase especial de canales iónicos regulados por glutama to, denominados canales receptores NMDA, son muy permeables al Ca2+, el cual puede desencadenar cambios a largo plazo en las sinapsis, los cuales al parecer participan en algunas formas de aprendizaje y de memoria. Los canales iónicos actúan juntos de formas muy complejas, controlando el comportamiento de las células eléctricas excitables. Una neurona típica, por ejem584
Capítulo 11 : Transporte de moléculas pequeñas a través de la membrana
pío, recibe miles de señales excitadoras e inhibidoras, combinándolas mediante sumación temporal y espacial y produciendo un potencial postsináptico (PSP) princi pal en el soma celular. La magnitud del PSP principal se traduce en velocidad de generación de potenciales de acción por medio de canales catiónicos de la membra na del cono axónico.
Bibliografía 7.
Citas 1. Hille, B. Ionic Channels of Excitable Membranes, 2nd ed. Sunderland, MA: Sinauer, 1992. Martonosi, A.N., ed. The Enzymes of Biological Mem branes, Vol. 3, Membrane Transport, 2nd ed. New York: Plenum Press, 1985. Stein, W.D. Channels, Carriers and Pumps: An Intro duction to Membrane Transport. San Diego, CA: Aca demic Press, 1990. Tosteson, D.C., ed. Membrane Transport: People and Ideas. Bethesda, MD: American Physiology Society, 1989. 2. Anderson, O.S. Permeability properties of unmodified lipid bilayer membranes. In Membrane Transport in Biology (G. Giebisch, D.C. Tosteson, H.H. Ussing, eds.), Vol. 1, pp. 369-446. New York: Springer-Verlag, 1978. Finkelstein, A. Water movement through membrane channels. Curr. Top. Membr. Transp. 21:295-308, 1984. Walter, A.; Gutknecht, J. Permeability of small nonelec trolytes throught lipid bilayer membranes. /. Membr. Biol 90:207-217,1986. 3. Stein, W.D., ed. Ion Pumps: Structure, Function and Re gulation. New York: Liss, 1988. Tanford, C. Mechanism of free energy coupling in active transport. Annu. Rev. Biochem. 52:379-409,1983. 4. Griffith, J.K., et al. Membrane transport proteins: impli cations of sequence comparisons. Curr. Opin. Cell Biol 4:684-695,1992. Kaback, H.R. Molecular biology of active transport: from membrane to molecule to mechanism. Harvey Lect. 83:77-105,1989. Lodish, H.F. Anion-exchange and glucose transport proteins: structure, function and distribution. Harvey Lect. 82:19-46,1988. Numa, S. A molecular view of neurotransmitter recep tors and ionic channels. Harvey Lect. 83:121-165,1989. Seeburg, P.H. The molecular biology of mammalian glutamate receptor channels. Trends Neurosci. 16:359-365,1993. 5. Dobler, M. Ionophores and Their Structures. New York: Wiley-Interscience, 1981. Pressman, B.C. Biological applications of ionophores. Annu. Rev. Biochem. 45:501-530,1976. Wallace, B.A. Gramicidin channels and pores. Annu. Rev. Biophys. Biophys. Chem. 19:127-157,1990. 6. Henderson, P.J.F. The 12-transmembrane helix trans porters. Curr. Opin. Cell Biol. 5:708-721,1993. Làuger, P. Electrogenic Ion Pumps. Sunderland, MA: Si nauer, 1991.
Bibliografía
8.
9.
10.
11.
12.
Stein, W.D. Transport and Diffusion Across Cell Mem branes. Orlando, FL: Academic Press, 1986. Glynn, I.M.; Ellory, C., eds. The Sodium Pump. Cam bridge, UK: Company of Biologists, 1985. Horisberger, J.D.; Lemas, V.; Kraehenbiihl, J.-P.; Rossier, B.C. Structure-function relationship of Na,K-ATPase. Annu. Rev. Physiol. 53:565-584,1991. Mercer, R.W. Structure of the Na,K-ATPase. Int. Rev. Cytol. 137C:139-168,1993. Shull, G.E.; Schwartz, A.; Lingrel, J.B. Amino acid sequence of the catalytic subunit of the (Na+-K+) ATPase deduced from a complementary DNA. Natu re 316:619-695,1985. Glynn, I.M. The Na+-K+ transporting adenosine triphos phatase. In The Enzymes of Biological Membranes, 2nd ed. (A. Martonosi, ed.), Vol. 3, pp. 34-114. New York: Plenum Press, 1985. Sweadner, K.J.; Goldin, S.M. Active transport of sodium adn potassium ions: mechanism, function and regu lation. New Engl J. Med. 320:777-783,1980. Carafoli, E. Calcium pump of the plasma membrane. Physiol Rev. 71:129-153,1991. Jencks, W.P. How does a calcium pump pump calcium? J. Biol Chem. 264:18855-18858,1989. MacLennan, D.H.; Brandi, C.J.; Korczak, B.; Green, N.M. Amino acid sequence of a Ca2+, Mg2+-dependent ATPase from rabbit muscle sarcoplasmic reticulum, deduced from its complementary DNA sequence. Nature 316:696-700,1985. Sachs, G.; Munson, K. Mammalian phosphorylating ionmotive ATPases. Curr. Opin. Cell Biol 3:685-694,1991. Schatzmann, H J. The calcium pump of the surface membrane and of the sarcoplasmic reticulum. Annu. Rev. Physiol 51:473-486,1989. Hinkle, P.C.; McCarty, R.E. How cells make ATP. Sci. Am. 238(3): 104-123,1978. Nicholls, D.G. An Introduction to the Chemiosmotic The ory, 2nd ed. San Diego, CA: Academic Press, 1987. Senior, A.E. ATP synthesis by oxidative phosphoryla tion. Physiol. Rev. 68:177-231,1988. Kinne, R.; Hannafin, JA.; Konig, B. Role of the NaCl-KCl cotransport system in active chloride absorption and secretion. Ann. N.Y.Acad. Sci. 456:198-206,1985. Scott, D.M. Sodium cotransport systems: cellular, mole cular and regulatory aspects. Bioessays 7:71-78,1987. Semenza, G.; Kessler, M.; Schmidt, U.; Venter, J.C.; Fra ser, C.M. The small-intestinal sodium glucose cotransporter(s). Ann. N.Y.Acad. Sci. 456:83-96,1985. Wright, E.M.; Hager, K.M.; Turk, E. Sodium cotransport proteins. Curr. Opin. Cell Biol. 4:696-702,1992. Wright, J.K.; Seckler, R.; Overath, P. Molecular aspects of sugar:ion transport. Annu. Rev. Biochem. 55:225-248, 1986. Boron, W.F. Intracellular pH regulation in epithelial cells. Annu. Rev. Physiol 48:377-388,1986.
565
13.
14.
15.
16.
17.
18.
Boron, W.F. Intracellular pH Regulation. In Membrane Transport Processes in Organized Systems (T.E. Andreoli, J.F. Hoffman, D.D. Fanestil, S.G. Schultz, eds.), pp. 39-51. New York: Plenum Press, 1987. Chesler, M.; Kaila, K. Modulation of pH by neuronal ac tivity. Trends Neurosci. 15:396-402, 1992. Rudnick, G. ATP-driven H+-pumping into intracellular organelles. Annu. Rev. Physiol. 48:403-413,1986. Thomas, R.C. Cell growth factors bicarbonate and pHj response. Nature 337:601,1989. Almers, W.; Stirling, C. Distribution of transport pro teins over animal cell membranes. J. Membr. Biol. 77:169-186, 1984. Handler, J.S. Overview of epithelial polarity. Annu. Rev. Physiol. 51:729-740, 1989. Ames, G.F.L. Bacterial periplasmic transport systems: structure, mechanism and evolution. Annu. Rev. Biochem. 55:397-425, 1986. Gottesman, M.M.; Pastan, I. Biochemistry of multidrug resistance mediated by the multidrug transporter. Annu. Rev. Biochem. 62:385-427, 1993. Higgins, C.F. ABC transpoters: from microorganisms to man. Annu. Rev. Cell Biol. 8:67-113, 1992. Kartner, N.; Ling, V. Multidrug resistance in cancer. Sei. Am. 261(3):44-51, 1989. Welsh, M.J.; Anderson, M.P.; Rich, D.P.; et al. Cystic fi brosis transmembrane conductance regulator: a chlo ride channel with novel regulation. Neuron 8:821829, 1992. Hall, Z.W. An Introduction to Molecular Neurobiology, pp. 33-178. Sunderland, MA: Sinauer, 1992. Hille, B. Ionic Channels of Excitable Membranes, 2nd ed. Sunderland, MA: Sinauer, 1992. Jessell, T.M.; Kandel, E.R. Synaptic transmission: a bidi rectional and self-modifiable form of cell-cell com munication. Cell72 (Suppl. 1): 1-30, 1993. Kandel, E.R.; Schwartz, J.H.; Jessell, T.M. Principle of Neural Science, 3rd ed., pp. 34-224. New York: Elsevier, 1991. Nicholls, J.G.; Martin, A.R.; Wallace, B.G. From Neuron to Brain, 3rd ed. Sunderland, MA: Sinauer, 1992. Unwin, N. The structure of ion channels in membranes of excitable cells. Neuron 3:665-676, 1989. Baker, P.F.; Hodgkin, A.L.; Shaw, T.L. The effects of changes in internal ionic concentration on the elec trical properties of perfused giant axons. /. Physiol. 164:355-374, 1962. Hodgkin, A.L.; Keynes, R.D. Active tranport of cations in giant axons from Sepia and Loligo. J.Physiol. 128:2660, 1955. Hodgkin, A.L.; Huxley, A.F. Currents carried by sodium and potassium ions through the membrane of the giant axon of Loligo. J. Physiol. 116:449-472, 1952. Hodgkin, A.L.; Huxley, A.F. A quantitative description of membrane current and its application to conduction and excitation in nerve./. Physiol. 117:500-544, 1952. Katz, B. Nerve, Muscle and Synapse. New York: McGraw-Hill, 1966. Huxley, A.F.; Stämpfli, R. Evidence for saltatory conduc tion in peripheral myelinated nerve fibres. J. Physiol. 108:315-339, 1949. Morell, P., ed. Myelin, 2nd ed. New York: Plenum Press, 1984. Morell, P.; Norton, W.T. Myelin. Sei. Am. 242(5):88-118, 1980.
586
19. Neher, E.; Sakmann, B. The patch clamp technique. Sci. Am. 266(3) :28-35, 1992. Sakmann, B. Elementary steps in synaptic transmission revealed by currents through single ion channels. Science 256:503-512, 1992. 20. Armstrong, C.M. Voltage-dependent ion channels and their gating. Physiol. Rev. (Suppl. on Forty Years of Membrane Current in Nerve) 72:S5-S13,1992. Catterall, W A Cellular and molecular biology of voltagegated sodium channels. Physiol. Rev. (Suppl. on Forty Years of Membrane Current in Nerve) 72:S15-S48,1992. Hoshi, T.; Zagotta, W.N.; Aldrich, R.W. Biophysical and molecular mechanisms of Shaker potassium channel inactivation. Science 250:533-538,1990. Jan, L.Y.; Jan, Y.N. Structural elements involved in spe cific K+ channel functions. Annu. Rev. Physiol. 54:537-555, 1992. Perney, T.M.; Kaczmarek, L.K. The molecular biology of K+channels. Curr. Opin. Cell Biol. 3:663-670,1991. 21. Hokfelt, T. Neuropeptides in perspective: the last ten years. Neuron 7:867-879, 1991. 22. Changeux, J.-P.; Galzi, J.-L.; Devillers-Thiery, A.; Ber trand, D. The functional architecture of the acetyl choline nicotinic receptor explored by affinity labe lling and site-directed mutagenesis. Q. Rev. Biophys. 25:395-432,1992. Karlin, A. Explorations of the nicotinic acetylcholine re ceptor. Harvey Lect. 85:71-107,1991. Lester, H.A. The permeation pathway of neurotransmit ter-gated ion channels. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 21:267-292, 1992. Unwin, N. Neurotransmitter action: opening of ligandgated ion channels. Cell 72 (Suppl.):31-41,1993. Unwin, N. Nicotinic acetylcholine receptor at 9 A reso lution./. Mol. Biol. 229:1101-1124, 1993. 23. Betz, H. Ligand-gated ion channels in the brain: the ami no acid receptor superfamily. Neuron 5:383-392,1990. Sargent, P.B. The diversity of neuronal nicotinic acetyl choline receptors. Annu. Rev. Neurosci. 16:403-443, 1993. Snyder, S.H. Drugs and the Brain. New York: W.H. Free man/Scientific American Books, 1987. Tallman, J.F.; Gallager, D.W. The GABAergic system: a locus of benzodiazepine action. Annu. Rev. Neurosci. 8:21-44, 1985. 24. Barrett, J.N. Motoneruon dendrites: roles in synaptic in tegration. Fed. Proc. 34:1398-1407,1975. Fuortes, M.G.F.; Frank, K.; Becker, M.C. Steps in the production of motoneuron spikes. J. Gen. Physiol. 40:735-752, 1957. 25. Baxter, D.A.; Byrne, J.H. Ionic conductance mechanisms contributing to the electrophysiological properties of neurons. Curr. Opin. Neurobiol. 1:105-112,1991. Connor, J.A.; Stevens, C.F. Prediction of repetitive firing behavior from voltage clamp data on an isolated neurone soma./. Physiol. 213:31-53, 1971. Meech, R.W. Calcium-dependent potassium activation in nervous tissues. Annu. Rev. Biophys. Bioeng. 7:118,1978. Rogawski, M.A. The A-current: how ubiquitous a feature of excitable cells is it? Trends Neurosci. 8:214-219,1985. Tsien, R.W., et al. Multiple types of neuronal calcium channels and their selective modulation. Trends Neurosci. 11:431-438, 1988.
Capítulo 11: Transporte de moléculas pequeñas a través de la membrana
26. Bekkers, J.M.; Stevens, C.F. Computational implications of NMDA receptor channels. Cold Spring Harb. 5Symp. Quant. Biol. 55:131-135,1990. Bliss, T.V.; Collingridge, G.L. A synaptic model of me mory: long-term potentiation in the hippocampus. Nature 361:31-39,1993. Daw, N.W.; Stein, P.S.; Fox, K. The role of NMDA recep tors in information processing. Annu. Rev. Neurosci. 16:207-222,1993.
Bibliografía
Madison, D.V.; Malenka, R.C.; Nicoll, RA. Mechanisms underlying long-term potentiation of synaptic trans mission. Annu. Rev. Neurosci. 14:379-397,1991. Stevens, C.F. Quantal release of neurotransmitter and long-term potentiation. Cell 72 (Suppl.):55-63, 1993.
587
Sección ultrafina de una célula exocrina de páncreas de perro. En la parte inferior izquierda se observa una porción del núcleo y de la envoltura nuclear. EL citosol está lleno de láminas densamente empaquetadas de retículo endoplasmático, recubierto de ribosomas. (Por cortesía de Lelio Orci.)
Compartimientos intracelulares y clasificación de proteínas
1
jL m
2
m
á
•La compartimentación de las células superiores •El transporte de moléculas hacia dentro y hacia fuera del núcleo •*El transporte de proteínas al . r, r , . j interior de niitocondrias y de cloroplastos •Peroxisomas •El retículo endoplasmático
A diferencia de las bacterias, que generalmente constan de un único comparti miento rodeado por una mem brana plasmática, la célula eucariota está subdividida en compartimientos rodeados por membrana, que son funcionalmente dis tintos. Cada compartimiento u orgánulo contiene su propia colección de enzimas, otras moléculas especializadas y un complejo sistema de distribución que transporta específicam ente los compuestos de un compartimiento a otro. Para entender la célula eucariota es necesario conocer lo que sucede en cada uno de estos compartimientos, cómo se desplazan las moléculas entre ellos y cómo se generan los compartimientos a sí mismos y se conservan. Las proteínas juegan un papel central en la compartimentación de una célula eucariota. Catalizan las reacciones que tienen lugar en cada orgánulo y transpor tan selectivamente pequeñas moléculas hacia dentro y hacia fuera de su interior o lumen. También actúan como marcadores específicos de superficie de los orgánulos que dirigen el destino de proteínas y de lípidos al orgánulo apropiado. Una célula de mamífero contiene aproximadamente 10 mil millones (1010) de molécu las de proteína, de unos 10 000 tipos distintos. La síntesis de la mayoría de todas estas proteínas empieza en el citosol, el espacio común que engloba a los orgánulos. Una vez sintetizada, cada proteína es transportada específicamente al com partimiento celular que la necesita. Por ello el tema central de este capítulo y también del siguiente será el tráfico intracelular de proteínas. El conocimiento de este tráfico de proteínas desde un compartimiento a otro permite empezar a comprender el desconcertarte laberinto de membranas intracelulares.
La compartimentación de las células superiores En esta sección introductoria vamos a dar una visión general de los distintos compartimientos de la células y de las relaciones que existen entre ellos. Para poder hacerlo, hemos organizado los orgánulos conceptualmente en un peque ño número de familias, revisando cómo las proteínas se dirigen a orgánulos es pecíficos y cómo atraviesan las membranas de los orgánulos.
Todas las células eucariotas tienen la mism a colección básica de orgánulos rodeados de m em brana1 Muchos procesos bioquímicos vitales ocurren en o sobre superficies de m em brana. Así, el metabolismo lipídico está catalizado mayoritariamente por enzi-
5 89
endosoma
citosol lisosoma com plejo de Golgi
peroxisom a
m itocondria retículo endoplasm ático con polirribosom as unidos a su m em brana
polirribosom c libres
núcleo m em brana plasmática 15 (xm
mas unidas a m em branas y la fosforilación oxidativa y la fotosíntesis requieren una m em brana semipermeable para acoplar el transporte de H+ con la síntesis de ATP. Además, los sistemas de m embranas intracelulares no sólo proporcio nan un área extra de membrana, sino que crean compartimientos que están se parados del citosol, dando a la célula espacios acuosos funcionalmente especia lizados. Como la bicapa lipídica de los orgánulos de membrana es impermeable a la mayoría de las moléculas hidrofílicas, la mem brana de cada orgánulo ha de disponer de proteínas transportadoras que son responsables de la importación o exportación de metabolitos específicos. Cada mem brana de un orgánulo ha de tener tam bién un m ecanismo de importación y de incorporación al orgánulo de las proteínas específicas que hacen que dicho orgánulo sea único. En la Figura 12-1 se ilustran los compartimientos más importantes comunes a todas las células eucariotas. El núcleo contiene el genoma principal y es el lu gar más importante de síntesis de DNA y de RNA. El citoplasma que lo circunda consiste en el citosol y los orgánulos citoplasmáticos suspendidos en él. El citosol constituye un poco más de la mitad del volumen total de la célula y es el lugar donde no sólo tiene lugar la síntesis de proteínas sino también donde se desa rrollan la mayoría de las reacciones del metabolismo intermediario celular -e s decir, el elevado número de reacciones mediante las cuales algunas moléculas pequeñas son degradadas y otras son sintetizadas proporcionando los elem en tos para la construcción de las macromoléculas (se explica en el Capítulo 2). Aproximadamente la mitad del área total de membrana de una célula se uti liza para englobar los espacios laberínticos del retículo endoplasmático (ER). El ER presenta muchos ribosomas unidos a su superficie citoplasmática, los cuales sintetizan proteínas integrales de membrana y proteínas solubles destinadas a ser segregadas o a ser transportadas a otros orgánulos. Veremos que existe una diferencia importante entre el sistema a través del cual las proteínas son dirigidas al ER o a otros orgánulos citoplasmáticos: mientras que las proteínas son translocadas a otros orgánulos solamente cuando su síntesis ha concluido, son translocadas al ER durante su síntesis, por lo que los ribosomas sobre los que se están produciendo están unidos a la membrana del ER. El ER también produce los lípidos del resto de la célula y tam bién actúa como almacén de iones Ca2+. El comple jo de Golgi consiste en una serie de compartimientos organizados en forma de sa cos discoidales llamados cisternas del Golgi; recibe lípidos y proteínas del ER y las distribuye hacia diferentes destinos intracelulares, generalmente modificándolas covalentemente durante el viaje. Las mitocondrias y (en las plantas) los cloroplastos, generan la mayor parte del ATP que se utiliza para desplazar las reacciones biosintéticas que requieren un aporte de energía libre. Los lisosomas presentan enzimas digestivas que de-
590
Capítulo 12: Compartimientos intracelulares y clasificación de proteínas
Figura 12-1 Los principales compartimientos intracelulares de una célula animal. El citosol [gris), el retículo endoplasmático, el complejo de Golgi, el núcleo, las mitocondrias, los endosomas, los lisosomas y los peroxisomas son diferentes compartimientos que se hallan aislados del resto de la célula mediante, al menos, una membrana dotada de permeabilidad selectiva.
Tabla 12-1 Volúmenes relativos ocupados por los principales compartimientos intracelulares en una célula hepática típica (hepatocito) Compartimiento intracelular
Porcentaje del volumen celular total
Número aproximado por célula*
54 22 9 6 6 1 1 1
1 1700 1
Citosol Mitocondria Vesículas del ER rugoso Vesículas del ER liso y de Golgi Núcleos Peroxisomas Lisosomas Endosomas
1 400 300 200
* Se cree que todas las cisternas del retículo endoplasmático liso y rugoso están conectadas, for mando un único gran compartimiento. En cada célula el complejo de Golgi está organizado en un número discreto de grupos de cisternas apiladas (dictiosomas) y todavía no se ha establecido claramente el grado de interconexión entre ellos.
gradan tanto orgánulos muertos como macromoléculas y partículas captadas del exterior de la célula por endocitosis. En su camino hacia los lisosomas, las macromoléculas y las partículas endocitadas primero han de pasar por una serie de compartimientos llamados endosomas. Los peroxisomas (también conocidos como microcuerpos) son pequeños compartimientos vesiculares que contienen enzimas que participan en diversas reacciones oxidativas. En general, cada orgánulo rodeado por m em brana realiza el mismo tipo de funciones básicas en to dos los tipos celulares pero varía en abundancia y puede tener propiedades adi cionales que difieren de un tipo celular a otro de acuerdo con las funciones especializadas de las células diferenciadas. En su conjunto, estos orgánulos ocupan casi la mitad del volumen celular (Ta bla 12-1), y se requiere una gran cantidad de membranas intracelulares para fabri carlos todos. Así, en las dos células de mamífero que se analizan en la Tabla 12-2,
Tabla 12-2 Cantidades relativas de tipos de membrana en dos células eucariotas •Porcentaje de membrana celular total Tipo de membrana Membrana plasmática Membrana del ER rugoso Membrana del ER liso Membrana del complejo de Golgi Mitocondrias Membrana externa Membrana interna Núcleo Membrana interna Membrana de las vesículas secretoras Membrana de los lisosomas Membrana de los peroxisomas Membrana del endosoma
Hepatocito*
Célula exocrina pancreática*
2 35 16 7
5 60 <1 10
7 32
4 17
0,2 no determinado 0,4 0,4 0,4
0,7 3 no determinado no determinado no determinado
* Estas dos células son de tamaño muy diferente, ya que el hepatocito tiene como promedio un volumen de 5000 (im3, en comparación a los 1000 f¿m3 de la célula exocrina pancreática. Las áreas totales de membrana celular se estiman en 110 000 nm2 y 13 000 |xm2, respectivamente.
La compartimentación de las células superiores
591
retículo cndo plásm atico rugoso
lisosom as
núcleo
Figural2-2 Electronmicrografía de una parte de una célula hepática vista en sección transversal. Se indican ejemplos de la mayoría de los principales compartimientos intracelulares. (Por cortesía de Daniel S. Friend.)
poroxisom as
m itocondrias
el retículo endoplasmático tiene una superficie de membrana total que es 25 y 12 veces mayor respectivamente que la mem brana plasmática. En términos de su perficie y de masa, pues, en la mayoría de la células eucariotas la membrana plasmática es sólo una mem brana minoritaria (Figura 12-2). Los orgánulos rodeados de mem brana no se hallan distribuidos al azar en el citosol; por el contrario, a menudo ocupan posiciones características. Así, en la mayoría de células el complejo de Golgi está cerca del núcleo mientras que la red de túbulos del ER se extiende a partir del núcleo por todo el citosol. Estas dis tribuciones características parecen depender de las interacciones de los orgánu los con el citoesqueleto: por ejemplo, la localización del ER y del complejo de Golgi depende de la red de microtúbulos. Si se despolimerizan experimental mente los microtúbulos con una droga, el complejo de Golgi se fragmenta y se dispersa por toda la célula y la red del ER se colapsa hacia el centro celular, o centrosoma, a partir del cual emerge la red de microtúbulos (véase Capítulo 16).
La relación topològica de los orgánulos rodeados de mem brana puede ser interpretada en térm inos de sus orígenes evolutivos2 Para entender la relación que existe entre los compartimientos de la célula, re sulta útil considerar cómo pueden haber evolucionado. Se cree que los precur sores de las primeras células eucariotas fueron organismos parecidos a bacte rias, los cuales generalmente tienen mem brana plasmática pero no membranas internas. En estas células, por lo tanto, la membrana plasmática realiza todas las funciones dependientes de membrana, com o el bom beo de protones, la síntesis de ATP, y la síntesis de lípidos. No obstante, las células eucariotas actuales tie-
592
Capítulo 12 : Compartimientos intracelulares y clasificación de proteínas
(C)
Figura 12-3 Organización de membranas especializadas en las bacterias. (A) Zonas (patches) de la superficie celular, consistentes en proteínas especializadas de membrana. (B) Zonas invaginadas de membrana plasmática que incrementan la cantidad de membrana disponible para funciones especializadas, com o por ejemplo, para fotosíntesis. (C) Internalización de las zonas invaginadas de membrana, formando vesículas cuya cara interior es topològicamente equivalente a la cara exterior de la célula. En algunos tipos de bacterias fotosintéticas se presentan vesículas de membrana de este tipo; su relación topològica con la superficie de la célula es similar a la del ER, la del complejo de Golgi, la de los endosomas y la de los lisosomas en las células eucariotas.
nen una dimensión lineal entre 10 y 30 veces mayor y un volumen entre 1000 y 10 000 veces mayor que una bacteria típica como E. cotí. Se puede proponer que la profusión de m embranas internas responde en parte a una adaptación a este increm ento en tamaño: las células eucariotas tienen una relación entre superfi cie y volumen mucho menor, de forma que probablemente el área de su m em brana plasmática es demasiado pequeña para contener la gran cantidad de fun ciones vitales ligadas a m em brana que presenta una célula. Evidentemente, la evolución de las membranas internas ha sido paralela a la especialización de la función de las membranas. En algunas bacterias actuales existen zonas (patches) especializadas de la membrana plasmática en las que se presentan una colección determinada de proteínas de membrana que realizan una serie de funciones relacionadas (Figura 12-3A). Estas porciones especializadas de membrana, tales como la “membrana púrpura” en Halobacterium que contie ne bacteriorrodopsina (se discute en el Capítulo 10) o los cromatóforos en las bac terias fotosintéticas (se discute en el Capítulo 14), representan orgánulos primiti vos. En algunas bacterias fotosintéticas, estas zonas de membrana se han transformado en zonas más elaboradas concretándose en invaginaciones de la membrana plasmática (Figura 12-3B), mientras que en otras bacterias parece que estas invaginaciones se han separado completamente de la membrana plasmática formando vesículas cerradas intracelulares rodeadas de membrana, especializa das en la fotosíntesis (Figura 12-3C). Puede esperarse que un orgánulo eucariota que se haya originado por el procedimiento que se ilustra en la Figura 12-3 tenga un interior topológicamente equivalente al exterior de la célula. Veremos que éste es el caso del ER, del complejo de Golgi, del endosoma y del lisosoma -a sí como del gran número de intermediarios vesiculares de las vías secretora y endocítica (vesículas de trans porte). Podemos por tanto pensar que todos estos orgánulos son miembros de la misma familia y que, tal como veremos en detalle en el próximo capítulo, sus in teriores se com unican intensam ente entre sí y con el exterior de la célula vía ve sículas de transporte que emergen por gemación de un orgánulo y se fusionan con otro (Figura 12-4). En bacterias los ribosomas se hallan unidos a la cara citosólica de la m em brana plasmática por lo que el origen evolutivo de la membrana del ER a partir de la mem brana plasmática puede explicar por qué en las células eucariotas los ribosomas se encuentran unidos a la mem brana del ER. Este esquem a evolutivo tam bién ofrece una explicación razonable para la arquitectura del núcleo, con su doble membrana. En las bacterias un único cro m osom a está unido a puntos especiales del interior de la m em brana plasm áti ca. Es por lo tanto posible que la doble envoltura nuclear se originara com o una invaginación profunda de la m em brana plasmática, tal como se muestra en la Figura 12-5A. Este esquem a podría explicar por qué el compartimiento nuclear es topológicam ente equivalente al citosol. De hecho, en las células eucariotas superiores la envoltura nuclear se rompe durante la mitosis, permitiendo que el contenido nuclear se disperse por el citosol, una situación que nunca sucede con el contenido de ningún otro orgánulo delimitado por membrana. Tal y
lisosom a
m em brana envoltura interna nuclear m em brana externa
La compartimentación de las células superiores
com plejo de Golgi
vesícula de secrección
Figura 12-4 Relaciones topoldgicas entre los compartimientos de una célula eucariota. Los espacios topológicamente equivalentes se presentan en rojo. Los ciclos de gemación y fusión permiten en principio que cualquier lumen se comunique con cualquier otro y con el exterior celular. La flechas azules indican la dirección de salida del tráfico de vesículas desde el ER hasta el complejo de Golgi y la membrana plasmática (o los lisosomas) y los puntos negros representan proteínas que son segregadas por la célula. Algunos orgánulos sin embargo -de forma más notable las mitocondrias y (en plantas) los cloroplastos- no participan en esta comunicación vesicular por lo que están aislados del tráfico entre orgánulos que se muestra aquí.
593
(A) VÍA EVOLUTIVA PROPUESTA PARA EL NÚCLEO Y PARA EL RETÍCULO ENDOPLASMÁTICO
retículo
célula procariota ancestral
a m em brana
citosol
núcleo m em brana nuclear interna mem brana nuclear externa
mesosoma com plejo de poro nuclear
lam ina nuclear
(B) VÍA EVOLUTIVA PROPUESTA PARA LA MITOCONDRIA
célula procariota
célula eucariota ancestral
como tam bién predice el esquema de la Figura 12-5A, el espacio entre las dos m embranas nucleares es topológicamente equivalente al exterior de la célula y es continuo con el lumen del ER. Como se discute en el Capítulo 14, las mitocondrias y los cloroplastos difie ren de los otros orgánulos rodeados de membrana en que presentan su propio genoma. La naturaleza de estos genomas y la estrecha similitud existente entre las proteínas de estos orgánulos y las de algunas bacterias actuales sugiere clara mente que las mitocondrias y los cloroplastos evolucionaron a partir de bacte rias que fueron “engullidas” por otras células con las que inicialmente vivieron en simbiosis (se explica en los Capítulos 1 y 14). De acuerdo con el esquema hi potético de la Figura 12-5B, la mem brana interna de las mitocondrias y de los cloroplastos corresponde a la mem brana plasmática original de las bacterias, mientras que el lumen de estos orgánulos evolucionó a partir del citoplasma bacteriano. Como podría esperarse de sus orígenes, estos orgánulos permane cen aislados del extenso tráfico de vesículas que conecta el interior de la mayoría de los orgánulos entre sí y con el exterior de la célula. Este esquema evolutivo agrupa los principales compartimientos intracelulares de la células eucariotas en cinco grupos: (1) el núcleo y el citosol, que se co munican entre sí a través de los poros nucleares, por lo que son topológicamente continuos (a pesar de ser funcionalmente diferentes): (2) todos los orgánulos que actúan en las rutas de secreción y de endocitosis -incluyendo el ER, el com plejo de Golgi, los endosomas, los lisosomas, y numerosas clases de vesículas de transporte; (3) las mitocondrias; (4) los plastos (sólo en plantas); y (5) los peroxisomas (cuyos orígenes evolutivos serán explicados más adelante).
Las proteínas pueden desplazarse entre compartimientos de diferentes m aneras3 Todas las proteínas empiezan a ser sintetizadas en el citosol, excepto las que son sintetizadas en los ribosomas de las mitocondrias y de los plastos. Su destino si guiente depende de su secuencia de aminoácidos, que puede presentar señales de clasificación que dirigen su reparto hacia posiciones fuera del citosol. Mu chas proteínas no presentan señales de clasificación y, en consecuencia, perma necen en el citosol como residentes permanentes. Sin embargo, muchas otras tienen señales de clasificación específicas que las dirigen desde el citosol hacia el núcleo, el ER, las mitocondrias, los plastos (en plantas), o los peroxisomas; las
594
Capítulo 12: Compartimientos intracelulares y clasificación de proteínas
Figura 12-5 Hipótesis sobre el origen evolutivo de algunos orgánulos rodeados de membrana. Los orígenes de las mitocondrias, de los cloroplastos, del ER y del núcleo celular pueden explicar las relaciones topológicas existentes entre estos com partimientos intracelulares en células eucariotas. (A) Posible vía para la evolución del ER y del núcleo. En algunas bacterias el DNA se halla unido a una invaginación de la m embrana plasmática llamada m esosom a. En células procariotas muy primitivas, una invaginación de este tipo pudo dar lugar a una envoltura alrededor del DNA permitiendo todavía el acceso del DNA al citosol celular (necesaria para permitir que el DNA pueda dirigir la síntesis de proteínas). Probablem ente esta envoltura se generó com pletam ente a partir de la membrana plasmática, produciendo un compartimiento limitado por una doble membrana. Tal como se ilustra, la envoltura nuclear está organizada mediante una capa fibrosa denominada lá m in a nuclear, que está atravesada por canales de com unicación denominados com p lejos d e p o ro nucleares. Dado que el núcleo está rodeado por dos membranas que continúan donde son atravesadas por estos poros, el lumen del núcleo es topológicamente equivalente al citosol. El lumen del ER es continuo con el espacio que se halla entre las membranas nucleares interna y externa, y es topológicamente equivalente con el espacio extracelular. (B) Se cree que las mitocondrias (y los cloroplastos) se originaron mediante la incorporación de una bacteria a una célula eucariota. Estas bacterias retuvieron su autonomía. Esta hipótesis puede explicar por qué el lumen de estos orgánulos perm anece aislado del extenso tráfico de vesículas que interconecta el lumen de muchos otros com partimientos intracelulares.
Figura 12-6 Durante el transporte de las vesículas se mantiene la “polaridad” de la membrana. Nótese que tanto para las proteínas como para los lípidos la orientación original del compartimiento dador se mantiene en la membrana del compartimiento diana y que los materiales solubles son transferidos de lumen a lumen.
señales de clasificación tam bién pueden dirigir el transporte desde el ER hacia otros destinos celulares. Para entender los principios generales por los que actúan las señales de cla sificación, es importante distinguir tres sistemas fundamentales diferentes m e diante los cuales las proteínas se desplazan desde un compartimiento a otro. (1) El tráfico de proteínas entre el citosol y el núcleo tiene lugar entre espacios topològicamente equivalentes, los cuales están en continuidad a través de los complejos de poro nucleares. Este proceso se llama transporte regulado porque el complejo de poro nuclear actúa como puertas selectivas que pueden trans portar activamente macromoléculas específicas y ensamblajes macromoleculares, aunque tam bién permiten difusión libre de moléculas pequeñas. (2) En el transporte transm em brana, translocadores proteicos unidos a la membrana di rigen el transporte específico de proteínas a través de la membrana desde el ci tosol hacia un espacio que es topològicamente distinto. Generalmente, la m olé cula de proteína transportada ha de desplegarse para poder deslizarse a través de la membrana. Por ejemplo el transporte inicial de determinadas proteínas desde el citosol hacia el lumen del ER o hacia el interior de las mitocondrias tie ne lugar de este modo. (3) En el transporte vesicular, las vesículas de transporte cargan proteínas desde un compartimiento a otro. A medida que la membrana de un compartimiento va produciendo vesículas por gemación, estas vesículas capturan un cargamento de moléculas del lumen del compartimiento. Tras el transporte y la fusión con la m em brana de otro compartimiento, estas vesículas descargan su cargamento en el interior de este otro compartimiento. Por ejem plo la transferencia de proteínas solubles desde el ER al complejo de Golgi tiene lugar por este m ecanismo. Dado que las proteínas transportadas no atraviesan la membrana, sólo se desplazan entre compartimientos que son topològicamen te equivalentes (Figura 12-6). En el Capítulo 13 explicaremos con más detalle el transporte vesicular. Los tres sistemas mediante los que se transportan las proteí nas entre distintos compartimientos se resumen en la Figura 12-7. Cada uno de los tres sistemas de transferencia proteica generalmente están guiados selectivamente por proteínas receptoras complementarias que se hallan
Figura 12-7 “Mapa de carreteras” simplificado del tráfico proteico. Las proteínas pueden desplazarse de un compartimiento a otro por medio de un transporte regulado (en rojo), por medio de transporte transmembrana (azul), o por medio de transporte vesicular (verde). Las señales que dirigen el camino de una proteína determinada a través del sistema, determinando su localización definitiva en la célula, están contenidas en la secuencia de aminoácidos de la proteína. El viaje comienza con la síntesis de una proteína sobre un ribosoma y termina cuando se ha alcanzado el destino final. En cada una de las estaciones intermedias (recuadros) se toma una decisión respecto a si la proteína será retenida en el compartimiento o bien continuará el viaje. En principio, se requiere una señal determinada tanto para retener la proteína en el compartimiento como para no retenerla. El destino alternativo es la ruta por defecto (en ausencia de señal). Por ejemplo, el transporte vesicular de proteínas desde el ER, a través del complejo de Golgi, hasta la superficie celular, parece que no necesita ninguna señal específica; las señales de retención específicas se requieren por consiguiente para retener las proteínas en el ER y en el complejo de Golgi, cuyas proteínas especializadas residen allí. Utilizaremos repetidamente esta figura como guía a través de este capítulo y del siguiente, destacando la ruta particular que será explicada.
La compartimentación de las células superiores
bícapa lipidica proteina de m em brana contenido del lum en
COMPARTIMIENTO DADOR
vesícula que se produce por gem ación, cuyo contenido va a ser transportado
GEMACION
CITOSOL
-^ T ÍP NUCLEO
■
MITOCONDRIA |
U
PEROXISOMA PE
|
PLASTIDOS PLÁ
RETICULO ENDOPLASMATICO
CLAVE: H H = transporte m = transporte transm em brana I cfaM.j = transporte vesicular
595
PROTEINA DESPLEGADA
PROTEINA PLEGADA NH2
------------------------------------ ----------------
H2N
__--->COOH
péptido señal
(A)
en el orgánulo de destino. Por ejemplo, si una proteína grande ha de ser impor tada hacia el núcleo, ha de tener una señal de clasificación que sea reconocida por proteínas receptoras asociadas con el complejo de poro nuclear. Si una pro teína ha de ser transferida directamente a través de una membrana, ha de tener una señal de clasificación que sea reconocida por el translocador de la m em bra na que tiene que atravesar. Del mismo modo, si una proteína ha de ser incorpo rada en cierto tipo de vesículas de transporte o retenida en ciertos orgánulos, sus señales de clasificación han de ser reconocidas por un receptor complementario de la m em brana apropiada.
Los péptidos señal y la región señal determ inan el destino celular correcto de las.proteínas4 Existen al menos dos tipos de señales de clasificación en las proteínas. Uno de ellos reside en una región continua de la secuencia de aminoácidos, típicamente de 15-60 residuos de largo. Este péptido señal es a menudo (pero no siempre) eliminado de la proteína por una peptidasa de señal especializada, una vez se ha ejecutado la decisión de clasificación. El otro tipo de señal consiste en una disposición tridimensional característica de los átomos de la superficie de la proteína, que se forma cuando se pliega la proteína. Los restos de aminoácidos que constituyen la región señal pueden ser bastante distantes el uno del otro en la secuencia lineal de aminoácidos, y generalmente permanecen en la proteína madura (Figura 12-8). Los péptidos señal son utilizados para dirigir las proteínas desde el citosol al ER, a las mitocondrias, a los cloroplastos, a los peroxisomas y al núcleo y tam bién son utilizados para retener las proteínas en el ER. Las regio nes señal identifican ciertas enzimas que han de ser marcadas con residuos de azúcar específicos que luego dirigen a las proteínas desde el complejo de Golgi a los lisosomas; las regiones señal tam bién se utilizan en otros pasos de clasifica ción que están m enos caracterizados. Para especificar los diferentes destinos celulares se utilizan diferentes tipos de péptidos señal. En general, las proteínas que están destinadas a ser transferi das al ER tienen, en su extremo amino terminal, péptidos señal que en la parte central de su secuencia presentan entre 5 y 10 residuos de aminoácidos hidrofóbicos. La mayoría de estas proteínas pasarán después desde el ER al complejo de Golgi; no obstante, las proteínas que presentan en su extremo carboxilo terminal una secuencia determinada de cuatro aminoácidos son retenidas permanente mente en el ER. Las proteínas destinadas a las mitocondrias tienen péptidos se ñal en los que se alternan restos de aminoácidos cargados positivamente con restos de aminoácidos hidrofóbicos. Las proteínas destinadas a los peroxisomas tienen habitualmente una secuencia de tres aminoácidos en su extremo carboxi lo. Muchas proteínas destinadas al núcleo tienen péptidos señal formados por una agrupación de residuos de aminoácidos cargados positivamente, la cual se
596
Capítulo 12: Compartimientos intracelulares y clasificación de proteínas
Figura 12-8 Los dos sistemas mediante los que se puede codificar una señal de transporte en una proteíha. (A) La señal se halla en una secuencia sencilla y discreta de aminoácidos, llamada péptido señal, que se halla expuesta en la proteína plegada. A menudo los péptidos señal se presentan en uno de los extremos de la cadena polipeptídica (tal como se presenta en la figura), pero también se pueden localizar en cualquier otro lugar de la proteína. (B) Se puede formar una región señal mediante la yuxtaposición de aminoácidos procedentes de regiones que se hallaban físicamente separadas antes de que la proteína se plegara (como se muestra en la figura); alternativamente, la señal puede estar formada por zonas separadas de la superficie de la proteína plegada que se hallan separadas entre sí por distancias fijas. En cualquier caso, la señal de transporte depende de la conformación tridimensional de la proteína. Por esta razón, este tipo de señal resulta difícil el localizar de forma precisa.
Tabla 12-3 Algunas secuencias típicas de péptidos señal Función del péptido señal
Ejemplo de péptido señal
Im p o rtación al ER
+H 3N -M et-M et-Ser-P h e-V al-Ser- Leu-Leu-Leu-V al Gly-Ile-Leu-Phe-Trp-A la -Thr-Glu-A la-GluG ln-Leu-Thr-Lys-Cys-G lu-V al-Phe-G ln-
R eten ción en el lum en del ER
-Lys-Asp -Gl u-Leu-COO
Im p o rtación a la m itocond ria
+H 3N -M et-Leu-Ser-Leu-A rg-G ln-Ser-Ile-A rg-PhePhe-Lys-Pro-A la-Thr-A rg-Thr-Leu-Cys-SerSer-A rg-Tyr-Leu-Leu-
Im p o rtación al núcleo
- Pro - Pro - Ly s - Ly s -Ly s -Ar g - Ly s -Val -
Im p o rtación a los peroxisom as
-Ser-Lys-Leu-
+H 3N -Gly-Ser-Ser-Lys-Ser-Lys-Pro-LysU n ión a m em b ran a a través de la un ión covalente del extrem o am ino term inal al ácido m irístico Los residuos de aminoácidos cargados positivamente se muestran en rojo y los cargados negati vamente en verde. En el recuadro am arillo se indica un gran bloque de aminoácidos hidrofóbicos. H3N+indica el extremo amino terminal de la proteína y COO' el carboxilo terminal.
encuentra habitualmente en lugares internos de la cadena polipeptídica. En la Tabla 12-3 se muestran algunos péptidos señal típicos. La importancia de cada uno de estos péptidos señal en el destino de las pro teínas se ha visto en experimentos en los que el péptido ha sido transferido des de una proteína a otra mediante técnicas de ingeniería genética: por ejemplo, colocando el péptido señal amino terminal que especifica para el ER, al princi pio de una proteína citosólica, se consigue que ahora la proteína se dirija al ER. Todos los péptidos señal que se hallan unidos a proteínas que tienen el mismo destino son funcionalmente intercambiables aunque sus secuencias de am ino ácidos puedan variar mucho. A menudo, parece que para los procesos de reco nocimiento, las propiedades físicas de estos péptidos señal, tales como la hidrofobicidad, son más importantes que la secuencia exacta de aminoácidos. Las regiones señal son mucho más difíciles de analizar que los péptidos se ñal; en consecuencia, se conoce mucho m enos sobre su estructura. Debido a que resultan de un patrón complejo de plegamiento proteico tridimensional, no pueden simplemente transferirse de una proteína a otra. En el Panel 12-1 (pág. 598) se ilustran los principales métodos para estudiar cómo se dirigen las proteínas desde el citosol a un compartimiento específico y có mo se translocan a través de las membranas.
Las células no pueden construir d e novo sus orgánulos rodeados de m em brana: necesitan inform ación del propio orgánulo5 Cuando una célula se reproduce y se divide, tiene que duplicar sus orgánulos ro deados de membrana. Normalmente las células realizan esta duplicación agran dando los orgánulos mediante la incorporación en ellos de nuevas moléculas, y la posterior división de estos orgánulos agrandados. Posteriormente, los orgánulos hijos son distribuidos entre las dos células hijas. Esta herencia es esencial ya que una célula no puede fabricar de novo estas membranas. Por ejemplo, si se elimina completamente el ER de la célula, ¿cómo puede reconstruirlo la célula? Las prote ínas de membrana que definen el ER y realizan muchas de su funciones clave son productos del propio ER. No se puede fabricar un nuevo ER sin la existencia pre via de un ER, o al menos de una membrana que contenga los translocadores n e cesarios para importar proteínas específicas hacia el ER (y que carezca de los translocadores de otros orgánulos, necesarios para importar proteínas). Así, parece que la información necesaria para construir un orgánulo rodeado de membrana no reside sólo en el DNA que especifica las proteínas del orgánulo.
La compartimentación de las células superiores
597
Aproximación por transfección para definir secuencias señal
Aproximación bioquímica para estudiar el mecanismo de translocación de la proteína
U n s is te m a d e m o s t r a r q u e u n a s e c u e n c ia s e ñ a l es
En e s te c a s o , u n a p r o te ín a m a r c a d a q u e c o n t ie n e u n a s e c u e n c ia s e ñ a l
n e c e s a r ia y s u fic ie n te p a r a d ir ig ir u n a p r o te ín a h a c ia
e s p e c ífic a e s t r a n s p o r t a d a in v itro al in t e r io r d e o r g á n u lo s a is la d o s .
u n c o m p a r t i m i e n t o in tr a c e lu la r d e te rm in a d o c o n s is te
G e n e r a lm e n t e la p r o t e ín a m a r c a d a e s p r o d u c id a p o r t r a d u c c ió n e n un
e n c r e a r u n a p r o t e ín a d e fu s ió n e n la q u e la s e c u e n c ia
s is te m a lib r e d e c é lu la s d e un m R N A q u e c o d ific a la p r o t e ín a ; s e u tiliz a n
s e ñ a l s e h a lle u n id a , m e d ia n t e té c n ic a s d e in g e n ie r ía
a m in o á c id o s r a d ia c tiv o s p a r a m a r c a r la p r o t e ín a a c a b a d a d e s in t e t iz a r d e
g e n é tic a , a u n a p r o te ín a q u e n o r m a lm e n t e e s r e s id e n te
f o r m a q u e p u e d a d is tin g u ir s e d e la s m u c h a s o tr a s p r o t e ín a s q u e s e h a lla n
e n el c ito s o l. D e s p u é s d e t r a n s f e c t u a r c é lu la s c o n el
p r e s e n te s e n el s is te m a d e t r a d u c c ió n in vitro.
c D N A q u e c o d ific a e s ta p r o te ín a , s e d e t e r m in a la
H a b it u a lm e n t e se u tiliz a n tr e s m é t o d o s p a r a d e t e r m in a r si la p r o t e ín a
lo c a liz a c ió n d e la p r o te ín a d e fu s ió n m e d ia n te
m a r c a d a s e ha tr a n s lo c a d o al o r g á n u lo :
in m u n o m a r c a je o p o r f r a c c io n a m ie n t o c e lu la r .
1. La p r o t e ín a m a r c a d a
secuencia señal a o b
c o f r a c c io n a c o n e l o r g á n u lo
m e d ia n t e u n a p r o t e a s a e s p e c ífic a
e n u n a c e n t r if u g a c ió n
q u e s e h a lla p r e s e n te e n e l in te r io r
gen que codifica una proteína citosólica
2. La s e c u e n c ia s e ñ a l e s e lim in a d a
d e l o r g á n u lo
incubación sin el orgánulo incubación con el orgánulo *
plásm ido utilizado para transfectar células /
con radiactividad
\
proteína ^transportada al orgánulo
proteínas radiactivas en gel SDS proteasa
3 . La p r o t e ín a e s tá p r o t e g id a d e la
la secuencia señal b (■ ) dirige la proteína de fusión al orgánulo B
la secuencia señal a ( □ ) dirige la proteína de fusión al orgánulo A
d ig e s t ió n c u a n d o s e a ñ a d e n p r o te a s a s al m e d io d e in c u b a c ió n , p e r o e s s u s c e p tib le a e lla si
proteina
p r im e r o s e a ñ a d e n d e t e r g e n t e s A lt e r a n d o la s e c u e n c ia s e ñ a l u tiliz a n d o m u ta g é n e s is
q u e r o m p e n la m e m b r a n a d e l
d ir ig id a p u e d e d e t e r m in a r s e q u é c a r a c te r ís tic a s
o r g á n u lo
e s t r u c tu r a le s s o n im p o r t a n t e s p a r a su f u n c ió n .
sin dete rg en te
con deterg en te
U t iliz a n d o e s to s e n s a y o s in v itro p u e d e d e t e r m in a r s e q u é c o m p o n e n t e s (p r o t e ín a s , A T P , G T P , e tc .) s o n n e c e s a r io s p a r a p r o c e s o s d e t r a n s c r ip c ió n .
Aproximación genética para el estudio del mecanismo de translocación de proteínas
(
P a ra e s t u d ia r la t r a n s lo c a c ió n d e p r o t e ín a s h a b it u a lm e n t e s e u tiliz a n c é lu la s d e le v a d u r a c o n m u t a c io n e s e n g e n e s q u e c o d ific a n c o m p o n e n t e s d e la m a q u in a r ia d e t r a n s lo c a c ió n . D e b id o a q u e la s c é lu la s m u t a n t e s q u e n o p u e d e n
célula de levadura salvaje
t r a n s lo c a r p r o t e ín a s a t r a v é s d e s u s m e m b r a n a s m o r ir á n , el tr u c o c o n s is te e n d is e ñ a r u n a e s t r a t e g ia q u e p e r m it a a is la r las m u t a c io n e s q u e ú n ic a m e n t e
histidina
__w oo 0
enzima en el citosol: la célula vive sin necesitar histidina com o nutriente
c a u s a n u n d e fe c to p a r c ia l e n la t r a n s lo c a c ió n d e p r o te ín a s . U n a v ía c o n s is te e n u tiliz a r la in g e n ie r ía g e n é tic a p a r a d is e ñ a r c é lu la s e s p e c ia le s d e le v a d u r a . P o r e je m p lo , la e n z im a h is tid in o l d e s h id r o g e n a s a r e s id e n o r m a lm e n t e e n el c ito s o l, d o n d e e s n e c e s a r ia p a r a p r o d u c ir el
aparato de translocación
a m in ó a c id o e s e n c ia l h is tid in a a p a r t ir d e su p r e c u r s o r h is tid in o l. S e c o n s tr u y e u n a c e p a d e le v a d u r a e n la q u e el g e n d e la h is tid in o l r e d u c ta s a e s tá
célula de levadura ob ten ida por in geniería genética
s u b s t it u id o p o r u n g e n c o n s t r u id o d e f o r m a q u e c o d if iq u e u n a p r o t e ín a d e fu s ió n c o n u n a s e c u e n c ia s e ñ a l e x tr a q u e d ir ig e la p r o t e ín a al in t e r io r d e l
histidinol ou °oO o ooo
r e tíc u lo e n d o p la s m á t ic o (E R ). C u a n d o e s ta s c é lu la s s e h a c e n c re c e r e n a u s e n c ia
la enzima se ha dirigido ----- ► al ER: la célula muere al colocarla en un m edio sin histidina
d e h is tid in a , m u e r e n d e b id o a q u e to d a la h is tid in o l d e s h id r o g e n a s a e s tá s e c u e s tr a d a e n el ER , d o n d e n o e s f u n c io n a l. S in e m b a r g o , las c é lu la s c o n m u t a c io n e s q u e in a c tiv a n p a r c ia lm e n t e el m e c a n is m o d e tr a n s to c a c ió n d e p r o t e ín a s d e s d e el c ito s o l al ER s o b r e v iv ir á n d e b id o a q u e h a b r á s u fic ie n te c a n t id a d d e d e s h id r o g e n a s a r e te n id a e n el c ito s o l p a r a p r o d u c ir la h is tid in a n e c e s a r ia . A m e n u d o s e o b t ie n e n c é lu la s e n la s q u e la p r o t e ín a m u t a n t e t o d a v ía a c tú a p a r c ia lm e n t e a t e m p e r a t u r a n o r m a l p e r o q u e e s c o m p le t a m e n t e
célula som etida a in geniería génetica m utada
in a c tiv a a t e m p e r a t u r a s
e le v a d a s . U n a c é lu la q u e t r a n s p o r t e u n a d e e s ta s
m u t a c io n e s s e n s ib le s a la t e m p e r a t u r a m u e r e a t e m p e r a t u r a s e le v a d a s , t e n g a o
histidinol ooo. oO
^
n o h is tid in a , y a q u e n o p u e d e t r a n s p o r t a r n in g u n a p r o t e ín a al ER . E llo p e r m it e
no toda la enzima se ----- ► halla en el ER: la célula vive aunque se coloque en ausencia de histidina
aparato de translocación, m utante
598
id e n t if ic a r el g e n n o r m a l q u e f u e m o d if ic a d o p o r la m u t a c ió n , m e d ia n t e la t r a n s f e c c ió n d e la c é lu la m u t a n t e c o n u n v e c t o r p la s m íd ic o d e le v a d u r a e n el q u e s e h a n c lo n a d o f r a g m e n t o s al a z a r d e D N A g e n ó m ic o : e l f r a g m e n t o e s p e c ífic o d e D N A q u e r e c u p e r a la c é lu la m u t a n t e c u a n d o s e h a c e c r e c e r a u n a t e m p e r a t u r a e le v a d a s e rá el q u e c o d ific a la v e r s ió n s a lv a je d e l g e n m u t a n t e .
Panel 12-1 Estudio de las secuencias señal y de la translocación de proteínas a través de membranas.
También se requiere la información epigenética en forma de al menos una pro teína característica en la membrana del orgánulo, y esta información es transm i tida desde la célula padre a las de la progenie en forma del propio orgánulo. Pro bablem ente esta información es esencial para la propagación de la organización celular en compartimientos, al igual que la información en DNA es esencial para la propagación de las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos.
Resumen Las células eucariotas contienen membranas intracelulares que encierran casi la mi tad de su volumen total en compartimientos intracelulares individualizados llama dos orgánulos. En todas las células eucariotas los principales tipos de orgánulos ro deados de membrana son el retículo endoplasmático, el complejo de Golgi, el núcleo, las mitocondrias, los lisosomas, los endosomasy los peroxisomas; las células vegeta les contienen, además, plastos, como por ejemplo los cloroplastos. Cada orgánulo contiene proteínas características que desarrollan susjunciones características. Cuando la proteína de un orgánulo acaba de ser sintetizada, encuentra el ca mino específico que ha de seguir desde el ribosoma donde ha sido sintetizada hasta el orgánulo donde actuará, guiada por una señal específica que se halla presente en su secuencia de aminoácidos y que actúa como un péptido señal o como una re gión señal. Los péptidos y las regiones señal son reconocidos por proteínas recepto ras complementarias presentes en los orgánulos de destino. Las proteínas que actúan en el citosol no presentan péptidos o regiones señal y por lo tanto permanecen en el citosol después de ser sintetizados.
El transporte de moléculas hacia dentro y hacia fuera del núcleo6 La envoltura nuclear encierra el DNA y define el compartimiento nuclear. Está formada por dos membranas concéntricas que, tal como hemos visto, son conti nuas con el retículo endoplasmático. A pesar de que la membrana nuclear inter na y la externa son continuas, las dos membranas presentan distinta com posi ción proteica. La m em brana nuclear interna contiene proteínas específicas que actúan como lugares de unión de la lámina nuclear que la soporta. Esta m em brana está rodeada por la m em brana nuclear externa, la cual se parece enor memente a la membrana del retículo endoplasmático, que forma un continuo con ella (Figura 12-9). Como la mem brana del ER rugoso, esta membrana exter na está generalmente tapizada por ribosomas que se hallan trabajando en la sín tesis de proteínas. Las proteínas fabricadas en estos ribosomas son transporta das al espacio entre las m embranas interna y externa (el espacio perinuclear), el cual a su vez es continuo con la luz del ER (véase Figura 12-9), Existe un tráfico bidireccional continuo entre el citosol y el núcleo. La gran cantidad de proteínas que actúan en el núcleo -incluyendo las histonas, las DNA y RNA polimerasas, las proteínas reguladoras de genes y las proteínas de procesam iento del RNA- son importadas de forma selectiva desde el citosol hacia el compartimiento nuclear, donde son fabricadas. Al mismo tiempo, los tRNA y mRNA son sintetizados en el com partim iento nuclear y luego son ex portados al citosol. Al igual que el proceso de importación, el proceso de ex portación es selectivo; por ejemplo, los mRNA sólo son exportados si han sido modificados correctam ente en el núcleo por reacciones de procesam iento de RNA. En algunos casos el proceso de transporte es com plejo: por ejemplo, las proteínas ribosóm icas son fabricadas en el citosol, importadas al núcleo -d o n de se ensam blan con RNA ribosóm icos recién fabricados, formando partículasy luego son exportadas de nuevo al citosol com o parte de la subunidad ribosómica, cada uno de estos pasos implica transporte selectivo a través de la envol tura nuclear.
El transporte de moléculas hacia dentro y hacia fuera del núcleo
CITOSOL
____________
PEROXISOMA
NUCLEO
PLASTIDOS
MITOCONDRIA
RETICULO ENDOPLASMATICO
&
599
envoltura | , m em brana nuclear nuclear interna .
m em brana nuclear externa
Figura 12-9 La envoltura nuclear. La
m em brana del ER - lum en del ER
envoltura nuclear de doble membrana está atravesada por poros nucleares y es continua con el retículo endoplasmático. No se muestran los ribosomas que se hallan unidos en la cara citosólica de la m embrana del ER y en la m em brana externa del núcleo.
Figura 12-10 Disposición de los complejos de poro nucleares en la envoltura nuclear. (A) Esbozo que
Los poros nucleares atraviesan la envoltura nuclear7 En todas las células eucariotas, desde las levaduras hasta las humanas, la envol tura nuclear está perforada por los poros nucleares. Cada poro está constituido por en una gran estructura discoidal conocida como el com plejo del poro n u clear, que se ha estimado que tiene un peso molecular de alrededor de 125 m i llones de daltons y se cree que está compuesto por más de 100 proteínas dife rentes, ordenadas según una sorprendente simetría ortogonal (Figuras 12-10 y 12- 11).
Cada complejo de poro presenta uno o más canales acuosos abiertos, a tra vés de los cuales pueden difundir pasivamente las moléculas solubles en agua que son más pequeñas de un determinado tamaño. El tamaño efectivo de estos canales ha sido determinado inyectando moléculas marcadas (que no son com ponentes nucleares) en el citosol y midiendo luego la velocidad de difusión hacia el núcleo. Las moléculas pequeñas (5000 daltons o menos) difunden tan rápida mente que puede considerarse que la envoltura nuclear es libremente permea ble a ellas. Una proteína de 17 000 daltons tarda 2 minutos en equilibrarse entre el citoplasma y el núcleo; una proteína de 44 000 daltons tarda 30 minutos. Una proteína globular mayor de 60 000 daltons parece que es completamente inca paz de entrar en el núcleo. Un análisis cuantitativo de estos datos sugiere que el poro nuclear tiene un canal cilindrico lleno de agua de aproximadamente 9 nm
fib rilla
m em brana nuclear externa
subunidad anular
CITOSOL
subunidad lum inal subunidad colum nar subunidad del anillo
600
muestra una pequeña región de la envoltura nuclear. En una sección transversal el com plejo de poro nuclear aparece compuesto de tres partes: (1) un com ponente columnar que forma el grueso de la pared del poro; (2) un com ponente anular, que extiende “radios” hacia el centro del poro; y (3) un com ponente luminal, que está formado por una gran glucoproteína transm em brana que se cree que participa en el anclaje del complejo a la m em brana nuclear. Además, existen fibrillas que sobresalen desde la cara citosólica o desde la cara nuclear del com plejo. En la parte nuclear las fibrillas convergen formando estructuras en forma de jaula, las cuales se muestran en una fotografía de m icroscopía electrónica de la cara nuclear de la envoltura nuclear de un oocito (B). (B, de M.W. Goldberg y T.D. Alien. J. Cell Biol. 119:1429-1440, 1992, con permiso de copyright de The Rockefeller University Press.)
envoltura nuclear NÚCLEO lám ina nuclear jaula nuclear L
m em brana nuclear interna 50 nm
Capítulo 12: Compartimientos intracelulares y clasificación de proteínas
(8)
Figura 12-11 Electronm icrografía y reconstrucción inform ática de complejos de poro nuclear. (A) y (B): diferentes perspectivas de com plejos de poros nucleares liberados de la envoltura con detergente y contrastados por tinción negativa. En (B) algunos com plejos de poro pueden verse de lado. (C) Reconstrucciones tridimensionales mediante ordenador que muestran vistas desde arriba, inclinada y de lado de com plejos de poro. (De J.E. Hinshawy R. Milligan, Cell 69:1133-1141, 1992. © Cell Press.)
de diámetro y 15 nm de largo; este canal puede ocupar sólo una pequeña frac ción del volumen total del poro (Figura 12-12). Dado que muchas proteínas celulares son demasiado grandes para pasar por difusión a través de los poros nucleares, la envoltura nuclear permite que el compartimiento nuclear y el citosol mantengan diferentes conjuntos de proteí nas. Por ejemplo, los ribosomas citoplasmáticos maduros tienen un diámetro de 30 nm, por lo que no pueden difundir a través de los canales de 9 nm; su exclu sión del núcleo asegura que toda la síntesis proteica estará limitada en el citosol. Pero, ¿cómo importa el núcleo las grandes moléculas que necesita, como las DNA y RNA polimerasas cuyas subunidades tienen pesos moleculares de entre 100 000 y 200 000 daltons? Como explicaremos más adelante, estas y muchas otras moléculas de proteína y de RNA se unen a proteínas receptoras localizadas en los complejos de poro y luego son transportadas activamente a través de la envoltura nuclear mediante los complejos de poro.
Unas señales de localización nuclear dirigen las proteínas nucleares hacia el núcleo8 En general, cuanto más activa sea la transcripción nuclear, mayor será el núm e ro de complejos de poro presentes en la envoltura nuclear. La envoltura nuclear
CITOSOL
o ° •o ®
50 nm
tam año de las proteínas que entran en el núcleo por difusión libre
El transporte de moléculas hacia dentro y hacia fuera del núcleo
tam año de las proteínas que entran en el núcleo mediante transporte activo
Figura 12-12 Posibles vías de difusión libre a través del complejo de poro nuclear. El dibujo muestra un hipotético diafragma insertado en el interior del poro para restringir el tamaño del poro del canal abierto a 9 nm, que es el tamaño de poro estimado a partir de medidas de difusión. Nueve nanómetros es un diámetro menor que la abertura central observada en las imágenes de los com plejos de poro nuclear obtenidas a partir de electronmicrografías (o a partir de medidas durante el transporte activo cuando se dilata el poro para permitir el transporte de partículas de hasta 26 nm de diámetro). Por lo tanto es probable que algunos com ponentes del poro se pierdan durante la preparación de las muestras para microscopía electrónica y que éstos sean los que en condiciones normales limiten la libre difusión a través de la abertura central. Estos com ponentes pueden formar un diafragma (o un tapón) que se abra o se cierre permitiendo el paso de grandes objetos durante el transporte activo, que está mediado por una señal de clasificación (se explica más adelante). A pesar de que en algunas preparaciones pueden observarse unos tapones, no está claro si son com ponentes del com plejo de poro o material que está siendo transportado a través suyo. Las reconstrucciones tridimensionales por ordenador sugieren que los canales que permiten la libre difusión podrían no estar localizados en el centro del com plejo de poro pero sí cerca del borde entre los com ponentes columnares (véase Figura 12-10A); esto podría significar que la difusión pasiva y el transporte activo tienen lugar a través de diferentes partes del com plejo de poro.
601
(A) LOCALIZACIÓN DEL ANTÍGENO T QUE PRESENTA LA SEÑAL DE IMPORTACIÓN NUCLEAR DEL TIPO SALVAJE
(B) LOCALIZACIÓN DEL ANTÍGENO T QUE PRESENTA UNA SEÑAL DE IMPORTACIÓN NUCLEAR MUTADA
de una célula típica de mamífero contiene entre 3000 y 4000 complejos de poro. Si la célula está sintetizando DNA, necesita importar aproximadamente 106 m o léculas de histona desde el citoplasma cada 3 minutos para poder empaquetar el DNA recién sintetizado en forma de cromatina, lo cual significa que, por térm i no medio, cada poro ha de transportar alrededor de 100 moléculas de histona por minuto. Si la célula está creciendo rápidamente, cada poro también ha de transportar por término medio 6 subunidades ribosómicas mayores y menores recién ensambladas por minuto, desde el núcleo, donde son producidas, hasta el citosol, donde son utilizadas. Y esto es sólo una muy pequeña parte del tráfico total que pasa a través de los poros nucleares. Cuando las proteínas del núcleo son extraídas experimentalmente y microinyectadas de nuevo en el citosol, incluso las más grandes se vuelven a acu mular en el núcleo de una forma eficiente. La selectividad de esta importación nuclear reside en las señales de localización nuclear, que sólo están presentes en las proteínas nucleares. Estas señales se han definido con precisión en mu chas proteínas nucleares utilizando la tecnología del DNA recombinante. Pue den estar situadas en cualquier lugar de la secuencia de aminoácidos y general mente consisten en una secuencia corta (típicamente de entre cuatro y ocho aminoácidos), que es diferente en diferentes proteínas nucleares pero que es rica en los aminoácidos cargados positivamente lisina y arginina, y generalmen te presenta prolina. En muchas proteínas nucleares esta secuencia está partida en dos bloques de dos a cuatro aminoácidos cada uno, con los bloques separa dos uno del otro por aproximadamente diez aminoácidos. Se cree que las seña les forman bucles en la superficie de las proteínas. Las señales de localización nuclear fueron identificadas en primer lugar en la proteína codificada por el virus SV40 llamada antígeno T, la cual es necesaria para la replicación del DNA vírico en el núcleo de la célula huésped. Normal mente el antígeno T se acumula en el núcleo poco tiempo después de ser sinteti zado en el citosol. No obstante, una mutación en un único aminoácido impide el transporte al núcleo (Figura 12-13). Asumiendo que esta mutación se localiza en una secuencia señal de importación al núcleo, se fusionaron cortas secuencias de DNA que codifican esta región del antígeno T normal, con un gen que codifi ca una proteína citosólica. Se determinaron las secuencias más cortas que hacían que la proteína de “fusión” resultante fuera importada al núcleo, y así se pudo demostrar que la señal de importación nuclear del antígeno T era una secuencia de ocho aminoácidos contiguos localizados en una región interna de la cadena polipeptídica (véase Figura 12-13). Experimentos posteriores demostraron que la secuencia señal tam bién puede ser funcional si es sintetizada como un peque ño péptido y unida quím icam ente a una lisina seleccionada al azar de una pro teína, la cual, en caso de no recibir este péptido, permanecería en el citoplasma, lo cual sugiere que la localización precisa en la proteína de la señal de importa ción al núcleo, no es importante. De hecho, muchas proteínas nucleares presen tan más de una señal de localización nuclear.
602
Capítulo 12: Compartimientos intracelulares y clasificación de proteínas
Figura 12-13 La función de la señal de localización nuclear. Fotografías de inmunofluorescencia que muestran la localización celular del antígeno T del SV40 conteniendo o no un péptido corto que actúa como señal de localización nulear. La forma salvaje de la proteína del antígeno T contiene la secuencia rica en lisina que se indica y que es importada a su lugar de acción en el núcleo, como se demuestra mediante una tinción inmunofluorescente con un anticuerpo contra el antígeno T (A). Si el antígeno T presenta una señal de localización nuclear alterada (una treonina que reemplaza a una lisina) perm anece en el citosol (B). (De D. Kalderon, B. Roberts, W. Richardson y A. Smith, Cell 39:499-509,1984 © Cell Press.)
oro coloidal
proteolisis lim itada cola cabeza •• núcleoplasm ina radiactiva
ù
,\ s
cabezas radiactivas
' colas radiactivas
I
I
partículas de oro coloidal com plejadas con las colas de la núcleoplasm ina
I
MICROINYECCIÓN EN EL CITOPLASMA DE OOCITOS DE X E N O P U S
O
iO
I
I
I
I
INCUBACIÓN
DETECCIÓN MEDIANTE AUTORRADIOGRAFÍA
I
I
I I DETECCIÓN POR EM
I
t citoplasm a
nucleo
•
CAPTACION EN LOS NÚCLEOS
NO CAPTACION
CAPTACION EN LOS NÚCLEOS
w ^
• poro
•
CAPTACION EN LOS NÚCLEOS A TRAVÉS DE LOS POROS NUCLEARES
Las macrom oléculas son transportadas activamente hacia dentro y hacia fuera del núcleo a través de los poros nucleares9
Figura 12-14 Captación de proteínas nucleares a través de los complejos de poro nucleares. La n ú cleop lasm in a es una gran proteína pentamérica del núcleo, que presenta dominios diferentes en la cabeza y en la cola. Las cabezas pueden ser separadas de las colas mediante fragmentación proteolítica limitada. Cuando se inyectan moléculas intactas de núcleoplasmina en el citoplasma de un oocito de rana, se acumulan rápidamente en el núcleo a pesar de que al parecer son demasiado voluminosas com o para poder difundir pasivamente a través del com plejo de poro nuclear. La señal necesaria para esta importación nuclear reside en el dominio de la cola, ya que el núcleo capta rápidamente las colas de la proteína pero no las cabezas. El papel de los poros nucleares en esta importación dirigida por señal se puede demostrar mediante electronm icroscopia utilizando colas de núcleoplasmina acopladas a esferas de oro coloidal, que son fácilm ente visualizables debido a su elevada electrodensidad. La unión de las colas de núcleoplasmina dirigen la entrada de las partículas de oro a través de los poros nucleares (véase Figura 12-15).
El transporte activo de proteínas nucleares a través de los poros nucleares puede ser visualizado directamente recubriendo partículas de oro con una proteína nuclear, inyectando estas partículas en el citosol, y siguiendo su destino por electronmicroscopia (Figuras 12-14 y 12-15). La interacción inicial de una proteína nuclear con el complejo de poro nu clear requiere una o más proteínas citosólicas que se unen a las señales de loca lización nuclear y colaboran dirigiendo a la pro teína nuclear hacia el complejo de poro, donde parece que se une a las fibrillas que se proyectan a partir del ani llo del complejo. Entonces, la proteína nuclear se desplaza hacia el centro del complejo de poro, donde es activamente transportada a través de la envoltura nuclear mediante un proceso que requiere la hidrólisis de ATP (Figura 12-16). Figura 12-15 Visualización del proceso de im portación específica de una proteína a través de los poros nucleares. Electronmicrografía que muestra las esferas de oro coloidal revistiendo núcleoplasmina (véase Figura 12-14) entrando en el núcleo a través de los poros nucleares (indicados mediante corchetes rojos). Cuando las esferas de oro coloidal se recubren con la región de la cola de moléculas de núcleoplasmina se obtienen resultados similares a éstos. Estas partículas de oro tienen un diámetro mayor que el canal de difusión del com plejo de poro, lo cual implica que, para permitir su paso, se ha inducido a abrirse un poro. Dado que las partículas de oro se alinean en el citosol antes de entrar en contacto y de entrar en el com plejo de poro, se ha sugerido que las fibrillas que se extienden hacia el citosol a partir del com plejo de poro (véase Figura 12-10A) guían a las partículas hacia su destino. (De C. Feldherr, E. Kallenbach y N. Schultz, /. C ell Biol. 99:22162222, 1984, con permiso de copyright de The Rockefeller University Press.)
El transporte de moléculas hacia dentro y hacia fuera del núcleo
603
proteina factores nuclear citosohcos com plejo del poro dilatado
CITOSOL
i PASO 1 | ,___________ PASO 2___________! UNIÓN: NO SE TRANSPORTE: REQUIERE ATP SE REQUIERE ATP
{
NÚCLEO
Estudios realizados con varios tamaños de partículas de oro indican que durante el proceso de transporte la abertura se puede dilatar hasta alcanzar 26 nm de diámetro: parece que una estructura muy poco definida en el centro del com ple jo de poro actúa igual que un diafragma de apertura controlada (close-fitting), abriéndose lo necesario cuando es activado por una señal de una proteína de grandes dimensiones (véase Figura 12-12). La base molecular de este m ecanis mo y el m ecanism o a través del que actúa bombeando macromoléculas hacia dentro y hacia fuera del núcleo todavía constituye un misterio. Parece probable que la exportación de nuevas subunidades ribosomales y de RNA m ensajero a través de los poros nucleares dependa de un sistema de transporte selectivo. Si se utilizan esferas de oro de 20 nm de diámetro similares a las utilizadas en la Figura 12-15, se recubren con pequeñas moléculas de RNA (tRNA o RNA 5S) de forma similar a como se realizó en los experimentos de nucleoplasmina, y luego se inyectan en el núcleo de un oocito de rana, son rápida mente transportadas a través de los poros hacia el citoplasma. Si, por otro lado, estas partículas son inyectadas en el citoplasma del oocito, no son transportadas hacia el núcleo sino que permanecen en el citoplasma. Parece que, además de contener receptores que reconocen las señales de importación nuclear, el poro contiene uno o más receptores que reconocen moléculas de RNA (o las proteí nas unidas a ellas) destinadas al citosol. Utilizando diferentes tamaños de partí culas de oro, unas cubiertas por RNA e inyectadas en el núcleo y otras recubier tas con señales proteicas de importación nuclear, se puede observar que un mismo com plejo de poro permite el tráfico en ambas direcciones. El mecanismo de transporte macromolecular a través de los poros nucleares es fundamentalmente distinto a los mecanismos de transporte implicados en la transferencia de proteínas a través de las membranas de otros orgánulos. La prin cipal diferencia radica en el hecho que el transporte nuclear no tiene lugar a tra vés de un transportador proteico que atraviesa una o más bicapacas lipídicas sino a través de un gran poro acuoso regulado. Parece que las proteínas nuclea res son transportadas a través de los poros, manteniendo dichas proteínas su conform ación com pletamente plegada, com o ocurre con una subunidad ribosomal que es transportada com o una partícula ensamblada; por el contrario, para ser transportadas a otros orgánulos, las proteínas tienen que desplegarse duran te su transporte, com o explicaremos más adelante.
La envoltura nuclear se desorganiza durante la m itosis10 La lám ina nuclear es una red de subunidades proteicas interconectadas deno minadas lamininas nucleares. Son un tipo especial de filamentos intermedios (explicado en el Capítulo 16) que polimerizan formando una red bidimensional (Figura 12-17). Se cree que la lámina nuclear da forma y estabilidad la envoltura nuclear, a la cual se halla anclada por la unión de los poros nucleares y la m em brana nuclear interna. Tam bién se cree que la cromatina interacciona directa mente con la lámina nuclear, por lo que la lámina proporciona un unión estruc tural entre el DNA y la envoltura nuclear.
604
Capítulo 12: Compartimientos intracelulares y clasificación de proteínas
Figura 12-16 Representación altamente esquemática del mecanismo de transporte activo a través de los poros nucleares. Las proteínas y las estructuras implicadas en el proceso de transporte activo no son conocidas. Sin embargo, sabemos que para la unión inicial de las proteínas nucleares al complejo se necesitan una colección diversa de proteínas citosólicas relacionadas. Estas proteínas, llamadas nucleoporinas, contienen un azúcar simple (la AT-acetilglucosamina) que ayuda a su identificación mediante el uso de lectinas y de anticuerpos específicos. No se muestran las fibrillas que se proyectan a partir del complejo de poro y que se cree que ayudan a guiar a las proteínas nucleares al centro del poro.
i___________ i 1 jim
Figura 12-17 La lám ina nuclear. Electronmicrografías de porciones de la lámina nuclear en un oocito de X enopus preparado por sublimación y sombreado metálico. La lámina está formada por una red regular de filamentos intermedios especializados. (Por cortesía de Ueli Aebi.)
poro nuclear
Cuando el núcleo se desorganiza durante la mitosis, la lámina nuclear se despolimeriza, al menos parcialmente, como consecuencia de la fosforilación de las lamininas nucleares en el inicio de la mitosis. Al mismo tiempo, los poros nu cleares se desorganizan en sus diversos componentes. La despolimerización de la lámina nuclear es probablemente un requisito previo para que la envoltura nu clear se rompa formando vesículas de membrana las cuales, con el contenido nuclear, se dispersan por todo el citosol. La reorganización de la lámina nuclear tienen lugar cuando las lamininas nucleares son desfosforiladas y, como resulta do de ello, repolimerizan en las superficie de los cromosomas; entonces, la lámi na nuclear reorganizada une las vesículas de la envoltura membranosa nuclear, las cuales se fusionan entre sí formando de nuevo una envoltura alrededor de cada cromosoma o grupo de cromosomas. Durante este proceso los complejos de poro nucleares tam bién se reorganizan. Los cromosomas envueltos se agru pan y sus membranas se fusionan formando una sola envoltura nuclear, la cual importa activamente todas las proteínas que presentan señales de localización nuclear (Figura 12-18). Dado que la nueva envoltura nuclear está situada muy cerca de la superficie de los cromosomas, excluye todas las proteínas de la célula excepto las que están unidas a los cromosomas mitóticos. Por lo tanto, las proteí nas grandes se mantienen fuera del núcleo interfásico a menos que presenten señales de localización nuclear. Las señales de localización nuclear no son eliminadas después del transpor te hacia el núcleo. Se supone que esto es así porque las proteínas nucleares han de ser importadas al núcleo varias veces, después de cada división celular. Por el contrario, cuando una molécula de proteína ha sido importada a cualquier otro orgánulo rodeado de membrana, se transmite de generación a generación en el interior del compartimiento y nunca ha de ser translocada de nuevo. En este caso el péptido señal de estas moléculas es a menudo eliminado después de la translocación proteica.
Figura 12-18 Rotura y nueva form ación de la envoltura nuclear durante la mitosis. Se cree que la fosforilación de las lamininas ayuda a disparar el desensam blaje de la lámina nuclear, lo cual a su vez causa la rotura en forma de vesículas de la envoltura nuclear. Parece que la desfosforilación de la láminas ayuda a revertir el proceso.
El transporte entre el núcleo y el citosol puede ser regulado evitando el acceso a la m aquinaria transportadora11 Como se explica en el Capítulo 9, la actividad de algunas proteínas de regulación génica está controlada manteniendo estas proteínas fuera del compartimiento
El transporte de moléculas hacia dentro y hacia fuera del núcleo
605
señal de localización nuclear lugar de unión \ horm ona de la horm ona \ esteroidea
envoltura nuclear CITOSOL
NUCLEO DNA
dom inio de unión al DNA COMPLEJO RECEPTOR INACTIVO EN EL CITOSOL
hsp90
LA UNION DE LA HORMONA LIBERA LA hsp90 Y EXPONE LA SEÑAL DE LOCALIZACIÓN NUCLEAR
transcripción
UNION DEL RECEPTOR ACTIVO AL DNA ACTIVANDO LA TRANSCRIPCIÓN
nuclear hasta que son necesarias en dicho compartimiento. La señal de localiza ción nuclear de estas proteínas puede ser inactivada por fosforilación. Otras, se unen a proteínas citosólicas inhibidoras que o bien las retienen en el citosol -p ro bablem ente mediante interacciones con el citoesqueleto o con orgánulos especí ficos- o bien enmascaran sus señales de localización nuclear. Cuando la célula recibe el estímulo apropiado, la proteína es liberada de su anclaje citosólico o de sus sistema de enmascaramiento y es transportada hacia el núcleo (Figura 12-19). La exportación de RNA desde el núcleo puede estar controlada de una m a nera similar. Como la importación activa hacia el núcleo, la exportación también requiere una señal: en el caso de la mayoría de moléculas de RNA mensajero, esta señal la proporciona una modificación característica, la estructura de cape ruza (cap) en el extremo 5 ’ del RNA (se explica en el Capítulo 8). Los RNA premensajeros procesados de forma incompleta tienen esta caperuza, pero están unidos a la maquinaria nuclear de transcripción y de maduración, la cual sólo li bera la molécula de RNA cuando se ha completado su procesamiento: estudios genéticos realizados en levaduras han demostrado que las mutaciones que evitan que el RNA pre-mensajero se relacione correctamente con la maquinaria de m a duración provocan la exportación de RNA no maduro. Otros RNA, como el RNA de transferencia o el RNA ribosómico, que no presentan la estructura en caperu za en el extremo 5 ’, primero han de ensamblarse con proteínas y entonces son exportados com o parte de estos complejos. Posiblemente las señales de exporta ción nuclear se encuentran en las subunidades proteicas de estos complejos, y estas señales se activan después del ensamblaje correcto con los componentes de RNA. Sin embargo, no conocem os todavía la naturaleza de estas señales.
Resumen La envoltura nuclear está formada por una membrana nuclear interna y otra ex terna. La membrana nuclear externa es continua con la membrana del ER, y el es pacio entre ésta y la membrana nuclear interna es continuo con el lumen del ER. Las moléculas de RNA, que son fabricadas en el núcleo, y las subunidades ribosómicas, que son ensambladas también en el núcleo, son exportadas al citosol, mientras que todas las proteínas que son funcionales en el núcleo han sido sintetizadas en el citosol e importadas. El intercambio de materiales entre el núcleo y el citosol tiene lugar a través de los poros nucleares que proporcionan una vía de paso a través de la envoltura nuclear. Las proteínas que presentan señales de importación nuclear son transportadas activamente hacia el núcleo a través de los poros, mientras que las moléculas de RNA y las subunidades ribosomáles recién fabricadas son transportadas activamente ha cia afuera, a través de los poros. Dado que este péptido señal no es eliminado, las proteínas nucleares pueden ser importadas varias veces, tal como se requiere cada vez que el núcleo se desorganiza en la mitosis. El transporte de las proteínas nuclea res y délas moléculas de RNA a través de los poros se puede regular evitando el acce so de estas moléculas a la maquinaria de transporte de los poros nucleares.
606
Capítulo 12: Compartimientos intracelulares y clasificación de proteínas
Figura 12-19 La importación nuclear del receptor de glucocorticoides. El receptor de glucocorticoides es una proteína reguladora de genes que en las células no tratadas con hormonas se halla en el citosol unida a la proteína chaperona hsp90. Cuando se activa por la unión de la hormona esteroidea apropiada, la proteína hsp90 se libera y el receptor se dirige al núcleo gracias a una señal de localización nuclear; una vez se halla en el núcleo, se une a secuencias específicas de DNA y regula la transcripción de una colección de genes discreta. (Se explica en los Capítulos 9 y 15.)
El transporte de proteínas al interior de mitocondrias y de cloroplastos12 Tal como se explica en el Capítulo 14, las mitocondrias y los cloroplastos son orgánulos de doble mem brana que se especializan en la síntesis de ATP, utilizan do la energía producida mediante el transporte electrónico y la fosforilación oxidativa en las mitocondrias y mediante la fosforilación fotosintética en los cloroplastos. A pesar de que ambos orgánulos contienen su propio DNA y su maquinaria para la síntesis proteica, la mayoría de sus proteínas están codifica das en el núcleo celular y son importadas desde el citosol. Además, cada proteí na importada ha de alcanzar el subcompartimiento determinado en el que es funcional. En las mitocondrias existen dos subcompartimientos: el espacio de la m atriz y el espacio interm em brana. Estos compartimientos están definidos por las dos membranas mitocondriales: la m em brana interna, que encierra el espacio de la matriz y la m em brana externa que se halla en contacto con el ci tosol (Figura 12-20A). En los cloroplastos existen estos dos subcompartimientos más otro adicional, el llamado espacio tilacoidal, que está delimitado por la membrana tilacoidal (Figura 12-20B). Cada uno de estos subcompartimientos contiene una colección específica de proteínas. Por lo tanto, el crecim iento de las mitocondrias y de los cloroplastos mediante la importación de proteínas citoplasmáticas constituye una proeza, que implica la traslocación selectiva de estas proteínas a través de varias membranas sucesivamente hasta alcanzar el lugar apropiado. Las proteínas codificadas por los genomas de estos orgánulos, que son rela tivamente pocas, están localizadas principalmente en la membrana interna de las mitocondrias y en la membrana tilacoidal de los cloroplastos. Generalmente los polipéptidos codificados por los orgánulos forman subunidades de com ple jos proteicos cuyas otras subunidades están codificadas por genes nucleares y, por lo tanto, son importadas desde el citosol. La formación de estos complejos proteicos híbridos requiere una síntesis equilibrada de los dos tipos de subuni dades; el mecanismo a través del cual está coordinada la síntesis proteica en dos tipos diferentes de ribosomas localizados en dos membranas separadas, consti tuye actualmente un misterio.
La translocación hacia la matriz mitocondrial depende de una señal típica de la matriz13 Generalmente, las proteínas importadas a la matriz mitocondrial son captadas desde el citosol uno o dos minutos después de su liberación desde los polirribosomas libres. Casi siempre estas proteínas precursoras mitocondriales poseen un péptido señal (de entre 20 y 80 residuos de aminoácidos) en su extremo ami-
(B) CLOROPLASTO
(A) MITOCONDRIA
espacio de la matriz espacio entre mem branas
espacio tilacoidal
m em brana interna espacio entre mem branas
m em brana tilacoidal
espacio de la m atriz (estroma) El transporte de proteínas al interior de mitocondrias y de cloroplastos
Figura 12-20 Los subcom partim ientos de la m itocondria y del cloroplasto. La topología del cloroplasto puede derivarse de la topología de la mitocondria de una forma sencilla: pellizcando las invaginaciones de la membrana mitocondrial interna para dar lugar a vesículas, se puede generar un com partimiento que es topologicamente equivalente al de las vesículas del tilacoide de los cloroplastos. Las vesículas del tilacoide podrían haber evolucionado de este modo.
607
Figura 12-21 Un péptido señal para la importación de proteínas a la mitocondria. La citocromo oxidasa es un gran complejo multiproteico localizado en la membrana mitocondrial interna, donde actúa como la enzima terminal de la cadena de transporte electrónico (se explica en el Capítulo 14). (A) Los 12 primeros aminoácidos del precursor de la subunidad IV de esta enzima son suficientes como péptido señal para dirigir el transporte de esta subunidad a la mitocondria. (B) Cuando el péptido señal se pliega en forma de hélice a de 3,6 residuos por vuelta, y se observa desde arriba de la hélice, se observa que los residuos de aminoácidos cargados positivamente (en rojo) se agrupan en una cara de la hélice mientras que los residuos de aminoácidos no polares (en verde) se hallan agrupados en la cara opuesta. Todas las secuencias de los péptidos señal mitocondriales pueden potencialm ente formar una hélice antipática como ésta. Se cree que una hélice de este tipo es reconocida por proteínas receptoras específicas de la superficie mitocondrial.
18 Leu—
no. Cuando las proteínas han sido importadas, el péptido señal es rápidamente eliminado por una proteasa específica (una peptidasa de señal) de la matriz mi tocondrial y probablem ente degradado hasta aminoácidos en la matriz. El pépti do señal puede ser extraordinariamente sencillo. Experimentos de genética m o lecular en los que se utiliza un péptido señal de longitud progresivamente menor, han demostrado que para señalizar la importación mitocondrial sólo son necesarios 12 aminoácidos en su extremo amino terminal. La unión experi mental de estos 12 residuos a cualquier proteína citoplasmática hace que la pro teína resultante sea dirigida a la matriz mitocondrial. Estudios de la física de péptidos señal completos sugieren que estos péptidos señal pueden formar es tructuras anfipáticas de hélice a, en las que todos los restos cargados positiva mente se localizan en un lado de la hélice y todos los restos hidrofóbicos se dis tribuyen en el lado opuesto (Figura 12-21). Se cree que esta configuración es reconocida por proteínas receptoras específicas de la superficie mitocondrial.
La translocación hacia la matriz mitocondrial depende del gradiente electroquím ico a través de la m em brana interna y de la hidrólisis de ATP14 Casi todo lo que conocem os acerca de los mecanismos moleculares de la impor tación proteica a las mitocondrias lo hemos aprendido del análisis de sistemas de transporte reconstituidos en sistemas libres de células. En primer lugar, se purifican mitocondrias por centrifugación diferencial a partir de un homogeneizado de células. A continuación, estas mitocondrias se incuban con proteínas precursoras mitocondriales marcadas radiactivamente. Generalmente las proteí nas precursoras purificadas son transportadas hacia el interior de estas mito condrias de forma rápida y eficiente durante una breve incubación in vitro. Cambiando las condiciones de estos experimentos in vitro, es posible establecer los requerimientos bioquímicos del transporte de. proteínas hacia el interior de las mitocondrias. Todas las formas de transporte y de desplazamiento vectorial requieren energía. En muchos sistemas biológicos la energía está suministrada por la hi drólisis de ATP. No obstante, en el caso de la importación mitocondrial también se requiere un gradiente electroquím ico a través de la mem brana mitocondrial interna. Este gradiente se m antiene por el bom beo de H+ desde la matriz al es pacio interm em brana durante el transporte electrónico, impulsado por los pro cesos de transporte electrónico en la m em brana interna. La m embrana mito condrial externa al igual que las bacterias gram negativas (véase Figura 11-14), presentan grandes cantidades de una proteína formadora de poros llamada porina, por que son librem ente permeables a los iones orgánicos y a los metabolitos (aunque no a la mayoría de proteínas) de modo que no es necesario mante ner ningún gradiente a su través. La energía del gradiente electroquímico a
608
Capítulo 12: Compartimientos intracelulares y clasificación de proteínas
través de la m em brana interna se utiliza com o una batería para impulsar la biosíntesis de la mayor parte del ATP de la célula, pero tam bién se utiliza para ayudar a impulsar la importación de proteínas dotadas del péptido señal de importación mitocondrial, que está cargado positivamente: cuando se añaden ionóforos que disipan el potencial de mem brana mitocondrial, se bloquea la im portación de proteínas a la mitocondria. Todavía no conocem os de qué for ma el gradiente electroquím ico colabora impulsando la translocación proteica. La función de la hidrólisis del ATP se conoce mucho mejor, como veremos más adelante.
Las proteínas m itocondriales son importadas hacia la matriz m ediante un proceso de dos etapas, a través de lugares de contacto que unen las m em branas externa e interna15 Como primer paso en la importación mitocondrial, las proteínas precursoras mitocondriales tienen que unirse a proteínas receptoras que se encuentran en la membrana mitocondrial externa y reconocen los péptidos señal mitocondriales. La etapa siguiente es el proceso de translocación en sí mismo. La proteína puede alcanzar la matriz mitocondrial cruzando las dos m em branas una por una, o pasando a través de ambas membranas a la vez. Para dis tinguir entre estas dos posibilidades, un sistema de importación libre de células se enfría hasta temperaturas bajas, atrapando las proteínas en algún paso inter medio del proceso de translocación. Las proteínas que se detectan en este paso tienen su extremo amino terminal en el espacio de la matriz (como lo indica el hecho de que su péptido señal ya haya sido eliminados por la proteasa de matriz), pero la mayor parte de la proteína todavía puede ser atacada desde el exterior de la mitocondria por enzimas proteolíticas añadidas externamente (Figura 12-22). Este resultado demuestra que para entrar en la matriz las proteínas precursoras pasan a través de ambas membranas mitocondriales a la vez. Se cree que existen dos proteínas transportadoras, una en la membrana externa y la otra en la inter na, y que sus funciones habitualmente se hallan acopladas permitiendo el trans porte a través de ambas membranas al mismo tiempo. Los electronmicroscopistas han detectado numerosos puntos de contacto en los cuales parece que se unen las membranas mitocondriales externa e interna, lo cual sugiere que los procesos de translocación se producen en o cerca de estos puntos. Aunque las proteínas precursoras son transportadas a través de ambas membranas a la vez, está claro a partir de los experimentos descritos en la Figura 12-22 que el proceso de importación tiene lugar en dos etapas distintas y que sólo la segunda se bloquea por temperaturas bajas. De ambas, la penetración inicial, que no se afecta por las bajas temperaturas, es la que requiere el poten cial de membrana: cuando una preparación enfriada de mitocondrias que con tienen intermediarios parcialmente translocados, se vuelven a calentar, el pro-
El transporte de proteínas al interior de mitocondrias y de cloroplastos
Figura 12-22 Las proteínas que son transportadas a la matriz mitocondrial atraviesan de forma transitoria tanto la m em brana externa com o la interna de la m itocondria. Cuando se incuban mitocondrias aisladas a 5 °C con un precursor de una proteína, el precursor sólo se transloca parcialmente. En la matriz mitocondrial se elimina el péptido señal amino terminal (en rojo); la mayor parte de la cadena polipeptídica permanece fuera de la mitocondria donde es accesible a enzimas proteolíticas. Al volver a calentar la preparación a 25 °C, el proceso de translocación se completa. Una vez se halla en el interior de la mitocondria, la cadena polipeptídica está protegida de las enzimas proteolíticas añadidas desde el exterior a menos que también se añada un detergente para romper las membranas mitocondriales, lo que permite la digestión de las proteínas importadas.
609
INSERCIÓN EN LA MEMBRANA, IMPULSADA POR EL GRADIENTE ELECTROQUÍMICO precursor de la proteína péptido señal
m em brana m itocondrial externa m em brana m itocondrial interna CITOSOL
RECONOCIMIENTO proteína receptora
lugar de s. contacto entre las m em branas LA TRANSLOCACION A LA MATRIZ REQUIERE ATP
ROTURA MEDÍANTE UNA PEPI! DAS A . DE SEÑAL
MATRIZ
proteína m itocondrial madura j péptido señal elim inado
ceso de importación se com pleta rápidamente (Figura 12-22), incluso aunque el potencial de m em brana a través de la membrana interna se haya disipado. Sin embargo, esta segunda etapa del proceso de transporte requiere ATP. Por lo tan to la primera etapa, que implica la inserción del péptido señal y de las secuen cias adyacente en el interior de ambas membranas mitocondriales, es impulsada por el gradiente electroquímico, y la segunda fase, en la cual el resto de cadena polipeptídica se desplaza hacia la matriz, requiere tanto hidrólisis de ATP como una temperatura fisiológica (Figura 12-23).
Las proteínas son importadas hacia el interior de la matriz m itocondrial, en un estado desplegado16 El transporte de las proteínas precursoras mitocondriales a través de los puntos de contacto de las m embranas mitocondriales está guiado por los miembros de la familia de las proteínas chaperonas, las cuales se explican en el Capítulo 5. Es difícil de imaginar cómo una proteína plegada soluble en agua puede pasar a través de dos (o incluso a través de una) bicapas lipídicas mientras mantiene su conform ación tridimensional nativa. Se sabe que las proteínas citosólicas de tipo chaperona (llamadas chaperoninas ) pertenecientes a la familia de las hsp70, además de asegurar el correcto plegamiento de proteínas citosólicas, tienen una función importante en la importación de proteínas tanto hacia el interior de las mitocondrias como hacia el ER, mediante su unión a los precursores en su esta do desplegado durante la translocación. Como se explica en el Capítulo 5, la li beración de los polipéptidos recién sintetizados de la familia de proteínas cha peronas hsp70 requiere la hidrólisis de ATP, lo cual supone parcialmente la dependencia del ATP de las últimas fases de la importación mitocondrial. Las primeras evidencias sobre la función esencial de las proteínas chapero nas en la translocación a través de las membranas celulares internas se obtuvie ron en estudios genéticos de levaduras. Cuando se inactivan los genes que codi fican ciertos m iembros de la familia hsp70 de las proteínas chaperonas, los precursores mitocondriales no son importados hacia las mitocondrias y se acu mulan en el citosol. Se cree que los precursores recién sintetizados, a medida que son liberados de los polirribosomas en el citosol, se unen a las proteínas hsp70, las cuales evitan la agregación o el plegamiento espontáneo de las proteí nas precursoras antes de que se unan a los translocadores proteicos de la m em brana de destino. La energía liberada por la hidrólisis de ATP se utiliza para libe rar a las proteínas hsp70 unidas a medida que las proteínas translocadas pasan a través de la membrana. Experimentalmente, la necesidad de hsp70 y de ATP en el citosol puede evitarse si las proteínas se m antienen desplegadas artificialmen te, por ejemplo, mediante un paso de desnaturalización en una solución con centrada de urea.
610
Capítulo 12: Compartimientos intracelulares y clasificación de proteínas
Figura 12-23 Im portación de proteínas por la mitocondria. El péptido señal amino terminal del precursor proteico es reconocido por receptores que al parecer existen en la membrana externa de la mitocondria. Se cree que la proteína es translocada a través de ambas membranas mitocondriales, a través de lugares especiales de contacto o muy cerca de ellos. Este transporte está impulsado inicialm ente por el gradiente electroquímico existente a través de la membrana interna, y después por la hidrólisis de ATP. En la matriz mitocondrial, el péptido señal es eliminado por una peptidasa de señal, formándose la proteína madura. El péptido señal libre es rápidamente degradado.
hsp70 m em brana m itocondrial externa espacio interm em brana m em brana m itocondrial ¿a interna hsp70 m itocondrial
La unión secuencial de las proteínas importadas a las proteínas mitocondriales hsp70 y hsp60 impulsa su translocación y ayuda el plegamiento proteico17
Figura 12-24 La im portación de proteínas hacia la matriz m itocondrial requiere proteínas hsp70 en ambos lados de la doble m em brana m itocondrial. Después de la inserción inicial del péptido señal y de las porciones adyacentes de la cadena polipeptídica, la cadena desplegada se desliza a través de un canal que atraviesa ambas membranas. La hsp70 citosólica unida se libera de la proteína por medio de una reacción que depende de la hidrólisis de ATP. De forma concom itante, la h sp70 m ito con d rial se une a regiones de la cadena polipeptídica que se hallan expuestas en la matriz, estirando así la proteína hacia el interior de la mitocondria.
Las proteínas importadas no sólo son dirigidas a las mitocondrias por las proteí nas chaperonas: una vez han sido liberadas en el interior, son recibidas en la matriz por proteínas estrecham ente relacionadas con las hsp70. La hsp70 mito condrial es crucial en procesos de importación ya que las mitocondrias que con tienen formas mutantes de la proteína no son capaces de importar proteínas precursoras. Al igual que su pariente citosólico, la hsp70 mitocondrial tiene una alta afinidad para las cadenas polipeptídicas no plegadas, y se une fuertemente a las proteínas importadas a medida que emergen de los translocadores. A conti nuación la hsp70 libera la proteína mediante una reacción dependiente de ATP. Este ciclo de unión y posterior liberación dependiente de energía puede propor cionar la fuerza impulsora para la importación proteica después de que la pro teína se haya insertado inicialmente en el translocador (Figura 12-24): la unión secuencial de muchas hsp70 mitocondriales puede empujar la proteína desple gada a través del canal transmembrana hacia la matriz. Después de la interacción inicial con la hsp70 mitocondrial, muchas proteí nas importadas son transferidas a otra proteína chaperona, la hsp60 mitocondrial. Tal como se explica en el Capítulo 5, la hsp60 se pega a las cadenas poli peptídicas no plegadas facilitando su plegamiento mediante una reacción dependiente de ATP. La mayor parte de nuestro conocimiento actual sobre la función de la hsp60 como proteína facilitadora del plegamiento deriva de estu dios sobre la importación de proteínas en las mitocondrias.
El transporte de proteínas al espacio interm em brana m itocondrial requiere dos señales18 Muchas de las funciones de las mitocondrias requieren proteínas que están inte gradas en la membrana mitocondrial interna o bien que actúan en el espacio in termembrana. Estas proteínas son transportadas desde el citosol mediante los mismos mecanismos que transportan proteínas hacia la matriz, pero mediante varios sistemas se evita que finalicen su viaje en la matriz. En muchos casos las proteínas precursoras son inicialmente transferidas hacia la matriz, tal como se ilustra en la Figura 12-23. No obstante, estas proteínas presentan una secuencia de aminoácidos muy hidrofóbica, situada muy estratégicamente después del péptido señal amino terminal que inicia la importación. Una vez el péptido se ñal ha sido eliminado por la proteasa de la matriz, la secuencia hidrofóbica ac túa como un péptido señal para volver a translocar la proteína de nuevo desde la matriz a través de la membrana interna. Posiblemente el paso final de esta ruta implica un mecanismo similar al utilizado para dirigir proteínas codificadas por las mitocondrias a través de la membrana interna (Figura 12-25A). Más adelante veremos que un mecanismo parecido se utiliza para translocar proteínas hacia o
El transporte de proteínas al interior de mitocondrias y de cloroplastos
611
CITOSOL
lugar de rotura péptido señal (A)
proteina de la m em brana interna
ir > « & •segundo
péptido señal / SINTESIS PROTEICA MITOCONDRI AL
proteina de la rotura por proteina del espacio m em brana interna proteasa interm em brana
lugar de / rotura / péptido señal
f
péptido de paro de la transferencia
(B)
a través de la m em brana del ER y de la membrana plasmática procariota, donde ha sido estudiado más intensamente. Una ruta alternativa hacia la membrana interna puede evitar la excursión hacia la matriz. El translocador en la membrana interna se une a la secuencia hidrofóbica que sigue al péptido señal amino terminal que inicia la importación y evita translocaciones posteriores a través de la membrana interna. Los dos translocadores en las m embranas externa e interna se desacoplan, lo cual provo ca que el resto de la proteína sea empujada hacia el espacio intermembrana (Fi gura 12-25B). Diferentes proteínas pueden utilizar una u otra de estas dos rutas hacia la mem brana interna o hacia el espacio intermembrana. No está claro cuál de ellas es la más utilizada. Después de que las proteínas destinadas a la membrana interna hayan sido insertadas en la membrana, una proteasa intermembrana las fracciona, liberan do la cadena polipeptídica madura como una proteína soluble (Figura 12-25C). Finalmente, muchas de estas proteínas se encuentran unidas, como proteínas de membranas periféricas, a la superficie externa de la membrana mitocondrial interna, donde forman subunidades de com plejos proteicos que también con tienen proteínas transmembrana.
Para dirigir el transporte de proteínas a la membrana tilacoidal de los cloroplastos se necesita la participación de dos péptidos señal19 El transporte de proteínas hacia el interior de los cloroplastos se parece en mu chos aspectos al transporte hacia el interior de las mitocondrias: ambos trans portes se producen de manera post-transcripcional, ambos requieren energía, y ambos utilizan péptidos señal hidrofóbicos amino terminales que se eliminan después de haber sido utilizados. Si embargo, existe al menos una diferencia im portante: las mitocondrias utilizan el gradiente electroquímico a través de su membrana interna para ayudar a impulsar el transporte, mientras que los cloro plastos, que tienen un gradiente electroquímico a través de sus tilacoides pero no de su mem brana interna, parece que sólo utilizan la hidrólisis de ATP como aporte energético para la importación a través de su envoltura externa de doble membrana. A pesar de que los péptidos señal para el transporte al interior de los cloro plastos son sem ejantes a los descritos anteriormente para el transporte a m ito condrias, en las células vegetales se hallan presentes tanto mitocondrias como cloroplastos, y las proteínas han de escoger de manera adecuada entre ellos. En plantas, por ejemplo, si una enzima bacteriana se une experimentalmente a una secuencia amino terminal de una proteína mitocondrial, es dirigida específica mente a las mitocondrias mientras que si se une experimentalmente a una se cuencia amino terminal de una proteína de cloroplasto, penetra en los cloro plastos. Por lo tanto, probablemente los receptores de importación de cada orgánulo pueden reconocer las diferentes secuencias señal. Los cloroplastos tienen un compartimiento extra rodeado de membrana, el tilacoide. Muchas proteínas de los cloroplastos, entre las que se encuentran las subunidades proteicas del sistema fotosintético y de la ATP sintasa, son trans-
612
n o
T
Capítulo 12 : Compartimientos intracelulares y clasificación de proteínas
MATRIZ (C)
Figura 12-25 La im portación de proteínas desde el citosol al espacio interm em brana o a la m em brana interna de la m itocondria. (A) Se cree algunas proteínas, para desplazarse desde el citosol a la membrana interna, siguen una ruta que requiere la participación de dos péptidos señal y de dos fenóm enos de translocación. En primer lugar, la proteína es transportada al espacio de la matriz, como muestra la Figura 12-23. Sin embargo, la eliminación del péptido señal (en rojo) utilizado para este transporte inicial desenmascara un péptido señal hidrofóbico (en n a ra n ja ) adyacente situado en el nuevo extremo amino. Esta señal hace que la proteína se inserte en la membrana interna mediante el mismo sistema por el que se insertan en esta membrana las proteínas codificadas por el genoma mitocondrial. (B) Según un mecanismo alternativo, la secuencia hidrofóbica que sigue a la señal que dirige hacia la matriz se une a un translocador y detiene la translocación a través de la membrana interna. Entonces el resto de la proteína es empujada hacia el espacio intermembrana y la secuencia hidrofóbica se libera en el interior de la membrana interna. Este mecanism o se denomina la ruta de paro de transferencia y se explica en detalle más adelante. (C) Algunas proteínas solubles del espacio intermembrana pueden utilizar también las rutas mostradas en (A) y en (B) antes de ser liberadas al espacio intermembrana por una segunda peptidasa de señal (con su lugar activo en el espacio intermembrana), la cual elimina el péptido señal hidrofóbico.
péptido señal de cloroplasto
CITOSOL
péptido señal de tilacoide ELIMINACIÓN DEL PÉPTIDO SEÑAL DE CLOROPLASTO
receptor cuya existencia se propone mem brana externa
TRANSLOCACIÓN « AL ESTROMA DEPENDIENTE DE ATP m em brana interna
ESTROMA
péptido señal de tilacoide, accesible TRANgÍLOCACIÓN AL ESPACIO TILACÜDAL
m em brana del tilacoide
proteina madura en el espacio del tilacoide
Figura 12-26 La translocación al espacio tilacoidal de los cloroplastos. La cadena polipeptídica precursora contiene un péptido señal amino terminal de cloroplasto {en rojo), seguido inmediatamente por un péptido señal de tilacoide (en n aran ja). El péptido señal de cloroplasto inicia la translocación al estroma a través de un lugar de contacto entre membranas, mediante un m ecanism o similar al utilizado para la translocación a la matriz mitocondrial. Entonces, este péptido señal es eliminado, desenmascarando el péptido señal de tilacoide, el cual inicia la translocación a través de la m em brana del tilacoide.
portadas desde el citosol hasta la membrana tilacoidal. Como en el caso de algu nos precursores mitocondriales, estas proteínas son transportadas a su destino final a través de un proceso en dos pasos. Primero pasan a través de la envoltura de doble membrana hacia el espacio de la matriz del cloroplasto (llamado el estrom a) y luego son translocadas hacia la membrana tilacoidal (o a través de esta membrana hacia el espacio tilacoidal). Los precursores de estas proteínas tie nen, a continuación del péptido señal amino terminal del cloroplasto, un pépti do señal hidrofóbico del tilacoide. Después de que el péptido señal amino term i nal haya sido utilizado para importar a la proteína al estroma, es eliminado por una proteasa señal del estroma (análoga a la proteasa señal de la matriz mitocondrial). Esta hidrólisis desenmascara el péptido señal del tilacoide, el cual en tonces inicia el transporte a través de la membrana tilacoidal (Figura 12-26). Igual que en el caso de las mitocondrias, el segundo paso es la vía utilizada para insertar las proteínas codificadas por el cloroplasto en la membrana tilacoidal; probablemente el translocador proteico que se utiliza es originario del antecesor bacteriano de los cloroplastos.
Resumen A pesar de que las mitocondrias y los cloroplastos tienen sus propios sistemas ge néticos, sólo producen una pequeña proporción de sus propias proteínas. De he cho, ambos orgánulos importan desde el citosol la mayoría de sus proteínas, utili zando en ambos casos mecanismos similares. Los procesos de transporte han sido muy estudiados en mitocondrias, especialmente en levaduras. Una proteína es translocada al espacio de la matriz mitocondrial mediante el paso a través de lu gares de adhesión entre las membranas externa e interna, llamados lugares de contacto. La translocación en las mitocondrias está impulsada por la hidrólisis de ATP y por el gradiente electroquímico a través de la membrana interna, mientras que la translocación en los cloroplastos sólo está impulsada por la hidrólisis del ATP. La proteína transportada atraviesa las membranas de las mitocondrias y de los cloroplastos en estado desplegado. Las proteínas chaperonas de la familia de las hsp70 citosólicas mantienen las proteínas precursoras en un estado desplegado competente con la translocación. La hsp70 mitocondrial se une a la cadena polipetídica que está llegando a la matriz y parece que la impulsa hacia el interior. Una vez que la proteína se halla en la matriz, otra proteína de estrés, la hsp60, ayuda al plegamiento de la proteína. Sólo las proteínas que contienen un péptido señal es pecífico son translocadas hacia el interior de las mitocondrias y los cloroplastos. El péptido señal se halla generalmente en el extremo amino terminal y es elimina do después de la importación. El transporte a la membrana interna puede tener lugar como un segundo paso si en la proteína importada se halla presente un pépEl transporte de proteínas al interior de mitocondrias y de cloroplastos
61 3
tido señal hidrofóbico; este segundo péptido señal es desenmascarado cuando se eli mina el primer péptido señal. De igual forma, en el caso de los cloroplastos la im portación desde el estroma hasta el tilacoide requiere un segundo péptido señal.
Peroxisomas20 Los peroxisom as se diferencian de las mitocondrias y de los cloroplastos en mu chos aspectos, entre los que cabe destacar que estos orgánulos están rodeados por una única membrana, y no presentan ni DNA ni ribosomas. A pesar de estas diferencias, se cree que los peroxisomas están formados por un proceso similar de importación específica de proteínas (y de lípidos) del citosol. No obstante, dado que los peroxisomas no poseen genoma, todas sus proteínas han de proce der del citosol. Por ello, los peroxisomas se parecen al ER en que son orgánulos autorreplicantes, delimitados por una mem brana unitaria y que existen sin ge nom a propio. Dado que no volveremos a tratar de los peroxisomas en otro lugar de este li bro, vamos ahora a detenernos a considerar las funciones de esta familia diversa de orgánulos, antes de hablar de su biosíntesis. Los peroxisomas se encuentran en todas las células eucariotas. Presentan enzimas oxidativas, como la catalasa y la urato oxidasa, a tan altas concentraciones que en algunas células los peroxiso mas se reconocen en electronmicrografías por la presencia de un nucleoide cris talino, principalmente compuesto de urato oxidasa (Figura 12-27). Como en el caso de las mitocondrias, los peroxisomas son los principales lu gares de utilización de oxígeno. Una hipótesis es que los peroxisomas son un vestigio de un orgánulo antiguo, que en los antecesores primitivos de las células eucariotas realizaba todo el metabolismo del oxígeno. Cuando el oxígeno produ cido por las bacterias fotosintéticas empezó a acumularse en la atmósfera podría haber resultado altamente tóxico para la mayoría de las células. Los peroxisomas pudieron haber contribuido a disminuir la concentración de oxígeno en estas células, a la vez que permitían utilizar su reactividad química para realizar reac ciones oxidativas útiles. De acuerdo con este punto de vista, el desarrollo poste rior de las mitocondrias hizo que los peroxisomas se volvieran altamente obsole tos, dado que muchas de las reacciones que ellos realizaban sin producir energía fueron acopladas a la formación de ATP por medio de la fosforilación oxidativa. Por lo tanto, las reacciones oxidativas que realizan actualmente los peroxisomas podrían ser las que siguen siendo útiles a pesar de la presencia de las m itocon drias.
Los peroxisomas utilizan el oxígeno molecular y el peróxido de hidrógeno para realizar reacciones oxidativas21 Los peroxisomas se denominan así porque generalmente contienen una o más enzimas que utilizan oxígeno molecular para eliminar átomos de hidrógeno a partir de substratos orgánicos específicos (aquí designados como R) a través de una reacción oxidativa que produce peróxido de hidrógeno (H20 2): RH2 + 0 2 —» R + H20 2 La catalasa utiliza el H20 2 generado por otras enzimas del orgánulo para oxidar diversas substancias -com o fenoles, ácido fórmico, formaldehído, y alco h o l- mediante una reacción de “peroxidación”: H20 2 + R’H2 —» R’+ 2H20 . Este tipo de reacción oxidativa es particularmente importante en el hígado y en las células de riñón, cuyos peroxisomas destoxifican una gran variedad de m olécu las tóxicas que entran en la circulación. Casi la mitad del etanol que bebemos es oxidado a acetaldehído de esta manera. Además, cuando se acumula un exceso de H20 2 en la célula, la catalasa transforma H20 2 a H20 (2H20 2 —>2H20 + 0 2). Una de las funciones principales de las reacciones oxidativas realizadas en los peroxisomas es la hidrólisis de las moléculas de ácidos grasos. En un proceso
614
Capítulo 12: Compartimientos intracelulares y clasificación de proteínas
200 nm Figura 12-27 Electronm icrograffa de tres peroxisom as de una célula de hígado de rata. Las inclusiones paracristalinas electrodensas corresponden a la enzima urato oxidasa. (Por cortesía de Daniel S. Friend.)
Figura 1 2 -2 8 Electronm icrografías de dos tipos de peroxisomas encontrados en células vegetales. (A) P eroxisom a de las hojas, con un nú cleo p aracristalino, de una célula del m esófilo de un a h o ja de tab aco . Se cree que la estrech a asociació n del peroxisom a con el cloroplasto facilita el in tercam bio de m ateriales entre estos orgánulos d urante la fo torrespiración. (B) Peroxisom as de una célu la de un cotiled on alm acen ad o ra de lípidos, de un a sem illa de tom ate, 4 días después de germ inar. En este caso, los peroxisom as [glioxisomas) están asociad os con los cu erp os lipídicos en los que se alm acen an los lípidos, lo cual refleja el papel cen tral de estos glioxisom as en la m ovilización de los lípidos y en su utilización para glu coneogén esis d urante la germ inación de la sem illa. (A por cortesía de P.J. G ruber y E.H. N ew com b; B, por cortesía de S.E. F red erick y E.H. N ew com b.)
llamado p oxidación, las cadenas alquilo de los ácidos grasos son acortadas secuencialm ente en bloques de dos átomos de carbono que son convertidos en acetil CoA y exportados desde los peroxisomas al citosol para su reutilización en reacciones biosintéticas. La (3 oxidación en células de mamífero tiene lugar tanto en mitocondrias como en peroxisomas, sin embargo en levaduras y células vege tales esta importante reacción se encuentra exclusivamente en los peroxisomas. Los peroxisomas son orgánulos extraordinariamente diversos: en distintas células de un mismo organismo pueden contener incluso muy distintos tipos de enzimas. Tam bién pueden adaptarse de manera remarcable a condiciones cam biantes. Por ejemplo, las células de levadura que crecen con azúcar tienen peroxisomas pequeños, pero cuando crecen en metanol desarrollan grandes peroxisomas capaces de degradar ácidos grasos hasta acetil CoA por jn ed io de la (3 oxidación. En las plantas, los peroxisomas tienen funciones importantes. Se han estu diado intensam ente dos tipos muy diferentes. Un tipo de peroxisomas está pre sente en las hojas, donde cataliza la oxidación de un producto colateral de la re acción crucial que transforma el C 0 2 en carbohidratos (Figura 12-28A). Este proceso se denomina fotorrespiración porque utiliza 0 2 y libera C 0 2. El otro tipo de peroxisomas se halla presente en las semillas en germinación, donde desem-
Peroxisomas
615
peñan una función esencial transformando los ácidos grasos almacenados en los lípidos de las semillas en azúcares necesarios para el crecimiento de la planta joven. Dado que esta conversión de grasas en azúcares se realiza a través de una serie de reacciones conocidas como el ciclo del glioxilato, estos peroxisomas son tam bién denominados glioxisomas (Figura 12-28B). En el ciclo del glioxilato, dos moléculas de acetil CoA producidas por la degradación de un ácido graso en el peroxisoma, son utilizadas para fabricar ácido succínico, el cual sale del peroxisoma y es transformado en glucosa. El ciclo del glioxilato no tiene lugar en la cé lulas animales, y por ello los animales son incapaces de transformar los ácidos grasos en carbohidratos.
Una corta secuencia señal dirige la im portación de proteínas hacia los peroxisomas22 Una secuencia específica de tres aminoácidos localizada cerca del extremo carboxilo de muchas proteínas peroxisomales actúa como señal de importación (véase Tabla 12-3). Si esta secuencia se une experimentalmente a una proteína citosólica, la proteína es importada a los peroxisomas. La importancia de este proceso de importación y de los peroxisomas se pone dramáticamente de mani fiesto en la enfermedad hereditaria hum ana llamada el síndrome Zellweger, en el que un defecto en las proteínas de importación a los peroxisomas conduce a una deficiencia peroxisomal grave. Estos individuos, cuyas células presentan peroxisomas vacíos, tienen severas anomalías en el cerebro, hígado, y riñones, y mueren pronto después del nacim iento. Se ha demostrado que una forma de esta enfermedad es debida a una mutación en el gen que codifica una proteína integral de la m em brana de los peroxisomas, llamada factor-1 de ensam blaje de peroxisomas. Probablem ente los peroxisomas tienen al menos una proteína expuesta en su cara citosólica, que actúa como receptor que reconoce la señal de las proteí nas que se importan al orgánulo. Anteriormente se pensó que la “cubierta” m em branosa del peroxisoma se formaba por gemación desde el ER, mientras que el “contenido” era importado desde el citosol. No obstante, actualmente existen evidencias que sugieren que los peroxisomas siempre se forman a partir de otros peroxisomas preexistentes mediante el crecimiento y la fisión del orgá nulo, tal como se ha descrito previamente para las mitocondrias y plastos y para el propio ER (Figura 12-29).
Resumen Los peroxisomas están especializados en la realización de reacciones oxidativas que utilizan oxígeno molecular. Generan peróxido de hidrógeno, que es utilizado con fi nes oxidativos, y destruyen el exceso de peróxido de hidrógeno por medio de la catalasa que contienen. Como en el caso de las mitocondrias y de los cloroplastos, los peroxisomas son orgánulos autorreplicantes. Dado que no presentan ni DNA ni ribosomas, tienen que importar todas sus proteínas desde el citosol. Una secuencia específica de tres aminoácidos situada cerca del extremo carboxilo de muchas de estas proteínas actúa como una señal de importación peroxisomal.
perpxisom a proteína receptora específica que catal la im portación de proteínas
N ¿9 s
CRECIMIENTO POR CAPTACIÓN DE PROTEÍNAS CITOSÓLICAS ESPECÍFICAS
Figura 12-29 Modelo del proceso a través del cual se ensamblan los peroxisom as. La m em b ran a de los peroxisom as co n tien e proteínas recep to ras de im p ortación . Todas las proteínas peroxisom ales, incluyendo las nuevas cop ias del propio recep to r de im portación , están sintetizadas por los rib osom as cito sólicos y después son transportad as hasta el orgánulo. Así pues, los peroxisom as se form an ú n icam en te a partir de otros peroxisom as ya form ados, m ed ian te un p ro ceso de crecim ien to y fisión. P ro bablem en te los lípidos n ecesarios para form ar las nuevas m em b ranas peroxisom ales tam bién son im portad os. M ás ad elante explicarem os cóm o los lípidos fabricad os en el E R p ued en ser transportad os a través del citosol hasta los orgánulos.
616
Capítulo 12: Compartimientos intracelulares y clasificación de proteínas
peroxisom as hijos
El retículo endoplasmático23 Todas las células eucariotas tienen un retículo endoplasm ático (ER de Endo plasmic Reticulum). Su mem brana constituye normalmente más de la mitad del total de la m em brana de la célula (véase Tabla 12-2). Está organizado en forma de una red laberíntica de túbulos ramificados y de sáculos aplanados que se ex tiende por todo el citoplasma (Figura 12-30). Se cree que los túbulos y sáculos están interconectados, de modo que la mem brana del ER forma una lámina continua que define un único espacio interno. Este espacio, altamente intrinca do, se denomina el lum en del ER o tam bién el espacio de las vesículas del ER, y a menudo ocupa más del 10% del volumen celular total (véase Tabla 12-1). La membrana del ER separa el lumen del ER del citosol, y media la transferencia se lectiva de determinados compuestos entre estos dos compartimientos. El ER juega un papel central en la biosíntesis celular. Su membrana es el lu gar de producción de todas las proteínas transmembrana y lípidos de la mayoría de los orgánulos celulares, incluyendo el propio ER, el complejo de Golgi, los lisosomas, los endosomas, las vesículas secretoras y la membrana plasmática. La membrana del ER también contribuye de forma importante a la formación de las membranas de las mitocondrias y de los peroxisomas, ya que produce los lí pidos de estos orgánulos. Además, todas las proteínas que serán secretadas al exterior celular -y tam bién las que acabarán en el lumen del RE, en el complejo de Golgi o en los lisosom as- son inicialmente transportadas al lumen del ER.
Los ribosomas adheridos a las membranas definen el ER rugoso24 El ER extrae determinadas proteínas desde el citosol a medida que son sintetiza das. Estas proteínas son de dos tipos: (1) proteínas transmembrana, que sólo son parcialmente translocadas a través de la membrana del ER y que, por tanto, se mantienen incluidas en ella, y (2) proteínas solubles en agua, que son completa mente translocadas a través de la membrana del ER y liberadas al lumen. Algunas de las proteínas transmembrana se mantienen en el ER, pero muchas otras están destinadas a residir en la membrana plasmática o en la membrana de otro orgánulo, mientras que las proteínas solubles en agua están destinadas al lumen de un orgánulo o a ser segregadas. Todas estas proteínas, independientemente de su destino posterior, son dirigidas a la membrana del ER por el mismo tipo de péptido señal y translocadas a través de la membrana mediante el mismo mecanismo. En las células de mamífero la importación de proteínas al ER empieza antes de que la cadena polipeptídica se haya acabado de sintetizar -e s decir, tiene lugar a nivel cotraduccional. Este hecho diferencia este proceso del de la importación a las mitocondrias, a los cloroplastos, al núcleo, y a los peroxisomas, en los cuales la importación es post-traduccional y requiere diferentes tipos de péptidos se ñal. Dado que habitualmente un extremo de la proteína está translocado en el in terior del ER mientras el resto de la cadena polipeptídica se está fabricando, la F ig u ra 1 2 -3 0 El retículo endoplasmático. M icrografía flu o rescen te de u n a célu la cultivada de m am ífero, teñid a co n un anticu erpo que se un e a u n a p ro teín a reten id a en el ER. El ER se extiend e com o un a red por todo el cito p lasm a de la célula, de form a que todas las regiones del citosol se hallan cercan as a alguna p o rción de la m em b ran a del ER. (Por co rtesía de Hugh Pelham .)
10 pm El retículo endoplasmático
617
Figu ra 12-31 E l E R ru goso. E lectronm icrografía que m u estra el ER rugoso, el cual recib e su n om bre de los ribosom as que se hallan en la superficie citosólica. (Cortesía de L. Orci.)
I____________ I 0,2 pm
proteína nunca es liberada al citosol y por consiguiente no existe el peligro de que se pliegue antes de alcanzar el translocador de la membrana. Contrariamen te al caso de importación post-traduccional de proteínas hacia el interior de las mitocondrias y de los cloroplastos, en el caso de la importación de proteínas al ER las chaperoninas citosólicas no son necesarias para m antener a la proteína desplegada. El ribosoma que está sintetizando la proteína está unido directa mente a la m em brana del ER. Estos ribosomas unidos a membrana recubren la superficie de la m em brana del ER, dando lugar a las regiones llamadas retículo endoplasm ático rugoso (Figura 12-31). Por lo tanto, en el citosol existen dos poblaciones de ribosomas, separadas espacialmente. Los ribosom as unidos a m em brana, unidos a la cara citosólica de la mem brana del ER, se dedican a la síntesis de proteínas que simultánea mente se translocan al interior del ER. Los ribosom as libres, no unidos a ningu na membrana, fabrican todas las demás proteínas codificadas por el genoma nu clear. Los ribosomas unidos a mem brana y los ribosomas libres son estructural y funcionalmente idénticos. Difieren sólo en las proteínas que están fabricando en un momento dado. Cuando un ribosoma empieza a fabricar una proteína con un péptido señal para el ER, la propia señal dirige al ribosoma a la membrana del ER. Dado que muchos ribosomas pueden unirse simultáneamente a una misma molécula de mRNA, normalmente se forma un polirribosom a, el cual se une a la mem brana de ER a través de múltiples cadenas polipeptídicas en crecimiento (Figura 12-32). Cada uno de los ribosomas asociados con una molécula de mRNA de este tipo puede volver al citosol en cuanto termina la traducción, cerca del ex tremo 3 ’ de la molécula de mRNA. No obstante, el mRNA por sí mismo tiende a permanecer unido a la membrana del ER debido a la interacción de una pobla ción cam biante de ribosomas que se mantienen unidos a la membrana mediante un receptor ribosómico que los ayudan a mantenerse allí. Por el contrario, si una molécula de mRNA codifica una proteína que no tiene el péptido señal para el ER, el polirribosoma que forma permanece libre en el citosol y la proteína pro ducto de esta síntesis es liberada en el propio citosol. Por lo tanto, sólo se unen a las m embranas rugosas del ER las moléculas de mRNA que codifican proteínas que tienen un péptido señal para el ER; las moléculas de mRNA que codifican to das la demás proteínas, permanecen libres en el citosol. Se cree que cada riboso ma individual se mueve al azar entre estas dos poblaciones de moléculas de mRNA segregadas (Figura 12-33).
El ER liso es abundante en algunas células especializadas25 Las regiones del ER que carecen de ribosomas unidos se denominan retículo en doplasm ático liso, o ER liso. En una gran mayoría de células estas regiones son escasas, y sólo existe una pequeña región del ER que es parcialmente lisa y par-
618
Capítulo 12: Compartimientos intracelulares y clasificación de proteínas
i__________i ¿00 mVi
F ig u ra 1 2 -3 2 P o lirrib o so m a s. E lectronm icrografía de una secció n ultrafina de polirribosom as unidos a la m em b ran a del ER. En algunos lugares el plano de la secció n corta a través del ER en paralelo a la m em b ran a, dando un a visión del patrón en roseta de los p olirribosom as. (Por cortesía de G eorge Palade.)
los mRNA que codifican una proteína citosólica permanecen libres en el citosol >
polirribosom a libre en el citosol
acervo com ún de subumdades de ribosom a, en el citosol péptido señal de ER los m R N A que codifican proteínas que serán dirigidas hacia el % ER perm anecen unidos a Ia m em brana
polirribosom a unido a la m em brana del ER, a través de m últiples cadenas nacientes
m em brana del ER
F igu ra 1 2 -3 3 R ib o so m a s lib re s y u n id os a m e m b ra n a . T an to para sin tetizar las p ro teínas que p erm an ecerán en el cito sol com o para sin tetizar las que serán transportad as al ER, se utiliza el m ism a acervo de ribosom as. Lo que dirige al ribo so m a corresp on d ien te a la m em b ran a del ER es la p resen cia del p éptido señ al para ER en la cad en a polip ep tíd ica que se e stá sintetizand o. La m o lécu la de mRNA pu ed e p erm an ecer unid a al ER, form ando parte de un p olirribosom a, m ientras que los ribo so m as q u e se van d esplazando sob re ella son reciclados; al final de cad a ciclo de síntesis de protem a, las subun id ad es del ribosom a se liberan volviéndose a incorporar al acervo co m ú n del citosol.
cialmente rugosa. Esta región se denomina elem entos transicionales porque de ella emergen las vesículas que transportan proteínas y lípidos recién sintetizados hacia el complejo de Golgi. No obstante, en determinadas células especializadas el ER liso es abundante y tiene otras funciones. Concretamente, es particular mente predominante en células especializadas en el metabolismo lipídico. Por ejemplo, las células que sintetizan hormonas esteroideas a partir del colesterol tienen un ER liso muy amplio que contiene las enzimas necesarias para fabricar colesterol y para modificarlo dando lugar a las hormonas (véase Figura 12-34). El principal tipo celular del hígado, el hepatocito, nos proporciona otro ejemplo. Es el principal lugar de producción de partículas lipoproteicas para la exportación; estas partículas transportan los lípidos por la corriente sanguínea a otros lugares del organismo. Las enzimas que sintetizan los componentes lipidí eos de las lipoproteínas están localizadas en la membrana del ER liso, la cual tam bién contiene enzimas que catalizan una serie de reacciones que destoxifican las drogas liposolubles y compuestos producidos por el metabolismo que resultan perjudiciales. Las reacciones de destoxificación más estudiadas están ca talizadas por la familia de enzimas de la familia de la citocromo P450, las cuales catalizan una serie de reacciones sobre drogas solubles en lípidos o sobre metabolitos que de otro modo podrían acumularse a niveles tóxicos en las m embra nas celulares, y las convierten en moléculas suficientemente hidrosolubles como para abandonar la célula y ser secretadas por la orina. Puesto que el ER rugoso no puede albergar por sí mismo un número suficientemente elevado de éstas y de otras enzimas necesarias para estos procesos, una proporción importante de la membrana del hepatocito consiste normalmente en ER liso (Figura 12-35 y véa se Tabla 12-2). F ig u ra 1 2 -3 4 A b u n d an te E R liso e n u n a c é lu la se c re to ra d e h o rm o n a s e ste ro id ea s. E sta electronm icrog rafía es de una célu la de Leydig secreto ra de testo stero n a de los testícu los hu m anos.
El retículo endoplasmático
619
Figura 12-35 Reconstrucción tridimensional del ER rugoso y liso de una célula hepática. El ER rugoso form a ord enad os m o n ton es de cistern as planas, cada u n a de las cuales tien e un esp acio lum inal de en te 20 y 30 nm de ancho. La m em b ran a del ER liso está con e ctad a a estas cisternas y form a un a fina red de túbu los de en tre 30 y 60 n m de d iám etro. (De R.V. K rstic, U ltrastru ctu re o f the M am m alian Cell. New York: Springer-Verlag, 1979.)
Cuando la circulación recibe grandes cantidades de ciertos compuestos, ta les com o la droga fenobarbital, el hígado sintetiza en cantidades extraordinaria m ente elevadas las enzimas de destoxificación, y en unos cuantos días el ER liso duplica su área superficial. Tras la eliminación de la droga, el exceso de m em branas del ER liso parece eliminarse específicam ente a través de un proceso de pendiente de lisosomas llamado autofagocitosis (explicado en el Capítulo 13). Se desconoce cóm o se regulan estos espectaculares cambios. Otra función del ER en la mayoría de células eucariotas es la de secuestrar Ca2+ del citosol. La liberación de Ca2+ en el citosol a partir del ER, y su posterior recaptura, median muchas respuestas rápidas a las señales extracelulares, como se explica en el Capítulo 15. El almacenamiento de Ca2+ en el lumen del ER esta facilitado por las altas concentraciones de proteínas de unión a Ca2+ presentes en el ER. En algunos tipos celulares, quizás en la mayoría de ellos, existen regio nes específicas del ER especializadas en el almacenamiento de Ca2+. Por ejem plo, las células musculares tienen una abundante región especializada del ER liso, llamada retículo sarcoplasmático, la cual secuestra Ca2+ del citosol por m e dio de una ATPasa de Ca2+que bom bea Ca2+; la liberación de Ca2+ y la posterior recaptación del Ca2+ por el retículo sarcoplasmático median la contracción rápi da y la relajación de la miofibrillas durante cada ciclo de contracción muscular (explicado en el Capítulo 16). A continuación explicaremos las dos funciones más importantes del ER: la síntesis y modificación de proteínas, y la síntesis de lípidos.
Las regiones lisas del ER pueden separarse de las rugosas mediante centrifugación26 Para estudiar las funciones y las características bioquímicas del retículo endoplasmático, es necesario aislar su membrana. A primera vista, esto puede pare cer una tarea imposible ya que el ER está extraordinariamente entremezclado con otros com ponentes del citoplasma. Afortunadamente, cuando se rompen por homogeneización los tejidos o células, el ER se fragmenta en numerosas ve sículas pequeñas y cerradas (-100 nm de diámetro), denominadas m icrosom as, que resultan relativamente fáciles de purificar. Los microsomas derivados del ER rugoso están tapizados de ribosomas, y reciben el nombre de microsomas rugo sos. Los ribosomas se encuentran siempre en la superficie exterior de dichos m i crosomas, siendo su interior bioquím icam ente equivalente al espacio luminal del ER (Figura 12-36). Dado que pueden ser purificados en su forma funcional, los microsomas rugosos son especialmente útiles para el estudio de muchos procesos que realiza el ER rugoso. Para el bioquímico representan auténticas pe queñas versiones del ER rugoso, todavía capaces de sintetizar proteínas, glucosilar proteínas y sintetizar lípidos.
620
Capítulo 12: Compartimientos intracelulares y clasificación de proteínas
!AÍ
(0)
200 nm
200 nm
En estos homogenados también se encuentran muchas vesículas de tamaño similar al de los microsomas rugosos, pero sin ribosomas unidos a ellas. Estos microsomas lisos derivan en parte de porciones lisas del ER y en parte de frag mentos vesiculados de la membrana plasmática, del complejo de Golgi, de los endosomas y de las mitocondrias (la proporción depende del tipo de tejido de que se trate). Por consiguiente, mientras que los microsomas rugosos pueden ser equiparados a porciones rugosas del ER, los orígenes de los microsomas lisos no resultan fáciles de determinar. Una excepción importante la constituye el hí gado. Debido a las enormes cantidades de ER liso existentes en el hepatocito, la mayor parte de los microsomas lisos de los homogenados hepáticos derivan del ER liso. Como los ribosomas contienen grandes cantidades de RNA, los microsomas rugosos son más densos que los microsomas lisos. Por consiguiente, los microsomas rugosos pueden separarse de los demás mediante una centrifugación en equilibrio (Figura 12-37). Cuando se comparan propiedades tales como la activi dad enzimàtica o la composición polipeptídica de los microsomas rugosos con las de los lisos obtenidos de un tejido como el hígado, se observa que son nota blem ente similares, aunque no idénticas: aparentemente la mayoría de los com ponentes de la membrana del ER pueden difundir libremente entre las regiones rugosa y lisa de la membrana, tal como cabría esperar de un sistema de flujo continuo de membrana. No obstante, los microsomas rugosos presentan más de 20 proteínas que no están presentes en los microsomas lisos, demostrando que debe de existir algún mecanismo restrictivo para un conjunto de proteínas de la
F igu ra 1 2 -3 6 E le c tro n m ic ro g ra fía s d e rib o so m a s. C uando se rom pen célu las por h o m og en eizació n , las cistern as del ER rugoso (A) se fragm entan form ando p equ eñ as vesículas cerrad as, d en o m inad as microsomas rugosos (B). D e form a sim ilar, el ER liso se fragm enta form ando p equ eñ as vesículas que c arecen de ribosom as, y qu e se d en o m in an microsomas lisos. (A, cortesía de D aniel S. Friend; B, cortesía de George Palade.)
ER rugoso
Figu ra 1 2 -3 7 P ro ce d im ie n to d e a isla m ie n to u tilizad o p a ra p u rific a r m ic ro so m a s ru g o so s y liso s a p a rtir d el ER. C uando los dos tipos de m icrosom as se sed im en tan hasta el equilibrio a través de un gradiente de sacarosa, se sep ararán uno de otro en b ase a sus d iferentes densidades.
O0 O
o ° o ;:oO O -
A°00 Y o 0
m icrosom as lisos y m icrosom as rugosos
los m icrosomas lisos tienen m enor densidad, o por lo que dejan de sedim entar y flotan a o ° ° ? ° concentraciones menores de sacarosa
centri fugación o o
O OO
oo
o o o
los m icrosomas rugosos tienen una elevada densidad, por lo que dejan de sedim entar y flotan a concentraciones de sacarosa elevadas
tubo con un gradiente de concentraciones crecientes de sacarosa
El retículo endoplasmático
621
subum dades r ib o s ó m ic a s lib r e s
p r o te ín a r e c e p to r a a s o c ia d a a u n p o r o
mRNA
CITOSOL
péptido señal en la cadena polipeptídica en crecimiento
COOH
ELIMINACIÓN DEL PÉPTIDO SEÑAL
LUMEN DEL ER cadena 1 polipeptídica madura
membrana del ER. Algunas de las proteínas de este conjunto ayudan a mantener unidos los ribosomas al ER rugoso, mientras que otras posiblemente producen la forma aplanada de esta parte del ER (véase Figura 12-35). No está claro si estas proteínas de m em brana son retenidas formando grandes agregados bidimensionales en la bicapa lipídica o por el contrario son mantenidas en su lugar median te interacciones con una red de proteínas estructurales en una u otra cara de la m em brana del ER.
Los péptidos señal fueron descubiertos por primera vez en proteínas importadas al ER27 Los péptidos señal (y con ellos la estrategia basada en la utilización de un péptido señal para dirigir el transporte de proteínas) fueron descubiertos por primera vez, a principios de los años 70, en proteínas de secreción que son translocadas a través de la m em brana del ER com o primer paso hacia su final descarga de la célula. En el experimento clave el mRNA codificante de una proteína de secre ción fue traducido mediante ribosomas in vitro. Cuando de este sistema libre de células se omitían los microsomas, la proteína sintetizada era ligeramente m a yor que la proteína normal secretada; esta longitud extra era debida a la presen cia de un péptido líder amino terminal. No obstante, en presencia de microso mas derivados del retículo endoplasmático rugoso se producía una proteína de tamaño correcto. Estos resultados fueron explicados mediante la hipótesis de la señal, la cual postulaba que la secuencia líder actúa de péptido señal dirigiendo la proteína de secreción hacia la membrana del ER; una vez en ella y antes de que la cadena polipeptídica esté completa, el péptido es hidrolizado por una peptidasa de señal de la m em brana del ER (Figura 12-38). De acuerdo con la hipótesis de la señal, la proteína secretada ha de ser em pujada al lumen del microsoma durante su síntesis in vitro. Esto puede ser de mostrado mediante un tratamiento con proteasas: una proteína recién sintetiza da fabricada en ausencia de microsomas es degradada al añadir una proteasa, mientras que la misma proteína pero fabricada en presencia de microsomas permanece intacta, a consecuencia de la protección que le proporciona la m em brana microsomal. Cuando en un sistema in vitro similar a éste se traducen pro teínas que carecen de péptido señal, estas proteínas no son importadas a los mi crosom as y por lo tanto permanecen susceptibles al tratamiento con proteasas. La hipótesis de la señal ha sido comprobada cuidadosamente mediante ex perimentos genéticos y bioquímicos, y puede aplicarse tanto a células vegetales
622
Capítulo 12: Compartimientos intracelulares y clasificación de proteínas
Figura 12-38 La hipótesis señal original. Visión simplificada de la translocación de una proteína a través de la membrana del ER, tal com o se propuso originalmente. Cuando el péptido señal emerge del ribosoma, dirige al ribosoma hacia un receptor proteico de la m embrana del ER. Se postula que a medida que va siendo sintetizado, el polipéptido se va translocando a través de la membrana del ER rugoso, atravesando un poro proteico asociado con el receptor. El péptido señal es eliminado durante el proceso de traducción y la proteína madura es liberada al lumen del ER inmediatamente después de ser sintetizada. En la actualidad sabemos que en términos generales la hipótesis es correcta, pero además de los com ponentes que se muestran en esta figura, son necesarios otros. Por ejemplo, la peptidasa de señal es un com plejo formado por cinco diferentes cadenas polipeptídicas unidas a la membrana, con un com plejo aparentemente asociado con cada poro de translocación.
como animales, a translocaciones proteicas a través de membranas plasmáticas de procariotas y, como hemos visto, a las membranas de mitocondrias, cloroplastos y peroxisomas. Además, los péptidos líder amino terminales guían no sólo las proteínas de secreción sino también los precursores de todas las proteí nas fabricadas en el ER, incluyendo las proteínas solubles y las proteínas de membrana. La función de señalización de estos péptidos líder ha sido demostra da directamente mediante la utilización de técnicas de DNA recombinante, uniendo secuencias señal a proteínas que normalmente no las presentan; las proteínas de fusión resultantes son dirigidas al ER. Los sistemas libres de células en los que se produce transporte de proteínas han proporcionado poderosos procedimientos de ensayo para identificar, puri ficar y estudiar los diversos com ponentes de la maquinaria molecular responsa ble del proceso de importación de proteínas al ER.
Una partícula de reconocimiento de señal (SRP) dirige los péptidos señal para el ER a un receptor específico de la membrana del ER28 El péptido señal es dirigido a la membrana del ER por lo menos mediante dos componentes: una partícula de reconocimiento de la señal (SRP, de Signal-Recognition Particle”), que se une al péptido señal y viaja de forma cíclica entre la membrana del ER y el citosol, y un receptor de SRP, también conocido como pro teína desembarcadero (docking), presente en la membrana del ER. La SRP fue descubierta al observarse que lavando microsomas con solución salina se elimi naba su capacidad de importar proteínas de secreción. Esta capacidad de impor tación puede restablecerse añadiendo a la preparación de microsomas el sobre nadante que contiene el extracto salino. A partir de este extracto se purificó el “factor de translocación” y se determinó que era una partícula compleja formada por seis cadenas polipeptídicas unidas a una pequeña molécula de RNA (Figura 12-39). La SRP y el receptor de SRP están presentes en todas las células eucariotas y también posiblemente en las células procariotas. A medida que el péptido va emergiendo del ribosoma, la SRP se va uniendo al péptido señal. Esto provoca una pausa en la síntesis proteica, lo que posible mente da al ribosoma tiempo suficiente para unirse a la membrana del ER antes de que se complete la síntesis de la cadena polipeptídica, asegurando así que la proteína no se liberará al citosol. Esto puede proporcionar un mecanismo de se guridad ya que muchas proteínas de secreción y proteínas lisosomales son hidrolasas que pueden provocar estragos en el citosol. Las células que secretan grandes cantidades de hidrolasas toman la precaución añadida de disponer de altas concentraciones de inhibidores de hidrolasas en su citosol. Una vez formado, el complejo ribosoma-SRP se une al receptor de SRP, el cual es una proteína integral de membrana expuesta en la superficie citosólica de la mem brana del ER rugoso. Entonces la SRP es liberada, y un aparato de translocación todavía poco caracterizado transfiere la cadena polipeptídica na ciente a través de la mem brana (Figura 12-40). Dado que una de las proteínas SRP y ambas cadenas del receptor de SRP contienen dominios de unión a GTP, se cree que los cambios conformacionales que tienen lugar durante los ciclos de unión de GTP e hidrólisis (explicado en el Capítulo 5) aseguran que la liberación de la SRP tenga lugar sólo después de que el ribosoma se haya acoplado correc tam ente con el aparato de translocación en la membrana del ER.
La translocación a través de la membrana del ER no siempre requiere que se esté produciendo el crecimiento de la cadena polipeptídica29 Como hemos visto, la translocación de proteínas al interior de las mitocondrias, de los cloroplastos y de los peroxisomas es post-traduccional, es decir que se produce después de que la proteína haya sido sintetizada completamente y se haya liberado al citosol, mientras que normalmente la translocación a través de
El retículo endoplasmático
SRP RNA
dominio de reconocimiento del péptido señal
dominio de paro de la traducción lugar de unión SRP-receptor 25 nm
Figura 12-39 Dibujo muy esquem ático de la partícula de reconocim iento de la señal (SRP). Una SRP es un com plejo alargado que contiene seis subunidades proteicas y una molécula de RNA (SRP RNA). Un extremo de la SRP se une a un péptido señal de la cadena polipeptídica en crecim iento, mientras que el otro extremo se une al ribosoma y frena la traducción. El RNA de la partícula puede interactuar con el RNA ribosómica. (Adaptado de V. Siegel y P. Walter, N atu re 320:82-84, 1986.)
623
partícula de reconocimiento de la señal (SRP) SRP DESPLAZADA Y RECICLADA
mRNA tRNA
LA UNION DE LA SRP CAUSA UNA PAUSA EN LA TRADUCCIÓN
LA SRP UNIDA AL IBOSOMA SE UNE AL RECEPTOR DE SRP DE LA MEMBRANA DEL ER SELECTIVAMENTE!
/ CONTINÚA LA i TRADUCCIÓN Y \ EMPIEZA LA TRANSLOCACIÓN
I
CITOSOL péptido señal en la cadena polipeptídica naciente LUMEN DELER receptor ribosómico
translocador proteico
proteína receptora de la SRP en la membrana del ER rugoso
Figura 12 -40 De qué form a los péptidos señal y la SRP dirigen los ribosomas a la m em brana del ER. Se cree que la SRP y el receptor de SRP actúan de forma concertada. La SRP se une al péptido señal que se halla expuesto y al ribosoma, induciendo una pausa en la traducción. El receptor de SRP de la membrana del ER, que está formado por dos cadenas polipeptídicas, une el com plejo SRP-ribosoma. A través de una com pleja reacción todavía muy poco conocida que implica múltiples proteínas de unión a GTP, la SRP es liberada dejando al ribosoma sobre la m embrana del ER. Entonces un aparato de translocación de la membrana del ER formado por varias subunidades proteicas inserta la cadena polipeptídica en la m em brana y la transfiere a través de la bicapa lipídica.
la m em brana del ER sucede durante la traducción (es decir, es cotraduccional). Esto explica por qué los ribosomas se unen a la membrana del ER pero no a la cara citoplasm ática de otros orgánulos. Un ribosoma unido al ER rugoso puede utilizar la energía de la síntesis proteica para forzar a la cadena polipeptídica en crecim iento a través del canal formado por el translocador en la membrana del ER. No obstante, estudios recientes de translocación in vitro en el ER han de mostrado que una pequeña minoría de determinados precursores proteicos pueden ser importados al interior del ER después de que se haya terminado su síntesis, demostrando así que la translocación no siempre requiere de la traduc ción continua. La translocación proteica post-traduccional puede tener lugar in cluso de modo más frecuente a través de la membrana del ER en células de leva duras y a través de la m em brana plasmática bacteriana (la cual se cree está evolutivamente relacionada con el ER; véase Figura 12-5). En ambos casos la translocación requiere hidrólisis de ATP, y en bacterias también es necesario un gradiente electroquímico. A partir de com ponentes bacterianos se ha reconsti tuido un aparato de translocación; uno de estos componentes es una ATPasa que se cree que ayuda a ensartar la proteína en la membrana (Figura 12-41). Dado que las proteínas que utilizan una ruta de translocación post-traduccional son liberadas primero en el citosol, su plegamiento se evita mediante su unión a proteínas chaperonas citosólicas, tal como hemos visto que sucede en la impor tación post-traduccional hacia el interior de mitocondrias y cloroplastos.
La cadena polipeptídica pasa a través de un poro acuoso en el aparato de translocación30 Durante mucho tiempo se ha discutido si las cadenas polipeptídicas son transfe ridas a través de la mem brana del ER, en contacto directo con la bicapa lipídica o a través de un poro de un translocador proteico. En la actualidad existen fuer tes evidencias de la existencia de un translocador proteico. Normalmente, el
624
Capítulo 12: Compartimientos intracelulares y clasificación de proteínas
COOH
COOH COOH
LUMEN c o m p le jo d e tr a n s lo c a c ió n im p u ls a d o p o r e n e rg ía
Figura 12-41 Translocación de una proteína a través de la m em brana plasm ática bacteriana. En este modelo esquemático, después de que un receptor del aparato de translocación se haya unido al péptido señal amino terminal de una proteína, un translocador proteico impulsado por energía empuja la proteína a través de la membrana, desplegando la cadena polipeptídica durante el proceso. La energía es proporcionada por la hidrólisis de ATP y por un gradiente electroquímico a través de la membrana.
poro del translocador está tapado con la cadena polipeptídica que está en trán sito a través de la membrana. Sin embargo, cuando experimentalmente las cade nas nacientes se liberan de los ribosomas mediante la droga puromicina, los po ros pueden ser detectados mediante corrientes iónicas que fluyen a través suyo. A pesar de que los poros son lo suficientemente grandes para permitir el paso de una cadena polipeptídica desplegada, se cierran cuando el ribosoma es elimina do de la mem brana (Figura 12-42). Por lo tanto el poro parece ser una estructura dinámica, abriéndose cuando un ribosoma con una cadena polipeptídica na ciente se une a la mem brana y cerrándose cuando el ribosoma se libera después de que la síntesis de la proteína haya finalizado.
El péptido señal del ER es eliminado de la mayoría de proteínas solubles después de la translocación31 Hemos visto que en los cloroplastos y en las mitocondrias los péptidos señal son eliminados de las proteínas precursoras después de cruzar la membrana. De modo parecido, los péptidos amino terminales señal para el ER son eliminados mediante una peptidasa señal situada en la cara luminal de la membrana del ER. Sin embargo, el péptido por sí mismo no es suficiente para que se produzca la hidrólisis de la señal por la peptidasa: se requiere un punto de hidrólisis adya cente que es reconocido por la peptidasa. Más adelante veremos que los pépti dos señal del ER no se encuentran en el extremo amino terminal sino en el inte rior de la cadena polipeptídica, no presentan estos puntos de reconocimiento y nunca son eliminados. Por el contrario, sirven para retener proteínas transm em brana en la bicapa lipídica después de que se ha terminado el proceso de trans locación. El péptido amino terminal señal para el ER de una proteína soluble tiene por sí mismo dos funciones de señalización: además de dirigir la proteína a la membrana del ER, se cree que actúa como señal de inicio de transferencia, per maneciendo unido al aparato de translocación, mientras que el resto de la pro-
EXPERIMENTAL
CONTROL LOS IONES NO PUEDE PASAR A TRAVÉS DEL TRANSLOCADOR PROTEICO
LOS IONES PASAN LIBREMENTE A TRAVÉS DEL TRANSLOCADOR PROTEICO CITOSOL
LUMEN t r a n s lo c a d o r p r o te ic o
El retículo endoplasmático
la p u r o m ic in a lib e r a la c a d e n a p o lip e p tíd ic a d e l r ib o s o m a
Figura 12-42 Dem ostración de la existencia de poros acuosos de translocación proteica en la m em brana del ER. El diseño experimental es similar al mostrado en la Figura 10-5, con una bicapa lipídica que separa dos com partimientos acuosos. Cuando se añaden microsomas rugosos a uno de los compartimientos, ocasionalm ente se fusionan con la bicapa lipídica incorporando una porción de la m em brana del ER (con ribosomas) a la bicapa. Cuando se añade la droga puromicina (en a z u l oscu ro) a este mismo compartimiento, se une covalentemente al extremo carboxilo terminal de la cadena polipeptídica y la libera del ribosoma; en estas condiciones se pueden detectar poros de tamaño uniforme debido a increm entos puntuales en la conductancia eléctrica a través de la membrana (el flujo iónico responsable del incremento en la conductancia eléctrica se indica con la fle c h a a m a rilla). Si los ribosomas se eliminan de la membrana mediante lavados con soluciones de concentración elevada de una sal, los poros no se detectan, lo cual indica que la unión de los ribosomas son necesarios para abrir (o ensamblar) el poro (no se muestra).
625
CITOSOL
LUMEN tr a n s lo c a d o r p r o t e ic o in a c tiv o
t r a n s lo c a d o r p r o t e ic o a c t iv o
COOH
COOH LA PEPTIDASA DE SEÑAL LIBERA LA PROTEÍNA MADURA AL INTERIOR DEL LUMEN DEL ER
teína va atravesando la membrana y formando un gran bucle en el lumen del ER. Una vez que el extremo carboxilo ha pasado a través de la membrana, el péptido señal es liberado del poro de translocación, hidrolizado por la peptidasa de señal, y rápidamente degradado hasta aminoácidos mediante otras proteasas del ER, mientras que la proteína es liberada al interior del lumen del ER (Figura 12-43).
En las proteínas transmembrana de un solo paso, un péptido señal interno permanece en la bicapa lipídica como una hélice a que atraviesa la membrana32 El proceso de translocación de las proteínas destinadas a permanecer en la membrana es más com plejo que el de las proteínas solubles, ya que algunas zo nas de la cadena polipeptídica son translocadas a través de la bicapa lipídica mientras que otras no lo son. Sin embargo, todos los tipos de inserción de las proteínas de mem brana pueden ser consideradas como variantes de la secuen cia de fenóm enos que acabam os de describir para la transferencia de proteínas solubles en la luz del ER. Empezaremos describiendo las tres vías a través de las cuales las proteínas transm em brana de paso único (véase Figura 10-13) son in sertadas en el ER. En el caso más simple, un péptido señal amino terminal inicia la transloca ción igual que para el caso de una proteína soluble, pero un segmento adicional hidrofóbico de la cadena polipeptídica frena el proceso de transferencia antes de que toda la cadena polipeptídica se haya translocado. Este péptido de paro de transferencia ancla la proteína en la membrana después de que el péptido señal del ER (iniciador de transferencia) sea liberado del translocador y eliminado (Figu ra 12-44). El péptido de paro de transferencia forma un solo segmento a helicoidal que atraviesa la membrana, con el extremo amino terminal de la proteína en la cara luminal de la membrana y el extremo carboxilo en la cara citosólica. En los otros dos casos el péptido señal no se hallará en el extremo amino terminal de la proteína sino que es interno. Al igual que los péptidos señal am i no terminales, el péptido señal interno es reconocido por la SRP, la cual sirve de puente entre el ribosoma que fabrica la proteína y la membrana del ER y actúa como señal de inicio de transferencia que empieza la translocación de la proteí na. Después de liberarse del translocador, el péptido interno de inicio de trans-
626
Capítulo 12: Compartimientos intracelulares y clasificación de proteínas
Figura 12-43 Translocación de una proteína soluble a través de la m em brana del ER. En este modelo hipotético se postula que el translocador proteico de la membrana puede estar en dos estados alternativos -activo e inactivo. Cuando se une un péptido señal para el ER (que actúa como iniciador de la transferencia) el translocador adopta un estado activo y comienza a transferir la cadena polipeptídica a través de la m embrana lipídica, como un bucle. Es este estado forma un poro acuoso a través de la m em brana que puede ser detectado electrofisiológicamente si la cadena polipeptídica es liberada (véase Figura 12-42). Cuando la proteína ha sido translocada com pletamente, el translocador revierte a una conform ación inactiva que ya no puede conducir iones a través de la membrana, pero que está abierto a la bicapa lipídica, permitiendo que el péptido señal hidrofóbico difunda hacia el exterior de la bicapa, donde es rápidamente degradado. Para mayor claridad, en ésta y en las dos figuras siguientes los ribosomas se han omitido del dibujo.
lugar de unión del lugar de unión del péptido hidrofóbico péptido hidrofóbico de paro de de inicio de i transferencia_______ transferencia ¡ proteína translocadora
Figura 12-44 Cómo se integra en la m em brana del ER una proteína transm em brana de un solo paso con un péptido señal cortado. En este modelo hipotético el proceso de translocación cotranslocación se inicia por un péptido señal amino terminal de ER {rojo) que actúa com o una señal de inicio de transferencia, com o en la Figura 12-43. Sin embargo, además del péptido de inicio de transferencia la proteína contiene un péptido de paro de transferencia (n aran ja). Cuando el proteína madura péptido señal de paro de transferencia en la membrana entra en el translocador e interactúa del ER con un lugar de unión determinado, el NH2 translocador pasa a su estado inactivo y descarga la proteína lateralmente en la bicapa lipídica.
ferencia permanece en la bicapa lipídica como una hélice a que atraviesa la membrana. Sin embargo los péptidos internos de inicio de transferencia se pue den unir al aparato de translocación en cualquiera de las dos direcciones, y la orientación del péptido de inicio de transferencia insertado determina, a su vez, qué segmento proteico (el que precede o el que sigue al péptido de inicio de transferencia) se desplazará a través de la membrana hacia el lumen del ER. En un caso la proteína de membrana resultante tendrá su extremo carboxilo en la cara luminal (Figura 12-45A) mientras que en el otro en el lado luminal estará su extremo amino (Figura 12-45B). La orientación del péptido de inicio de transfe rencia depende de la distribución de los aminoácidos cargados vecinos, tal como se describe en el pie de la figura.
Combinaciones de señales de inicio y de paro de transferencia determinan la topología de las proteínas transmembrana de multipaso33 En las proteínas transm em brana de multipaso la cadena polipeptídica atravie sa repetidamente, de una parte a otra, la bicapa lipídica (véase Figura 10-13). Se cree que en estas proteínas un péptido señal interno actúa como señal de inicio de transferencia iniciando la translocación, la cual continúa hasta que se alcan za un péptido de paro de transferencia. En las proteínas de doble paso, por ejemplo, el polipéptido se libera de la bicapa en este estadio (Figura 12-46). Las proteínas multipaso más complejas, en las cuales existen muchas hélices a hidrofóbicas que atraviesan la bicapa, un segundo péptido de inicio de transferen cia reinicia la translocación de la cadena, la cual se produce hasta que se alcanza el siguiente péptido de final de transferencia, y así sucesivamente para posterio res péptidos de inicio y de paro de transferencia (Figura 12-47). Una secuencia señal hidrofóbica determinada actuará como un péptido de inicio o de paro dependiendo de su localización en la cadena polipeptídica, ya que se puede cam biar su función si se modifica su localización en la proteína utilizando técnicas de DNA recombinante. Así la distinción entre péptidos de inicio y de paro de transferencia depende, fundamentalmente, del orden en el que se suceden en la cadena polipeptídica naciente. Parece que la SRP empieza buscando los segmentos hidrofóbicos de la cadena polipeptídica desplegada empezando por su extremo amino terminal, y va progresando hacia el extremo carboxilo terminal, en la misma dirección en la que se sintetiza la proteína. La SRP reconoce el primer segmento apropiado y por lo tanto fija la “pauta de lectu ra”: si se ha iniciado la translocación, el próximo segmento hidrofóbico adecúa -
El retículo endoplasmático
627
péptido interno de inicio de transferencia CITOSOL
LUMEN
COOH
proteina madura en la membrana del ER
COOH la secuencia señal se inserta en dirección opuesta
CITOSOL
LUMEN
proteina madura la membrana del
do será reconocido com o un péptido de paro de transferencia, lo cual originará que la región de la cadena polipeptídica comprendida entre ambos segmentos hidrofóbicos resulte ensartada a través de la membrana. Un proceso similar de búsqueda continúa hasta que todas las regiones hidrofóbicas de la proteína se insertan en la membrana. Puesto que las proteínas de mem brana siempre son insertadas a partir de la cara citosólica del ER y siguiendo este sistema programado, todas las copias de la misma cadena polipeptídica tendrán la misma orientación general en la bicapa. Esto gene'ra una m em brana del ER asimétrica en la que los dominios de pro teína expuestos en una cara son diferentes de los que están expuestos en la otra. Esta asimetría se mantiene durante los diversos procesos de gemación y fusión de mem brana que se producen al transportar las proteínas fabricadas en el ER a otras membranas celulares (explicado en el Capítulo 13). Por lo tanto la vía por la cual una proteína recién sintetizada es insertada en la membrana del ER de termina la orientación de la proteína tam bién en otras membranas. Cuando en el laboratorio se disocian proteínas de una membrana y se re constituyen en vesículas lipídicas artificiales, generalmente se obtiene una mez cla al azar de orientaciones dentro-fuera de las proteínas. Por ello, parece que la asimetría de las proteínas que se observa en las membranas celulares no es debi da a las propiedades inherentes de la proteína sino que es el resultado del proce so por el que las proteínas son insertadas en la membrana del ER desde el cito-
628
Capítulo 12 : Compartimientos intracelulares y clasificación de proteínas
Figura 12-45 Cómo una proteína transm em brana de un solo paso con un péptido señal interno se integra en la m em brana del ER. En este modelo hipotético un péptido señal ER interno que actúa como señal de inicio de transferencia se une al translocador de tal forma que su extremo cargado más positivamente perm anece en el citosol. Si en la cadena existen más aminoácidos cargados positivamente inmediatamente antes del núcleo hidrofóbico del péptido de inicio de transferencia de los que hay después de él, en el extremo carboxilo terminal, el péptido de inicio de transferencia se inserta en el translocador en la orientación mostrada en (A) y el brazo carboxilo terminal del bucle insertado se desliza a través de la membrana. Sin embargo, si existen más aminoácidos cargados positivamente inmediatamente después del núcleo hidrofóbico del péptido de inicio de transferencia de los que hay antes de él, en su extremo amino terminal, el péptido de inicio de transferencia se inserta en el translocador en la orientación mostrada en (B), y será el brazo amino terminal del bucle insertado el que se deslizará a través de la membrana. Debido a que la translocación no puede iniciarse antes de que salga del ribosoma una secuencia de inicio de translocación, la translocación de la porción amino terminal de la proteína mostrada en (B) solamente puede ocurrir después de que se haya sintetizado com pletam ente esta secuencia. Nótese que existen dos caminos para insertar una proteína transm em brana de un solo paso cuyos aminoácidos amino terminales se localicen en el lumen del ER: el que se muestra en la Figura 12-44 y el que se muestra aquí.
COOH
péptido de paro de transferencia
NH2
péptido de inicio de transferencia
CITOSOL
Figura 12-46 Cómo se integra en la m em brana del ER una proteína de doble paso con una secuencia señal interna. En este modelo hipotético un péptido señal para el ER interno actúa como una señal de inicio de transferencia (como en la Figura 1245) e inicia la transferencia del brazo carboxilo terminal de la cadena polipeptídica. Cuando entra en el translocador un péptido señal de paro de transferencia, descarga lateralmente la proteína en la m embrana.
LUMEN
proteina madura de doble paso a través de la membrana
Las cadenas polipeptídicas translocadas se pliegan y se ensamblan en el lumen del ER rugoso34 Muchas de las proteínas presentes el lumen del ER solamente están en tránsito, en ruta hacia otros destinos; sin embrago, otras residen normalm ente en el ER y se hallan en elevadas concentraciones. Estas proteínas residentes del ER pre sentan en su extremo carboxilo terminal una señal de retención del ER, de cua tro aminoácidos, que es responsable de que la proteína quede retenida en el ER (véase Tabla 12-3). Algunas de estas proteínas actúan como catalizadores que ayudan a otras muchas proteínas que son translocadas al ER a plegarse y a en samblarse de forma correcta. Una de estas proteínas residentes del ER es la pro teína disulfuro isomerasa (PDI), la cual cataliza la oxidación de los grupos sulfhidrilo libres (SH) formando enlaces disulfuro (S-S). La mayoría de los residuos cisteína de los dominios proteicos expuestos al espacio extracelular o al lumen de los orgánulos están unidos por puentes disulfuro. Sin embargo, los enlaces disulfuro no se forman en los dominios expuestos al citosol debido al ambiente reductor de este ambiente.
COOH CITOSOL
LUMEN
100
200
número de aminoácidos
(A)
(C)
1M-COOH
H2N(B)
J
inicio
L
El retículo endoplasmático
paro
inicio
paro
paro
Figura 12-47 Inserción de la proteína multipaso de m em brana rodopsina en la m em brana del ER. La rodopsina es la proteína sensible a la luz de los fotorreceptores de las células en bastón de la retina de los mamíferos. (A) Un gráfico de hidrofobicidad identifica siete cortas regiones hidrofóbicas en la rodopsina. (B) La región amino terminal actúa como péptido de inicio de transferencia, responsable de que la región amino terminal anterior atraviese la m em brana del ER. Los péptidos hidrofóbicos siguientes actuarán alternativamente de inicio de transferencia y de paro de transferencia. (C) La rodopsina madura, una vez integrada, tiene su extremo amino terminal localizado en el lumen del ER y su extremo amino terminal localizado en el citosol. Los h ex ág on os azu les representan oligosacáridos unidos covalentemente.
629
Otra proteina residente del ER es una proteína chaperona conocida como proteína de unión (BiP, de binding protein), que estructuralmente está relacio nada con las proteínas hsp70, y como ellas reconoce proteínas plegadas incorrec tamente, y también subunidades proteicas que no han sido ensambladas en sus complejos oligoméricos finales. Se cree que BiP, al igual que otras proteínas chaperonas, se une a secuencias de aminoácidos expuestos que normalmente están escondidos en el interior de las cadenas polipeptídicas que están correctamente plegadas o ensambladas. Cuando BiP se ha unido evita la agregación de las pro teínas y ayuda a m antener las proteínas en el ER (y por tanto fuera del complejo de Golgi y de otras etapas posteriores de la ruta se secreción); también ayuda a que las proteínas se plieguen correctamente. Como en el caso de las proteínas de la familia hsp70, las cuales unen proteínas no plegadas en el citosol y facilitan su importación hacia las mitocondrias y hacia los cloroplastos, la proteína BiP hidroliza ATP para obtener la energía necesaria para plegar las proteínas. Como hemos visto anteriormente para la hsp70 mitocondrial (véase Figura 12-24), la unión de BiP a una cadena polipeptídica que está emergiendo en el lu men del ER puede ayudar a estirar la proteína hacia el interior del ER. Este proce so puede ser particularmente importante en proteínas que entran en el ER tras su traducción, ya que en este caso no existen ribosomas unidos a la membrana que empujen a la proteína naciente a través del translocador durante su síntesis.
COOH
1i
cadena lateral de asparagina
La mayoría de proteínas sintetizadas en el ER rugoso son glucosiladas por la adición de un iV-oligosacárido com ún35 La adición covalente de azúcares a las proteínas es una de las principales funcio nes biosintéticas del ER. La mayoría de las proteínas solubles y unidas a la m em brana que son fabricadas en el lumen del ER, incluyendo las destinadas a ser transportadas al com plejo de Golgi, a los lisosomas, a la membrana plasmática o al espacio extracelular, son glucoproteínas. Por el contrario, muy pocas proteí nas del citosol están glucosiladas, y las que lo están contienen una modificación de azúcares muy simple: la adición de un grupo Af-acetilglucosamina a un resi duo serina o treonina de la proteína. Un avance importante en la comprensión del proceso de glucosilación pro teica fue el descubrimiento de que en el ER se transfiere en bloque a las proteínas un oligosacárido preformado (compuesto de Af-acetilglucosamina, manosa y glu cosa y conteniendo un total de 14 residuos de azúcar). Dado que este oligosacárido siempre es transferido al grupo NH2 de la cadena lateral de un residuo de asparagina, se le denomina N-oligosacárido (N-linked) o unido a asparagina (Figura 12-48). La transferencia está catalizada por una enzima, una transferasa de oligo sacárido que se halla unida a la membrana, y cuyo lugar activo está expuesto a la superficie luminal de la mem brana del ER, lo cual explica por qué las proteínas citosólicas no son glucosiladas de esta manera. El oligosacárido precursor se mantiene en la m em brana del ER mediante una molécula lipidica especial lla mada dolicol y es transferido a la asparagina diana a través de una sola etapa en zimàtica inm ediatamente después de que este aminoácido aparezca en el lumen del ER durante la translocación de la proteína (Figura 12-49). Dado que muchas proteínas son importadas al ER de forma cotraduccional, casi siempre los 7V-oligosacáridos son añadidos durante la síntesis proteica. El oligosacárido precursor unido a lípido se une al dolicol mediante un enla ce fosfato de alta energía, el cual proporciona la energía de activación necesaria para la reacción de glucosilación ilustrada en la Figura 12-49. El oligosacárido se va construyendo antes de ser transferido a la proteína, azúcar a azúcar, unido a esta molécula de lípido que, a su vez, está unido a la membrana. Los azúcares son activados primero en el citosol mediante la formación de intermediarios azúcar-nucleótido, que ceden su azúcar (directa o indirectamente) al lípido, si guiendo una secuencia ordenada. En parte a través de este proceso, el oligosacá rido unido al lípido es translocado desde la cara citosólica a la luminal de la m em brana del ER (Figura 12-50).
630
Capítulo 12 : Compartimientos intracelulares y clasificación de proteínas
N-acetil glucosam ina Figura 12-48 Estructura del oligosacárido unido a asparagina (unido a N) que es añadido a la m ayoría de las proteínas en la m em brana del ER rugoso. Los cinco residuos de azúcar mostrados en el forman la “región central” de este oligosacárido. En el complejo de Golgi se produce una profunda reordenación y recorte de los azúcares y en muchas proteínas únicamente sobreviven a este proceso estos cinco residuos. Solamente se glucosilan las asparaginas que se hallan en la secuencia o siendo X cualquier aminoácido que no sea la prolina. Estas dos secuencias se presentan en frecuencias mucho menores en glucoproteínas que en proteínas citosólicas no glucosiladas; evidentemente ha habido una presión selectiva en contra de estas secuencias durante la evolución de las proteínas, probablemente porque la glucosilación en demasiados residuos podría interferir con el plegamiento de la proteína.
recuadro gris
X-Thr,
Asn-X-Ser Asn-
CITOSOL
LUMEN
oligosacárido unido a lípido
bicapa lipidica de la m em brana del ER CITOSOL
LUMEN
I d o U c o P K P X P > (GIcNA c)2 5 |GDP|-M an 5 |g D p ] "SALTO" ("FLIP-FLOP") ( ' doifcol ) - ( p) - ( p )-(G lcNAc)2(M an)5 EN LA MEMBRANA j (
(M an)5(GlcNAc)2-(F )-(p > dolicol ' J / \ / ...dador de manosa, construido ------Man VPX dolicol a pa rtir de d 0 |iC0| fosfato y 4X --------------- (? )- ( doIicoI ) de GDP-manosa (Man)9(GlcNAc)2-(p )-(p >-( d o lic o P ) 3X
Glc -\P~)-( dol icol ) ►(p ^ dolicol )
(Glc)3(M an)9(GlcNAc)2-( p ) -( p ) _ cjolicol _ I
El retículo endoplasmático
dador de glucosa construido a partir de dolicol fosfato y UDP-glucosa
Figura 12-49 Glucosilacidn de una proteína en el ER. Casi inmediatamente después de que la cadena polipeptídica entre en el lumen, se glucosila sobre los residuos de asparaguina diana. El oligosacárido que se muestra en la Figura 12-48 se transfiere a la asparaguina como una unidad intacta, a través de una reacción catalizada por la una enzima unida a membrana. Existe una copia de esta enzima asociada con cada translocador proteico de la membrana del ER.
transferasa,
oligosacaril
Figura 12-50 Síntesis del precursor del oligosacárido unido a lípido de la de la m em brana del ER rugoso. El oligosacárido se va construyendo azúcar a azúcar, sobre el lípido transportador dolicol (un poliisoprenoide, véase Panel 2-4). El dolicol es largo y muy hidrofóbico: sus 22 unidades de cinco carbonos pueden atravesar el grosor de la bicapa lipídica más de tres veces, de forma que el oligosacárido que se une al él queda firmemente anclado a la membrana. El primer grupo de azúcar se une al dolicol a través de un enlace pirofosfato. Este enlace de alta energía activa el oligosacárido para su transferencia desde el lípido hasta una cadena lateral de la asparagina de un polipéptido naciente sobre la cara luminal del ER rugoso. La síntesis del oligonucleótido comienza en la cara citosólica de la membrana del ER, y continúa sobre la cara luminal, después de que el lípido intermediario (Man)5 (G1cNAc)2 haya sido transferido (por flip-flop) a través de la membrana. Todas las reacciones posteriores de transferencia de glucosilos que se producen en la cara luminal del ER se producen a partir de dolicol-P-glucosa y de dolicol-Pmanosa; estos monosacáridos, unidos a lípidos, que se hallan activados, se sintetizan a partir de dolicol fosfato y de UDP-glucosa o GDP-manosa sobre la cara citosólica del ER, y posteriormente, según parece, son transportados (por flip-flop) a través de la membrana del ER. Abreviaturas: GlcNAc = TV-acetilglucosamina; Man = mañosa; Glc = glucosa.
631
Toda la diversidad de estructuras de iV-oligosacáridos que se presentan en las glucoproteínas maduras se produce por modificación posterior de la estruc tura de oligosacárido precursora. Todavía en el ER, se eliminan de los oligosacáridos de muchas glucoproteínas tres residuos de glucosa y uno de mañosa (véa se Figura 12-48). Estos “recortes” o “procesam iento” del oligosacárido continúan en el complejo de Golgi, y se explican en el Capítulo 13. Los 7V-oligosacáridos son, con gran diferencia, los oligosacáridos más com u nes de los que se encuentran en las glucoproteínas. Menos frecuentemente, los oligosacáridos están unidos al grupo hidroxilo de la cadena lateral de un residuo de serina, de treonina o de hidroxilisina. Estos O-oligosacáridos se forman en el complejo de Golgi a través de vías que aún no son conocidas completamente (se discute en el Capítulo 13).
Algunas proteínas de membrana, poco después de entrar en el ER, intercam bian una cola transm em brana carboxilo term inal por un glucosilfosfatidilinositol (GPI) unido de form a covalente36 Como hem os explicado en el Capítulo 10, algunas enzimas citosólicas catalizan la adición covalente de un ácido graso a determinadas proteínas, colaborando en la direccionalidad de estas proteínas hacia las membranas celulares. En el ER rugoso se produce un proceso catalizado por enzimas relacionado con éste: el extremo carboxilo de algunas proteínas de mem brana destinadas a la m em bra na plasmática se unen de forma covalente a un residuo de azúcar de un glucolípido. Esta unión se forma en el lumen del ER a través del mecanismo ilustrado en la Figura 12-51, y añade a la proteína un anclaje de glucosilfosfatidilinositol (GPI, de glycosylphosphatidilinositol) que contiene dos ácidos grasos. En el m is mo proceso se elimina el segmento transm em brana de las proteínas. Cada vez es mayor el número de proteínas conocidas de la membrana plasmática que son modificadas de esta manera. Dado que estas proteínas están unidas al exterior de la mem brana plasmática exclusivamente a través de su anclaje GPI, en princi pio pueden ser liberadas de las células en forma soluble en respuesta a señales que activen una fosfolipasa de la m em brana plasmática. Por ejemplo, los parási tos tripanosoma utilizan este m ecanismo para liberar su cubierta de proteínas unidas a GPI si son atacados por el sistema inmunitario.
La mayoría de las bicapas lipídicas de m em brana son ensam bladas en el ER37 La mem brana del ER produce casi todos los lípidos de membrana necesarios para la elaboración de nuevas membranas celulares, incluyendo los fosfolípidos y el colesterol. El principal fosfolípido fabricado es la fosfatidilcolina (también
CITOSOL
COOH
glucosil fosfatidiIinositol
péptido C-terminal elim inado
LUMEN
632
Capítulo 12: Compartimientos intracelulares y clasificación de proteínas
Figura 12-51 Unión a un anclaje de glucosilfosfatidilinositol. En cuanto la síntesis de la proteína ha finalizado, la proteína precursora permanece unida a le membrana del ER a través de una secuencia hidrofóbica carboxilo terminal de entre 15 y 20 residuos de aminoácido, de forma que el resto de la proteína queda en el lumen del ER. En menos de un minuto, una enzima del ER corta la proteína, liberándola de su extremo carboxilo terminal, que la unía a la membrana, y simultáneamente une el nuevo extremo carboxilo terminal a un grupo amino de un intermediario glucosil fosfatidilinositol preformado. La señal que especifica esta modificación se halla contenida en la secuencia hidrofóbica carboxilo terminal y en algunos aminoácidos adyacentes a ella sobre la cara luminal de la membrana del ER; si esta señal es añadida a otras proteínas, éstas también son modificadas de esta forma. Debido a este anclaje lipídico al que se une de forma covalente, la proteína permanece unida a la membrana; todos sus restos de aminoácido se hallan expuestos a la cara luminal del ER y, por lo tanto, sobresaldrán hacia el exterior celular si la proteína es transportada a la membrana plasmática.
acil transferasa
CITOSOL
colina
C H 2— C H — C H 2
C H 7— C H — C H 2
O
o
O
I
I
f
C H 2— C H — C H 2
o
bicapa lipidica del ER ácido fosfatídico
diacilglicerol
fosfatidilcolina
LUMEN
llamado lecitina), que puede formarse en tres etapas a partir de dos ácidos gra sos, glicerofosfato y colina. Cada etapa está catalizada por enzimas de la m em brana del ER que tienen sus lugares activos dispuestos hacia el citosol, donde se encuentran los metabolitos necesarios. Por lo tanto las síntesis de fosfolípidos tiene lugar exclusivamente en la mitad citosólica de la bicapa lipídica. El la pri mera etapa, las acil transferasas añaden consecutivamente dos ácidos grasos al glicerofosfato produciendo ácido fosfatídico, un compuesto que es suficiente mente insoluble en agua com o para permanecer en la bicapa lipídica después de ser sintetizado. Esta etapa es la que hace crecer la bicapa lipídica. Las otras eta pas posteriores determinan el grupo de cabeza de la molécula lipídica recién sintetizada, y por lo tanto la naturaleza química de la bicapa, pero no suponen un crecim iento neto de la mem brana (Figura 12-52). Los otros dos fosfolípidos mayoritarios de membrana -la fosfatidiletanolamina (PE) y la fosfatidilserina (PS)- al igual que el fosfolípido minoritario fosfatidilinositol (PI), son sintetiza dos de esta manera. Como la síntesis de fosfolípidos tiene lugar en la mitad citosólica de la bicapa lipídica, ha de existir un mecanismo que transfiera alguna de las moléculas de fosfolípido recién sintetizados hacia la otra mitad de la bicapa. En bicapas lipídicas sintéticas, los lípidos no son capaces de “saltar” (“flip”, de flip-flop) de esta manera. En el ER, sin embargo, los fosfolípidos se equilibran a través de la mem brana en cuestión de minutos, lo cual es al menos unas 100 000 veces más rápido de lo que puede representar el flip-flop espontáneo. Se cree que este movimien to rápido transbicapa está mediado por translocadores de fosfolípidos específi cos de grupos de cabeza. Concretamente, parece que la membrana del ER con tiene un translocador (una “flipasa”) que transfiere, entre la cara citoplasmática
El retículo endoplasmático
Figura 12-52 Síntesis de fosfatidilcolina. Este fosfolípido es sintetizado a partir de acil coenzima A (acil graso CoA), glicerol 3-fosfato y citidín-bisfosfocolina (CDP-colina).
633
y la cara luminal, fosfolípidos que contengan colina -pero no etanolam ina-, serina, o fosfolípidos que contengan inositol. Esto significa que la fosfatidilcolina alcanza la cara luminal mucho más rápidamente que los otros fosfolípidos. De esta forma el translocador mantiene la bicapa y es responsable de la distribución asim étrica de los lípidos en la bicapa (Figura 12-53). El ER tam bién produce colesterol y ceramida. La ceramida es fabricada por condensación del aminoácido serina con un ácido graso hasta forma el amino alcohol esfingosina; luego se añade un segundo ácido graso, formándose la ceramida. La ceramida es exportada al complejo de Golgi, donde actúa como precur sor de la síntesis de dos tipos de lípidos: se añaden cadenas de oligosacáridos formando los glucoesfingolípidos (glucolípidos), y se transfieren los grupos de cabeza de la fosfocolina desde la fosfatidilcolina a otras moléculas de ceramida, formando esfingomielina. Así, ambos glucolípidos y la esfingomielina son pro ducidos relativamente tarde en el proceso de síntesis de membrana. Dado que son producidos por enzimas expuestas al lumen del complejo de Golgi, se en cuentran exclusivamente en la mitad no citosólica de las bicapas lipídicas que los presentan.
• M ili
000000 0101
LA SINTESIS DE LIPIDOS AÑADE FOSFOLÍPIDOS A LA MITAD CITOSÓLICA DE LA BICAPA
M0MM0M 0 0 0 0 0
CITOSOL
UNA PROTEÍNA ESPECÍFICA CATALIZA EL "SALTO " ("FLIP") DE DETERMINADAS MOLÉCULAS DE FOSFOLÍPIDO DESDE LA MITAD CITOSÓLICA A LA MITAD LUMINAL
00000000
Las proteínas de intercam bio de fosfolípidos pueden transportar fosfolípidos desde el ER a las m itocondrias y a los peroxisomas38 Como se discute en el Capítulo 13, la mem brana plasmática y las membranas del com plejo de Golgi, de los lisosomas y de los endosomas forman parte de un sistema de m embranas que se com unica con el ER por medio de vesículas de transporte que transfieren tanto las proteínas como los lípidos. Las m itocon drias, los plastos y los peroxisomas no forman parte de este sistema, por lo que requieren m ecanism os diferentes para la importación de proteínas y de lípidos necesaria para su crecim iento. Ya hemos visto que la mayoría de las proteínas de mitocondrias y plastos y todas las de los peroxisomas son importadas post-traduccionalm ente desde el citosol. Aunque las mitocondrias modifican algunos de los lípidos que importan, no sintetizan lípidos de novo ; en cambio, tienen que obtener estos lípidos por transferencia desde el ER, donde son sintetizados, o tienen que obtenerlos de forma menos directa desde el ER por medio de otras membranas celulares. En cualquier caso son necesarios mecanismos especiales para que se produzca la transferencia. En experimentos in vitro se ha demostrado que unas proteínas de transporte solubles en agua -llam adas proteínas de intercam bio de fosfolípidos (o proteí nas de transferencia de fosfolípidos)- tienen la capacidad de transferir moléculas individuales de fosfolípidos entre membranas. Cada proteína de intercambio re conoce sólo determinados tipos específicos de fosfolípido. La transferencia entre bicapas lipídicas se produce cuando la proteína “extrae” una molécula de fosfolí pido de una membrana y luego difunde por la célula con el lípido “enterrado” en su lugar de unión. Cuando encuentra otra membrana, la proteína de intercambio tiende a descargar la molécula de fosfolípido en la nueva bicapa (Figura 12-54). Se ha propuesto que la fosfatidilserina es importada a la mitocondria de esta ma nera, siendo luego descarboxilada para recuperar la fosfatidiletanolamina, mien tras que la fosfatidilcolina es importada intacta. Las proteínas de intercambio actúan distribuyendo fosfolípidos al azar entre todas las m embranas de la célula. En principio, de este proceso de intercambio al azar puede resultar un transporte neto de lípidos desde una membrana rica en determinados lípidos a otra pobre en ellos, permitiendo que las moléculas de fosfatidilcolina y fosfatidilserina, por ejemplo, sean transferidas desde el ER, donde son sintetizadas, hasta la membrana mitocondrial o hasta la membrana peroxisomal. Puede ser que las mitocondrias y los peroxisomas sean los únicos orgánulos “pobres en lípidos” del citoplasma y que un intercambio de este tipo sea suficiente, aunque pueden existir otros mecanismos más específicos que transporten fosfolípidos a estos orgánulos.
634
Capítulo 12: Compartimientos intracelulares y clasificación de proteínas
bicapa lipidica asimétrica del retículo endoplasmático
crecimiento de — ambas mitades de la bicapa
LUMEN DELER
Figura 12-53 Papel de los translocadores lipídicos en la biosíntesis de la bicapa lipídica. Las
nuevas moléculas lipídicas se van añadiendo exclusivamente a la mitad citosólica de la bicapa y no pueden “saltar" (flip) de forma espontánea de una monocapa lipídica a la otra. Por ello, para que se produzca la transferencia de determinadas moléculas a la mitad luminal y así la membrana pueda crecer como una bicapa, se hace necesaria la participación de proteínas translocadoras de fosfolípidos (“flipasas”). Debido a que la flipasa de la membrana del ER reconoce preferentemente y transfiere grupos de cabeza que contengan colina, se genera una membrana asimétrica con la monocapa luminal (la cual produce la mitad exterior de la bicapa de la membrana plasmática) altamente enriquecida en fosfatidilcolina.
Figura 12-54 Proteínas intercambiadoras de fosfolípidos. Debido a que los fosfolípidos son insolubles en agua, su transferencia entre membranas requiere la participación de una proteína transportadora. Las proteínas de intercambio de fosfolípidos son moléculas hidrosolubles que transportan una sola molécula de fosfolípido a la vez; pueden tomar una molécula lipídica de una membrana y liberarla en otra membrana, redistribuyendo así los fosfolípidos entre los compartimientos rodeados de membrana. La transferencia de fosfatidilcolina (PC) desde el ER hacia la mitocondria puede ocurrir, en principio, sin aporte exterior de energía debido a que la concentración de PC es alta en la membrana del ER (donde se sintetiza) y baja en la membrana mitocondrial externa. Puede predecirse que debe existir una flipasa en la membrana mitocondrial externa que equilibre las concentraciones de lípidos entre las dos mitades de la membranas externa, y un mecanismo de transferencia de lípidos entre la membrana mitocondrial externa y la interna. Sin embargo, estos procesos todavía no se han descubierto.
m em brana del ER
m em brana m itocondrial externa
citosol
t \ ~ / grupo de cabeza de la fosfatidilcolina
I
proteína intercam biadora de fosfolípidos
Resumen La extensa red del ER actúa de fábrica de producción de casi todos los lípidos celula res. Además, la mayor parte de la síntesis proteica celular tiene lugar en la superficie citosólica del ER: todas las proteínas destinadas a la secreción y todas las proteínas destinadas al propio ER, al complejo de Golgi, a los lisosomas, a los endosamos y a la membrana plasmática, primero son importadas al interior del ER desde el citosol. En el lumen del ER las proteínas se pliegan y oligomerizan, seforman los enlaces di sulfuro y se añaden los N-oligosacáridos. Sólo son importadas al interior del ER las proteínas que presentan un péptido señal hidrofóbico. El péptido señal es reconocido por una partícula de reconoci miento de señal (SRP, de Signal Recognition Particle) que se une a la cadena polipeptídica naciente y al ribosoma y dirige todo el conjunto a una proteína receptora de la superficie de la membrana del ER. Esta unión a la membrana inicia un proce so de translocación que arrastra un bucle de la cadena polipeptídica a través de la membrana del ER a través de un poro hidrofílico de una proteína translocadora. Las proteínas solubles destinadas al lumen del ER, a ser secretadas o a ser transferidas al lumen de otros orgánulos, primero pasan completamente al interior del lumen del ER. Las proteínas transmembrana destinadas al ER o a otras mem branas de la célula, son translocadas a través de la membrana del ER pero no son liberadas al interior del lumen sino que permanecen ancladas a la bicapa a través de una o más regiones de su cadena polipeptídica, a-helicoidales, que atraviesan la membrana. Estas porciones hidrofóbicas de la proteína pueden actuar durante el proceso de translocación, bien como péptido de inicio de transferencia o bien como señal de paro de transferencia. Cuando un polipéptido contiene varios péptidos de inicio de transferencia y de paro de transferencia, atravesará muchas veces la bicapa. La asimetría de la síntesis de lípidos, inserción proteica y glucosilación en el ER establece la polaridad de las membranas de todos los demás orgánulos que son abastecidos con lípidos y proteínas de membrana por el ER.
El retículo endoplasmático
635
Bibliografía General Blobel, G. Control of intracelular protein traffic. Methods Enzymol. 96:663-682, 1983. Néupert, W.; Lili, R. New Comprehensive Biochemistry: Membrane Biogenesis and Protein Targeting, Vol. 22. Amsterdam: Elsevier, 1992. Osborne, M.A.; Silver, P.A. Nucleocytoplasmic transport in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Annu. Rev. Biochem. 62:219-254, 1993. Palade, G. Intracellular aspects of the process of protein synthesis. Science 189:347-358, 1975. Warren, G. Membrane partitioning during cell division. Annu. Rev. Biochem. 62:323-348,1993.
6.
7.
Citas 1. Bolender, R.P. Stereological analysis of the guinea pig pancreas./. Cell Biol. 61:269-287, 1974. Fulton, A.B. How crowded is the cytoplasm? Cell 30:345347, 1982. Kelly, R.B. Associations between microtubules and in tracellular organelles. Curr. Opin. Cell Biol. 2:105108, 1990. Weibel, E.R.; Staubli, W.; Gnagi, H.R.; Hess, F.A. Correla ted morphometric and biochemical studies on the li ver cell./. Cell Biol. 42:68-91, 1969. 2. Blobel, G. Intracellular protein topogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:1496-1500, 1980. Morden, C.W.; Delwiche, C.F.; Kuhsel, M.; Palmer, J.D. Gene phylogenies and the endosymbiotic origin of plastids. Biosystems 28:7590, 1992. Schwarz, R.M.; Dayhoff, M.O. Origins of prokaryotes, eukaryotes, mitochondria, and chloroplasts. Science 199:395-403, 1978. Voelker, D.R. Organelle biogenesis and intracellular li pid transport in eukaryotes. Microbiol. Rev. 55:543560, 1991. 3. Bradshaw, R.A. Protein translocation and turnover in eukaryotic cells. Trends Biochem. Sci. 14:276-279, 1989. Sabatini, D.D.; Kreibichi, G.; Morimoto, T.; Adesnik, M. Mechanisms for teh incorporation of proteins in membranes and organelles./. Cell Biol. 92:1-22, 1982. 4. Blobel, G.; Walter, P.; Chang, C.N.; et al. Translocation of proteins across membranes: the signal hypothesis and beyond. Symp. Soc. Exp. Biol. 33:9-36, 1979. Deshaies, R.J.; Schekman, R. A yeast mutant defective at an early stage in import of secretory protein precur sors into the endoplasmic reticulum. /. Cell Biol. 105:633-645, 1987. Garoff, H. Using recombinant DNA techniques to study protein targeting in the eukaryotic cell. Annu. Rev. Cell Biol. 1:403-445, 1985. Oliver, D.B.; Beckwith, I. E. coli mutant pleiotropically defective in the export of secreted proteins. Cell 25:765-772, 1981. von Heijne, G. Protein targeting signals. Curr. Opin. Cell Biol. 2:604-608, 1990. 5. Iones, H.D.; Schliwa, M.; Drubin, D.G. Video micros copy of organelle inheritance and motility in bud ding yeast. Cell Modi. Cytoskeleton 25:129-142, 1993.
636
8.
9.
10.
Warren, G. Membrane partitioning during cell division. Annu. Rev. Biochem. 62:323-348, 1993. Dingwall, C.; Laskey, R. The nuclear membrane. Science 258:942-947, 1992. Newport, J.W.; Forbes, D J. The nucleus: structure, func tion and dynamics. Annu. Rev. Biochem. 56:535-565, 1987. Nigg, E.A.; Baeuerle, P.A.; Luhrmann, R. Nuclear im port-export: in search of signals and mechanisms. Cell 66:15-22, 1991. Silver, P.A. How proteins enter the nucleus. Cell 64:489497, 1991. Akey, C.W.; Radermacher, M. Architecture of the Xenopus nuclear pore complex revealed by three-dimen sional cryo-electron microscopy. /. Cell Biol. 122:119.1993. Forbes, D J. Structure and function of the nuclear pore complex. Annu. Rev. Cell Biol. 8:495-527, 1992. Gerace, L. Molecular trafficking across the nuclear pore complex. Curr. Opin. Cell Biol. 4:637-645, 1992. Hinshaw, I.E.; Carragher, B.O.; Milligan, R.A. Architec ture and design of the nuclear pore complex. Cell 69:1133-1141, 1992. Pante, N.; Aebi, U. The nuclear pore complex. /. Cell Biol. 122:977-984, 1993. Dingwall, C.; Laskey, R.A. Nuclear targeting sequences-a consensus? Trends Biochem. Sci. 16:478-481, 1991. Goldfarb, D.S.; Gariepy, J.; Schoolnik, G.; Kornberg, R.D. Synthetic peptides as nuclear localization signals. Nature 322:641 -644, 1986. Kalderon, D.; Roberts, B.L.; Richardson, W.D.; Smith, A.E. A short amino acid sequence able to specify nucclear location. Cell 39:499-509, 1984. Yamasake, L.; Lanford, R.E. Nuclear transport: a guide to import receptors. Trends Cell Biol. 2:123-127,1992. Adam, S.A.; Gerace, L. Cytosolic proteins that specifi cally bind nuclear localization signals are receptors for nuclear import. Cell 66:837-847, 1991. Dingwall, C. Transport across the nuclear envelope: enigmas and explanations. Bioessays 13:213-218, 1991. Feldherr, C.M.; Akin, D. EM visualization of nucleocyto plasmic transport processes. Electron Microsc. Rev. 3:73-86, 1990. Michaud, N.; Goldfarb, D.S. Multiple pathways in nu clear transport: the import of U2 snRNP occurs by a novel kinetic pathway./. Cell Biol. 112:215-223, 1991. Newmeyer, D.D. The nuclear pore complex and nucleo cytoplasmic transport. Curr. Opin. Cell Biol. 5:395407.1993. Chaudhary, N.; Courvalin, I. Stepwise reassembly of the nuclear envelope at the end of mitosis. /. Cell Biol. 122:295-306, 1993. Glass, J.R.; Gerace, L. Lamins A and C bind and assemble at the surface of mitotic chromosomes. /. Cell Biol. 111:1047-1057, 1990. Peter, M.; Heitlinger, E.; Haner, M.; Aebi, U.; Nigg, E.A. Disassembly of in vitro formed lamin head-to-tail polymers by cdc2 kinase. EMBO J. 10:1535-1554, 1991. Weise, C.; Wilson, K.L. Nuclear membrane dynamics. Curr. Opin. Cell Biol. 5:387-394, 1993.
Capítulo 12: Compartimientos intracelulares y clasificación de proteínas
11. Dingwall, C. If the cap fits__ Curr. Biol. 1:65-66,1991. Eckner, R.; Ellmeier, W.; Bimstiel, M.L. Mature mRNA 3' end formation stimulates RNA export from the nu cleus. EMBOJ. 10:3513-3522,1991. Izaurralde, E.; Mattaj, I.W. Transport of RNA between nucleus and cytoplasm. Semin. Cell Biol. 3:279-288, 1992. Miller, M.W.; Hanover, J.A. Regulation of macromolecular traffic mediated by the nuclear pore complex. Cell Biol. Int. Rep. 16:791-798,1992. Moll, T.; Tebb, G.; Surana, U.; Robitsch, H.; Nasmyth, K. The role of phosphorylation and the cdc28 protein ki nase in cell cycle-regulated nuclear import of the S. cerevisiae transcription factor SW15. Cell 66:743-758, 1991. 12. Archer, E.K.; Keegstra, K. Current views on chloroplast protein import and hypotheses on the origin of the transport mechanism. /. Bioenerg. Biomem. 22:789810, 1990. Attardi, G.; Schatz, G. Biogenesis of mitochondria. Annu. Rev. Cell Biol. 4:289-333, 1988. Glick, B.; Schatz, G. Import of protein into mitochon dria. Annu. Rev. Genet. 25:21-44,1991. Pfänner, N.; Rassow, J.; van der Klei, I.J.; Neupert, W. A dynamic model of the mitochondrial protein import machinery. Cell 68:999-1002,1992. Smeekens, S.; Weisbeek, P.; Robinson, C. Protein trans port into and within chloroplasts. Trends Biochem. Sei. 15:73-76, 1990. 13. Roise, D.; Schatz, G. Mitochondrial presequences. /. Biol. Chem. 263:4509-4511, 1988. Vestweber, D.; Schatz, G. DNA-protein conjugates can enter mitochondria via the protein import pathway. Nature 338:170-172, 1987. 14. Beasley, E.M.; Wächter, C. Schatz, G. Putting energy into mitochondrial protein import. Curr. Opin. Cell Biol. 4:646-651,1992. Weinhues, U.; Neupert, W. Protein translocation across mitochondrial membranes. Bioessays 14:17-23, 1992. 15. Pfänner, N.; Rassow, J.; Wienhues, U.; et al. Contact si tes between inner and outer membranes: structure and role in protein translocation into the mitochon dria. Biochim. Biophys. Acta 1018:239-242,1990. Pon, L.; Moll, T.; Vestweber, D.; Marshallsay, B.; Schatz, G. Protein import into mitochondria: ATP-dependent protein translocation activity in a submitochondrial fraction enriched in membrane contact sites and specific proteins./. Cell Biol. 109:2603-2316, 1989. Schleyer, M.; Neupert, W. Transport of proteins into mi tochondria: translocational intermediates spanning contact sites between outer and inner membranes. Cell 43:339-350, 1985. 16. Deshaies, R.J.; Koch, B.D.; Werner-Washburne, M.; Craig, E.A.; Schekman, R. A subfamily of stress pro teins facilitates translocation of secretory and mito chondrial precursor polypeptides. Nature 332:800805, 1988. Eilers, M.; Schatz, G. Protein unfolding and the energet ics of protein translocation across biological mem branes. Cell 52:481-483,1988. Wienhues, U.; Becker, K.; Schleyer, M.; et al. Protein fol ding causes an arrest of preprotein translocation into mitochondria in vivo. J. Cell Biol. 115:1601-1609, 1991.
Bibliografía
17. Hendrick, J.P.; Hartl, F.U. Molecular chaperone func tions of heat-shock proteins. Annu. Rev. Biochem. 62:349-384, 1993. Kelley, W.L.; Georgopoulos, C. Chaperones and protein folding. Curr. Opin. Cell Biol. 4:984-991,1992. Koll, H.; Guiard, B.; Rassow, J.; et al. Antifolding activity of hsp60 couples protein import into the mitochon drial matrix with export to the intermembrane space. Cell 68:1163-1175, 1992. Scherer, P.; Krieg, U.C.; Hwang, S.T.; Vestweber, D.; Schatz, G. A precursor protein partly translocated into yeast mitochondria is bound to a 70 kd mito chondrial stress protein. EMBO J. 9:4315-4322, 1990. 18. Glick, B.S.; Beasley, E.M.; Schatz, G. Protein sorting in mitochondria. Trends Biochem. Sci. 17:453-459, 1992. Glick, B.S.; Brandt, A.; Cunningham, K.; et al. Cytochro mes cl and b2 are sorted to the intermembrane spa ce of mitochondria by a stop-transfer mechanism. Cell 69:809-822,1992. Hartl, F.U.; Ostermann, J.; Guiard, B.; Neupert, W. Suc cessive translocation into and out of the mitochon drial matrix: targeting of proteins to the intermem brane space by a bipartite signal peptide. Cell 51:1027-1037, 1987. 19. Knight, J.S.; Madueno, F.; Gray, J.C. Import and sorting of protein by chloroplasts. Biochem. Soc. Trans. 21:31-36, 1993. Robinson, C.; Klosgen, R.B.; Herrmann, R.G.; Shackleton, J.B. Protein translocation across the thylakoid membrane-a tale of two mechanisms. FEBS Lett. 325:67-69, 1993. Smeekens, S.; Weisbeek, P.; Robinson, D. Protein trans port into and within chloroplasts. Trends Biochem. Sci. 15:73-76, 1990. Theg, S.M.; Geske, F.S. Biophysical characterization of a transit peptide directing chloroplast protein import. Biochemistry 31:5053-5060, 1992. 20. deDuve, C. Microbodies in the living cell. Sci. Am. 248(5):74-84, 1983. Lazarow, P.B. Genetic approaches to studying peroxiso me biogenesis. Trends Cell Biol.3:89-93, 1993. Lazarow, P.B.; Fujiki, Y. Biogenesis of peroxisomes. Annu. Rev. Cell Biol. 1:489-530, 1985. 21. Taiz, L.; Zeiger, E. Plant Physiology, pp. 229-233; 288290. Redwood City, CA: Benjamin/Cummings, 1991. Titus, D.E.; Becker, W.M. Investigation of the glyoxysome-peroxisome transition in germinating cucumber cotyledons using double-label immunoelectron mi croscopy./. Cell Biol. 101:1288-1299, 1985. Tolbert, N.E.; Essner, E. Microbodies: peroxisomes and glyoxysomes./. Cell Biol. 91:271s-283s, 1981. 22. Borst, P. Peroxisome biogenesis revisited. Biochim Biophys. Acta 1008:1-13, 1989. Lazarow, P.B. Peroxisome biogenesis. Curr. Opin. Cell Biol. 1:630-634, 1989. Shimozawa, N.; Tsukamoto, T.; Suzuki, Y.; et al. A hu man gene responsible for Zellweger syndrome that affects peroxisome assembly. Science 255:1132-1134, 1992. Subramani, S. Targeting of proteins into the perosixomal matrix./. Memb. Biol. 125:99-106, 1992. Valle, D.; Gartner, ]. Human genetics: penetrating the peroxisome. Nature 361:682-683, 1993.
637
23. DePierre, J.W.; Dallner, G. Structural aspects of the membrane of the endoplasmic reticulum. Biochim. Biophys. Acta 415:411-472, 1975. Lee, C.; BoChen, L. Dynamic behavior of endoplasmic reticulum in living cells. Cell 54:37-46, 1988. Preuss, D.; Mulholland, J.; Kaiser, C.; et al. Structure of the yeast endoplasmic reticulum: localization of ER proteins using immunofluorescence and immunoelectron microscopy. Yeast 7:891-911, 1991. Vertel, B.M.; Walters, L.M.; Mills, D. Subcompartments of the endoplasmic reticulum. Semin. Cell Biol. 3:325-341, 1992. 24. Adelman, M.R.; Sabatini, D.D.; Blobel, G. Ribosomemembrane interaction: nondestructive dissasembly of rat liver rough microsomes into ribosomal and membranous components. /. Cell Biol. 56:206-229, 1973. Borgese, N.; Mok, W.; Kreibich, G.; Sabatini, D.D. Ribosomal-membrane interaction: in vitro binding of ri bosomes to mirosomal membranes. J. Mol. Biol. 88:559-580, 1974. Garcia, P.D.; Walter, P. Full-length pre-pro-a-factor can be translocated across the mammalian microsomal membrane only if translation has not terminated. /. Cell Biol. 106:1043-1048, 1988. Nunnari, J.; Walter, P. Protein targeting to and translo cation across the membrane of the endoplasmic reti culum. Curr. Opin. Cell Biol. 4:573-580, 1992. Rapoport, T.A. Transport of proteins across the endo plasmic reticulum membrane. Science 258:931-936, 1992. 25. Jones, A.L.; Fawcett, D.W. Hypertrophy of the agranular endoplasmic reticulum in hamster liver induced by phénobarbital. J. Histochem. Cytochem. 14:215-232, 1966. Mori, H.; Christensen, A.K. Morphometric analysis of Leydig cells in the normal rat testis. J. Cell Biol. 84:340-354, 1980. Vila, A.; Podini, P.; Panzeri, M.; et al. The endoplasmicsarcoplasmic reticulum of smooth muscle: immunocytochemistry of vas deferens fibers reveals specia lized subcompartments differently equipped for the control of Ca2+ homeostasis. /. Cell Biol. 121:10411051,1993. 26. Dallner, G. Isolation of rough and smooth microsomes-general. Meth. Enzym. 31:191-201, 1974. deDuve, C. Tissue fractionation-past and present. J. Cell Biol. 50:20d-55d, 1971. 27. Blobel, G.; Dobberstein, B. Transfer of proteins across membranes./. Cell Biol. 67:835-851,1975. Kaiser, C.A.; Preuss, D.; Grisafi, P.; Botstein, D. Many random sequences functionally replace the secretion signal sequence of yeast invertase. Science 235:312317, 1987. Milstein, C.; Brownlee, G.; Harrison, T.; Mathews, M.B. A possible precursor of immunoglobulin light chains. Nat. New Biol. 239:117-120, 1972. Simon, K.; Perara, E.; Lingappa, V. Translocation of globin fusion proteins across the endoplasmic reticu lum membrane in Xenopus laevis oocytes. /. Cell Biol. 104:1165-1172, 1987. von Heijne, G. Signal sequences: the limits of variation. /. Mol. Biol. 184:99-105, 1985.
638
28. Gilmore, R. The protein translocation apparatus of the rough endoplasmic reticulum, its associated pro teins, and the mechanism of translocation. Curr. Opin. Cell Biol. 3:580-584, 1991. Meyer, D.I.; Krause, E.; Dobberstein, B. Secretory pro tein translocation across membranes-the role of the “docking protein.” Nature 297:647-650, 1982. Siegel, V.; Walter, P. Each of the activities of signal re cognition particle (SRP) is contained within a distinct domain: analysis of biochemical mutants of SRP. Cell 52:39-49, 1988. Simon, S. Translocation of proteins across the endo plasmic reticulum. Curr. Opin. Cell Biol. 5:581-588, 1993. Walter, P.; Lingappa, V.R. Mechanism of protein trans location across the endoplasmic reticulum membra ne. Annu. Rev. Cell Biol. 2:499-516, 1986. 29. Hann, B.C.; Walter, P. The signal recognition particle in S. cerevisiae. Cell 67:131-134, 1991. Sanders, S.L.; Schekman, R. Polypeptide translocation across the endoplasmic reticulum membrane. /. Biol. Chem. 267:13791-13794, 1992. Wickner, W.; Driessen, A.J.; Hartl, F.U. The enzymology of protein translocation across the Escherichia coli plasma membrane. Annu. Rev. Biochem. 60:101-124, 1991. Zimmermann, R.; Meyer, D.I. 1986: a year of new in sights into how proteins cross membranes. Trends Biochem. Sci. 11:512-515, 1986. 30. Crowley, K.S.; Reinhart, G.D.; Johnson, A.E. The signal sequence moves through a ribosomal tunnel into a noncytoplasmic aqueous environment at the ER membrane early in translocation. Cell 73:1101-1115, 1993. Deshaies, R.J.; Sanders, S.L.; Feldheim, D.A.; Schekman, R. Assembly of yeast Sec proteins involved in translo cation into the endoplasmic reticulum into a mem brane-bound multisubunit complex. Nature 349:806808, 1991. Gorlich, D.; Prehn, S.; Hartman, E.; Kalies, K.U.; Rapo port, T.A. A mammalian homolog of SEC61p and SECYp is associated with ribosomes and nascent polypeptides during translocation. Cell 71:489-503, 1992. Nicchitta, C.; Migliaccio, G.; Blobel, G. Reconstitution of secretory protein translocation from detergent-solu bilized rough microsomes. Methods Cell Biol. 34:263285, 1991. Simon, S.M.; Blobel, G. A protein-conducting channel in the endoplasmic reticulum. Cell 65:371-380, 1991. 31. Blobel, G.; Dobberstein, B. Transfer of proteins across membranes./. Cell Biol. 67:835-851,1975. Dalbey, R.E.; von Heijne, G. Signal peptidases in prokar yotes and eukaryotes-a new protease family. Trends Biochem. Sci. 17:474-478, 1992. 32. High, S.; Andersen, S.S.; Gorlich, D.; et al. Sec61p is ad jacent to nascent type I and II signal-anchor proteins during their membrane insertion. /. Cell Biol. 121:743-750, 1993. High, S.; Dobberstein, B. Mechanisms that determine the transmembrane disposition of proteins. Curr. Opin. Cell Biol. 4:581-586, 1992. Singer, S.J. The structure and insertion of integral pro teins in membranes. Annu. Rev. Cell Biol. 6:247-296, 1990.
Capítulo 12 : Compartimientos intracelulares y clasificación de proteínas
Thrift, R.N.; Andrew, D.W.; Walter, P.; Johnson, A.E. A nascent membrane protein is located adjacent to ER membrane proteins throughout its integration and translation. J. Cell Biol. 112:809-821,1991. von Heijne, G. Transcending the impenetrable: how proteins come to terms with membranes. Biochim. Biophys.Acta 974:307-333, 1988. 33. Engelman, D.M.; Steitz, T.A.; Goldman, A. Identifying nonpolar transbilayer helices in amino acid sequen ces of membrane proteins. Annu. Rev. Biophys. Biophys. Chem. 15:321-353, 1986. Hartmann„E.; Rapoport, T.A.; Lodish, H.F. Predicting the orientation of eukaryotic membrane-spanning pro teins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5786-5790,1989. Kyte, I.; Doolittle, R.F. A simple method for displaying the hydropathic character of a protein. /. Mol. Biol. 157:105-132,1982. Wessels, H.P.; Spiess, M. Insertion of a multispanning membrane protein occurs sequentially and requires only one signal sequence. Cell 55:61-70, 1988. 34. Doms, R.W.; Lamb, R.A.; Rose, I.K.; Helenius, A. Folding and assembly of viral membrane proteins. Virology 193:545-562, 1993. Gaut, I.R.; Hendershot, L.M. The modification and as sembly of proteins in the endoplasmic reticulum. Curr. Biol. 5:589-595, 1993. Gething, M.J.; Sambrook, ]. Transpot and assembly pro cesses in the endoplasmic reticulum. Semin. Cell Biol. 1:65-72, 1990. Helenius, A.; Marquardt, T.; Braakman, I. The endoplas mic reticulum as a protein-folding compartment. Trends Cell Biol. 2:227-231,1992. Marquardt, T.; Helenius, A. Misfolding and aggregation of newly synthesized proteins in the endoplasmic re ticulum./. Cell Biol. 117:505-513, 1992. 35. Abeijon, C.; Hirschberg, C.B. Topography of glycosylation reactions in the endoplasmic reticulum. Trends Biochem. Sci. 17:32-66, 1992.
Bibliografía
Hart, G.W. Glycosylation. Curr. Opin. Cell Biol. 4:10171023, 1992. Kelleher, D.J.; Kreibich, G.; Gilmore, R. Oligosaccharyltransferase activity is associated with a protein com plex composed of ribophorins I and II and a 48 kd protein. Cell 69:55-65,1992. Komfeld, R.; Komfeld, S. Assembly of asparagine-linked oli gosaccharides. Annu. Rev. Biochem. 54:631-664,1985. Snider, M. A function for ribophorins. Curr. Biol. 2:4345,1992. 36. Brown, D.A. Interactions between GPI-anchored pro teins and membrane lipids. Trends Cell Biol. 2:338343, 1992. Ferguson, M.A. Colworth Medal Lecture. Glyucosylphosphatidylinositol membrane anchors: the tale of a tail. Biochem. Soc. Trans. 20:243-256,1992. Moran, P.; Caras, I. Proteins containing an uncleaved signal for glycopohspohatidylinositol membrane an chor attachment are retained in a post-ER compart ment./. Cell Biol. 119:763-772, 1992. 37. Bishop, W.R.; Bell, R.M. Assembly of phospholipids into cellular membranes: biosynthesis, transmembrane movement, and intracellular translocation. Annu. Rev. Cell Biol. 4:579-610,1988. Davidowicz, E.a. Dynamics of membrane lipid metabo lism and turnover. Annu. Rev. Biochem. 56:43-61,1987. van Meer, G. Transport and sorting of membrane lippids. Curr. Opin. Cell Biol. 5:661-674, 1993. 38. Dawidowicz, E.A. Lipid exchange: transmembrane mo vement, spontaneous movement, and protein-mediated transfer of lipids and cholesterol. Curr. Top. Memb. Transp. 29:175-202, 1987. Dowhan, W. Phospohlipid-transfer proteins. Curr. Opin. Cell Biol. 3:621-625, 1991. Pagano, R.E. Lipid traffic in eukaryotic cells: mecha nisms for intracellular transport and organelle-specific enrichment of lipids. Curr. Opin. Cell Biol. 2:652663,1990.
639
Tráfico vesicular mediante las rutas secretora y endocítica
!■ |£
j
v
IB
. Si •' "■ ‘ :j í> V'-||
'■■■•'.
. :' ''
1: ’ .'Js■ ''-;: *‘••■“'" ■:■..■'•:-<■:- .'■••.:::i:; ::: :•:•;<■■■ ir t
'Áf _' t +;>-r
y ,l
t. >
Transporte desde el ER al complejo de Golgi Transporte , , desde , ,. la red del trans Golgi a los lisosomas Transporte desde la membrana i / ♦ > i plasmatica vía endosomas: endocitosís
Mecanismos moleculares del . . . transporte vesicular y mantenimiento de la diversidad de compartimientos Todas las células han de comunicarse con su entorno. En una célula procariota esta comunicación tiene lugar a través de su membrana plasmática: así, por ejemplo, las enzimas digestivas son secretadas hacia el exterior celular y los pe queños metabolitos generados por la digestión son captados por proteínas de transporte presentes en la membrana plasmática. Por el contrario, las células eucariotas han adquirido un elaborado sistema membranoso interno que les permite captar las macromoléculas por un proceso denominado endocitosis, y ponerlas en contacto con enzimas digestivas que se almacenan intracelularmente en los lisosomas; como consecuencia de ello, a medida que se van produciendo, los m e tabolitos de la digestión van saliendo de los lisosomas directamente hacia el citosol. Además de proporcionar un sistema de regulación de la digestión de las macromoléculas mediante la vía endocítica, el sistema membranoso interno per mite que las células eucariotas puedan regular la liberación al exterior de las pro teínas y glúcidos acabados de sintetizar. Todas las moléculas que viajan a lo largo de esta vía biosintética y secretora pasan por numerosos compartimientos, por lo que la célula puede modificar esta molécula en varios pasos controlados, almace narla hasta que se necesite, y entonces descargarla en un dominio de la superficie celular determinado mediante un proceso llamado exocitosis. En la Figura 13-1 se muestran las rutas endocítica y la biosintética-secretora.
CITOSOL
____________
PEROXISOMA
NUCLEO Sz:
MITOCONDRIA
PLASTIDOS
RETÍCULO ENDOPLASMATICO
5
31
GOLGI
LISOSOMA £■ ENDOSOMA
---------------
VESICULAS SECRETORAS .Sz:
SUPERFICIE CELULAR
Figura 13-1 Las rutas secretora y endocítica. En este “mapa de carreteras” sobre el tráfico de las proteínas biosintetizadas, que fue introducido en el Capítulo 12, aparecen coloreadas tanto la ruta secretora como la endocítica.
CITOSOL
FUSIÓN
GEMACIÓN Figura 13-2 Transporte vesicular. Las vesículas de transporte emergen por gemación de un compartimiento y se fusionan con otro.
641
com plejo de Golgi
El lumen de cada uno de los compartimientos que participan en la ruta biosintética-secretora y en la endocítica es topológicamente equivalente al exterior de la célula. Además, todos los compartimientos están en comunicación perma nente entre sí, por lo menos mediante las numerosas vesículas de transporte que continuamente emergen por gemación de una membrana y se fusionan con otra (Figura 13-2). El tráfico está altamente organizado: la vía biosintética-secretora va hacia afuera desde el ER al complejo de Golgi y a la superficie celular, con una ruta lateral que va a los lisosomas; por otro lado, la vía endocítica va hacia aden tro, desde la membrana plasmática a los endosomas y lisosomas (Figura 13-3). Para poder realizar su función, cada vesícula de transporte que emerge de un compartimiento ha de tomar sólo las proteínas apropiadas y únicamente ha de fusionarse con la membrana diana apropiada. Así, por ejemplo, una vesícula que va del complejo de Golgi a la membrana plasmática no puede llevarse proteí nas que deben residir en el com plejo de Golgi, y sólo ha de fusionarse con la mem brana plasmática y no con otros orgánulos. Asimismo, a pesar de participar en este flujo constante de com ponentes de membrana, cada orgánulo ha de mantener su propia identidad diferencial. En este capítulo consideraremos la función del com plejo de Golgi, de los lisosomas, de las vesículas de secreción y de los endosomas, y veremos las vías por las cuales estos orgánulos están interconectados. En la parte final consideraremos los mecanismos moleculares de la gemación y fusión que se dan en todo transporte vesicular, y discutiremos el problema fundamental de cómo, a pesar de este transporte, se mantienen las di ferencias en los compartimientos.
Transporte desde el ER al complejo de Golgi1 Como ya hemos visto en el Capítulo 12, las proteínas sintetizadas de novo entran en la ruta biosintética-secretora cuando atraviesan la membrana del ER desde el citosol. El transporte posterior, desde el ER al complejo de Golgi y desde éste a la superficie celular o a cualquier otro sitio, tiene lugar a través de vesículas. Estas vesículas transfieren las proteínas de una membrana a otra o de un lumen a otro, mediante ciclos de gemación y fusión (véase Figura 12-7). La vía que va desde el ER, pasando por el complejo de Golgi, hasta la superficie celular se lla ma a menudo vía por defecto ya que parece que las proteínas no necesitan pre-
642
Capítulo 13 : Tráfico vesicular mediante las rutas secretora y endocítica
Figura 13-3 Los compartimientos intracelulares de una célula eucariota implicados en la ruta biosintéticasecretora y en la vía endocítica. Cada compartimiento limita un espacio que es topológicamente equivalente al exterior de la célula. Un lumen cualquiera se comunica con otro cualquiera mediante vesículas de transporte. En la ruta biosintéticasecretora (flechas rojas) las proteínas son transportadas desde el ER a la membrana plasmática o (vía endosomas tardíos) a los lisosomas. En la ruta endocítica (flechas verdes) las moléculas son ingeridas mediante vesículas formadas a partir de la membrana plasmática, conducidas a los endosomas tempranos y, vía endosomas tardíos, a los lisosomas. Muchas moléculas endocitadas son recuperadas de los endosomas tempranos y retornadas a la superficie celular para ser reutilizadas; de forma similar, algunas moléculas son recuperadas de los endosomas tardíos y devueltas al complejo de Golgi, y algunas son recuperadas del Golgi y devueltas al ER. Todas estas rutas de recuperación se muestran con las
flechas azules.
CITOSOL NUCLEO
PEROXISOMA
MITOCONDRIA
PLASTIDOS
RETICULO ENDOPLASMATICO GOLGI LISOSOMA
VESICULAS SECRETORAS
ENDOSOMA SUPERFICIE CELULAR
sentar determinadas señales para seguirla: cualquier protema que entre en el ER (y se pliegue y se forme correctamente) será transportada automáticamente a través del complejo de Golgi hacia la superficie celular, a menos que contenga señales que o bien la detengan en algún compartimiento de la ruta o bien la des víen, pasando por el complejo de Golgi, hacia los lisosomas o las vesículas de se creción. En esta sección vamos a centrarnos en el com plejo de Golgi, que es un im portante punto de síntesis glucídica y un lugar de clasificación y distribución de los productos del ER. Muchos de los polisacáridos celulares son sintetizados en el complejo de Golgi, entre ellos la pectina y la hemicelulosa de la pared celular de las plantas y la mayoría de los glucosaminoglucanos de la matriz extracelular de las células animales (véase Capítulo 19). Pero el complejo de Golgi también constituye una zona de paso de los productos del ER, de manera que una gran parte de los glúcidos que fabrica el Golgi se unen como cadenas de oligosacáridos a las proteínas y lípidos que el ER le envía. Algunos oligosacáridos actúan como señales que dirigen determinadas proteínas hacia vesículas que las envia rán a los lisosomas; otras proteínas y lípidos, una vez adquiridos los oligosacári dos apropiados en el complejo de Golgi, son distribuidas mediante vesículas de transporte a otras partes de la célula.
El com plejo de Golgi está formado por una serie de com partim ientos ordenados2 El com plejo de Golgi se localiza normalmente cerca del núcleo celular, y en una célula animal a menudo está cerca del centrosoma, o centro celular. Está forma do por una serie de cisternas limitadas por una membrana y de forma aplanada que se parecen a un m ontón de platos. Normalmente estos dictiosom as del Gol gi presentan entre cuatro y seis cisternas (Figura 13-4). El número de dictioso mas del Golgi por célula varía enormemente en función del tipo celular: algunas células animales tienen un gran dictiosoma, mientras que ciertas células vegeta les presentan cientos de dictiosomas muy pequeños. Multitud de pequeñas vesículas se hallan asociadas a los dictiosomas del Golgi, agrupadas en la cara contigua al ER y a lo largo de los anillos dilatados de cada cisterna (véase Figura 13-4). Se cree que estas vesículas del Golgi son vesí culas de transporte de proteínas y de lípidos hacia y desde el Golgi y entre las cisternas del Golgi. Durante su paso a través del complejo de Golgi, las m olécu las transportadas sufren una serie de modificaciones covalentes ordenadas.
Figura 13-4 El complejo de Golgi. (A) Dibujo tridimensional del complejo de Golgi, a partir de micrografías de una célula secretora animal. (B) Electronmicrografía de un complejo de Golgi de una célula vegetal (del alga verde Chlamydomonas), visto en sección transversal. Se pueden observar dos dictiosomas. Generalmente, en las células vegetales el complejo de Golgi es más diferenciado y está más claramente separado de los otros sistemas membranosos intracelulares que en las células animales. (A, a partir de A. Rambourg e Y. Clermont, Eur. J. CellBiol. 51:189-200, 1990; B, por cortesía de George Palade.)
cara cis
Vesícula del Golgi
red del cis Golgi cisterna cis cisterna m edial cisterna trans red del trans Golgi
vesícula de secreción
i____________ i 2Û0 fim
(A)
cara trans
Transporte desde el ER al complejo de Golgi
(B)
643
Figura 13-5 Célula caliciforme del intestino delgado. Esta célula está especializada en la secreción de mucus, una mezcla de glucoproteínas y de proteoglucanos sintetizados en el ER y en el complejo de Golgi. El complejo de Golgi está altamente polarizado, lo cual facilita la descarga del mucus mediante exocitosis en la superficie apical de la célula. (De R.V.Krstic, Ilustrated Encyclopedia of Human Histology. New York: Springer-Verlag, 1984.)
secreción de m ucus a través de la superficie apical
Los dictiosomas del Golgi tienen dos caras distintas: una cara cis (o cara de entrada) y una cara trans (o cara de salida). Ambas caras están conectadas a unos compartimientos especiales, formados por una red de estructuras tubula res y cisternas, que son, respectivamente, la red del cis Golgi (también llamada compartimiento intermediario o de salvamento) y la red del trans Golgi. Las proteínas y lípidos entran por la red del cis Golgi en vesículas de transporte que provienen del ER y salen por la red del trans Golgi en vesículas de transporte con destino a la superficie celular o a otro compartimiento. Se cree que ambas redes son importantes en la clasificación de las proteínas: las proteínas que entran en la red cis pueden seguir a través del Golgi o bien volver al ER; las proteínas que salen de la red trans están clasificadas según su destino sea los lisosomas, las ve sículas de secreción o la superficie celular. El complejo de Golgi es prominente en las células que están especializadas en la secreción, tales como las células caliciformes del epitelio intestinal, las cua les secretan al intestino grandes cantidades de moco rico en polisacáridos. En células de este tipo, se forman grandes vesículas a partir de la cara trans del complejo de Golgi, el cual se encara hacia el dominio de la membrana plasmáti ca por el que tiene lugar la secreción (Figura 13-5).
Las proteínas residentes en el ER son selectivamente recuperadas de la red del cis Golgi3 Las vesículas destinadas al complejo de Golgi emergen desde regiones especiali zadas del ER llamadas elementos transicionales, cuya membrana no tiene ribosomas adheridos y se encuentra a menudo entre el ER rugoso y el complejo de Golgi (Figura 13-6). Se cree que estas vesículas no son selectivas. Transportan cualquier proteína desde el ER al complejo de Golgi, aunque puede haber señales que favorezcan este proceso. No obstante, existe un requerimiento esencial para que una proteína salga del ER: ha de estar correctamente plegada y formada. Las proteínas que no tienen la conformación correcta o que están incompletas son retenidas, o bien unidas a la proteína de unión especial BiP (discutido en el Capí tulo 12) o bien formando agregados que no pueden ser empaquetados, y final-
m om brana nuclear
ER rugoso
elementos transicionales red det
cis Golgi
I_________________________i 1 iim
644
Capítulo 13 : Tráfico vesicular mediante las rutas secretora y endocítica
!_________ 1 10 virn
Figura 13-6 Electronmicrografía de los elementos transicionales y de la red del cis Golgi. De los elementos transicionales del ER emergen vesículas de transporte por gemación; estos elementos transicionales están casi completamente libres de ribosomas y se fusionan con la red del cis Golgi, transfiriendo así proteínas y lípidos acabados de sintetizar desde el ER hasta el complejo de Golgi. (Por cortesía de Brij J. Gupta.)
red del cis Golgi
dictiosom a
red del trans Golgi
mente son degradadas en el propio ER. Así pues, la salida desde el ER puede ser considerada como un control de calidad: si la proteína no se pliega o no se forma correctamente, es descartada. De hecho, el ER parece que es uno de los principa les lugares de la célula donde se degradan proteínas (los otros son los lisosomas, como veremos más adelante, y el citosol, como vimos en el Capítulo 5). Las proteínas que están bien plegadas no necesitan ninguna señal específica para que sean transportadas fuera del ER, pero aquellas que, como la proteína BiP, se encuentran en el lumen del ER necesitan una señal para quedarse en él. Esta retención de las proteínas solubles residentes en el ER está mediada por una señal de clasificación constituida por una corta secuencia, de cuatro am inoáci dos: KDEL (Lys-Asp-Glu-Leu) u otra similar (véase Tabla 12-3). Si, por ejemplo, mediante ingeniería genética se elimina esta señal de retención en ER de la proteí na BiP, se observa cómo esta proteína es secretada al exterior de la célula; y si la señal se transfiere a una proteína que normalmente es secretada, ahora queda re tenida en el ER. Esta señal de retención no consiste en un anclaje de las proteínas residentes en el lumen del ER sino en una recuperación selectiva después de que hayan sido transportadas en vesículas y descargadas en la red del cis Golgi. En la red del cis Golgi, un receptor de membrana específico une a todas las proteínas que presentan la señal de retención en ER y las empaqueta en vesículas de trans porte especiales que las devuelve al ER. Así pues, para estas proteínas residentes el ER es como una prisión abierta: no hay nada que impida que salgan, pero si lo hacen, son transportadas de nuevo al interior del ER (Figura 13-7).
Figura 13-7 Mecanismo utilizado para retener las proteínas residentes en el ER. Las proteínas residentes en el ER que se escapan hacia la red del cis Golgi son devueltas al ER mediante transporte vesicular. Un receptor de membrana en la red cis Golgi captura las proteínas y las conduce, en vesículas de transporte, hacia el ER. Las condiciones iónicas presentes en el ER separan las proteínas de su receptor, de forma que el receptor regresa a la red del cis Golgi para ser reutilizado. Se han encontrado también receptores que reconocen la señal de retención en ER en las cisternas cis, medial y trans del Golgi. De esta manera, la recuperación de proteínas del ER empieza en la red del cis Golgi, pero la ruta de retomo también funciona en las cisternas más trans del Golgi. En el lumen del ER se producen interacciones entre las proteínas residentes en el ER, que ayudan a su retención. Estas interacciones retardan la salida de las proteínas del ER en relación con las proteínas que han de ser secretadas (proteínas de secreción). En experimentos en los que se ha eliminado la señal de retención de ER de la proteína BiP, se observa cómo la BiP abandona el ER y es secretada por las células; ahora bien, su salida del ER tiene lugar más lentamente que las proteínas de secreción bona fide, lo cual indica que BiP es parcialmente retenida en el ER mediante interacciones débiles con otras proteínas.
Las proteínas del Golgi vuelven al ER cuando las células se tratan con la droga brefeldina A4 El continuo retorno de las proteínas residentes en el ER desde la red del cis Golgi implica que el transporte entre estos dos orgánulos tiene lugar en ambas direc ciones. Como ya se menciona en el pie de la Figura 13-7, los receptores que reco nocen la señal de retención en ER se encuentran también en los compartimien tos más trans del Golgi, de manera que quizá existe una ruta de retomo desde ellos al ER. La importancia de esta ruta de retomo se ilustra muy bien usando la droga brefeldina A, la cual bloquea la secreción de proteínas ya que desorganiza el complejo de Golgi. En células tratadas con brefeldina A, el complejo de Golgi desaparece y sus proteínas se acaban encontrando en el ER, donde se mezclan con las propias del ER. Cuando se elimina la droga, el complejo de Golgi se vuelve a organizar y sus proteínas retoman a sus compartimientos (Figura 13-8). Para explicar estas observaciones, se ha propuesto que la brefeldina A blo quea el transporte hacia delante -desde el ER al complejo de Golgi- sin afectar
Transporte desde el ER al complejo de Golgi
645
Figura 13-8 Electronmicrografías que muestran el efecto del tratam iento con brefeldina A sobre el complejo de Golgi. Una tinción histoquímica permite ver la localización de una enzima del Golgi (una manosidasa) antes (A) y dos horas después (B) del tratamiento con brefeldina A sobre fibroblastos en cultivo. Nótese que después del tratamiento, la enzima pasa de las cisternas cis y m e d ia l del Golgi al ER y a la membrana nuclear, que es continua con el ER. (Por cortesía de Jennifer Lippincott-Schwartz y Lydia Yuan.)
al transporte de retorno -desde el Golgi al ER (Figura 13-9). En este sentido, la droga provocaría que las proteínas del complejo de Golgi se vaciasen al ER m e diante la ruta de retorno y, cuando la droga desapareciese, la vía hacia delante se encargaría de devolver las proteínas del Golgi a sus compartimientos.
En el com plejo de Golgi se procesan las cadenas de oligosacárido5 Como se ha descrito en el Capítulo 12, en el ER se añade un mismo tipo de Noligosacárido a muchas proteínas diferentes, y este oligosacárido se modifica profundamente mientras las proteínas todavía están en el ER. En el complejo de Golgi se producen modificaciones posteriores, dependiendo de la proteína. El resultado es que en las glucoproteínas de mamífero se encuentran dos grandes tipos de N-oligosacáridos, los oligosacáridos complejos y los oligosacáridos ricos en mañosa. Algunas veces ambos tipos de oligosacáridos están unidos (en luga res diferentes) a la misma cadena polipeptídica. Los oligosacáridos ricos en m a ñosa no presentan azúcares que hayan sido añadidos en el complejo de Golgi. Sólo contienen dos iV-acetilglucosaminas y muchos residuos de mañosa, cuyo número a menudo se acerca al número de residuos que se hallan presentes en el precursor del oligosacárido original unido a lípido, del ER. Por el contrario, los oligosacáridos complejos pueden tener más de las dos moléculas de iV-acetilglucosamina originales y tam bién pueden presentar un número variable dé ga-
646
Capítulo 13: Tráfico vesicular mediante las rutas secretora y endocítica
Figura 13-9 Ruta de retorno propuesta que va desde el complejo de Golgi al ER. Mientras que la ruta hacia delante precisa de vesículas de transporte y tiene lugar independientemente de los microtúbulos, se cree que la ruta de retorno precisa de unos túbulos membranosos que emergen del complejo de Golgi hacia el ER siguiendo los microtúbulos (los cuales son fragmentados por drogas como el nocodazol). Como ya hemos dicho anteriormente, la brefeldina A evita la unión de las cubiertas que son necesarias para la gemación de las vesículas de transporte, de manera que bloquea los pasos del transporte vesicular hacia delante y m antiene intacto el proceso de transporte hacia atrás, dependiente de túbulos de membrana.
NH Asn Ser o Thr CO
(A)
(B)
CLAVE ( ^ y = /V-acetilglucosamina (GIcNAc) = manosa (Man) ( ~ \ = galactosa (Ga
#
= ácido A/-acetilneuramínico (ácido siálico, o NANA)
lactosas y de residuos de ácido siálico, y en algunos casos, de fucosa. El ácido siálico tiene una importancia especial porque es el único residuo de azúcar de las glucoproteínas con una carga negativa neta (Figura 13-10). Los oligosacáridos complejos se generan mediante una combinación de modificaciones posteriores del oligosacárido original, añadido en el ER, y por la adición de nuevos azúcares. El hecho de que un determinado oligosacárido se mantenga rico en mañosa o sea procesado viene determinado fundamental mente por su configuración sobre la proteína a la cual se halla unido: si el oligo sacárido es estéricamente accesible a las enzimas procesadoras del Golgi, es pro bable que se convierta en una forma compleja; si es inaccesible a ellas, es probable que se mantenga como una forma rica en mañosa. El proceso que ge nera cadenas de oligosacáridos complejos sigue la vía altamente ordenada que se muestra en las Figuras 13-11 y 13-12.
Las cisternas del Golgi están organizadas en form a de series secuenciales de com partim ientos de procesam iento6 Las proteínas exportadas desde el ER entran al primero de los compartimientos del Golgi (el com partim iento cis), que se cree que es continuo con la red del cis Golgi; luego se desplazan al siguiente compartimiento (el com partim iento m e dial, formado por la cisterna central del dictiosoma), y finalmente se desplazan al com partim iento trans, donde se completa la glucosilación. Se cree que el lu men del compartimiento trans continúa con la red del trans Golgi, donde las proteínas se segregan en diferentes vesículas de transporte y se liberan a sus destinos finales -la membrana plasmática, los lisosomas, o las vesículas de se creción. Estas rutas de procesamiento de oligosacáridos tienen lugar según una se cuencia ordenada en el dictiosoma, en el que cada cisterna contiene sus propias enzimas. Las proteínas se modifican a través de sucesivas etapas a medida que van de cisterna en cisterna a través del dictiosoma, de forma que las cisternas constituyen una unidad de procesamiento múltiple. Esta compartimentación podría parecer innecesaria, ya que cada enzima sólo actúa sobre su glucoproteína después de que haya sido convenientemente procesada por la enzima ante rior. Sin embargo, parece claro que el procesamiento tiene lugar tanto en una secuencia espacial como en una secuencia bioquímica: así, las enzimas que ca talizan las primeras etapas se localizan en las cisternas más cis del dictiosoma, mientras que las que catalizan las últimas etapas se encuentran en las cisternas más trans.
Transporte desde el ER al complejo de Golgi
Figura 13-10 Ejemplos de las dos clases principales de oligosacáridos unidos a asparagina (AT-oligosacáridos) encontrados en glucoproteínas maduras. En (B) se muestra un oligosacárido complejo y en (C) un oligosacárido rico en mañosa. Todo oligosacárido complejo consta de una región central (en color en A) que deriva del Af-oligosacárido original añadido en el ER y que consta de forma característica de dos Af-acetilglucosaminas (GlcNAc) y tres mañosas (Man). Además, existe una región terminal que contiene un número variable de unidades de trisacáridos (Af-acetilglucosaminagalactosa-ácido siálico) unidas al núcleo de mañosas. Frecuentemente la región terminal está truncada y contiene sólo GlcNAc y galactosa (Gal) o sólo GlcNAc. Normalmente se puede añadir un residuo de fucosa al núcleo de GlcNAc unido a la asparagina (Asn). Así pues, aunque las etapas de procesamiento y posterior adición de azúcares están ordenadas estrictamente, los oligosacáridos complejos pueden ser heterogéneos: por ejemplo, mientras que el oligosacárido complejo que se muestra en la figura tiene tres ramas terminales, también es habitual encontrar oligosacáridos con dos o con cuatro ramas, en función de la glucoproteína de que se trate y de la célula en la que se fabrique. También se encuentran oligosacáridos “híbridos” con una rama de Man y otra de GlcNAc-Gal. Los tres aminoácidos que en esta figura se presentan en color constituyen la secuencia reconocida por la enzima oligosacaril transferasa que añade el oligosacárido inicial a la proteína. Abreviaturas: Ser = serina; Thr = treonina; X = cualquier aminoácido.
647
glucosidasa I manosidasa del Golgi
glucosidasa II
/v-acetilgl ucosa mina transferasa I O - UDP UDP
000
manosidasa del ER
manosjdasa del Goigi
se obtiene el oligosacárido com pleto al añadir dos GlcNAc, tres Gal y tres NANA O el próxim o se añade aquí LUMEN DEL GOLGI
LUMEN DEL ER
CLAVE: O = /V-acetilglucosamina (GlcNAc)
Q = manosa (Man)
sensibles a Endo-H
resistentes a Endo-Hi
0 = glucosa (Glc)
Figura 13-11 Procesam iento de los oligosacáridos en el ER y en el complejo de Golgi. El proceso es altamente ordenado, de forma que cada uno de los pasos depende de las reacciones anteriores de cada serie. El procesamiento comienza en el ER con la eliminación de los residuos de glucosa del oligosacárido inicialmente transferido a la proteína. A continuación, una manosidasa de la membrana del ER elimina un determinado residuo de mañosa. En los dictiosomas del Golgi, la manosidasa I elimina tres residuos más de mañosa y la iV-acetilglucosamina transferasa I añade un residuo de GlcNAc, lo cual permite que la manosidasa II elimine dos residuos más de mañosa. Así, se obtiene el núcleo final de tres residuos de mañosa que se presenta en un oligosacárido complejo. En este estadio, el enlace que existe entre los dos residuos de GlcNAc del núcleo del oligosacárido se vuelve resistente al ataque de una endoglucosidasa altamente específica [Endo-H). Todas las estructuras posteriores son resistentes a Endo-H, por lo que se utiliza el tratamiento con esta enzima para distinguir los complejos de oligosacáridos ricos en mañosa. Por último, como se muestra en la Figura 13-10, se añaden residuos de GlcNAc, de galactosa y de ácido siálico. Algunos oligosacáridos pueden escaparse del procesamiento del complejo de Golgi, mientras que otros seguirán el proceso que se muestra, con algunas variantes. La complejidad del proceso depende del tipo de proteína y de la localización en la proteína del residuo de asparagina al que se halla unido el oligosacárido.
UDP-GIcNAc
UDP-Gal
CMP-IMANA
Figura 13-12 Etapas finales en la síntesis de un oligosacárido complejo. L
OH
OH CMP
"región central" del oligosacárido
nucleosido difosfatasa UMP
648
glucoproteína
UMP
CMP
Capítulo 13: Tráfico vesicular mediante las rutas secretora y endocítica
adición progresiva de residuos de azúcar se produce en los compartimientos de las cisternas del complejo de Golgi. Tres tipos de enzimas glucosil transferasa actúan de forma secuencial, utilizando como substrato azúcares que han sido activados mediante su unión a determinados nucleótidos (los que se indican en la figura). Las membranas de las cisternas del Golgi contienen proteínas transportadoras transmembrana específicas que permiter a cada azúcar-nucleótido entrar por intercambio con su producto nucleótido monofosfato, que es liberado después de que el azúcar se una a la proteína en la cara luminal (no se muestra). En la parte superior de la figura se muestra la estructura de los compuestos azúcarnucleótido UDP-AT-acetilglucosamina, UDP-galactosa y CMP-AT-ácido acetilneuramínico.
Figura 13-13 Contrastado histoquímico que dem uestra que el complejo de Golgi está bioquímicamente polarizado. La serie de electronmicrografías muestra el com plejo de Golgi sin contrastar (A), contrastado con osmio (B), el cual es reducido preferentemente por las cisternas del compartimiento cis, y contrastado revelando la localización de una enzima específica (C y D). La enzima nucleósido difosfatasa (véase Figura 13-12) se halla en las cisternas del trans Golgi (C), mientras que la enzima fosfatasa àcida marca la red del trans Golgi (D). (Por cortesía de Daniel S. Friend.)
Se cree que el transporte de proteínas entre las diferentes cisternas del Golgi tiene lugar mediante vesículas de transporte, las cuales surgen por gemación de una cisterna y se fusionan con la siguiente. Se supone que las vesículas que se desplazan entre las cisternas del Golgi no seleccionan la carga, como ya sucedía con las que viajan desde el ER al complejo de Golgi. Así, cualquier proteína solu ble o de membrana que no sea considerada residente puede entrar en las vesícu las de transporte y desplazarse a través de la ruta biosintética-secretora desde la cisterna cis a la trans pasando por la medial. Casi todo lo que sabemos sobre el mecanismo molecular del transporte vesicular fue descrito originalmente utili zando sistemas in vitro para medir el transporte proteico entre las cisternas del Golgi (véase Panel 13-1, págs. 682-683). Los electronmicroscopistas han visto pe queños túbulos membranosos que parecen interconectar algunos dictiosomas, y es posible que a través de estas estructuras tenga lugar algún tipo de transfe rencia de material desde una cisterna a la siguiente. Las diferencias funcionales entre las subdivisiones cis, medial y trans del com plejo de Golgi fueron descubiertas mediante la localización, tanto por fracciona miento físico del orgánulo como por electronmicroscopia marcando con anticuer pos las enzimas implicadas en el procesamiento de los AT-oligosacáridos en distintas regiones del orgánulo. Por ejemplo, se encontró que la separación de los residuos de mañosa y la adición de iV-acetilglucosamina tenía lugar en el compar timiento medial, mientras que la adición de galactosa y de ácido siálico ocurría en el compartimiento trans y en la red del trans Golgi (Figura 13-13). La compartimentación funcional del complejo de Golgi está resumida en la Figura 13-14.
Los proteoglucanos son ensamblados en el complejo de Golgi7 No sólo son las cadenas de Af-oligosacárido de las proteínas las que son alteradas a medida que las proteínas pasan a través de las cisternas del Golgi, en su camino desde el ER a sus destinos finales; muchas proteínas también son modificadas de otras formas. Por ejemplo, algunas proteínas tienen azúcares añadidos a los grupos OH de las cadenas laterales de determinadas serinas o treoninas. Como el creci miento de las cadenas de Af-oligosacáridos, esta O-glucosilación está catalizada por series de enzimas glucosiltransferasas que utilizan compuestos azúcar-nucleótido en el lumen del Golgi para añadir residuos de azúcar, uno a uno, a una proteí na. Habitualmente primero se añade la Af-acetilgalactosamina, y a continuación un número variable (desde unos pocos a 10 o más) de residuos de azúcar. De todas las proteínas glucosiladas, las que lo están más son algunas proteí nas nucleares de proteoglucanos, las cuales son modificadas en el complejo de Golgi produciendo proteoglucanos. Tal como se explica en el Capítulo 19, esto implica la polimerización de una o más cadenas de glucosaminoglucano (largos polímeros no ramificados compuestos por unidades repetidas de disacáridos) vía una unión a xilosa en las serinas de las proteínas nucleares. Muchos proteo glucanos son secretados y pasan a ser componentes de la matriz extracelular, mientras que otros permanecen anclados a la membrana plasmática. Otros constituyen el com ponente principal de substancias como el moco que es secre tado formando una cubierta protectora sobre muchos epitelios. Los azúcares incorporados a los glucosaminoglucanos son altamente sulfata dos inmediatamente después de que los polímeros se hayan formado en el com plejo de Golgi, lo cual ayuda a dar la elevada carga negativa que presentan los pro-
Transporte desde el ER al complejo de Golgi
1 tini
649
SINTESIS PROTEICA ER
Un r'/% (
y
L J'
'
• fosforilación de oligosacáridos lisosom ales eliminación de manosa
eliminación de manosa
com plejo de Goigi
ii-r adición de
.M/-;
red del cis Golgi cisterna cis cisterna dictiosom a m edial
G c íI
red del trans Golgi
m em brana plasmática teoglucanos. Algunos residuos de tirosina también son sulfatados en este estadio. En ambos casos la sulfatación depende de un dador de sulfato (3’-fosfoadenosina5’-fosfosulfato, o PAPS, de 3 ’-phosphoadenosine-5’-phosphosulfate), que es trans portado desde el citosol al lumen del compartimiento trans del Golgi.
Los carbohidratos de las m em branas celulares se encuentran en la cara de la m em brana que es topològicamente equivalente al exterior de la célula8 Dado que todos los oligosacáridos son incorporados en el lado luminal del ER y del com plejo de Golgi, la distribución de carbohidratos en las proteínas de membrana y en los lípidos es asimétrica. Tal como ocurre con la asimetría de la bicapa lipidica, la orientación asimétrica de estas moléculas glucosiladas se mantiene durante su transporte a la m em brana plasmática, a las vesículas de secreción, o a los lisosomas. Por lo tanto, los oligosacáridos de todas las glucoproteínas y glucolípidos de las m embranas intracelulares correspondientes se encuentran encarados hacia el lado luminal, mientras que en la membrana plasmática se encuentran encarados hacia el exterior de la célula (Figura 13-15).
¿Cuál es el propósito de la glucosilación? 9 Existe una diferencia importante entre la construcción de un oligosacárido y la síntesis de otras macromoléculas como el DNA, el RNA o las proteínas. Mientras que los ácidos nucleicos y las proteínas son copiados de un molde a través de una serie repetida de pasos idénticos y utilizando la(s) misma(s) enzima(s), los car bohidratos complejos requieren una enzima diferente en cada paso, de forma que cada producto de una reacción es reconocido como el substrato exclusivo por la siguiente enzima de la serie. Dado lo complicadas que son las vías que han tenido que evolucionar para sintetizar estos oligosacáridos, parece probable que
650
Capítulo 13: Tráfico vesicular mediante las rutas secretora y endocítica
Figura 13-14 Compartimentación funcional del complejo de Golgi. La localización de cada una de las etapas de procesamiento que se muestran en la figura ha sido determinada por medio de la combinación de técnicas, entre las que se encuentran el subfraccionamiento de las membranas del complejo de Golgi y la electronmicroscopia tras la tinción con anticuerpos específicos contra algunas de las enzimas específicas de procesamiento. La localización de muchas otras reacciones de procesamiento todavía no ha sido determinada. A pesar de que sólo se ha podido demostrar la existencia de tres compartimientos de cisternas, a veces cada uno de ellos está formado por un grupo de dos o más cisternas secuenciales, y es posible que haya subdivisiones aún por descubrir. También podría ser que hubiese sólo tres compartimientos funcionalmente distintos y que las cisternas extra representasen múltiples copias de uno de las tres unidades funcionales. No obstante, no está claro si cada enzima está restringida a una cisterna concreta o si su distribución varía a lo largo del dictiosoma -de manera que las enzimas que actúan primero están presentes mayoritariamente en las cisternas cis del Golgi, mientras que las que actúan más tarde están sobretodo en las cisternas trans del Golgi.
m em brana plasm ática
ESPA CIO
Figura 13-15 Los azúcares de las glucoproteínas de membrana y de los glucolípidos están orientados hacia afuera del citosol. La orientación que tiene una proteína transmembrana en la membrana del ER se mantiene cuando esta proteína es transportada a otras membranas. Los puntos coloreados del final de cada molécula de glucoproteína representan el 7V-oligosacárido añadido a las proteínas en el lumen del ER. Nótese que estos residuos de azúcar están confinados en el lumen de cada uno de los orgánulos internos de la célula, y que después de que la vesícula de transporte se haya fusionado con la membrana plasmática aparecen expuestos hacia el espacio extracelular. Lo mismo sirve para los residuos de azúcar de los glucolípidos y los O-oligosacáridos producidos en el complejo de Golgi.
formando parte de los glucolípidos y de las glucoproteínas desempeñen funcio nes importantes, aunque todavía se desconocen la mayoría de estas funciones. La iV-glucosilación, por ejemplo, es predominante en todos los eucariotas, incluyendo las levaduras, pero no se presenta en procariotas. En la mayoría de las proteínas transportadas a través del ER y del complejo de Golgi -u n proceso que es exclusivo de las células eucariotas- se hallan presentes uno o más TV-oligosacáridos, por lo que se creyó que su función era la de colaborar en los proce sos de transporte. No obstante, por regla general las drogas que bloquean deter minados pasos de la glucosilación no interfieren con el transporte (con la importante excepción del transporte a los lisosomas, que se explicará más ade lante). Además, las células mutantes que tienen bloqueados varios pasos de glu cosilación del Golgi son viables en cultivo y transportan proteínas normalmente. En ausencia de glucosilación la mayoría de la proteínas retienen sus actividades normales, aunque algunas no se pliegan correctam ente sin sus oligosacáridos normales, y por lo tanto precipitan en el ER y no son transportadas.
(A)
Transporte desde el ER al complejo de Golgi
(B)
*
Figura 13-16 Estructura tridimensional de un pequeño iV-oligosacárido. La estructura fue determinada por análisis cristalográfico de rayos X de una glucoproteína. Este oligosacárido tan sólo contiene 6 residuos de azúcar, mientras que el iV-oligosacárido transferido inicialmente a las proteínas en el ER tiene 14 residuos de azúcar (véase Figura 12-48). (A) Modelo del esqueleto del compuesto, en el que se muestran todos los átomos excepto los de hidrógeno; (B) modelo espacial en el que la asparagina se presenta en negro. (Por cortesía de Richard Feldmann.)
651
Dado que las cadenas de azúcar tienen una flexibilidad limitada, incluso los Af-oligosacáridos más pequeños sobresalen de la superficie de las glucoproteínas (Figura 13-16), de forma que pueden limitar la aproximación de otras macromoléculas a la superficie de la glucoproteína. De esta manera, por ejemplo, la presencia de oligosacáridos tiende a hacer que una glucoproteína sea relativa mente resistente a la digestión por proteasas. Podría ser que los oligosacáridos provinieran originalmente de una célula eucariota ancestral que tuviera una cu bierta protectora, la cual, a diferencia de la rígida pared celular bacteriana, per mitiera a la célula una cierta libertad para cambiar de forma y para moverse. Desde entonces los oligosacáridos pueden haber sido modificados en el sentido de que tam bién sean útiles para otros fines: por ejemplo, las selectinas -polisacáridos unidos a las proteínas de la superficie celular- intervienen en la adhe sión entre dos células, como ya se vio en el Capítulo 10.
Resumen El complejo de Golgi recibe las proteínas recién sintetizadas y los lípidos del ER, y los distribuye a la membrana plasmática, a los lisosomas y a la s vesículas de secre ción. Se trata de una estructura polarizada, form ada por una o más hileras de cis ternas en form a de disco, organizadas como series de por lo menos tres comparti mientos secuenciales distintos bioquímica y funcionalmente, llamados cis, medial y trans. Las cisternas cis y trans están conectadas a estaciones de clasificación, lla madas la red del cis y trans Golgi, respectivamente. Las proteínas bien plegadas son transportadas indiscriminadamente desde el lumen y la membrana del ER a la red del cis Golgi, pero las residentes del ER son devueltas. Las proteínas destinadas a las vesículas secretoras, a la membrana plasmática y a los lisosomas se desplazan a través del dictiosoma en la dirección cis a trans, pasando desde una cisterna a la si guiente, en serie. Finalmente, las proteínas alcanzan la red del trans Golgi, desde donde cada tipo de proteína parte a su destino final. Todas estas etapas de trans porte tienen lugar mediante vesículas, las cuales surgen por gemación de una mem brana y se fusionan con otra. El complejo de Golgi, a diferencia del ER, contiene muchos compuestos azúcarnucleótido; una diversidad de enzimas glucosil transferasas utilizan estos substra tos para realizar reacciones de glucosilación, tanto en moléculas de lípido como de proteína, a medida que éstas van pasando a través del complejo de Golgi. Los N-oli gosacáridos, por ejemplo, que se añaden a las proteínas en el ER, son a menudo mo dificados por eliminación de residuos de mañosa y por adición de azúcares adicio nales -como la N-acetilglucosamina, la galactosa y el ácido siálico. Además, el Golgi es el lugar donde se produce la O-glucosilación y donde las cadenas de glucosaminoglucanos se añaden a las proteínas centrales de proteoglucano form ando proteoglucanos. En el último compartimiento del Golgi también tiene lugar la sulfatación de azúcares de proteoglucanos y de determinadas tirosinas de las proteínas. CITOSOL
Transporte desde la red del t r a n s Golgi a los lisosomas Al parecer, todas las proteínas que pasan a través del complejo de Golgi, excepto las que son retenidas en él como residentes permanentes, son clasificadas en la red del trans Golgi de acuerdo con su destino final. El mecanismo de clasifica ción está especialmente bien estudiado para el caso de las proteínas destinadas al lumen de los lisosomas. En esta sección vamos a considerar este proceso de transporte selectivo. Empezaremos con una breve descripción de la estructura y de la función de los lisosomas.
Los lisosomas son el lugar principal de digestión intracelular10 Los lisosom as son vesículas membranosas que contienen enzimas hidrolíticas utilizadas para la digestión intracelular controlada de macromoléculas. Contie-
652
Capítulo 13 : Tráfico vesicular mediante las rutas secretora y endocítica
NUCLEO
PEROXISOMA
MITOCONDRIA
PLASTIDOS
RETICULO ENDOPLASMATICO
IE
5
GOLGI
LISOSOMA t í ENDOSOMA
VESICULAS SECRETORAS
SUPERFICIE CELULAR
0,05-0,5 um
Figura 13-17 Lisosomas. Las hidrolasas ácidas son enzimas hidrolíticas que están activas en condiciones ácidas. El lumen se mantiene a un pH ácido mediante la acción de una bomba de H+situada en la membrana, la cual utiliza la energía de hidrólisis del ATP para bombear H+ al interior del lisosoma.
nen alrededor de 40 tipos de enzimas hidrolíticas, entre las que se encuentran proteasas, nucleasas, glucosidasas, lipasas, fosfolipasas, fosfatasas, y sulfatasas. Todas ellas son hidrolasas ácidas, cuya actividad óptima se expresa a un pH cer cano a 5, que es el pH que se mantiene en el interior de los lisosomas. En este sentido el citosol está doblemente protegido contra el ataque de su propio siste ma digestivo. Normalmente, la membrana del lisosoma mantiene las enzimas alejadas del citosol, pero en el caso incluso de que se produzca alguna fuga, la dependencia ácida de la actividad de estas enzimas protege el contenido del ci tosol (cuyo pH es de aproximadamente 7,2). Como en el caso de otros orgánulos intracelulares, el lisosoma no sólo con tiene una dotación característica de enzimas sino una membrana envolvente también característica. La membrana lisosomal contiene, por ejemplo, proteí nas de transporte que permiten que se escapen los productos finales de la diges tión de macromoléculas, como los aminoácidos, azúcares y nucleótidos, de tal manera que estos productos puedan ser excretados o reutilizados por la célula. Tam bién contiene una bom ba de protones que utiliza la energía de hidrólisis del ATP para bom bear H+ al interior del lisosoma, manteniendo así el lumen a un pH ácido (Figura 13-17). La mayoría de las proteínas de la membrana lisosomal están altamente glucosiladas, lo cual puede ayudar a protegerlas de las proteasas lisosomales del lumen. Como veremos más adelante, los materiales endocitados son inicialmente descargados a unos orgánulos llamados endosomas antes de ser liberados a los lisosomas. Los endosomas también tienen bom bas de H+ que mantienen su lu men a un pH bajo, aunque no tan bajo como el de los lisosomas (Figura 13-18). Veremos cómo estas diferencias de pH son a menudo usadas para unir o separar las moléculas de sus receptores durante el transporte vesicular a lo largo de la ruta endocítica.
Figura 13-18 El bajo pH de los lisosomas y endosomas. Las proteínas marcadas con una sonda fluorescente sensible al pH (fluoresceína) y que son endocitadas por las células, pueden ser utilizadas para medir el pH en endosomas y lisosomas. Los diferentes colores son una muestra del pH que la sonda fluorescente encuentra en estos orgánulos. El pH en los lisosomas [rojo) es alrededor de 5, mientras que el pH en los diversos tipos de endosomas (azul y verde) va de 5,5 a 6,5. Este método fue usado originalmente en la década de 1890 por Metchnikoff, quien alimentaba células fagocíticas mediante partículas de tornasol y observaba cómo variaba su color del azul al rojo después de la ingestión. (Por cortesía de Fred Maxfield y Kenneth Dunn.) Transporte desde la red del trans Golgi a los lisosomas
653
Figura 13-19 Visualización histoquímica de los lisosomas. Electronmicrografía de dos secciones de una célula contrastadas para poner de manifiesto la localización de la fosfatasa ácida, una enzima marcadora de lisosomas. Los grandes orgánulos rodeados de membrana, que contienen precipitados densos de fosfato de plomo son lisosomas. Su diversa morfología refleja variaciones de la cantidad y de la naturaleza del material que están digiriendo. Los precipitados se producen cuando el tejido fijado con glutaraldehído (para fijar las enzimas en su sitio) se incuba con un substrato de la fosfatasa en presencia de iones plomo. En el panel superior se indican mediante flechas rojas dos pequeñas vesículas que probablemente transportan hidrolasas desde el complejo de Golgi. (Por cortesía de Daniel S. Friend.)
Los lisosomas son heterogéneos11 Los lisosomas fueron inicialmente descubiertos mediante el fraccionamiento bioquímico de extractos celulares, y más tarde fueron observados al microscopio electrónico. Son extraordinariamente diversos en cuanto a forma y tamaño, pero por procesos histoquímicos pueden ser identificados como miembros de una fa milia única de orgánulos, utilizando el precipitado producido por la acción de una hidrolasa ácida sobre su substrato, para mostrar qué orgánulos contienen la enzima (Figura 13-19). Utilizando este criterio, los lisosomas se hallan en todas las células eucariotas. La heterogeneidad de la morfología lisosomal contrasta con la uniformidad relativa de la mayoría de los demás orgánulos celulares. La diversidad refleja la amplia variedad de funciones digestivas mediadas por las hidrolasas ácidas, com o la digestión de desechos intra y extracelulares, la digestión de microorga nismos fagocitados, e incluso la nutrición celular. Por esta razón, a veces se considera a los lisosomas como una colección heterogénea de orgánulos distintos cuya característica común es un elevado contenido de enzimas hidrolíticas. Como veremos a continuación, es especialmente difícil aplicar una definición más ajustada que ésta en las células vegetales.
Las vacuolas de las plantas y de los hongos son lisosomas muy versátiles12 La mayoría de células vegetales y hongos (incluyendo las levaduras) tienen una o varias vesículas muy grandes y llenas de fluido, llamadas vacuolas, que ocupan más del 30% del volumen celular -cerca del 90% en algunos tipos celulares (Fi gura 13-20). Las vacuolas se parecen a los lisosomas de las células animales por que tienen numerosas enzimas hidrolíticas, pero sus funciones son muy diver sas. Las vacuolas vegetales pueden actuar como alm acén de nutrientes y de productos de desecho, como compartimiento de degradación, incrementando el volumen celular de una forma económ ica (Figura 13-21), y controlando la pre sión de turgencia (la presión osmótica que empuja hacia afuera la pared celular y que impide que la planta se marchite). En una misma célula se encuentran a menudo diferentes vacuolas con diferentes funciones (por ejemplo, digestión y alm acenam iento). La vacuola es im portante como aparato homeostático, permitiendo a las cé lulas vegetales resistir grandes variaciones de su entorno. Por ejemplo, cuando el pH del medio disminuye, el flujo de H+ hacia el citosol es controlado, al menos en parte, aumentando el transporte de H+ a la vacuola, de manera que el pH del citosol se m antiene constante. De forma parecida, muchas células vegetales m antienen una presión de turgencia casi constante a pesar de grandes cambios en la osmolaridad del fluido que les rodea. Esto lo consiguen cambiando la pre sión osmótica del citosol y de la vacuola -e n parte por la hidrólisis y resíntesis controlada en la vacuola de algunos polímeros como el polifosfato, y en parte por la alteración del transporte de azúcares, aminoácidos y otros metabolitos a
654
Capítulo 13: Tráfico vesicular mediante las rutas secretora y endocítica
200 nm
cloroplastos
vacuola
Figura 13-20 Las vacuolas de una célula vegetal. Esta electronmicrografía de células de una hoja joven de tabaco muestra cómo el citoplasma está reducido, debido a la enorme vacuola, a una delgada capa que contiene numerosos cloroplastos dispuestos contra la pared celular. La membrana de la vacuola recibe el nombre de tonoplasto. (Por cortesía de J. Burgess.)
pared celular]
tonoplastos
i__________________ i 10 Jim
través de las m embranas plasmática y vacuolar. La presión de turgencia controla estos flujos regulando las actividades de los diferentes transportadores de cada bicapa lipidica. Las substancias almacenadas en las vacuolas vegetales varían entre las dife rentes especies, desde la goma al opio y al aromatizante del ajo. A menudo, los productos almacenados tienen una función metabòlica. Por ejemplo, las proteí nas pueden ser guardadas durante años en las vacuolas de algunas células de muchas semillas, como los guisantes y las judías. Cuando estas semillas germi nan, las proteínas son hidrolizadas y los aminoácidos que se movilizan propor cionan alimento al embrión. Los antocianos, pigmentos que se encuentran en las vacuolas, dan color a los pétalos de muchas flores atrayendo los insectos polinizadores, mientras que las moléculas nocivas que se liberan de las vacuolas cuando una planta es comida o dañada, proporcionan un sistema de defensa contra los depredadores.
núcleo
Transporte desde la red del trans Golgi a los lisosomas
Figura 13-21 El papel de la vacuola en el control del tamaño de las células vegetales. Es posible conseguir un aumento del volumen celular sin que se produzca un aumento del volumen del citosol. La relajación local de la pared permite una expansión celular impulsada por la turgencia que conlleva la captación de agua en el interior de una vacuola en expansión (véase Figura 19-67). Finalmente el citoplasma queda confinado a un delgado estrato periférico, comunicado con la región perinuclear mediante cordones citoplasmáticos transvacuolares que contienen haces de filamentos de actina (no se muestran).
655
Los m ateriales son transportados hasta los lisosomas a través de varias rutas13 En general, los lisosomas son puntos de encuentro donde convergen diferentes corrientes del tráfico intracelular. Las enzimas digestivas son descargadas a ellos mediante una ruta que va por el ER y el complejo de Golgi, mientras que las subs tancias que deben ser digeridas llegan a ellos a través de por lo menos tres vías. De estas tres vías, la m ejor estudiada es la que siguen las macromoléculas que son endocitadas. De forma breve (más adelante discutiremos los detalles), las moléculas endocitadas son inicialmente transferidas a unas vesículas intracelulares pequeñas e irregulares, llamadas endosomas tempranos. Desde ellos, algunas de las moléculas endocitadas son seleccionadas y recicladas a la m em brana plasmática, mientras que otras se dirigen a los endosomas tardíos. Allí, los materiales que van a ser digeridos se encuentran con las hidrolasas lisosomales que provienen del complejo de Golgi, debido a la fusión de las vesículas de transporte de ambas rutas. El interior de los endosomas tardíos es medianamen te ácido (pH ~6), y se cree que es el lugar donde empieza la digestión hidrolítica de las moléculas endocitadas. A partir de los endosomas tardíos se forman los li sosomas, a pesar de que no se sabe exactam ente cómo ocurre. Durante este pro ceso de conversión, algunas moléculas de la membrana de los endosomas son eliminadas y se produce una disminución del pH interno. Todas las células disponen de una segunda ruta que aporta materiales a los lisosomas para su degradación, mediante la cual pueden ser destruidas partes obsoletas de la propia célula -u n proceso denominado autofagia. En una célula hepática, por ejemplo, una mitocondria tiene una vida media de 10 días. En las imágenes de microscopía electrónica de células normales se pueden observar li sosomas conteniendo (y probablemente digiriendo) mitocondrias así como otros orgánulos. Al parecer, el proceso de digestión supone que el orgánulo sea envuelto por membranas derivadas del ER, generándose un autofagosoma. Se cree que el autofagosoma se fusiona con un lisosoma (o un endosoma tardío). El proceso está altamente regulado, de forma que durante la remodelación celular se pueden seleccionar diferentes com ponentes celulares y ser destinados a su destrucción: por ejemplo, el ER liso que prolifera en una célula hepática en res puesta a la droga pentobarbital (discutido en el Capítulo 12) es eliminado selec tivamente por medio de la autofagia cuando esta droga es retirada. Como veremos más adelante, la tercera ruta que proporciona materiales a los lisosomas sólo tiene lugar en células que están especializadas en la fagocitosis de grandes partículas y de microorganismos. Estas células (macrófagos y neutrófílos en vertebrados) pueden ingerir grandes objetos y formar un fagosoma. Se cree que el fagosoma se transforma en lisosoma de la misma forma que hemos explicado para el caso del autofagosoma. Estas tres rutas se resumen en la Figura 13-22.
Algunas proteínas citosólicas son transportadas directamente a los lisosomas para ser degradadas14 Podría existir una cuarta ruta de degradación proteica que condujese hasta los li sosomas: algunas proteínas poseen ciertas señales en su superficie [llamadas se cuencias KFERQ, de lisina (K), fenilalanina (F), glutamato (E), arginina (R) y gluta mina (Q)] que son responsables de su selección para ser descargadas en los lisosomas y degradadas. Es posible que las secuencias KFERQ unan estas proteí nas a determinados orgánulos que vayan a ser autofagocitados, de manera que de forma indirecta también serían destruidas. Alternativamente, puede existir un transportador específico en la membrana del lisosoma que reconozca estas seña les y transfiera directamente las proteínas a través de la membrana lisosomal. Se conocen antecedentes de mecanismos no convencionales que desplazan proteínas a través de las membranas. Algunas de las proteínas que son secretadas al exterior de la célula, como el factor básico de crecimiento de los fibroblastos o la interleuquina-1, llegan a la superficie celular sin haber pasado nunca por la ruta
656
Capítulo 13 : Tráfico vesicular mediante las rutas secretora y endocítica
Figura 13-22 Tres rutas de degradación en los lisosomas. Cada
fagosom a
bacteria fagocitosis
mem brana / plasmática
endosoma tem prano endocitosis
retículo endoplasm ático
ENDOSOMA TARDÍO
LISOSOMA
ruta conduce a la digestión intracelular de materiales derivados de diferentes orígenes. Los compartimientos resultantes de estas tres rutas pueden, a veces, ser diferenciados morfológicamente -a ello se deben los términos “autofagolisosoma”, “fagolisosoma”, etc. No obstante, estos lisosomas sólo pueden diferenciarse por los diferentes materiales que están digiriendo.
m itocondria autofagosom a autofagia
clásica a través del ER y del complejo de Golgi. En la mayoría de los casos no se co noce qué membrana es atravesada por la proteína o cómo se cataliza su transporte transmembrana. En el caso de un pequeño péptido de levaduras, el factor feromona a, se sabe que el transporte tiene lugar directamente a través de la membrana plasmática mediante una bomba proteica impulsada por ATP que pertenece a la familia proteica de los transportadores ABC (discutido en el Capítulo 11). Así, es posible que bombas parecidas a ésta proporcionen sistemas de transporte “priva dos”, cada uno de ellos especializado en la transferencia de un pequeño y específi co grupo de proteínas a través de una membrana en particular.
Las enzimas lisosomales son clasificadas en la red del tran s Golgi por un receptor proteico unido a m em brana que reconoce la m añosa 6-fosfato15 Ahora consideraremos con más detalle el sistema que conduce la otra mitad del tráfico hasta los lisosomas -las hidrolasas lisosomales especializadas y las proteí nas de membrana. Ambos tipos de proteínas se sintetizan en el ER rugoso y son transportadas a través del complejo de Golgi. Las vesículas de transporte que conducen estas proteínas hasta los endosomas tardíos -lo s cuales forman más tarde los lisosom as- parten de la red del trans Golgi, incorporando las proteínas lisosomales y excluyendo todas las demás proteínas, que serán empaquetadas en otras vesículas de transporte y serán descargadas en otros lugares. ¿Cómo son reconocidas y seleccionadas las proteínas lisosomales con la precisión necesaria? Para las hidrolasas lisosomales la respuesta es conocida. Es tas hidrolasas presentan un solo marcador en forma de grupos de m añosa 6-fos fato (M6P), los cuales son añadidos exclusivamente a los Af-oligosacáridos de es tas enzimas lisosomales solubles, probablemente mientras están en el lumen de la red del cis Golgi. Los grupos M6P son reconocidos por los receptores M6P, que son proteínas transmembrana presentes en la red del trans Golgi. Estos re ceptores unen a las hidrolasas lisosomales y ayudan a concentrarlas en vesículas de transporte específicas que surgen por gemación de la red del trans Golgi y acaban fusionándose con los endosomas tardíos, descargando su contenido en el lumen de estos orgánulos. Como veremos más adelante, los receptores M6P son empaquetados en vesículas de transporte específicas en la red del trans Gol gi mediante unas proteínas de recubrimiento especiales que se ensamblan en la superficie citosólica de la membrana y permiten la gemación de las vesículas desde la red del trans Golgi. Transporte desde la red del trans Golgi a los lisosomas
657
precursor de una hidrolasa lisosom al TRANSPORTE DEPENDIENTE DE RECEPTOR
DISOCIACION A pH ÁCIDO
RECICLAJE DEL RECEPTOR red del trans Golgi
^
ELIMINACION DEL FOSFATO
receptor M6P en las « vesículas recubiertas de clatrina que emergen por gemación
El receptor de m añosa 6-fosfato viaja como una lanzadera, adelante y atrás, entre determinadas m em branas16
Figura 13-23 Transporte de las hidrolasas lisosomales recién sintetizadas a los lisosomas. Los
El receptor de la mañosa 6-fosfato une su oligosacárido específico a pH 7 en la red del trans Golgi y lo libera a pH 6, que es el pH del interior de los endosomas tardíos. Así en cuanto llegan al interior de estos endosomas tardíos, las enzimas lisosomales se disocian de los receptores M6P y empiezan a digerir el material endocitado transferido desde los endosomas tempranos. Una vez han liberado las enzimas, los receptores son recuperados y devueltos a la membrana de la red del trans Golgi, mediante vesículas de transporte que surgen por gemación de los endosomas tardíos (Figura 13-23). No se sabe si el transporte de vuelta al complejo de Golgi requiere un péptido señal específico en la cola citoplasmática del receptor M6P o si tiene lugar por defecto. Este proceso de reciclaje de m em brana desde el endosom a tardío hacia el complejo de Golgi es similar al reciclaje que ocurre entre otros subcompartimientos de las rutas secretora y endocítica que veremos más adelante. El proceso de clasificación de las hidrolasas lisosomales es el modelo mejor conocido de los diversos fenóm enos de clasificación mediados por vesículas de transporte que tienen lugar en las células eucariotas. Aunque no es probable que en todos los casos se utilice un marcador oligosacárido, la estrategia general es seguramente típica de otros procesos de clasificación mediados por vesículas. La carga es reconocida y recogida por los receptores de carga unidos a la m embra na, durante el proceso de gemación de vesículas específicas recubiertas de cla trina. Estas vesículas cargadas se fusionan con una membrana diana específica, la carga es liberada en el compartimiento diana y los receptores vacíos vuelven a su compartimiento original. No toda la carga que está destinada a acabar en los lisosomas llega a su des tino. Parece que algunas de las hidrolasas lisosomales consiguen escapar del proceso de empaquetamiento en la red del trans Golgi y son transportadas, vía la ruta por defecto, a la superficie celular, desde donde son secretadas al fluido extracelular. No obstante, algunos receptores M6P también van a la membrana plasmática para recapturar a las hidrolasas lisosomales escapadas y devolverlas mediante endocitosis m ediada por receptor a los lisosomas vía endosomas tem pranos y tardíos. Esta ruta basurero fue originalmente descubierta en células humanas que eran genéticamente defectuosas en una hidrolasa lisosomal específica. Un ejem-
precursores de las hidrolasas son etiquetados con grupos mañosa 6 -fosfato (M 6 P) en la red del cis Golgi, y separados de todas las demás proteínas en la red del trans Golgi. Esta separación ocurre porque las vesículas recubiertas con clatrina que emergen por gemación de la red del trans Golgi presentan elevadas concentraciones de receptores específicos de mañosa 6 -fosfato, los cuales unen las hidrolasas lisosomales. Estas vesículas se fusionan con los endosomas tardíos. Al bajo pH de los endosomas tardíos, las hidrolasas se disocian de sus receptores, los cuales se reciclan hacia el com plejo de Golgi para ser reutilizados en siguientes rondas de transporte. La posterior eliminación del fosfato de la mañosa de las hidrolasas disminuye la probabilidad de que las hidrolasas vuelvan de nuevo al com plejo de Golgi, unidas al receptor.
658
Capítulo 13 : Tráfico vesicular mediante las rutas secretora y endocítica
pío de ello es la enfermedad de Hurler, en la cual la enzima necesaria para la ro tura de los glucosaminoglucanos no es funcional. En estos individuos mutantes se acumulan en los lisosomas grandes cantidades de compuestos no digeridos. Por esta razón estas enfermedades se conocen con el nombre de enfermedades de acúmulo lisosomal . Cuando se cultivan las células de individuos mutantes, se observan los mismos defectos intracelulares. No obstante, si se hace un cocultivo entre las células mutantes y células de un individuo normal, dejan de obser varse los defectos. Las células mutantes son rescatadas porque pueden captar del medio de cultivo la hidrolasa lisosomal que no tienen. Más adelante veremos cómo el estudio de estas enfermedades han permitido conocer una parte impor tante del m ecanismo de clasificación de las hidrolasas lisosomales.
Una región señal en la cadena polipeptídica proporciona la clave para m arcar una enzima lisosomal con la m añosa 6-fosfato17 El sistema de clasificación que segrega las hidrolasas lisosomales y las dirige ha cia los endosomas tardíos funciona porque en el complejo de Golgi se añaden grupos de mañosa 6-fosfato tan sólo a las glucoproteínas adecuadas. Este m ar eaje específico requiere un reconocimiento también específico de las hidrolasas por la enzima del Golgi responsable de añadir los grupos M6P. Dado que todas las glucoproteínas abandonan el ER con las cadenas de Af-oligosacáridos idénti cas, la señal para añadir las unidades M6P a los oligosacáridos ha de residir en alguna parte de la cadena polipeptídica de cada hidrolasa. La adición de grupos M6P a las hidrolasas lisosomales está catalizada por dos enzimas que actúan de manera secuencial (Figura 13-24). La primera es una fosfotransferasa con un lugar de reconocimiento que une específicamente la hi drolasa, y un lugar catalítico ; la señal reconocida por el lugar de reconocimiento no es un péptido señal sino una región señal dependiente de conformación (véa se Figura 12-8). Cuando la hidrolasa está unida, la fosfotransferasa añade grupos GlcNAc-P a una o dos de las mañosas de cada cadena de oligosacárido (Figura 13-25). Entonces una segunda enzima elimina el residuo GlcNAc, creando el marcador de la mañosa 6-fosfato (véase Figura 13-24). La mayoría de las hidrolasas lisosomales tienen varios oligosacáridos, por lo que adquieren muchos residuos de M6P, lo cual amplifica enormem ente la se ñal. Así, mientras que una hidrolasa lisosomal se une al sitio de reconocimiento de la fosfotransferasa con una constante de afinidad (KJ de aproximadamente 105 litros/mol, la hidrolasa multifosforilada se une al receptor M6P con una Ka de aproximadamente 109 litros/mol, lo cual supone un incremento en la afinidad de 10 000 veces.
Los defectos en la GlcNAc-fosfotransferasa causan una enfermedad de acúmulo lisosomal en hum anos18 Las enfermedades de acúmulo lisosomal están causadas por defectos genéticos que afectan a una o más de las hidrolasas lisosomales, lo cual provoca una acu mulación en los lisosomas de sus substratos no digeridos. Este acúmulo tiene
GlcNAc fosfotransferasa ^ -Hump| GlcNAc - { p ) - 0 - C H 2
HO
Figura 13-24 Síntesis del marcador mañosa 6-fosfato sobre una hidrolasa lisosomal. La síntesis ocurre en dos pasos. En primer lugar, la GlcNAc
fosfotransferasa transfiere residuos de GlcNAc-P a la posición 6 de diversos residuos de mañosa de los AT-oligosacáridos de la hidrolasa lisosomal. En segundo lugar, una fosfoglucosidasa elimina el residuo GlcNAc, generando el marcador mañosa 6 -fosfato. La primera enzima está activada específicamente por una zona señal presente en las hidrolasas lisosomales (véase Figura 13-25), mientras que la fosfoglucosidasa es una enzima no específica. Esta modificación de determinados residuos de mañosa en la red del cis Golgi protege las mañosas de ser eliminadas por las manosidasas que más tarde encontrarán en el compartimiento m ed ia l del Golgi.
Transporte desde la red del trans Golgi a los lisosomas
G lc N A c
OH \ |
OH, 1 / O
GlcNAc fosfoglucosidasa GlcNAc
( \ HO \
OH I
OH, 1 / O
mañosa 6-fosfato
659
hidrolasa lisosomal /V-oligosacárido con un residuo term inal de manosa TRANSFERENCIA DEL GRUPO G Ic N A c -® A UNA MANOSA DEL LUGAR CATALÍTICO
D < pX p> ®
~ r
UDP-GIcNAc
no UMP
GIcNAc fosfotransferasa
lugar catalítico
consecuencias patológicas profundas. Habitualmente, se producen como con secuencia de una mutación en un gen estructural que codifica una hidrolasa li sosomal; éste es el caso de la enfermedad de Hurler, mencionada anteriormente. No obstante, la forma más dramática de una enfermedad de acúmulo lisosomal es una alteración muy poco frecuente denominada enfermedad de inclusión ce lular (enfermedad celular-I). En esta enfermedad la mayoría de las enzimas hidrolíticas han desaparecido de los lisosomas de los fibroblastos y sus substratos no digeridos se acumulan formando grandes “inclusiones” en las células de los pacientes. La enfermedad celular-I es debida a un solo defecto génico que, como en el caso de la mayoría de las deficiencias genéticas, es recesivo -e s decir, sólo presentan la enfermedad los individuos que tienen defectuosas las dos copias del gen. En la enfermedad celular-I todas las hidrolasas que han desaparecido de los lisosomas se hallan en la sangre; la anomalía se produce por un error en el proce so de clasificación de estas hidrolasas en el complejo de Golgi, error que provoca que las hidrolasas sean secretadas en lugar de ser transportadas a los lisosomas. Este error de clasificación es debido a una GlcNAc-fosfotransferasa defectuosa o ausente. En este caso, las enzimas lisosomales no son fosforiladas en la red del cis Golgi, por lo que no son captadas por los receptores M6P ni empaquetadas en las vesículas de transporte apropiadas en la red del trans Golgi. Por el contrario, las hidrolasas son transportadas a la superficie celular y son secretadas por la ruta por defecto. En realidad ésta fue la primera evidencia de la existencia de una ruta por defecto; y comparando bioquímicamente las hidrolasas lisosomales con las de los pacientes de la enfermedad celular-I se descubrió que la mañosa 6-fosfato era la señal de clasificación lisosomal y se comprendió toda la ruta de clasifica ción de las hidrolasas lisosomales. En la enfermedad celular-I los lisosomas de algunos tipos celulares, como los hepatocitos, contienen una dotación normal de enzimas lisosomales. Este hecho implica que tiene que existir otra vía para dirigir las hidrolasas a los liso somas, la cual se utiliza en algunos tipos celulares pero no en otros. Se descono ce la naturaleza de esta vía independiente de M6P. De manera similar, las proteí nas de la mem brana lisosomal son clasificadas en todas las células desde la red del trans Golgi hasta los endosomas tardíos, a través de una vía independiente de M6P. No está claro todavía por qué las células necesitan más de una vía de clasificación para construir un lisosoma, aunque quizá no sea sorprendente que en proteínas solubles y unidas a mem brana actúen mecanismos diferentes.
Resumen Los lisosomas están especializados en la digestión intracelular. Contienen proteí nas de membrana características y una amplia variedad de enzimas hidrolíticas que trabajan mejor a pH 5, que es el pH interno de los lisosomas. El pH ácido de los 660
Capítulo 13 : Tráfico vesicular mediante las rutas secretora y endocítica
lugar de reconocim iento
oligosacárido
Figura 13-25 Reconocimiento de una hidrolasa lisosomal. La enzima GIcNAc fosfotransferasa, que reconoce las hidrolasas lisosomales en el complejo de Golgi, tiene un lugar catalítico y un lugar de reconocim iento separados. El lugar catalítico une AT-oligosacáridos ricos en mañosa y UDP-GlcNAc. El lugar de reconocim iento se une a una zona señal que únicamente se encuentra sobre la superficie de las hidrolasas lisosomales.
lisosomas se mantiene por una bomba de ATP de su membrana, que impulsa proto nes. Las proteínas lisosomales recién sintetizadas son transferidas al lumen del ER, son transportadas a través del complejo de Golgi, y luego conducidas por medio de vesículas de transporte desde la red del trans Golgi a los endosomas tardíos. Las hidrolasas lisosomales contienen N-oligosacáridos que son modificados covalentemente de una forma característica en la red del cis Golgi, de manera que sus residuos de mañosa son fosforilados. Estos grupos de mañosa 6-fosfato (M6P) son reconocidos por un receptor de la red del trans Golgi, el cual separa las hidrola sas del resto de las moléculas y ayuda a empaquetarlas en el interior de vesículas de transporte, las cuales descargan su contenido en los endosomas tardíos y después en los lisosomas. Estas vesículas de transporte actúan como un servicio de trans porte que desplaza el receptor M6P de un lugar a otro, entre la red del trans Golgi y los endosomas tardíos. El bajo pH de los endosomas tardíos disocia las hidrolasas lisosomales de su receptor, haciendo que el transporte de las hidrolasas sea unidi reccional.
Transporte desde la membrana plasmática vía endosomas: endocitosis19 Las rutas que llevan hacia los lisosomas desde la superficie celular empiezan con la endocitosis, mediante la cual las células captan macromoléculas, sustancias particuladas y, en casos especiales, otras células. La substancia que va a ser ingerida es rodeada progresivamente por una pe queña porción de la membrana plasmática, que primero se invagina y luego se es trangula formando una vesícula intracelular que contiene el material ingerido. En función del tipo de vesículas que se forman, se pueden distinguir dos tipos de en docitosis: la pinocitosis (“bebida de la célula”), que implica la ingestión de fluidos y de solutos vía pequeñas vesículas (<150 nm de diámetro); y la fagocitosis (“comida de la célula”) que comporta la ingestión de grandes partículas tales como microor ganismos o restos celulares, mediante grandes vesículas llamadas fagosomas, gene ralmente de diámetro superior a 250 nm. Aunque la mayoría de las células eucariotas ingieren continuamente fluidos y solutos por pinocitosis, las grandes partículas son ingeridas principalmente por células fagocíticas especializadas.
CITOSOL
SZ.
PEROXISOMA
NUCLEO
PLASTIDOS
MITOCONDRIA
RETÍCULO ENDOPLASMATICO
J L LISOSOMA ENDOSOMA
--------------
5
GOLGI VESICULAS SECRETORAS
SUPERFICIE CELULAR
Células fagocíticas especializadas pueden ingerir grandes partículas20 La fagocitosis es una forma especial de endocitosis en la que se ingieren grandes partículas, tales como microorganismos y restos de células, vía grandes vesículas de endocitosis llamadas fagosomas. En los protozoos, la fagocitosis constituye un sistema de alimentación: las grandes partículas atrapadas en los fagosomas acaban en los lisosomas, y los productos de los procesos digestivos posteriores pasan al citoplasma donde son utilizados como alimento. La mayoría de las cé lulas de los organismos pluricelulares son incapaces de ingerir grandes partícu las de forma eficaz. En el intestino, las grandes partículas de alimento son frac cionadas fuera de las células antes de ser captadas por ellas. En la mayoría de los animales la fagocitosis es importante en otros procesos diferentes al de la nutri ción, y la llevan a cabo células especializadas que son fagocitos “profesionales”. En los mamíferos existen dos tipos de glóbulos blancos que actúan como fagoci tos: los m acrófagos (que además de encontrarse en la sangre, se hallan amplia mente distribuidos en los tejidos) y los neutrófilos. Estos dos tipos de células proceden de un precursor común (discutido en Capítulo 22), y nos defienden contra las infecciones mediante la ingestión de los microorganismos invasores. Los macrófagos también desempeñan un importante papel en la eliminación tanto de células viejas y lesionadas como de restos celulares. En términos cuan titativos, esta última función es la más importante: en cada uno de nosotros los macrófagos fagocitan más de 10u eritrocitos viejos cada día.
Transporte desde la membrana plasmática vía endosomas: endocitosis
661
Mientras que las vesículas endocíticas implicadas en la pinocitosis son pe queñas y uniformes, el diámetro de los fagosom as está determinado por el tipo de partículas que ingieren, y pueden llegar a ser tan grandes como la propia cé lula fagocítica (Figura 13-26). Los fagosomas se fusionan con los lisosomas, y el material ingerido es degradado; en los lisosomas permanecen substancias no digeribles, formando cuerpos residuales. Algunos de los componentes de la m em brana plasmática internalizada son recuperados del fagosoma mediante vesículas de transporte y devueltos a la m em brana plasmática. Para que una partícula sea fagocitada, primero ha de unirse a la superficie del fagocito. No obstante, no se ingieren todas las partículas que pueden unirse. Los fagocitos tienen toda una gama de receptores de superficie especializados que se encuentran unidos funcionalmente a la maquinaria fagocítica de la célu la. A diferencia de la pinocitosis, que es un proceso constitutivo que ocurre con tinuamente, la fagocitosis es un proceso regulado en el que los receptores acti vados transmiten la señal al interior de la célula, iniciándose la respuesta. Los reguladores m ejor caracterizados de este proceso son los anticuerpos, que nos protegen contra los microorganismos infecciosos uniéndose a su superficie for mando una cubierta en la que las colas de los anticuerpos (llamadas regiones Fe) se hallan expuestas al exterior. Esta cubierta de anticuerpos es reconocida en tonces por los receptores Fe de la superficie de los macrófagos y de los neutrófilos (véase Figura 23-20). La unión de partículas recubiertas por anticuerpos a estos receptores induce a la célula fagocítica a extender pseudópodos que engullen a la partícula, formando un fagosoma (Figura 13-27). Se han caracterizado algunas otras clases de receptores que provocan fago citosis: por ejemplo, los que reconocen el complemento (una clase de moléculas que circulan por la sangre y que colaboran con los anticuerpos marcando las cé lulas indeseables para ser destruidas, discutido en Capítulo 23), y los que reco nocen directam ente oligosacáridos de la superficie de ciertos microorganismos. No se sabe qué receptores de los macrófagos reconocen las células viejas o da ñadas, aunque se sospecha que en algunos casos están implicadas las proteínas de adhesión celular de la familia de las integrinas (discutido en Capítulo 22).
i_________) 5 Jim Figura 13-26 Fagocitosis por un macròfago. Electronmicrografía de barrido de un macròfago de ratón fagocitando dos eritrocitos modificados químicamente. Las fle c h a s rojas indican los bordes de las finas extensiones (pseudópodos) del macròfago que se proyectan como collares engullendo los eritrocitos. (Por cortesía de Jean Paul Revel.)
Las vesículas de pinocitosis se form an en la m em brana plasm ática a partir de depresiones revestidas21 Prácticam ente todas la células eucariotas ingieren continuam ente zonas de su m em brana plasm ática en forma de pequeñas vesículas pinocíticas (endocíticas)
pseudópodo
^ membrana plasmática
g lóbu lo blanco íagocitico
662
1 jim
Capítulo 13 : Tráfico vesicular mediante las rutas secretora y endocítica
Figura 13-27 Fagocitosis por un neutróñlo. Electronmicrografía de un neutrófilo fagocitando una bacteria que se hallaba en proceso de división. (Por cortesía de Dorothy F. Bainton.)
0.1
|JI1>
que posteriormente retornan a la superficie de la célula. La velocidad a la que se internaliza la mem brana plasmática en este proceso de pinocitosis varía de un tipo celular a otro, pero normalmente es bastante elevada. Por ejemplo, un macrófago ingiere cada hora una cantidad de fluido igual al 25% de su propio volu men. Esto significa que cada minuto ha de ingerir un 3% de su mem brana plas mática, o un 100% en media hora. Los fibroblastos presentan una velocidad menor, mientras que algunas amebas ingieren la membrana plasmática todavía más rápidamente. Dado que el área de la superficie y el volumen celular no varían durante este proceso, está claro que toda la membrana que desaparece por endocitosis se ha de ir añadiendo por exocitosis (el proceso contrario, discutido más adelante). En este sentido, endocitosis y exocitosis son procesos ligados que se puede considerar que constituyen un ciclo endocítico-exocítico. Normalmente, la parte endocítica de este ciclo empieza en regiones espe cializadas de la mem brana plasmática llamadas depresiones revestidas de clatrina (clathrin-coated pits), que ocupan aproximadamente un 2% del área total de la m em brana plasmática. En electronmicrografías de las membranas plasmá ticas estudiadas mediante las técnicas de congelación rápida por sublimación (rapid freeze, deep-etch) estas depresiones aparecen como invaginaciones de la mem brana plasmática revestidas en su superficie interna (citosólica) con estruc turas densas. Estos revestimientos están formados por clatrina, la cual, junto con otras proteínas, forma una estructura característica que discutiremos más adelante. La vida media de las depresiones revestidas de clatrina es corta: un m i nuto después de haber sido formadas, se invaginan hacia en interior de la célula y se separan de la membrana formando las vesículas revestidas de clatrina (Fi gura 13-28). En fibroblastos aislados se ha estimado que aproximadamente cada minuto, 2500 vesículas revestidas de clatrina abandonan la membrana plasmáti ca. Estas vesículas revestidas son más transitorias incluso que las depresiones revestidas: segundos más tarde de ser formadas, se despojan de su revestimiento siendo así capaces de fusionarse con los endosomas tempranos. Dado que las depresiones revestidas de clatrina están llenas de fluido extracelular, cuando se invaginan formando vesículas revestidas también se internalizan las substancias disueltas en el fluido extracelular -u n proceso denominado endocitosis de la fase fluida.
Figura 13-28 Formación de vesículas revestidas de clatrina a partir de la membrana plasmática. Electronmicrografías que ilustran la probable secuencia de acontecimientos durante la formación de una vesícula revestida de clatrina a partir de una depresión revestida de clatrina. Las depresiones y las vesículas revestidas que aparecen en las fotografías son mucho mayores que las que se presentan en las células de tamaño normal. Intervienen en la captación de lipoproteínas en un gran oocito de gallina, formando la yema del huevo. En la superficie extracelular de la membrana plasmática puede verse una capa electrodensa que corresponde a las lipoproteínas asociadas a su receptores. (Por cortesía de M.M. Perry yA.B. Gilbert, de /. Cell Sci. 39:257-272, 1979, con permiso de The Company of Biologists.)
Las depresiones revestidas de clatrina pueden actuar como un mecanism o concentrador internalizando macromoléculas extracelulares específicas22 En la mayoría de células animales, las depresiones y las vesículas revestidas de clatrina proporcionan una ruta eficiente para captar macromoléculas específi-
Transporte desde la membrana plasmática vía endosomas: endocitosis
66 3
cas del fluido extracelular, un proceso llamado endocitosis mediada por recep tor. Las macromoléculas se unen a receptores complementarios de la superficie celular (proteínas transmembrana), se acumulan en depresiones revestidas, y entran en la célula en forma de complejos receptor-macromolécula en vesículas recubiertas de clatrina. El proceso es muy similar al empaquetamiento de las hidrolasas lisosomales en el complejo de Golgi. Allí, como hemos visto, las molécu las que han de ser transportadas también se unen a receptores específicos de la membrana (receptores M6P) y son capturadas en vesículas de membrana que abandonan el compartimiento y se desplazan por el citosol. Además, la gemación desde el complejo de Golgi de vesículas cargadas con las enzimas lisosomales también tienen lugar mediante un revestimiento de clatrina (véase Figura 13-23). Como discutiremos más adelante, se supone que, tanto para la membrana plas mática como para la del Golgi, la formación del recubrimiento en la cara citosólica es la responsable de la invaginación. La endocitosis mediada por receptores proporciona un mecanismo de con centración selectivo que increm enta la eficiencia de la internalización de deter minados ligandos más de 1000 veces. De esta manera se pueden captar específi cam ente y en grandes cantidades com ponentes incluso minoritarios del fluido extracelular, sin internalizar el gran volumen correspondiente de fluido extrace lular. Un ejemplo bien conocido y fisiológicamente importante es el proceso mediante el cual las células de los mamíferos captan el colesterol.
Las células im portan colesterol por endocitosis mediada por receptor23 Muchas células animales captan colesterol por endocitosis mediada por recep tor y así adquieren la mayor parte del colesterol que necesitan para la síntesis de las membranas. Si esta ingestión se bloquea, el colesterol se acumula en la san gre y puede contribuir a la formación en las paredes de los vasos sanguíneos de placas ateroscleróticas (depósitos de lípidos y de tejido fibroso que causan apo plejías e infartos de miocardio al impedir la circulación sanguínea). De hecho, fue a través del estudio de humanos con una alta predisposición genética por la aterosclerosis que se conoció por primera vez el mecanismo de endocitosis m e diada por receptor. La mayor parte del colesterol se transporta en la sangre unido a proteínas, formando unas partículas conocidas como lipoproteínas de baja densidad, o LDL (de Low Density Lipoproteins; Figura 13-29). Cuando la célula necesita co lesterol para la síntesis de m embranas, produce proteínas receptoras de LDL y las inserta en su m em brana plasmática. Una vez en la membrana, los receptores de LDL difunden hasta asociarse con depresiones revestidas de clatrina que se hallan en proceso de formación (Figura 13-30A). Dado que las depresiones re-
lugar de unión de las LDL
l_Q|_
clatrina y otras proteínas asociadas depresión
(A) receptor proteico de LDL lugar de unión L a la depresión depresión revestida revestida de clatrina
CITOSOL
(B) receptor proteico de LDL con el lugar de unión a la depresión revestida defectuoso 664
m em brana plasmática
Capítulo 13: Tráfico vesicular mediante las rutas secretora y endocítica
22 nm m olécula de colesterol
lécula de :olíp¡do éster protrusión superficial de la m olécula proteica Figura 13-29 Lipoproteína de baja densidad (LDL). Cada partícula esférica tiene una masa de 3 x 10 6 daltons. En la región central contiene alrededor de 1500 moléculas de ésteres de colesterol esterificado con ácidos grasos de cadena larga. Esta región central está rodeada de una monocapa lipidica de unas 800 moléculas de fosfolípido y unas 500 de colesterol no esterificado. Además presenta una única molécula de proteína, de unos 500 000 daltons, que organiza la partícula y que es la responsable de la unión específica de las LDL a las proteínas receptoras de la superficie de las células.
Figura 13-30 Receptores norm ales y m utantes de LDL. (A) Proteínas receptoras de LDL unidas a una depresión revestida de la membrana plasmática de una célula normal. El receptor humano de LDL es una glucoproteína transm embrana de paso único compuesta de unos 840 residuos de aminoácido, de los cuales únicam ente 50 se hallan en el lado citoplasmàtico de la membrana. (B) Célula mutante en la que las proteínas receptoras de LDL son anormales porque carecen del dominio citoplasmàtico que les permite unirse a las vesículas revestidas. Estas células unen LDL pero no pueden captarlas. En la mayoría de poblaciones humanas, uno de cada 500 individuos tiene un gen que codifica un receptor de LDL alterado, y como consecuencia de ello, tiene una elevada probabilidad de morir prematuramente de un infarto de miocardio debido a la aterosclerosis.
vestidas se separan constantem ente de la membrana formando vesículas reves tidas, cualquier partícula de LDL que se halle unida a los receptores en las de presiones revestidas es rápidamente internalizada. Después de desprenderse de su cubierta de clatrina, las vesículas de endocitosis liberan su contenido en los endosomas tempranos, que se encuentran cerca de la periferia celular. Una vez en el compartimiento endosomal, las LDL pasan a los endosomas tardíos y de ellos a los lisosomas, donde se hidrolizan los esteres de colesterol dando lugar a colesterol libre, que de esta forma queda a disposición de la célula para la biosíntesis de membrana. Si se acumula demasiado colesterol libre en la célula, ésta detiene tanto la síntesis de colesterol como la síntesis de proteínas receptoras de LDL, con lo que la célula produce y absorbe menos colesterol. Esta vía regulada para la absorción del colesterol está perturbada en algunos individuos que heredan unos genes defectuosos para la producción de proteínas receptoras de LDL y, por consiguiente, sus células no pueden captar LDL de la sangre. Los niveles elevados de colesterol en sangre resultantes predisponen a estos individuos a una aterosclerosis prematura, y la mayoría de ellos mueren a una edad temprana de un infarto de miocardio como consecuencia de alteracio nes de las arterias coronarias. La anomalía se puede atribuir al receptor de LDL, el cual puede estar ausente o ser defectuoso -b ien en su lugar de unión extracelular para las LDL o bien en el lugar de unión intracelular que fija el receptor al revestimiento de las depresiones revestidas de clatrina (véase Figura 13-30B). En este último caso, el número de proteínas receptoras que unen las LDL es nor mal, pero no pueden localizarse en las regiones revestidas con clatrina de la membrana plasmática. Aunque las LDL se unen a la superficie de estas células mutantes, no se incorporan a la célula. Este hecho demuestra directamente la importancia que tienen las depresiones revestidas de clatrina respecto a la en docitosis mediada por receptor del colesterol. Se han descrito más de 25 receptores diferentes que participan en la endoci tosis mediada por receptor de diferentes tipos de moléculas, y todos ellos apa rentemente utilizan la misma ruta de las depresiones revestidas de clatrina. Mu chos de estos receptores, como el receptor de las LDL, entran en las depresiones revestidas independientemente de si se han unido o no a sus ligandos específi cos; otros entran sólo si se han unido a su ligando específico, lo cual sugiere que es necesario un cambio conformacional induido por el ligando para llegar a las depresiones. No obstante, no todas las proteínas de la membrana plasmática se acumulan en depresiones revestidas de clatrina, lo cual indica que estas depre siones actúan como filtros moleculares recogiendo ciertas proteínas de la m em brana plasmática (receptores) y excluyendo a otras. Estudios de electronmicroscopia de células cultivadas expuestas a diferentes ligandos (que se han marcado para hacerlos más visibles al microscopio electrónico) han demostrado que en una misma depresión revestida se agrupan muchas clases de receptores. La membrana plasmática de una depresión revestida de clatrina puede acumular probablemente unos 1000 receptores de varias clases. Aunque todos los comple jos receptor-ligando que utilizan esta ruta endocítica terminan aparentemente en el mismo compartimiento endosomal, el destino posterior de las moléculas endocitadas varía, como veremos ahora.
El material endocitado termina frecuentemente en los lisosomas24 El com partim iento endosom al puede ser reconocido al microscopio electrónico añadiendo al medio extracelular una molécula fácilmente detectable, como la en zima peroxidasa, y permitiendo que las células la capten por endocitosis a dife rentes tiempos. La distribución de la molécula después de ser captada revela que el compartimiento endosomal es como una serie de túbulos heterogéneos rodea dos de membrana y vesículas que se distribuyen desde la periferia de la célula hasta la región perinuclear, donde a menudo se observan cerca, aunque física mente separados, del complejo de Golgi. Mediante estos experimentos de marea je pueden distinguirse rápidamente dos series de endosomas: al cabo de un mi-
Transporte desde la membrana plasmática vía endosomas: endocitosis
665
ñuto, las moléculas endocitadas aparecen en los endosomas tempranos, justo por debajo de la mem brana plasmática, y al cabo de 5-15 minutos en los endosom as tardíos, al lado del complejo de Golgi y cerca del núcleo (Figura 13-31). Como ya m encionam os, el interior del compartimiento endosomal es ácido (pH ~6) debido a la presencia en la m em brana del endosoma de bom bas dirigi das por ATP que bom bean H+desde el citosol hacia el lumen. En general, los en dosomas tardíos son más ácidos que los tempranos. Este ambiente ácido juega un papel crucial en la función de estos orgánulos. Se cree que una ATPasa de H+ vacuolar similar o idéntica a ésta es la responsable de la acidificación de todos los orgánulos endocíticos y exocíticos, incluyendo fagosomas, lisosomas, deter minados com partim ientos del com plejo de Golgi y muchas vesículas secretoras y de transporte. Ya hem os visto cóm o los materiales endocitados que llegan a los endosomas tardíos se mezclan con hidrolasas lisosomales recién sintetizadas y acaban en los lisosomas. No obstante, muchas moléculas se salvan específicamente de su destrucción y son recicladas desde los endosomas tempranos hacia la m em bra na plasmática, m ediante vesículas de transporte. Como resultado de ello, sólo se degradan las moléculas endocitadas que no son recuperadas de los endosomas.
Determinadas proteínas son recuperadas de los endosomas tem pranos y devueltas a la m em brana plasm ática25 El compartimiento endosomal primario actúa com o la principal estación de cla sificación en la ruta endocítica, tal com o lo hace la red del trans Golgi en la vía biosintética-secretora. En el am biente ácido del endosoma temprano, muchos receptores internalizados cam bian su conform ación y liberan su ligando, como tam bién ocurre en los receptores M6P con sus hidrolasas lisosomales en los aún más ácidos endosomas tardíos. Normalmente, los ligandos endocitados que se disocian de sus receptores en el endosoma temprano están predestinados a ser destruidos en los lisosomas, conjuntam ente con los otros contenidos del endo soma no unidos a membrana. No obstante, algunos otros ligandos endocitados permanecen unidos a sus receptores y comparten su destino. El destino de los receptores -y de algunos ligandos unidos a ellos- varía se gún el tipo de receptor de que se trate: (1) la mayoría de ellos retornan al mismo dominio de la m em brana plasmática de donde proceden; (2) algunos viajan has-
666
Capítulo 13 : Tráfico vesicular mediante las rutas secretora y endocítica
Figura 13-31 Relación entre los endosomas tardíos y otros compartimientos membranosos. (A) Células cultivadas de riñón de hámster joven (BHK, de Baby Hámster Kidney) fueron incubadas en una solución conteniendo la enzima peroxidasa, durante 15 minutos, lo cual es suficiente para que la peroxidasa sea captada por endocitosis de fase fluida y transportada hasta los endosomas tardíos, pero no suficiente para que haya llegado a los lisosomas. Después de que las células fuesen fijadas y expuestas a un substrato de la peroxidasa, el producto de la reacción se hizo denso a los electrones mediante la fijación con tetróxido de osmio. (B) Reconstrucciones seriadas de endosomas tardíos [azul), ER (iamarillo), y complejo de Golgi {rojo) a partir de electronmicrografías, una de las cuales se muestra en (A). La reconstrucción fue dibujada a partir de 18 secciones ultrafinas seriadas. En (A) el núcleo se indica con una N y en (B) se muestra en verde. (A, de M. Marsh, G. Griffiths, G. Dean, I. Mellman y A. Helenius, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 83:2899-2903,1986; B, por cortesía de Mark Marsh.)
Figura 13-32 Posibles destinos de los receptores transmembrana que han sido endocitados. Se muestran tres rutas que parten del compartimiento endosomal en una célula epitelial. Los receptores que no son recuperados específicamente de los endosomas siguen la ruta desde el compartimiento endosomal hasta los lisosomas, donde son degradados. Los receptores recuperados pueden retornar tanto al mismo dominio de la membrana plasmática del que partieron (reciclaje) como a un dominio diferente de la m embrana plasmática (transcitosis). Si el ligando que es endocitado con su receptor sigue unido a él en el entorno ácido del endosoma, seguirá la misma ruta que el receptor; en caso contrario, será descargado en los lisosomas.
ta los lisosomas, donde son degradados; y (3) otros retornan a un dominio dife rente de la m em brana plasmática, mediando así un proceso llamado transcitosis (Figura 13-32). El receptor de LDL sigue la primera de estas rutas. Se disocia de su ligando LDL en el endosoma y es reciclado hacia la membrana plasmática para su reutili zación, mientras que la LDL descargada es transportada a los lisosomas (Figura 13-33). Un reciclaje similar a éste, aunque más complejo, tiene lugar después de la endocitosis de la transferrina, una proteína que transporta hierro por la sangre. El receptor de la transferrina de la superficie celular descarga la transferrina, con el hierro unido, en los endosomas tempranos mediante un proceso de endocitosis mediada por receptor. El bajo pH del endosoma hace que la transferrina libere el hierro que transporta. La transferrina libre de hierro (llamada apotransferrina) permanece unida a su receptor y es reciclada a la membrana plasmática como un complejo receptor-apotransferrina. Cuando retorna al pH neutro del fluido extracelular, la apotransferrina se disocia del receptor, por lo que puede volver a unir hierro y empezar de nuevo el ciclo. De esta forma, la transferrina actúa como una lanzadera entre el fluido extracelular y el compartimiento endosomal, evitando entrar en contacto con los lisosomas y repartiendo el hierro que las células necesi tan para crecer. La segunda ruta que pueden seguir a partir de los endosomas los receptores endocitados es la que sigue el receptor que une al factor de crecimiento epidérmi co (EGF, de Epidemial Growth Factor), una pequeña proteína que estimula la di visión de las células de la epidermis y de otros tipos celulares. A diferencia de los receptores de LDL, estos receptores únicamente se acumulan en depresiones re vestidas después de haber unido EGF. Además, muchos de ellos no se reciclan
1. reciclaje
m em b ra n a plasm ática apical v
endosoma temprano^ »vesículas : de ’ transporte^ 3. transcitosis
u n io n / estrecha 2. degradación lisosom a
m em brana plasm ática basolateral
núcleo
Figura 13-33 Endocitosis de LDL mediada por receptor. Nótese que en
/ LDL
vesícula revestida
receptores de LDL
m em brana plasmática
/ endosoma tem prano
RETORNO DE LOS RECEPTORES DE LDL A LA MEMBRANA PLASMÁTICA
APARICION DE VESICULAS DE TRANSPORTE
enzimas hidrolíticas
Transporte desde la membrana plasmática vía endosomas: endocitosis
el am biente ácido del endosoma, la LDL se disocia de su receptor. Después de una serie de pasos (véase Figura 13-34), la LDL acaba en los lisosomas, donde se degrada y se libera en forma libre el colesterol que contenía. El receptor proteico de LDL vuelve a la m embrana plasmática vía transporte de vesículas que, tal com o se muestra en la figura, brotan de la región tubular del endosoma. Para simplificar el dibujo, se muestra un solo receptor de LDL que entra en la célula y que retorna a la membrana plasmática. Esté ocupado o no, típicam ente cada receptor de LDL realiza un ciclo completo, hacia adentro y de nuevo hacia la m embrana de la célula, cada 10 minutos, dando un total de varios cientos de vueltas en su vida media de 20 horas.
667
Figura 13-34 La vía endocítica desde la membrana plasmática a los lisosomas. El transporte desde los endosomas tempranos a los endosomas tardíos tiene lugar mediante grandes vesículas d e transporte en d osom al, las cuales contienen una gran cantidad de membrana invaginada y por ello reciben el nom bre de cu erpos m ultivesiculares. No está claro si deben ser considerados com o endosomas de mediana edad que se desplazan hacia el interior celular a medida que maduran, o bien como unos compartimientos de transporte distintos. Su movimiento tiene lugar mediante microtúbulos y puede ser experimentalmente bloqueado con drogas que los despolimericen. Finalmente, puede que los endosomas tardíos se conviertan en lisosomas. Entre los endosomas tempranos y la superficie celular existen unas vesículas de transporte que reciclan material, mientras que otro tipo de vesículas hacen lo mismo entre los endosomas tardíos y la red del trans Golgi.
membrana plasmática
TRANSPORTE MEDIADO POR MICROTÚBULOS endosoma tardío
sino que acaban en los lisosomas, donde son degradados con el EGF. Por consi guiente, la unión de EGF conlleva un descenso en la concentración de los recep tores de EGF en la superficie celular -u n proceso llamado regulación por dismi nución (down regulation). Como resultado de ello, la concentración del ligando señal en el medio extracelular regula el número de moléculas de receptor com plementario de la superficie de la célula diana (discutido en Capítulo 15).
La relación entre endosomas tempranos y tardíos es incierta26 No está claro cóm o se desplazan las moléculas endocitadas de un comparti miento endosomal a otro y acaban en los lisosomas. Una hipótesis sería que los endosomas tempranos van desplazándose lentamente hacia el interior de la cé lula y pasan a ser endosomas tardíos; éstos se convierten en lisosomas com o re sultado de su fusión con las vesículas que transportan hidrolasas desde la red del trans Golgi, de su continuo reciclaje de la membrana y de su incremento de la acidificación. Otra hipótesis sería que los endosomas tempranos y tardíos son dos compartimientos separados y que el transporte entre ellos tiene lugar a tra vés de un com partim iento intermediario de transporte -m ediante una red diná mica de túbulos o mediante el desprendimiento de trozos del endosoma tem prano que son transportados al interior celular, donde se fusionan con los endosomas tardíos (Figura 13-34). Los endosomas tempranos y tardíos se dife rencian, en realidad, en su com posición proteica: concretamente, están asocia dos con diferentes proteínas rab, las cuales son importantes para dirigir el trans porte vesicular, como veremos más adelante (véase Tabla 13-1, pág. 689).
Las m acrom oléculas pueden ser transferidas a través de las lám inas de células epiteliales mediante transcitosis27 Algunos receptores de la superficie de las células epiteliales polarizadas transfie ren macromoléculas específicas desde un espacio extracelular a otro, mediante un proceso llamado transcitosis. Estos receptores siguen la tercera vía descrita a partir de los endosomas (véase Figura 13-32). Las ratas recién nacidas, por ejem plo, obtienen anticuerpos de la leche materna (que les ayudan a protegerse de las infecciones) transportándolos a través de su epitelio intestinal. El lumen del intestino es algo ácido, y a este bajo pH los anticuerpos de la leche se unen a re ceptores específicos de la superficie apical (absortiva) de la células epiteliales del intestino y son internalizados vía depresiones y vesículas revestidas de clatrina, y transferidos a los endosomas tempranos. Los complejos receptor-anticuerpo permanecen intactos en los endosomas y son recuperados en vesículas de trans porte que se fusionan con el dominio basolateral de la membrana plasmática. Al ser expuestos al pH neutro del fluido extracelular, los anticuerpos se disocian de sus receptores y entran en el torrente circulatorio de los recién nacidos. En la madre, la secreción de estos anticuerpos a la leche también tiene lugar por transcitosis, pero en dirección opuesta, desde la sangre hasta la leche. Otros ma
668
Capítulo 13: Tráfico vesicular mediante las rutas secretora y endocítica
lisosoma
red del trans Golgi
Figura 13-35 Dos compartimientos endosomales tempranos distintos en una célula epitelial. Los dominios basolateral y apical de la m embrana plasmática com unican con distintos com partimientos endosomales tempranos, a pesar de que las moléculas endocitadas en ambos dominios que no tienen señales para su reciclaje o transcitosis se encuentran en un com partimiento endosomal tardío com ún antes de ser digeridas en los lisosomas.
míferos, incluidos los humanos, tam bién transportan anticuerpos a la leche de esta manera, pero los anticuerpos permanecen en el intestino del recién nacido y no entran, como pasa en las ratas, en el torrente circulatorio. El hecho de que los diferentes receptores puedan seguir diferentes caminos a partir de los endosomas implica que, además de un lugar de unión para el li gando y otro para la depresión revestida, muchos receptores también han de presentar señales de clasificación que los guíen desde el endosoma hasta la vesí cula de transporte apropiada, y por lo tanto a la membrana adecuada de la célu la. Se desconoce todavía la naturaleza de estas señales.
Las células epiteliales tienen dos com partim ientos endosomales tem pranos distintos pero un solo com partim iento endosomal tardío com ún28 En células epiteliales polarizadas, la endocitosis ocurre tanto en el dominio basolateral de la mem brana plasmática como en el apical. El material endocitado en cada dominio entra primero en un compartimiento endosomal temprano que es único en este dominio. Esto permite que los receptores endocitados sean reciclados a su dominio original de membrana, a menos que contengan señales que les obliguen a transitar al otro dominio. Las moléculas endocitadas desde cada dominio que no son recuperadas en los endosomas tempranos son trans portadas a un compartimiento endosomal tardío común, situado cerca del cen tro de la célula, y acaban siendo degradadas en los lisosomas (Figura 13-35).
Resumen Las células ingieren macromoléculas por endocitosis: determinadas regiones de la membrana plasmática se invaginan y se desprenden formando vesículas endocíticas; muchas de las partículas y moléculas endocitadas acaban en los lisosomas, donde son degradadas. La endocitosis tiene lugar tanto constitutivamente como en respuesta a señales extracelulares. La endocitosis es tan frecuente en muchas células que una importante fracción de la membrana plasmática es internalizada cada hora. Los componentes de la membrana plasmática (proteínas y lípidos) son continuamente devueltos a la su perficie celular mediante un gran ciclo endocítico-exocítico mediado principal
Transporte desde la membrana plasmática vía endosomas: endocitosis
669
mente por depresiones y vesículas revestidas de clatrina. Muchos receptores de la superficie celular que se unen a macromoléculas extracelulares específicas acaban localizándose en las depresiones revestidas de clatrina y, por lo tanto, son internali zados en vesículas recubiertas de clatrina -un proceso denominado endocitosis me diada por receptor. Las vesículas endocíticas revestidas pierden rápidamente su cu bierta de clatrina y se fusionan con los endosomas tempranos. La mayoría de Ugandos se separan de sus receptores en el ambiente ácido de los endosomas y aca ban en los lisosomas, mientras que la mayoría de receptores son reciclados a la su perficie celular mediante vesículas de transporte, y son reutilizados. Pero los comple jos receptor-ligando pueden seguir otras rutas desde el compartimiento endosomal En algunos casos tanto el receptor como el ligando acaban degradándose en los liso somas, dando lugar a la Uregulaci6n por disminución” del receptor. En otros casos, ambos son transferidos a un dominio de la membrana plasmática diferente y, por lo tanto, el ligando es liberado por exocitosis en una superficie de la célula diferente de la de origen -un proceso llamado transcitosis.
Transporte desde la red del t r a n s Golgi hasta la superficie celular: exocitosis29 Habiendo considerado el sistema digestivo interno de la célula y los diversos ti pos de tráfico de mem branas que convergen en los lisosomas, ahora volveremos al com plejo de Golgi y examinaremos las rutas secretoras que conducen al exte rior celular. Normalmente, las vesículas de transporte destinadas a la membrana plasmática abandonan el trans Golgi siguiendo un flujo constante. Las proteínas de m em brana y los lípidos de estas vesículas aportan nuevos com ponente a la m em brana plasmática celular, mientras que las proteínas solubles de estas vesí culas son secretadas al espacio extracelular. La fusión de las vesículas con la m em brana plasmática se llama exocitosis. De esta forma, por ejemplo, las célu las producen y secretan la mayoría de los proteoglucanos y glucoproteínas de la matriz extracelular, como se discute en el Capítulo 19. Todas las células necesitan esta ruta de secreción constitutiva. No obstante, las células especializadas en la secreción disponen de una segunda ruta secreto ra en la que las proteínas solubles y otras substancias se almacenan primero en vesículas de secreción y son segregadas más tarde. Ésta es la ruta de secreción re gulada, que se encuentra principalmente en células especializadas en secretar rápidamente productos com o las hormonas, neurotransmisores o enzimas di gestivas, cuando es necesario (Figura 13-36). En esta sección consideraremos el papel del com plejo de Golgi en estas dos rutas de secreción y compararemos los mecanism os que intervienen en ambas.
Parece que muchas proteínas y lípidos son transportados autom áticam ente desde el ER y el com plejo de Golgi a la superficie celular30 En una célula capaz de realizar secreción regulada, antes de abandonar la red del trans Golgi se han de separar por lo m enos tres tipos de proteínas: las desti nadas a los lisosomas (vía endosomas tardíos), las destinadas a las vesículas de secreción y las destinadas a ser descargadas inmediatamente en la superficie ce lular. Ya hem os visto que las proteínas destinadas a los lisosomas son seleccio nadas para su empaquetam iento en vesículas de transporte específicas (me diante la M6P en el caso de las hidrolasas lisosomales), y se cree que señales análogas a éstas dirigen las proteínas empaquetadas al interior de las vesículas de secreción. La mayoría de las otras proteínas son transportadas directamente a la superficie celular mediante una ruta por defecto no selectiva (las proteínas que deben ser selectivamente dirigidas a un dominio de la superficie celular o a otro son excepciones) (Figura 13-37). Así, se ha propuesto que en una célula no
670
Capítulo 13: Tráfico vesicular mediante las rutas secretora y endocítica
"TV
CITOSOL
NUCLEO MITOCONDRIA
____________
PEROXISOMA PLASTIDOS
RETICULO ENDOPLASMATICO
proteínas recién sintetizadas para su secreción constitutiva
lípidos de m em brana plasm ática recién SECRECIÓN CONSTITUTIVA fusión de m em brana no regulada proteínas de m em brana plasmática recién sintetizadas CITOSOL
m em b ra n a plasm ática
señal de tipo h o rm onal o de n eurotransm isor
red de trans transducción de señal
SECRECIÓN REGULADA com plejo de Golgi
fusión de vesícula de secreción m em brana que almacena proteínas regulada de secrección y otras substancias
polarizada, tal como las células de la serie blanca de la sangre o los fibroblastos, si las proteínas del lumen del ER no son específicamente retenidas como resi dentes del ER o del complejo de Golgi o no son seleccionadas para las rutas que llevan a la secreción regulada o a los lisosomas, serán automáticamente trans portadas a través del complejo de Golgi hasta la superficie celular mediante la vía secretora constitutiva. Veremos que en células polarizadas, en las que se han de transferir diferentes productos a diferentes dominios de la superficie celular, las opciones son un poco más complejas.
Las vesículas de secreción emergen por gemación desde la red del tran s Golgi31 Las células que están especializadas en secretar rápidamente algunos de sus productos en respuesta a una señal concentran y almacenan estos productos en vesículas de secreción (frecuentemente denominadas gránulos de secreción o vesículas de núcleo denso porque se observan núcleos densos cuando se miran al microscopio electrónico). Las vesículas de secreción se forman por gemación de vesículas recubiertas de clatrina, a partir de la red del trans Golgi, y liberan su
mezcla de proteínas
clasificación DESVIO MEDIADO POR UNA SEÑAL HACIA LOS LISOSOMAS receptor de manosa 6-fosfato SECRECIÓN C O N S TIT U T IV A
flujo hacia la superficie celular red del
red del trans cis m edial Golgi trans com plejo de Golgi
mem brana plasmática
DESVÍO M E D IA D O POR U N A SEÑ AL HAC IA VESIC U LA S
DE SECRECIÓN {PARA LA SECRECIÓN REGULADA)
Transporte desde la red del trans Golgi hasta la superficie celular: exocitosis
Figura 13-36 La ruta de secreción regulada y constitutiva. Las dos rutas divergen en la red del trans Golgi. Muchas proteínas solubles son segregadas continuamente de la célula a través de la ruta de secreción constitutiva (también llamada ruta por defecto), que actúa en todas las células. Esta vía también nutre a la membrana plasmática con proteínas y lípidos acabados de sintetizar. Las células especializadas en la secreción también disponen de una ruta de secreción regulada, mediante la cual determinadas proteínas de la red del trans Golgi son conducidas en vesículas de secreción, donde las proteínas son empaquetadas y concentradas hasta que una señal extracelular estimula su secreción. La secreción regulada de pequeñas moléculas, como la histamina, tiene lugar de forma similar: estas moléculas son activamente transportadas desde el citosol a vesículas de secreción ya formadas. Allí, a menudo, se complejan con determinadas macromoléculas (proteoglucanos en el caso de la histamina), de manera que pueden ser almacenadas en grandes cantidades sin producir una presión osmótica excesivamente elevada.
Figura 13-37 Los procesos de clasificación de proteínas en la red del trans Golgi mejor conocidos. Las proteínas marcadas con mañosa 6-fosfato son dirigidas hacia los lisosomas (vía endosomas tardíos) mediante vesículas de transporte recubiertas de clatrina (véase Figura 13-23). Las proteínas cuyas señales les dirigen hacia vesículas de secreción son concentradas en grandes vesículas recubiertas de clatrina, que rápidamente pierden su recubrimiento transformándose en vesículas de secreción -un proceso que únicamente tiene lugar en células secretoras especializadas. Al parecer, en células no polarizadas, las proteínas que no presentan características especiales son transportadas hacia la superficie celular por defecto a través de la ruta de secreción constitutiva. En células polarizadas, sin embargo, las proteínas de secreción y las de membrana plasmática son dirigidas selectivamente hacia el dominio apical o hacia el dominio basolateral de la membrana plasmática, de forma que al menos una de estas dos rutas ha de estar mediada por una señal, como veremos más adelante.
671
contenido al exterior celular en respuesta a una señal extracelular. El producto secretado puede ser tanto una molécula pequeña (como la histamina) como una proteína (como una hormona o una enzima digestiva). Las proteínas destinadas a las vesículas de secreción (a menudo denomina das proteínas de secreción ) son empaquetadas en vesículas adecuadas en la red del trans Golgi. En este caso, parece que el mecanismo implica la agregación se lectiva de las proteínas de secreción. Estos agregados se pueden detectar al mi croscopio electrónico com o material electrodenso en el lumen de la red del trans Golgi. Se desconoce cuál es la “señal de clasificación” que dirige a las pro teínas de secreción a estos agregados, pero se cree que es una zona señal que presentan muchas proteínas de esta clase. Si un gen que codifica una proteína de secreción se transfiere a una célula secretora de otro tipo, que normalmente no fabrica esta proteína, la proteína extraña se empaqueta de manera apropiada en vesículas de secreción. Tam poco se conoce cóm o se segregan los agregados de las proteínas de se creción en las vesículas secretoras. Las vesículas de secreción contienen proteí nas de m em brana especiales, algunas de las cuales pueden actuar como recep tores uniendo el material agregado en la red del trans Golgi. No obstante, los agregados son demasiado grandes para que cada molécula de la proteína secre tada pueda unirse a su propio receptor, como se propone para el transporte de enzimas lisosomales. La captura de los agregados en las vesículas de secreción puede parecerse más a la captación de partículas por fagocitosis en la superficie celular, la cual tam bién puede estar mediada por membranas revestidas de clatrina. Después de que las vesículas de secreción inmaduras emerjan de la red del trans Golgi, su cubierta de clatrina es eliminada y su contenido se condensa aún más -h asta unas 200 veces respecto a su concentración en el lumen del Golgi (Figura 13-38). La condensación tiene lugar de repente y parece que es debida a la acidificación del lumen de la vesícula, inducida por una bomba de H+ impul sada por ATP de la m em brana de la vesícula. Debido a que las vesículas maduras son tan densas, la célula secretora libera grandes cantidades de material por exocitosis en cuanto es necesario (Figura 13-39).
A menudo las proteínas son procesadas proteolíticam ente durante la form ación de las vesículas de secreción32 La condensación no es el único proceso por el que se ven afectadas las proteínas de secreción a medida que las vesículas de secreción maduran. Muchas hormo nas polipeptídicas y neuropéptidos, así como muchas enzimas hidrolíticas secre tadas, se sintetizan como proteínas precursoras inactivas, a partir de las cuales tienen que ser liberadas las moléculas activas por proteolisis. Se cree que esta hi-
Figura 13-38 Form ación de vesículas de secreción. Esta electronmicrografía
muestra algunas vesículas de secreción formándose a partir de la red del trans Golgi en una célula P del páncreas secretora de insulina. Para localizar las moléculas de clatrina se ha utilizado un anticuerpo conjugado con esferas de oro coloidal (puntos negros). Las vesículas de secreción inmaduras (.cabezas de flecha negras), que contienen la proteína precursora de la insulina (proinsulina), se hallan revestidas de clatrina. En cuanto la vesícula se ha formado, este recubrimiento de clatrina es rápidamente eliminado, ya que no se encuentra en las vesículas de secreción maduras, las cuales tienen un núcleo muy denso (cabezas de flecha vacías). (Por cortesía de Lelio Orci.)
Figura 13-39 Exocitosis de vesículas de secreción. La electronmicrografía
muestra la liberación de insulina desde una vesícula de secreción de una célula |3pancreática. (Por cortesía de Lelio Orci, de L. Orci, J-D. Vassali, y A. Perrelet, Sci.Am. 256: 85-94,1988.)
I______l 0,2 |jm
672
Capítulo 13 : Tráfico vesicular mediante las rutas secretora y endocítica
pro-opiocortina COOH
H2N
I
péptido señal
(J-lipotropina
corticotropina | (ACTH) ot-MSH
I y-lipotropina
p-MSH
(3-endorfina
drólisis empieza en la red del trans Golgi, y continúa en las vesículas de secreción y a veces en el fluido extracelular después de que haya ocurrido la secreción. Mu chos polipéptidos secretados tienen, por ejemplo, una prosecuencia amino termi nal que es eliminada justo antes de la secreción, formándose la proteína madura. Estas proteínas se sintetizan, pues, como preproproteínas, en las que la presecuencia consiste en el péptido señal del ER que se elimina en el ER rugoso. En otros casos las moléculas peptídicas señal se sintetizan como poliproteínas que contienen múltiples copias de una misma secuencia aminoacídica. En casos aún más complejos una variedad de moléculas peptídicas señal son sintetizadas como partes de una única poliproteína que es la precursora de los múltiples pro ductos finales, los cuales son cortados individualmente a partir de la cadena polipeptídica inicial; la misma poliproteína puede ser procesada de formas diferentes produciendo diferentes péptidos en diferentes tipos celulares (Figura 13-40). ¿Por qué es tan común el procesamiento proteolítico en la ruta de secreción? Algunos de los péptidos producidos así, como las encefalinas (neuropéptidos de cinco aminoácidos con una actividad parecida a la morfina), son demasiado cor tos en sus formas maduras para ser cotransportados hacia el lumen del ER o para poder tener las señales necesarias para empaquetarse en las vesículas secretoras. En el caso de las enzimas hidrolíticas secretadas, o de cualquier proteína cuya ac tividad pueda ser peligrosa en el interior de la célula, el retraso en la activación por rotura hasta que la proteína llega a una vesícula de secreción o hasta que ha sido secretada, proporciona una clara ventaja en la prevención de que actúe pre maturamente dentro de la célula en la que ha sido sintetizada.
Figura 13-40 Rutas alternativas de procesamiento de la prohormona pro-opiocortina. Los cortes iniciales son realizados por proteasas unidas a la membrana que cortan cerca de pares de residuos aminoácidos cargados positivamente (Lys-Arg, LysLys, Arg-Lys, o Arg-Arg). Mediante reacciones accesorias se obtienen los productos de secreción finales. Diferentes tipos celulares tienen diferentes tipos de enzimas, de manera que el mismo precursor prohormonal puede ser usado para producir diferentes hormonas peptídicas. Por ejemplo, en el lóbulo anterior de la hipófisis a partir de la pro-opiocortina sólo se producen la corticitropina (ACTH) y la P-lipotropina, mientras que en el lóbulo intermedio se producen principalmente a-MSH, y-lipotropina, P-MSH y P-endorfina.
Las vesículas de secreción perm anecen cerca de la m em brana plasm ática hasta que una señal les hace liberar su contenido33 Una vez cargada, una vesícula secretora tiene que ir al lugar de secreción, don de debe esperar hasta que la célula reciba la señal de secreción. En algunas cé lulas el lugar de secreción está lejos del complejo de Golgi. Las células nerviosas proporcionan el ejemplo más extremo. Las proteínas de secreción, como los neurotransmisores peptídicos que deben ser liberados al final del axón, son sin tetizadas y empaquetadas en vesículas del cuerpo celular, donde se sitúan los ribosomas, el ER y el complejo de Golgi. Entonces deben viajar a lo largo del axón hasta alcanzar el terminal axónico -u n a distancia muy corta o de más de un m e tro. Como se vio en el Capítulo 16, las vesículas utilizan proteínas motoras uni das a su superficie para propulsarse a lo largo de los microtúbulos axonales, la orientación de los cuales guía este tráfico a lo largo del axón en la dirección apropiada. En las células epiteliales polarizadas los microtúbulos pueden tener un papel similar dirigiendo las vesículas de secreción hacia la superficie que co rresponda. La última etapa de la ruta secretora regulada es la liberación del producto por exocitosis. La señal de secreción es a menudo un mensajero químico, como una hormona, que se une a los receptores de la superficie celular. La activación de estos receptores genera señales intracelulares, que incluyen a menudo un in cremento transitorio de la concentración de Ca2+ libre en el citosol. En el caso de un axón nervioso, la señal de exocitosis normalmente es una excitación eléctrica Transporte desde la red del trans Golgi hasta la superfìcie celular: exocitosis
673
Figura 13-41 Electronmicrograffas que m uestran el proceso de exocitosis en células cebadas de rata. La célula
!______ r
5 uni
-u n potencial de acción - que se ha producido por la unión de un transmisor químico a los receptores de la superficie celular. El potencial de acción provoca una entrada de Ca2+ en el terminal axónico a través de canales de Ca2+ depen dientes de voltaje. Mediante un mecanism o desconocido, la repentina entrada de Ca2+, o algún otro tipo de señal intracelular en la célula secretora, dispara la exocitosis, provocando que las vesículas de secreción se fusionen con la m em brana plasmática y liberen su contenido al espacio extracelular.
La exocitosis regulada es una respuesta localizada de la m em brana plasm ática y del citoplasm a subyacente34 La histamina es una pequeña molécula segregada por las células cebadas, m e diante la ruta regulada, com o respuesta a ligandos específicos que se unen a los receptores de su superficie. La histamina es la responsable de muchos síntomas desagradables, tales com o el prurito o los estornudos, que acompañan a las re acciones alérgicas. Si se incuban células cebadas en un medio que contenga un estimulante soluble, se observa que la exocitosis se produce por toda la superfi cie celular (Figura 13-41). Sin embargo, ésta no es una respuesta generalizada de toda la célula, ya que si el ligando estimulador está artificialmente fijado a una superficie sólida de modo que sólo puede interaccionar con una región localiza da de la superficie de la célula cebada, la exocitosis queda restringida a la región en la que la célula entra en contacto con el ligando (Figura 13-42). Claramente, distintos segmentos de la m em brana plasmática pueden actuar con indepen dencia del resto de la membrana. Como resultado de ello, la célula cebada, a di ferencia de una célula nerviosa, no responde como un todo cuando está estimu lada; la activación de los receptores, las señales intracelulares resultantes y la exocitosis posterior están localizadas en la región particular de la célula que ha sido excitada.
de (A) no ha sido estimulada. La célula de (B) ha sido activada, por un ligando extracelular soluble, para segregar la histamina que tenía almacenada. Las vesículas que contienen histamina aparecen oscuras, mientras que las que la han liberado son claras. El material que queda en las vesículas vacías consiste en una red de proteoglucanos a la que normalmente se halla unida la histamina almacenada. Cuando la vesícula secretora se ha fusionado con la membrana plasmática, la membrana de la vesícula secretora actúa normalmente como diana a la cual se unen otras vesículas de secreción. Así, la célula de (B) presenta grandes cavidades delimitadas por las membranas fusionadas de muchas vesículas secretoras vacías, que ahora se hallan en continuidad con la membrana plasmática. Esta continuidad no siempre es patente en el plano del corte realizado a través de la célula. (De D. Lawson, C. Fewtrell, B. Gomperts y M. Raff. /. Exp. Med. 142:391-402,1975, con permiso de copyright de The Rockefeller University Press.)
núcteo
Los com ponentes de la m em brana de las vesículas de secreción se reciclan35 Cuando una vesícula secretora se fusiona con la membrana plasmática, su con tenido se descarga desde la célula por exocitosis y su membrana pasa a formar Figura 13-42 La exocitosis como una respuesta localizada.
Electronmicrografia de una célula cebada que ha sido estimulada para segregar histamina por un estimulante acoplado a una amplia esfera sólida. La exocitosis se ha producido únicamente en la región de la célula que se halla en contacto con esta superficie. (De D. Lawson, C. Fewtrell y M. Raff. /. Celi. Biol. 79:394-400, 1978, con permiso de copyright de The Rockefeller University Press.)
674
Capítulo 13: Tráfico vesicular mediante las rutas secretora y endocítica
J
superficie
región de exocitosis
parte de la membrana plasmática. Este hecho podría incrementar notablemente el área de la superficie de la membrana plasmática, pero sólo ocurre de forma transitoria ya que constantem ente son eliminados de la superficie celular com ponentes de membrana mediante endocitosis, y este proceso es por lo menos tan rápido com o lo ha sido el de adición de com ponentes por exocitosis. Esta eliminación devuelve las proteínas de la membrana de la vesícula secretora a la red del trans Golgi (probablemente vía endosomas), donde pueden ser utiliza das de nuevo. Este reciclaje mantiene un estado estacionario de distribución de com ponentes de membrana entre los diversos compartimientos celulares. La cantidad de membrana vesicular que se añade temporalmente a la membrana plasmática puede ser enorme: cuando una célula acinar del páncreas es estimu lada para secretar sus enzimas digestivas, en la membrana plasmática apical (cuya área es de sólo 30 jim 2) se insertan aproximadamente 900 (im 2 de m em brana vesicular.
Las vesículas sinápticas se forman a partir de los endosomas36 Las células nerviosas (y algunas células endocrinas) tienen dos tipos de vesículas secretoras. Como acabamos de ver, estas células empaquetan proteínas y péptidos en vesículas de secreción de contenido denso por la ruta típica, y son libera das mediante la ruta de secreción regulada. No obstante, estas células utilizan además otra clase especializada de pequeñas vesículas de secreción (-50 nm de diámetro) que se forman de manera diferente. Estas vesículas sinápticas alm a cenan neurotransmisores pequeños, como la acetilcolina, el glutamato y el áci do Y-aminobutírico (GABA), que se usan en las sinapsis químicas para que dos células se comuniquen rápidamente (y, en algunos tejidos endocrinos, en com u nicaciones locales). Cuando un potencial de acción llega al terminal nervioso, las vesículas liberan su contenido en una fracción de un milisegundo -algunas neuronas disparan más de 1000 veces por segundo- liberando vesículas sinápti cas cada vez. Esto precisa un rápido relleno de las vesículas, que al parecer no se generan a partir de la membrana del Golgi, sino mediante reciclaje local de la membrana plasmática, como se indica a continuación. Se supone que los com ponentes de la membrana de las vesículas sinápticas son descargados inicial mente a la membrana plasmática mediante la ruta de secreción constitutiva y entonces son recuperados por endocitosis y transferidos a los endosomas, desde los cuales se agrupan y surgen por gemación para formar las vesículas sinápti cas. Los com ponentes de la membrana de las vesículas incluyen transportadores especializados en la captación de neurotransmisores del citosol, donde son sin tetizados. Una vez llenas con el neurotransmisor, las vesículas vuelven a la membrana plasmática, donde esperan hasta que la célula es estimulada. Des pués de que liberen su contenido, los com ponentes de su membrana son recu perados de la misma manera y reutilizados otra vez (Figura 13-43). Se puede ob servar el ciclo completo, desde la endocitosis hasta la exocitosis, añadiendo un marcador, como la peroxidasa, al medio externo y siguiendo su paso a los endo somas y su vuelta a la superficie celular en vesículas sinápticas.
Las células polarizadas dirigen las proteínas desde la red del trans Golgi hasta el dominio apropiado de la membrana plasmática37 La mayoría de las células de los tejidos están polarizadas y tienen dos (y a veces más) dominios de mem brana diferentes hacia los cuales van dirigidos diferen tes tipos de vesículas secretoras. Aparece, pues, el problema general de cómo se organiza la salida del complejo de Golgi para que se mantengan las diferencias entre un dominio membranoso y otro. Una célula epitelial típica, por ejemplo, tiene un dominio apical, que da al lumen y que a menudo tiene estructuras es pecializadas como los cilios o los microvilli, y un dominio basolateral, que com prende el resto de la célula. Los dos dominios están separados por un anillo de uniones estrechas o estancas (véase Figura 23-35). Estas uniones especializadas Transporte desde la red del trans Golgi hasta la superficie celular: exocitosis
675
© LIB E R A C IÓ N DE LOS COMPONENTES DE LA VESÍCULA SINÁPTICA EN LA MEMBRANA PLASMÁTICA © EN D O C ITO S IS DE LOS COMPONENTES DE LA VESÍCULA SINÁPTICA Y LIBERACIÓN EN EL ENDOSOMA © G E M A C IÓ N DE LA VESÍCULA SINÁPTICA DESDE EL ENDOSOMA © C A R G A DEL NEUROTRANSMISOR A LA VESÍCULA SINÁPTICA © SEC R EC IÓ N DEL NEUROTRANSMISOR POR EXOCITOSIS EN RESPUESTA A LA ACTIVACIÓN CELULAR
entre células (discutidas en el Capítulo 19) impiden que las proteínas, y los lípidos en la hem im em brana exterior, se desplacen entre las regiones apical y basolateral, de m anera que no sólo la com posición proteica sino también la lipídica de los dos dominios de m em brana son diferentes. Concretamente, la región de la m em brana apical está muy enriquecida en glucolípidos, los cuales se piensa que protegen a esta superficie del daño que puedan producir, por ejemplo, las enzimas digestivas y el bajo pH que se encuentra en lugares como el lumen del intestino. Las proteínas de la m em brana plasmática que están unidas a la bicapa lipídica mediante un glucosilfosfatidilinositol (GPI) también se encuentran ex clusivamente en la m em brana plasmática apical. Si a una proteína que normal mente es transferida a la superficie basolateral se le añade, mediante manipula ción genética, una secuencia de unión a un GPI, se observa que la proteína es descargada en la superficie apical. Las proteínas unidas a GPI parecen asociarse con glucolípidos y pueden ser transportadas a la misma región de la superficie celular como resultado de esta asociación. Sin embargo, se desconoce cómo tie ne lugar esta selección. En principio, las diferencias entre los dominios de la membrana plasmática no son las que determinan la descarga de los componentes de la mem brana apropiados. Lo que ocurriría sería que los com ponentes de la mem brana po drían ser descargados en cualquier punto de la superficie celular y entonces ser estabilizados selectivamente en algunas posiciones y eliminados selectivamente en otras. Esta estrategia de descarga al azar y retención o eliminación selectiva parece.que funciona en determinados casos; no obstante, hay ejemplos muy claros donde la transferencia está dirigida específicamente. Así, a menudo, las células epiteliales secretan una serie de productos en su superficie apical -com o las enzimas digestivas o el moco, en el caso de las células que se encuentran en el intestino- y otra serie de productos en la superficie basolateral -com o la laminina y otros com ponentes de la lámina basal. Este tipo de células deben tener m ecanism os para dirigir las vesículas que llevan cargas distintas, rodeadas de distintos tipos de membranas, a diferentes dominios de la membrana plasmáti ca. Examinando células polarizadas en cultivo, se ha visto cómo las proteínas que salen del ER destinadas a los diferentes dominios viajan juntas hasta que lle gan a la red del trans Golgi. Allí son separadas y enviadas mediante vesículas de secreción o de transporte al dominio de la mem brana plasmática apropiado. En algunos casos las proteínas basolaterales y las apicales tienen distintas señales de clasificación que las dirigen al dominio correspondiente -o directamente o
676
Capítulo 13: Tráfico vesicular mediante las rutas secretora y endocítica
Figura 13-43 La form ación de vesículas sinápticas. Estas vesículas
diminutas y uniformes se encuentran sólo en células nerviosas y en algunas células endocrinas, donde almacenan y secretan pequeños neurotransmisores.
vesícula de transporte basolateral
vesícula de transporte apical
endosoma tem prano basolateral unión estrecha
(A) CLASIFICACIÓN DIRECTA DE LAS PROTEÍNAS DE MEMBRANA EN LA RED DEL TRANS GOLGI
I
% y *)
Figura 13-44 Clasificación de las proteínas de la m em brana plasmática en una célula epitelial polarizada. Las
proteínas recién sintetizadas pueden alcanzar su dominio de la membrana plasmática apropiado mediante una vía directa (A) o indirecta (B). En la vía indirecta una proteína es recuperada del dominio de la membrana plasmática inapropiado por endocitosis y luego transportada al dominio correcto vía endosomas tempranos -es decir, por transcitosis.
(B) CLASIFICACIÓN INDIRECTA VÍA ENDOSOMAS
indirectamente vía endosomas (Figura 13-44); en otros casos sólo las proteínas destinadas a uno de los dos dominios membranosos tienen una señal de clasifi cación, mientras que el otro dominio no requiere de ninguna señal (y es alcan zado por una ruta por defecto). Una célula nerviosa es un ejemplo límite de célula polarizada: la membrana plasmática de su terminal axónico está especializada en enviar señales a otras células, y la mem brana plasmática de su soma celular y dendritas está especiali zada en recibir señales de otras células nerviosas. Estos dos tipos de dominios de la m em brana plasmática no son sólo funcionalmente distintos sino que también tienen una composición proteica distinta. Estudios del tráfico de proteínas en células nerviosas en cultivo indican que, en lo que respecta a transporte vesicu lar desde la red del trans Golgi a la superficie celular, la mem brana plasmática del soma celular nervioso y de las dendritas es equivalente a la membrana baso lateral de una célula epitelial polarizada, mientras que la membrana plasmática del axón y de los terminales nerviosos es equivalente a la mem brana apical de la misma célula (Figura 13-45). Así, una proteína que esté destinada a un dominio específico en una célula epitelial, también lo está, y en el dominio equivalente, en una célula nerviosa.
Resumen Las proteínas pueden ser secretadas de una célula por exocitosis a través de una ruta regulada o constitutiva. En las rutas reguladas las moléculas son almacena das en vesículas de secreción o en vesículas sinápticas, las cuales no se fusionan con la membrana plasmática liberando su contenido, hasta que se recibe una señal extracelular. Este empaquetamiento dentro de estas vesículas, que tiene lugar en la red del trans Golgi, es precedido por una condensación selectiva de las proteínas. Las vesículas sinápticas son propias de las células nerviosas y de algunas células endocrinas; se forman a partir de los endosomas y son responsables de la secreción regulada de pequeños neurotransmisores. Mientras que las rutas reguladas sólo actúan en células secretoras especializadas, en todas las células existe una ruta de secreción constitutiva: hay un transporte vesicular continuo desde la red del trans Golgi a la membrana plasmática. Transporte desde la red del trans Golgi hasta la superficie celular: exocitosis
term inales
m em brana plasmática apical
celular núcleo
plasmática basolateral dendritas células epiteliales
célula nerviosa
Figura 13-45 Com paración entre dos tipos de células polarizadas. Teniendo
sólo en cuenta los mecanismos utilizados para dirigir las proteínas hacia los diferentes dominios de una célula, la membrana plasmática del soma celular nervioso y las dendritas parecen ser equivalentes al dominio basolateral de una célula epitelial polarizada, mientras que la membrana plasmática de una axón y los terminales nerviosos actuarían como el dominio apical de una célula epitelial.
677
Las proteínas fabricadas en el ER son automáticamente transferidas a la red del trans Golgi y después a la membrana plasmática a través de la ruta constituti va, por defecto, a menos que sean captadas en otras rutas o retenidas por señales de clasificación específicas. No obstante, en las células polarizadas las rutas de trans porte desde la red del trans Golgi a la membrana plasmática presentan un control selectivo asegurando que diferentes tipos de proteínas de membrana y lípidos sean transferidos a los dominios de la membrana plasmática apropiados.
Mecanismos moleculares del transporte vesicular y mantenimiento de la diversidad de compartimientos38 Ahora vamos a tratar la cuestión más importante del tráfico vesicular. Hemos visto que la célula contiene 10 o más compartimientos, limitados por membrana, quí micamente distintos y que el transporte vesicular media un intercambio continuo de componentes entre ellos (véase Figura 13-3). En presencia de este intercambio masivo, ¿cómo mantiene su carácter especializado cada compartimiento? Para contestar a esta pregunta primero hay que considerar qué es lo que de fine el carácter de un compartimiento. Por encim a de todo, parece que es la na turaleza de la membrana que lo delimita: los marcadores expuestos en la super ficie citosólica de la mem brana guían la dirección de las vesículas, asegurando que sólo se fusionen con el compartimiento adecuado, dictando por lo tanto el patrón del tráfico entre un compartimiento y otro. Una vez determinada la presencia de distintos marcadores para cada com partimiento, el problema radica en explicar cómo se mantienen componentes específicos de m em brana a una concentración elevada en un compartimiento y baja en otro. La respuesta depende, fundamentalmente, del mecanismo de for m ación de las vesículas de transporte y de fusión, por el cual zonas de la m em brana, enriquecidas o no de com ponentes específicos, son transferidas de un compartimiento a otro. Ya hemos visto cóm o la generación de una vesícula de transporte conlleva el ensam blaje de una cubierta especial en la cara citosólica de la membrana que genera la vesícula. Estas cubierta actúan como un dispositivo que “chupa” la m em brana rica en ciertas proteínas y pobre en otras hacia afuera del comparti miento, de forma que las proteínas pueden ser transportadas de forma específi ca a otro compartimiento. Consideraremos cómo se forman estas cubiertas y de qué están compuestas. También comentarem os cómo llegan las proteínas a la m em brana diana correcta y cómo se fusionan entonces descargando su conteni do en el órgano correspondiente. Veremos cómo una combinación de genética y bioquím ica ha descubierto una variedad de proteínas de unión a GTP que ayu dan a controlar el transporte vesicular. Acoplando la hidrólisis de GTP a otros procesos catalíticos, ayudan a controlar la dirección del transporte vesicular uniendo la liberación y la fusión de vesículas al gasto de energía libre, y garanti zan su fidelidad velando por la precisión con la que la vesícula de transporte re conoce su m em brana diana específica. Las estrategias genéticas y bioquímicas básicas que se han utilizado para estudiar la maquinaria molecular implicada en el transporte vesicular están perfiladas en el Panel 13-1, páginas 682-683. De todos modos, antes de com entar los detalles de la maquinaria, es útil tra tar el problema desde su base, estudiando los principios básicos generales que se deben aplicar a cualquier proceso de transporte vesicular unidireccional.
El m antenim iento de las diferencias entre compartimientos requiere un aporte de energía libre38 Supongamos que tenem os dos compartimientos, delimitados por membrana, conectados por vesículas de transporte que circulan de uno a otro, y que la dife rencia entre ambos compartimientos radica sólo en la concentración de un úni-
678
Capítulo 13 : Tráfico vesicular mediante las rutas secretora y endocítica
CITOSOL NUCLEO
PEROXISOMA
MITOCONDRIA
PLASTIDOS .SZ.
RETICULO ENDOPLASMATICO
5
3
E
GOLGI
LISOSOMA ENDOSOMA
--------------
u
VESICULAS SECRETORAS
SUPERFICIE CELULAR
lanzadera de vesículas de transporte
com partim iento A
)
-proteina P
o
flujo unidireccional de la proteina P
Figura 13-46 La energía química es utilizada para conseguir que en el transporte vesicular sea unidireccional. En este ejemplo
com partim iento B
«
ir
lADPj
na ®
co tipo P de proteína unida a membrana. Si el sistema se deja que tienda al equi librio, a través del tráfico de vesículas de transporte entre los compartimientos las concentraciones de P se equilibrarían y la diferencia entre compartimientos desaparecería. La diferencia puede ser mantenida utilizando energía libre para transferir activamente moléculas de P en una dirección, en contra de su gradien te de concentración. La proteína P podría ser secuestrada en la membrana formadora de vesículas de transporte del compartimiento en el cual está a baja concentración, por ejemplo, y mantenerse fuera de las vesículas en formación de los compartimientos en los que está en concentración elevada. Esto sería po sible gracias a un cambio de conformación de la proteína conducido directa o indirectamente por la hidrólisis de ATP o GTP en la membrana generadora de vesículas por gemación (Figura 13-46). Aunque este ejemplo es mucho más sim ple que cualquier sistema conocido usado por las células, ilustrar por qué tiene que haber un aporte de energía libre que medie el transporte direccional selecti vo de vesículas de transporte, entre compartimientos rodeados de membrana. El transporte direccional selectivo es de una importancia central en la orga nización de la célula eucariota. Empezaremos nuestra discusión de los m ecanis mos moleculares que le sirven de base considerando cómo se forman las vesícu las de transporte.
Existe más de un tipo de vesículas revestidas39 La mayoría de vesículas de transporte se forman a partir de regiones revestidas especializadas de la membrana, por lo que generan vesículas revestidas de una red de proteínas distintas de las que recubren la superficie citosólica. Antes de que la vesícula se fusione con la membrana receptora, este recubrimiento ha de eliminarse para permitir que las dos membranas interaccionen directamente. Existen dos tipos de vesículas revestidas bien caracterizadas -las revestidas de clatrina y las revestidas de coatómero (de coat, cubierta) (Figura 13-47). Las
hipotético, la proteína P es una bomba de H+dependiente de ATP. La concentración de protones en el compartimiento A es baja y alta en el compartimiento B. Debido a la alta concentración de P en el compartimiento B, el lumen de este orgánulo poseerá un pH mucho menor que el compartimiento A. Si P sufre un cambio de conformación dependiente de pH que le permita entrar en las vesículas que se forman a partir del compartimiento A (pH elevado) pero que a su vez le impide entrar en las vesículas que se producen a partir del compartimiento B (pH bajo), el flujo de P es unidireccional. Mientras se mantenga la diferencia de pH entre ambos compartimientos debido a la utilización continua de energía libre en forma de hidrólisis de ATP para mantener la bomba de H+, se conservará el gradiente de concentración de P entre los dos compartimientos. Como comentamos en el Capítulo 12, la mayoría de las membranas nunca se crean de novo sino que crecen por expansión de membrana ya existente. Por lo tanto, aunque este modelo simple no explica cómo se formó inicialmente el gradiente de P entre los compartimientos, proporciona un ejemplo de cómo la célula puede utilizar energía para mantener el carácter de sus compartimientos.
Figura 13-47 Com paración entre las vesículas revestidas de clatrina y las revestidas de coatóm ero. (A)
Electronmicrografía de vesículas revestidas de clatrina. (B) Electronmicrografía de cisternas del Golgi de un sistema libre de células en el cual aparecen por gemación vesículas revestidas de coatómero en el tubo de ensayo. Obsérvese cómo las vesículas revestidas de clatrina tienen una estructura regular más obvia. (Cortesía de Lelio Orci, de L. Orci, B. GlickyJ. Rothman, Cell46:171-184, 1986 © Cell Press.)
Mecanismos moleculares del transporte vesicular y mantenimiento de la diversidad de compartimientos
679
Figura 13-48 Caveolas en la m em brana plasm ática de un fibroblasto hum ano.
(A) Electronmicrografía de fibroblastos en sección transversal mostrando las caveolas como indentaciones profundas de la membrana plasmática. (B) Electronmicrografía de gravado por congelación que muestra numerosas caveolas en la cara citoplasmàtica de la membrana plasmática. Su cubierta parece que está constituida por hebras distribuidas concéntricamente, que contienen la proteína caveolina. Obsérvese que las caveolas difieren en tamaño y estructura de las depresiones revestidas de clatrina, una de las cuales se observa en la parte superior derecha de (B). (Cortesía de R.G.W. Anderson, de K.G. Rothberg et al., Celi 68:673-682,1992. © Celi Press.)
(A)
vesículas revestidas de clatrina, como hemos visto anteriormente, median el transporte selectivo de los receptores transmembrana, como el receptor M 6P desde la red del trans Golgi, o el receptor de LDL desde la membrana plasmática, ambos con cualquier m olécula soluble que se haya unido a ellos, quedando atra pada en el lumen de la vesícula. Las vesículas revestidas de coatómero, por el contrario, median el transporte vesicular no selectivo desde el ER y las cisternas del Golgi. Puede haber un tercer tipo de vesícula revestida. La membrana plasmática de la mayoría de células presenta invaginaciones morfológica y bioquím icam en te diferenciadas, denominadas caveolas (Figura 13-48); aunque su función es in cierta, una posibilidad sería que estas caveolas generaran vesículas revestidas de caveolina. Si esto es así, no está claro qué transportarían estas vesículas ni cuál sería su destino, y por ahora no se pude decir nada más de ellas. Parece que las vesículas revestidas median la transferencia direccional de ti pos específicos de membrana. Normalmente esta transferencia está equilibrada por un flujo de m em brana en dirección opuesta, tanto en forma de vesículas de tipos no tan caracterizados, como por medio de sacos alargados o túbulos de m em brana que avanzan a lo largo de los microtúbulos (véase Figura 13-9).
El ensam blaje del revestimiento de clatrina conduce a la form ación de la vesícula40
i__________ i 0.2 jim
El principal com ponente proteico de las vesículas recubiertas de clatrina es la Figura 13-49 Depresiones propia clatrina, un com plejo proteico altamente conservado a lo largo de la evo revestidas de clatrina y vesículas. Esta electronmicrografía por grabado por lución. Consiste en tres cadenas polipeptídicas grandes y tres pequeñas que ju n congelación muestra numerosas tas forman una estructura de tres patas denominada trisquelion. Los trisquelions depresiones revestidas de clatrina y de clatrina se unen dando lugar a un esqueleto en forma de cesto convexo for vesículas en la superficie interior de la mado por hexágonos y pentágonos, generando depresiones revestidas en la cara membrana plasmática de fibroblastos citoplasm àtica de las m embranas (Figura 13-49). Bajo condiciones adecuadas en en cultivo. Las células se congelan el tubo de ensayo, los trisquelions aislados se reasocian espontáneamente for rápidamente en helio líquido, se mando agregados típicam ente poliédricos, incluso en ausencia de las vesículas fracturan y se graban por congelación de mem brana que estos cestos normalmente incluyen (Figura 13-50). para exponer la superficie de la Se cree que la form ación de una yema revestida de clatrina se produce por • membrana plasmática. (De J.Heuser, fuerzas generadas por el ensam blaje de las proteínas de la cubierta sobre la su /. CellBiol. 84:560-683,1980, con perficie citosólica de la m em brana (Figura 13-51). No se conoce qué inicia el permiso de copyright de The proceso de unión a una región particular de la m embrana ni cómo se libera la Rockefeller University Press.)
680
Capítulo 13 : Tráfico vesicular mediante las rutas secretora y endocítica
-y».*. »
»«■-* »♦ :i-'. .*» :¿
»v'
ï*r *
¿ .I
cadena pesada
^ S û àJF M :
* “•*»; *'
[-*i>P W ïR W ÿ .<';'iv**,**';'•v ’"viV X ;> ¿ ;;V
é ^ % ;J K Î S 50 nm
(A)
(B)
50 nm
(C)
Figura 13-50 Estructura de la cubierta de clatrina. (A) Electronmicrografía de trisquelions de clatrina sombreados con platino. Aunque no puede observarse en las micrografías, cada trisquelion está compuesto por 3 cadenas pesadas y 3 cadenas ligeras de clatrina. (B) Dibujo esquemático de la distribución probable de los trisquelions en la superficie de las vesículas revestidas de clatrina. Se muestran dos trisquelions, las cadenas pesadas de uno se han dibujado en rojo y las del otro en gris; las cadenas ligeras de ambos se presentan en amarillo. La distribución superpuesta del los brazos flexibles del trisquelion proporciona fuerza mecánica y flexibilidad. Obsérvese que el final de cada brazo del trisquelion se dobla hacia dentro, por lo que su dominio amino terminal forma una cubierta intermedia. (C) Reconstrucción tridimensional de la cubierta de clatrina compuesta por 36 trisquelions organizados en una red de 12 pentágonos y 6 hexágonos. La cubierta poligonal exterior, en rojo, representa las patas superpuestas de los trisquelions de clatrina; la cubierta intermedia, en verde, está formada por los dominios amino terminales de los trisquelions; y la cubierta interior, en azul, representa las proteínas adaptadoras que comentaremos más adelante. Aunque la cubierta mostrada es demasiado pequeña para incluir una vesícula de membrana, los revestimientos de clatrina de las vesículas están construidos de forma similar a ésta, a partir de 12 pentágonos y un número superior de hexágonos. (A, de E. Ungewickell y D. Branton, Nature 289:420-422,1981, © 1981 Macmillan Journals Ltd.; B, de I.S.Nathke et al., Cell 68:899-910,1992. © Cell Press; C, de G.P.A. Vigers, R.A. Crowther y B.M.F. Pearse, EMBOJ. 5:2079-2085,1986.)
vesículas de transporte com pletas
subunidades de cubierta
mem brana
región de la m em brana recubierta
DESENSAMBLAJE DE LA CUBIERTA
lum en del orgánulo
ENSAMBLAJE DE LA CUBIERTA
FORMACIÓN DE LA YEMA
FORMACIÓN DE LA VESÍCULA
Figura 13-51 Ensamblaje y desensamblaje de la cubierta de clatrina. Parece que el ensamblaje de la cubierta de clatrina induce una curvatura en la membrana que conduce a la formación de yemas revestidas de tamaño uniforme. El desprendimiento de la yema formando una vesícula supone el proceso más complejo de fusión de membrana, que comentaremos más adelante. Aunque las cubiertas están constituidas por muchos componentes proteicos, en este esquema simplificado sólo se muestra la clatrina. El revestimiento de las vesículas recubiertas de clatrina se elimina inmediatamente después de la formación de la vesícula, mientras que, como veremos más adelante, la cubierta de coatómero se elimina después de que las vesículas entren en contacto con su membrana diana.
Mecanismos moleculares del transporte vesicular y mantenimiento de la diversidad de compartimientos
681
SISTEMAS LIBRES DE CÉLULAS PARA EL ESTUDIO DE LOS COMPONENTES Y DEL MECANISMO DEL TRANSPORTE VESICULAR El tr a n s p o r t e v e s ic u la r p u e d e s e r r e c o n s titu id o e n s is te m a s lib r e s d e c é lu la s . La p r im e r a v e z q u e se c o n s ig u ió f u e p a r a el c a s o d e lo s d ic tio s o m a s d e l c o m p le jo d e G o lg i. C u a n d o se a ís la n lo s d ic t io s o m a s y se in c u b a n e n p r e s e n c ia d e c ito s o l y d e A T P c o m o f u e n t e d e e n e r g ía , la s v e s íc u la s e m e r g e n p o r g e m a c ió n d e s d e lo s b o rd e s d e lo s d ic t io s o m a s y p a r e c e q u e t r a n s p o r t e n p r o t e ín a s e n tr e la s c is te rn a s . S ig u ie n d o el p r o c e s a m ie n t o p r o g r e s iv o d e los o lig o s a c á r id o s d e u n a g lu c o p r o t e ín a y su d e s p la z a m ie n t o e n tr e u n c o m p a r t im ie n t o d e l G o lg i y el s ig u ie n t e , e s p o s ib le s e g u ir el p r o c e s o d e l t r a n s p o r t e v e s ic u la r . P a ra s e g u ir el t r a n s p o r t e , se in c u b a n ju n ta s d o s p o b la c io n e s d e d ic t io s o m a s d e G o lg i. La p o b la c ió n " d a d o r a " s e a ís la a p a r t ir d e c é lu la s m u t a n t e s q u e c a r e c e n d e la e n z im a /V -a c e tilg lu c o s a m in a ( G Ic N A c ) t r a n s f e r a s a I y q u e h a n s id o in fe c ta d a s c o n un v ir u s ; d e b id o a la m u ta c ió n , la p r in c ip a l g lu c o p r o t e ín a v ír ic a n o p u e d e s e r m o d if ic a d a c o n G Ic N A c e n el c o m p le jo d e G o lg i d e la c é lu la s . El d ic tio s o m a d e l G o lg i " a c e p t o r " e s tá a is la d o d e la c é lu la s s a lv a je s n o in fe c ta d a s y q u e p o r lo t a n t o c o n t ie n e n u n a c o p ia c o r re c ta d e G Ic N A c t r a n s fe r a s a I, p e r o c a r e c e n d e la g lu c o p r o t e ín a v ír ic a . En la m e z c la d e d ic t io s o m a s d e l G o lg i la p r o t e ín a v ír ic a a d q u ie r e G Ic N A c , lo c u a l in d ic a q u e el G o lg i d a d o r se f u s io n a c o n el c o m p a r t im ie n t o m e d ia l d e l G o lg i a c e p to r . E s te t r a n s p o r t e d e p e n d ie n t e d e g lu c o s ila c ió n p u e d e s e g u ir s e m id ie n d o la tr a n s f e r e n c ia d e 3H - G lc N A c d e s d e U D P - 3 H - G lc N A c a la g lu c o p r o te ín a v ír ic a . El tr a n s p o r t e s ó lo se p r o d u c e e n p r e s e n c ia d e A T P y d e c ito s o l. F r a c c io n a n d o el c ito s o l, s e h a n id e n tific a d o p r o te ín a s e s p e c ífic a s c ito s ó lic a s n e c e s a r ia s p a r a la f o r m a c ió n y la fu s ió n d e las v e s íc u la s d e tr a n s p o r t e .
SE INCUBAN JUNTOS + CITOSOL + ATP + 3H-GlcNAc D IC T IO S O M A D E L G O L G I D A D O R
glucoproteína vírica
D IC T IO S O M A D E L G O L G I A C E P T O R
en la cisterna m edial
S is te m a s lib r e s d e c é lu la s s im ila r e s a é s te se h a n u tiliz a d o p a r a e s t u d ia r el t r a n s p o r t e d e s d e la re d m e d ia l h a s ta la re d d e l
tra n s G o lg i, d e s d e la re d d e l tra n s G o lg i h a s ta la m e m b r a n a p la s m á t ic a , d e s d e lo s e n d o s o m a s h a s ta lo s lis o s o m a s y d e s d e la re d d e l tra n s G o lg i h a s ta lo s e n d o s o m a s ta r d ío s .
APROXIMACIONES GENÉTICAS AL ESTUDIO DEL TRANSPORTE VESICULAR
L o s e s tu d io s g e n é tic o s d e c é lu la s d e le v a d u r a m u t a n t e s d e fic ie n te s e n la s e c r e c c ió n a t e m p e r a t u r a e le v a d a h a n p e r m it id o id e n tific a r m á s d e 2 5 g e n e s q u e p a r tic ip a n e n la v ía d e s e c r e c ió n . M u c h o s d e e s to s g e n e s m u t a n t e s c o d ific a n p r o t e ín a s
s e n s ib le s a te m p e ra tu ra , las c u a le s a 2 5 °C a c tú a n n o r m a lm e n t e , p e r o c u a n d o s e e le v a la t e m p e r a t u r a a 3 5 ° C , a lg u n a s d e e lla s fr a c a s a n e n el t r a n s p o r t e d e p r o te ín a s d e s d e el ER h a s ta el c o m p le jo d e G o lg i, o tr a s d e s d e u n a c is te rn a a o tr a d e l G o lg i, y o tr a s d e s d e el c o m p le jo d e G o lg i h a s ta la v a c u o la (e l lis o s o m a d e las le v a d u r a s ) o h a s ta la m e m b r a n a p la s m á tic a . U n a v e z s e id e n tif ic a n , p o r e s te s is te m a , a lg u n a s p r o t e ín a s n e c e s a r ia s p a r a q u e se p r o d u z c a la s e c r e c ió n , s e p u e d e n id e n t if ic a r g e n e s q u e c o d ific a n p r o t e ín a s q u e in t e r a c c io n a n c o n e lla s m e d ia n t e u n f e n ó m e n o lla m a d o s u p re s ió n m u ltic o p ia . U n a p r o te ín a m u ía n t e s e n s ib le a la t e m p e r a t u r a e le v a d a a m e n u d o t ie n e u n a a f in id a d d e m a s ia d o b a ja p o r las p r o t e ín a s c o n la s q u e h a b i t u a lm e n t e in te r a c c io n a y s e u n e . S in e m b a r g o , si las p r o t e ín a s d e in te r a c c ió n s e p r o d u c e n a u n a c o n c e n t r a c ió n m u y s u p e r io r a la n o r m a l, s e d a u n a u n ió n s u fic ie n te p a r a p a lia r el d e fe c to . P a ra e llo , c é lu la s d e le v a d u r a c o n u n a m u t a c ió n s e n s ib le a la t e m p e r a t u r a e n u n g e n q u e p a r tic ip a e n el t r a n s p o r t e d e v e s íc u la s , se t r a n s f e c t a n c o n u n v e c t o r p la s m íd ic o d e le v a d u r a e n la c u a l se h a n c lo n a d o f r a g m e n t o s al a z a r d e D N A g e n ó m ic o d e le v a d u r a . C o m o el p lá s m id o se m a n t ie n e e n las c é lu la s e n un n ú m e r o d e c o p ia s e le v a d o , lo s q u e p o r te n g e n e s in ta c to s s o b r e p r o d u c ir á n el p r o d u c to n o r m a l d e l g e n y p e r m it ir á n a un r e d u c id o n ú m e r o d e c é lu la s s o b r e v iv ir a t e m p e r a t u r a e le v a d a . L o s f r a g m e n t o s d e D N A r e le v a n t e s , q u e p r o b a b le m e n t e c o d ific a n p r o te ín a s q u e in te r a c c io n a n c o n la p r o t e ín a m u ta d a o r ig in a l, p u e d e n s e r a is la d o s d e las c é lu la s s u p e r v iv ie n t e s . L as a p r o x im a c io n e s g e n é tic a s y b io q u ím ic a s s e c o m p le m e n t a n , y m u c h a s d e la s p r o te ín a s im p lic a d a s e n el t r a n s p o r t e v e s ic u la r h a n s id o id e n tific a d a s in d e p e n d ie n t e m e n t e a t r a v é s d e e s tu d io s b io q u ím ic o s d e s is te m a s lib r e s d e c é lu la s d e m a m íf e r o s y a t r a v é s d e e s tu d io s g e n é tic o s e n le v a d u r a s .
682
Panel 13-1 Estrategias utilizadas para estudiar los mecanismos moleculares implicados en el transporte vesicular.38
SISTEMAS DE CELULAS SEMI-INTACTAS PARA EL ESTUDIO DEL TRANSPORTE VESICULAR (A )
2 o °c
El t r a n s p o r t e d e v e s íc u la s t a m b ié n p u e d e e s tu d ia r s e en
9 ,u c o P r o te in a V S V b lo q u e a d a e n la re d d e l tra n s G o lg i
c é lu la s c u y a m e m b r a n a p la s m á t ic a h a y a s id o p r e v ia m e n t e p e r m e a b iliz a d a p a r a p e r m it ir lib r e m e n t e el p a s o , h a c ia d e n tr o o h a c ia fu e r a , d e m o lé c u la s p e q u e ñ a s y d e m a c r o m o lé c u la s . La p e r m e a b iliz a c ió n se c o n s ig u e m e d ia n t e r o tu r a fís ic a o m e d ia n t e el t r a t a m ie n t o c o n t o x in a s b a c t e r ia n a s q u e a b r e n g r a n d e s o r ific io s e n la m e m b r a n a p la s m á tic a . E s ta s c é lu la s s e m i-in ta c t a s s o n p a r t ic u la r m e n t e ú tile s p a r a e s tu d ia r el t r a n s p o r te d e s d e s is t e m a s d e m e m b r a n a e x te n d id a q u e se fr a g m e n t a n d u r a n t e lo s p r o c e d im ie n to s d e h o m o g e n e iz a c ió n c o n v e n c io n a le s , c o m o e s el c a s o d e l ER y d e la re d d e l
tra n s G o lg i. Las c é lu la s s e m i-in t a c ta s s e h a n u tiliz a d o p a r a a is la r v e s íc u la s d e t r a n s p o r t e q u e m e d ia n el t r a n s p o r t e d e s d e la
m em brana plasm ática apical agujereada m ediante papel de nitrocelulosa
re d d e l tra n s G o lg i h a s ta la m e m b r a n a p la m á t ic a a p ic a l. Las c é lu la s se c u ltiv a n a u n a t e m p e r a t u r a b a ja (2 0 °C ) d e m a n e r a q u e el tr á f ic o d e m e m b r a n a d e s d e la re d d e l tran s G o lg i h a s ta la s u p e r fic ie d e la c é lu la e s tá b lo q u e a d o , y p o r lo t a n t o la p r o te ín a v ír ic a p r in c ip a l s e h a lla a tr a p a d a e n el
tra n s G o lg i (A ). C u a n d o la s c é lu la s se p e r m e a b iliz a n ( d e p o s ita n d o u n tr o z o d e p a p e l d e n itr o c e lu lo s a s o b re e lla s y p o s t e r io r m e n t e r e tir á n d o lo p a ra r o m p e r la m e m b r a n a ) , el c ito s o l s a le d e la s c é lu la s d e ja n d o los s is te m a s d e m e m b r a n a (B ). E n to n c e s s e le v a n ta el b lo q u e o p o r t e m p e r a t u r a y s e a ñ a d e c ito s o l fr e s c o y A T P , lo c u a l h a c e q u e la s v e s íc u la s q u e c o n t ie n e n la g lu c o p r o t e ín a v ír ic a s e d e s p r e n d a n d e la re d d e l tra n s G o lg i p o r g e m a c ió n y s a lg a n d e las c é lu la s s e m i-in ta c t a s a t r a v é s d e lo s o r ific io s d e la m e m b r a n a p la s m á tic a (C ). Las v e s íc u la s s e r e c o g e n y se p u r ific a n u s a n d o u n a n tic u e r p o q u e r e c o n o z c a la c o la c it o p la s m á tic a d e la g lu c o p r o te ín a t r a n s m e m b r a n a d e l v ir u s , lo c u a l p e r m it e id e n tific a r las p r o te ín a s q u e c o n fig u r a n las v e s íc u la s d e tr a n s p o r te .
(C )
+ c ito s o l °
+ATP
anticuerpo contra la cola clstosólica de la glucoproteína vírica
b lo q u e a d o p o r
b lo q u e a d o p o r
las p r o t e ín a s d e t r a n s p o r t e a p ic a l s e p u r ific a n
m u ta n t e s
m u ta n te s
m e d ia n t e su u n ió n a u n a c o lu m n a
A ,B ,C
D ,E ,F
c o n u n a n t ic u e r p o e s p e c ífic o
yema formando la vesícula revestida. Una vez la vesícula se desprende, la cu bierta se pierde rápidamente. El mecanismo por el cual se desprende tampoco se conoce, pero se ha demostrado que in vitro una proteína chaperona de la fa milia hsp70 actúa como una ATPasa de eliminación de la cubierta que utiliza la energía de la hidrólisis de ATP para eliminar la cubierta de las vesículas revestidas de clatrina. Sin embargo, en la célula ha de actuar algún mecanismo de control adicional para evitar que la cubierta de clatrina se elimine de la yema revestida de clatrina antes de que tenga tiempo de formar una vesícula, a pesar de que la cu bierta persiste más tiempo en la yema que en la vesícula. Una posibilidad es que la pérdida de la cubierta esté controlada por Ca2+, el cual puede unirse a las ca denas ligeras de clatrina y desestabilizar la cubierta de clatrina. Las bombas de Ca2+de la m em brana plasmática bom bean Ca2+ hacia el exterior de la célula y por lo tanto la concentración de Ca2+ se mantiene extremadamente baja en la cara citosólica de la membrana, lo cual permite que las depresiones se m anten gan revestidas; pero una vez las vesículas revestidas se forman y migran aleján dose de la membrana, se encuentran con concentraciones de Ca2+ mayores, que podrían desencadenar la pérdida del revestimiento. Normalmente las vesículas pinocíticas revestidas de clatrina son de tamaño pequeño y uniforme, pero la clatrina tam bién está implicada en la formación de vesículas mayores, tanto de vesículas de secreción que contienen grandes agre gados de proteína como de fagosomas que contienen grandes partículas. En es tos casos la clatrina no forma revestimientos completos sino que se concentra en determinadas zonas de las vesículas que se forman. Parece que la formación de los parches de clatrina ayudan a que la m em brana se doble, pero el gran ta maño de la carga unida a los receptores evita que la membrana se pliegue lo su ficiente com o para permitir que se forme un revestimiento completo.
Las adaptinas reconocen proteínas transmembrana específicas y las unen ai revestimiento de clatrina41 Se cree que el ensam blaje de la cubierta de las vesículas revestidas tiene dos fun ciones com o mínimo: proporciona la fuerza m ecánica para “estirar” hacia el ex terior la membrana, formando una yema, y ayuda a capturar receptores de m em brana específicos junto con las moléculas a las que están unidos. Una se
Figura 13-52 Transporte selectivo mediado por vesículas revestidas de clatrina. Las adaptinas se unen tanto a los trisquelions de clatrina como a los receptores de carga.
♦
ELIMINACIÓN DE VESÍCULAS
FORMACIÓN DE VESÍCULAS receptor de carga
adaptina clatrina
684
Capítulo 13 : Tráfico vesicular mediante las rutas secretora y endocítica
gunda molécula principal de recubrimiento presente en estas vesículas, un com plejo formado por muchas subunidades llamado adaptina, participa en ambas funciones. Las adaptinas son necesarias tanto para unir el revestimiento de clatrina a la membrana como para atrapar diversos receptores proteicos trans membrana, los cuales capturan moléculas específicas en el interior de la vesícu la. De este modo un grupo seleccionado de moléculas a transportar, unidas a sus receptores de carga específicos, se incorporan al lumen de cada una de las vesícu las de transporte revestidas de clatrina acabadas de formar (Figura 13-52). Las vesículas revestidas de clatrina no son todas iguales. Hemos visto, por ejemplo, que algunas de ellas, las que participan en el tránsito desde el complejo de Golgi hasta los endosomas tardíos, son ricas en receptores M 6P; otras, que participan en la ruta desde la membrana plasmática a los endosomas tempra nos, son ricas en receptores de compuestos extracelulares como las LDL. Aun que parece que el revestimiento de clatrina en sí mismo es el mismo en cada caso, las adaptinas son diferentes y median la captura de diferentes receptores. Las adaptinas reconocen péptidos señal en la cola citoplasmàtica de los re ceptores. Una secuencia característica de cuatro residuos de aminoácido, que pa rece que forma un giro brusco en la cadena polipeptídica, es una parte esencial de la señal de endocitosis compartida por los receptores de la superficie celular que participan en la endocitosis mediada por receptor a partir de la membrana plasmática (Figura 13-53). Por el contrario, en la red del trans Golgi las adaptinas reconocen una secuencia de aminoácidos fosforilados en la zona carboxilo termi nal de los receptores M 6P.
Las vesículas revestidas de coatómero median el transporte vesicular no selectivo42
adaptina
Figura 13-53 Péptido señal para la endocitosis. Se cree que los diversos receptores proteicos de superficie celular que son endocitados en las vesículas de clatrina com parten esta señal, la cual es reconocida por las adaptinas que actúan en la endocitosis mediada por receptor desde la m embrana plasmática. Los aminoácidos mostrados aquí son una parte esencial de la señal.
Se cree que las vesículas revestidas de coatóm ero median el transporte vesicu lar no selectivo de la ruta por defecto, que incluye el transporte desde el retículo endoplasmático al complejo de Golgi, de una cisterna del Golgi a otra y desde la red del trans Golgi a la membrana plasmática (Figura 13-54). Ninguno de estos procesos de transporte requieren que las vesículas que se forman capturen una carga específica en su lumen. El revestimiento de estas vesículas consiste en parte en un gran complejo proteico llamado coatóm ero, formado por siete subunidades proteicas de reves timiento (llamadas COP, de coat protein). Por lo menos una de ellas, presenta homología de secuencia con las adaptinas de las vesículas revestidas de clatrina, pero existen importantes diferencias de comportamiento entre el revestimiento de coatómero y el de clatrina. Al contrario que las cubiertas de clatrina, las de coatómeros no se autoensamblan sino que necesitan ATP que dirija su forma
endosom a tardío
Golgi
Figura 13-54 Transporte vesicular selectivo y no selectivo en células no polarizadas. Se postula que el transporte no selectivo (constitutivo) (fle c h a s azu les) está mediado por vesículas revestidas de coatómero, mientras que diversas formas de transporte selectivo (mediado por señal) (flechas rojas) se lleva a cabo mediante vesículas revestidas de clatrina. En células polarizadas se requiere una vía adicional desde la red del trans Golgi mediada por señal.
Golgi
Mecanismos moleculares del transporte vesicular y mantenimiento de la diversidad de compartimientos
685
ción y en lugar de separarse en cuanto la vesícula se desprende de la membrana dadora, la cubierta de coatómero se mantiene hasta que la vesícula alcanza su m em brana diana. Parece que tanto el ensamblaje com o el desensamblaje del revestimiento de coatóm ero depende de una proteína denominada ARF, que también podría participar en el ensamblaje de las cubiertas de clatrina. Es una de las muchas proteínas de unión a GTP que son com ponentes clave en el control del trans porte vesicular. Antes de com entar las particularidades de ARF, nos detendre mos a revisar algunas propiedades de regulación generales de las proteínas de unión a GTP.
El transporte vesicular depende de proteínas reguladoras que unen GTP43 Como se com enta en el Capítulo 5, las células contienen extensas familias de proteínas reguladoras que unen GTP. Estas proteínas actúan como interruptores moleculares que pueden alternar entre dos estados conformacionales -u n o acti vo, unido a GTP y otro inactivo, unido a GDP- y actúan como reguladores de muchos procesos celulares complejos. Las proteínas de unión a GTP actúan en un ciclo que depende típicam ente de dos com ponentes auxiliares: una proteína liberadora de nucleótidos de guanina (GNRP, de Guanine Nucleotide Releasing Protein) que cataliza el intercambio de GDP por GTP y una proteína activadora de GTPasa (GAP, de GTPase Activating Protein) que desencadena la hidrólisis del GTP unido. Muchas proteínas reguladoras que unen GTP tienen un grupo lipídico uni do covalentemente que les permite unirse a la membrana, y participan en una gran variedad de procesos dependientes de membrana en la célula. Se han des crito dos clases estructuralmente distintas: las proteínas de unión a GTP monoméricas (también llamadas GTPasa monoméricas) , constituidas por una sola ca dena polipeptídica, y las proteínas de unión a GTP triméricas (también llamadas proteínas G), constituidas por tres subunidades distintas. Aunque estudios con inhibidores muestran que ambas clases de proteínas juegan un papel esencial en el transporte vesicular, las funciones de las GTPasas monoméricas están más claras, por lo que trataremos de ellas aquí.
Parece que ARF señaliza el ensam blaje y el desensamblaje del revestimiento de coatóm ero44 ARF es una GTPasa m onom érica con una cola de ácido graso, y se cree que juega un papel crucial en el ensam blaje y desensamblaje del revestimiento de coató mero. En el citosol se encuentra altamente concentrada en la forma descargada, unida a GDP. Parece que la mem brana dadora desde donde va a generarse una vesícula revestida de coatómero contiene una proteína específica liberadora de nucleótidos de guanina que hace que ARF libere su GDP y una GTP en su lugar (la concentración de GTP en el citosol es mayor que la de GDP). Se cree que la unión de GTP hace que ARF exponga la cola de ácido graso, que se inserta en la bicapa lipídica de la m em brana dadora. Cuando ARF se ha unido, recluta las subunidades del coatómero, que se unen a él. El ensamblaje de la cubierta de coatómero, formado por ARF con GTP y por las proteínas de coatómero, estira la membrana induciéndola a que forme una yema, que entonces se desprende como lo hace una vesícula revestida (Figura 13-55). Cuando la vesícula revestida de coatómero alcanza su membrana de desti no, una proteína específica de la mem brana diana, activadora de GTPasa, activa ARF para que hidrolice el GTP que lleva unido hasta GDP. Se cree que esto pro voca un cambio de conform ación en la proteína ARF de manera que la cadena de ácido graso se desprende de la membrana, causando el desensamblaje del re vestimiento y permitiendo que se produzca la fusión de la membrana, como ve remos. Por lo tanto ARF puede considerarse como una proteína que detecta las
686
Capítulo 13 : Tráfico vesicular mediante las rutas secretora y endocítica
vesícula recubierta de coatóm ero
ARF-GDP inactiva y soluble
coatóm ero
proteína liberadora de nucleótidos de guanina (GNRP) (A)
(B)
circunstancias y genera la señal apropiada, tanto para el ensamblaje de la cu bierta y la gemación de la vesícula como para el desprendimiento de la cubierta y su fusión a la membrana, como será el caso. Aún más importante, si existe una proteína liberadora de nucleótidos de guanina en la membrana dadora y una proteína activadora de GTPasa en la membrana receptora, la dirección de trans porte está definida: mediante el ciclo de hidrólisis de GTP y el intercambio GDP/GTP, ARF facilita la transferencia en una única dirección.
Figura 13-55 Modelo actual sobre la formación de las vesículas revestidas de coatómero. (A) La proteína ARFGDP, soluble e inactiva, se une a una proteína liberadora de nucleótidos de guanina (GNRP) en la membrana dadora, lo cual provoca que ARF libere su GDP y se una a GTP. El GTP desencadena un cambio conformacional en ARF dejando expuesta su cadena de ácido graso, que se inserta en la membrana dadora. (B) Ahora, la proteína ARF-GTP activa unida a la membrana recluta subunidades de coatómero de la membrana. Esto hace que la membrana forme una yema. El posterior acontecimiento de fusión de membrana separa y libera la vesícula revestida. La droga brefeldina A bloquea la formación de la cubierta de coatómero inhibiendo la reacción de intercambio de GDP por GTP. Ello bloquea el tráfico de las vesículas revestidas de clatrina desde el ER a través del complejo de Golgi, haciendo que el complejo de Golgi vacíe su contenido en el ER, como se explica en la página 646.
Marcadores proteicos de orgánulo, llamados SNARE, colaboran en la dirección del transporte de vesículas45 Las vesículas de transporte, sean o no selectivas al tomar la carga del comparti miento dador, han de ser altamente selectivas en cuanto a la m em brana diana a la que se fusionan. Esto sugiere que todos los tipos de vesículas de transporte de la célula han de expresar marcadores de superficie que las identifiquen según su origen y su carga, y que sean reconocidos por receptores de las membranas diana. Aunque el m ecanism o de este reconocim iento no se conoce, existe una hipótesis atractiva que supone la participación de unas proteínas denominadas SNARE (por razones que se com entan más adelante), de las cuales existen gru pos com plem entarios v-SNARE en la membrana de la vesícula y t-SNARE en la membrana diana {t de target. diana) (Figura 13-56). Las proteínas SNARE están bien caracterizadas en las células nerviosas, en las cuales se cree que median la unión de las vesículas sinápticas a la mem brana plasmática del terminal nervio-
ORGÁNULO DADOR
ORGÁNULO DIANA
t-SNARE COMPARTIMIENTO B
Figura 13-56 Papel propuesto para las proteínas SNARE en la dirección del transporte vesicular. Grupos complementarios de SNARE en las vesículas (v-SNARE) y de SNARE en las membranas diana (t-SNARE) determinan la selectividad del contacto de las vesículas de transporte con su membrana diana. Las proteínas v-SNARE, que están coempaquetadas con las proteínas de la cubierta durante la formación por gemación de las vesículas de transporte desde la membrana dadora, se unen a las t-SNARE complementarias de la membrana diana.
Mecanismos moleculares del transporte vesicular y mantenimiento de la diversidad de compartimientos
687
Rab-GTP
v-SNARE vesícula de transporte
so en preparación para la exocitosis: en la vesícula sináptica existe una v-SNARE y en la cara citoplasmática de la mem brana plasmática existe una t-SNARE com plementaria.
Se cree que las proteínas Rab aseguran la especificidad de la unión de las vesículas46 En la célula existen muchos sistemas de mem brana por lo que el proceso de unión de las distintas vesículas ha de ser altamente selectivo. Una vesícula pue de inspeccionar muchas m embranas potencialmente diana antes de que su v-SNARE encuentre una t-SNARE complementaria. Según un punto de vista, este proceso crucial de reconocim iento está controlado por miembros de una familia de proteínas GTPasas monoméricas llamadas proteínas Rab, que con trolan que la interacción entre v-SNARE y t-SNARE sea correcta. Según este en foque, las proteínas Rab están unidas a la superficie de las vesículas revestidas que se están formando en la m em brana dadora. Cuando una vesícula encuentra la m em brana diana adecuada, la unión de v-SNARE a t-SNARE permite que la vesícula permanezca unida durante el tiempo necesario para que la proteína Rab hidrolice el GTP que lleva unido, lo cual bloquea a la vesícula en la m em bra na diana, preparándola para la fusión posterior con ella (Figura 13-57). Las células eucariotas tienen muchos tipos de proteínas Rab, cada una de las cuales está asociada con un orgánulo rodeado de membrana particular que participa en la vía de secreción o en la vía endocítica. Cada uno de estos orgánulos presenta por lo menos una proteína Rab en la superficie citosólica (Tabla 131). La primera proteína Rab (llamada Sec4) fue descubierta en levaduras m e diante la selección de mutaciones (llamadas mutaciones SEQ que interfieren en el proceso de secreción. Posteriormente se vio que se trataba de un componente de las vesículas de secreción necesario para su unión a la membrana plasmática; las mutaciones que los modifican evitan que las vesículas de secreción viertan su contenido al exterior. Las secuencias de aminoácidos de estas proteínas Rab son más diferentes entre sí en su zona carboxilo terminal; experimentos de inter-
688
Capítulo 13: Tráfico vesicular mediante las rutas secretora y endocítica
Figura 13-57 Papel propuesto para las proteínas Rab garantizando la especificidad de la unión entre las vesículas de transporte y la membrana diana. La proteína liberadora de nucleótidos de guanina en la membrana dadora reconoce una proteína Rab específica y la induce a intercambiar su GDP por GTP. Este cambio altera la conformación de la proteína Rab, exponiendo su grupo lipidico unido covalentemente, el cual ancla la proteina Rab a la membrana. La proteína Rab-GTP permanece unida a la superficie de la vesícula de transporte después de que ésta se separe de la membrana dadora. Una proteína v-SNARE de la superficie de la vesícula se une a una t-SNARE de la membrana diana, inmovilizando parcialmente la vesícula. Entonces, la proteína Rab hidroliza su GTP anclando la vesícula a la membrana diana y liberándose al citosol como Rab-GDP, desde donde puede ser reutilizada en una nueva ronda de transporte. La vesícula se fusiona entonces con la membrana diana. Nótese que los revestimientos de la vesícula han sido omitidos del esquema para mayor claridad.
Tabla 13-1 Localizaciones subcelulares de algunas proteínas Rab Proteína*
Orgánulo
Rabí (YPT1) Rab2 Rab3A Rab4 Rab5 Rab6 Rab7 Rab9 Sec4
ER y complejo de Golgi ER transicional, red del cis Golgi vesículas de secreción endosomas tempranos membrana plasmática cisternas del trans y del medial Golgi endosomas tardíos endosomas tardíos, red del trans Golgi vesículas de secreción
* Todas estas proteínas se han hallado en células de mamífero excepto Sec4 e YPT1, que son proteínas de levadura.
cambio de extremos usando técnicas de ingeniería genética indican que es pre cisamente este extremo el que determina la localización intracelular de cada miembro de la familia, probablemente permitiéndole que se una a un factor da dor de nucleótidos de guanina complementario, situado en la superficie del orgánulo particular (véase Figura 13-57). Antes de que las SNARE fueran las candidatas como las proteínas marcadoras de orgánulos que guían el transporte de vesículas, se creía que las proteínas Rab ejercían esta función por su notable dis tribución específica entre los orgánulos. Sin embargo, actualmente se sabe que algunas proteínas Rab son funcionalmente intercambiables, ya que mediante experimentos de ingeniería se ha podido localizarlas en otros orgánulos. Por lo tanto no pueden constituir la única explicación de la selectividad del transporte vesicular.
La fusión de vesículas está catalizada por una “m aquinaria de fusión de m em brana"47 Cuando la vesícula de transporte ha reconocido su mem brana diana y se ha uni do a ella, la vesícula ha de liberar su carga mediante la fusión de membrana. Sin embargo, la fusión de la membrana no se produce siempre inmediatamente. Como hemos visto, en la exocitosis regulada la fusión no ocurre hasta que es des encadenada por una señal extracelular. La unión y la fusión son dos procesos distintos y separables. Es posible, por ejemplo, evitar la fusión pero no la unión, m anteniendo los niveles de Ca2+ citosólico muy bajos. Ello provoca la acum ulación de vesículas unidas, pero no fusionadas, con su m em brana diana. La unión sólo requiere que las dos mem-
SNAP
NSF
vesícula de transporte inm ovilizada
GDPta Rab-GDP
Rab-GTP
t-SNARE
v-SNARE ENSAMBLAJE DE LA M AQUINARIA DE FUSIÓN
MEMBRANA DE FUSIÓN
Figura 13-58 Modelo actual sobre la fusión de vesículas mediada por proteína. Una compleja maquinaria de fusión cataliza la fusión de una vesícula de transporte con su membrana diana. Sólo han sido caracterizados dos de los componentes proteicos del complejo de fusión: NSF (proteína de fusión sensible a iV-etilmaleimida, de Nethylmaleimide-sensitive/usion protein) y SNAP (proteínas solubles de acoplamiento a NSF, de soluble NSF «ttachment proteins). (NEM es un compuesto químico que modifica los grupos libres SH expuestos en las superficies proteicas y por lo tanto inactiva proteínas cuyos grupos SH expuestos sean necesarios para su actividad.) Las proteínas SNARE fueron identificadas por primera vez como receptores de SNAP (de aquí su nombre): unen tanto v-SNARE como t-SNARE. La unión de SNAP permite que NSF se una. Este complejo, con la ayuda de acil Coa y proteínas aún no identificadas, cataliza la fusión de las dos bicapas lipídicas. NSF es una ATPasa que hidroliza ATP liberando el complejo una vez ha realizado su trabajo (no se muestra).
Mecanismos moleculares del transporte vesicular y mantenimiento de la diversidad de compartimientos
689
ácido nucleico vírico cápside cubierta dei virus
de fusión ENDOCITOSIS DE UN VIRUS RECUBIERTO Y TRANSPORTE HASTA UN ENDOSOMA. LA DISMINUCIÓN DEL pH EXPONE LOS LUGARES HIDROFÓBICOS DE LAS PROTEÍNAS DE FUSIÓN endosoma
Figura 13-59 Entrada en las células de una plaga de virus de ave.
íw k.
(A) Electronmicrografías que muestran cómo es endocitado un virus en una vesícula revestida de clatrina, cómo es conducido a un endosoma, y cómo se escapa de él fusionándose con la membrana del endosoma. (B) Dibujo esquemático de la forma en qué unas proteínas de fusión de la superficie del virus median su salida del endosoma. (A, cortesía de Karl Matlin y Hubert Reggio, de K.S. Matlin et al.,/. CellBiol. 91:601-613,1981, con permiso de copyright de The Rockefeller University Press.)
branas se acerquen lo suficiente com o para permitir que las proteínas que so bresalen de la bicapa lipídica interaccionen entre sí y se adhieran. La fusión requiere una aproximación mayor, quedando las membranas a 1,5 nm una de otra de manera que puedan juntarse. Para que se produzca esta aproximación, se ha de desplazar el agua de la superficie hidrofílica de la membrana -proceso que es altamente desfavorable desde el punto de vista energético. Parece proba ble que todas las fusiones de m em brana en las células sean catalizadas por pro teínas de fusión especializadas que proporcionen un camino para atravesar esta barrera energética. El m ecanismo todavía se conoce muy mal. En el caso de las vesículas de transporte revestidas de coatómero, por lo menos, la fusión con la mem brana diana requiere ATP, GTP, acil CoA, y diversos com ponentes protei cos. Se conocen dos com ponentes proteicos, denominadas NSF y SNAP (por ra zones que se explican en el pie de la Figura 13-58), que reaccionan de forma cí clica con las m embranas que se van a fusionar y el citosol. Las SNAP se unen tanto a v-SNARE de la mem brana de la vesícula como a t-SNARE de la m embra na diana, iniciando el ensam blaje del aparato de fusión, el cual cataliza la fusión de las dos bicapas lipídicas en la interfase membranosa de la vesícula diana (Fi gura 13-58).
La proteína de fusión de m em brana m ejor caracterizada está sintetizada por un virus48 La fusión de membranas es importante en otros procesos además de serlo en el transporte de vesículas; se conocen con detalle las fusiones de membrana más simples, que son las catalizadas por proteínas víricas de fusión víricas. Las proteí nas víricas de fusión juegan un papel crucial permitiendo la entrada de los virus recubiertos (los cuales tienen una cubierta membranosa de tipo bicapa lipídica) al interior de las células que infectan (comentado en el Capítulo 6). Los virus como el virus de la gripe, por ejemplo, entran en la célula por endocitosis media da por receptor y son transportados hasta los endosomas. El bajo pH de los endosomas activa una proteínas de fusión de la cubierta del virus que cataliza la fusión del virus con las membranas del endosoma, permitiendo así al ácido nucleico ví rico escapar al citosol, donde se puede replicar (Figura 13-59).
690
Capítulo 13 : Tráfico vesicular mediante las rutas secretora y endocítica
LAS REGIONES HIDROFOBICAS DE LAS PROTEÍNAS DE FUSIÓN SE INSERTAN EN LA MEMBRANA DE ENDOSOMA
FUSION DE LAS BICAPAS Y LIBERACIÓN DEL ÁCIDO NUCLEICO EN EL CITOSOL
(B)
proteina de fusión de la gripe en la m em brana , .. . de la célula 1 peptidos hidrofóbicos de fusión, escondidos
CAMBIO CONFORMACION AL QUE EXPONE LOS PÉPTIDOS DE FUSIÓN HIDROFÓBICOS
mem brana plasmática de la célula 2 CITOSOL DE LA CELULA 2
pH bajo
(A)
anclaje transm em brana
(C)
CITOSOL DE LA CÉLULA 1
Figura 13-60 Modelo para explicar cómo una proteina de fusión de membrana cataliza la fusión de la bicapa lipidica. Una célula que expresa en su superficie la proteina de fusión de la gripe se fusiona rápidamente con sus células vecinas una vez se ha expuesto a pH bajo. Los procesos de fusión se producen a través de un paso intermedio (D y E) en el que sólo se fusionan las capas lipídicas exteriores de la membrana, mientras que las dos capas internas se mantienen separadas. Incluso se han obtenido formas mutantes de la proteína de fusión que permiten que la reacción se desarrolle sólo hasta este estado intermedio.
Se han clonado los genes que codifican varias proteínas de fusión y se han utilizado para transfectar células eucariotas en cultivo. Estas células transfectadas expresan las proteínas víricas en su superficie, y bajo condiciones adecuadas se fusionan entre sí formando células gigantes multinucleadas. En el caso mejor estudiado, el del virus de la gripe, la estructura tridimensional de la proteína de fusión ha sido determinada por cristalografía de rayos X. Se ha demostrado que el pH bajo induce un cambio de conformación importante en la proteína de fu sión, que expone una región hidrofóbica, antes escondida, en la superficie de la proteína, que ahora puede interaccionar con la bicapa lipídica de la membrana diana. Parece que una agrupación de regiones hidrofóbicas de este tipo en pro teínas de fusión muy cercanas une las dos bicapas lipídicas manteniéndolas muy cerca una de la otra, de forma que se desestabilizan y se fusionan (Figura 13-60). Recientem ente, en mamífero se ha identificado una proteína sem ejante a las víricas, y se cree que media la fusión de las m em branas plasm áticas del esperma y del huevo que se produce en la fecundación (se com enta en el Capí tulo 20). Como resaltan todos estos ejemplos, bajo circunstancias normales las membranas no se fusionan fácilmente. La fusión de membranas requiere la par ticipación de proteínas especiales y está sometida a controles selectivos -u n a restricción que es crucial tanto para m antener la identidad de la célula en sí m is ma como para mantener la individualidad de cada uno de los compartimientos intracelulares.
Resumen Las diferencias entre los compartimientos membranosos de una célula se mantie nen gracias a un aporte de energía libre, que impulsa el transporte selectivo y diri gido de componentes particulares de membrana desde un compartimiento a otro. Las vesículas de transporte se generan a partir de regiones revestidas especializadas de la membrana dadora. El ensamblaje de la cubierta colabora en la formación de la vesícula. Existen dos tipos bien caracterizados de vesículas revestidas: las vesícu las revestidas de clatrina, que median el transporte vesicular selectivo desde la membrana plasmática y la red del trans Golgi, y las vesículas revestidas de coatómero, que permiten el transporte vesicular no selectivo desde el ER a las cisternas del Golgi. Las adaptinas proporcionan una unión molecular entre las cubiertas de clatrina y los receptores específicos de membrana y por lo tanto median la capta ción selectiva de moléculas a transportar por las vesículas revestidas de clatrina. Las vesículas revestidas han de perder su cubierta para fusionarse con la membra
Mecanismos moleculares del transporte vesicular y mantenimiento de la diversidad de compartimientos
691
na diana apropiada: en cuanto las vesículas entran en contacto con su membrana diana, los revestimientos de clatrina se pierden. Diversos tipos de GTPasas monoméricas, incluyendo ARF y las proteínas Rab, participan en la regulación de varias etapas del transporte vesicular, incluyendo la gemación de las vesículas, el contacto con la membrana diana y la fusión. Las pro teínas ARF, Rab, y v-SNARE se incorporan a las vesículas de transporte durante la gemación y aseguran que las vesículas sólo entreguen su contenido al comparti miento rodeado de membrana apropiado: se cree que ARF media el ensamblaje de la cubierta de coatómero (y probablemente el de clatrina) y el desensamblaje de la cubierta de coatómero, mientras que las proteínas Rab parece que aseguran la es pecificidad de unión anclando la vesícula a la membrana diana cuando interaccionan SNARE complementarias de la membrana diana y de la vesícula. Por lo tan to, la fusión de membranas está catalizada por varias proteínas citosólicas, incluyendo SNAPyNSF, que se unen entre síformando un complejo de fusión en el lugar de anclaje.
Bibliografîa General Gal, S. Raikhel, N.V. Protein sorting in the endomembrane system of plant cells. Curr. Opin. Cell Biol. 5:636-640, 1993. Gruenberg, J.; Clague, M.J. Regulation of intracellular mem brane transport. Curr. Opin. Cell Biol. 4:593-599, 1992. . Pryer, N.K.; Wuesthube, L.J.; Schekman, R. Vesicle-mediated protein sorting. Annu. Rev. Biochem. 61:471-516, 1992. Rothman, J.E. The reconstitution of intracellular protein transport in cell-free systems. Harvey Lect. 86:65-85, 1992.
Citas 1. Balch, W.E. Molecular dissection of early stages of the eukaryotic secretory pathway. Curr. Opin. Cell Biol. 2:634-641,1990. Hauri, H.-P.; Schweizer, A. The endoplasmic reticulumGolgi intermediate compartment. Curr. Opin. Cell Biol. 4:600-608, 1992. Saraste, J.; Kuismanen, E. Pathways of protein sorting and membrane traffic between the rough endoplamic reticulum and the Golgi complex. Semin. Cell Biol. 3:343-355,1992. Schwaniger, R.; Plutner, H.; Bokoch, G.M.; Balch, W.E. Multiple GTP-binding proteins regulate vesicular transport from the ER to Golgi membranes. J. Cell Biol. 119:1077-1096,1992. 2. Driouich, A.; Faye, L.; Staehelin, L.A. The plant Golgi ap paratus: a factory for complex polysaccharides and glyucoproteins. Trends Biochem. Sci. 18:210-214, 1993. Griffing, L.R. Comparisons of Golgi structure and dyna mics in plant and animal cells. /. Electron Microsc. Tech. 17:179-199, 1991. Mollenhauer, H.H.; Morre, D.J. Perspectives on Golgi ap paratus form and function. J. Electron Microsc. Tech. 17:2-14,1991. Rambourg, A.; Clermont, Y. Three-dimensional electron microscopy: structure of the Golgi apparatus. Eur. J. Cell Biol. 51:189-200, 1990.
692
3. Hauri, H.-P.; Schweizer, A. The endoplasmic reticulumGolgi intermediate compartment. Curr. Opin. Cell Biol. 4:600-608, 1992. Lippincott-Schwartz, J. Bidirectional membrane traffic between the endoplasmic reticulum and Golgi appa ratus. Trends. Cell Biol. 3:81-88,1993. Pelham, H.R. Recycling of proteins between the endo plasmic reticulum and Golgi complex. Curr. Opin. Cell Biol. 3:585-591,1991. 4. Doms, R.W.; Russ, G.; Yewdell, J.W. Brefeldin A redistri butes resident and itinerant Golgi proteins to the en doplasmic reticulum./. Cell Biol. 109:61-72,1989. Graham, T.R.; Scott, P A ; Emr, S.D. Brefeldin A reversibly blocks early but not late protein transport steps in the yeast secretory pathway. EMBOJ. 12:869-877,1993. Lippincott-Schwartz, J.; Yuan, L.; Tipper, C.; et al. Brefel din A’s effects on endosomes, lysosomes, and the TGN suggest a general mechanism for regulating organelle structure and membrane traffic. Cell 67:601-616,1991. Pelham, H.R. Multiple targets for Brefeldin A. Cell 67:449-451, 1991. Takizawa, P.A.; Yucel, J.K.; Veit, B.; et al. Complete vesiculation of Golgi membranes and inhibition of pro tein transport by a novel sea sponge metabolite, ilimaquinone. Cell 73:1079-1090, 1993. 5. Balch, W.E.; Dunphy, W.G.; Braell, W.A.; Rothman, J.E. Reconstitution of the transport of proteins between successive compartments of the Golgi measured by the coupled in incorporation of iV-acetylglucosamine. Cell 39:405-416, 1984. Komfeld, R.; Komfeld, S. Assembly of aspargine-linked oli gosaccharides. Annu. Rev. Biochem. 54:631-634,1985. Schachter, H.; Roseman, S. Mammalian glycosyltransferases: their role in the synthesis and function of complex carbohydrates and glycolipids. In The Bio chemistry of Glycoproteins and Proteoglycans (WJ. Lennarz, ed.), Chap. 3. New York: Plenum Press, 1980. 6. Armstrong, J. Latest episodes in the Golgi serial. Curr. Biol. 2:335-337,1992. Graham, T.R.; Emr, S.D. Compartmental organization of Golgi-specific protein modification and vacuolar protein sorting events defined in a yeast sec18 (NSF) mutant./. Cell Biol. 114:207-218,1991.
Capítulo 13: Tráfico vesicular mediante las rutas secretora y endocítica
7.
8. 9.
10.
11. 12.
13.
14.
15.
Machamer, C. Targeting and retention of Golgi mem brane proteins. Curr. Opin. Cell Biol. 5:606-612,1993. Mellman, I.; Simons, K. The Golgi complex: in vitro Veri tas'? Cell 68:829-840,1992. Rothman, J.E.; Orci, L. Movement of proteins through the Golgi stack: a molecular dissection of vesicular transport. FASEB J. 4:1460-1468, 1990. Esko, J.D. Genetic analysis of proteoglycan structure, function and metabolism. Curr. Opin. Cell Biol. 3:805-816,1991. Jentoft, N. Why are proteins O-glycosylated? Trends Biochem. Sci. 15:291-294,1990. Ruoslahti, G. Structure and biology of proteoglycans. Annu. Rev. Cell Biol. 4:229-255,1988. Hirschberg, C.B.; Snider, M.D. Topography of glycosylation in the rough endoplasmic reticulum and Golgi apparatus. Annu. Rev. Biochem. 56:63-87,1987. Varki, A. Biological roles of oligosaccharides: all of the theories are correct. Glycobiology 3:97-130, 1993. West, C.M. Current ideas on significance of protein glycosylation. Mol. Cell Biochem. 72:3-20,1986. Bainton, D. The discovery of lysosomes. /. Cell Biol. 91:66s-76s, 1981. Kornfeld, S.; Mellman, I. The biogenesis of lysosomes. Annu. Rev. Cell Biol. 5:483-525,1989. Holzman, E. Lysosomes: A Survey. New York: SpringerVerlag, 1976. Boiler, T.; Wiemken, A. Dynamics of vacuolar compartmentation. Annu. Rev. Plant Physiol. 37:137-164, 1986. Klionsky, D.J.; Herman, P.K.; Emr, S.D. The fungal vacu ole: composition, function, and biogenesis. Micro biol. Rev. 54:266-292,1990. Matile, P. Biochemistry and function of vacuoles. Annu. Rev. Plant Physiol. 29:193-213,1978. Vitale, A.; Chrispeels, M.J. Sorting of proteins to the va cuoles of plant cells. Bioessays 14:151-160,1992. Dunn, W.A., Jr. Studies on the mechanisms of autophagy: formation of the autophagic vacuole. [Two ar ticles.]/. Cell Biol. 110:1923-1933,1935-1945,1990. Helenius, A.; Mellman, I.; Wall, D.; Hubbard, A. Endosomes. Trends Biochem. Sci. 8:245-250,1983. Lawrence, B.P.; Brown, W.J. Autophagic vacuoles ra pidly fuse with pre-existing lysosomes in cultured hepatocytes./. Cell Science 102:515-526,1992. Noda, T.; Farquhar, M.G. A non-autophagic pathway for diversion of ER secretory proteins to lysosomes. /. Cell Biol. 119:85-97,1992. Takeshige, K.; Baba, M.; Tsuboi, S.; Noda, T.; Ohsumi, Y. Autophagy in yeast demonstrated with proteinasedeficient mutants and conditions for its induction. /. Cell Biol. 119:301-311,1992. Dice, J.F. Selective degradation of cytosolic proteins by lysosomes. Ann. N.Y.Acad. Sci. 674:658-664,1992. Klionsky, D.J.; Cueva, R.; Yaver, D.S. Aminopeptidase I of Saccharomyces cerevisiae is localized to the vacuo le independent of the secretory pathway. J. Cell Biol. 119:287-299,1992. Dahms, N.M.; Lobel, P.; Kornfeld, S. Mannose 6-phos phate receptors and lysosomal enzyme targeting. /. Biol. Chem. 264:12115-12118,1989. von Figura, K. Molecular recognition and targeting of lyso somal proteins. Curr. Opin. Cell Biol. 3:642-646,1991.
Bibliografía
16. Brown, W.J.; Goodhouse, J.; Farquhar, M.G. Mannose-6phosphate receptors for lysosomal enzymes cycle between the Golgi complex and endosomes. J. Cell Biol 103:1235-1247, 1986. Duncan, J.R.; Kornfeld, S. Intracellular movement of two mannose-6-phosphate receptors: return to the Golgi apparatus./. Cell Biol. 6:617-628-1988. Johnson, K.F.; Kornfeld, S. The cytoplassmic tail of the mannose 6-phosphate/insulin-like growth factor-II receptor has two signals for lysosomal enzyme sort ing in the Golgi./. Cell Biol. 119:249-257,1992. 17. Baranski, T.J.; Cantor, A.B.; Kornfeld, S. Lysosomal enzyme phosphorylation: protein recognition deter minants in both lobes of procathepsin D mediate its interactions with UDP-GlcNAc:lysosomal enzyme Nacetylglucosamine-1-phosphotransferase. /. Biol. Chem. 267:23342-23348,1992. Baranski, T.J.; Faust, P.L.; Kornfeld, S. Generation of a lysosoma enzyme targeting signal in the secretory protein pepsinogen. Cell 63:281-291,1990. von Figura, K. Molecular recognition and targeting of ly sosomal proteins. Curr. Opin. Cell Biol. 3:642-646, 1991. 18. Amara, J.; Cheng, S.H.; Smith, A. Intracellular protein trafficking defects in human disease. Trends Cell Biol. 2:145-149,1992. Kornfeld, S. Trafficking of lysosomal enzymes in normal and disease states./. Clin. Invest. 77:1-6,1986. Neufeld, E.F.; Lim, T.W.; Shapiro, L.J. Inherited disor ders of lysosomal metabolism. Annu. Rev. Biochem. 44:357-376,1975. 19. Watts, C.; Marsh, M. Endocytosis: what goes in and how?/. Cell Sci. 103:1-8,1992. 20. Aggeler, J.; Werb, Z. Initial events during phagocytosis by macrophages viewed from outside and inside the cell: membrane-particle interactions and clathrin. /. Cell Biol. 94:613-623,1982. Frank, M.M.; Fries, L.F. The role of complement in in flammation and phagocytosis. Immun. Today 12:322-326,1991. Griffin, F.M., Jr.; Silverstein, S.C. Segmental response of the macrophage plasma membrane to a phagocytic stimulus./. Exp. Med. 139:323-336,1974. Mellman, I. Endocytosis and antigen processing. Semin. Immunol. 2:229-237,1990. 21. Brodsky, F.M. Living with clathrin: its role in intracellu lar membrane traffic. Science 242:1396-1402,1988. Robinson, M.S. Coated vesicles and protein sorting. /. Cell Sci. 87:203-204,1987. 22. Brodsky, F.M.; Hill, B.L.; Acton, S.L.; et al. Clathrin light chains: arrays of protein motifs that regulate coatedvesicle dynamics. Trends Biochem. Sci. 16:208-213, 1991. Morris, S.; Ahle, S.; Ungewickell, E. Clathrin-coated ve sicles. Curr. Opin. Cell Biol. 1:684-690,1989. Smythe, E.; Warren, G. The mechanism of receptor-mediated endocytosis. Eur. J. Biochem. 202:689-699,1991. 23. Brown, M.S.; Goldstein, J.L. Koch’s postulates for cho lesterol. Cell 71:187-188,1992. Brown, M.S.; Goldstein, J.L. A receptor-mediated path way for cholesterol homeostasis. Science 232:34-47, 1986. 24. Helenius, A.; Mellman, I.; Wall, D.; Hubbard, A. Endoso mes. Trends. Biochem. Sci. 8:245-250,1983.
693
25.
26.
27.
28.
29.
McCoy, K.L. Contribution of endosomal acidification to antigen processing. Semin. Immunol. 2:239-246,1990. Mellman, I.; Fuchs, R.; Helenius, A. Acidification of the endocytic and exocytic pathways. Annu. Rev. Bio chem. 55:663-700, 1986. Robinson, D.G.; Depta, H. Coated vesicles. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 39:53-99, 1988. Schmid, S.L. Toward a biochemical definition of the en dosomal compartment. Studies using free flow elec trophoresis. Subcell. Biochem. 19:1-28, 1993. Bomsel, M.; Mostov, K. Sorting of plasma membrane proteins in epithelial cells. Curr. Opin. Cell Biol. 3:647-653, 1991. Hansen, S.H.; Sandvig, K.; van Deurs, B. Molecules in ternalized by clathrin-independent endocytosis are delivered to endosomes containing transferrin recep tors./. Cell Biol. 123:89-97,1993. Mayor, S.; Presley, J.F.; Maxfield, F.R. Sorting of mem brane components from endosomes and subsequent recycling to the cell surface occurs by a bulk flow process./. Cell Biol. 121:1257-1269, 1993. Sorkin, A.; Waters, C.M. Endocytosis of growth factor re ceptors. Bioessays 15:375-382,1993. Dunn, K.W.; Maxfield, F.R. Delivery of ligands from sor ting endosomes to late endosomes occurs by matu ration of sorting endosomes./. Cell Biol. 117:301-310, 1992. Hopkins, C.R. Selective membrane protein trafficking: vectoral flow and filter. Trends. Biochem. Sci. 17:2732, 1992. Nelson, W.J. Cytoskeleton functions in membrane traf fic in polarized epithelial cells. Semin. Cell Biol. 2:375-385, 1991. Parton, R.G.; Schrotz, P.; Bucci, C.; Gruenberg, J. Plasti city of early endosomes./. Cell Sci. 103:335-348, 1992. Rodman, J.S.; Mercer, R.W.; Stahl, P.D. Endocytosis and transcytosis. Curr. Opin. Cell Biol. 2:664-672, 1990. Apodaca, G.; Bomsel, M.; Arden, J.; et al. The polymeric immunoglobulin receptor. A model protein to study transcytosis./. Clin. Invest. 87:1877-1882, 1991. Mellman, I.; Fuchs, R.; Helenius, A. Acidification of the endocytic and exocytic pathways. Annu. Rev. Bio chem. 55:663-700, 1986. Mostov, K. The polymeric immunoglobulin receptor. Semin. Cell Biol. 2:411-418,1991. Bomsel, M.; Prydz, K.; Parton, R.G.; Gruenberg, J.; Si mons, K. Endocytosis in filter-grown Madin-Darby canine kidney (MDCK) cells. /. Cell Biol. 109:3243-58, 1989. Fujita, M.; Reinhart, F.; Neutra, M. Convergence of api cal and basolateral endocytic pathways at apical late endosomes in absorptive cells of suckling rat ileum in vivo.J. Cell Sci. 97:385-394, 1990. Hauri, H.P.; Matter, K. Protein traffic in intestinal epi thelial cells. Semin. Cell Biol. 2:355-364,1991. Matlin, K.S. W(h)ither default? Sorting and polarization in epithelial cells. Curr. Opin. Cell Biol. 4:623-628, 1992. Simionescu, M.; Simionescu, N. Endothelial transport of macromolecules: transcytosis and endocytosis. A look from cell biology. Cell Biol. Rev. 25:1-78,1991. Hong, W., Tang, B.L. Protein trafficking along the exocytotic pathway. Bioessays 15:231-238, 1993.
694
30.
31.
32.
33. 34.
35.
36.
37.
Kelly, R.B. Secretory granule and synaptic vesicle for mation. Curr. Opin. Cell Biol. 3:654-660,1991. Burgess, T.L.; Kelly, R.B. Constitutive and regulated secre tion of proteins. Annu. Rev. Cell Biol. 3:243-294,1987. Stoller, T.J.; Shields, D. The propeptide of preprosoma tostatin mediates intracellular transport and secre tion of alpha-globin from mammalian cells. /. Cell Biol. 108:1647-1655, 1989. van Meer, G. Transport and sorting of membrane lipids. Curr. Opin. Cell Biol. 5:661-673, 1993. Davidson, H.W.; McGowan, C.H.; Balch, W.E. Evidence for the regulation of exocytic transport by protein phosphorylation./. Cell Biol. 116:1343-1355,1992. Orci, L.; Ravazzola, M.; Amherdt, M.; et al. The transmost cisternae of the Golgi complex: a compartment for sorting of secretory and plasma membrane pro teins. Cell 51:1039-1051,1987. Tooze, J. Secretory granule formation. The morpholo gist’s view. CellBiophys. 19:117-130, 1991. Bruzzone, R. The molecular basis of enzyme secretion. Gastroenterology. 99:1157-1176,1990. Douglass, J.; Civelli, O.; Herbert, E. Polyprotein gene ex pression: generation of diversity of neuroendocrine peptides. Annu. Rev. Biochem. 53:665-715,1984. Neurath, H. Proteolytic processing and regulation. Enzyme 45:239-243, 1991. Burgoyne, R.D.; Morgan, A. Regulated exocytosis. Bio chem. J. 293:305-316, 1993. Arvan, P.; Castle, D. Protein sorting and secretion gran ule formation in regulated secretory cells. Trends Cell Biol. 2:327-331,1992. Thomas, P.; Aimers, W. Exocytosis and its control at the synapse. Curr. Opin. Neurobiol. 2:308-311,1992. Heuser, J. The role of coated vesicles in recycling of sy naptic vesicle membrane. Cell Biol. Int. Rep. 13:10631076,1989. Meldolesi, J. Dynamics of cytoplasmic membranes in guinea pig pancreatic acinar cells. I. Synthesis and turnover of membrane proteins. /. Cell Biol. 61:1-13, 1974. von Grafenstein, H.; Roberts, C.S.; Baker, P.F. Kinetic analysis of the triggered exocytosis/endocytosis se cretory cycle in cultured bovine adrenal medullary cells./. Cell Biol. 103:2343-2352, 1986. Bauerfeind, R.; Huttner, W. Biogenesis of constitutive secretory vesicles, secretory granules, and synaptic vesicles. Curr. Opin. Cell Biol. 5:628-635,1993. Kelly, R.B. Secretory granule and synaptic vesicle for mation. Curr. Opin. Cell Biol. 3:654-660, 1991. Hubbard, A.L. Targeting of membrane and secretory proteins to the apical domain in epithelial cells. Se min. Cell Biol. 2:365-374,1991. Hunziker, W.; Mellman, I. Relationships between sort ing in the exocytic and endocytic pathways of MDCK cells. Semin. Cell Biol. 2:397-410,1991. Lisanti, M.P.; Rodriguez-Boulan, E. Polarized sorting of GPI-linked proteins in epithelia and membrane mi crodomains. Cell Biol. Int. Rep. 15:1023-1049, 1991. Mostov, K.; Apodaca, G.; Aroeti, B.; Okamoto, C. Plasma membrane protein sorting in polarized epithelial cells./. Cell Biol. 116:577-583,1992. Simons, K.; Wandinger-Ness, A. Polarized sorting in epithelia. Cell 62:207-210,1990.
Capítulo 13 : Tráfico vesicular mediante las rutas secretora y endocítica
38. Bennett, M.K.; Scheller, R.H. The molecular machinery for secretion is conserved from yeast to neurons. PNAS 90:2559-2563,1993. Franzusoff, A. Beauty and the yeast: compartmental or ganization of the secretory pathway. Semin. Cell Biol. 3:309-324,1992. Kreis, T.E. Regulation of vesicular and tubular membra ne traffic of the Golgi complex by coat proteins. Curr. Opin. Cell Biol. 4:609-615,1992. Rothman, J.E. The reconstitution of intracellular protein transport in cell-free systems. Harvey Lect. 86:65-85, 1992. Schekman, R. Genetic and biochemical analysis of vesi cular traffic in yeast. Curr. Opin. Cell Biol. 4:587-592, 1992. Warren, G. Intracellullar transport: vesicular consump tion. Nature 345:382-383,1990. Waters, M.G.; Griff, I.C.; Rothman, J.E. Proteins involved in vesicular transport and membrane fusion. Curr. Opin. Cell Biol. 3:615-620,1991. 39. Anderson, R.G.W. Plasmalemma caveolae and GPI-anchored membrane proteins. Curr. Opin. Cell Biol. 5:647-652,1993. Dupree, P.; Parton, R.G.; Raposo, G.; Kurzchalia, T.V.; Simons, K. Caveolae and sorting in the irans-Golgi network of epithelial cells. EMBO J. 12:1597-1605, 1993. Kreis, T.E. Regulation of vesicular and tubular membra ne traffic of the Golgi complex by coat proteins. Curr. Opin. Cell Biol. 4:609-615,1992. Orci, L.; Glick, B.S.; Rothman, J.E. A new type of coated vesicular carrier that appears not to contain clathrin: its possible role in protein transport withing the Gol gi stack. Cell 46:171-184,1986. Sargiacomo, M.; Sudol, M.; Tang, Z.-L.; Lisanti, M.P. Sig nal transducing molecules and glycosyl-phosphatidyl inositol-linked proteins form a caveolin-rich inso luble complex in MDCK cells. J. Cell Biol. 122:789-808, 1993. Schmid, S. Biochemical requirements for the formation of clathrin and COP-coated transport vesicles. Curr. Opin. Cell Biol. 5:621-627,1993. 40. Anderson, R. Dissecting clathrin-coated pits. Trends Cell Biol. 2:177-179,1992. DeLuca-Flaherty, C.; McKay, D.B.; Parham, P.; Hill, B.L. Uncoating protein (hsc70) binds a conformationally labile domain of clathrin light chain LCa to stimulate ATP hydrolysis. Cell 62:875-887,1990. Gao, B.; Biosca, J.; Craig, E A ; Greene, L.E.; Eisenberg, E. Uncoating of coated vesicles by yeast hsp70 proteins. J. Biol. Chem. 266:19565-19571,1991. Nathke, I.S.; Heuser, J.; Lupas, A.; et al. Folding and trimerization of clathrin subunits at the triskelion hub. Cell 68:899-910,1992. Pearse, B.M.; Robinson, M.S. Clathrin, adaptors, and sorting. Annu. Rev. Cell Biol. 6:151-171,1990. 41. Chang, M.P.; Mallet, W.G.; Mostov, K.E.; Brodsky, F.M. Adaptor self-aggregation, adaptor-receptor recogni tion and binding of a-adaptin subunit to the plasma membrane contribute to recruitment of adaptor (AP2) components of clathrin-coated pits. EMBO J. 12:2169-2180, 1993.
Bibliografía
42.
43.
44.
45.
46.
47.
48.
Trowbridge, I.S. Endocytosis and signals for internaliza tion. Curr. Opin. Cell Biol. 3:634-641, 1991. Kreis, T.E. Regulation of vesicular and tubular membra ne traffic of the Golgi complex by coat proteins. Curr. Opin. Cell Biol. 4:609-615, 1992. Pfeffer, S.R.; Rothman, J.E. Biosynthetic protein trans port and sorting by the endoplasmic reticulum and Golgi. Annu. Rev. Biochem. 56:829-852,1987. Balch, W.E. From G Minor to G Major. Curr. Biol. 2:157160, 1992. Bourne, H.R.; Sanders, D.A.; McCormick, F. The GTPase superfamily: a conserved switch for diverse cell func tions. Nature 348:125-132,1990. Melancon, P. Vesicle traffic: “G Whizz.” Curr. Biol. 3:230-233,1993. Magee, T.; Newman, C. The role of lipid anchors for small G proteins in membrane trafficking. Trends Cell Biol. 2:318-323, 1992. Orci, L.; Palmer, D.J.; Amherdt, M.; Rothman, J.E. Coa ted vesicle assembly in the Golgi requires only coatomer and ARF proteins from the cytosol. Nature 364:732-734,1993. Serafini, T.; Orci, L.; Amherdt, M.; et al. ADP-ribosylation factor is a subunit of the coat of Golgi-derived COP-coated vesicles: a novel role for a GTP-binding protein. Cell 67:239-253,1991. Bennett, M.K.; Carciaarraras, J.E.; Elferink, L.A.; et al. The syntaxin family of vesicular transport receptors. Cell 74:863-873,1993. Sollner, T.; Whiteheart, S.W.; Brunner, M.; et al. SNAP receptors implicated in vesicle targeting and fusion. Nature 362:318-324,1993. Goud, B. Small GTP-binding proteins as compartmental markers. Semin. Cell Biol. 3:301-307,1992. Lombardi, D.; Soldati, T.; Riederer, M.A.; et al. Rab9 functions in transport between late endosomes and the trans Golgi network. EMBO J. 12:677-682,1993. Marsh, M.; Cutler, D. Membrane traffic: taking the Rabs off endocytosis. Curr. Biol. 3:30-33,1993. Zerial, M.; Stenmark, H. Rab GTPases in vesicular trans port. Curr. Opin. Cell Biol. 5:613-620,1993. Sztul, E.S.; Melancon, P.; Howell, K.E. Targeting and fu sion in vesicular transport. Trends Cell Biol. 2:381386,1992. Waters, M.G.; Griff, I.C.; Rothman, J.E. Proteins involved in vesicular transport and membrane fusion. Curr. Opin. Cell Biol. 3:615-620,1991. Zimmerberg, J.; Vogel, S.S.; Chernomordik, L.V. Mecha nisms of membrane fusion. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 22:433-466,1993. Blumenthal, R.; Schoch, C.; Puri, A.; Clague, M.J. A dis section of steps leading to viral envelope proteinmediated membrane fusion. Ann. N.Y. Acad. Sci. 635:285-296,1991. Doms, R.W. Protein conformational changes in virus cell fusion. Methods Enzymol. 221:61-72,1993. White, J.M. Membrane fusion. Science 258:917-924, 1992. Wiley, D.C.; Skehel, J.J. The structure and function of the hemagglutinin membrane glycoprotein of in fluenza virus. Annu. Rev. Biochem. 56:365-394,1987.
695
Mitocondrias parecidas a caracoles de una célula epitelial de caracol, visualizada por electronmicroscopia de alto voltaje.
Conversión energética: mitocondrias y cloroplastos Evolución de las cadei transporte de electror Los genomas de las mitocondrias y de los cloroplastos *
Las mitocondrias, que están presentes en todas las células, y los plastos (espe cialmente los cloroplastos) que se presentan exclusivamente en las plantas, transforman la energía en formas utilizables para impulsar reacciones celulares. De acuerdo con su importancia en el metabolismo, generalmente constituyen una parte importante del volumen celular total. En electronmicrografías una de las características morfológicas de las mitocondrias y de los cloroplastos es la gran cantidad de membrana interna que contienen. Como veremos, esta m em brana juega un papel crucial en la función de estos orgánulos transformadores de energía mediante la provisión de un substrato estructural para los procesos de transporte de electrones. Aunque las mitocondrias convierten la energía derivada de combustibles químicos y los cloroplastos convierten la energía derivada de la luz solar, los dos tipos de orgánulos se organizan de manera similar; además, ambos producen grandes cantidades de ATP a través del mismo mecanismo. Esta destacada con clusión surgió de los detallados estudios llevados a cabo durante los últimos treinta años. La ruta común mediante la cual las mitocondrias, los cloroplastos y hasta las bacterias se proveen de energía para sus funciones biológicas actúa a través de un proceso conocido como el acoplamiento quimiosmótico. La energía de los nutrientes y de la luz solar es utilizada para impulsar una bom ba de protones (bom ba de H+) unida a la membrana que transfiere protones de un lado al otro de la membrana. Estas bom bas generan un gradiente electroquímico de protones a través de la membrana que es utilizado en varias reacciones que requieren energía cuando los protones son captados por proteínas asociadas a la m em bra na (Figura 14-1). Concretamente, entre estas máquinas se encuentra la enzima ATP sintasa, que utiliza la energía del flujo de protones para sintetizar ATP a par tir de ADP y P¡. Otras proteínas acoplan el flujo de protones al transporte de de terminados metabolitos dentro y fuera de los orgánulos. En las bacterias el gra diente electroquímico de protones es por sí solo tan importante como almacén de energía directamente utilizable como por el ATP que éste genera: el gradiente no sólo impulsa muchos procesos de transporte sino que también impulsa la ro tación rápida del flagelo bacteriano, lo que permite la motilidad bacteriana en medio acuoso. ¿De qué forma la energía derivada de los nutrientes o de la luz impulsa las bom bas de H+ que están en el núcleo del mecanismo quimiosmótico? La res puesta radica en las reacciones en las que los electrones son transferidos de un com ponente a otro. En la mitocondria, por ejemplo, los electrones liberados de
luz solar
electrones de elevada energía
gradiente electroquím ico de protones transm em brana
transporte síntesis activo a de través de la B H m em brana
rotación del flagelo bacteriano
Figura 14-1 Acoplamiento quimiosmótico. La energía procedente de la luz solar o de la oxidación de los alimentos, se utiliza en primer lugar para generar un
gradiente electroquímico de protones a través de la membrana. Este gradiente constituye un almacén versátil de energía y se utiliza para impulsar diversas reacciones de la mitocondria, de los cloroplastos y de las bacterias.
697
CLOROPLASTO
MITOCONDRIA
gradiente de H+
gradiente de H+
t 'bomba
de
H+
bomba de s H+
‘ bomba de v. I
moléculas de grasa y de carbohidrato
ciclo del àcido citrico
CO,
ì CO,
moléculas de carbohidrato
H20 (B)
(A)
productos
una molécula glucídica en el curso de su degradación hasta C 0 2 son transferidos hasta el 0 2 a través de una ruta complicada, reduciendo el 0 2 hasta formar agua. La energía libre liberada cuando los electrones pierden energía por esta vía de un estado de alta energía a un estado de baja energía es utilizada para impulsar las bom bas de protones com o parte de un elaborado proceso de transporte de electrones que tiene lugar en la mem brana mitocondrial principal. El m ecanis mo es análogo al de una célula eléctrica que impulsa corriente eléctrica a través de un conjunto de motores eléctricos. Pero en los sistemas biológicos los elec trones no son transportados de un lugar a otro mediante hilos conductores, sino por moléculas difusibles que pueden recoger electrones en un lugar y entregar los en otro. Uno de los más importantes de estos transportadores de electrones es el NAD+, que puede captar dos electrones (más un H+) para convertirse en NADH, que es una pequeña molécula soluble en agua que transporta electrones desde los lugares en que se degradan las moléculas hasta el primero de una serie de transportadores incluidos en la mem brana mitocondrial. Estos transportado res difunden en el plano de la mem brana y transportan su carga de electrones desde una bom ba de H+ a otra. La tercera bom ba de H+ de la serie cataliza la transferencia final de los electrones al 0 2 (Figura 14-2A). El conjunto completo de proteínas y moléculas pequeñas implicadas en esta secuencia ordenada de transportadores de electrones en la mem brana se denomina cadena de trans
productos
Figura 14-2 La mitocondria y el cloroplasto como aparatos de transformación de energía. Las entradas se indican con flechas verde claro, los productos en azul y el sentido del flujo electrónico con flechas rojas. Nótese que la fuerza electromotriz generada por los dos fotosistemas de los cloroplastos permite al cloroplasto (B) impulsar una transferencia electrónica desde el H20 al carbohidrato, en sentido contrario al de la transferencia electrónica de las mitocondrias.
porte de electrones. Aunque el cloroplasto puede ser descrito en términos similares y algunos de sus com ponentes principales son muy similares a los de la mitocondria, la m em brana del cloroplasto contiene algunos componentes cruciales no encontrados en la membrana mitocondrial. Es más, entre esos componentes están los fotosistemas, en los que la energía luminosa es capturada y preparada para la transfe rencia de electrones, de manera análoga a como hacen las fotocélulas fabricadas por el hombre en paneles solares, absorbiendo la energía luminosa y utilizándola para impulsar corriente eléctrica. La fuerza motriz del electrón generada por los fotosistemas del cloroplasto impulsa el transporte de electrones en dirección opuesta a la que hemos descrito para el caso de las mitocondrias: los electrones son recogidos desde la molécula del agua produciendo 0 2 y son donados (vía NADPH) al C 0 2, para sintetizar carbohidratos. De esta forma el cloroplasto gene ra 0 2y carbohidratos, mientras que la mitocondria los consume (Figura 14-2B). Generalmente, se cree que los orgánulos de eucariotas transformadores de energía evolucionaron desde procariotas que fueron endocitados por células euca riotas primitivas y desarrollaron una relación simbiótica con ellos, hace aproxi madamente 1,5 x 10 9años. Esto explicaría por qué las mitocondrias y los cloroplastos contienen su propio DNA, que codifica algunas de sus proteínas. Desde
698
Capítulo 14 : Conversión energética: mitocondrias y cloroplastos
\!
\ \
\ \i \i V
!\ ■20 minutos Figura 14-3 Plasticidad mitocondrial. Cuando se observa una mitocondria en una célula viva, se aprecian en ella rápidos cambios de forma.
(A)
CB)
su captación inicial por una célula huésped estos orgánulos han perdido gran parte de su genoma y han llegado a depender notablem ente de proteínas que son codificadas por genes en el núcleo celular, sintetizadas en el citosol y enton ces importadas al orgánulo. De forma recíproca, las células huésped han llegado a depender de estos orgánulos tanto por la gran cantidad de ATP que necesitan para llevar a cabo la biosíntesis, el bom beo de iones, y la motilidad como por de terminadas reacciones biosintéticas que ocurren dentro de ellos.
La mitocondria1 La mitocondria ocupa una parte substancial del volumen citoplasmático de las células eucariotas, y han sido esenciales para la evolución de los animales pluri celulares. Sin las mitocondrias las células animales actuales dependerían de la glucólisis anaeróbica para formar ATP. Sin embargo, cuando la glucosa es con vertida en piruvato a través de la glucólisis, sólo se libera una pequeña fracción del total de la energía libre potencialmente disponible de la glucosa. En las mito condrias el metabolismo de los azúcares está integrado: el piruvato es importado dentro de la mitocondria y oxidado por el oxígeno molecular ( 0 2) a C 0 2y H20 . La energía liberada es almacenada de una forma tan eficiente que por cada molécu la de glucosa oxidada se producen aproximadamente 30 moléculas de ATP. Por el contrario, sólo dos moléculas de ATP son producidas a partir de la glucólisis. Las mitocondrias suelen describirse como cilindros alargados y rígidos, de un diámetro comprendido entre 0,5 y 1 pm y parecidos a bacterias. Sin embargo, la microcinematografía a intervalos de tiempo de las células vivas revela que las mitocondrias son orgánulos claramente móviles y plásticos, que cambian cons tantem ente de forma (Figura 14-3) e incluso que se fusionan unos con otros y se vuelven a separar. Cuando se desplazan por el citoplasma, las mitocondrias apa recen a menudo asociadas a los microtúbulos (Figura 14-4), lo que quizás deter mina la orientación y la distribución típica de las mitocondrias en los diferentes tipos celulares. Así, las mitocondrias de algunas células forman largos filamentos o cadenas móviles, mientras que otras se mantienen en una posición fija en la que pueden proporcionar ATP directamente en lugares de consumo anormal mente elevado de ATP -p or ejemplo, existen un gran número de mitocondrias empaquetadas entre las miofibrillas adyacentes en las células del músculo cardía co, o mitocondrias densamente agrupadas alrededor del flagelo en los esperma tozoides (Figura 14-5). Aunque su tamaño es suficiente como para ser observadas al microscopio óptico -fueron identificadas por primera vez en el siglo xix- el verdadero progre so en el conocim iento de su función dependió de procedimientos para aislar mi-
La mitocondria
10 Jim Figura 14-4 Relaciones entre las m itocondrias y los microtúbulos. (A) Micrografía óptica de cadenas de mitocondrias alargadas observadas en una célula viva de mamífero mantenida en cultivo. La célula fue contrastada con un colorante vital fluorescente (la rodamina 123) que marca específicam ente las mitocondrias. (B) Micrografía de inmunofluorescencia de la misma célula anterior pero fijada y contrastada con anticuerpos fluorescentes que se unen a los microtúbulos. Nótese que las mitocondrias tienden a alinearse a lo largo de los microtúbulos. (Por cortesía de Lan Bo Chen.)
699
m itocondria
MITOCONDRIA INTACTA
tocondrias intactas, d l^ r o lla d o s en de los estudios bioquím iW Lse han re gado; cada célula h e p á tic^ ^ n tie n e cuales ocupan aproxim adam ^fct una
m atriz m em brana externa m em brana interna espacio interm em brana
Figura 14-5 Localización de las mitocondrias en el músculo cardíaco y en la cola del espermatozoide, cerca de los lugares en los que se u á ra n grandes cantidades de ATP. Dur ite el desarrollo del flagelo de la cola^respermatozoide, unos microtúbul|^^enroscan de forma helicoidal alr^flror del axonema, donde al parecer (^P¡Qcionan la localización de las mitc^flrclrias en la cola; después, estos^Krotúbulos desaparecen.
en un m edio de baja osm olaridad, el influjo de agua hace que la m itocondria se hinche y que la m em brana externa se rompa, liberando el contenido del espacio interm em brana; la m em brana interna permanece intacta
m atriz m em brana ext • m em brana intt -espacio ¡nterm em bran: en un m edio de baja osm olaridad, i influjo de agua hace que la m itocondria se hinche y que la m em brana externa se rompa, liberando el contenido del espacio interm em brana; la m em brana inter permanece intacta
La mitocondria presenta u n ? m em brana interna que define Cada mitocondria está limitada por i que desempeñan membranas defin de la matriz, inter rior. c ' 1------ — nan sus distintos ción bioquím ica c como se presenta da de proteínas. La membran; porte, llamada po través de la bicaps todas las molécule tas moléculas pue m ú s c u lo c a r d ía c o de ellas no pueden atravesar la memb nifíca que, mientras que el espacio ir lente al citosol respecto a las pequeñí
AMHfHMlIfflC-
matriz rnntipnp nn aninn rl<=>npnnpñai
de la m itocondria desde el punto d^ interna que lo delimita. La membi pecializada. Contiene una elevad A r e na, que contiene cuatro ácidos g p o s la m em brana sea especialm ent^m pt versas proteínas de transporM que h
la centrifugación consigue que el contenido del espacio interm em brana quede en la fracción no sedimentada
la transferencia a un m edio de osm olaridad elevada provoca la retracción
la centrifugación en gradiente de densidad separa la m em brana externa de la m itocondria de la m atriz y la m em brana que la rodea
ESPACIO INTERMEMBRANA •EL ESPERMATOZOIDE la transterencia a un m edio de osm olaridad elevada provoca la retracción
en gradiente separa la na externa de la m ito c B d ría de la m atriz y la m e m IB n a que la rodea
la rotura y centrifugación separa la m em brana interna de los com ponentes de la matriz
o ° ° r *, Figura 14-6 Fr^Konamient 0 o ° ® o O Ttk d °o componentes, tas técnicas 0o#^ . V O° ° 0 ^ y proteínas de « T a compartim MEMBRANA MATRIZ MEMBRANA permite el pj*esam iento de i INTERNA EXTERNA tiempo, apivecha el hecho d,. Un uu,u.u ^u.. Un« baja, el agwfluye hacia dentro de la mitocondria y dilata el espacio matricial {amarillo'mAientras que las crestas de la membrana mitocondrial interna la permiter jsplegarse para acomodarse a la expansión, la membrana externa -que noj Éne pliegues- se rompe, liberando una estructura compuesta sólo por la íbrana interna y la matriz. 700
jgación consigue que el d del espacio interm em bre i la fracción no sedim entat
ESPACIO INTERMEMBRANA
Capítulo 14 : Conversión energética: mitocondrias y cloroplastos
la rotura y ce ifugación separa la m e m m a interna de los c o m p o n e n te ^ « la m atriz
OO O «=»
MEMBRANA INTERNA
MATRIZ
Figura 14-7 Organización general de una mitocondria. En el hígado se estima que un 67% de la totalidad de las proteínas mitocondriales se encuentran en la matriz, un 21% se encuentran en la membrana mitocondrial interna, un 6% en la membrana externa y otro 6% en el espacio intermembranoso. Como se indica a continuación, cada una de estas cuatro regiones contiene un equipo especial de proteínas que interviene en distintas funciones. (Cortesía de Daniel S. Friend.)
[.............. 100 nm
M a tr iz . La matriz contiene una mezcla altamente concentrada de cientos de enzimas, incluyendo las que son necesarias para la oxidación del piruvato y los ácidos grasos y para el ciclo de ácido cítrico. La matriz también contiene diversas copias idénticas del genoma de DNA mitocondrial, ribosomas mitocondriales especiales, tRNA y varias enzimas requeridas para la expresión de los genes mitocondriales. M e m b ra n a in te rn a . La membrana interna se encuentra replegada en numerosas crestas, que aumentan considerablemente su superficie total. Contiene proteínas con tres tipos de funciones: (1) aquellas que realizan las reacciones de oxidación de la cadena respiratoria, (2) un complejo enzimàtico llamado ATP sintasa que produce ATP en la matriz, y (3) proteínas de transporte específicas que regulan el paso de metabolitos dentro y fuera de la matriz. Dado que se establece un gradiente electroquímico a través de esta membrana por la cadena respiratoria que impulsa la ATP sintasa, es importante que la membrana sea impermeable a la mayoría de iones. M e m b ra n a e x te rn a . Gracias a que ésta contiene una gran proteína formadora de canales (llamada porina), la membrana externa es permeable a todas las moléculas con un peso molecular inferior a 5000 daltons. Otras proteínas de esta membrana son las enzimas implicadas en la síntesis mitocondrial de lípidos y las enzimas que transforman en la matriz los substratos lipídicos en formas metabolizables. Espacio in te rm e m b ra n a . Este espacio contiene varias enzimas que utilizan la salida de ATP de la matriz para fosforilar otros nucleótidos.
La mitocondria
701
m ente a las pequeñas moléculas que son metabolizadas o que son necesarias por las numerosas enzimas mitocondriales que se hallan concentradas en el es pacio de la matriz. Entre estas enzimas se encuentran las que metabolizan el piruvato y los ácidos grasos hasta acetil CoA y las que oxidan el acetil CoA en el ci clo del ácido cítrico. Los principales productos finales de esta oxidación son el C 0 2, que es eliminado de la célula, y el NADH, que constituye la principal fuente de electrones que serán transportados a través de la cadena respiratoria -n o m bre que recibe la cadena de transporte de electrones de la mitocondria. Las enzi mas de la cadena respiratoria están situadas en la membrana mitocondrial in terna y son esenciales para todo el proceso de la fosforilación oxidativa, que genera la mayoría del ATP de la célula animal. La membrana mitocondrial interna suele estar muy replegada en el espacio de la matriz, formando una serie de dobleces denominados crestas. Estas inva ginaciones aumentan notablem ente el área de la membrana interna, de forma que en las células de hígado, por ejemplo, constituyen alrededor de una tercera parte del total de la membrana de la célula. El número de crestas de las mitocondrias de las células del músculo cardíaco es tres veces mayor que el de las mitocondrias de una célula hepática, debido probablemente a la mayor demanda de ATP de la células del corazón. Además de las diferencias morfológicas, también existen diferencias substanciales en las enzimas mitocondriales de diferentes ti pos celulares. Sin embargo, en este capítulo prescindiremos de estas diferencias y centrarem os nuestra atención en las enzimas y en las propiedades que son co munes a todas las mitocondrias.
La oxidación mitocondrial empieza cuando se generan grandes cantidades de acetil CoA a partir de piruvato y de ácidos grasos en el espacio de la m atriz3 El metabolism o oxidativo de las mitocondrias utiliza como combustibles mayoritarios el piruvato y los ácidos grasos producido en el citosol a través de la glucolisis. Estos com puestos son transportados selectivamente desde el citosol hasta la matriz mitocondrial, donde son degradados hasta el grupo acetilo, de dos carbonos, de la molécula del acetil coenzim a A (acetil CoA) (Figura 14-8); a continuación, el grupo acetilo es introducido en el ciclo del ácido cítrico para su degradación posterior, y el proceso term ina con el paso de los electrones de alta energía derivados del grupo acetilo, a lo largo de la cadena respiratoria. Figura 14-8 El acetil coenzima A (acetil CoA). Este intermediario central es producido durante la transformación de los alimentos en la mitocondria. En la figura se muestra un modelo espacial de una abreviación común del acetil CoA (véase también Figura 2-20). El átomo señalado con una S es un átomo de azufre que forma una unión tioéster con el acetato. Debido a que este enlace es rico en energía, el grupo acetato puede ser fácilmente transferido a otras moléculas, como el oxalacetato (véase Figura 14-14).
CHq CoA 'V
702
Capítulo 14: Conversión energética: mitocondrias y cloroplastos
O II
CHi— O — C — cola de ácido graso
O il CU — O — C — cola de ácido graso
Figura 14-9 Grasa. (A) Fotografía obtenida con el microscopio electrónico de una inclusión lipidica en el citoplasma que contiene triacilglicéridos, la principal forma de reserva de grasa. (B) Estructura de un triacilglicérido, con su porción de glicerol en co lor verde. (A, por cortesía de Daniel S. Friend.)
O I!
(Ai
L__.___________ __ __„_ J 1 pm
CH >— O — C — cola do ácido graso
(0>
Para asegurar un aporte continuado de combustible para el metabolismo oxidativo, las células animales almacenan ácidos grasos en forma de grasas y glucosa en forma de glucógeno. Desde el punto de vista cuantitativo, las grasas son, con diferencia, más importantes que el glucógeno, por una parte debido a que la oxidación de las grasas libera una cantidad de energía más de seis veces superior a la que libera una masa igual de glucógeno en forma hidratada. Un in dividuo humano adulto medio almacena una cantidad de glucógeno suficiente aproximadamente para un solo día de actividad normal, pero almacena una cantidad de grasa suficiente para casi un mes de actividad normal. Si nuestra re serva mayoritaria de energía fuese el glucógeno en lugar de las grasas, nuestro peso corporal aumentaría en unos 25 kilos de promedio. La mayor parte de nuestra grasa está almacenada en el tejido adiposo, del cual pasa al torrente sanguíneo cuando otras células la necesitan. Esta necesidad surge tras un período de ayuno; incluso el ayuno nocturno normal da lugar a la movilización de grasa, de forma que por la mañana, la mayor parte del acetil CoA que entra en el ciclo del ácido cítrico deriva de los ácidos grasos y no de la glucosa. Sin embargo, después de una comida la mayor parte del acetil CoA que entra en el ciclo del ácido cítrico procede de la glucosa derivada de los alim en tos, y toda la glucosa que se halla en exceso es utilizada o para restablecer las agotadas reservas de glucógeno o para sintetizar grasas. (Téngase en cuenta que en las células animales los azúcares son fácilmente convertidos en grasa pero que la grasa no puede ser convertida en azúcares.) Una molécula de grasa está compuesta por tres moléculas de ácido graso unidas a una de glicerol, a través de enlaces éster. Estos triacilglicéridos (triglicéridos) carecen de carga y son prácticam ente insolubles en agua, formando pe queñas gotitas en el citosol (Figura 14-9). En los adipocitos, las grandes células especializadas en el almacenamiento de grasa en el tejido adiposo, existe una gran gota única de grasa que ocupa casi todo el volumen de la célula. En otras células que obtienen la energía a partir de la transformación de los ácidos gra sos, como por ejemplo las fibras del músculo cardíaco, normalmente se presen tan unas gotas de grasas mucho más pequeñas, a menudo estrechamente aso ciadas a la mitocondrias (Figura 14-10). En todas las células, las enzimas de las membranas mitocondriales externa e interna median el paso de los ácidos gra sos derivados de las moléculas de grasa, hacia la matriz mitocondrial. En la ma triz, cada molécula de ácido graso (en forma de acil graso CoA) es degradada completamente gracias a un ciclo de reacciones que en cada vuelta elimina los dos carbonos del extremo carboxilo terminal del acil graso CoA, dando lugar a una molécula de acetil CoA (Figura 14-11). Este acetil CoA producido entra en el ciclo del ácido cítrico para ser oxidado. El glucógeno, es un polímero de glucosa, grande y ramificado, que se halla en forma de gránulos en el citoplasma celular (Figura 14-12); su síntesis y degra dación están altamente reguladas de acuerdo con las necesidades de la célula.
La mitocondria
m iofibrilla
gota de grasa m itocondria
Figura 14-10 Gotas de grasa de una célula de músculo cardíaco. Las gotas están rodeadas de mitocondrias, las cuales oxidan los ácidos grasos derivados de los triacilglicéridos de la gota.
703
Figura 14-11 Ciclo de oxidación de los ácidos grasos. El ciclo está catalizado por series de cuatro enzimas, en la matriz mitocondrial. Tal como se indica en la figura, cada vuelta del ciclo acorta el ácido graso en dos carbonos (que se muestran en color rojo) y genera una molécula de acetil CoA, una molécula de NADH y una de FADH2. El NADH es soluble en la matriz. Por el contrario, el FADH2 permanece fuertemente unido a la enzima a c il graso CoA d esh id rog en asa; sus dos electrones pueden ser transferidos rápidamente a la cadena respiratoria de la membrana mitocondrial interna, con lo que se regenera FAD.
Figura 14-12 Electronmicrografía y dibujo esquemático de un gránulo de glucógeno. El glucógeno es la forma +H
Cuando las necesidades aumentan, el glucógeno es hidrolizado liberando gluco sa 1-fosfato, substrato de la glucolisis. Las reacciones de la glucolisis convierten las moléculas de la glucosa, de seis átomos de carbono, (y también de otros azú cares relacionados) en dos moléculas de piruvato, de tres carbonos, las cuales todavía contienen la mayor parte de la energía que se puede obtener de la oxida ción de los azúcares. Esta energía sólo se obtiene después de que el piruvato haya sido transportado desde el citosol hasta la matriz de la mitocondria, donde
principal de reserva de carbohidratos de las células de los vertebrados. Es un polímero de glucosa, y cada gránulo de glucógeno es una sola molécula muy ramificada. La síntesis y la degradación del glucógeno están catalizadas por enzimas unidas a la superficie de los gránulos: la enzima de biosíntesis o glu cógen o sin tasa y la enzima de degradación o glu cógen o fosforilasa. (Por cortesía de Robert Fletterick y Daniel S. Friend.)
35 nm
dom inio catalítico \
cadenas ramificadas form adas por residuos de glucosa de una m olécula de glucógeno
\
gránulos de glucógeno en el citoplasm a de una célula del hígado
704
m onocapa de m oléculas de enzima cubriendo un gránulo de glucógeno
Capítulo 14 : Conversión energética: mitocondrias y cloroplastos
dom inio regulador
dim ero de glucógeno fosforilasa
//
CHtC
o
CoASH
\
piruvato C H ,C
s
O
\ ...
SCoA
acetil CoA
se encuentra con un gran complejo multienzimático, el complejo de la piruvato deshidrogenasa. Este complejo -q u e contiene múltiples copias de tres enzimas, cinco coenzimas y dos proteínas reguladoras- transforma rápidamente el piru vato hasta acetil CoA, liberando C 0 2 como subproducto (Figura 14-13). Este ace til CoA, junto con el acetil CoA producido a partir de los ácidos grasos, alimenta el ciclo del ácido cítrico.
Figura 14-13 Reacciones que cataliza el complejo de la piruvato deshidrogenasa. El complejo transforma el piruvato en acetil CoA, en la matriz mitocondrial; en esta reacción también se produce NADH. A,B, y C son las tres enzimas piruvato
descarboxilasa, lipoamida reductasa transacetilasa y dihidrolipoil deshidrogenasa, cuyas actividades están acopladas tal como se muestra en la figura. En la Figura 2-41 se muestra la estructura del complejo enzimàtico; este complejo también presenta una proteína quinasa y una proteína fosfatasa que regulan la actividad de la piruvato deshidrogenasa, inhibiéndola cuando los niveles de ATP son altos.
El ciclo del ácido cítrico oxida el grupo acetilo del acetil CoA, generando NADH y FADH2 para la cadena respiratoria4 En el siglo xix, unos biólogos observaron que en ausencia de aire (en condiciones anaeróbicas) las células producen ácido láctico (o etanol) mientras que en pre sencia de aire (en condiciones aeróbicas) utilizan 0 2 y producen C 0 2 y H20 . Los esfuerzos que se realizaron para definir las vías del metabolismo aeróbico se centraron en el estudio de la oxidación del piruvato y condujeron al descubri miento, en 1937, del ciclo del ácido cítrico, también conocido como el ciclo de los ácidos tricarboxílicos o ciclo de Krebs. En la mayoría de las células, el ciclo del ácido cítrico es el responsable de la oxidación total de aproximadamente dos terceras partes de los compuestos de carbono, y sus principales productos fina les son el C 0 2 y electrones ricos en energía, los cuales pasan vía NADH y FADH2 a la cadena respiratoria. El C 0 2 es eliminado como producto de desecho m ien tras que los electrones ricos en energía se desplazan a lo largo de la cadena res piratoria y finalmente se combinan con el 0 2formando H20 . El ciclo del ácido cítrico empieza cuando el acetil CoA formado a partir de los ácidos grasos o del piruvato reacciona con el compuesto de cuatro carbonos oxalacetato produciendo ácido cítrico, molécula de seis átomos de carbono que da nombre al ciclo. A continuación, como resultado de siete reacciones conse cutivas, catalizadas por enzimas, se eliminan en forma de C 0 2 dos átomos de carbono y se regenera en oxalacetato. En cada una de estas vueltas del ciclo se producen dos moléculas de C 0 2 a partir de dos átomos de carbono que entraron en ciclos anteriores (Figura 14-14); por lo que respecta al grupo acetilo del acetil CoA, el resultado neto es el siguiente: CH3COOH (como acetil CoA) + 2H20 + 3NAD+ + FAD unido a proteína -> 2 C 0 2+ 3H+ + 3NADH + FADH2unido a proteína Esta reacción produce también una molécula de ATP (vía GTP) a través de una transferencia directa de un fosfato del azúcar fosfato intermediario al GDP; reacción de fosforilación a nivel de substrato del mismo tipo de las que se produ cen en la glucolisis, como se explicó en el Capítulo 2. Sin embargo, la contribución más importante del ciclo del ácido cítrico al metabolismo consiste en la extracción de electrones de alta energía durante la oxidación de los dos átomos de carbono del grupo acetilo, hasta C 0 2. Estos elec trones, que son transportados de forma transitoria por el NADH y por el FADH2, son rápidamente transferidos a la cadena respiratoria en la membrana mitocondrial interna. El FADH2, que forma parte del complejo de la succinato deshidro genasa de la membrana interna, cede sus electrones directamente a la cadena La mitocondria
705
Figura 14-14 El ciclo del ácido cítrico.
acetil CoA
://
O
C H >C
siguiente ciclo
C O O II
I CH, I “
m alato COOH
isocitrato
il •
c
-
c o o ii
CO,
respiratoria. Por el contrario, el NADH forma un acervo de equivalentes reduci dos en la matriz mitocondrial y transfiere sus electrones después de que se pro duzca una colisión al azar con una enzima deshidrogenasa unida a la m em bra na. Ahora vamos a considerar de qué forma se utiliza para sintetizar ATP la energía alm acenada en estos electrones.
En la m em brana mitocondrial interna, un proceso quim iosm ótico convierte la energía de oxidación en ATP5 Aunque el ciclo del ácido cítrico forma parte del metabolismo aeróbico, ninguna de las reacciones que llevan a la producción de NADH y FADH2 utilizan directa mente oxígeno molecular. Casi toda la energía disponible a partir de la com bus tión de los carbohidratos, grasas y otros nutrientes, obtenidos de los substratos por el NAD+ y el FAD, se alm acena inicialmente en forma de electrones de alta energía. Estos electrones, transportados por el NADH y el FADH2, reaccionan con el oxígeno molecular a través de la cadena respiratoria. Para describir estas últimas reacciones se utiliza el término de fosforilación oxidativa ya que la gran cantidad de energía que se libera de ellas es utilizada por las enzimas de la mem-
706
Capítulo 14 : Conversión energética: mitocondrias y cloroplastos
Los intermediarios se muestran en forma de ácidos libres, aunque en realidad los grupos carboxilo están ionizados. Cada una de las reacciones indicadas está catalizada por una enzima diferente, localizada en la membrana mitocondrial. Los dos carbonos procedentes del acetil CoA que entran en esta vuelta del ciclo (sombreados en co lor rojo) serán transformados en C 0 2 en posteriores vueltas del ciclo. Los dos átomos de carbono que son transformados en C 0 2 en esta vuelta del ciclo se señalan con una C de co lor azu l. En cada vuelta se forman tres moléculas de NADH y una de GTP, la cual se puede transformar en ATP mediante la reacción de intercambio GTP + ADP —» GDP + ATP. Además, se forma una molécula de FADH2, que permanece unida a una proteína formando parte del co m p lejo d e la su ccin ato d esh id rog en asa en la membrana mitocondrial interna; este complejo transfiere directam ente los electrones transportados por el FADH2 a la ubiquinona (véase más adelante).
brana interna de la mitocondria para impulsar la transformación de ADP + P¡ hasta ATP (Figura 14-15). Como ya hemos mencionado, la producción de ATP por la fosforilación oxidativa en la cadena respiratoria depende de un proceso quimiosmótico. Cuando fue propuesto por primera vez en 1961, este mecanismo resolvió un antiguo rom pecabezas de la biología celular. No obstante, la idea resultaba tan original que fueron necesarios varios años para acumular las pruebas suficientes para que fue ra aceptada de forma general. Anteriormente se creía que la energía para la sínte sis del ATP vía la cadena respiratoria era suministrada por el mismo proceso que actúa durante las fosforilaciones a nivel de substrato: es decir, se creía que la energía de oxidación era utilizada para producir un enlace de alta energía entre un grupo fosfato y algún compuesto intermedio, y que la conversión de ADP en ATP era impulsada por la energía que se liberaba al romperse este enlace. Sin embargo, a pesar de los intensos esfuerzos que se realizaron, nunca se pudieron llegar a detectar estos intermediarios. Un resumen de nuestra visión actual del metabolismo energético m itocondrial se representa en la Figura 14-16. Según la hipótesis quimiosmótica, los in termediarios químicos de alta energía son substituidos por una conexión entre procesos químicos (“quim io”) y procesos de transporte (“osm ótico”, del griego osmos, empujar) -d e ahí el nombre de acoplam iento quim iosm ótico (Tabla 14-1). Cuando los electrones de alta energía de los hidrógenos del NADH y del FADH2 son transferidos a lo largo de la cadena respiratoria de la m em brana mitocondrial interna, la energía que se libera cada vez que pasan de una molécula transportadora a la siguiente es utilizada para bom bear protones (H+) a través de la m em brana interna, desde la matriz mitocondrial hasta el espacio inter membranoso. Esto genera un gradiente electroquímico de protones a través de la mem brana mitocondrial interna, y el flujo de H+ a favor de este gradiente es utilizado, m ediante una enzima ligada a la membrana, la ATP sintasa, para im pulsar la conversión de ADP + P¡ en ATP, completando así el proceso de la fosfo rilación oxidativa. En lo que queda de esta sección vamos a esbozar brevemente el tipo de re acciones que hacen posible la fosforilación oxidativa, dejando los detalles para más tarde.
piruvato
ácidos grasos m em brana interna m em brana externa
o2
La mitocondria
E H 3 J |+ H+ + <áo 2
|n a d +|+ h 2o
^
J procesos de transform ación energética
f iappi+Pj
FOSFORILACIÓN OXIDATIVA
A
^
n a +H2o
Figura 14-15 Principal red de transform ación energética catalizada p or la m itocondria. En este proceso d e fo sfo rila c ió n ox id ativ a, la membrana mitocondrial interna actúa com o una máquina de interconversión energética, transformando parte de la energía de oxidación del NADH (y del FADHZ) en energía de enlace fosfato del ATP.
Figura 14-16 Resumen del metabolismo energético mitocondrial. El piruvato y los ácidos grasos que entran en la mitocondria son procesados a acetil CoA y son metabolizados por el ciclo del ácido cítrico, produciéndose NADH (y FADH2, que no se muestra en la figura). En el proceso de la fosforilación oxidativa, los electrones de alta energía del NADH (y del FADH2) se transfieren al oxígeno mediante la cadena respiratoria de la membrana mitocondrial interna, produciéndose ATP mediante un mecanismo quimiosmótico. El NADH generado en el citosol por la glucolisis también transfiere electrones a la cadena respiratoria (no se muestra en la figura). Dado que el NADH no puede pasar a través de la membrana mitocondrial interna, la transferencia electrónica desde el NADH citosólico se ha de efectuar de manera indirecta por medio de un (de entre varios) sistema de “lanzadera”, que transporta otros compuestos reducidos al interior de la mitocondria; después de ser oxidado, este compuesto vuelve al citosol, donde es reducido de nuevo por el NADH.
707
T abla 14-1 Acoplamiento quimiosmótico La hipótesis quimiosmótica, tal como fue propuesta a principios de la década de 1960, consiste en cuatro postulados independientes. En términos de función mitocondrial, fueron: 1. La cadena respiratoria mitocondrial de la membrana interna transloca protones; cuando se transportan electrones a través de la cadena, bombea H+ hacia afuera del espacio de la matriz. 2. El complejo mitocondrial ATP sintasa también transloca protones a través de la membrana interna: al ser reversible, puede utilizar energía de la hidrólisis del ATP para bombear H+a través de la membrana, pero si existe un gradiente electroquímico de protones suficiente, los protones fluyen en dirección opuesta a través del complejo impulsando la síntesis de ATP. 3. La membrana mitocondrial interna está equipada con una serie de proteínas transportadoras que median la entrada y la salida de metabolitos esenciales y de determinados iones inorgánicos. 4. La membrana mitocondrial interna es impermeable a H+, OH- y, en general, a cationes y aniones
Los electrones son transferidos desde el NADH hasta el oxígeno, a través de tres grandes com plejos enzimáticos respiratorios6 Aunque el m ecanismo a través del que se aprovecha la energía por la cadena res piratoria difiere del de otras reacciones metabólicas, el principio es el mismo. Se consigue que la reacción energéticamente favorable H2 + 1/202 —>H20 se produz ca a través de muchos pequeños pasos, de forma que la mayor parte de la ener gía de esta reacción pueda ser transformada en una forma de almacenamiento en vez de ser liberada al medio en forma de calor. Tal y como ocurre en la forma ción de ATP y de NADH en la glucolisis o en el ciclo del ácido cítrico, esto impli ca que la reacción debe realizarse a través de una vía indirecta. La cadena respi ratoria es una vía única en cuanto a que en ella los átomos de hidrógeno son escindidos en protones y electrones. Los electrones pasan a través de una serie
(B)
(A)
H2
yiC>2
escisión en protones y electrones 2H+
LIBERACION EXPLOSIVA DE ENERGÍA CALORÍFICA
HÜr
2q
la m ayor parte de la energía se aprovecha y se transform a en una form a de alm acenam iento
|
H20
708
Capítulo 14 : Conversión energética: mitocondrias y cloroplastos
Figura 14-17 Comparación de las oxidaciones biológicas con la combustión. En esta ilustración se muestra cómo la mayor parte de la energía que se liberaría en forma de calor si se quemara el hidrógeno (A) se utiliza y se almacena en forma útil por medio de la cadena de transporte electrónico de la membrana mitocondrial interna (B). El resto de la energía de oxidación se libera por la mitocondria en forma de calor. En realidad, los protones y los electrones que se muestran aquí se obtienen de los átomos de hidrógeno que se hallan unidos covalentemente a moléculas de NADH o de FADH2 (véase Figura
14-18).
h 2o
interm ediarios transitorios
alcohol
R — C- 5 - d* ®
R — c-^c/
H
H
H\
O H
c
II
N
H
h
-C —NH?
C II
R —C #0
h:
H /C -N H 2
H
■Ct O '
H
H
H
H4'
H
H
aldehido
c
II o
'H
•c —nh 7 'c % Q ' II o —
c
c
'H
C
H
'C f
II
H-
C
II
N'
.C -N H , II
O 'H
NAD+
RESUMEN: substrato
+ NAD H + NAD+ ----------- -- C O substrato oxidado
de transportadores de electrones de la membrana mitocondrial interna. En algu nos pasos a lo largo de esta cadena los protones y los electrones se recombinan temporalmente. Pero sólo cuando los electrones alcanzan el final de esta cadena de transporte electrónico, se devuelven los protones para neutralizar las cargas negativas creadas por la adición final de electrones a la molécula de oxígeno (Fi gura 14-17). Estudiaremos el proceso de oxidación empezando por el NADH, el más im portante colector de electrones derivados de la oxidación de las moléculas de los nutrientes. Cada átomo de hidrógeno consta de un electrón (er) y un protón (H+). En el Capítulo 2, ya explicamos el mecanismo por el que el NADH capta los electrones, lo cual se muestra con más detalle en la Figura 14-18. Como cla rifica este ejemplo, cada molécula de NADH no transporta un ion hidrógeno sino un ion hidruro (un átomo de hidrógeno más un electrón adicional, al que podemos indicar como H r, ilustrando como un punto cada uno de sus dos elec trones). Sin embargo, y puesto que en las soluciones acuosas los protones están disponibles libremente, el transporte de un ion hidruro por el NADH equivale a transportar dos átomos de hidrógeno, es decir, una molécula de hidrógeno (H: + H+—>H2). El transporte de electrones empieza en el momento en que el ion hidruro se libera del NADH, regenerándose NAD+, y se convierte en un protón y dos elec trones (H r—» H+ + 2e~). Estos dos electrones son transferidos al primero de una serie de más de 15 transportadores diferentes de electrones que se hallan en la cadena respiratoria. Los electrones empiezan con una energía muy alta, que van perdiendo a medida que pasan a lo largo de la cadena. La mayor parte de las ve ces los electrones pasan de un átomo metálico a otro, cada uno de los cuales está estrechamente unido a una molécula de proteína que altera la afinidad electrónica del átomo metálico. Más adelante se explicarán con detalle los dife rentes tipos de transportadores electrónicos de la cadena respiratoria. Pero lo que es más importante es el elevado número de enzimas implicadas en este pro ceso que se encuentran agrupadas en tres grandes complejos enzimáticos respi ratorios, cada uno de los cuales presenta proteínas transmembrana que sostie nen firmemente el complejo en la membrana mitocondrial interna. Cada complejo de la cadena tiene mayor afinidad por los electrones que su predece sor, de forma que los electrones pasan secuencialmente de un complejo al otro hasta que finalmente son transferidos al oxígeno, el cual tiene una afinidad por los electrones mayor que la de cualquier complejo de la cadena.
La mitocondria
Figura 14-18 La oxidación biológica de un alcohol a un aldehido. Del alcohol se eliminan los com ponentes de dos átomos de hidrógeno completos: un ion hidruro es transferido al NAD+y un protón escapa a la solución acuosa. En la figura se muestra únicam ente la porción del anillo de nicotinamida de las moléculas de NAD+y de NADH (véase Figura 2-24). Las reacciones que se ilustran aquí se desarrollan sobre la superficie de una proteína, y están catalizadas por grupos químicos específicos de la enzima alcohol deshidrogenasa (que no se muestra). (Modificado con permiso de P.F. Cook, N.J. Oppenheimer y W.W. Cleland, B iochem istry 20:1817-1825, 1981. © 1981 American Chemical Society.)
709
La energía liberada por el paso de los electrones a lo largo de la cadena respiratoria se alm acena en form a de gradiente electroquím ico de protones a través de la m em brana m itocondrial interna7 La íntima asociación existente entre los transportadores de electrones y las m o léculas de proteína hace posible la fosforilación oxidativa. Las proteínas guían a los electrones a lo largo de la cadena respiratoria, de tal manera que los electro nes se desplazan secuencialm ente de un complejo enzimàtico al otro -sin que haya cortocircuitos. Es importante que la transferencia de electrones esté aco plada a la captación y liberación de protones y a los cambios alostéricos de de terminadas moléculas de proteína, de tal manera que el flujo energéticamente favorable de electrones bom bea protones (H+) a través de la membrana interna desde el com partim iento de la matriz hasta el espacio intermembrana. Este des plazamiento de protones tiene dos consecuencias principales. (1) Genera un gradiente de pH a través de la m em brana mitocondrial interna, con un valor de pH mayor en la matriz que en el citosol en donde suele ser cercano a 7. (El pH del espacio interm em brana es equivalente al del citosol ya que las moléculas pe queñas se equilibran librem ente a través de la membrana externa de la mitocondria.) (2) Genera un gradiente de voltaje (potencial de membrana) a través de la m em brana mitocondrial interna, negativo en el interior y positivo en el exterior (que es el resultado del flujo neto de salida de iones positivos). El gradiente de pH (ApH) empuja a los H+ de nuevo hacia adentro y a los OH- hacia afuera de la matriz, reforzando así el efecto del potencial de m embra na (AV) que actúa atrayendo hacia la matriz a cualquier ion positivo y em pujan do hacia el exterior a cualquier ion negativo. En conjunto, estas dos fuerzas constituyen un gradiente electroquímico de protones (Figura 14-19). El gradiente electroquímico de protones ejerce una füeiza protón-motriz, la cual puede medirse en unidades de milivoltios (mV). Cada ApH de una unidad de pH tiene un efecto equivalente a un potencial de membrana de aproximadamente 60 mV, por lo que la fuerza protón-motriz total es igual a AV- 60(ApH). En una célu la típica, la fuerza protón-motriz a través de la membrana interna de una mitocondria en respiración es de unos 200 mV y está constituida por un potencial de mem brana de unos 140 mV y de un gradiente de pH de alrededor de -1 unidad de pH.
La energía alm acenada en el gradiente electroquímico de protones se utiliza para producir ATP y para transportar m etabolitos e iones inorgánicos hacia el espacio de la matriz8 La membrana mitocondrial interna contiene una extraordinaria cantidad de protei na: un 70% de su peso seco son proteínas mientras que el otro 30% son fosfolípidos. Muchas de estas proteínas forman parte de la cadena de transporte electrónico, la cual establece el gradiente electroquímico de protones a través de la membrana. Otro
m em brana m itocondrial interna
r
++++++++
¡ *
/ & ’\ fuerza Pr° t0 "- , Potencial de • m otriz debida al mem brana
AV
ESPACIO DE LA MATRIZ
H+ m em brana m itocondrial interna
H + ácido H+ H+ H+ H+ H+ H+ H+
fuerza protóngradiente de . ¡j m otriz debida al conc. de protones ¿ X p n ESPACIO DE LA MATRIZ
710
Capítulo 14 : Conversión energética: mitocondrias y cloroplastos
H+ H+ alcalino
Figura 14-19 Los dos componentes del gradiente electroquímico de protones. La fuerza protón-motriz total a través de la membrana mitocondrial interna está compuesta por una gran fuerza debida al potencial de membrana (designada tradicionalmente como AT por los expertos, pero que en este libro se indica como AV) y por una pequeña fuerza debida al gradiente de concentración de protones (ApH). Ambas fuerzas actúan en el sentido de impulsar protones hacia el espacio de la matriz mitocondrial.
componente mayoritario de la membrana mitocondrial es la enzima ATP sintasa, que cataliza la síntesis de ATP. Se trata de un gran complejo proteico a través del cual los protones fluyen hacia la matriz a favor de su gradiente electroquímico. Como si se tratara de una turbina, este complejo proteico transforma una forma de energía en otra, sintetizando ATP a partir de ADP y P¡ en la matriz mitocondrial, a través de una reacción que está acoplada al flujo de protones hacia la matriz (Figura 14-20). La síntesis de ATP no es, sin embargo, el único proceso que está impulsado por el gradiente electroquímico de protones. Las enzimas de la matriz m itocon drial, donde tienen lugar el ciclo del ácido cítrico y otras reacciones metabólicas, han de abastecerse con elevadas concentraciones de substratos, y la ATP sintasa se ha de abastecer con ADP y fosfato. Así pues, han de ser transportados a través de la mem brana mitocondrial interna un elevado número de substratos carga dos. Este transporte se realiza gracias a la acción de varios transportadores pro teicos de membrana, muchos de los cuales transportan activamente moléculas específicas en contra de sus gradientes electroquímicos, procesos que requieren un aporte de energía. Como se explicó en el Capítulo 11 , a menudo esta energía procede del cotransporte de otra molécula a favor de su gradiente electroquím i co. El transporte de ADP hacia el espacio de la matriz, por ejemplo, está media do por un sistema antiporte de ADP-ATP: por cada molécula de ADP que entra, sale una molécula de ATP a favor de su gradiente electroquímico (la salida de una carga negativa es favorable). El transporte de fosfato hacia la matriz está mediado por una proteína transportadora que acopla el movimiento de fosfato hacia adentro con el flujo de protones hacia adentro, a favor de su gradiente electroquímico, de tal manera que el fosfato es arrastrado con ellos. El piruvato es transportado hacia la matriz de la misma manera (Figura 14-21). El gradiente electroquímico de protones se utiliza también para importar Ca2+, el cual se cree que es importante en la regulación de algunas enzimas mitocondriales; la im portación de Ca2+ hacia la mitocondria puede ser importante para eliminarlo del citosol cuando sus niveles empiezan a ser peligrosos. Se utiliza mayor cantidad de energía del gradiente electroquímico de proto nes, para transportar moléculas e iones hacia la mitocondria, que para impulsar la ATP sintasa. Si por ejemplo se incuban mitocondrias aisladas en presencia de elevadas concentraciones de Ca2+, la producción de ATP cesa completamente; toda la energía de su gradiente electroquímico de protones se utiliza para bom bear Ca2+ hacia la matriz. De forma similar, en unas células especializadas el gra diente electroquímico de protones se cortocircuita, de tal manera que sus m ito condrias producen calor en lugar de ATP com o se explica más adelante. La utilización de energía almacenada en el gradiente electroquímico de protones puede regularse por las células de tal manera que, en un momento dado, se pue de dirigir hacia aquellas actividades que sean más necesarias.
La rápida conversión de ADP en ATP en las mitocondrias m antiene una elevada relación ATP-ADP en las células8 A consecuencia del antiporte de la membrana interna que bombea ADP hacia la matriz mitocondrial intercambiándolo con ATP (véase Figura 14-21), las m olécu las de ADP producidas en el citosol por la hidrólisis del ATP, penetran rápida mente en las mitocondrias para ser recargadas a ATP, mientras que las moléculas de ATP formadas en la matriz mitocondrial mediante la fosforilación oxidativa son rápidamente bombeadas hacia el citosol, que es donde son necesarias. Una molécula típica de ATP del cuerpo humano entra y sale de la mitocondria miles de veces al día (tal como ocurre también con el ADP), manteniendo la concentra ción de ATP en la célula unas 10 veces superior a la de ADP. Como hemos discutido en el Capítulo 2, las enzimas biosintéticas de las célu las guían a sus substratos a lo largo de cadenas de reacciones específicas, impul sando a menudo reacciones energéticamente desfavorables al acoplarlas con la hidrólisis del ATP, que es energéticamente favorable (véase Figura 2-29). De esta forma, los elevados niveles de ATP se utilizan para impulsar procesos celulares, de
La mitocondria
interna
externa
Figura 14-20 Mecanismo general de la fosforilación oxidativa. Cuando un electrón de alta energía es transferido a lo largo de la cadena de transporte electrónico, parte de la energía liberada se utiliza para impulsar la acción de tres complejos enzimáticos respiratorios que bombean protones hacia el exterior del espacio de la matriz. Estos protones generan un gradiente electroquímico de protones a través de la membrana mitocondrial interna que impulsa a los protones a volver hacia la matriz a través de la ATP sintasa, un complejo proteico transmembrana que utiliza la energía del flujo de protones para sintetizar ATP a partir de ADP y P¡ en la matriz.
711
ADP
ATP
\
\ MATRIZ 5E el gradiente de pH im pulsa la entrada de piruvato
h * y/
'
piruv ato
(Fj)
+
el gradiente de pH im pulsa la entrada de fosfato
piruvato
la misma forma como se puede utilizar una batería para accionar máquinas eléc tricas: si la actividad de las mitocondrias se detiene, el nivel de ATP disminuye y la batería celular se descarga, de forma que, finalmente, las reacciones energética mente desfavorables ya no pueden ser impulsadas por la hidrólisis del ATP. Podría parecer que esta situación no se alcanza hasta que la concentración de ATP es cero. Sin embargo, se alcanza a concentraciones de ATP que depen den de la concentración de ADP y de P¡. Para explicar el porqué, hemos de consi derar algunos principios elementales de la termodinámica.
La diferencia entre AG° y AG: para que la hidrólisis de ATP sea útil para la célula es necesario que tenga un valor muy negativo de AG9 La segunda ley de la termodinámica dice que las reacciones químicas discurren espontáneam ente en la dirección que corresponde a un aumento del desorden del universo. En el Capítulo 2 ya indicamos que las reacciones que liberan ener gía al medio en forma de calor (tales como la hidrólisis del ATP) tienden a aumentar el desorden del universo al increm entar los movimientos aleatorios de las moléculas. Por esta razón, las reacciones discurren convirtiendo la energía li bre (energía disponible para realizar un trabajo) en calor. Así, la reacción A ^ B discurrirá en la dirección A -» B cuando el cambio de energía libre asociado, AG, es negativo, del mismo modo que cuando un muelle tensado se deja súbitamen te de estirar libera su energía almacenada en forma de calor. Sin embargo, para una reacción química, AG no sólo depende de la energía almacenada en cada molécula individual, sino también de las concentraciones de las moléculas en la mezcla de reacción. Esto es porque, para una reacción reversible A ^ B, un ex ceso de B sobre A tenderá a impulsar la reacción en dirección B -» A; es decir, habrá más moléculas haciendo la transición B —> A que moléculas haciendo la transición en sentido contrario. No está claro cuál es valor de la diferencia de concentración necesario para compensar una cantidad de calor liberada dada; esto depende de cambios en la entropía que pueden ser calculados como se des cribió en el Panel 14-1, págs. 714-715. Para una reacción dada, el AG se descompone en la suma de dos partes: la primera, denominada variación de energía libre estándar, AG°, depende de las características intrínsecas de las moléculas que reaccionan; la segunda depende de sus concentraciones. Para la reacción simple A B, AG = AG°+ RT\n ^ [A]
712
Capítulo 14: Conversión energética: mitocondrias y cloroplastos
Figura 14-21 Algunos procesos de trasporte activo impulsados por el gradiente electroquímico a través de la m em brana mitocondrial interna.
La carga de cada una de las moléculas transportadas se indica con respecto al potencial de membrana, que es negativo en el interior. La membrana mitocondrial externa es permeable a todos estos compuestos. Para una discusión sobre los mecanismos de transporte de membrana, véase el Capítulo 11.
hidrólisis relación constante de hidrólisis
velocidad de hidrólisis m-
concentración de ATP
síntesis
1a d p |
relación constante de síntesis
velocidad de síntesis
conc. de fosfato
conc. de ADP
abreviando,
[ADP] [ ® ] = K ATP]
En el equilibrio, la reacción no tiene un efecto neto en el desorden del universo, así que AG = 0. Por esta razón, en el equilibrio,
Para la reacción QQ —
EN EL EQUILIBRIO: velocidad de síntesis = velocidad de hidrólisis relación relación conc. de conc. de conc. de constante constante ADP fosfato ATP de síntesis de hidrólisis relación conc. de conc. de constante ADP fosfato de hidrólisis = constante de equilibrio K relación concentración constante de ATP de síntesis
[adp! + ®
[ADP] I ® ] - fíT In ------------ = A G° [ATP]
se utiliza la siguiente ecuación: AG = A G °+ fíT In
Pero las concentraciones de los reactivos en el equilibrio deben satisfacer la reacción de equilibrio:
[ADP] [ ® ] [ATP]
[ADP] [ @ ] [ATP]
Donde AG y AG° están expresados en kilocalorías por m ol, R es la constante de los gases (2 x 10‘ 3 kcal/mol °K), Tes la tem peratura absoluta (°K), y todas las concentraciones están expresadas en m oles por litro. Cuando las concentraciones de todos los com puestos reaccionantes son iguales a 1 M, AG = AG° (ya que fíT In 1 = 0). Por consiguiente, AG° es una constante definida com o la variación de energía libre estándar para la reacción.
Por esta razón, en el equilibrio, AG° = - fí7 ln K Vemos así, que AG° indica el punto de equilibrio para una reacción, y AG indica lo alejada que está una reacción del equilibrio. A G es una medida de la "fuerza im pulsora" de una reacción quím ica, com o la fuerza protón m otriz lo es para la translocación de protones.
donde [A] y [B] representan las concentraciones de A y de B, y ln es el logaritmo neperiano. De esta manera, AG° iguala el valor de AG cuando las concentracio nes molares de A y de B son iguales (ln 1= 0). El equilibrio químico se alcanza cuando el efecto de la concentración está equilibrado por el efecto de AG°, así que no se produce un cambio neto de energía libre para impulsar la reacción en cualquier dirección; entonces AG = 0, y las concentraciones de A y B son tales que
-RT ln
[A]
= AG°
lo que significa que hay un equilibrio químico cuando [B] _ g-AG"//?'/' ÍA]
Figura 14-22 Relación básica entre las variaciones de energía libre y el equilibrio, ilustradas para la reacción de hidrólisis del ATP. Las constantes de velocidad en los recuadros ( 1 ) y (2 ) se determinan en experimentos en los que se mide la acumulación del producto en función del tiempo. La constante de equilibrio que se muestra aquí, K, viene dada en moles por litro. (Para una discusión sobre la energía libre, véase Panel 14-1, págs. 714-715, y para una definición de la constante de equilibrio, véase Figura 3-9.)
Cuando el ATP se hidroliza a ADP y P ¡, a las condiciones que normalmente existen en la célula, la variación de energía libre del proceso está entre -11 y -1 3 kcal/mol. Este AG es extremadamente favorable y requiere que la concentración de ATP en la célula se mantenga alta en relación a la de ADP y a la de P¡. En “con diciones estándar”, en las que tanto el ATP como el ADP y el P¡ se hallan presen tes a la misma concentración de 1 mol por litro, el AG para la hidrólisis del ATP -llam ada variación de energía libre estándar o AG° de la reacción- es únicamente de -7 ,3 kcal/mol. A concentraciones de ATP todavía más bajas en relación con las de ADP y P ¡, el AG llegará a ser igual a cero. En este punto, la velocidad a la que se unirán el ADP i el P¡ formando ATP será igual a la velocidad a la que se hidrolizará el ATP formando ADP y P¡. En otras palabras, cuando AG = 0 la reacción se halla en equilibrio (Figura 14-22). Es AG y no AG° el valor que indica lo lejos que una reacción dada está del equilibrio y lo que determina si una reacción puede ser utilizada o no para im-
La mitocondria
713
LA IMPORTANCIA DE LA ENERGÌA LIBRE PARA LAS CÉLULAS La v id a e s p o s ib le g r a c ia s a u n a c o m p le ja re d d e r e a c c io n e s
La c u e s tió n d e si u n a r e a c c ió n p u e d e o c u r r ir e s p o n t á n e a m e n t e , o
q u ím ic a s in t e r a c tu a n te s q u e t ie n e n lu g a r e n to d a s la s c é lu la s .
p o r el c o n t r a r io , n e c e s ita a c o p la r s e a o tr a re a c c ió n , e s d e u n a
O b s e r v a n d o la s r e a c c io n e s m e ta b ó lic a s q u e c o m p o n e n e s ta re d ,
im p o r t a n c ia c a p ita l p a r a la b io lo g ía c e lu la r . La r e s p u e s ta s e o b t ie n e
u n o p u e d e s u p o n e r q u e la c é lu la d e b e t e n e r la h a b ilid a d d e
e n re la c ió n a u n a c a n tid a d lla m a d a la ene rg ía Ubre: la v a r ia c ió n to ta l
d e s a r r o lla r e n z im a s c a p a c e s d e lle v a r a c a b o c u a lq u ie r r e a c c ió n
d e e n e rg ía lib re q u e se p r o d u c e a tr a v é s d e un c o n ju n to d e re a c c io n e s
q u e la c é lu la n e c e s ite . P e ro e n r e a lid a d e s to n o e s a s í. A p e s a r
d e t e r m in a si e s te g r u p o d e r e a c c io n e s p u e d e o n o t e n e r lu g a r . En
d e q u e las e n z im a s s o n p o d e r o s o s c a ta liz a d o r e s , ú n ic a m e n t e
e s te P a n e l e x p lic a r e m o s a lg u n a s d e la s ¡d e a s f u n d a m e n t a le s
p u e d e n a c e le r a r la s r e a c c io n e s q u e s e a n t e r m o d in à m ic a m e n t e
- d e r iv a d a s d e u n a r a m a e s p e c ia l d e la q u ím ic a y d e la fís ic a , lla m a d a
p o s ib le s . L a s o tr a s r e a c c io n e s ú n ic a m e n te s o n p o s ib le s p o r q u e
te rm o d in á m ic a - q u e s o n n e c e s a r ia s p a r a e n t e n d e r lo q u e e s la
s e a c o p la n a r e a c c io n e s m u y f a v o r a b le s q u e la s im p u ls a n .
e n e r g ía lib r e y p o r q u é e s ta n im p o r t a n t e p a r a la s c é lu la s .
H iiiM ia M a B iK i LA ENERGIA LIBERADA POR CAMBIOS EN LOS ENLACES QUÍMICOS ES TRANSFORMADA EN CALOR s e r ie s d e c o lis io n e s m o le c u la r e s q u e e n p r im e r lu g a r c a le n t a r á n las p a r e d e s d e la c a ja y p o s t e r io r m e n t e el m u n d o e x t e r io r (r e p r e s e n t a d o e n n u e s tr o e je m p lo p o r el m a r ) . A l fin a l, el s is t e m a v u e lv e a su t e m p e r a t u r a in ic ia l, e n el m o m e n t o e n el q u e t o d a la e n e r g ía d e e n la c e q u ím ic o ha s id o t r a n s f o r m a d a e n e n e r g ía c a lo r ífic a y CAJA
t r a n s f e r id a f u e r a d e la c a ja al m e d io e x t e r io r . D e a c u e r d o c o n la p r im e r le y , la v a r ia c ió n d e la e n e r g ía e n la c a ja
CÉLULA^
MAR
(A Fcaja, q u e
in d ic a r e m o s c o m o A E) d e b e s e r ig u a l y d e s ig n o c o n t r a r io a la v a r ia c ió n d e e n e r g ía c a lo r ífic a tr a n s f e r id a , la c u a l p o d e m o s in d ic a r c o m o h\ es d e c ir , A E = ~h. A s í p u e s , c u a n d o el c a lo r a b a n d o n a el s is t e m a , la c a n tid a d d e e n e r g ía d is m in u y e e n la c a ja .
E t a m b ié n p u e d e v a r ia r d u r a n t e u n a r e a c c ió n d e b id o al t r a b a jo r e a liz a d o e n el m u n d o e x t e r io r . S u p o n g a m o s p o r e je m p lo q u e d u r a n t e u n a re a c c ió n d e t e r m in a d a s e p r o d u c e u n p e q u e ñ o
U N IV E R S O
111
in c r e m e n t o d e l v o lu m e n (AV) d e la c a ja . D a d o q u e p a r a p o d e r e x p a n d ir s e , la s p a r e d e s d e la c a ja d e b e n e m p u ja r c o n tr a la p r e s ió n U n s is te m a c e rra d o s e d e f in e c o m o u n c o n ju n t o d e m o lé c u la s q u e
c o n s t a n t e (P ) d e l m e d io e x t e r io r , e s ta e x p a n s ió n s u p o n e la
n o in t e r c a m b ia n m a t e r ia c o n el re s to d e l u n iv e r s o (p o r e je m p lo , la
r e a liz a c ió n d e un t r a b a jo e n el m u n d o e x t e r io r y r e q u ie r e e n e r g ía .
" c é lu la -c a ja " q u e s e m u e s tr a m á s a r r ib a ). C u a lq u ie r s is t e m a c o m o
La e n e r g ía u tiliz a d a e s P ( AV) q u e , d e a c u e r d o c o n la p r im e r a le y ,
é s te p r e s e n ta m o lé c u la s c o n u n a e n e r g ía to t a l E. E s ta e n e r g ía se
d e b e r e d u c ir la e n e r g ía d e la c a ja ( E ) e n u n a c a n t id a d ig u a l a la
d is tr ib u y e e n t r e d if e r e n te s f o r m a s : c o m o e n e r g ía d e t r a n s la c ió n d e
u tiliz a d a p a ra p r o d u c ir e s te t r a b a jo . En m u c h a s r e a c c io n e s , la
la s m o lé c u la s , c o m o su e n e r g ía d e v ib r a c ió n , c o m o su e n e r g ía d e
e n e r g ía q u ím ic a d e e n la c e e s t r a n s f o r m a d a e n t r a b a jo y c a lo r . La
e n la c e e n tr e lo s á t o m o s in d iv id u a le s q u e f o r m a n la s m o lé c u la s .
e n ta lp ia (H )e s u n a f u n c ió n c o m p u e s t a q u e in c lu y e a m b a s f o r m a s d e
S u p o n g a m o s q u e e n el s is t e m a tie n e lu g a r u n a re a c c ió n . La
e n e r g ía (H = E + P V ) . P a ra s e r r ig u r o s o s , e n u n s is t e m a c e r r a d o , es
p r im e r a le y d e la t e r m o d in á m ic a r e s tr in g e el tip o d e r e a c c ió n q u e
la v a r ia c ió n d e la e n t a lp ia {A H ), y n o la v a r ia c ió n d e la e n e r g ía , la
p u e d e t e n e r lu g a r e n el s is te m a : e s ta b le c e q u e " e n c u a lq u ie r
q u e es ig u a l a la c a n tid a d d e c a lo r t r a n s f e r id a al m u n d o e x t e r io r
p r o c e s o , la e n e r g ía to t a l d e l s is te m a se m a n t ie n e c o n s t a n t e " . P o r
d u r a n t e u n a r e a c c ió n . Las r e a c c io n e s e n las q u e /- / d is m in u y e lib e r a n
e je m p lo , s u p o n g a m o s q u e e n el s is te m a c e r r a d o tie n e lu g a r la
c a lo r al m e d io y se d e n o m in a n " e x o t é r m ic a s " m ie n t r a s q u e las
re a c c ió n A —> B, y q u e e s ta r e a c c ió n lib e r a u n a g r a n c a n t id a d d e
r e a c c io n e s e n las c u a le s H in c r e m e n t a a b s o r b e n c a lo r d e l m e d io y
e n e r g ía q u ím ic a d e e n la c e . In ic ia lm e n te , e s ta e n e r g ía in c r e m e n t a r á
se d e n o m in a n " e n d o t é r m ic a s " . A s í, ~h = AH. S in e m b a r g o , d e b id o
la in t e n s id a d d e lo s m o v im ie n t o s m o le c u la r e s (d e t r a n s la c ió n , d e
a q u e la v a r ia c ió n d e v o lu m e n q u e o c u r r e d u r a n t e la m a y o r ía d e la
v ib r a c ió n y d e r o ta c ió n ) e n e l s is t e m a , lo c u a l e q u iv a le a un
r e a c c io n e s b io ló g ic a s , e s d e s p r e c ia b le , p u e d e a p r o x im a r s e :
a u m e n t o d e la t e m p e r a t u r a . S in e m b a r g o , e s te in c r e m e n t o d e los
- h = AH = AE
m o v im ie n t o s p r o n to s e rá t r a n s f e r id o fu e r a d e l s is te m a a tr a v é s d e
LA SEGUNDA LEY DE LA TERMODINÁMICA C o n s id e r e m o s u n r e c ip ie n te e n el q u e h a y 1 0 0 0 m o n e d a s ,
m á s c a m in o s p a r a a lc a n z a r un e s ta d o 5 0 :5 0 q u e p a r a c o n s e g u ir
v ig o r o s a m e n t e , s o m e t ie n d o a las m o n e d a s a m o v im ie n t o s
c u a lq u ie r o tr o e s ta d o . C a d a e s ta d o t ie n e u n a p o s ib ilid a d d e s u c e d e r,
a le a to r io s d e l m is m o t ip o d e lo s q u e e x p e r im e n t a n to d a s las
q u e es p r o p o r c io n a l al n ú m e r o d e v ía s p o r las q u e d ic h o e s t a d o se
m o lé c u la s d e b id o a s u s f r e c u e n t e s c o lis io n e s c o n o tr a s m o lé c u la s ,
p u e d e a lc a n z a r. La s e g u n d a le y d e la t e r m o d in á m ic a e s t a b le c e q u e
p u e d e e s p e r a r s e q u e al fin a l, a p r o x im a d a m e n t e la m it a d d e las
" lo s s is te m a s c a m b ia r á n e s p o n t á n e a m e n t e d e s d e e s ta d o s d e
m o n e d a s s e e n c o n t r a r á n o r ie n t a d a s d e c a ra h a c ia a b a jo . El m o t iv o
p r o b a b ilid a d b a ja d e o c u r r ir , h a c ia e s ta d o s d e p r o b a b ilid a d
d e e s ta r e o r ie n t a c ió n e s q u e ta n s ó lo e x is te u n c a m in o p a ra
e le v a d a " . D a d o q u e lo s e s ta d o s d e b a ja p r o b a b ilid a d s o n m á s
r e in s ta u r a r el e s t a d o in ic ia l (c a d a m o n e d a c o n la c a ra h a c ia a r r ib a ),
" o r d e n a d o s " q u e lo s e s ta d o s d e a lta p r o b a b ilid a d , la s e g u n d a le y
m ie n t r a s q u e e x is te n m u c h o s c a m in o s d ife r e n te s
ta m b ié n se p u e d e e x p r e s a r c o m o : " e l u n iv e r s o c a m b ia
( a p r o x im a d a m e n t e u n o s 1 0 298) p a r a a lc a n z a r u n e s t a d o c o m p u e s t o
... 714
p o r el m is m o n ú m e r o d e c a r a s y d e c ru c e s ; d e h e c h o , h a y m u c h o s
d is p u e s ta s to d a s e lla s d e c a r a h a c ia a r r ib a . S i el r e c ip ie n te s e a g ita
Panel 14- i Energía libre y reacciones biológicas.
c o n s t a n t e m e n te e n el s e n tid o d e c o n v e r tir s e e n m á s d e s o r d e n a d o " .
—
------------------- _
_
_
_
_
_
_
m o n e d a s c u a n d o la c a ja e s a g it a d a v ig o r o s a m e n t e y s e o b t ie n e el
LA ENTROPÍA, S
m is m o n ú m e r o d e c a r a s q u e d e c ru c e s , e s R In ( 1 0 298), e s d e c ir ,
La s e g u n d a le y (a d ife r e n c ia d e la p r im e r a ) p e r m it e p r e d e c ir la
a p r o x im a d a m e n t e ig u a l a 1 3 7 0 u e p o r m o l d e c a ja s d e e s te t ip o
d ire c c ió n d e u n a r e a c c ió n d e t e r m in a d a . S in e m b a r g o , p a r a p o d e r
(6 x 1 0 23 c a ja s ). A s í p u e s , d e b id o a q u e a n t e r i o r m e n t e s e ha
u tiliz a r la e n e s te s e n tid o , e s n e c e s a r io d is p o n e r d e u n a m e d id a d e la
d e f in id o A S c o m o p o s itiv a p a r a la tr a n s ic ió n d e l e s t a d o A al e s ta d o
p r o b a b ilid a d d e u n e s ta d o , e s d e c ir , d e su g r a d o d e d e s o r d e n . E s ta
B ( p B / p A > 1), las r e a c c io n e s c o n u n g r a n in c re m e n to d e S (e s to es,
m e d id a e s la e n t r o p ía (S ). La e n tr o p ía e s u n a fu n c ió n lo g a r ít m ic a d e
las r e a c c io n e s q u e t e n g a n u n a A S > 0 ) s e h a lla n f a v o r e c id a s , es
la p r o b a b ilid a d ta l q u e la v a ria c ió n de e n tro p ía ( A S ) q u e s e p r o d u c e
d e c ir , s e p r o d u c ir á n e s p o n t á n e a m e n t e .
c u a n d o la r e a c c ió n A —» B c o n v ie r te u n m o l d e A e n u n m o l d e B, es:
C o m o se d is c u te e n el C a p ít u lo 2 , la e n e r g ía c a lo r íf ic a p r o v o c a u n a c o n m o c ió n a le a t o r ia d e la s m o lé c u la s . D a d o q u e la
A S = R In p B / p A d o n d e p A y p B s o n las p o s ib ilid a d e s d e lo s d o s e s ta d o s A y B, R es la c o n s ta n te d e los g a s e s (2 cal g r a d o 1 m o l 1), y A S se m id e en u n id a d e s d e e n tr o p ía (u e ). En n u e s tro e je m p lo in ic ia l d e las m il m o n e d a s , la p r o b a b ilid a d re la tiv a d e q u e se p re s e n te n to d a s las c a ra s (e s ta d o A ) re s p e c to a la s itu a c ió n d e m ita d d e c a ra s y m ita d d e c ru c e s (e s ta d o B) es ig u a l al n ú m e r o d e c a m in o s d ife r e n te s a tra v é s d e lo s q u e se p u e d e n a lc a n z a r c a d a u n o d e e s to s d o s e s ta d o s . S e p u e d e c a lc u la r q u e p A = 1 y p B = 1 0 0 0 1 (5 0 0 ! x 5 0 0 !) = 1 0 298. A s í p u es ,
t r a n s f e r e n c ia d e c a lo r d e s d e u n s is t e m a c e r r a d o al m e d io in c r e m e n t a el n ú m e r o d e d is p o s ic io n e s d if e r e n t e s q u e p u e d e n a d o p t a r la s m o lé c u la s d e l m e d io e x t e r io r , in c r e m e n t a la e n t r o p ía d e l m e d io . S e p u e d e d e m o s t r a r q u e la lib e r a c ió n d e u n a d e t e r m in a d a c a n t id a d d e e n e r g ía c a lo r íf ic a t ie n e u n e fe c to d e d e s o r d e n m a y o r a t e m p e r a t u r a s b a ja s q u e a a lta s , y q u e , c o m o se d e f in ió a n t e r io r m e n t e , el v a lo r p a r a la A S d e l m e d io (A S mar), es ig u a l a la c a n t id a d d e c a lo r t r a n s f e r id a d e s d e el s is t e m a ( h ) al m e d io d iv id id a p o r la t e m p e r a t u r a ( T ):
A S mar = h / T
la v a r ia c ió n d e e n t r o p ía p r o d u c id a p o r la r e o r ie n t a c ió n d e las
LA ENERGÍA LIBRE DE GIBBS, G A l t r a b a ja r c o n u n s is te m a b io ló g ic o c e r r a d o , n o s p u e d e in te r e s a r
A t e m p e r a t u r a c o n s t a n t e , la v a r ia c ió n d e e n e r g ía lib r e (A G)
d is p o n e r d e un s is te m a s e n c illo d e p r e d e c ir si u n a re a c c ió n v a a
d u r a n t e la r e a c c ió n e s ig u a l a A H - TAS. C o m o A H = - h , el c a lo r
t e n e r lu g a r o n o e n el s is te m a . H e m o s v is to q u e la c u e s tió n c ru c ia l
a b s o r b id o d e l m a r , t e n e m o s
es si, al p r o d u c ir s e la re a c c ió n , la v a r ia c ió n d e e n tr o p ía d e l u n iv e r s o e s p o s itiv a o n e g a tiv a . En n u e s tr o s is te m a id e a liz a d o d e la c é lu la c a ja , la v a r ia c ió n d e e n tr o p ía e n el u n iv e r s o t ie n e d o s c o m p o n e n te s
-A G = -A H + TAS
-A G - h + TAS y -A G /T = h /T + AS
— la v a r ia c ió n d e e n tr o p ía p a ra el s is te m a c e r r a d o d e la c a ja y la v a r ia c ió n d e e n tr o p ía e n el m a r c ir c u n d a n te — y a m b o s c o m p o n e n t e s d e b e n s e r c o n s id e r a d o s c o n ju n t a m e n te p a ra
P e ro c o m o h /T e s ig u a l a la v a r ia c ió n d e e n t r o p ía d e l m a r (A S mar), y A S e n la r e a c c ió n a n t e r io r e s A S caja, te n e m o s
c u a lq u ie r tip o d e p r e d ic c ió n q u e se h a g a . P o r e je m p lo , es p o s ib le q u e u n a re a c c ió n a b s o r b a c a lo r , h a g a d is m in u ir la e n tr o p ía d e l m a r
(A S mar < 0 ) y c a u s e u n g r a n in c r e m e n to d e l d e s o r d e n e n el in te r io r
-A G/T-- A S mar + A S caja —A S un¡verso
d e la c a ja (A Scaja > 0 ), d e m a n e r a q u e la v a r ia c ió n to ta l A S un¡verso =
A S mar + A S caja se a m a y o r q u e 0. En e s te c a s o la re a c c ió n s u c e d e rá
P o d e m o s c o n c lu ir q u e u n a r e a c c ió n s e p r o d u c ir á e n la d ir e c c ió n e n
e s p o n t á n e a m e n te s ie m p r e q u e d u r a n te la re a c c ió n el m a r c e d a
la q u e s u p o n g a q u e la v a r ia c ió n d e e n e r g ía lib r e (A G) s e a m e n o r
c a lo r a la c a ja . U n e je m p lo d e re a c c ió n d e e s te tip o es la d is o lu c ió n
q u e c e r o , p o r q u e e n e s te c a s o , c u a n d o t e n g a lu g a r la r e a c c ió n se
d e c lo r u r o s ó d ic o e n u n v a s o d e p r e c ip ita d o s c o n te n ie n d o a g u a (la
p r o d u c ir á u n a v a r ia c ió n p o s itiv a d e la e n t r o p ía d e l u n iv e r s o . A s í, la
" c a ja " ). E sta re a c c ió n t ie n e lu g a r e s p o n tá n e a m e n te a p e s a r d e q u e
v a r ia c ió n d e la energía libre e s u n a m edida directa de la variación
la t e m p e r a t u r a d e l a g u a s u b e c u a n d o la sal se d is u e lv e .
de la entropía del universo.
Lo s q u ím ic o s h a n e n c o n tr a d o ú til d e fin ir n u e v a s " fu n c io n e s
P a ra u n a s e r ie c o m p le ja d e r e a c c io n e s a c o p la d a s e n la s q u e
c o m p u e s ta s " q u e d e s c rib e n co m b in a cio n e s d e p r o p ie d a d e s fís ic a s
p a r tic ip e n m u c h a s m o lé c u la s d if e r e n t e s , la v a r ia c ió n to t a l d e
d e l s is te m a . Las p r o p ie d a d e s q u e se p u e d e n c o m b in a r s o n : la
e n e r g ía lib r e se p u e d e m e d ir s im p le m e n t e s u m a n d o la e n e r g ía
t e m p e r a t u r a ( T ) , la p re s ió n (P), el v o lu m e n (V), la e n e r g ía ( E ), y la
lib r e d e t o d a s las e s p e c ie s m o le c u la r e s d e s p u é s d e la r e a c c ió n y
e n tr o p ía ( S ) . La e n ta lp ia (H ) e s u n a d e e s ta s fu n c io n e s c o m p u e s ta s .
c o m p a r a n d o e s te v a lo r c o n la s u m a d e la e n e r g ía lib r e a n te s d e la
P e ro la fu n c ió n c o m p u e s ta m á s ú til p a ra lo s b ió lo g o s e s , c o n
re a c c ió n ; lo s v a lo r e s d e e n e r g ía lib r e d e lo s c o m p u e s t o s m á s
d ife r e n c ia , la energía lib re de G ibbs, G. E sta fu n c ió n e s ú til c o m o
c o m u n e s s e p u e d e n e n c o n t r a r e n ta b la s p u b lic a d a s . D e e s ta
e s tr a te g ia d e c o n ta je q u e p e r m ite d e d u c ir los c a m b io s d e e n tr o p ía
m a n e r a s e p u e d e p r e d e c ir la d ir e c c ió n d e u n a re a c c ió n
d e l u n iv e r s o r e s u lta n te s d e re a c c io n e s q u ím ic a s e n la c a ja , e v ita n d o
d e t e r m in a d a y , e n c o n s e c u e n c ia , r e f u t a r f á c ilm e n t e c u a lq u ie r
c u a lq u ie r c o n s id e r a c ió n s o b re lo s c a m b io s d e e n tr o p ía e n el m a r.
m e c a n is m o p r o p u e s to . A s í, p o r e je m p lo , d e lo s v a lo r e s
P a ra u n a c a ja d e v o lu m e n V a p r e s ió n P, la d e fin ic ió n d e G es
o b s e r v a d o s p a r a la m a g n it u d d e l g r a d ie n t e e le c t r o q u ím ic o d e p r o t o n e s a tr a v é s d e la m e m b r a n a m it o c o n d r ia l in t e r n a , s e p u e d e
G = H -T S
a s e g u r a r q u e la e n z im a A T P s in te ta s a r e q u ie r e el p a s o d e m á s d e u n p r o tó n p o r c a d a m o lé c u la d e A T P q u e s in te tiz a . El v a lo r d e A G d e u n a re a c c ió n es u n a m e d id a d ire c ta d e l g r a d o
d o n d e H e s la e n ta lp ia d e s c rita a n te s (E + P V ), T e s la t e m p e r a t u r a
d e d e s p la z a m ie n t o d e l e q u ilib r io d e d ic h a r e a c c ió n . El e le v a d o v a lo r
a b s o lu ta y S e s la e n tr o p ía . C a d a u n o d e e s to s p a r á m e t r o s e s tá
n e g a tiv o q u e p r e s e n ta la c é lu la p a ra la h id r ó lis is d e A T P
r e f e r id o ú n ic a m e n t e al in t e r io r d e la c a ja . D u r a n te u n a re a c c ió n
s im p le m e n t e re fle ja el h e c h o d e q u e las c é lu la s m a n t ie n e n la
q u e se p r o d u z c a e n la c a ja , la v a r ia c ió n d e la e n e r g ía lib r e (la G d e
r e a c c ió n d e h id ró lis is d e l A T P u n a s 10 v e c e s a le ja d a d e l v a lo r d e
lo s p r o d u c to s m e n o s la G d e lo s s u b s tr a to s in ic ia le s ) se s e ñ a la
e q u ilib r io . S i u n a re a c c ió n a lc a n z a el e q u ilib r io , A G = 0 , la re a c c ió n
c o m o A G, y c o m o a h o r a d e m o s t r a r e m o s , e s u n a m e d id a d ire c ta d e
tie n e lu g a r a la m is m a v e lo c id a d e n un s e n tid o q u e e n el o tro . P a ra
la c a n tid a d d e d e s o r d e n g e n e r a d o e n el u n iv e r s o c u a n d o tie n e
la h id r ó lis is d e l A T P , el e q u ilib r io s e a lc a n z a c u a n d o la g r a n m a y o r ía
lu g a r la r e a c c ió n .
d e l A T P ha s id o h id r o liz a d o , ta l c o m o o c u r r e e n u n a c é lu la m u e r ta .
715
pulsar otras reacciones. Debido a que la eficiente conversión de ADP en ATP en la m itocondria mantiene una concentración de ATP elevada en relación a la de ADP y de P ¡, la reacción de hidrólisis del ATP se mantiene muy lejos del equili brio, por lo que AG tiene un valor muy negativo. Si no existiera este desequili brio, la hidrólisis del ATP no se podría utilizar para impulsar las reacciones de la célula, de forma que muchas reacciones biosintéticas se producirían “hacia atrás” en lugar de “hacia adelante”.
La respiración celular es notablem ente eficiente10 Por medio de la fosforilación oxidativa, cada par de electrones del NADH propor cionan energía para la formación de aproximadamente 2,5 moléculas de ATP. El par de electrones del FADH2, que tiene una energía algo más baja, únicamente ge nera aproximadamente 1,5 moléculas de ATP. En total, a partir de cada molécula de acetil CoA que entra en el ciclo del ácido cítrico se forman aproximadamente 10 moléculas de ATP, lo que significa que a partir de una molécula de glucosa se producen unas 20 moléculas de ATP y 84 a partir de una molécula de palmitato, un ácido graso de 16 átomos de carbono. Si también se incluyen las reacciones energéticas que se producen antes de que se forme el acetil CoA, la oxidación completa de una molécula de glucosa produce un rendimiento neto aproximado de 30 moléculas de ATP, mientras que a partir de la oxidación completa de una mo lécula de palmitato se producen aproximadamente 110 moléculas de ATP netas. Estas cifras son valores máximos aproximados, ya que la cantidad de ATP produ cido en la mitocondria depende del porcentaje de energía del gradiente electro químico que se utilice para otros fines diferentes a la síntesis de ATP. Cuando se comparan las variaciones de energía libre de la combustión di recta de grasas y de hidratos de carbono hasta C 0 2y H20 con la cantidad total de energía almacenada en enlaces fosfato del ATP durante las correspondientes oxidaciones biológicas, se observa que a menudo la eficiencia con que se trans forma la energía de oxidación en energía de enlace de fosfato del ATP es superior al 40%. Este valor es considerablemente superior al de la eficiencia de la mayoría de los aparatos de conversión energética no biológica. Si las células trabajaran con un rendimiento igual al que tienen un motor eléctrico o un motor de gasoli na (entre 10% y 20%), un organismo debería comer de una forma voraz para mantenerse vivo. Además, puesto que la energía no utilizada se libera en forma de calor, los organismos de gran volumen tendrían que desarrollar mecanismos más eficientes para poder ceder este calor al medio. Los estudiantes a veces se preguntan por qué las interconversiones celulares siguen estas vías tan complejas. De hecho, la oxidación de los azúcares hasta C 0 2 y H20 podría realizarse más directamente, eliminando el ciclo del ácido cí trico y muchos de las pasos de la cadena respiratoria. De esta forma, la respira ción hubiera resultado más fácil de estudiar pero el resultado habría sido desas troso para la célula. La oxidación produce inmensas cantidades de energía libre que sólo a pequeñas dosis puede ser utilizada de forma eficiente. Las vías oxidativas complejas implican muchos intermediarios, cada uno de los cuales se dife rencia de su predecesor en algunos detalles. Como resultado de ello, la energía liberada se fracciona en pequeños paquetes que pueden ser convertidos de for ma eficiente en enlaces de alta energía de moléculas útiles, como el ATP y el NADH mediante reacciones acopladas (véase Figura 2-17).
Resumen La mitocondria realiza la mayoría de las oxidaciones que se producen en la célula y genera la mayor parte del ATP que se genera en las células animales. La matriz mi tocondrial contiene una gran variedad de enzimas, entre las que se hallan las que oxidan el piruvato y los ácidos grasos hasta acetil CoA, y las enzimas del ciclo del ácido cítrico, que oxidan este acetil CoA hasta CO.¿. En estas reacciones se producen grandes cantidades de NADH (y de FADH.J. La energía disponible resultante de la
716
Capítulo 14: Conversión energética: mitocondrias y cloroplastos
combinación del oxígeno con los electrones reactivos transportados por el NADHy el FADH# se utiliza mediante una cadena de transporte electrónico que se halla in cluida en la membrana interna de la mitocondria y que recibe el nombre de cadena respiratoria. La cadena respiratoria bombea protones hacia el exterior de la matriz mitocondrial, generando así un gradiente electroquímico de protones al que contri buyen tanto el potencial de membrana como la diferencia de pH. Este gradiente transmembrana se utiliza, a su vez, para sintetizar ATP y para impulsar el trans porte activo de determinados metabolitos a través de la membrana mitocondrial interna. La combinación de estas reacciones es la responsable de un eficiente inter cambio de ATP-ADP entre la mitocondria y el citosol que mantiene el acervo celular de ATP altamente cargado, deform a que el ATP puede ser utilizado para impulsar muchas de las reacciones celulares que requieren energía.
m em brana interna
MITOCONDRIA DISGREGADA POR ULTRASONIDOS pO
A partir de las mitocondrias se pueden aislar partículas invertidas funcionales12 La cadena respiratoria es relativamente inaccesible a la manipulación experi mental en las mitocondrias intactas. Fragmentando las mitocondrias mediante ultrasonidos, es posible aislar partículas submitocondriales que están formadas por crestas rotas que se han fusionado de nuevo, constituyendo pequeñas vesí culas cerradas de unos 100 nm de diámetro (Figura 14-23). Cuando estas partí culas submitocondriales se examinan al microscopio electrónico, se aprecia que su superficie está recubierta de pequeñas esferas que se hallan unidas a la m em brana mediante unos finos pedúnculos (Figura 14-24). En las mitocondrias in tactas se observa que estas estructuras semejantes a un “chupa-chups” se hallan localizadas en la superficie interna (de la matriz) de la membrana interna. Así pues, las partículas submitocondriales son vesículas de membrana interna re vertidas, de forma que la superficie que inicialmente estaba dirigida hacia la m a triz ahora está expuesta al medio circundante. Por consiguiente, fácilmente se les puede suministrar metabolitos para los que la membrana es impermeable, que normalmente se encuentran en el compartimiento de la matriz. Cuando se les añade NADH, ADP y fosfato inorgánico, estas partículas transportan electro nes desde el NADH hasta el 0 2 y acoplan esta oxidación a la síntesis de ATP, ca talizando la reacción ADP + P¡ —>ATP. Este sistema libre de células proporciona un sistema de ensayo que hace posible la purificación, en su forma funcional, de muchas proteínas responsables de la fosforilación oxidativa.
.
0
^
°ú w
#/ £ vtj. <¡~
La cadena respiratoria y la ATP sintasa i i Después de estas consideraciones generales sobre la función de las m itocon drias, pasemos a estudiar con mayor detalle la cadena respiratoria -la cadena de transporte de electrones que es tan crucial para todo el metabolismo oxidativo. La mayoría de los elementos de la cadena son com ponentes intrínsecos de la membrana mitocondrial interna, y suministran algunos de los ejemplos más cla ros de las complejas interacciones que puedan tener lugar entre proteínas indi viduales en una membrana biológica.
m em brana externa
u t
-
^
A««, V avsy
5 ^ ****** í 3* t i o
°o
o
VESÍCULAS CON LA CARA INTERNA EN CONTACTO CON EL EXTERIOR OBTENIDAS A PARTIR DE FRAGMENTOS DE MEMBRANA INTERNA REFUSIONADOS
i
%v -
%JV* $
i'
%
partículas subm itocondriales purificadas Figura 14-23 Preparación de partículas submitocondriales a partir de m itocondrias purificadas. Las partículas son trozos de crestas disgregadas que forman vesículas cerradas.
La ATP sintasa puede ser purificada y de nuevo incorporada a las m em branas13 Los primeros experimentos que demostraron que las diferentes proteínas de la m em brana que catalizan la fosforilación oxidativa pueden ser separadas unas de otras sin perder actividad, fueron realizados en 1960. Las minúsculas esferas proteicas que recubren la superficie de las partículas submitocondriales fueron separadas de las partículas, dejando el palo del chupa-chups y las otras proteí nas intrínsecas de membrana en la membrana de la partícula. Las partículas desnudas de esferas podían todavía oxidar NADH en presencia de oxígeno, pero
La cadena respiratoria y la ATP sintasa
100 nm Figura 14-24 Electronm icrografía de partículas submitocondriales. Esta preparación se ha contrastado en negativo. (Cortesía de Efraim Racker.)
717
ya no podían sintetizar ATP. Por otro lado, las esferas purificadas podían actuar com o ATPasas, hidrolizando ATP a ADP y P¡. Cuando las esferas purificadas (de nom inadas ATPasasFj) se añadieron de nuevo a las partículas submitocondriales desnudas, las partículas reconstituidas volvieron a sintetizar ATP a partir de ADP y P¡. Estudios posteriores demostraron que la ATPasaFj forma parte de un com plejo transm em brana mayor (de unos 500 000 daltons) que contiene, por lo m e nos, nueve cadenas polipeptídicas diferentes (Figura 14-25) y que actualmente se denomina ATP sintasa (o tam bién ATPasaFj¡). La ATP sintasa supone apro ximadamente un 15% de la proteína total de la membrana interna; en m em bra nas de cloroplastos y de bacterias se hallan presentes complejos enzimáticos muy similares a éste. . La porción transm em brana del complejo proteico actúa como un transpor tador de H+ y la porción ATPasaF, (la cabeza del chupa-chups) sintetiza ATP cuando los protones pasan a través suyo a favor de gradiente electroquímico. Cuando la ATPasaF, se separa del transportador de H+, sólo actúa en sentido in verso, catalizando la hidrólisis de ATP. Una de las demostraciones más convincentes de la función de la ATP sinta sa se obtuvo en un experimento realizado en 1974. En aquel momento ya se ha bían desarrollado algunos métodos que permitían transferir proteínas integra les de m em brana solubilizadas con detergente a vesículas lipídicas (liposomas) formadas a partir de fosfolípidos purificados. Así, fue posible formar una m em brana híbrida que contenía ATP sintasa mitocondrial purificada y bacteriorrodopsina -u n a bom ba de protones activada por la luz, estudiada en el Capítulo 10- pero ninguna de las proteínas de la cadena respiratoria mitocondrial. Cuan do estas vesículas eran expuestas a la luz, los protones bom beados hacia el inte rior del lumen de la vesícula por la bacteriorrodopsina, fluían de nuevo hacia el exterior a través de la ATP sintasa, produciendo ATP en el medio externo (Figu ra 14-26). Puesto que la interacción directa entre una bom ba bacteriana de protones y una ATP sintasa de mamífero parecía altamente improbable, este experimento sugirió claram ente que en las mitocondrias la traslocación de protones impulsa da por el transporte de electrones por un lado y la síntesis de ATP por otro, son dos acontecim ientos diferentes.
bacteriorrodopsina purificada
ATP sintasa purificada
detergente +
ADICIÓN DE FOSFOLÍPIDOS Y ELIMINACIÓN DEL DETERGENTE
vesícula cerrada (liposoma) [ADP] + < £
718
Capítulo 14 : Conversión energética: mitocondrias y cloroplastos
transportador de H+ transm em brana Figura 14-25 La ATP sintasa. Como ya se ha indicado, la porción ATPasaF 1 se forma de subunidades múltiples (letras griegas), como ocurre con el transportador de H+transm embrana.
Figura 14-26 Esquema de un experimento que dem uestra de qué forma un flujo simple de protones puede im pulsar la acción de la ATP sintasa. Combinando una bom ba bacteriana de protones activada por la luz (la bacteriorrodopsina), una ATP sintasa purificada a partir de mitocondrias de corazón de buey y fosfolípidos, se produjeron vesículas que sintetizaban ATP en respuesta a un estímulo luminoso.
HIDROLISIS DE ATP
ESPACIO DE LA MATRIZ
9 nm
u y f¡¡2
La ATP sintasa puede funcionar de m anera reversible, hidrolizando ATP y bombeando H+13 La ATP sintasa puede utilizar un flujo de protones a favor de gradiente electro químico para sintetizar ATP, pero también puede utilizar la energía de hidrólisis del ATP para bom bear H+ a través de la membrana mitocondrial interna (Figura 14-27). Así pues, actúa como un elemento de acoplamiento reversible, interconvirtiendo un gradiente electroquímico de protones en energías químicas de en lace y viceversa. La dirección en que actúa depende del balance entre el valor del gradiente electroquímico de protones y el AG local para la hidrólisis de ATP. El com plejo enzimàtico se denomina ATP sintasa porque normalmente sintetiza ATP gracias al impulso del gran gradiente electroquím ico de protones que se mantiene por la cadena respiratoria (Figura 14-20). El número exacto de protones necesarios para sintetizar una molécula de ATP no se conoce con exactitud. De todas formas, para facilitar los cálculos que describiremos más adelante, asumiremos que la ATP sintasa sintetiza una molécula de ATP por cada 3 protones impulsados a través de ella. En un momento dado, el que la ATP sintasa sintetize o hidrolize ATP depen de del balance exacto entre la variación de energía libre favorable para que los tres protones atraviesen la membrana, hacia la matriz (AG3H+, que es negativa) y la variación de energía libre desfavorable para la síntesis de ATP en la matriz (AGsíntesisdeATP> que es positiva). Como ya discutimos, el valor de AGs(ntesisdeATP de pende de las concentraciones exactas de los tres compuestos que reaccionan ATP, ADP y P¡ en la matriz mitocondrial (véase Figura 14-22). Por otra parte, el valor de AG3H+ es proporcional al valor de la fuerza protón-motriz a través de la membrana mitocondrial interna. El siguiente ejemplo ayudará a explicar de qué forma afecta a la ATP sintasa el equilibrio entre estas dos variaciones de energía libre. Como se explica en el pie de la Figura 14-27, un único protón que penetra en la matriz a favor de un gradiente de 200 mV, libera una energía libre de 4,6 kcal/mol; la energía libre liberada para el movimiento de tres protones es el tri ple (AG3H+ = -13,8 kcal/mol). Así, si la fuerza protón-motriz se mantiene constan te a 200 mV, la ATP sintasa sintetizará ATP hasta que se alcance una relación de ATP respecto con ADP i P¡ tal que AGsíntesjs deATP sea igual a +13,8 kcal/mol (aquí AGSfntesis deatp + AG3H+=0). En este punto, no existirá ni síntesis ni hidrólisis neta de ATP mediada por la ATP sintasa. Supongamos que, de pronto, se hidroliza una gran cantidad de ATP debido a reacciones que requieren energía en el citosol -cayendo la relación ATP/ADP de la matriz. En esta situación el valor de AGs(ntesis deATP disminuirá (véase Figura 14-22), y la ATP sintasa comenzará a sintetizar de nuevo ATP, para restablecer la relación ATP/ADP original. Alternativamente, si de pronto la fuerza protón-mo-
La cadena respiratoria y la ATP sintasa
Figura 14-27 La ATP sintasa es un mecanismo acoplador reversible que interconvierte las energías del gradiente electroquímico de protones y los enlaces químicos. La ATP sintasa puede sintetizar ATP mediante la utilización de la fuerza protón-motriz {izquierda) y también puede bombear protones en contra de su gradiènte electroquímico mediante la hidrólisis de ATP {derecha). Como se ha explicado en el texto, en un cada momento la dirección de su actuación depende de la variación de energía libre neta para los procesos acoplados de translocación de H+a través de la membrana y la síntesis de ATP a partir de ADP y P¡. Previamente, mostramos cómo la variación de la energía libre (AG) para la hidrólisis de ATP depende de las concentraciones de los tres reactivos ATP, ADP y P¡ (Figura 14-22); el AG para la translocación de los protones a través de la membrana es proporcional a la fuerza protón-motriz. El factor de conversión entre ellos es el faraday. Así, AGh+= -0,023 (fuerza protónmotriz), donde AGh+ se expresa en kilocalorías por mol (kcal/mol) y la fuerza protón-motriz en milivoltios (mV). Para un gradiente electroquímico de H+de 200 mV tendremos un AGH+= -4,6 kcal/mol.
719
triz disminuye y entonces se mantiene constante pero a un valor de 160 mV, en tonces AG3H+ variará a -11,0 kcal/mol. Como resultado de ello, la ATP sintasa co menzará a hidrolizar una parte del ATP de la matriz hasta que se alcance un nuevo equilibrio de ATP a ADP y P¡ (donde AGsíntesisdeATP= +11 kcal/mol), etc. Como veremos más adelante, en muchas bacterias la ATP sintasa revierte el sentido de su acción durante la transición entre el metabolismo aeróbico y anaeróbico. La reversibilidad de la ATP sintasa es una propiedad compartida por otras proteínas de membrana que acoplan el bombeo de iones con la síntesis o hidróli sis de ATP. Por ejemplo, tanto la bomba de Na+-K+como la de Ca2+, descritas en el Capítulo 11, hidrolizan ATP y utilizan la energía liberada para bombear los iones a través de la membrana. Si cualquiera de estas bombas estuviera expuesta a un valor anormalmente elevado del gradiente de los iones que transporta, actuaría en sentido contrario -sintetizando ATP a partir de ADP y P¡ en lugar de hidrolizarlo. De esta manera, como ocurre con la ATP sintasa, estas bombas son capaces de convertir directamente la energía electroquímica almacenada en un gradiente iónico transmembrana en energía de enlace fosfato del ATP.
La cadena respiratoria bom bea H+a través de la m em brana m itocondrial interna14 La cadena respiratoria incluida en la mem brana mitocondrial interna normal mente genera el gradiente electroquímico de protones que impulsa la síntesis de ATP. La capacidad de la cadena respiratoria para traslocar H+ hacia afuera de la matriz se puede poner de manifiesto experimentalmente bajo ciertas condicio nes. Por ejemplo, se puede tratar una suspensión de mitocondrias aisladas con un substrato adecuado para la oxidación y se puede bloquear el flujo de proto nes a través de la ATP sintasa. En ausencia de aire, la administración de una pe queña cantidad de oxígeno a esta preparación causa una breve incremento de la respiración, de 1 o 2 segundos antes de que todo el oxígeno haya sido consumi do. Durante este brusco increm ento de la respiración se puede medir con un sensible electrodo de pH la súbita acidificación del medio que resulta de la sali da de H+desde el espacio de la matriz. En un experimento similar llevado a cabo con una suspensión de partículas submitocondriales, el medio se alcaliniza cuando se agrega el oxígeno, ya que los H+ son bombeados hacia dentro de cada vesícula debido a su orientación in vertida.
Se han utilizado métodos espectroscópicos para identificar muchos transportadores de electrones de la cadena respiratoria15 Muchos de los transportadores de electrones de la cadena respiratoria absorben la luz visible y cam bian de color cuando son oxidados o reducidos. En general, cada uno de ellos tiene su propio espectro de absorción y su reactividad, sufi cientem ente característicos como para poder seguir espectroscópicam ente su comportamiento incluso en mezclas crudas. Gracias a esta característica, fue posible purificar estos com ponentes mucho antes de que se conocieran sus fun ciones exactas. Así, los citocromos fueron descubiertos en 1925 como com pues tos que sufren una rápida oxidación y reducción, en organismos vivos tan dispa res como las bacterias, levaduras e insectos. Mediante la observación de células y tejidos con un espectroscopio, se identificaron tres tipos de citocromos en base a su espectro de absorción característico y fueron denominados citocromos a, b y c. Esta nom enclatura se mantiene en la actualidad a pesar de que se sabe que las células contienen varios citocromos de cada tipo, y que la clasificación en tipos no es funcionalmente importante. Los citocrom os constituyen una familia de proteínas coloreadas que tienen en común la presencia de un grupo hemo, cuyo átomo de hierro pasa del estado férrico (Fe III) al estado ferroso (Fe II) cada vez que acepta un electrón. El grupo hemo consiste en un anillo de porflrina con un átomo de hierro fuertemente en-
720
Capítulo 14: Conversión energética: mitocondrias y cloroplastos
lazado y sostenido por cuatro átomos de nitrógeno de las esquinas de un cua drado (Figura 14-28). Un anillo de porfírina relacionado con éste, unido a hierro en la hemoglobina y a magnesio en la clorofila, es el responsable del color rojo de la sangre y del color verde de las hojas. El citocromo que se conoce mejor de la cadena respiratoria es el citocromo c, cuya estructura tridimensional ha sido determinada por cristalografía de rayos X (Figura 14-29). Las proteínas de hierro-azufre constituyen otra familia de transportadores de electrones. Estas proteínas presentan entre dos y cuatro átomos de hierro unidos a un número igual de átomos de azufre y a cadenas laterales de cisterna, formando un centro de hierro-azufre en la proteína (Figura 14-30). En la cadena respiratoria existen más centros de hierro-azufre que citocromos, pero su detec ción espectroscópica requiere la utilización de espectroscopia de resonancia de espín electrónico (ESR, de Electron Spin Resonance), por lo que están menos ca racterizados que los citocromos. El más sencillo de los transportadores de electrones es una pequeña m olé cula hidrofóbica disuelta en la bicapa lipídica conocida como ubiquinona o co enzima Q. Una quinona (Q) puede aceptar o ceder uno o dos electrones, y por cada electrón que transporta acepta temporalmente un protón del medio (Figu ra 14-31). Además de los seis grupos hemo diferentes unidos a citocromos, de más de seis centros de hierro-azufre y de la ubiquinona, también actúan como transpor tadores de electrones desde el NADH hasta el oxígeno, dos átomos de cobre y una flavina que se hallan fuertemente unidos a proteínas de la cadena respiratoria. La vía implica aproximadamente 40 proteínas diferentes en total. El orden de los transportadores de electrones ha sido determinado mediante sofisticados méto dos espectroscópicos (Figura 14-32), y muchas de las proteínas fueron inicialmen te aisladas y purificadas como polipéptidos individuales. No obstante, para com prender el funcionamiento real de la cadena respiratoria hay que tener en cuenta que las proteínas están organizadas en tres grandes complejos enzimáticos.
COOH
COOH
CH2
c h
c h
3
2
HC — S c h
3
proteína Figura 14-28 Estructura del grupo hemo unido covalentem ente al citocrom o c. El anillo de porfírina se muestra en azu l. En la cadena respiratoria hay 5 citocrom os diferentes. Dado que en citocrom os diferentes los grupos hemo presentan algunas diferencias estructurales y están unidos a sus respectivas proteínas de m anera diferente, cada uno de los citocrom os tiene diferente afinidad por los electrones.
La cadena respiratoria contiene tres grandes complejos enzim áticos incluidos en la m em brana interna16 Las proteínas de membrana son difíciles de purificar en forma de complejos in tactos, porque son insolubles en la mayoría de soluciones acuosas, y algunos de Figura 14-29 Estructura tridimensional del citocrom o c, un transportador de electrones de la cadena de transporte electrónico. Esta pequeña proteína contiene algo más de 100 aminoácidos y se une a la membrana de m anera bastante laxa, mediante interacciones iónicas (véase Figura 14-33). El átomo de hierro {en co lo r n a ra n ja ) colocado sobre el grupo hemo {en colo r azul) puede transportar un solo electrón (véase también Figura 3-59).
La cadena respiratoria y la ATP sintasa
721
Figura 14-30 Estructura de dos tipos de centros de hierro-azufre. (A) Un centro del tipo 2Fe2S. (B) Un centro del tipo 4Fe4S. Aunque contienen muchos átomos de hierro, cada centro de hierro-azufre sólo puede transportar un electrón a la vez. En la cadena respiratoria existen más de seis centros de hierro-azufre diferentes.
los detergentes que se requieren para solubilizarlas pueden destruir las interac ciones normales proteina-proteina. Sin embargo, a principios de la década de 1960 se descubrió que los detergentes iónicos relativamente suaves como el desoxicolato pueden solubilizar, en forma nativa, com ponentes determinados de la mem brana mitocondrial interna. Esto permitió identificar y purificar los tres principales complejos enzimáticos respiratorios, unidos a la membrana, de la vía que va desde el NADH hasta el oxígeno (Figura 14-33). Como veremos, cada uno de estos com plejos actúa com o una bom ba de H+ impulsada por un trans porte de electrones; sin embargo, estos complejos fueron caracterizados inicial mente en función de los transportadores de electrones que contienen y con los que interactúan. 1.
El complejo NADH deshidrogenasa es el mayor de los complejos enzimáti cos respiratorios, con una masa de aproximadamente 800 000 daltons y más de 22 cadenas polipeptídicas. Acepta electrones del NADH y los trans fiere a través de una flavina y al m enos cinco centros de hierro-azufre a la ubiquinona, que transfiere sus electrones a un segundo complejo enzimà tico respiratorio, el complejo b-c¡.
2.
El complejo citocrom o b -q contiene por lo menos 8 cadenas polipeptídicas diferentes, y parece que se presenta en forma de dímero de unos 500 000 daltons. Cada monómero contiene tres grupos hemo unidos a citocromos, y una proteína hierro-azufre. El complejo acepta electrones de la ubiquinona y los transfiere al citocromo c, que transporta su electrón hasta el complejo
de la citocromo oxidasa. 3.
El complejo de la citocrom o oxidasa (citocromo aa3) es el complejo mejor caracterizado de los tres. Está formado por, al menos, 9 cadenas polipeptí dicas diferentes, y se aísla como un dímero de unos 300 000 daltons; cada m onómero contiene dos citocromos y dos átomos de cobre. El complejo acepta electrones del citocromo c y los cede al oxígeno.
e
+
H4
-C H
-C H ,
cola hidrofóbica hidrocarbonada
u b iq u in o n a
722
u b is e m iq u in o n a (ra dica ! lib re )
u b iq u in o l (d ih id ro u b iq u in o n a )
Capítulo 14 : Conversión energética: mitocondrias y cloroplastos
Figura 14-31 Las quinonas. Cada uno de estos transportadores de electrones capta un protón del ambiente acuoso por cada electrón que acepta, y puede transportar uno o dos electrones como parte de un átomo de hidrógeno (color amarillo). Cuando cede sus electrones al siguiente transportador de la cadena, estos protones se liberan. En las mitocondrias la quinona es la ubiquinona (coenzima Q), que se muestra aquí; la larga cola hidrofóbica que ancla la ubiquinona a la membrana consta generalmente de 6 a 10 unidades de isopreno (de cinco carbonos cada una). En las plantas, el transportador de electrones correspondiente es la plastoquinona, casi idéntica a la ubiquinona. Para simplificar, tanto a la ubiquinona como a la plastoquinona se les denomina quinona, abreviada como Q.
(A) CONDICIONES NORMALES
(B) CONDICIONES ANAEROBICAS
® CU ,-
02
parcialm ente oxidados
control
e- - 0
inhibidor d ) -► 0 2
a 1— ( b reducido
-© ~ 0
~® ,
com pletam ente reducido adición repentina de oxigeno e- - 0
oxidado
-
Q
- 0
-
0
- 0 2
se produce una ola de oxidación que se va desplazando de izquierda a derecha
Los citocromos, los centros de hierro-azufre y los átomos de cobre, sólo pueden transportar un electrón a la vez. Sin embargo, cada NADH cede dos elec trones y cada molécula de 0 2 debe recibir cuatro electrones para producir agua. Existen varios puntos de recolección y de dispersión de electrones a lo largo de la cadena de transporte de electrones en los que se reajustan estas diferencias en el número de electrones.
En la citocromo oxidasa, un centro de hierro-cobre cataliza de form a eficiente la reducción del 0 217 Debido a que el oxígeno tiene una gran afinidad por los electrones, libera una gran cantidad de energía libre cuando es reducido formando agua. De esta m a nera, la evolución de la respiración celular, en la que el 0 2 es convertido en agua, capacitó a los organismos para obtener mucha más energía que la que podían obtener a partir del metabolismo anaeróbico. Es por ello por lo que probable mente todos los organismos superiores respiran. En cualquier caso, para poder utilizar el 0 2 de este modo, los sistemas biológicos requieren disponer de unos procesos químicos muy sofisticados. Podemos tolerar el 0 2 en el aire que respi ramos porque le cuesta captar el primer electrón, por lo que su reacción inicial en las células está finamente controlada por la catálisis enzimàtica. Pero un vez que una molécula de 0 2 haya captado un electrón, formando un radical superóxido (0 2~), éste se convierte en peligrosamente reactivo y captará tres electro nes adicionales de donde sea. La célula puede utilizar el 0 2 para la respiración sólo porque la citocromo oxidasa sitúa el 0 2 en un centro bimetálico especial (Figura 14-34B), donde se mantiene unido entre un átomo de hierro ligado a un grupo hemo y a un átomo de cobre, hasta que se captan un total de cuatro elec-
ESPACIO INTERMEMBRANA
m em brana m itocondrial interna H20 ubiquinona
IJM>lil+ H+
ESPACIO DE LA MATRIZ
10 nm
2H + + 1/ 2 O 2
NAD+ com plejo NADH deshidrogenasa
La cadena respiratoria y la ATP sintasa
com plejo b-ci
com plejo citocrom o oxidasa (dímero)
Figura 14-32 Métodos generales utilizados para determ inar la trayectoria de los electrones a lo largo de la cadena de transporte electrónico. El grado de oxidación de los transportadores electrónicos a, b, c, y d se puede seguir de forma continua estudiando su espectro, ya que el del estado oxidado es diferente al del estado reducido. En este esquema un aumento en el grado de oxidación se indica en co lo r rojo oscuro. (A) En condiciones normales, todos los transportadores se hallan en un estado parcialmente oxidado. La adición de un inhibidor específico hace que los transportadores situados a favor de la corriente de electrones se oxiden más (rojo claro) y los transportadores situados en dirección contraria de la corriente de electrones se reduzcan. (B) En ausencia de oxígeno, todos los transportadores se hallan en estado com pletam ente reducido (gris). La adición súbita de oxígeno hace que cada transportador se transforme en su forma parcialmente oxidada, con un retraso que es mayor para la mayoría de los transportadores situados a favor de la corriente de electrones.
Figura 14-33 Paso de los electrones a través de los tres complejos enzimáticos respiratorios. En la figura se observan las formas y tamaños relativos de tres com plejos enzimáticos respiratorios. Estas estructuras tridimensionales de baja resolución fueron obtenidas a partir de imágenes de cristales bidimensionales (hojas cristalinas) visualizadas al microscopio electrónico a varios ángulos de inclinación. Durante la transferencia de dos electrones del NADH al oxígeno (lín eas rojas), la ubiquinona y el citocromo c hacen la función de transportadores entre los complejos.
723
paso de electrones
entrada de electrones
I
I
bom beo de P atones
4e_
mem brana m itocondrial interna ESPACIO DE LA MATRIZ 2H20 (B) subunidad I subunidad com plejo de la citocrom o oxidasa
trones; sólo entonces los dos átomos de la molécula de oxígeno serán liberados como dos moléculas de agua, sin ningún peligro (Figura 14-34C). Aunque la citocromo oxidasa contiene muchas subunidades proteicas, la mayoría de ellas tienen un papel secundario, ayudando a regular tanto la activi dad com o el ensam blaje de las tres subunidades que forman el núcleo de la en zima. Una de las subunidades de este núcleo contiene el centro bimetálico don de se une el oxígeno, y es responsable del bombeo de cuatro protones que se transfieren a través de la m em brana mitocondrial interna por cada molécula de oxígeno que se reduce a agua (Figura 14-34).
724
Capítulo 14 : Conversión energética: mitocondrias y cloroplastos
Figura 14-34 La reacción del 0 2 con los electrones en la citocrom o oxidasa. (A) Disposición de los transportadores de electrones en la citocromo oxidasa. La subunidad I, que tiene 12 hélices a transmembrana, contiene 2 átomos de hierro unidos a 2 grupos hemo; uno de éstos actúa como un punto captador de electrones que los transfiere al centro bimetálico (.en m a rcad o en un rectán gu lo blan co), formado por el otro átomo de hierro y por un átomo de cobre opuesto muy cercano. Hay que destacar que por cada molécula de 0 2 que reacciona son bombeados fuera de la matriz 4 H+y que esto requiere un total de 4 electrones. (B) Una visión ampliada del centro bimetálico de hierro-cobre con el 0 2 unido. (C) Un esquema de la vía utilizada para la reducción del oxígeno, dando una idea de la complejidad de las reacciones implicadas. Los electrones se representan com o p u n tos rojos hasta que se incorporan a los átomos de hidrógeno (am arillo). (Basado en el modelo de G. T. Babcock y M. Wikstrom, N ature 356:301-309,1992. © 1992. Macmillan Magazines Ltd.)
Se estima que la reacción de la citocromo oxidasa utiliza un 90% del consu mo total de oxígeno de la mayoría de las células. La toxicidad de venenos como el cianuro y la azida se basa en su capacidad de unirse fuertemente a este com plejo, bloqueando así cualquier tipo de transporte electrónico.
Las transferencias de electrones están mediadas por colisiones aleatorias que se producen entre los dadores y los aceptores que difunden en la m em brana m itocondrial interna18 Los dos componentes que transportan los electrones entre los tres complejos enzimáticos principales de la cadena respiratoria -la ubiquinona y el citocromo c difunden rápidamente en el plano de la membrana. Las colisiones que se pueden esperar entre estos dos transportadores móviles y los complejos enzimáticos pue den explicar las velocidades observadas de transferencia de electrones (cada complejo cede y recibe un electrón cada 5 a 20 milisegundos). Así pues, para ex plicar la transferencia de electrones en la bicapa lipídica no es necesario postular la existencia de una cadena de proteínas ordenada estructuralmente; de hecho, parece que los tres complejos enzimáticos existen en el plano de la membrana in terna como entidades independientes, de forma que la transferencia ordenada de electrones se debe a la especificidad de las interacciones funcionales entre los componentes de la cadena. Esta idea se ve reforzada por la observación de que varios de los com ponen tes de la cadena respiratoria se hallan presentes en cantidades bastante diferen tes. En las mitocondrias de corazón, por ejemplo, se estima que por cada m olé cula del complejo de la NADH deshidrogenasa existen 3 moléculas de complejo b-Cp 7 moléculas de complejo de la citocromo oxidasa, 9 moléculas de citocro mo c, y 50 moléculas de ubiquinona; en otros tipos celulares se presentan pro porciones muy diferentes. Estos com ponentes forman una cadena en la que cada uno interactúa específicamente con el transportador adyacente en la se cuencia mostrada en la Figura 14-33, y hay un flujo neto de electrones desde la NADH deshidrogenasa a la citocromo oxidasa porque cada uno de los complejos enzimáticos de la secuencia presenta una afinidad mayor por los electrones que su predecesor. La afinidad que presenta una molécula por los electrones es su potencial redox. Como estudiaremos a continuación, las diferencias de potencial redox de un transportador de electrones y el siguiente se utiliza para bombear protones fuera de la matriz mitocondrial.
Una gran caída del potencial redox a través de cada uno de los tres com plejos enzimáticos respiratorios aporta energía para el bom beo de H+19 A los pares de componentes, tales como el H20 y V202 o el NADH y el NAD+se les denomina pares redox conjugados, ya que uno de los componentes se convierte en el otro mediante la adición de uno o más electrones más uno o más protones -lo s protones están ya disponibles en cualquier solución acuosa. Así, por ejemplo, i/202 + 2e~ + 2H+
H20
Muchos lectores sabrán que una mezcla equimolar de los miembros de un par conjugado ácido-base actúa como tampón, manteniendo una “presión de H+” definida, o pH, que es una medida de la constante de disociación del ácido. De la misma forma, una mezcla equimolar de los miembros de un par conjugado redox mantiene una “presión de electrones” definida, o potencial redox (reducción-oxidación), E, que es una medida de la afinidad del transportador de elec trones por los electrones. Colocando electrodos en contacto con soluciones que contengan los pares redox conjugados apropiados, uno puede medir el potencial redox de cada uno de los diversos transportadores de electrones que participan en las reacciones biológicas de oxidación-reducción. En los sistemas biológicos el potencial redox
La cadena respiratoria y la ATP sintasa
725
se determina a pH 7,0, al que [H+] = IO-7 M. Los pares de compuestos que pre sentan un potencial redox más negativo tienen menor afinidad por los electro nes y por esta razón contienen transportadores con una fuerte tendencia a do nar electrones, mientras que los pares que presentan potenciales redox más positivos tienen mayor afinidad por los electrones y, consecuentem ente, contie nen transportadores con una fuerte tendencia a aceptar electrones. De esta m a nera, una mezcla 50-50 de NADH y NAD+ tiene un potencial redox de -320 mV, lo cual indica que el NADH tiene una fuerte tendencia a donar electrones; una mezcla 50-50 de H20 y llz02 tiene un potencial redox de +820 mV, lo cual indica que el 0 2tiene una fuerte tendencia a aceptar electrones. Se pueden determinar los potenciales redox de todos los transportadores de electrones de la cadena respiratoria que se puedan distinguir por su espectro, y se observa que van aumentando a medida que uno va pasando por la cadena de transportadores de electrones. Dado que la mayoría de citocromos presentan unos potenciales redox más altos que los de los centros de hierro-azufre, gene ralmente actúan como transportadores de electrones cerca del extremo del 0 2 de la cadena respiratoria, mientras que las proteínas hierro-azufre actúan como transportadores cerca del extremo del NADH. En la Figura 14-35 se muestra un esquema de los potenciales redox medidos a lo largo de la cadena respiratoria. Los potenciales caen en tres grandes escalo nes, uno a través de cada complejo enzimàtico principal. La variación de poten cial redox entre cada dos transportadores de electrones es directamente propor cional a la energía libre liberada por cada electrón transferido entre ellos (véase Figura 14-35). Cada complejo actúa como un elemento transformador de ener gía, utilizando esta variación en energía libre para bom bear protones a través de la m em brana interna, creando de esta manera un gradiente electroquímico de protones a través de la membrana. Esta transformación se puede poner de m a nifiesto mediante la incorporación a liposomas de cada uno de los complejos purificados: cuando se añaden un dador y un aceptor de electrones apropiados, de forma que los electrones atraviesen el complejo, los H+ se traslocarán a través de la m em brana del liposoma.
El m ecanism o del bom beo de H+se conoce m ejor en bacteriorrodopsina20 Debido a que algunos com plejos enzimáticos de la cadena respiratoria bombean un protón por electrón a través de la mem brana mitocondrial interna mientras
-4 00 -3 00
25
-2 0 0
-100 0 com plejo de la NADH 100 deshldrogenasa 200 300 400 500 600 700 800
20
nH 4
15
t
com plejo de la b-ci
10
com plejo de la citocrom o oxidasa 2H + + V2O 2
h 2o
d ire cció n del flu jo de e lectro nes 726
Capítulo 14 : Conversión energética: mitocondrias y cloroplastos
Figura 14-35 El potencial redox (indicado como E’0o Eh) aumenta a medida que los electrones fluyen hacia abajo de la cadena respiratoria, hacia el oxígeno. La variación de energía libre estándard, AG0, para la transferencia de cada uno de los dos electrones cedidos por la molécula de NADH puede obtenerse en la escala de ordenadas de la derecha (AG = -n(0,023) AE¿, donde n es el número de electrones transferidos a través de una variación de potencial redox de AE¿ mV). Los electrones fluyen a través de un complejo enzimàtico pasando de manera secuencial a los cuatro o más transportadores de electrones de cada complejo. Como se indica, parte de la variación favorable de energía libre es utilizada por cada complejo enzimàtico para bombear protones a través de la membrana mitocondrial interna. No se conoce con exactitud cuál es el número de protones bombeados por electrón (n); se estima que la NADH deshidrogenasa y los complejos b-ct bombean dos H+por electrón, mientras que el complejo de la citocromo oxidasa sólo bombea uno. Los dos electrones transportados desde el FADH2, generados a partir de la oxidación de los ácidos grasos (véase Figura 14-11) y del ciclo del ácido cítrico (véase Figura 14-14), pasan directamente a la ubiquinona. Por esta razón, inducen menos bombeo de H+ que los dos electrones que provienen del NADH (no mostrado).
CONFORMACIÓN C
CONFORMACIÓN A
CONFORMACIÓN A captación de protones
ENERGÍA
DENTRO
ERA
liberación de ' acoplam iento energético protones AUMENTO DE LA AFINIDAD' POR LOS H' DISMINUCIÓN (baja - alta) DE LA AFINIDAD POR LOS H+ (alta — baja)
CONFORMACIÓN B
que otros bom bean dos, el mecanismo molecular mediante el que el transporte de electrones se acopla al bom beo de protones parece ser diferente para cada uno de los tres complejos enzimáticos. Se desconocen los detalles del m ecanis mo por el que actúan. En el caso del complejo b -cp las quinonas claramente par ticipan en este mecanismo. Como mencionamos anteriormente, una quinona capta un protón del medio acuoso por cada electrón que transporta y lo libera cuando libera el electrón (véase Figura 14-31). El libre desplazamiento de la ubiquinona por la bicapa lipídica le permite aceptar electrones cerca de la superfi cie interna de la mem brana y donarlos al complejo b-c, cerca de la superficie ex terna, transfiriéndose así un protón a través de la bicapa por cada electrón transportado. Sin embargo, por cada electrón se bom bean dos protones a través del complejo b-Cji existen evidencias del llamado ciclo Q, en el que la ubiquinona se recicla a través del complejo en un sentido determinado, que hace posible esta transferencia dos por uno. Los cambios alostéricos de las conformaciones proteicas determinados por el transporte electrónico también pueden bombear H+, tal como la ATP sintasa trabajando en sentido inverso bom bea H+ hidrolizando ATP. Tanto para el com plejo de la NADH deshidrogenasa como para el complejo de la citocromo oxidasa, parece probable que el transporte de electrones determine de manera ordena da los cambios alostéricos de conformación de las proteínas que provocan que una parte de la proteína bombee H+ a través de la membrana mitocondrial inter na. Este tipo de bombeo de protones está bien estudiado para la bacteriorrodopsina, una bom ba protónica impulsada por luz que se encuentra en la membrana plasmática de ciertas bacterias altamente especializadas (véase Figura 10-32). En la Figura 14-36 se presenta un mecanismo general para el bom beo de H+ basado en estudios estructurales y funcionales de esta proteína.
captación de protones
Figura 14-36 Bombeo de protones. Este modelo general del bombeo de H+ impulsado por energía se basa en el mecanismo que parece que utiliza la bacteriorrodopsina. La proteína transmembrana mostrada es impulsada a seguir cambios ordenados de conformaciones, designadas aquí como A, B y C. En la conformación C la proteína tiene una baja afinidad para los H+causando la liberación de un H+ al exterior de la bicapa lipídica; en la conformación A, la proteína tiene una afinidad muy alta por los H+, favoreciendo su captación hacia dentro de la bicapa lipídica. Como se indica, la transición de la conformación B a la C es energéticamente desfavorable, pero está impulsada a realizarse por el acoplamiento con una reacción energéticamente favorable que ocurre en algún sitio de la proteína {flecha azul). Los otros cambios conformacionales, conducen a estados de menor energía y discurren espontáneamente. De este modo, el ciclo A —>B — >C —»A sólo va en un sentido, favoreciendo el bombeo de los H+desde dentro hacia fuera. En el caso de la bacteriorrodopsina, la energía para la transición B - » C está proporcionada por la luz, mientras que en la mitocondria esta energía está proporcionada por el transporte electrónico.
Los ionóforos de H+disipan el gradiente de H+, desacoplando así el transporte de electrones de la síntesis de ATP21 Desde los años 1940 se sabe que varias substancias, como el 2,4-dinitrofenol, ac túan como agentes desacoplantes, desacoplando el transporte de electrones de la síntesis de ATP. La adición de estos compuestos orgánicos de bajo peso m olecu lar a las células detiene la síntesis de ATP en las mitocondrias, sin bloquear el
La cadena respiratoria y la ATP sintasa
727
consumo de oxígeno. En presencia de este agente desacoplante, el transporte de electrones continúa a gran velocidad pero no se genera ningún tipo de gradiente de H+. La explicación de esto es tan elegante como sencilla: los agentes desaco plantes actúan como transportadores de H+ (ionóforos de H+), constituyendo una vía para el flujo de H+ a través de la membrana mitocondrial interna alterna tiva a la de la ATP sintasa. Como consecuencia de este “cortocircuito”, la fuerza protón-motriz se disipa completamente por lo que ya no se puede sintetizar ATP.
Normalmente el control respiratorio restringe el flujo de electrones a través de la cadena22 Cuando se añade un desacoplador tal como el dinitrofenol a las células, las mitocondrias aumentan substancialmente la captación de oxígeno debido a un aumen to en la velocidad de transporte de electrones. Este aumento refleja la existencia de un control respiratorio. Se cree que el control actúa a través del efecto inhi bidor directo que tiene el gradiente electroquímico de protones sobre la veloci dad de transporte de electrones. Cuando el gradiente se elimina por acción de un desacoplador, el transporte de electrones discurre a la máxima velocidad po sible, de una manera descontrolada. A medida que el gradiente aumenta, el transporte de electrones se vuelve más difícil y el proceso se vuelve más lento. Además, si experimentalmente se genera un fuerte gradiente electroquímico ar tificial de protones a través de la mem brana interna, el transporte normal de electrones se para por completo y se detecta un flujo inverso de electrones en al gunas secciones de la cadena respiratoria. Esta observación sugiere que el con trol respiratorio refleja un equilibrio simple entre la variación de energía libre del bom beo de protones ligado al transporte de electrones y la variación de energía libre del transporte de electrones -e s decir, la magnitud del gradiente electroquímico de protones afecta tanto a la velocidad como a la dirección del transporte de electrones, tal com o afecta a la direccionalidad de la ATP sintasa (véase Figura 14-27). El control respiratorio es sólo una parte de un sistema compartimentado muy elaborado de controles por retroalimentación que coordina las velocidades de la glucolisis, la hidrólisis de los ácidos grasos, el ciclo del ácido cítrico y el transporte de electrones. Las velocidades de todos estos procesos se ajustan a la relación ATP/ADP, aumentando cuando se produce un aumento de la utiliza ción de ATP que provoca una disminución de esta relación. La ATP sintasa de la mem brana mitocondrial interna, por ejemplo, trabaja a velocidad mayor cuan do aumenta la concentración de sus dos substratos ADP y P¡. Al aumentar la acti vidad de la enzima, aumenta el flujo de protones hacia en interior de la matriz, disipándose más rápidamente el gradiente electroquímico de protones. A su vez, el descenso de este gradiente activa la velocidad del transporte electrónico. Sistemas de control similares a éste, incluida la retroinhibición negativa por ATP de varias enzimas clave (para un ejemplo, véase Figura 14-13), adaptan por ejemplo la velocidad de producción de NADH a la de utilización de NADH en la cadena respiratoria. Como resultado de todos estos mecanismos de control, du rante un período de ejercicio intenso, el cuerpo oxida grasas y azúcares a una ve locidad entre 5 y 10 veces superior a la que se produce durante un período de re poso.
Existen desacoplantes naturales que transform an las mitocondrias del tejido adiposo m arrón en m áquinas generadoras de calor23 En algunas células adiposas especializadas la respiración mitocondrial está des acoplada de la síntesis de ATP de forma natural. En estas células, conocidas como adipocitos del tejido adiposo marrón o de la grasa parda, la mayor parte de la energía de oxidación se disipa en forma de calor en lugar de ser transfor-
728
Capítulo 14: Conversión energética: mitocondrias y cloroplastos
mada en ATP. La mem brana interna de las grandes mitocondrias de estas célu las, contienen una proteína de transporte que permite a los protones fluir a tra vés de la mem brana a favor de su gradiente electroquímico, sin activar la ATP sintasa. A consecuencia de ello, las células oxidan sus reservas de grasa a una gran velocidad, produciendo más calor que ATP. Por ello, los tejidos que contie nen tejido adiposo marrón actúan como “almohadillas calefactoras” que reani man a los animales hibernantes y que protegen del frío las áreas sensibles el re cién nacido humano.
(A) CONDICIONES AERÓBICAS cadena respiratoria
Todas las bacterias utilizan m ecanism os quimiosmóticos para ahorrar energía24 Las bacterias utilizan fuentes de energía enormemente diversas. Como las célu las eucariotas, algunas bacterias sintetizan ATP a partir de azúcares, oxidándolos hasta C 0 2 y H20 a través de la glucolisis y del ciclo del ácido cítrico; estas bacte rias tienen en su mem brana plasmática una cadena respiratoria muy similar a la de la membrana mitocondrial interna. Otras bacterias son anaeróbicas estrictas por lo que obtienen la energía exclusivamente de la glucolisis (fermentación) o de una cadena electrónica que utiliza como aceptor final de electrones una m o lécula diferente al oxígeno. Estos aceptores alternativos pueden ser un com puesto nitrogenado (nitratos o nitritos), un compuesto de azufre (sulfatos o sulfitos) o un compuesto orgánico (fumaratos o carbonatos). Los electrones son transferidos a estos aceptores mediante una serie de transportadores de electro nes que se hallan en la membrana plasmática, semejantes a los que se encuen tran en las cadenas respiratorias mitocondriales. A pesar de esta diversidad, la mem brana plasmática de la mayoría de las bacterias presenta una ATP sintasa muy similar a la de las mitocondrias (y a la de los cloroplastos). En las bacterias aeróbicas, existe una cadena de transporte de electrones que establece la fuerza protón-motriz que impulsa la ATP sintasa a generar ATP. En las bacterias anaeróbicas que carecen de cadena de transporte electrónico, esta ATP sintasa actúa en sentido inverso, utilizando el ATP produ cido en la glucolisis para generar una fuerza protón- motriz a través de la m em brana plasmática bacteriana. Así, la mayoría de las bacterias, incluidas las anaeróbicas estrictas, m antie nen una fuerza protón-motriz a través de su membrana plasmática. El gradiente electroquímico de protones se utiliza para impulsar el motor flagelar que permi te la motilidad de la bacteria; el Na+ es bombeado afuera de las bacterias por un sistema de antiporte de Na+-H+ que desempeña la función de la ATPasa de Na+K+ de la células eucariotas; la mayoría de aminoácidos y azúcares son transpor tados de esta manera en las bacterias: el transporte activo de nutrientes tiende a estar mediado por un sistema de simporte impulsado por H+ (Figura 14-37) en el que el metabolito deseado es arrastrado hacia el interior de la célula juntam ente con uno o más protones. En las células animales, por el contrario, la mayoría del transporte hacia el interior a través de la membrana plasmática es impulsado por el gradiente de Na+establecido por la ATPasa de Na+-K+. Entre los distintos tipos de bacterias, existen algunas que son capaces de adaptarse a vivir en ambientes muy alcalinos y deben mantener su citoplasma a un pH fisiológico. Para estas células, cualquier intento de generar un gradiente electroquímico de protones sería opuesto al elevado gradiente de concentración de protones en dirección contraria (más H+en el interior que en el exterior). Pro bablem ente por esta razón, al algunas de estas bacterias substituyó el Na+por H+ en todos sus mecanismos quimiosmóticos. Su cadena respiratoria bombea Na+ hacia el exterior de la célula, sus sistemas de transporte están acoplados a un simporte de Na+ hacia adentro, su motor flagelar está impulsado por un flujo de Na+hacia adentro, y la responsable de la mayor parte de su síntesis de ATP pare ce ser una ATP sintasa impulsada por Na+. La existencia de estas bacterias de muestra que el principio de la quimiosmosis es más fundamental que el gra diente electroquímico de protones en el que se basa normalmente.
La cadena respiratoria y la ATP sintasa
ÍB) C O N D IC IO N E S A N A ER Ó B IC A S
Figura 14-37 Transporte impulsado por protones en las bacterias. Una fuerza protón-motriz generada a través de la m em brana plasmática bom bea nutrientes hacia el interior de la célula y sodio hacia el exterior. En (A), se está generando un gradiente electroquímico de protones en una bacteria anaeróbica, mediante una cadena respiratoria. Luego, este gradiente será utilizado por la ATP sintasa para producir ATP. Tam bién será utilizado para transportar algunos nutrientes al interior de la bacteria. En (B), la m isma bacteria pero en condiciones anaeróbicas, obtendrá el ATP de la glucolisis. Parte de este ATP será hidrolizado por la ATP sintasa generando una fuerza protón-motriz transm embrana que impulsará los procesos de transporte.
729
Resumen La cadena respiratoria de la membrana mitocondrial interna contiene tres comple jos enzimáticos principales, implicados en la transferencia de electrones desde el NADH hasta el 0¿. Cada uno de estos complejos puede ser purificado e insertado en vesículas lipídicas sintéticas, demostrándose así que bombean protones cuando se transportan electrones a su través. En la membrana nativa, la ubiquinonay el cito cromo c son transportadores móviles de electrones que van y vienen de uno a otro complejo enzimàtico, completando la cadena de transporte electrónico. La vía del flujo de electrones es: NADH -» complejo de la NADH deshidrogenasa -» ubiquinona -» complejo b-c¡ -» citocromo c complejo de la citocromo oxidasa oxígeno molecular (O2). Los complejos enzimáticos respiratorios acoplan el transporte de electrones, energéticamente favorable, al bombeo de protones hacia el exterior de la matriz. El gradiente electroquímico resultante se utiliza para fabricar ATP mediante otro complejo proteico transmembrana, la ATP sintasa, a través del cual los protones fluyen de nuevo hacia la matriz. La ATP sintasa es un mecanismo acoplador rever sible que normalmente transforma el flujo de protones hacia adentro de la mitocondria en energía de enlace fosfato del ATP, catalizando la reacción ADP + P¡ -> ATP, pero que, si se reduce el gradiente electroquímico de protones, también puede hidrolizar ATP y bombear electrones en dirección opuesta. Su presencia universal en mitocondrias, cloroplastos y bacterias testifica su importancia central en los me canismos quimiosmóticos de las células.
Cloroplastos y fotosíntesis25 Todos los animales y la mayoría de los microorganismos confían en una conti nuada captación de grandes cantidades de compuestos orgánicos de su am biente. Estos compuestos aportan los esqueletos carbonados para la biosíntesis y la energía m etabolica que impulsa todos los procesos celulares. Se cree que los primeros organismos de la Tierra primitiva tenían acceso a una abundancia de compuestos orgánicos de origen geoquímico (véase Capítulo 1), pero la mayoría de estos compuestos originales se agotaron hace miles de millones de años. Desde ese período prácticam ente todos los materiales orgánicos que han nece sitado las células vivas han sido producidos por organismos fotosintéticos, inclu yendo muchos tipos de bacterias fotosintéticas. Las cianobacterias, que son las bacterias fotosintéticas más evolucionadas, tienen unos requerimientos nutricionales mínimos. Estas bacterias utilizan los electrones del agua y la energía de la luz solar para convertir el C 0 2 atmosférico en compuestos orgánicos. En el curso de la hidrólisis del agua [en la reacción nW20 + n C 0 2 ini, (CH20)„ + n 0 2], liberan a la atmósfera el oxígeno necesario para la fosforilación oxidativa. Como veremos se cree que la evolución de las cianobacterias a partir de bacterias fotosintéticas más primitivas hizo posible por primera vez el desarrollo de las formas aeróbicas de vida. En las plantas, que se desarrollaron más tarde, la fotosíntesis se realiza en un orgánulo intracelular especializado -e l cloroplasto. Los cloroplastos realizan la fotosíntesis durante las horas de luz solar. Los productos de la fotosíntesis son utilizados directamente por las células fotosintéticas para la biosíntesis y tam bién son transformados en azúcares de bajo peso molecular (normalmente saca rosa) que son exportados para satisfacer las necesidades metabólicas de muchas de las células no fotosintéticas de la planta. Alternativamente, los productos pue den ser almacenados como polisacáridos osmóticamente inertes (normalmente almidón) que se guardan disponible como una fuente de azúcar para una utili zación futura. Las evidencias bioquímicas sugieren que los cloroplastos son descendientes de bacterias fotosintéticas productoras de oxígeno que fueron endocitadas y vi vieron en simbiosis con células primitivas eucariotas. Tam bién se cree que, en
730
Capítulo 14 : Conversión energética: mitocondrias y cloroplastos
granos de_ “ almidón
general, las mitocondrias son descendientes de bacterias endocitadas. Probable mente, la gran cantidad de diferencias que hay entre cloroplastos y mitocondrias refleja tanto el hecho de que provienen de antecesores bacterianos diferentes com o su posterior divergencia evolutiva. Sin embargo, los mecanismos funda mentales implicados en la síntesis de ATP impulsada por la luz, en los cloroplas tos, y los que están implicados en la síntesis de ATP impulsada por la respiración, en las mitocondrias, son muy parecidos.
El cloroplasto es un miembro de una familia de orgánulos exclusivos de las plantas -lo s plastidios26 El cloroplasto es el miembro más prominente de la familia de los plastidios. Los plastidios se presentan en todas las células vivas de las plantas, cada tipo celular tiene su propio complemento característico. Todos los plastidios tienen una se rie de características comunes. Lo más notable de ellas es que todos los plasti dios de una especie de planta concreta contienen múltiples copias del mismo genoma, relativamente corto (véase Tabla 14-3, pág. 754) y están rodeados por una envoltura compuesta por dos membranas concéntricas. Todos los plastidios se desarrollan a partir de los proplastidios, que son unos orgánulos relativamente pequeños presentes en las células inmaduras de los meristemos de la planta (Figura 14-38A). Los proplastidios se desarrollan en fun ción de los requerimientos de cada célula diferenciada y el tipo de proplastidio viene determinado en gran parte por el genoma nuclear. Si se hace crecer una hoja en la oscuridad, sus proplastidios aumentaran de tamaño y se transforma ran en etioplastos, los cuales presentan un eje semicristalino de membranas in ternas que contiene una clorofila amarilla precursora en lugar de la clorofila. Cuando son expuestos a la luz, los etioplastos rápidamente se transforman en cloroplastos mediante la conversión de este precursor a clorofila y sintetizando nuevas membranas, pigmentos, enzimas fotosintéticos y componentes de la ca dena de transporte electrónico. Los leucoplastos son plastidios que aparecen en la epidermis y en muchos tejidos internos que no se vuelven verdes ni fotosintéticos. Son ligeramente más grandes que los proplastidios. El amiloplasto es una forma común de leucoplasto (Figura 14-38B), que acumula almidón en los tejidos de reserva. En alguna plantas, tales como las patatas, los amiloplastos pueden llegar a ser tan grandes como una célula animal de tamaño medio. Es importante darse cuenta que los plastidios no sólo son lugares en los que tiene lugar la fotosíntesis ni la deposición de materiales de reserva. Las plantas han utilizado sus plastidios para la compartimentación celular del metabolismo intermediario. Los plastidios producen mucha más energía y más poder reduc tor (en forma de ATP y NADPH) que los que son utilizados para las reacciones biosintéticas de la planta. La síntesis de las purinas y pirimidinas, la mayoría de
Cloroplastos y fotosíntesis
Figura 14-38 Diversidad de los plastidios. (A) Un proplastidio de una célula de raíz de una planta de judías. Obsérvese la doble membrana; la membrana interna resalta la relativa escasez de membranas internas. (B) Tres amiloplastos (un forma de leucoplasto) o plastidios almacenadores de almidón, en una punta de la raíz de soja. (De B. Gunning y M. Steer, Ultrastructure and the Biology of Plant Cells. Londres: Arnold, 1975.)
731
2 iim■---- *h HOJA
CLOROPLASTO c su 0 ma
epiderm is superior
grana
m embrana tilacoidal
epiderm is inferior m embrana
membrana
exlerna
in t e r n a
ospacro tilacoidal
espacio interm embranoso
Figura 14-39 El cloroplasto. Este orgánulo fotosintético presenta tres membranas distintas (la membrana extema, la membrana interna y la membrana tilacoidal) que delimitan tres compartimientos internos diferentes (el espacio intermembranoso, el estroma y el espacio tilacoidal). La membrana tilacoidal contiene todos los sistemas generadores de energía del cloroplasto. En las electronmicrografías, esta membrana aparece formando unidades separadas que delimitan vesículas aplanadas (véase Figura 14-40), pero probablemente están unidas formando una sola membrana muy plegada en cada cloroplasto. Como se indica en la figura, los distintos tilacoides están interconectados, y tienden a agruparse formando agregados denominados grana.
espacio de airi
núcleo
pared celular
v ;ic Lióla
cloroplasto
citosol
envoltura del cloroplasto
tilacoides
almidón
grana pared celular
732
Capítulo 14 : Conversión energética: mitocondrias y cloroplastos
Figura 14-40 Electronmicrografía de cloroplastos. (A) Una hoja de trigo en la que existe una gran vacuola rodeada por una fina franja de citoplasma con cloroplastos. (B) Sección ultrafina de un solo cloroplasto, mostrando los gránulos de almidón y gotas lipídicas que se han acumulado en el estroma como resultado de los procesos de biosíntesis que se producen en este lugar. (C) Una visión a mayor aumento de los grana, mostrando las membranas tilacoidales aplanadas. (Por cortesía de K. Plaskitt.)
Figura 14-41 Comparación entre una mitocondria y un cloroplasto. El cloroplasto suele ser mucho mayor y contiene una membrana tilacoidal y un espacio tilacoidal. La membrana interna de la mitocondria está plegada formando crestas.
los aminoácidos y de todos los ácidos grasos de las plantas tiene lugar en los plastidios, mientras que en las células animales todos estos compuestos son producidos en el citosol.
Los cloroplastos se parecen a las mitocondrias, pero tienen un com partim iento adicional27 Los cloroplastos realizan sus interconversiones energéticas mediante m ecanis mos quimiosmóticos, tal como lo hacen las mitocondrias, y su organización se basa en los mismos principios (Figuras 14-39 y 14-40). Ambos tipos presentan una m em brana externa altamente permeable, una membrana interna mucho menos permeable, en la que están incluidas proteínas transportadoras especia les, y un estrecho espacio intermembrana. La membrana interna envuelve un gran espacio llamado estrom a, que es análogo a la matriz mitocondrial y contie ne varias enzimas, ribosomas, RNA y DNA. En cualquier caso, existe una importante diferencia entre la organización de las mitocondrias y de los cloroplastos. Generalmente la membrana interna del cloroplasto no está plegada en crestas y no contiene una cadena transportadora de electrones. En lugar de ello, tanto la cadena de transporte de electrones como el sistema fotosintético de absorción de la luz y una ATP sintasa se localizan en una tercera m em brana distinta que forma un conjunto de sacos planos apilados, los tilacoides (véase Figura 14-39). Se cree que el lumen de cada tilacoide está conectado con el lumen de los otros tilacoides, definiendo así un tercer com par timiento interno llamado el espacio tilacoidal que delimita con el estroma m e diante la membrana tilacoidal. En la Figura 14-41 se ilustran las similitudes y diferencias ultraestructurales entre las mitocondrias y los cloroplastos. En general, se puede imaginar el cloro plasto como una mitocondria más grande en la que las crestas se han convertido en series de partículas submitocondriales interconectadas situadas en el espacio de la matriz. El extremo prominente de la ATP sintasa del cloroplasto, donde se sintetiza el ATP, sobresale de la membrana tilacoidal hacia el estroma, como si sobresaliera de la matriz desde la membrana de cada cresta mitocondrial.
Dos reacciones características de los cloroplastos: la producción de ATP y de NADPH, impulsada por la luz, y la conversión de C 0 2 en carbohidratos25 La gran cantidad de reacciones que se producen durante la fotosíntesis, se pue den agrupar en dos grandes categorías. (1) En las reacciones fotosintéticas de transferencia de electrones (algunas veces llamadas las “reacciones de la fase luminosa”), la energía derivada de la luz solar activa un electrón de la clorofila, Cloroplastos y fotosíntesis
733
lo cual permite que este electrón se desplace a lo largo de una cadena de oxida ción de la m em brana tilacoidal, de manera análoga a como se desplazan los electrones a lo largo de la cadena respiratoria de las mitocondrias. La clorofila obtiene sus electrones del agua, con la liberación de 0 2. Este proceso de trans porte electrónico bom bea protones a través de la m embrana tilacoidal, y la fuer za protón-m otriz resultante impulsa el proceso de síntesis de ATP en el estroma. Al m ismo tiempo, las reacciones de transporte electrónico generan electrones de alta energía (junto con H+) que transforman el NADP+ en NADPH. Todas es tas reacciones se producen en el cloroplasto. (2) En las reacciones de fijación del carbono (llamadas tam bién “reacciones de la fase oscura”), el ATP y el NADPH producidos en las reacciones fotosintéticas de transferencia de electro nes se utilizan como fuente de energía y de poder reductor, respectivamente, para impulsar la transformación de C 0 2 en carbohidratos. Las reacciones de fi jación de carbono, que empiezan en el estroma del cloroplasto y continúan en el citosol celular, producen sacarosa en las hojas de la planta; desde donde es exportada a otros tejidos como fuente de moléculas orgánicas y de energía para el crecimiento. Así, la formación de oxígeno (que necesita directamente la energía de la luz) y la conversión del dióxido de carbono en carbohidratos (que necesita, tan sólo indirectamente, la energía de la luz), son dos procesos fotosintéticos claramente separados el uno del otro (Figura 14-42). No obstante, como veremos, existen elaborados mecanism os de retroalimentación que interconectan ambos proce sos, equilibrando la biosíntesis. Por ejemplo, las variaciones en los requerimien tos celulares de ATP y de NADPH regulan la producción de estas moléculas en la m em brana del tilacoide; tam bién ocurre que varias de las enzimas del cloroplas to que son necesarias para la fijación del carbono se inactivan en la oscuridad y se reactivan por los procesos de transporte electrónico estimulados por la luz.
CITOSOL
H20
C02
CLOROPLASTO reacciones fotosintéticas de transferencia de electrones
02
reacciones de fijación del carbono gliceraldehído 3-fosfato (precursor de los azúcares, am inoácidos y ácidos grasos para la célula)
Figura 14-42 El proceso de la fotosíntesis en un cloroplasto. En la primera serie de reacciones, el agua se oxida y se libera oxígeno, mientras que en la segunda serie de reacciones el dióxido de carbono es asimilado (fijado) produciendo carbohidratos.
La fijación del carbono está catalizada por la ribulosa bisfosfato carboxilasa28 En este capítulo hemos visto que las células producen ATP aprovechando la gran cantidad de energía libre que se libera cuando los carbohidratos son oxidados hasta C 0 2 y H20 . Por consiguiente, es evidente que la reacción inversa en la que el C 0 2 y el H20 se com binan formando carbohidratos ha de ser una reacción muy desfavorable. En consecuencia, esta síntesis debe estar acoplada a otras re acciones muy favorables que la impulsen. La Figura 14-43 ilustra la reacción central en la que un átomo de carbono inorgánico se transforma en un carbono orgánico: el C 0 2 de la atmósfera se com bina con el compuesto de cinco carbonos, la ribulosa 1,5-bisfosfato, y con agua, para dar dos moléculas de tres carbonos, el 3-fosfoglicerato. Esta reacción de “fijación del carbono”, que fue descubierta en 1948, se produce en el estroma del cloroplasto y está catalizada por una gran enzima llamada ribulosa bisfosfato carboxilasa (-500 000 daltons). Puesto que cada molécula de enzima trabaja con
c 2 © c=o h
o=c =o
+
o
H — c — OH H — C — OH c h
dióxido de carbono 734
2o (
p)
ribulosa 1,5 bisfosfato
o
c h 2o ®
\
°
I c —c — /’ I
OH
c=o
+
h
9o
H — c — OH c h 2o
®
producto interm ediario
dos m oléculas de 3-fosfoglicerato
Capítulo 14 : Conversión energética: mitocondrias y cloroplastos
Figura 14-43 La reacción inicial de la fijación del carbono. Esta reacción, en la que el dióxido de carbono se transforma en carbono orgánico, se desarrolla en el estroma del cloroplasto y está catalizada por la enzima ribulosa bisfosfato carboxilasa, que es muy abundante. El producto, 3-fosfoglicerato, el cual también es un importante intermediario de la glucolisis: cuando la enzima adiciona oxígeno en lugar de C02, los dos átomos de carbono que se presentan en color azul se utilizan para generar fosfoglicolato (véase más adelante).
bastante lentitud (transforma unas 3 moléculas de substrato por segundo, en comparación con las 1000 moléculas por segundo de una enzima típica), es n e cesario que en cada cloroplasto existan muchas copias de ella. A menudo, la ribulosa bisfosfato carboxilasa representa más del 50% del total de proteína del cloroplasto, y se cree que es la proteína más abundante de la Tierra.
En el ciclo de fijación del carbono se consum en tres moléculas de ATP y dos moléculas de NADPH por cada molécula de C 0 2 fijada29 La reacción de fijación del C 0 2 es energéticamente favorable gracias a la reacti vidad del compuesto rico en energía ribulosa 1,5-bisfosfato al que se añade cada molécula de C 0 2 (Figura 14-43). Pero para que se produzca un aporte de ribulo sa 1,5-bisfosfato se requieren una serie de reacciones que consuman grandes cantidades de NADPH y ATP. La elaborada vía a través de la cual se regenera este compuesto se descubrió gracias a un experimento que constituye uno de los mayores éxitos en el uso de los radioisótopos. Como se muestra en la Figura 1444, gracias a la ribulosa bisfosfato carboxilasa se fijan 3 moléculas de C 0 2 produ ciéndose 6 moléculas de 3-fosfoglicerato (con un total de 6 x 3 = 18 átomos de carbono: 3 procedentes del C 0 2y 15 de la ribulosa 1,5-bisfosfato). Los 18 átomos de carbono recorren entonces un ciclo de reacciones que regeneran las 3 m olé culas de ribulosa 1,5-bisfosfato que fueron utilizadas en el primer paso de fija ción del carbono (3 x 5 = 15 átomos de carbono). Así, el proceso genera una m o lécula de gliceráldehído 3-fosfato (3 átomos de carbono) como ganancia neta. En este ciclo de fijación del carbono (o ciclo de Calvin-Benson), se consumen 3
tres m oléculas C 02
Figura 14-44 Ciclo de fijación del carbono, que forma moléculas orgánicas a partir de COzy de H20 . El
1C
----- - seis m oiecuias ribulosa 1,5-bisfosfato
3-fosfoglicerato
5C
3C
3 |a d p |■6
3 ^ -
tres m oléculas ribulosa 5C 5-fosfato
►6|ADP|
seis m oléculas' 1,3-difosfoglicerato
2 P¡
número de átomos de carbono de cada tipo de molécula se indica en los recu adros blan cos. Entre el gliceráldehído 3-fosfato y la ribulosa 5-fosfato hay una gran cantidad de intermediarios, que en este esquema se han omitido en aras de una mayor claridad. Tam poco se representa la entrada de agua en el ciclo.
A
3C
6
\
■
cinco moléculas gliceráldehído 3C 3-fosfato
tres moléculas de CO2 fijadas dan un rendimiento neto de una molécula de gliceráldehído 3-fosfato lo que supone un gasto neto de nueve moléculas de ATP y seis moléculas de NADPH
gliceráldehído 3-fosfato
una m olécula gliceráldehído 3-fosfato
6 P¡
seis m oléculas
3C
3C
H— C =0 I H — C — OH c h 2o
®
AZUCARES, ACIDOS GRASOS, AMINOACIDOS
Cloroplastos y fotosíntesis
735
moléculas de ATP y 2 moléculas de NADPH por cada molécula de C 0 2 que se transform a en carbohidrato. La ecuación neta es 3 C 0 2 + 9ATP + 6NADPH + agua —» gliceraldehído 3-fosfato + 8P¡ + 9ADP + 6NADP+ En consecuencia, para la formación de moléculas orgánicas a partir de C 0 2 y H20 , se requiere energía de enlace fosfato (en forma de ATP) y poder reductor (en forma de NADPH). Más adelante volveremos sobre este punto. El gliceraldehído 3-fosfato producido en los cloroplastos a través del ciclo de fijación del carbono es un azúcar de tres carbonos que también se utiliza com o intermediario central en la glucolisis. Gran parte de este azúcar es expor tado al citosol donde puede ser rápidamente transformado en fructosa 6-fosfato y glucosa 1-fosfato mediante la inversión de varias reacciones en la glucolisis (véase Figura 2-21). Luego, la glucosa 1-fosfato es transformada en el azúcarnucleótido UDP-glucosa, que se com bina con la fructosa 6-fosfato formando sacarosa fosfato, el intermediario precursor del disacárido sacarosa. La sacarosa es la forma principal de transporte de azúcares en las células vegetales, como lo es la glucosa en las células animales: al igual que la glucosa, que es transportada en la sangre de los animales, la sacarosa es exportada desde las hojas a través de los haces vasculares, proporcionando los carbohidratos requeridos por el resto de la planta. La mayor parte del gliceraldehído 3-fosfato que permanece en el cloroplasto es transformado en almidón en el estroma. Al igual que el glucógeno en las célu las animales, el almidón es un gran polímero de glucosa que se utiliza como re serva de carbohidratos. La producción de almidón está regulada de tal manera que se produce y almacena en grandes granos en el estroma del cloroplasto (véa se Figura 14-38B) durante períodos de exceso de capacidad fotosintética. Esto sucede a través de reacciones que se producen en el estroma, inversas de las que tienen lugar en la glucolisis: transforman el gliceraldehído 3-fosfato en glucosa 1-fosfato, que entonces se utiliza para producir el azúcar-nucleótido ADP-glucosa, el precursor inmediato del almidón. Durante la noche, el almidón es hidrolizado para proveer de energía a las necesidades metabólicas de la planta.
En algunas plantas, la fijación del carbono está compartimentada para facilitar el crecimiento a concentraciones bajas de C 0 230 Aunque la ribulosa bisfosfato carboxilasa añade preferentemente una molécula de C 0 2 a la ribulosa 1,5-bisfosfato, puede tam bién utilizar 0 2 además de C 0 2, y si la concentración de C 0 2 es baja, añadirá 0 2. Éste es el primer paso de una vía lla mada fotorrespiración, cuyo efecto es consumir 0 2 y liberar C 0 2 sin la produc ción de alm acenes de energía útil. En muchas plantas, aproximadamente una tercera parte del C 0 2 fijado se pierde de nuevo como resultado de la fotorrespi ración. La fotorrespiración resulta dominante en condiciones secas y calurosas en las que las plantas se ven forzadas a cerrar sus estomas (los poros de intercam bio gaseoso de su hojas) con el fin de evitar un pérdida excesiva de agua. Esto provoca una caída extraordinaria de los niveles de C 0 2 en la hoja, favoreciendo la fotorrespiración. No obstante, en las hojas de muchas plantas que viven en am bientes cálidos y secos, com o ocurre con los cereales y con la caña de azúcar, tiene lugar una adaptación especial. En estas plantas, el ciclo de fijación del car bono mostrado en la Figura 14-44 tiene lugar sólo en los cloroplastos de las célu las túnico-vasculares, que contienen toda la ribulosa bisfosfato carboxilasa de la planta. Estas células están protegidas del aire y rodeadas por una capa especiali zada de células del mesófilo que “bom bean” C 0 2 hacia las células túnico-vascu lares, abasteciendo a la ribulosa bisfosfato carboxilasa con una alta concentra ción de C 0 2, que disminuye en gran medida la fotorrespiración. La bom ba de C 0 2 es un ciclo de reacciones que empieza con un paso espe cial de fijación del C 0 2, catalizado en el citosol de las células del mesófilo por
736
Capítulo 14: Conversión energética: mitocondrias y cloroplastos
HOJAS C3
cloroplasto
HOJAS C4
epiderm is
células del m esófilo
haz vascular
haz vascular
estoma células del m esófilo
células túnico-vasculares
células túnico-vasculares
estoma
epiderm is
cloroplasto
Figura 14-45 Comparación de la anatomía de la hoja de una planta C3 y de una planta C4. Las células dibujadas en co lo r verde contienen cloroplastos que llevan a cabo el ciclo normal de fijación del carbono. En las plantas C4, las células del mesófilo no fijan carbono sino que están especializadas en el bom beo de C 0 2, y generan una elevada relación C 0 2:0 2 en las células túnico-vasculares, que son las únicas células de estas plantas en las que tiene lugar el ciclo de fijación del carbono. Los haces vasculares transportan la sacarosa producida en la hoja hasta otros tejidos. ch
2
una enzima que une dióxido de carbono (en forma de bicarbonato) con alta afi nidad y lo com bina con una molécula activada de tres carbonos formando una molécula de cuatro carbonos. La molécula de cuatro carbonos difunde a las cé lulas túnico-vasculares, donde es transformado liberando el C 0 2 y generando una molécula de tres carbonos. El ciclo de bom beo se completa cuando este compuesto de tres carbonos vuelve a las células del mesófilo y es transformado en su forma original activada. Las plantas que fijan C 0 2 en las que el C 0 2 es ini cialmente capturado mediante su conversión en un compuesto que contiene cuatro carbonos, reciben el nombre de plantas C4. Todas las demás plantas reci ben el nombre de plantas C3 (Figura 14-45) porque capturan el C 0 2 directamen te en un compuesto de tres carbonos, el 3-fosfoglicerato. Como sucede en cualquier proceso de transporte vectorial, el bom beo de C 0 2 en las células túnico-vasculares de las plantas C4 cuesta energía. En los am bientes secos y calurosos, este coste es normalmente muy inferior a la pérdida por fotorrespiración de las plantas C3, por lo que las plantas C4tienen una venta ja potencial. Además, dado que las plantas C4 pueden realizar la fotosíntesis en el interior de las hojas a concentraciones de C 0 2 más bajas, necesitan abrir m e nos sus estomas y por lo tanto pueden fijar aproximadamente el doble de carbo no neto por unidad de agua perdida que las plantas C3.
La fotosíntesis depende de la fotoquímica de las moléculas de clorofila31 Habiendo estudiado las reacciones de fijación del carbono, vamos a retornar a la cuestión de cómo las reacciones fotosintéticas de transferencia de electrones ge neran el ATP y el NADH necesarios para impulsar la producción de los carbohi dratos en la planta a partir de C 0 2y H20 (véase Figura 14-42). La energía necesa ria deriva de la luz solar captada por las moléculas de clorofila (Figura 14-46). El proceso de conversión energética empieza cuando una molécula de clorofila es excitada por un cuanto de luz (un fotón) y un electrón se desplaza de un orbital molecular a otro de mayor energía. Esta molécula excitada es inestable y tiende a volver a su estado original no excitado por una de estas tres posibles vías: ( 1) mediante la conversión de la energía extra en calor (movimientos moleculares) o por alguna com binación de calor y luz de una longitud de onda más larga (fluo rescencia), tal como ocurre cuando la energía lumínica es absorbida por una molécula aislada de clorofila en solución; (2) mediante la transferencia de ener gía -pero no del electrón- directamente a una molécula de clorofila vecina, por un proceso denominado transferencia de energía por resonancia ; o (3) mediante la transferencia del electrón de alta energía a otra molécula cercana (un aceptor de electrones) y retornando a su estado original tomando un electrón de baja
Cloroplastos y fotosíntesis
I
CH
/ \
CH3
ch
3
Figura 14-46 Estructura de la clorofila. Un átomo de magnesio está unido a un anillo de porfirina, que está relacionado con el anillo de porfirina que une hierro en el grupo hemo (comparar con la Figura 14-28). En los enlaces señalados en color, los electrones están deslocalizados.
737
m olécula excitada de clorofila
molécula excitada de luz clorofila
m olécula excitada de clorofila
aceptor reducido
m olécula vecina de clorofila
caíor
luz
<&U(, *
electrón EXCITACION
P O S IB L E S V ÍA S DE D E C A IM IE N T O
decaim iento por liberación de luz y de calor
decaim iento por 2 transferencia energética por resonancia
decaim iento por transferencias sucesivas de electrones
energía de alguna otra molécula (un dador de electrones, Figura 14-47). Los dos últimos mecanismos desempeñan un papel esencial en la fotosíntesis.
Un fotosistem a contiene un centro de reacción y un com plejo antena32 Ciertos complejos multiproteicos, llamados fotosistemas, catalizan la transfor mación de la energía lumínica capturada por moléculas excitadas de clorofila, en formas útiles de energía. Un fotosistema consiste en dos componentes estrecha mente unidos: un centro de reacción fotoquímico, que consiste en un complejo de proteínas y moléculas de clorofila que captan la energía solar convirtiéndola en energía química, y un complejo antena, que consiste en moléculas de pigmento que capturan la energía solar y la canalizan al centro de reacción. El complejo antena es importante para el aprovechamiento de la luz. En los cloroplastos, los com plejos antena consisten en agrupaciones de varios cientos de moléculas de clorofila unidas entre sí por proteínas que las fijan fuertemente sobre la mem brana tilacoidal. Según la planta de que se trate, en cada complejo tam bién existen cantidades variables de pigmentos accesorios, denominados carotenoides, que ayudan a captar la luz de otras longitudes de onda, y que tam bién se hallan localizados en cada complejo. Cuando una molécula de clorofila del complejo antena es excitada, la energía es rápidamente transferida desde una molécula a la otra, mediante transferencia energética por resonancia, hasta que alcanza un par especial de moléculas de clorofila en el centro fotoquímico de reacción. Por lo tanto cada complejo antena actúa a modo de “embudo”, que recoge la energía luminosa y la dirige hacia un único centro de reacción específi co que la puede utilizar con eficiencia (Figura 14-48).
• moléculas de clorofila en el com plejo proteico de la antena
ENTRADA DE LA ¡ MOLÉCULAA \ TRANSPORTANDO Ul ELECTRÓN DE "BAJA ENERGÍA" j
SALIDA DELA MOLÉCULA B TRANSPORTANDO UN ELECTRÓN DE "ALTA ENERGÍA" m em brana
"pa r especial" de m oléculas de clorofila del centro de reacción 738
com plejo proteínapigm ento del centro de reacción
Capítulo 14 : Conversión energética: mitocondrias y cloroplastos
Figura 14-47 Tres posibles vías que puede seguir una molécula excitada de clorofila para volver a su estado original, no excitado. Mediante el proceso 1 , la energía luminosa absorbida por una molécula de clorofila se libera com pletam ente en forma de luz y calor. Por el contrario, en la fotosíntesis las moléculas de clorofila siguen el proceso 2 en el complejo antena y el proceso 3 en el centro de reacción, com o se describe en el texto.
Figura 14-48 Un fotosistema consta de en un centro de reacción y una antena. Las moléculas A (dadores de electrones) y las moléculas B (aceptores de electrones) difieren de acuerdo con el fotosistema.
par especial de m oléculas de clorofila
Figura 14-49 Disposición de los transportadores de electrones en un centro de reacción fotosintético bacteriano, determinada por cristalografía de rayos X. Tal com o se indica en la figura, las moléculas de pigmento están colocadas en el interior de una proteína transm em brana y envueltas por la bicapa lipídica. Un electrón en el par especial es excitado por resonancia desde un com plejo antena clorofílico (proceso 2 en la Figura 14-47), y luego, el electrón excitado es transferido desde el par especial a la quinona (véase Figura 14-50).
El centro de reacción fotoquímico es un pigmento proteico transmem bra na que se halla en el corazón de la fotosíntesis. Se cree que se originó hace más de 3 mil millones de años en una bacteria fotosintética primitiva. El par especial de moléculas de clorofila del centro de reacción actúa como una trampa de cuantos de excitación porque su electrón excitado pasa inmediatamente a una cadena de aceptores de electrones que se hallan situados de forma precisa en el mismo complejo proteico (Figura 14-49). Mediante el rápido desplazamiento del electrón de alta energía lejos de las clorofilas, el centro de reacción lo transfiere a un ambiente donde es mucho más estable. Por consiguiente, el electrón es resta blecido convenientem ente para reacciones fotoquímicas posteriores que requie ren más tiempo para llevarse a cabo.
En un centro de reacción, la energía capturada por la clorofila genera un dador fuerte de electrones a partir de uno débil33 Las transferencias de electrones implicadas en las reacciones fotoquímicas des critas recientem ente han sido analizadas exhaustivamente mediante métodos espectroscópicos rápidos, especialmente en el fotosistema de la bacteria púrpu ra, que es más sencillo que el fotosistema evolutivamente emparentado de los cloroplastos. El centro de reacción bacteriano es un gran complejo pigmentoproteína que puede solubilizarse con detergentes y purificarse en forma activa. En 1985 se determinó su estructura tridimensional completa mediante cristalo grafía de rayos X (véanse Figura 10-33 y Figura 14-49). Su estructura, combinada con los datos cinéticos, proporciona la mejor representación de que se dispone de las reacciones iniciales de transferencia de electrones en que se basa la foto síntesis. En la Figura 14-50 se muestra un diagrama de la secuencia de transferencias que tienen lugar en el centro de reacción de la batería púrpura. Como esquema tizamos anteriormente (Figura 14-48), en un centro de reacción, la luz provoca la transferencia neta de un electrón desde un dador débil de electrones a una molécula que es un dador fuerte de electrones en su forma reducida. De esta manera la energía de excitación, que podría ser liberada en forma de fluorescen cia y/o de calor, es utilizada para aumentar la energía de un electrón y generar un dador fuerte de electrones donde no lo había antes. En esta bacteria el dador débil de electrones es un citocromo (recuadro naranja ), y el dador fuerte de electrones es una quinona (recuadro amarillo). Tal como veremos, en los cloro plastos de las plantas superiores, es el agua (en lugar de un citocromo) la que ac túa como dador inicial de electrones, por lo que en la fotosíntesis de las plantas se libera oxígeno.
Cloroplastos y fotosíntesis
739
Figura 14-50 Transferencia electrónica que tiene lugar en el centro de reacción fotoquímico de la bacteria púrpura. Se cree que en el fotosistema II de las plantas, relacionado evolutivamente tiene lugar una serie de reacciones similar a ésta. En la parte superior derecha de la figura se muestra un diagrama esquemático que indica las moléculas que transportan electrones, las cuales son las de la Figura 14-49 más una quinona intercam biable (QB) y una quinona librem ente móvil (Q) disuelta en la bicapa lipídica. Los transportadores de electrones del 1 al 5 se unen en una posición específica de una proteína transm embrana de 596 aminoácidos, formada por dos subunidades diferentes (véase Figura 10-33). Tras la excitación por un fotón de luz, un electrón de alta energía pasa de una molécula de pigmento a otra, generando una carga de separación tal com o se muestra debajo en los pasos de la secuencia de A hasta D, en la que la molécula de pigmento que transporta electrones de alta energía está indicada en co lor verde. La etapa E se desarrolla muy lentam ente. Una vez liberada en la bicapa, la quinona con dos electrones acepta dos protones y pierde su carga (véase Figura 14-31).
los electrones débiles del dado r rellenan el hueco
par especial de moléculas de clorofila
clorofila
intercam biable (Q b) quinona reducida que transporta dos electrones de alta energía
" ----- C " ----- ^ D "-------E A "------B 3 picosegundos <1 picosegundos 230 picosegundos 270 nanosegundos 100 m icrosegundos repetición de intercam bio de (3 x 10-12 segundos) los pasos desde la quinona en A hasta E el lugar Q b
En plantas y en cianobacterias, la fotofosforilación no cíclica produce NADPH y ATP31,34 En las plantas y en las cianobacterias la fotosíntesis produce directamente tanto ATP com o NADH mediante un proceso en dos pasos llamado fotofosforilación no cíclica. Dado que se utilizan dos fotosistemas en serie para dar energía a un electrón, este electrón puede ser transferido por toda la vía desde el agua hasta NADPH. Debido a que los electrones de alta energía pasan a través de fotosiste mas acoplados generando NADPH, parte de su energía es desviada para la sínte sis de ATP. En el primero de los dos fotosistemas -denom inado fotosistema II por razo nes históricas- los oxígenos de dos moléculas de agua se unen a un grupo de átomos de manganeso de una enzima hidrolítica, todavía poco estudiada, que posibilita que los electrones sean eliminados uno a uno rellenando los agujeros generados por la luz en el centro de reacción de las moléculas de clorofila. En cuanto los cuatro electrones de las dos moléculas de agua se han eliminado (lo que requiere cuatro quantos de luz), la enzima libera el 0 2. Así pues, el fotosiste m a II cataliza la reacción 2H20 + 4 fotones —>4H++ 4e~+ 0 2. El núcleo del centro de reacción del fotosistema II es homólogo al centro de reacción bacteriano descrito anteriormente, y también produce fuertes dadores de electrones en forma de moléculas de quinona reducida en la membrana. Las quinonas ceden sus electrones a una bom ba de protones llamada complejo b6-f que se parece notablemente al complejo b-Cj de la cadena respiratoria mitocondrial y a un complejo emparentado en las bacterias. Como en las mitocondrias, el complejo bom bea H+ al espacio tilacoidal a través de la membrana del tilacoide (o fuera del citosol a través de la membrana plasmática en cianobacterias), y el gradiente electroquímico resultante impulsa la síntesis de ATP por la ATP sintasa (Figuras 14-51 y 14-52). El aceptor final de electrones de esta cadena de transpor te electrónico es el segundo fotosistema {fotosistema I), que acepta el electrón del agujero dejado por la luz en el centro de reacción de su molécula de clorofila. Cada electrón que entra el fotosistema I es elevado a un nivel energético más alto, lo que le permitirá pasar al centro de hierro-azufre de la ferrodoxina e impulsar la reducción de NADP+ hasta NADPH; este último paso también implica la captura de un protón del medio (Figura 14-52).
740
Capítulo 14 : Conversión energética: mitocondrias y cloroplastos
Figura 14-51 Flujo de electrones que se produce en la membrana tilacoidal durante la fotosíntesis. Los
ESTROMA mem brana tilacoidal enzima que descom pone el agua 0 ~ + 4H+ ESPACIO TILACOIDAL fotosistem a II
plastocianina
complejo be-f
ferredoxina
fotosistem a I
gradiente electroquím ico de protones
NADP reductasa
El esquema de la fotosíntesis que se presenta en la Figura 14-52 se conoce como el esquema Z. Por medio de sus dos pasos de activación electrónica, catali zados cada uno por un fotosistema, un electrón es transferido desde el agua, que normalmente fija sus electrones muy fuertemente (potencial redox = +820 mV), hasta el NADPH, que normalmente fija sus electrones de forma más débil (po tencial redox = -3 2 0 mV). Un solo cuanto de luz visible no dispone de suficiente energía para activar un electrón desde la base del fotosistema II hasta el extremo superior del fotosistema I, la cual representa probablemente la variación de energía necesaria para transferir un electrón desde el agua hasta el NADP+. El uso de dos fotosistemas separados supone que queda suficiente cantidad de energía para que la cadena de transporte electrónico que une los dos fotosiste mas bom bee H+ a través de la membrana tilacoidal (o la membrana plasmática
fotosistema I
transportadores de electrones móviles de la cadena son la plastoquinona (que se parece a la ubiquinona de las mitocondria), la plastocianina (una pequeña proteína que contiene cobre) y la ferrodoxina (una pequeña proteína que contiene un centro de hierroazufre). El co m p lejo b 6- f e s muy similar al com plejo b-c, de la mitocondria y al complejo b -c de las bacterias (véase Figura 14-61): los tres com plejos aceptan electrones desde quinonas y bom bean protones. Obsérvese que tanto los H+liberados en la oxidación del agua como el H+captado durante la formación del NADPH, también contribuyen a la generación del gradiente electroquím ico de protones que impulsa la síntesis de ATP mediante una sintasa presente en esta misma m embrena (no se muestra).
Figura 14-52 Variaciones del potencial redox para el paso de electrones durante la fotosíntesis. El potencial redox de cada especie molecular se indica por su posición a lo largo del eje vertical. El fotosistema II es similar al centro de reacción de las bacterias púrpura. El fotosistema I es diferente: transfiere electrones desde su clorofila excitada a través de series de centros de reacción de hierro-azufre fuertemente unidos. El flujo neto de electrones a través de los dos fotosistemas unidos en serie va desde el agua hasta el NADP+, y produce NADPH y ATP, que se sintetiza por una ATP sintasa (no indicada aquí) que utiliza el gradiente electroquímico de protones producido por los tres lugares de actividad de protones que se resaltan en la Figura 14-51. Este esq u em a Z para la producción de ATP se denomina fo to fosforilación no cíclica, para distinguirlo del esquema cíclico que sólo utiliza el fotosistema I (véase texto).
Cloroplastos y fotosíntesis
741
de las cianobacterias), lo cual permite a la ATP sintasa aprovechar parte de la energía electrónica derivada de la luz para producir ATP.
MITOCONDRIA
Los cloroplastos pueden producir ATP por fotofosforilación cíclica sin generar NADPH31,35 En el esquema de fotofosforilación no cíclica que acabamos de mencionar, los electrones altamente energéticos que dejan el fotosistema II son utilizados para generar ATP y son transferidos al fotosistema I para impulsar la producción de NADPH. Esto produce un poco más de una molécula de ATP por cada par de elec trones que pasan del agua hasta el NADP+ generando una molécula de NADPH. Pero para la fijación del carbono se necesita 1,5 moléculas de ATP por NADPH (véase Figura 14-44). Para producir más ATP, en algunas especies los cloroplas tos pueden utilizar el fotosistema I de un modo cíclico, de forma que se produz ca ATP en lugar de NADPH. En este proceso, llamado fotofosforilación cíclica, los electrones de alta energía del fotosistema I son transferidos de nuevo al comple jo b6-f en lugar de ser transferidos al NADP+, y el electrón con una energía infe rior es entonces reciclado hacia el fotosistema I. El único resultado neto, al igual que la conversión de una parte de la energía lumínica en calor, es que el H+ es bombeado a través de la mem brana tilacoidal mediante el complejo b6-f aumen tando el gradiente electroquímico de protones que impulsa la ATP sintasa. En resumen, la fotofosforilación cíclica implica sólo el fotosistema I, que produce ATP sin la formación de NADPH ni de 0 2. De esta manera, las activida des relativas de los flujos cíclicos y no cíclicos de electrones pueden determinar cuánta energía lumínica se transforma en poder reductor (NADPH) y cuánta en enlaces fosfato de alta energía (ATP).
matriz estroma
membrana interna
membrana externa
membrana tilacoidal CLOROPLASTO
El gradiente electroquímico de protones es similar en las mitocondrias y los cloroplastos36 La presencia del espacio tilacoidal divide el cloroplasto en tres compartimientos internos, en lugar de dos como ocurre en la mitocondria. En cualquier caso, el efecto neto de la translocación de H+en los dos orgánulos es similar. En la Figura 14-53 se ilustra cómo se bom bea el H+ desde el estroma (pH 8) hasta el espacio tilacoidal en los cloroplastos (pH aproximadamente 5), creando un gradiente de 3 a 3,5 unidades de pH. Esto representa una fuerza protón-motriz de aproxima damente 200 mV a través de la m em brana tilacoidal (la mayor parte del cual es debida al gradiente de pH más que al potencial de membrana), que impulsa la síntesis de ATP mediante la ATP sintasa integrada en esta membrana. Como el estroma, la matriz mitocondrial tiene un pH de aproximadamente 8, pero en este caso está generado por el bom beo de protones de la mitocondria hacia el citosol (pH de aproximadamente 7), en lugar de hacia un espacio inte rior del orgánulo. Así, el gradiente de pH es relativamente pequeño, y la mayoría de la fuerza protón-motriz a través de la mem brana mitocondrial interna, que es aproximadamente la misma que la de la membrana tilacoidal del cloroplasto, está generada por el potencial de mem brana resultante. En cualquier caso, tanto para las mitocondrias como para los cloroplastos, el lugar catalítico de la ATP sintasa se encuentra a un pH de aproximadamente 8 y se localiza en un gran compartimiento del orgánulo (matriz o estroma) donde se incluyen enzimas so lubles. Consecuentemente, es allí donde se produce todo el ATP del orgánulo (Figura 14-53). Aunque hay muchas similitudes entre las mitocondrias y los cloroplastos, la estructura de los cloroplastos hace que el estudio de sus procesos de transporte de electrones y protones sea más fácil: a través de la rotura de las membranas in terna y externa de un cloroplasto, los discos tilacoidales aislados pueden obte nerse intactos. Estos tilacoides se parecen a las partículas submitocondriales que contienen una m em brana en la que la cadena de transporte de electrones tiene sus lugares de utilización para el NADP+, ADP, y fosfato libremente accesi-
742
Capítulo 14 : Conversión energética: mitocondrias y cloroplastos
Figura 14-53 Comparación de los flujos de protones y de la orientación de la ATP sintasa que se presentan en las mitocondrias y en los cloroplastos. Los com p artim ien to s que tien en un pH sim ilar se rep resentan en el m ism o color. La fuerza p rotó n -m o triz a través de la m em b ran a tilacoid al con siste m ayoritariam ente en un gradiente de pH; la alta perm eabilid ad de esta m em bran a al Mg2+ y a los iones CL perm ite que el flujo de estos iones disipe la m ayoría del p o ten cial de m em brana. P robablem en te, las m itocon d rias no pu ed en tolerar un pH de 10 en su m atriz, y por ello requ ieren generar fuerzas p ro tó n -m o trices sin que exista p o ten cial de m em brana.
bles al exterior. Pero los tilacoides aislados mantienen su estructura nativa intac ta y son mucho más activos que las partículas submitocondriales aisladas. Por esta razón varios de los experimentos que en un principio demostraron el papel central de los mecanismos quimiosmóticos se realizaron con cloroplastos y no con mitocondrias.
Como la membrana mitocondrial interna, la membrana interna del cloroplasto contiene proteínas transportadoras que facilitan el intercambio de metabolitos con el citosol37 Si los cloroplastos se aíslan de manera que se dejan intactas sus membranas in ternas, se puede demostrar que esta membrana tiene una permeabilidad selecti va, reflejando la presencia de proteínas transportadoras específicas. Además, la mayor parte del gliceraldehído 3-fosfato producido por la fijación de C 0 2 en el estroma del cloroplasto es transportado fuera del cloroplasto por un eficiente sistema antiporte que intercambia azúcares-fosfato de 3 átomos de carbono por fosfato inorgánico. Normalmente, el gliceraldehído 3-fosfato suministra al citosol una abun dante fuente de carbohidratos que es utilizada por la célula como punto de partida de otros muchos procesos de biosíntesis -incluyendo la producción de sacarosa para su exportación. Pero su utilidad no term ina aquí. Cuando el gli ceraldehído 3-fosfato llega al citosol, es rápidamente transformado (mediante parte de la vía glucolítica) de nuevo en 3-fosfoglicerato, generando una m olé cula de ATP y otra de NADH. (Una reacción de dos pasos en sentido inverso, muy similar, que forma el gliceraldehído 3-fosfato en el ciclo de fijación del carbono -véase la Figura 14-44.) Por consiguiente, la exportación de gliceralde hído 3-fosfato del cloroplasto suministra al resto de la célula, no sólo la princi pal fuente de carbono fijado sino tam bién el poder reductor y el ATP necesa rios para el m etabolism o fuera del cloroplasto.
Los cloroplastos llevan a cabo otros procesos biosintéticos Además de la fotosíntesis, el cloroplasto también realiza otros procesos biosinté ticos. Todos los ácidos grasos de la célula y un número determinado de amino ácidos, por ejemplo, están sintetizados por enzimas del estroma del cloroplasto. En el cloroplasto, el poder reductor de los electrones activados por la luz impulsa la reducción de los nitritos (NO2) a amoníaco (NH3); este amoníaco proporciona a la planta el nitrógeno necesario para la síntesis de aminoácidos y de nucleótidos. Por consiguiente, la importancia metabòlica del cloroplasto para las plantas y las algas es mucho más amplia que su papel en el proceso de la fotosíntesis.
Resumen Los cloroplastos y las bacterias fotosintéticas obtienen los electrones d e alta energía p o r m edio d e fotosistem as q u e capturan los electrones excitados cuando la luz solar es absorbida p o r las m oléculas d e clorofila. Los fotosistem as están com puestos p o r u n com plejo antena unido a un centro d e reacción fotoquím ico, q u e es precisam en te un com plejo ordenado d e proteínas y pigm entos en donde tiene luga r la fo to qu í m ica d e la fotosíntesis. El m ejor centro d e reacción fotoquím ica conocido es, con d i feren cia , el d e la bacteria p ú rp u ra fotosintética, d el q u e se conoce la estructura tridim ensional com pleta. M ientras qu e estas bacterias sólo contienen un único fo tosistema, en cloroplastos y cianobacterias existen dos tipos d e fotosistem as. Los dos fotosistem as están norm alm ente ligados en serie y transfieren los electrones desde el agua hasta el NADP+form an d o NADPH, con la producción concom itante d e un gradiente electroquím ico transm em brana; el oxígeno m olecular (O J se g en e ra com o producto secundario. E n com paración con las m itocondrias, los cloroplastos tienen una m em brana a dicional (la m em brana tilacoidal) y un espacio interno (el espacio tilacoidal). To
Cloroplastos y fotosíntesis
743
dos los procesos d e transporte electrónico tienen lu ga r en la m em brana tilacoidal: p a ra p ro d u cir ATP, el protón es bom beado hacia el espacio tilacoidal; un flu jo in verso d e protones a través d e una ATP sintasa p rod uce el ATP en el estrom a d el clo roplasto. Este ATP se utiliza en conjunción con el NADPH producido en la fotosínte sis p a ra im pulsar un gra n núm ero d e reacciones biosintéticas en el estrom a d el cloroplasto, incluyendo el im portante ciclo d e fija ció n d el carbono, q u e gen era ca r bohidratos a p a rtir d e COr Junto con otros productos d el cloroplasto, este carbohi drato se exporta a l citosol d e la célula, d on de -e n fo rm a d e gliceraldehído 3-fo sfa to - p roporcionan carbono orgánico, ATP, y p o d er redu cto r al resto d e la célula.
Evolución de las cadenas de transporte de electrones38 Mucho de lo que se conoce sobre la estructura, función y evolución de las célu las y organismos puede relacionarse con sus necesidades energéticas. Hemos visto que los m ecanism os fundamentales para utilizar energía de fuentes tan dispares como la luz y la oxidación de la glucosa son los mismos. Aparentemen te un método efectivo para sintetizar ATP surgió en una evolución temprana y desde entonces ha sido conservado con sólo pequeñas variaciones. ¿Cómo sur gieron los primeros com ponentes individuales cruciales tales como la ATP sin tasa, las bom bas protónicas generadoras de poder reductor y los fotosistemas? Las hipótesis sobre acontecim ientos que sucedieron en una escala temporal evolutiva son difíciles de probar. Pero disponemos de pistas, tanto respecto a las muy diferentes cadenas de transporte electrónico primitivas que sobreviven ac tualmente en algunas bacterias como respecto a evidencias geológicas en rela ción al am biente de la Tierra de hace miles de millones de años.
Probablemente las células más primitivas producían ATP mediante fermentación39 Como explicamos en el Capítulo 1, se cree que las primeras células vivas apare cieron hace más de 3,5 x 109 años, cuando la Tierra no tenía más de 109 años. Probablem ente las vías metabólicas más primitivas que producían ATP se pare cían a las actuales formas de ferm entación debido a la falta de oxígeno en el am biente y a la presencia de moléculas orgánicas producidas geoquímicamente. En el proceso de la ferm entación el ATP se produce mediante un proceso de fosforilación que utiliza la energía liberada cuando una molécula orgánica rica en hidrógeno, tal como la glucosa, se oxida parcialmente (véase Figura 2-14). Al no disponer de oxígeno com o aceptor, los electrones que provienen de las m olé culas orgánicas oxidadas tienen que ser transferidos (vía NADH o NADPH) a una molécula orgánica diferente (o a una parte diferente de la misma molécula), que consecuentem ente se reduce. Al final del proceso fermentativo, una (o varias) de las moléculas orgánicas producidas se excretan al medio como productos metabólicos residuales; otros, tales como el piruvato, son retenidos por la célula para la biosíntesis. Los productos excretados son distintos en diferentes organismos, pero tien den a ser ácidos orgánicos (compuestos carbonados con un grupo COOH). En las células bacterianas los más importantes son el ácido láctico (que también se acumula en la glucolisis anaeróbica en los mamíferos) y ácidos como el fórmico, el acético, el propiónico, el butírico y el succínico. En la Figura 14-54 se ilustran dos vías fermentativas de las bacterias actuales.
La evolución de la cadena de transporte electrónico conservadora de energía capacitó a las bacterias anaeróbicas para utilizar compuestos orgánicos no fermentables como fuente de energía40 Los procesos de ferm entación primitivos no sólo habrían generado el ATP sino tam bién el poder reductor (en forma de NADH o de NADPH) necesarios para la 744
Capítulo 14: Conversión energética: mitocondrias y cloroplastos
(A) FERMENTACIÓN QUE PRODUCE LA EXCRECIÓN DE ÁCIDO LÁCTICO ^glucosa)
(B) FERMENTACIÓN QUE PRODUCE LA EXCRECIÓN DE ÁCIDO SUCCÍNICO <^glucosa)
2NAD+ H:
piruvato
T
ácido succínico
co 2
Figura 14-54 Dos tipos de procesos de ferm entación. Los productos finales se d estacan en recuadros de color verde. En am b o s caso s se utilizan dos m olécu las de NAD+ por cada m olécu la de glu cosa que sufre la glucolisis y éstas son regeneradas m ed iante la tran sferen cia de iones hidruro desde el NADH. En (A) los iones hidruro son transferidos hasta el piruvato, p rod ucien do dos m olécu las de ácid o láctico que es excretad o. En (B) los dos io n es hidruros se transfieren su cesivam en te desde dos m olécu las de NADH hasta com p u esto s derivados del piruvato, prod uciendo ácido su ccín ico . Por cad a m o lécu la de ácido su ccín ico excretad a, se guarda un a m olécu la de piruvato {rojo) para p rocesos de b io sín tesis en el interior celular. T an to en (A) com o en (B) se ha de excretar un ácid o orgánico para pod er volver a sin tetizar NAD+y p erm itir q ue la glucolisis co n tin ú e en au sen cia de oxígeno.
biosíntesis esencial, y probablemente algunas de las principales vías metabólicas evolucionaron mientras la fermentación era la única forma de producción de energía. Sin embargo, con el tiempo, las actividades m etabólicas de esos or ganismos procariotas cambiaron el medio ambiente circundante, forzando a los organismos a desarrollar nuevas vías bioquímicas. La acumulación de productos residuales de fermentación, por ejemplo, pudo provocar la siguiente serie de cambios:
Estadio 1. La excreción continua de ácidos orgánicos disminuyó el pH del m e dio ambiente, favoreciendo la evolución de proteínas que actuaban como bom bas transmembrana de H+que bom beaban H+hacia el ex terior de la célula con el objetivo de protegerla de los efectos peligro sos de la acidificación intracelular. Una de esas bombas pudo haber utilizado la energía procedente de la hidrólisis del ATP y así mismo pudo haber sido la antecesora de la ATP sintasa actual. Estadio 2. Al mismo tiempo que los ácidos orgánicos no fermentables se acu mulaban en el medio ambiente y favorecían la evolución de una bom ba de H+ consumidora de ATP, el aporte de nutrientes fermen tables de origen geoquímico, que suministraba la energía a las bom bas y a otros procesos celulares, fue disminuyendo. Ello favoreció a las bacterias que podían excretar H+ sin hidrolizar ATP, lo que les permitía conservar el ATP para otras actividades celulares. De este tipo de presiones selectivas pudieron haber surgido las primeras proteínas unidas a membrana que utilizaron el transporte de elec trones entre moléculas de diferente potencial redox como fuente de energía para transportar H+ a través de la membrana plasmática. Al gunas de esas proteínas debieron encontrar sus dadores y aceptores de electrones entre los ácidos orgánicos no fermentables que acu mulaban. Muchas de esas proteínas transportadoras de electrones se encuentran en las bacterias actuales: por ejemplo, algunas bacte rias que crecen en ácido fórmico bom bean H+utilizando una peque ña cantidad de energía redox derivada de la transferencia de electro-
Evolución de las cadenas de transporte de electrones
745
ácido fórmico gradiente electroquím ico EXTERIOR de protones CELULAR
H-COOH
2 H+ + CO.i
f^ r x
CITOSOL
nes desde el ácido fórmico al fumarato (Figura 14-55). Otras tienen com ponentes transportadores de electrones similares dedicados so lamente a la oxidación y reducción de substratos inorgánicos (véase Figura 14-57, por ejemplo). Estadio 3. A la larga, algunas bacterias desarrollaron sistemas de transporte electrónico que bom beaban H+, que fueron suficientemente eficien tes para obtener más energía redox de la que necesitaban para m an tener su pH interno. Ahora bien, las bacterias que disponían de los dos tipos de bom bas de H+ presentaban una ventaja. En esas células un gran gradiente electroquímico de protones generado por un ex cesivo bom beo de H+permitía el retorno de los protones a la célula a través de bom bas de H+ impulsadas por ATP, haciéndolas actuar al revés, ya que funcionaban como ATP sintasas produciendo ATP. De bido a que estas bacterias requerían cada vez menos aporte de nu trientes fermentables, proliferaron a expensas de sus vecinos.
Figura 1 4 -5 5 La oxidación del ácido fórmico de algunas bacterias actuales. En tales b acterias anaerób icas, incluyendo E. coli, la oxid ación de ácido fórm ico está m ediada por una cad ena de transporte de electron es conservad ora de energía, de la m em b ran a celular. Tal com o se indica en la figura, los reactivos de este proceso son ácido fórm ico y fum arato y los productos, su ccin ato y C 0 2. N ótese que los H+se generan fuera de la célula y se utilizan d entro de la célula, lo cual equivale a b o m b ear H+ hacia el exterior celular. Así pués, este sistem a de transporte de electro n es ligado a m em b ran a puede gen erar un gradiente electro qu ím ico de protones a través de la m em brana. El potencial redox del par ácido fó rm ic o -C 0 2 es de - 4 2 0 mV, m ientras que el del par fu m arato-su ccin ato es de +30 mV.
H+
En la Figura 14-56 se resumen estos tres estadios hipotéticos en la evolución de los m ecanism os de la fosforilación oxidativa.
Las bacterias fotosintéticas, suministrando una fuente inagotable de poder reductor, superaron el mayor obstáculo de la evolución de las células41 Las etapas evolutivas que hemos mencionado habrían resuelto el problema de m antener un pH intracelular neutro y una fuente abundante de energía, pero habrían dejado sin solución otro problema también muy grave. La disminución de la cantidad de nutrientes orgánicos fermentables significaba que se debía en contrar una fuente de carbono alternativa, para producir los azúcares que se uti lizaban como precursores de otras muchas moléculas de la célula. El dióxido de carbono de la atmósfera constituía una abundante fuente potencial de carbono. Sin embargo, la conversión de dióxido de carbono en una molécula orgánica, como por ejemplo un carbohidrato, requiere que el dióxido de carbono fijado sea reducido por un fuerte dador electrónico, como el NADH o el NADPH, capaz de suministrar los dos electrones necesarios para generar una unidad de (CH20 ) a partir de cada C 0 2 (véase Figura 14-44). En las primeras etapas de la evolución celular debieron abundar agentes reductores fuertes como éstos, procedentes de los procesos de fermentación. Pero a medida que el aporte de nutrientes fer mentables disminuía, y empezó a actuar una ATP sintasa unida a membrana produciendo la mayor parte del ATP de las células, tam bién debió empezar a disminuir el aporte abundante de NADH y de otros agentes reductores. Por ello, resultó imprescindible que las células desarrollaran un nuevo sistema de gene rar una fuente de poder reductor. 746
Capítulo 14 : Conversión energética: mitocondrias y cloroplastos
ESTADIO 2 H+
H+
H+
ESTADIO 3 Figura 14-56 Evolución de los m ecanism os de fosforilación oxidativa. Se m u estra una posible secu en cia.
poder reductor formado aquí debido al flujo inverso de electrones impulsado por el gradiente de H+
Figura 14-57 Algunas de las vías del transporte de electrones de las bacterias actuales. Estas vías generan
gradiente de H+ formado por el bombeo de H+ hacia el exterior de la célula durante la transferencia de electrones
EXTERIOR CELULAR
CITOSOL
citocromo
NADP
O o NO 2
m ó v il
NADH (NADPH) deshidrogenasa
complejo de tipo b-c
3
complejo de tipo citocromo oxidasa
Probablemente, los principales dadores disponibles de electrones fueron los ácidos orgánicos producidos por el metabolismo anaeróbico de los carbohidra tos, algunas moléculas inorgánicas como el sulfuro de hidrógeno (H2S) generadas geoquímicamente, y el agua. Sin embargo, el poder reductor de estas moléculas resulta demasiado débil para poder ser utilizado en la fijación del dióxido de car bono. Probablemente, la utilización de un gradiente electroquímico de electro nes a través de la membrana plasmática para impulsar un flujo inverso de elec trones, generó un suministro temprano de dadores fuertes de electrones. Este proceso requirió la evolución de complejos enzimáticos unidos a membrana se m ejantes a la NADH deshidrogenasa; mecanismos de este tipo sobreviven toda vía en el metabolismo anaeróbico de algunas bacterias actuales (Figura 14-57). El principal avance en el metabolismo energético fue, sin embargo, el desarrollo de centros de reacción fotoquímicos que pueden utilizar energía solar para pro ducir directamente moléculas como el NADH. Se cree que esto sucedió hace más de 3 x 109 años en los organismos ancestrales de las bacterias verdes del azufre. Actualmente, las bacterias verdes del azufre utilizan energía luminosa para transferir átomos de hidrógeno (como un electrón más un protón) desde el H2S al NADPH; de esta forma, se crea el fuerte poder reductor necesario para la fijación de carbono (Figura 14-58). Como los electrones eliminados del H2S se hallan a un potencial redox más negativo que los del H20 (-230 mV comparados a +820 mV del H20 ), un cuanto de luz absorbida por el único fotosistema de esas bacterias es suficiente para conseguir un potencial redox suficientemente alto para generar NADPH a través de una cadena de transporte de electrones fotosintética relativamente sencilla.
NADP reductasa
-400
CËD-
\
H* 4 'J AL.----d H-— ___¡BSHi58l3i$8s£eB@í T O » !? ? !
-300
-200
todo el ATP y el pod er red uctor celu lar a partir de la oxid ación de m olécu las inorgánicas tales com o hierro, am on io, nitritos y com p u esto s de azufre. Tal com o se indica, algunas esp ecies pueden cre ce r de form a an aeró b ica utilizando nitratos com o acep tor final de electron es en lugar de oxígeno. La m ayoría de estas b acterias utilizan el ciclo de fijació n del carb o n o y sin tetizan sus m olécu las org ánicas a partir de dióxido de carb on o . El flujo de electron es h ace que se b o m b een protones h acia el exterior de la célula, y el gradiente de p rotones resultante dirige la p rod u cción de ATP m ed iante un a ATP sin tasa (no m ostrad a aquí). Adem ás, el NADPH n ecesario para la fijació n del carb o n o se produce m ed iante un flujo inverso de electron es que es tam b ién im pulsado por el gradiente de H+, com o se indica.
Figura 14-58 Flujo general de electrones en una forma relativamente primitiva de fotosíntesis observada en bacterias verdes del azufre actuales. El foto sistem a de un a b acteria verde se parece al foto sistem a I de las plantas y de las cian ob acterias en que utiliza series de cen tro s de hierro-azu fre com o acep tores prim arios de electro n es, los cuales ced en finalm ente sus electron es de alta energía a la ferrodoxina (Fd).
S + 2 H+ dirección del flujo de electrones Evolución de las cadenas de transporte de electrones
747
Las cadenas de transporte electrónico de los complejos fotosintéticos de las cianobacterias produjeron oxígeno atmosférico y permitieron nuevas formas de vida42 Parece ser que el siguiente paso que se produjo con el desarrollo de las cianobacte rias hace unos 3 x 109 años consistió en la evolución de organismos capaces de uti lizar agua como fuente de electrones para reducir el C 0 2. Esto permitió la evolu ción de una enzima hidrolizadora de la molécula del agua y también requirió un segundo fotosistema que actuara en serie con el primero haciendo de puente por encima de la enorme diferencia de potencial redox existente entre el H20 y el NADPH. Las homologías estructurales que existen entre fotosistemas actuales su gieren que este cambio implicó la cooperación de un fotosistema derivado de las bacterias verdes (fotosistema I) con un fotosistema derivado de las bacterias púr puras (fotosistema II). Las consecuencias biológicas de este paso evolutivo se m a nifestaron hace mucho tiempo. Al principio, había organismos cuyas demandas químicas a su medio ambiente eran mínimas, por lo que se extendían y evolucio naban por vías que las bacterias fotosintéticas primitivas, que necesitaban H2S o ácidos orgánicos como fuentes de electrones, no podían seguir. Consecuentemen te se acumulaban grandes cantidades de materiales orgánicos reducidos, sintetiza dos biológicamente. Además, el oxígeno por primera vez entró en la atmósfera. El oxígeno es altam ente tóxico porque las reacciones de oxidación que cata liza pueden alterar al azar moléculas biológicas. Por ejemplo, muchas bacterias anaeróbicas actuales mueren rápidamente cuando son expuestas al aire. Por lo tanto, los organismos de la Tierra primitiva tuvieron que desarrollar m ecanis mos de protección contra el increm ento de los niveles de 0 2 en el ambiente. Los recién llegados evolutivamente, como nosotros mismos, presentan numerosos m ecanism os de destoxificación que protegen las enzimas de los efectos adversos del oxígeno. El increm ento de los niveles del oxígeno atmosférico fue inicialmente muy lento y permitió una evolución gradual de medidas protectoras. Los mares pri mitivos tenían grandes cantidades de hierro ferroso (Fe [II]), y casi todo el oxíge no producido por las bacterias fotosintéticas primitivas fue utilizado en transfor mar el Fe(II) en Fe(III). Esta conversión causó la precipitación de enormes cantidades de óxidos férricos. Los extensos acúmulos de hierro, que nacieron hace aproximadamente 2,7 x 109 años, permiten datar el incremento evolutivo de las cianobacterias. Hace aproximadamente 2 x 109 años, el suministro de hie rro ferroso se agotó, y cesó la deposición de precipitaciones de hierro. Las evi dencias geológicas sugieren que entonces empezaron a aumentar los niveles de oxígeno en la atmósfera, alcanzando los niveles actuales hace entre 0,5 y 1,5 x 109años (Figura 14-59).
Figura 14-59 Relación entre las variaciones de los niveles atmosféricos de oxígeno y algunos de los principales estadios que se debieron producir durante la evolución de los organismos vivos sobre la Tierra. Tal com o se indica en la figura, existen evidencias geológicas que sugieren que hubo más de mil millones de años de intervalo entre la aparición de las cianobacterias (las cuales, según se cree, fueron los primeros organismos que liberaron oxígeno) y el momento en que el oxígeno se empezó a acumular en las atmósfera en grandes cantidades. Este retraso fue debido principalmente a las grandes cantidades de hierro ferroso disuelto en los océanos, que reaccionó con el oxígeno liberado formando enormes depósitos de óxidos de hierro.
NIVELES DE OXÍGENO EN LA ATMÓSFERA
(%)
TIEMPO (MILES DE MILLONES DE AÑOS)
10
formación de los océanos y de los continentes formación de la Tierra
actualmente primeras primeros procesos células fotosintéticos que liberaron O2 del agua vivas primeras células fotosintéticas
748
Capítulo 14 : Conversión energética: mitocondrias y cloroplastos
origen de las células primeros fotosintéticas vertebrados eucariotas la respiración aeròbica primeras plantas y se generaliza animales multicelulares
CLOROPLASTOS DE PLANTAS Y DE ALGAS
MTOCONDRA
V E R D ES
EUCARIOTAS PROCARIOTAS
f cianobacterias
\ bacterias deslizantes
1
J
V
A 1
pérdida de la fotosíntesis í
ATMÓSFERA OXIDANTE ATMÓSFERA REDUCTORA
pérdida de la fotosíntesis bacterias verdes filamentosas
bacterias púrpuras no sulfúricas
respiración O2
respiración O2
bacterias púrpuras sulfúricas
fotosíntesis H20 ciclo fijador del carbono
f
\ bacterias verdes sulfúricas
V
J
fotosíntesis H2S bacterias termentadoras ancestrales
La disponibilidad de oxígeno hizo posible el desarrollo de bacterias que de pendían del metabolismo aeróbico para producir ATP. Como hemos explicado anteriormente, estos organismos pudieron utilizar la gran cantidad de energía li berada en la degradación de carbohidratos y de otras moléculas orgánicas redu cidas hasta C 0 2y H20 . Los componentes de los complejos de transporte electró nico preexistentes fueron modificados, generándose una citocromo oxidasa, de forma que los electrones obtenidos a partir de substratos orgánicos e inorgáni cos pudieron ser transportados hasta el 0 2, como aceptor final de electrones. Muchas bacterias púrpura fotosintéticas actuales pueden alternar entre la foto síntesis y la respiración, dependiendo de la disponibilidad de luz y de oxígeno, mediante sorprendentes reorganizaciones secundarias en sus cadenas de trans porte de electrones. Como resultado de la fotosíntesis se acumularon materiales orgánicos en la Tierra, lo que provocó que algunas bacterias fotosintéticas (incluyendo las pre cursoras de E. coli) perdieran su capacidad de sobrevivir sólo de la energía de la luz y se volvieran enteram ente dependientes de la respiración. Se cree que las primeras mitocondrias surgieron hace 1,5 x 109 años, cuando estas bacterias de pendientes de la respiración se transformaron en endosimbiontes de células pri mitivas eucariotas. Posteriormente, los descendientes de estas células eucariotas aeróbicas primitivas endocitaron una bacteria fotosintética que se convirtió en el precursor de los cloroplastos; no obstante, los cloroplastos actuales proceden tes de diferentes tipos de algas son suficientemente distintos entre sí como para sugerir que evolucionaron separadamente en diferentes linajes. La Figura 14-60 esboza algunas de estas vías evolutivas. La evolución siempre es conservativa utilizando partes antiguas y constru yendo sobre ellas nuevos procesos. Por ello, probablemente todavía sobreviven,
Evolución de las cadenas de transporte de electrones
Figura 14-60 Arbol filogenético de la probable evolución de las m itocondrias y los cloroplastos y de sus ancestros bacterianos. Parece que la respiración de oxígeno com enzó su desarrollo hace 2 x 109 años; tal como se indica, parece ser que evolucionó independientemente en las líneas verde, púrpura y azul-verdosas (cianobacterias) de bacterias fotosintéticas. Se cree que una bacteria púrpura aeróbica que debió de perder su capacidad para realizar fotosíntesis, dio lugar a las mitocondrias, mientras que algunas bacterias azul-verdosas diferentes dieron lugar a los cloroplastos. Análisis detallados de secuencias de nucleótidos sugieren que las mitocondrias surgieron de bacterias parecidas a las rizobacterias, las agrobacterias y a las rickettsias -tres especies estrechamente relacionadas que generan asociaciones íntimas con las células eucariotas actuales.
749
Figura 14-61 Comparación de los tres tipos de cadenas transportadoras de electrones, que se discuten en este capítulo. Las bacterias, los cloroplastos y las mitocondrias contienen un com plejo enzimàtico unido a membrana que es muy sem ejante al com plejo b-c, de las mitocondrias. Estos com plejos captan electrones del transportador quinona (designado como Q) y bom bean H+a través de sus respectivas membranas. Además, en sistemas in vitro reconstituidos, los diferentes complejos pueden substituirse uno por otro y las secuencias de aminoácidos de sus com ponentes proteicos indican que están relacionados evolutivamente.
CLOROPLASTOS VEGETALES Y CIANOBACTERIAS
EB23
lNAp,l
NADH deshidrogenasa
MITOCONDRIA
02
H20
aunque en forma alterada, en los eucariotas superiores actuales partes de la ca dena de transporte electrónico de las bacterias anaeróbicas de hace más de tres a cuatro mil millones de años. Por ejemplo, existe una notable homología en cuanto a estructura y función entre un complejo enzimàtico que bombea proto nes en el segmento central de la cadena respiratoria mitocondrial (el complejo b-Cj) y los segmentos correspondientes de las cadenas de transporte electrónico de las bacterias y de los cloroplastos actuales (Figura 14-61).
Resumen Al parecer, las células primitivas fueron organismos parecidos a las bacterias ac tuales, que vivían en un medio rico en moléculas orgánicas altamente reducidas, de origen geoquímico, en el transcurso de cientos de millones de años. Probablemente, estas células primitivas obtenían la mayor parte de su ATP mediante la transfor mación de estas moléculas orgánicas reducidas en diversos ácidos orgánicos, que eran excretados como productos de desecho. Así pues, estas fermentaciones acidifi caron el medio, lo cual pudo haber sido la causa de la evolución de las primeras bombas de H* unidas a membrana, que permitieron mantener un pH neutro en el interior de la célula. Las propiedades de las bacterias actuales sugieren que en este ambiente anaeróbico aparecieron una bomba de H* impulsada por el transporte electrónico y una bomba de H* impulsada por ATP. La inversión del sentido del funcionamiento de la bomba de H* impulsada por ATP pudo permitir que funcio nase como una ATP sintasa. Al desarrollarse cadenas de transporte electrónico más efectivas, se pudo utilizar para generar ATP la energía liberada por las reacciones
750
Capítulo 14 : Conversión energética: mitocondrias y cloroplastos
redox entre moléculas inorgánicas y/o la energía acumulada en compuestos nofermentables. La proliferación de bacterias que utilizaban moléculas orgánicas preformadas como fuente de carbono y de poder reductor, no pudo llegar muy lejos, ya que estas moléculas orgánicas eran generadas con una gran lentitud por los procesos geoquí micos. Por consiguiente, el agotamiento de los nutrientes orgánicos fermentables condicionó probablemente la evolución de las bacterias fotosintéticas, que podían utilizar dióxido de carbono para producir carbohidratos. Combinando fragmentos de las cadenas de transporte electrónico desarrolladas con anterioridad, las bacte rias fotosintéticas llegaron a desarrollar un fotosistema que utilizaba energía lu minosa para generar el NADPH necesario para la fijación del carbono. La posterior aparición en las cianobacterias, de cadenas fotosintéticas de transporte electrónico más complejas, permitió que se pudiera utilizar el agua, en lugar de dadores de electrones menos abundantes y que eran utilizados por otras bacterias fotosintéti cas, como dador de electrones para la formación del NADPH. De esta forma, la vida pudo proliferar en grandes áreas de la Tierra, por lo que se volvieron a acumular moléculas orgánicas reducidas. Hace aproximadamente 2 mil millones de años el oxígeno liberado por la fotosíntesis de las cianobacterias empezó a acumularse en la atmósfera. Cuando tanto las moléculas orgánicas como el oxígeno llegaron a ser abundantes, las cadenas de transporte electrónico se adaptaron a transportar elec trones desde el NADH hasta el oxígeno, y en muchas bacterias se desarrolló un me tabolismo aeróbico eficiente. En las mitocondrias de los eucariotas se presentan exactamente estos mismos mecanismos aeróbicos, y existen considerables eviden cias de que tanto las mitocondrias como los cloroplastos evolucionaron a partir de bacterias aeróbicas que fueron endocitadas por células eucariotas primitivas.
Los genomas de las mitocondrias y de los cloroplastos Para poder seguir el ritmo de crecimiento y división celular, las células han de generar nuevos orgánulos citoplasmáticos. También han de reponer los orgánulos que son degradados como parte del proceso continuo de recambio de orgá nulos que se produce en las células no proliferativas. La biosíntesis de orgánulos supone la síntesis ordenada de las proteínas y de los lípidos necesarios, así como el transporte de cada com ponente al subcompartimiento del orgánulo adecua do. En el Capítulo 12 explicábamos la transferencia de proteínas y lípidos hacia el interior de las mitocondrias y de los cloroplastos desde cualquier sitio de la cé lula. Aquí describimos las contribuciones que hacen estos orgánulos transfor madores de energía a su propia biogénesis.
La biosíntesis de las m itocondrias y de los cloroplastos supone la contribución de dos sistemas genéticos diferentes43 Mientras que la mayoría de las proteínas de las mitocondrias y de los cloroplas tos están codificadas por el DNA nuclear y son importadas hacia el orgánulo desde el citosol después de haber sido sintetizadas en los ribosomas citosólicos, otras proteínas están codificadas por el DNA del propio orgánulo y son sintetiza das sobre los ribosomas del interior del orgánulo. Parece que el tráfico de proteí nas entre el citoplasma y los orgánulos es unidireccional, ya que no se conoce ninguna proteína que sea exportada desde las mitocondrias o desde los cloro plastos hacia el citosol. Las contribuciones de ambos sistemas genéticos a la formación de las m ito condrias y de los cloroplastos están estrechamente coordinadas en la célula. Aunque sólo durante un período de tiempo breve, los orgánulos aislados en un tubo de ensayo continúan produciendo DNA, RNA y proteínas, lo cual ha permi tido determinar cuáles son las proteínas que están codificadas en el DNA del or gánulo y cuáles lo están en el DNA nuclear. Otra forma de abordar este estudio consiste en utilizar inhibidores específicos sobre células intactas. La droga cicloLos genomas de las mitocondrias y de los cloroplastos
751
Figura 14-62 Resumen de la biosíntesis de las proteínas en las mitocondrias y en los cloroplastos.
DNA
Cada fle c h a roja indica el lugar de acción de un inhibidor que es específico para la síntesis de proteínas, en los orgánulos o en el citosol.
CITOSOL
NUCLEO
T
RNA
genó m ico
ciclohexim ida proteina precursora
MITOCONDRIA O CLOROPLASTO DNA del orgánulo acridinas o etidio
RNA
proteina im po rtada
protein a sintetiza' en el orgánu lo
cloranfenicol, eritrom icina o tetraciclina
heximida, por ejemplo, inhibe la síntesis citosólica de proteínas, pero no inhibe la síntesis proteica de los orgánulos. Por el contrario, varios antibióticos (como el cloranfenicol, la tetraciclina y la eritromicina) inhiben la síntesis de proteínas en las mitocondrias y en los cloroplastos, pero tienen poco efecto sobre la sínte sis de proteínas citosólica (Figura 14-62). Estos inhibidores se utilizan amplia mente en los estudios sobre la función de estos orgánulos.
El crecim iento y la división de los orgánulos m antiene el número de mitocondrias y de cloroplastos en la célula44 Las mitocondrias y los cloroplastos no se sintetizan nunca de novo. Siempre surgen por crecim iento y división de cloroplastos y mitocondrias ya existentes. Las observaciones de células vivas indican que las mitocondrias no sólo se divi den, sino que tam bién se fusionan una con otra. Sin embargo, cada orgánulo ha de duplicar su masa y luego dividirse por la mitad un promedio de una vez por cada generación celular. Estudios con el m icroscopio electrónico sugieren que la división de estos orgánulos empieza con la invaginación de la m embrana in terna, tal como ocurre en la división celular de muchas bacterias (Figuras 14-63 y 14-64), lo cual implica que se trata de un proceso controlado y no de un acon tecim iento causado por un estrangulamiento casual. En la mayoría de las células, los diferentes orgánulos transformadores de ener gía se dividen durante la interfase, en desfase con el proceso de división celular o con el de la división de los otros orgánulos. De forma análoga, la replicación del DNA de los orgánulos no se produce únicamente durante la fase S, cuando se reali za la replicación del DNA nuclear, sino a lo largo de todo el ciclo celular. Parece que las moléculas de DNA de los orgánulos individuales se seleccionan al azar para su replicación, de manera que durante un ciclo celular determinado algunas de ellas pueden replicarse más de una vez y otras no llegar a replicarse. De cualquier modo, en condiciones constantes el proceso está regulado asegurando que el número to tal de moléculas de DNA se duplique en cada ciclo celular, de tal manera que cada tipo celular mantiene una cantidad constante de DNA de los orgánulos.
752
Capítulo 14 : Conversión energética: mitocondrias y cloroplastos
Figura 14-63 Diagrama de una división mitocondrial. La vía mostrada aquí ha sido postulada a partir de fotografías estáticas de mitocondrias en división, com o la de la Figura 14-64.
Figura 14-65 Electronmicrografía de una molécula de DNA mitocondrial animal durante el proceso de replicacidn del DNA. El genoma de DNA circular se ha replicado únicamente entre los dos puntos señalados con flechas (hebras amarillas). (Cortesía de David Clayton.)
I_____________ ! 1 jj n i
Figura 14-64 Electronmicrografía de una mitocondria en división de una célula hepática. (Cortesía de Daniel S. Friend.)
i________________________ i 1 uní
El número de orgánulos que se presentan en cada célula puede estar regula do de acuerdo a las necesidades de la célula; por ejemplo, si un músculo esque lético en reposo se estimula repetidamente durante un período prolongado de tiempo, se observa un gran incremento de la cantidad total de mitocondrias (del orden de 5 a 10 veces). Por otra parte, en circunstancias especiales, la división de los orgánulos está controlada con precisión por la células: así en algunas algas que contienen un solo o unos cuantos cloroplastos, el orgánulo se divide justo antes de la citocinesis, en un plano que es idéntico al futuro plano de la división.
Generalmente los genomas de los cloroplastos y de las m itocondrias son moléculas de DNA circulares45 Las moléculas de DNA de los orgánulos son relativamente pequeñas y simples, y excepto en los genomas mitocondriales de algunas algas y protozoos, son circu-
Tabla 14-2 Tamaño de los genomas de los orgánulos* Tipo de DNA
Tamaño (en miles de pares de nucledtidos)
DNA de cloroplastos Plantas superiores Chlamydomonas (alga verde)
120-200 180
DNA de mitocondrias Animales (incluyendo los gusanos platelmintos, los insectos y los mamíferos) Plantas superiores Hongos Schizosaccharomyces pombe (levaduras de fisión)
Aspergillus nidulans Neurospora crassa Saccharomyces cerevisiae (levadura de gem ación) Chlamydomonas (alga verde)
16-19 150-2500 17 32 60 78 16 (molécula lineal)
Protozoos
Trypanosoma brucei Paramecium
22 40 (molécula lineal)
* Estos genomas son moléculas de DNA circular a menos que se indique lo contrario.
Los genomas de las mitocondrias y de los cloroplastos
753
Tabla 14-3 Cantidades relativas de DNA de los orgánulos de diferentes células y tejidos
Organismo DNA mitocondrial Rata Levadura* Rana DNA del cloroplasto
Chlamydomonas Maiz
Moléculas de DNA Tejido o por tipo celular orgánulo
Orgánulos por célula
hígado vegetativo huevo
5-10 2-50 5-10
1000
vegetativo hojas
80 20-40
1 20-40
DNA de los orgánulos como porcentaje del DNA celular
1-50 IO7
1 15 99 7 15
* La gran variación del número y tamaño de las mitocondrias por célula en las levaduras es de bida a la fusión y fragmentación de mitocondrias.
lares. El genoma de los cloroplastos (que es idéntico al genoma de los otros plastidios de la planta) tiene un tamaño similar en todos los organismos examina dos, pero el genoma mitocondrial es mucho mayor en las plantas que en los ani males (Tabla 14-2). Muchas moléculas de DNA de los orgánulos tienen aproximadamente el mismo tam año que el DNA típico de los virus. En los mamíferos, por ejemplo, el genoma m itocondrial es un DNA circular de unos 16 500 pares de bases (me nos de 10~5 veces el tamaño del genoma nuclear). En animales tan diversos como Drosophila y el erizo de mar, el genoma mitocondrial es aproximadamen te del mismo tam año (Figura 14-65). No obstante, las plantas tienen un genoma mitocondrial circular que es entre 10 y 150 veces más grande, dependiendo de la planta. Los más grandes de estos genomas son aproximadamente la mitad del tamaño de los genomas bacterianos típicos, que también son moléculas circula res de DNA. Todas las mitocondrias y los cloroplastos contienen múltiples copias de la molécula de DNA del orgánulo (Tabla 14-3). Normalmente, estas moléculas de DNA están distribuidas en varios grupos separados, situados en la matriz de la mitocondria o en el estroma del cloroplasto, donde al parecer están unidos a la mem brana interna. A pesar de que no se conoce cómo está empaquetado este DNA, es probable que la estructura del genoma se parezca más a la de las bacterias que a la de la cromatina eucariota. Por ejemplo, como en el caso de las bacterias, en los cloroplastos y en las mitocondrias no hay histonas. En las células de mamífero el DNA mitocondrial constituye menos del 1% del DNA celular total. Sin embargo, en otras células -com o en las de las hojas de las plantas superiores o en los grandes oocitos de los anfibios- los orgánulos transformadores de energía pueden contener una proporción mucho mayor del DNA total de la célula (véase Tabla 14-3) y, por consiguiente, en ellos se produce una mayor proporción de RNA y síntesis proteica total.
Las mitocondrias y los cloroplastos contienen sistemas genéticos completos46 A pesar del reducido número de proteínas codificadas en su genoma, las mito condrias y los plastidios llevan a cabo replicación de su DNA, transcripción del DNA y síntesis proteica. Estos procesos se producen en la matriz de las m itocon drias y en el estroma de los cloroplastos. Aunque las proteínas que llevan a cabo estos procesos genéticos son exclusivas del orgánulo, la mayoría de ellas están codificadas en el genoma nuclear. Este hecho es tanto más sorprendente por
754
Capítulo 14 : Conversión energética: mitocondrias y cloroplastos
cuanto que la maquinaria de síntesis proteica de los orgánulos se parece más a la de las bacterias que a la de los eucariotas. Esta similitud es particularmente grande en el caso de los cloroplastos: 1.
2.
3.
Los ribosomas de los cloroplastos son muy similares a los ribosomas de E. coli, tanto respecto a su sensibilidad frente a diversos antibióticos (tales como el cloranfenicol, la estreptomicina, la eritromicina y la tetraciclina), como respecto a su estructura. No sólo son extremadamente parecidas las secuencias de nucleótidos de los RNA ribosómicos respecto a las de los clo roplastos y de E. coli, sino que los ribosomas del cloroplasto son capaces de utilizar los tRNA ribosomales para realizar síntesis proteica. En todos los aspectos, los ribosomas de los cloroplastos difieren de los que se hallan en el citosol de la misma célula de la planta. En los cloroplastos la síntesis proteica empieza con la iV-formilmetionina, al igual que en las bacterias, y no con la metionina como ocurre en el citosol de las células eucariotas. A diferencia del DNA nuclear, el DNA del cloroplasto puede ser transcrito por la enzima RNA polimerasa de E. coli, produciendo moléculas de mRNA del cloroplasto, que pueden se traducidas de forma eficiente por un siste ma sintetizador de proteínas de E. coli.
Aunque los sistemas genéticos mitocondriales son menos similares a los de las bacterias actuales de lo que lo son los sistemas genéticos de los cloroplastos, sus ribosomas son también sensibles a los antibióticos antibacterianos y la sín tesis proteica en mitocondrias también empieza con la AT-formilmetionina.
El genoma del cloroplasto de las plantas superiores contiene aproximadamente 120 genes47 Los genomas de cloroplastos m ejor estudiados son los de las plantas y de las al gas verdes, moléculas de DNA circular muy similares entre sí. Se ha determinado la secuencia completa de nucleótidos de los cloroplastos del tabaco y de las he páticas. Los resultados indican que estas dos plantas superiores lejanam ente emparentadas contienen en sus cloroplastos genes casi idénticos. Además de cuatro RNA ribosómicos, estos genomas codifican aproximadamente 20 proteí nas ribosomales del cloroplasto, determinadas subunidades de la RNA polime rasa del cloroplasto, varias proteínas que forman parte de los fotosistemas I y II, subunidades de la ATP sintasa, porciones de complejos enzimáticos de la cade na de transporte de electrones, una de las dos subunidades de la ribulosa bisfosfato carboxilasa y 30 moléculas de tRNA (Figura 14-66). Además, parece que las secuencias de DNA presentes codifican al menos 40 proteínas cuyas funciones son desconocidas. Paradójicamente, todas las proteínas conocidas codificadas en el cloroplasto forman parte de grandes complejos proteicos que también contienen una o más subunidades codificadas en el núcleo. Las posibles razones de este hecho se discutirán más adelante. Las similitudes entre los genomas de los cloroplastos y de las bacterias son notables. Las secuencias reguladoras básicas, como los promotores de la trans cripción y los terminadores, son prácticamente idénticas en los dos casos. Las secuencias proteicas codificadas en cloroplastos son claramente reconocibles como bacterianas, y varias agrupaciones de genes con funciones relacionadas (por ejemplo, los que codifican para proteínas ribosomales) están organizados de la misma manera en los genomas de los cloroplastos, de E. coli y de las cianobacterias. Son necesarios detallados estudios comparativos de un gran número de se cuencias nucleotídicas homologas para trazar la vía evolutiva desde las bacterias hasta los cloroplastos, pero ya pueden esbozarse varias conclusiones. (1) Los clo roplastos de las plantas superiores evolucionaron a partir de bacterias fotosintéticas. (2) El genoma del cloroplasto se ha mantenido estable al menos durante va-
Los genomas de las mitocondrias y de los cloroplastos
755
CLAVE: .......
23S 16S
o
w
longitud total del genom a = 121 024 pares de nucleótidos
//
genes tRNA genes de proteínas ribosóm icas genes del fotosistem a I genes del fotosistem a II genes de la ATP sintasa genes del com plejo b6-f genes de la RNA polimerasa genes que codifican el com plejo de la NADH deshidrogenasa
Figura 14-66 Organización del genoma de los cloroplastos de hepáticas. Se ha determinado la secuencia completa de nucleótidos. La organización del genoma del cloroplasto es muy similar en todas las plantas superiores, pero el tamaño varía entre especies, dependiendo de la cantidad que haya presente en las dos copias de DNA que flanquea los genes que codifican los RNA ribosómicos 16S y 23S de los cloroplastos.
ribulosa bisfosfato carboxilasa (subunidad —— grande) o
irm\ rios miles de millones de años, el momento estimado en el que se produjo la di vergencia entre las hepáticas y el tabaco. (3) Muchos de los genes de la bacteria original pueden ser identificados en el genoma nuclear, donde fueron transferi dos y mantenidos de forma estable. En plantas superiores, por ejemplo, dos ter cios de las casi 60 proteínas ribosomales del cloroplasto están codificadas en el núcleo celular, aunque los genes tienen un claro ancestro bacteriano, y los ribosomas del cloroplasto retienen todavía sus propiedades bacterianas originales.
Los genomas mitocondriales presentan varias características sorprendentes48 El genoma del cloroplasto no fue el primer genoma de un orgánulo que fue com pletamente secuenciado. El tamaño relativamente pequeño del genoma mitocondrial humano lo convirtió en un material atractivo para los genetistas mole culares equipados con las técnicas recién desarrolladas de secuenciación de DNA, y en 1981 se publicó la secuencia completa de sus 16 569 nucleótidos. Comparando esta secuencia con las de tRNA mitocondriales conocidas y con las secuencias parciales de aminoácidos disponibles de las proteínas codificadas por el DNA mitocondrial, fue posible localizar todos los genes mitocondriales humanos en la molécula circular de DNA (Figura 14-67).
Figura 14-67 Organización del genoma mitocondrial humano. El genoma contiene 2 genes rRNA, 22 genes tRNA y 13 secuencias que codifican proteínas. También se han secuenciado com pletamente los DNA de otros genomas mitocondriales de algunos animales, y tienen los mismos genes y la misma organización de genes.
subunidades de la ATP sintasa subunidades de la citocrom o oxidasa subunidades de la NADH ~7 deshidrogenasa
región que codifica proteína (13 en total) gen tRNA (22 en total)
subunidades de la NADH deshidrogenasa
longitud total del genom a = 16 569 pares de bases
rRNA 16S
756
rRNA 12S
origen y replicación
Capítulo 14 : Conversión energética: mitocondrias y cloroplastos
citocrom o b
Tabla 14-4 Algunas diferencias entre el código genético “universal” y algunos códigos genéticos mitocondriales* Códigos mitocondriales Código “universal”
Mamíferos
{jrosophila
Levaduras
Plantas
Trp Met
Trp
Trp
STOP
AUA
STOP lie
• 'Metí
Met
lie
CUA
Leu
Leu
Leu
Thr
Leu
Arg
STOP
: Ser j
Arg
Arg
Codón UGA
AGA 1 AGG J
* En cursiva y en color se señalan los códigos que difieren del código “universal”.
Comparando los genomas del núcleo, de los cloroplastos y de las bacterias con el genoma m itocondrial humano se pueden observar varios rasgos sorpren dentes. (1) A diferencia de otros genomas, casi todos los nucleótidos parecen formar parte de secuencias que codifican, ya sea para proteínas o para m olécu las de rRNA o de tRNA. Dado que estas secuencias codificantes están práctica mente una a continuación de otra, queda muy poco espacio para las secuencias de DNA reguladoras. (2) Aunque en el citosol y en los cloroplastos existen al menos 30 o más moléculas de tRNA diferentes que especifican aminoácidos, sólo se requieren 22 moléculas de tRNA para la síntesis proteica mitocondrial. Las reglas normales de apareamiento codón-anticodón están relajadas en las mitocondrias, de modo que muchas moléculas de tRNA reconocen cualquiera de los cuatro nucleótidos de la tercera posición (fluctuante o de balanceo). Esta lectura de “2 de cada 3 ” permite que un tRNA se aparee con uno cualquiera de los cuatro codones y permita la síntesis proteica con menos moléculas de tRNA. (3) Quizás lo más sorprendente aparezca al comparar las secuencias génicas m i tocondriales y las secuencias de aminoácidos de las proteínas correspondientes, ya que se concluye que en las mitocondrias el código genético está alterado, de modo que 4 de los 64 codones tienen “significados” diferentes de los que tienen en otros genomas (Tabla 14-4). La observación de que el código genético es casi el mismo en todos los orga nismos proporciona fuertes evidencias de que todas la células evolucionaron a partir de un antepasado común. Entonces, ¿cómo pueden explicarse las diferen cias en el código genético de las mitocondrias? Una indicación procede del re ciente descubrimiento de que el código genético mitocondrial es diferente en diferentes organismos. Así UGA, que en todos las células es un codón de term i nación, se lee como triptófano en las mitocondrias de mamíferos, de hongos y de protozoos, pero es una señal de stop en las mitocondrias de las plantas. De m a nera similar, el codón AGG que normalmente codifica arginina, codifica parada en las mitocondrias de los mamíferos y codifica serina en Drosophila (véase Ta bla 14-4). Esta variación sugiere que en el código genético de las mitocondrias aparece una variación al azar. Seguramente, el extraordinariamente pequeño número de proteínas codificadas por el genoma mitocondrial hace que un cam bio ocasional en el significado de un codón raro sea tolerable, mientras que un cambio de este tipo en un gran genoma podría alterar la función de muchas pro teínas y por lo tanto destruir la célula.
Las mitocondrias de animales contienen el sistema genético más simple de los conocidos49 Estudios comparativos entre las secuencias de DNA de diferentes organismos revelan que la velocidad de substitución de nucleótidos durante la evolución ha
Los genomas de las mitocondrias y de los cloroplastos
757
sido 10 veces mayor en los genomas mitocondriales que en los nucleares, lo cual posiblemente se deba a la reducida fidelidad de los sistema de replicación y/o reparación en el DNA mitocondrial. Dado que en las mitocondrias de las células animales sólo se han de replicar y expresar en forma de RNA y de proteína unos 16 500 nucleótidos de DNA aproximadamente, la tasa de errores por nucleótido copiado por la replicación de DNA, mantenido por la reparación de DNA, trans crito por la RNA polimerasa, o traducido a proteína por los ribosomas m itocon driales, puede ser relativamente alta sin que se altere ninguno de los relativa mente pocos productos génicos. Esto puede explicar por qué los mecanismos que realizan estos procesos son relativamente simples comparados con los utili zados con el mismo propósito en otras partes de la célula. Por ejemplo, aunque no se ha probado adecuadamente, se puede esperar que la presencia de tan sólo 22 tipos de tRNA y el extraordinariamente pequeño tamaño de los rRNA (inferior a dos tercios del tamaño de los rRNA de E. coli) pueden reducir la fidelidad de la síntesis proteica en la mitocondria. La relativamente elevada velocidad de la evolución de los genes m itocon driales hace que las comparaciones entre las secuencias de DNA mitocondriales sean especialmente útiles para estimar -as fechas de sucesos evolutivos relativa mente recientes, tales como las fases del desarrollo de los primates.
¿Por qué los genomas m itocondriales en las plantas son tan grandes? 50 Los genomas mitocondriales de las plantas son mucho más grandes que los de las células animales, y su contenido en DNA varía de forma importante, oscilan do desde aproximadamente 150 000 hasta aproximadamente 2,5 x 106 pares de nucleótidos. Sin embargo, al parecer estos genomas mitocondriales de las plan tas codifican muy pocas proteínas más que los genomas mitocondriales de ani males. La paradoja se complica con la observación de que en una familia de plantas, las cucurbitáceas, el tamaño de los genomas mitocondriales varía tanto como siete veces. Además, el alga verde Chlamydomonas tiene un genoma m ito condrial lineal de tan sólo 16 000 pares de nucleótidos, el mismo tamaño que el presente en animales. Aunque todavía se dispone de poca información sobre las secuencias de las moléculas de DNA mitocondriales de las plantas superiores, se han secuenciado casi todos los 70 000 pares de nucleótidos del gran genoma mitocondrial de la le vadura Saccharomyces cerevisiae, del que sólo una tercera parte aproximada mente codifica proteína. Estos hallazgos suscitan la posibilidad de que gran par te del DNA extra de las mitocondrias de levadura, y posiblemente también de las mitocondrias vegetales en general, sea un “DNA de desecho” de poca importan cia para el organismo.
Algunos genes de orgánulos contienen intrones51 El procesamiento de los RNA precursores desempeña un papel importante en los dos sistemas mitocondriales estudiados con más detalle -e l humano y el de levadura. En células humanas, las dos hebras del DNA mitocondrial son trans critas a la misma velocidad a partir de una sola región promotora en cada hebra, produciendo dos moléculas diferentes de RNA gigantes, cada una de las cuales contiene una copia completa de cada hebra del DNA. Por lo tanto, la transcrip ción es com pletamente simétrica. Los transcritos hechos sobre una hebra -lla mada la hebra pesada (hebra H, de “heavy”) debido a su densidad en CsCl- son procesados com pletamente mediante la acción de nucleasas que los fragmen tan, produciendo las dos moléculas de rRNA, la mayoría de las moléculas de tRNA y unas 10 moléculas de RNA que presentan poli-A. Por el contrario, el pro cesam iento del transcrito de la hebra ligera (hebra L, de “light”J produce sólo ocho moléculas de tRNA y un pequeño RNA que contiene poli-A; aparentemen te, el 90 % restante de este transcrito (que es complementario de las secuencias
758
Capítulo 14: Conversión energética: mitocondrias y cloroplastos
codificantes sintetizadas en la otra hebra) contiene información no útil, y es de gradado. Los RNA que presentan poli-A son los mRNA mitocondriales: aunque les falta la estructura de capucha (“cap”) en su extremo 5’, tienen una cola de poli-A en su extremo 3 ’ que se añade después de la transcripción mediante una polimerasa de poli-A mitocondrial. A diferencia de los genes humanos mitocondriales, algunos genes m itocon driales de plantas y de hongos (incluyendo las levaduras) presentan intrones, que deben ser eliminados por maduración por corte y empalme (“splicing”) del RNA. También se presentan intrones en unos 20 genes de cloroplastos vegetales. Muchos de los intrones de genes de orgánulos consisten en secuencias de nucleótidos emparentadas que son capaces de madurar por sí solos fuera de los transcritos de RNA, mediante catálisis mediada por RNA (véase pág. 113), aun que generalmente estas reacciones de automaduración (self-splicing) están faci litadas por proteínas. La presencia de intrones en los genes de orgánulos es sor prendente, ya que en los genes de las bacterias, cuyos antepasados se cree que dieron lugar a las mitocondrias y a los cloroplastos de las plantas, no se hallan intrones similares a éstos. En las levaduras es posible que un mismo gen mitocondrial tenga un intrón en una cadena pero no en la otra. Al parecer, estos “intrones opcionales” son ca paces de desplazarse, entrando o saliendo de los genomas, igual que los elem en tos transponibles. Por otro lado, en otros genes mitocondriales de levadura se han hallado intrones en una posición correspondiente del genoma de las m ito condrias de Aspergillus y de Neurospora, lo que implica que estos intrones fue ron heredados a partir de un antepasado común de estos tres hongos. Parece probable que las secuencias de los intrones tengan un origen muy antiguo y que se hayan perdido en muchas bacterias pero que se hayan conservado preferencialmente en aquellos genomas de orgánulos en los que la maduración del RNA esté regulada, colaborando en el control de la expresión génica.
Los genes mitocondriales se pueden distinguir de los genes nucleares gracias a su herencia no mendeliana (citoplasm ática)52 La mayoría de experimentos realizados sobre los m ecanismos de la biogénesis mitocondrial han sido realizados en Saccharomyces cerevisiae (levadura del pan). Existen diversas razones para ello. En primer lugar, estas levaduras tienen la capacidad de sobrevivir exclusivamente de la glucolisis si se cultivan en pre sencia de glucosa y, por lo tanto, sin utilizar las mitocondrias, las cuales son necesarias para la fosforilación oxidativa. Este hecho permite a estas células so brevivir con mutaciones de su DNA mitocondrial o nuclear que afectan drásti cam ente la biogénesis mitocondrial; este tipo de mutaciones resulta letal en casi todos los eucariotas. En segundo lugar, las levaduras son eucariotas unice lulares simples, fáciles de cultivar y de caracterizar bioquímicamente. Por últi mo, norm alm ente estas células de la levadura se reproducen asexualmente m e diante gemación (mitosis asimétrica), pero tam bién se pueden reproducir sexualmente. Durante su reproducción sexual, dos células haploides se fusio nan formando un zigoto diploide que puede crecer m itóticam ente o bien divi dirse por meiosis produciendo de nuevo células haploides. La capacidad de controlar en el laboratorio la alternancia entre reproducción sexual y asexual fa cilita enorm em ente su análisis genético. Dado que las mutaciones en los genes mitocondriales no se heredan de acuerdo a las leyes mendelianas que gobier nan la herencia de los genes nucleares, los estudios genéticos revelan cuáles de los genes implicados en la función mitocondrial se localizan en el núcleo y cuá les en la mitocondria. En la Figura 14-68 se ilustra un ejemplo de herencia no mendeliana (cito plasmática) de los genes mitocondriales en una célula haploide de levadura. En este ejemplo, el gen mutante hace que la síntesis de proteína sea resistente al cloranfenicol. Cuando una célula haploide resistente al cloranfenicol se aparea con con una célula de fenotipo salvaje sensible al cloranfenicol, el zigoto diploi-
Los genomas de las mitocondrias y de los cloroplastos
759
m utante de levadura haploide resistente a cloranfenicol
levadura haploide salvaje
CONJUGACION levadura diploide SEGREGACION MITOTICA GRADUAL DE LAS MITOCONDRIAS DURANTE MUCHOS CICLOS DEL CRECIMIENTO VEGETATIVO
MEIOSIS DURANTE LA ESPORULACIÓN DE LAS CÉLULAS DIPLOIDES
toda la progenie es resistente al cloranfenicol
toda la progenie es sensible al cloranfenicol
de resultante contendrá una mezcla de mitocondrias mutantes y salvajes. Pero cuando sufra la mitosis para producir una célula hija diploide, las mitocondrias mutantes y salvajes serán distribuidas al azar entre la célula madre y la hija, por lo que cada célula hija es probable que herede más mitocondrias mutantes o más salvajes. En sucesivas divisiones mitóticas, tanto las mitocondrias mutantes como las salvajes serán gradualmente eliminadas de algunas células hijas m e diante el mismo proceso aleatorio, dejando mitocondrias de un solo tipo. A par tir de entonces, toda la progenie de esta célula hija tendrá mitocondrias genéti cam ente idénticas. Con el tiempo, este proceso aleatorio, llamado segregación mitótica, produce una progenie diploide de células de levadura con un sólo tipo de DNA mitocondrial. Cuando estas células diploides sufren meiosis y forman cuatro células haploides hijas, cada una de estas células hijas recibirá los mis mos genes mitocondriales. Este tipo de herencia se denomina no mendeliana o citoplasmática, en contraposición con la herencia mendeliana de los genes nu cleares (véase Figura 14-68). Cuando esto ocurre, se demuestra que el gen en cuestión se localiza fuera de los cromosomas nucleares y por lo tanto, está situa do probablem ente en las mitocondrias.
En muchos organismos, los genes de los orgánulos se heredan de la madre53 Las consecuencias de la herencia citoplasmática son más profundas para algu nos organismos, incluido el hombre, que para las levaduras. En las levaduras,
760
Capítulo 14 : Conversión energética: mitocondrias y cloroplastos
Figura 14-68 Diferencias entre los patrones de herencia de los genes mitocondriales y nucleares en la levadura. Para cada gen nuclear, dos de las cuatro células que resultan de la meiosis heredan el gen procedente de una de las células haploides parenterales originales, y las otras dos células heredan el gen procedente de la otra célula (h eren cia m en d elian a). En cambio, y debido a la segregación mitótica de las mitocondrias durante el crecim iento vegetativo (véase texto), es posible que las cuatro células que resultan de la meiosis hereden los genes mitocondriales de una de las dos células haploides originales (h eren cia cito p la sm àtica o n o m en d elian a). En este ejemplo, el gen mitocondrial puede mutar haciendo que la síntesis de proteínas en la mitocondria sea resistente al cloranfenicol, un inhibidor de la síntesis de proteínas que actúa específicamente sobre los orgánulos transformadores de energía y sobre las bacterias. Las células de levadura que contienen el gen mutado pueden ser detectadas por su capacidad de crecim iento en presencia de cloranfenicol sobre un substrato, como por ejemplo el glicerol, que no se utiliza en la glucolisis. Con la glucolisis bloqueada, la mitocondria funcional ha de proporcionar ATP y, por tanto, sólo crecerán las células que contengan mitocondrias resistentes al cloranfenicol.
cuando dos células haploides se aparean, ambas son de igual tamaño y por lo tanto contribuyen por igual a la dotación del DNA mitocondrial del zigoto (véa se Figura 14-68). Por consiguiente, en la levadura la herencia mitocondrial es biparental : ambos progenitores contribuyen por igual al acervo de genes mitocondriales de la progenie (aunque, como hemos visto, tras varias generaciones de crecim iento vegetativo, a menudo la progenie individual contiene mitocondrias procedentes de uno solo de los progenitores). En los animales superiores, en cambio, el óvulo aporta siempre al zigoto mucho más citoplasma que el esper matozoide -e n algunos animales, el espermatozoide no aporta nada de citoplas ma al zigoto. Por consiguiente, cabe esperar que en los animales superiores, la herencia mitocondrial sea uniparental (más exactamente, materna). En algunos animales de laboratorio se ha podido demostrar esta herencia materna, utilizan do dos cepas que se diferencian en su DNA mitocondrial. Cuando los animales que presentan DNA mitocondrial del tipo A se cruzan con animales del tipo B, la progenie presenta sólo DNA mitocondrial del tipo materno. De forma similar, siguiendo en grandes familias la distribución de secuencias variantes de DNA mitocondrial, se ha demostrado que el DNA mitocondrial humano se hereda por vía materna. En aproximadamente dos terceras partes de las plantas superiores, los cloroplastos paternos masculinos (contenidos en los granos de polen) no entran en el zigoto, de tal manera que tanto el DNA de los cloroplastos como el de las mi tocondrias se heredan por vía materna. En otras plantas, los cloroplastos del po len entran en el zigoto, haciendo que la herencia de los cloroplastos sea biparental. En estas plantas, la presencia de cloroplastos defectivos son la causa de la variegación: mediante la segregación mitótica se puede producir una mezcla de cloroplastos normales y defectuosos en un zigoto durante el crecimiento y desa rrollo de la planta, produciendo por lo tanto porciones alternantes verdes y blancas en las hojas. Las porciones verdes contienen los cloroplastos normales, mientras que las blancas contienen los cloroplastos defectuosos.
Los mutantes diminutos en levadura demuestran la extraordinaria importancia del núcleo celular en la biogénesis mitocondrial54 Diversos estudios genéticos en levadura han resultado de una gran importancia para el análisis de la biogénesis mitocondrial. Un ejemplo notable de esto lo constituyen los estudios de mutantes de levadura que contienen grandes deleciones en su DNA mitocondrial, de manera que toda la síntesis proteica m ito condrial se halla anulada. Como era de esperar, estos mutantes no pueden pro ducir mitocondrias funcionales en la respiración. A algunos de estos mutantes les falta todo el DNA mitocondrial. Dado que estos mutantes forman colonias extraordinariamente pequeñas cuando crecen en un medio con baja cantidad de glucosa, todos los mutantes con estas mitocondrias defectuosas se denomi nan mutantes diminutos citoplasmáticos. Los mutantes diminutos no pueden sintetizar proteínas en sus mitocondrias y, por lo tanto, no pueden tener mitocondrias que produzcan ATP, pero a pesar de todo tienen mitocondrias. Estas mitocondrias tienen una membrana externa normal y una membrana interna que presenta crestas pobremente desarrolladas (Figura 14-69) y contienen prácticamente todas las proteínas mitocondriales que están codificadas por los genes nucleares importados desde el citosol - in cluyendo las DNA y RNA polimerasas, todas las enzimas del ciclo del ácido cítri co y muchas proteínas de la membrana interna- demostrando claramente la ex traordinaria importancia del núcleo en la biogénesis mitocondrial. Los mutantes diminutos tam bién demuestran que un orgánulo que se divide por fisión puede replicarse indefinidamente en el citoplasma de células eucariotas proliferantes, incluso en ausencia completa de su propio genoma. Muchos biólogos creen que normalmente los peroxisomas se replican de esta manera (véase Figura 12-29). Para el caso de los cloroplastos, los equivalentes más cercanos a los mutan tes diminutos mitocondriales de las levaduras son los mutantes de algas unice
Los genomas de las mitocondrias y de los cloroplastos
1 (jm Figura 14-69 Electronmicrografías de secciones ultrafinas de células de levadura, mostrando la estructura de mitocondrias normales (A) y de mitocondrias de un muíante diminuto que carece de todos los productos génicos codificados por las mitocondrias (B). En los mutantes diminutos todos los productos génicos codificados en la mitocondria se pierden, y por ello, el orgánulo está formado exclusivamente a partir de proteínas codificadas en el núcleo de la célula. (Por cortesía de Barbara Stevens.)
761
lulares como la Euglena. Células de este tipo, en las que no tiene lugar la síntesis proteica en los cloroplastos, presentan cloroplastos y son perfectamente viables si se les proporcionan substratos oxidables. No obstante, si en las plantas se blo quea el desarrollo de los cloroplastos maduros, ya sea situando las plantas en la oscuridad o bien debido a que el DNA del cloroplasto es defectuoso o está ausen te, las plantas mueren en cuanto se agotan sus reservas de alimento.
Las m itocondrias y los cloroplastos contienen proteínas específicas de tejido55 En determinados tipos celulares las mitocondrias pueden tener funciones espe cializadas. El ciclo de la urea, por ejemplo, es la vía metabòlica central de que disponen los mamíferos para la degradación de los compuestos que contienen nitrógeno. Estos productos son secretados por la orina en forma de urea. Varios pasos de este ciclo están catalizados, en la matriz mitocondrial, por enzimas co dificadas en el núcleo. La síntesis de urea sólo se realiza en algunos tejidos, como el hígado, y sólo en estos tejidos se produce la síntesis y el transporte hasta la mitocondria de estas enzimas. Además, los complejos enzimáticos respirato rios de la membrana mitocondrial interna de los mamíferos contienen varias subunidades codificadas por el núcleo que son específicas de tejido y que al parecer actúan como reguladoras del transporte electrónico. Así, algunos humanos que padecen una determinada enfermedad muscular genética tienen una subunidad defectuosa de la citocromo oxidasa; dado que esta subunidad es específica de la células del músculo esquelético, las células musculares de corazón funcionan normalmente, permitiendo que los individuos sobrevivan. Tal como cabría es perar, tam bién se encuentran diferencias específicas de tejido en proteínas de cloroplastos codificadas por el núcleo celular.
Las m itocondrias im portan la mayor parte de sus lípidos m ientras que los cloroplastos producen la mayor parte de ellos56 La biosíntesis de nuevos cloroplastos y de mitocondrias requiere lípidos, ácidos nucleicos y proteínas. Los cloroplastos tienden a producir los lípidos que necesi tan. En las hojas de la espinaca, por ejemplo, toda la síntesis celular de ácidos grasos tiene lugar en los cloroplastos, mientras que su desaturación tiene lugar en otro lugar de la célula. Los grandes glucolípidos del cloroplasto también se producen localmente. Las mitocondrias, por el contrario, importan la mayor parte de sus lípidos. En las células animales, los fosfolípidos fosfatidilcolina y fosfatidilserina, se sin tetizan en el retículo endoplasmático y luego se transfieren a la membrana ex terna de la mitocondria. Además de descarboxilar la fosfatidilserina importada transformándola en fosfatidiletanolamina, la principal reacción de la biosíntesis de lípidos catalizada por la mitocondria es la transformación de los lípidos im portados hasta cardiolipina (bisfosfatidilglicerol). La cardiolipina es un fosfolípido “doble” que contiene cuatro colas de ácidos grasos; se halla principalmente en la m em brana mitocondrial interna y constituye aproximadamente un 20% de su contenido lipidico total. En el Capítulo 12 ya se estudió en detalle la importante cuestión de cómo proteínas citosólicas específicas son importadas a las mitocondrias y a los clo roplastos.
Probablem ente, tanto las mitocondrias como los cloroplastos han evolucionado a partir de bacterias endosimbióticas57 Como vimos en el Capítulo 1, el carácter procariota de los sistemas genéticos de los orgánulos celulares, especialmente notable en el caso de los cloroplastos, su giere que las mitocondrias y los cloroplastos evolucionaron a partir de bacterias que fueron endocitadas hace más de mil millones de años. De acuerdo con la hi-
762
Capítulo 14 : Conversión energética: mitocondrias y cloroplastos
célula procariota anaeróbica prim itiva
Figura 14-70 Ruta evolutiva sugerida sobre origen de la mitocondria.
Microsporidia y Giardia son dos eucariotas unicelulares anaeróbicos actuales (protozoos) que carecen de mitocondrias. Su secuencia de rRNA sugiere que existe una gran distancia evolutiva entre ellos y resto de los eucariotas, por lo que se ha postulado que sus parientes ancestrales también Fueron anaeróbicos y parecidos a los primeros eucariotas que incorporaron los precursores de las mitocondrias.
J procariota aeróbico UNA CÉLULA EUCARIOTA INCORPORÓ UNA CÉLULA PROCARIOTA AERÓBICA MEDIANTE ENDOCITOSIS
célula eucariota con un procariota endosim bionte aeróbico TRANSFERENCIA DE GENES DEL PROCARIOTA AL NÚCLEO DEL EUCARIOTA célula eucariota actual
célula eucariota anaeróbica actual
m itocondria
núcleo
pótesis endosimbidtica, las células eucariotas aparecieron en forma de organis mos anaeróbicos sin mitocondrias ni cloroplastos, y luego establecieron una rela ción endosimbiótica estable con un tipo de bacterias, utilizando su sistema de fosforilación oxidativa (Figura 14-70). El proceso de endocitosis que condujo al desarrollo de las mitocondrias se produjo cuando el oxígeno apareció en la at mósfera en cantidades substanciales, hace aproximadamente 1,5 x 109 años, an tes de que los animales y las plantas se separaran (véase Figura 14-59). Al parecer, los cloroplastos de las plantas y de las algas han derivado posteriormente a partir de un suceso endocítico que implicó a una bacteria fotosintética productora de oxígeno. Para explicar los diferentes pigmentos y propiedades de los cloroplastos que se encuentran en las actuales plantas superiores y en las algas verdes, se asu me que por los menos tuvieron lugar tres sucesos separados de este tipo. Dado que la mayoría de los genes que codifican las proteínas actuales se h a llan en el núcleo celular, parece probable que durante la evolución eucariota se produjera una extensa transferencia de genes desde el orgánulo al DNA del nú cleo. Esto explicaría por qué algunos de los genes del núcleo que codifican pro teínas mitocondriales se parecen a los genes bacterianos: por ejemplo, la secuen cia de aminoácidos del extremo amino terminal de la enzima mitocondrial superóxido dismutasa de gallina se parece mucho más al segmento correspon diente de la misma enzima de una bacteria que a la superóxido dismutasa del citosol de las mismas células eucariotas. Más evidencias de que este tipo de trans ferencias de DNA sucedieron durante la evolución surge del descubrimiento de algunas secuencias de DNA no codificantes del DNA nuclear que parecen ser de origen mitocondrial reciente; aparentemente se han integrado dentro del genoma nuclear como “DNA de desecho”. ¿Qué tipo de bacteria dio lugar a las mitocondrias? Análisis más recientes de secuencias de proteínas y nucleótidos proporcionan la principal evidencia para
Los genomas de las mitocondrias y de los cloroplastos
763
DNA m itocondrial transcritos de RNA m em brana m itocondrial mem brana m itocondrial interna externa
transcripción tRNAs
am inoacil tRNA
R NA p o lim e ra s a m ito c o n d ria l
rRNA pequeño rRNA grande subunidad subunidad ribosómica ribosomica grande pequeña mRNA
• • proteínas sintetizadas
IIS I
DNA m itocondrial replicando
en/im as solubles riel ciclo de ácido cítrico, «le.
unidos a la membrana/
a m in o a c íl-tR N A sin ta sa s m ito c o n d ria ie s
e n zim a s m ito c o n d ria le s de ia re p lic a c ió n dei D N A
proteínas sintetizadas en el citosol
p ro te ín a s m ito c o n d ria le s rib o s ó m ic a s
configurar el árbol evolutivo presentado previamente en la Figura 14-60. Parece que las mitocondrias descienden de un tipo particular de bacteria púrpura fotosintética que previamente perdió la capacidad de realizar fotosíntesis y que que dó únicam ente con una cadena respiratoria. Sin embargo, igual que para los cloroplastos, no está claro si todas las mitocondrias se originaron a partir de un sólo suceso endosimbiótico o no. Por ejemplo, las mitocondrias de los proto zoos tienen rasgos procariotas distintivos, pero algunas de ellas son suficiente mente diferentes de las mitocondrias de las plantas y de los animales como para sugerir un origen diferente.
¿Por qué los cloroplastos y las m itocondrias tienen sus propios sistemas genéticos?58 ¿Por qué las mitocondrias y los cloroplastos necesitan sus propios sistemas ge néticos, si otros orgánulos, como los peroxisomas y los lisosomas, no los tienen? La pregunta no es trivial, ya que m antener un sistema genético diferente resulta costoso: más de 90 proteínas -incluyendo las proteínas ribosómicas, las aminoacil-tRNA sintasas, las DNA y RNA polimerasas, y las enzimas de procesamiento y de m odificación del RNA- se han de codificar por genes nucleares, especial mente para este fin (Figura 14-71). Las secuencias de aminoácidos de la mayoría de las proteínas de mitocondrias y cloroplastos difieren de las secuencias de las proteínas correspondientes del núcleo y del citosol y no existe ninguna razón
764
Capítulo 14 : Conversión energética: mitocondrias y cloroplastos
Figura 14-71 Orígenes de las proteínas y RNA mitocondriales. Las proteínas importadas del citosol desempeñan una importante función en el sistema genético de la mitocondria y constituyen la mayor parte de las proteínas del orgánulo. La mitocondria sólo contribuye a su sistema genético con los mRNA, los rRNA y los tRNA. En este diagrama no se indican las proteínas adicionales codificades por el núcleo que regulan la expresión de los genes mitocondriales individuales a niveles post-transcripcionales.
para pensar que estos orgánulos tengan relativamente pocas proteínas en co mún con el resto de la célula. Esto significa que el núcleo debe suministrar como mínimo 90 genes para mantener el sistema genético de cada orgánulo. La razón de este arreglo tan costoso no está clara, y la esperanza de que el conocim iento de la secuencia de nucleótidos del genoma de las mitocondrias y de los cloroplastos proporcione la respuesta definitiva, ha resultado fallida. No se nos ocu rren razones imperiosas por las que las proteínas de las mitocondrias tengan que estar producidas en las propias mitocondrias y no puedan estar sintetizadas en el citosol. En cierto momento se sugirió que algunas proteínas tienen que estar sinteti zadas en el interior del orgánulo, ya que son demasiado hidrofóbicas para poder llegar desde el citosol hasta su lugar en la membrana mitocondrial. No obstante, estudios más recientes hacen que esta explicación sea inverosímil. En muchos casos, subunidades incluso altamente hidrofóbicas están sintetizadas en el citosol. Además, aunque las distintas subunidades proteicas de los diferentes com plejos enzimáticos mitocondriales están altamente conservadas a lo largo de la evolución, no está conservado su lugar de síntesis. La diversidad en la localiza ción de los genes que codifican subunidades de proteínas funcionalmente equi valentes en diferentes organismos es difícil de explicar por cualquier hipótesis que postule una ventaja evolutiva específica de los sistemas genéticos de las mi tocondrias o de los cloroplastos actuales. Quizás el sistema genético de los orgánulos sea un callejón evolutivo sin sa lida. En términos de la hipótesis endosimbiótica, esto podría significar que los procesos por los que los endosimbiontes transfirieron la mayoría de sus genes al núcleo se pararon antes de completarse. Posteriores transformaciones se han podido descartar, en el caso de las mitocondrias, por recientes alteraciones en el código genético mitocondrial que convirtieron los genes mitocondriales rem a nentes en no funcionales si eran transferidos al núcleo.
Resumen Las mitocondrias y los cloroplastos crecen y se dividen mediante procesos coordina dos que requieren la contribución de dos sistemas genéticos diferentes -el del orgá nulo y el del núcleo celular. La mayoría de las proteínas de estos orgánulos están codificadas por el DNA nuclear, están sintetizadas en el citosol y luego son trans portadas individualmente al orgánulo. Sin embargo, algunas proteínas del orgá nulo y algunos RNA están codificados por el DNA del orgánulo y son sintetizados en el propio orgánulo. El genoma mitocondrial humano contiene aproximadamente 16 500 nucleótidos y codifica 2 moléculas de RNA ribosómico, 22 moléculas de RNA de transferencia y 13 cadenas polipeptídicas diferentes. El genoma de los cloroplas tos es aproximadamente 10 veces mayor que el de las mitocondrias y contiene unos 120 genes. Sin embargo, en mutantes en los que el genoma del orgánulo no es fu n cional, se pueden form ar orgánulos parcialmente funcionales y en cantidades nor males, lo cual demuestra la extraordinaria importancia que tiene el núcleo en la biogénesis de ambos orgánulos. Los ribosomas de los cloroplastos se parecen enormemente a los ribosomas bacterianos, mientras que los ribosomas mitocondriales muestran similitudes y di ferencias que dificultan mucho más el estudio de su origen. Algunas similitudes proteicas sugieren que las mitocondrias y los cloroplastos se originaron cuando una célula eucariota primitiva estableció una relación endosimbiótica estable con una bacteria: se cree que una bacteria púrpura dio lugar a las mitocondrias y que, más tarde, un pariente de una cianobacteria dio lugar a los cloroplastos de las plantas. Aunque muchos de los genes de estas antiguas bacterias todavía son fu n cionales para producir proteínas del orgánulo, muchos de ellos han quedado inte grados en el genoma nuclear, donde codifican enzimas semejantes a las de las bac terias, que son sintetizadas en los ribosomas del citosol y luego transportadas al orgánulo. Los genomas de las mitocondrias y de los cloroplastos
765
Bibliografía General Ernster, L., ed. Bioenergetics. New York: Elsevier, 1984. Harold, F.M. The Vital Force: A Study of Bioenergetics. New York: W.H. Freeman, 1986. Lehninger, A.L.; Nelson, D.L.; Cox, M.M. Principios de Bioquí mica. Barcelona: Ediciones Omega, SA. Barcelona, 1993. Nicholls, D.G. Bioenergetics: An Introduction to the Chemiosmotic Theory. New York: Academic Press, 1982. Stryer, L. Biochemistry, 3rd ed., Chaps. 16, 17, and 22. New York: W.H. Freeman, 1988.
Citas 1. Bereiter-Hahn, J. Behavior of mitochrondria in the liv ingcell. Int. Rev. Cytol. 122:1-63,1990. Ernster, L.; Schatz, G. Mitochondria: a historical review. J. Cell Biol. 91:227s-255s, 1981. Fawcett, D.W. The Cell, 2nd ed., pp. 410-485. Philadel phia: Saunders, 1981. Tzagoloff, A. Mitochondria. New York: Plenum Press, 1982. 2. DePierre, J.W.; Ernster, L. Enzyme topology of intracel lular membranes. Annu. Rev. Biochem. 46:201-262, 1977. Krstic, R.V. Ultrastructure of the Mammalian Cell, pp. 28-57. New York: Springer-Verlag, 1979. Poliak, J.K.; Sutton, R. The differentiation of animal mi tochondria during development. Trends Biochem. Sei. 5:23-27,1980. Srere, P.A. The structure of the mitochondrial inner membrane-matrix compartment. Trends. Biochem. Sei. 7:375-378, 1982. 3. Geddes, R. Glycogen: a metabolic viewpoint. Biosci. Rep. 6:415-428,1986. McGilvery, R.W. Biochemistry: A Functional Approach, 3rd ed. Philadelphia: Saunders, 1983. Newsholme, E.A.; Start, C. Regulation in Metabolism. New York: Wiley, 1973. 4. Baldwin, J.E.; Krebs, H. The evolution of metabolic cy cles. Nature 291:381-382,1981. Krebs, H.A. The history of the tricarboxylic acid cycle. Perspect. Biol. Med. 14:154-170,1970. 5. Mitchell, P. Coupling of phosphorylation to electron and hydrogen transfer by a chemi-osmotic type of mechanisms. Nature 191:144-148,1961. Racker, E. From Pasteur to Mitchell: a hundred years of bioenergetics. Fed. Proc. 39:210-215,1980. 6. Hatefi, Y. The mitochondrial electron transport and oxi dative phosphorylation system. Annu. Rev. Biochem. 54:1015-1070, 1985. 7. Nicholls, D.G. Bioenergetics: An Introduction to the Chemiosmotic Theory, Chap. 3. New York: Academic Press, 1982. Wood, W.B.; Wilson, J.H.; Benbow, R.M.; Hood, L.E. Bio chemistry: A Problems Approach, 2nd ed. Menlo Park, CA: Benjamin-Cummings, 1981. (Ver proble mas, Capítulos 9, 12 y 14.) 8. Durand, R.; Briand, Y.; Touraille, S.; Alziari, S. Molecular approaches to phosphate transport in mitochondria. Trends Biochem. Sei. 6:211-214, 1981.
766
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
Hinkle, P.C.; McCarty, R.E. How cells make ATP. Sci. Am. 238(3):104-123,1978. Klingenberg, M. The ADP, ATP shuttle of the mitochon drion. Trends Biochem. Sci. 4:249-252, 1979. LaNoue, K.F.; Schoolwerth, A.C. Metabolite transport in mitochondria. Annu. Rev. Biochem. 48:871-922,1979. Eisenberg, D.; Crothers, D. Physical Chemistry with Ap plications to the Life Sciences, Chaps. 4 and 5. Menlo Park, CA: Benjamin-Cummings, 1979. Kauzmann, W. Thermodynamics and Statistics: With Ap plications to Gases. New York: WA. Benjamin, 1967. Hinkle, P.C.; Kumar, MA.; Resetar, A.; Harris, D.L. Me chanistic stoichiometry of mitochondrial oxidative phosphorylation. Biochemistry 30:3576-3582, 1991. Hatefi, Y. The mitochondrial electron transport and oxi dative phosphorylation system. Annu. Rev. Biochem. 54:1015-1069,1985. Racker, E. A New Look at Mechanisms in Bioenergetics. New York: Academic Press, 1976. (Una explicación personal de los conceptos y la historia.) Bianchet, M.; Ysern, X.; Hullihen, J.; Pedersen, P.L.; Amzel, L.M. Mitochondrial ATP synthase. Quaternary structure of the F, moiety at 3.6 A determined by xray diffraction analysis. /. Biol. Chem. 266:2119721201,1991. Futai, M.; Noumi, T.; Maeda, M. ATP synthase (H+-ATPase): results by combined biochemical and molecular biological approaches. Annu. Rev. Biochem. 58:111136,1989. Pederson, P.L.; Carafoli, E. Ion motive ATPases. II. En ergy coupling and work output. Trends Biochem. Sci 12:186-189, 1987. Racker, E.; Stoeckenius, W. Reconstitution of purple membrane vesicles catalyzing light-driven proton uptake and adenosine triphosphate formation. /. Biol. Chem. 249:662-663,1974. Fillingame, R.H. The proton-translocating pumps of oxidative phosphorylation. Annu. Rev. Biochem. 49:1079-1113,1980. Malmstrom, B.G. The mechanism of proton transloca tion in respiration and photosynthesis. FEBS Lett. 250:9-21,1989. Chance, B.; Williams, G.R. A method for the localization of sites for oxidative phosphorylation. Nature 176: 250-254, 1955. Dickerson, R.E. The structure and history of an ancient protein. Sci. Am. 226(4) :58-72, 1972. (La conforma ción y evolución del citocromo c.) Keilin, D. The History of Cell Respiration and Cytochro mes. Cambridge, UK: Cambridge University Press, 1966. Spiro, T.G., ed. Iron-Sulfur Proteins. New York: WileyInterscience, 1982. Capaldi, R.A. Structure and function of cytochrome c oxidase. Annu. Rev. Biochem. 59:569-596,1990. Casey, R.P. Membrane reconstitution of the energyconserving enzymes of oxidative phosphorylation. Biochim. Biophys. Acta 768:319-347, 1984. Hofhaus, G.; Weiss, H.; Leonard, K. Electron microsco pic analysis of the peripheral and membrane parts of mitochondrial NADH dehydrogenase (complex I). /. Mol. Biol. 221:1027-1043, 1991.
Capítulo 14 : Conversión energética: mitocondrias y cloroplastos
17.
18.
19.
20.
21. 22.
23.
24.
25.
Weiss, H.; Linke, P.; Haiker, H.; Leonard, K. Structure and function of the mitochondrial ubiquinol: cyto chrome c reductase and NADH: ubiquinone reducta se. Biochem. Soc. Trans. 15:100-102, 1987. Badcock, G.T.; Wikstrom, M. Oxygen activation and the conservation of energy in cell respiration. Nature 356:301-308, 1992. Hackenbrock, C.R. Lateral diffusion and electron trans fer in the mitochodnrial inner membrane. Trends Biochem. Sci. 6:151-154, 1981. Dutton, P.L.; Wilson, D.F. Redox potentiometry in mito chondrial and photosynthetic bioenergetics. Biochim. Biophys. Acta 346:165-212, 1974. Hamamoto, T.; Carrasco, N.; Matsushita, K.; Kabak, H.R.; Montal, M. Direct measurement of the electrogenic activity of O-type cytochrome oxidase from E. coli reconstituted into planar lipid bilayers. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:2570-2573,1985. Lehninger, A.L. Bioenergetics: The Molecular Basis of Biological Energy Transformations, 2nd ed. Menlo Park, CA: Benjamin-Cummings, 1971. Henderson, R.; Baldwin, J.M.; Ceska, T.A.; Zemlin, F.; Beckmann, E.; Downing, K.H. Model for the structure of bacteriorhodopsin based on high-resolution elec tron cryo-microscopy./. Mol. Biol. 213:899-929,1990. Mathies, R.A.; Lin, S.W.; Ames, J.B.; Pollard, W.T. From femtoseconds to biology: mechanism of bacteriorhodopsin’s light-driven proton pump. Annu. Rev. Biophys. Biophys. Chem. 20:491-518, 1991. Prince, R.C. The proton pump of cytochrome oxidase. Trends Biochem. Sci. 13:159-160,1988. Trumpower, B.L. The proton motive Q cycle. /. Biol. Chem. 265:11409-11412, 1990. Hanstein, W.G. Uncoupling of oxidative phosphoryla tion. Trends Biochem. Sci. 1:65-67,1976. Brand, M.D.; Murphy, M.P. Control of electron flux through the respiratory chain in mitochondria and cells. Biol. Rev. Camb. Phil. Soc. 62:141-193,1987. Racker, E.A. New Look at Mechanisms in Bioenergetics. New York: Academic Press, 1976. Klingenberg, M. Mechanism and evolution of the un coupling protein of brown adipose tissue. Trends Biochem. Sci. 15:108-112, 1990. Nicholls, D.G.; Rial, E. Brown fat mitochondria. Trends Biochem. Sci. 9:489-491, 1984. Gottschalk, G. Bacterial Metabolism, 2nd ed. New York: Springer-Verlag, 1986. MacNab, R.M. The bacterial flagellar motor. Trends Bio chem. Sci. 9:185-189,1984. Neidhardt, F.C., et al, eds. Escherichia coli and Salmone lla typhimurium: Cellular and Molecular Biology. Washington, DC: American Society for Microbiology, 1987. Skulachev, V.P. Sodium Bioenergetics. Trends Biochem. Sci. 9:483-485, 1984. Thauer, R.; Jungermann, K.; Decker, K. Energy conser vation in chemotrophic anaerobic bacteria. Bacteriol. Rev. 41:100-180, 1977. Bogorad, L. Chloroplasts./. Cell Biol. 91:256s-270s, 1981. (Una revisión histórica.) Clayton, R.K. Photosynthesis: Physical Mechanisms and Chemical Patterns. Cambridge, UK: Cambridge Uni versity Press, 1980. (Un tratamiento general excelente.)
Bibliografía
26.
27.
28.
29.
30.
31.
32.
33.
Haliwell, B. Chloroplast Metabolism—The Structure and Function of Chloroplasts in Green Leaf Cells. Oxford, UK: Clarendon Press, 1981. Hoober, J.K. Chloroplasts. New York: Plenum Press, 1984. Anderson, J.M. Photoregulation of the composition, func tion, and structure of thylakoid membranes. Annu. Rev. Plant Physiol. 37:93-136,1986. Gruissem, W. Chloroplast gene expression: how plants turn their plastids on. Cell 56:161-170, 1989. Thomson, W.W.; Whatley, J.M. Development of non-gre en plastids. Annu. Rev. Plant Physiol. 31:375-394,1980. Cramer, W.A.; Widger, W.R.; Herrmann, R.G.; Trebst, A. Topography and function of thylakoid membrane proteins. Trends Biochem. Sci. 10:125-129, 1985. Miller, K.R. The photosynthetic membrane. Sci. Am. 241(4):102-113,1979. Akazawa, T.; Takabe, T.; Kobayashi, H. Molecular evolu tion of ribulose-l,5-bisphosphate carboxylase/oxyge nase (RuBisCO). Trends Biochem. Sci. 9:380-383,1984. Lorimer, G.H. The carboxylation and oxygenation of ribulose-l,5-bisphosphate: the primary events in pho tosynthesis and photorespiration. Annu. Rev. Plant. Physiol. 32:349-383, 1981. Lundqvist, T.; Schneider , G. Crystal structure of activa ted ribulose-1,5-biphosphate carboxylase complexed with its substrate, ribulose-1,5-biphosphate. /. Biol. Chem. 266:12604-12611, 1991. Bassham, J.A. The path of carbon in photosynthesis. Sci. Am. 206(6):88-100, 1962. Preiss, J. Starch, sucrose biosynthesis and the partition of carbon in plants are regulated by orthophosphate and triose-phosphates. Trends Biochem. Sci. 9:24-27,1984. Bjorkman, O.; Berry, J. High-efficiency photosynthesis. Sci. Am. 229(4):80-93,1973. (C4plants.) Edwards, G.; Walker, D. C3, C4Mechanisms, and Celular and Environmental Regulation of Photosynthesis. Berkeley: University of California Press, 1983. Heber, U.; Krause, G.H. What is the physiological role of photorespiration? Trends Biochem. Sci. 5:32-34,1980. Langdale, J.A.; Nelson, T. Spatial regulation of photo synthetic development in C4 plants. Trends Genet. 7:191-196, 1991. Clayton, R.K. Photosynthesis: Physical Mechanisms and Chemical Patterns. Cambridge, UK: Cambridge Uni versity Press, 1980. Parson, W.W. Photosynthesis and other reactions invol ving light. In Biochemistry (G. Zubay, ed.) 2nd ed., pp. 564-597. New York: Macmillan, 1988; 3rd ed., Carmel, IN: Brown & Benchmark, 1993. Barber, J. Photosynthethic reaction centres: a common link. Trends Biochem. Sci. 12:321-326, 1987. Govindjee; Govindjee, R. The absorption of light in pho tosynthesis. Sci. Am. 231(6):68-82, 1974. Zuber, H. Structure of light-harvesting antenna comple xes of photosynthetic bacteria, cyanobacteria, and red algae. Trends Biochem. Sci. 11:414-419, 1986. Boxer, S.G. Mechanism of long-distance electron transfer in proteins: lessons from photosynthetic reaction cen ters. Annu. Rev. Biophys. Biophys. Chem. 19:267-299,1990. Deisenhofer, J.; Epp, O.; Miki, K.; Huber, R.; Michel, H. Structure of the protein subunits in the photosynthe tic reaction centre of Rhodopseudomonas virdis at 3A resolution. Nature 318:618-624,1985.
767
34.
35.
36.
37.
38.
39.
40.
41.
42.
Deisenhofer, J.; Michel, H. Structures of bacterial pho tosynthetic reaction centers. Annu. Rev. Cell Biol. 7:123,1991. Blankenship, R.E.; Prince, R.C. Excited-state redox p o tentials and the Z scheme of photosynthesis. Trends Biochem. Sci. 10:382-383,1985. Govindjee; Coleman, W.J. How plants make oxygen. Sci. Am. 262(2):50-58,1990. Krauss, N.; Hinrichs, W.; Witt, I.; et al. Three-dimensio nal structure of system I of photosynthesis at 6 A re solution. Nature 361:326-331,1993. Anderson, J.M. Photoregulation of the composition, function, and structure of thylakoid membranes. Annu. Rev. Plant Physiol. 37:93-136, 1986. Hinkle, P.C.; McCarty, R.E. How cells make ATP. Sci. Am. 238(3):104-123, 1978. Jagendorf, A.T. Acid-base transitions and phosphoryla tion by chloroplasts. Fed. Proc. 26:1361-1369,1967. Douce, R.; Joyard, J. Biochemistry and function of the plastid envelope. Annu. Rev. Cell Biol. 6:173-216,1990. Fliigge, U.I.; Heldt, H.W. The phosphate-triose phosphate-phosphoglycerate translocator of the chloroplast. Trends Biochem. Sci. 9:530-533,1984. Wilson, T.H.; Lin, E.C.C. Evolution of membrane bio energetics./. Supramol. Struct. 13:421-446, 1980. Woese, C.R. Bacterial evolution. Microbiol. Rev. 51:221271.1987. Gest, H. The evolution of biological energy-transducing systems. FEMS Microbiol. Lett. 7:73-77,1980. Gottschalk, G. Bacterial Metabolism, 2nd ed. New York: Springer-Verlag, 1986. (El Capitulo 8 trata las fermentaciones.) Miller, S.M.; Orgel, L.E. The Origins of Life on the Earth. Englewood Cliffs, NJ: Prentice-Hall, 1974. Cross, R.L.; Taiz, L. Gene duplication as a means for al tering H+/ATP ratios during the evolution of F0Fj ATPases and synthases. FEBSLett. 259:227-229,1990. Knowles, C.J., ed. Diversity of Bacterial Respiratory Sys tems, Vol. 1. Boca Raton, FL: CRC Press, 1980. Nelson, N.; Taiz, L. The evolution of H+-ATPases. Trends Biochem. Sci. 14:113-116,1989. Clayton, R.K.; Sistrom, W.R., eds. The Photosynthetic Bacteria. New York: Plenum Press, 1978. Deamer, D.W., ed. Light Transducing Membranes: Structure, Function and Evolution. New York: Acade mic Press, 1978. Gromet-Elhanan, Z. Electrochemical gradients and energy coupling in photosynthetic bacteria. Trends Biochem. Sci. 2:274-277, 1977. Olson, J.M.; Pierson, B.K. Evolution of reaction centers in photosynthetic prokaryotes. Int. Rev. Cytol. 108:209248.1987. Dickerson, R.E. Cytochrome c and the evolution of energy metabolism. Sci. Am. 242(3):136-153,1980. Gabellini, N. Organization and structure of the genes for the cytochrome b/c, complex in purple photosynthe tic bacteria. A phylogenetic study describing the ho mology of the b/c, subunits between prokaryotes, miotochondria, and chloroplasts. J. Bioenerg. Biomem.br. 20: 59-83,1988. Lockhart, P.J.; Penny, D.; Hendy, M.D.; et al. Controversy on chloroplast origins. FEBSLett. 301:127-131,1992.
768
43.
44.
45.
46.
47.
48.
49.
50.
Schopf, J.W.; Hayes, J.M.; Walter, M.R. Evolution of earth’s earliest ecosystemas: recent progress and un solved problems. In Earth’s Earliest Biosphere: Its Origin and Evolution (J.W. Schopf, ed.), pp. 361-384. Princeton, NJ: Princeton University Press, 1983. Attardi, G.; Schatz, G. Biogenesis of mitochondria. Annu. Rev. Cell Biol. 4:289-333, 1988. Ellis, R.J., ed. Chloroplast Biogenesis. Cambridge, UK: Cambridge University Press, 1984. Clayton, D.A. Replication and transcription of vertebra te mitochondrial DNA. Annu. Rev. Cell Biol. 7:453478,1991. Posakony, J.W.; England, J.M.; Attardi, G. Mitochondrial growth and division during the cell cycle in HeLa cells./. Cell Biol. 74:468-491,1977. Borst, P.; Grivell, L.A.; Groot, G.S.P. Organelle DNA. Trends Biochem. Sci. 9:128-130,1984. Gray, M.W. Origin and evolution of mitochondrial DNA. Annu. Rev. Cell Biol. 5:25-50,1989. Sugiura, M. The chloroplast chromosomes in land plants. Annu. Rev. Cell Biol. 5:51-70, 1989. Grivell, L.A. Mitchondrial DNA. Sci. Am. 248(3):60-73, 1983. Hoober, J.K. Chloroplasts, New York: Plenum Press, 1984. Rochaix, J.D. Molecular genetics of chloroplast and mi tochondria in the unicellular green alga Chlamydomonas. FEMS Microbiol. Rev. 46:13-34,1987. Clegg, M.T. Chloroplast gene sequences and the study of plant evolution. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:363367,1993. Ohyama, K., et al. Chloroplast gene organization dedu ced from complete sequence of liverwort. Marchantia polymorpha chloroplast DNA. Nature 322:572574,1986. Shinozaki, K., et al. The complete nucleotide sequence of the tobacco chloroplast genome: its gene organi zation and expression. EMBO J. 5:2034-2049,1986. Anderson, S., et al. Sequence and organization of the human mitochondrial genome. Nature 290:457-465, 1981. Bibb, M.J.; Van Etten, R.A.; Wrigth, C.T.; Walberg, M.W.; Clayton, D.A. Sequence and gene organization of mouse mitochondrial DNA. Cell 26:167-180,1981. Breitenberger, CA.; RajBhandary, U.L. Some highlights of mitchondrial research based on analysis of Neurospora crassa mitchondrial DNA. Trends Biochem. Sci. 10:478-482,1985. Fox, T.D. Natural variation in the genetic code. Annu. Rev. Genet. 21:67-91,1987. Attardi, G. Animal mitochondrial DNA: an extreme ex ample of genetic economy. Int. Rev. Cytol. 93:93-145, 1985. Wilson, A. The molecular basis of evolution. Sci. Am. 253(4):164-173,1985. Levings, C.S. Molecular biology of plant mitochondria. Cell 56:171-179,1989. Mulligan, R.M.; Walbot, V. Gene expression and recom bination in plant mitochondrial genomes. Trends Ge net. 2:263-266,1986. Newton, K.J. Plant mitochodnrial genomes: organiza tion, expression and variation. Annu. Rev. Plant Phy siol. PlantMol. Biol. 39:503-532,1988.
Capitulo 14: Conversiön energätica: mitocondrias y cloroplastos
51. Clayton, D.A. Transcription of the mammalian mito chondrial genome. Annu. Rev. Biochem. 53:573-594, 1984. Grivell, L.A.; Schweyen, R.J. RNA splicing in yeast mito chondria: taking out the twists. Trends Genet. 5:3941,1989. Gruissem, W.; Barken, A.; Deng, S.; Stern, D. Transcrip tional and post-transcriptional control of plastid mRNA in higher plants. Trends Genet. 4:258-262,1988. Mullet, J.E. Chloroplast development and gene expres sion. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 39:475-502,1988. Rochaix, J.-D. Post-transcriptional steps in the expres sion of chloroplast genes. Annu. Rev. Cell Biol. 8:1-228,1992. 52. Birky, C.W., Jr. Transmission genetics of mitochondria and chloroplasts. Annu. Rev. Genet. 12:471-512, 1978. 53. Giles, R.E.; Blanc, H.; Cann, H.M.; Wallace, D.C. Mater nal inheritance of human mitochondrial DNA. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77:6715-6719,1980. 54. Attardi, G.; Schatz, G. Biogenesis of mitochondria. Annu. Rev. Cell Biol. 4:289-333, 1988. Bernardi, G. The petite mutation in yeast. Trends Bio chem. Sei. 4:197-201, 1979. Montisano, D.F.; James, T.W. Mitochondrial morphol ogy in yeast with and without mitochondrial DNA. /. Ultrastruct. Res. 67:288-296, 1979.
Bibliografía
55. DiMauro, S., et al. Mitochondrial myopathies. /. Inherit. Metab. Dis. 10(Suppl. 1):113-128, 1987. Wallace, D.C. Diseases of the mitochondrial DNA. Annu. Rev. Biochem. 61:1175-1212,1992. 56. Bishop, W.R.; Bell, R.M. Assembly of phospholipids into cellular membranes: biosynthesis, transmembrane movement, and intracellular translocation. Annu. Rev. Cell Biol. 4:579-611, 1988. 57. Butow, B.A.; Doeherty, R.; Parikh, V.S. A path from mito chondria to the yeast nucleus. Philos. Trans. R. Soc. Lond. (Biol.) 319:127-133,1988. Cavalier-Smith, T. The origin of eukaryotic and archaebacterial cells. Ann. N.Y. Acad. Sci. 503:17-54,1987. Gellissen, G.; Michaelis, G. Gene transfer: mitochondria to nucleus. Ann. N.Y. Acad. Sci. 503:391-401, 1987. Margulis, I. Symbiosis in Cell Evolution. New York: W.H. Freeman, 1981. Schwartz, R.M.; Dayhoff, M.O. Origins of prokaryotes, eukaryotes, mitochondria, and chloroplasts. Science 199:395-403, 1978. Whatley, J.M.; John, P.; Whatley, F.R. From extracellular to intracellular: the establishment of mitochondria and chloroplasts. Proc. R. Soc. Lond. (Biol.) 204:165187, 1979. 58. von Heijne, G. Why mitochondria need a genome. FEBS Lett. 198:1-4,1986.
769
Transmisión de señales entre células
—
i ! »•'■5
-------------- L, - ■
-
II ,
Principios generales de la señalización celular Señalización vía receptores de superficie celular asociados a proteínas G Señalización vía receptores de superficie celular asociados a enzimas Adaptación de las células diana La lógica de la señalización intracelular: lecciones de “redes neuronales” basadas en los ■ -y ordenadores El registro fósil sugiere que hace 3,5 mil millones de años ya existían sofisticados or ganismos unicelulares parecidos a las bacterias actuales, pero que al parecer fueron necesarios otros 2,5 mil millones de años para que apareciera el primer organismo pluricelular (véase Figura 1-17). ¿Por qué la pluricelularidad tardó tanto en evolu cionar? Aunque no podemos conocer la respuesta parece que esta cuestión está re lacionada con la necesidad de los organismos pluricelulares de elaborar señales que permitieran a sus células comunicarse entre sí, de forma que pudieran coordi nar su comportamiento en beneficio del organismo como un todo. Las señales in tercelulares, interpretadas por complejas maquinarias de la célula que responde a ellas, permite a cada célula determinar su posición y su papel especializado en el cuerpo y, por ejemplo, asegurar que cada célula se divida únicamente cuando sus vecinas dicten que ello puede ser posible. La importancia de estos “controles socia les” sobre la división celular se hace aparente cuando el control falla, dando lugar a un cáncer, que habitualmente mata el organismo pluricelular. A medida que vamos disponiendo de técnicas sofisticadas y potentes que nos permiten estudiar las células y los mecanismos que utilizan para com uni carse entre sí, lentamente vamos comprendiendo los procesos de señalización que utilizan los eucariotas superiores. Una célula animal contiene un elaborado sistema de proteínas que le permite responder a señales que provienen de otras células. El sistema incluye proteínas receptoras de la superficie celular, proteí nas receptoras intracelulares, proteína quinasas, proteína fosfatasas, proteínas que unen GTP y el enorme número de proteínas intracelulares con las que interactúan estas proteínas de señal. En este capítulo discutimos en primer lugar los principios generales de la señalización intercelular. En las dos secciones siguien tes consideramos las dos principales familias de proteínas receptoras de la super ficie celular, y cómo generan señales intracelulares. A continuación examinamos de qué forma las células se adaptan continuamente para responder de forma sen sible a pequeños cambios de concentración de moléculas señal extracelulares. Fi nalmente consideramos una analogía de las redes neuronales, basada en los or denadores, que nos proporciona sugerencias sobre la forma en que trabajan las complejas redes de señales intracelulares.
Principios generales de la señalización celular1 Casi con toda seguridad los mecanismos que permiten a una célula influir en el comportamiento de otra célula ya existían en el mundo de los organismos unice-
771
SEÑALIZACION POR MOLECULAS SEGREGADAS \
CELULA | SEÑAL I '
!
m olécula señal
Figura 15-1 Señalización intercelular en animales. Se ilustran dos sistemas a través de los que las células animales se comunican entre sí.
receptor
SEÑALIZACIÓN POR MOLÉCULAS UNIDAS A MEMBRANA PLASMÁTICA
CELULA SEÑAL
RECEPTORES DE SUPERFICIE CELULAR m olécula señal receptor
lulares mucho antes de que los organismos pluricelulares aparecieran sobre la Tierra. Algunas evidencias de ello provienen de estudios realizados en eucariotas unicelulares actuales, como las levaduras. A pesar de que normalmente estas c é lulas llevan una vida independiente, pueden comunicarse entre sí, y cada una de ellas puede influir en la proliferación de otra, en preparación del acoplamiento sexual. En la levadura de gemación Saccharomyces cerevisiae, por ejemplo, cuan do un individuo haploide está preparado para el acoplamiento, segrega un péptido denominado factor de acoplamiento que constituye una señal para que las cé lulas cuyo tipo de acoplamiento es el contrario dejen de proliferar y se preparen para la conjugación; la fusión de dos células haploides de tipo de acoplamiento contrario produce una célula diploide, la cual entonces puede sufrir una meiosis y esporular, generando células haploides con una nueva dotación de genes. Estudios sobre levaduras mutantes que son incapaces de acoplarse han per mitido identificar muchas proteínas que son necesarias para este proceso de se ñalización. Estas proteínas forman una red de señalización que incluye recepto res de superficie celular, proteínas que unen GTP y proteína quinasas, cada una de las cuales tiene parientes cercanos entre las proteínas que participan en la se ñalización de las células animales. Sin embargo, a través de la duplicación génica y de la divergencia, los sistemas de señalización de los animales se han vuelto mucho más elaborados que los de las levaduras.
Las moléculas señal extracelulares son reconocidas por receptores específicos de la superficie o del interior de las células diana2 Mientras que las células de levadura se comunican entre ellas para acoplarse, se cretando diversos tipos de pequeños péptidos, las células de los animales superio res se comunican mediante centenares de tipos de moléculas señal, incluyendo proteínas, pequeños péptidos, aminoácidos, nucleótidos, esteroides, retinoides, derivados de ácidos grasos, e incluso gases disueltos como el óxido nítrico y el monóxido de carbono. La mayoría de estas moléculas señal están secretadas por las células señal mediante exocitosis (véase Capítulo 13). Otras se liberan por difu sión a través de la membrana plasmática y sólo influyen en las células que están en contacto con la célula señalizadora (Figura 15-1). Sea cual sea la naturaleza de la molécula señal, la célula diana responde m e diante una proteína específica denominada receptor. Se une específicamente a la molécula señal, y entonces inicia una respuesta en la célula diana. Muchas de las moléculas señal extracelulares actúan a concentraciones muy bajas (típica mente <10~8M), y los receptores que las reconocen usualmente se unen a ellas con una elevada afinidad (constante de afinidad Ka > 108litros/mol; véase Figura 3-9). En la mayoría de los casos los receptores son proteínas transmembrana de
772
Capítulo 15 : Transmisión de señales entre células
receptor de la superficie celular \
m em brana plasmática
m olécula señal hidrofílica RECEPTORES INTRACELULARES pequeña m olécula ^señal hidrofóbica *
proteina ' transportadora/
receptor intracelular Figura 15-2 Las moléculas señal extracelulares se unen a receptores de la superficie celular o a receptores intracelulares. La mayoría de las moléculas señal son hidrofílicas, por lo que son incapaces de atravesar directamente la membrana plasmática; en lugar de ello, se unen a receptores de la superficie de la célula los cuales, a su vez, generan una o varias señales en el interior de la célula diana. Por el contrario, algunas pequeñas moléculas señal difunden a través de la membrana plasmática y se unen a receptores situados en el interior de la célula diana -en el citosol o en el núcleo (como se observa en la figura). Muchas de estas pequeñas moléculas señal son hidrofóbicas y casi insolubles en soluciones acuosas; por ello, son transportadas a través del torrente sanguíneo y de otros fluidos extracelulares, unidas a proteínas transportadoras, de las que han de disociarse antes de entrar a la célula diana.
las superficie de las células diana; cuando se unen a una molécula señal extracelular (un ligando) se vuelven activos, de forma que generan una cascada de seña les intracelulares que alteran el comportamiento de la célula. En algunos casos, sin embargo, los receptores están situados en el interior de la célula diana, y el li gando señal entra a la célula para activarlos: estas moléculas señal, por lo tanto, han de ser suficientemente pequeñas e hidrofóbicas para poder difundir a través de la m em brana plasmática (Figura 15-2). En este capítulo nos centraremos fundamentalmente en el estudio de la co municación entre células animales mediada por señales químicas segregadas. Este énfasis refleja el estado actual de conocimientos sobre el tema: las moléculas segregadas son mucho más fáciles de estudiar que las moléculas unidas a m em brana, por lo que conocemos muchos más detalles de su actuación. La señaliza ción dependiente de contacto, vía moléculas unidas a membrana, es mucho más difícil de estudiar y por ello mucho peor conocida, pero es de crucial importancia especialmente durante el desarrollo y en la respuesta inmune; como veremos más adelante, la base molecular de este sistema de comunicación puede ser simi lar a la de la señalización a distancia.
Las moléculas secretadas median tres formas de señalización: la paracrina, la sináptica y la endocrina2 Las moléculas señal que segrega una célula pueden ser transportadas a largas distancias para que actúen sobre células diana muy alejadas, o pueden actuar com o mediadores locales afectando únicamente las células del ambiente inm e diato de la célula señal. Este último proceso se denomina señalización p aracri na (Figura 15-3A). Para que las señales paracrinas solamente afecten a las célu las diana más cercanas, es necesario que las moléculas señal segregadas no puedan difundir mucho; por esta razón habitualmente son captadas rápidamen te por las células diana vecinas, destruidas por enzimas extracelulares o inmovi lizadas por la matriz extracelular. Para un organismo pluricelular, grande y complejo, la señalización de corto alcance no es suficiente para coordinar el comportamiento de sus células. Por ello han evolucionado conjuntos de células especializadas en la señalización en tre partes del cuerpo muy separadas entre sí. Las más sofisticadas de ellas son las células nerviosas, o neuronas, las cuales típicamente emiten largas prolonga ciones (axones) que entran en contacto con células diana alejadas. Cuando es activada por señales del ambiente o de otras células nerviosas, la neurona envía impulsos eléctricos (potenciales de acción) a lo largo de su axón; cuando uno de estos impulsos llega al terminal nervioso, en el extremo del axón, estimula al ter minal para que segregue una señal química denominada neurotransmisor. El terminal nervioso entra en contacto con su célula diana a través de uniones ce lulares especiales denominadas sinapsis químicas, las cuales parecen estar dise ñadas para asegurar que el neurotransmisor sea liberado sobre la membrana postsináptica de la célula diana, rápida y específicamente (Figura 15-3B). Este
Figura 15-3 Tres formas de señalización mediadas por moléculas segregadas. En las señalizaciones paracrina, sináptica y endocrina se utilizan muchos tipos iguales de moléculas señal. Las diferencias cruciales radican en la velocidad y en la selectividad con las que son liberadas las señales a sus células diana.
(C) ENDOCRINA célula endocrina
célula diana Principios generales de la señalización celular
773
Figura 15-4 Contraste entre las señalización endocrina y la sináptica. Las células endocrinas y las células nerviosas actúan conjuntamente coordinando las diversas actividades de los miles de millones de células de un animal superior. Las células endocrinas segregan a la circulación muchos tipos diferentes de hormonas, para señalizar células diana específicas. Las células diana tienen receptores que se unen específicamente a las hormonas, de forma que tienen que “atrapar” del líquido extracelular las hormonas adecuadas. En la señalización sináptica, por el contrario, la especificidad reside en los contactos entre las prolongaciones nerviosas y las células nerviosas determinadas que señalizan: habitualmente sólo la célula diana que se halla en contacto sináptico con la célula nerviosa está expuesta al neurotransmisor liberado por el terminal nervioso (a pesar de que algunos neurotransmisores actúan de una manera paracrina como mediadores locales que influyen sobre muchas células diana en una cierta área). Mientras que diferentes células endocrinas han de utilizar diferentes hormonas para conseguir comunicarse específicamente con sus células diana, muchas células nerviosas pueden utilizar el mismo neurotransmisor y, a pesar de ello, comunicarse también de una forma específica.
proceso de señalización sináptica se trata en detalle en el Capítulo 11, por lo que no será considerado aquí. Las otras células señal especializadas que controlan el comportamiento del organismo como un todo son las células endocrinas. Segregan sus moléculas se ñal, denominadas hormonas, en el torrente sanguíneo (de un animal) o en la savia (de una planta), los cuales transportan la señal hasta las células diana distribuidas ampliamente por todo el cuerpo (Figura 15-3C). En la Figura 15-4 se contrastan los diferentes sistemas a través de los cuales las células endocrinas y las células ner viosas coordinan el comportamiento celular en los animales. Como la señalización endocrina depende de la difusión y del flujo sanguí neo, es relativamente lenta. Las células nerviosas, por el contrario, pueden al canzar una velocidad y una precisión mucho más elevadas. Pueden transmitir información a grandes distancias mediante impulsos eléctricos que transportan la señal a lo largo de las prolongaciones nerviosas, a velocidades de hasta 100 metros por segundo. Una vez liberado por un terminal nervioso, un neurotrans misor difunde no más de 100 nm de la célula diana, un proceso que dura menos de un milisegundo. Otra diferencia entre la transmisión endocrina y la sináptica es que, mientras que las hormonas se diluyen enormem ente en la sangre circu lante y en el líquido intersticial, por lo que han de poder actuar a concentracio nes muy bajas (típicamente < 10_8M), los neurotransmisores se diluyen mucho menos, pudiendo llegar a alcanzar concentraciones locales altas. Por ejemplo, la concentración del neurotransmisor acetilcolina en la hendidura sináptica de una unión neuromuscular activa es de alrededor de 5 x 10-4M. Por lo tanto, en la señalización sináptica los receptores de los neurotransmisores tienen una afini dad relativamente baja para sus ligandos, lo cual significa que el neurotransmi sor puede disociarse rápidamente del receptor, con lo que acaba la respuesta. (Los neurotransmisores son rápidamente retirados de la hendidura sináptica, tanto por enzimas hidrolíticas específicas como por proteínas de mem brana que transportan específicam ente el neurotransmisor, bombeándolo de nuevo hacia el terminal nervioso o hacia las células gliales vecinas.)
La señalización autocrina puede coordinar decisiones de grupos de células idénticas3 Todas las formas de señalización que hemos descrito permiten a un tipo celular influir sobre otro tipo celular. Sin embargo, mediante el mismo mecanismo las cé lulas pueden enviar señales a otras células del mismo tipo, de lo que se deduce que pueden enviarse incluso señales a ellas mismas. En una señalización de este tipo, denominada autocrina, una célula segrega moléculas señal que pueden
774
Capítulo 15 : Transmisión de señales entre células
(A) SEÑALIZACIÓN ENDOCRINA
varias células endocrinas
varias horm onas
(B) SEÑALIZACIÓN SINÁPTICA varias neuronas
varias células diana
• (.
Figura 15-5 Señalización autocrina. Un grupo de células idénticas produce concentraciones de molécula señal más elevadas que una célula sola.
v~* S- .. V
•7v
'&•
•’ •
%••A t•í •
•V
UNA SOLA CELULA SEÑAL RECIBE UNA SEÑAL AUTOCRINA MÁS DÉBIL
EN UN GRUPO DE CELULAS SEÑAL IDÉNTICAS, CADA CÉLULA RECIBE UNA SEÑAL AUTOCRINA MAYOR
unirse a receptores de la propia célula. Durante el desarrollo, por ejemplo, cuando una célula ha sido dirigida a una etapa determinada de diferenciación, puede co menzar a segregar señales autocrinas que refuercen esta decisión de desarrollo. La señalización autocrina es más efectiva cuando se lleva a cabo simultánea mente por varias células vecinas del mismo tipo, por lo que puede utilizarse para estimular a grupos de células idénticas para que tom en las mismas decisiones de desarrollo (Figura 15-5). Así, se cree que la señalización autocrina constituye un posible m ecanismo sobre el que se basa el “efecto comunitario” observado en las primeras etapas del desarrollo, según el cual un grupo de células idénticas puede responder a señales que inducen diferenciación mientras que una célula aislada no puede hacerlo. Pero, la señalización autocrina no se produce sólo durante el desarrollo. Los eicosanoides son moléculas señal que a menudo actúan de una forma autocrina en los mamíferos maduros. Estos derivados de ácidos grasos están sintetizados por células de todos los tejidos de mamífero. Se sintetizan continuamente en la membrana plasmática y se liberan al exterior celular, donde son rápidamente de gradados por enzimas del medio extracelular. Sintetizados a partir de precursores (principalmente de ácido araquidónico) liberados a partir de los fosfolípidos de la membrana celular mediante la acción de fosfolipasas (Figura 15-6), tienen una gran variedad de actividades biológicas; por ejemplo influyen sobre la contrac ción del músculo liso y la agregación de las plaquetas y participan en las respues-
'C - O - C H ,
fosfolípido de m em brana
II O
I “
-O -C H
Ó
C h U —O — P —O — X
fosfolipasa A 2 ácido araquidónico (20 carbonos) en co nfo rm ac Io n exte n d id a
/= w = \
a
O
/C O O H
Figura 15-6 La síntesis de un eicosanoide. Los eicosanoides son continuamente sintetizados en las membranas, a partir de cadenas de ácidos grasos de 20 carbonos que contengan, al menos, tres dobles enlaces, como se muestra en (A) para el caso de la síntesis de prostaglandina PGE2. El subíndice se refiere a los dos dobles enlaces carbono-carbono situados fuera del anillo de PGE2. Existen cuatro clases principales de eicosanoides -las prostaglandinas, las prostaciclinas, los tromboxanos y los leucotrienos- y todas ellas están sintetizadas a partir del ácido araquidónico. La síntesis de todas ellas, excepto de los leucotrienos, se produce por la acción de la ciclooxigenasa; la síntesis de los leucotrienos se produce por la acción de la lipoxigenasa (B). Estas etapas biosintéticas son diana de una gran cantidad de drogas terapéuticas, ya que los eicosanoides son importantes en procesos de dolor, fiebre e inflamación. Por ejemplo, las hormonas corticoesteroideas, como el cortisol, inhiben la actividad de la fosfolipasa de la primera etapa de la síntesis de eicosanoides, por lo que son ampliamente utilizadas clínicamente para tratar enfermedades inflamatorias no infecciosas, como son algunas formas de artritis. Por el contrario, drogas antiinflamatorias no esteroideas, como la aspirina y el ibupofrén, bloquean la primera etapa de oxidación, catalizada por la ciclooxigenasa. Algunas prostaglandinas producidas en grandes cantidades en el útero en el momento del parto y que estimulan la contracción del músculo liso uterino, se utilizan para inducir abortos.
ácido araquidónico ácido araquidónico en conform ación plegada
COOH
ETAPA DEPENDIENTE DE LA CICLOOXIGENASA
prostaglandinas, prostaciclinas, trom boxanos
p r o st a g Ia n dina (PG E2) (A)
Principios generales de la señalización celular
E TA PA DEPENDIE
r
DE LA LIPOXIGENASA
leucotrienos
(B) 775
tas inflamatorias y febriles. Cuando las células se activan por daño tisular o por algún tipo de señales químicas, se incrementa la velocidad de síntesis de ecosanoides; el incremento resultante de los niveles locales de eicosanoides influye tanto sobre las células que los sintetizan como sobre sus vecinas inmediatas.
Las uniones com unicantes perm iten que la inform ación de señalización sea compartida por las células vecinas4 Otra vía para coordinar las actividades de las células vecinas consiste en las unio nes com unicantes o de tipo gap. Se trata de uniones especializadas célula-célula que pueden formarse entre membranas plasmáticas situadas en estrecho contac to, y que conectan directamente los citoplasmas de las células que unen, a través de estrechos canales llenos de agua (véase Figura 19-15). Los canales permiten el intercambio de pequeñas moléculas señal intracelulares (mediadores intracelula res), como el Ca2+y el AMP cíclico, pero no el de macromoléculas como proteínas y ácidos nucleicos. Así pues, las células conectadas por uniones de tipo gap pue den comunicarse entre ellas directamente, sin tener la dificultad de la barrera que supone la presencia de las m embranas plasmáticas (Figura 15-7). Como se discute en el Capítulo 19, el patrón de distribución de las conexio nes com unicantes en un tejido puede ponerse de manifiesto tanto eléctricam en te, con electrodos intracelulares, com o visualmente, tras la microinyección de colorantes solubles en agua. Estudios de este tipo indican que las células de un embrión en desarrollo forman y deshacen uniones com unicantes siguiendo pa trones específicos y muy interesantes, lo cual sugiere que estas uniones juegan un importante papel en los procesos de señalización que tienen lugar entre estas células. Puede sospecharse que, com o en el caso de la señalización autocrina descrita con anterioridad, las uniones com unicantes colaboran en la coordina ción del comportamiento de las células vecinas de tipo similar. Sin embargo, no sabemos qué pequeñas moléculas en particular son importantes transportado res de señales a través de las uniones comunicantes; tampoco se ha definido con precisión cuál es la función precisa de la com unicación a través de las uniones de tipo gap en el desarrollo animal.
Cada célula está programada para responder a com binaciones específicas de m oléculas señal5 Cualquier célula dada de un organismo pluricelular está expuesta a muchas -quizás cien tos- señales diferentes de su entorno. Estas señales pueden ser solu bles, estar unidas a la matriz extracelular o estar unidas a la superficie de las cé lulas vecinas, y pueden actuar en varios millones de combinaciones posibles. La célula responderá a esta selectividad de babel, de acuerdo con su carácter espe cífico adquirido mediante la progresiva especialización celular, en el curso del desarrollo. Así pues, una célula puede estar programada para responder a un conjunto de señales, diferenciándose, a otro conjunto de señales, proliferando, y a un tercer grupo de señales, desarrollando algunas funciones especializadas. La mayoría de las células de los animales superiores, sin embargo, están programadas para depender de un grupo específico de señales simplemente para sobrevivir: cuando son deprivadas de las señales adecuadas (por ejemplo, en una placa de cultivo), las células inician un programa suicida y se autodestruyen -u n proceso denominado muerte celular programada, que se discute más extensam ente en el Capítulo 21 (Figura 15-8). Diferentes tipos de células requie ren diferentes conjuntos de señales de supervivencia, y por ello su localización está restringida a diferentes ambientes en el cuerpo. Debido a que generalmente las moléculas señal actúan en combinaciones de ellas, un animal puede controlar el comportamiento de sus células de una manera altamente específica, utilizando una diversidad limitada de tales m olé culas: cientos de moléculas señal pueden utilizarse en millones de com binacio nes diferentes.
776
Capítulo 15 : Transmisión de señales entre células
Figura 15-7 Señalización a través de uniones comunicantes. Las células que están conectadas por uniones comunicantes comparten las pequeñas moléculas, incluidas las pequeñas moléculas señal intracelulares, por lo que pueden responder a señales extracelulares de una forma coordinada.
MUERTE CELULAR PROGRAMADA
Ax
B——
I -
SOBREVIVE
PROLIFERA
—
(
•
C
•
D
Figura 15-8 Señalización combinatoria. Cada tipo de célula presenta un conjunto de receptores que le permite responder a un conjunto correspondiente de moléculas señal producidas por otras células. Varias de estas moléculas señal actúan de forma combinada, regulando el comportamiento de la célula. Como se muestra aquí, muchas células requieren múltiples señales {flechas verdes) para sobrevivir y señales adicionales {flechas rojas) para proliferar; si se depriva a las células de todas esas señales, inician un programa de muerte celular.
(A) fibra m uscular esquelética
Diferentes células pueden responder de form a diferente a la m ism a señal quím ica6 La manera específica en que una célula reacciona con su entorno, varía, en pri mer lugar, de acuerdo con el conjunto de proteínas receptoras que posee la célu la y a través de las que detecta un conjunto particular de todas las señales que le son asequibles y, en segundo lugar, de acuerdo con la maquinaria intracelular a través de la cual la célula integra e interpreta la información que recibe. Así, a menudo una misma molécula señal tiene efectos diferentes sobre células diana diferentes. Por ejemplo, el neurotransmisor acetilcolina estimula la concentra ción de las células del músculo esquelético pero disminuye la frecuencia y la fuerza de contracción de las células musculares del corazón. Ello es debido a que las proteínas receptoras de acetilcolina de las células musculares esqueléticas son diferentes de las de las fibras musculares del corazón. Sin embargo, no siem pre son las diferencias entre los receptores lo que explica las diferencias de efec tos. En muchos casos la misma molécula señal se une a proteínas receptoras idénticas y produce respuestas muy diferentes en diferentes tipos de células dia na, lo cual refleja diferencias en la maquinaria enzimàtica a la que están acopla dos los receptores (Figura 15-9).
La concentración de una m olécula puede ajustarse rápidamente sólo si la vida media de la m olécula es corta6 Es natural pensar en los sistemas de señalización en términos de los cambios que se producen cuando se libera una señal. Pero tam bién resulta importante considerar qué ocurre cuando se elimina una señal. Durante el desarrollo a m e nudo señales transitorias producen efectos duraderos: pueden desencadenar un cambio que persiste indefinidamente, a través de mecanismos de memoria celu lar como los discutidos en los Capítulos 9 y 21 . Sin embargo, en la mayoría de los casos, especialmente en los tejidos adultos, la respuesta se desvanece cuando cesa una señal. La señal actúa sobre un sistema de moléculas que están en conti-
RELAJACIÓN
(C) célula secretora
SECRECIÓN Figura 15-9 Una misma molécula señal puede inducir respuestas diferentes en células diana diferentes. En algunos casos, ello es debido a que la molécula señal se une a proteínas receptoras diferentes, tal como se ilustra en (A) y (B). En otros casos, la molécula señal se une a proteínas receptoras idénticas pero éstas activan respuestas diferentes en células diferentes, tal como se ilustra en (B) y (C). En todos los casos mostrados aquí la molécula señal es la acetilcolina (D).
Principios generales de la señalización celular
(D) acetilcolina O h 3c
—
Il
c
CH, —
o
—
I
c h 2— c h 2— n
+— c h 3
ch
, 777
2 4 6 8 10 m inutos después de que la velocidad de síntesis haya dism inuido en un factor de 10 (A)
2 4 6 8 10 m inutos después de que la velocidad de síntesis haya aum entado en un factor de 10 (B)
nuo recambio, de forma que cuando la señal cesa el reemplazamiento de las moléculas viejas por moléculas nuevas borra las trazas de su acción. De ello se deduce que la velocidad de la reacción para eliminar los efectos de la señal de pende de la velocidad del recambio de las moléculas a las que afecta la señal. Puede no resultar tan obvio que esta velocidad de recambio también determine la prontitud de la respuesta cuando la señal se activa. Consideremos por ejemplo dos moléculas intracelulares X e Y, y que ambas se mantienen normalmente a una concentración de 1000 moléculas por célula. La molécula X tiene una velocidad de recambio baja: es sintetizada y degradada a una velocidad de 10 moléculas por segundo, de forma que cada molécula tiene una vida media de 100 segundos. A su vez, la molécula Y se recambia 10 veces más rápidamente: es sintetizada y degradada a una velocidad de 100 moléculas por segundo, de forma que cada molécula tiene una vida media de 10 segundos. Si una señal que actúa sobre la célula increm enta 10 veces las velocidades de síntesis tanto de X com o de Y sin alterar las vidas medias, al final del primer se gundo la concentración de Y se habrá incrementado unas 900 moléculas en cada célula (10 x 100 - 100) mientras que la concentración de X sólo se habrá incre mentado 90 moléculas por célula. De hecho, después de que su velocidad de síntesis haya aumentado o disminuido abruptamente, el tiempo necesario para que una molécula llegue a medio camino entre su concentración antigua y su nueva concentración de equilibrio es igual a su vida media -e s decir, es igual al tiempo que sería necesario para que su concentración bajara a la mitad si se pa rara com pletam ente su síntesis (Figura 15-10). El mismo principio se aplica tanto a proteínas como a pequeñas moléculas, y tanto a moléculas del espacio extracelular como intracelulares. Muchas proteí nas intracelulares que son degradadas rápidamente tienen vidas medias cortas; algunas de ellas sobreviven m enos de 10 minutos; en la mayoría de los casos se trata de proteínas cuyo papel regulador es clave, y cuyas concentraciones celula res están reguladas rápidamente mediante cambios en la velocidad de su sínte sis. De la misma forma, cualquier modificación covalente de una proteína, que tenga lugar como parte de un proceso de rápido de señalización -habitualm ente la adición de un grupo fosfato a una cadena lateral de un am inoácido- ha de ser eliminada continuam ente a una gran velocidad para hacer posible tal señaliza
778
Capítulo 15 : Transmisión de señales entre células
Figura 15-10 La im portancia de un recam bio rápido. La figura muestra predicciones de las velocidades relativas de cam bio de las concentraciones intracelulares de moléculas que tienen diferentes velocidades de recambio, cuando sus velocidades de síntesis disminuyen (A) o aumentan (B) repentinamente en un factor de 10. En ambos casos la concentración de las moléculas que normalmente son degradadas rápidamente en la célula (lín eas rojas) cambia rápidamente mientras que la concentración de las moléculas que normalmente son degradadas más lentamente (lín eas verdes) cambia proporcionalmente más despacio. Los números (en azul) del lado derecho de las gráficas son las vidas medias asumidas para cada una de las diferentes moléculas.
ción. Más adelante discutimos en detalle algunos de estos procesos moleculares, para el caso de procesos de señalización que trabajan vía receptores de superfi cie celular. Sin embargo, los principios se aplican de forma general, como ilus tran los siguientes ejemplos.
El gas óxido nítrico actúa como una señal, uniéndose directam ente a una enzima en el interior de la célula diana7 A pesar de que la mayoría de las señales extracelulares están mediadas por m olé culas hidrofílicas que se unen a receptores situados en la superficie de la m em brana de la célula diana, algunas moléculas señal son suficientemente hidrofóbicas y/o suficientemente pequeñas para atravesar fácilmente la membrana de la célula diana; una vez en el interior, regulan directamente la actividad o la especi ficidad de una proteína intracelular. Un ejemplo remarcable lo constituye el gas óxido nítrico (NO), el cual recientemente ha sido reconocido como una m olécu la señal en los vertebrados. Por ejemplo, cuando la acetilcolina es liberada por nervios autónomos a las paredes de los vasos sanguíneos, hace que las fibras musculares lisas se relajen. La acetilcolina actúa indirectamente induciendo a las células endoteliales a sintetizar y liberar NO, el cual hace que las células m uscu lares lisas se relajen. El efecto de NO sobre los vasos sanguíneos proporciona una explicación del mecanismo de acción de la nitroglicerina, que ha sido utilizada durante más de 100 años para tratar pacientes con angina de pecho (dolor debi do a un flujo sanguíneo inadecuado en el músculo cardíaco). La nitroglicerina es transformada en NO, que relaja los vasos sanguíneos, reduciendo el trabajo del corazón y, en consecuencia, el requerimiento de oxígeno del músculo cardíaco. También se produce NO como mediador local por macrófagos y neutrófilos acti vados para colaborar en el proceso de eliminación de microorganismos invaso res. Además, se utiliza por muchos tipos de células nerviosas para señalizar célu las vecinas: el NO liberado por nervios autónomos en el pene, por ejemplo, hace que se dilaten los vasos sanguíneos locales que son responsables de la erección. El NO es sintetizado por la enzima NO sintasa mediante la desaminación del aminoácido arginina. Como difunde fácilmente a través de las membranas, el NO difunde fuera de la célula que lo sintetiza, y entra directamente en las células vecinas. Sólo actúa localmente debido a que en el espacio extracelular su vida media es muy corta -en tre 5 y 10 segundos- transformándose en nitratos y nitri tos al com binarse con oxígeno y agua. En muchas células diana, como las células endoteliales, el NO reacciona un átomo de hierro del lugar activo de la enzima guanilato ciclasa, estimulándola para que produzca el mediador intracelular GMP cíclico, del que hablaremos más adelante. Los efectos del NO pueden ser rápidos, ocurriendo en cuestión de segundos, debido a que la velocidad de re cambio del GMP cíclico es alta: la rápida producción de GMP cíclico a partir de GTP por la guanilato ciclasa está compensada por la rápida degradación a GMP por una fosfodiesterasa. Existen evidencias recientes de que el monóxido de car bono (CO) también se utiliza como una señal intracelular, y de que puede actuar de la misma forma que el NO, estimulando la guanilato ciclasa. Los gases como el NO y el CO no son las únicas moléculas señal que pueden pasar directamente a través de la membrana plasmática de la célula diana. Tam bién entran en la célula diana, de esta forma, un grupo de hormonas no gaseo sas, pequeñas e hidrofóbicas, y varios mediadores locales; sin embargo, en lugar de unirse directamente a enzimas, se unen a receptores intracelulares que regu lan directamente la transcripción génica.
Las horm onas esteroideas, las horm onas tiroideas, los retinoides y la vitam ina D se unen a receptores intracelulares que son proteínas reguladoras de genes activadas por ligando8 Las hormonas esteroideas, las hormonas tiroideas, los retinoides y la vitamina D son pequeñas moléculas hidrofóbicas, muy diferentes entre sí tanto en estructu-
Principios generales de la señalización celular
779
c h 2o h
I
c=o OH
testosterona
estradiol
cortisol
tiroxina
ra química (Figura 15-11) com o en función. Sin embargo, todas ellas actúan a través de un mecanismo similar. Difunden directamente a través de la membrana plasmática de las células diana y se unen a proteínas receptoras intracelulares. La unión del ligando activa los receptores, los cuales entonces regulan directamente la transcripción de determinados genes. Estos receptores tienen estructuras rela cionadas entre sí y constituyen la superfamilia de receptores intracelulares (o superfamilia de receptores de hormonas esteroideas) (Figura 15-12). Todas las horm onas esteroideas, incluyendo el cortisol, las hormonas se xuales, la vitamina D (en los vertebrados) y la hormona de la muda ecdisona (en los insectos), están sintetizadas a partir del colesterol. El cortisol se produce en el córtex de las glándulas adrenales y afecta el metabolismo de muchos tipos celu lares. Las hormonas esteroideas sexuales se sintetizan en los testículos y en los ovarios y son responsables de las características sexuales secundarias que distin guen los m achos de las hembras. La vitamina D se sintetiza en la piel en res puesta a la luz solar; después de transformarse en una forma activa en el riñón o en el hígado, regula el m etabolismo del Ca2+, favoreciendo la captación de Ca2+ en el intestino y reduciendo su excreción por el riñón. Las horm onas tiroideas, que son sintetizadas a partir del aminoácido tirosina, incrementan el m etabolis mo de una gran variedad de tipos celulares, mientras que los retinoides, como el ácido retinoico, que se sintetizan a partir de la vitamina A, juegan un importante papel como mediadores locales durante el desarrollo de los vertebrados. A pesar de que todas estas moléculas señal son relativamente insolubles en agua, se ha
com plejo proteico lugar de unión a la horm ona inhibidor C0QH I dom inio de activación de la transcripción
/A (
dominio de unión , al DNA
receptor de cortisol
1
receptor de estrògeno dom inio de unión al DNA horm ona esteroidea
región bisagra receptor de progesterona N ---------------------------- C receptor de vitam ina D
lugar de unión al DNA expuesto N ------ m --------------------C receptor de horm onas tiroideas
(A)
780
(B)
Capítulo 15: Transmisión de señales entre células
Nreceptor de ácido retinoico
ácido retinoico
Figura 15-11 Algunas moléculas señal que se unen a receptores intracelulares. Nótese que todas ellas son pequeñas e hidrofóbicas. Se muestra la forma activa, hidroxilada, de la vitamina D3.
Figura 15-12 La superfamilia de receptores intracelulares. (A) Modelo de proteína receptora de hormonas esteroideas. En su estado inactivo el receptor se halla unido a un complejo proteico inhibidor que contiene una proteína activada por estrés calorífico (heat shock protein) denominada Hsp90 (se discute en el Capítulo 5). La unión del ligando al receptor hace que la proteína inhibidora se disocie, de forma que el receptor se activa exponiendo su lugar de unión al DNA. El modelo que se presenta en la figura se basa en el receptor para el cortisol (glucocorticoides), pero todos los receptores de la superfamilia tienen una estructura similar a ésta, como se muestra en (B), donde se han dibujado en verde los cortos dominios de unión al DNA de cada receptor. Experimentos de intercambio de dominios sugieren que en estos receptores la mayoría de los dominios de unión a la hormona, de activación de la transcripción y de unión al DNA pueden actuar como módulos intercambiables. Se cree que todos los receptores intracelulares se unen al DNA como homodímeros o como heterodímeros.
cen solubles para su transporte por el torrente sanguíneo y otros líquidos extracelulares mediante su unión a proteínas transportadoras específicas, de las que se disocian antes de entrar en la célula diana (véase Figura 15-2). Además de la diferencia fundamental en la manera en que señalizan a sus células diana, la mayoría de las moléculas insolubles en agua se diferencian de las solubles en agua en cuanto al tiempo que se mantienen en el torrente sanguí neo y en los tejidos. La mayoría de las hormonas solubles en agua se eliminan y lo degradan en cuestión de minutos después de entrar en la sangre y los m e diadores locales y los neurotransmisores son eliminados del espacio extracelular incluso más rápidamente -e n cuestión de segundos o de milisegundos. Las hor monas esteroideas, por el contrario, persisten en la sangre durante horas, y las hormonas tiroideas durante días. En consecuencia, las moléculas señal solubles en agua habitualmente median respuestas de duración corta mientras que las insolubles en agua tienden a mediar respuestas más duraderas. Todos los receptores intracelulares para las hormonas esteroideas, para las hormonas tiroideas, para los retinoides y para la vitamina D, se unen a secuen cias específicas del DNA adyacentes a los genes que están regulados por el ligan do correspondiente. Algunos de ellos, como los receptores de cortisol, se locali zan principalmente en el citoplasma y sólo se unen al DNA después de unirse al ligando (véase Figura 15-12); otros, com o los receptores de retinoides, se locali zan principalmente en el núcleo y se unen al DNA incluso en ausencia de ligan do. En cualquier caso, la unión del ligando altera la conformación de la proteína receptora, la cual entonces activa (u ocasionalmente inhibe) la transcripción génica. En m uchos casos la respuesta tiene lugar en dos etapas: en primer lugar la inducción directa de la transcripción de un pequeño número de genes específi cos, en cuestión de 30 minutos, y que se conoce como la respuesta prim aria ; los productos de estos genes, a su vez, activan otros genes, produciendo una res puesta retardada, denominada respuesta secundaria. Así, un simple incremento hormonal puede generar un complejo cambio del patrón de expresión génica (Figura 15-13). La respuesta a las hormonas tiroideas y esteroideas, a la vitamina D y a los retinoides, como en el caso de las respuestas a señales extracelulares en general, está determinada tanto por la naturaleza de la célula diana como por la natura leza de la m olécula señal. A pesar de que diferentes tipos celulares tengan recep tores intracelulares idénticos, el conjunto de genes que regula el receptor es di-
(A) RESPUESTA PRIMARIA TEMPRANA A LA HORMONA ESTEROIDEA
Figura 15-13 Respuesta primaría temprana (A) y respuesta secundaria retardada (B) que resulta de la activación de receptores proteicos intracelulares. Se ilustra la respuesta a una hormona esteroidea, pero estos mismos principios se pueden aplicar a todos los ligandos que activan alguno de los componentes de esta familia de proteínas receptoras. Algunas de las proteínas de la respuesta primaria activan a los genes de la respuesta secundaria, mientras que otras inactivan a los genes de la respuesta primaria. El número real de genes implicados en las respuestas primaria y secundaria es mayor que el que se indica en este dibujo. Como era de esperar, las drogas que inhiben la síntesis proteica suprimen la transcripción de los genes de la respuesta secundaria pero no los de la respuesta primaria.
(B) RESPUESTA SECUNDARIA RETARDADA A LA HORMONA ESTEROIDEA
horm ona receptor de horm ona esteroidea esteroidea
AA proteínas de la respuesta secundaria los com plejo s ho rm on a esteroidea-recepto r activan los genes de la respuesta prim aria
DNA
inducción de la síntesis de algunas proteínas diferentes en la respuesta prim aria
Principios generales de la señalización celular
una proteína de la respuesta prim aria inactiva los genes de la respuesta prim aria
una proteína de la respuesta prim aria activa los genes de la respuesta secundaria
781
ferente en cada caso. Ello es debido a que generalmente a cada gen eucariota se le ha de unir más de un tipo de proteína reguladora de genes, para activar su transcripción. Por ello, un receptor intracelular puede activar un gen sólo si exis te la com binación adecuada de otras proteínas reguladoras de genes, y algunas de ellas son específicas del tipo celular. Así, las hormonas tiroideas, la vitamina D y cada una de las hormonas esteroideas y de retinoides inducen un conjunto característico de respuestas en los animales, debido a que: ( 1) únicamente ciertos tipos celulares tienen receptores para ello; y (2) cada uno de estos tipos celulares contienen una combinación diferente de otras proteínas reguladoras de genes, que colaboran con el receptor activado influyendo en la transcripción de conjun tos específicos de genes. En el Capítulo 9 se discuten los detalles moleculares so bre cómo los receptores intracelulares y otras proteínas reguladoras controlan la transcripción de genes de forma específica.
Se conocen tres clases de proteínas receptoras de superficie celular: las asociadas a canales iónicos, las asociadas a proteínas G y las asociadas a enzimas9 Las técnicas de DNA recom binante han revolucionado el estudio de los recepto res y de las proteínas intracelulares que participan en la señalización celular. Es tas proteínas a menudo constituyen menos del 0,01% de la masa proteica total de una célula, por lo que ha resultado extremadamente difícil purificarlas. El clonaje de las secuencias de DNA que codifican las proteínas ha acelerado enorm e mente el proceso de caracterización; la mayoría de las proteínas señal discutidas en este capítulo se han caracterizado de esta forma. Una contribución funda mental de estos estudios de clonaje y de secuenciación de DNA ha consistido en revelar que la increíble diversidad de proteínas receptoras conocidas puede re ducirse a un número mucho menor de grandes familias. Los receptores intrace lulares de los que acabam os de tratar constituyen una de estas familias. Ahora consideraremos los grupos de familias que pueden identificarse como pertene cientes a una gran clase de receptores de señal: los receptores localizados en la superficie de la célula. Todas las moléculas señal solubles en agua (incluyendo los neurotransmisores, las hormonas proteicas y los factores de crecimiento) y algunas moléculas señal liposolubles, se unen a receptores proteicos específicos situados en la su perficie de las células diana que afectan. Estos receptores proteicos de superficie actúan com o transductores de señal: unen la molécula señal (el ligando) con una alta afinidad, y transforman este evento extracelular en una o más señales intracelulares, las cuales alteran el comportamiento de la célula diana. La mayoría de los receptores de la superficie celular pertenecen a una de es tas tres clases, que se definen en función del mecanismo de transducción que uti lizan. Los receptores asociados a canales, también conocidos como canales ióni cos regulados por transmisor, participan principalmente en la rápida señalización sináptica entre células excitables eléctricamente. Este tipo de señalización está mediada por un pequeño número de neurotransmisores que abren o cierran transitoriamente el canal iónico al que están unidos, alterando así brevemente la permeabilidad iónica de la membrana plasmática y, por lo tanto, modificando la excitabilidad de la célula postsináptica (Figura 15-14A). Estos receptores relacio nados con un canal pertenecen a una familia de proteínas transmembrana que la atraviesan varias veces (multipaso) y que son homólogas entre sí. En el Capítulo 11 se estudian estos receptores, de forma que aquí no se tratarán en mayor pro fundidad. Los receptores asociados a proteínas G actúan indirectamente regulando la actividad de una enzima ligada a la membrana plasmática o un canal iónico, se parados del receptor. La interacción entre el receptor y la proteína diana está mediada por una tercera proteína, llamada proteína reguladora que une GTP (o proteína G) (Figura 15-14B). La activación de la proteína diana altera la concen tración de una o más pequeñas moléculas señal intracelulares (si la proteína
782
Capítulo 15 : Transmisión de señales entre células
Figura 15-14 Las tres clases de receptores de superficie. A pesar de
(A) RECEPTOR RELACIONADO CON CANALES IÓNICOS
que muchos receptores asociados a enzimas tienen una actividad enzimàtica intrínseca, como se muestra en (C), muchos otros actúan sobre enzimas asociadas (no se muestra).
ligando
(B) RECEPTOR RELACIONADO CON PROTEÍNAS G ligando
proteina G
enzima o canal iónico
proteina G activada
enzima activada o canal iónico
(C) RECEPTOR RELACIONADO CON ENZIMAS ligando
dom inio catalítico inactivo
dom inio catalítico activo
diana es una enzima) o altera la permeabilidad de la membrana plasmática (si la proteína diana es un canal iónico). A su vez, los m ensajeros intracelulares ac túan alterando el comportamiento de otras proteínas diana de la célula. Todos los receptores relacionados con proteínas G pertenecen a una gran superfamilia de proteínas homólogas, que atraviesan siete veces la membrana Cuando son activados por su ligando, los receptores asociados a enzimas actúan directamente como enzimas o están asociados a enzimas (Figura 15-14C). La mayoría de ellos son proteínas que atraviesan la membrana una sola vez y que tienen el lugar de unión al ligando en el exterior de la célula y el lugar catalítico en el interior. Comparados con las otras dos clases, los receptores relacionados con enzimas son heterogéneos, a pesar de que la gran mayoría de ellos son proteína quinasas o están asociados con proteína quinasas, que fosforilan conjuntos espe cíficos de proteínas en la célula diana.
Los receptores de superficie celular, una vez activados, desencadenan la adición de grupos fosfato a una red de proteínas intracelulares9,10 La mayoría de lo que se tratará en este capítulo a partir de aquí se refiere a cómo trabajan los receptores relacionados con proteínas G y los receptores relacionados con enzimas. A menudo las señales recibidas en la superficie de la célula por estas dos clases de receptores son transmitidas hasta el núcleo, donde alteran la expre sión de determinados genes modificando así el comportamiento de la célula. El sistema de transmisión de la señal está formado por elaborados conjuntos de pro teínas señal intracelulares. La mayoría de estas proteínas son: o bien proteínas que cuando llega la señal se fosforilan mediante proteína quinasas o bien proteínas que cuando llega la señal se unen a GTP. En ambos casos las proteínas ganan uno
Principios generales de la señalización celular
783
ENTRADA DE LA SEÑAL
© SALIDA DE LA SEÑAL
(A) SEÑALIZACIÓN MEDIANTE FOSFORILACIÓN
(B) SEÑALIZACIÓN MEDIANTE UNA PROTEÍNA QUE UNE GTP
o más fosfatos en su estado activado y pierden los fosfatos cuando la señal decae (Figura 15-15). A su vez, estas proteínas generalmente causan la fosforilación de otras proteínas, generando una cascada de fosforilaciones. Las cascadas de fosforilaciones están mediadas por dos tipos principales de proteína quinasas: las serina/treonina quinasas, que fosforilan proteínas sobre cadenas laterales de serina y (menos a menudo) de treonina, y las tirosina qui nasas que fosforilan proteínas sobre cadenas laterales de tirosina. Una quinasa ocasional puede hacer ambas cosas. Se estima que alrededor del 1% de nuestros genes codifican proteína quinasas, y que una sola célula de mamífero puede contener más de 100 tipos distintos de estas enzimas, la mayoría de las cuales son serina/treonina quinasas. A pesar de que menos del 0,1% de las proteínas fosforiladas celulares contienen fosfotirosinas, veremos que esta pequeña m ino ría juega un papel crucial en la señalización de la mayoría de los receptores rela cionados con enzimas. Como hemos tratado previamente, generalmente los comportamientos ce lulares complejos, com o la supervivencia o la proliferación, no están estimula dos por una sola señal que actúa sola sino por com binaciones específicas de se ñales (Figura 15-8). La célula ha de integrar la información que proviene de señales diferentes, para generar una respuesta adecuada -para vivir o morir, o para proliferar o permanecer quiescente. La integración parece depender de in teracciones entre las diversas cascadas de fosforilación de proteínas que se acti van por diferentes señales extracelulares. En particular, algunas de las proteínas señal en las cascadas actúan como elementos integradores, equivalentes a los microprocesadores de un ordenador: en respuesta a múltiples señales de entra da producen una salida calibrada para generar el efecto biológico deseado. En la Figura 15-16 se presentan dos ejemplos sobre cómo pueden actuar estas proteí nas integradoras. La complejidad de estos sistemas de respuesta a señales, compuestos por múltiples cadenas de proteínas señal que interactúan entre sí, intimida. Sin em bargo, la tecnología de DNA recombinante combinada con los análisis genéticos básicos en Drosophila, en el nemátodo C. elegans y en levaduras, así como otros métodos bioquímicos y farmacológicos convencionales nos permiten descubrir rápidamente los intrincados detalles de estos mecanismos mediante los cuales las proteínas receptoras activadas cambian el comportamiento de la célula.
Resumen Cada una de las células de un animal pluricelular está programada durante el de sarrollo para responder a un conjunto específico de señales que actúan en diversas combinaciones regulando el comportamiento de la célula y determinando si la cé-
784
Capítulo 15 : Transmisión de señales entre células
Figura 15-15 Los dos mecanismos principales de señalización intracelular comparten características comunes. En ambos casos una proteína señal es activada por la adición de un grupo fosfato, e inactivada por la eliminación del grupo fosfato. En (A) el fosfato es añadido de forma covalente a la proteína señal, mediante una proteína quinasa; en (B) una proteína señalizadora es inducida a cambiar su GDP por un GTP. Para poner de manifiesto las similitudes entre ambos mecanismos, el ATP se muestra como APP(P) el ADP como APP, el GTP como GPP(P)y el GDP como GPP.
(A)
(B)
= 4\ 1 = V
Q— \
/ l—
EílU
r —*-[Anpl
PROCESO DE PRODUCCION DE SEÑAL
PROCESO DE PRODUCCION DE SEÑAL
lula debe vivir o morir o si debe proliferar o permanecer quiescente. La mayoría de estas señales median señalizaciones paracrinas en las que los mediadores locales son rápidamente captados, destruidos o inmovilizados, de forma que únicamente pueden actuar sobre las células vecinas. Además, existe un control centralizado que está ejercido tanto por la señalización endocrina, en la que las hormonas segrega das por las células endocrinas son transportadas por la sangre hasta las células diana de todo el cuerpo, como por la señalización sináptica en la cual los neurotransmisores segregados por las células nerviosas actúan localmente sobre las célu las postsinápticas con las que contactan sus axones. La señalización celular requiere tanto moléculas señal extracelulares como un conjunto complementario de proteínas receptoras en cada célula, que les permiten unirlas y responder a ellas de una forma programada y característica. Algunas pe queñas moléculas hidrofóbicas, incluyendo las hormonas esteroideas y tiroideas y los retinoides, difunden a través de la membrana plasmática de la célula diana y activan proteínas receptoras intracelulares, las cuales regulan directamente la transcripción de determinados genes. Algunos gases en solución, como el óxido ní trico y el monóxido de carbono, actúan como mediadores locales difundiendo a tra vés de la membrana de la célula diana y activando una enzima intracelular -habi tualmente la guanilato ciclasa, que produce GMP cíclico en la célula diana. Sin embargo, la mayoría de las moléculas señal extracelulares son hidrofüicas y sólo son capaces de activar proteínas receptoras de la superficie de la célula diana; estos receptores actúan como transductores de señal, convirtiendo el evento de unión extracelular en señales intracelulares que alteran el comportamiento de la célula dia na. Existen tres familias principales de receptores de superficie celular, los compo nentes de cada una de las cuales transducen las señales extracelulares de una manera diferente. Los receptores asociados a canales iónicos son canales iónicos re gulados por transmisor que se abren o se cierran brevemente como respuesta a la unión de un neurotransmisor. Los receptores asociados a proteínas G activan o inactivan indirectamente enzimas unidas a membrana plasmática o canales ióni cos, a través de proteínas triméricas que unen GTP (proteínas G). Los receptores asociados a enzimas actúan directamente como enzimas o están asociados a enzi mas; habitualmente las enzimas son proteína quinasas que fosforilan proteínas determinadas de la célula diana. A través de cascadas de fosforilaciones de proteí nas, muy bien reguladas, conjuntos elaborados de proteínas que interactúan entre ellas transportan la mayoría de las señales desde la superficie hasta el núcleo, alte rando así el patrón de expresión génica y, como consecuencia de ello, el comporta miento de la célula. La interacción entre diferentes cascadas permite a la célula in tegrar la información que proviene de las múltiples señales que recibe.
Principios generales de la señalización celular
Figura 15-16 Integración de señales. En (A) las señales A y B activan diferentes cascadas de fosforilación de proteínas, cada una de las cuales produce la fosforilación de la proteína Y, pero en diferentes lugares de la proteína. La proteína Y se activa únicam ente cuando ambos lugares están fosforilados, por lo que únicam ente es activa cuando las señales A y B se hallan presentes simultáneamente. En (B) las señales A y B producen la fosforilación de dos proteínas, a y b, las cuales entonces se unen entre sí dando lugar a una proteína activa ab. En ambos ejemplos las proteínas se fosforilan. Sin embargo, una forma equivalente de control puede ocurrir con el intercambio de GTP por GDP sobre una proteína que une GTP (véase Figura 15-15).
785
Señalización vía receptores de superficie celular asociados a proteínas G11 Los receptores asociados a proteínas G constituyen la mayor familia de recep tores de la superficie celular. En mamíferos se han descrito más de 100 m iem bros de esta familia. La mayoría de ellos han sido identificados mediante clonaje de homología, en el que se utiliza la hibridación a baja estringencia con sondas de cDNA preexistentes para detectar secuencias de DNA relacionadas (véase Fi gura 7-17). Otros miembros de la familia se han encontrado mediante clonaje de expresión, utilizando sus propiedades de unión de ligandos o de activación celu lar para identificarlos. Una forma de esta aproximación consiste en copiar en moléculas de RNA una librería de moléculas de cDNA preparada a partir de cé lulas o de tejidos que expresan el receptor en cuestión, e inyectarlas en oocitos de Xenopus. Los oocitos traducen las moléculas de RNA a proteína. Estas proteí nas se insertan en la membrana plasmática, donde pueden detectarse gracias a sus propiedades de unión de un ligando determinado o de activación celular. Los receptores asociados a proteínas G median las respuestas celulares de una enorme diversidad de moléculas señal, incluyendo hormonas, neurotransmisores y mediadores locales, de estructura tan variada como lo es su función: la lista incluye proteínas y pequeños péptidos, aminoácidos y derivados de ácidos grasos. Un mismo ligando puede activar muchos miembros diferentes de la fa milia. Por ejemplo, la adrenalina puede activar por lo menos 9 miembros dife rentes de receptores asociados a proteínas G, la acetilcolina a 5 o más y la serotonina por lo menos a 15 de ellos. A pesar de la diversidad química y funcional de las moléculas señal que se unen a ellos, todos los receptores asociados a proteína G de los que se conoce su secuencia de aminoácidos a partir de estudios de secuenciación de DNA, tienen una estructura similar y están, casi con toda seguridad, relacionados evolutiva mente. Están formados por una sola cadena polipeptídica que atraviesa siete ve ces, arriba y abajo, la bicapa lipídica (Figura 15-17). Como discutiremos más adelante, esta superfamilia de proteínas receptoras transmembrana que atravie san la mem brana siete veces incluye la rodopsina, la proteína localizada en los ojos de los vertebrados y que es activada por la luz, así como los receptores olfa tivos de los vertebrados. En los organismos unicelulares también se encuentran miembros de esta familia: un ejemplo de ellos son los receptores de levaduras que reconocen los factores de acoplamiento de las levaduras. Este motivo es tructural tan antiguo tam bién lo presenta la bacteriorrodopsina, una bomba bacteriana de H+ activada por la luz, que se discute en el Capítulo 10, a pesar de que, a diferencia de los miembros de la familia, la bacteriorrodopsina no es un receptor y no actúa a través de ninguna proteína G. En su conjunto, estos hechos sugieren que los receptores asociados a proteínas G que median la señalización célula-célula en los organismos pluricelulares deben haber evolucionado a par tir de receptores sensoriales de sus antepasados unicelulares. Los miembros de esta familia de receptores han conservado no sólo su secuencia de aminoácidos sino también su relación funcional con una proteína G a través de la cual trans miten al interior celular la señal que ha transportado un ligando extracelular. En esta sección trataremos principalmente de esta cadena de acontecim ientos que se inician con la activación de las proteínas G.
Las proteínas G trim éricas transm iten la señal intracelular desde los receptores asociados a proteínas G11,12 Las proteínas trim éricas que unen GTP (proteínas G) que acoplan funcional mente estos receptores a sus enzimas diana o a canales iónicos en la membrana plasmática son estructuralmente diferentes de las proteínas que unen GTP, de una sola cadena (denominadas proteínas monoméricas que unen GTP o GTPasas monoméricas), las cuales transm iten las señales intracelulares y regulan el tráfi-
786
Capítulo 15: Transmisión de señales entre células
Figura 15-17 Dibujo esquemático de un receptor asociado a proteínas G. Los receptores que unen ligandos proteicos tienen un gran dominio extracelular de unión formado por la parte de la cadena polipeptídica que se muestra en verde claro. Los receptores para ligandos pequeños, como es la adrenalina, tienen dominios extracelulares pequeños y habitualmente el lugar de unión se halla incrustado en el plano de la membrana, formado por aminoácidos de varios de los segmentos transmembrana. Las regiones de los dominios transmembrana que son responsables principales de unirse a las proteínas G triméricas se muestran en naranja, y los que se fosforilan durante la desensibilización del receptor (lo cual se discute más adelante) se muestran en rojo.
m olécula señal
-----------------------■
Figura 15-18 Los dos procesos principales mediante los cuales la proteína G relacionada con los receptores de superficie de la célula genera mensajeros intracelulares. En ambos casos, la unión de un ligando extracelular altera la conformación del dominio citoplasmático del receptor, de forma que ahora puede unirse a una proteína G, la cual a su vez activa (o inactiva) una enzima de la membrana plasmática. En el proceso del AMP cíclico (cAMP), la enzima produce AMP cíclico directamente. En el proceso del Ca2+, la enzima produce un mediador soluble (el inositol trisfosfato, se discute más adelante) que libera Ca2+desde el retículo endoplasmático. Como otros pequeños mediadores intracelulares, tanto el AMP cíclico como el Ca2+ transmiten la señal actuando como efectores alostéricos: se unen específicamente a proteínas de la célula, alterando su conformación y, por lo tanto, su actividad.
co de vesículas y muchos otros procesos de las células eucariotas. Las GTPasas monoméricas serán tratadas más tarde en este y en otros capítulos. Sin em bar go, ambas clases de proteínas que unen GTP son GTPasas y actúan como inte rruptores moleculares que pueden saltar entre dos estados: uno activo, cuando están unidas a GTP, y otro inactivo, cuando están unidas a GDP. En el contexto habitual, “activo” significa que la molécula actúa como una señal desencade nando otros procesos celulares. Cuando un ligando extracelular se une a un re ceptor asociado a proteína G, el receptor cambia de conformación modificando la pro teína G trimérica a la que está asociado, haciendo que se desprenda del GDP y lo reemplace por GTP. Este cambio revierte cuando la proteína G hidroliza el GTP que lleva unido, transformándolo de nuevo en GDP. Pero mientras ello ocurre, la proteína (activa) tiene la oportunidad de difundir lejos del receptor y de transmitir su m ensaje por la célula, durante un período de tiempo más o m e nos prolongado. La mayoría de receptores asociados a proteínas G activan una cadena de acontecimientos que modifican la concentración de una o más moléculas señal intracelulares. A su vez, estas pequeñas moléculas, a menudo denominadas m e diadores intracelulares (o también mensajeros intracelulares o segundos mensaje ros), transfieren la señal alterando el comportamiento de determinadas proteínas de la célula. Dos de los mediadores intracelulares más ampliamente utilizados son el AMP cíclico (cAMP) y el Ca2+: en la mayoría de las células animales existen diferentes mecanismos que modifican sus concentraciones y la mayoría de los re ceptores asociados a proteínas G regulan uno de los dos mediadores, como se in dica en la Figura 15-18.
Algunos receptores increm entan los niveles intracelulares de AMP cíclico activando la adenil ciclasa a través de una proteína G estimuladora (Gs)13 El AMP cíclico (Figura 15-19) fue identificado por primera vez en 1959 como un mediador intracelular de la acción hormonal. Ahora sabemos que actúa como una molécula señal intracelular en todas las células procariotas y animales en que se ha estudiado. Para que el AMP cíclico actúe como un mediador intracelu-
Señalización vía receptores de superficie celular asociados a proteínas G
787
ADENINA NH,
-o — P—
FOSFATO lar, su concentración (que normalmente es < 10~7M) ha de poder variar, aumen tando o disminuyendo, en respuesta a señales extracelulares: bajo la influencia de hormonas los niveles de AMP cíclico pueden variar hasta valores cinco veces superiores, en cuestión de segundos. Como hemos explicado antes (véase Figura 15-10), una capacidad de respuesta como ésta requiere que la rápida síntesis de la molécula esté compensada por una rápida degradación o eliminación de ella. El AMP cíclico se sintetiza a partir de ATP mediante una enzima unida a m em brana, la adenil ciclasa, y es rápida y continuam ente destruido mediante una o varias fosfodiesterasas de AMP cíclico, que hidrolizan el AMP cíclico hasta adenosina 5 ’-monofosfato (5’-AMP) (Figura 15-20). Mudhas moléculas señal extracelulares actúan controlando los niveles de AMP cíclico, alterando la actividad de la adenil ciclasa (Figura 15-21) y no la acti vidad de la fosfodiesterasa. De la misma forma en que la misma hormona esteroidea produce efectos diferentes en células diana diferentes, distintas células diana responden de forma muy diferente a señales extracelulares que alteran los niveles intracelulares de AMP cíclico (Tabla 15-1). Sin embargo, habitualmente todos los ligandos que activan la adenil ciclasa en un determinado tipo de célula diana causan siempre el mismo efecto: por ejemplo, por lo menos cuatro hormonas ac tivan la adenil ciclasa en las células del tejido adiposo y todas ellas estimulan la degradación de triacilglicéridos (la forma de almacenamiento de las grasas) hasta ácidos grasos (véase Tabla 15-1). Los diferentes receptores para estas hormonas activan un acervo común de moléculas de adenil ciclasa, a las que están acopla das mediante una proteína G trimérica. Como esta proteína participa en la acti vación de la enzima, se denomina proteína G estimuladora (Gs de “stimulating”). Los individuos que son genéticamente deficientes en Gs presentan respuestas disminuidas a ciertas hormonas y, por lo tanto, tienen anomalías metabólicas, anomalías en el desarrollo de los huesos y retraso mental. Los receptores acoplados a la activación de la adenil ciclasa mejor estudia dos son los receptores p adrenérgicos, los cuales median algunas de las accio nes de la adrenalina y de la noradrenalina (Figura 15-22 y véase la Tabla 15-1). Puede reconstruirse un sistema adenil ciclasa activable por adrenalina en vesí culas de fosfolípidos sintéticas, utilizando receptores (3-adrenérgicos purifica dos, Gs y moléculas de adenil ciclasa, lo cual indica que no se requiere ninguna otra proteína para este proceso de activación. ¿De qué forma la proteína Gs m e dia este acoplamiento? La respuesta depende de la estructura trimérica de la proteína G, tal como discutiremos a continuación.
Se cree que las proteínas G trim éricas se desensamblan cuando son activadas11,12,14 Una proteína G está com puesta por tres cadenas polipeptídicas diferentes, de nominadas a, (3 y y: La cadena a de las proteínas Gs (as) se une e hidroliza GTP y
788
Capítulo 15: Transmisión de señales entre células
Figura 15-19 El AMP cíclico. Se muestra su fórmula, un modelo espacial de varilla y un modelo de espacio lleno. (C, H, N, O y P indican átomos de carbono, hidrógeno, nitrógeno, oxígeno y fósforo, respectivamente.)
0
0
0
'O-P-O-P-O-P-O-CH, n
0~
O”
o
fosfodiesterasa de AMP cíclico
OH
OH
Figura 15-20 Síntesis y degradación del AMP cíclico (cAMP). Una pirofosfatasa hace que la síntesis de AMP cíclico sea un proceso irreversible, hidrolizando el pirofosfato (P)—(P)que se libera en esta reacción (no se muestra).
catalíticos Figura 15-21 La adenil ciclasa. En los vertebrados, la enzima está formada habitualm ente por unos 1100 residuos de aminoácido y se cree que tiene dos grupos de seis segmentos transm embrana que separan dos dominios catalíticos citoplasmáticos similares. En mamíferos existen como mínimo seis tipos de estas formas de adenil ciclasa (tipos I-VI). Todos ellos están estimulados por Gs, aunque el tipo I, que se encuentra principalmente en el cerebro, tam bién se estimula por com plejos de Ca2+ unidos a la proteína que une Ca2+, la calmodulina (de la que trataremos más adelante).
activa la adenil ciclasa. La cadena (3 y la cadena y de las proteínas Gs forman un íntimo complejo (fty) que ancla el complejo Gs a la cara citoplasmática de la mem brana plasmática al menos en parte mediante una cadena lipídica (un gru po prenilo) que está anclado covalentemente a la subunidad y. En su forma inac tiva, Gs está en forma de trímero con una molécula de GDP unida a a s. Cuando Gs es activada por la unión de un receptor activado por un ligando, a s cambia su GDP por GTP. Se cree que ello hace que a s se disocie de (fy permitiendo que a s se una a una molécula de adenil ciclasa, a la que activa a producir cAMP cíclico. Si las células son capaces de responder rápidamente a cambios en la concen tración de una molécula señal extracelular, la activación de la adenil ciclasa pue de ser revertida rápidamente en cuanto el ligando señal se disocia del receptor. Esta capacidad para responder rápidamente a cambios está asegurada debido a que la vida media de la forma activa de cxs es corta: la actividad GTPasa de a s se estimula cuando a s se une a la adenil ciclasa, de forma que el GTP unido a ella se hidroliza a GDP, generando ocsy la adenil ciclasa inactiva. Entonces, a s se vuelve a asociar con (3y dando lugar de nuevo a una molécula Gs inactiva (Figura 15-23). La importancia de la actividad GTPasa en el proceso de finalización de la respuesta puede ponerse de manifiesto en el tubo de ensayo. Si se toman célu las, se rompen, se abren y se exponen a un análogo del GTP (GTPyS) cuyo fosfato terminal no es hidrolizable, la producción de AMP cíclico tras el tratamiento con
Tabla 15-1 Algunas respuestas celulares inducidas por hormonas a través del AMP cíclico Tejido diana
Hormona
Glándula tiroides hormona estimuladora de la tiroides (TSH) Corteza adrenal hormona adrenocorticotropa (ACTH) hormona luteinizante (LH) Ovario Músculo adrenalina Hueso parathormona Corazón adrenalina
Hígado Riñón Tejido adiposo
glucagón vasopresina adrenalina, ACTH, glucagón, TSH
Respuesta principal síntesis y secreción de hormonas tiroideas secreción de cortisol
adrenalina
Figura 15-22 La adrenalina. Esta hormona (también denominada epinefrina) se sintetiza a partir de tirosina y es segregada por la glándula adrenal cuando un mamífero se estresa.
secreción de progesterona degradación de glucógeno resorción del hueso incremento de la frecuencia cardíaca y de la fuerza de contracción del corazón degradación de glucógeno resorción de agua degradación de triacilglicéridos
Señalización vía receptores de superficie celular asociados a proteínas G
789
ESPACIO EXTRACELULAR
proteína receptora A A
proteína Gs
I--------------1 PY
adenil ciclasa
0Cs
m em brana asmática
CITOSOL ligando señal la unión del ligando altera la conform ación del receptor haciendo asequible un lugar para la unión de la proteína Gs
la difusión en la bicapa perm ite la asociación de los com plejos ligando-receptor con proteínas
el GDP se disocia, perm itiendo que se una GTP; ello hace que la subunidad a se disocie del com plejo Gs, exponiendo su lugar de unión para la adenil ciclasa
la subunidad a se une a la adenil ciclasa, activándola para producir muchas m oléculas de cAMP; m ientras tanto, la disociación del ligando hace que el receptor recupere su conform ación original
la hidrólisis del GTP por la subunidad a hace que esta subunidad recupere su conform ación original, disociándose de la adenil ciclasa (que se vuelve inactiva) y se reasocie con un com plejo Pyform ando de nuevo un com plejo Gs
790
Capítulo 15: Transmisión de señales entre células
Figura 15-23 Modelo actual que ilustra de qué forma Gsacopla la activación del receptor a la activación de la adenil ciclasa. Mientras el ligando señal permanece unido, el receptor proteico puede continuar activando moléculas de proteína Gs, con lo que se produce una amplificación de la respuesta. Lo que es más importante, después de que el ligando señal se haya disociado del receptor, la proteína ocs puede permanecer activa y seguir estimulando una molécula de ciclasa durante muchos segundos, lo cual proporciona una amplificación todavía mayor.
una horm ona se prolonga enormemente. Un fenómeno similar se observa en pacientes que sufren de cólera, en los que la toxina bacteriana responsable de los síntomas de esta enfermedad inhibe el mecanismo de autoinactivación de a s. La toxina colérica es una enzima que cataliza la transferencia de ADP ribosa desde NAD+ intracelular a ocs. La ADP ribosilación altera ocs de forma que pierde la capacidad de hidrolizar el GTP que tiene unido. Las moléculas de adenil ciclasa activadas por estas a s alteradas permanecen activas indefinidamente. La ele vación prolongada de los niveles de AMP cíclico en las células epiteliales intesti nales provoca un gran eflujo de Na+y de agua en el intestino, que es responsable de la severa diarrea característica del cólera.
Algunos receptores disminuyen los niveles de AMP cíclico inhibiendo la adenil ciclasa vía una proteína G trim érica inhibidora (Gj)11,12,15 Una misma molécula señal puede incrementar o disminuir la concentración in tracelular de AMP cíclico, en función del tipo de receptor al que se una. Cuando la adrenalina, por ejemplo, se une a un receptor p adrenérgico, activa la adenil ci clasa mientras que cuando se une a un receptor a2 adrenérgico inhibe a la enzi ma. La diferencia entre ambos radica en la proteína G que acopla en cada caso estos receptores a la ciclasa. Los receptores P-adrenérgicos se acoplan funcio nalmente a la adenil ciclasa a través de una proteína Gs mientras que los recep tores a 2 adrenérgicos se acoplan a la misma enzima a través de una proteína G inhibidora (G,). Una G¡ puede contener el mismo complejo P/que una Gs pero tiene una subunidad a diferente (a¡). Cuando son activados, los receptores a 2 adrenérgicos se unen a la proteína G¡ provocando que a¡ se una a GTP y se diso cie del complejo Py. Se cree que tanto la a¡ como el Py contribuyen a la inhibición de la adenil ciclasa: a¡ inhibe la adenil ciclasa, probablemente de forma directa mientras que Py puede inhibir la síntesis de AMP cíclico de dos maneras -d irec tamente, uniéndose a la ciclasa, e indirectamente uniéndose a algunas subunidades a s libres de la misma célula, impidiendo así que activen moléculas de ade nil ciclasa. Más adelante veremos que G¡ tam bién actúa abriendo canales de K+ de la m em brana plasmática, y parece probable que esta función sea más impor tante que la inhibición de la adenil ciclasa. Mientras que la toxina colérica cataliza la ADP ribosilación de cxs y de esta forma inactiva la actividad GTPasa de ocs, la toxina pertúsica, sintetizada por la bacteria que causa la tos ferina, cataliza la ADP ribosilación de a¡. La ADP ribosi lación de a¡ impide que el complejo G¡ pueda interactuar con los receptores, por lo que permanece unido a GDP y pierde la capacidad de inhibir la adenil ciclasa o de abrir los canales de K+. Las proteínas G triméricas son moléculas señal extraordinariamente versáti les. En los ejemplos considerados anteriormente tanto la subunidad a como el complejo Py son com ponentes activos, pero en otros casos los receptores se ha llan acoplados a sus proteínas diana únicamente a través de la liberación del complejo Py. Además, los complejos Py tam bién pueden actuar como regulado res condicionales de proteínas efectoras: por ejemplo pueden incrementar la ac tivación de algunas formas de adenil ciclasa, pero únicamente si la ciclasa ha sido activada previamente por a s.
La proteína quinasa dependiente de AMP cíclico (quinasa A) media los efectos del AMP cíclico16 El AMP cíclico ejerce sus efectos en las células animales principalmente activan do la enzima proteína quinasa dependiente de AMP cíclico (quinasa A), la cual cataliza la transferencia de un grupo fosfato terminal desde el ATP a un residuo específico de serina o de treonina de determinadas proteínas de la célula diana. Los residuos de aminoácido que son fosforilados por la quinasa A se caracteri zan por estar unidos, por su lado amino terminal, a dos o más aminoácidos bási-
Señalización vía receptores de superficie celular asociados a proteínas G
791
AMP cíclico
•V quinasa A inactiva
subunidad reguladora
+
subunidad catalítica inactiva
com plejo de AMP cíclico y de las subunidades reguladoras
c? / /M \X
subunidades catalíticas activas
cos. A su vez, la fosforilación covalente de los residuos de aminoácido adecua dos regula la actividad de la proteína. La quinasa A se encuentra en todas las células animales y se cree que es la responsable de todos los efectos del AMP cíclico en la mayoría de las células. (La única función conocida diferente del AMP cíclico en mamíferos consiste en re gular una clase especial de canales iónicos en neuronas olfativas sensibles al olor.) Los substratos de la quinasa A son diferentes en diferentes tipos celulares, lo cual explica por qué los efectos del AMP cíclico varían en función de la células diana de que se trate. En su estado inactivo, la quinasa A es un complejo formado por dos subuni dades catalíticas y dos subunidades reguladoras que unen AMP cíclico. La unión de AMP cíclico altera la conform ación de las subunidades reguladoras, haciendo que se disocien del complejo. Las subunidades catalíticas liberadas resultan ac tivas para fosforilar específicam ente determinadas moléculas proteicas (Figura 15-24). La fosforilación de proteínas mediada por AMP cíclico fue demostrada por primera vez en estudios del m etabolismo del glucógeno en células de músculo esquelético. El glucógeno constituye la principal reserva de glucosa, y tanto su síntesis com o su degradación en el músculo esquelético están reguladas por la adrenalina. Por ejemplo, cuando por cualquier causa un animal se halla asusta do o en tensión, su glándula suprarrenal segrega adrenalina a la sangre, ponien do en estado de “alerta” a diversos tejidos del cuerpo. Entre otros efectos, la adrenalina circulante induce a las células musculares a degradar su glucógeno hasta glucosa 1-fosfato y a detener la síntesis de glucógeno. La glucosa se oxida a través de la glucolisis suministrando ATP para la contracción muscular sosteni da. De esta forma, la adrenalina prepara a las células musculares para una activi dad intensa. La adrenalina se une a receptores P adrenérgicos de la superficie de la célula muscular, incrementando los niveles citosólicos de AMP cíclico. A su vez, el AMP cíclico activa la quinasa A, la cual fosforila otras dos enzimas. La pri mera de ellas, la fosforilasa quinasa es la primera proteína quinasa que fue des cubierta (1956) y a su vez, fosforila la enzima glucógeno fosforilasa, activándola para que libere residuos de glucosa a partir de la molécula de glucógeno (Figura 15-25). La otra enzima que resulta fosforilada por la acción de la quinasa A es la glucógeno sintasa, la cual cataliza el último paso de la síntesis de glucógeno a partir de glucosa. Mediante esta cascada de interacciones, un incremento de los niveles de AMP cíclico estimula la degradación de glucógeno e inhibe su síntesis, con lo que aum enta al máximo la cantidad de glucosa disponible para la célula. En algunas células animales, un incremento de los niveles de AMP cíclico activa la transcripción de determinados genes. Por ejemplo, en las células que segregan la horm ona somatostatina, el AMP cíclico activa los genes que codifi can esta hormona. La región reguladora del gen de la somatostatina contiene una corta secuencia de DNA, denominada elemento respuesta al AMP cíclico
792
Capítulo 15 : Transmisión de señales entre células
Figura 15-24 Activación de la proteina quinasa dependiente de AMP cíclico (quinasa A). La unión de AMP cíclico a las subunidades reguladoras induce en ellas un cambio de conformación que las hace disociarse del complejo, activando así las subunidades catalíticas. Cada subunidad reguladora tiene dos lugares de unión para AMP cíclico, y la liberación de las subunidades catalíticas es un proceso cooperativo que requiere la unión de más de dos moléculas de AMP cíclico al tetràmero. Este hecho hace que la respuesta de la quinasa a los cambios en la concentración de AMP cíclico sea aguda, como discutimos más tarde. En la mayoría de las células de mamífero existen al menos dos tipos de quinasas A: la del tipo I se halla fundamentalmente en el citosol mientras que la de tipo II se halla unida a través de su subunidad reguladora a la membrana plasmática, a la membrana nuclear y a los microtúbulos. En ambos casos, sin embargo, cuando las subunidades catalíticas son liberadas y activadas, pueden migrar al núcleo (donde pueden fosforilar proteínas reguladoras de genes) mientras que las subunidades reguladoras permanecen en el citoplasma. La estructura tridimensional del dominio proteína quinasa de la subunidad catalítica de la quinasa A se muestra en la Figura 5-12.
Figura 15-25 Estimulación de la degradación de glucógeno por AMP cíclico en células de músculo esquelético. La unión de AMP cíclico a
quinasa A inactiva
la quinasa A activa a esta enzima a fosforilar, y por tanto activar, a la fosforilasa quinasa, la cual, a su vez, fosforila y activa la glucógeno fosforilasa, la enzima que degrada el glucógeno. La quinasa A también incrementa, directa e indirectamente, la fosforilación de la glucógeno sintasa inhibiéndola, inactivando así la síntesis de glucógeno (no se muestra).
GLUCÓGENO
GLUCOSA 1-FOSFATO
I GLUCOLISIS
(CRE, de Cyclic AMP Response ElementJ, que también se encuentra en las regio nes reguladoras de otros genes activados por el AMP cíclico. Esta secuencia es reconocida por una proteína específica reguladora de genes denominada proteí na de unión a CRE (CREB, de CRE-Binding). Cuando CREB es fosforilada por la quinasa A sobre un residuo de serina, adquiere la capacidad de activar la trans cripción de estos genes; la fosforilación estimula la actividad transcripcional de CREB sin afectar sus propiedades de unión al DNA. Si este residuo de serina se modifica por mutación, CREB resulta inactiva y ya no puede estimular la trans cripción de ningún gen en respuesta a un incremento de los niveles de AMP cí clico.
Diversas proteína serina/treonina fosfatasas revierten rápidamente los efectos de la quinasa A17 Normalmente es importante que los efectos del AMP cíclico sean transitorios, por lo que es evidente que las células han de desfosforilar las proteínas que han sido fosforiladas por la quinasa A. En general la desfosforilación de las serinas y las treoninas fosforiladas está catalizada por cuatro grupos de fosfoproteína serina/treonina fosfatasas -la s proteína fosfatasas I, ILA, IIB y IIC. Excepto para el caso de la proteína fosfatasa IIC (que es una fosfatasa poco importante, no relacionada con las otras), las demás fosfatasas están compuestas por una subunidad catalítica homologa que forma un complejo con una o más subunidades reguladoras. La proteína fosfatasa I juega un importante papel en la res puesta al AMP cíclico, como veremos a continuación. La proteína fosfatasa ILA tiene una especificidad muy amplia y parece ser la principal fosfatasa responsable de revertir muchas de las fosforilaciones catalizadas por serina/treonina quinasas; juega un papel importante en la regulación del ciclo celular. La proteína fosfatasa IIB, también denominada calcineurina, es activada por Ca2+ y es especialmente abundante en el cerebro. La actividad de cualquier proteína regulada por fosforilación depende del balance en un instante dado entre las actividades de las quinasas que la fosforilan y de las fosfatasas que constantem ente la están desfosforilando. La proteína fosfatasa I es responsable de la desfosforilación de muchas de las proteínas que son fosforiladas por la quinasa A. Por ejemplo, inactiva la CREB eliminando su
Señalización vía receptores de superficie celular asociados a proteínas G
793
fosfato activador, inactivando así la respuesta transcripcional causada por un increm ento de los niveles de AMP cíclico. En las células del músculo esquelético, la proteína fosfatasa I desfosforila cada una de las tres enzimas clave del m etabo lismo del glucógeno que, como hemos mencionado antes, resultan fosforiladas por la quinasa A en respuesta a la adrenalina, y hacen que la célula cambie de una situación de síntesis de glucógeno a otra de degradación. La proteína fosfa tasa I tiende a contrarrestar estas fosforilaciones, pero en las células musculares activadas por adrenalina su actividad está suprimida por otra enzima diana de la quinasa A, que es una proteína inhibidora defosfatasas específica. Cuando esta proteína inhibidora es fosforilada por la quinasa A, se une a la proteína fosfatasa I inactivándola (Figura 15-26). Activando la fosforilasa quinasa e inhibiendo si multáneamente la acción opuesta de la proteína fosfatasa I, la quinasa A genera un cambio mucho mayor en el metabolismo del glucógeno del que podría obtener mediante su acción a través de una sola de estas enzimas. Habiendo discutido de qué forma las proteínas G triméricas acoplan los re ceptores a la adenil ciclasa alterando los niveles de AMP cíclico en las células, ahora considerarem os de qué form a las proteínas G acoplan los receptores a otra enzima crucial -la fosfolipasa C. La activación de esta enzima conduce a un increm ento de la concentración de Ca2+ en el citosol, y el Ca2+ es utilizado, de una forma incluso más general que el AMP cíclico, como mediador intracelular.
Para utilizar el Ca2+ como señal intracelular, las células han de m antener los niveles basales de Ca2+ muy bajos18 La concentración de Ca2+ libre en el citosol de cualquier célula es extrem ada m ente baja (< 10- 7 M), m ientras que su concentración en el fluido extracelular (~10~3M) y en el retículo endoplasm ático (ER) es alta. Así pues, existe un enor me gradiente de Ca2+ que tiende a llevar Ca2+ hacia el citosol, tanto a través de la m em brana plasm ática com o a través de la m em brana de ER. Cuando una señal abre transitoriam ente los canales de Ca2+ en alguna de estas dos m em branas, el Ca2+ fluye precipitadam ente al citosol, increm entando dram ática m ente la concentración local de Ca2+ y activando m ecanism os celulares sensi bles a Ca2+. Para que este m ecanism o de señalización sea funcional, es necesario que la concentración de Ca2+ en el citosol se mantenga baja, lo cual se consigue de dife-
quinasa A inactiva cAMP uinasa A activa
^ p ro te in a
inhibidora de la fosfatasa V inactiva
/''proteina
inhibidora de la fosfatasa activa !
UNION DE LA ______ INA INHIBIDORA FOSFORILADA INHIBE LA PROTEÍNA FOSFATASA
794
Capítulo 15 : Transmisión de señales entre células
Figura 15-26 Papel de la proteína fosfatasa I en la regulación del metabolismo del glucógeno por el AMP cíclico. El AMP cíclico inhibe la proteína fosfatasa I, que en caso contrario podría oponerse a la reacción de fosforilación estimulada por el AMP cíclico. Ello ocurre ya que la quinasa A fosforila a la proteína inhibidora de la fosfatasa, la cual entonces se une a la fosfatasa I, inhibiéndola.
rentes formas. Todas las células eucariotas tienen en su membrana plasmática una ATPasa que utiliza la energía de la hidrólisis del ATP para bombear Ca2+ ha cia el exterior del citosol. Las células tales com o las musculares y las nerviosas, que utilizan de forma intensa el sistema de señalización del Ca2+, disponen en su membrana plasmática de otra bom ba de Ca2+ adicional, que acopla el eflujo de Ca2+ a un influjo de Na+. Este intercambiador Ca2+-Na+ tiene una afinidad por el Ca2+ relativamente baja, por lo cual únicamente actúa de forma eficiente cuando los niveles citoplasmáticos de Ca2+ aumentan 10 veces por encim a de sus valores normales, tal como ocurre después de que una célula nerviosa o una célula mus cular hayan sido estimuladas repetidamente. En la membrana de ER existe otra bom ba que también desempeña un papel importante en el mantenimiento de una concentración baja de Ca2+ en el citosol: esta ATPasa dependiente de Ca2+ permite al ER captar grandes cantidades de Ca2+ del citosol, en contra del gra diente de concentración y aunque los niveles de Ca2+ en el citosol sean bajos. Habitualmente, la concentración de Ca2+ libre en el citosol varía desde 10~7 M cuando la célula está en reposo, hasta alrededor de 5 x 10-6 M cuando está ac tivada por una señal extracelular. Sin embargo, cuando la célula está dañada y no puede extraer Ca2+ del citosol de forma eficiente, la concentración de Ca2+ puede aumentar de forma peligrosa (>10-5 M). En estas circunstancias, comienza a actuar una bom ba de Ca2+ de baja actividad pero gran capacidad, situada en la membrana interna de la mitocondria, y utiliza el gradiente electroquímico gene rado a través de esta membrana durante las etapas de transferencia de electro nes de la fosforilación oxidativa, para extraer Ca2+ del citosol importándolo a la mitocondria. En la Figura 15-27 se resume este mecanismo.
El Ca2+ actúa com o un m ensajero intracelular ubicuo 19 La primera evidencia directa de que el Ca2+ actúa como un mediador intracelular proviene de un experimento realizado en 1947, que demostró que la inyección intracelular de una pequeña cantidad de Ca2+ provoca la contracción de las fi bras musculares esqueléticas. Recientem ente se ha puesto claramente de m ani fiesto que el Ca2+ actúa com o un mensajero intracelular en una amplia gama de respuestas celulares, entre las que se pueden destacar la secreción y la prolifera-
ATPasa dependiente de Ca2+ en la membrana del retículo endoplasmático
transporte de intercam bio de Ca2+ im pulsado por Na+
Figura 15-27 Controles de la concentración citosólica de Ca2+. El dibujo muestra un esquema de los mecanismos principales a través de los cuales la célula mantiene muy bajas las concentraciones de Ca2+en el citosol, en contra de elevadas concentraciones de Ca2+en el fluido extracelular. El Ca2+es bombeado activamente desde el citosol al exterior de la célula (A) y al interior de ER (B). Además, en la célula existen varios tipos de moléculas que unen Ca2+libre. La mitocondria también puede bombear Ca2+extrayéndolo del citosol, pero sólo lo hace de forma eficiente cuando los niveles de Ca2+son extremadamente altos -habitualmente como resultado de una alteración de la célula.
moléculas del citoplasma que unen Ca2+
importación activa de Ca2+ en la mitocondria
ATPasa dependiente de Ca2+ m olécula que une calcio
retículo endoplasm ático CITOSOL
Señalización vía receptores de superficie celular asociados a proteínas G
m itocondria CITOSOL
795
m em brana plasmática polarizada
m em brana plasm ática despolarizada
Figura 15-28 Dos procesos com unes a través de los cuales el Ca2+ puede entrar en el citosol en respuesta a señales extracelulares. En (A) el Ca2+
entra a un terminal nervioso desde el fluido extracelular a través de canales de Ca2+regulados por voltaje, cuando la membrana del terminal nervioso es despolarizada por un potencial de acción. En (B), la unión de una molécula señal extracelular a un receptor de superficie celular genera inositol trisfosfato, el cual estimula la liberación de Ca2+desde el ER.
ción celular. Se han definido dos procesos en la señalización por Ca2+, uno de ellos utilizado principalmente por células con actividad eléctrica (excitables) y el otro utilizado por casi todas las células eucariotas. El primero de estos procesos ha sido particularmente bien estudiado en las células nerviosas, en las cuales la despolarización de la m em brana plasmática provoca un influjo de Ca2+ al inte rior del terminal nervioso iniciándose la secreción de un neurotransmisor; el Ca2+ entra a través de canales regulados por voltaje que se abren cuando la m em brana plasmática del terminal nervioso se despolariza por un potencial de acción que llega hasta el terminal (véase Figura 11-34). En el segundo proceso, que es ubicuo, la unión de moléculas señal extracelulares a receptores de super ficie celular provoca la liberación de Ca2+ del ER; los acontecim ientos que ocu rren en la superficie celular están acoplados a la apertura de los canales de Ca2+ del ER a través de otra molécula m ensajera intracelular, el inositol trisfosfato (Fi gura 15-28), como discutiremos después.
Algunos receptores relacionados con proteínas G activan el proceso de señalización de fosfolípidos de inositol activando la fosfolipasa C-(J20 En 1953 se sugirió por primera vez que los fosfolípidos de inositol (fosfoinosítidos ) desempeñan un cierto papel en la transducción de la señal extracelular, cuando se descubrió que algunas moléculas señal extracelulares estimulan la in corporación de fosfato radiactivo a fosfatidilinositol (PI, de phosphatidylinositol), una clase minoritaria de fosfolípidos de las m embranas celulares. Más tarde se descubrió que esta incorporación se produce por la degradación y posterior síntesis de fosfolípidos de inositol. Se encontró que los fosfolípidos de inositol más importantes en la transducción de la señal son dos derivados fosforilados del PI, el PI-fosfato (PIP, de Pl-phosphate y el Pl-bisfosfato (PIP2). Se cree que ambos compuestos se hallan localizados principalmente en la cara interna de la m em brana plasmática (Figura 15-29). A pesar de que en las membranas de las células animales el PIP 2 es m enos abundante que el PI, es la hidrólisis de PIP2 la que es realmente importante en el proceso de señalización. La cadena de acontecim ientos que lleva a la rotura de PIP2, empieza con la unión de una molécula señal a un receptor unido a la proteína G de la m em bra na plasmática. Se ha demostrado que más de 25 receptores de superficie diferen tes utilizan esta vía de transducción; en la Tabla 15-2 se presentan varios ejem-
796
Capítulo 15: Transmisión de señales entre células
Figura 15-29 Los fosfolípidos de inositol (fosfoinosítidos). Los cadenas de ácidos grasos del exterior de la m onocapa lipidica de la m em brana plasm ática
3 J S s <
< <
y > /
c o
c o
O \
O i
2
cadenas de ácidos grasos del interior de la monocapa lipídica de la m em brana plasmática
ch -ch -ch
3 J j s <
<
y y > /
o\ oI
c h ?- c h - c h
Ì
J
y
3 1
< <
< > c=o c o 1 1
c=o c o
2
ì
O
9
fosfoinosítidos (PIP y PIP2) se producen por fosforilación del fosfatidilinositol (Pl). A pesar de que los tres fosfolípidos de inositol pueden degradarse en el proceso de respuesta a una señal, la degradación más crítica es la de PIP2, a pesar de que es el menos abundante, ya que constituye menos del 10% del total de lípidos de inositol y menos del 1% del total de fosfolípidos.
O CITOSOL
CH - C H - C H ,
0 'O
?"
1 , o o OH \j
OHHO/1 r ?i
o=p-cr I cr
inositol fosfatidilinositol (Pl)
Pl 4,5-bisfosfato (PIP2)
PI 4-fosfato (PIP)
píos de respuestas mediadas de esta forma. Los detalles del proceso de activa ción no son tan bien conocidos como los del AMP cíclico, pero existen eviden cias crecientes de que en la membrana plasmática actúa el mismo tipo de m eca nismo constituido por varias etapas. Un receptor activado estimula a una proteína G denominada Gq, la cual, a su vez, activa una fosfolipasa C específica de fosfoinositoles, denominada fosfolipasa C-(J. En menos de un segundo, esta en zima degrada el PIP 2generando dos productos: inositol trisfosfato y diacilglicerol (Figura 15-30). En este punto, el proceso de señalización se bifurca en dos ra mas. Ambas moléculas juegan papeles cruciales en la señalización celular, por lo que las consideraremos por separado.
El inositol trisfosfato (IP3) acopla la activación del receptor con la liberación de Ca2+ del E R 21 El inositol trisfosfato (IP3) producido por la hidrólisis de PIP 2 es una pequeña molécula hidrosoluble que se libera de la membrana plasmática y difunde rápi damente por todo el citosol. Allí, libera Ca2+ del ER uniéndose a canales liberado res de Ca2+ sensibles a IP3 de la membrana del ER. Los canales son estructural-
Tabla 15-2 Algunas resp u estas celu lares m ed iad as p o r recep to res unidos a p roteín as G, acop lad os al p ro ceso de señalización de los fosfolípidos de inositol Tejido dian a
M olécula señal
R espu esta prin cip al
Hígado
vasopresina
Páncreas Músculo liso Célula cebada Plaquetas sanguíneas
acetilcolina acetilcolina antígeno trombina
degradación del glucógeno secreción de amilasa contracción secreción de histamina agregación
Señalización vía receptores de superfìcie celular asociados a proteínas G
7 97
Figura 15-30 Hidrólisis de PIP2. La
cadenas de ácidos grasos del exterior de la monocapa lipidica de la m em brana plasm ática
cadenas de ácidos grasos del interior de la m onocapa lipidica de la m em brana plasm ática
c=o c=o I 1 o
o
2
ch -ch -ch
CITOSOL
2
LIBERA Ca DESDE EL RETÍCULO ENDOPLASMÁTICO
PI 4,5-bisfosfato (PIP2 )
inositol 1,4,5-trisfosfato (IP3)
mente similares a los canales de liberación de Ca2+ (receptores de rianodina ) del retículo sarcoplasmático de las células musculares, los cuales liberan el Ca2+que desencadena el proceso de contracción muscular (véase Figura 16-92). Ambos tipos de canales están regulados por retroalimentación positiva, ya que el Ca2+li berado puede unirse a los canales incrementando aún más la liberación de Ca2+. Ello hace que la liberación de Ca2+ ocurra de una manera repentina, tipo “todo o nada”. En muchas células incluyendo las células musculares, se encuentran am bos tipos de canales liberadores de Ca2+. Para acabar la respuesta inicial de Ca2+ actúan dos mecanismos: (1) el IP3 es rápidamente desfosforilado (y así inactivado) m ediante fosfatasas específicas, y (2) el Ca2+ que entra en el citosol es rápidamente bombeado hacia el exterior, principalmente hacia el exterior de la célula. Sin embargo no todo el IP 3 es desfosforilado: algunas moléculas son fosforiladas hasta 1,3,4,5-tetraquisfosfato (IP4), el cual puede mediar respuestas lentas pero más prolongadas en la célula o facilitar la recuperación de las reservas intracelulares de Ca2+ a partir del fluido extracelular. La enzima que cataliza la pro ducción de IP 4 se activa por un incremento de la concentración citosólica de Ca2+ inducida por IP3, lo cual constituye una forma de retroalimentación negati va de los niveles de IP3.
A menudo las oscilaciones de Ca2+prolongan la respuesta inicial de Ca2+inducida por IP322 Cuando se utilizan indicadores fluorescentes sensibles a Ca2+, como la aecuorina o fura-2 (se discute en el Capítulo 4) para estudiar las variaciones de los niveles citosólicos de Ca2+ en células individuales en las que se ha activado el proceso de señalización de fosfolípidos de inositol, a menudo se observa que la señal inicial de Ca2+ se propaga com o una ola a través del citosol desde una zona localizada 798
Capítulo 15 : Transmisión de señales entre células
hidrólisis de PIP2produce dos mediadores intracelulares: el inositol trisfosfato (IP3), el cual difunde a través del citosol y provoca la liberación de Ca2+desde el ER, y el diacilglicerol, que permanece en la membrana y colabora en la activación de la enzima proteína quinasa C (véase más adelante). Al menos existen tres clases de fosfolipasas C -0, y y 5- y es la de clase P la que se activa por receptores unidos a proteína G. Más adelante veremos que la clase y es activada por otra clase de receptores, denominados receptores tirosina quinasa, que activan el proceso de señalización de fosfolípidos de inositol sin ninguna proteína G intermediaria.
concentraciones de vasopresina 0,4 nM
0,6 nM
0,9 nM
Figura 15-31 Inducción de oscilaciones de Ca2+ en una célula hepática por vasopresina. La célula fue cargada con la proteína sensible a Ca2+, aecuorina, y a continuación fue expuesta a concentraciones crecientes de vasopresina. Nótese que la frecuencia de las espigas de Ca2+ aum enta a medida que aum enta la concentración de vasopresina, pero que la amplitud de las espigas no se ve afectada. (Adaptado de N.M. Woods, K.S.R. Cuthbertson y P.H. Cobbold, N atu re 319:600-602,1986. © 1986 Macmillan Magazines Ltd.)
tiem po (minutos)
de la célula. Además, a menudo el incremento transitorio inicial de la concentra ción de Ca2+ viene seguido por series de “espigas” de concentración de Ca2+, cada una de las cuales tarda en producirse del orden de segundos o minutos; es tas oscilaciones de Ca2+ pueden persistir mientras los receptores se mantengan activados en la superficie de la célula (Figura 15-31). El mecanismo responsáble de la propagación de las olas de Ca2+ y de la ge neración de las oscilaciones no es conocido con certeza, a pesar de que se han propuesto una gran cantidad de modelos para explicarlo. En la mayoría de estos modelos tanto la propagación como las oscilaciones dependen de una retroalim entación positiva, en la que el Ca2+ activa su propia liberación produciendo una espiga de Ca2+ del “todo o nada”. Los modelos se diferencian entre sí princi palmente en considerar si el Ca2+ actúa directamente sobre los canales de libera ción de Ca2+ del ER estimulando su propia liberación, o bien si actúa indirecta mente incrementando la actividad de la fosfolipasa C, generando así oleadas de IP3 que, a su vez, inducirían oleadas de liberación de Ca2+. El significado biológico de las oscilaciones de Ca2+ también es incierto. A menudo su frecuencia depende de las concentración del ligando señal extracelular (Figura 15-31) y puede, en principio, traducirse a respuesta celular de pendiente de frecuencia. En células de la hipófisis secretoras de horm ona, por ejemplo, la estim ulación por una m olécula señal extracelular induce espigas repetidas de Ca2+, cada una de las cuales está asociada con un pulso de secre ción de horm ona. Se ha sugerido que este hecho puede maximizar la secreción impidiendo los efectos tóxicos de un increm ento sostenido de la concentra ción citosólica de Ca2+.
El diacilglicerol activa la proteína quinasa C (quinasa C)23 Al mismo tiempo que el IP3 producido por la hidrólisis del PIP2 incrementa la con centración de Ca2+ en el citosol, el otro producto de hidrólisis -e l diacilglicerolejerce efectos bastantes diferentes. Tiene dos papeles funcionales potenciales. En primer lugar, puede ser posteriormente degradado, liberando ácido araquidónico que puede actuar como mensajero o ser utilizado en la síntesis de eicosanoides (véase Figura 15-6); En segundo lugar, y mucho más importante, activa una proteí na serina/treonina quinasa que fosforila varias proteínas de la célula diana.
Señalización vía receptores de superficie celular asociados a proteínas G
799
La enzima activada por el diacilglicerol se denomina proteina quinasa C (quinasa C o PKC de Protein Kinase C), debido a que es dependiente de Ca2+. Se cree que el increm ento inicial de la concentración citosólica de Ca2+ inducido por IP 3 altera la quinasa C, trastocándola de la cara citosólica de la membrana plasmática a la cara citoplasmàtica. Se activa por la com binación de Ca2+, diacil glicerol y el fosfolipido de m em brana cargado negativamente, fosfatidilserina. De las ocho o más isoformas diferentes de la quinasa C en mamíferos, al menos cuatro son activadas por diacilglicerol. Como el diacilglicerol producido inicialmente por la rotura de PIP2 es rápi damente metabolizado, no puede mantener la actividad de la quinasa C como sería necesario para obtener respuestas mantenidas como la proliferación o la diferenciación. La activación prolongada de la quinasa C depende de una segun da ola de producción de diacilglicerol catalizada por fosfolipasas que rompen el fosfolípido principal de la mem brana fosfatidilcolina. No se conoce cómo resul tan activadas estas fosfolipasas que actúan retrasadas. Cuando la quinasa C es activada fosforila residuos determinados de serina o de treonina de proteínas diana, las cuales varían en función del tipo de célula de que se trate. Las mayores concentraciones de quinasa C se han encontrado en el cerebro, donde (entre otras cosas) fosforila canales iónicos de las células nervio sas alterando sus propiedades y, por lo tanto, variando la excitabilidad de las m em brana plasmática de las células nerviosas. En muchas células la activación de la quinasa C incrementa la transcripción de determinados genes. Se conocen por lo menos dos procesos. En uno de ellos, la qui nasa C activa una cascada de proteínas quinasa que conduce a la fosforilación, y ac tivación, de una proteína reguladora de genes unida a DNA; en el otro proceso, la activación de la quinasa C conduce a la fosforilación de una proteína inhibidora, li berando así una proteina citoplasmàtica reguladora de genes que puede migrar al núcleo y estimular la transcripción específica de determinados genes (Figura 15-32).
QUINASA C INACTIVA
QUINASA C ACTIVA
MEMBRANA PLASMÁTICA (^quinasa c ) MAP quinasa
A CITOSOL
NF-KB
MAP quinasa
Figura 15-32 Dos procesos intracelulares mediante los cuales la quinasa C activa puede activar la transcripción específica de determinados genes. En uno de ellos {flechas rojas), la quinasa C activa una cascada de fosforilaciones que conduce a la fosforilación de una proteína quinasa clave, denominada MAP quinasa (se discute más adelante), la cual, a su vez, fosforila y activa la proteína reguladora de genes Elk-1. Elk-1 se halla unida a cortas secuencias de DNA (denominadas
elementos de respuesta sérica, SRE, de Serum Response
NO HAY TRANSCRIPCION DE LOS GENES 1 Y 2
800
Capítulo 15 : Transmisión de señales entre células
TRANSCRIPCION ACTIVADA DE LOS GENES 1 Y 2
Elements) en asociación con otra proteína de unión al DNA (denominada factor de respuesta sérica, SRF, de Serum Response Factor). En el otro proceso (flechas verdes) la activación de la quinasa C conduce a la fosforilación de Ik-B, la cual libera la proteína reguladora de genes NF-kB de forma que ahora puede migrar hasta el núcleo y allí activar la transcripción de determinados genes.
m olécula señal extracelular fosfolipasa C-(3 activada
diacilglicerol
ESPACIO EXTRACELULAR MEMBRANA PLASMÁTICA CITOSOL
ásteres de forbol
receptor activado i &
n ^
quinasa C activada
i
proteína Gq activada m im etizado por ionóforos de Ca2 UBERA Ca;;: DEL RETÍCULO ENDOPLASMÁTICO
En la Figura 15-33 se muestra cada una de las dos ramas del proceso de se ñalización de fosfolípidos de inositol. Como se indica en la figura, cada rama del proceso puede ser mimetizada mediante la adición a células intactas de agentes farmacológicos específicos . Los efectos de IP3 pueden ser mimetizados utilizan do un ionóforo de Ca2+, com o el A23187 o la ionomicina, los cuales permiten que el Ca2+ entre al citosol desde el líquido extracelular (se discute en el Capítulo 11). Los efectos del diacilglicerol se pueden mimetizar por ásteres de forbol, produc tos vegetales que se unen a la quinasa C y la activan directamente. Utilizando es tos reactivos, se ha podido demostrar que, a menudo, las dos ramas del proceso colaboran produciendo una respuesta celular completa. Por ejemplo, algunos ti pos celulares pueden ser estimulados a proliferar en cultivo cuando son tratados con ionóforos de calcio y con un activador de la quinasa C, pero no si se tratan con uno solo de ambos reactivos.
La calmodulina es un receptor intracelular de Ca2+ubicuo24 Habitualmente la concentración de Ca2+ libre en el citoplasma es < 10~7 M y ge neralmente no aumenta por encim a de 6 x 10-6 M, incluso aunque la célula esté activada por un influjo de Ca2+. Así, cualquiera que sea la estructura de la célula que actúe directamente como diana para la regulación dependiente de Ca2+ de berá tener una constante de afinidad (Ka) para el Ca2+ de unos 106 litros/mol. Además, como la concentración de Mg2+ en el citosol es relativamente constante (alrededor de 10~3 M), estos lugares de unión al Ca2+ deberán presentar una se lectividad para el Ca2+ sobre el Mg2+ de unas 1000 veces como mínimo. Se cono cen varias proteínas que unen Ca2+, que cumplen estos requisitos. La primera proteína de este tipo que se descubrió es la troponina C de las células del músculo esquelético; en el Capítulo 16 se discute el papel de esta pro teína en la contracción muscular. En todas las células animales y vegetales en que se ha estudiado, se ha encontrado otra proteína que une Ca2+, estrecham en te relacionada con la troponina C, denominada calmodulina. Una célula animal típica contiene más de 107 moléculas de calmodulina, lo cual significa aproxima damente el 1% de la masa total de proteína de la célula. La calmodulina actúa como un receptor intracelular polivalente de Ca2+ que media la mayoría de los procesos regulados por Ca2+. Se trata de una cadena polipeptídica altamente conservada, de unos 150 residuos de aminoácido, con cuatro lugares de unión con una alta afinidad para el Ca2+. Cuando une calcio, la calmodulina sufre un importante cambio de conformación (Figura 15-34A).
Señalización vía receptores de superficie celular asociados a proteínas G
FOSFORILA PROTEÍNAS CELULARES
Figura 15-33 Las dos ram as del proceso de los fosfolípidos de inositol. El receptor, una vez activado, se une a una proteína G trimérica específica (Gq) haciendo que la subunidad a se disocie y active la fosfolipasa C-0, la cual rompe el PIP2 generando IP 3 y diacilglicerol. El diacilglicerol (junto con el Ca2+ que lleva unido y con fosfatidilserina -n o se muestra en el dibujo), activa la quinasa C. Tanto la fosfolipasa C-P com o la quinasa C son enzimas solubles en agua que, al activarse, se translocan desde el citosol hasta la cara interna de la m embrana plasmática. Los efectos de IP3 pueden ser mimetizados experimentalmente en células intactas mediante el tratamiento con ionóforos de Ca2+ mientras que los efectos del diacilglicerol pueden ser mimetizados mediante el tratamiento con ásteres de forbol, los cuales se unen a la quinasa C activándola.
801
La activación alostérica de la calmodulina por el Ca2+ es análoga a la activa ción alostérica de la quinasa A por el AMP ciclico, con la diferencia de que el com plejo Ca2+-calmodulina no tiene actividad enzimàtica sino que actúa unién dose a otras proteínas. En algunos casos, la calmodulina actúa como una subunidad reguladora permanente de un complejo enzimàtico, pero en la mayoría de los casos la unión del Ca2+ induce a la calmodulina a unirse a varias proteínas diana de la célula, alterando su actividad. Cuando el complejo Ca2+-calmodulina se une a su proteína diana puede sufrir un cambio de conformación posterior mucho más importante (Figura 15-34B). De entre las proteínas diana reguladas por el complejo Ca2+-calmodulina, va rias de ellas son enzimas o proteínas de transporte a través de la membrana. En muchas células, por ejemplo, el complejo Ca2+-calmodulina se une, activando, la Ca2+-ATPasa de la membrana plasmática, la cual bom bea Ca2+ hacia el exterior de la célula. Así, si la concentración de Ca2+ en el citosol aumenta, la bomba se acti va, lo cual contribuye a que los niveles citosólicos de Ca2+ vuelvan a los valores normales. Sin embargo, la mayor parte de los efectos del complejo Ca2+-calmodulina son más directos y están mediados por proteina quinasas dependientes de
Ca2+-calmodulina.
En las células animales la mayoría de acciones del Ca2+ se producen a través de proteina quinasas dependientes de Ca2+-calmodulina (quinasas CaM)25 La mayoría de los efectos de Ca2+ en las células animales están mediados por fos forilaciones de proteínas catalizadas por una familia de proteína quinasas de pendientes de Ca2+-calm odulina (quinasas CaM). Estas quinasas fosforilan resi duos de serina o de treonina de determinadas proteínas y, como en el caso del AMP cíclico, la respuesta de una célula diana a un increménto de la concentra ción de Ca2+ libre en el citosol depende del tipo de quinasas CaM reguladas de que disponga la célula. Las primeras quinasas CaM que se descubrieron -la qui nasa de la cadena ligera de la miosina, que activa la contracción del músculo liso, y la fosforilasa quinasa, que activa la degradación del glucógeno- presentan una especificidad de substrato muy alta. Más recientemente, sin embargo, se han identificado algunas quinasas CaM con una especificidad más amplia, y que parecen ser las responsables de mediar muchas de las acciones del Ca2+ en las células animales. El ejemplo m ejor estudiado de una quinasa “multifuncional” Ca2+-calmodulina es la quinasa-CaM II, que se encuentra en todas las células animales pero
802
Capítulo 15 : Transmisión de señales entre células
Figura 15-34 Estructura del complejo Ca2+-calmodulina, basada sobre estudios de difracción de rayos X y de resonancia m agnética nuclear (NMR, de Nuclear Magnetic Reso nance). (A) La molécula parece una “pesa de gimnasia”, con dos cabezas globulares conectadas mediante una larga hélice a expuesta. Cada una de las dos cabezas tiene dos dominios de unión al Ca2+, cada uno de los cuales está constituido por un lazo de 12 residuos de aminoácidos en el que algunas cadenas laterales de ácido aspártico y de ácido glutámico forman enlaces iónicos con el Ca2+. Los dos lugares de unión al Ca2+ del extremo carboxilo terminal de la molécula tienen una afinidad por el Ca2+ diez veces superior a la del extremo amino terminal. En solución la molécula es flexible, mostrando un abanico de formas, desde formas extendidas (como la de la figura) hasta formas más compactas. (B) Cambios estructurales del complejo Ca2+-calmodulina que ocurren cuando éste se une a una proteína diana (en este ejemplo, un péptido que contiene un dominio de unión para Ca2+-calmodulina de una proteína quinasa dependiente de Ca2+calmodulina [la quinasa de la cadena ligera de la miosina, tratada más adelante]). Nótese que el complejo Ca2+-calmodulina se dobla com o una “navaja de bolsillo” abrazando al péptido. (A, basado en datos de cristalografía de rayos X de Y.S. Babu et al., N ature 315:37-40,1985. © 1985 Macmillan Magazines Ltd.; B, basado en datos de cristalografía de rayos X de W.E. Quiocho, Science 257:1251-1255, 1992, y en datos de NMR de M. Ikura et al., Science 256:632-638,1992. © the AAAS.)
dom inio inhibidor proteina fosfatasa
COOH INACTIVO
INDEPENDIENTE DE Ca: (50-80% ACTIVO) dom inio catalítico
Ca2+-calm odulina
calm odulina
autofosforilación COMPLETAMENTE ACTIVO
ACTIVADO
especialmente enriquecida en el sistema nervioso. Constituye hasta el 2% de la masa total de proteína en algunas regiones del cerebro, altamente concentradas en sinapsis. Por ejemplo, cuando las neuronas que utilizan catecolaminas (dopamina, noradrenalina o adrenalina) como neurotransmisores) son activadas, el influjo de Ca2+ a través de canales de Ca2+ regulados en sus membranas plasmáti cas induce a la célula a segregar su neurotransmisor. El influjo de Ca2+ también hace que la quinasa CaM II se fosforile, activándose, y activando a la tirosina hidroxilasa, la cual es la enzima reguladora de flujo de la síntesis de catecolam i nas. De esta forma, cuando la célula se activa se estimula tanto la secreción como la síntesis del neurotransmisor. La quinasa CaM II tiene una propiedad destacable: puede actuar como un dispositivo de memoria molecular, colocándose en un estado activo cuando es expuesta a Ca2+-calmodulina y permaneciendo activa incluso después de que la concentración de Ca2+ haya bajado. Ello es debido a que la quinasa se fosforila a ella misma (un proceso denominado autofosforilación), tal como fosforila a otras proteínas celulares cuando es activada por Ca2+-calmodulina. En su estado autofosforilado la enzima permanece activa en ausencia de Ca2+, prolongando así la duración de la actividad de la quinasa después de que acabe la señal inicial activadora de Ca2+; la actividad se mantiene hasta que las fosfatasas abaten la activi dad autofosforilativa de la enzima, inhibiéndola (Figura 15-35). Debido a estas propiedades, la activación de la quinasa CaM II puede ser utilizada como una memoria traza de un pulso de Ca2+ anterior, y al parecer ju e ga un importante papel en algunos tipos de memoria y de aprendizaje del siste ma nervioso de los vertebrados. Ratones mutantes que carecen de la subunidad específica de cerebro que se ilustra en la Figura 15-35 tienen defectos específicos en su capacidad de recordar la localización de un objeto -e s decir, de aprendiza je espacial.
Figura 15-35 Activación de la quinasa CaM II. La enzim a es un com plejo proteico de unas 12 subunidades. Las subunidades son de cuatro tipos homólogos (a, P, y y 8 ) que se expresan en diferentes tipos celulares en proporciones diferentes. En la figura se presenta únicam ente la subunidad a (en gris), que se expresa sólo en el cerebro. En ausencia de Ca2+-calmodulina la enzim a es inactiva com o consecuencia de una interacción entre el dominio inhibidor y del dominio catalítico. La unión de Ca2+-calmodulina altera la conform ación de la proteína, permitiendo que el dominio catalítico fosforile el dominio inhibidor de subunidades vecinas del com plejo así com o otras proteínas de la célula (no se muestran). La autofosforilación del com plejo enzim àtico (por fosforilación mutua de sus subunidades) prolonga la actividad de la enzima de dos maneras: ( 1 ) atrapa el com plejo Ca2+-calmodulina unido, de forma que no se disocia del com plejo enzim àtico hasta que los niveles citosólicos de Ca2+vuelven a los valores basales, unos 10 segundos después (no se muestra); (2 ) convierte la enzima en una forma independiente de Ca2+ ya que la quinasa se m antiene activa incluso después de que el com plejo Ca2+-calmodulina se disocie de ella. La actividad continúa hasta que el proceso de autofosforilación es contrarestado por una proteína fosfatasa.
Los procesos de Ca2+y de AMP cíclico interaccionan entre sí26 Los procesos de señalización a través de calcio y de AMP cíclico interaccionan en diversos niveles en la jerarquía de control. En primer lugar, los niveles citosó-
Señalización vía receptores de superficie celular asociados a proteínas G
803
licos de Ca2+ y de AMP cíclico pueden influirse respectivamente. Por ejemplo, al gunas formas de las enzimas pueden sintetizar y degradar AMP cíclico -la adenil ciclasa y la fosfodiesterasa respectivam ente- están reguladas por complejos Ca2+calmodulina. De forma inversa, la quinasa A puede fosforilar algunos canales y bom bas de Ca2+, modificando su actividad; por ejemplo, la quinasa A fosforila el receptor de IP3 del ER, lo cual puede inhibir o activar la liberación de Ca2+ induci da por IP3, dependiendo del tipo celular. En segundo lugar, las enzimas regula das directamente por Ca2+ y por AMP cíclico pueden influirse mutuamente. Por ejemplo, algunas quinasas CaM son fosforiladas por la quinasa A. En tercer lugar, estas enzimas pueden tener efectos interactivos sobre las mismas moléculas dia na del metabolismo. Así, frecuentemente la quinasa A y la quinasa CaM fosforilan lugares diferentes de la misma proteína la cual, por lo tanto, está regulada tanto por el AMP cíclico como por el Ca2+; la proteína reguladora del gen CREB, de la que hemos tratado anteriormente (véase pág. 793), constituye un ejemplo de ello. Como ejemplo de cómo pueden interactuar el Ca2+ y al AMP cíclico, consi deremos la fosforilasa quinasa del músculo esquelético, cuyo papel en la degra dación de glucógeno ya hemos explicado. Esta quinasa fosforila la glucógeno fosforilasa, la cual cataliza la degradación del glucógeno (véase Figura 15-25). Se trata de una enzima formada por cuatro subunidades aunque tan sólo una de ellas cataliza la reacción de fosforilación: las otras tres son reguladoras y permi ten que el com plejo enzimàtico sea activado por AMP cíclico y por Ca2+. Las cua tro subunidades se designan como a, (3, y y 5. La subunidad y es la que presenta la actividad catalítica; la subunidad 8 es la calmodulina y es la principal respon sable de la dependencia de la enzima por el Ca2+. Las subunidades a y (3 son las dianas de la regulación por el AMP cíclico, siendo ambas fosforiladas por la qui nasa A (Figura 15-36). La misma señal de Ca2+ que inicia la contracción muscular también asegura que exista suficiente cantidad de glucosa que aporte la energía necesaria para la contracción. El gran influjo de Ca2+ al interior del citosol (se discute en el Capítu lo 16) altera la conform ación de la subunidad de calmodulina de la fosforilasa quinasa, incrementando su actividad quinasa, con lo que se incrementa la velo cidad de degradación de glucógeno varios centenares de veces. Además, el influ jo de Ca2+ tam bién activa dos quinasas CaM que fosforilan (inhibiéndola) la glu cógeno sintasa, con lo que se inhibe la síntesis de glucógeno. Por el contrario, las fosforilaciones de la quinasa A inducidas por la adrenalina que hemos descrito ajustan el m etabolismo de la célula muscular anticipándose al incremento de la demanda energética permitiendo a la enzima ser activada cuando existen m e nos iones calcio unidos a la calmodulina, con lo que la enzima se hace más sen sible al Ca2+.
Algunas proteínas G triméricas regulan directamente canales iónicos27 Las proteínas G triméricas no actúan exclusivamente regulando la actividad de enzimas y alterando la concentración de nucleótidos cíclicos o de Ca2+ en el citosol. En algunos casos activan o inactivan directamente canales iónicos de la m em brana plasmática de la célula diana, alterando así su permeabilidad iónica y, por lo tanto, la excitabilidad de la membrana. Por ejemplo, la acetilcolina libe rada por el nervio vago reduce tanto la frecuencia como la fuerza de la contrac ción de la célula muscular del corazón. El efecto está mediado por una clase es pecial de receptores de acetilcolina que activan la proteina G inhibidora Gi( de la que hemos tratado previamente. (Estos receptores, que pueden ser activados por el alcaloide de hongos muscarina, se denominan receptores muscarínicos de acetilcolina para distinguirlos de otros receptores, muy diferentes a éstos, deno minados receptores nicotínicos de acetilcolina, que son receptores relacionados con canales iónicos de las células del músculo esquelético y de células nerviosas que pueden ser activadas por nicotina.) Una vez activada, la subunidad a de G¡
804
Capítulo 15 : Transmisión de señales entre células
lugar activo subunidad catalítica Ca2+-calm odul¡na
lugares fosforilados por quinasa A Figura 15-36 La fosforilasa quinasa. Dibujo muy esquemático que muestra las cuatro subunidades de la enzima de músculo de mamífero. La subunidad y presenta la actividad catalítica de la enzima activa; las subunidades a y P y la subunidad 8 (la calmodulina) median la regulación de la enzima por AMP cíclico y por Ca2+, respectivamente. El complejo enzimàtico final contiene cuatro copias de cada subunidad.
cilios m odificados neurona olfativa célula de sostén célula basal lám ina basal axón (A)
ÍB)
no sólo inhibe la adenil ciclasa (como hemos descrito previamente) sino que también abre directamente canales de K+de la membrana plasmática de la célu la muscular. La apertura de estos canales de K+ hace que la célula sea más difícil de despolarizar, lo cual contribuye al efecto inhibidor de la acetilcolina sobre el corazón. Otras proteínas G triméricas regulan la actividad de canales iónicos de una forma menos directa, bien regulando la fosforilación de canales (mediante, por ejemplo, la quinasa A, la quinasa C o la quinasa CaM) o bien causando la pro ducción o la destrucción de nucleótidos cíclicos que activan o inactivan directa mente canales iónicos. Estos canales iónicos regulados por nucleótidos juegan un papel crucial en los procesos de la visión y de la olfacción.
Figura 15-37 Receptores de neuronas olfativas. (A) Dibujo esquem ático del epitelio olfativo de la nariz. El receptor olfativo de las neuronas poseen cilios modificados que se proyectan desde la superficie del epitelio y contienen los receptores olfativos y la maquinaria para la transducción de la señal. El axón, que se extiende desde el extremo opuesto de la neurona receptora, conduce las señales eléctricas hasta el cerebro cuando la célula es activada por un odorante. Las células basales actúan como células madre, produciendo nuevas neuronas receptoras durante toda la vida. (B) Electronmicrografía de barrido de cilios de la superficie de una neurona olfativa. (B, de E.E. Morrison y R.M. C o s t a n z o Com p. Neurol. 297: 1-13, 1990 © Wiley-Liss, Inc.)
La olfacción y la visión dependen de receptores asociados a proteínas Gy de canales iónicos regulados por nucleótidos cíclicos28 Los humanos podemos distinguir más de 10 000 olores diferentes (odorantes ), los cuales son detectados por neuronas con receptores olfativos especializados en el revestimiento de la nariz. Estas células reconocen odorantes mediante re ceptores olfativos relacionados con una proteína G específica, que se presentan en la superficie de cilios modificados que sobresalen de las células (Figura 1537). Muchos de estos receptores actúan a través de AMP cíclico; cuando son esti mulados por la unión del odorante, activan una proteína G trimérica olfativa es pecífica (Goí/), la cual, a su vez, activa la adenil ciclasa; el incremento resultante de los niveles de AMP cíclico abre canales catiónicos regulados por AMP cíclico, lo cual permite que se produzca un influjo de Na+ que despolariza la célula e ini cia un impulso nervioso que viaja a lo largo del axón, hasta el cerebro. Otros re ceptores olfativos actúan a través del proceso de fosfolípidos de inositol y cana les de Ca2+ regulados por IP3 de la mem brana plasmática, pero respecto a su mecanismo de transducción existe todavía poca información. Se cree que existen centenares de receptores olfativos diferentes; cada uno está codificado por un gen diferente y reconoce odorantes diferentes, pero todos ellos pertenecen a la superfamilia de receptores asociados a proteínas G. A pesar de que sabemos que cada célula olfativa responde a un conjunto determinado de odorantes, no está claro si cada célula contiene únicamente un tipo de recep tor que reconoce toda la serie de odorantes a los que la célula es sensible o si cada célula contiene un juego de receptores, cada uno de los cuales es específico de un solo odorante. Los receptores relacionados con proteínas G también m e dian algunas formas de detección de sabor, pero respecto a ello se conoce toda vía muy poca cosa. Los canales iónicos regulados por nucleótidos cíclicos también participan en la transducción de señales en la visión de los vertebrados, pero el nucleótido crucial en este caso es el GMP cíclico (Figura 15-38) en lugar de ser el AMP cícli-
Señalización vía receptores de superficie celular asociados a proteínas G
GUANINA O
Figura 15-38 El GMP cíclico.
805
co. Como el AMP cíclico, las concentraciones celulares de GMP cíclico están controladas por una rápida velocidad de síntesis (por la guanilato ciclasa ) y una rápida degradación (por la fosfodiesterasa de GMP cíclico). En la transducción visual, la activación de los receptores está producida por la luz, y conduce a una disminución, en lugar de un incremento, de los niveles del nucleótido cíclico. El proceso se ha estudiado especialmente bien en el caso de la respuesta a la luz de los fotorreceptores en form a de bastón (bastones) de la retina de los vertebrados. Los bastones son responsables de la visión m ono crom ática con luz tenue, mientras que los fotorreceptores en form a de cono (co nos) son responsables de la visión crom ática con luz brillante. Un fotorreceptor en forma de bastón es una célula altamente especializada con un segmento ex terior y otro interior, un cuerpo celular y una región sináptica a través de la cual el bastón pasa una señal química a una célula nerviosa retiniana, la cual trans fiere la señal a lo largo del proceso visual (Figura 15-39), El aparato fototransductor se halla en el segmento exterior, que contiene discos apilados, cada uno de los cuales está formado por una especie de saco de membrana en la que se ha llan embebidas las moléculas fotosensibles de rodopsina. La membrana plas m ática que rodea el segmento exterior contiene canales de Na+ regulados por GMP cíclico. Estos canales de Na+ se mantienen abiertos en la oscuridad m e diante moléculas de GMP cíclico unidas al canal. Paradójicamente, la luz no causa una despolarización de la membrana plasmática (que podría estimular la señalización sináptica) sino una hiperpolarización de la membrana plasmática (que inhibe la señal sináptica), porqué la activación de las moléculas de rodopsi na por la luz en la m em brana de los discos conduce a que los canales de Na+ de la m em brana circundante se cierren (Figura 15-40). Como hemos indicado anteriormente, la rodopsina es una molécula trans m em brana que atraviesa la m em brana siete veces, homologa de otros miembros de la familia de receptores asociados a proteínas G y, como sus primas, actúa a través de una proteína G trimérica. Sin embargo, la señal activadora extracelular no es una molécula sino un fotón de luz. Cada molécula de rodopsina contiene el cromóforo, 11-cis retinal, unido covalentemente, el cual se isomeriza casi ins tantáneam ente a todo-trans retinal cuando absorbe un solo fotón. La isomerización altera la conform ación del retinal, induciendo un cambio de conformación más lento en la proteína (opsina). Entonces, la proteína activada se une a la pro teína G trimérica transducina (Gt) haciendo que la subunidad a (at) se disocie y active una fosfodiesterasa de GMP cíclico, la cual hidroliza el GMP cíclico, de forma que los niveles de GMP cíclico del citosol disminuyen. Como consecuen cia de ello, el GMP cíclico se disocia de los canales de Na+ de la membrana plas mática, permitiendo que se cierren. De esta forma la señal pasa de la membrana de los discos a la membrana plasmática, y la señal luminosa se transforma en una señal eléctrica. Los canales de Na+ tam bién son permeables al Ca2+, de forma que cuando se cierran el influjo normal de calcio se inhibe, haciendo que la concentración de Ca2+ en el citosol disminuya; esta disminución estimula a la guanilato cicla sa, la cual sintetiza GMP cíclico recuperando los niveles y haciendo que la célu la rápidamente recobre el estado en el que estaba antes de que la luz la activara. La activación de la guanilato ciclasa por la disminución de los niveles de Ca2+ está mediada por una proteína sensible al Ca2+ denominada recoverina la cual, contrariam ente a la calmodulina, es inactiva cuando se halla unida a Ca2+ y ac tiva cuando está libre de Ca2+; estimula la ciclasa cuando los niveles de Ca2+ son bajos tras la respuesta a la luz. Este m ecanism o dependiente de Ca2+ es de im portancia crucial, en dos aspectos. En primer lugar, permite al fotorreceptor re vertir rápidamente hasta su estado de reposo, típico de la oscuridad, tras un flash de luz, haciendo posible que el fotorreceptor pueda ser sensible a la corta duración del flash. En segundo lugar, contribuye a permitir que el fotorreceptor se adapte, disminuyendo la intensidad de la respuesta cuando se expone a la luz continuam ente. Como explicaremos más adelante, la adaptación significa que la célula receptora puede actuar como un detector sensible a cambios de la
806
Capítulo 15 : Transmisión de señales entre células
d is c o s cié
seg m en to exterio r ~
m em b ra n a fotorreceptora
m em brana plasm ática
seg m en to
interior
núcleo
CU(!f|)0 sinóptico
Figura 15-39 Dibujo de una célula fotorreceptora en bastón. En el segmento exterior existen unos 1000 discos; las membranas de cada disco no se hallan conectadas a la membrana plasmática.
:::: i j T O l . r0d0pSÍna
segmento exterior
jO
^
inactiva
I CHS» X -cana les de Na+ P X abiertos I » I t
O
t
~L
l O
I *
rodopsina
activa
-canales de Na+
X<3S*Í cerrados t O ' í o 1
1
segmento interior
célula despolarizada
célula hiperpolarizada
alta velocidad de liberación de transm isor
baja velocidad de liberación de transm isor
región nuclear región sináptica
OSCURIDAD
Figura 15-40 La respuesta a la luz de una célula fotorreceptora en bastón. Los fotones son absorbidos por las moléculas de rodopsina situadas en los discos del segmento exterior. Ello determina que los canales de Na+de la membrana plasmática se cierren, lo cual hiperpolariza la m em brana y reduce la velocidad de liberación del neurotransmisor desde la región sináptica. Debido a que el neurotransmisor actúa inhibiendo muchas de las neuronas retinianas postsinápticas, la iluminación frena la inhibición y, de esta forma, de hecho, las activa.
ILUMINACION
intensidad del estímulo en un enormemente amplio abanico de niveles basales de estimulación. En la Tabla 15-3 se recogen datos de las principales proteínas G tratadas en este capítulo.
Las señales extracelulares son notablem ente amplificadas mediante la utilización de m ensajeros intracelulares y de cascadas enzim áticas29 A pesar de diferencias en detalles moleculares, todos los sistemas señalizadores iniciados por receptores dependientes de proteínas G comparten ciertas carac terísticas y están gobernados por principios generales similares. Todos ellos, por ejemplo, dependen de complejas cascadas o inician cadenas de mensajeros in tracelulares. A diferencia de lo que ocurre con sistemas de señalización más di rectos utilizados por los receptores intracelulares discutidos antes y por recepto res relacionados con canales iónicos, tratados en el Capítulo 11, las cascadas catalíticas de mediadores intracelulares proporcionan numerosas oportunida des de amplificar y de regular las respuestas a señales extracelulares. En la casca da de la transducción visual que acabamos de describir, por ejemplo, una sola molécula de rodopsina activada cataliza la activación de cientos de moléculas de transducina a una velocidad de unas 1000 moléculas de transducina por segun do. Cada molécula de transducina activada activa una molécula de fosfodiesterasa de GMP cíclico, cada una de las cuales hidroliza unas 4000 moléculas de GMP cíclico por segundo. Esta cascada catalítica se mantiene durante aproxima damente un segundo, produciendo la hidrólisis de más de 105 moléculas de GMP cíclico por cada cuanto de luz absorbida, que cierra transitoriamente cen tenares de canales de Na+de la membrana plasmática (Figura 15-41). De forma similar, cuando una molécula señal extracelular se une a un re ceptor que indirectamente activa la adenil ciclasa vía proteína Gs, cada proteína receptora puede activar muchas moléculas de proteína Gs, cada una de las cua les puede activar a una molécula de adenil ciclasa. Como cada molécula de Gs permanece activa durante algunos segundos antes de hidrolizar su GTP unido,
Señalización vía receptores de superficie celular asociados a proteínas G
807
T abla 1 5-3 Las p rin cip ales fam ilias de p ro teín as G trim éricas* Algunos m iem bros Subunidades a Fam ilia de la fam ilia
I
II
III
Gs
as
G0if
«óir
G,
«i
G0
«o
G, (transducina)
a.
Gq
«q
-
Funciones
activa adenil ciclasa; activa canales de Ca2+ activa adenil ciclasa en neuronas sensoriales al olfato inhibe adenil ciclasa; activa canales de K+ activa canales de K+; inactiva canales de Ca2+; activa fosfolipasa C-p activa fosfodiesterasa de GMP cíclico en fotorreceptores en bastón de vertebrado activa fosfolipasa C-P
Modificado por toxina bacteriana
colérica activa colérica activa
pertúsica inhibe pertúsica inhibe
colérica activa y pertúsica inhibe no tiene efecto
* Las familias se determinan por la relación entre las secuencias de aminoácidos de las subunidades a. Únicamente se presentan ejemplos seleccionados. En mamíferos se han descrito unas 20 subunidades a y al menos 4 subunidades p y 7 subunidades y.
puede m antener activa a la ciclasa a la que se halla unida durante algunos se gundos, de forma que la ciclasa puede catalizar la conversión de un gran núm e ro de moléculas de ATP a AMP cíclico (Figura 15-42). Un tipo de amplificación como éste se presenta en la ruta de los fosfolípidos de inositol. Como resultado de ella, una señal extracelular a concentración nanomolar (10~9 M) induce a m e nudo concentraciones micromolares (IO-6 M) de un segundo mensajero intracelular como el AMP cíclico o el Ca2+. Estas moléculas actúan como efectores alostéricos activando enzimas determinadas, por lo que una única molécula señal extracelular puede provocar la alteración de varios miles de moléculas en la cé lula diana. Además, cada una de las proteínas reguladoras de la cadena de pro cesos que se han activado puede ser una diana independiente de la regulación, tal como ocurre por ejemplo en la cascada metabòlica que produce la degrada ción del glucógeno en las fibras del músculo esquelético. Estas cascadas m etabólicas explosivas han de estar reguladas por m ecanis mos muy eficientes y sensibles. Por consiguiente, no resulta sorprendente que las células presenten m ecanism os eficaces para la degradación rápida del AMP cíclico y para el amortiguamiento y secuestro del Ca2+, así com o para la inactiva ción de las enzimas que responden y para las proteínas transportadoras, una vez se han activado. Todo esto es claram ente esencial para parar la respuesta y para definir el estado estacionario a partir del cual la célula ha de responder. Como hemos visto antes (véase pág. 777), en general la respuesta a la estimula ción puede ser frenada rápidamente únicamente si los mecanism os también son rápidos.
Las células pueden responder de form a súbita a incrementos graduales de la concentración de una señal extracelular30 Algunas respuestas celulares a ligandos de señalización aumentan gradualmen te de forma proporcional a la concentración del ligando. La respuesta primaria a las horm onas esteroideas (véase Figura 15-13) sigue a menudo este patrón, posiblem ente porque cada receptor hormonal une una sola molécula de hor mona, y cada secuencia de DNA de reconocim iento específico de un gen que responde a las horm onas esteroideas actúa de forma independiente. A medida
808
Capítulo 15 : Transmisión de señales entre células
una m olécula de rodopsina absorbe un fotón
se activan 500 m oléculas de trasducina
I
se activan 500 m oléculas de fosfodiesterasa
se hidrolizan 105 m oléculas de GMP cíclico
l se cierran 250 canales de Na+ se im pide que entre 106 y 107 iones Na+ entren a la célula por segundo, durante un período de ~1 segundo
.
I.
la m em brana de la célula bastón se hiperpolariza 1 mV Figura 15-41 Amplificación de la cascada catalítica inducida por la luz, en bastones de vertebrados. Las flechas divergentes indican las etapas en las que se produce amplificación.
cada proteína receptora activada puede activar muchas moléculas de proteina Gs, cada una de las cuales libera una subunidad a que puede activar una m olécula de adenil ciclasa durante un período de tiem po prolongado
subunidad a de la proteína Gs adem ciclasa activada
AMPLIFICACION
cada m olécula de adenil ciclasa activada genera muchas m oléculas de cAMP
Figura 15-42 Amplificación en una cascada catalítica inducida por un ligando. La primera etapa de amplificación requiere que el ligando señal permanezca unido al receptor el tiempo necesario para que el receptor active varias moléculas Gs ; en muchos casos el ligando se disociará muy lentam ente para que se produzca esta amplificación.
AMPLIFICACIÓN
I l
9
#
1 #
I #
cAMP
100
las m oléculas de cAMP activan la quinasa A
/ cada m olécula de quinasa A puede fosforilar, activando muchas copias de la enzima X
I
\ \
/
\
quinasa A )n a lb ú m in a
AMPLIFICACIÓN
/
\
• fH §
cada copia de la enzima X produce muchas m oléculas de producto
I
' o v a lb ú m i na
I
AMPLIFICACIÓN
0
productos de la enzim a X
que aumenta la concentración de la hormona, la concentración de los com ple jos horm ona-receptor aumenta de forma proporcional, y tam bién aumenta pro porcionalmente el número de complejos unidos a secuencias específicas de re conocim iento de los genes que responden; así pues, la célula responde de una manera lineal. Sin embargo, otras respuestas a ligandos de señalización empiezan de m a nera más súbita cuando aumenta la concentración del ligando. Algunas de ellas pueden ocurrir incluso de una forma que casi es del “todo o nada”, siendo indetectable por debajo de una concentración umbral de ligando y aumentando has ta un máximo en cuanto esta concentración umbral se sobrepasa. Algunos facto res de crecimiento, por ejemplo, actúan como señales de todo o nada indicando a las células que deben empezar a replicar su DNA como preludio de una divi sión celular. ¿Cuál puede ser la base molecular de una respuesta abrupta como ésta, casi a modo de interruptor, ante una señal gradual ? Un posible m ecanismo para escalonar la respuesta consiste en que para que se produzca la respuesta haga falta que a una macromolécula diana se le una una molécula o un complejo intracelular. Por ejemplo, en algunas respuestas in-
Señalización vía receptores de superficie celular asociados a proteínas G
100
% de receptores activados Figura 15-43 Respuesta que presentan las células del oviducto de gallina ante la estimulación por la horm ona esteroidea estradiol. Una vez activados, los receptores de estradiol activan la transcripción de varios genes diferentes. La gráfica muestra las curvas dosis-respuesta para dos de estos genes, que codifican las proteínas del huevo co n a lb ú m in a uno y o v o a lb ú m in a el otro. La cinética lineal de respuesta para la conalbúm ina indica que cada molécula de receptor activado que se une al gen de la conalbúm ina increm enta la actividad del gen en la misma cantidad. Por el contrario, el retraso seguido del abrupto increm ento en la cinética de respuesta para la ovoalbúmina sugiere qúe para iniciar la transcripción de este gen se le han de unir sim ultáneamente más de un receptor activado (en este caso son 2 receptores). (Adaptado de E.R. Mulvihill y R.D. Palmiter, J. Biol. Chem . 252:2060-2068, 1977.)
809
Figura 15-44 Cinéticas de activación en función de la concentración de la molécula señal. Las curvas muestran
cómo se incrementa la pendiente de la respuesta a medida que se incrementa el número de moléculas de efector que se han de unir simultáneamente para activar una macromolécula diana. Las curvas de la gráfica son las que cabe esperar si la activación necesitara la unión simultánea de 1, 2,8 o 16 moléculas de efector, respectivamente.
subunidades proteicas inactivas
ligando señal"S "
cntÁlB 0,5 1,0 1,5 concentración relativa de moléculas de efector
2,0
ducidas por hormonas esteroideas parece que han de unirse simultáneamente más de un com plejo horm ona-receptor a una secuencia de DNA específica de reconocim iento para conseguir activar un gen determinado. Como resultado de ello, la activación del gen empieza de forma más abrupta que si fuera suficiente la unión de un solo com plejo para producir esta activación (Figura 15-43). Un m ecanism o similar a éste actúa en las activaciones mediadas por la quinasa A y por la calmodulina, como hem os discutido antes. Por ejemplo, se han de unir dos o más iones Ca2+para conseguir que la calmodulina adopte su conformación activa; com o resultado de ello, se produce un incremento de cincuenta veces en la activación del proceso cuando la concentración de Ca2+ tan sólo se increm en ta diez veces. Este tipo de respuestas son tanto más abruptas cuanto mayor sea el número de moléculas que cooperan, de forma que si el número es suficiente m ente elevado se pueden conseguir respuestas cercanas al “todo o nada” (Figu ras 15-44 y 15-45). Tam bién se consiguen respuestas súbitas cuando un ligando activa a una enzima y al mismo tiempo inhibe otra enzima que cataliza la reacción opuesta a la de la primera enzima. Ya hemos hablado de un ejemplo de este habitual siste m a de regulación en la estimulación de la degradación del glucógeno en las cé lulas del músculo esquelético, en las cuales un incremento en la concentración intracelular de AMP cíclico activa la fosforilasa quinasa e inhibe la acción opues ta de la fosfoproteína fosfatasa. Este mecanism o puede producir respuestas muy abruptas, pero en todo caso ligeramente graduales de acuerdo con la variación de la concentración del ligando señal. Sin embargo, existe otro m ecanismo por el cual una célula puede responder de forma “todo o nada” de modo que en cuanto la señal sobrepasa un valor umbral se produce una respuesta rápida y máxima. Todas las respuestas “todo o nada” de este tipo dependen generalmente de la retroalimentación posi tiva. Por este m ecanismo, las células nerviosas y musculares generan potenciales de acción siguiendo la ley del “todo o nada”, en respuesta a neurotransmisores (se discute en el Capítulo 11). La activación de los receptores de acetilcolina en una unión neuromuscular, por ejemplo, abre los canales catiónicos de la mem brana plasmática de la célula muscular. El resultado de ello es un influjo neto de Na+ que despolariza localm ente la mem brana plasmática. Esto hace que los ca nales de Na+ controlados por voltaje situados en esta región de la membrana se abran, produciendo un nuevo influjo de Na+, el cual despolariza aún más la
810
Capítulo 15 : Transmisión de señales entre células
,0
com plejos proteicos activos ensam blados de form a cooperativa Figura 15-45 Un tipo de m ecanism o de señalización del que cabe esperar que presente una respuesta súbita.
Aquí se requiere la unión de ocho moléculas de un ligando señal sobre un complejo proteico para activarlo: la capacidad de las subunidades para ensamblarse formando el complejo activo depende del cambio alostérico de conformación que sufre cada subunidad cuando se une a su ligando. La unión de un ligando formando un complejo de este tipo es generalmente un proceso cooperativo, que genera una respuesta escalonada cuando cambia la concentración del ligando, como se explica en el Capítulo 5. A bajas concentraciones del ligando, el número de complejos activos se incrementará súbitamente en proporción a la octava potencia de la concentración del ligando.
mem brana por lo que los canales de Na+todavía se abren más, etc. Si la despola rización inicial excede un cierto umbral, esta retroalimentación positiva tiene un efecto “explosivo”, produciendo un potencial de acción que se propaga por toda la mem brana del músculo. Como hemos discutido antes, tiene lugar un m eca nismo de retroalimentación positivo como éste cuando el Ca2+ es liberado del ER o del retículo sarcoplasmático a través de canales de Ca2+: el Ca2+ liberado puede unirse a los canales de Ca2+ incrementando más la liberación de Ca2+, producien do así una espiga de Ca2+ tipo "todo o nada".
El efecto de algunas señales puede ser recordado por la célula31 Un m ecanismo de aceleración por retroalimentación positiva puede establecer se entre proteínas señal que en lugar de ser canales iónicos presenten actividad enzimàtica. Supongamos por ejemplo que un ligando señal determinado activa una enzima localizada a mitad de la cadena de acontecim ientos que transmiten la señal, y que dos o más moléculas del producto de esta reacción enzimàtica se unen a la enzima activándola aún más (Figura 15-46). La consecuencia será que en ausencia del ligando se producirá una velocidad muy pequeña de síntesis del producto enzimàtico, y que esta velocidad aumentará muy lentamente cuando aumente la concentración del ligando hasta que, a un determinado valor umbral de concentración del ligando, se formará suficiente cantidad de producto para activar la enzima, estableciéndose entonces un sistema de autoaceleración. En tonces, la concentración del producto enzimàtico aumentará súbitamente hasta el nivel más alto posible. De esta forma, la célula puede traducir una variación gradual de la concentración de un ligando señal en un cambio de tipo “interrup tor" de los niveles de un producto enzimàtico determinado, generando una res puesta de tipo “todo o nada” en la célula. Este tipo de m ecanism o tiene una importante propiedad que lo hace inutilizable para determinados propósitos y únicamente útil para otros. Si un siste ma como éste ha sido activado aumentando la concentración del ligando señal por encim a del umbral, generalmente permanecerá activo cuando la señal vuelva a descender por debajo del valor umbral: en lugar de reflejar fielmente los niveles reales de señal en cada momento, este sistema de respuesta tiene memoria. Ya hem os discutido el ejemplo de la CaM quinasa II, la cual es activa da por Ca2+-calmodulina a autofosforilarse y a fosforilar otras proteínas. La autofosforilación m antiene activa la quinasa cuando los niveles de Ca2+ ya han vuelto a la normalidad y el com plejo Ca2+-calmodulina se ha disociado de la en zima (véase Figura 15-35). Tam bién puede actuar un m ecanism o de autoactivación de memoria más abajo en un proceso de señalización, a nivel de la trans cripción gènica. Por ejemplo, la señal que desencadena la determinación de la fibra muscular activa una serie proteínas reguladoras de genes específicos de célula muscular que estimulan tanto la transcripción de estos mismos genes como de otros genes que producen muchas otras proteínas de célula muscular (véase pág. 475).
enzima inactiva
ligando señal enzima activa
lugar de unión para el producto de la enzima lugar activo
de la enzima UNIÓN DE DOS MOLÉCULAS DEL PRODUCTO DE LA ENZIMA
producto de la enzima
enzima m uy activa
Figura 15-46 Un m ecanism o de “retroalim entación positiva acelerante”. La unión inicial del
ligando señal activa la enzima para generar un producto, el cual se une a la propia enzima, incrementado aún más su actividad enzimàtica.
Resumen Los receptores asociados con proteínas G activan o inactivan indirectam ente enzi m as unidas a la m em brana plasmática o canales iónicos, a través d e proteínas re guladoras G triméricas (proteínas G), qu e se inactivan a sí mismas m ediante la h i drólisis del GTP q u e llevan unido. Algunos receptores asociados a proteínas G activan o inactivan la adenil ciclasa, alterando así la concentración intracelular del m ediador intracelular AMP cíclico. Otros activan una fosfolipasa C específica d e fosfolípidos d e inositol (la fosfolipasa C-pj, la cual hidroliza elfosfatidilinositol bisfosfato (P IP J generando dos m ediadores intracelulares -el inositol trisfosfato (IP J, qu e libera Ca2* desde el ER increm entando así la concentración d e Ca2+ en el citosol, y el diacilglicerol, qu e perm anece en la m em brana plasmática y activa la quinasa C. Un increm ento d e los niveles de AMP cíclico o d e Ca2* afecta la célula es
Señalización vía receptores de superficie celular asociados a proteínas G
811
timulando la quinasa A y la quinasa CaM, respectivamente. La quinasa C, la qui nasa A y la quinasa CaMfosforilan proteínas diana determinadas sobre residuos de serina y de treonina, alterando la actividad de estas proteínas. Cada tipo de cé lula tiene conjuntos característicos de proteínas diana que son reguladas de esta forma, lo cual permite a la célula presentar su respuesta propia y característica a cambios de los niveles intracelulares de AMP cíclico o de Ca2+libre. A través de las cascadas mediadas por el AMP cíclico o por el Ca2+, las respuestas a las señales extracelulares pueden ser enormemente amplificadas. Las diferentes respuestas mediadas por estos receptores son rápidamente frena das cuando el ligando señal extracelular es eliminado. Ello es debido a que las proteí nas G se autoinactivan hidrolizando el GTP que llevan unido, el IP3 es rápidamente desfosforilado mediante una fosfatasa (o fosforilado por una quinasa), el diacilglicerol es rápidamente degradado, los nucleótidos cíclicos son rápidamente hidrolizados por una fosfodiesterasa, el Ca2+es rápidamente bombeado hacia juera del citosol y las proteínas son rápidamente desfosforiladas por proteína fosfatasas. El continuo y rápido recambio de estos mediadores intracelulares hace posible que se produzca un rápido incremento de sus concentraciones cuando las células respon den a señales extracelulares. Además, las células pueden utilizar la cooperatividady la retroalimentación positiva para hacer que sus respuestas sean más súbitas.
Señalización vía receptores de superficie celular asociados a enzimas Como los receptores asociados a proteínas G, los receptores asociados a enzi mas son proteínas transm em brana cuyo dominio de unión al ligando se halla sobre la superficie exterior de la membrana plasmática. En lugar de tener un do minio citosólico que se asocia a una proteina G trimérica, sus dominios citosólicos tienen una actividad enzimàtica asociada o están asociados directamente a una enzima. Mientras que los receptores asociados a proteínas G atraviesan sie te veces la membrana, habitualm ente cada subunidad de los receptores catalíti cos la atraviesan una sola vez. Existen cinco clases conocidas de receptores asociados a enzimas: (1) el re ceptor guanilato ciclasa, que catalizan la producción de GMP cíclico en el citosol; (2) los receptores tirosina quinasa, que fosforilan determinados residuos de tirosina de un pequeño grupo de proteínas señal intracelulares; (3) los receptores asociados a tirosina quinasas, que están asociados a proteínas que tienen activi dad tirosina quinasa; (4) los receptores tirosina fosfatasa, que eliminan grupos fosfato de residuos de tirosina de determinadas proteínas señal intracelulares, y (5) los receptores serina/treonina quinasa, que fosforilan determinados residuos serina o treonina de algunas proteínas intracelulares. Empezaremos nuestra discusión con el receptor guanilato ciclasa.
Los receptores guanilato ciclasa generan GMP cíclico directamente31 Los péptidos natriuréticos atriales (ANP, de Atrial Natriuretic Peptides) constitu yen una familia de hormonas peptídicas, muy relacionadas entre sí, que son se gregadas por células musculares del atrium del corazón cuando se incrementa la presión de la sangre. Los ANP estimulan el riñón para que segregue Na+y agua e inducen a las células musculares lisas de las paredes de los vasos sanguíneos a que se relajen. Ambos efectos tienden a disminuir la presión sanguínea. El re ceptor de ANP que media estas respuestas se halla presente en las células del ri ñón y en las células de la musculatura lisa de los vasos sanguíneos; se trata de una proteína que atraviesa una sola vez la membrana plasmática, que tiene un lugar extracelular de unión a ANP y un dominio intracelular con actividad guani lato ciclasa. La unión de ANP activa la ciclasa para producir GMP cíclico, el cual, a su vez, se une y activa una proteina quinasa dependiente de GMP cíclico (qui nasa G), la cual fosforila determinadas proteínas sobre residuos de serina o treo-
812
Capítulo 15 : Transmisión de señales entre células
dom inio rico en cisteínas
k
dom inio semejante a una ¡nm unoglobulm a
m em brana CITOSOL P'asmática región insertada en la quinasa
dom inio tirosina quinasa receptor receptor de receptor de EGF insulina, de NGF receptor receptor de IGF-1 de PDGF, receptor de M-CSF
Figura 15-47 Seis subfamilias de receptores tirosina quinasa. Solamente se indican uno o dos miembros de cada subfamilia. Nótese que en algunas subfamilias el dominio tirosina quinasa se halla interrumpido por una “región insertada en la quinasa”. No se conoce el significado funcional de los dominios ricos en cisterna y de los dominios sem ejantes a una inmunoglobulina.
receptor de VEGF
nina. Así, los re c e p to r e s g u a n ila to c ic la s a utilizan el GMP cíclico como media dor intracelular de la misma forma que algunos receptores asociados con proteí nas G utilizan el AMP cíclico, con la diferencia de que la unión entre el ligando y la actividad ciclasa se produce directamente en lugar de suceder vía una proteí na G trimérica. A pesar de que conocem os relativamente pocos receptores que pertenezcan a la familia guanilato ciclasa, muchos receptores conocidos pertenecen a la fa milia tirosina quinasa, de la que trataremos a continuación.
Los receptores para la mayoría de los factores de crecim iento son proteínas transm em brana que presentan actividad proteína tirosina quinasa específica32 La primera proteína receptora que se reconoció que presentaba a ctiv id a d p ro te í n a tiro s in a q u in a s a e s p e c ífic a (en 1982) fue el receptor para el factor de creci
miento epidérmico (EGF, de Epidermal Growth Factor). El EGF es una pequeña proteína (53 residuos de aminoácido) que estimula la proliferación de las células epidérmicas y de una gran variedad de otros tipos celulares. Su receptor es una proteína transmembrana, que atraviesa la membrana una sola vez, de unos 1200 residuos de aminoácido y que presenta una larga zona extracelular glucosilada que se une a EGF. Cuando el EGF se une a esta porción, se activa un dominio in tracelular con actividad tirosina quinasa. Una vez activado, el receptor transfiere un grupo fosfato del ATP a determinadas cadenas laterales de tirosina, tanto de la propia proteína receptora como de otras proteínas celulares determinadas. Muchos otros receptores para factores de crecimiento y diferenciación también son re c e p to r e s tiro s in a q u in a s a . Entre ellos, cabe destacar los receptores para el factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF, de Platelet-Derived Growth Factor), para los factores de crecimiento de los fibroblastos (FGF, de Fibroblast Growth Factors), para el factor de crecimiento de los hepatocitos (HGF, de Hepatocyte Growth Factor), para el factor de crecimiento-1 para insulina y compuestos análogos (IGF-1, de Insulin, insulinlike Growth Factor-1), para el factor de creci miento neuronal (NGF, de Nerve Growth Factor), para el factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF, de Vascular Endothelial Growth Factor), y para el fa c tor estimulador de la formación de colonias de macrófagos (M-CSF, de Macrophage Colony Stimulating Factor), todos los cuales son proteínas. Como se muestra en la Figura 15-47, la familia de receptores con actividad tirosina quinasa puede subdividirse en un determinado número de subfamilias estructurales; en cada
Señalización vía receptores de superficie celular asociados a enzimas
813
COOH dím ero de PDGF
2 nm
HOOC (B) caso los receptores se fosforilan a sí mismos para iniciar la cascada de señaliza ción intracelular. ¿De qué forma la unión de una proteína específica del dominio extracelular de un receptor tirosina quinasa activa el dominio catalítico que se halla situado al otro lado de la m em brana plasmática? Resulta difícil de imaginar que un cam bio de conform ación pueda propagarse a través de la bicapa lipídica a través de una hélice a sencilla que atraviesa la membrana. El problema quedó resuelto cuando se demostró que la unión de un ligando hace que el receptor de EGF for me dímeros, lo cual permite a los dos dominios citoplasmáticos fosforilarse uno al otro sobre varios residuos tirosina. Esta fosforilación cruzada se denomina autofosforilación porque se produce dentro del receptor dimérico. En el caso de los receptores de PDGF el ligando es un dímero que reacciona con dos receptores a la vez (Figura 15-48). El EGF, por el contrario, es un monómero que al parecer induce un cam bio de conform ación en el dominio extracelular de su receptor, lo cual induce la dimerización del receptor. Se cree que la dimerización del recep tor es un m ecanism o general de la activación de los receptores asociados a enzi ma que tienen un único dominio transmembrana. La dimerización del receptor puede utilizarse experimentalmente para inactivar específicam ente determinados receptores, en un intento de determinar su importancia en una respuesta celular particular. La estrategia supone la transfección de células con un DNA que codifica una forma mutante de un receptor tirosina quinasa que dimeriza norm alm ente pero que tiene un dominio quinasa inactivo. Cuando se coexpresan a elevado nivel con receptores normales, los re ceptores mutantes actúan de una manera dominante negativa (véase Figura 744), inhabilitando los receptores normales al formar dímeros inactivos con ellos. Los procesos de señalización desencadenados por los receptores de EGF, PDGF y de FGF se han analizado con gran detalle. En cada caso las tirosinas de autofosforilación se utilizan como lugares de unión, de alta afinidad, para proteí nas señal intracelulares de la célula diana. Cada una de estas proteínas se une a diferentes lugares fosforilados del receptor activado, reconociendo además de la fosfotirosina, determinadas características del entorno de la cadena polipeptídica. Una vez se han unido al receptor, muchas de estas proteínas resultan fosforiladas sobre tirosinas, y así son activadas. De esta forma se cree que la autofosfo rilación en tirosinas actúa com o una especie de interruptor que desencadena el ensam blaje transitorio de un complejo señal intracelular, el cual libera la señal al interior de la célula. Los receptores de insulina y de IGF-1 actúan de una forma ligeramente dife rente. En primer lugar, dado que los receptores son tetrámeros (véase Figura 1547), se cree que la unión del ligando no induce una dimerización sino una inter acción alostérica entre las dos mitades del receptor. En segundo lugar, la unión de insulina hace que el receptor fosforile su dominio catalítico, el cual activa la capacidad de fosforilar otra proteína (denominada substrato-1 del receptor de in sulina o IRS-1, de Insulin Receptor Substrate-1) sobre múltiples tirosinas. Las fosfotirosinas de IRS-1 actúan como lugares de unión de alta afinidad para el aco plamiento y activación de proteínas señal intracelulares, muchas de las cuales también se unen directamente a otros receptores tirosina quinasa activados.
814
Capítulo 15: Transmisión de señales entre células
receptor de PDGF
Figura 15-48 Factor de crecim iento derivado de las plaquetas (PDGF).
(A) Estructura dimérica de la proteína, con las regiones de unión al receptor sombreadas en amarillo. El dímero se mantiene por tres enlaces disulfuro (no se muestran). (B) Debido a que PDGF es un dímero con dos lugares de unión, puede unirse a dos receptores adyacentes, iniciando así el proceso de señalización intracelular. El factor de crecimiento neuronal (NGF), como las demás proteínas de la familia de las neurotrofinas (discutida en el Capítulo 21), también actúa como dímeros que entrecruzan sus tirosina quinasas.
m em brana plasmatica
receptor de PDGF
Figura 15-49 Unión de proteínas señal Intracelulares que contienen SH2, a un receptor activado de PDGF.
CITOSOL Pl 3-quinasa (subunidad reguladora)
(A)
dom inio SH2
^
® (p)| ty r
proteína activadora de GTPasa (GAP)
71
fosfolipasa C-y (PLC-y)
1009
dom inio tirosina quinasa dividido
1021
dom inio SH3
dom inio de unión dom inio de unión para la cadena lateral para la fosfotirosina de un am inoácido
nh2 cooh (C)
(B)
Los residuos tirosina fosforilados son reconocidos por proteínas con dominios SH233 Se ha encontrado una colección completa de proteínas señal intracelulares que se unen a las fosfotirosinas de receptores tirosina quinasa activados. Algunas de estas proteínas -u n a proteína activadora de una GTPasa (GAP, de GTPase-Activating Protein”), la fosfolipasa C-y (PLC-y, de phospholipase C-y) y las proteína tirosina quinasas no receptoras, semejantes a Src- tienen funciones más o menos conoci das, como veremos en las próximas páginas. La fosfolipasa C-y, por ejemplo, actúa de la misma forma que la fosfolipasa C-p, activando el proceso de señalización de los fosfolípidos de inositol, del que hemos tratado anteriormente en conexión con la señalización vía proteínas G. Otras proteínas que se unen a receptores tirosina quinasa activados constituyen un misterio. La enzima fosfatidilinositol 3’-quinasa (PI3-quinasa), por ejemplo, parece ser importante en la regulación de la prolifera ción celular; su acción inmediata es fosforilar el anillo de inositol del fosfatidilino sitol en la posición 3 (véase Figura 15-29), pero las funciones de los fosfoinosítidos especiales generados de esta forma son desconocidas. A pesar de que las proteínas señal intracelulares que se unen a residuos de fosfotirosina de receptores activados tirosina quinasa (y a IRS-1) tienen estructuras y funciones muy variadas, habitualmente comparten dos dominios no catalíticos al tamente conservados, denominados SH2 y SH3 por regiones homologas Src 2 y 3 , ya que encontraron por primera vez en la proteína Src (famosa por su papel en el estudio de cáncer, como se discute en el Capítulo 24). Los dominios SH2 recono cen tirosinas fosforiladas y permiten a las proteínas que los presentan unirse a los receptores tirosina quinasa activados así como a otras proteínas señal intracelula res que hayan sido fosforiladas transitoriamente sobre tirosinas (Figura 15-49). La
Señalización vía receptores de superfìcie celular asociados a enzimas
(a) Dibujo esquemático de un receptor de PDGF mostrando cinco lugares de autofosforilación en tirosinas, tres en la región insertada en la quinasa y cinco en la cola carboxilo terminal; a estos lugares se unen las tres proteínas señal que se indican a su izquierda. (Existen otros dos lugares de autofosforilación en tirosinas del receptor, que no se indican en el dibujo, localizados entre el dominio que atraviesa la membrana y el principio del domjnio quinasa, que actúan como lugares de unión para tirosina quinasas no receptoras semejantes a Src.) Los números de la derecha indican las posiciones de las tirosinas en la cadena polipeptídica. Estos lugares de unión han sido identificados utilizando la tecnología del DNA recombinante para mutar determinadas proteínas del receptor: la mutación de las tirosinas 1009 y 1021, por ejemplo, impide la unión y la activación de PLC-y, de forma que la activación del receptor no estimula el proceso de señalización de fosfolípidos de inositol. Se indica la localización de los dominios SH2 (en rojo) y SH3 (en azul) en las tres proteínas señal. (B) Estructura tridimensional de un dominio SH2, determinada por cristalografía de rayos X. En amarillo a la derecha, se muestra el bolsillo para la fosfotirosina y en amarillo a la izquierda se muestra un bolsillo de unión específica a una cadena lateral de un aminoácido. (C) El dominio SH2 es un módulo compacto que puede ser insertado en casi cualquier sitio de una proteína sin alterar ni el plegamiento ni la función de dicha proteína. Debido a que cada dominio tiene diferentes lugares de unión que reconocen fosfotirosinas y determinadas cadenas laterales de aminoácidos, los diferentes dominios SH2 reconocen fosfotirosinas en el contexto de diferentes secuencias de aminoácidos flanqueantes. (B, basado en datos de G. Waksman et al., Cell 72:1-20,1993. © Cell Press.)
815
función del dominio SH3 es menos clara, pero parece ser que se une a otras proteí nas celulares. Los estudios sobre una clase de pequeñas proteínas “adaptadoras” que sola mente constan de un dominio SH2 y otro SH3 han permitido sugerir que el do minio SH3 debe tener una función de unión. Estas pequeñas proteínas SH adap tadoras no presentan actividad catalítica intrínseca y actúan acoplando proteínas fosforiladas en tirosinas, como los receptores tirosina quinasa activa dos, con otras proteínas que no tienen dominios SH2 o SH3 propios. Una de es tas proteínas SH adaptadoras, denominada Sem-5, fue descubierta a través de estudios genéticos en el gusano nemátodo C. elegans, como se discute en el Ca pítulo 21. Determinadas mutaciones en el gen sem-5 bloquean el proceso de se ñalización que parte desde varios receptores tirosina quinasa y tiene profundos efectos sobre el desarrollo del gusano. Los procesos de señalización son bloquea dos con la misma efectividad por mutaciones que afectan al dominio SH2 o a cualquiera de los dos dominios SH3 de la molécula, lo cual sugiere que ambos dominios SH3 son necesarios para unir un com ponente señal del proceso (véase Figura 15-53). De hecho, parece que en la mayoría de las células animales se ha llan presentes proteínas homologas a Sem-5, y existen evidencias tanto genéti cas como bioquímicas de que estas proteínas acoplan los receptores proteína quinasa activados con Ras, la importante proteína del proceso de señalización, sobre la que volveremos enseguida.
Las proteínas Ras constituyen un eslabón crucial en la cascada intracelular de señalización activada por receptores proteína quinasa34 Las proteínas Ras pertenecen a la gran superfam ilia Ras de GTPasas m onom éricas, que tam bién contiene otras dos superfamilias: (1) las proteínas Rho y Rae, implicadas en la transmisión de señales desde receptores de la superficie celular hasta el citoesqueleto de actina (discutidas en el Capítulo 16), y (2) la fam ilia Rab, implicada en la regulación del tráfico del transporte intracelular de vesícu las (discutidas en el Capítulo 13). Como casi todas estas proteínas GTPasa monoméricas, las proteínas Ras contienen un grupo fenil, unido covalentemente, que participa en el anclaje de la proteína a la membrana, en este caso a la cara citoplasmática de la m em brana plasmática donde actúa esta proteína. Las proteínas Ras participan en la transmisión de señales desde receptores tirosina quinasa hasta el núcleo, estimulando la proliferación o la diferenciación celular. Si se inhibe la función de Ras mediante la microinyección de anticuer pos anti-Ras o mediante formas mutantes dominantes negativas de Ras, deja de producirse la respuesta de proliferación o de diferenciación normalmente indu cida por receptores proteína quinasa activados; contrariamente, si un mutante hiperactivo de proteína Ras es introducido en una célula, el efecto sobre la proli feración o la diferenciación es habitualmente el mismo que el inducido por la unión de un ligando a los receptores de la superficie celular. De hecho, las proteí nas Ras fueron descubiertas como los productos hiperactivos de genes ras mu tantes, que producen cáncer al romper los controles normales sobre la prolifera ción y la diferenciación; alrededor del 30% de los cánceres humanos presentan estas mutaciones en un gen ras. Como otras GTPasas monoméricas y las proteínas G triméricas, las proteí nas Ras actúan com o interruptores, alternando entre dos estados conformacionales diferentes -activo cuando unen GTP (véase Figura 15-18) e inactivo cuan do unen GDP. Ras hidroliza GTP al menos 100 veces más lentamente que la subunidad a de la proteína G trimérica estimuladora Gs de la que hemos tratado anteriormente, y debido a que en el citosol las concentraciones de GTP son unas 10 veces más altas que las de GDP, en ausencia de otros estímulos, mientras el GTP se halla unido a ella Ras permanece constantem ente activa. Sin embargo, en la célula existen dos clases de proteínas señal que regulan la actividad de Ras influyendo en la transición entre el estado activo y el inactivo. Las proteínas ac-
816
Capítulo 15: Transmisión de señales entre células
INACTIVA
ACTIVA
tivadoras de GTPasa (GAP, de GTPase-Activating Proteins) incrementan la velo cidad de hidrólisis del GTP unido a Ras, de forma que la inactivan. Estos regula dores negativos están compensados por las proteínas liberadoras de nucleóti dos de guanina (GNRP, de Guanine Nucleotide Releasing Proteins), las cuales estimulan el intercambio de los nucleótidos unidos estimulando la pérdida de GDP y la posterior captación de GTP del citosol; así, tienden a activar Ras (Figura 15-50). En principio, pues, los receptores tirosina quinasa pueden activar Ras ac tivando una GNRP o inhibiendo una GAP. Los receptores tirosina quinasa acti vados se unen a GAP directamente, como hemos dicho antes, y se unen a GNRP sólo indirectamente, como discutiremos después. Sin embargo, es la unión indi recta a GNRP la que habitualmente es la responsable de conducir a la proteína Ras a su estado activo, unido a GTP. Las proteínas Ras y las proteínas que regulan la actividad de Ras han sido muy conservadas durante la evolución; análisis genéticos realizados en Drosop hila y en C. elegans han proporcionado los primeros indicios sobre cómo los re ceptores tirosina quinasa activan Ras. Han sido particularmente informativos los estudios sobre el desarrollo de la célula fotorreceptora del ojo de Drosophila.
Figura 15-50 Regulación de la actividad Ras. Las proteínas activadoras de GTPasa (GAP) inactivan Ras al estimularlas a que hidrolizen el GTP que llevan unido. Las proteínas liberadoras de nucleótidos de guanina (GNRP) activan Ras al estimularlas a que liberen el GDP que llevan unido; dado que la concentración de GTP en el citosol es 10 veces mayor que la de GDP, Ras tendrá tendencia a unir GTP cuando se haya liberado de su GDP. En células de mamífero se han identificado hasta ahora dos GAP reguladoras de Ras (Ras GAP) - p l 2 ( f ,AP y n eu ro fib ro m in a (denominada así porque está codificada por el gen que se halla mutado en la mayoría de la enfermedad humana com ún llamada neurofibromatosis, asociada con tumores de los nervios). A pesar de que las dos Ras GAP se expresan de forma ubicua, parece que en los diferentes tipos celulares una de las dos domina al m antener la mayoría de las proteínas Ras (-95% ) en su estado inactivo, unido a GDP.
Una proteína SH adaptadora acopla los receptores tirosina quinasa con Ras: evidencias que provienen del desarrollo del ojo de D roso p h ila 35 El ojo compuesto de Drosophila está formado por unas 800 unidades idénti cas denominadas omatidios, cada una de las cuales está formada por 8 células fotorreceptoras (R1-R8) y 12 células accesorias (Figura 15-51). El ojo se desarrolla a partir de una lámina epitelial simple, y las células que forman cada omatidio son reclutadas desde toda la lámina a través de una secuencia fija mediante una serie de interacciones célula-célula. Empezando con el desarrollo de R8, cada célula diferenciada induce a su célula vecina inmediata, hasta este momento no comprometida, a adoptar un destino y a ensamblarse de una manera especial en el desarrollo del omatidio (Figura 15-52). El desarrollo del fotorreceptor R7, necesario para la detección de la luz ul travioleta, ha sido estudiado más intensamente, empezando en 1976 con la des cripción de una m osca mutante denominada sevenless (sev, de “sin el siete”) en la que el único defecto observado es que R7 no se desarrolla. Estos mutantes son fáciles de seleccionar sobre la base de su ceguera a la luz ultravioleta. El gen sev fue aislado y se observó que codifica un receptor tirosina quinasa que se expresa en las células precursoras de R7. Posteriores análisis genéticos de mutantes en los que se halla bloqueado el desarrollo de R7 pero en los que la proteína R7 no está afectada, llevaron a la identificación del gen bride-of-sevenless (boss, o “compañero de sevenless”), que codifica el ligando de la proteína receptora Sev. Señalización vía receptores de superfìcie celular asociados a enzimas
i________ i 100 |jm
Figura 15-51 Electronmicrografía de barrido de un ojo compuesto de Drosophila. El ojo está compuesto de unas 800 unidades idénticas (omatidios), cada una de las cuales tiene una lente independiente que enfoca la luz sobre las ocho células fotorreceptoras de su base. (Por cortesía de Em st Hafen.)
817
Boss es una proteína que atraviesa 7 veces la membrana, que exclusivamente se expresa en la superficie de la célula adyacente R8, y que cuando se une a una Sev la activa induciendo a la célula precursora de R7 a diferenciarse en un fotorreceptor R7. La proteína Sev tam bién se expresa en algunas otras células precurso ras del omatidio en desarrollo, pero ninguna de estas células entran en contacto con R8, por lo que la proteína Sev no es activada y las células no se diferencian a fotorreceptores R7. A pesar de que puede sospecharse que los organismos pluri celulares hacen un uso muy extendido de ligandos señal unidos a la superficie celular com o Boss, tales moléculas han sido muy difíciles de identificar y carac terizar mediante técnicas bioquímicas típicas. La identificación de Boss ilustra el poder de las aproximaciones genéticas. Ha resultado más difícil identificar los componentes del proceso intracelular de señalización activado por Sev en la célula precursora de R7 que el receptor o su ligando, debido a que estos com ponentes son utilizados por células de una gran cantidad de órganos en desarrollo además del ojo, y las mutaciones que inactivan el proceso son letales. Sin embargo, algunas de estas mutaciones son letales únicam ente cuando están afectadas ambas copias del gen, por lo que pueden m antenerse en animales heterozigotos que presentan una copia del gen mutante y la otra normal. Aislando estos mutantes así como utilizando otras es trategias genéticas, se han podido identificar algunos genes que codifican pro teínas de señalización intracelular. Uno de ellos codifica la proteína Ras. Mien tras que las moscas en las que ambas copias del gen ras están inactivadas por mutación mueren, las que presentan únicam ente una copia inactivada sobrevi ven aunque carecen de R7. Contrariamente, si uno de los genes ras se hace hiperactivo mediante m utación, R7 se desarrolla incluso en mutantes en los que tanto sev com o boss son inactivos. Así pues, la activación de Ras parece ser nece saria y suficiente para inducir la diferenciación de R7. Un segundo gen, el llama do hijo-de-sevenless (sos, de “son-of-sevenless”) codifica una proteína liberadora de nucleótidos de guanina (GNRP), que es necesaria para que el receptor tirosina quinasa Sev active a Ras. Un tercer gen codifica una proteína semejante a Sem -5 denominada Drk (de downstream o f receptor kinases, “más adelante de los receptores quinasa”) que acopla el receptor Sev a la proteína Sos; el dominio SH2 de Drk se une a Sev, activándola, mientras que parece que los dos dominios SH3 se unen a Sos. Un cuarto gen codifica una proteína activadora de GTPasa (GAP). Si este gen es inactivado, R7 se desarrolla incluso aunque sev haya sido inactivado, probablem ente porque Ras es hiperactivo cuando GAP no lo inhibe (Figura 15-53). En este sistema de señalización, sin embargo, y en muchos otros sistemas estudiados, la activación de Ras por receptores tirosina quinasa depen de de la activación de GNRP más que de la inactivación de GAP. Una vez activada, Ras transmite la señal activando una cascada de fosforila ción serina/treonina, que está altam ente conservada en las células eucariotas, desde las levaduras hasta los humanos, Un com ponente crucial en esta cascada es un nuevo tipo de proteína quinasa denominado MAP-quinasa, que conside raremos a continuación.
Ras activa una cascada de fosforilaciones serina/treonina que activa la MAP-quinasa36 Las fosforilaciones en tirosina y la activación de Ras, estimuladas por receptores quinasa de la superficie citoplasm ática de la membrana plasmática, tienen una vida muy corta: las fosforilaciones son revertidas rápidamente por proteína tiro sina fosfatasas específicas (discutidas más adelante), y Ras cuando está activa se inactiva a sí misma hidrolizando el GTP que tiene unido, a GDP. Para poder esti-
818
Capítulo 15: Transmisión de señales entre células
Figura 15-52 Ensamblaje de las células de un fotorreceptor en un omatidio en desarrollo de D ro so p h ila . Dibujo esquemático del reclutamiento secuencial de fotorreceptores, empezando con R8 y acabando con R7, que es la última célula fotorreceptora que se desarrolla.
célula R8 CITOSOL mem branas plasmaticas CITOSOL célula R7
inhibición de GAP
SIGUE EL PROCESO DE SEÑALIZACIÓN
mular las células para proliferar o para diferenciarse, estos cortos eventos señal han de convertirse en eventos más duraderos que puedan mantener la señal y transmitirla hacia el núcleo. El sistema de transmisión está formado por múlti ples cascadas de fosforilación en serinas/treoninas, que interactúan entre sí, las cuales son procesos más duraderos que las fosforilaciones en tirosinas. En estas cascadas participan muchas serina/treonina quinasas, pero una familia que contiene al m enos cinco miembros parece desempeñar un papel especialmente importante -la s p ro te ín a q u in a s a s a c tiv a d a s p o r m itó g e n o s (MAP, de Mitogen Activated Proteins) (también denominadas quinasas reguladas por señales extracelulares, [ERK, de Extracellular Signal Regulated Kinases]). Estas quinasas son activadas por una gran variedad de señales inductoras de proliferación y dife renciación celular, algunas de las cuales activan receptores tirosina quinasa mientras que otras activan receptores asociados con proteínas G. Una característica extraordinaria de las MAP-quinasas es que para que se produzca su activación completa hace falta que se fosforilen sobre una treonina y sobre una tirosina que en la proteína se hallan separadas por un solo am ino ácido. La proteína quinasa que cataliza ambas fosforilaciones se denomina MAP-quinasa-quinasa. Los requerimientos de fosforilación sobre tirosina y treo nina aseguran que MAP-quinasa se mantenga inactiva mientras no se active es pecíficamente la MAP-quinasa-quinasa, cuyos únicos substratos conocidos son las MAP-quinasas. A su vez, la MAP-quinasa-quinasa se activa por fosforilación en serinas/treoninas catalizada por una MAP-quinasa-quinasa-quinasa, que al parecer se activa por unión a Ras activa (Figura 15-54). Cuando MAP-quinasa se halla activada, transmite señales fosforilando va rias proteínas celulares, incluyendo otras proteína quinasas y proteínas regula doras de genes. A menudo, en cuestión de minutos después de que la célula haya sido estimulada por un factor de crecimiento, se activa la transcripción de un conjunto de genes tempranos inmediatos. Un complejo proteico que desem peña un importante papel en esta activación de la transcripción es el complejo discutido anteriormente formado por el factor de respuesta sérica (SRF, de Se rum Response Factor) y Elk-1. El complejo se halla unido constitutivamente a una secuencia determinada de DNA (el elemento de respuesta sérica) que se ha lla en la región reguladora de un gen denominado fos y de otros genes (véase Fi gura 15-32). Además, las MAP-quinasas pueden fosforilar la proteína Jun, que se com bina con la proteína recién formada Fos formando una proteína activa regu ladora de genes denominada AP-1. Entonces, esta proteína AP-1 activa otros ge-
Señalización vía receptores de superfìcie celular asociados a enzimas
Figura 15-53 Procesos de señalización celular tem pranos en el desarrollo de R7. La activación del receptor tirosina quinasa Sev de la superficie de la célula precursora de R7 por la proteína Boss de la superficie de R8 está acoplada con la activación de la proteína liberadora de nucleótidos de guanina Sos, a través de la pequeña proteína adaptadora SH, Drk. Drk reconoce una determinada tirosina autofosforilada de la proteína Sev mediante un dominio SH2 e interactúa con Sos mediante dos dominios SH3. Sos estimula la proteína inactiva Ras para eliminar el GDP que tiene unido y así a captar GTP, lo cual activa a Ras para transmitir la señal siguiendo el curso del proceso de señalización. (A pesar de que no se muestra aquí, Ras se halla unida a la cara citosólica de la membrana plasmática.) Se cree que Sev activa tam bién inhibe GAP, la cual podría, caso de estar activa, contrarrestar la función de Sos estimulando a Ras para hidrolizar el GTP que llevara unido, inactivándose. Parece que el acoplamiento del receptor tirosina quinasa con Ras ocurre a través del mismo m ecanism o que en las células de mamífero.
819
m em brana plasmática
nes, aunque no se conoce con total exactitud cuál es el papel que desempeña en la proliferación celular. La quinasa C tam bién puede fosforilar Jun y, como se ilustra en la Figura 1554, puede activar la MAP-quinasa-quinasa-quinasa, de forma que tanto Jun como MAP-quinasa-quinasa-quinasa constituyen ejemplos de puntos de inte gración donde convergen varios procesos de señalización.
La actividad de los receptores asociados a tirosina quinasa depende de tirosina quinasas que no son receptores37 Muchas de las proteínas receptoras de la superficie celular que han sido aisladas y caracterizadas no encajan en ninguna de las familias principales de receptores que hemos descrito hasta aquí: no están asociadas a canales iónicos ni a proteí nas G, y carecen de dominio catalítico evidente. Este gran y heterogéneo surtido de receptores incluye receptores para la mayoría de los mediadores locales (de nominados citoquinas ) que regulan la proliferación y diferenciación en el siste ma hematopoyético, así como receptores para algunas hormonas (por ejemplo, horm ona de crecimiento y prolactina) y los receptores específicos de antígenos de los linfocitos T y B. Muchos de los receptores de esta categoría trabajan a tra vés de tirosina quinasas asociadas que fosforilan varias proteínas diana cuando el receptor se une a su ligando. La mayoría de las quinasas asociadas con estos receptores asociados a tirosina quinasa son miembros de la bien caracterizada fam ilia Src de proteína tirosina quinasas no receptoras mencionadas anterior mente, o de la recientem ente descrita fam ilia Janus también de proteína tirosi na quinasas no receptoras. Se cree que estos receptores actúan casi de la misma forma que los receptores tirosina quinasa, excepto en que su dominio quinasa está codificado por otro gen y se halla asociado no covalentemente con la cade na polipeptídica del receptor. Como los receptores tirosina quinasa, parece que a menudo en su activación participa una dimerización del receptor inducida por el ligando (Figura 15-55).
820
Capítulo 15 : Transmisión de señales entre células
Figura 15-54 Cascada de fosforilaciones serina/treonina activada por Ras y quinasa C. En el proceso activado por receptores tirosina quinasa a través de Ras, a menudo MAP-quinasa-quinasaquinasa es una serina treonina quinasa denominada Raf, que al parecer se activa por la unión de una Ras activada. En el proceso activado por receptores asociados a proteínas G a través de quinasa C, MAP-quinasaquinasa-quinasa puede ser tanto Raf como otra proteína serina/treonina quinasa. En levaduras y en todos los animales en que se ha estudiado, se ha encontrado una cascada de fosforilaciones serina/treonina sem ejante a ésta, en la que participan proteínas relacionadas estructural y funcionalmente con éstas. Estas cascadas de fosforilación integran y amplifican señales que provienen de diferentes estímulos extracelulares. Los receptores tirosina quinasa también pueden activar un proceso de señalización más directo hacia el núcleo mediante la fosforilación directa de proteínas reguladoras de genes, que así se activan, que contienen dominios SH2.
En mamíferos existen al menos ocho miembros de la fa m ilia Sre de protei na tirosina quinasas no receptoras: Src, Yes, Fgr, Fyn, Lek, Lyn, H cky Blk. Contie nen dominios SH2 y SH3 y todos ellos se hallan localizados en la cara citoplas màtica de la membrana plasmática, unidos a ella en parte a través de su interacción con proteínas receptoras transmembrana y en parte por su unión covalente a cadenas lipídicas. Varios miembros de la familia se hallan asociados con diferentes receptores y fosforilan de forma solapada distintos juegos de pro teínas diana. Por ejemplo, Lyn, Fyn y Lek se hallan asociadas a diferentes juegos de receptores en los linfocitos. Todos los miembros de la familia Src tirosina quinasa se activan cuando un ligando extracelular se une a una proteína receptora adecuada. Los miembros de esta familia Src quinasa pueden asociarse tanto a recepto res que no tienen actividad tirosina quinasa intrínseca como a receptores que sí la tienen. En varias células no-linfocíticas, por ejemplo, Fyn se une vía su domi nio SH2 a receptores PDGF activados, los cuales fosforilan a Fyn en residuos ti rosina, activando así su actividad quinasa. Por ello no resulta sorprendente que los receptores tirosina quinasa y los receptores de la familia Src de receptores asociados a actividad tirosina quinasa, en algunos casos activen los mismos pro cesos de señalización. De mucha menos información disponemos sobre la fa m ilia Ja n u s de protei na tirosina quinasas no receptoras, que incluye JAK1, JAK2 y Tyk2. Participan en la señalización a partir de varios receptores asociados a tirosina quinasa, inclu yendo los de hormona de crecimiento, prolactina y varias citoquinas que actúan sobre células hematopoyéticas (se discuten en el Capítulo 22). En muchos receptores asociados a tirosina quinasa, la unión del ligando ge nera el ensam blaje de dos o más subunidades receptoras transmembrana dife rentes. Un ejemplo de ello, bien estudiado, es el receptor para interleucina-2 (IL-2), un mediador local segregado por los linfocitos T que estimula la prolife ración de los linfocitos (se discute en el Capítulo 23). El re c e p to r IL -2 está com puesto de tres cadenas polipeptídicas (a, (3 y y), que al parecer se ensamblan des pués de que el ligando se una a un complejo receptor funcional, como se ilustra en la Figura 15-56.
Algunos receptores son proteína tirosina fosfatasas38 Como hemos mencionado previamente, los residuos de tirosina que son fosforilados por proteína tirosina quinasas son rápidamente desfosforilados por p ro te i n a tiro s in a fo sfa ta sa s. Desde el punto de vista estructural, estas enzimas no es tán relacionadas con las proteína serina/treonina fosfatasas de las que hemos tratado antes, y únicamente eliminan un grupo fosfato de determinados grupos fosfotirosina de determinados tipos de proteínas. Estas fosfatasas se encuentran tanto en formas solubles como unidas a membrana, y de ellas existen muchas más variedades que de serina/treonina fosfatasas. Su elevada especificidad ase gura que las fosforilaciones en tirosina tengan una vida media muy corta y que el nivel de fosforilación en tirosinas que presentan las células en reposo sea muy
quinasa Lek activada
Señalización vía receptores de superficie celular asociados a enzimas
Figura 15-55 Estructura tridimensional de la horm ona de crecim iento hum ana unida a su receptor. La hormona (en rojo) se ha unido, entrecruzándolos, a dos receptores idénticos (uno se muestra en verde y el otro en azul), formando un receptor homodímero. (No podía preverse en absoluto que un ligando monomérico com o la hormona de crecim iento pudiera unirse, entrecruzándolos, a dos receptores, ya que ello supone que los dos receptores idénticos han de reconocer zonas diferentes de la hormona.) Se cree que la dimerización inducida por la unión de un ligando une los dominios citoplasmáticos de las dos proteínas receptoras transm embrana de un solo paso. Ello, a su vez, activa una tirosina quinasa no receptora (no se muestra). Las estructuras mostradas aquí han sido determinadas por estudios de cristalografía de rayos X de complejos formados entre la hormona y los dominios extracelulares del receptor producidos por la tecnología del DNA recom binante. (De A.M. deVos, M. Ultrech y A.A. Kossiakoff, Science 255:306-312, 1992. © the AAAS.)
Figura 15-56 Ensamblaje inducido por ligando en un receptor IL-2. Parece que la unión de baja afinidad de IL-2 a la cadena a desencadena el ensamblaje del receptor heterotrimérico, de alta afinidad, el cual entonces se une, activándola, a la tirosina quinasa Lek, interaccionando con ella a través de la cola citoplasmàtica de la subunidad (3.
821
bajo. Las proteína tirosina fosfatasas no actúan simplemente revertiendo conti nuam ente el efecto de las proteína tirosina quinasas, sino que pueden estar re guladas y desempeñar funciones específicas en la señalización celular, así como en el control del ciclo celular (se discute en el Capítulo 17). Un importante ejemplo de proteína tirosina fosfatasa regulada es la proteína CD45, que se encuentra sobre la superficie de los linfocitos y juega un papel esencial en la activación tanto de los linfocitos B como de los linfocitos T por antígenos extraños. CD45 es una glucoproteína que atraviesa la mem brana una sola vez, cuyo dominio tirosina fosfatasa se halla expuesto sobre la cara citoplasm ática de la m em brana plasmática. Cuando se activa por la reacción de un anti cuerpo extracelular (su ligando normal no es conocido), su dominio catalítico se activa eliminando grupos fosfato de residuos de tirosina de determinadas pro teínas diana de la célula. Se cree que una de estas proteínas es la tirosina quina sa Lck m encionada anteriormente. Cuando es desfosforilada por CD45, Lck se activa fosforilando otras proteínas de la célula.
La utilización de oncogenes que provocan cáncer ha permitido identificar muchos com ponentes del proceso de señalización de los receptores tirosina quinasa39 Normalmente, las células de los animales superiores se dividen únicamente cuando son estimuladas por factores de crecimiento, producidos por otras célu las y que habitualmente actúan uniéndose a receptores tirosina quinasa. Las cé lulas cancerosas proliferan excesivamente principalmente porque, como resul tado de mutaciones acumuladas, son capaces de dividirse sin ser estimuladas por otras células, por lo que no se hedían sujetas al control “social” normal de la proliferación celular (se discute en el Capítulo 17). No es sorprendente que m u chas de estas mutaciones afecten a genes que codifican proteínas que participan en los procesos de señalización utilizados por los receptores tirosina quinasa. De hecho, muchos de los genes que codifican las proteínas señal discutidas en esta sección, incluyendo Ras, Src (y los otros miembros de la familia Src), Raf, Fos y Jun, fueron identificadas por primera vez como formas mutantes en células can cerosas o en virus tumorales productores de cáncer. Como se discute en el Capí tulo 24, los genes mutantes se denominaron oncogenes antes de que se com prendiera su origen a partir de genes normales; por ello, a los genes normales habitualm ente se les denomina proto-oncogenes. En principio podría esperarse que cualquier mutación que provocara la pro ducción de una proteína anormalmente activa de cualquier paso del proceso de señalización que va desde el factor de crecimiento hasta el núcleo pudiera pro ducir cáncer al estimular a la célula a proliferar en ausencia de las señales extracelulares apropiadas. Las evidencias de que disponemos corroboran esta idea. El oncogén sis, por ejemplo, codifica un forma funcionalmente activa de PDGF que se expresa de forma inadecuada; las células que presentan el oncogén sis y tam bién expresan receptores para PDGF, continuamente se autoestimulan a prolife rar. El oncogén erbB codifica una forma truncada del receptor de EGF que tiene un dominio intracelular tirosina quinasa que se halla activo continuamente; las células que expresan este oncogén se comportan como si estuvieran estimula das continuam ente a proliferar por un factor de crecimiento. Las células se com portan de una forma similar a como lo harían si hubieran estado infectadas por un virus que transportara el oncogén v-src, que codifica una forma constitutiva mente activa de la pro teína tirosina quinasa Src, o como si expresara un onco gén ras, que codifica una forma anormal de una proteína Ras que no puede inactivarse a sí misma ya que ha perdido la capacidad de hidrolizar GTP. De for m a similar, las células proliferan de forma anormal si expresan un oncogén que codifica una forma constitutivamente activa de una proteína reguladora de un gen activado por factores de crecimiento, como Jun o Fos. Los estudios sobre oncogenes de este tipo no sólo han iluminado los mecanismos moleculares que están en la base del cáncer, sino que también han descubierto muchas proteínas
822
Capítulo 15: Transmisión de señales entre células
desconocidas de los procesos de señalización activados por factores de creci miento. Algunas hormonas que estimulan sus células diana a proliferar se unen a re ceptores asociados a proteínas G en lugar de unirse a receptores tirosina quinasa. Por ejemplo, el factor liberador de hormona de crecimiento (GHF, de Growth Hormone Releasing Factor) estimula las células secretoras de hormona de creci miento de la glándula hipófisis a proliferar; GHF se une a los receptores de GHF que activan la adenil ciclasa a través de una proteína G estimuladora Gs. El incre mento resultante de los niveles de AMP cíclico induce a las células de la hipófisis a dividirse. Como era de esperar, las mutaciones del gen a s que inactivan la acti vidad GTPasa de la subunidad a de Gs (y por lo tanto hacen que la proteína esté activa de forma constitutiva) producen un oncogén que se halla frecuentemente en los tumores humanos de hipófisis.
Las proteínas de la superfamilia TGF-p activan receptores que son proteína serina/treonina quinasas40 Los factores-p transformantes del crecimiento (TGF-p, de Transforming Growth Factors-P) constituyen una familia de mediadores locales que regulan la prolife ración y otras funciones de la mayoría de tipos celulares de los vertebrados. Los cinco miembros de la familia (TGF-pi al (35) son proteínas de estructuras y fun ciones similares. Sus efectos sobre las células son variados. Dependiendo del tipo celular, pueden suprimir la proliferación, estimular la síntesis de matriz extracelular, estimular la formación del hueso y atraer células por quimiotaxis. Los TGF-P son sintetizados como largos precursores y secretados como complejos inactivos que más tarde son activados por procesamiento proteolítico. Algunas otras proteínas señal extracelulares están estructuralmente relacio nadas con los TGF-p. Entre ellas, encontramos las activinas, que juegan un papel importante en la inducción del mesodermo en el desarrollo de los vertebrados (se discute en el Capítulo 21), y las proteínas de morfogénesis del hueso, que esti mulan la formación del hueso. En conjunto, estas proteínas constituyen la su perfamilia TGF- p. Recientem ente se han clonado y secuenciado los cDNA que codifican algu nos receptores de miembros de esta superfamilia. Estos receptores son proteí nas que atraviesan una vez la mem brana y con dominios serina/treonina quinasa sobre la cara citosólica de la mem brana plasmática. Se trata de los primeros receptores serina/treonina quinasa que se han identificado, y todavía conoce mos muy poca cosa acerca de los procesos de señalización que ellos activan. En la Figura 15-57 se resumen algunas de las proteína quinasas específicas de tirosina o específicas de serina/treonina de que hemos tratado en este capí tulo.
El receptor transm em brana Notch media la inhibición lateral mediante un m ecanism o desconocido41 La clase de receptores de superficie celular asociados a enzimas es grande y va riada. Incluye, además de los que ya hemos considerado, las integrinas, que se unen a com ponentes de la matriz extracelular. Como se discute en el Capítulo 19, estas proteínas transmembrana no sólo unen células a la matriz a través de contactos focales sino que tam bién generan señales intracelulares en estos luga res de unión, probablemente desencadenando el ensamblaje de un complejo se ñal intracelular (véase Figura 17-42). El m ecanismo de señalización utilizado por algunas proteínas receptoras es todavía tan desconocido que resulta difícil clasificar tales receptores. Un ejem plo importante de ello lo constituye la proteína de Drosophila Notch. Como se explica en el Capítulo 21 , esta proteína transmembrana que la atraviesa una sola vez juega un papel crucial en las interacciones célula-célula que controlan el de licado patrón de diversificación celular durante el desarrollo de la mosca. Típi-
Señalización vía receptores de superficie celular asociados a enzimas
82 3
nh2
nh2
nh2 NH2
100 am inoácidos
S? <5
COA HOOC
MEMBRANA PLASMÁTICA
Jb (fi ■Sc> s.$• È ,?
.è
a
(&
O'•?
COOH
CITOSOL
c <>
fo -S
,c /&
JZ>
• «V Ov?
nh2
NH2
NH2
HOOC COOH COOH receptor de EGF
COOH receptor de PDGF
receptor de insulina
COOH COOH
COOH
COOH
Src
PROTEINA QUINASAS ESPECÍFICAS DE TIROSINA
PROTEINA QUINASAS ESPECÍFICAS DE SERINA/TREONINA
Resumen Se conocen cinco clases d e receptores asociados a enzimas: (1) receptores guanilato ciclasa transm em brana, q u e gen eran GMP cíclico directam ente; (2) receptores tiro sina fosfatasa, q u e elim inan fosfatos d e cadenas laterales d e fosfotirosina d e deter m inadas proteínas; (3) receptores serina/treonina quinasa transm em brana, que a ña den un gru po fosfato a cadenas laterales d e serina o d e treonina de proteínas
Capítulo 15 : Transmisión de señales entre células
COOH
COOH
cam ente, una célula que carece de Notch no responde a la inhibición lateral -s e ñales inhibidoras que provienen de sus vecinas inmediatas y que normalmente harían que se diferenciara siguiendo un camino diferente a ellas. En un embrión normal de mosca, por ejemplo, un precursor de célula nerviosa inhibe a sus ve cinas para impedir que tam bién se transformen en células nerviosas, por lo que dichas células se transforman en células epiteliales; en mutantes Notch esta in hibición no se produce y todas las células se transforman en células nerviosas. Como en el caso de la proteína Sev de la que hemos tratado anteriormente, Notch se activa al unirse no a moléculas señal solubles sino a proteínas que se presentan sobre la superficie de las células adyacentes. Aunque se conoce la se cuencia de Notch y se han identificado algunas de las proteínas del proceso de se ñalización, mediante análisis genéticos, todavía no está claro de qué forma Notch transmite la señal al interior de la célula. Otras proteínas semejantes a Notch tam bién desempeñan papeles importantes en el desarrollo de los vertebrados, pero en estos casos, los mecanismos que participan en los procesos de señalización también resultan un misterio.
824
nh2
Figura 15-57 Algunas de las proteína quinasas discutidas en este capítulo.
Se muestra el tamaño y la localización de sus dominios catalíticos (en verde oscuro). En cada caso el dominio catalítico es de unos 250 residuos de aminoácidos de longitud. Todos estos dominios tienen una secuencia similar, lo cual sugiere que todos ellos han evolucionado a partir de una quinasa primordial común. Nótese que todas las tirosina quinasas mostradas se hallan unidas a la membrana plasmática, mientras que la mayoría de las serina/treonina quinasas se hallan en el citosol.
diana; (4) receptores tirosina quinasa, y (5) receptores asociados a tirosina quinasas. Los dos últimos tipos de receptores son, con diferencia, los más num erosos y al p arecer actúan d e una m anera sim ilar: habitualm ente la unión del ligando induce la dim erización del receptor, lo cual activa la actividad tirosina quinasa del propio receptor o d e la enzim a tirosina quinasa asociada al receptor. Una vez activada, habitualm ente la actividad tirosina quinasa se autofosforila a sí m isma sobre m úl tiples residuos tirosina, q u e entonces actúan como lugares d e unión p ara un red u cido núm ero d e proteínas señal intracelulares las cuales, a través de sus dom inios SH2, se u nen específicam ente a determ inados residuos fosfotirosina. De esta fo rm a se activa un complejo señal multiproteína, a partir del cual la señal se transmite al interior celular. Las proteínas Ras actúan como uniones cruciales del sistema intracelular de transmisión de señales. Son GTPasas m onom éricas q u e actúan como interruptores m oleculares; son activadas p o r proteínas q u e liberan nucleótidos d e gu an in a e inactivadas p o r GAP. Cuando las proteínas Ras son activadas, inician una cascada d e fosforilaciones serinaJtreonina qu e convergen sobre MAP-quinasas, las cuales colaboran en la transmisión d e la señal al núcleo. Muchos d e los genes qu e codifi can proteínas d e las cascadas intracelulares d e señalización qu e son activados p or receptores tirosina quinasas fu ero n identificados como oncogenes en células cance rosas o como virus tumorales, ya qu e su activación inadecuada hace qu e la célula prolifere excesivamente.
Adaptación de las células diana Normalmente, cuando las células y los organismos responden a algún estímulo, pueden detectar el mismo porcentaje de variación de la señal en una gama muy amplia de intensidades del estímulo. A nivel celular, esto requiere que las células diana sufran un proceso de adaptación o desensibilización, mediante el cual su respuesta va disminuyendo cuando se halla expuesta a un estímulo durante un período prolongado de tiempo. De esta forma, la célula ajusta de forma reversible su sensibilidad al nivel del estímulo. En el caso de la señalización química, la de sensibilización permite a la célula responder a cambios de la concentración de la molécula ligando (en lugar de responder a concentraciones absolutas del ligan do) en un amplio margen de concentraciones absolutas. El principio general es sencillo: la adaptación se consigue a través de una retroalimentación negativa que actúa con un cierto retraso. La retroalimentación negativa significa que una respuesta fuerte modifica la maquinaria que produce dicha respuesta, de forma que se inhibe a sí misma; pero gracias al retraso, un cambio repentino del nivel de estímulo es capaz de producir una respuesta intensa durante un período de tiempo corto, antes de que la retroalimentación negativa tenga tiempo de actuar. La adaptación a señales químicas puede producirse de diferentes formas. En algunos casos, se produce por la disminución progresiva del número de pro teínas receptoras específicas de superficie, la cual normalmente se produce en un intervalo de horas. En otros casos se produce por una rápida inactivación de estos receptores, lo cual se produce en cuestión de minutos. En otros casos es debida a cambios en las proteínas que participan en la transducción de la señal tras la activación de los receptores, los cuales se producen habitualmente a unas escalas de tiempo intermedias.
La adaptación lenta depende de la regulación por disminución del número de receptores42 A menudo, después de que una hormona o un factor de crecimiento se haya unido a su receptor de la superficie de las células diana, son ingeridos por la cé lula por endocitosis mediada por receptor y liberados a los endosomas (se discu te en el Capítulo 13). La mayoría de los receptores descargan su ligando en el am biente ácido de los endosomas y se reciclan de nuevo hacia la membrana,
Adaptación de las células diana
825
adrenalina
receptor desensibilizado
UN INCREMENTO DE LA CONCENTRACIÓN DE AMP CÌCLICO ACTIVA LA QUI NASA A PARA QUE FOSFORILE EL RECEPTOR EN UN SOLO LUGAR quinasa A activa
LA QUINASA (3 ADRENÉRGICA FOSFORILA EL RECEPTOR ACTIVADO EN MUCHOS LUGARES
receptor desensibilizado
LA p ARRESTINA SE UNE AL RECEPTOR FOSFORILADO
quinasa (3 adrenérgica activa
P arrestina
mientras que el ligando es transferido a los lisosomas y es degradado. Este pro ceso, por lo tanto, constituye el principal mecanismo de degradación de muchas proteínas señal. A pesar de que muchas moléculas de receptor son recuperadas del endosoma y recicladas, una cierta proporción de ellas no se liberan de su li gando y acaban en los lisosomas, donde son degradadas con el ligando. Así, cuando una célula es expuesta continuam ente a elevadas concentraciones de un ligando, el número de receptores de su superficie va disminuyendo progresiva mente, con una disminución concom itante de la sensibilidad de la célula diana al ligando. Mediante este tipo de mecanismos, conocido com o regulación por disminución del núm ero de receptores (receptor down-regulation), las células pueden, lentam ente (durante horas) ajustar su sensibilidad a la concentración de un ligando estimulador.
A menudo la adaptación rápida se produce por fosforilación de los receptores43 Frecuentem ente en la adaptación de la célula diana participa, además de la lenta regulación por disminución del número de receptores, una rápida fosforilación del receptor inducida por el ligando. El ejemplo m ejor conocido es el receptor P2 adrenérgico, que activa la adenil ciclasa a través de las proteína G estimulado ra Gs. Cuando las células son expuestas a elevadas concentraciones de adrenali na, pueden desensibilizarse en cuestión de minutos, a través de dos procesos que dependen de la fosforilación del receptor P2 adrenérgico. En uno de ellos, el increm ento de los niveles de AMP cíclico causado por la unión de la adrenalina activa la quinasa A, la cual fosforila el receptor P2 sobre un residuo de serina, in terfiriendo así con la habilidad del receptor de activar Gs. En el otro proceso, el receptor p2 una vez activado se convierte en substrato de otra proteína quinasa más específica (denominada quinasa P adrenérgica) que fosforila el extremo carboxilo de la cola citoplasm ática del receptor activado, sobre múltiples residuos de serina y treonina; esta cola fosforilada se une a una proteína inhibidora deno minada p arrestina (del inglés “arrest”: parar), la cual bloquea la capacidad del receptor para activar Gs (Figura 15-58). En las células fotorreceptoras de los ver tebrados, la rodopsina, que com o hemos visto está estructuralmente relaciona da con los receptores p adrenérgicos, se inactiva mediante un mecanismo alta mente relacionado al descrito basado en la acción de la arrestina, después de haber sido activado por la acción de un fotón. Estas células tienen una capaci-
826
Capítulo 15 : Transmisión de señales entre células
Figura 15-58 Dos m ecanism os de la rápida desensibilizacidn del receptor P2 adrenérgico. Ambos dependen de la fosforilación del receptor. Tanto la fosforilación en (A) com o la unión de arrestina en (B) inhiben la capacidad del receptor para interactuar con Gs, disminuyendo así la respuesta a la adrenalina.
dad de adaptación excepcionalmente rápida y sofisticada, en la que participan, además del m ecanism o basado en la arrestina, muchos otros; uno de ellos fue discutido anteriormente, en la página 806. El m ecanism o de desensibilización del receptor P2 adrenérgico dependiente de la quinasa A actúa cuando los niveles de AMP cíclico aumentan en la célula. Así, la activación de cualquier tipo de receptor de la célula diana que active la adenil ciclasa puede desensibilizar el receptor P2 -lo cual constituye un ejemplo de desensibilización heteróloga, mediante el cual un ligando desensibiliza la cé lula diana a otro ligando. El mecanism o dependiente de la P arrestina, por el contrario, únicamente actúa cuando los receptores P2 han sido activados por la unión de un ligando -u n ejemplo de desensibilización homologa, mediante el cual un ligando desensibiliza la célula diana únicamente a sí mismo.
Algunas form as de adaptación son debidas a cambios en el proceso de señalización44 A pesar de que la mayoría de los m ecanismos conocidos de adaptación suponen cam bios en la proteína receptora, en principio la adaptación puede producirse por m odificaciones de cualquier com ponente del proceso de señalización. Se conocen varios casos en los que la adaptación de la célula diana se produce por modificación de una proteína G trimérica. Ello ocurre, por ejemplo, en la res puesta de las células de levadura a feromonas de apareamiento. Las alteraciones más adelante de la proteína G en el proceso de señalización también pueden contribuir a la adaptación de las células diana, como en el caso de los fotorreceptores (véase pág. 806). En los adictos a la morfina, por ejemplo, las neuronas sensibles a los opiáceos del cerebro se desensibilizan a la morfina, de forma que los adictos necesitan dosis de morfina muy superiores a las que requie ren los individuos normales para eliminar el dolor o para causar sensación de euforia (Figura 15-59). Las células adaptadas, sin embargo, tienen niveles norma les de receptores de superficie celular funcionales contra la morfina (opiáceos). Los mecanismos de adaptación se han estudiado tanto en rata como en líneas ce lulares neurales sensibles a la morfina, mantenidas en cultivo. Los receptores a la morfina de la superficie de estas células activan la proteína G inhibidora G¡, que inhibe la adenil ciclasa, causando así una disminución de los niveles intracelulares de AMP cíclico. Ello disminuye la actividad de la quinasa A y, por lo tanto, la fosfo rilación de varios tipos de canales iónicos, lo cual disminuye la excitabilidad eléc trica de las neuronas. Las células cultivadas mantenidas durante mucho tiempo en presencia de elevadas concentraciones de morfina se adaptan mediante un in cremento compensatorio de la expresión de los genes de quinasa A y de adenil ci clasa, lo cual hace que los niveles tanto de actividad adenil ciclasa como de AMP cíclico vuelvan a los valores normales aunque los receptores de la superficie celu lar estén ocupados por morfina. Sin embargo, como las células adaptadas tienen niveles incrementados de adenil ciclasa y de quinasa A, cuando se elimina la mor fina se produce un marcado incremento de la actividad adenil ciclasa y de la acti vidad quinasa A, que provoca que los niveles de AMP cíclico aumenten hasta al canzar valores anormalmente elevados. Ello incrementa la excitabilidad de las neuronas y conduce a los síntomas extremadamente desagradables de la depriva ción, (ansiedad, sudoración, temblores, alucinaciones, etc.) que experimentan los adictos a la morfina cuando tienen “el mono”.
m orfina Figura 15-59 Estructura de la morfina. ¿Por qué algunas de nuestras células tienen receptores para una droga com o la morfina, que proviene de las semillas de la adormidera? Durante mucho tiempo los farmacólogos han sospechado que la morfina puede mimetizar alguna molécula señal intracelular que regule el humor y la percepción del dolor. En 1975 se aislaron a partir de cerebro de cerdo dos pentapéptidos con actividad sem ejante a la morfina denominados encefalinas, y poco más tarde a partir de hipófisis y de otros tejidos se aislaron unos polipéptidos más grandes con actividad sem ejante, denominados endorfinas. Todas estas substancias, denominadas op iá c eo s en dógen os, presentan una secuencia com ún de cuatro aminoácidos y se unen al mismo tipo de receptores de la superficie celular al que se une la morfina (y otros narcóticos relacionados con ella). A diferencia de la morfina, sin embargo, estos compuestos son rápidamente degradados tras ser segregados, de forma que nunca se acumulan en cantidades suficientes com o para inducir la tolerancia que se observa en los adictos a la morfina.
La adaptación desempeña un papel crucial en la quimiotaxis bacteriana45 Muchos de los mecanismos que participan en la señalización química entre cé lulas en los animales pluricelulares han evolucionado a partir de mecanismos utilizados por organismos unicelulares para responder a cambios químicos de su entorno. De hecho, ambos tipos de organismos utilizan algunos mediadores intracelulares comunes. Entre las reacciones de los organismos unicelulares me-
Adaptación de las células diana
827
jor estudiadas frente a señales extracelulares, se encuentran las respuestas quimiotácticas, en las cuales el movimiento celular se dirige hacia o escapa de una fuente de algún compuesto químico del medio. Concluimos este capítulo con una descripción de la quimiotaxis bacteriana la cual, a través de la potencia del análisis genético, nos proporciona una ilustración clara y elegante del papel cru cial que supone la adaptación en respuesta a señales químicas. En el Capítulo 16 se discute la quimiotaxis de las células eucariotas. Las bacterias móviles han de nadar hacia los lugares donde haya elevadas concentraciones de nutrientes (atrayentes), como los azúcares, los aminoácidos y pequeños péptidos, y alejarse de lugares donde haya elevadas concentraciones de productos químicos nocivos (repelentes) (Figura 15-60). Este comportamiento quimiotáctico, relativamente simple pero claramente adaptativo, se ha estudiado especialmente en E. coli y en Salmonella typhimurium. Aquí nos centraremos principalmente en la quimiotaxis hacia los atrayentes; la quimiotaxis que huye de los repelentes se produce esencialm ente por los mismos mecanismos, ac tuando a la inversa. Las bacterias nadan gracias a los flagelos, que son completamente diferen tes de los flagelos de las células eucariotas. Los flagelos bacterianos consisten en un cilindro helicoidal que contiene un solo tipo de subunidad proteica, llamada flagelina. Cada flagelo está unido por su base, gracias a un corto codo flexible, a un pequeño disco proteico localizado a nivel de la membrana de la bacteria. Por increíble que pueda parecer, este disco forma parte de un diminuto “motor” que
Figura 15-60 Quimiotaxis bacteriana. Las fotografías muestran bacterias S alm o n ella typhim uriu m atraídas hacia un pequeño tubo capilar de vidrio que contiene el aminoácido serina (A) y repelidas por un tubo capilar que contiene fenol (B). Las fotografías fueron tomadas a los cinco minutos de haber introducido los tubos capilares en las placas de cultivo en que se encontraban las bacterias. Esta prueba del tubo capilar es un método sencillo para demostrar la existencia de quimiotaxis bacteriana (De B.A. Rubik y D.E. Koshland, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 75:2820-2824, 1978.)
codo
flagelo
“ I membrana J externa capa de peptidoglucano en el espacio periplasmático membrana _ interna
27 nm
estator
828
Capítulo 15: Transmisión de señales entre células
Figura 15-61 Dibujo esquem ático del m otor del flagelo bacteriano. El flagelo está unido a un codo flexible. El codo está unido a varias proteínas circulares (mostradas en rojo) que se hallan integradas en las membranas interior y exterior (plasmática), y giran con el flagelo aproximadamente a 150 revoluciones por segundo. Se cree que la rotación está dirigida por un flujo de protones a través de un anillo exterior de proteínas (el estator), que también contiene las proteínas responsables de cambiar la dirección de giro. (Basado en datos de T. Kubori et al., /. Mol. Biol. 226:433-446, 1992 y N.R.Francis et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89:63046308, 1992.)
utiliza la energía almacenada en el gradiente transmembrana de H+ girando rá pidamente y moviendo el flagelo helicoidal (Figura 15-61). Debido a que los flagelos de la superficie bacteriana tienen una “orienta ción” intrínseca, diferentes direcciones de rotación tienen efectos distintos so bre el movimiento. La rotación en el sentido opuesto a las agujas del reloj hace que los flagelos se unan formando un haz, con lo que la bacteria nada de forma uniforme en una dirección. Pero la rotación en el sentido de las agujas del reloj hace que los flagelos se separen unos de otros, con lo que la bacteria se mueve de forma caótica sin avanzar (Figura 15-62). En ausencia de estímulos am bienta les, la dirección de giro de los flagelos se revierte cada pocos segundos produ ciendo un patrón característico de movimientos en el que la natación suave en línea recta se halla interrumpida por cambios abruptos de dirección (Figura 1563A). Este patrón normal de natación de la bacteria se modifica por atrayentes o por repelentes quimiotácticos, los cuales se unen a proteínas receptoras especí ficas afectando la frecuencia de cambios de dirección, incrementando o dismi nuyendo la duración de los intervalos de tiempo entre los cambios sucesivos de dirección de giro de los flagelos. Cuando las bacterias están nadando en una di rección favorable (hacia concentraciones elevadas de un atrayente o huyendo de concentraciones elevadas de un repelente), cambian de dirección menos fre cuentem ente que cuando están nadando en una dirección desfavorable (o cuan do no existe ningún gradiente). Como los períodos de natación suave son más largos cuando la bacteria se desplaza en una dirección favorable, gradualmente progresará en esta dirección -h acia un atrayente (Figura 15-63B) o apartándose de un repelente. En su ambiente natural, una bacteria detecta un gradiente espacial de atra yentes o de repelentes en el medio, nadando a una velocidad constante y com parando la concentración de compuestos químicos en función del tiempo (no monitoriza los cambios de concentración utilizando receptores separados en el espacio a lo largo de su longitud; ello sería extremadamente difícil dado el pe queñísimo tamaño de la bacteria). En el laboratorio se pueden generar artificial mente variaciones de concentración en función del tiempo, mediante la adición o la eliminación de productos químicos del medio de cultivo. Cuando se añade, de esta forma, un atrayente al medio, la bacteria, tal como era de esperar, cesa de cambiar de dirección durante algunos segundos. Pero transcurrido este tiem po, incluso aunque se mantenga la presencia de atrayente en el medio, la fre cuencia de cambio de dirección de la bacteria se recupera hasta valores norma-
(A)
(B) Figura 15-62 Posiciones de los flagelos de E. coli durante la natación. Cuando los flagelos giran en sentido opuesto al de las agujas del reloj (A) quedan unidos en un solo haz que ' actúa com o hélice, dando lugar a una natación suave. Cuando los flagelos giran en el sentido de las agujas del reloj (B) se separan entre sí, generando un movimiento caótico.
Figura 15-63 Caminos recorridos por una bacteria al nadar. En ausencia de señales quimiotácticas (A), los períodos de natación suave se interrumpen con breves movimientos caóticos que modifican al azar la dirección del desplazamiento. Así pues, la bacteria se desplaza en tres dimensiones de una forma caótica, con continuos cambios de dirección que alternan con períodos de natación suave. En presencia de un atrayente quimiotáctico (B), el movimiento caótico queda parcialmente suprimido mientras la bacteria se desplaza hacia una concentración más alta del atrayente, de modo que se va acercando gradualmente al atrayente -u n desplazamiento al azar sesgado.
(B)
Adaptación de las células diana
829
Figura 15-64 Modelo de la estructura homodimérica de la proteína receptora quimiotáctica del aspartato. La estructura tridimensional del dominio extracelular ha sido obtenida por difracción de rayos X. Los dominios intracelulares superenrollados son una predicción a partir del análisis de la secuencia de aminoácidos. Contienen los lugares de metilación (mostrados como puntos negros), de los que hay cuatro en cada una de las dos cadenas polipeptídicas (los lugares de una de las cadenas están fuera de visión en la figura). Se cree que la unión del ligando, en el espacio periplasmático, induce un cambio de conformación en el receptor que se propaga por toda la membrana mediante un movimiento de toda la molécula semejante al de una tijera. (Basado en M.V. Milbum et al., Science 254:13421347,1991 © 1991 the AAAS; y J.B. Stock et al.,/. Biol. Chem. 267:19753-19756, 1992, publica ASBMB.)
ligando unido
les. La bacteria se mantiene en este estado adaptado mientras no se produzca ninguna disminución o aumento de la concentración de atrayente en el medio; la adición de más atrayente de nuevo suprimirá durante unos segundos los cam bios de dirección de la bacteria mientras que la eliminación de atrayente en el medio incrementará, tam bién durante unos segundos, la frecuencia de cambios de dirección, hasta que la bacteria se haya vuelto a adaptar al nuevo nivel. La adaptación constituye una parte crucial de la respuesta quimiotáctica en tanto que permite a la bacteria responder a cambios de concentración en lugar de res ponder a niveles estacionarios de un atrayente, y responde a estos cambios en un extraordinariamente amplio rango de concentraciones del atrayente (en al gunos casos desde menos de 10~10M hasta más de 10-3 M).
La quimiotaxis bacteriana está mediada por una familia de cuatro receptores transm em brana homólogos y por un sistem a de fosforilación que transm ite la señal46 El desenmarañamiento de los mecanism os moleculares responsables de la qui miotaxis bacteriana ha dependido fundamentalmente del aislamiento y análisis de m utantes con comportamiento quimiotáctico defectuoso. De esta forma, se ha demostrado que la quimiotaxis a varios compuestos depende de una peque ña familia de proteínas receptoras transm em brana relacionadas entre sí, que son responsables de la transmisión de señales quimiotácticas a través de la m em brana plasmática. Estos receptores quim iotácticos se metilan durante la adaptación (véase más adelante), por lo que a menudo se les denomina proteí nas de quimiotaxis aceptoras de metilos (MCP, de Methyl-Accepting Chemotaxis Proteins”). Como veremos, la actividad del receptor se estimula por un incre mento de la concentración de atrayente: un solo receptor se afecta por ambos ti pos de moléculas, con consecuencias opuestas. Existen cuatro tipos de receptores quimiotácticos de membrana, cada uno de los cuales está relacionado con la respuesta a un pequeño grupo de com pues tos químicos. Los receptores de tipo 1 y de tipo 2 median la respuesta a la serina y al aspartato, respectivamente, uniéndose a estos aminoácidos directamente y transduciendo el evento unión en forma de señal en el citosol. En la Figura 15-64 se presenta un modelo de la estructura de uno de estos receptores. Los recepto res de tipo 3 y 4 median la respuesta a azúcares y a dipéptidos, respectivamente, de una m anera ligeramente menos directa (Figura 15-65). Estudios genéticos indican que cuatro proteínas citoplasmáticas -CheA, CheW, CheY y CheZ- participan en el proceso de señalización que acopla el re ceptor quimiotáctico con el motor bacteriano. CheY actúa en el final efector del proceso, controlando la dirección de giro del flagelo. Cuando está activada, se une al motor haciendo que gire en el sentido de las agujas del reloj, lo cual pro duce cambios de dirección del movimiento de la bacteria; los mutantes que ca recen de esta proteína nadan de forma continua sin cambiar de dirección. CheA es una histidina proteína quinasa. Cuando está unida tanto al receptor quimio-
830
Capítulo 15: Transmisión de señales entre células
dom inio de señalización
7 nm
am inoácidos
dipéptidos atrayentes
ESPACIO PERI PLASMÁTICO
proteínas receptoras periplasm áticas
mem brana exterior
proteínas receptoras quim iotácticas
m em brana plasmática CITOSOL
/
procesos señal intracelulares
m otor del flagelo
táctico como a CheW, y activada por ellos, se autofosforila sobre un residuo de histidina y casi inmediatamente transfiere el fosfato a un residuo de ácido aspártico de CheY. La fosforilación de CheY activa la proteína de manera que se une al motor flagelar y genera una rotación en el sentido de las agujas del reloj, y cam bios de dirección. CheZ rápidamente inactiva a la CheY fosforilada, estimulando su desfosforilación (Figura 15-66). La unión de un repelente a un receptor quimiotáctico increm enta la activi dad del receptor, el cual, a su vez, increm enta la actividad de CheAy por lo tanto la fosforilación de CheY, que genera cambios de dirección. Estas fosforilaciones se producen rápidamente: el tiempo necesario para que se produzca la respues ta de cambios de dirección tras la adición de un repelente es de alrededor de 200 milisegundos. La unión de un atrayente tiene el efecto opuesto. Disminuye la actividad del receptor, el cual disminuye la actividad de CheA, de forma que CheY permanece desfosforilada, el motor continuará girando en sentido contra rio al de las agujas del reloj y la bacteria nadará de manera continua. La función de CheY en la quimiotaxis bacteriana es análoga a la función de las proteínas Ras en la señalización de las células animales. Como Ras, CheY ac túa com o un interruptor de encendido/apagado: se halla activa cuando está fos forilada e inactiva cuando está desfosforilada, tal como ocurre con Ras, que está activa cuando tiene unido GTP e inactiva cuando tiene unido GDP. CheY se acti va por CheA y se inactiva por CheZ, tal como Ras se activa por GNRP y se inacti va por GAP (véase Figura 15-50). En efecto, las estructuras tridimensionales de CheY y de Ras son similares.
Figura 15-65 Diferentes tipos de receptores quimiotácticos. Los atrayentes químicos se unen a los receptores quimiotácticos de la membrana plasmática de tipo 1 o de tipo 2 o a proteínas receptoras específicas del espacio periplasmático (entre las membranas exterior e interior de la bacteria), las cuales entonces se unen a receptores quimiotácticos de tipo 3 o de tipo 4. La unión de un atrayente disminuye la actividad del receptor quimiotáctico, inhibiendo la cascada de señalización intracelular y haciendo que el motor del flagelo continúe girando en sentido opuesto al de las agujas del reloj, suprimiendo pues los cambios de dirección del desplazamiento de la bacteria y generando un movimiento suave y continuado. Los atrayentes difunden en el espacio periplasmático desde el exterior de la célula, a través de grandes canales situados en la membrana exterior (no mostrados aquí).
En la quimiotaxis bacteriana, la m etilación del receptor es responsable de la adaptación46 En la quimiotaxis bacteriana la adaptación resulta de la metilación covalente de las proteínas receptoras quimiotácticas. Si se bloquea el proceso de metilación mediante una mutación, la adaptación se inhibe m arcadamente y la exposición de la bacteria mutante a un atrayente produce el cese de los cambios de direc ción de su movimiento durante días, en lugar de durante algunos segundos o un minuto. Así pues, la activación de los receptores quimiotácticos por un quimio-
Adaptación de las células diana
831
Figura 15-66 Sistema de transferencia de fosforilación que permite a los receptores quimiotácticos controlar el m otor del flagelo. La unión de un repelente increm enta la actividad el receptor, el cual se une a CheW y a CheA, estimulando así CheA a que se autofosforile. Rápidamente CheA transfiere el grupo fosfato que tiene unido de forma covalente a través de un enlace de alta energía, directamente a CheY generando CheY-fosfato, el cual se une al motor del flagelo haciéndolo girar en el sentido de las agujas del reloj, lo cual hace que la bacteria entre en un movimiento anárquico, con constantes cambios de dirección. La unión de un atrayente tiene los efectos contrarios. Disminuye la actividad del receptor con los que produce una disminución del grado de fosforilación de CheA y de CheY, lo cual provoca que el motor flagelar gire en sentido opuesto al de las agujas del reloj, y por lo tanto la bacteria nade con un movimiento suave y continuo. CheZ acelera la desfosforilación de CheY-fosfato, antagonizando así la acción de CheY. Cada uno de estos intermediarios fosforilados se desfosforila en cuestión de unos 10 segundos, lo cual le permite a la bacteria responder de una forma muy rápida a cambios de su entorno (véase Figura 15-10).
atrayente tiene dos consecuencias diferentes: ( 1) rápidamente disminuye la acti vidad del receptor, disminuyendo la actividad de CheA y de CheY y haciendo que el m otor flagelar continúe rotando en sentido contrario al de las agujas del reloj, lo cual hace que cesen los cambios de dirección; (2) se produce una adap tación ya que, mientras el atrayente está unido al receptor, el receptor es media do por una enzima del citoplasma, lo cual revierte la activación durante un perío do de algunos minutos (Figura 15-67). La mediación del receptor está catalizada por una enzima soluble (la metil transferasa ) que actúa sobre la proteína receptora. Se pueden llegar a transferir ocho grupos metilo a cada receptor, por lo que el grado de mediación se incre menta a elevadas concentraciones del atrayente (cuando cada receptor está uni do al ligando durante períodos de tiempo prolongados). Cuando el atrayente se elimina del medio, el receptor es desmetilado mediante una enzima desmedían te soluble (metil esterasa). A pesar de que el nivel de mediación varía durante la respuesta quimiotáctica, permanece constante mientras la bacteria está adapta da, ya que se alcanza un balance exacto entre las velocidades de metilación y de desmetilación. La metil esterasa que elimina los grupos metilo de los receptores quimiotácticos tam bién está regulada mediante fosforilación mediada por CheA, lo cual proporciona otra forma de regulación por retroalimentación nega tiva que tam bién contribuye al proceso de adaptación. Probablemente quedan otras interacciones y retroalimentaciones por des cubrir en la quimiotaxis bacteriana. Sin embargo, ya se han identificado todos los genes y todas las proteínas que participan en este comportamiento altam en te adaptativo, y en la mayoría de los casos se conocen las secuencias de las pro teínas, y estas proteínas se encuentran disponibles en grandes cantidades. Por ello, parece que la quimiotaxis bacteriana será el primer sistema de señalización
Figura 15-67 Activación secuencial y adaptación (vía metilación) de un receptor quim iotáctico. Nótese que la actividad del receptor, y por lo tanto la frecuencia de cambios de dirección de la bacteria, es la misma en el estado basal que en el estado de adaptación. El receptor se ha representado con dos lugares de metilación, para simplificar el dibujo; en realidad existen ocho lugares de metilación en cada receptor. A medida que la concentración del atrayente va aumentando, la fracción de tiempo durante la cual el receptor está ocupado por el ligando también aumenta. A elevados niveles del atrayente pues, se producirá un cambio de conform ación del receptor mayor que a bajos niveles de ligando, empujando aún más al receptor hacia su estado com pletam ente alterado. Sin embargo, se produce un ligero grado de metilación, de forma que en cuestión de algunos minutos la alteración conform acional del receptor se habrá revertido com pletamente y la actividad del receptor se incrementará hasta su nivel anterior. El receptor se ha adaptado.
832
Capítulo 15 : Transmisión de señales entre células
repelente
receptor de quim iotaxis
m otor del flagelo giro en el sentido de las agujas del reloj MOVIMIENTO ANARQUICO CON CONTINUOS CAMBIOS DE DIRECCIÓN
lugar de unión del ligando lugar de m etilación m em brana plasmatica
lugar activo del receptor " /
receptor en reposo LAUNIÓN DELATRAYENTE DISMINUYE LAACTIVIDAD DEL RECEPTOR Y HACE ASEQUIBLES LOS LUGARES DE METILACIÓN A LA METIL TRANSFERASA
LA METILACION LENTA DE LOS LUGARES EXPUESTOS HACE QUE LAACTIVIDAD DEL RECEPTOR RECUPERE LOS NIVELES ANTERIORES
H,C—O
-CH3
receptor adaptado
celular que será comprendido completamente en términos moleculares. Pero incluso cuando se hayan definido todas las moléculas y sus interacciones, resul tará todavía difícil comprender de qué forma actúan los procesos de señaliza ción de una red integrada, como discutiremos a continuación.
Resumen M ediante la adaptación a altas concentraciones d e un ligando señal, de una form a reversible y dependiente del tiempo, las células pueden ajustar su sensibilidad al nivel de estímulo, respondiendo pues a cambios de la concentración en un rango amplísimo, y no a concentraciones absolutas de ligando. La adaptación se puede prod ucir d e diferentes form as: (1) la unión del ligando p uede inducir la intem alización d e los receptores, algunos de los cuales serán degradados en los lisosomas - u n proceso denom inado regulación por dism inución del núm ero d e receptores (re ceptor do wn-regulation); (2) los receptores activados p ueden ser inactivados d e fo r m a reversible siendo fosforilados o metilados; (3) las proteínas G p ueden ser inactivadas d efo rm a reversible; y (4) las proteínas de etapas más avanzadas del proceso d e señalización p ueden ser reguladas p o r increm ento (up-regulation) o p or dism i nución (down-regulation). A nivel molecular, el ejemplo m ejor conocido d e adapta ción tiene lugar en las quimiotaxis bacteriana, en la cual la metilación reversible d e proteínas clave en la transducción de la señal, qu e se hallan en la m em brana plasmática, perm ite a la célula nad ar hacia los am bientes óptimos.
La lógica de la señalización intracelular: lecciones de “redes neuronales” basadas en los ordenadores Cada una de las células de un organismo pluricelular está bombardeada con se ñales químicas que han sido producidas por otras células -señales que regulan su metabolismo, señales que alteran o mantienen su estado de diferenciación, señales que determinan cuándo se han de dividir las células y señales que dictan cuándo la célula ha de vivir o morir. En general, estas señales se unen a recepto res de la superficie extracelular, los cuales activan varios procesos intracelulares de señalización, de forma que las señales intracelulares generadas por recepto res diferentes interactúan entre sí de maneras muy complejas. ¿De qué forma una célula integra toda esta información de modo que puede comportarse de la manera que es óptima para el organismo en su conjunto? La tarea de entender de qué manera la célula controla su magia parece abrumado ra. Incluso en el caso relativamente sencillo de la quimiotaxis bacteriana, en el que existen relativamente pocos componentes, y probablemente todos ellos co nocidos, las complejidades de las integraciones es demasiado enorme para po derse visualizar fácilmente y comprender completamente, por el momento. To davía no podemos predecir realmente, por ejemplo, el comportamiento de un mutante bacteriano en el que se hayan alterado los niveles de un receptor de membrana o de una proteína citoplasmática, especialmente si el estímulo quimiotáctico incluye más de un atrayente o repelente o si el estímulo cambia rápi damente con el tiempo. ¿De qué forma podemos esperar, entonces, entender las redes mucho más complejas de señalización intracelular de las células animales, en las que participan cientos de componentes, muchos de los cuales todavía no conocemos? A medida que vamos disponiendo de más información, resulta más eviden te que las simulaciones basadas en los ordenadores deberán jugar un papel cada vez más importante en nuestros intentos de entender de qué forma actúan estos procesos de señalización. Construyendo un modelo del proceso en un ordena dor, se puede visualizar y manipular la red de componentes interactivos, de for mas que son imposibles de estudiar en las células.
La lógica de la señalización celular: lecciones de redes neuronales basadas en los ordenadores
833
Los análisis basados en el ordenador son útiles desde otro punto de vista -q u e no depende del conocim iento cuantitativo detallado de las reacciones que participan. Los procesos de señalización intracelular, vistos como un todo, for man una red altamente interconectada en la que las señales son procesadas a través de múltiples rutas paralelas que interactúan una con otra. Así, uno puede aprender acerca del comportamiento de las redes de señalización comparándo las con otras redes altamente interconectadas. Las redes basadas en el ordena dor, a menudo denominadas redes neuronales, se desarrollaron originalmente para comprender de qué forma las células nerviosas transmiten y procesan la in formación en el cerebro, pero existen propiedades que también son relevantes para la señalización intracelular.
Las redes neuronales basadas en el ordenador pueden ser entrenadas47 Uno de los tipos más sencillos de redes neuronales basadas en el ordenador está compuesto de tres niveles de unidades interconectadas -u n nivel de entrada (input), un nivel escondido y un nivel de salida (output). Cada una de las muchas unidades de la red actúa como un modelo de célula nerviosa (neurona), cuya sa lida individual está controlada por múltiples señales de entrada. Las conexiones entre las unidades son análogas a las sinapsis y tienen pesos de conexión modificables, que controlan la fuerza con la que una unidad influye en otra unidad. La actividad de la red com o un todo depende tanto de los valores de estos pesos de conexión como de las reglas matem áticas mediante las cuales cada unidad suma sus señales de entrada para generar una señal de salida. Un patrón de señales de entrada recibido por las unidades de entrada es transformado según estos pesos y reglas en otros patrones diferentes de actividad en las unidades de salida, vía conexiones a través de las unidades escondidas (Figura 15-68). La característica más remarcable y más útil de las redes neuronales basadas en el ordenador es que pueden ser entrenadas para reconocer patrones específicos de señales de entrada, y para responder a cada uno de ellos con un patrón de acti vidad de salida determinado. El entrenamiento se consigue confrontando la red con ejemplos de entrenamiento en forma de series de señales de entrada acompa ñadas de los correspondientes patrones deseados de señales de salida. Por ejem plo, las entradas pueden ser series de letras presentadas en una orientación deter minada en la pantalla, y la salida deseada puede ser simplemente la identificación correcta de cada letra. La entrada también puede ser las secuencias de aminoáci dos de varias cadenas polipeptídicas y la salida los tipos de estructuras secunda rias que forma cada cadena polipeptídica. Cualquiera que sea la tarea, cuando se ha presentado un ejemplo concreto de entrenamiento, la salida que propone la red se compara con la salida deseada y se asigna un valor de “error” basado en lo cerca que estén las señales real y deseada. Tras procesar todos los ejemplos de la serie de entrenamiento, se calcula una medida general de realización, que caracte riza lo bien que ha trabajado la red en toda la serie de entrenamiento.
ENTRADA NIVEL DE ENTRADA
NIVEL E SC O N DIDO
N IVEL DE SA LID A
SALIDA
834
Capítulo 15: Transmisión de señales entre células
Figura 15-68 Una red neuronal sencilla. La actividad de cada unidad
neuronal (mostrada como círculos) se determina por las unidades de entrada. Habitualmente la salida de cada unidad es una función no lineal de las unidades de entrada. Cada una de las conexiones entre unidades tiene una fuerza particular o “peso”, que se indica por las diferencias de grosor de las flechas que las conectan.
La ventaja del entrenamiento es que pueden cambiarse los valores de peso de la red, de forma que su realización m ejore en presentaciones posteriores de series de entrenamiento. Se han diseñado varios algoritmos de entrenamiento para realizar estos cambios de los pesos de las conexiones. Uno de los métodos conceptualm ente más sencillos, y quizás el más relevante para la señalización celular (como se discute más adelante), es aquel en el que los pesos de las cone xiones se cam bian al azar, y los cambios que producen una mejora de la realiza ción de la red tienden a mantenerse. Sea cual fuere el algoritmo utilizado, el pro ceso de entrenam iento se repite una y otra vez hasta que la salida real de la red se asemeja a la salida deseada. Los pesos finales de la red no está predetermina dos por el algoritmo sino que emergen de una forma autónoma como resultado de la presentación repetida de los ejemplos de entrenamiento. Cuando la red ha "aprendido” la tarea deseada, a menudo puede reconocer y dar la respuesta co rrecta de patrones de entrada nuevos, que no formaron parte de los ejemplos de entrenamiento.
Las redes de señalización celular pueden observarse como redes neuronales entrenadas por la evolución48 A pesar de que las redes neurales se utilizaron originalmente para estudiar siste mas de neuronas interconectadas, no existe ninguna razón para que las unida des de estas redes tengan que representar únicamente neuronas; por ejemplo pueden ser enzimas u otro tipo de moléculas señal intracelulares. Consideremos las proteína quinasas que participan en la señalización celular. Estas enzimas re ciben señales de entrada (en forma de fosforilaciones o de sencillas uniones de proteínas) a partir de com ponentes de varios procesos intracelulares de señali zación, y estas señales de entrada, colectivamente, regulan la actividad catalítica de la quinasa. A su vez, cada quinasa genera una señal de salida (la fosforilación de otras proteínas) que regula la actividad de determinadas proteínas diana, las cuales pueden ser com ponentes más alejados del propio proceso de señaliza ción o procesos de señalización paralelos. En términos de una red, en este ejem plo las quinasas actúan exactamente como lo hacen las neuronas: integran va rias señales de entrada y responden con una señal de salida adecuada. Al menos en principio, puede entrenarse una red altamente interconectada de reacciones señal intracelulares para que reconozcan ciertos patrones de se ñales de entrada y respondan con patrones de salida específicos, de una forma similar a como hemos descrito para las redes neuronales basadas en ordenador. En este esquema, el entrenamiento debió de ocurrir durante la evolución, m e diante mutación y selección natural, de forma que mutaciones al azar en los ge nes que codifican proteínas señal ejercieron la misma función que las variacio nes al azar en los pesos de las conexiones introducidas por el ordenador. Una mutación que cam bie la actividad de una proteína quinasa señal, por ejemplo, puede increm entar el peso de una o más conexiones de la red, mientras que un cambio de la especificidad de unión de una proteína SH adaptadora puede añadir nuevas conexiones. Las mutaciones que mejoran la realización de una red de se ñalización, por ejemplo, al permitirle reconocer una nueva combinación de facto res de crecimiento o discriminar entre dos señales extracelulares que previamente la célula era incapaz de distinguir, pueden proporcionar al organismo una ventaja selectiva y por ello, ser retenidas para ser mejoradas posteriormente. De esta for ma, pudo evolucionar una red de señalización cada vez más compleja.
Las redes de señalización capacitan a las células para responder a complejos patrones de señales extracelulares47,49 Cuando se analizan las redes neuronales entrenadas para determinar como reco nocen complejos patrones de señales de entrada, se encuentra que las unidades individuales del nivel escondido (véase Figura 15-68) han quedado fuertemente
La lógica de la señalización celular: lecciones de redes neuronales basadas en los ordenadores
835
ENTRADA m oléculas de la matriz factores de crecim iento
Jquinasa 3 SALIDA interconectadas a conjuntos significativos de unidades del nivel de entrada, de forma que las unidades escondidas pasan a representar características significati vas del patrón de entrada aplicado a la red. En una red entrenada para reconocer letras representadas en cualquier orientación sobre la pantalla, por ejemplo, de terminadas unidades escondidas pueden empezar para reconocer líneas curvas o pares de líneas en ángulo recto, mientras que en una red entrenada para pronun ciar palabras escritas, determinadas unidades escondidas pueden representar so nidos de vocales o de consonantes. De una forma similar, moléculas determinadas de señalización intracelular de una célula pueden haber evolucionado para reconocer com binaciones deter minadas de señales extracelulares, contribuyendo así a traducir estas com bina ciones de señales en una respuesta celular particular. Consideremos la hipotéti ca red mostrada en la Figura 15-69, que casi con toda seguridad es mucho más sencilla que cualquier red de señalización encontrada en una célula. Consta de seis tipos de receptores de superficie que están acoplados funcionalmente a tres proteína quinasas citosólicas. Cada uno de los receptores I, II y III reconocen di ferentes com ponentes de la matriz extracelular, mientras que cada uno de los receptores A, B y C reconocen diferentes factores de crecimiento. La quinasa 3 trabaja en una etapa posterior del proceso que las quinasas 1 y 2 y actúa como salida de la red, quizás estimulando a la célula a proliferar al fosforilar un con junto de proteínas reguladoras de genes. Debido a las diferentes fuerzas de las conexiones de la red, algunas de las cuales son excitadoras y otras inhibidoras, cada una de las tres quinasas serán estimuladas de forma óptima por diferentes com binaciones de señales extracelulares. La quinasa 1 es más activa cuando la célula encuentra los com ponentes I y II de matriz y no encuentra los com ponen tes III, mientras que la quinasa 2 es más activa cuando la célula encuentra facto res de crecim iento A, B y C y no el com ponente III de matriz. Los requerimientos para la actividad óptima de la quinasa 3 son más complejos, ya que es sensible al entorno extracelular únicamente a través de las quinasas 1 y 2 . Presentará máxi ma actividad, y estimulará a la célula a proliferar, cuando las quinasas 1 y 2 sean activas sim ultáneamente -e s decir, cuando la célula haya encontrado los facto res de crecim iento A, B y C y las moléculas de matriz I y II, y no la molécula de matriz III, lo cual constituye un patrón sorprendentemente complejo si conside ramos la sencillez de la red. De acuerdo con este punto de vista, la quinasa 3 ha “aprendido” a lo largo de la evolución a asociar esta particular combinación de estímulos extracelulares con la necesidad de la célula para proliferar. De la m is ma forma algunas de las importantes moléculas señal de una célula real han aprendido a reconocer y responder a com binaciones relevantes de característi cas del entorno celular.
836
Capítulo 15 : Transmisión de señales entre células
Figura 15-69 Una hipotética red de señalización sencilla. La red consta de seis receptores y tres proteína quinasas citosólicas. Cada receptor activa (flechas verdes) o inhibe (líneas negras) la quinasa 1, la quinasa 2 o ambas, mediante un mecanismo no específico. Dado que las señales convergen en la quinasa 3 (la quinasa de salida), esta red será activa al máximo únicamente cuando se presenten las combinaciones específicas de estímulos extracelulares. A pesar de que esta red es mucho más sencilla que cualquiera de las que se halla en una célula viva, puede formar parte de un proceso de señalización más complejo.
Las redes señal son robustas Una importante consecuencia de la arquitectura altamente interconectada de una red neuronal es que, una vez ha sido entrenada para realizar una tarea, su realización no es fácilmente destruida por la modificación o la eliminación de unidades de la red. Si una determinada unidad responde de forma óptima cuan do recibe señales de entrada de otras seis unidades, también responderá, aunque no tan bien, a tan sólo cinco de estas señales. Si por ejemplo se introducen cam bios al azar en el peso de las conexiones en una red neuronal entrenada para re conocer letras, la capacidad para realizar esta tarea no se suprime, sino que úni camente se degrada ligeramente. De una forma similar, una respuesta celular que depende de procesos de se ñalización intracelular altamente interconectados no será fácilmente alterada si se elimina o se cam bia un solo elemento señal de uno de estos procesos. Por ello, no debemos sorprendernos demasiado de encontrar que una célula eucariota pueda actuar casi con normalidad aunque una proteína quinasa haya sido inactivada por mutación, incluso si esta proteína quinasa ha sido muy conserva da durante la evolución. Probablemente esta estabilidad de las redes de señali zación es importante para células perfectamente normales y para célula que no contienen números determinados de forma precisa de proteínas intracelulares; además, las concentraciones de metabolitos importantes pueden fluctuar con el estado metabòlico de la célula. El extenso entrecruzamiento entre los procesos señal en las células animales puede haber evolucionado, en parte, para permitir que los procesos funcionen normalmente en el seno de estas fluctuaciones. Las propiedades semejantes a las de redes neuronales de los sistemas alta mente interconectados de proteínas, puede ayudarnos a entender otros aspec tos de la biología celular, además de la señalización celular. Estas mismas consi deraciones se pueden aplicar, por ejemplo, a las complejas redes de proteínas que interaccionan entre sí, que forman el citoesqueleto, que es el tema del próxi mo capítulo.
Resumen La construcción de modelos en el ordenador p uede ayudam os a ilum inar los com plejos comportamientos d e las cascadas d e señalización qu e se encuentran en las cé lulas. En particular, las redes neuronales basadas en el ordenador tienen una serie d e propiedades qu e es posible qu e las redes de señalización intracelular compartan. Tal como las redes neuronales pueden ser entrenadas para responder d efo rm a a d e cuada a determ inados patrones de señales d e entrada, estas redes de señalización, m ediante procesos darw inianos de cambio aleatorio y selección p ueden haber desa rrollado la capacidad d e responder d efo rm a apropiada a complejas combinaciones de señales extracelulares. La arquitectura altamente interactiva d e las redes n eu ro nales está mimetizada p or las redes de proteínas señal intracelulares. Ambas redes pueden, en principio, actuar como elementos de reconocimiento de patrones, que responden de fo rm a óptima a com binaciones seleccionadas de estímulos de entra da. Las redes de este tipo también son relativamente resistentes a las fluctuaciones de fondo o a las alteraciones, de fo rm a que elim inando uno d e sus com ponentes no se altere com pletam ente la red.
La lógica de la señalización celular: lecciones de redes neuronales basadas en los ordenadores
837
Bibliografía G eneral Barritt, G.J. Communitation Within Animal Cells. Oxford, UK: Oxford Science Publications, 1992. Baulieu, E.-E.; Kelly, P.A. Hormones: From Molecules to Di sease. London: Chapman and Hall, 1990. Hardie, D.G. Biochemical Messengers: Hormones, Neuro transmitters and Growth Factors. London: Chapman and Hall, 1990. Molecular Biology of Signal Transduction. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol., Vol. 53,1988. Morgan, N.G. Cell Signalling. Milton Keynes, UK: Open Uni versity Press, 1989. C itas 1. Errede, B.; Levin, D.E. A conserved kinase cascade for MAP kinase activation in yeast. Curr. Opin. Cell Biol. 5:254-260,1993. Kurjan, J. Pheromone response in yeast. Annu. Rev. Biochem. 61:1097-1129,1992. Marsh, I.; Neimsen, A.M.; Herskowitz, I. Signal trans duction during pheromone response in yeast. Annu. Rev. Cell Biol. 7:699-728,1991. 2. Hardie, D.G. Biochemical Messengers: Hormones, Neurotrasnmitters and Growth Factors. London: Chap man and Hall, 1990. Kahn, C.R. Membrane receptors for hormones and neu rotransmitters./. Cell Biol. 70:261-286,1976. Levitski, A. Receptors: A Quantitative Approach. Menlo Park, CA: Benjamin-Cummings, 1984. Snyder, S.H. The molecular basis of communication between cells. Sci. Am. 253(4):132-140,1985. 3. Gurdon, J.; Tiller, E.; Roberts, J.; Kato, K. A community effect in muscle development. Curr. Biol. 3:1-11,1993. Smith, W.L.; Borgeat, P. The eicosanoids: prostaglan dins, thromboxanes, leukotrienes, and hydroxyeicosaenoic acids. In Biochemistry of Lipids and Mem branes (D.E. Vance, J.E. Vance, eds.), pp. 325-360. Menlo Park, CA: Benjamin-Cummings, 1985. Weissmann, G. Aspirin. Sci. Am. 264(l):84-90,1991. 4. Caveney, S. The role of gap junctions in development. Annu. Rev. Physiol. 47:319-335,1985. Warner, A.E. The role of gap junctions in amphibian de velopment. /. Embryol. Exp. Morphol. Suppl. 89:365380,1985. 5. Raff, M.C. Social controls on cell survival and cell death. Nature 356:397-400,1992. 6. Schimke, R.T. On the roles of synthesis and degradation in regulation of enzyme levels in mammalian tissues. Curr. Top. CellRegul. 1:77-124,1969. 7. Bredt, D.S.; Snyder, S.H. Nitric oxide, a novel neuronal messenger. Neuron 8:3-11,1992. Lowenstein, C.J.; Snyder, S.H. Nitric oxide, a novel bio logical messenger. Cell 70:705-707,1992. Moneada, S.; Palmer, R.M.; Higgs, E A Nitric oxide: phy siology, pathophysiology and pharmacology. Phar macol. Rev. 43:109-142,1991. Stevens, C.F. lust say NO. Curr Biol. 2:108-109,1992. 8. Andres, A.J., Thummel, C.S. Hormones, puffs and flies: the molecular control of metamorphosis by ecdysone. Trends Genet. 8:132-138,1992.
838
Capítulo 15 : Transmisión de señales entre células
Ashburner, M.; Chihara, C.; Meltzer, P.; Richards, G. Temporal control of puffing activity in polytene chro mosomes. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 38:655-662,1974. Evans, R.M. The steroid and thyroid hormone receptor superfamily. Science 240:889-895,1988. Parker, M.G., ed. Nuclear Hormone Receptors: Molecu lar Mechanisms, Cellular Functions and Clinical Ab normalities. London: Academic Press, 1991. Yamamoto, K.R. Steroid receptor regulated trancription of specific genes and gene networks. Annu. Rev. Ge net. 19:209-252,1985. 9. Nishizuka, Y., ed. Signal trnasduction: crosstalk. Trends Biochem. Sci. 17:367-443,1992. 10. Bourne, H.R.; Nicoll, R. Molecular machines integrate coincident synaptic signals. Cell/Neuron 72/10:65-75, 1993. Cohen, P. Signal integration at the level of protein kina ses, protein phosphatases and their substrates. Trends Biochem. Sci. 17:408-413,1992. Pelech, S.L. Networking with protein kinases. Curr. Biol. 3:513-515,1993. Posada, J.; Cooper, J A Molecular signal integration. In terplay between serine, threonine, and tyrosine phos phorylation. Mol. Biol. Cell 3:583-592,1992. 11. Birnbaumer, L. G proteins in signal transduction. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 30:675-705,1990. Dohlman, H.G.; Thomer, J.; Caron, M.G.; Lefkowitz, RJ. Model systems for the study of seven-transmembrane-segment receptors. Annu. Rev. Biochem. 60:653688.1991. Houslay, M.D.; Milligan, G., eds. G-Proteins as Media tors of Cellular signalling Processes. Chichester, UK: Wiley, 1990. Linder, M.E.; Gilman, A.G. G proteins. Sci. Am. 267(1): 36-43,1992. 12. Bourne, H.R.; Sanders, D.A.; McCormick, F. The GTPase superfamily: conserved structure and molecular me chanisms. Nature 349:117-127,1991. Heppler, J.R.; Gilman, A.G. G proteins. Trends Biochem. Sci. 17:383-387,1992. 13. Feder, D., et al. Reconstitution of beta,-adrenoceptordependent adenylate cyclase from purified compo nents. EMBOJ. 5:1509-1514,1986. Gilman, A.G. G proteins: transducers of receptor-generated signals. Ann«. Rev. Biochem. 56:615-649,1987. Pastan, I. Cyclic AMP. Sci. Am. 227(2):97-105,1972. Schramm, M.; Selinger, Z. Message transmission: recep tor controlled adenylate cyclase system. Science 225:1350-1356,1984. Sutherland, E.W. Studied on the mechanisms of hormo ne action. Science 177:401-408, 1972. Tang, W.-J.; Gilman, A.G. Adenylyl cyclases. Cell 70:869872.1992. 14. Lai, C.-Y. The chemistry and biology of cholera toxina. CRC Crit. Rev. Biochem. 9:171-206,1980. 15. Birnbaumer, L. Receptor-to-effector signaling through G proteins: roles for beta gamma dimers as well as alpha subunits. Cell 71:1069-1072,1992. Iniguez-Lluhi, I.; Kleuss, C.; Gilman, A.G. The importan ce of G-portein Py subunits. Trends. Cell Biol. 3:230235.1993.
16. Brindle, P.K.; Montminy, M.R. The CREB family of tran scription activators. Curr. Opin. Gen. Dev. 2:199-204, 1992. Cohen, P. Protein phosphorylation and the control of glycogen metabolism in skeletal muscle. Philos. Trans. R. Soc. Lond. (Biol.) 302:13-25,1983. Krebs, E.G. Role of the cyclic AMP-dependent protein kinase in signal transduction. JAMA 262:1815-1818, 1989. Pilkis, S.J.; El-Maghrabi, M.R.; Claus, T.H.Hormonal re gulation of hepatic gluconeogenesis and glycolysis. Annu. Rev. Biochem. 57:755-784,1988. Taylor, S.S.; Buechler, JA ; Yonemoto, W. cAMP-dependent protein kinase: framework for a diverse family of regulatory enzymes. Annu. Rev. Biochem. 59:9711005.1990. 17. Cohen, P. Structure and regulation of protein phospha tases. Annu. Rev. Bichem. 58:453-508,1989. 18. Carafoli, E. Intracellular calcium homeostasis. Annu. Rev. Biochem. 56:395-433,1987. Evered, D.; Whelan, J., eds. Calcium and the Cell, Ciba Foundation Symposium 122. Chichester, UK: Wiley, 1986. Koch, G.L.E. The endoplasmic reticulum and calcium storage. Bioessayss 12:527-531,1990. ■ 19. Augustine, G.J.; Charlton, M.P.; Smith, S.J. Calcium ac tion in synaptic transmitter release. Annu. Rev. Neurosci. 10:633-693, 1987. Heilbrunn, L.V.; Wiercenski, F.J. The action of various cations on muscle protoplasm. /. Cell. Comp. Physiol. 29:15-32,1947. 20. Bansal, V.S.; Majerus, P.W. Phosphatidylinositol-deri ved precursors and signals. Annu. Rev. Cell Biol. 6:4167.1990. Harden, T.K. G-protein-regulated phospholipase C: iden tification of component proteins. Adv. Second Messen ger Phosphoprotein Res. 26:11-34,1992. Majerus, P.W. Inositol phosphate biochemistry. Annu. Rev. Biochem. 61:225-250,1992. Michell, R.H. Inositol lipids in cellular signalling mecha nisms. Trends Biochem. Sci. 17:274-276,1992. Sekar, M.C.; Hokin, L.E. The role of phosphoinositides in signal transduction./. Membr. Biol. 89:193-210,1986. 21. Berridge, M.J. Inositol trisphosphate and calcium signa lling. Nature 361:315-325,1993. Feris, C.D.; Snyder, S.H. Inositol 1,4,5-trisphosphate-activated calcium channels. Annu. Rev. Physiol. 54:469488,1992. Meldolesi, J. Multifarious IP3 receptors. Curr. Biol. 2:393-394,1992. Taylor, C.W.; Marshall, I.C.B. Calcium and inositol 1,4,5-triphosphate receptors: a complex relation ship. Trends Biochem. Sci. 17:403-407,1992. 22. Berridge, M.J. Inositol triphosphate and calcium oscilations. Adv. Second Messenger Phosphoprotein Res. 26:211-223,1992. Cobbold, P.H.; Cuthbertson, K.S. Calcium oscillations: phenomena, mechanisms and significance. Semin. Cell Biol. 1:311-321,1990. Meyer, T.; Stryer, L. Calcium spiking. Annu. Rev. Biophys. Biophys. Chem. 20:153-174,1991. Tsien, R.W.; Tsien, R.Y. Calcium channels, stores, and oscillations. Annu. Rev. Cell Biol. 6:715-760,1990.
Bibliografía
Tsunoda, Y. Oscilatory Ca2+ signaling and its cellular function. New Biol. 3:3-17,1991. 23. Asaoka, Y.; Nakamura, S.-I.; Yoshida, K.; Nishizuka, Y. Protein kinase C, calcium and phospholipid degrada tion. Trends Biochem. Sci. 17:414-417, 1992. Hunter, T.; Karin, M. The regulation of trancription by phosphorylation. Cell 70:375-387,1992. Liou, H.-C.; Baltimore, D. Regulation of the NF-KB/rel transcription factor and Ik B inhibitor system. Curr. Opin. Cell Biol. 5:477-487,1993. Nishizuka, Y. Intracelllular signaling by hydrolisis of phospholipids and activation of protein kinase C. Science 258:607-614,1992. Sternweis, P.C.; Smrcka, A.V. Regulation of phospholi pase C by G proteins. Trends Biochem. Sci. 17:502506.1992. 24. Gerday, C.; Bolis, L.; Gilles, R., eds. Calcium and Cal cium Binding Proteins. Berlin: Springer-Verlag, 1988. Head, J.F. A better grip on calmodulin. Curr. Biol. 2:609611.1992. O’Neil, K.T.; DeGrado, W.F. How calmodulin binds its targets: sequence independent recognition of amphipathic a-helices. Trends Biochem. Sci. 15:59-64, 1990. 25. Hanson, P.I.; Schulman, H. Neuronal Ca2+/calmodulindependent protein kinases. Annu. Rev. Biochem. 61:559-601,1992. Morris, R.G.M.; Kennedy, M.B. The pierian spring. Curr. Biol. 2:511-514,1992. Schulman, H. The multifunctional Ca2+/calmodulin-dependent protein kinases. Curr. Opin. Cell Biol. 5:247253.1993. 26. Cohen, P. Protein phosphorylation and hormone ac tion. Proc. R. Soc. Lond. (Biol.) 234:115-144,1988. 27. Brown, A.M.; Bimbaumer, L. Ionic channels and their regulation by G protein subunits. Annu. Rev. Physiol. 52:197-213,1990. Hille, B. G protein-coupled mechanisms and nervous signaling. Neuron 9:187-195,1992. 28. Buck, L.B. The olfactory multigene family. Curr. Opin. Neurobiol. 2:282-288,1992. Kaupp, U.B.; Koch, K.W. Role of cGMP and Ca2+in verte brate photoreceptor excitation and adaptation. Annu. Rev. Physiol. 54:153-176,1992. Lagnado, L.; Baylor, D. Signal flow in visual transduc tion. Neuron 8:995-1002,1992. Reed, R.R. How does the nose know? Cell 60:1-2,1990. Simon, M.I.; Strathmann, M.P.; Gautam, N. Diversity of G proteins in signal transduction. Science 252:802808,1991. Stryer, L. Visual excitation and recovery. J. Biol. Chem. 266:10711-10714,1991. 29. Lamb, T.D.; Pugh, E.N., Jr. G-protein cascades: gain and kinetics. Trends neurosci. 15:291-298,1992. 30. Lewis, J.; Slack, J.; Wolpert, L. Thresholds in develop ment. /. Theor. Biol. 65:579-590,1977. Mulvihill, E.R.; Palmiter, R.D. Relationship of nuclear estrogen receptor levels to induction of ovalbumin and conalbumin mRNA in chick oviduct. /. Biol. Chem. 252:2060-2068,1977. 31. Maack, T. Receptors of atrial natriuretic factor. Annu. Rev. Physiol. 54:11-27,1992.
839
32.
33.
34.
35.
35.
36.
Miller, S.G.; Kennedy, M.B. Regulation of brain type II Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase by au tophosphorylation: a Ca2+-triggered molecular switch. Cell 44:861-870,1986. Mohun, T. Muscle differentiation. Curr. Opin. Cell Biol. 4:923-928, 1992. Rosenzweig, A.; Seidman, C.E. Atrial natriuretic factor and related peptide hormones. Annu. Rev. Biochem. 60:229-256, 1991. Yuen, P.S.T.; Garbers, D.L. Guanylyl cyclase-linked re ceptors. Annu. Rev. Neurosci. 15:193-225, 1992. Carpenter, G. Receptors for epidermal growth factor and other polypeptide mitogens. Annu. Rev. Bio chem. 56:881-914, 1987. Fantl, W.J.; Johnson, D.E.; Williams, L.T. Signalling by receptor tyrosine kinases. Annu. Rev. Biochem. 62:453-481, 1993. Schlessinger, J. Ullrich, A. Growth factor signaling by re ceptor tyrosine kinases. Neuron 9:383-391,1992. Ullrich, A.; Schlessinger, J. Signal transduction by recep tors with tyrosine kinase activity. Cell 61:203-212, 1990. Clark, S.G.; Stern, M.J.; Horvitz, H.R. C. elegans cell-signalling gene sem-5 encodes a protein with SH2 and SH3 domains. Nature 356:340-344,1992. Koch, C.A.; Anderson, D.; Moran, M.F.; Ellis, C.; Pawson, T. SH2 and SH3 domains: elements that control inte ractions of cytoplasmic signaling proteins. Science 252:668-674, 1991. Mayer, B.J.; Blatimore, D. Signalling through SH2 and SH3 domains. Trends Cell Biol. 3:8-13,1993. Pawson, T.; Schlessinger, J. SH2 and SH3 domains. Curr. Biol. 3:434-442,1993. Bollag, G.; McComick, F. Regulators and effectors of ras proteins. Annu. Rev. Cell Biol. 7:601-632,1991. Downward, J. Ras regulation: putting back the GTP. Curr. Biol. 2:329-331,1992. Hall, A. Ras-related proteins. Curr. Opin. Cell Biol. 5:265-268,1993. Lowy, D.R.; Willumsen, B.M. Function and regulation of Ras. Annu. Rev. Biochem. 62:851-891,1993. Greenwald, I.; Rubin, G.M. Making a difference: the role of cell-cell interactions in establishing separate iden tities for equivalent cells. Cell 68:271-281,1992. Olivier, J.P., et al. A Drosophila SH2-SH3 adaptor pro tein implicated in coupling the sevenless tyrosine ki nase to an activator of Ras guanine nucleotide ex change, Sos. Cell 73:179-191,1993. Ready, D.F. A multifaceted approach to neural develop ment. Trends Neurosci. 12:102-110,1989. Simon, M.A.; Dodson, G.S.; Rubin, G.M. An SH3-SH2SH3 protein is required for p2lRasI activation and binds to sevenless and Sos proteins in vitro. Cell 73:169-177,1993. Tomlinson, A. Cellular interactions in the developing Drosophila eye. Development 104:183-193, 1988. Warne, P.H.; Viciana, P.R.; Downward, J. Direct interac tion of Ras and the amino-terminal region of Raf-1 in vitro. Nature 364:352-355,1993. Hill, C.S., et al. Functional analysis of a growth factorresponsive trancription factor complex. Cell 73:395406, 1993.
840
Capítulo 15: Transmisión de señales entre células
37.
38.
39.
40.
41.
42.
43.
Nishida, E.; Gotoh, Y. The MAP kinase cascade is essen tial for diverse signal transduction pathways. Trends Biochem. Sci. 18:128-130,1993. Pelech, S.L. Networking with protein kinases. Curr. Biol. 3:513-515,1993. Ruderman, J.V. MAP kinase and the activation of quies cent cells. Curr. Opin. Cell Biol. 5:207-213,1993. Thomas, G. MAP kinase by any other name smells just as sweet. Cell 68:3-6,1992. Argetsinger, L.S., et al. Identification of JAK2 as a growth hormone receptor-associated tyrosine kinase. Cell 74:237-244, 1993. Miyajima, A.; Hara, T.; Kitamura, T. Common subunits of cytokine receptors and the functional redundancy of cytokines. Trends Biochem. Sci. 17:378-382,1992. Mustelin, T.; Burn, P. Regulation of src family tyrosine kinases in lymphocytes. Trends Biochem. Sci. 18:215220.1993. Schreurs, J.; Gorman, D.M.; Miyajima, A. Cytokine re ceptors: a new superfamily of receptors. Int. Rev. Cytol. 137B:121-155,1993. Sthal, N.; Yancopoulos, G.D. The alphas, betas, and ki nases of cytokine receptor complexes. Cell 74:587590.1993. Charnonneau, H.; Tonks, N.K. 1002 protein phosphata ses? Annu. Rev. Cell Biol. 8:463-493, 1992. Koretzky, G.A. Role of the CD45 tyrosine phosphatase in signal transduction in the immune system. FASEB J. 7:420-426,1993. Walton, K.M.; Dixon, J.E. Protein tyrosine phosphatases. Annu. Rev. Biochem. 62:101-120, 1993. Bishop, J.M. Molecular themes in oncogenes. Cell 64:235-248,1991. Gupta, S.K.; Gallego, C.; Johnson, G.L. Mitogenic path ways regulated by G protein oncogenes. Mol. Biol. Cell 3:123-128,1992. Kahn, P.; Graf, T., eds. Oncogenes and Growth Control. Berlin: Springer, 1986. Lin, H.Y.; Lodish, H.F. Receptors for the TGF-J3 super family: multiple polypeptides and serine/threonine kinases. Trends Cell Biol. 3:14-19,1993. Massague, J. The transforming growth factor-p family. Annu. Rev. Cell Biol. 6:597-641,1990. Massague, J. Receptors for the TGF-P family. Cell 69:1067-1070,1992. Taylor, S.S., et al. Structural framework for the protein kinase family. Annu. Rev. Cell Biol. 8:429-462,1992. Artavanis-Tsakonas, S.; Delidakis, C.; Fehon, R.G. The Notch locus and the cell biology of neuroblast segre gation. Annu. Rev. Cell Biol. 7:427-452,1991. Burridge, K.; Petch, LA ; Romer, L.H. Signals from focal adhesions. Curr. Biol. 2:537-539,1992. Soderquist, A.M.; Carpenter, G. Biosynthesis and meta bolic degradation of receptors for epidermal growth factor./. Membr. Biol. 90:97-105,1986. Hausdorff, W.P.; Caron, M.G.; Lefkowitz, R.J. Turning off the signal: desensitization of P-adrenergic receptor function. FASEBJ. 4:2881-2889,1990. Lefkowitz, R.J. G-protein-coupled receptor kinases. Cell 74:409-412,1993. Palczewski, K.; Benovic, J.L. G-protein-coupled receptor kinases. Trends Biochem. Sci. 16:387-391,1991.
44. Cole, G.M., Reed, S.I. Pheromone-induced phosphory lation of a G protein (3 subunit in S. cerevisiae is asso ciated with an adaptive response to mating pheromone. Cell 64:703-716,1991. Nestler, E.J. Molecular mechanisms of drug addiction. /. Neurosci. 12:2439-2450, 1992. 45. Adler, J. The sensing of chemicals by bacteria. Sci. Am. 234(4):40-47, 1976. Berg, H. How bacteria swim. Sci. Am. 233(2):36-44, 1975. Koshland, D.E., Jr. Biochemistry of sensing and adapta tion in a simple bacterial system. Annu. Rev. Biochem. 50:765-782, 1981. 46. Bourret, R.B.; Borkovich, K.A.; Simon, M.I. Signal trans duction pathways involving protein phosphorylation in prokaryotes. Annu. Rev. Biochem. 60:401-441, 1991. Hazelbauer, G.L. Bacterial chemoreceptors. Curr. Opin. Struct. Biol. 2:505-510,1992. Parkinson, J.S. Signal transduction schemes of bacteria. Cell 73:857-871, 1993. Stock, J.B.; Lukat, G.S.; Stock, A.M. Bacterial chemotaxis and the molecular logic of intracellular signal trans duction networks. Annu. Rev. Biophys. Biophys. Chem. 20:109-136,1991.
Bibliografía
Stoddard, B.L.; Bui, J.D.; Koshland, D.E., Jr. Structure and dynamics of transmembrane signaling by the Es cherichia coli aspartate receptor. Biochemistry 31: 11978-11983, 1992. 47. Hinton, G.E. How neural networks learn from experien ce. Sci. Am. 267(3): 144-151, 1992. Hopfield, J.J. Neural networks and physical systems with emergent collective computational abilities. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:2554-2558, 1982. Sejnowski, T.J.; Rosenberg, C.R. Parallel networks that learn to pronounce English text. Complex Systems 1:145-168, 1987. 48. Bray, D. Intracellular signalling as a parallel distributed process./. Theor. Biol. 143:215-231, 1990. Pelech, S.L. Networking with protein kinases. Curr. Biol. 3:513-515, 1993. 49. Gatmaitan, Z., et al. Regulation of growth and differen tiation of a rat hepatoma cell line by the synergistic interactions of hormones and collagenous substrata. /. Cell Biol. 97:1179-1190, 1983. Rozengurt, E.; Mendoza, S.A. Synergistic signals in mitogenesis: role of ion fluxes, cyclic nucleotides and protein kinase in Swiss 3T3 cells. /. Cell Sci. Suppl. 3:229-242, 1985.
841
Micrografia de fluorescencia de la bacteria Listeria m onocytogenes. La bacteria (en rojo) se desplaza induciendo la formación de filamentos de actina (en verde) en el citosol de las células huésped. Las regiones en las que se superpone la fluorescencia verde y la roja aparecen de color a m arillo . (Por cortesía de Tim Mitchison y Julie Theriot.)
El citoesqueleto Filamentos intermedios • Microtúbulos Cilios y cenírfolos ♦ Filamentos de actina • Proteínas de unión a la actina * El musculo
La capacidad de las células eucariotas de adoptar una gran variedad de formas y llevar a cabo movimientos direccionales y coordinados depende de una red muy com pleja de filamentos proteicos que se extienden a través del citoplasma (Figu ra 16-1). Esta red recibe el nombre de citoesqueleto, aunque, a diferencia del esqueleto óseo, es una estructura sumamente dinámica que se reorganiza con tinuamente mientras la célula cam bia de forma, se divide, y responde a su en torno. De hecho, el citoesqueleto podría llamarse también “citomusculatura” ya que es el responsable directo de movimientos tales como el deslizamiento de las células sobre un substrato, la contracción muscular, y todos los cambios de for ma que ocurren durante el desarrollo embrionario de los vertebrados; también proporciona la maquinaria para los movimientos intracelulares, tales como el transporte de los orgánulos desde un lugar a otro del citoplasma y la segregación de los cromosomas durante la mitosis. Las bacterias carecen, aparentemente, de citoesqueleto, por lo que podría haber sido un factor decisivo en la evolución de las células eucariotas. Las diversas actividades del citoesqueleto dependen de tres tipos de fila mentos proteicos -los filamentos de actina, los microtúbulos y los filamentos in termedios. Cada tipo de filamento está formado por una subunidad proteica dis tinta: actina para los filamentos de actina, tubulina para los microtúbulos, y una familia de proteínas fibrosas relacionadas, tales como vimentina o láminas, para los filamentos intermedios. La actina y la tubulina han sido altamente conservadas a lo largo de la evo lución de los eucariotas; sus filamentos proteicos se unen a una gran variedad de proteínas accesorias, las cuales capacitan al mismo filamento para participar en distintas funciones en regiones diferentes de la célula. Empezaremos este capítulo con una introducción sobre los tres principales tipos de filamentos del citoesqueleto e ilustrando algunos de los principios ge nerales que rigen su funcionamiento. Después de ello, consideraremos cada tipo de filamento por separado: en primer lugar, los filamentos intermedios, cuya estructura a modo de cuerda pa rece tener la función relativamente simple de proveer a las células de fuerza m e cánica; en segundo lugar, los microtúbulos, los cuales se consideran los organi zadores primarios del citoesqueleto; y finalmente, los filamentos de actina, que son esenciales para muchos de los movimientos celulares, especialmente los que se llevan a cabo en la superficie celular.
Figura 16-1 El citoesqueleto. Célula en cultivo fijada y marcada con el azul de Coomassie, colorante específico de proteínas. Podemos observar la gran variedad de estructuras filamentosas que se extienden a través de la célula. (Por cortesía de Colin Smith.)
843
La naturaleza del citoesqueleto Una célula eucariota dispone de miles de millones de moléculas proteicas, las cuales constituyen cerca del 60% de su peso seco. Se cree que una célula indivi dual de un vertebrado tiene aproximadamente 10 000 tipos de proteínas distin tas, la mayoría de las cuales se encuentran organizadas en el espacio. Encontra mos esta organización a distintos niveles. En todas las células, las proteínas forman com plejos funcionales, la mayoría de los cuales están formados quizás por 5 a 10 proteínas, aunque otros complejos pueden ser tan grandes o incluso más que los ribosomas. El siguiente nivel de organización incluye la disposición de proteínas localizadas funcionalmente en la misma m em brana o en el mismo compartimiento acuoso de un orgánulo limitado por una membrana, como por ejemplo el núcleo, las mitocondrias o el complejo de Golgi. El citoesqueleto es el encargado de crear y m antener un nivel de organización todavía más elevado. Convierte la célula viva en una cosa muy parecida a una ciudad, con servicios especializados concentrados en áreas distintas pero totalmente interconectados mediante vías de comunicación. En esta sección, revisaremos algunas de las es trategias básicas que capacitan al citoesqueleto para controlar la localización de los com plejos proteicos y los orgánulos así como para crear las vías de com uni cación entre ellos.
El citoplasm a de una célula eucariota está organizado espacialm ente por los filam entos de actina, los microtúbulos y los filam entos interm edios1 ¿De qué formas una célula eucariota, de diámetro de 10 pm o más, puede estar espacialmente organizada por moléculas de proteina del citoesqueleto que son claramente más pequeñas (unas 2000 veces más pequeñas en dimensiones linea les)? La respuesta radica en la polimerización. En cada uno de los tres principa les tipos de proteínas de citoesqueleto, miles de moléculas proteicas idénticas se ensamblan formando un filamento lineal, que puede ser lo suficientemente lar go como para ir de un lado de la célula hasta el lado opuesto. Estos filamentos conectan com plejos proteicos y orgánulos de regiones distintas de la célula y ac túan a modo de raíles para el transporte entre ellos. Además, forman el soporte m ecánico, que es especialmente importante en las células animales, las cuales no disponen de rígidas paredes celulares externas. El citoesqueleto forma una armazón interno que mantiene todo el volumen citoplasmàtico, de igual modo com o el esqueleto formado por vigas contribuye a mantener un edificio. Resulta sencillo determinar cóm o aparecen los filamentos durante la evolu ción: cualquier proteína que disponga en su superficie de pares orientados de lugares de autounión complementarios puede formar un largo filamento heli coidal (véase pág. 131). Cada uno de los tres tipos principales de filamentos pro teicos que forman el citoesqueleto es un polímero helicoidal que tiene una dis posición diferente en la célula y una función distinta (Figura 16-2). Sin embargo, los tres tipos de filamentos, por sí mismos, no pueden ser responsables ni de la forma ni de la longitud de la célula. Sus funciones dependen de un gran séquito de proteínas accesorias que unen los filamentos a otros filamentos y a otros com ponentes celulares. Las proteínas accesorias son esenciales para el control del ensam blaje de los filamentos proteicos en lugares particulares, y proporcio nan los motores que, o bien mueven los orgánulos a lo largo de los filamentos, o bien mueven los filamentos unos respecto a otros.
La dinám ica de los microtúbulos em ana del centrosom a2 Los microtúbulos son estructuras polares: un extremo (el extremo más ) es capaz de crecer a gran velocidad mientras que el otro extremo (el extremo menos) tiene tendencia a perder subunidades si no está estabilizado. En la mayoría de células,
844
Capítulo 16 : El citoesqueleto
FILAMENTOS DE ACTINA
microfUamentos)
Los filamentos de actina (también conocidos com o son polím eros helicoidales, enroscados de dos en dos, de la protefna actina. Aparecen com o estructuras flexibles, con un diámetro de 5 a 9 nm, que están organizadas en una gran variedad de haces, de redes bidim ensionales y de geles tridimensionales. Aunque los filamentos de actina están dispersos por el citoplasma de la célula, están altamente concentrados en el justo por debajo de la m embrana plasmática.
córtex,
25 nm
I_______ I
25 |jm
MICROTUBULOS Los microtúbulos son cilindros largos y huecos form ados por una protema tubulina. Su diámetro externo es de 25 nm y son m ucho más rígidos que los filam entos de actina. Los m icrotúbulos son largos y rectos y típicamente disponen de un extremo unido a un centro organizador de microtúbulos (M TOC, de microtubule organizing center) llam ado tal com o puede observarse en la imagen.
centrosoma
25 nm
25 }jm
FILAMENTOS INTERMEDIOS Los filamentos intermedios son estructuras parecidas a cuerdas, de un diámetro de aproxim adamente 10 nm; están form ados por las proteínas de los filamentos intermedios, que constituyen una gran familia heterogénea de proteínas. Uno de los tipos de filamentos intermedios forma una red llamada lámina nuclear que se localiza debajo de la membrana nuclear interna. Otros filamentos interm edios se extienden a lo largo del citoplasma proporcionando a las células resistencia mecánica y sosteniendo la tensión mecánica de los tejidos epiteliales mediante la unión de los citoplasmas de las células vecinas a través de las uniones celulares.
25 nm
25 |jm
el extremo menos de los microtúbulos está estabilizado mediante la unión a una estructura que recibe el nombre de centrosom a, y los extremos con crecim ien to rápido están entonces libres para añadir moléculas de tubulina (Figura 16-3). El centrosoma suele estar localizado cerca del núcleo, en la zona central de la célula. En un momento determinado, centenares de microtúbulos crecen a partir de un centrosoma, alargándose muchas mieras, con su “extremo m ás” dirigido hacia la periferia celular. Cada uno de estos microtúbulos es una estructura di nám ica que tanto puede acortarse como alargarse: después de unos minutos de crecim iento durante los cuales se produce la adición de subunidades, su extre mo más puede sufrir una repentina transición que implica una pérdida de tales subunidades, de forma que la longitud del microtúbulo disminuye rápidamente y puede llegar incluso a desaparecer. La red microtubular que emerge a partir del centrosoma está enviando constantem ente nuevos microtúbulos que reemplazan a los viejos que se han despolimerizado (Figura 16-4).
La naturaleza del citoesqueleto
Figura 16-2 Los tres tipos de filamentos proteicos que constituyen el citoesqueleto. Se muestra una
electronmicrografia de cada tipo de filamento y un diagrama esquemático de cómo están formados a partir de subunidades. También puede observarse esquemáticamente la distribución de cada filamento en un tipo de célula epitelial. Los colores utilizados para cada tipo de filamento se utilizan también en el resto del capítulo. (Las micrografías de los filamentos de actina, de los microtúbulos y de los filamentos intermedios por cortesía de Roger Craig, Richard Wade y Roy Quinlan, respectivamente.)
845
Figura 16-3 Un centrosom a con microtúbulos adheridos. Como hemos
+ n
indicado, el extremo menos, de crecimiento lento, de cada microtúbulo se encuentra inmerso en la matriz del centrosoma (verde claro) que rodea a un par de estructuras que reciben el nombre de centríolos. Esta matriz colabora en la determinación del número de microtúbulos de una célula mediante la nucleación del crecimiento de los microtúbulos de nueva formación.
La red microtubular puede encontrar el centro de la célula3 ¿Qué es lo que determina que las hileras de microtúbulos tengan una posición determinada en la célula? Experimentos en los cuales se utilizan células pigmen tarias aisladas a partir de las escamas de peces han proporcionado datos muy importantes: en la célula existen grandes células alargadas que contienen gránulos llenos de pigmento. Los gránulos, que pueden ser marrón oscuro, amarillos, rojos, o iridiscentes, dependiendo de la especie, están unidos a los microtúbulos y pueden agregarse en el centro de la célula o dispersarse a través del citoplas ma. El movimiento de los gránulos de pigmento se produce a lo largo de los m i crotúbulos y puede ser controlado por el pez; de esta forma pueden cambiar el color de su piel. En una célula pigmentaria mantenida en cultivo, el movimiento puede ser controlado convenientem ente mediante la aplicación de hormonas u otros reactivos, que hacen variar las concentraciones de AMP cíclico del citosol: un increm ento de la concentración de AMP cíclico provoca la dispersión de los gránulos, mientras que una disminución implica una agregación de los mismos. Los gránulos de pigmento pueden ser utilizados como marcadores de la disposi ción de los microtúbulos en la célula (Figura 16-5). Si cortamos, con una aguja, una porción de una célula pigmentaria, el frag mento celular restante puede sobrevivir durante largos períodos de tiempo in cluso aunque desaparezca su núcleo. Si realizamos la misma operación cuando los gránulos pigmentarios se encuentran dispersos por el citoplasma, algunos de estos gránulos quedan atrapados en el fragmento celular. Si, inmediatamente después de la operación inducimos una agregación de los gránulos de pigmento en este fragmento celular mediante tratamientos hormonales, éstos se mueven hacia el lugar donde se ha producido el corte. Pero si esta agregación se induce 4 horas después de la operación, los gránulos en vez de moverse hacia la zona donde se ha producido la lesión, se mueven exactamente hacia el centro del fragmento celular. Investigaciones posteriores muestran que este cambio impli ca una redistribución importante de los microtúbulos dentro del fragmento, de forma que ahora su extremo menos se encuentra en el centro del fragmento, com o si estuvieran en el centro de una célula intacta. En efecto, el fragmento ce lular aislado se ha convertido en una minicélula respecto a la organización de sus microtúbulos; los microtúbulos se han reorganizado alrededor de un nuevo centro organizador de microtúbulos (Figura 16-6).
+
Figura 16-4 Crecimiento y acortam iento de un haz de microtúbulos. El haz de microtúbulos
anclados en un centrosoma está en cambio continuo, mientras los nuevos microtúbulos crecen {flechas rojas) y los microtúbulos antiguos se acortan
(flechas azules).
846
Capítulo 16 : El citoesqueleto
dism inución de cAMP aum ento de cAMP
(A)
DISPERSOS
AGREGADOS
■
50 (ini Figura 16-5 Células pigmentarias de peces. Estas células gigantes, responsables de los cambios de coloración de algunas especies de peces, disponen de grandes gránulos de pigmento {m arrón), los cuales pueden cam biar su localización en respuesta a estímulos neuronales u hormonales. (A) Visión esquemática de una célula pigmentaria, que muestra la dispersión y la agregación de los gránulos de pigmento, que se producen a lo largo de los microtúbulos. (B) Electronmicrografía de barrido de una célula pigmentaria después de una breve exposición a un detergente. La membrana plasmática y el contenido soluble del citoplasma han sido eliminados y pueden observarse los haces de microtúbulos así como los gránulos de pigmento asociados. (C y D) Imágenes en campo claro de la misma célula en una escam a de un pez cíclido africano, que muestra sus gránulos de pigmento dispersos por el citoplasma o agregados en el centro de la célula. (E) Una imagen de inmunofluorescencia de otra célula del mismo ejemplar marcada con anticuerpos contra tubulina, que muestra largos haces de microtúbulos paralelos extendiéndose a partir del centrosom a hacia la periferia celular. (B, deM.A. McNiven and K.R. Porter,/. C ellB iol. 103:1547-1555), 1986, reproducida con permiso de copyright de The Rockefeller University Press; C, D, y E, por cortesía de Leah Haimo.)
centrosom a un par de centríolos
'igura 16-6 Un experim ento que nuestra de qué form a un haz de nicrotúbulos puede encontrar el entro de la célula. Después de que el xtremo de una célula pigmentaria de in pez se corte con una aguja, los nicrotúbulos situados el fragmento elular aislado se reorientan, situando u extremo menos cercano al centro iel fragmento.
ESPERA DE 4 HORAS cortado «t* por aquí con una aguja
fragm ento celular separado
nuevo centro organizador de m icrotúbulos sin centríolos
fragm ento celular con m icrotúbulos reorganizados
célula m elanófora
La naturaleza del citoesqueleto
847
Este experimento tan sencillo sugiere que las hileras citoplasmáticas de mi crotúbulos que emergen del centrosom a pueden actuar como un mecanismo de supervivencia que es capaz de encontrar el centro de la célula. Esta posibilidad es muy importante puesto que implica que la red microtubular puede organizar el interior de la célula. Pero esto sólo es el punto de inicio; tal y como veremos más adelante en esta sección de introducción, una célula puede posicionar la red moviendo específicam ente su centrosoma a un lugar desplazado del centro celular.
Determinadas proteínas motoras utilizan la red microtubular como guía para posicionar los orgánulos rodeados de membrana4 Como acabam os de ver en las células pigmentarias de determinadas especies de peces, los filamentos del citoesqueleto pueden utilizarse no sólo como soporte estructural sino com o líneas de transporte. Si con el microscopio óptico obser vamos una célula viva de un vertebrado, podemos contemplar su citoplasma en continuo movimiento. Después de unos minutos, las mitocondrias y otros orgá nulos mem branosos más pequeños cam bian sus posiciones mediante movi mientos saltatorios periódicos, mucho más sostenidos y direccionados que el continuo y pequeño movimiento browniano, provocado por el movimiento tér mico al azar. Éstos y otros movimientos intracelulares en las células eucariotas son generados por proteínas m otoras, las cuales se unen a los microtúbulos o a los filamentos de actina y utilizan la energía producida a partir de ciclos repeti dos de hidrólisis de ATP para moverse a lo largo de estos filamentos (véase pág. 221). Actualmente han sido identificadas docenas de proteínas motoras distin tas. Se diferencian en el tipo de filamento al cual se unen, en la dirección en la que se mueven a lo largo de este filamento y en la “carga” que transportan. La primera proteína motora descubierta fue la miosina, una proteína que se desliza a lo largo de los filamentos de actina y que es especialmente abundante en el músculo esquelético donde constituye la parte más importante del aparato contráctil. Posteriormente se descubrieron otros tipos de miosinas en las células no musculares. Todas las miosinas tienen dominios motores semejantes (la par te de la proteína responsable del movimiento), pero presentan diferencias muy marcadas en los dominios a través de los cuales la molécula de miosina se une a otros com ponentes de la célula. Las proteínas motoras que se mueven a lo largo de los microtúbulos son dis tintas a las miosinas y pertenecen a dos familias: las quinesinas, que generalmen te se mueven hacia el extremo más de los microtúbulos (a partir del centrosoma), y las dineínas, que se desplazan hacia el extremo menos (hacia el centrosoma). Al igual que las miosinas, cada tipo de proteína motora dependiente de microtúbu los transporta una carga determinada con la cual se desplaza (Figura 16-7). Las proteínas motoras m icrotúbulo-dependientes juegan un papel muy im portante en el posicionamiento de los orgánulos membranosos dentro de la cé lula eucariota. Los túbulos membranosos del retículo endoplasmático (ER), por ejemplo, están alineados con los microtúbulos y se extienden casi hasta la peri feria celular; el complejo de Golgi, en cambio, está localizado cerca del centrosoFigura 16-7 Proteínas m otoras que se mueven a lo largo de los microtúbulos. Las quinesinas se mueven hacia el extremo más de los microtúbulos, mientras que las dineínas se mueven hacia el extremo menos. Como hemos indicado, pueden existir diversas formas de ambas proteínas motoras microtubulares, y se cree que cada una de ellas transporta un tipo distinto de carga.
848
Capítulo 16: El citoesqueleto
(A)
10 Mrn
ma. Cuando tratamos las células con una droga que despolimeriza los microtú bulos, ambos orgánulos cambian su localización: el ER se colapsa hacia el centro de la célula, mientras que el complejo de Golgi se fragmenta en múltiples vesícu las de pequeño tamaño que se dispersan por todo el citoplasma. Cuando la dro ga es eliminada, los orgánulos recuperan su posición inicial, conducidos por proteínas motoras que se desplazan a lo largo de los microtúbulos nuevamente formados. Se cree que la posición de cada uno de estos orgánulos viene determi nada por una proteína receptora que se encuentra localizada en la superficie citosólica de la membrana del orgánulo, la cual se une a una proteína motora microtúbulo-dependiente específica -u n a quinesina para el ER y una dineína para el complejo de Golgi (Figura 16-8).
El córtex de actina puede generar y mantener la polaridad celular5 En general, los microtúbulos funcionan como entidades individuales, mientras que los filamentos de actina actúan formando redes o haces. Los filamentos de actina que descansan debajo de la membrana plasmática, por ejemplo, están asociados a una red de proteínas que se unen a la actina formando el córtex ce lular. Como discutiremos más adelante, la red es altamente dinámica y funciona con diversos tipos de miosinas que controlan los movimientos de la superficie celular. La localización y orientación de los filamentos de actina corticales está controlada mediante lugares de nucleación en la membrana plasmática; distin tas regiones de la membrana dirigen la formación de diferentes estructuras ba sadas en los filamentos de actina. Determinadas señales extracelulares que afectan a una parte de la superficie celular pueden provocar reestructuraciones locales del córtex de actina debajo de la zona correspondiente de la membrana plasmática. De manera recíproca, la organización del córtex de actina puede tener una influencia determinada en el comportamiento de la membrana plasmática que está por encima. Mecanismos basados en los filamentos de actina corticales, pueden, por ejemplo, empujar la mem brana plasmática hacia fuera formando largas y finas microespinas o exten sos lamelipodios, o pueden invaginar la membrana durante la división celular (Figura 16-9). En casos extremos el córtex de actina puede integrar los movimientos de una célula animal sobre su superficie completa y mantener la polaridad celular
La naturaleza del citoesqueleto
Figura 16-8 Distribución de los orgánulos por los microtúbulos. (A) Diagrama esquemático de una célula que muestra la disposición típica de los microtúbulos {verde), el retículo endoplasmático {azul), y el complejo de Golgi {am arillo). Se muestra el núcleo en m arrón y el centrosoma en verde claro. (B) Célula marcada con anticuerpos contra el retículo endoplasmático {pan el superior) o contra los microtúbulos {p an el inferior). Las proteínas motoras empujan al retículo endoplasmático a lo largo de los microtúbulos, tirando de ellos desde su localización hacia la membrana nuclear. (C) Célula marcada con anticuerpos contra el complejo de Golgi {p an el superior) o contra los microtúbulos {pan el inferior). En este caso las proteínas motoras mueven el com plejo de Golgi hacia su posición cerca del centrosoma. (B, por cortesía de Mark Terasaki y Lan Bo Chen; C, por cortesía de Viki Alian y Thomas Kreis.)
8 49
independientemente de la red microtubular. Esto ha sido ilustrado mediante ex perimentos en los cuales se han utilizado células no pigmentadas de las escamas de los peces. Estas células epidérmicas, conocidas como queratinocitos, migran en cultivo rápidamente y de una manera poco corriente, viajando a velocidades iguales o superiores a 30 pm/minuto. Inmunomarcajes utilizando anticuerpos demuestran que los filamentos intermedios y los microtúbulos se encuentran sólo en la región posterior alrededor del núcleo, mientras que el extremo exten dido de la célula es rico en filamentos de actina (Figura 16-10). Además, las célu las tratadas con una droga que despolimeriza los microtúbulos migran a la mis ma velocidad que las no tratadas, mientras que la migración se detiene totalm ente si las células son tratadas con agentes que interfieren con los fila mentos de actina. Evidentemente, los filamentos de actina (actuando con otras proteínas) son capaces de provocar el movimiento de los queratinocitos sobre una superficie y tam bién de mantener su morfología diferencial y su polaridad; los detalles del mecanism o implicado no están aún totalmente esclarecidos.
Figura 16-9 A menudo los filamentos de actina configuran la m em brana plasm ática de las células animales. Tres ejemplos de cambios en la membrana plasmática provocados por la red cortical de filamentos de actina. (A) Protrusiones delgadas y puntiagudas como las microespinas se forman en la superficie de las células por el ensam blaje de haces de filamentos de actina anclados en el córtex celular. (B) Extensiones parecidas a sábanas, llamadas lamelipodios, tam bién se forman en la superficie, en este caso sostenidas por redes alargadas de filamentos de actina en vez de haces discretos. (C) Invaginaciones de la superficie celular, iguales que las que se producen durante la división de la célula, producidas por un haz contráctil de filamentos de actina asociado con la proteína motora miosina.
Normalmente los filam entos de actina y los microtúbulos actúan juntos polarizando la célula6 En una célula viva los tres tipos mayoritarios de filamentos del citoesqueleto es tán conectados los unos con los otros y sus funciones están coordinadas. La dis tribución de los filamentos intermedios en una célula epitelial en cultivo, por
10 Jim 850
Capítulo 16: El citoesqueleto
Figura 16-10 La epidermis de los peces está formada por células migratorias. (A) Micrografías ópticas de un queratinocito en cultivo tomadas a intervalos de 15 segundos. La célula está migrando aproximadamente a 15 pm/segundo. (B) Queratinocito observado con el microscopio electrónico de barrido, que muestra su extremo en avance altamente extendido, y con el cuerpo celular que contiene el núcleo cerca del extremo final de la célula. (D) Distribución de los filamentos del citoesqueleto en este tipo inusual de célula. Los filamentos de actina {rojo) llenan el margen extendido de la célula y son los responsables de su migración. Los microtúbulos (verde) y los filamentos intermedios (azul) están restringidos en la zona próxima al núcleo. (Micrografía por cortesía de Juliet Lee.)
célula T
(A)
//
w
V
/
\
\J célula diana
señal localizada
del córtex
I igura Ití-ll La polarización de una célula T citotóxica después del reconocim iento de una célula diana. (A) Cambios en el citoesqueleto de una célula T citotóxica después del contacto con una célula diana. (B) Micrografía de inmunofluorescencia en que la célula T (a rrib a ) y su célula diana {abajo) han sido marcadas con un anticuerpo contra los microtúbulos. En la célula T el centrosoma y los microtúbulos que irradian a partir de él están orientados hacia el punto de contacto entre ambas células. En la célula diana el haz de microtúbulos no está polarizado. (B, reproducida de B. Geiger, D. Rosen, y G. Berke ,J . C ellB iol. 95:137-143, 1982, reproducido con permiso de copyright de The Rockefeller University Press.)
10 imi
ejemplo, puede verse radicalmente alterada si tratamos las células con una dro ga que provoca una despolimerización de los microtúbulos: los filamentos inter medios, que normalmente se distribuyen a lo largo del citoplasma, se agrupan en la región cercana al núcleo. Existen diversas situaciones en las cuales los mi crotúbulos y los filamentos de actina actúan de una manera coordinada polari zando la célula entera. Discutiremos únicamente un ejemplo: la muerte de una célula diana mediatizada por los linfocitos T citotóxicos. Las células T citotóxicas matan a otras células que llevan antígenos extraños en su superficie. Esto constituye una parte importante de la respuesta inmune de los vertebrados a una infección, como se discute en el Capítulo 23. Cuando los receptores en la superficie de la célula T reconocen un antígeno en la superfi cie de la célula diana, la señal de los receptores hacia el córtex subyacente de la célula T altera el citoesqueleto de diversas maneras. Primero, las proteínas aso ciadas con los filamentos de actina en la célula T reorganizan la zona de contac to entre las dos células. Entonces, el centrosoma se reorienta y se mueve junto a los microtúbulos hacia la zona de contacto entre la célula T y la célula diana (Fi gura 16-11A). Los microtúbulos, colocan el complejo de Golgi correctamente de bajo de la zona de contacto, dirigiendo la maquinaria asesina -q u e está asociada con una secreción del complejo de Golgi- hacia la célula diana. En este ejemplo y en muchos otros, una célula se convierte en polarizada de la m anera siguiente. Primero, la membrana plasmática detecta alguna diferencia en un lado de la célula y genera una señal transmembrana. El córtex de actina se reorganiza localmente debajo de la membrana afectada, con lo cual el centroso ma se desplaza hacia esta zona de la célula, probablemente con un movimiento de los microtúbulos. Entonces, el centrosoma posiciona los sistemas endomembranosos de una manera polarizada. El resultado final es una célula con un foco direccional muy marcado (Figura 16-1 IB).
Las funciones del citoesqueleto son difíciles de estudiar Aunque las principales subunidades de los tres tipos de polímeros del citoesque leto, así como los muchos cientos de proteínas que se asocian con ellos, han sido aislados y su secuencia de aminoácidos determinada, ha sido difícil establecer cómo funcionan estas proteínas dentro de la célula. Independientemente de la complejidad que implica la existencia de un número enorme de proteínas impli cadas, la comprensión del citoesqueleto se ve dificultada por dos hechos princi
La naturaleza del citoesqueleto
851
pales. Primero, el funcionamiento del citoesqueleto depende de un ensamblaje complejo de proteínas, que se unen en grupos cooperativos a los filamentos del citoesqueleto. Es relativamente sencillo estudiar el efecto sobre un filamento de una única proteína accesoria, pero es mucho más complejo analizar los efectos de un conjunto de muchas proteínas distintas. Este problema no se encuentra únicamente en el estudio del citoesqueleto, pero aquí es mucho más acusado. En segundo lugar, las funciones del citoesqueleto son mucho más difíciles de analizar que las funciones de otros grandes grupos de complejos proteicos. El proceso de síntesis del RNA y del DNA, por ejemplo, que incluye la formación de nuevos polímeros unidos mediante enlaces covalentes, puede ser fácilmente analizado in vitro, en parte porque los productos de las reacciones in vitro se pueden medir de una manera fácil y comparar con los productos correspon dientes fabricados en la célula. El citoesqueleto, por el contrario, ejerce fuerzas y provoca movimientos sin cambios químicos importantes. Esto hace que sea es pecialmente difícil estudiar la función de un sistema citoesquelético reconstitui do in vitro a partir de los com ponentes purificados.
Resumen
Una red de proteínas filamentosas conocidas con el nombre de citoesqueleto orga nizan espacialmente el citoplasma de las células eucariotas. Esta red está formada por tres tipos de filamentos principales: microtúbulos, filamentos de actina y fila mentos intermedios. Los microtúbulos son estructuras rígidas que, generalmente, disponen de un extremo unido al centrosoma y otro extremo libre en el citoplasma. En la mayoría de células los microtúbulos son estructuras altamente dinámicas que alternativamente crecen y se acortan mediante la adición y la pérdida de subunidades de tubulina. Algunas proteínas motoras se desplazan en ambas direccio nes a lo largo de los microtúbulos, transportando orgánulos membranosos específi cos hacia sus localizaciones determinadas en la célula. Los filamentos de actina son también estructuras dinámicas, pero normalmente forman haces o redes y no fila mentos simples. Una capa llamada córtex se forma justo debajo de la membrana plasmática a partir de los filamentos de actina y de una variedad importante de proteínas que se unen a la actina. Esta capa rica en actina controla la forma y los movimientos superficiales de la mayoría de las células animales. Los filamentos in termedios son relativamente resistentes, estructuras a modo de cuerdas que propor cionan una estabilidad mecánica a la células y tejidos. Los tres tipos de filamentos están interconectadosy sus funciones coordinadas.
Filamentos intermedios7 Los filamentos intermedios son fibras proteicas resistentes y duraderas que se encuentran en el citoplasma de la mayoría de las células eucariotas superiores. Reciben el nombre de “interm edios” porque en las micrografías electrónicas su diámetro aparente (8-10 nm) se encuentra entre el de los finos filamentos de actina y el de los gruesos filamentos de miosina de las células musculares, don de se descubrieron por vez primera (su diámetro es tam bién intermedio entre el de los filamentos de actina y el de los microtúbulos). En la mayoría de células animales, una extensa red de filamentos intermedios rodea al núcleo y se ex tiende desde esta zona hacia la periferia celular, donde interacciona con la m em brana plasm ática (Figura 16-12). Además, un armazón densamente tejido de filamentos intermedios -la lámina nuclear- se encuentra debajo de la envol tura del núcleo. Los filamentos intermedios son particularmente abundantes en las células que están sometidas a importantes tensiones mecánicas. Son muy abundantes, por ejemplo, en los epitelios, donde forman parte de las uniones especializadas entre dos células vecinas, a lo largo de los axones de las células nerviosas, y en todos los tipos de células musculares. Cuando las células se tratan con solucio-
852
Capítulo 16: El citoesqueleto
i_________! 20 litn
Figura 16-12 Filamentos intermedios en el citoplasm a de una célula de un tejido en cultivo. Se marcaron células epiteliales de rata canguro (células PtK2) en interfase, con anticuerpos contra uno de los tipos de filamentos intermedios (llamados queratinas) y se observaron al microscopio de fluorescencia. (Por cortesía de Mary Osborn.)
dominio central en hélice a
regiones que contienen las "secuencias en heptada" (heptad repeats)
nes salinas concentradas o bien con detergentes no iónicos, los filamentos inter medios se conservan mientras que los elementos restantes del citoesqueleto son solubilizados. De hecho, el término “citoesqueleto” se utilizó originalmente para describir a este sistema fibroso tan estable e insoluble.
Los filam entos intermedios son polímeros de proteínas fibrosas8 A diferencia de la actina y la tubulina, que son proteínas globulares, los tipos principales de monómeros proteicos de los filamentos intermedios son m olécu las fibrosas muy alargadas que tienen una cabeza amino terminal, una cola carboxilo terminal, y un dominio central a modo de varilla. Este dominio central consta de una región extensa de hélice a que contiene largos tándems repetidos de secuencias aminoacídicas distintas, que reciben el nombre de “repeticiones en heptada”. Como discutimos en el Capítulo 3, esta secuencia de 7 aminoácidos permite la formación de dímeros enrollados entre dos hélices a paralelas (véase Figura 3-48). Otros tipos de proteínas alargadas del citoesqueleto con estructu ras diméricas enrolladas, como por ejemplo la tropomiosina y la cola de la miosina, contienen largas tiras de repeticiones en heptada, como discutiremos más adelante. En la siguiente etapa del ensamblaje, dos de los dímeros enrollados interaccionan antiparalelamente formando un tetràmero (Figura 16-14). Se encuentran pequeñas cantidades de tetrámeros solubles en las células, lo cual sugiere que la subunidad tetramérica constituye la unidad fundamental para el ensam blaje de los filamentos intermedios. La disposición antiparalela de los dímeros implica que el tetràmero y, por consiguiente, el filamento que forma, es una estructura no polarizada -esto es, es la misma estructura en ambos extremos y es simétrica en toda su longitud. Esto distingue los filamentos intermedios de los microtúbulos y los filamentos de actina, que son estructuras polarizadas, cuya función de pende de esta polaridad. La etapa final del ensamblaje de los filamentos interm e dios no está aún completamente caracterizada, pero parece que los tetrámeros se añaden al filamento intermedio en crecimiento mediante una reacción de unión sencilla, alineándose a lo largo del eje del filamento y uniéndose siguiendo un patrón helicoidal (véase Figura 16-14). El dominio central a modo de varilla, cuya estructura es parecida en todos los tipos de filamentos intermedios, interviene en las interacciones laterales que forma el filamento ensamblado. Los dominios globulares de la cabeza y de la cola pueden variar significativamente tanto en el tamaño como en la secuencia de aminoácidos, sin que esto afecte la estructura axial básica del filamento; a menudo se proyectan desde la superficie del filamento e intervienen en las unio nes con otros componentes. Este diseño experimental implica la existencia de una sorprendente variedad de tamaños de las proteínas que los forman (desde 40 000 a 200 000 daltons). En la mayoría de células, casi todas las proteínas de los filamentos interm e dios se encuentran totalmente polimerizadas, con muy pocas subunidades te-
Filamentos intermedios
Figura 16-13 Organización de los dominios de los m onóm eros proteicos de los filamentos intermedios. La mayoría de las
proteínas de los filamentos intermedios disponen de una región central similar que tiene generalmente unos 310 aminoácidos y que forma una larga hélice a. Los dominios amino terminal y carboxilo terminal no presentan esta estructura en hélice a y son variables en cuanto a tamaño y secuencia en los distintos tipos de filamentos intermedios.
853
NH2
m
& m r'
0,5
COOH
48 nm ---------------------------------H
i'i i".F 1
COOH
nh2
COOH
(C)
COOH tetràm ero de dos dim eros sobreenrollados
COOH
10 nm traméricas libres. Sin embargo, una célula puede controlar el ensamblaje de sus filamentos intermedios y decidir su cantidad, longitud y posición. Uno de los mecanismos de control se basa en la fosforilación de residuos de serina en el do minio amino terminal de las proteínas de los filamentos intermedios. En un caso extremo, la fosforilación de las subunidades proteicas que forman la lámina nu clear provoca un desensamblaje total de los filamentos durante la mitosis; cuan do ésta termina, las serinas específicas son desfosforiladas y se produce la for mación de novo de la lámina nuclear (véase Figura 12-18). Los filamentos intermedios citoplasmáticos pueden sufrir también una reorganización radical durante la mitosis como respuesta a algún tipo de señal extracelular. Aunque es tos cambios suelen ir acompañados de un incremento en la fosforilación de las subunidades, otros factores pueden intervenir también en este proceso.
Las células epiteliales presentan una familia muy diversa de filamentos de queratina9 En las células de los vertebrados, los filamentos intermedios citoplasmáticos pueden agruparse en tres clases: ( 1) filamentos de queratina, (2) filamentos de vimentina y filamentos relacionados con la vimentina y (3) neurofilamentos, cada uno de los cuales está formado por la polimerización de sus correspondientes
854
Capítulo 16 : El citoesqueleto
Figura 16-14 Modelo habitual de ensamblaje de un filamento intermedio. El monómero mostrado en (A) se empareja con un monómero idéntico a él, formando un dimero (B), de forma que la región central -conservada- se alinea en paralelo y se empaqueta conjuntamente formando un sobreenrollamiento. Entonces, dos dímeros se alinean, lado contra lado, y forman un tetràmero antiparalelo de cuatro cadenas polipeptídicas (C). Dentro de cada tetràmero los dímeros están distanciados suficientemente uno con respecto a otro permitiendo la asociación con otro tetràmero, como puede observarse en (D). En el filamento intermedio final de 19 nm los tetrámeros están unidos formando un haz helicoidal (E). Se muestra una electronmicrografía del filamento final en el margen superior izquierdo. (Diagrama basado en datos de Murray Stewart; micrografia por cortesía de Roy Quinlan.)
T abla 16-1 Prin cip ales tipos de p ro teín as de filam entos in term ed ios en las células de los v erteb rad os Tipo de filam ento in term ed io
C om p onen te polipeptídico (m asa en daltons)
L ocalización celu lar
Láminas nucleares
lamininas A, B, y C (65 000 - 75 000)
lámina nuclear de las células eucariotas
vimentina (54 000) Proteínas relacionadas con la vimentina
muchas células de origen mesenquimático, a menudo expresada transitoriamente durante el desarrollo
Queratinas
desmina (53 000)
músculo
proteína glial acídica fibrilar (50 000)
células gliales (astrocitos y células de Schwann)
periferina (66 000)
neuronas
tipo I (ácidas) \ (40 000 - 70 000) 1 tipo II (neutras/básicas) | (40 000 - 70 000)
células epiteliales y sus derivados (p. ej., el pelo y las uñas)
J
Filamentos intermedios neuronales
proteínas de los neurofilamentos NF-L, NF-M y NF-H (60 000 - 130 000)
neuronas
subunidades proteicas (Tabla 16-1). La familia más diversa de subunidades pro teicas la constituyen las q u e ra tin a s (también llamadas citoqueratinas), que for man fila m e n to s d e q u e ra tin a , principalmente en las células epiteliales. Hay más de 20 tipos distintos de queratinas en los epitelios humanos. Al menos, otras 8 queratinas, llamadas queratinas duras, son específicas del pelo y de las uñas. (Las queratinas de las células epiteliales, pelo, y uñas reciben también el nombre de a-queratinas para distinguirlas de las p-queratinas, evolutivamente distintas, que se encuentran en las plumas de las aves y que presentan una estructura to talmente distinta que no discutiremos en este capítulo). Las queratinas se subdividen en dos tipos, si nos basamos en su secuencia de aminoácidos: queratinas del tipo I (ácidos) y queratinas del tipo II (neutras/bási cas). Mediante experimentos de reensamblaje se ha encontrado que los heterodímeros formados por queratinas del tipo I y del tipo II pueden formar filamentos mientras que los homodímeros no los forman, hecho que permite explicar por qué los filamentos de queratina son siempre heteropolímeros formados por la misma cantidad de polipéptidos de queratina del tipo I y del tipo II. Cualquier célula epitelial puede disponer de una gran variedad de querati nas, todas ellas copolimerizando en un único sistema filamentoso de queratina. Los epitelios más simples, como los que encontramos en los embriones tempra nos o en algunos tejidos adultos como por ejemplo el hígado, disponen de un solo tipo de queratina del tipo I y uno solo también de queratina del tipo II. Otros epitelios, como el de la lengua, el de la vejiga, y el de las glándulas sudorí paras, contienen 6 o más tipos de queratinas -cuya combinación particular de pende de la localización de la célula dentro del órgano. Esta diversidad es aún más pronunciada en la piel, donde en las células de las distintas capas de la epi dermis se expresan mediante distintos tipos de queratinas (véase Figura 22-19). Existen también queratinas que son características de los epitelios en prolifera ción. Esta heterogeneidad de queratinas es muy útil clínicamente: en el diagnós tico de los cánceres epiteliales (carcinomas ), el tipo concreto de queratinas que se expresa puede ser utilizado para determinar el tejido epitelial a partir del cual se ha originado el tumor, lo cual puede servir de ayuda en el momento de deci dir el tipo de tratamiento que resultará más efectivo.
Filamentos intermedios
855
Muchas células no epiteliales presentan sus propios filamentos intermedios citoplasm áticos diferenciales10 A diferencia de las queratinas, la vimentina y las proteínas relacionadas con la vi mentina, pueden formar filamentos intermedios que son polímeros de un único tipo de especie proteica. La vimentina es la proteína de los filamentos interm e dios citoplasmáticos más abundante y se encuentra en la mayoría de células de origen mesodérmico, incluyendo fibroblastos, células endoteliales, y células sanguíneas de la línea blanca; además muchas células expresan la vimentina transitoriamente durante el desarrollo. La desmina se encuentra principalmente en las fibras musculares: se encuentra distribuida por todo el citoplasma de las fibras musculares lisas, y se une a las miofibrillas adyacentes (haces ordenados de actina y miosina filamentosas que discutiremos más adelante) en las fibras del músculo esquelético y cardíaco. La proteína glial acídica fibrilar forma los fi lamentos gliales en los astrocitos del sistema nervioso central y en algunas célu las de Schwann de los nervios periféricos (Figura 16-15). Todas estas proteínas pueden polimerizar correctam ente entre ellas; en algunos tipos celulares adul tos se han encontrado copolímeros formados por vimentina y por proteínas re lacionadas con la vimentina. Por el contrario, ninguna de estas proteínas copolimeriza con las queratinas: cuando queratinas y proteínas relacionadas con la vimentina se expresan en la misma célula, forman sistemas filamentosos inde pendientes. Las células nerviosas disponen de una variedad única de filamentos inter medios, que se expresan en distintas regiones del sistema nervioso central en es tadios específicos del desarrollo. Los neurofilamentos son los más abundantes; se extienden a lo largo del axón y forman su componente citoesquelético prima rio, especialmente en las células nerviosas maduras. En los mamíferos, se han descrito tres tipos de proteínas de los neurofilamentos : llamadas NF-L, NF-M y NF-H, debido a diferencias en su peso molecular (L de bajo, “low”, M de medio, “middle” y H de alto, “high”, respectivamente). Normalmente los tres tipos de proteínas se encuentran en cada neurofilamento. NF-M y NF-H tienen largas co las carboxilo terminales; se cree que se proyectan desde el eje del neurofilamen to y contribuyen a regular el espaciamiento lateral de los neurofilamentos en el axón (Figura 16-16). Si marcamos una célula en cultivo con un anticuerpo contra las proteínas de los filamentos intermedios del citoplasma, podremos observar una red deli cada de filamentos fibrosos que envuelve el núcleo y se extiende a través del ci toplasma hasta la m em brana plasmática (véase Figura 16-12). En las células epi-
Figura 16-15 Micrografía de inmunofluorescencia de filamentos gliales en astrocitos cultivados. Los haces de filamentos intermedios {verde) se han marcado con anticuerpos contra la proteína glial acídica fibrilar. Los núcleos se han marcado con un colorante azu l de unión al DNA. (Por cortesía de Nancy L. Kedersha.)
100
856
Capítulo 16: El citoesqueleto
|jm
, «•■».•'7—. . . "T1
::v.
microtúbulos
teliales, los filamentos de queratina están unidos a las uniones celulares espe cializadas -lo s desmosomas que unen células vecinas y los hemidesmosomas, que unen las células a la lámina basal (se discuten en el Capítulo 19). Dado que en cada célula los filamentos de queratina están conectados a través de los des mosomas con las células vecinas, forman una red continua a través de todo el epitelio (Figura 16-17). De forma parecida, los filamentos de desmina se en cuentran a menudo anclados en las uniones celulares especializadas de las fi bras musculares.
La lám ina nuclear está constituida por un tipo especial de proteínas de filam entos intermedios: las lam ininas11 La lám ina nuclear es una red proteica que limita la superficie interna de la mem brana nuclear interna en las células eucariotas (Figura 16-18). Presenta un grosor típico de 10-20 nm y está interrumpida en la zona de los poros nucleares, permitiendo la libre entrada y salida de macromoléculas del núcleo. En los m a míferos la lámina nuclear está formada por las lamininas, proteínas homólogas a las de los filamentos intermedios, de las cuales difieren al menos en cuatro puntos: (1) el dominio central en forma de varilla es algo más largo (véase Figura
!------------------- 1 20 [im Filamentos intermedios
neurofilamentos
Figura 16-16 Electronm icrografías de dos tipos de filamentos intermedios en células del sistem a nervioso. (A) Imagen de neurofilamentos preparados mediante congelación rápida y sublimación profunda de un axón de una célula nerviosa, mostrando el extraordinario entrecruzamiento de los haces a través de puentes de proteína -u n a configuración que probablem ente proporciona una gran resistencia a la tensión en este largo apéndice celular. Las uniones cruzadas están formadas por largas extensiones no helicoidales dei extremo carboxilo terminal de las proteínas más grandes del neurofilamento. (B) Imagen de filamentos gliales en una célula glial obtenida mediante congelación rápida y sublimación profunda ilustrando que estos filamentos son lisos y tienen menos puentes cruzados. (C) Electromicrografía convencional de un corte de un axón que muestra la distancia de separación regular de los neurofilamentos, mucho más abundantes que los microtúbulos. (A y B, por cortesía de Nobutaka Hirokawa; C, por cortesía de John Hopkins.)
Figura 16-17 Los filamentos de queratina m antienen unidas las células, formando las capas celulares. Micrografía de inmunofluorescencia de una red de filamentos de queratina en una m onocapa de células epiteliales en cultivo. Los filamentos de cada célula están conectados indirectamente con los de las células vecinas, a través de los desmosomas. (Por cortesía de Michael Klymkowsky.)
857
com plejo del poro nuclear
CITOSOL
m em brana nuclear
lám ina nuclear NUCLEO
Figura 16-18 La lám ina nuclear. (A) Dibujo esquemático que muestra la lámina nuclear a través de un corte en la región del poro nuclear. La lámina está asociada con la cromatina y con la membrana nuclear interna. (B) Electronmicrografía de una porción de la lámina nuclear de un oocito de rana preparado por liofilización y sombreado metálico. La lámina está formada por una red cuadrangular altamente organizada de filamentos intermedios, compuesta por lamininas nucleares (no siempre tan altamente organizada com o aquí se presenta). (C) Electronmicrografía de dímeros aislados de laminina, sombreados m etálicam ente (marcados como L). Presentan una forma general sem ejante a la miosina muscular (marcados com o M), con una cola en forma de varilla y dos cabezas globulares. Sin embargo, son mucho menores que las moléculas de miosina. Las cabezas globulares están formadas por los dos largos dominios carboxilo terminales. (B y C, por cortesía de Ueli Aebi).
16-13). (2) Presentan una señal de transporte hacia el núcleo que las dirige desde el citosol, donde son sintetizadas, hasta el núcleo. (3) Se ensamblan formando una red bidimensional parecida a una lámina y necesitan de la asociación de otras proteínas para el ensam blaje. (4) La red que forman es extraordinariamen te dinámica y rápidamente se produce el desensamblaje al iniciarse la mitosis y el reensam blaje cuando ésta ha terminado; como ya hemos mencionado, el des ensam blaje y reensam blaje vienen determinados por la fosforilación y desfosfo rilación de algunos residuos de serina en las lamininas. A diferencia de los microtúbulos y de los filamentos de actina, que se en cuentran en todas las células eucariotas, los filamentos intermedios citoplasmáticos han sido descritos sólo en animales pluricelulares, y en ellos no son nece sarios en cada uno de los tipos celulares que los forman. Por ejemplo, las células gliales especializadas del sistema nervioso central que fabrican mielina no dis ponen de filamentos intermedios. Además, si desorganizamos los filamentos in termedios de fibras musculares, fibroblastos o células epiteliales en cultivo, no se produce ningún efecto en el comportamiento celular. Parece ser que la primera clase de proteínas de los filamentos intermedios que apareció en la evolución fueron las lamininas nucleares y los diversos tipos de filamentos intermedios citoplasmáticos aparecieron más adelante como adaptaciones de esta forma primitiva. Las proteínas de los filamentos interm e dios en los invertebrados, por ejemplo, se parecen mucho más a las lamininas que a las proteínas de los filamentos intermedios citoplasmáticos de los verte brados.
Los filam entos intermedios proporcionan estabilidad m ecánica a las células anim ales12 Cada día disponemos de mayor número de evidencias de que la función princi pal de los filamentos intermedios es la de soportar la tensión mecánica. En la enfermedad genética humana epidermolisis hullosa simple, las mutaciones en los genes de las queratinas que se expresan norm alm ente en la capa basal de la epidermis desorganizan la red de filamentos de citoqueratina en estas células, transformándolas en células extremadamente sensibles a las lesiones m ecáni cas: una ligera presión puede provocar la rotura de las células basales mutantes, y la piel se llena de ampollas en la zona afectada. Podemos provocar una situa ción parecida en monos transgénicos que expresan queratinas mutantes de este tipo (Figura 16-19). Tanto en humanos com o en monos la epidermis puede ser
858
Capítulo 16 : El citoesqueleto
célula basal de la epiderm is
(A)
I_____ | 40 jim
(B)
tan frágil que el individuo mutante puede morir por un trauma mecánico. Se cree que los filamentos intermedios citoplasmáticos juegan un papel semejante en las células no epiteliales. La estructura que presentan los filamentos intermedios es la ideal para de sarrollar este tipo de funciones mecánicas. Las subunidades fibrosas se asocian de manera paralela formando haces superpuestos, lo cual les permite resistir tensiones mecánicas mucho más intensas que las que resisten los microtúbulos o los filamentos de actina (Figura 16-20). En la piel, los filamentos de queratina de las capas más 'externas de la epidermis se entrecruzan covalentemente entre sí y con proteínas asociadas, y a medida que las células de la capa exterior van muriendo, las queratinas entrecruzadas persisten como la parte principal de la capa protectora externa del animal. Las células epiteliales especializadas de lu gares específicos de la piel proporcionan variaciones regionales, y generan apéndices superficiales tales como los pelos y las uñas. Sin embargo, si la función de los filamentos intermedios es simplemente la de resistir las tensiones m ecánicas en las células y tejidos, ¿por qué existen tan tos tipos de subunidades proteicas? Además, ¿cuál es la función de los dominios variables de la cabeza y de la cola de estas proteínas? En la actualidad estas pre guntas no pueden contestarse detalladamente, pero está claro que la manera en que los filamentos intermedios se unen a otros componentes de la célula varia de un tipo celular a otro. Los filamentos de desmina que unen entre sí los bordes de las miofibrillas en las células del músculo esquelético deben presentar luga res de unión para proteínas específicas asociadas a las miofibrillas. Los neurofilamentos en los axones están unidos entre sí a través de sus dominios carboxilo terminales y forman un haz continuo de filamentos, a modo de cuerda de un metro o más de longitud. Algunas queratinas están especializadas en la forma-
Figura 16-19 Aparición de ampollas en la piel provocadas por un gen mutante de queratina. Un gen mutante que codifica una queratina truncada (sin dominios amino y carboxilo terminales) ha sido expresado en un ratón transgénico. La proteína defectuosa se ensambla con las moléculas de queratina normales y desorganiza la red de filamentos de queratina en las capas celulares basales. Micrografías ópticas de piel normal (A) y mutante (B) muestran que las ampollas se producen a partir de la ruptura de las células en la capa basal de la epidermis mutante. El dibujo en (C) de tres células de la capa basal de la epidermis mutante observadas mediante microscopía electrónica muestra que las células se rompen entre el núcleo y los hemidesmosomas, que conectan los filamentos de queratina con la lámina basal subyacente. (De PA. Coulombe, M.E. Hutton, R. Vassar y E. Fuchs, J. Cell Biol. 115:1661-1674,1991, reproducido con permiso de copyright de The Rockefeller University Press.)
Figura 16-20 Propiedades m ecánicas de los polímeros de actina, tubulina y vimentina. Redes formadas por microtúbulos o filamentos de actina o filamentos de vimentina, todas a la misma concentración, fueron expuestas a una fuerza en un viscómetro, y se calculó el grado de tensión resultante. Los resultados muestran que la red de microtúbulos se deforma fácilmente pero que cuando la tensión sobrepasa el 50% de su longitud original (indicada mediante la estrella roja q u e estalla) se rompen y empiezan a fluir sin límite. Los filamentos de actina son mucho más rígidos, pero se rompen fácilmente. Las redes de vimentina, al contrario, se deforman fácilmente, pero a diferencia de los microtúbulos, soportan tensiones y esfuerzos muy grandes sin romperse. Los filamentos de vimentina son muy necesarios para el mantenimiento de la integridad celular. (Adaptado de P. Jamney et al., /. Cell Biol. 113:155-160,1991, reproducido con permiso de copyright de The Rockefeller University Press.)
Filamentos intermedios
85 9
ción de la capa extem a protectora de la piel, dura y resistente, mientras que otras simplemente mantienen las tensiones que sufren los epitelios en los cam bios de forma que se producen durante la morfogénesis. Estas funciones dife renciales han de ser desarrolladas por las regiones variables de las distintas pro teínas de los filamentos intermedios, que se proyectan desde la superficie del filamento y determinan su capacidad de unión a otros com ponentes de la célula. En este sentido, las regiones variables de las proteínas de los filamentos interme dios realizan funciones parecidas a las de las proteínas accesorias de los fila mentos de actina y de los microtúbulos. La diferencia estriba en que las regiones variables son parte integral de la subunidad del filamento intermedio mientras que las otras constituyen una proteína independiente.
Resumen Los filamentos intermedios son fuertes polímeros de polipéptidos fibrosos, a modo de cuerda, que resisten tensiones y desempeñan un papel estructural o mecánico en la célula. Se conocen distintasformas específicas de filamentos intermedios que di fieren en el tipo de polipéptido que los form a: entre las que se encuentran los fila mentos de queratina de las células epiteliales, los neurofilamentos de las células nerviosas, los filamentos gliales de los astrocitos y las células de Schwann, los fila mentos de desmina de lasfibras musculares, y losfilamentos de vimentina de losfi broblastos y de otros muchos tipos celulares. Las lamininas nucleares, que forman la lámina fibrosa subyacente a la envoltura nuclear, son una familia diferente de proteínas de losfilamentos intermedios. Los monómeros de los distintos tipos de filamentos intermedios tienen secuen cias de aminoácidos distintas y difieren en sus pesos moleculares. Sin embargo, to dos ellos presentan un dominio central homólogo que, cuando dimeriza, forma una estructura de sobreenrollamiento rígido. Estas subunidades diméricas se aso cian unas con otras formando tetrámeros simétricos, los cuales se ensamblan en haces superpuestos formando el filamento intermedio no polarizado. Los dominios fibrosos de las subunidades forman el eje estructural de losfilamentos intermedios, mientras que los dominios globulares se proyectan hacia el exterior. Una función de estos dominios variables puede ser la de permitir a cada tipo de filamento inter medio la asociación con otros componentes específicos de la célula y la de posicionar estosfilamentos en el lugar adecuado dentro de la célula.
Microtúbulos13 Los microtúbulos, como hemos visto, son polímeros largos y rígidos que se ex tienden a través del citoplasma y dirigen la localización de los orgánulos delimi tados de membrana y de otros com ponentes celulares. En este apartado discuti remos el ensam blaje de estas importantes estructuras a partir de moléculas de tubulina y explicaremos cóm o su polimerización y despolimerización está con trolada por el nucleótido GTP. A continuación examinaremos cómo algunos mi crotúbulos previamente seleccionados son estabilizados en la célula mediante su asociación a proteínas accesorias específicas. Finalmente, discutiremos la im portancia de los motores dependientes de microtúbulos que transportan vesícu las m em branosas y diversos com plejos proteicos a lo largo de los microtúbulos.
Los microtúbulos son cilindros huecos formados por tubulina14 Los microtúbulos están constituidos por moléculas de tu b u lin a , cada una de las cuales es un heterodímero formado por dos subunidades globulares fuertemen te unidas entre sí, llamadas a-tubulina y fi-tubulina. Aunque la tubulina está presente en casi todas las células eucariotas, la fuente más abundante para los estudios bioquímicos es el cerebro de los vertebrados. Los procedimientos de extracción recuperan de un 10 a un 20% de la proteína soluble total del cerebro
860
Capítulo 16: El citoesqueleto
Figura 16-21 Microtúbulos. (A) Electronmicrografía de un microtúbulo visto en sección transversal, con su anillo de 13 subunidades, cada una de las cuales corresponde a una molécula de tubulina diferente (un heterodímero a/(3). (B) Crioelectronmicrografía de un microtúbulo ensamblado in vitro. (C y D) Diagramas esquemáticos de un microtúbulo, en los que se muestra la forma en que las moléculas de tubulina se empaquetan entre sí formando la pared cilindrica. (C) muestra las 13 moléculas vistas en sección transversal. (D) muestra una visión lateral de una corta sección de un microtúbulo, con las moléculas de tubulina alineadas formando largas hileras paralelas o protofilam en tos. Cada uno de los 13 protofilamentos está compuesto por series de moléculas de tubulina, cada una de las cuales es un heterodímero a/|3. Un microtúbulo es una estructura polar, ya que cada uno de sus extremos tiene una molécula de tubulina (a o (3) diferente. (A, por cortesía de Richard Linck; B, por cortesía de Richard Wade; D, dibujado a partir de datos proporcionados por Joe Howard.)
en forma de tubulina, lo cual refleja la elevada y poco usual densidad de m icro túbulos que existe en los apéndices alargados de las células nerviosas. Las moléculas de tubulina, en sí mismas, son diversas. En los mamíferos existen com o mínimo seis formas de a-tubulina y un número parecido de for mas de (3-tubulina, cada una de las cuales está codificada por un gen distinto. Las distintas formas de tubulina son muy parecidas, y todas ellas copolimerizan en ensayos in vitro, formando un mismo microtúbulo, aunque pueden encon trarse en distintas regiones de la célula y llevar a cabo funciones sutilmente dis tintas. Por ejemplo, en seis neuronas especializadas que presentan sensibilidad por contacto del nemátodo Caenorhabditis elegans, los microtúbulos están for mados por una forma específica de P-tubulina; las mutaciones en el gen que co difica esta proteína implican la pérdida de la sensibilidad por contacto específi ca, sin ningún efecto aparente en otras funciones celulares. Un microtúbulo puede ser considerado como una estructura cilindrica en la cual los heterodímeros de tubulina están empaquetados alrededor de un núcleo central, que aparece vacío en las micrografías electrónicas. De una forma quizás más detallada, uno puede observar cómo esta estructura se construye a partir de 13 protofilamentos lineales, cada uno de los cuales está formado por subunida des alternadas de a- y P-tubulina, dispuestos paralelamente formando un cilin dro (Figura 16-21). Dado que los 13 protofilamentos están alineados en paralelo con la misma polaridad, los microtúbulos son estructuras polares, y es posible distinguir un extremo más (de crecimiento rápido) y un extremo menos (de cre cimiento lento).
,A}
25 nm
molécula de tubulina
Los microtúbulos son estructuras muy lábiles, sensibles a drogas antim itóticas específicas15 Muchas de las disposiciones de los microtúbulos celulares son lábiles y esta labi lidad es imprescindible para que puedan desarrollar su función. Uno de los ejemplos más notables de este hecho es el huso mitótico, que se forma después del desensamblaje de los microtúbulos al comienzo de la mitosis. El huso mitóti co es la diana de una gran variedad de drogas antimitóticas específicas que actúan interfiriendo en el recambio entre las subunidades de tubulina de los m icrotú bulos y el acervo de tubulina libre. Una de estas drogas es la colchicina (Figura 16-22), alcaloide que se extrae del azafrán silvestre y que ha sido utilizada como planta medicinal para el tratamiento de la gota desde la época de los antiguos egipcios. Cada molécula de colchicina se une fuertemente a una molécula de tu bulina e impide su polimerización, pero no puede unirse a la tubulina una vez la tubulina ha polimerizado formando un microtúbulo. La exposición de una célu la en división a la colchicina, o a la colcemida, droga íntimamente relacionada con ella, produce una desaparición rápida del huso mitótico, e indica que el equilibrio químico se mantiene mediante el recambio continuo de subunidades
Microtúbulos
861
entre los microtúbulos del huso mitótico y el acervo de tubulina libre. Debido a que la interrupción temporal de los microtúbulos del huso mitótico provoca preferentemente la muerte de células que se dividen de forma anormal, las dro gas antimitóticas, como la vinblastina y la vincristina (cuyos efectos son pareci dos a los de la colchicina), han sido ampliamente utilizadas en el tratamiento del cáncer. La droga taxol (Figura 16-22), que se extrae de la corteza del tejo, tiene un efecto opuesto. Se une fuertemente a los microtúbulos y los estabiliza; cuando se añade a células, provoca que m uchas de las moléculas de tubulina libre se en samblen formando microtúbulos. La estabilización de los microtúbulos con ta xol detiene la mitosis de las células en división, lo cual indica que durante la mitosis los microtúbulos deben ser capaces no sólo de polimerizar sino tam bién de despolimerizar. El taxol ha sido tam bién ampliamente utilizado como droga an ticancerosa.
El alargam iento de un microtúbulo es un proceso rápido, m ientras que la nucleación de un nuevo microtúbulo es un proceso lento16 La polimerización y despolimerización de los microtúbulos es com pleja e inter viene en procesos interesantes con importantes papeles biológicos. Una buena parte de los conocim ientos actuales acerca del comportamiento dinámico de los microtúbulos ha sido obtenida en estudios de polimerización in vitro a partir de moléculas de tubulina purificadas. La tubulina pura polimeriza a 37°C en el tubo de ensayo, formando microtúbulos, siempre y cuando estén presentes tanto Mg2+ com o GTP. Si seguimos la polimerización ya sea midiendo la luz dispersada o a través del microscopio, podremos observar una fase inicial (fase lag), des pués de la cual los microtúbulos se forman rápidamente hasta llegar a un nivel de polimerización determinado. La fase inicial se produce porque es mucho más fácil añadir moléculas de tubulina a un microtúbulo existente, proceso llamado alargamiento, que iniciar un nuevo microtúbulo de novo, proceso llamado nu
cleación. Durante la fase de polimerización rápida, las concentraciones elevadas de tubulina libre provocan que la polimerización de los microtúbulos sea más rápi da que la despolimerización (véase más adelante). Sin embargo, cuando se ha lle gado al nivel de polimerización más elevado, no toda la tubulina habrá polimerizado puesto que las subunidades se están disociando (despolimerizando) a partir de los extremos de los microtúbulos y, al mismo tiempo, añadiéndose a ellos. La velocidad de polimerización decae con el tiempo porque es proporcional a la concentración de tubulina libre; la concentración de tubulina libre en el nivel más alto, en el cual las velocidades de polimerización y despolimerización se en cuentran en equilibrio, recibe el nombre de concentración crítica (Figura 16-23). Al iniciar este capítulo vimos que normalmente en una célula los microtú bulos crecen a partir de un lugar específico de nucleación (generalmente el cen862
Capítulo 16: El citoesqueleto
Figura 16-22 Estructuras químicas de la colchicina y del taxol. La colcemida, una tercera droga, está íntimamente relacionada con la colchicina y en ella el grupo que se muestra en a m a r illo está substituido por un -C H 3. Se une a la tubulina, pero a diferencia de la colchicina, su unión es fácilmente reversible.
a la rg a m ie n to
100
estado estacion a rio
m icrotùbulo con subunidades entrando y saliendo
m icrotùbulo en crecim iento =¡ -O 3 _Q 3 '=J T3 U subunidades ss'E
individuales
0 - 8‘
coco
' ¿d cP oligóm eros tiem po a 37°C
trosoma); puesto que existe una barrera cinética para la nucleación en solución, la polimerización de la tubulina se produce únicamente en este lugar. Como en el tubo de ensayo, no toda la tubulina de la célula se encuentra polimerizada. Una fibroblasto típico dispone aproximadamente de una concentración de tu bulina 20 micromolar (2 mg/ml), de la cual un 50% está en los microtúbulos y el 50% restante se encuentra libre.
Figura 16-23 Polimerización de tubulina pura. Una mezcla de tubulina, tampón y GTP se coloca a 37°C en el tiempo cero. La cantidad de microtúbulo polimerizado, medida mediante dispersión de luz, sigue una curva sigmoidal. Durante la fase inicial (fase lag) las moléculas individuales de tubulina se asocian formando agregados metaestables, algunos de los cuales continúan y nuclean microtúbulos. La fase lag refleja una barrera cinética para este proceso de nucleación. Durante la fase rápida de alargamiento, las subunidades se añaden a los extremos libres de los microtúbulos existentes. Durante la fase de meseta, la polimerización y la despolimerización están en equilibrio ya que la cantidad de tubulina libre ha llegado al punto en que se ha conseguido la con cen tración crítica. Para simplificar, las subunidades que se añaden y que se pierden de un microtúbulo se muestran siempre en el mismo extremo.
Los dos extremos de un microtúbulo son diferentes y crecen a velocidades diferentes17 La polaridad estructural de un microtúbulo, reflejo de la orientación regular de las subunidades de tubulina, hace que los dos extremos del polímero sean dis tintos, lo cual tiene un efecto profundo en su velocidad de crecimiento. Si se permite que moléculas de tubulina purificada polimericen durante un corto pe-
microtúbulo formado
í/e novo
extremo, “ más"
Figura 16-24 Electronm icrografía que m uestra la polimerización preferencial de tubulina en los extrem os “m ás” de los microtúbulos. Un haz estable de microtúbulos obtenido del núcleo de un cilio (se discute más adelante) se incuba con subunidades de tubulina en condiciones de polimerización. Los microtúbulos crecen más rápidamente en el extremo “m ás” del haz de microtúbulos (extremo que se encuentra sobre el haz en esta figura). (Por cortesía de Gary Borisy.)
extrepio “ monos".
Microtúbulos
863
Figura 16-25 Polaridad de los microtúbulos puesta de manifiesto por el método de “decoración con ganchos”. En esta electronmicrografía todos los microtúbulos (vistos en sección transversal) tienen la misma orientación. Los pequeños ganchos, formados por la tubulina que se ha añadido, se curvan siguiendo el sentido de las agujas del reloj, lo cual indica que los microtúbulos se están observando desde el extremo “m ás” hacia el extremo “m enos”. La polaridad de los microtúbulos también se puede determinar mediante la decoración con moléculas de dineína (no se muestra aquí). (Por cortesía de Ursula Euteneuer.)
ríodo de tiempo en los extremos de fragmentos de microtúbulos estables y en tonces se examina la mezcla al microscopio electrónico puede observarse que un extremo se alarga al menos a una velocidad tres veces superior a la del otro (Figura 16-24). Por ello, el extremo de crecimiento rápido se definió entonces como el extrem o m ás y el otro como el extrem o m enos. Es posible detectar la polaridad de los microtúbulos en sección transversal añadiendo moléculas de tubulina libre a microtúbulos preexistentes: en condi ciones especiales los monómeros de tubulina no se incorporan a los extremos de los microtúbulos sino a los lados, formando láminas de protofilamentos curva dos. Estas láminas observadas en sección transversal parecen pequeños ganchos y, dependiendo de la orientación del microtúbulo, siguen la misma dirección de las agujas del reloj o van en sentido contrario (Figura 16-25). De esta forma se ha demostrado que en una célula, los extremos más de los microtúbulos se extien den a partir de los lugares de nucleación de los microtúbulos como por ejemplo el centrosoma, los polos del huso mitótico o el corpúsculo basal de un cilio (Fi gura 16-26).
0,2 Jim
célula en interfase
Los centrosomas son el lugar primario de nucleación de los microtúbulos en las células animales18 En el citoplasma de una célula interfásica podemos observar los microtúbulos mediante tinción de la célula con anticuerpos anti-tubulina fluorescentes, des pués de que las células hayan sido fijadas. Se observa una elevada densidad de microtúbulos alrededor del núcleo, desde donde irradian hacia la periferia celu lar, en forma de finas hebras (Figura 16-27). El origen de los microtúbulos se púede observar claramente si éstos se despolimerizan primero con colcemida y luego se permite su repolimerización después del lavado de la droga. Los nuevos microtúbulos crecen a partir del centrosoma y forman una estructura con apa riencia de estrella llamada áster y entonces se alargan hacia la periferia celular hasta que se restablece su distribución inicial (Figura 16-28). Si los microtúbulos de células en cultivo se “decoran” con ganchos de tubulina para determinar su polaridad, se observa que todos tienen sus extremos “m ás”, alejado del centroso ma, lo cual indica que este centro organizador tiene la capacidad de nuclear la polimerización de los microtúbulos con una polaridad específica. En la mayoría de células animales el centrosom a es el centro organizador de microtúbulos más importante. Durante la interfase se localiza en la proximidad del núcleo, muy cercano a la superficie externa de la envoltura nuclear. Inmer sas en el centrosom a se encuentran un par de estructuras cilindricas, dispuestas en ángulo recto una respecto a otra, en un configuración en forma de L. Son los centríolos, que discutiremos más adelante. El centrosoma se duplica y se divide en dos partes iguales durante la interfase de manera que cada mitad contiene un
centrosom a célula ciliada cilio/flagelo
corpúsculo basal
célula en división
centrosom a Figura 16-26 Orientación de los microtúbulos en las células. Normalmente los extremos “m enos” de los microtúbulos se hallan embebidos en un centro organizador de microtúbulos, mientras que los extremos “m ás” se hallan cerca de la m embrana plasmática.
864
Capítulo 16 : El citoesqueleto
polo del huso
Figura 16-27 Distribución interfásica de los microtúbulos en un fibroblasto en cultivo. Los microtúbulos (en verde) han sido marcados con un anticuerpo contra la tubulina; el núcleo celular (en azul) se ha marcado con un colorante fluorescente que se une al DNA. (Por cortesía de Nancy L. Kedersha.)
10 |jm
par de centríolos duplicados. Estos dos centrosomas hijos se dirigen hacia lados opuestos del núcleo al empezar la mitosis, y forman los dos polos del huso mitótico (véase Figura 18-5). Durante la interfase y la metafase se distingue una región de citoplasma mucho más oscura rodeando cada par de centríolos; en las mejores electronmicrografías se puede distinguir en esta región una red de pequeñas fibras (Figura 16-29A). Es el m aterial pericentriolar, o m atriz del centrosom a, y es la región del centrosom a que nuclea la polimerización de los microtúbulos. La com posi ción proteica de la matriz del centrosoma sólo es parcialmente conocida, igual que el m ecanismo a partir del cual se produce la nucleación de los microtúbu los. Sin embargo, sabemos que está formada por proteínas específicas del cen trosoma, incluyendo una forma minoritaria de la tubulina, llamada y-tubulina (Figura 16-29B), que puede interactuar con el dímero a/p-tubulina colaborando en la nucleación de los microtúbulos. No todos los centros organizadores de microtúbulos contienen centríolos. En las células mitóticas de plantas superiores, por ejemplo, los microtúbulos terminan en regiones electrodensas pobrem ente definidas, completamente des provistas de centríolos. El huso meiótico de los oocitos de ratón tampoco pre senta centríolos, aunque éstos aparecen más tarde en el embrión en desarrollo. En hongos y diatomeas el centro organizador de microtúbulos es una placa lla mada corpúsculo polar del huso, que se encuentra en la envoltura nuclear. A pe sar de las diferencias morfológicas (Figura 16-30), todos los centros organizado res contienen una matriz que nuclea la polimerización de los microtúbulos, y que norm alm ente está formada por y-tubulina y otras proteínas específicas del centrosoma. Así pues, parece que el m ecanismo molecular de la nucleación de los microtúbulos se ha conservado notablem ente durante la evolución.
Figura 16-28 Microtúbulos creciendo a partir del centrosoma después de retirar la colcemida. Micrografías de inmunofluorescencia que muestran la distribución de los microtúbulos en células cultivadas, detectados mediante tinción con anticuerpos contra tubulina. En (A) se muestra una célula normal de un tejido en cultivo. Las células que se muestran en (B) fueron tratadas con colcemida durante 1 hora para despolimerizar sus microtúbulos, y posteriormente se permitió que se recuperaran; los microtúbulos aparecen en primer lugar en una estructura en forma de estrella, y luego se alargan hacia la periferia de la célula. (A, por cortesía de Eric Karsenti y Marc Kirschner; B, de M. Osborn y K. Weber, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 73:867-871, 1976.)
Microtúbulos
20 iim 865
Figura 16-29 La matriz del centrosoma. (A) Electronmicrografía
ZOO nm
En las células animales los microtúbulos se despolimerizan y repolimerizan continuamente19
de un centrosoma en una preparación purificada. La matriz envuelve un centríolo en forma de barril y aparece com o un material fibroso que contiene gránulos finos. (B) Micrografía óptica de una célula humana dividiéndose en cultivo, teñida con un anticuerpo contra la P-tubulina (verde) y con un anticuerpo contra la y-tubulina (rojo), una proteína que se localiza en el centrosom a de las células de una gran variedad de organismos. La superposición del mareaje rojo y verde provoca que las regiones que contienen la y-tubulina en los polos del huso sean amarillas. (A, cortesía de Stephen Fuller; B, cortesía de M. Katherine Jung y Berl R. Oakley.)
En una célula, com o por ejemplo un fibroblasto en cultivo, se produce un re cambio continuo de la red de microtúbulos. La vida media de un microtúbulo individual es aproximadamente de 10 minutos, mientras que la vida media de una molécula de tubulina, desde su síntesis hasta su degradación proteolítica, es de más de 20 horas. Así pues cada molécula de tubulina participa en la forma ción y desmantelamiento de muchos microtúbulos durante su período de vida, proceso que puede ser estudiado mediante la observación directa de células vi vas. Así por ejemplo, a una célula podemos inyectarle tubulina que ha sido uni da covalentemente a un colorante fluorescente y seguir, utilizando un m icrosco pio de fluorescencia, el comportamiento de los microtúbulos que incorporan la tubulina marcada. Alternativamente, en algunas células muy extendidas los mi crotúbulos pueden observarse directamente, sin necesidad de ningún tipo de mareaje, utilizando la microscopia de contraste interferencial-diferencial vídeo amplificada (véase Figura 4-12). Cuando se sigue el comportamiento de los mi crotúbulos m ediante alguno de estos métodos, se observa un fenómeno impor tante. Los microtúbulos individuales crecen hacia la periferia celular a una velo cidad constante durante un cierto período de tiempo y entonces de repente se
Figura 16-30 Un centro organizador de microtübulos en una célula de un hongo. Electronmicrografía del corpúsculo polar del huso en la levadura. (Cortesía de John Kilmartin.)
866
Capítulo 16: El citoesqueleto
Figura 16-31 Dinámica de los microtúbulos en una célula viva. Se ha inyectado tubulina a un fibroblasto, que ha sido ligada covalentemente a rodamina, de manera que aproximadamente una subunidad de tubulina de cada 10 de la célula está marcada con el colorante fluorescente. Se observa entonces la fluorescencia en un extremo de la célula mediante un sistema de imagen electrónica extremadamente sensible. Debajo de las micrografias se muestran trazos que permiten ver los microtúbulos seleccionados más detalladamente. Podemos observar, por ejemplo, cómo el microtúbulo 1 crece primero y luego se acorta rápidamente, mientras que el microtúbulo 4 crece continuamente. (De P.J. Sammaky G.C. Borisy, Nature 332:724-736,1988. © 1988 Macmillan Joumals Ltd.)
acortan rápidamente hacia el centrosoma. Pueden acortarse parcialmente y en tonces continuar el crecimiento, o desaparecer por completo, siendo substitui dos por un microtúbulo distinto (Figura 16-31). Estas fluctuaciones de tamaño pueden abarcar algunos micrómetros de longitud e incluyen la polimerización y después la despolimerización de miles de subunidades de tubulina. Cuando se han estudiado en un tubo de ensayo microtúbulos purificados, se han podido observar transiciones entre períodos prolongados de polimerización y despoli merización (Figura 16-32). Este comportamiento, llamado inestabilidad dinámi ca, juega un papel muy importante en el posicionamiento de los microtúbulos en la célula, tal como discutiremos más adelante.
La hidrólisis de GTP puede explicar la inestabilidad dinámica de los microtúbulos individuales20 La inestabilidad dinám ica de los microtúbulos necesita un aporte de energía para equilibrar el balance químico entre la polimerización y la despolimeriza ción -energía que proviene de la hidrólisis de GTP. El GTP se une a la subunidad P-tubulina de la molécula de tubulina heterodimérica y, cuando la molécula de tubulina se incorpora al extremo de un microtúbulo, esta molécula de GTP es hidrolizada a GDP. (La subunidad a-tübulina también transporta GTP, pero no puede ser intercambiado por GTP libre y no es hidrolizado, por lo cual puede considerarse como una parte fija de la estructura proteica de la tubulina.) Se ha estudiado el papel de la hidrólisis del GTP en la polimerización de los microtúbulos, utilizando análogos no hidrolizables del GTP. Las moléculas de tubulina que contienen estos análogos no hidrolizables de GTP forman microtú bulos normalmente, lo cual indica que la unión del nucleótido es necesaria para la polimerización del microtúbulo, pero su hidrólisis no lo es. Sin embargo, es tos microtúbulos son anormalmente estables y no se despolimerizan igual que los microtúbulos normales cuando la concentración de tubulina en el fluido que los rodea es menor o cuando se tratan con colchicina. Así pues, aparentemente el papel normal de la hidrólisis del GTP es el de permitir la despolimerización de los microtúbulos debilitando las uniones entre las subunidades de tubulina.
Microtúbulos
f
' ^5 l'm
extremo menos
t extremo rnás
Figura 16-32 La inestabilidad dinámica del crecimiento de los microtúbulos. Fluctuaciones de la longitud de un microtúbulo en una solución de tubulina pura observadas mediante microscopía de campo oscuro vídeo-amplificada. Se recogieron imágenes del mismo microtúbulo a intervalos de 1 o 2 minutos y se presentaron siguiendo una secuencia ordenada en la pantalla del monitor. Los dos extremos del microtúbulo estuvieron sometidos a ciclos de acortamiento y alargamiento, de forma independiente, siendo el extremo “más” el que experi mentó las mayores fluctuaciones. (De T. Horio y H. Hotani, N ature 321:605-607, 1986. © 1986 Macmillan Joumals Ltd.)
867
Se cree que la inestabilidad dinámica es una consecuencia de la hidrólisis re trasada del GTP después del ensamblaje de la tubulina. Cuando un microtúbulo crece rápidamente, la incorporación de moléculas de tubulina en el extremo del polímero es más rápida que la velocidad de hidrólisis del GTP que transportan. Esto implica la formación de un “casquete” de GTP en el extremo del microtúbulo y, puesto que las moléculas de tubulina que contienen GTP se unen unas a otras con mayor afinidad que las que contienen GDP, el casquete de GTP estimula al microtúbulo a continuar su crecimiento. Por el contrario, cuando un microtúbulo ha perdido su casquete de GTP -p or ejemplo, si la velocidad de polimerización baja lentam ente- empezará a acortarse y luego tenderá a seguir acortándose. En la Figura 16-33 se muestra un modelo esquemático de los cambios es tructurales que acom pañan a la inestabilidad dinámica. Algunos principios ge nerales que pueden aplicarse tanto a los filamentos de actina como a los microtúbulos se discuten en el Panel 16-1, páginas 882-883. Las células pueden modificar la inestabilidad dinámica de sus microtúbulos para propósitos específicos. En cada fase M del ciclo celular, por ejemplo, la ra pidez con la que los microtúbulos se forman y se rompen se ve incrementada, de forma que los cromosomas pueden ser fácilmente capturados por los microtú bulos en crecimiento y el huso mitótico se forma con una gran rapidez (discuti do en el Capítulo 18). Contrariamente, cuando un célula se diferencia y adopta una morfología definida, la inestabilidad dinámica de sus microtúbulos se supri me mediante proteínas que se unen a los microtúbulos y los estabilizan, impi diendo su despolimerización. La capacidad de estabilizar a los microtúbulos en una configuración particular proporciona un mecanismo muy importante m e diante el cual la célula puede organizar su citoplasma.
La inestabilidad dinámica de los microtúbulos proporciona un principio organizador para la morfogénesis celular21 En las células animales los microtúbulos citoplasmáticos tienden a irradiar en todas direcciones a partir del centrosoma, donde están anclados sus extremos “m enos”. No obstante, la mayoría de las células animales están polarizadas, y el
Figura 16-33 La hidrólisis del GTP después de la polimerización desestabiliza los microtúbulos. El análisis del crecimiento y acortamiento de los microtúbulos in vitro sugiere el siguiente modelo para la inestabilidad dinámica. (A) La adición de los heterodímeros de tubulina transportando GTP a un extremo del protofilamento provoca su crecimiento en una conformación lineal, lo cual favorece el empaquetamiento en la pared cilindrica del microtúbulo, es decir, lo convierte en estabilizado. La hidrólisis del GTP después del ensamblaje cambia la conformación de las subunidades y el protofilamento tiende a deformarse en un forma curvada que es menos capaz de empaquetarse en la pared del microtúbulo. (B) En un microtúbulo intacto, los protofilamentos formados por subunidades que contienen GDP son forzados a adoptar una conformación lineal mediante los muchos enlaces laterales de la pared del microtúbulo, especialmente en el casquete estable de subunidades que contienen GTP. La pérdida del casquete de GTP permite que los protofilamentos que contienen GDP se relajen y adopten su conformación curvada. Esto conduce a una disrupción progresiva del microtúbulo y al desensamblaje final de los protofilamentos, formando dímeros de tubulina libres.
dím ero de tubulina
GTP intercam biable
casquete de GTP
protofilam ento recto la hidrólisis del GTP cambia la conform ación de la subunidad y debilita el enlace en el polím ero I
protofilam ento curvado | despolim erización
región menos estable del m icrotúbulo que contiene dím eros de tubulina unidos a GDP
CRECIMIENTO (A) 868
Capítulo 16: El citoesqueleto
(B)
ACORTAMIENTO
núcleo
/ g
(A)
centrosoma
proteína que form a un casquete
l ¿ 4 ''-
ensam blaje y desensamblaje de las moléculas de tubulina están controlados es pacialmente de manera que predomina la extensión de los microtúbulos hacia regiones específicas de la célula. Se desconoce como se consigue esta distribu ción, pero se cree que los mecanismos dependen de la inestabilidad dinámica de los microtúbulos. Hemos visto como in vitro los microtúbulos individuales tienden a existir en uno de los dos estados posibles -d e crecimiento regular o rápido, y de desen samblaje “catastrófico”- y que los microtúbulos en las células también existen en una de estas dos formas. La inestabilidad inherente de los microtúbulos con tribuye a explicar cómo pueden ser inducidos a crecer en direcciones específicas de la célula -p or ejemplo, hacia el borde frontal de avance de la célula que se arrastra. La red de microtúbulos que irradia a partir del centrosoma está cam biando continuam ente ya que crecen nuevos microtúbulos y reemplazan a otros que se están despolimerizando. Un microtúbulo que crece desde un centrosoma puede ser estabilizado si su extremo “m ás” es estabilizado, o si se forma un cas quete, de manera que se impida su despolimerización. Si es recubierto por una estructura de una región particular de la célula, se establecerá un punto de unión relativamente estable entre esta estructura y el centrosoma. Así pues, los microtúbulos originados en el centro organizador pueden estabilizarse selecti vamente por diferentes fenómenos en cualquier lugar de la célula. Se cree que la polaridad celular está determinada de esta manera, por medio de estructuras o factores desconocidos localizados en regiones particulares del córtex celular que “capturan” los extremos más de los microtúbulos (Figura 16-34). Tal como discutiremos a continuación, en muchas células la estabilización inicial de los extremos más de los microtúbulos se consolida, produciéndose una polarización más permanente de la misma.
Figura 16-34 La estabilización selectiva de los microtúbulos puede polarizar una célula. Un microtúbulo acabado de formar sólo persistirá si sus dos extremos están protegidos de la despolimerización. En las células, los extremos menos de los microtúbulos generalmente están protegidos por los centros organizadores, a partir de los cuales crecen. Los extremos más son inicialm ente libres pero pueden ser estabilizados por otras proteínas. Aquí por ejemplo en (A) se representa una célula no polarizada con nuevos microtúbulos creciendo y rompiéndose en todas direcciones. Los haces de microtúbulos encuentran entonces estructuras hipotéticas en una región específica del córtex celular que pueden unir (estabilizar) los extremos más de los microtúbulos (B). La estabilización selectiva de estos microtúbulos, que sucede al encontrar estas estructuras, comportará una redistribución rápida de los haces de microtúbulos y convertirá a la célula en una forma polarizada (C y D).
Los microtúbulos sufren una lenta “maduración” como resultado de modificaciones post-traduccionales de sus subunidades de tubulina22 Las subunidades de tubulina pueden ser modificadas covalentemente después de su polimerización. Dos de estas modificaciones son especialmente interesan tes puesto que proporcionan una forma de reloj molecular, que puede usarse para explicar cuánto tiempo ha transcurrido desde que un microtúbulo determi nado ha polimerizado. Estas modificaciones son la acetilación de la a-tubulina en un residuo determinado de Usina y la eliminación de un residuo de tirosina del extremo carboxilo terminal de la a-tubulina. Ambas, acetilación y destirosinación, son reacciones enzimáticas lentas que tienen lugar sólo en los m icrotú bulos y no se producen sobre moléculas de tubulina libres; además, su acción revierte rápidamente cuando la molécula de tubulina se despolimeriza. Así pues, cuanto más tiempo haga que un microtúbulo particular ha polimerizado, mayor será el porcentaje de sus subunidades que están acetiladas y destirosinadas. Las modificaciones tardan diversas horas en producirse, de forma que en los fibro blastos, donde los microtúbulos se recambian rápidamente, relativamente po cos de ellos están modificados. Al contrario, en los axones de las células nervio sas, la mayoría de los microtúbulos son estables por lo que muchos de ellos se hallan modificados.
Microtúbulos
869
La acetilación y la destirosinación pueden ser detectadas mediante anti cuerpos específicos, y proporcionan un indicio útil de la estabilidad de los microtúbulos en aquellas células en que es difícil estudiar directamente la dinámi ca de los microtúbulos. Se desconoce aún el papel de estas modificaciones, pero se cree que proporcionan lugares de unión para proteínas específicas asociadas a microtúbulos que podrían estabilizar los microtúbulos maduros.
Las proteínas asociadas a microtúbulos (MAP) se unen a los microtúbulos y modifican sus propiedades23 Mientras la modificación post-traduccional de la tubulina marca ciertos m icro túbulos como “maduros” y puede aumentar su estabilidad, las modificaciones más extendidas y versátiles de los microtúbulos son las conferidas por la unión de otras proteínas. Estas proteínas asociadas a los m icrotúbulos (MAP, de Microtubule-Associated Proteins), actúan tanto estabilizando los microtúbulos contra el desensamblaje como mediando su interacción con otros componentes celulares. Como cabría esperar de la diversidad de funciones de los microtúbu los, hay muchos tipos de MAP; algunas de ellas están ampliamente distribuidas en la mayoría de células, mientras que otras se encuentran tan sólo en algunos tipos celulares específicos. Los dos principales tipos de MAP se pueden aislar a partir de cerebro, asocia das a microtúbulos: las proteínas HMW (proteínas de alto peso molecular, de High Molecular Weight), que tienen pesos moleculares de 200 000 a 300 000 daltons o más; y las proteínas tau, de pesos moleculares entre 55 000 y 62 000 daltons. Am bos tipos de proteínas tienen dos dominios, y sólo uno de ellos se une a los micro túbulos; se cree que el otro dominio permite a los microtúbulos unirse a otros componentes celulares (Figura 16-35). Puesto que este dominio de unión a los microtúbulos se une simultáneamente a varias moléculas de tubulina no polimerizada, estas MAP aceleran in vitro el proceso de nucleación durante la polimeri zación de la tubulina. Mucho más importante es el hecho que estas MAP inhiben la disociación de la tubulina de los extremos de los microtúbulos, por lo cual estas proteínas los estabilizan una vez formados. Anticuerpos contra la MAP-2 y contra tau muestran que ambas proteínas se unen a lo largo de toda la extensión de los microtúbulos citoplasmáticos. Se han aislado muchas otras MAP. Algunas actúan como componentes es tructurales y proporcionan uniones permanentes con otros componentes celu lares, incluyendo otras partes del citoesqueleto. Otras son motores microtubulares, y utilizan la energía que proporciona la hidrólisis del ATP para desplazarse a lo largo de los microtúbulos, tal y como discutiremos más adelante.
Las MAP colaboran en la generación de regiones citoplasmáticas funcionalmente distintas24 Muchos tipos celulares estabilizan específicamente los microtúbulos en regio nes especializadas del citoplasma. Un ejemplo especialmente bien estudiado es
m icrotùbulo MAP-2
25 nm íAt
870
100 nm
Capítulo 16 : El citoesqueleto
Figura 16-35 Una proteína asociada a los microtúbulos. (A) Electronmicrograña que muestra los brazos laterales distribuidos uniformemente a lo largo de un microtùbulo, y formados por una gran proteina asociada a los microtúbulos (denominada MAP-2) aislada a partir del cerebro de los vertebrados. Porciones de la proteína se proyectan hacia el exterior del microtùbulo, como se muestra esquemáticamente en (B). (Micrografia electrónica por cortesía de William Voter y Harold Erickson.)
el de las células nerviosas, que disponen de dos tipos de apéndices -axones y den dritas. Los axones, uniformes en cuanto a su diámetro y que pueden tener varios centímetros de longitud, son los responsables de la propagación de las señales eléctricas a partir del soma celular, mientras que las dendritas, que se distribuyen radialmente a partir del soma celular y que raramente sobrepasan los 500 pm de longitud, son las responsables de recibir la información eléctrica de otras neuro nas y retransmitirla al soma celular. La mayoría de células nerviosas disponen de varias dendritas pero tienen solamente un único axón (véase Figura 11-20). Ambos, axones y dendritas, están formados por microtúbulos, aunque con disposiciones distintas. En los axones, los microtúbulos son muy largos y todos están orientados con su extremo “m ás” alejado del cuerpo celular. En las dendri tas, los microtúbulos son más cortos y su polaridad es mixta: algunos de los ex tremos “m ás” se alejan del cuerpo celular, mientras que otros dirigen su extremo “m ás” hacia este cuerpo celular. Cuando se estudia la distribución de las MAP en neuronas cultivadas mediante anticuerpos específicos, se observa cómo ciertas formas de la proteína tau se encuentran solamente en los axones; por otro lado, la MAP-2 se encuentra sólo en las dendritas y en el soma celular y está totalm en te ausente en los axones (Figura 16-36). Axones y dendritas se diferencian tam bién en otros aspectos: por ejemplo, en las dendritas y en el soma celular, pero no en los axones, se encuentran las moléculas de mRNA, los ribosomas y algu nos tipos de canales iónicos mientras que ciertos tipos de moléculas implicadas en la adhesión celular y los canales de sodio implicados en la generación de po tenciales de acción están localizados selectivamente en los axones. De este modo tanto el citoplasma como la mem brana plasmática de las células nervio sas se dividen en compartimientos axonales y dendríticos. Estos compartimien tos en una célula individual se diferencian de los compartimientos delimitados por membrana, tales como el retículo endoplasmático o las mitocondrias, en que no están separados los unos de los otros por membranas; de hecho, la dife rencia radica en la organización estructural y en los tipos de proteínas que se en cuentran presentes. La formación de los axones y de las dendritas durante la diferenciación de las células nerviosas se discute en el Capítulo 21. Aunque todavía no conocem os cóm o se compartimentan el citoplasma y la membrana plasmática de una célula nerviosa, las MAP podrían ser esenciales en este proceso. Cuando se inhibe la producción de la proteína tau en neuronas cultivadas mediante tratamiento con oligonucleótidos antisentido específicos, se suprime la formación de los axones mientras que no se ve afectada la de las dendritas. Contrariamente, cuando célu las no neuronales son manipuladas genéticamente de manera que se expresa en ellas la proteína tau (que normalmente se expresa solamente en las células ner viosas), forman largos apéndices parecidos a los axones, que están formados por haces de microtúbulos dispuestos con sus extremos “m ás” partiendo hacia fuera del cuerpo celular, al igual que en las células nerviosas. Debido a que diferentes com ponentes de la célula se desplazan en distintas direcciones a lo largo de los microtúbulos, se puede postular que una diferencia inicial en la polaridad de los microtúbulos está generada por la distribución dife rencial de las MAP, que comportará una diferencia posterior entre axones y den dritas. Las vesículas secretoras, por ejemplo, se desplazan hacia el extremo más de los microtúbulos y son transportadas desde el axón hasta los terminales ner viosos donde desarrollan su función; contrariamente, si los ribosomas y los mRNA se desplazan hacia el extremo menos de los microtúbulos, podrían ser ex cluidos de los axones.
Figura 16-36 Un ejemplo de la compartimentación citoplasmática de una célula nerviosa. Esta micrografía muestra la distribución de la proteína tau [verde) y de la MAP-2 (n a ra n ja ) en una neurona de hipocampo, en cultivo. Mientras que tau se encuentra confinada al axón, MAP-2 se encuentra localizada en el soma celular y en las dendritas. El anticuerpo que se ha utilizado para detectar tau se une únicam ente a tau desfosforilada, que se encuentra en el axón; otros datos muestran que tau fosforilada tam bién puede encontrarse en las dendritas. (Por cortesía de James W. Mandell y Gary A. Banker.)
La quinesina y la dineína dirigen el movimiento de los orgánulos a lo largo de los microtúbulos25 A menudo ocurre que la aparición de una nueva técnica experimental ha com portado avances muy importantes en la biología celular. Con la microscopía óp tica vídeo-amplificada se ha mejorado la capacidad de observación de objetos
Microtúbulos
871
extrem o más
(A)
quinesina
extrem o menos
dineina
débiles y diminutos, lo cual ha conducido al descubrimiento de los motores de los microtúbulos responsables del transporte de los orgánulos. Cuando fue posi ble visualizar los microtúbulos simples en un espécimen no fijado, los investiga dores pudieron seguir el movimiento de los orgánulos y otras partículas a lo lar go de los microtúbulos in vitro. Alternativamente, pudieron observar y medir el deslizamiento de microtúbulos individuales sobre superficies de cristal recu biertas con extractos celulares. Estos estudios in vitro sirvieron para identificar y aislar dos tipos de proteí nas motoras dependientes de microtúbulos -las quinesinas y las dineínas citoplasmáticas. Las dineínas citoplasmáticas están implicadas en el transporte de los orgánulos y en la mitosis y están muy íntimamente relacionadas con la dineína ciliar, proteína motora de los cilios y flagelos (se discute más adelante). Las quinesinas son m ucho más diversas que las dineínas; algunos miembros de esta familia están implicados en el transporte de los orgánulos en la mitosis y en la meiosis y en el transporte de las vesículas sinápticas a lo largo de los axones. Tanto las dineínas citoplasmáticas como las quinesinas están formadas por dos cadenas pesadas y algunas cadenas ligeras. Cada cadena pesada contiene una cabeza globular muy conservada de unión al ATP y una cola formada por domi nios a modo de varillas. Las dos cabezas globulares son motores ATPasa que se unen a los microtúbulos, mientras que las colas generalmente se unen a com po nentes celulares específicos, determinando así la carga que cada proteína trans porta (Figura 16-37).
La velocidad y la dirección de desplazamiento a lo largo de los microtúbulos son específicos del dominio globular de las proteínas motoras26 La mayoría de proteínas motoras conocidas se mueven únicamente en una di rección a lo largo de los microtúbulos -h acia su extremo más o hacia su extremo menos. Esta direccionalidad se puede analizar in vitro si se permite que bolas de poliestireno recubiertas con proteínas motoras se desplacen a lo largo de micro túbulos polimerizados en centrosomas. Los microtúbulos así dispuestos tienen su extremo más dirigido hacia al exterior y es fácil determinar la dirección del movimiento con un microscopio óptico. Mientras que las bolas de poliestireno que han sido recubiertas con extractos crudos de citoplasma se mueven en am bas direcciones, las que han sido recubiertas con quinesina aislada de axones se mueven únicamente hacia el extremo más de los microtúbulos. Al contrario, bo litas recubiertas con dineínas citoplasmáticas se mueven hacia los extremos m e nos de los microtúbulos, embebidos en el centrosoma. Estudios con axones nerviosos intactos han confirmado los resultados ob tenidos en los experimentos in vitro: la quinesina conduce, principalmente, el movimiento de los orgánulos hacia el exterior del soma celular, mientras que la dineína citoplasmática conduce el movimiento de los orgánulos desde los extre
872
Capítulo 16 : El citoesqueleto
Figura 16-37 Proteínas m otoras de los microtúbulos. Las qu inesin as y las dineínas citop lasm áticas son proteínas m otoras de los m icrotúbu los que gen eralm ente se desplazan en d irecciones opu estas a lo largo de un m icrotùbu lo (A). Estas p roteínas (aquí dibujadas a escala) son com p lejo s com p u estos por dos cad enas pesadas idénticas y algunas cad en as ligeras m ás pequeñas. Cada cad en a pesada form a un a cabeza globular que une la proteina a los m icrotúbu los de form a d ep en diente de ATP. (B y C) E lectronm icrografías de grabado por con gelació n de un a m olécu la de qu inesin a (B) y de una m o lécu la de d in eína cito p lasm àtica (C). M ientras la quinesin a y la d in eína cito p lasm àtica tien en dos cabezas, la d in eína ciliar (D) tien e tres, (véase Figura 16-44). (Las m icrografías e lectró n icas de grabado por con gelació n fueron preparadas por Jo h n H euser.)
Figu ra 16 -3 8 Transporte vesicular en dos direcciones. La qu inesin a y la d in eína citop lasm àtica transp ortan su carga en d ireccion es opuestas a lo largo de los m icrotúbu los, tal y com o se m uestra en un fibroblasto (A) y en el axón de una n eu ro n a (B).
■m m icrotùbulo
mos del terminal nervioso hacia el soma celular (Figura 16-38). La dineína citoplasmática se sintetiza, igual que el resto de proteínas, en el soma celular nervio so, y entonces debe ser transportada en un estado no funcional hacia el terminal nervioso antes de que empiece su función transportando orgánulos de regreso al cuerpo celular. Sorprendentemente no todas las quinesinas desplazan los orgánulos hacia el extremo más de los microtúbulos. Por ejemplo en Drosophila, una quinesina llamada Ncd, que es necesaria para la meiosis normal, se diferencia de la quine sina axonal tanto en la dirección como en la velocidad a la que se desplaza a lo largo de los microtúbulos: mientras que la quinesina axonal se dirige hacia el ex tremo más a una velocidad aproximada de 2 pm/segundo, la pro teína Ncd lo hace hacia el extremo menos a 0,1 pm/segundo, aproximadamente. Se desconoce el mecanismo mediante el cual estas proteínas convierten la energía de la hidrólisis del ATP en movimiento vectorial. Serán necesarios estu dios estructurales más detallados para determinar cómo las cabezas globulares tan íntimamente relacionadas de estas proteínas pueden desplazarse en direc ciones opuestas a lo largo de los microtúbulos y quizás esto aporte algún conoci miento sobre el proceso de transducción de energía.
Resumen
Los microtúbulos son polímeros rígidos de moléculas de tubulina. El ensamblaje se produce mediante la adición al extremo libre de los microtúbulos de moléculas de tubulina que contienen GTP y que disponen de un extremo (el extremo “más”) que crece más rápidamente que el otro extremo (el “menos”) . Después del ensamblaje se produce la hidrólisis del GTP y debilita los enlaces que mantienen unidos a los mi crotúbulos. Los microtúbulos de crecimiento lento son muy inestables y están suje tos a un desensamblaje catastrófico; pueden estabilizarse dentro de la célula si se asocian con otras estructuras que recubren sus dos extremos. Los centros organiza dores de microtúbulos, tales como los centrosomas, protegen los extremos menos y continuamente nuclean nuevos microtúbulos, que crecen en tocias direcciones. Si un microtúbulo encuentra una estructura que estabiliza su extremo “más” libre, será selectivamente retenido, mientras que otro microtúbulo se despolimerizará. Se cree que este proceso selectivo determina la posición de los haces de microtúbulos dentro de la célula. Las subunidades de tubulina de los microtúbulos que han sido selectivamente estabilizadas se modifican mediante acetilación y destirosinación. Se cree que estas alteraciones marcan a los microtúbulos como “maduros” y proporcionan lugares de unión para las proteínas específicas de unión a los microtúbulos (MAP), lo cual también estabiliza al microtúbulo frente al desensamblaje. Las proteínas motoras microtubulares constituyen una clase importante de MAP que utilizan la energía de la hidrólisis del ATP para desplazarse unidireccionalmente a lo largo de los mi crotúbulos, llevando una carga específica. En general, las dineínas desplazan su Microtúbulos
873
carga hacia los extremos menos de los microtúbulos, mientras que la mayoría de las quinesinas lo hacen hacia los extremos más. Estas proteínas motoras son las responsables de la organización espacial y del movimiento dirigido de los orgánulos del citoplasma. Cilios y centríolos27 El batido de los cilios es una de las formas del movimiento celular más estudia das. Los cilios son evaginaciones delgadas, a modo de pelos, de unos 0,25 pm de diámetro, con un haz de microtúbulos en su interior; sobresalen desde la super ficie de muchos tipos celulares y se encuentran en la mayoría de especies ani males, muchos protozoos, y algunas plantas inferiores. Su principal función es triba en desplazar fluidos sobre la superficie de la célula o en propulsar a una célula aislada a través de un líquido. Los protozoos, por ejemplo, utilizan los ci lios tanto para capturar partículas alimenticias como para la locomoción. En las células epiteliales del tracto respiratorio humano, grandes cantidades de cilios ( 109/cm2 o más) trasladan hacia la boca capas de mucus que contienen partícu las atrapadas de polvo o células muertas. En la boca son engullidas y eliminadas. Los cilios participan en el proceso de trasladar los oocitos a lo largo del oviducto. Una estructura relacionada, el flagelo, propulsa el espermatozoide humano.
Los cilios se mueven por el batido de un axonema -un complejo haz de microtúbulos27 Los campos de cilios se inclinan siguiendo ondas coordinadas, unidireccionales (Figura 16-39). El movimiento de cada cilio es semejante al de un látigo: un gol pe activo hacia adelante, durante el cual el cilio está totalm ente extendido y es capaz de ejercer una fuerza máxima sobre el líquido circundante, seguido de una fase de recuperación, durante la cual el cilio recupera su posición original gracias a un movimiento de desenrollamiento que minimiza la resistencia visco sa (Figura 16-40A). Los ciclos de los cilios adyacentes son casi sincrónicos, aun que no los son totalmente. Este sincronismo da lugar a unos patrones parecidos a olas, que se pueden observar al microscopio óptico. El único flagelo de los espermatozoides y de muchos protozoos es muy pa recido a los cilios en cuanto a su ultraestructura interna, pero normalmente los flagelos son mucho más largos que los cilios. Los flagelos no presentan un movi miento parecido al de un látigo, sino que generalmente propagan ondas casi si nusoidales (Figura 16-40B). Sin embargo, la base molecular de su movimiento es
Figura 16-39 Cilios. E lectronm icrografía de barrido de un área ciliar del intestin o de un gusano m arino. (De J.S. M ellor y J.S. Hyams, Micron 9 :9 1 -9 4 ,1 9 7 8 . © 1978, con autorización de Pergam on Press Ltd.)
i----------2 pm
874
Capítulo 16: El citoesqueleto
Figura 16-40 Contraste entre los movimientos de batido de un cilio y de un flagelo. (A) El batido de un cilio de una célu la epitelial del tracto respiratorio h u m ano p arece una brazada de un nadador. El golpe de una brazada (estadios 1 y 2), d urante el cual el fluido es em pu jad o sobre la superficie de la célula, va seguido de un lento movimiento de recuperación (estadios 3 ,4 y 5). T íp icam en te, cada ciclo tarda entre 0,1 y 0,2 segundos y genera una fuerza perpendicu lar al e je del axonem a. Para efecto s com parativos en (B) se m u estra el m ovim iento ond ulante del flagelo de un esp erm atozoid e de un tunicad o. La célu la se fotografió sobre una pelícu la en m ovim iento co n una ilu m inación estrob o scóp ica de 400 destellos por segundo. N ótese que las ondas de am plitud co n stan te se desplazan desde la base del flagelo hasta su punta. E ntonces, la célula es em pu jad a d irectam en te desde su axonem a, un efecto m uy d iferente del que produce un cilio. (B, por cortesía de C.J. Brokaw.)
la misma que la de los cilios. Los flagelos de las bacterias, sin embargo, (descri tos en el Capítulo 15) son completamente diferentes a los cilios y a los flagelos de las células eucariotas. El movimiento de un cilio o de un flagelo está producido por la flexión de su eje, llamado axonema. El axonema está formado totalmente por microtúbulos y por sus proteínas asociadas. Los microtúbulos están modificados y se hallan dis puestos siguiendo un patrón cuyo aspecto curioso y característico fue una de las más notables revelaciones de los inicios de la microscopía electrónica: nueve dobletes de microtúbulos especiales están dispuestos en círculo alrededor de un par de microtúbulos sencillos (Figura 16-41). Esta disposición de “9 + 2 ” es ca racterística de casi todas las formas de cilios y de flagelos eucariotas, desde los protozoos hasta los que existen en los humanos. Los microtúbulos se extienden ininterrumpidamente en toda la longitud del axonema, que suele ser de 10 |im, aunque en algunas células puede alcanzar los 200 pm. Cada miembro del par de microtúbulos sencillos (el par central) es un microtúbulo completo pero cada uno de los dobletes exteriores está compuesto por un microtúbulo completo y un microtúbulo parcial fusionados, de tal forma que ambos comparten una pared común. En secciones transversales, cada mi-
r ,
(A)
CB>
brazo exterior de dineína espina radial vaina interior par central de m icrotúbulos sencillos
membrana plasmática
¡A)
!________________I
100 nm
brazo interior de dineína , A tùbulo B tùbulo, doblete externo de m icrotúbulo
Figura 16-41 La disposición de los microtúbulos en un cilio o en un flagelo. (A) E lectronm icrografía que m uestra una secció n transversal del flagelo de un alga verde ( Chlamydomonas) en la que se puede observar la disposición característica de “9 + 2 ” de los m icrotúbulos. (B) D iagram a de las partes. Las diversas p royecciones de los m icrotúbulos los m an tienen unidos y se p rod ucen a intervalos regulares a lo largo del axonem a. (A, por cortesía de Lewis Tilney.)
Cilios y centríolos
875
Figura 16-42 Microtúbulo deslizándose en un axonema. Electronmicrografía de un axonema aislado (a partir de un cilio de Tetrahymena) que ha sido brevemente expuesto a la enzima proteolítica tripsina para romper las uniones proteicas que normalmente lo mantienen unido. Tras el tratamiento con ATP, los distintos dobletes de microtúbulos se deslizan unos respecto a los otros, tal y como se muestra esquemáticamente en la Figura 16-43A. Como hay nueve dobletes de microtúbulos en el axonema, la estructura original puede alargarse hasta nueve veces su longitud inicial. (De F.D. Warner y D. R. Mitchell, /. Cell Biol. 89:35-44,1981. Reproducido con permiso de copyright de The Rockefeller University Press.)
ero tùbulo aparece formado por un anillo de 13 subunidades, mientras que el tu bulo incompleto de los dobletes exteriores está formado sólo por 11 subunida des.
La dineína dirige el movimiento de los cilios y de los flagelos28 Los microtúbulos del axonema están asociados a numerosas proteínas, que se encuentran en posiciones regulares a lo largo de los microtúbulos. Algunas sir ven como puntos de unión que mantienen juntos los haces de microtúbulos. Otras generan fuerzas que dirigen el movimiento de flexión, mientras que otras forman un sistema de transmisión activado m ecánicam ente que controla el m o vimiento, produciendo la forma de onda deseada. La más importante de estas proteínas accesorias es la dineína ciliar, cuyas cabezas interaccionan con los microtúbulos adyacentes y generan una fuerza de deslizamiento entre microtú bulos. A causa de las múltiples uniones que mantienen unidos los dobletes de microtúbulos adyacentes, lo que sería un movimiento deslizante entre microtú bulos libres (Figura 16-42) se convierte en un movimiento de flexión en el cilio (Figura 16-43). Como la dineína citoplasmàtica, la dineína ciliar tiene un dominio motor que hidroliza ATP para desplazarse a lo largo del microtúbulo hacia su extremo menos, y una cola que transporta la carga, la cual en este caso es un microtúbulo adyacente. La dineína ciliar es considerablemente más larga que la dineína cito plasmàtica, tanto en la medida de sus cabezas pesadas como en el número y complejidad de sus cadenas polipeptídicas. En los flagelos del alga verde unice lular Chlamydomonas, por ejemplo, la dineína está formada por 2 o 3 cadenas pesadas (hay múltiples formas de dineína en los flagelos) y 10 o más polipéptidos más pequeños (Figura 16-44). Podemos observar cómo la cola de la dineína ciliar se une sólo al tùbulo A y no al tùbulo B, que tiene una estructura ligera mente distinta. Esta asimetría, resultado de la disposición de las moléculas de dineína, es necesaria para prevenir una lucha de “estirar la cuerda” sin sentido
(A) DESPUES DE LA PROTEOLISIS: DESPLAZAMIENTO TELESCÓPICO
dobletes libres (los puentes cruzados se han elim inado m ediante proteolisis)
876
los dobletes se deslizan
Capítulo 16 : El citoesqueleto
L—__.___ J 2 imi
Figura 16-43 Flexión de un axonem a. (B) ESTRUCTURA INTACTA: FLEXIÓN
C dobletes unidos de un cilio m ediante puentes cruzados
el deslizamiento de los dobletes provoca la flexión de la estructura
(A) Si las proteínas que mantienen unidos los dobletes son eliminadas mediante proteolisis, el deslizamiento de los dobletes de microtúbulos externos, unos respecto a los otros, provoca el alargamiento del axonema. (B) Si los dobletes se encuentran unidos entre sí, el axonema se flexiona.
|___________ i 100 r»m
Figura 16-44 La dineína ciliar. La dineína ciliar es un gran complejo proteico (cerca de 2 millones de daltons) compuesto por entre 9 y 12 cadenas polipeptídicas, la mayor de las cuales tiene unos 512 000 daltons. (A) Se cree que las cadenas pesadas constituyen la mayor parte de la cabeza globular y de los dominios del tallo, y muchas de las cadenas más pequeñas se encuentran agrupadas alrededor de la base del tallo. La base de la molécula se une fuertemente a un microtúbulo A, a través de una reacción dependiente de ATP, mientras que las cabezas globulares mayores tienen un lugar de unión dependiente de ATP para un microtúbulo B (véase Figura 16-41). Cuando las cabezas hidrolizan el ATP que tienen unido, se desplazan hacia el extremo menos de este segundo microtúbulo, produciendo así una fuerza de deslizamiento entre los dobletes de microtúbulos adyacentes de un cilio o de un flagelo (véase Figura 16-43). Aquí se ilustra la forma de tres cabezas de la dineína ciliar, formada por tres cadenas pesadas. (B) Electronmicrografía de un cilio sometido a criofractura, mostrando los brazos de dineína proyectándose a intervalos regulares a partir de los dobletes de microtúbulos. (B, por cortesía de John Heuser.)
50 nm entre microtúbulos vecinos, lo cual posiblemente explicaría por qué cada uno de los nueve microtúbulos externos es un doblete A-B.
Cilios y flagelos crecen a partir de corpúsculos basales que están muy íntim am ente relacionados con los centríolos29 Si los dos flagelos del alga verde Chlamydomonas se separan de la célula, vuel ven a formarse rápidamente por elongación a partir de unas estructuras llama das corpúsculos basales. Los corpúsculos basales poseen la misma estructura que los centríolos que encontramos inmersos en el centro de los centrosomas animales. De hecho, en algunos organismos, corpúsculos basales y centríolos parecen tener funciones intercambiables: durante cada una de las mitosis en Chlamydomonas, por ejemplo, los flagelos son reabsorbidos y los corpúsculos basales se mueven hacia el interior de la célula y se convierten en los generado res de los polos del huso mitótico. Centríolos y corpúsculos basales son estructuras cilindricas de aproximada mente 0,2 pm de ancho y 0,4 pm de longitud. La pared del centríolo está forma da por nueve grupos de tres microtúbulos, distribuidos en tripletes. Cada triplete está inclinado hacia el eje central, como las aletas de una turbina (Figura 16-45). Los tripletes adyacentes están unidos a intervalos a lo largo de su longi tud. En electronmicrografías se pueden observar finos radios proteicos irradiando desde un núcleo central hasta cada triplete y dando lugar a un patrón semejante a una rueda de carro (véase Figura 16-45A).
i----------- 1
100 nm
Figura 16-45 Corpúsculos basales. (A) Electronmicrografía de una sección transversal a través de tres centríolos del córtex de un protozoo. (B) Diagrama de un corpúsculo basal visto lateralmente. Cada corpúsculo basal constituye la porción inferior de un axonema ciliar, y está formado por nueve tripletes de microtúbulos, cada uno de los cuales tiene un microtúbulo completo (el túbulo A) fusionado con dos microtúbulos incompletos (los túbulos B y C). Otras proteínas [marcada en rojo en (B)] forman puentes que mantienen unida la disposición cilindrica de microtúbulos. La estructura del centríolo es esencialmente la misma. (A, por cortesía de D.T. Woodrow y R.W. Linck.)
Cilios y centríolos
(B) 877
Durante la formación o regeneración del cilio, cada doblete de microtúbulos del axonema crece a partir de dos de los microtúbulos del triplete del corpúsculo basal, de manera que se preserva la simetría nonagonal de los microtúbulos del axonema ciliar. Los estudios autorradiográficos sugieren que la incorporación de tubulina y de otras proteínas del axonema tiene lugar en la punta distal de la estructura, en el extremo más de los microtúbulos. Se desconoce cómo se forma el par central de microtúbulos aislados del axonema, ya que en el centríolo y en los corpúsculos basales no existe ningún par central. Se desconoce cómo se determina la longitud de los cilios y de los flagelos. La longitud es constante para unas células determinadas, y no está limitada por la disponibilidad de com ponentes o por la cinética del alargamiento. Si separa mos uno de los dos flagelos de Chlamydomonas, por ejemplo, el flagelo restante empieza a reabsorberse mientras que, simultáneamente, el flagelo perdido se regenera. Una vez el flagelo que se reabsorbe alcanza la misma longitud que el flagelo que se regenera, los dos crecen juntos hasta conseguir la longitud final característica. Este experimento sugiere que la longitud flagelar está constante mente controlada de la misma forma (Figura 16-46).
Los centríolos suelen aparecer por duplicación de los centríolos preexistentes30 El incremento continuo de la masa celular a lo largo de todo el ciclo celular ani mal presenta dos acontecim ientos discretos de duplicación: la replicación del DNA y la duplicación del centrosoma, que normalmente tiene un par de centrío los en su interior. Los dos centríolos del par están dispuestos perpendicularmen te uno respecto al otro (Figura 16-47). En los fibroblastos en cultivo la duplica ción del centríolo empieza casi al mismo tiempo que empieza la síntesis de DNA: primero se separan los dos miembros de un par y entonces se forma un centríolo hijo perpendicular a cada centríolo original (véase Figura 18-4). Un centríolo inmaduro muestra una disposición en simetría nonagonal de microtú-
(B)
I_______________ 10 |jm
Figura 16-46 La longitud del flagelo está controlada mediante un proceso activo. (A) Cuando se separa físicamente uno de los flagelos (a sp a azul), empieza a crecer mediante polimerización a partir del corpúsculo basal {rojo). Al mismo tiempo, el flagelo restante empieza a reabsorberse. Cuando ambos miden la mitad de su longitud original, empiezan a crecer juntos. El crecim iento se detiene cuando ambos flagelos han conseguido la longitud final, cuidadosamente especificada. (B) Fotografía en color del alga C hlam ydom on as, donde el color a n a ra n ja d o es el resultado de la autofluorescencia de la clorofila y el verde proviene de la unión de un anticuerpo fluorescente contra una proteína de la membrana plasmática. (B, por cortesía de Robert A. Bloodgood.)
Figura 16-47 Electronm icrografía m ostrando un par de centríolos recién replicados. Un centríolo de cada par ha sido cortado transversalmente y el otro cortado en sentido longitudinal, lo cual indica que los dos miembros de cada par están colocados formando un ángulo recto. (De M. McGill, D.P. Highfield, T.M. Monahan, and B.R. Brinkley, /. Ultrastruct. Res. 57:43-53, 1976.)
1 |im 878
Capítulo 16 : El citoesqueleto
las hileras de cilios baten todas en la m isma dirección
PARAMECIUMNORMAL , las hileras de cilios invertidas baten en direcciones opuestas
20 pm
PARAMECIUMALTERADO
Figura 16-48 Herencia cortical del patrón en un protozoo ciliado. (A) Electronmicrografía de barrido de un P aram eciu m , que nada mediante el batido sincrónico de sus cilios. (B) Dibujo esquemático de las hileras de cilios de la superficie de un P aram eciu m normal y de un P aram eciu m en el que se han invertido algunas hileras de cilios, con lo cual baten en direcciones opuestas. Estos patrones alterados se propagan indefinidamente mientras el P aram eciu m se divida, aunque la información a nivel de DNA no haya cambiado. (A, por cortesía de Sidney Tamm.)
bulos sencillos; probablemente cada microtúbulo actúa como plantilla para el ensam blaje de los tripletes de microtúbulos típicos de los centríolos maduros. Los dos centríolos que forman un par no son idénticos: el centríolo hijo no sola mente tiene una orientación distinta sino que también se diferencia en detalles con cretos de su morfología y de su función. En muchos tipos celulares de los vertebra dos, por ejemplo, uno de los dos centríolos se distingue por su capacidad para nuclear el llamado cilio primario -cilio aislado inmóvil cuya función es desconocida. Estas diferencias padres/hijos también se presentan en los corpúsculos basales, lo cual puede conducir a las asimetrías del citoesqueleto. En los protozoos ciliados, la replicación de los corpúsculos basales está coordinada con la división celular y se cree que la estereoespecificidad del proceso de duplicación puede ser impor tante para mantener la orientación del cilio en la superficie celular. Esto fue clara mente demostrado en un experimento clásico llevado a cabo durante los años 1960 en Paramecium, protozoo cuya superficie esta cubierta por hileras de cilios móviles. Normalmente, todas las hileras están alineadas con la misma polaridad a través de la replicación coordinada de los corpúsculos basales, los cuales producen corpúsculos basales hijos con la misma orientación relativa respecto a la superficie celular. Los haces de cilios que crecen a partir de los corpúsculos basales propor cionan a la célula la capacidad para nadar con una gran eficiencia. Mediante expe rimentos de microinyección, es posible alterar este patrón y producir hileras de ci lios invertidos que baten en direcciones opuestas a las de sus vecinos (Figura 16-48). Una vez establecidas, estas alteraciones pasan de padres a hijos en el Para mecium durante más de 100 generaciones. Este tipo de herencia no tiene nada que ver con el DNA: las células modificadas heredan un patrón particular de hileras de cilios gracias a la replicación estereoespecífica de sus corpúsculos basales.
Resumen El axonema del cilio y del flagelo eucariota contiene un haz cilindrico de nueve do bletes de microtúbulos periféricos. Entre los dobletes de microtúbulos adyacentes se extienden brazos laterales de dineína que hidrolizan ATP y generan fuerza de desli zamiento entre los dobletes. Diversas proteínas accesorias mantienen unido el anillo de dobletes de microtúbulos y convierten la fuerza de deslizamiento en un movi miento inclinado que genera el batido de los cilios. La compleja estructura del axo nema ciliar seforma por un autoensamblaje de sus componentes proteicos y está nucleada por un centríolo (corpúsculo basal), que sirve de plantilla para el patrón característico de 9 + 2 microtúbulos que forman el núcleo del axonema. Los centrío los se duplican mediante un proceso altamente controlado en el cual el centríolo hijo se nuclea a partir de un centríolo padre que se encuentra a su lado y crece per pendicularmente a él. La replicación orientada de los corpúsculos basales comporta un patrón heredable de batido de los cilios en la superficie de protozoos ciliados. Cilios y centríolos
879
Filamentos de actina31 Todas las especies eucariotas contienen actina. Esta proteína del citoesqueleto es la proteína más abundante en muchas células eucariotas, y a menudo consti tuye el 5% o más de la proteína celular total. Las fibras del músculo esquelético de los vertebrados son la fuente más común de actina para los experimentos que se realizan in vitro, puesto que la actina constituye el 20% de su masa. Si se trata polvo seco de músculo con una solución salina muy diluida, los filamentos de actina se disocian en sus subunidades de actina. Cada molécula de actina es un único polipéptido de 375 aminoácidos de longitud y está asociada muy íntima mente con una molécula de ATP. En las células los filamentos de actina pueden formar estructuras estables y estructuras lábiles. Los filamentos estables de actina forman el eje de los microvilli y son un com ponente crucial del aparato contráctil de las células muscula res. Sin embargo, muchos de los movimientos celulares dependen de estructu ras lábiles formadas por filamentos de actina. Dedicaremos esta sección a ver cómo la célula controla el ensamblaje de los filamentos dinámicos de actina a partir de subunidades de actina solubles en el citosol.
Los filam entos de actina son delgados y flexibles32 En las electronmicrografías los filamentos de actina aparecen como hebras de 8 nm de diámetro. Están formados por una apretada hélice de monómeros de ac tina orientados uniformemente (también conocida como actina globular, o acti na G) (Figura 16-49). Al igual que los microtúbulos, un filamento de actina es una estructura polar, con dos extremos estructuralmente distintos -u n extremo “m enos”, relativamente inerte y de crecimiento lento y un extremo “m ás”, de crecim iento rápido. A causa de la apariencia de flecha del complejo formado en tre los filamentos de actina y la proteína motora miosina, que describiremos más adelante, el extremo m enos se conoce también como el extremo en punta y el extremo más como extremo ancho o barbado. La estructura tridimensional de la molécula de actina ha sido analizada mediante análisis de difracción de rayos X, y esta información ha sido utilizada para deducir la estructura de un filamen to de actina a nivel de sus aminoácidos individuales (Figura 16-50). Algunos eucariotas inferiores, como las levaduras, tienen un único gen para la actina, que codifica una única proteína. Sin embargo, todos los eucariotas su periores tienen algunas isoformas codificadas por una familia de genes de acti na. Al menos hay seis tipos distintos de actina en los tejidos de los mamíferos; se agrupan en tres clases, dependiendo de su punto isoeléctrico. Las alfa actinas se encuentran en diversos tipos de músculo, mientras que las beta y las gamma son los constituyentes principales de las células no musculares. Aunque las distintas formas de actina presentan sutiles diferencias en sus propiedades, las secuen cias de aminoácidos han sido altamente conservadas durante la evolución, y to das se ensamblan en filamentos que son esencialmente idénticos en la mayoría de estudios llevados a cabo in vitro. La longitud total de todos los filamentos de actina de una célula es al menos 30 veces mayor que la longitud total de los microtúbulos, lo cual refleja una dife rencia fundamental en la manera como estos polímeros del citoesqueleto están organizados y funcionan en la célula. Los filamentos de actina son más delgados y más flexibles, y normalmente más cortos, que los microtúbulos. Veremos que rara mente los filamentos de actina se encuentran aislados en la célula, sino que gene ralmente forman agregados y haces, con puentes entrecruzados, que son mucho más fuertes que los filamentos individuales.
La actina y la tubulina polimerizan por mecanismos parecidos33 La polimerización de la actina pura in vitro necesita ATP y también cationes m o novalentes y divalentes, que normalmente son el K+y el Mg2+. La reacción puede
880
Capítulo 16: El citoesqueleto
(A)
i----------- 1
50 nm
(B)
Figura 16-49 Filamentos de actina. (A) Electronmicrografía de filamentos de actina contrastados negativamente. (B) Disposición helicoidal de las moléculas de actina en un filamento. (A, por cortesía de Roger Craig.)
extrem o menos extrem o menos
extrem o más ^
estudiarse mediante la observación del cambio de luz emitida desde una sonda fluorescente que ha sido covalentemente unida a la actina o mediante el segui miento del gran incremento de viscosidad provocado por la polimerización. Cuando se añade K+y Mg2+ a la actina monomérica en presencia de ATP, se pro duce una fase lenta (lag), mientras se nuclean los nuevos filamentos, y luego una fase de polimerización rápida, mientras los cortos filamentos se alargan. La fase lag que encontramos en la polimerización de la actina pura es debida a la misma barrera cinética para la nucleación que discutimos para la polimerización de la tubulina (véase Figura 16-23). Para la actina, la velocidad de nucleación es pro porcional al cubo de la concentración de actina, lo cual sugiere que la estructura de nucleación para la polimerización espontánea de la actina pura es un trímero de moléculas de actina. Al contrario, la velocidad con la cual un filamento se alarga es proporcional, igual que para los microtúbulos, a la concentración de la subunidad libre indicando que el filamento se alarga mediante adición de m olé culas de actina, de una en una. La velocidad de polimerización es distinta en los dos extremos del filamento de actina, y esta diferencia es mucho mayor que en los microtúbulos: el extremo “m ás” o “barbado”, la actina polimeriza unas 10 veces más rápidamente que el extremo “m enos” o “puntiagudo”. La concentración crítica para la polimeriza ción de la actina -esto es, la concentración del monómero de actina libre en la cual la proporción de actina polimerizada detiene su increm ento- está alrededor de 0,2 micromolar (alrededor de 8 jig/ml). Esta concentración es mucho más baja que la concentración de actina no polimerizada de la célula, por lo que la célula ha desarrollado mecanismos especiales para impedir que la mayoría de esta actina monomérica se ensamble formando filamentos, tal y como discutire mos más adelante. Rápidamente después de la polimerización, el fosfato terminal del ATP uni do a la molécula de actina es hidrolizado, quedando un ADP atrapado en el polí mero. La hidrólisis del ATP durante la polimerización de la actina es análoga a la hidrólisis del GTP que acompaña el ensamblaje de los microtúbulos, pero en el caso de la actina podemos comprender los cambios conformacionales implica dos puesto que conocem os la estructura tridimensional de la proteína. La m olé cula de actina tiene forma de almeja y el ATP se halla situado en la charnela si tuada entre las dos mitades; como la concha de una almeja, puede abrirse y cerrarse. Cuando la actina polimeriza, la concha está totalmente cerrada por in-
Filamentos de actina
extrem o más
Figura 16-50 Estructura de la actina. (A) Estructura tridimensional de la molécula de actina, deducida mediante análisis de difracción de rayos X. Una molécula aislada de ATP {am arillo) está estrecham ente unida en una fisura entre los dos dominios de la proteína. (B) Dibujo esquemático de una molécula de actina que pone de manifiesto sus dos dominios y el lugar de unión al ATP que se encuentra entre ellos. (C) Dibujo esquemático del filamento de actina que muestra cómo las moléculas de actina interactúan unas con otras formando el polímero helicoidal. Adviértase que de la misma manera que las moléculas de actina se ensamblan en el polímero, hidrolizan sus moléculas de ATP estrecham ente unidas (véase Figura 16-51). (D) Estructura de la molécula de actina basada en la imagen de un filamento obtenida mediante microscopía electrónica. Cada bola del modelo representa a un aminoácido; los que interactúan con la miosina (se discute más adelante) se han marcado en verde. La diferencia entre los extremos más y menos es aparente. (A, adaptado de W. Kabsch et al., N a tu re347:37-44, 1990. © 1990 Macmillan Magazines Ltd.; B, de K.C. Holmes et al., N ature 347;44-49, 1990. © Macmillan Magazines Ltd.)
881
VELOCIDADES DE CRECIMIENTO Y DE ACORTAMIENTO
Un polímero lineal de moléculas de proteína, como por ejemplo un filamento de actina o un microtúbulo, se ensambla (polimeriza) y se desensambla (despolimeriza) mediante la adición y la pérdida de subunidades de los extremos del filamento. La velocidad de adición de monómeros viene dada por la constante kon, cuyas unidades son de M-1 seg-1. La velocidad de pérdida viene dada por la constante kofí (unidades de seg“1). subunidad
polím ero (con n subunidades)
L dím ero
monomero
La adición posterior puede tener lugar sobre este trímero, que entonces actúa como lugar de nucleación para la polimerización. El lugar de nucleación de la tubulina es mucho más grande y tiene una estructura más compleja (posiblemente un anillo de 13 o más moléculas), pero el principio es el mismo. El ensamblaje del lugar de nucleación es relativamente lento, lo cual explica la fase inicial lenta (fase lag) producida durante la polimerización. La fase lenta puede ser reducida o eliminada del todo si se añaden lugares de nucleación prefabricados, tales como fragmentos de microtúbulos o filamentos de actina previamente polimerizados.
+
kon
NUCLEACION y n polímero helicoidal está estabilizado mediante múltiples contactos entre subunidades adyacentes. Para la actina, dos moléculas de actina se unen mediante enlaces relativamente débiles, pero la unión de un tercer monómero de actina formando un trímero proporciona una mayor estabilidad al conjunto.
| ^off
polím ero (con n + 1 subunidades)
■ ■ ■ ■ ■ LA CONCENTRACION CRÍTICA
POLIMERACION EN FUNCION DEL TIEMPO
El número de subunidades que se adicionan por segundo al polímero (filamento de actina o microtúbulo) será proporcional a la concentración de las subunidades libres (/ron[C]), pero las subunidades abandonarán el extremo del polímero a una velocidad constante (kofí) que no depende de [C], A medida que el polímero va creciendo, las subunidades se van incorporando de forma que [C] cae hasta alcanzar un valor constante, llamado concentración crítica (Cc). A esta concentración la velocidad de adición de subunidades se iguala a la velocidad a la que el polímero pierde subunidades. En este punto de equilibrio, kon IC] = froff de forma que p uoff,, _ _i
C" knn
K
(donde K es la constante de equilibrio para la adición de subunidades, véase Figura 3-9).
El ensamblaje de una proteína en un largo polímero helicoidal, (p. ej., un filamento del citoesqueleto o un flagelo bacteriano) muestran esta curva dependiente del tiempo:
F A SE DE CRECIM IEN TO
tie m p o ----- ►
La fase inicial lenta (fase lag) es debida a la barrera cinética para la nucleación. La fase de crecimiento se produce mientras los monómeros se añaden a los extremos expuestos del polímero en crecimiento. La fase de equilibrio se consigue cuando el crecimiento del polímero debido a la adición de monómeros está precisamente en equilibrio con el acortamiento del polímero debido a la pérdida de monómeros.
EXTREMO MAS Y EXTREMO MENOS
Los dos extremos de un filamento de actina o de un microtúbulo polimerizan a velocidades distintas. El extremo de crecimiento rápido se llama extremo más, y el de crecimiento lento se llama extremo menos. La diferencia de velocidad de crecimiento de ambos extremos se debe a cambios conformacionales de cada subunidad cuando se incorpora al polímero. s u b u n ¡d a d \~ libre /
| |
*" /
\ /
extremo \ menos /
subunidad en el polím ero
882
Panel 16-1 Polimerización de la actina y la tubulina.
\
\
/
\
/
\ /
I LENTO / ^
/ ^
)
Este cambio conformacional afecta a la velocidad a la cual las subunidades se añaden a los dos extremos. Aunque kor¡ y fc0ff tendrán valores distintos para el extremo menos del polímero, la relación koff/kon —y, por tanto, Cc— debe ser igual en ambos extremos. Ello es debido a que cuando se pierde una subunidad en uno de los extremos se rompen exactamente el mismo número de interacciones entre subunidades, y el estado final de la
/
^
/
^
)
/
^
)
/
^
/
\
/
\
/
\ extremo más
RÁPIDO
/ / / / / ' -------------------- ^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ — '
) _______ ) > > > ■ ■ >
subunidad después de la disociación es idéntico. Así pues, la AG de la subunidad perdida, que determina la constante de equilibrio para su asociación al extremo (véase Tabla 3-3, página 101), es idéntica en ambos extremos; si el extremo más crece cuatro veces más rápidamente que el extremo menos, también debe disociarse cuatro veces más rápidamente. Por tanto, para [C] > Cc ambos extremos crecen; para [C] < Cc, ambos extremos decrecen.
INTERCAMBIO ROTATORIO (TREADMILLING) Una consecuencia de la hidrólisis del nucleótido que acompaña la form ación de un polím ero es el cam bio de la concentración crítica en los dos extrem os del polím ero. Debido a que fc°off y k J o n se refieren a reacciones diferentes, la relación ^ 0 n / k T 0 n no tiene por qué ser necesariamente la misma en los dos extrem os del polím ero, de form a que: Cc (extrem o menos) > Cc (extrem o más) A sum iendo que am bos extrem os del polím ero se hallan asequibles, la polim erización procederá hasta que la concentración del m onóm ero libre supere el valor de Cc para el extrem o más, pero esté por debajo de Cc para el extrem o menos. En este estado estacionario, las subunidades se ensam blarán al extrem o más y se desensamblarán del extrem o menos a velocidades idénticas. El polím ero m antendrá una longitud constante, aunque exista un flu jo neto de subunidades a través del polím ero que se conoce como intercam bio rotatorio (treadm illing).
HIDROLISIS DE NUCLEOTIDOS Cada molécula de actina transporta una molécula de ATP fuertemente unida, la cual, en cuanto se produce el cambio de conformación que acompaña al ensamblaje de subunidades formando el polímero, es hidrolizada hasta una molécula de ADP. De manera similar, cada molécula de tubulina transporta una molécula de GTP fuertemente unida, que se convierte en una molécula de GDP cuando la molécula se ensambla en el polímero.
) T/
—
(T = ATP o GTP) (D = ADP o GDP)
7°)
subunidad en el polímero
monómero libre
La hidrólisis del nucleótido unido reduce la afinidad de unión de cada subunidad respecto a la subunidad vecina, haciéndola más fácilm ente disociable de cada uno de los extrem os del fila m en to (véase Figura 16-33 para el posible mecanismo). Es habitual que la form a y?"] se añada al fila m en to y que la form a ) D ) se disgregue del filam ento. Considerem os sólo los acontecim ientos del extrem o más:
)
)
d
)
d
)
d
)
d
)
d
)
t
d
)
d
)
d
)
d
)
d
)
d
)
)
Como antes, el polím ero crecerá hasta que [C] = Cc. Por m otivos didácticos, podemos considerar que k ° on y k J o f í son insignificantes, de form a que podem os decir que el crecim iento del polím ero cesa cuando
^a on ^r -“ *ip off
On
r -
tPoff
La INESTABILIDAD DINÁMICA y el INTERCAMBIO ROTATORIO son dos com portam ientos observados en los polím eros del citoesqueleto. Am bos procesos están asociados a la hidrólisis de nucleótidos trifosfato. Se cree que la inestabilidad dinám ica predom ina en los m icrotúbulos m ientras que el intercam bio rotatorio podría predom inar en los filam entos de actina
CASQUETES DE ATP Y DE GTP La velocidad de adición de subunidades a un fila m en to de actina o a un m icro tú bu lo en crecim iento puede ser más rápida que la velocidad a la cual se hidroliza el nucleótido que llevan unido. En estas condiciones, las subunidades de los extrem os del fila m en to form an un casquete de subunidades que tienen unido el nucleósido trifosfato — un casquete de ATP en el fila m en to de actina y un casquete de GTP en el m icrotúbulo.
k on Es un estado estacionario y no un e q uilib rio ya que el ATP o el GTP hidrolizados pueden ser reemplazados por una reacción intercam biadora de nucleótidos sobre la subunidad libre ^ |~p~~) —► ^
< d
INESTABILIDAD DINAMICA
casquete de ATP/GTP
Los m icrotúbulos se despolim erizan unas 100 veces más rápidam ente del extrem o que contiene tub ulina GDP que del que contiene tubulina GTP. Un casquete de GTP favorece el crecim iento, pero si se pierde, entonces se produce la despolim erización. casquete de GTP
i-------- 1
CRECIMIENTO
cc>
ACORTAMIENTO
Los m icrotúbulos individuales pueden alternar períodos de crecim iento lento y de desensamblaje rápido, fenóm eno llam ado inestabilidad dinámica.
883
Figura 16-51 La tram pa de ADP en un filamento de actina. Una molécula de actina tiene una estructura que está relacionada con la de la ubicua enzima hexoquinasa (véase Figura 5-2), con dos dominios que forman una bisagra alrededor del lugar de unión al ATP. El ATP es hidrolizado a ADP inmediatamente después de que la molécula se ha incorporado a un filamento de actina. Para que el ADP sea reemplazado por un ATP, la bisagra debería abrirse, pero en el filamento de actina los dos dominios de cada molécula de actina están unidos entre sí por interacciones con las subunidades vecinas, de manera que la bisagra se mantiene cerrada y actúa de trampa para el ADP, hasta que el filamento se despolimeriza.
teracciones entre aminoácidos de las dos valvas de la almeja y la zona posterior de la siguiente subunidad en el polímero. Se cree que la hidrólisis del ATP se des encadena por el cierre de la concha mientras cada molécula de actina se incor pora al filamento, y deja el ADP atrapado dentro (Figura 16-51).
El com portam iento dinámico de los filam entos de actina requiere la hidrólisis del ATP34 En la polimerización de la actina, la hidrólisis del ATP juega un papel parecido al de la hidrólisis del GTP en la polimerización de la tubulina, como explicamos en el Panel 16-1 (págs. 882-883). Para formar el filamento no es necesaria la hidróli sis del ATP: de hecho, debilita los enlaces del polímero y de esta forma facilita la despolimerización. Sin embargo, existen diferencias importantes en los com por tamientos del nucleótido que está unido a las subunidades de estos dos políme ros. Una diferencia especialmente interesante es que el recambio ATP-ADP (la substitución del ADP unido por ATP) es relativamente lenta para la actina libre (del orden de minutos), mientras que el recambio GTP-GDP es muy rápido para la tubulina libre (del orden de segundos); así pues, cuando las moléculas de acti na son liberadas por el desensamblaje de un filamento, tardan mucho tiempo en poder a volver a ser reutilizadas en el ensamblaje de un filamento. En principio, esta propiedad de la actina permite a la célula mantener una elevada concentra ción citosólica de moléculas de actina no polimerizadas en forma ADP-actina; además, el monómero ADP-actina puede ser estabilizado en la célula mediante su unión a otra proteína, lo cual podría proporcionar una manera para regular la polimerización de la actina. El efecto que la hidrólisis del ATP tiene sobre la actina es sutil, y quedan mu chas preguntas sin responder sobre las consecuencias precisas de tiene este pro ceso para la célula. Los filamentos de actina, a diferencia de los microtúbulos, no parecen mostrar una inestabilidad dinámica drástica in vitro. De hecho, pueden intervenir en un comportamiento dinámico interesante denominado intercambio rotatorio (treadmilling), que se produce cuando se añaden continuamente m olé culas de actina al extremo más del filamento y se pierden continuamente por el extremo menos, sin que haya un cambio neto de longitud en el filamento (véase Panel 16-1, págs. .882-883). El intercambio rotatorio, al igual que la inestabilidad dinámica, es un comportamiento de no equilibrio que requiere un aporte de energía, el cual proviene de la hidrólisis de ATP que acompaña a la polimeriza ción. Se cree que este fenómeno contribuye al recambio rápido de subunidades de filamentos de actina que se produce en la célula. Es remarcable que tanto la actina como la tubulina estén implicadas en la hidrólisis de nucleósidos trifosfato por la misma razón básica -para poder, una vez polimerizadas, despolimerizarse fácilmente. Actina y tubulina no están ab solutamente relacionadas en cuanto a su secuencia de aminoácidos: la actina está relacionada relativamente, en cuanto a estructura, a la enzima glucolítica hexoquinasa, mientras que la tubulina esta distantemente relacionada con una gran familia de GTPasas que incluye la proteína G heterotrimérica y GTPasas monoméricas como la proteína Ras. (Ambos tipos de estructura se discuten con detalle en el Capítulo 5.) La evolución convergente de la capacidad de hidrólisis
884
Capítulo 16: El citoesqueleto
H ,C
/“
H j C — CH
CH,
\
CHOH
/
\
borde frontal de avance de la célula de un nucleótido en la actina y en la tubulina demuestra lo importante que re sulta la función de los microtúbulos y de los filamentos de actina: el ensamblaje y desensamblaje dinámicos de estos polímeros del citoesqueleto en los que la hidrólisis hace posible que se encuentren en el corazón de la organización citoplasmática.
Las funciones de los filam entos de actina son inhibidas por drogas estabilizadoras y desestabilizadoras del polímero35 Las drogas que estabilizan o desestabilizan los filamentos de actina constituyen herramientas importantes para investigar el comportamiento dinámico de estos filamentos en las células. Las citocalasinas son productos sintetizados por hon gos, que impiden la polimerización de la actina ya que se unen al extremo más de los filamentos de actina. Las faloidinas son toxinas aisladas del hongo Amanita, que se unen muy fuertemente a los lados de los filamentos de actina y los es tabilizan, impidiendo su despolimerización. (Un remedio contra el veneno del hongo Amanita es comer una gran cantidad de carne cruda: la elevada cantidad de filamentos de actina del tejido muscular se une a la faloidina y reduce su toxi cidad.) Ambas drogas provocan cambios dramáticos en el citoesqueleto de acti na. Anteriormente vimos, al referirnos a los microtúbulos, que tanto las drogas desestabilizadoras del polímero, por ejemplo la colchicina, como las drogas que los estabilizan, por ejemplo el taxol, son tóxicas para las células. Lo mismo suce de con las drogas que afectan la estabilidad de los filamentos de actina, lo cual indica que la función de los filamentos de actina también depende de un equili brio dinámico entre el filamento y el monómero de actina. La citocalasina es de gran utilidad para el estudio del movimiento celular. En particular, el borde frontal de avance de una célula en movimiento contiene filamentos de actina que continuamente polimerizan y son muy sensibles a la ci tocalasina. En la mayoría de células en movimiento la citocalasina provoca la re tracción de este borde frontal de avance. Sin embargo, si la membrana plasmática de este borde está fuertemente unida al substrato, la citocalasina provoca la re tracción de los filamentos de actina pero deja la membrana pegada al substrato (Figura 16-52). La faloidina también se utiliza ampliamente, como derivado fluorescente, para marcar los filamentos de actina de células fijadas, y tiene también un efecto profundo en las células vivas. Si se microinyecta faloidina a un fibroblasto vivo, por ejemplo, los m onómeros de actina polimerizan formando filamentos situa dos al azar en el citoplasma, lo cual provoca una contracción brusca que destru ye la célula.
c ito c a la s in a B
Figura 16-52 El efecto de la citocalasina sobre el borde frontal del cono en crecim iento de una célula nerviosa en cultivo. Observación de un cono vivo en crecim iento mediante microscopia de contraste interferencial de Nomarsky antes (A) y después (B) del tratamiento con citocalasina. La célula en (B) ha sido marcada después con faloidina ligada a rodamina para revelar los filamentos de actina (C). Puede observarse cómo la región detrás del borde frontal de avance del cono en crecim iento tratado con citocalasina está desprovista de filamentos de actina. La estructura química de la citocalasina B se muestra en (D). (A, B, y C, por cortesía de Paul Forscher.)
La molécula de actina se une a pequeñas proteínas que ayudan a controlar su polim erización36 En un fibroblasto, aproximadamente el 50% de la actina se encuentra en forma de filamentos, mientras que el 50% restante está monomerizada. En una gran
Filamentos de actina
885
la proteína se une y mantiene la actina en la form a de unión al ADP
ES 3
n lugar de unión al filam ento de actina PUEDE POLIMERiZAR
Figura 16-53 Dos m ecanism os posibles mediante los cuales im a proteina de unión al m onóm ero de actina puede inhibir la polimerización de la actina. Se cree que la timosina inhibe la polimerización de la actina mediante uno de estos dos mecanismos.
proteína cubriendo el lugar de unión a la actina NO PUEDE POLIMERiZAR
variedad de tipos celulares la concentración del monómero es típicamente de 50-200 micromolar (2-8 mg/ml). Esta concentración es sorprendentemente ele vada dada la baja concentración crítica de actina pura (menos de 1 micromo lar), y refleja la presencia de proteínas especiales que se unen a la molécula de actina e inhiben su unión en los extremos de los filamentos de actina. La más abundante de estas proteínas de unión al monómero de actina en muchos tipos celulares es la timosina, una pequeña proteína poco común, de un peso mole cular de aproximadamente 5000 daltons. En las células en que ha sido cuidado sam ente estudiada (las plaquetas sanguíneas y los neutrófilos), se encuentra a una concentración que es suficiente para secuestrar toda la actina monomérica. Se desconoce cóm o esta proteína inhibe la polimerización de la actina: podría bloquear estéricam ente la polimerización cubriendo el lugar donde un m onó mero se une al otro, o podría secuestrar el ADP unido a la actina impidiendo el recambio ADP-ATP, con lo cual la molécula de actina no podría polimerizar (Fi gura 16-53). Otra proteína de unión al monómero de actina es la profílina, que se en cuentra en todas las células y se cree que controla la polimerización de la actina com o respuesta a estímulos extracelulares. La profílina, que en muchas células está asociada a la mem brana plasmática, acelera el recambio de ATP por ADP cuando se une a la actina monomérica y se cree que facilita la polimerización re gulada de actina durante el movimiento celular, aunque esto es tema de contro versia. Un mutante de levadura deficiente en profílina tiene un déficit de fila mentos de actina, lo cual apoya el papel de esta molécula en la estimulación de la polimerización de la actina.
extrem o menos de los filam entos de actina
Figura 16-54 Filamentos de actina en el borde frontal de avance de un fibroblasto en cultivo. (A) Electronmicrografía del extremo delantero de avance de una célula en cultivo, tratada con un detergente no iónico para eliminar la membrana plasmática y la mayoría de las proteínas solubles. Nótese la trama orientada de los filamentos de actina que se presenta en el lamelipodio, en el que se halla incrustada la microespina. En (B) se presenta una visión esquemática de los filamentos de actina de un lamelipodio. (A, de J.V. Small, J. C ellB iol. 91:695-705, 1981. Reproducido con permiso de copyright de The Rockefeller University Press.)
lugares de nucleación de actina unidos a m em brana (extrem os más de los filam entos de actina)
lam elipodio contacto estrecho con el substrato 0,2 fim
886
Capítulo 16 : El citoesqueleto
- substrato proteínas que entrecruzan la actina
Además de la timosina y de la profilina, las células disponen de otras mu chas proteínas capaces de unirse a los monómeros de actina, y algunas de estas proteínas, como el factor despolimerizador de la actina (ADF, de Actin-Depolymerizing Factor), inhibe el ensam blaje de los filamentos de actina. Evidente mente las células disponen de una gran variedad de mecanismos, cuyos detalles no comprendemos todavía, mediante los cuales la célula controla el ensam blaje de los filamentos de actina sólo, cuándo y dónde es necesario.
Muchas células emiten, desde su borde frontal de avance, microespinas y lamelipodios dinámicos que contienen actina37 Las expansiones superficiales dinámicas que contienen filamentos de actina son una característica común de las células animales, especialmente cuando las cé lulas están migrando o cambiando de forma. Las voluminosas células vivas de Amoeba proteus, por ejemplo, producen pseudópodos -extensiones cortas y gruesas del córtex de actin a- con los cuales se mueven sobre las superficies. En los tejidos de los vertebrados, muchas células también son capaces de despla zarse sobre una superficie, especialmente cuando se cultivan. El borde frontal de avance de un fibroblasto que se arrastra extiende regularmente delgadas protu berancias laminares conocidas como lamelipodios, que poseen una densa red de filamentos de actina. Muchas células emiten también protrusiones delgadas y rígidas llamadas microespinas, de aproximadamente 0,1 pm de diámetro y entre 5 y 10 pm de largo y que contienen un haz laxo de aproximadamente 20 filamen tos de actina orientado con su extremos más hacia el exterior (véase Figura 169). El extremo en crecimiento (núcleo de crecimiento) de un axón nervioso ex tiende microespinas incluso más largas, llamadas filopodios, que pueden tener hasta 50 pm de largo. Un lamelipodio puede ser considerado como una versión bidimensional de una microespina; de hecho, a menudo este borde de la célula está delimitado por cortas microespinas. Cuando una célula en movimiento es fijada y contras tada cuidadosamente para ser examinada al microscopio electrónico, se observa cómo los filamentos de actina de los lamelipodios parecer estar más organiza dos que en otras regiones de la corteza celular. Muchos de los filamentos se pro yectan hacia el exterior siguiendo una disposición ordenada, con sus extremos “m ás” insertados en el borde frontal de avance de la membrana plasmática (Fi gura 16-54). Los lamelipodios se comportan com o una unidad estructural; si se pierde su adhesión al substrato, normalmente se retraen rápidamente hacia atrás y se enrollan de nuevo sobre la célula como un “rizo” (Figura 16-55).
Figura 16-55 Lamelipodios y microespinas del borde frontal de avance de un fibroblasto humano en cultivo que está migrando. La flecha indica la dirección del desplazamiento de la célula. A medida que la célula va avanzando, los lamelipodios y las microespinas pierden su unión a la placa de cultivo y se enrollan sobre la superficie dorsal -un movimiento conocido como rizado (rufíling). (Por cortesía de Julián Heath.)
T>
Y •. .
5 )im
Filamentos de actina
887
Tanto los lamelipodios como las microespinas son estructuras móviles que pueden formarse y retraerse a una gran velocidad. Tal como discutiremos más adelante, se cree que estas microespinas y lamelipodios son generados por la po limerización de la actina local en la membrana plasmática y que esta actina pue de rápidamente empujar la membrana plasmática hacia adelante sin rasgarla.
El borde frontal de avance de las células móviles nuclea la polim erización de la actina38 Cuando se estudia el comportamiento de los filamentos de actina en el borde frontal de avance, marcando una pequeña parte de la actina y siguiendo su m o vimiento, puede verse cómo la actina se mueve continuam ente de regreso hacia el cuerpo celular a una velocidad de aproximadamente 1 pm/minuto, lo que su giere que esta actina está continuam ente polimerizando cerca del borde frontal de avance y continuam ente despolimerizándose en lugares más internos (Figura 16-56). Se cree que este comportamiento altamente dinámico de los filamentos de actina en el borde frontal de avance es crucial para procesos tales como la lo com oción celular y la quimiotaxis. La impresión general es que el borde frontal de avance se impulsa a sí mismo hacia delante empujando los filamentos de ac tina hacia atrás. Parece que el borde frontal de avance de una célula organiza los filamentos de actina al igual que un centrosoma organiza los microtúbulos, pero con una diferencia crucial: no nuclea únicamente el crecimiento de nuevos filamentos sino que tam bién parece ser el lugar en que los monómeros se van añadiendo, permitiendo el alargamiento de los filamentos. Esta función puede demostrarse si lisamos ligeramente un fibroblasto y entonces añadimos monómeros de acti na unidos a rodamina, los cuales se ha visto que polimerizan preferentemente en el límite del borde frontal de avance (Figura 16-57). Ademas, si se marcan los
(A)
888
(B)
Capítulo 16: El citoesqueleto
5 (jm
Figura 16-56 Dinámica de un
filamento de actina en el lamelipodio de un fibroblasto en cultivo. Las moléculas de actina marcadas con el colorante fluorescente rodamina fueron microinyectadas en una célula, donde fueron incorporadas a los filamentos de actina. Utilizando un rayo láser se produce una pequeña mancha (por eliminación del mareaje fluorescente) sobre los filamentos de actina en el extremo anterior de la célula. Entonces la célula se fotografía a intervalos de tiempo utilizando un microscopio fluorescente equipado con un intensificador de imágenes. El rápido movimiento hacia atrás de la mancha sugiere que las moléculas de actina polimerizan continuamente en el extremo del borde frontal de avance y se despolimerizan en su base. (Por cortesía de Y.L. Wang.) Figura 16-57 El extremo del borde
frontal de avance nuclea filamentos de actina. Fibroblastos en cultivo se permeabilizaron ligeramente con un detergente no iónico y entonces se incubaron con moléculas de actina marcadas con rodamina {rojo). Al cabo de 5 minutos se fijaron las células y se marcaron con faloidina marcada con fluoresceína (verde). (A) Todos los filamentos de actina, la mayoría de ellos formados antes de la lisis, se marcan en verde. (B) La localización de los filamentos de actina nuevamente formados (rojo) polimerizados a partir de la actina marcada con rodamina añadida permite observar que el borde frontal de avance es el lugar predomínate de nucleación de filamentos de actina en la célula. (De M.H. Sym onsyT .J. Mitchison,/. Cell Biol. 114:503-513,1991, reproducido con permiso de copyright de The Rockefeller University Press.)
polim erización de la actina en el borde frontal de avance
. ■ rotatorio * * m odelo del intercam bio los filam entos de actina se nuclean en el borde frontal de avance
m odelo de liberación de la nucleación
araos entos de actina. . .se despolim erizan a enfilam ^ ^trasera la parte del lam elipodio
filam entos cortos de actina liberados
e|
Figura 16-58 Dos modelos que podrían explicar el flujo retrógrado de actina en un lamelipodio. Las fle c h a s azu les indican la dirección del movimiento de la célula. Aunque aquí se muestran las diferencias entre los dos modelos, ambos procesos pueden darse sim ultáneamente en la célula. (Adaptado de J.A. Theriot y T.J. Mitchison, N atu re 352:126-131, 1991. Reproducido con el permiso de N ature. © 1991 Macmillan Magazines Ltd.)
la red de filam entos de actina liberados en frontal de avance se desplaza hacia la parte posterior del lam elipodio
filamentos de actina para poder observar su polaridad, se encuentra que en cada filamento de actina, el extremo más de rápido crecimiento se encuentra unido a la mem brana en el borde frontal de avance. Hay aún muchas cuestiones sin respuesta acerca del m ecanismo mediante el cual el borde frontal de avance nuclea la polimerización de los filamentos de actina. ¿El borde frontal de avance se une al extremo más del filamento que nu clea, o nuclea un nuevo filamento y rápidamente se libera de él? A causa del m o vimiento retrógrado de la actina (véase Figura 16-56), algún modelo postula que, para que el borde frontal de avance se agarre a los extremos de los filamento de actina se necesitaría que los filamentos del lamelipodio estuvieran en continuo intercambio rotatorio mediante la inserción de monómeros de actina en los lu gares donde los filamentos están unidos a la membrana. En un modelo alternati vo, los filamentos de actina individuales serían liberados en cuanto se formaran y se desplazarían alejándose de la membrana (seguramente como una red de puentes cruzados) (Figura 16-58). El rápido ensamblaje de los filamentos de actina en el borde frontal de avan ce de una célula en movimiento implica la liberación de los monómeros de acti na de las proteínas de unión al monómero, que normalmente impiden la poli merización de los filamentos de actina. Discutiremos más adelante cómo las señales del ambiente celular externo pueden regular esta liberación y permitir la polimerización de los monómeros de actina en el extremo del borde frontal de avance.
Algunas bacterias patógenas utilizan la actina para moverse dentro y entre las células39 Listeria monocytogenes, una bacteria que provoca una forma aguda de envene namiento alimentario, ha proporcionado datos inesperados acerca del m ecanis mo mediante el cual la célula controla la polimerización local de la actina. Esta bacteria patógena penetra por fagocitosis en la célula; entonces secreta enzimas que rompen la membrana del fagosoma y se libera en el citosol de la célula huésped. Una vez en el citosol, no solamente crece y se divide, sino que se des plaza hacia las células adyacentes movilizando el sistema de motilidad basado en los filamentos de actina de la célula huésped. Mediante la nucleación de los filamentos de actina en una región de su superficie, una bacteria individual se desplaza por el citosol a una velocidad de 10 pm por minuto o más, dejando tras ella una cola de filamentos de actina. Cuando colisiona con la membrana plas mática de la célula huésped, se desplaza hacia el exterior induciendo la forma-
Filamentos de actina
889
bacteria libre
fagocitosis bacteria /~ ) escapándose ( / ensam blaje de
engullim iento por una célula huésped vecina (A)
(B)
ción de una larga y fina microespina, en cuyo extremo se sitúa la bacteria. A m e nudo esta proyección es engullida por una célula vecina, con lo cual la bacteria puede entrar en su citoplasma sin exponerse al ambiente extracelular donde po dría ser reconocida por anticuerpos producidos por el organismo huésped (Fi gura 16-59). Este tipo de movimiento sugiere que la bacteria puede estar usando la actina para impulsarse, de la misma forma en que la membrana plasmática de una célula eucariota la utiliza para impulsarse durante la formación de una m icroes pina normal o un lamelipodio. Si marcamos con fluorescencia los filamentos de actina de la cola que deja atrás la bacteria Listeria cuando migra por el citosol y los observamos con el mi croscopio de fluorescencia, podremos observar que son estacionarios. Los fila mentos se forman en la parte trasera de la bacteria y se quedan atrás como la cola de un cohete mientras la bacteria avanza, despolimerizándose de nuevo al cabo de aproximadamente un minuto o en cuanto encuentran factores despolimerizantes en el citosol. El ensam blaje se induce por una proteína específica de la superficie de la bacteria que actúa indirectamente secuestrando las proteínas de la célula huésped, incluida la profilina. Si el movimiento inducido por la bac teria pudiera ser reproducido en un extracto libre de células concentrado, se po drían conocer los detalles del mecanism o a partir de estudios bioquímicos. Estos detalles ayudarían a comprender cómo se producen la nucleación de la actina y la polimerización en las microespinas y lamelipodios de una célula normal, no infectada, y cómo estos procesos capacitan a la célula para avanzar.
La polim erización de la actina en el córtex celular está controlada por receptores de la superficie celular40 La producción de movimiento es poco útil a menos que esté de acuerdo directa y adecuadamente con el ambiente. Como hemos discutido anteriormente, la red
890
Capítulo 16 : El citoesqueleto
10 pm Figura 16-59 Movimiento basado en la actina de una bacteria dentro y entre células de mam ífero. (A) La bacteria L isteria m on ocytogenes viaja de una célula a otra induciendo el ensamblaje de filamentos de actina en el citosol de la célula huésped. (B) Micrografía de fluorescencia de la bacteria desplazándose en el interior de una célula que ha sido marcada para poder observar tanto a la bacteria como a los filamentos de actina. Nótese la cola, parecida a un cometa, de los filamentos de actina (verde) detrás de cada bacteria en movimiento (rojo). Las regiones en las que ambas fluorescencias se superponen, se observan en am arillo. (B, por cortesía de Tim Mitchison y Julie Theriot.)
cortical dinámica de filamentos de actina se ordena de nuevo rápidamente como respuesta a señales que vienen del exterior de la célula y que inciden sobre la membrana plasmática. Por lo tanto, el citoesqueleto de actina puede ser con siderado como una parte de los sistemas de transducción de señales celular, dis cutidos en el Capítulo 15: cuando se añaden determinados factores de creci miento al medio de cultivo de células quiescentes, por ejemplo, inmediatamente se forman lamelipodios que contienen actina y se mueven sobre la superficie ce lular. La respuesta del córtex de actina a las señales externas que llevan informa ción espacial puede ser altamente localizada. Anteriormente consideramos un ejemplo cuando discutimos la polarización de una célula T citotóxica inducida por el contacto con su célula diana, a la que seguidamente matará (véase Figura 16-11). En las células animales capacitadas para la quimiotaxis también se pro duce una polarización del córtex de actina inducida por una señal, que se define com o un movimiento en una dirección controlado por un gradiente de una substancia química difusible al que la célula es sensible. Un ejemplo muy bien estudiado es el movimiento quimiotáctico de ciertas células de la serie blanca (neutrófilos) hacia la fuente de infección bacteriana. Los neutrófilos tienen pro teínas receptoras en su superficie que les permiten detectar muy bajas concen traciones de péptidos N-formilados derivados de proteínas bacterianas (sólo los procariotas empiezan la síntesis proteica con una N-formil-metionina). Los neu trófilos pueden ser guiados hacia sus dianas con sólo una diferencia de concen tración de un 1% de estos péptidos difundibles, entre un lado de la célula y el otro. Otro ejemplo de quimiotaxis es el proporcionado por el moho del cieno, Dictyostelium discoideum. Estos eucariotas viven en el suelo de los bosques como células móviles independientes llamadas am oebae (amebas). Se alimentan de bacterias y de levaduras y, en condiciones óptimas, se dividen cada pocas ho ras. Cuando su suministro alimentario se agota, la ameba interrumpe su división y se agrupa formando estructuras minúsculas ( 1-2 mm), pluricelulares, parecidas a gusanos, que se arrastran como babosas y dejan rastros de cieno detrás de ellas (Figura 16-60). Mientras la babosa migra, las células comienzan a diferenciarse e inician un proceso que finaliza con la producción de una estructura muy peque ña parecida a una planta que consiste en un tallo y un cuerpo fructífero unas 30 horas después de haberse iniciado la agregación (Figura 16-61). El cuerpo fructí fero contiene un número muy grande de esporas, que pueden sobrevivir largos períodos de tiempo en condiciones ambientales extremadamente hostiles. Sólo cuando las condiciones son favorables, las esporas germinan y producen las amebas libres que empiezan el ciclo de nuevo. Las amebas Dictyostelium se agregan mediante quimiotaxis migrando hacia una fuente de AMP cíclico, secretada por las amebas hambrientas. Al igual que los neutrófilos, las amebas reorientan su borde frontal de avance para migrar hacia el gradiente quimioatrayente superficial. Y cuando se exponen a una fuente local de AMP cíclico que sale de una micropipeta, las amebas extienden apéndices que contienen actina, directamente hacia la pipeta (Figura 16-62). Este experimento demuestra que la quimiotaxis eucariota implica la detección directamente de un gradiente espacial de una concentración de atrayente, a diferencia de la quimiota xis bacteriana, que utiliza una variación de la concentración dependiente del tiem po para detectar los gradientes, como discutimos en el Capítulo 15. La reacción del citoesqueleto de Dictyostelium al AMP cíclico puede exami narse mediante Usados de estas células poco después de su estimulación con una solución rica en AMP cíclico. Como se muestra en la Figura 16-63, a los 5-10 segundos de añadir el AMP cíclico se produce una estallido dramático de poli merización de actina, que corresponde al tiempo necesario para la extensión de la célula en el substrato. Entre los 20 y 40 segundos después del pulso de AMP cí clico, la actina se despolimeriza y la célula se redondea. Entonces se produce un estallido de polimerización de actina más prolongado, en forma de un recluta miento en el citoesqueleto de proteínas de unión a la actina a partir de acervos
Filamentos de actina
t__________ i 1 mm Figura 16-60 Micrografía óptica de una babosa del moho del cieno Dictyostelium discoideum migrando. (Por cortesía de David Francis.)
i___________ i 2 mui Figura 16-61 Micrografía óptica del cuerpo fructífero de Dictyostelium discoideum. (Por cortesía de John Bonner.)
891
Figura 16-62 Respuesta quimiotáctica de la ameba
Dictyostelium discoideum. La ameba
I-----------
50 jim
solubles; durante este último período las células que responden al AMP cíclico empiezan a formar lamelipodios y otras expansiones ricas en actina.
tiene receptores para el AMP cíclico en su membrana plasmática, que la capacitan para arrastrarse hacia una fuente extracelular de AMP cíclico. En este experimento se libera AMP cíclico desde la punta de una micropipeta, que puede verse en la parte inferior de las micrografías; la respuesta que se muestra se produce en menos de un minuto. (Por cortesía de Günther Gerisch.)
Proteínas G heterotrim éricas y pequeñas GTPasas transm iten señales desde la superficie celular al córtex de actina41 ¿De qué forma la unión del AMP cíclico a su receptor desencadena la polimeri zación masiva de actina en la am eba de Dictyostelium? Se sabe que el receptor activa una proteína G heterotrimérica. El citoplasma contiene una reserva de monóm eros de actina, los cuales, tal y como vimos anteriormente, están estabi lizados m ediante proteínas de unión al monómero de actina. La estimulación de la polimerización de la actina supone que estas moléculas de actina tienen que estar disponibles para polimerizar y tam bién será necesario superar la barrera cinética para la nucleación. La proteína de unión al monómero de actina, profílina, se une estrecham ente a los fosfolípidos de inositol de la mem brana plas mática, que generan señales intracelulares como respuesta a ligandos extracelulares (véase Figura 15-30). De acuerdo con una hipótesis, la activación de esta vía de señal (que se produce a través de una proteína G heterotrimérica) podría liberar la profilina de la m em brana plasmática y dejarla libre en el citosol. La profilina puede catalizar el recam bio ATP-ADP de la actina in vitro, así que cuando es liberada desde la m em brana plasmática puede, rápidamente, conver tir la actina inactiva unida a ADP en actina activa unida a ATP, induciendo la formación local de filamentos de actina. Las proteínas G tam bién están implicadas en los procesos de señalización que activan el córtex de actina durante la respuesta quimiotáctica de los neutró-
Figura 16-63 Efecto del AMP cíclico sobre el córtex de actina de la ameba Dictyostelium discoideum. La gráfica (línea verde) muestra las cantidades relativas de actina filamentosa asociada con el citoesqueleto a distintos tiempos de la adición repentina de AMP cíclico.
estirada
t
cAMP
añadido 0
892
Capítulo 16: El citoesqueleto
30
60 90 tiem po de adición de cAMP (seg)
filos y en la activación de las plaquetas sanguíneas. Disponemos de datos evi dentes de que dos pequeñas GTPasas relacionadas con la proteína Ras conoci das como Rho y Rae, intervienen en este proceso; se ha visto que estas proteínas tienen diversos efectos sobre el citoesqueleto de actina en los fibroblastos. La m icroinyección de la proteína Rae en células en cultivo provoca, al cabo de 5 mi nutos, un incremento dramático de la formación de lamelipodios. Además, un mutante dominante negativo de Rae inhibe la formación de lamelipodios indu cida normalmente por diversos factores de crecimiento. Esto indica que la res puesta a los factores de crecimiento es dependiente de la proteína Rae. La mi croinyección de la proteína Rho comporta la aparición de grandes haces de filamentos de actina conocidos como fibras de estrés y el incremento de contac tos focales, lugares donde la célula se une al substrato externamente y donde las fibras de estrés están ancladas interiormente (como veremos más adelante). Se cree que la proteína Rho también es necesaria para la formación del anillo con tráctil durante la división celular. Sin embargo, Rae y Rho no sólo controlan la polimerización de los filamentos de actina sino que también dirigen la organiza ción de estos filam entos formando algunos tipos determinados de estructuras.
Los m ecanism os de polarización celular pueden ser analizados en las células de levadura42 Se han obtenido indicaciones adicionales sobre cómo las células pueden orien tar las actividades de su citoesqueleto, a partir del estudio del comportamiento de las células de levadura. La facilidad de realizar un análisis genético en las le vaduras ha proporcionado una fuente importante de información fundamental acerca de los mecanismos biológicos comunes a todas las células eucariotas. Concretamente, estudios acerca de las interacciones entre levaduras durante el apareamiento han iniciado la identificación de mecanismos mediante los cuales las células eucariotas se convierten en estructuras polarizadas. En la levadura de gemación Saccharomyces cerevisiae, células con dos tipos de apareamiento dis tintos, a y a , secretan hormonas conocidas como factor a y factor a, respectiva mente. Estas hormonas actúan a través de su unión a receptores de la superficie celular que pertenecen a la gran familia de receptores relacionados con proteína G, discutidos en el Capítulo 15. Una consecuencia de la unión del factor a a su receptor en una célula a es la conversión de la célula en una célula polarizada que adopta una forma conocida como “shm oo” (Figura 16-64). Si existe un gra diente de factor a, el extremo de “shm oo” se dirige hacia la zona donde se en cuentra la concentración más elevada de esta molécula. Durante esta polarización la levadura sufre reorganizaciones del citoesque leto que son paralelas a las que aparecen en las células animales cuando se con vierten en polarizadas. Los filamentos de actina se congregan en la punta del borde “shm oo”, desde donde se cree que dirigen la secreción local de com po nentes de la pared celular -dirigiendo posiblemente el transporte de vesículas portadoras de estos com ponentes hacia el borde de “shm oo”. Al mismo tiempo, el centro organizador de microtúbulos [en este caso, el corpúsculo polar del huso (spindle pole body)], véase Figura 17-24) se desplaza hacia el lado del núcleo que está muy relacionado con el borde de “shm oo”, y los microtúbulos se extienden
(A) Filamentos de actina
(B)
(C)
Figura 16-64 Polarización morfológica de las células de levadura. Normalmente las células de Saccharomyces cerevisiae son esféricas (A), pero pueden convertirse en polarizadas cuando se tratan con un factor de apareamiento (B). Las células polarizadas se llaman “shmoos”, debido al famoso personaje de cómic de Al Capp (C). (Ay B, cortesía de Michael Snyder; C, © 1948 Capp Enterprises, Inc., reservados todos los derechos.)
893
desde allí hacia el borde de la célula. Mediante la observación de células mutantes que no forman shmoo durante el apareamiento, se han identificado muchos de los genes implicados en la polarización de las levaduras. Parece que algunas de las proteínas que codifican estos genes estarían implicadas en la polarización en las células animales.
Resumen La actina es una proteina del citoesqueleto altamente conservada que se encuentra a concentraciones elevadas en casi todas las células eucariotas. La actina purifica da se encuentra en forma de monómero en soluciones de baja fuerza iónica y al añadir una sal que contenga ATP se ensambla espontáneamente formando fila mentos de actina. Al igual que la tubulina, la polimerización de la actina es un pro ceso dinámico que se encuentra regulado por la hidrólisis de un nucleótido al que cada molécula está estrechamente unida (el ATP en este caso). En las células, apro ximadamente la mitad de la actina se encuentra en forma monomérica gracias a su unión a determinadas proteínas de bajo peso molecular como la timosina. En el córtex de las células animales, las moléculas de actina polimerizan y despolimerizan continuamente generando protrusiones en la superficie celular tales como los lamelipodios y las microespinas. La polimerización puede ser regulada por señales extracelulares que se unen a receptores de la superficie celular y que actúan a través de proteínas G heterotriméricas y de pequeñas GTPasas como RacyRho.
Proteínas de unión a la actina43 La actina está implicada en un abanico notablem ente amplio de estructuras, desde extensiones rígidas y relativamente permanentes de la superficie celular hasta redes tridimensionales dinámicas en el borde frontal de avance de una cé lula que está migrando. En cada célula viva coexisten estructuras muy distintas, basadas en la actina. En cada caso la estructura fundamental del filamento de actina es la misma. Lo que varia es la longitud de estos filamentos, su estabilidad y el número y la geometría de sus uniones (tanto las uniones de unos filamentos con otros como las uniones con otros com ponentes celulares). Estas propieda des dependen, a su vez, de una gran grupo de proteínas de unión a la actina, que se unen a la actina y modulan sus propiedades y sus funciones. En este apartado describimos algunas de las proteínas de unión a la actina más importantes y las estructuras que forman. Muchas de estas proteínas se en cuentran en el perímetro celular, en la capa rica en actina que se encuentra justo debajo de la mem brana plasmática, llamada córtex celul ir. Esta capa proporcio na fuerza m ecánica a la célula animal y le permite llevar a cabo una gran varie dad de movimientos superficiales, tales como la fagocitosis, la citocinesis (divi sión celular), y el movimiento celular.
Un citoesqueleto unido de m anera sencilla a la m em brana proporciona soporte m ecánico a la m em brana plasmática de los eritrocitos44 Como se explicó en el Capítulo 10, las proteínas espectrina y anquirina fueron descubiertas como com ponentes importantes del citoesqueleto que se halla asociado a la mem brana de los glóbulos rojos sanguíneos (eritrocitos). Estas cé lulas excepcionales han perdido el núcleo y los compartimentos membranosos internos de tal manera que la única mem brana de la célula es la membrana plas mática. Esta mem brana está sostenida por una red bidimensional de tetrámeros de espectrina conectados por sus extremos por filamentos muy cortos de actina. La espectrina está unida a la cola citoplasmàtica de una proteína transportadora transmembrana muy abundante (banda 3) a través de puentes de anquirina (véa se Figura 10-26). En la superficie de muchas células de vertebrados se encuen
894
Capítulo 16 : El citoesqueleto
tran parientes muy próximos de la espectrina (también llamada fodrina ) y de la anquirina. Así, la disposición detallada de las proteínas en la corteza del eritroci to también proporciona un modelo simplificado de la red del citoesqueleto ba sado en actina que sostiene la membrana plasmática en todas las demás células animales. Los filamentos de actina en el córtex del eritrocito son muy cortos, y tan sólo actúan como elementos de entrecruzamiento entre los tetrámeros de espectri na. Al contrario, en el córtex de una célula más típica, son mucho más largos y así se proyectan hacia el citoplasma, donde forman la base de una red tridimen sional de filamentos de actina. No está nada claro si las moléculas parecidas a la anquirina servirían de anclaje a la membrana plasmática para esta disposición cortical más típica, aunque se cree que en algunas células epiteliales la ATPasa de Na+-K+ transmembrana (discutida en el Capítulo 11) uniría esta red cortical de actina a la membrana plasmática a través de este tipo de proteínas. Generalmente la red cortical de filamentos de actina determina la forma y las propiedades m ecánicas de la membrana plasmática. Muchos tipos de unio nes a mem brana necesitan de los filamentos de actina para llevar a cabo sus di versas funciones en el córtex; el acoplamiento a proteínas transmembrana a tra vés de la anquirina es únicamente uno de ellos. Existen otros tipos de uniones más dinámicas, pero tan sólo empiezan a ser caracterizadas las proteínas que los median.
Proteínas de entrecruzamiento con diferentes propiedades organizan ensam blajes particulares de actina43 En las células animales los filamentos de actina corticales están organizados en tres tipos generales de disposiciones (Figura 16-65). En haces paralelos, tal como se encuentran en las microespinas y en los filopodios: los filamentos están orientados con la misma polaridad y están espaciados muy regularmente (sepa rados 10-20 nm). En haces contráctiles, encontrados en las fibras de estrés y en el anillo contráctil que divide la célula en dos durante la mitosis: los filamentos se encuentran orientados con polaridades opuestas, mucho más espaciados (sepa rados 30-60 nm) y presentan la proteína motora miosina-II (se discute más ade lante). En las redes parecidas a geles del córtex celular: los filamentos están dis puestos de forma relativamente más relajada, en disposiciones abiertas con interconexiones ortogonales. ¿Cómo se generan y se mantienen estas diferentes disposiciones del mismo filamento de actina en una misma célula? Aunque no
Figura 16-65 Tres tipos de disposiciones corticales de los filamentos de actina. Se muestra una célula arrastrándose, con tres áreas ampliadas para evidenciar la disposición de los filamentos de actina dibujados a escala. Las puntas de flecha apuntan hacia el extremo más de los filamentos.
haz contráctil
red a m odo de gel
haz paralelo denso
I_______ I
100 nm
Proteínas de unión a la actina
895
filam entos de actina y a-actinina
filam entos de actina y ibrina
L
(A)
haz contráctil em paquetam iento laxo que perm ite a la m olécula de m iosina-ll entrar en el haz
50 nm haces paralelos em paquetam iento apretado que im pide la entrada de m iosina-ll en el haz
conozcam os totalm ente la respuesta, las proteínas de entrecruzamiento de los f i lamentos de actina tienen claram ente una gran importancia. Las proteínas de entrecruzamiento pueden dividirse en dos clases -proteí nas que form an haces y proteínas que form an geles- de acuerdo con su efecto in vitro sobre los filamentos de actina puros. Las proteínas que forman haces en trecruzan los filamentos de actina en disposiciones paralelas y son importantes en la formación tanto de las íntimas disposiciones paralelas como de los haces contráctiles más espaciados descritos anteriormente. Al contrario, las proteínas que forman geles entrecruzan los filamentos de actina en intersecciones en dia gonal, creando los geles laxos. La fim brina y la a-actinina son proteínas formadoras de haces ampliamente distribuidas. La fimbrina se encuentra en los haces de filamentos paralelos del borde frontal de las células, particularmente en las microespinas y en los filopodios, y se cree que es la responsable de la asociación íntima de los filamentos de actina en estas disposiciones. La segunda proteína formadora de haces, la a -actinina, se concentra en las fibras de estrés, donde se cree que es la responsable, en parte, de los entrecruzamientos relajados de los filamentos de actina en estos haces contráctiles; tam bién interviene en el anclaje de los extremos de las fibras de estrés en los contactos focales. Tal y como explicaremos más adelante, la miosina es la proteína motora en las fibras de estrés y en otras disposiciones con tráctiles y es la responsable de su contractibilidad. Parece que el íntimo em pa quetamiento de los filamentos de actina causado por la fimbrina excluye a la miosina, mientras que el empaquetamiento relajado provocado por la a-actin i na permitiría la entrada de las moléculas de miosina; de todas formas, el dife rente espaciamiento provoca que cada una de las dos proteínas formadoras de haces excluya a la otra (Figura 16-66). La filamina es una proteína formadora de geles ampliamente distribuida. Aunque no se encuentra ni en las fibras de estrés ni en el borde delantero, se en cuentra enriquecida en el córtex. La filamina es un homodímero que permite la formación de redes laxas y altamente viscosas al unir dos filamentos de actina y entrecruzarlos uno con otro (Figura 16-67). Es una proteína abundante en mu-
IB)
100 nm
Figura 16-66 La formación de dos tipos de haces de filamentos de actina. (A) La a-actinina, que es un homodímero, entrecruza los filamentos de actina en haces laxos, que permiten a la proteína motora miosina-II (no se muestra) participar en el ensamblaje. La fimbrina entrecruza los filamentos de actina en haces apretados, que excluyen a esta proteína. La fimbrina y la a-actinina tienden a excluirse la una a la otra a causa del espaciado de los diferentes haces de filamentos de actina que forman. (B) Electronmicrografía de moléculas de a-actinina purificadas. (B, por cortesía de John Heuser.)
dím ero de
Figura 16-67 La filamina entrecruza los filamentos de actina formando una red tridimensional con las propiedades físicas de un gel. Cada homodímero de filamina tiene cerca de 160 nm de longitud cuando está totalm ente extendido y forma una unión flexible con un ángulo elevado entre dos filamentos de actina adyacentes. La filamina puede constituir un 1% de la proteína total de la célula. Hay una molécula de filamina por cada 50 m onómeros de actina.
896
Capítulo 16: El citoesqueleto
50 nm
espectrina (tetràmero) ''--•/v--''/'''-''V'-''a'~-'/'^--''V'->;''^ ^ ^ -----<*v—«A-----A-----A-----A----A-----A---------------------------------------------------------------------------------- )
o cH
fim brina (m onóm ero)
■ cccooo o o cccc* a-actinina (dimero)
filam ina (dimero) 50 nm
chas células animales, lo cual refleja el predominio de las redes laxas en la orga nización de la actina.
Las proteínas de unión a la actina con propiedades diferentes están construidas a partir de módulos sem ejantes45 La fimbrina, la a-actinina, la filamina y la espectrina presentan todas ellas dos dominios de unión al filamento de actina, con lo cual no es de extrañar que cada una necesite entrecruzar dos filamentos. Sorprendentemente, la estructura de los dominios de unión a la actina de estas proteínas es parecida. En estas cuatro proteínas, la longitud y la flexibilidad de las secuencias espaciadoras que sepa ran los dos lugares de unión a la actina son distintas, y estas diferencias determi nan las propiedades diferenciales de los cuatro entrecruzamientos. Evidente mente, estas proteínas han derivado a partir de una proteína de unión a la actina ancestral común mediante la adición de secuencias espaciadoras distintas (Fi gura 16-68).
La gelsolina, cuando se activa por Ca2+, fragmenta los filamentos de actina46 Cuando se calientan a 37°C en presencia de ATP extractos preparados a partir de alguno de entre muchos tipos celulares, forman un gel. Aunque esta gelificación depende tanto de los filamentos de actina como de una proteína de entrecruzamiento como la filamina, el gel presenta un comportamiento más complejo que las mezclas simples de filamentos de actina y de filamina. Por ejemplo, si se in crementa la concentración de Ca2+ por encima de 10~7 M, el gel semisólido de ac tina empieza a licuar -proceso conocido como solación. Al microscopio se pue de observar que algunas regiones del gel solante presentan vigorosas corrientes locales. Así pues, es evidente que, además de la actina y de la filamina, en el ex tracto celular han de existir otros componentes responsables de este comporta miento. Es probable que estos componentes estén implicados en las corrientes citoplasmáticas observadas en algunas células grandes, en las que se requieren vigorosos movimientos de flujo para mantener una distribución determinada de metabolitos y de otros componentes citoplasmáticos. Al parecer estos movi mientos están asociados a un cambio local repentino del citoplasma desde una consistencia gelificada a un estado más fluido. A partir de extractos se han aislado algunas proteínas celulares que cuando se añaden a un gel de filamentos de actina y filamina provocan que, en presencia de Ca2+, el gel cambie a un estado más fluido. La mejor caracterizada de estas pro teínas es la gelsolina, que, cuando se activa por la unión al Ca2+, separa los fila mentos de actina y forma un casquete en el extremo más del filamento que ahora está asequible, deshaciendo así la red entrecruzada de filamentos de actina. En la corteza de muchos tipos de células de los vertebrados se han encontrado proteí nas similares a ésta; estas proteínas fragmentadoras se activan por concentracio nes de Ca2+ (aproximadamente 10-6 M) que se alcanzan sólo temporalmente en el citosol.
Proteínas de unión a la actina
Figura 16-68 Estructuras modulares de cuatro proteínas de unión a la actina. Cada una de las proteínas mostrada tiene dos lugares de unión a la actina (en rojo) que están relacionados entre sí en cuanto a su secuencia. La fimbrina tiene dos lugares de unión a la actina, adyacentes, de forma que une sus dos filamentos de actina muy juntos (14 nm de separación), alineados con la misma polaridad (véase Figura 16-66). Los dos lugares de unión a la actina de la molécula de a-actinina están más separados, conectados por un espaciador flexible de 30 nm de longitud, con lo cual forman haces de filamentos de actina con una mayor separación entre los filamentos (40 nm de separación). La filamina tiene dos lugares de unión a la actina que están muy separados, con una unión en forma de V entre ellos, y así entrecruza filamentos de actina formando una red con los filamentos orientados casi en ángulo recto el uno respecto al otro (véase Figura 16-67). La espectrina es un tetràmero de dos subunidades a y dos subunidades p, y el tetràmero tiene dos lugares de unión a la actina separados unos 200 nm. Las regiones espaciadoras de estas proteínas se construyen de manera modular a partir de unidades de repetición que incluyen zonas en hélice a (verde claro), zonas de lámina (3 {verde oscuro), y dominios de unión al Ca2+ (óvalos azules).
897
Una de las funciones que se postula para estas proteínas fragmentadoras es la de ayudar a la relajación o licuación local del córtex celular, permitiendo que se produzcan procesos de fusión de membrana. Por ejemplo, cuando una célula fagocítica sanguínea engulle a un microorganismo, el fagosoma que se forma está inicialmente cubierto, por el lado citoplasmático, por una gruesa red de fila mentos de actina originados a partir del córtex. Para que este fagosoma pueda fusionarse con los lisosomas, estos filamentos de actina han de despolimerizarse para permitir el contacto íntimo entre las membranas del fagosoma y la del lisosoma. Esta desaparición de la actina puede prevenirse reduciendo artificialmen te la concentración del ion Ca2+, a través de la acción de la gelsolina (o de una proteína similar). Se cree que la gelsolina también es necesaria para que la célula se arrastre a lo largo de un substrato, aunque se desconoce su papel exacto en este proceso. Una mezcla de filamentos de actina purificada, filamina, y gelsolina es ca paz de experimentar transiciones de gel a sol dependientes de Ca2+, pero no pue de contraerse ni presentar los movimientos de flujo que presentan los geles cru dos ricos en actina obtenidos a partir de la célula. Estas actividades requieren la presencia de otro tipo de proteína de unión a la actina -la proteína motora m io sina. Si la miosina se elimina selectivamente de los geles crudos ricos en actina, desaparecen com pletamente las contracciones y las corrientes, lo cual sugiere que la fuerza que provoca las corrientes citoplasmáticas está generada por una interacción entre la actina y la miosina.
En las células eucariotas se han encontrado múltiples tipos de m iosina47 La cinematografía a intervalos de tiempo revela que el córtex de las células está en continuo movimiento. En la sección anterior remarcamos la importancia de la polimerización y despolimerización de la actina en estos movimientos, pero, al igual que en los microtúbulos, las proteínas motoras también son muy impor tantes. Todas las proteínas motoras de los filamentos de actina que han sido identificadas pertenecen a la familia de las miosinas. Las m iosinas fueron aisla das originalmente gracias a su capacidad para hidrolizar el ATP a ADP i P¡ cuan do se unen a la actina, y esto se ha mantenido como criterio bioquímico útil para su identificación. Esta actividad motora de las miosinas también se puede ob servar directam ente si son adsorbidas encim a de un cubreobjetos de cristal: cuando se añade ATP a una preparación de filamentos de actina fluorescentes, se puede observar con un microscopio de fluorescencia cómo los filamentos se deslizan sobre la superficie del cristal cubierta por la miosina. Las miosinas des cubiertas más recientem ente también se han identificado mediante la secuenciación de su DNA antes incluso de su caracterización funcional o bioquímica. La miosina, distribuida a lo largo de la actina, fue descubierta en el músculo esquelético, y es en este tejido donde se ha aprendido la mayor parte de lo que se conoce acerca de la interacción entre estas dos proteínas. La miosina muscu lar pertenece a la subfamilia m iosina-II de las miosinas. Todas ellas tienen dos cabezas y una larga cola, parecida a una varilla: cada cabeza presenta tanto la actividad ATPasa como la motora. Una proteína del tipo miosina-II está formada por dos cadenas pesadas idénticas, cada una de las cuales está complejada a un par de cadenas ligeras. El fragmento amino terminal de la cadena pesada forma el dominio motor mientras que la mitad del extremo carboxilo terminal de la ca dena pesada se extiende en forma de hélice a. Dos cadenas pesadas se entrela zan a través de sus dominios de cola en hélice a formando un sobreenrollamiento que da lugar a un dímero estable formado por dos cabezas y una única cola parecida a una varilla (Figura 16-69). La función más importante de la cola semejante a una varilla de la miosina-II es la de permitir la polimerización de las moléculas formando filamentos bipola res. Esta polimerización es crucial para el desarrollo de la función de la miosinaII, es decir, la de mover grupos de filamentos de actina opuestos, tal y como su-
898
Capítulo 16: El citoesqueleto
Figura 16-69 M iosina-II. (A) Una molécula de miosina está compuesta por dos cadenas pesadas (cada una de las cuales tiene alrededor de 2000 residuos de aminoácido de longitud) y cuatro cadenas ligeras. Las cadenas ligeras son de dos tipos (unas contienen alrededor de 190 residuos de aminoácidos y las otras alrededor de 170). En cada cabeza de miosina se halla presente una molécula de cada tipo (véase Figura 5-23). La dimerización se produce cuando las dos hélices a se enroscan la una alrededor de la otra formando un sobreenrollamiento en hélice a mediado por la asociación de aminoácidos hidrofóbicos separados regularmente. La disposición en sobreenrollamiento produce en solución una extensa cuerda; esta parte de la molécula se denomina el dominio de cuerda, o cola. Este tipo de estructura se encuentra en otras proteínas del citoesqueleto y les permite formar una estructura extendida. (B) Las dos cabeza globulares y la cola pueden observarse claramente en electronmicrografías de moléculas de miosina sombreadas con platino. (B, por cortesía de David Shotton.)
cede durante la contracción muscular. La miosina es relativamente abundante en el córtex celular; en los fibroblastos, por ejemplo, existe una molécula de miosina-II por cada 100 moléculas de actina. En el anillo contráctil los filamen tos de miosina son los responsables del movimiento de la membrana en el surco central durante la división celular, como discutimos en el Capítulo 18. Se cree que estos filamentos generan tensión en las fibras de estrés y también mucha tensión cortical que comportaría el tensamiento de la superficie celular. Su pa pel en la contracción muscular se describe al final de este capítulo. Además de la miosina-II, que generalmente es la miosina más abundante de la célula, las células no musculares disponen de diversas miosinas más peque ñas, la m ejor caracterizada de las cuales es la llamada m iosina-I (Figura 16-70). Se cree que la miosina-I es más parecida a la original, a una miosina más primiti va a partir de la cual habría evolucionado la miosina-II. Una única célula puede disponer de múltiples miosinas más pequeñas, cada una de las cuales está codi ficada por un gen distinto y también lleva a cabo una función diferente; la célula del moho del cieno Dictyostelium, por ejemplo, tiene al menos nueve de ellas. La característica más común de todas las miosinas es la de presentar un dominio motor muy conservado; el resto de dominios varían de una miosina a otra y deter minan el papel específico de la molécula en la célula. Además, las colas de miosi na pueden presentar un lugar de unión a la membrana y/o un lugar de unión a un segundo filamento de actina independientemente del dominio de cabeza. Depen diendo de su cola, una molécula de miosina puede mover una vesícula a lo largo de un filamento de actina, unir un filamento de actina a la membrana plasmática, o hacer que dos filamentos de actina queden íntimamente alineados y entonces se deslicen uno con respecto al otro (Figura 16-71). Todas las miosinas conocidas hidrolizan ATP para deslizarse a lo largo de los filamentos de actina desde el extremo menos hacia el extremo más. Dada la importancia de las proteínas motoras que se desplazan en direcciones opuestas Figura 16-70 Dos miembros de la familia de las miosinas. A la izquierda, se muestran la miosina-I y la miosinaII, dibujadas a escala, y alineadas respecto a sus lugares de unión al ATP y a la actina, altamente conservados. Las formas relativas de las proteínas completas se muestran a la derecha.
Proteínas de unión a la actina
899
m em brana plasmática
Figura 16-71 Posibles funciones de la miosina-I y la miosina-II en una célula eucariota típica. Las colas cortas de una molécula de miosina-I contienen lugares que unen los filamentos de actina a la membrana. Esto permite al dominio de cabeza desplazarse de un filamento de actina a otro (1), desplazar una vesícula a lo largo de un filamento de actina (2) o desplazar un filamento de actina hacia la membrana respecto a otro filamento de actina (4). Además, los pequeños ensamblajes antiparalelos de las moléculas de miosina pueden deslizar unos filamentos de actina sobre los otros, con lo cual median contracciones locales en un haz de filamentos de actina (3). En todos los casos el grupo de cabeza “cam ina” hacia el extremo más del filamento de actina con el que contacta.
a lo largo de los microtúbulos (véase Figura 16-37), no sería sorprendente descu brir un tipo adicional de proteínas motoras que se desplazaran hacia el extremo menos de los filamentos de actina.
En células no musculares pueden form arse transitoriam ente ensam blajes sem ejantes a los musculares48 En las células eucariotas superiores se forman transitoriamente haces contrácti les organizados de filamentos de actina y de filamentos de miosina para realizar una función específica y luego se deshacen. Más destacado aún, la división celu lar en las células animales es posible gracias a un haz a modo de cinturón de fila mentos de actina y de miosina, conocido como el anillo contráctil. Este anillo aparece justo debajo de la mem brana plasmática durante la fase M del ciclo de división celular; las fuerzas generadas por este anillo constriñen la mitad de la célula conduciendo a la eventual separación de las dos células hijas mediante un proceso conocido como citocinesis (Figura 16-72). El anillo contráctil se forma al iniciarse la división celular a partir de actina, miosina y otras proteínas. Este pro ceso puede seguirse mediante la tinción con anticuerpos fluorescentes antimiosina de las células en división. Por ejemplo, en los huevos del erizo de mar que están próximos a dividirse, las moléculas de miosina están al principio dis tribuidas uniformemente por debajo de la mem brana plasmática y luego, a m e dida que se forma el anillo contráctil, se desplazan a la región ecuatorial de la cé lula. Una vez se ha completado la división celular, las moléculas de miosina se dispersan de nuevo. Se desconoce cómo se controla este proceso, pero parece que estaría implicado el catión Ca2+ ya que la fosforilación de la miosina-II es de pendiente de Ca2+ y tanto el Ca2+ como la fosforilación increm entan la interac ción de la m iosina con la actina lo cual comporta la formación de filamentos bi polares cortos (Figura 16-73). Otro ejemplo de haces contráctiles temporales de filamentos de actina y de miosina son las fibras de estrés, que son com ponentes mayoritarios del citoesqueleto de los fibroblastos en cultivo (Figura 16-72). Aunque mucho más peque ñas y m enos organizadas, las fibras de estrés presentan un cierto parecido con
Figura 16-72 Haces contráctiles parecidos al del músculo en células no m usculares. Cada haz contiene filamentos de miosina-II además de filamentos de actina.
900
Capítulo 16 : El citoesqueleto
CE l JL A .
SÓ
anillo contráctil
n 'L U A l t ’II LIA!
cinturón adhesivo
F 3R B LA S TO E f Cl
í \O
cadenas ligeras de m iosina
lugar de unión a la actina [a d p |
FOSFORILACIÓN
ESPONTÁNEO
filam ento bipolar de 15-20 m oléculas
— cola de m iosina liberada ESTADO INACTIVO: (cadenas ligeras no fosforiladas)
ESTADO ACTIVO: (cadena ligera fosforilada)
Figura 16-73 Ensamblaje controlado de la miosina-II, formando filamentos. (A) La fosforilación controlada de una de las dos cadenas ligeras tiene al menos dos efectos in vitro: provoca un cambio en la conform ación de la cabeza de miosina, exponiendo su lugar de unión a la actina, y libera la cola de miosina de la "zona pegajosa” de la cabeza de miosina, permitiendo así a la molécula de miosina ensamblarse formando cortos filamentos bipolares. La enzima responsable de esta fosforilación (la quinasa de la cadena ligera de la miosina) se describe en relación con el músculo liso (véase Figura 16-98). (B) Tinción negativa de filamentos cortos de miosina-II que han sido inducidos a ensamblarse por fosforilación de sus cadenas ligeras. (Por cortesía de John Kendrick-Jones.)
las minúsculas miofibrillas del músculo (discutido más adelante) en cuanto a su estructura y a su función. Por uno de sus extremos se insertan en la membrana plasmática, mediante unas uniones especiales llamadas contactos focales, lugar donde la cara externa de la célula está íntimamente unida a la matriz extracelular (Figura 16-74); por el otro extremo se insertan en un segundo contacto focal o en una red de filamentos intermedios que rodea el núcleo celular. Las fibras de estrés se forman en respuesta a la tensión generada a través de la célula y se des ensamblan durante la mitosis cuando la célula se redondea y pierde sus uniones al substrato. También desaparecen rápidamente si se libera la tensión mediante un rayo láser, separando súbitamente un extremo de la fibra del contacto focal. Se cree que las fibras de tensión de los fibroblastos tisulares se contraen permi tiendo a las células ejercer tensión sobre la matriz de colágeno que las rodea -u n proceso esencial en la curación de las heridas y en la morfogénesis (véase Figura 19-48). En los epitelios, los haces de filamentos de actina que se extienden desde el citoplasma de una célula hasta el citoplasma de la célula vecina a través de las uniones celulares pueden aparecer y desaparecer de una manera semejante; es tos haces de filamentos, ligados de extremo a extremo a través de las uniones célula-célula, pueden formar cables y generar tensión a lo largo de líneas de estrés particulares en las láminas multicelulares.
Proteínas de unión a la actina
Figura 16-74 Relación entre los contactos focales y las fibras de estrés en fibroblastos en cultivo. Los contactos focales puede observarse de forma óptima en células vivas mediante microscopio de contraste interdiferencial (A). En esta técnica, la luz se refleja a partir de la superficie inferior de una célula unida a un soporte de vidrio, y los contactos focales aparecen com o manchas negras. (B) La tinción de la misma célula (tras su fijación) con anticuerpos anti-actina muestra que la mayoría de los haces de filamentos de actina de la célula (o fibras de estrés) acaban en o cerca de un contacto focal. (Por cortesía de Grenham Ireland.)
901
No todos los ensam blajes contráctiles de los filamentos de actina de las cé lulas no musculares son transitorios. Por ejemplo, los que están asociados a uniones de anclaje intercelulares, los llamados cinturones de adhesión, son más permanentes. Los cinturones de adhesión (discutidos en el Capítulo 19), se en cuentran próximos a la superficie apical de las células epiteliales (véase Figura 16-72). Se cree que, entre otras funciones, desempeñan un papel importante en el plegamiento de las capas de células epiteliales durante la embriogénesis. El mecanism o de contracción de todos estos haces del citoesqueleto se basa en un deslizamiento interdigitado de los filamentos de actina y miosina impul sado por el ATP. Se cree que es necesario un tipo particular de ensamblaje orde nado, que explicaremos más adelante cuando tratemos del músculo.
Los contactos focales perm iten que los filam entos de actina se extiendan hacia el substrato49 Para extenderse sobre la matriz extracelular o sobre la superficie de otra célula, una fibra de estrés ha de estar firmemente unida a un lugar adecuado de la m em brana plasmática. Los anclajes entre los filamentos de actina del interior de la célula y la matriz extracelular exterior están mediados por proteínas trans mem brana unidas a glucoproteínas de la membrana plasmática. Los anclajes m ejor caracterizados son los que forman los fibroblastos en cultivo. Cuando los fibroblastos crecen en una placa de cultivo, la mayoría de su superficie está se parada del substrato por un espacio de más de 50 nm; pero en las zonas de los contactos focales (placas de adhesión), este espacio se reduce a entre 10 y 15 nm. En estas zonas la m em brana plasmática está unida a componentes de la matriz extracelular que se han adsorbido en la placa de cultivo. Mediante tinción con anticuerpos anti-actina, puede observarse cómo estas regiones son los lugares donde los extremos de las fibras de estrés se unen a la membrana plasmática (véase Figura 16-74). Las principales proteínas de unión transmembrana de los contactos focales pertenecen a la familia de las integrinas, cuyo dominio externo se une a un com ponente de la matriz extracelular mientras que el dominio citoplasmático se une a los filamentos de actina de las fibras de estrés. La unión es indirecta y está me diada por múltiples proteínas de anclaje (Figura 16-75). El dominio citoplasmáti co de la integrina se une a una proteína llamada talina, que a su vez se une a la vinculina, proteína que se encuentra también en otras uniones que contienen fi lamentos de actina, como por ejemplo las uniones adherentes (discutido en el Capítulo 19). La vinculina se une a la a-actinina que tam bién está unida a un fi lamento de actina. Aunque la topología exacta de las interacciones proteicas en los contactos focales no está establecida, en la Figura 16-75B se muestra una po sible disposición de todas estas proteínas. Además de su papel como anclas para la célula, los contactos focales pue den tam bién transmitir señales desde la matriz hasta el citoesqueleto. Algunas proteína quinasas, incluyendo la tirosina quinasa codificada por el gen src, se lo calizan en los contactos focales, y existen indicios de que su actividad cambia con el tipo de substrato sobre el cual la célula descansa. Estas quinasas pueden fosforilar diversas proteínas diana, incluyendo algunos componentes del citoes queleto, y así regular la supervivencia, el crecimiento, la morfología, el movi miento, y la diferenciación de las células como respuesta a la matriz extracelular de su entorno.
Los microvilli ilustran de qué form a los haces de filamentos entrecruzados de actina pueden estabilizar zonas locales de la m em brana plasm ática50 Los m icrovilli son extensiones digitiformes que se encuentran en la superficie de muchas células animales. Son especialmente abundantes en las células epite liales que para funcionar de una manera eficiente han de presentar una gran
902
Capítulo 16: El citoesqueleto
(A)
(B)
filam ento de actina a-actinina
proteína d capucha
UNIÓN DE LA CÉLULA A UNA MATRIZ EXTRACELULAR
vinculina paxilina talina receptor de fibronectina
50 nm
CITOSOL
\
MATRIZ EXTRACELULAR área superficial. Por ejemplo, una sola célula epitelial del intestino delgado hu mano tiene varios miles de microvilli en su superficie apical. Cada uno de ellos tiene aproximadamente 0,08 pm de ancho y 1 pm de largo, de forma que la su perficie de absorción de la célula es 20 veces mayor de lo que sería sin los m icro villi. La membrana plasmática que recubre estos microvilli está altamente espe cializada, y contiene una gruesa cubierta extracelular de polisacáridos y de enzimas digestivas. El citoesqueleto de los microvilli ha sido estudiado con deta lle -labor que no ha sido difícil ya que se trata de una estructura altamente espe cializada, comparada con las regiones menos especializadas del córtex celular. La zona central de cada microvillus intestinal contiene un haz rígido de entre 20 y 30 filamentos paralelos de actina que se extiende desde la punta del microvi llus hasta el interior de la corteza celular. Todos los filamentos de actina del haz están orientados de forma que sus extremos más apuntan hacia fuera del cuerpo celular y se mantienen unidos a intervalos regulares mediante proteínas formadoras de haces de actina. Aunque la fimbrina, la proteína formadora de haces de actina en las microespinas y los filopodios, interviene en la formación de los fila mentos de actina en los microvilli, la proteína formadora de haces de actina más importante es la villina, que se encuentra únicamente en los microvilli (Figura 16-76). La villina, igual que la fimbrina, entrecruza filamentos de actina en haces paralelos, pero tiene una secuencia de unión a la actina diferente. Cuando se in troduce villina en un cultivo de fibroblastos, los cuales normalmente no presen tan villina y sólo tienen unos cuantos microvilli pequeños, los microvilli existen tes se convierten en microvilli alargados y estabilizados e incluso se puede inducir la aparición de nuevos microvilli. Estos datos sugieren que la villina es principalmente la responsable de la formación de los largos microvilli de las cé lulas epiteliales.
Proteínas de unión a la actina
Figura 16-75 Modelo que explica de qué form a las integrinas de la m em brana plasm ática conectan los filamentos de actina intracelulares con la matriz extracelular en los contactos focales. La formación de un contacto focal tiene lugar cuando la unión de glucoproteínas de la matriz (tales como la fibronectina) de la superficie exterior de la célula hace que las moléculas de integrina se agreguen en el lugar de contacto, tal como se ilustra esquem áticam ente en (A). En (B) se muestra una posible disposición de las proteínas de unión intracelular que median la unión entre una integrina y un filamento de actina.
903
Figura 16-76 Un microvillus. Un haz de filamentos de actina paralelos, que se m antienen mediante las proteínas formadoras de haces de actina -villina y fim brina- forman la parte central de un microvillus. Los brazos laterales (formados de miosina-I y la proteína de unión al Ca2+, calmodulina) conectan los lados del haz de filamentos de actina a la m embrana plasmática contigua. Los extremos más de los filamentos de actina se hallan en el extremo del microvillus, donde están inmersos en una sustancia amorfa, muy electrodensa, de com posición desconocida.
La parte inferior del haz de filamentos de actina del microvillus está anclada en la corteza especializada de la región apical de la célula epitelial intestinal. Esta cor teza, conocida como la red terminal, contiene una densa trama de moléculas de espectrina que cubre una capa de filamentos intermedios (Figura 16-77). Se cree que la espectrina da rigidez y estabilidad al córtex, manteniendo los haces de actina en una proyección en ángulo recto hacia la superficie apical de la célula. El haz de filamentos de actina está unido a la membrana plasmática del mi crovillus mediante puentes laterales que pueden ser observados mediante electronmicrografías. Los puentes están formados por una forma de la miosina-I que tiene algunas calmodulinas unidas en la región de su cola (discutido en el Capítu lo 15). La miosina está orientada de forma que su cola está inmersa en la mem brana y su cabeza, unida a un ATP activo, contacta con los filamentos de actina. Resulta un misterio por qué una proteína motora es utilizada para unir los fila mentos de actina a la membrana de los microvilli. Si la miosina-I de la membrana de los microvilli fuera móvil, debería desplazarse hacia el extremo más del fila mento de actina en la punta del microvillus. Esto ha conducido a especular que posiblemente la miosina-I ayudaría a transportar membrana desde el extremo de los microvilli hacia su región central, formando vesículas en su extremo que serían entonces liberadas en el lumen del intestino, donde las enzimas digestivas que transportan continúan su acción.
región am orfa teñida densam ente extrem os más de los filam entos de actina
m em brana plasmática
brazos laterales (m iosina-I y calm odulina)
entrecruzam ientos (villina, fim brina)
El com portam iento de la corteza celular depende de un equilibrio de interacciones cooperativas y competitivas entre una gran colección de proteínas de unión a la actina Los ejemplos precedentes muestran que un mismo filamento de actina puede unirse a diferentes tipos de proteínas de unión a la actina, localizadas en distinpuentes do espectrina
híir tic filamentos de actina
membrana pías mítica
retí terminal
0,2 ijm 904
Capítulo 16 : El citoesqueleto
intermedios
Figura 16-77 Electronmicrografía por congelación de una célula epitelial intestinal, en la que se m uestra la red terminal por debajo de la m em brana plasm ática apical. Los haces de filamentos de actina que forman el núcleo del microvillus se extienden entre la red terminal, donde se unen conjuntam ente mediante un grupo complejo de proteínas del citoesqueleto, que incluyen la espectrina y la miosina-II. Por debajo de la red terminal se encuentra una capa de filamentos intermedios. (De N. Hirokawa y J.E. Heuser, J. Cell Biol. 91:399-409, 1981. Reproducido con permiso de copyright de The Rockefeller University Press.)
ENSAMBLAJE A
filam ina
s
la filam ina excluye tanto a la tropom iosina com o a la a-actinina
la unión de filam ina com pite con la m iosina-ll tram a de filam entos de actina entrecruzados
la tropom iosina excluye a la filam ina y perm ite que la a-actinina se una sólo al extrem o más
la tropom iosina increm enta la unión de m iosina-ll
tropom iosina
tas regiones del córtex, y que estas proteínas pueden ser segregadas en zonas distintas de la célula. ¿Qué impide que las distintas colecciones de proteínas se mezclen en el citoplasma? Parece probable que sean importantes las interaccio nes cooperativas y competitivas entre estas proteínas. Por ejemplo, un tipo de proteínas de unión a la actina que aún no hemos discutido se une a lo largo de los filamentos de actina. El ejemplo más extendido de esta clase son las tropom iosinas, que son proteínas rígidas en forma de varilla, denominadas así por sus similitudes con la miosina-II en cuanto a su patrón de difracción de rayos X. Al igual que la cola de la miosina-II, la tropomiosina es un dímero con dos cade nas en hélice a idénticas que se enrollan una sobre la otra formando un sobreenrollamiento. Al unirse a lo largo del filamento de actina, lo estabilizan y le dan consistencia. También inhiben la unión de la filamina a los filamentos de actina, lo cual explica probablemente por qué la tropimiosina y la filamina están distri buidas de forma diferencial en la célula. Por el contrario, la unión de la tropo miosina al filamento de actina incremente la unión de la miosina-II al filamento -u n ejemplo de interacción cooperativa (Figura 16-78). Así ahora podemos empezar a comprender cómo las fibras de estrés y las re des corticales de filamentos de actina pueden coexistir en un mismo citoplasma. En un lado de la célula -quizás nucleados en las adhesiones focales que se for man por la influencia de la proteína Rho activada- la tropomiosina, la miosinaII, y la a-actinina se asocian con los filamentos de actina e impiden la unión de la filamina; entonces, la actividad contráctil de la miosina-II favorece cambios en la organización que comportan la producción de las fibras de estrés. En otro lugar de la célula los filamentos de actina, deficientes en tropomiosina, se unen a la filamina, y producen una red laxa que proporciona un bajo número de luga res donde la a-actinina puede unirse a dos filamentos a la vez, con lo cual queda excluida; la inclinación de los filamentos en una red laxa tam bién puede impedir la unión de la tropomiosina, que prefiere los filamentos rígidos. Aunque esta ex plicación es parcialmente especulativa, puede ilustrar la vía básica por la cual una com binación de interacciones cooperativas y competitivas puede producir disposiciones de los filamentos de actina espacialmente diferenciadas en un mismo citoplasma. Se desconoce cómo se establecen estas diferencias locales postuladas que inician la formación de estos ensamblajes. También se descono ce cuántos tipos distintos de disposiciones de los filamentos de actina pueden coexistir en una célula -hay ciertamente algunos más de los dos que hemos mencionado. En la Figura 16-79 se resumen algunas de las proteínas de unión a la actina discutidas en esta sección.
Proteínas de unión a la actina
ENSAMBLAJE B
form ación de haces de filam entos contráctiles de actina
Figura 16-78 Algunos ejemplos de interacciones com petitivas y cooperativas entre proteínas de unión a la actina. La punta de flecha en el extremo de cada filamento indica el extremo menos. Tanto la tropomiosina com o la filamina se unen fuertem ente a los filamentos de actina, pero su unión es competitiva. Debido a que la tropom iosina se une a los filamentos de actina de forma cooperativa, tanto la tropomiosina com o la filamina predominan sobre largas zonas de la red de filamentos de actina. Otras proteínas de unión a la actina, com o la a-actinina y la miosina, serán excluidas de sus lugares específicos por interacciones competitivas. Así, por ejemplo, la a-actinina se une in vitro a todo lo largo de los filamentos purificados de actina pero en la célula, debido a la com petencia con otras proteínas, solamente se une de forma muy débil a los filamentos de actina, en los que está confinada a lugares cercanos a los extremos más. Alternativamente, la unión puede verse reforzada a través de uniones cooperativas; así, la tropomiosina increm enta la unión de la miosina a los filamentos de actina. Se cree que las múltiples interacciones que se producen entre los diferentes tipos de proteínas de unión a actina son los responsables de la com pleja variedad de redes de actina encontradas en todas las células eucariotas (véase Figura 16-79 para las claves de los símbolos).
905
FUNCIÓN DE LA PROTEINA
EJEMPLO DE PROTEÍNA
Forma filam entos
a c tin a
Fortalece los filam entos
tro p o m io s in a
Genera haces de filam entos
FORMAS, TAMAÑOS Y MASAS MOLECULARES COMPARATIVAS 50 nm i 370 x 43 kD/nm
i.
*— 2 X 35 kD
fim b rin a
O
a act
□ -------- - Q
Entrecruza los filam entos form ando un gel
í i 14;! 1l ì i 1! ti
Fragm enta filam entos
(Jí‘liU ïil!
Hace deslizar los filam entos
h i i osi na-II
Desplaza vesículas por encim a de los filam entos
m io ñ fi'.. - :
] 14 nm
68 kD
i
G
ïlîl
2 x in o k n
140 nr
2 x 270 kD
90 kD 2 x 260 kD ATP 150 kD
ATP 2 X 265 kD más 2 X 260 kD
Une los lados de los filam entos a la m em brana plasm ática
espt- ;i
Secuestra monómeros de actina
tim o s in a
«
P
|3
a
O 5 kD
La m igración de las células animales com porta tres subprocesos distintos dependientes de actina51 Los movimientos de deslizamiento de las células animales son de muy difícil ex plicación a nivel molecular. Diferentes partes de la célula cambian a la vez, y además no hay un único orgánulo locomotor fácilmente identificable (análogo al flagelo, por ejemplo). Aunque la actina es la base de la migración celular animal, puede sufrir diferentes tipos de modificaciones mientras la célula migra, ensam blándose en forma de lamelipodios o microespinas, asociándose con los contac tos focales, formando las fibras de estrés y otras muchas estructuras. Un informe completo tendría que dar una explicación molecular a estas transformaciones, explicar cómo están coordinadas en el tiempo y en el espacio y también informar de parámetros bioquímicos importantes tales como el desarrollo de la tensión cortical y la formación de fuertes uniones entre la célula y el substrato. Hay, a grandes rasgos, tres procesos distintos que pueden identificarse en los movimientos deslizantes de las células animales: la protrusión, en que los la melipodios y las microespinas (o filopodios) se extienden desde la parte anterior de la célula; la adhesión, en que el citoesqueleto de actina conecta con el subs trato; y la tracción, en que el cuerpo celular se mueve hacia adelante. La protrusión es una función del borde frontal de avance de la célula. Los la melipodios y las microespinas (o filopodios) ricos en actina se extienden hacia adelante sobre el substrato, proceso que va acompañado de la polimerización de la actina, descrita anteriormente. Parece probable que la protrusión sea condu cida por la polimerización de la actina en el borde frontal (Figura 16-58), pero ello aún es discutido. Los motores proteicos del tipo miosina-I se adhieren a la mem brana plasmática y podrían conducir a la célula hacia adelante moviéndose activamente a lo largo de los filamentos de actina. Aún existe otra posibilidad,
906
INTERACCION ESQUEMÁTICA CON LA ACTINA extrem o extrem o menos más . subunidad que se adiciona prefe rentemente
Capítulo 16 : El citoesqueleto
• •0
* *'
Figura 16-79 Algunos de los tres tipos de proteínas que se unen a la actina hallados en la m ayoría de células de los vertebrados. La actina se muestra en rojo, mientras que las proteínas de unión a la actina se muestran en verde. El peso molecular de cada proteína se da en quilodaltons (kD).
cortex de actina
lam elipodio
córtex som etido a tensión
substrato
la polim erización de la 1 actina en los extremos más extiende el lam elipodio
m ovim iento de la actina no polimerizada retraim iento
contactos focales
Figura 16-80 Modelo que explica cóm o las fuerzas generadas en el córtex rico en actina podrían desplazar la célula hacia adelante. La extensión dependiente de actina y la fijación de un lamelipodio en el borde frontal de avance estirarían el córtex de actina. La tensión cortical dirigiría el cuerpo de la célula hacia adelante disipando parte de la tensión. Se forman nuevos contactos focales y los viejos se desensamblan mientras la célula se mueve hacia adelante. Este mismo ciclo se repetiría una y otra vez, desplazando la célula hacia adelante de una forma gradual. Se muestra en rojo la actina cortical polimerizada nuevamente.
que ha sido sugerida a partir del movimiento de amebas gigantes, y es que las protrusiones aparezcan en el frente celular mediante la presión hidrostática ge nerada por la contracción del córtex celular. La adhesión al substrato de los filamentos de actina corticales se ha discuti do anteriormente cuando se describían los contactos focales, aunque hay es tructuras de adhesión especializadas presentes en los fibroblastos en cultivo que están asociadas a los extremos de las fibras de estrés. Rápidamente las células móviles -com o las amebas Dictyostelium y los glóbulos blancos- realizan más contactos difusos con el substrato. Se cree que a estos contactos pueden aplicar se principios similares: receptores transmembrana de proteínas de la matriz extracelular unen la membrana plasmática con el substrato, y los filamentos de ac tina del citoplasma interactúan con los dominios citoplasmáticos de estos receptores a través de las proteínas de unión a la actina. Se desconocen aún al gunos de los detalles de estas interacciones tan importantes, pero está claro que los contactos celulares con el substrato deben estar formándose y rompiéndose continuam ente mientras la célula se mueve. La tracción es quizás la parte más enigmática del movimiento celular. En muchos casos se cree que la fuerza para la locomoción celular se genera cerca del extremo anterior de la célula y que el núcleo y el volumen citoplasmático son arrastrados pasivamente en este movimiento. Se puede observar esta fuerza ge neradora de distintas formas. El extremo anterior de una célula puede contraer se activamente igual que una fibra muscular y entonces tirar de la parte trasera de la célula. Desde otro punto de vista, la polimerización de los filamentos de ac tina en el borde frontal de avance de la célula extiende también el córtex de acti na hacia adelante, y la parte trasera de la célula es entonces arrastrada hacia adelante por la fuerza contráctil resultante de la tensión cortical (Figura 16-80).
El m ecanism o de la locom oción celular puede ser diseccionado genéticam ente52 Una de las vías más poderosas para analizar el mecanismo de procesos celulares complejos es examinar el efecto de las mutaciones que resultan de supresiones, sobreexpresiones, o modificaciones de proteínas específicas. En el caso del movi miento de las células animales, las células ameboides del moho del cieno Dictyos telium son particularmente adecuadas para los análisis genéticos. Estas células tienen una forma y una manera de desplazarse que está íntimamente relacionada con la de las células de los organismos superiores. Además son haploides y, por
Proteínas de unión a la actina
907
tanto, son fácilmente manipulables mediante métodos de genética inversa. Por tanto, en estas células ha sido posible suprimir un número importante de proteí nas de unión a la actina y examinar su efecto sobre la locomoción celular. Por ejemplo, el papel de la miosina-II ha sido comprobado genéticamente mediante dos métodos. En uno, se ha substituido el gen de la miosina-II por una forma defectiva de este gen, mediante recom binación homologa (véase Figura 747), comportando la aparición de un mutante sin miosina-II. La segunda estrate gia es la de utilizar RNA antisentido (véase Figura 7-43) para inactivar el mRNA de la miosina-II, lo cual tiene esencialmente el mismo efecto que la estrategia ante rior. En un Dictyostelium normal que se desliza, la miosina-II está concentrada cerca de la parte trasera de la célula mientras que la miosina-I se concentra en el extremo anterior (Figura 16-81). En los mutantes, la miosina-I no ha cambiado pero no existe la miosina-II. Es de destacar que las células de Dictyostelium sin miosina-II pueden despla zarse todavía sobre el substrato y responder quimiotácticamente a una fuente de AMP cíclico, aunque ambos procesos están algo alterados. Por tanto, la miosinaII no es absolutamente imprescindible para la locomoción celular. La actividad protrusiva del extremo anterior de tales mutantes es bastante normal, pero el movimiento del cuerpo celular hacia adelante no es tan normal, lo cual sugiere que la miosina-II puede jugar un papel en la generación de la tracción. De todas formas, la miosina-I y la polimerización de la actina pueden conducir la célula hacia adelante a una velocidad razonable sin la ayuda de la miosina-II. Como era de esperar, las célula mutantes son incapaces de formar el anillo contráctil después de la mitosis y entonces se forma una célula gigante multinucleada. Estas células se dividen finalmente utilizando la locomoción celular que las rompe en dos partes. Es interesante especular que esta citocinesis depen diente del movimiento puede representar un m ecanismo de división celular pri mitivo y que la miosina-II podría haber evolucionado a partir de la miosina-I mediante selección natural, formando un aparato citocinético más eficiente.
Resumen Las múltiples formas y variadas funciones de la actina en las células eucariotas de penden de un repertorio versátil de proteínas de unión a la actina que entrecruzan los filamentos de actina formando geles laxos, los unen en forma de haces rígidos, los adhieren a la membrana plasmática, o los desplazan a la fuerza uno respecto al otro. Por ejemplo, la tropomiosina se une a lo largo de los filamentos de actina, convirtiéndolos en estructuras más rígidas y alterando su afinidad hacia otras pro teínas. La filam ina entrecruza los filamentos de actina formando geles laxos. La fim brinay la a-actininia form an haces de filamentos de actina paralelos. La gelsolina media una fragmentación dependiente de Ca2+ de los filamentos de actina, lo que provoca la solación de los geles de actina. Diversas formas de miosina utilizan la energía de la hidrólisis del ATP para desplazarse a lo largo de los filamentos de actina, transportando orgánulos rodeados de membrana de una región a otra de la célula o desplazando filamentos de actina adyacentes, uno contra otro. Se cree que colecciones de proteínas de unión a la actina actúan cooperativamente generando movimientos de la superficie celular, incluyendo la citocinesis, la fagocitosis y la lo comoción celular. Estos movimientos son difíciles de analizar a causa de los mu chos componentes implicados en ellos, pero aproximaciones genéticas, en las cuales se han mutado los genes que codifican proteínas de unión a la actina específicas, pueden mostrar la junción individual de las proteínas en cada proceso.
El músculo53 Muchas de las proteínas que se asocian a los filamentos de actina en las células eucariotas fueron descubiertas por primera vez en el músculo. La contracción muscular es el movimiento más familiar y mejor conocido de todos los tipos de
908
Capítulo 16: El citoesqueleto
5 |jm Figura 16-81 La localización de la miosina-I y de la miosina-II en una ameba deslizante normal de Dictyostelium. Se han marcado las dos formas de la miosina con anticuerpos específicos, cada uno acoplado a un marcador fluorescente distinto, y se han observado con el microscopio de fluorescencia. La miosina-II {rojo) se presenta a una elevada acumulación en el córtex posterior, mientras que la miosina-I {verde) está principalmente restringida al extremo anterior. También puede verse algo de miosina en vesículas endocíticas dentro del citoplasma. (Por cortesía de Yoshio Fukui.)
núcleo
m iofibrilla
Figura 16-82 Células del músculo esquelético (también denominadas fibras musculares). (A) En un individuo humano adulto, estas enormes células plurinucleadas tienen típicamente 50 pm de diámetro y pueden llegar a tener algunos centímetros de longitud. (B) Micrografía fluorescente que muestra la localización periférica del núcleo en el músculo de la rata (azul). (B, por cortesía de Nancy L. Kedersha.)
50 |jm movimiento de que son capaces los animales. En los vertebrados, por ejemplo, el correr, el andar, el nadar y el volar son dependientes de la capacidad del mús culo esquelético de contraerse rápidamente en su andamiaje de hueso, mientras que los movimientos involuntarios tales como el latido del corazón y el peristaltismo del intestino, dependen de la contracción del músculo cardíaco y del mús culo liso, respectivamente. Figura 16-83 Miofibrillas del músculo esquelético. (A) Electronmicrografía a bajos aumentos de una sección longitudinal de una fibra muscular esquelética de conejo, mostrando el patrón regular de bandas transversales. La célula contiene numerosas miofibrillas alineadas en paralelo (véase Figura 16-82). (B) Detalle de la fibra muscular esquelética de (A), mostrando porciones de dos miofibrillas adyacentes y la definición de sarcómero. (C) Diagrama esquemático de un sarcómero, mostrando el origen de las bandas oscuras y de las bandas claras observadas en las electronmicrografías. Los discos Z, en cada extremo del sarcómero, son los lugares de unión de los filamentos delgados (filamentos de actina); la línea M, o línea media, es el lugar donde se localizan las proteínas específicas que unen los filamentos gruesos adyacentes (filamentos de miosina-II) unos con otros. Las b an d as verdes an chas, que marcan la localización de los filamentos gruesos, son denominadas a veces b a n d as A, porque aparecen como anisótropas a la luz polarizada (es decir, su índice de refracción varía con el plano de polarización). Las b an d as rojas delgadas, formadas únicamente por filamentos delgados y con una densidad de proteínas menor, son relativamente isotrópicas a la luz polarizada, y a veces se denominan b an d as I. (A y B, por cortesía de Roger Craig.)
banda oscura banda clara í--------------) I-------------- 1 miofibrilla miofibrilla
disco Z f
(B)
-
sarcómero -2.2 um
- --
—
-
banda clara banda oscura banda clara
filam ento grueso (m iosina) filam ento delgado (actina) (C )
El músculo
909
Figura 16-84 Electronmicrografía de una sección transversal del músculo de vuelo de un insecto. Los filamentos de actina y de miosina están dispuestos siguiendo una regularidad cristalina. A diferencia de lo que ocurre en los vertebrados, los filamentos gruesos son huecos, tal com o se observa en la ampliación de la derecha. En la Figura 16-86 se muestra una sección longitudinal del músculo. La geometría de la trama hexagonal es ligeramente diferente en el músculo de los vertebrados. (De J. Auber, J. d e M icrosc. 8:197-232,1969.)
t____________________ I 1 ijm
Aunque el músculo es el ejemplo m ejor comprendido del movimiento basa do en la actina, fue desarrollado relativamente tarde en la evolución y está alta mente especializado si lo comparamos en las diversas células animales. En par ticular, las unidades contráctiles de las células musculares, basadas en la actina y en la miosina, las miofibrillas, no son lábiles como las estructuras basadas en la actina y en la miosina de las células no musculares.
Las m iofibrillas están formadas por ensam blajes repetitivos de filam entos gruesos y delgados54 Las esbeltas fibras musculares del músculo esquelético son enormes células in dividuales formadas durante el desarrollo embrionario, resultantes de la fusión de células individuales (discutido en el Capítulo 22). El núcleo de las células in tegrantes permanece en esta gran célula y se dispone justo debajo de la m em brana plasmática. Pero la mayor parte del citoplasma (unas dos terceras partes de su masa) está formado por m iofibrillas, que son los elementos contráctiles de la célula muscular. Las miofibrillas son estructuras cilindricas de 1 a 2 pm de diámetro, que a menudo son tan largos com o la célula muscular (Figura 16-82). Cada miofibrilla está formada por una cadena de minúsculas unidades con tráctiles, o sarcóm eros, cada uno de ellos de unas 2,2 pm de longitud, que confie ren a la miofibrilla de los vertebrados su apariencia estriada. A gran aumento, en cada sarcómero puede verse una serie de anchas bandas claras y oscuras; cada sarcómero está separado del siguiente por una línea electrodensa, situada en el centro de cada banda clara, denominada línea Z o disco Z (Figura 16-83). Cada sarcómero contiene un ensam blaje de filamentos parcialmente super puestos y paralelos. Los filam entos delgados están formados por actina con pro teínas asociadas que están unidas a los discos Z en uno de los extremos del sar cómero. Se extienden hacia el interior del sarcómero, donde se superponen con los filamentos grueso, que son polímeros de isoformas de la miosina-II específi cas del músculo (Figura 16-83C). Cuando se observa al microscopio electrónico un corte transversal de esta región de superposición, se puede ver que los fila mentos gruesos se hallan dispuestos siguiendo una trama hexagonal regular, con los filam entos delgados dispuestos regularmente entre ellos (Figura 16-84).
La contracción se produce por el deslizamiento de los filam entos de m iosina y de actina entre sí El acortam iento del sarcómero se produce por el deslizamiento de los filamen tos de miosina sobre los de actina, sin que se produzca ningún cambio en la Ion-
910
Capítulo 16: El citoesqueleto
filam ento delgado
filam ento grueso
Figura 16-85 Modelo de deslizamiento de los filamentos de la contracción muscular. Los filamentos de actina y de miosina se deslizan unos sobre otros, sin que se reduzca su longitud.
gitud de cada tipo de filamento (Figura 16-85). Este modelo de deslizamiento de los filamentos, propuesto por primera vez en 1954, fue crucial para entender el mecanismo de la contracción muscular. En las micrografías electrónicas a gran aumento se puede observar la base ultraestructural de la interacción generadora de la fuerza. Se puede observar cóm o los filamentos de m iosina presentan numerosos brazos laterales dimi nutos, o puentes cruzados, que atraviesan la separación de unos 13 nm, en trando en contacto con los filam entos de actina adyacentes (Figura 16-86). Es tos puentes cruzados son las cabezas de la miosina-II, y cuando el músculo se contrae, los filam entos de actina y de miosina se em pujan los unos a los otros mediante la acción cíclica de los puentes cruzados, a modo de baterías de di minutos remos. Como ya hemos mencionado anteriormente, la cabeza globular, o dominio motor, de la molécula de miosina-II se une a los filamentos de actina e hidroliza ATP. Las cabezas de miosina-II aisladas, que pueden prepararse mediante diges tión con papaína, retienen tanto la actividad ATPasa como las propiedades de unión al filamento de actina y pueden utilizarse para analizar la interacción en tre la actina y la miosina. Cada molécula de actina de un filamento es capaz de unir una cabeza de miosina-II formando un complejo que permite ver la polaridad estructural del filamento de actina. Mediante tinciones negativas, estos complejos se pueden observar al microscopio electrónico y tienen una forma regular y característica: cada cabeza de miosina forma una proyección lateral y la imagen superpuesta de muchas de estas proyecciones toma la apariencia de unas cabezas de flecha a lo largo de los filamentos de actina. El extremo puntiagudo creado por estas fle-
discoZ
ac,ina
miosina
linea M
Figura 16-86 Electronmicrografía de una sección longitudinal del músculo de vuelo de un insecto. Esta sección ultrafina muestra claramente la alternancia entre los filamentos de actina y de miosina, así com o los puentes que los unen. Véase que el músculo de vuelo de un insecto tienen un elevado grado de superposición inusual entre los dos tipos de filamentos. (Por cortesía de Mary C. Reedy.)
100 nm El músculo
911
extremo menos
(A) extremo más
exlrcmo más
extremo menos
extrem o menos
(B)
extrem o más
i____ _____________ 1
Figura 16-87 Filamentos de actina “decorados” con cabezas aisladas de miosina. (A) En la electronmicrografía la disposición helicoidal de las cabezas de miosina unidas, inclinadas siguiendo una sola dirección, confiere al conjunto una apariencia de puntas de flecha y pone de manifiesto la polaridad del filamento de actina. El extremo de la punta corresponde al extrem o m enos, mientras que el extremo ancho corresponde al extrem o m ás. (B) Reconstrucción tridimensional a partir de las micrografías electrónicas, de un filamento de actina decorado de una manera parecida. La región que se muestra corresponde al área marcada en (A). El filamento de actina se muestra en rojo, las cabezas de miosina son am arillas, las cadenas ligeras de miosina son grises, y la posición de la tropomiosina se muestra en m ora d o. (A, por cortesía de Roger Craig; B, por cortesía de Ron Milligan.)
100 nm
chas de miosina corresponde al extremo “m enos”, de crecimiento lento, del fila mento de actina descrito anteriormente (véase pág. 880). El otro, el extremo bar bado, corresponde al extremo “m ás”, de crecimiento rápido (Figura 16-87). Como se muestra en la Figura 16-88, las cabezas de miosina se orientan en direcciones opuestas a cada lado de la zona central desnuda del filamento de
cabezas de m iosina
I____________________
500 nm
Figura 16-88 El filamento grueso de miosina. (A) Electronmicrografía de un filamento grueso de miosina-II aislado de un músculo de rana. Nótese la zona central desnuda. (B) Diagrama esquemático, no dibujado a escala. Las moléculas de miosina-II se agregan conjuntam ente a través de sus colas, de forma que sus cabezas se proyectan hacia el exterior. La zona desnuda del centro del filamento está formada enteram ente por colas de miosina-II. (C) Pequeña sección de un filamento de miosina-II, reconstruido a partir de electronmicrografías. Se ha dibujado en verde una molécula individual de miosina. (A, por cortesía de Murray Stewart; C, basado en R.A. Crowther, R. Padrón, y R. Craig, /. Mol. Biol. 184:429-439, 1985.)
912
Capítulo 16: El citoesqueleto
10 nm
sarcóm ero
los filam entos gruesos de m iosina invierten su polaridad
sobre el extrem o del disco Z
miosina-II. Dado que las cabezas deben interactuar con los filamentos de actina en la región de solapamiento, los filamentos de actina han de tener polaridades opuestas a cada lado del sarcómero. Esto ha sido demostrado utilizando cabezas de miosina para “decorar” los filamentos de actina unidos a discos Z aislados. Se encontró que todas las puntas de flecha de la miosina apuntaban en dirección opuesta a las bandas Z mientras que los extremos menos apuntaban hacia los fi lamentos de miosina (Figura 16-89).
Figura 16-89 A cada lado de la línea media de un sarcómero los filamentos de miosina y de actina se solapan con la misma polaridad relativa.
Las cabezas de m iosina “cam inan” hacia el extremo menos de los filam entos de actina55 La contracción muscular está impulsada por la interacción entre las cabezas de miosina y los filamentos de actina adyacentes. Durante esta interacción, la cabe za de miosina hidroliza ATP. La hidrólisis del ATP y la disociación consiguiente de los productos fuertemente unidos (ADP i P¡) producen una serie ordenada de cambios alostéricos en la conformación de la miosina. Como resultado de todo ello, parte de la energía liberada se acopla a la producción de movimiento. Un mayor avance en la comprensión de estos cambios en la estructura proteica y tam bién en la comprensión de cómo la hidrólisis del ATP está acoplada al movi miento direccionado de la molécula de miosina, se obtuvo con la determinación de la estructura tridimensional de la cabeza de la miosina mediante difracción de rayos X (Figura 16-90). Con éstos y otros datos, esta estructura sugiere que el movimiento unidireccional se genera mediante la secuencia de acontecim ientos ilustrada en la Figura 16-91. Dado que cada vuelta del ciclo que se ilustra en la Figura 16-91 resulta de la hidrólisis y liberación de una molécula de ATP, las series de cambios conformacionales que acabamos de describir están impulsados por un cambio de energía libre muy favorable, que los hace unidireccionales. Por consiguiente, cada m olé cula de miosina “cam ina” en una única dirección a lo largo del filamento de acti na adyacente, desplazándose siempre hacia el extremo más del filamento (véase Figura 16-89). Al sufrir un cambio cíclico de conformación, la cabeza de miosina va estirando el filamento de actina, haciendo que éste se deslice sobre el fila mento de miosina. Cuando una cabeza individual de miosina se ha separado del filamento de actina, es arrastrada por la acción de las otras cabezas de miosina del mismo filamento de miosina, de modo que una fotografía instantánea de todo un filamento de miosina de un músculo en contracción mostraría algunas de las cabezas de miosina unidas a los filamentos de actina, mientras que otras estarían separadas. (Para que esto suceda es esencial que exista un cierto grado de elasticidad en el salto de las moléculas de miosina.) Cada filamento de miosi na tiene aproximadamente unas 300 cabezas de miosina (294 en el músculo de la rana); en una contracción rápida cada una de ellas realiza unos 5 ciclos por se gundo -e l deslizamiento de los filamentos de miosina sobre los de actina tiene lugar a velocidades superiores a 15 pm/segundo.
El músculo
913
Figura 16-90 Modelo espacial de la cabeza de la miosina muscular. El modelo está orientado de manera que la superficie de unión a la actina se encuentra en la esquina derecha de la parte inferior. Los tres dominios de la cadena pesada de la miosina se han marcado en verde, rojo y azul, respectivamente, mientras que las dos cadenas ligeras se han marcado en amarillo y morado. (De I. Rayment et al., Science, 261:50-58,1993. © 1993 the AAAS.)
filamento de actina UNIÓN—Al iniciarse el ciclo que se muestra en la figura,
extremo menos
extremo más cabeza de miosina
UNION
filamento grueso de miosina
LIBERACIÓN
una cabeza de miosina, sin ningún nucleótido unido, se une fuertemente a un filamento de actina en una configuración d e r i g o r (así llamada porque es la responsable del r i g o r m o r t i s , la rigidez de la muerte). En un músculo en contracción activa este estado es de corta duración y finaliza rápidamente mediante la unión de una molécula de ATP.
LIBERACIÓN— Una molécula de ATP se une en el surco de la "parte trasera" de la cabeza (es decir, en la parte más alejada del filamento de actina) e inmediatamente provoca un cambio ligero en la conformación de los dominios, que libera el lugar de unión a la actina (véase Figura 16-90). Esto reduce la afinidad de la cabeza por la actina y le permite desplazarse a lo largo del filamento. (El espacio aquí dibujado entre la cabeza y la actina enfatiza este cambio, aunque en la realidad probablemente se mantiene muy cerca de la actina.)
HIDRÓLISIS MOVIMIENTO—El surco se cierra como la concha de una
almeja alrededor de la molécula de ATP, induciendo un gran cambio morfológico que provoca el desplazamiento de la cabeza a lo largo del filamento a una distancia de unos 5 nm. Se produce la hidrólisis del ATP, pero el ADP y el P¡ producidos se mantienen íntimamente unidos a la proteína.
MOVIMIENTO
GENERACIÓN DE LA FUERZA—La unión débil de la
cabeza de miosina a un nuevo lugar en el filamento de actina provoca la liberación del fosfato inorgánico producido por la hidrólisis del ATP, con lo cual se refuerza la unión de la cabeza con la actina. Esta liberación proporciona el golpe de potencia —el cambio de forma generado por la fuerza durante el cual la cabeza recupera su conformación original. Durante el golpe de potencia, la cabeza pierde el ADP unido y se inicia un nuevo ciclo.
GENERACIÓN DE LA FUERZA
GOLPE DE POTENCIA
UNION
914
Capítulo 16 : El cítoesqueleto
UNIÓN—Al final del ciclo, la cabeza de miosina se encuentra de nuevo íntimamente unida al filamento de actina en la configuración de rigor. Nótese que la cabeza se ha desplazado hacia una nueva posición en el filamento de actina.
Figura 16-91 El ciclo de cambios por los cuales una molécula de miosina “camina” a lo largo de un filamento de actina. (Basado en I. Rayment et al., Science 261:50-58, 1993. © 1993 the AAAS.)
La contracción muscular se inicia por un aumento repentino de la concentración de Ca2+ citosólico56 La fuerza que genera la interacción molecular que acabamos de describir sólo tiene lugar cuando una señal procedente del nervio motor pasa al músculo es quelético. La señal procedente del nervio dispara un potencial de acción en la membrana plasmática de la célula muscular, y esta excitación eléctrica se trans mite rápidamente a través de una serie de pliegues membranosos, los túbulos transversales, o túbulos T, que son invaginaciones de la membrana plasmática de la fibra muscular que penetran hacia el interior de la célula. A continuación, la señal se transfiere, de alguna manera, al retículo endoplasm ático, una capa adyacente de vesículas aplanadas y anastomosadas que rodea cada miofibrilla como una funda (Figura 16-92A). En la región de unión, grandes canales de liberación de Ca2+ se extienden como pilares desde la mem brana del retículo endoplasmático contactando con la m em brana del túbulo T del otro lado (Figura 16-92C). Cuando diversas proteí nas sensibles al voltaje en la membrana del túbulo T se activan por el increm en to del potencial de acción, desencadena la apertura de alguno de los canales de liberación de calcio, probablemente mediante un acoplamiento m ecánico di recto. Entonces, los iones Ca2+ se escapan del retículo endoplasmático (donde se alm acenan en grandes cantidades) al lugar de la unión, provocando que se abran más canales de liberación de calcio, con lo cual se amplifica la respuesta. El flujo de iones Ca2+ en dirección al citosol, inicia la contracción de cada una de las miofibrillas. La señal se transmite desde la membrana plasmática de la fibra muscular hasta cada sarcómero, en cuestión de milisegundos (vía los túbulos T y el retícu lo endoplasmático), por lo que todas las miofibrillas se contraen simultánea mente. El incremento de la concentración de Ca2+ es transitorio, ya que el Ca2+ es rápidamente bombeado de nuevo hacia el retículo endoplasmático mediante una ATPasa dependiente de Ca2+, presente en cantidades abundantes en la mem brana de este retículo sarcoplasmático (discutido en el Capítulo 11). Típi camente, la concentración de Ca?+ citosólico se restablece hasta sus niveles de reposo, en unos 30 milisegundos, lo cual provoca la relajación de las miofibrillas.
Figura 16-92 Los túbulos T y el retículo sarcoplasm ático. (A) Dibujo
esquemático de los dos sistemas de membrana que transmiten la señal de contracción desde la membrana plasmática de la fibra muscular a todas las miofibrillas de la célula. (B) Electronmicrografía que ilustra dos túbulos T. Nótese la posición de los grandes canales liberadores de Ca2+en la membrana del retículo sarcoplasmático; parecen “pies” de forma cuadrangular que están conectados a la membrana del túbulo T adyacente. (C) Diagrama esquemático que muestra cómo puede abrirse un canal liberador de Ca2+de la membrana del retículo sarcoplasmático mediante una proteína transmembrana sensible al voltaje localizada en la membrana del túbulo T adyacente. (B, por cortesía de Clara Franzini-Armstrong.)
m em brana plasmática m iofibrilla canales liberadores de Ca2+
(B)
túbulos transversales (T) form ados a partir de invaginaciones de la mem brana plasmática retículo sarcoplasm átii
|__________________ 0,5 pm proteína sensible al voltaje
m em brana r polarizada L del túbulo T CITOSOL
m em brana despolarizada del túbulo T
potencial de acción
35 nm
(A)
mem brana del retículo sarcoplasm ático canales liberadores de Ca
El músculo
915
com plejo de troponina tropom iosina I----------------1 I C T
bloqueo del lugar de unión de la m iosina a la actina por la tropom iosina
el m ovim iento de la tropom iosina m ediado por el Ca2+ deja expuesto el lugar de unión a la m iosina
actina + Qa 2+
(A)
10 nm
(B)
La troponina y la tropomiosina median la regulación de la contracción del músculo esquelético por el Ca2+57
Figura 16-93 El control de la contracción del músculo esquelético por la troponina. (A) Filamento
La dependencia respecto al Ca2+ de la contracción muscular de los vertebrados, y por consiguiente su dependencia respecto a las órdenes motoras transmitidas a través de los nervios, es debida exclusivamente a un grupo de proteínas accesorias especializadas, estrechamente asociadas con los filamentos de actina. Si en un tubo de ensayo se mezcla miosina con filamentos de actina purificada, la ATPasa de la miosina se activa tanto si existe Ca2+ en el medio como si no; por otro lado, en una miofibrilla normal, en la que los filamentos de actina están asociados a proteínas accesorias, la activación de la ATPasa de la miosina es dependiente de Ca2+. Una de estas proteínas accesorias es una forma muscular de la tropomio sina, la molécula en forma de varilla que hemos introducido anteriormente y que se une al surco de la hélice de actina (véase Figura 16-78). La otra proteína acce soria principal implicada en la regulación del músculo esquelético de los verte brados por el Ca2+ es la troponina, un complejo de tres polipéptidos -troponinas T, I, y C (llamadas así por sus actividades de unión a la 7Yopomiosina, actividad Inhibidora, y de unión al Calcio, respectivamente). El complejo de la troponina tiene forma alargada, con las subunidades C e I formando una región de cabeza globular y la subunidad T formando una cola larga. La cola de troponina T se une a la tropomiosina y, al parecer, es la responsable de situar el complejo sobre el fi lamento delgado (Figura 16-93A). La troponina I se une a la actina, y cuando se añade a la troponina T y a la tropomiosina, el complejo inhibe la interacción en tre la actina y la miosina, incluso en presencia de Ca2+. La posterior adición de troponina C completa el complejo y lo hace sensible al Ca2+. Cada molécula de troponina C une hasta cuatro moléculas de Ca2+; con el Ca2+ unido se suprime la inhibición de la unión de la miosina a la actina pro ducida por los otros com ponentes de la troponina. La troponina C está estrecha mente relacionada con la calmodulina, la cual media respuestas señalizadas por Ca2+ en todas las células, incluyendo la activación de la miosina del músculo liso. Por lo tanto, la troponina C puede ser considerada como una forma especializa da de calmodulina que ha desarrollado de forma permanente un lugar de unión a la troponina I y T, asegurando así que la miofibrilla responda de manera extre madamente rápida a un increm ento en la concentración de Ca2+. En un filamento de actina existe una sola molécula del complejo de troponi na por cada siete m onómeros de actina (véase Figura 16-93A). Estudios estructu rales sugieren que en un músculo en reposo la unión de la troponina I a la actina desplaza las moléculas de tropomiosina a una posición que en un músculo en contracción activa está ocupada por las cabezas de miosina, inhibiendo así la in teracción entre la actina y la miosina. Cuando los niveles de Ca2+ aumentan, la troponina C provoca que la troponina I se libere de la actina, permitiendo a las moléculas de tropomiosina desplazarse liberamente de tal manera que las cabe zas de miosina puedan unirse al filamento de actina (Figura 16-93B).
delgado que muestra la posición de la tropomiosina y de la troponina a lo largo del filamento de actina. Cada molécula de tropomiosina tiene siete regiones de secuencias homólogas, espaciadas regularmente. Se cree que cada una de estas secuencias se une a un monómero de actina, tal como se muestra en el dibujo. (B) Un filamento delgado que ilustra cómo la unión del Ca2+a la troponina se cree que libera el bloqueo de la interacción de la cabeza de la miosina con la actina. (A, adaptada de G.N. Phillips, J.P. Fillers, y C. Cohén,/. Mol. Biol. 192:111-131, 1986.)
Otras proteínas accesorias m antienen la arquitectura de la miofibrilla y le proporcionan su elasticidad58 La notable velocidad y potencia de la contracción muscular depende de que los filamentos de actina y de miosina de cada miofibrilla estén dispuestos uno res-
916
Capítulo 16: El citoesqueleto
pecto al otro a una distancia óptima y en una alineación correcta. La organiza ción exacta de la miofibrilla se mantiene gracias a más de una docena de proteí nas estructurales: el orden en que se ensamblan y los controles sobre el proceso son temas importantes de la investigación contemporánea. Los filamentos de actina están anclados por sus extremos más en el disco Z, donde se mantienen mediante proteínas que forman una trama cuadrangular. Una de las proteínas más importantes de esta región es la a-actinina, proteína que entrecruza la actina, que hemos discutido anteriormente y que es abundante en la mayoría de células animales. Se concentra en la región del disco Z de la miofibrilla (Figura 16-94). Los filamentos de miosina están también mantenidos mediante una trama regular -e n este caso, hexagonal- a través de proteínas asociadas que se unen en la zona media, a lo largo de los filamentos gruesos bipolares. Las células del músculo esquelético contienen dos proteínas extraordinaria mente abundantes, llamadas titina y nebulina, que forman una red de fibras asociada con los filamentos de actina y de miosina. La titina, que tiene un peso molecular de 3 x 106, es el polipéptido más grande descrito hasta ahora. Las m o léculas de titina, a modo de cuerdas, se extienden desde los filamentos gruesos del disco Z; se cree que actúan a modo de muelles manteniendo los filamentos de miosina centrados en el sarcómero (Figura 16-95). Al contrario, la nebulina, que también es muy grande, está íntimamente asociada con los delgados fila mentos de actina, y está formada casi enteramente en una secuencia repetida de 35 aminoácidos que se unen a la actina. El número de estos motivos, y por tanto la longitud total de la molécula de tubulina, es el necesario para extenderse des de un extremo del filamentos de actina hasta el otro. De este modo, la nebulina podría actuar como una “regla molecular” para regular el ensamblaje de actina y la longitud de los filamentos de actina durante el desarrollo del músculo (véase Figura 3-52). Las miofibrillas se unen unas a las otras, lado a lado, mediante un sistema de filamentos intermedios de desmina, y toda esta disposición se ancla entonces en la membrana plasmática de la célula muscular mediante diversas proteínas, incluyendo una proteína de unión a la actina alargada y flexible, llamada distrofina. Esta proteína, que se encuentra ausente en aquellos pacientes con distrofia muscular, tienen un enorme parecido con la espectrina, y puede unir proteínas específicas de la membrana muscular a los filamentos de actina de la miofibrilla.
La mism a m aquinaria contráctil, en una forma modificada, se encuentra en el músculo cardíaco y en el músculo liso59 Hasta ahora sólo hemos explicado uno de los tres tipos principales de músculo presentes en los vertebrados -e l músculo esquelético. Los otros tipos son el mús culo del corazón (o músculo cardíaco ), que se contrae unos 3 mil millones de ve ces en el curso de una vida humana de duración media, y el músculo liso, que produce las contracciones lentas y prolongadas típicas de órganos tales como el intestino. Los tres tipos de fibras musculares, conjuntamente con otro tipo de células contráctiles conocidas como células mioepiteliales (véase Figura 22-36E),
5 |jm Figura 16-94 Localización de la a-actinina en el músculo. Imagen de inmunofluorescencia confocal que muestra un grupo de miofibrillas de células del músculo cardíaco cultivadas. La actina se ha marcado en rojo con faloidina unida a rodamina, y la a-actinina se ha marcado en verde, con un anticuerpo ligado a fluoresceína, pero como la actina y la a-actinina se colocalizan en el disco Z, esta región aparece realmente como amarilla. (De M.H. Lu et al.,/. CellBiol. 117:1017-1022,1992, con el permiso de copyright de The Rockefeller University Press.)
Figura 16-95 Localización de la titina y de la nebulina en un sarcómero del músculo esquelético. Cada molécula
gigante de titina se extiende desde el disco Z hasta la línea M -una distancia superior a 1 pm. Una parte de cada molécula de titina está íntimamente asociada con las moléculas de miosina de los filamentos gruesos; el resto de la molécula es elástico y cambia de longitud mientras el músculo se contrae y se relaja. Cada molécula de nebulina se extiende desde el disco Z a lo largo de la longitud de un filamento de actina delgado y podría determinar la longitud de éste.
disco Z titina
nebulina
El músculo
línea M
m iosina (filam ento grueso)
actina (filam ento delgado)
917
disco intercalar
CÉLULA 1
disco Z
disco Z
\ / disco intercalar m itocondria
Figura 16-96 Estructura del músculo cardíaco. Diagrama esquemático del
CÉLULA 2
se contraen mediante un m ecanismo de deslizamiento de filamentos de actina y filamentos de miosina. Al igual que el músculo esquelético, el m úsculo del corazón es estriado, re flejando una organización de filamentos de actina y de miosina muy similar. Tam bién es estimulado a contraerse mediante un mecanismo parecido: un po tencial de acción de los túbulos T dispara de alguna manera la liberación de Ca2+ del retículo sarcoplasmático, lo cual activa la contracción por medio de un com plejo troponina-tropomiosina. No obstante, las células musculares del corazón no son plurinucleadas, y están unidas por sus extremos mediante unas estructu ras especiales llamadas discos intercalares (Figura 16-96). Los discos intercalares realizan al m enos tres funciones. (1) Unen una célula a la siguiente por medio de desmosomas (discutido en el Capítulo 19). (2) Conectan los filamentos delgados de las miofibrillas de las células adyacentes (realizando una función análoga a la que desempeñan los discos Z en el interior de las células). (3) Presentan uniones de tipo gap que permiten la transmisión rápida del potencial de acción desde una célula a la siguiente, sincronizando las contracciones de las células muscu lares cardíacas. El tipo de músculo más “primitivo”, en el sentido de ser más parecido a las células no musculares, no presenta estriaciones por lo que se le denomina m ús culo liso. Forma la porción contráctil del estómago, del intestino y del útero, las paredes de las arterias, los conductos de las glándulas secretoras y muchas otras regiones en las que es necesaria una contracción lenta y sostenida. Está formado por capas de células alargadas y fusiformes, cada una de las cuales presenta un solo núcleo. Las células contienen filamentos de miosina y de actina, pero estos filamentos no están dispuestos siguiendo la distribución altamente ordenada del músculo esquelético y del músculo cardíaco, y no forman miofibrillas. Por el contrario, los filamentos forman un aparato contráctil dispuesto de forma más laxa, que se halla alineado, aproximadamente, con el eje largo de la célula pero que está anclado oblicuam ente a la mem brana plasmática en uniones discoida les que agrupan conjuntos de células. Aunque el aparato contráctil del músculo liso no se contrae tan rápidamen te como las miofibrillas del músculo estriado, tiene la ventaja de permitir un m a yor grado de acortamiento, y por lo tanto, puede producir grandes movimientos a pesar de que no disponga del sistema de palancas que proporciona el anclaje a los huesos. Actualmente se conoce muy poco todavía acerca de la organización de los filamentos de actina y de los de miosina que hacen esto posible; en la Fi gura 16-97 se presenta un posible modelo al respecto.
En muchas células, la activación de la m iosina depende de la fosforilación de la cadena ligera de la m iosina60 Los mecanism os contráctiles altamente especializados que acabamos de descri bir en fibras musculares evolucionaron a partir de unos simples mecanismos de
918
Capítulo 16 : El citoesqueleto
músculo cardíaco que muestra dos células unidas, extremo con extremo, mediante uniones especializadas conocidas como discos intercalares. Los filamentos de actina de los sarcómeros de células adyacentes se insertan en el denso material asociado con la membrana plasmática de la región de cada disco intercalar, como si se tratara de discos Z. Así, las miofibrillas continúan a través del núcleo, sin tener en cuenta los límites celulares.
fibras de soporte que contienen filam entos interm edios
fibras contráctiles que contienen actina y miosina
cuerpos densos citoplasm áticos
lugares de unión de la m em brana plasmática densam ente teñidos
generación de fuerza que se encuentran en todas las células eucariotas. No es sorprendente que la miosina-II de las células no musculares se parezca a la miosina-II de las células musculares lisas, el tipo menos especializado de m ús culo. Como en el músculo esquelético y en el cardíaco, la contracción en las cé lulas musculares lisas se dispara por un incremento del Ca2+ citosólico; pero, al contrario que en el m ecanism o del músculo esquelético y del cardíaco, la con tracción se inicia principalmente por la fosforilación de una de las dos cadenas ligeras de la miosina-II, la cual a su vez controla la interacción de la miosina con la actina. Un m ecanism o parecido regula la actividad de la miosina-II no muscular. Las dos cadenas ligeras de cada cabeza de la molécula de miosina-II (véase Figura 5-23) son diferentes, y sólo una de ellas es fosforilada durante la contrac ción no muscular y durante la contracción del músculo liso. Cuando esta cadena ligera se fosforila, la cabeza de miosina interactúa con un filamento de actina por lo que se genera la contracción; cuando la cadena se desfosforila, la cabeza de mosina tiende a disociarse de la actina y se vuelve inactiva. La fosforilación está catalizada por la enzima quinasa de la cadena ligera de la miosina, cuya unión requiere la unión de un complejo Ca2+-calmodulina. Como resultado de ello, la contracción está controlada por los niveles de Ca2+ citosólicos, tal como ocurre en el músculo esquelético y en el músculo cardíaco (Figura 16-98). La fosforilación de la cadena ligera puede tener influencia sobre el estado de agregación de las moléculas de miosina-II en la célula, mencionado anterior mente en relación con la motilidad de las células no musculares (véase Figura 16-73). La fosforilación de la miosina-II se produce de una manera relativamen te lenta, de modo que a menudo la contracción máxima se alcanza aproximada mente un segundo después del estímulo (respecto a los pocos milisegundos n e cesarios para el caso de la célula del músculo estriado). Sin embargo, en las células musculares lisas y en las no-musculares, la activación rápida de la con tracción no es importante: en estas células las miosinas-II hidrolizan ATP apro-
quinasa de la
filamentos contráctiles que contienen actina y miosina [rojo) se hallan anclados por un extremo a los cuerpos densos de la membrana plasmática, y por el otro extremo, atravesando los “cuerpos densos” citoplasmáticos, se hallan unidos a haces no contráctiles de filamentos intermedios [azul). Los haces contráctiles de actina-miosina se hallan orientados de forma oblicua al eje longitudinal de la célula (el cual, generalmente, es mucho más largo de lo que aquí se muestra), de forma que su contracción acorta notablemente la célula. En la figura se presentan únicamente unos cuantos de los haces existentes.
m iosina con la PROTEINAS INACTIVAS
PROTEINAS ACTIVADAS
El músculo
Figura 16-97 Modelo del aparato contráctil de una célula del músculo liso. Según esta hipótesis, haces de
Figura 16-98 Regulación de la contracción del músculo liso por el Ca2+. La contracción se activa con la
presencia de Ca2\ por la quinasa de la cadena ligera de la miosina, que cataliza la fosforilación de un lugar particular en uno de los dos tipos de cadenas ligeras de la miosina. Las moléculas de miosina no muscular están reguladas por el mismo mecanismo (véase Figura 16-73).
919
rim adam ente 10 veces más lentam ente que la miosina del músculo esquelético, lo cual produce un ciclo de unión lento que supone que estas células sólo pue den contraerse lentamente.
Resumen La contracción muscular se produce mediante el deslizamiento de los filamentos de actina respecto los de miosina. La regiones de la cabeza de las moléculas de miosina, que se proyectan desde losfilamentos de miosina, inician un ciclo condu cido por el ATP en que se unen a los filamentos de actina adyacentes, y se produce un cambio conformacional que empuja el filamento de miosina contra el filam en to de actina, y entonces se separan. Diversas proteínas accesorias específicas facili tan este ciclo en el músculo y mantienen los filamentos de actina y de miosina en disposiciones superpuestas y paralelas con la orientación correcta para que se produzca el deslizamiento. Otras dos proteínas accesorias -troponina y tropomiosina- permiten que la contracción del músculo esquelético y del músculo cardíaco esté regulada por el Ca2+. En lasfibras del músculo liso, y en la mayoría de células no musculares, la acti na y la miosina producen la contracción de una forma similar a la del músculo es quelético y cardíaco. Sin embargo, las unidades contráctiles son más pequeñas y menos organizadas en estas células; tanto su actividad como su estado de ensam blaje están controlados por una fosforilación de la cadena ligera de la miosina de pendiente de Ca2+.
Bibliografia G en eral Amos, L.A.; Amos, W.B. Molecules of the Cytoskeleton. New York: Guilford Press, 1991. Bershadsky, A.D.; Vasiliev, J.M. Cytoskeleton. New York: Plenum Press, 1988. Bray, D. Cell Movements. New York: Garland Publishing, 1992. Kreis, T.E.; Vale, R.D., eds. Guidebook to Cytoskeletal and Motor Proteins. Oxford, UK: Oxford University Press, 1993. C itas 1. Cell motility. Trends Cell Biol. 3:363-412, 1993. Elson, E.L. Cellular mechanics as an indicator of cytos keletal structure and function. Annu. Rev. Biophys. Biophys. Chem. 17:397-430, 1988. Ingher, D.E. Cellular tensegrity: defining new rules of biological design that govern the cytoskeleton. /. Cell Sei. 104:613-627,1993. 2. Gelfand, V.l.; Bershadsky, A.D. Microtubule dynamics: mechanisms, regulation, and function. Annu. Rev. Cell Biol. 7:93-116,1991. Karsenti, E.; Maro, B. Centrosomes and the spatial dis tribution of microtubules in animal cells. Trends Biochem. Sei. 11:460-463, 1986. 3. McNiven, M.A.; Porter, K.R. Organization of microtubles in centrosome-free cytoplasm. /. Cell Biol. 106:1593-1605, 1988. 4. Corthdsy-Theulaz, I.; Pauloin, A.; Pfeffer, S.R. Cytoplas mic dynein participates in the centrosomal localiza tion of the Golgi complex. J. Cell Biol. 118:1333-1345, 1992.
920
Capítulo 16: El citoesqueleto
Kreis, T.E. Role of microtubules in the organization of the Golgi apparatus. Cell Motil. Cytoskeleton 15:6770,1990. Lee, C.; Chen, L.B. Dynamic behavior of endoplasmic reticulum in living cells. Cell 54:37-46,1988. Terasaki, M. Recent progress on structural interactions of the endoplasmic reticulum. Cell Motil. Cytoskele ton 15:71-75, 1990. Vale, R. Intracellular transport using microtubule-based motors. Annu. Rev. Cell Biol. 3:347-378, 1987. 5. Euteneuer, U.; Schliwa, M. Persistent, directional moti lity of cells and cytoplasmic fragments in the absence of miocrotubules. Nature 310:58-61, 1984. Lee, J.; Ishihara, A.; Threiot, J.A.; Jacobson, K. Principles of locomotion for simple-shaped cells. Nature 362:167-171, 1993.
6. Euteneuer, U.; Schliwa, M. Mechanisms of centrosome positining during the wound response in BSC-1 cells.
J. Cell Biol. 116:1157-1166, 1992. Gyoeva, F.K.; Gelfand, V.I. Coalignment of vimentin in termediate filamets with microtubules depends on kinesin. Nature. 353:445-448,1991. Kupfer, A.; Singer, S.J. Cell biology of cytotoxic and hel per T cell functions: inmmunofluorescence micros copic studies of single cells and cell couples. Annu. Rev. Immunol. 7:309-337, 1989. 7. Albers, K.; Fuchs, E. The molecular biology of interme diate filament proteins. Int. Rev. Cytol. 134:243-279, 1992. Cary, R.B.; Klymkowsky, M.W. Finding filament func tion. Curr. Biol. 2:43-45, 1992. Steinert, P.M.; Roop, D.R. Molecular and cellular bio logy of intermediate filaments. Annu. Rev. Biochem. 57:593-625, 1988.
8. Chou, Y.-H.; Bischoff, J.R.; Beach, D.; Goldman, R.D. In
9.
10.
11. 12.
13.
14.
termediate filament reorganization during mitosis is mediated by p34cdc2 phospohrylation of vimentin. Cell 62:1063-1071,1990. Okabe, S.; Miyasaka, H.; Hirokawa, N. Dynamic of the neuronal intermediate filaments./. Cell Biol. 121:375386,1993. Stewart, M. Intermediate filament structure and as sembly. Curr. Opin. Cell Biol. 5:3-11,1993. Coulombe, P.A. The cellular and molecular biology of keratins: beginning a new era. Curr. Opin. Cell Biol. 5:17-29, 1993. Osborn, M.; Weber, K. Tumor diagnosis by intermediate filament typing: a novel tool for surgical pathology. Lab. Invest. 48:372-394,1983. Cleveland, D.W.; Monteiro, M J.; Wong, P.C.; et al. In volvement of neurofilaments in the radial growth of axons./. CellSci. Suppl. 15:85-95,1991. Garrod, D.R. Desmosomes and hemidesmosomes. Curr. Opin. Cell Biol. 5:30-40, 1993. Nigg, E.A. Assembly and cell cycle dynamics of the nu clear lamina. Semin. Cell Biol. 3:245-253,1992. Fuchs, E.; Coulombe, P.A. Of mice and men: genetic skin diseases of keratin. Cell. 69:899-902, 1992. lanmey, P.A. Mechanical properties of cytoskeletal polymers. Curr. Opin. Cell Biol. 3:4-11, 1991. Dustin, P. Microtubules, 2nd ed. New York: SpringerVerlag, 1984. Hyams, J.F.; Lloyd, C.W. Microtubules. New York: Wiley-Liss, 1993. Amos, L.A.; Baker, T.S. The three-dimensional structure of tubulin protofilaments. Nature 279:607-612, 1979. Luduena, R.F. Are tubulin isotypes functionally signifi cant? Mol. Biol. Cell 4:445-457,1993. Sullivan, K.F. Structure and utilziation of tubulin isoty pes. Annu. Rev. Cell Biol. 4:687-716, 1988. Wade, R.H.; Chrétien, D. Cryoelectron microscopy of microtubules./. Struct. Biol. 110:1-27, 1993.
15. DeBrabander, M. Microtubule dynamics during the cell cycle: the effects of taxol and nocodazole on the mi crotubule system of Pt K2 cells at different stages of the mitotic cycle. Int. Rev. Cytol. 101:215-274,1986.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
Inoué, S. Cell division and the mitotic spindle. /. Cell Biol. 91:131s-147s, 1981. Salmon, E.D.; McKeel, M.; Hays, T. Rapid rate of tubulin dissociation from microtubules in the mitotic spindle in vivo measured by blocking polymerization with colchicine./. Cell Biol. 99:1066-1075,1984. 16. Mandelkow, E.-M.; Mandlekow, E. Microtubule oscilla tions. Cell Motil. Cytoskeleton. 22:235-244,1992.
25.
17. Bergen, L.G.; Borisy, G.G. Head-to-tail polymerization of microtubules in vitro. Electron microscope analy sis of seeded assembly./. Cell Biol. 84:141-150,1980. McIntosh, J.R.; Euteneuer, U. Tubulin hooks as probes for microtubule polarity: an analysis of the method and an evaluation of data on microtubule polarity in the mitotic spindle. / Cell Biol. 98:525-533, 1984. Mitchinson, T.J. Localization of an exchangeable GTP binding site at the plus end of microtubules. Science 261:1044-1047, 1993. 18. Glover, D.M.; González, C.; Raff, J.W. The centrosome. Sci. Am. 268(6):62-68,1993.
Bibliografía
26.
loshi, H.C.; Palacios, M J.; McNamara, L.; Cleveland, D.W. y-tubulin is a centrosomal protein required for cell cycle-dependent microtubule nucleation. Nature 356:80-83, 1992. Mazia, D. Centrosomes and mitotic poles. Exp. Cell Res. 153:1-15, 1984. Sammak, P J.; Borisy, G.G. Direct observation of micro tubule dynamics in living cells. Nature 332:724-726, 1988. Tanaka, E.M.; Kirschner, M.W. Microtubule behavior in the growth cones of living neurons during axon elon gation./. Cell Biol. 115:345-363, 1991. Erickson, H.P.; O’Brien, E.T. Microtubule dynamic in stability and GTP hydrolysis. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 21:145-166, 1992. Mandelkow, E.-M.; Mandelkow, E.; Milligan, R.A. Mi crotubule dynamics and microtubule caps—a timeresolved cryo-electron microscopy study. /. Cell Biol. 114:977-991, 1991. Mitchison, T J.; Kirschner, M.W. Dynamic instability of microtubule growth. Nature 312:237-242, 1984. Gelfand, V.I.; Bershadsky, A.D. Microtubule dynamics: mechanism, regulation, and function. Annu. Rev. Cell Biol. 7:93-116, 1991. Kirschner, M.W.; Mitchison, T.J. Beyond self-assembly: from microtubules to morphogenesis. Cell 45:329342,1986. Greer, K.; Rosenbaum, J.L. Post-translational modifica tions of tubulin. In Cell Movement, Vol. 2: Kinesin, Dynein, and Microtubule Dynamics (F.D. Warner, J.R. McIntosh, eds.), 47-66. New York: Wiley-Liss, 1989. MacRae, T.H. Towards an understandig of microtubule function and cell organization: an overview. Biochem. Cell Biol. 70:835-841, 1992. Drechsel, D.N.; Hyman, A.A.; Cobb, M.H.; Kirschner, M.W. Modulation of the dynamic instability of tubu lin assembly by the microtubule-associated protein tau. Mol. Biol. Ce//3:1141-1154, 1992. Lee, G. Non-motor microtubule-associated proteins. Curr. Opin. Cell Biol. 5:88-94, 1993. Olmsted, J.B. Microtubule-associated proteins. Annu. Rev. Cell Biol. 2:421-457, 1986. Chen, J.; Kanai, Y.; Cowan, N.J.; Hirokawa, N. Projection domains of MAP2 and tau determine spacings be tween microtubules in dendrites and axons. Nature 360:674-677, 1992. Knops, J.; Kosik, K.S.; Lee, G.; et al. Overexpression of tau in a nonneuronal cell induces long cellular pro cesses./. Cell Biol. 114:725-733, 1991. Skoufias, D.A.; Scholey, J.M. Cytoplasmic microtubulebased motor proteins. Curr. Opin. Cell Biol. 5:95-104, 1993. Vale, R.D.; Reese, T.S.; Sheetz, M.P. Identification of a novel force-generating protein, kinesin, involved in microtubule-based motility. Cell 42:39-50, 1985. Vallee, R.B.; Wall, J.S.; Paschal, B.M.; Shpetner, H.S. Mi crotubule-associated protein 1C from brain is a twoheaded cytosolic dynein. Nature 332:561-563, 1988. Bloom, G.S. Motor proteins for cytoplasmic microtubu les. Curr. Opin. Cell Biol. 4:66-73, 1992. Endow, S.A.; Titus, M.A. Genetic approaches to molecu lar motors. Annu. Rev. Cell Biol. 8:29-66, 1992. Gelfand, V.I.; Scholey, J.M. Every motion has its motor. Nature 359:480-482,1992.
921
27. Blair, D.F.; Dutcher, S.K. Flagella in prokaryotes and lo wer eukaryotes. Curr. Opin. Gen. Dev. 2:756-767, 1992. Fawcett, D.W.; Porter, K.R. A study of the fine structure of ciliated epithelia./. Morphol. 94:221-281,1954. Gibbons, I.R. Cilia and flagella of eukaryotes. J. Cell Biol. 91:107s-124s, 1981. 28. Burgess, S.A.; Dover, S.D.; Woolley, D.M. Architecture of the outer arm dynein ATPase in an avian sperm flagellum, with further evidence for the B-link. J. Cell Sei. 98:17-26, 1991. Smith, E.F.; Sale, W.S. Regulation of dynein-driven mi crotubule sliding by the radial spokes in flagella. Science 257:1557-1559, 1992. Warner, F.D.; Satir, P.; Gibbons, I.R., eds. Cell Move ment, Vol. 1. The Dynein ATPases. New York: WileyLiss, 1989. Witman, G.B. Axonemal dyneins. Curr. Opin. Cell Biol. 4:74-79,1992. 29. Huang, B. Chlamydomonas reinhardtii: a model system for genetic analysis of flagellar structure and motility. Int. Rev. Cytol. 99:181-215, 1986. Johnson, K.A.; Rosebaum, J.L. Polarity of flagellar as sembly in Chlamydomonas. J. Cell Biol. 119:16051611,1992. Ringo, D.L. Flagellar motion and the fine structure of flagellar apparatus in Chlamydomonas reinhardtii. J. Cell Biol. 33:543-571, 1967. 30. Beisson, J.; Sonnenborn, T.M. Cytoplasmic inheritance of the organization of the cell cortex in Panamecium aurelia. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 53:275-282,1965. Holmes, J.A.; Dutcher, S.K. Cellular asymmetry in Chla mydomonas reinhardtii. J. Cell Sei. 94:273-285, 1989. Palazzo, R.E.; Vaisberg, E.; Cole, R.W.; Rieder, C.L. Centriole duplication in lysates of Spisula solidissima oocytes. Science 256:219-221, 1992. 31. Kabsch, W.; Vandekerckhove, J. Structure and function of actin. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 21:49-76, 1992. 32. Bonder, E.M.; Fishkind, D.J.; Mooseker, M.S. Direct me asurement of critical concentrations and assembly rate constants at the two ends of an actin filament. Cell 34:491-501,1983. Janmey, P.A. Mechanical properties of cytoskeletal polymers. Curr. Opin. Cell Biol. 3:4-11, 1991. Kabsch, W.; Mannherz, H.G.; Suck, D.; Pai, E.F.; Holmes, K.C. Atomic structure of the actin:DNase I complex. Nature 347:37-44, 1990. 33. Carlier, M.-F. Actin: protein structure and filament dy namics./. Biol. Chem. 266:1-4, 1991. Mitchison, T.J. Compare and contrast actin filaments and microtubules. Mol. Biol. Cell 3:1309-1315, 1992. Oosawa, F.; Asakura, S. Thermodynamics of the Poly merization of Protein. London: Academic Press, 1975. 34. Carlier, M.-F. Role of nucleotide hydrolysis in the dyna mics of actin filaments and microtubules. Int. Rev. Cytol. 115:139-170,1989. Wegner, A. Head to tail polymerization of actin. /. Mol. Biol. 108:139-150,1976. 35. Cooper, J.A. Effects of cytochalasin and phalloidin on actin./. Cell Biol. 105:1473-1478, 1987.
922
Capítulo 16: El citoesqueleto
Forscher, P.; Smith, S.J. Actions of cytochalasins on the or ganization of actin filaments and microtubules in a neuronal growth cone./. Cell Biol. 107:1505-1516,1988. Wehland, J.; Weber, K. Actin rearrangement in living cells revealed by microinjection of a fluorescent pha lloidin derivative. Eur.J. Cell Biol. 24:176-183, 1981. 36. Cassimeris, L.; Safer, D.; Nachmias, V.T.; Zigmond, S.H. Thymosin (34 sequesters the majority of G-actin in resting human polymorphonuclear leukocytes. /. Cell Biol. 119:1261-1270, 1992. Fechheimer, M.; Zigmond, S.H. Focusing on unpolyme rized actin./. Cell Biol. 123:1-5, 1993. Goldschmidt-Clermont, P.J.; Furman, M.I.; Wachsstock, D.; et al. The control of actin nucleotide exchange by thymosin beta 4 and profilin. A potential regulatory mechanism for actin polymerization in cells. Mol. Biol. Cell 3:1015-1024,1992. 37. Abercrombie, M. The crawling movement of metazoan cells. Proc. R. Soc. Lond. (Biol.) 207:129-147,1980. Fukui, Y. Toward a new concept of cell motility: cytos keletal dynamics in amoeboid movements and cell division. Int. Rev. Cytol. 144:85-127, 1993. Small, J.V. Microfilament-based motility in non-muscle cells. Curr. Opin. Cell Biol. 1:75-79, 1989. 38. Cao, L.; Fishkind, D.J.; Wang, Y-L. Localization and dy namics of nonfilamentous actin in cultured cells. /. Cell Biol. 123:173-181,1993. Condeelis, J. The formation of cell protrusions. Annu. Rev. Cell Biol. 9:441-444,1993. Theriot, J.A.; Mitchison, T.J. The nucleation-release mo del of actin filament dynamics in cell motility. Trends Cell Biol. 2:219-222, 1992. 39. Kocks, C.; Helio, R.; Gounon, P.; Ohayon, H.; Crossart, P. Polarized distribution of Listeria monocytogenes sur face protein ActA at the site of directional actin as sembly./. CellSci. 105:699-710,1993. Theriot, J.A.; Mitchison, T.J.; Tilney, L.G.; Portnoy, D.A. The rate of actin-based motility of intracellular Liste ria monocytogenes equals the rate of actin polymeri zation. Nature 357:257-260, 1992. Tilney, L.G.; Portnoy, D.A. Actin filaments and the growth, movement, and spread of the intracellular bacterial parasite, Listeria monocytogenes. J. Cell Biol. 109:1597-1608, 1989. 40. Devreotes, P.N.; Zigmond, S.H. Chemotaxis in eukary otic cells: a focus on leukocytes and Dictyostelium. Annu. Rev. Cell Biol. 4:649-686, 1988. 41. Ridley, A.J.; Hall, A. The small GTP-binding protein rho regulates the assembly of focal adhesions and actin stress fibers in response to growth factors. Cell 70:389-399,1992. Zigmond, S.H., ed. Sensory Adaptation and Motor Acti vation in Chemotaxis. Semin, in Cell Biol., Vol. 1(2), 1990. 42. Chenevert, J.; Corrado, K.; Bender, A.; Pringle, J.; Herskowitz, I. A yeast gene (BEM1) necessary for cell pola rization whose product contains two SH domains. Nature 356:77-79, 1992. Flescher, E.G.; Madden, K.; Snyder, M. Components re quired for cytokinesis are important for bud site se lection in yeast./. Cell Biol. 122:373-386, 1993. 43. Bretscher, A. Microfilament structure and function in the cortical cytoskeleton. Annu. Rev. Cell Biol. 7:337374,1991.
44.
45.
46.
47.
48.
Hartwig, J.H.; Kwiatkowski, D.J. Actin-binding proteins. Curr. Opin. Cell Biol. 3:87-97,1991. Bennett, V.; Gilligan, D.M. The spectrin-based membra ne structure and micron-scale organization of the plasma membrane. Annu. Rev. Cell Biol. 9:27-66, 1993. Carraway, K.L.; Carraway, C.A.C. Membrane-cytoskeleton interactions in animal cells. Biochim. Biophys. Acta 988:147-171,1989. Matsudaira, P. Modular organization of actin crosslin king proteins. Trends Biochem. Sci. 16:87-92,1991. Vandekerckhove, J.; Vancompernolle, K. Structural rela tionships of actin-binding proteins. Curr. Opin. Cell Biol. 4:36-42,1992. McLaughlin, P.J.; Gooch, J.T.; Mannherz, H.-G.; Weeds, A.G. Structure of gelsolin segment 1-actin complex and the mechanism of filament severing. Nature 364:685-692, 1993. Matsudaira, P.; Janmey, P. Pieces in the actin-severing protein puzzle. Cell 54:139-140,1988. Cheney, R.E.; Riley, M.A.; Mooseker, M.S. Phylogenetic analysis of the myosin superfamily. Cell Motil. Cytoskeleton 24:215-223, 1993. Korn, E.D.; Hammer, J.A., 3d. Myosin I. Curr. Opin. Cell Biol. 2:57-61,1990. Pollard, T.D.; Doberstein, S.K.; Zot, H.G. Myosin-I. Annu. Rev. Physiol. 53:653-681,1991. Titus, M.A. Myosins. Curr. Opin. Cell Biol. 5:77-81,1993. Langanger, G.; Moeremans, M.; Daneels, G.; et al. The molecular organization of myosin in stress fibers of cultured cells./. Cell Biol. 102:200-209,1986. Strome, S. Determination of cleavage planes. Cell 72:36,1993.
49. Burridge, K.; Fath, K.; Kelly, T.; Nuckolls, G.; Turner, C. Focal adhesions: transmembrane junctions between the extracellular matrix and the cytoskeleton. Annu. Rev. Cell Biol. 4:487-525, 1988.
53.
54.
55.
56.
57.
Burridge, K.; Turner, C.E.; Romer, L.H. Tyrosine phos phorylation of paxillin and ppl25FAK accompanies cell adhesion to extracellular matrix: a role in cytoskeletal assembly./. Cell Biol. 119:893-903,1992. 50. Mooseker, M.S. Organization, chemistry, and assembly of the cytoskeletal apparatus of the intestinal brush border. Annu. Rev. Cell Biol. 1:209-241,1985.
58.
51. Heath, J.P.; Holifield, B.F. Cell locomotion: new rese arch tests old ideas on membrane and cytoskeletal flow. Cell Motil. Cytoskeleton 18:245-257,1991. Lackie, J.M. Cell Movement and Cell Behavior. London: Allen and Unwin, 1986. Stossel, T.P. On the crawling of animal cells. Science 260:1086-1094,1993.
59.
Trinkaus, J.P. Cells into Organs: The Forces That Shape the Embryo, 2nd ed. Englewood Cliffs, NJ: PrenticeHall, 1984. 52. Brown, S.S. Phenotypes of cytoskeletal mutants. Curr. Opin. Cell Biol. 5:129-134,1993. DeLozanne, A.; Spudich, J.A. Disruption of the Dictyostelium myosin heavy chain gene by homologous re combination. Science 236:1086-1091, 1987. Gerisch, G.; Noegel, A.A.; Schleicher, M. Genetic alter ation of proteins in actin-based motility systems. Annu. Rev. Physiol. 53:607-628,1991.
Bibliografía
60.
Knecht, D.A.; Loomis, W.F. Antisense RNA inactivation of myosin heavy chain gene depression in Dictyostelium discoideum. Science 236:1081-1086, 1987. Cooke, R. The mechanism of muscle contraction. CRC Crit. Rev. Biochem. 21:53-118,1986. Huxley, A.F. Reflections on Muscle. Princeton, NJ: Prin ceton University Press, 1980. Squire, J.M. Muscle: Design, Diversity and Disease. Menlo Park, CA: Benjamin-Cummings, 1986. Amos, L.A. Structure of muscle filaments studied by electron microscopy. Annu. Rev. Biophys. Biophys. Chem. 14:291-313,1985. Burton, K. Myosin step size: estimates from motility as says and shortening muscle. J. Muscle Res. Cell Motil. 13:590-607,1992. Holmes, K.C.; Popp, D.; Gebhard, W.; Kabsch, W. Ato mic model of the actin filament. Nature 347:44-49, 1990. Irving, M. Muscle mechanics and probes of the cross bridge cycle. In Fibrous Protein Structure (J.M. Squi re; P.J. Vibert, eds.). San Diego, CA: Academic Press, 1987. Pollard, T.D. The myosin crossbridge problem. Cell 48:909-910,1987. Rayment, I.; Rypniewski, W.R.; Schmidt-Base, K.; et al. Three-dimensional structure of myosin subfrag ment-1: a molecular motor. Science 261:50-58, 1993. Katz, B. Nerve, Muscle and Synapse. New York: McGraw-Hill, 1966. Lai, F.A.; Erickson, H.P.; Rousseau, E.; Liu, Q.-Y.; Meiss ner, G. Purification and reconstitution of the calcium release channel from skeletal muscle. Nature 331:315-319,1988. Murray, J.M.; Weber, A. The cooperative action of mus cle proteins. Sci. Am. 230(2):59-71, 1974. Phillips, G.N.; Fillers, J.P.; Cohen, C. Tropomyosin crys tal structure and muscle regulation. J. Mol. Biol. 192:111-131,1986. Zot, A.S.; Potter, J.D. Structural aspects of troponin-tropomyosin regulation of skeletal muscle contraction. Annu. Rev. Biophys. Biophys. Chem. 16:535-559,1987. Ervasti, J.M.; Campbell, K.P. Dystrophin and the mem brane skeleton. Curr. Opin. Cell Biol. 5:82-87,1993. Trinick, J. Molecular rulers in muscle? Curr. Biol. 2:7577, 1992. Wang, K. Sarcomere-associated cytoskeletal lattices in straited muscle. Review and hypothesis. In Cell and Muscle Motility (J.W. Shay, ed., Vol. 6), New York: Plenum Press, 1985. Fawcett, D.W. A Textbook of Histology, 11th ed. Phila delphia: Saunders, 1986. Korn, E.D.; Hammer, J.A. Myosins of nonmuscle cells. Annu. Rev. Biophys. Biophys. Chem. 17:23-45, 1988. Sellers, J.R.; Adelstein, R.S. Regulation of contractile ac tivity. In The Enzymes (P. Boyer; E.G. Krebs, eds.), San Diego, CA: Academic Press, 1987. Citi, S.; Kendrick-Jones, J. Regulation of non-muscle myo sin structure and function. Bioessays 7:155-159,1987. Fishkind, D.J.; Cao, L.G.; Wang, Y.-L. Microinjection of the catalytic fragment of myosin light chain kinase into dividing cells: effects on mitosis and cytokinesis. J. Cell Biol. 114:967-975,1991.
923
Células del ápice de una raíz de una planta, en diferentes estadios del ciclo celular. (Por cortesía de John McLeish.)
El ciclo de división celular
im
•La general del ciclo . .. i estrategia ... i _ .. •El ciclo celular de los embriones tempranos y la función del MPr • Las levaduras y la genética molecular del sistema de control del ciclo celular •Controles de la división celular en los animales pluricelulares
Las células se reproducen duplicando su contenido y luego dividiéndose en dos. El ciclo de división es el medio fundamental a través del cual todos los seres vi vos se propagan. En especies unicelulares como las bacterias y levaduras, cada división de la célula produce un nuevo organismo. En especies pluricelulares se requieren muchas secuencias de divisiones celulares para crear un nuevo indivi duo; la división celular también es necesaria en el cuerpo adulto para reempla zar las células perdidas por desgaste, deterioro o por muerte celular programa da. Así, un humano adulto debe producir muchos millones de nuevas células cada segundo simplemente para mantener el status quo y, si la división celular se detiene - a causa por ejemplo de una dosis elevada de radiación ionizante- el individuo morirá en pocos días. Los detalles de la división celular pueden variar, pero existen algunos reque rimientos universales. Lo primero y principal para que se produzcan un par de células hijas genéticamente idénticas es que el DNA se replique exactamente y que los cromosomas replicados se segreguen en dos células distintas (Figura 171). El ciclo celular comprende, como mínimo, el conjunto de procesos que una célula debe llevar a cabo para cumplir estas funciones. La gran mayoría de las células también doblan su masa y duplican todos sus orgánulos citoplasmáticos en cada ciclo celular. De este modo, durante el ciclo celular un conjunto com plejo de procesos citoplasmáticos y nucleares tienen que coordinarse unos con otros. El problema central es explicar cómo se consigue esta coordinación. Nuestro conocimiento de la célula ha avanzado muchísimo en los últimos años. En el pasado se estudiaba el ciclo celular observando los pasos de la segrega ción cromosómica con un microscopio óptico y siguiendo la replicación del DNA mediante la medición de precursores radiactivos incorporados al DNA. El centro de atención, por lo tanto, eran los cromosomas, y parecían existir grandes diferen cias entre los ciclos celulares de distintos organismos y tipos de células. Experi mentos recientes han aportado perspectivas nuevas y más sencillas, revelando un sistem a de control del ciclo celular que coordina el ciclo en su totalidad. Las pro teínas de este sistema de control aparecieron por primera vez hace más de mil mi llones de años y se han conservado tan bien durante su evolución que muchas de ellas funcionan perfectamente cuando se transfieren de una célula humana a una célula de levadura. Por lo tanto podemos estudiar el sistema de control en una gran variedad de organismos eucariotas y utilizar los descubrimientos de todos ellos para dar una visión unificada de cómo las células crecen y se dividen. Este capítulo trata de cómo se coordinan y controlan unos con otros los pro cesos del ciclo celular. Otros capítulos explican detalladamente estos mismos
SEGREGACION CROMOSÓMICA REPLICACION CROMOSÓMICA
Figura 17-1 El ciclo de división celular.
925
mitosis transición de !a metafase a la anafase
replicación del DNA
procesos pero por separado: Los Capítulos 6 y 8 tratan del mecanismo de repli cación del DNA, y el Capítulo 18 describe el aparato citoesquelético que segrega los cromosomas y divide la célula en dos. Aquí, tras describir brevemente las eta pas del ciclo celular, tratamos los experimentos efectuados en embriones tem pranos de animales y de levaduras que han proporcionado los mayores avances sobre el sistema de control básico. Luego consideramos cómo actúan las señales extracelulares sobre el sistema de control regulando la división celular en los or ganismos pluricelulares.
La estrategia general del ciclo celular La duración del ciclo celular cam bia mucho de un tipo de célula a otro. Los em briones de m osca tienen los ciclos celulares más cortos que se conocen, cada uno solamente dura 8 minutos, mientras que el ciclo celular de las células del hí gado de un mamífero puede durar más de un año. Sin embargo, comenzamos nuestro tratado con un ejemplo más típico y describimos la secuencia de proce sos en una célula de mamífero que se divide bastante más deprisa, con una du ración del ciclo de unas 24 horas. El ciclo celular se divide tradicionalm ente en varias fases distintas, de las cuales la más importante es la m itosis, el proceso de división nuclear, que nos conducirá hasta el mismo mom ento de la división celular. Tal como se trata de talladamente en el Capítulo 18, durante la mitosis la envoltura del núcleo se descompone, los contenidos del núcleo se condensan formando cromosomas visibles, y los microtúbulos se reorganizan formando el huso mitótico que final mente separará los cromosomas. Mientras tiene lugar el proceso de la mitosis, la célula parece detenerse brevemente en un estado llamado metafase, en el cual los cromosomas, ya duplicados, se alinean en el huso mitótico, preparados para la segregación. La separación de los cromosomas duplicados señala el ini cio de la anafase, durante la cual los cromosomas se trasladan a los polos del huso, donde se descondensan y forman un nuevo núcleo. Entonces la célula se divide por el centro en dos mediante un proceso llamado citocinesis, que tradi cionalmente se considera el fin de la fase mitótica, o fase M, del ciclo celular (véa se Figura 17-2). En la mayoría de las células, toda la fase M sólo dura una hora aproximada mente, lo cual es sólo una pequeña fracción de la duración total del ciclo. El pe ríodo que transcurre entre una fase M y la fase siguiente es mucho más largo y se conoce como la interfase. Al microscopio parece, engañosamente, como un in terludio tranquilo durante el cual la célula aumenta de tamaño. Pero otras técni-
926
Capítulo 17 : El ciclo de división celular
Figura 17-2 Las etapas de la división celular vistas al m icroscopio.
Normalmente, los procesos fácilmente visibles de división nuclear (mitosis) y fisión celular (citocinesis), que juntos forman la llamada fase M, ocupan una fracción pequeña del ciclo celular total. La otra parte del ciclo, mucho más larga, se conoce con el nombre de interfase. En la fase M durante la transición de la metafase a la anafase tiene lugar un cambio brusco en el estado bioquímico de la célula; una célula puede detenerse en la metafase antes del punto de transición, pero una vez ha sobrepasado este punto, la célula continuará sin detenerse hasta el fin de la mitosis y a través de la citocinesis a la interfase.
Figura 17-3 Las cuatro fases sucesivas del ciclo de una célula eucariota típica. Durante la interfase
la célula crece continuamente; durante la fase M se divide. La replicación del DNA se produce únicamente durante la parte de la interfase conocida como la fase S. La fase Gj es un intervalo de tiempo entre la fase M y la fase S; G2es el intervalo entre la fase S y la fase M.
cas demuestran que en realidad la interfase es un período muy activo para la cé lula en división, durante el cual tienen lugar, siguiendo una secuencia muy orde nada, complicados procesos de preparación para la división celular. Particular mente, en el transcurso de la interfase tiene lugar la replicación del DNA en el núcleo.
La replicación del DNA nuclear ocurre durante una fase específica de la interfase: la fase S 1 La replicación del DNA nuclear sólo suele ocupar una parte de la interfase lla mada fase S del ciclo celular (S = síntesis). El intervalo entre la consumación de la mitosis y el comienzo de la síntesis del DNA se llama la fase G, (G = “gap”, in tervalo, lapso) y el intervalo entre el final de la síntesis del DNA y el principio de la mitosis se denomina fase G2. G! y G2 proporcionan un tiempo adicional para el crecimiento: si la interfase sólo durara lo necesario para que se produjera la replicación del DNA, la célula no tendría tiempo suficiente para duplicar su masa antes de dividirse. Durante G! la célula supervisa su entorno y su propio tamaño y, cuando llega el momento, da un paso decisivo que le conducirá a la replicación del DNA y a la consumación del ciclo de división celular. La fase G2 proporciona un lapso de seguridad, que permite a la célula asegurarse de que la replicación del DNA se ha completado, antes de lanzarse a la mitosis. Gp S, G2 y M son las subdivisiones tradicionales del ciclo celular típico (Figura 17-3). Vere mos que la mayoría de los ciclos celulares, aunque no todos, se ajustan a este es quema típico. Debido a que las células necesitan un cierto tiempo para crecer antes de separarse, norm alm ente el ciclo celular típico es bastante largo -p o r ejemplo, 12 horas o más para tejidos de crecim iento rápido en mamífero. Aunque la du ración de las fases del ciclo son variables dentro de unos márgenes, en la ma yoría de los casos estudiados la variación más grande ocurre durante G^ Las células en Gj pueden, si no han iniciado la replicación del DNA, detener su progresión en el ciclo y entrar en un estado de reposo especial, a menudo lla mado G0 (G cero), donde pueden perm anecer durante días, semanas o incluso años antes de volver a proliferar.
La estrategia general del ciclo celular
92 7
ciclo celular norm al G,
S
G2
Gì
M
s
g2
Figura 17-4 El ciclo celular típico com parado con el ciclo celular del embrión tem prano. En el ciclo del
£ M
embrión temprano no ocurre crecimiento, por lo que cada una de las dos células hijas producto de cada división tiene un tamaño de la mitad del de la célula progenitora. La duración del ciclo es extremadamente corta, las fases M y S se alternan sin que tengan lugar las fases Gi y G2.
ciclo celular del em brión tem prano S M
S M
S
M
S M
S
Los ciclos de división más breves de todos en eucariotas -m ás breves incluso que los de muchas bacterias- son los ciclos celulares de embriones tempranos que tienen lugar en algunos embriones animales poco después de la fecundación, y que sirven para subdividir una célula huevo gigante en muchas células más pe queñas, tan rápidamente como sea posible. En estos ciclos no hay crecimiento, las fases G, y G2 se acortan drásticamente, y el período entre una división y la si guiente oscila entre 8 y 60 minutos, de los cuales la mitad se dedican a la fase S y la otra mitad a la fase M (Figura 17-4). Más adelante trataremos sobre estos ci clos de embriones tempranos. ¿Cómo podemos saber en qué fase del ciclo se encuentra una célula? Las cé lulas en fase S son reconocibles si les suministramos moléculas marcadas de timidina -u n compuesto que las células utilizan exclusivamente para la síntesis del DNA. Las marca puede ser radiactiva, normalmente en la forma de timidina- 3H, o química, generalmente en forma de bromodeoxiuridina (BrdU), un análogo artifi cial de la timidina. Los núcleos celulares que han incorporado dichos compuestos se reconocen mediante autorradiografía (Figura 17-5) o añadiendo anticuerpos anti-BrdU, respectivamente. Generalmente, en una población de células en creci miento que estén proliferando rápida pero asincrónicamente, cerca del 30% de ellas se encuentra en algún momento de la fase S y, por lo tanto, quedarán m arca das por un breve pulso del precursor del DNA. Partiendo de la fracción de células que queden marcadas (el índice de mareaje ), se puede calcular la duración de la fase S como una fracción del ciclo completo. Igualmente, partiendo de la fracción de células detectadas en mitosis (el índice mitótico ), se puede calcular la duración de la fase M como una fracción del ciclo completo. En resumen, añadiendo un pulso de timidina-3H o BrdU y permitiendo continuar a las células dentro del ci clo durante períodos de tiempo determinados, podemos establecer cuánto tarda una célula en fase S en progresar por G2hasta la fase M, a través de la fase M hasta G, y, finalmente a través de Gj hasta volver a la fase S. Alternativamente, se puede establecer en qué fase del ciclo está una célula midiendo su contenido de DNA, que se dobla durante la fase S. Esta operación Figura 17-5 Mareaje de las células en fase S por autorradiografía. El tejido
20 |jm 928
Capítulo 17 : El ciclo de división celular
ha sido expuesto durante un período corto de tiempo a timidina-3H. La presencia de granos de plata (puntos negros) en la emulsión fotográfica sobre el núcleo indica que la célula ha incorporado timidina-3H al DNA del núcleo, y que esto ocurrió en la fase S, en algún momento durante el período de mareaje. En esta preparación del epitelio sensorial del oído interno, la presencia de una célula en fase S evidencia la proliferación de células que tiene lugar como respuesta al daño sufrido. (Cortesía de Mark Warchol y Jeffrey Corwin.)
Figura 17-6 Análisis del contenidos de DNA con un citofluorímetro de flujo separador. El gráfico muestra los resultados característicos obtenidos sobre
una población celular en crecimiento cuando se determina el contenido de DNA de sus células. En este caso el citofluorímetro de flujo separador (véase Figura 4-31) no se utiliza para clasificar las células sino sólo para realizar mediciones de ellas. Las células se tifien con un colorante que se hace fluorescente cuando se une al DNA, por lo tanto la cantidad de fluorescencia es directamente proporcional a la cantidad de DNA en cada célula. Las células se reparten en tres categorías: aquellas que tienen todo su DNA sin replicar de nuevo (una unidad arbitraria) y, por lo tanto, están en fase G,, aquellas que tienen todo su DNA replicado por completo (dos unidades arbitrarias), y por lo tanto están en fase G2o fase M, y aquellas que tienen una cantidad intermedia de DNA, por lo que están en fase S. En el caso que se ilustra, la distribución de células indica que el número de células en Gt es mayor que el de células en G2+ M, lo cual implica que en este caso la población es mayor en Gj que en G2+ M.
se ve facilitada en gran manera con la utilización de un citofluorímetro de flujo separador (Figura 17-6), el cual permite analizar grandes cantidades de células automáticamente. Se puede ir más allá y establecer la duración de G,, y de las fases S y G2 + M estudiando una población seleccionada de células por estar to das en una misma fase y, utilizando las mediciones de contenido de DNA, para seguir el proceso posterior de estas células a lo largo del ciclo.
células en fase Gi
j§ | «
2
células en fase G2 y fase M
e
c
o
1
2
cantidad relativa de d n a por célula (unidades arbitrarias)
Paralelamente al crecim iento continuo de la célula, durante el ciclo celular se producen una serie de procesos discretos2 En condiciones que favorezcan el crecimiento, el total de proteína contenido en una célula normal aumenta más o menos continuam ente durante el ciclo. De la misma forma, la síntesis del RNA continúa a una frecuencia regular, excepto du rante la fase M, cuando los cromosomas están aparentem ente demasiado condensados para permitir su transcripción. Si se analiza el patrón de síntesis de las proteínas individuales, se ve que la gran mayoría de ellas se sintetizan durante todo el ciclo. Por lo tanto, el crecim iento de la mayoría de los com ponentes de la célula es un proceso tranquilo y continuo, sólo interrumpido brevemente por la fase M, cuando el núcleo y la célula se dividen en dos. La síntesis del DNA y los pasos visibles de la mitosis no son, sin embargo, los únicos procesos discontinuos que tienen lugar, frente a este crecim iento continuo generalizado. El centrosoma, por ejemplo, ha de ser duplicado duran te la preparación de la mitosis, de forma que pueda formar los dos polos del huso mitótico (véase Figura 17-2). La producción de unas cuantas -aunque muy p ocas- proteínas clave para el proceso, se acelera enormem ente en una fase de terminada del ciclo. Por ejemplo las histonas, que se requieren para la forma ción de cromatina, se forman a una velocidad muy alta sólo durante la fase S, y lo mismo ocurre con algunas enzimas que sintetizan los desoxirribonucleótidos y replican el DNA. La activación e inhibición de la expresión de genes y el comienzo y la deten ción de procesos tales como la síntesis del DNA y la mitosis son las consecuencias evidentes de una serie de transiciones repentinas en el control del ciclo celular, mucho más difíciles de observar, cuyos principios discutimos a continuación.
Un sistem a de control central desencadena los procesos esenciales del ciclo celular3 En lo que refiere a su control, el ciclo celular actúa como una lavadora automáti ca. Las funciones de una lavadora automática son introducir agua y detergente, lavar la ropa, aclararla y centrifugarla hasta secarla. Los procesos básicos del ci clo de una lavadora son análogos a los procesos esenciales de: replicación del
La estrategia general del ciclo celular
92 9
M A Q U I N A R I A D E L A M I T O S I S - v e a s e C a p it u lo 18
t
puesta en marcha de la m aquinaria de la m itosis
í
progresión a través de la transición de la metafase a la anafase
Figura 17-7 El control del ciclo celular. Los procesos básicos tales
como la replicación del DNA, la mitosis y la citocinesis, se ponen en marcha mediante un sistema de control central del ciclo celular. Si efectuamos una analogía con una lavadora automática, el sistema de control se equipararía a un indicador que gira en la dirección de las agujas del reloj, desencadenando los procesos básicos cuando alcanza puntos determinados del dial exterior.
puesta en marcha de la m aquinaria de la replicación
I MAQUINARIA DE LA REPLICACIÓN DEL DNA - veanse Capítulos 6 y 8
DNA, mitosis etc., del ciclo celular (Figura 17-7). En ambos casos un controlador central inicia cada proceso en el momento oportuno, siguiendo una secuencia específica. Aunque el controlador podría en principio actuar como un simple re loj que asignara un tiempo fijo a cada proceso, tanto en la lavadora automática com o en el ciclo celular, normalmente el propio controlador está regulado por retroalimentación, en ciertos m omentos críticos del ciclo, por los procesos que se están efectuando. Dentro de la lavadora, unos sensores miden el nivel del agua, y envían señales de retorno al controlador para evitar que el siguiente pro ceso com ience antes de que el anterior haya terminado. Sin esta retroalimenta ción el retraso o la interrupción en cualquiera de estos procesos podría provocar un desastre. La distinción entre el sistema de control y la maquinaria que lleva a cabo los procesos básicos del ciclo celular no fue admitida mayoritariamente hasta hace poco. Por el contrario, se creía que cada uno de los procesos principales podía, de alguna manera, desencadenar por sí mismo el siguiente proceso, como en una cadena de fichas de dominó cayéndose (Figura 17-8). El punto de inflexión en nuestro conocim iento vino con la identificación de los componentes funda mentales del sistema de control central del ciclo celular y el reconocim iento de que eran distintos de las moléculas que efectúan los procesos básicos de la repli cación del DNA, la segregación cromosómica, etc. El sistem a de control del ciclo celular es un dispositivo bioquímico que ac túa cíclicam ente, compuesto por un conjunto de proteínas interactivas que in ducen y coordinan los procesos subordinados básicos que duplican y dividen los contenidos de la célula (subordinados en este contexto simplemente significa
930
Capítulo 17: El ciclo de división celular
Figura 17-8 Dos concepciones alternativas del control del ciclo de control celular. Las fichas verdes
representan los procesos básicos del ciclo celular, tales como la replicación del DNA, la condensación cromosómica, la formación del huso, etc. En (A) la ejecución de un proceso desencadena la del siguiente, como en una cadena de fichas de dominó que se van cayendo. En (B) los procesos no se acoplan directamente sino que se suceden consecutivamente debido a un mecanismo de control que funciona independientemente. El mecanismo mostrado en (B) corresponde mejor al ciclo celular real, en el que un mecanismo de control cíclico, que denominaremos el sistema de control del ciclo celular, pone en marcha los procesos subordinados del ciclo.
m aquinaria de la replicación del DNA entorno
¿Están todos los crom osom as alineados en el huso?
¿Es favorable el entorno? ¿Es la célula bastante grande? crecim iento celular
m aquinaria de la m itosis
¿Está todo el DNA replicado?
PUNTO DE CONTROL G2 I ENTRADA EN M
PUNTO DE CONTROL DE LA METAFASE SALIDA DE M
PUNTO DE CONTROL Gi
Figura 17-9 Puntos de control y entradas de información reguladora al sistema de control del ciclo celular.
La retroalimentación de los procesos subordinados y las señales del entorno pueden impedir que el sistema de control pase por ciertos puntos de control específicos. Los puntos de control más importantes están donde el sistema activa los procesos marcados en recuadros amarillos.
crecim iento celular
¿Es la célula bastante grande? ¿Es favorable el entorno? entorno
que dichos procesos ocupan una posición inferior en la jerarquía del control del ciclo celular). Durante el ciclo celular típico, el sistema de control está regulado por unos factores de retraso que pueden parar el ciclo en unos puntos de control determinados. En ellos, las señales de retroalimentación que contienen informa ción sobre los procesos subordinados pueden retrasar el avance del propio siste ma de control, evitando que éste desencadene el proceso siguiente sin que el an terior haya terminado. Los factores de retraso también son importantes en otro aspecto: sirven para que el sistema de control celular esté regulado por señales de su entorno. Normalmente estas señales de control ambiental actúan en uno o dos de los puntos de control cruciales del sistema de control del ciclo -u n o en G,, justo an tes de entrar en fase S; y el otro en G2, al comenzar la mitosis. En células eucariotas más desarrolladas las señales que retrasan el ciclo acostumbran a actuar en punto de control de G^ Este punto de control se llama Inicio en las levaduras, y en las células de mamífero simplemente lo llamaremos punto de control Gt (Fi gura 17-9). Si las circunstancias impiden la división celular, será en este punto del ciclo donde muchas células se detendrán. En una célula de ciclo continuo, el punto de control Gt es aquel en el cual el sistema de control de la célula pondrá en marcha un proceso que inicia la fase S, y el punto de control G2 aquel que pone en marcha un proceso que dará comienzo a la fase M.
El control del ciclo celular es un mecanismo basado en una proteína quinasa3 Por razones históricas la mayoría de lo que sabemos sobre el mecanismo del sis tema de control proviene de estudios sobre el punto de control G2 al comienzo de la mitosis. En nuestra descripción inicial de este sistema de control, conse cuentemente, nos centramos en los mecanismos que conducen a la célula una vez pasado el punto de control G2 dentro de la fase M. Parece probable que un mecanismo similar a éste actúe en el punto de control Gp aunque los com po nentes precisos sean diferentes.
La estrategia general del ciclo celular
931
El sistema de control del ciclo celular se basa en dos familias clave de proteí nas. La primera es la familia de las proteína quinasas dependientes de ciclina (Cdk, de Cyclin-Dependent protein Kinases), las cuales inducen los procesos sub ordinados fosforilando proteínas seleccionadas sobre serinas y treoninas. La se gunda es una familia de proteínas activadoras especializadas, las ciclinas, que se unen a las moléculas Cdk y controlan su capacidad para fosforilar proteínas diana adecuadas (Figura 17-10). El ensamblaje cíclico de compuestos de ciclina y Cdk, su activación, y desensamblaje, son los procesos centrales que dirigen el ciclo ce lular. Las ciclinas se llaman así porque sufren un ciclo de síntesis y degradación en cada ciclo de división de la célula. Hay dos clases principales de ciclinas: las ci clinas mitóticas, las cuales se unen a las moléculas de Cdk durante G2 y son ne cesarias para entrar en la mitosis, y las ciclinas Gp las cuales se unen a m olécu las Cdk durante G: y son necesarias para entrar en la fase S (Figura 17-11). En las células de levadura, que han jugado un papel fundamental en la investigación del ciclo celular, el mismo miembro de la familia Cdk proporciona la actividad quinasa en ambos puntos de control; en células de mamífero hay al menos dos proteínas Cdk diferentes, una para cada punto de control. En resumen, los procesos que llevan a la célula a la mitosis son los siguientes: la ciclina mitótica se acumula gradualmente durante G2y se une al Cdk formando un compuesto conocido como factor promotor de la fase M (MPF, de M-Phasepromoting Factor). Este compuesto inicialmente permanece inactivo, pero a tra vés de la acción de otras enzimas que lo fosforilan y desfosforilan, se convierte en un factor activo. La activación final del MPF es casi explosiva, probablemente de bido a un mecanismo de retroalimentación positiva por el cual el MPF activo in crementa la acción de las enzimas que lo activan: de este modo la concentración de MPF activo auménta a ritmo acelerado hasta que se llega a la explosión cru cial, después de la cual un flujo de MPF activos desencadena una serie de sucesos que impulsan a la célula hacia la mitosis. El MPF también se desactiva de repente por la degradación de la ciclina mitótica en la metafase-anafase que sucede a continuación, permitiendo a la célula salir de la mitosis. Cada paso de la activación o desactivación de Cdk marca una transición del ciclo celular y probablem ente tiene algún efecto sobre el propio sistema de con
pone en marcha el mecanismo de la mitosis
t f a c t o r p r o m o t o r d e la f a s e M
I
I
la quinasa empieza a actuar pone en marcha el mecanismo de replicacíón del DNA
932
Capítulo 17: El ciclo de división celular
ciclina quinasa dependiente (Cdk)
Figura 17-10 Dos componentes fundamentales del sistema de control del ciclo celular. Un com plejo de ciclina y Cdk actúa como una proteína quinasa para desencadenar los procesos subordinados. Sin la ciclina, la Cdk es inactiva.
Figura 17-11 El corazón del sistema de control del ciclo celular. Se cree que Cdk se asocia sucesivamente a diferentes ciclinas desencadenando los distintos procesos subordinados del ciclo. La actividad de Cdk se termina con la degradación de la ciclina.
trol celular, iniciando reacciones que finalmente lo conducirán a poner en m ar cha el proceso subordinado siguiente. El mecanismo que actúa en el punto de control Gj es mucho m enos conocido, pero se cree que lo hace de manera simi lar: del mismo modo que el ensam blaje del MPF desencadena finalmente los procesos de la mitosis, el ensam blaje de un compuesto parecido constituido por proteína Cdk y ciclina G! conduciría a la célula más allá del punto de control G1( desencadenando los procesos que nos llevarán a la replicación del DNA. Los procesos subordinados inducidos por la activación de Cdk en los puntos de control Gj y G2 son com pletamente diferentes, aunque en la levadura la misma proteína sirva para ambos procesos. Por lo tanto se cree que las proteínas que en cada caso se fosforilan, y son activadas por la proteína Cdk, dependen del com ponente de ciclina del complejo. Ahora volvamos a las evidencias en las que se basa esta visión del ciclo celular.
Resumen En cada ciclo de división la célula tiene que replicar su DNA. La mayoría de las célu las también aumentan y duplican todo su contenido. Durante la fase M los cromo somas replicados se segregan (por mitosis) en núcleos separados y la célula se divide en dos (por citocinesis). La otra parte del ciclo conocida por interfase es mucho más larga. Este período de crecimiento continuo comprende la fase S, en la cual tiene lu gar la replicación del DNA, y dos lapsos de tiempo, las fases G, y G2, entre la fase S y la fase M. La secuencia de procesos del ciclo celular está regulada por un sistema de control del ciclo celular que cíclicamente pondrá en marcha los procesos básicos de la reproducción celular, tales como la replicación del DNA y la segregación cromosómica. En el corazón del sistema encontramos un conjunto de compuestos protei cos formado básicamente por dos clases de componentes: subunidades de proteína quinasas (llamadas proteínas Cdk) y unas proteínas activadoras llamadas ciclinas. El ciclo celular normal está regulado al menos por dos compuestos proteicos -uno un punto de control alfinal de la fase G¡, poco antes de la fase S, y otro al final de la fase G2 poco antes de la fase M. Estos complejos proteicos ejercen su control a través de sus actividades quinasa, que se activan y desactivan de repente en puntos concre tos del ciclo.
El ciclo celular de los embriones tempranos y la función del MPF4 En un ciclo característico la célula pasa, antes de poder dividirse, por un período de crecimiento con el objetivo de duplicar todo su DNA y todos los com ponen tes de su citoplasma. Esto supone tiempo -u n período variable de tiempo si el entorno es variable. Así pues el ciclo celular típico se prolonga, y se requieren mecanismos de control que garanticen que todos los preparativos indispensa bles previos a la división se hayan completado en la secuencia correcta. Los embriones tempranos de muchos animales experimentan ciclos de divi sión celular que son atípicos: tienen lugar sin crecimiento y se suceden a una ve locidad extraordinaria y sin la mayoría de controles yTevisiones habituales. Es tos ciclos celulares de embriones tempranos nos muestran cómo trabaja el sistema de control celular, desnudo y simplificado hasta los mínimos necesarios para conseguir el requerimiento más fundamental -la duplicación del genoma y su segregación en dos células hijas. Aunque estos ciclos celulares son excepcio nales, iluminan los mecanismos del ciclo de división en todas las células eucariotas. En esta sección veremos cómo estudios de ciclos de embriones tem pra nos de la rana Xenopus nos llevan a la identificación del MPF como componente central del sistema de control celular; trataremos cómo el sistema de control simplificado efectúa sus ciclos repetidos de activación y desactivación del MPF y también veremos cómo cada uno de estos ciclos del sistema de control conduce precisamente a una ronda de replicación y segregación cromosómica.
El ciclo celular de los embriones tempranos y la función del MPF
9 33
El crecimiento del oocito de Xenopus está equilibrado por la división del huevo5 El huevo de Xenopus, como el de muchas otras especies, es una célula esférica gigante (Figura 17-12), de un poco más de un milímetro de diámetro. Por lo tan to su citoplasma es 100 000 veces mayor que el de una célula de tamaño media no, pero contiene un único núcleo. El citoplasma se llena de materiales de reser va que necesitará para la formación del renacuajo. Estos materiales se han acumulado durante un largo período de crecimiento del huevo inmaduro, cono cido com o oocito, mientras está en el ovario de la madre. De esta manera el em brión temprano se ve relevado de la necesidad de encontrar alimento y puede desarrollarse rápidamente en un organismo vivo independiente capaz de arre glárselas solo (Figura 17-13). Para preparase para su fusión con un espermatozoide, el oocito en creci miento se ha embarcado tam bién en un proceso de meiosis, al final del cual verá reducido su número de cromosomas a la mitad de lo normal. La reducción se consigue a través de una sola etapa de replicación del DNA seguida de dos divi siones celulares especiales en las que no hay más replicaciones del DNA (tal como se explica en el Capítulo 20). El crecimiento del oocito se produce a lo lar go de un amplio período, durante el cual la progresión meiótica se detiene en un estadio llamado tradicionalmente profase meiótica, pero m ejor descrito como fase G2 del primer ciclo de división meiótica: este punto de detención, justo an tes de entrar en la fase M, corresponde al punto de control G2 del ciclo celular característico. Para que se produzca un huevo maduro, diversas hormonas actúan en el oocito, desbloqueando la detención de G2y provocando que el oocito progrese a través de la meiosis hasta que llegue a detenerse en otro punto no habitual de parada, en la fase M de su segunda división meiótica (Figura 17-14). En este es tado el huevo desciende por el oviducto, es fecundado y puesto. La fecundación desencadena una serie sorprendente de divisiones celula res en las cuales la célula gigante se divide, sin crecer, generando un embrión que consiste en miles de células más pequeñas (véase Figura 17-13). En este proceso prácticam ente las únicas macrom oléculas sintetizadas son de DNA -necesarias para producir los miles de núcleos- junto con una pequeña canti dad de proteína. Después de la primera división, que dura unos 90 minutos, las 11 divisiones siguientes se suceden, más o menos sincrónicam ente, a intervalos de 30 minutos, produciéndose alrededor de 4096 (212) células en unas 7 horas. Cada ciclo consta de aproximadamente 15 minutos de fase M y 15 minutos de interfase ocupada principalm ente por la síntesis de DNA. No se han detectado fases G! o G2.
el oocito crece sin dividirse (meses)
934
Capítulo 17 : El ciclo de división celular
0,5 mm
Figura 17-12 Un huevo maduro de X en op u s listo para la fecundación. La mancha pálida cerca del ápice nos indica la colocación del núcleo, el cual ha desplazado el pigmento pardo de la capa de la superficie del citoplasma del huevo y cuya envoltura se ha roto durante el proceso de maduración del huevo. (Cortesía de Tony Mills.)
Figura 17-13 El crecimiento del oocito y las segmentaciones en un huevo de Xenopus. El oocito crece durante muchos meses en el ovario de una rana hembra, sin dividirse, y finalmente madura en forma de huevo. En la fecundación, el huevo se divide muy rápidamente -inicialmente a una velocidad de un ciclo de división cada 30 minutos- formando un renacuajo pluricelular en uno o dos días. Las células se hacen progresivamente más pequeñas con cada división ya que no existe crecimiento alguno hasta que el renacuajo empieza a alimentarse. Los dibujos de la línea superior están todos a la misma escala (pero no el sapo del nivel inferior).
el huevo fecundado se divide sin crecimiento (horas)
MADURACION
oocito
-------------------------------------------------------- ►
u.._ _
huevo
ACTIVACION
-----------------------► embrión núcleo diploide
núcleo (vesícula germinal) MEIOSIS I
DIVISIÓN
FECUNDACIÓN
— oocito parado en fase G2 de la meiosis I
corpúsculo fase M de polar oocito la meiosis I parado en fase M de la meiosis II
®
corpúsculo polar
huevo fecundado en interfase
Un regulador citoplasmàtico, el MPF, controla la entrada en la mitosis6,7 Dos experimentos cruciales establecieron la existencia de un mecanismo de control citoplasmàtico que actúa en todas las células que se están dividiendo para empezar la mitosis. El primero se basó en una técnica de ensayo sobre un oocito de Xenopus, que ha tenido una importancia crucial en la identificación de los com ponentes del sistema de control del ciclo celular. El oocito de Xenopus, tal como hemos visto, se detiene en la fase G2 meiótica, mientras que el huevo se detiene en fase M meiótica. Por lo tanto, el oocito y el huevo de Xenopus constituyen fuentes abundantes de citoplasma de estos es tadios definidos del ciclo celular. Además, al ser tan grandes, es fácil inyectar substancias en su citoplasma. Si se inyecta citoplasma en fase M de un huevo maduro no fecundado en un oocito en fase G2, el oocito receptor avanza hasta la fase M y com pleta su maduración (Figura 17-15). De esta forma se identificó en el citoplasma del huevo una actividad que se inicialmente se denominó factor promotor de la maduración porque induce la maduración de un oocito inm a duro a un huevo maduro. El otro experimento crucial se realizó con células cultivadas de mamífero. Las células de mamífero normalmente no son suficientemente grandes como para poderles inyectar citoplasma, pero lógicamente se puede efectuar un test equivalente fusionando una célula mitótica con una célula en interfase: de este modo se expone el núcleo de la célula en interfase a cualquier com ponente acti vo que pueda estar presente en el citoplasma de la célula mitótica. En tales expe rimentos la célula en interfase progresa directamente hasta la mitosis, tanto si ha replicado su DNA como si no lo ha hecho (Figura 17-16). Posteriormente se demostró que la actividad que conduce el oocito hasta la maduración y a la célula en interfase hasta la mitosis, era la misma: el factor pro motor de maduración es idéntico al factor promotor de la fase M -d os nombres para una mismas sustancia, MPF.
INYECCIÓN DE CITOPLASMA DE UNA CÉLULA EN FASE M núcleo
huso fácilmente detectable en la superficie de la célula
INYECCIÓN DE CITOPLASMA DE UNA CÉLULA EN INTERFASE
EL OOCITO ES CONDUCIDO HASTA LA FASE M
El ciclo celular de los embriones tempranos y la función del MPF
Figura 17-14 Maduración y activación del huevo deX en o p u s. Las actuación de diversas hormonas sobre el oocito cuando éste ha completado su crecim iento, lo conducen de su estado de reposo en G2 a la fase M de meiosis: com pleta su primera división meiótica y se queda en reposo en la metafase de su segunda división meiótica. Ahora, en este nuevo estado, se denomina huevo maduro, y es puesto. Las dos divisiones meióticas se suceden una a otra rápidamente, sin que intervenga la fase S; los cromosomas continúan condensados a lo largo de todo este período. La fecundación saca al huevo del reposo de la metafase, de manera que éste com pleta su segunda división meiótica y entra en la interfase de su primer ciclo celular embrionario. Cada una de las dos divisiones m eióticas genera un célula grande -u n futuro huevo- y una célula pequeña, llamada corpúsculo polar, que finalmente degenera.
Figura 17-15 Ensayo de MPF mediante inyección en un oocito de X en op u s. El MPF puede ser detectado porque conduce al oocito hasta la fase M. El gran núcleo (o vesícula germinal) del oocito se rompe cuando se forma el huso mitótico.
EL OOCITO PERMANECE EN FASE G2
935
célula mitótica
célula mitótica
célula en fase Gi
inducción de la condensación de cromosomas de una célula en fase Gi
célula en fase S
inducción de la condensación de cromosomas de una célula en fase S
célula mitótica
célula en fase G2
inducción de la condensación de cromosomas de una célula en fase G?
u 20
cromosomas humanos en metafase
cromosomas humanos en metafase
fusionarse, añadiendo al medio de cultivo un agente apropiado (véase pág. 170). El núcleo en interfase es conducido directamente hasta el estado de mitosis, con crom osom as condensados, independientemente de su estado de replicación. Las fotografías muestran fusiones de células humanas con células de marsupiales (células PtK) en interfase. En (A) la célula PtK estaba en fase G ,; consecuentem ente sus cromosomas, condensados prematuramente, todavía son cromátidas. En (B) la célula PtK estaba en fase S y su cromatina adopta un aspecto “plumulado”. En (C) la célula PtK estaba en fase G2 y ahora las cromátidas, aunque muy largas en com paración con los cromosomas metafásicos normales (humanos), son dobles. (De K. Sperlingy P. Rao, H u m an gen etik 23:235-258,1974.)
Las oscilaciones de la actividad MPF controlan el ciclo de división celular8 Los huevos y oocitos de Xenopus suministran una gran fuente de material tanto para purificar el MPF como para com probar su actividad. Una vez purificado, se descubrió que el MPF era una proteína quinasa que fosforila proteínas sobre
Capítulo 17 : El ciclo de división celular
»
iim
Figura 17-16 Resultados obtenidos al fusionar una célula de mamífero en mitosis con una célula de mamífero en interfase. Las células son inducidas a
936
»* «
cromosomas humanos en metafase
residuos de serina y treonina y que está compuesta de dos unidades básicas -u n a quinasa dependiente de ciclina (Cdk) denominada Cdc2 y una ciclina mitótica (Figura 17-17). Sin embargo, incluso antes de ser purificado y caraterizado bioquím icam ente fue posible demostrar el papel decisivo que desempeña el MPF en el ciclo celular. Experimentos utilizando el ensayo del oocito con muestras de citoplasma de ciclos celulares de embriones tempranos, así como de oocitos maduros y de huevos, muestran que la actividad del MPF es alta durante toda la mitosis y baja durante la interfase, alcanzando un máximo cada 30 minutos en un huevo en di visión. Es más, sabemos que la actividad del MPF es un rasgo universal del ciclo celular eucariota: en todas las especies, desde las levaduras a los mamíferos, las células que están en mitosis contienen actividad MPF que puede ser detectada con un ensayo de inoculación de oocitos. Rápidamente se estableció que los incrementos de actividad MPF que se pro ducen cada 30 minutos provocando la escisión del embrión de Xenopus, se gene ran debido a un oscilador citoplasmático que actúa incluso en ausencia de un núcleo. Comprimiendo un huevo activado antes de que haya completado su pri mera división, se puede separar en dos partes -u n a con un núcleo y la otra sin nú cleo. Como era de esperar, la parte con núcleo sigue la programación normal de rápidas divisiones. Sorprendentemente, la parte sin núcleo también experimenta una serie de oscilaciones, en forma de ciclos repetidos de contracciones y endure cimientos de la corteza citoplasmática. Estos espasmos recurrentes ocurren en sincronía casi perfecta con las divisiones por escisión de la mitad del huevo con núcleo (Figura 17-18). Un huevo de estrella de mar cuyo núcleo ha sido extraído, todavía va más allá: en el caso de que retenga un centrosoma, se escindirá repeti damente formando células cada vez más pequeñas, todas ellas sin núcleo. Si tomamos muestras de citoplasma a diferentes tiempos, de la célula de Xe nopus sin núcleo y se ensayan por inyección en oocitos, se puede demostrar que las oscilaciones visibles reflejan oscilaciones de la actividad MPF. Evidentemen te en estas células gigantes las oscilaciones que dirigen los ciclos de división se producen de forma independiente a cualquier señal que pueda emitir la relati vamente pequeña cantidad de DNA que normalmente se halla presente en la cé lula. Luego veremos que no ocurre lo mismo en los ciclos celulares típicos, en los que actúan estrictos mecanismos de control asegurando que la replicación cromosóm ica y la división celular se acoplen correctamente.
quinasa dependiente de ciclina Cdc2
I___________________ I
MPF
Figura 17-17 Las dos subunidades clave del MPF. La subunidad Cdk se llama Cdc2 debido al gen de la levadura de fisión que lo codifica.
La acum ulación y la destrucción de ciclina controla la activación y la inactivación de MPF9 Aunque los ciclos de división en el embrión en escisión pueden tener lugar en ausencia de DNA, no pueden ocurrir en ausencia de síntesis de proteínas: si blo queamos la síntesis de proteínas al inicio de la interfase evitamos tanto la activa ción del MPF como la mitosis siguiente. La explicación de esta observación que dó clara con la identificación de la ciclina.
45 minutos tiempo tras la fecundación
90 minutos
116 minutos
«■
El ciclo celular de los embriones tempranos y la función del MPF
L
"l mm
Figura 17-18 Un huevo deXenopus se divide en dos partes -una con núcleo y la otra sin él. Se tensa un cabello humano alrededor del huevo para partirlo en dos. La mitad que contiene el núcleo continúa dividiéndose: la otra mitad, sin núcleo, no se divide. Las instantáneas cinematográficas, sin embargo, muestran que la parte sin núcleo cambia de tamaño periódicamente mediante cambios en la dureza de su corteza celular, oscilando en clara sincronía con las divisiones de la mitad del huevo que tiene núcleo. (De K. Hara, P. Tydeman y M. Kirschner, 77:462-466, 1980.)
USA
Proc. Nati. Acad. Sci.
interfase
i
>% •
i -i
i.?
m
1 1 !
cicli na A ciclina B ribonucleótido reductasa
Figura 17-19 Incremento y decremento de los niveles de ciclina y de MPF durante el ciclo celular de embriones tempranos. Las
interfase
m itosis
■- ■—
7
Se estudió la síntesis de proteínas en huevos fecundados de erizos de mar (cuyo ciclo celular es similar al de los embriones de Xenopus) fecundando un conjunto de huevos en agua de mar que contenía un aminoácido radiactivo (metionina-35S), extrayendo muestras periódicamente, y corriéndolas sobre un gel. Una vez separadas en el gel, se podían detectar las proteínas recién sinteti zadas gracias a su radiactividad. Estos experimentos revelaron que mientras que la mayoría de la proteínas se acumulan continuamente después de la fecunda ción, un tipo de proteínas sigue un patrón periódico: se acumulan de manera continua durante cada interfase hasta la transición de la metafase-anafase, y en tonces se destruyen de repente (Figura 17-19). Esta secuencia de procesos ha motivado que a dichas proteínas se les denomine ciclinas y ha conducido a la hi pótesis de que para activar el MPF una o más ciclinas tienen que alcanzar un umbral de concentración, y que la destrucción de la ciclina está acoplada a la inactivación del MPF y la salida de la célula de la mitosis. El desarrollo de extractos libres de células que siguen el ciclo celular in vitro fue crucial para dilucidar el papel de la ciclina. Estos extractos se prepararon centrifugando huevos de rana para romperlos y así abrirlos y poder recoger su citoplasma. El núcleo de un espermatozoide añadido a dicho extracto de cito plasma puede hincharse, replicar su DNA y experimentar la mitosis tal como ha ría en un huevo fecundado: de este modo nos sirven de indicadores de la fase del ciclo celular en la que se encuentra el extracto (Figura 17-20). Si entonces se des truye todo el mRNA existente en el extracto, el ciclo celular se detiene en la inter fase, tal como ocurre cuando se inhibe la síntesis de proteínas en un embrión.
mediciones de ciclina se han hecho principalmente en huevos de invertebrados marinos, donde la ciclina representa el 5% de la proteína sintetizada durante un breve pulso con aminoácidos radiactivos. Los geles de la parte inferior del gráfico muestran las cantidades de dos variedades, A y B, de ciclina marcada en diferentes estadios del ciclo de un huevo de almeja. La línea inferior de los geles muestra la síntesis de una enzima constitutiva, como una estándar de referencia. (Adaptado de T. Hunt, F.C. Luca y J.V. Ruderman, 116:707-724, 1992.)
J. Cell Biol.
Figura 17-20 Ciclos en un sistema libre de células. Se fracciona un gran
citoplasma de huevos de rana activados
núcleo del espermatozoide de rana
ciclo celular libre de células; duración entre 40 y 60 minutos
938
Capítulo 17 : El ciclo de división celular
número de huevos de rana activados, mediante una centrifugación suave, la cual también separa el citoplasma de otros componentes. Se recoge el citoplasma no diluido y se le añade un núcleo de espermatozoide y ATP. El núcleo del espermatozoide se descondensa y experimenta ciclos repetidos de mitosis y replicación del DNA, lo cual indica que en este extracto citoplasmático libre de células actúa el sistema de control celular.
Hay que destacar que basta con añadir mRNA de ciclina purificado para resta blecer la capacidad del extracto para activar el MPF e inducir la mitosis, lo cual indica que la falta de síntesis de ciclina en el extracto vaciado de mRNA es sufi ciente para detener el ciclo. La hipótesis más simple sería que normalmente, en cuanto la concentración de ciclina alcanza el umbral necesario, se desencadena la activación del MPF. En realidad, tal como ya se ha dicho, el momento de acti vación del MPF no se regula exclusivamente mediante la ciclina sinó que depen de tam bién de la regulación de la subunidad de Cdk del MPF por parte de otras proteínas. Estos otros controles son difíciles de investigar en el embrión de Xenopus, pero pueden ser descifrados mediante los conocim ientos de la genética de las levaduras, tal como trataremos más adelante.
La degradación de la ciclina desencadena la salida de la m itosis10 La destrucción de la ciclina es tan importante para la salida de la mitosis como su síntesis lo es para entrar en ella. Normalmente la ciclina se destruye de repen te por proteolisis en la transición metafase-anafase. Este proceso necesita una secuencia señal en la cadena polipeptídica de ciclina que dirige a la molécula a su degradación (proporcionando un lugar para la unión de la ubiquitina -véase pág. 232), y depende de la activación del MPF. La función de la degradación de la ciclina ha sido estudiada construyendo una forma truncada de ciclina que es capaz de estimular la activación del MPF pero que no puede ser degradada porque carece de la secuencia señal adecuada. Si se añade mRNA de la ciclina indestructible a un extracto del ciclo celular de rana, el extracto entra en mitosis pero no puede salir de ella. Así pues, la activación de MPF que induce la mitosis necesita la síntesis de la ciclina, y la inactivación del MPF que nos conduce a la próxima interfase necesita la degradación de la ciclina. La ciclina es un com ponente esencial de MPF y se encuentra en todas las cé lulas eucariotas. Tal como mencionábam os anteriormente, hay muchas varieda des de ciclina, fabricadas por una familia de genes relacionados. La ciclina mitótica más grande se conoce como ciclina B. Los ciclos celulares típicos también dependen de otras ciclinas diferentes: las ciclinas Gp particularmente, parecen desempeñar un papel central en la activación de la proteína quinasa que saca a las células de y las conduce de lleno a la replicación del DNA. Las principales evidencias de que disponemos sobre estos hechos también provienen de estu dios genéticos de levaduras y se tratarán más adelante.
El MPF puede actuar como autocatalítico, estimulando su propia activación6 Experimentos efectuados en oocitos de Xenopus sugieren una explicación para una característica más del MPF -esta vez sobre su repentina activación todo o nada en el comienzo de la mitosis. Si se inyecta una pequeña cantidad de MPF activo a un oocito en reposo, el oocito genera más MPF activo, lo cual implica que la producción de MPF activo es un proceso autocatalítico. En resumen el sistema de control del ciclo celular actúa de la siguiente forma: la gradual acu mulación de ciclina actúa como una m echa retardada, la cual finalmente provo cará la explosión autocatalítica de la actividad del MPF que pondrá en marcha los primeros procesos de la mitosis que iniciarán la destrucción de ciclina. Con la destrucción de la ciclina termina la actividad MPF, y empieza un nuevo proce so de acumulación de ciclina.
El MPF activo induce los procesos subordinados de la m itosis11 El MPF tiene que causar muchos cambios radicales dentro de la célula para conducirla a la mitosis. Los cromosomas han de condensarse, la envoltura del núcleo ha de romperse y el citoesqueleto ha de reorganizarse formando un huso mitótico. El MPF induce todos estos procesos básicos mediante su activi
E1 ciclo celular de los embriones tempranos y la función del MPF
939
dad proteína quinasa. Produce directam ente algunos cambios mediante la fos forilación de algunos elem entos esenciales de la arquitectura celular. Otros pro cesos pueden inducirse indirectam ente -p o r ejemplo, mediante fosforilaciones que activan otras proteína quinasas que actúan en cascada alterando conside rablem ente el estado celular. La rotura del núcleo requiere la desorganización de la lámina nuclear -la cu bierta de filamentos polimerizados de laminina (tratada en el Capítulo 12). El MPF cataliza este proceso directamente, forzando a las moléculas de laminina a desensamblarse al fosforilarlas en residuos clave de serina (véase Figura 12-18). En células que contengan lamininas mutantes, obtenidas mediante ingeniería genética, en las que no existen lugares para la fosforilación del MPF, la lámina nuclear es incapaz de desmantelarse durante la mitosis, aunque la envoltura del núcleo se rompa en vesículas y otros procesos de la mitosis ocurran casi con normalidad. Otra de las moléculas que puede fosforilar directamente el MPF es la histona H l, la cual interviene en el em paquetamiento del DNA en los nucleosomas. Es posible, pero no está probado, que la fosforilación ayude a la inducción de la condensación cromosómica. El MPF cambia el comportamiento de los microtúbulos en mitosis fosforilando las proteínas asociadas a los microtúbulos. Durante la interfase el centrosoma nuclea largos microtúbulos que se extienden por todo el citoplasma. En la mitosis esta formación citoplasmática de microtúbulos se desmonta y los centrosomas nuclean un gran número de microtúbulos más pequeños y menos estables, los cuales interactúan unos con otros formando el huso mitótico (tratado en el Capí tulo 18). Esta transformación refleja un cambio químico en el centrosoma, en los microtúbulos o en ambos a la vez, y esta transformación puede ser reproducida in vitro añadiendo MPF a un sistema de libre de células que contenga centroso mas, tubulina y otros componentes del citoplasma en interfase. Los dos compo nentes de MPF -la ciclina m itótica y la quinasa C dc2- pueden encontrarse fuerte mente unidos a los centrosomas de la célula viva: se cree que la ciclina mitótica reconoce los com ponentes del centrosoma y atrae la quinasa Cdc2. Aunque los procesos no se conocen con detalle, está claro que el MPF indu ce directa o indirectamente las fosforilaciones de muchas proteínas. Para salir de la mitosis las células tienen que invertir estas fosforilaciones; se ha demostrado en m oscas y levaduras de fisión que las mutaciones que inactivan la proteína fosfatasa I -u n a de las mayores fosfatasas de uso general en la célula- evitará o retrasará en gran m anera los procesos subordinados que normalmente siguen a la inactivación del MPF, tales como la reconstrucción de la envoltura nuclear.
El sistem a de control del ciclo celular permite tiempo suficiente para que se produzca una ronda de replicación del DNA en cada interfase12 Hasta ahora hemos visto de manera resumida cómo se activan e inactivan perió dicamente los com ponentes del sistema de control celular, haciendo que la cé lula entre y salga de la mitosis, y cóm o los componentes activados desencade nan los procesos subordinados. Sin embargo los procesos subordinados requieren un intervalo de tiempo para producirse. ¿Cómo asegura el sistema de control que existe tiempo suficiente para que cada uno de estos procesos se lle ven a cabo completamente, antes de poner en marcha el siguiente proceso? El más crítico de los procesos a los que hay que concederles un tiempo ade cuado para que se produzcan, es la replicación del DNA. Si el sistema de control activa la puesta en m archa de la fase M antes de que la replicación del DNA se complete, la célula entra en una mitosis suicida, con sus cromosomas sólo par cialm ente replicados. Luego veremos que en los ciclos celulares típicos la señal de retroalimentación de un DNA replicado de forma incompleta detiene la pro gresión del sistema de control, protegiendo a la célula de este tipo de un desas tre de este tipo.
940
Capítulo 17: El ciclo de división celular
Durante los primeros ciclos embrionarios del desarrollo de una rana, sin embargo, estas señales de retroalimentación no existen. En este caso el tiempo necesario para que se produzca cada proceso subordinado es predecible e inva riable, gracias a las reservas nutritivas del huevo y al entorno protegido del em brión; por lo tanto es suficiente que el sistema de control programe atravesar el ciclo a una velocidad adecuada, con descansos adecuados programados entre la puesta en marcha de un proceso y del siguiente. La DNA polimerasa y otros com ponentes necesarios para la replicación del DNA están permanentemente a punto y pueden completar una ronda de replicación del DNA antes de que el sis tema de control pueda completar su ciclo. De hecho, el sistema de control en el embrión temprano no es consciente de la progresión del proceso de replicación del DNA, de forma que si la replicación del DNA se detiene artificialmente m e diante un inhibidor de la síntesis del DNA, la célula entra en una mitosis desas trosa. Parece que durante las primeras escisiones del embrión la cantidad de DNA es sencillamente demasiado escasa en relación con la cantidad de citoplas ma para que las señales dependientes del DNA puedan afectar el sistema de control. En los 12 primeros ciclos de división, mientras el huevo se subdivide y se forman nuevos núcleos, la proporción entre el DNA nuclear y el citoplasma aumenta por un factor superior a 4000, y hacia el final de este período los con troles de retroalimentación del ciclo celular típico empiezan a actuar.
Un bloqueo de la re-replicación asegura que ningún segmento de DNA se replique más de una vez en cada ciclo celular7 Es necesario otro tipo de control para solucionar un problema complementario: al igual que es esencial que en cada ciclo celular se replique todo el DNA celular, es igualmente importante que ningún DNA celular se replique más de una vez. La célula no soluciona este problema mediante la regulación de la retroalimen tación del sistema de control del ciclo celular sino mediante un dispositivo autolimitante dentro del propio proceso de replicación del DNA: como se trata en el Capítulo 8, en cuanto se ha replicado, cada segmento de cromatina queda modi ficado de alguna forma tal que impide que se vuelva a replicar durante el ciclo celular actual. Aunque la naturaleza de este bloqueo de las re-replicaciones todavía es desconocida, existe una evidencia clara de su existencia, y parece fundamental para el funcionamiento del ciclo celular en todos los eucariotas. Experimentos realizados en cultivos de células de mamífero que están pasando por ciclos de división característicos lo demuestran claramente. Como observamos anterior mente en la Figura 17-16, dos células que estén en diferentes fases del ciclo pue den fusionarse una con otra. Cuando una célula en Gp con el DNA todavía por replicar, se fusiona con una célula en fase S, el núcleo en Gj en el citoplasma hí brido es inducido a comenzar la síntesis del DNA inmediatamente. Evidente mente la célula en fase S contiene en su citoplasma inductores de la síntesis de DNA, y el núcleo en G! es susceptible a ellos. Por el contrario, si una célula en G2, es decir que acaba de terminar la síntesis del DNA, se fusiona con una célula en fase S, el núcleo en G2 no reinicia la síntesis del DNA, a pesar de que en el núcleo en fase S del citoplasma compartido, la síntesis del DNA continúa. Parece que la célula híbrida contiene la maquinaria para la replicación del DNA, pero que nú cleo en G2 es refractario a su actuación (Figura 17-21). Al pasar de Gt hasta G2vía S se ha creado un bloqueo de posteriores replicaciones del DNA.
El paso por la mitosis hace desaparecer el bloqueo a las re-replicaciones13 El bloqueo a las re-replicaciones tiene que desaparecer en algún momento entre el final de G2 y el comienzo de la siguiente fase S, para que se pueda iniciar el próximo ciclo de replicaciones del DNA. No se conoce de forma precisa ni cuán do ni cómo se elimina el bloqueo pero, al menos en el ciclo celular de embriones
El ciclo celular de los embriones tempranos y la función del MPF
941
el núcleo en fase Gi entra inmediatamente en la fase S; el núcleo en fase S continúa la replicación del DNA
(A)
el núcleo en fase G2 permanece en fase G2; el núcleo en fase S continúa la replicación del DNA
(B)
el núcleo en fase G2 permanece en fase G2; el núcleo en fase G1 entra en la fase S siguiendo su programa temporal (C)
tempranos, este cam bio parece depender del desmantelamiento de la envoltura del núcleo, en la mitosis. Los experimentos que lo demuestran también ilustran cómo el sistema de control del ciclo celular conduce los cromosomas a través de ciclos de replicación y segregación, en estricta alternancia. Como hem os discutido previamente, el sistema de control del ciclo celular de em briones tempranos puede actuar en extractos de huevo de rana libres de célula, donde puede detenerse en la interfase al bloquear la síntesis de proteínas o conducirse hasta la fase M, añadiendo MPF. Un núcleo de espermatozoide añadido a un extracto detenido en la interfase sufrirá exactam ente una ronda de replicaciones del DNA y se detendrá. Esto es así no porque haya habido al gún cam bio en el extracto (el cual todavía puede provocar la replicación de otro núcleo, añadido posteriormente) sino porque se ha producido un bloqueo de re-replicaciones en el núcleo del espermatozoide. Si se añade MPF al extracto, el núcleo se desmonta y cuando se recom pone (tras la inactivación del MPF), solam ente experim entará una ronda adicional de replicaciones del DNA y se detendrá de nuevo. De este modo cada increm ento de actividad MPF concede al núcleo una licencia para experimentar una ronda de replicación. Aunque la naturaleza de esta licencia no se conoce, existen pruebas que sugieren que de pende de un factor citoplasm ático que para actuar ha de introducirse en el nú cleo, y que sólo es capaz de hacerlo cuando se rompe la envoltura nuclear du rante la mitosis. Así pues, la replicación del DNA en los embriones tempranos se podría resu mir de la manera siguiente. El desencadenamiento de la mitosis se activa a inter valos temporales fijos y en cada mitosis el DNA recibe una licencia para su repli cación. La maquinaria de replicación del DNA dispone del tiempo necesario para efectuar una ronda de replicación antes de que empiece la mitosis siguien te, y se impide que se produzca más de una replicación mediante un bloqueo de re-replicaciones. Esto es suficiente para asegurar que en las fases S se repliquen los cromosomas de forma precisa y se alternen de forma regular con las fases M, en las cuales se segregan los cromosomas en células separadas. En los ciclos estándar de división celular, el sistema de control es mucho más complejo, pero el bloqueo de las re-replicaciones actúa de forma similar, garantizando que el DNA se replique solamente una vez en cada ciclo. Como en la mayoría de “reglas” del ciclo celular, el bloqueo de las re-replicaciones tiene algunas excepciones. En la mosca, por ejemplo, muchas de las células de la larva experimentan muchas rondas de replicación de sus cromosomas sin que se pro duzca la mitosis o la división celular, formándose así cromosomas politénicos gigantes en los cuales cientos o miles de copias del genoma se disponen en para lelo (véase Figura 8-19). En este caso especial, el bloqueo de re-replicaciones se elimina sin que se rompa la envoltura nuclear.
942
Capítulo 17: El ciclo de división celular
Figura 17-21 El bloqueo de las rereplicaciones: evidencias a partir de experimentos de fusión celular con células de mamífero cultivadas. Los resultados muestran que los citoplasmas en fase S contienen factores que hacen que los núcleos en Gj entren directamente en proceso de síntesis del DNA (A); sin embargo, los núcleos en G2, que ya ha replicado su DNA, son refractarios a dichos factores (B). Nótese que la fusión de una célula en G2con una célula en Gj no hace que el núcleo Gj inicie la síntesis de su DNA (C); por lo tanto, los factores citoplasmáticos para la replicación del DNA que estaban presentes en la célula en fase S desaparecen cuando la célula se traslada de la fase S a la fase G2.
Para avanzar en la explicación sobre el sistema de control celular, y para ver de qué forma las células coordinan procesos más complejos del ciclo celular tí pico, tenemos que pasar desde los embriones tempranos de rana a las levaduras, en las que se puede tratar el problema desde el punto de vista genético.
Resumen Los embriones tempranos de muchas especies animales experimentan ciclos celula res excepcionalmente rápidos, a través de los cuales el gran huevo se subdivide en muchas células más pequeñas, sin aumentar de tamaño. Estos ciclos celulares de embriones tempranos, en los cuales las fases SyM se alternan y se suceden rápida mente sin que se produzcan fases G¡ y G# nos muestran como actúa el sistema de control del ciclo celular en su forma más simple. El componente fundamental del sistema de control del ciclo celular es una proteína quinasa, llamada MPF, cuya ac tivación, mediante un explosivo proceso autocatalítico, conduce a la célula a la mitosis; la inactivación de MPF permite a la célula salir de la mitosis y replicar su DNA. El MPF se activa e inactiva cíclicamente en los ciclos embrionarios tempranos inde pendientemente del núcleo. Consta de dos subunidades principales -una quinasa dependiente de ciclina, denominada Cdc2, y ciclina. Cdc2 tiene que asociarse con ciclina para adquirir actividad MPF. La destrucción de la ciclina inactiva el MPF en el punto de salida de la mitosis, y la acumulación de ciclina acabada de sintetizar per mite la reactivación de MPF en el ciclo siguiente. En estos embriones tempranos, el tiempo necesario para reactivar el MPF es suficiente para permitir una única ronda de replicación del DNA. Tras ser replicado, sobre cada segmento de DNA actúa un mecanismo de bloqueo de re-replicaciones, el cual solamente se elimina cuando la célula atraviesa la mitosis. De esta forma, el sistema de control celular dirige rondas alternas de replicación del DNA y de segregación cromosómica.
Las levaduras y la genética molecular del sistema de control del ciclo celular14 Las levaduras son hongos unicelulares -u n grupo amplio y heterogéneo de orga nismos eucariotas. Son ideales para el estudio genético de la biología celular de los eucariotas porque se reproducen casi tan rápidamente como las bacterias y tienen un genoma cuyo tamaño es menor de 1/100 parte que el de un mamífero. Las levaduras y las ranas presentan ventajas complementarias para el estudio del ciclo celular pero tam bién desventajas. Las levaduras son muy adecuadas para la identificación, el clonaje, y la caracterización de genes que controlan el ciclo celular, pero son demasiado pequeñas para poder efectuar microinyecciones, y sus ciclos celulares son más complejos y todavía no pueden ser reproduci dos en sistemas libres de células in vitro. De todas formas estos dos organismos, muy diferentes entre sí, utilizan maquinarias del ciclo celulares básicam ente si milares y, conjuntam ente, nos han permitido diseccionar los distintos com po nentes del sistema del control celular. Las dos especies que trataremos son la levadura de gem ación Saccharomyces cerevisiae, utilizada por cerveceros y panaderos, y la levadura de fisión Schizosaccharomyces pombe, cuyo segundo nombre se debe a la cerveza africana en cuya fabricación se usa. Aunque los linajes evolutivos que conducen a las leva duras de gemación y las levaduras de fisión divergieron hace muchos cientos de miles de años, ambos organismos tienen ciclos celulares parecidos. Ambas leva duras pueden proliferar tanto en estado diploide como haploide: las células diploides pueden experimentar meiosis formando células haploides, como una al ternativa a la división habitual (véase Capítulo 20); las células haploides, como una alternativa a la división, pueden conjugarse unas con otras formando células diploides (Figura 17-22). La fase haploide facilita el aislamiento y el estudio de mutaciones que inactivan un gen, sin la complicación de tener una segunda co pia de dicho gen en la célula. En ambas especies de levadura, la nutrición y el
Las levaduras y la genética molecular del sistema de control del ciclo celular
943
/ v O \ C2n)
( p ro life ra c ió n ^ I de células I
vS)V
2n algunas cepas / pueden p ro life ra r/ com o células ( diploides \
/
n w
, . m eiosis y esporulacion (desencadenadas por las condiciones de ayuno) conjugación (norm alm ente justo después de la eclosión de las esporas)
2
X
m eiosis y esporulación (norm alm ente justo después de la conjugación)^ conjugación (desencadenada por las condiciones de ayuno) eclosión de esporas
eclosión de esporas algunas cepas de las células haploides am pliam ente utilizadas proliferan com o células haploides
CICLO VITAL DE LAS LEVADURAS DE GEMACIÓN
/ p ro life ra ció n \ I de células J
K
T
J
CICLO VITAL DE LAS LEVADURAS DE FISIÓN
sexo juegan partes importantes en el control del ciclo de división celular, por lo que estos organismos pueden ser utilizados para investigar la generalidades de la regulación del ciclo de división por parte de factores ambientales y de las inte racciones célula-célula.
El crecim iento celular requiere una interfase prolongada con puntos de control del ciclo celular3,15 El ciclo celular de la levadura es más com plejo que el del embrión temprano de rana porque una levadura, com o la inm ensa mayoría de las células, tiene que crecer antes de dividirse. Como una célula necesita más tiempo para duplicar el total de su m asa que para replicar su DNA y segregar sus cromosom as, el ci clo celular de células en crecim iento consta de interludios G, y G2 -G , entre el final de la fase M y el com ienzo de la síntesis del DNA, y G2 entre el final de la síntesis del DNA y el com ienzo de la fase M. Tanto G, com o G2 permiten la exis tencia de controles que acoplen la duración del ciclo celular al ritmo de creci m iento celular. Para m antener constante el tamaño de la célula, la duración del ciclo celu lar tiene que encajar perfectam ente con el tiempo que necesita la célula para doblar su tamaño. Si el tiempo del ciclo es más corto que el tiempo que necesita la célula para doblar su tamaño, las células serán más pequeñas en cada nueva generación; y a la inversa, si el tiempo del ciclo celular es más largo que el tiem po que necesita la célula para doblar su tamaño, las células serán más grandes en cada generación. Debido a que el ritmo de crecim iento de una célula está a la merced del entorno, y variará según el suministro de alimentos y otros factores, necesariam ente la duración del ciclo celular será ajustable (Figura 17-23). Para conseguir esta coordinación, el control del ciclo celular tiene puntos de control de tamaño específicos en los cuales el sistema de control se detiene y espera hasta que la célula ha alcanzado su tamaño crítico. Estos puntos de control tie nen lugar tanto en Gv permitiendo al sistema detenerse antes de una nueva ronda de replicación del DNA, com o en G2, permitiendo la detención del siste ma antes de que se desencadene la mitosis. Aunque ambos puntos de control actúan en todas las células, el punto de control Gi es más importante en algunas células y el punto de control G2 en
944
Capítulo 17 : El ciclo de división celular
Figura 17-22 Ciclos vitales de una levadura de gemación (Saccharomyces cerevisiae) y de una levadura de fisión (Schizosaccharomyces pom bé). La proporción del ciclo vital destinada a los estados diploide y haploide varía con las especies y depende del entorno. Cuando en el medio hay mucho alimento, las variedades salvajes normales de la levadura de gemación proliferan como células diploides, y la duración de su ciclo celular es aproximadamente de 2 horas. Si se colocan en situación de ayuno, entran en meiosis y forman esporas haploides, las cuales germinan cuando las condiciones mejoran y forman células haploides que pueden proliferar o fusionarse sexualmente (conjugarse) en fase Gj formando células diploides, dependiendo del entorno y de otros factores. Las levaduras de fisión, por el contrario, normalmente proliferan como células haploides, y en condiciones de ayuno se fusionan formando células diploides que atraviesan rápidamente la meiosis y la esporulación y regeneran células haploides. Las cepas de levaduras de gemación más utilizadas en el laboratorio son células mutantes que pueden proliferar, igual que las levaduras de fisión, como células haploides.
(A) SIN CONTROL NUTRICIONAL DEL CICLO CELULAR
(B) CON CONTROL NUTRICIONAL DEL CICLO CELULAR
reducción de la nutrición
otras, dependiendo de dónde se apliquen el control de tamaño o la mayoría de los controles ambientales. Así pues en la levadura de gemación el punto de con trol Gj, llamado Inicio, es el punto de control de tamaño más importante, y una célula que sea lo bastante grande para superar este punto de control norm al mente superará el punto de control G2; el punto de control G! también es en el que actúan la mayoría de los controles ambientales en las células de levadura y en los mamíferos. En la levadura de fisión, en cambio, es el punto G2, o entrada mitótica, el punto de control de tamaño más riguroso.
Las levaduras de fisión y de gemación cam bian de form a a medida que van progresando a lo largo del ciclo celular14 Aunque las levaduras son modelos útiles para el estudio del ciclo celular típico, sus ciclos difieren en algunos aspectos de los de una célula animal o vegetal. Como todos los hongos, m antienen su núcleo celular intacto a lo largo de la mitosis: se forma un huso mitótico dentro del núcleo, y después de que la segrega ción crom osóm ica se ha completado, el núcleo se divide por la mitad. Además, ambas clases de levaduras presentan algunos detalles diferentes en su ciclo celular. Las levaduras de fisión son células en forma de bastón y crecen por el alargamiento de sus extremos. Después de la mitosis la célula se divide en dos mediante un septo en el centro del bastón. Las levaduras de gemación, por el contrario, se dividen formando una yema. La yema se inicia durante Gp crece despacio, y finalmente se separa de su madre después de la mitosis (Figura 1724). La existencia de la yema es una señal de que la célula ha pasado el Inicio y se ha embarcado en un ciclo de división, y el tamaño de la yema indica lo que la cé lula ha progresado dentro del ciclo.
unidades de tie m p o ----- *-
Figura 17-23 Control del tamaño celular mediante el control del ciclo celular. Los diagramas muestran la relación entre el ritmo de crecimiento de la célula, el tamaño celular y el ciclo de división celular, en un organismo de vida libre como la levadura. (A) Si la división celular continuara a un mismo ritmo cuando las células están desnutridas, las células hijas resultado de cada división serían cada vez más pequeñas, quedando reducidas a la cantidad de material que su célula madre pudiera sintetizar en un solo ciclo celular. (B) La respuesta de las células de la levadura frente a condiciones desfavorables de nutrición es la disminución del ritmo de división celular: como una célula no puede proseguir más allá de un cierto punto del ciclo celular si no ha alcanzado un tamaño determinado, el ritmo de división celular se ralentiza y el tamaño de la célula continúa más o menos invariable. (En el diagrama, una unidad de tiempo representa la parte de ciclo observada en condiciones de un exceso de alimentos.)
Las mutaciones del ciclo de división celular detienen el ciclo en puntos específicos; las mutaciones w ee permiten al ciclo saltarse un punto de control de tam año16 Los fundamentos de nuestro conocim iento actual sobre el ciclo celular de las le vaduras provienen de un estudio sistemático de las mutaciones en los genes que codifican com ponentes de la maquinaria del ciclo celular. Para identificar los genes que controlan directamente el ciclo celular, la in vestigación se centró en dos fenotipos mutantes. En el primero de ellos, todas las células mutantes se detenían en el mismo punto del ciclo celular. Los genes de estas células mutantes se llaman genes cdc (de Cell-Division Cycle, ciclo de división celular); normalmente cada cdc mutante es deficiente en la fabricación de un producto necesario para que la célula supere el punto específico del ciclo en el cual se detienen las células mutantes. La segunda clase de mutación es la que llamamos wee (“pequeño” en escocés), debido a que la división de dichas células mutantes da lugar a células de un tamaño más pequeño de lo normal. Se espera que las células mutantes wee sean deficientes en un producto que nor malmente inhibe el paso por un punto de control de tamaño.
Las levaduras y la genética molecular del sistema de control del ciclo celular
945
LEVA D UR A DE FISIÓ N (Schizosaccharomyces pombe)
(TD
( O ) C «ra» )CWJW) I
\
PUNTO DE CONTROL DE INICIO
PUNTO DE CONTROL DE LA ENTRADA MITÓTICA
LEVA D UR A DE G E M A C IÓ N (Saccharomyces cerevisiae)
O M
Gi
PUNTO DE CONTROL DE INICIO
PUNTO DE CONTROL DE LA ENTRADA MITÓTICA
Al no poder completar un ciclo de división celular las células mutantes no pueden propagarse, las células mutantes cdc sólo pueden ser seleccionadas y conservadas si su fenotipo es condicional, es decir, solamente si el producto génico no funciona solamente en algunas condiciones específicas. La mayoría de las células mutantes condicionales son mutantes sensibles a la temperatura en las cuales la proteína mutante no funciona a altas temperaturas pero a bajas tem pe raturas funciona lo suficientemente bien para permitir que se produzca el ciclo celular. Una linaje de células mutantes cdc sensibles a la temperatura puede ha cerse crecer a baja temperatura (condición permisiva) y entonces puede subirse la temperatura (condición restrictiva) para desactivar la función del gen afectado. Todas las células seguirán su ciclo hasta que alcancen el punto en el que la fun ción del gen mutante se hace necesaria para continuar progresando, punto en el que todas las células se detendrán (Figura 17-25). En las levaduras de gemación una detención uniforme del ciclo celular de este tipo se puede detectar simple mente observando las células; la presencia o ausencia de una yema y su tamaño proporcionan una fácil indicación del punto del ciclo en el que se encuentran bloqueadas las células mutantes. En las levaduras de fisión se necesitan unos es tudios más laboriosos para identificar el proceso del ciclo celular que ha fallado. Actualmente se conocen cerca de 70 genes del ciclo de división celular, mu chos de los cuales se han clonado y secuenciado. Varios de ellos codifican proteí-
detención debida a la elevada tem peratura
M
® población de células escogida al azar antes de que se eleve la tem peratura
946
(9)— (9 y fä
n
(?)
Capítulo 17: El ciclo de división celular
detención debida a la elevada tem peratura
Gi
M
Figura 17-24 Comparación entre los ciclos celulares de una levadura de fisión y una levadura de gemación. La levadura defisión mostrada en el panel superior tiene el ciclo celular normal eucariota con fases G,, S, G2y M. A diferencia de lo que ocurre en las células eucariotas superiores, sin embargo, la envoltura nuclear de las células de levadura no se desmonta: los microtúbulos del huso mitótico se forman dentro del núcleo y se adhieren a los corpúsculos polares del huso (verde oscuro) en su periferia. La célula se divide formando una tabicación (conocida como la placa celular) y dividiéndose en dos. La levadura de gemación tiene fases G, y S normales. No obstante, muy temprano en el ciclo, durante la fase S, se empieza a formar un huso formado por microtúbulos; de este modo parece no haber una fase S normal. A diferencia de la levadura de fisión, la célula se divide mediante yemas. Como en las levaduras de fisión, pero a diferencia de las células eucariotas más desarrolladas, la envoltura nuclear permanece intacta durante la mitosis. Los cromosomas mitóticos condensados (rojo) son fáciles de ver en la levadura de fisión, pero más difíciles de observar en la levadura de gemación. Figura 17-25 Comportamiento de un mutante de ciclo de división celular (cdc) sensible a la temperatura. A una temperatura permisiva (baja) las células se dividen más o menos con normalidad, de forma que se encuentran células en todas las fases del ciclo (la fase celular viene indicada por su color). Si elevamos la temperatura hasta que sea restrictiva (alta), a la que el producto del gen mutante deja de funcionar con normalidad, la célula continuará progresando por el ciclo pero sólo hasta alcanzar un punto determinado que será incapaz de superar (en este caso dicho punto será el inicio de la fase S). Debido a que las células cdc mutantes continúan creciendo de todas formas, serán anormalmente grandes (no se muestra). Por el contrario, las células no mutantes cdc que tengan deficiencias en algún proceso (por ejemplo la producción de ATP) necesario a lo largo del ciclo para la biosíntesis y el crecimiento, se detendrán al azar en cualquier estadio del ciclo, en cuanto se les terminen sus reservas bioquímicas.
ñas ya conocidas que participan en los procesos subordinados del ciclo celular, tales como las DNA polimerasas que intervienen en la formación de los precur sores de la síntesis del DNA, que son necesarios para el paso a través de la fase S. Sin embargo, un número substancial de genes cdc y un gen wee clave, codifican com ponentes y reguladores del propio sistema de control del ciclo celular.
Las subunidades del MPF en las levaduras son homólogas a las del MPF en anim ales17 Tal como mencionábamos anteriormente, el punto de control de tamaño más im portante en el ciclo de S. pombe es el punto de control de entrada en la mitosis, si tuado al final de G2. En este punto es donde normalmente se detiene el sistema de control de la levadura de fisión, cuando la célula es más pequeña de lo convenien te, para conceder tiempo para el crecimiento: una vez pasado este punto de con trol la célula se ve abocada a la mitosis. Así pues, estudios de la levadura de fisión nos proporcionan una ruta natural para la identificación de los genes que codifi can los componentes del sistema de control celular que conducen la célula a la mitosis, así como de los reguladores que actúan en el sistema en este punto. El momento de entrada en la mitosis también es el punto en el que se activa el MPF en los ciclos celulares de los embriones tempranos de Xenopus, y ahora veremos que los estudios genéticos sobre la levadura de fisión convergen con los estudios bioquímicos sobre Xenopus y nos permiten identificar el gen que codifica la subunidad de Cdk del MPF y clarificar el mecanismo de activación del MPF. El homólogo de la subunidad proteína quinasa del MPF en la levadura de fi sión está codificado por un gen llamado cdc2. Estudios del ciclo celular de un mutante de esta levadura revelaron que el producto génico de cdc2 resulta ser un com ponente decisivo y fundamental para conducir la célula a la mitosis: si es defectuoso, la mitosis no tiene lugar; si se libera del control normal, la mitosis ocurre prematuramente. Los tests genéticos identificaron tres genes más, wee 1, cdc25, y cdcl3, cuyos productos regulan el funcionamiento del producto génico cdc2 (Figura 17-26). Como discutimos a continuación, la caracterización de estos productos génicos reguladores nos ha llevado al conocimiento actual sobre la regulación del MPF. El descubrimiento de la relación entre MPF y el producto génico cdc2 se produjo gracias al clonaje de cdc2. Existe una estrategia, sencilla y poderosa, para clonar el gen normal correspondiente a cualquier gen cdc mutante. Células mutantes, incapaces de dividirse a elevadas temperaturas (la condición de res tricción), son transfectadas con plásmidos que contienen fragmentos de DNA, al azar, de células normales. Ocasionalmente, algunas células mutantes recibirán un fragmento de DNA que contendrá una copia del gen cdc normal que falta en el mutante, y estas escasas células podrán dividirse bajo las condiciones de res tricción. De la progenie de estas células se puede recuperar el DNA del plásmido y obtener el gen cdc. Dicho gen puede ser secuenciado y caracterizado y se pue den generar anticuerpos contra su producto génico. La secuenciación ha revelado que el gen cdc2 de la levadura de fisión codifi ca una proteína quinasa. Los anticuerpos contra esta quinasa reconocen la sub unidad quinasa dependiente de ciclina purificada a partir de MPF de una rana. La secuenciación posterior del gen demostró que la proteína Cdcl3 de la levaduLas levaduras y la genética molecular del sistema de control del ciclo celular
Figura 17-26 Comparación del ciclo de división celular de algunas levaduras de fisión mutantes con una célula normal. En el mutante cdc2~, con un fenotipo recesivo, el gen cdc2 está inactivado de forma que la célula no puede superar el punto de control de la entrada mitótica, por lo que continúa creciendo y su tamaño final es enorme. Inversamente, el mutante cdc2 dominante, cdc2D, en el que el producto del gen cdc2 es hiperactivo, tiene un fenotipo wee: sobrepasa el punto de control prematuramente y su tamaño celular es anormalmente pequeño. El mutante cdc25 actúa como el mutante cdc2~, y el mutante wee1 como un mutante cdc2D: cdc25 y wee1 afectan la activación de la quinasa codificada por cdc2. (Fotografías cortesía de Sergio Moreno.)
947
ra de fisión es homóloga a la ciclina mitótica (ciclina B) de animales. La similitud fundamental entre las levaduras y los vertebrados se puso de manifiesto de una forma todavía más dramática mediante un tercer hecho: cuando se transfectaron células im itantes de levadura deficientes en cdc2 con plásmidos que conte nían fragmentos de DNA humano, algunas de ellas fueron capaces de dividirse normalmente. Una vez clonado y secuenciado, se comprobó que el fragmento de estas células contenía un gen humano homólogo al gen cdc2 de las levaduras de fisión. A partir de estas y de otras evidencias resulta claro que la entrada en la mitosis tanto de levaduras como de vertebrados está dirigida esencialmente por la misma quinasa y que, para que adquiera actividad MPF, esta quinasa ha de formar un com plejo con ciclina. Por razones históricas la subunidad quinasa de pendiente de ciclina de MPF se denomina Cdc2 tanto en las levaduras de fisión como en las células animales.
La actividad del MPF está regulada por fosforilación y desfosforilacióii18,19 Volvamos a las proteínas reguladoras identificadas mediante mutaciones cdcy wee y examinemos cómo controlan la activación y la inactivación del MPF. Anterior mente vimos que la ciclina, aunque necesaria, no es suficiente para activar la Cdc2; sin embargo, una vez adherida a la ciclina B durante la interfase, Cdc2 se convierte en substrato para dos proteínas quinasa. La primera quinasa es la proteína W eel, la cual fosforila un residuo tirosina cerca del lugar catalítico de Cdc2, bloqueando su actividad quinasa e impidiendo que actúe prematuramente como MPF. La segun da quinasa, llamada M 015 (identificada en la rana), fosforila un residuo treonina en otra región de la molécula de Cdc2. Esta fosforilación finalmente activará el MPF, pero mientras el residuo tirosina también esté fosforilado, el complejo de ci clina Cdc2 será inactivo. Tanto en ranas como en levaduras es la supresión de la ti rosina fosfato inhibidora lo que finalmente activa el MPF. En las levaduras de fisión dicha supresión está cataliza por la proteína Cdc25, que es una proteína fosfatasa (Figura 17-27). En la Figura 5-16 se presentan las series de cambios conformacionales en la proteína Cdc2 que acompañan este mecanismo de activación. Probablemente, el equilibrio de la actividad de W eel y de Cdc25 es tal que al principio sólo se crea una pequeña cantidad de MPF activo. Pero se cree que este MPF activo estimula la activación de más MPF, probablemente a través de la actividad de la fosfatasa Cdc25, y la inhibición de la actividad de la quinasa W eel, o de am bas cosas a la vez, creando un efecto de retroalimentación positi va. Así, durante la fase G2la ciclina se acumula de forma gradual, que provoca un lento increm ento de la actividad MPF hasta que, finalmente, se produzca una explosión autocatalítica. Al superar el umbral crítico, los niveles de actividad MPF conducirán irreversiblemente a la célula hacia la mitosis.
El m ecanism o de activación del MPF controla el tamaño de las levaduras de fisión15,18,19,20,21 Aunque la información anterior sobre la activación del MPF parece ser válida para todos los eucariotas, existen variantes. Por ejemplo, en algunos organismos
MPF inactivo
Cdc2 ciclina
quinasa activadora | MQ15 |
(Weel
quinasa inhibidora
948
Capítulo 17: El ciclo de división celular
in h ib id o r
MPF inactivo
Figura 17-27 Génesis de la actividad MPF. A medida que el nivel de ciclina va aumentando gradualmente, Cdc2 se va asociando con la ciclina; esto permite que Cdc2 sea fosforilada tanto por una quinasa activadora en un lugar de “activación” como por la quinasa Weel en el lugar catalítico de Cdc2. Esta última fosforilación inhibe la actividad de Cdc2 hasta que este grupo fosfato sea eliminado por la fosfatasa Cdc25. Se cree que el MPF activo estimula su propia activación activando Cdc25 e inhibiendo Weel, tanto directa como indirectamente.
fosfatasa
MPF activo
el ritmo de activación del MPF puede depender principalmente del ritmo de acumulación de la ciclina, mientras que en otros puede depender de la actividad Cdc25. Además en diferentes organismos y en distintas clases de células dentro de un mismo organismo, el mecanismo de activación del MPF es aprovechado con fines reguladores diferentes. En el embrión temprano sirve sencillamente para establecer el tiempo entre una mitosis y la siguiente. En las levaduras de fi sión, por el contrario, retrasa el final de la fase S y el comienzo de la mitosis, y concede una oportunidad al control de tamaño celular. Todavía no se conoce con exactitud cómo actúa el mecanismo de control de tamaño en las levaduras de fisión, pero podemos hacernos una idea general de cóm o podría funcionar. La activación del MPF se controla equilibrando su inhi bición mediante la proteína W eel y su activación mediante la proteína Cdc25, además de otros posibles reguladores. Las concentraciones y las actividades de estas moléculas se alterarán de manera diferente a medida que la célula vaya creciendo. Si, por ejemplo, la proteína W eel se diluyera en relación con la prote ína Cdc25 como consecuencia del crecimiento de la célula, dicho crecimiento inclinaría el equilibrio en favor de la activación del MPF, y un crecim iento supe rior a un tamaño crítico desencadenaría la explosión autocatalítica del MPF. Que el tamaño celular sea un regulador crucial en activación del MPF (como en las levaduras de fisión) o no (como en casi todas las demás células) no depende del modo básico de actuación del mecanismo de activación sino de los detalles cuantitativos de dicho mecanismo y de los reguladores que lo afecten. Aunque existen pruebas de la existencia de control del tamaño en muchas otras clases de células, el mecanismo parece incluso más oscuro que en las leva duras de fisión. Una pista posible vendría de las comparación entre células que difieren en el grado de ploidía (es decir, en el número de copias del genoma que contienen) pero que en cambio tienen similitudes bioquímicas y genéticas (véa se Figura 17-49). Parece una regla general que el tamaño celular es de alguna manera proporcional a la ploidía, lo cual sugiere, a su vez, que el mecanismo de control depende de algún tipo de titulación -directa o indirecta- de la cantidad de un com ponente citosólico frente a la cantidad de DNA.
Para la mayoría de las células el punto de control principal del ciclo celular se encuentra en el Inicio de GL14’ 15 Para las levaduras de gemación y para los ciclos de división característicos de la mayoría de las células de los eucariotas pluricelulares más estudiadas, el punto de control principal donde se detiene el ciclo celular para conceder el tiempo necesario para el crecimiento, no es G2, como en las levaduras de fisión, sino al final de Gv Este punto de control de G! se llama Inicio. Normalmente, si la célula de levadura de gemación puede superar dicho Inicio, también superará el punto de control de entrada a la mitosis una vez ha completado la fase S. Así pues, para la levadura de gemación, como para la mayoría de las células animales , el punto de control Gt es el punto de no retorno más allá del cual la célula completará el ciclo incluso aunque las condiciones cambien. Estudios genéticos de la levadura de gemación han demostrado que el paso por este punto, como el paso por el punto de control G2, depende de la actividad de una proteína quinasa depen diente de ciclina.
La proteína Cdc2 se asocia con la ciclina Gl para conducir a la célula más allá del Inicio14,18,22 Para una colonia de células, el crecer libremente no es suficiente para superar el Inicio: es fundamental superar este punto en el momento adecuado. En las leva duras de gemación son necesarias al menos tres condiciones para que ello ocurra -e l tamaño de la célula, la disponibilidad de alimento, y las demandas sexuales. Si la célula es demasiado pequeña, el sistema de control se detiene para proporcio nar tiempo para el crecimiento. Si la célula está en condiciones de ayuno, el siste
Las levaduras y la genética molecular del sistema de control del ciclo celular
949
ma de control también se detiene, retrasando el intento de la célula de duplicar se. Cuando a la célula se le requiere que se aparee, un factor peptídico de aparea miento secretado por una célula vecina detiene el ciclo celular en Gj y prepara la célula para la fusión con una pareja haploide (véase Figura 17-22). De este modo, tamaño, alimento y sexo regulan de forma tripartita que la célula se aproximarse al Inicio (Figura 17-28). Mutaciones que afectan la respuesta de las levaduras de gemación a estas influencias han identificado los componentes del control del ci clo celular que dirigen el progreso desde G, hasta S. La búsqueda de genes cdc en la levadura de gemación reveló algunos genes que la célula necesita para superar el Inicio. Una célula mutante deficiente en cualquiera de esto genes se detendrá en G} aunque sea suficientemente grande para superar el Inicio. Uno de los genes cdc identificados de esta forma, llamado CDC28 en las levaduras de gemación, resultó ser homólogo al gen cdc2 de las le vaduras de fisión: ambos genes tienen secuencias similares y son intercambiables funcionalmente. Este descubrimiento puso de manifiesto el vínculo remarcable entre el Inicio (el punto de control predominante en la levadura de gemación) y la entrada m itótica (el punto de control predominante en la levadura de fisión). Ahora sabemos que los ciclos celulares de ambos tipos de levadura incluyen los tipos de punto de control, y que en ambos tipos de levadura el producto del mis mo gen sirve tanto para conducir a la célula a la mitosis y superar el Inicio como para iniciar la replicación del DNA. En este capítulo, para clarificar y enfatizar su papel universal, a este gen lo denominaremos gen cdc2, sin tener en cuenta la es pecie de la que estemos tratando. La proteína Cdc2 tiene distintas actividades en los dos puntos de control y se asocia con diferentes tipos de ciclina. En G2, como se ha visto, se asocia con ciclina m itótica formando el MPF; en G, se asocia con ciclina G, formando un com plejo al que nos referiremos com o quinasa de Inicio. Probablemente la quinasa de Inicio y el MPF fosforilan diferentes series de proteínas diana, las fosforilan distintamente, o ambas cosas a la vez. Por lo tanto, parece que la especifici dad de Cdc2 depende de la clase de ciclina con la que se asocia (Figura 17-29). La clase de proteínas ciclina G! fue descubierta en las levaduras de gema ción mediante estudios sobre células mutantes que superaron el Inicio prematu ramente o bajo condiciones en las cuales las células no mutantes no lo habrían hecho. Los tres genes identificados mediante estas mutaciones resultaron codifi car proteínas lejanam ente relacionadas con las ciclinas mitóticas. Esto hizo que a estas proteínas se las denominara “ciclinas G/’ y de inmediato se sugirió que podían desempeñar un papel activo en el Inicio, análogo al que desempeñaban la ciclina mitótica en el punto de control G2 (Figura 17-30). Se podría probar que los fenotipos mutantes son resultado de un exceso de actividad de la ciclina G,. Sorprendentemente, sin embargo, la deleción de uno solo de estos genes de ciclina G, no tiene ningún efecto práctico; las células sólo se detienen en G1( incapaces de superar el Inicio, si los tres genes desaparecen simultáneamente. Por lo tanto parece que en una célula de levadura corriente por lo menos existen tres clases de ciclinas Gp que la célula requiere su actua ción para superar el Inicio, y que son, al menos hasta cierto punto, funcional
Cdc2
factor prom otor de la fase M (MPF)
950
substratos que se fosforilan en la m itosis
Capítulo 17: El ciclo de división celular
(gj
ciclina Gi
quinasa de Inicio
substratos que se fosforilan en el Inicio
Figura 17-28 Las tres opciones de que dispone una célula haploide de levadura de ñsión cuando se acerca al Inicio. Nótese que una célula diploide, en lugar de aparearse, tendría la opción de entrar en la meiosis y formar esporas.
Figura 17-29 Com paración entre la quinasa de Inicio y el MPF. Ambos disponen de Cdc2, pero se asocian con diferentes tipos de ciclina. Ello sugiere que la ciclina determina la especificidad de substrato de la quinasa Cdc2, tanto porque se une a los substratos (como se muestra) como porque conduce a la quinasa a su localización adecuada en la célula (no se muestra).
Figura 17-30 El ciclo de Cdc2 en levaduras. Cdc2 está presente de forma permanente, pero cambia su estado de asociación con la ciclina, lo cual define las fases del ciclo de división de la célula.
ciclina Gi
mente intercambiables de forma que la célula puede seguir adelante si uno o dos de los tres genes se han perdido. Se cree que en un ciclo habitual las tres ciclinas G{ colaboran asegurando que las células sobrepasen el Inicio de una manera rápida, decisiva e irreversi ble, mediante una activación explosiva de la quinasa de Inicio análoga a la acti vación explosiva del MPF al comienzo de la mitosis. Aunque todavía quedan muchas lagunas en el conocim iento de estos procesos, de nuevo parece que el mecanismo depende de una retroalimentación positiva, aunque por un proceso distinto: cuando la quinasa Cdc2 se une a una de las ciclinas G! forma un com plejo activo que induce la transcripción de genes que codifican las otras dos ci clinas Gp las cuales, a su vez, se unen a Cdc2 e incrementan su producción hasta que se alcanza el umbral del complejo activo. Cuando la célula ya ha pasado por el Inicio, las ciclinas Gp como las ciclinas G2 en la mitosis, desaparecen de la célula y, por lo que se sabe hasta ahora, no desempeñan ningún otro papel hasta la fase G, del siguiente ciclo.
Las ciclinas GLmedian muchos de los controles que actúan en el Inicio15,22,23 El sistema de control del ciclo celular de las levaduras de gemación está regulado ampliamente en el Inicio, mediante frenos y aceleradores que controlan la pro ducción de las diversas ciclinas Gv Las células de levadura de gemación regulan su tamaño, haciendo que la adquisición de una talla determinada sea la condición indispensable para supe rar el Inicio -u n a estrategia que probablemente utilizan también la mayoría de las demás células. Así pues, las células que comienzan G! cuando son anormal mente pequeñas utilizarán un tiempo extra para crecer antes de superar el Ini cio, mientras que las células anormalmente grandes al comenzar G! superarán el Inicio antes de lo habitual. Ya hemos discutido de qué forma el tamaño celular puede controlar el paso de la célula a través del punto de control G2 en las leva duras de fisión, modificando las concentraciones relativas o las actividades de las moléculas reguladoras. Principios similares podrían aplicarse al mecanismo a través del cual tamaño de la célula regula el paso a través del Inicio. Los mecanismos a través de los cuales los factores ambientales regulan el paso por el Inicio se comprenden algo mejor. Una deficiencia de alimento redu ce la velocidad de síntesis de ciclinas respecto a la de su degradación, por lo que reduce la concentración de ciclinas en la célula. Como consecuencia de ello, la célula podría no alcanzar el umbral de concentración de ciclinas Gj necesario para desencadenar la explosión de quinasa de Inicio. También se cree que las feromonas de apareamiento bloquean el paso por el Inicio al hacer disminuir los
Las levaduras y la genética molecular del sistema de control del ciclo celular
951
niveles de ciclinas G,, pero en este caso ésto se consigue haciendo que las cicli nas Gj se mantengan inactivas y degradadas.
La quinasa de Inicio pone en m archa la fabricación de los com ponentes necesarios para la replicación del DNA2 24 La actividad de la quinasa de Inicio tiene que inducir directa o indirectamente la replicación cromosómica, tal como la actividad del MPF tiene que inducir al fi nal de G2 la mitosis. La replicación crom osómica requiere un equipamiento com plejo -enzim as tales como la DNA polimerasa, la ligasa, y la topoisomerasa, así com o enzimas necesarias para la síntesis de nucleótidos, proteínas estructu rales com o las histonas, y factores de iniciación que actúan en los orígenes de la replicación iniciando la síntesis del DNA (se discute en el Capítulo 6). Los genes de al m enos algunas de estas proteínas se transcriben cíclicam ente durante cada fase S, y existen evidencias circunstanciales de que su transcripción está activa da por la quinasa de Inicio. Exceptuando las histonas, parece que la mayoría de estas proteínas subsisten (al menos en las levaduras) a través de todo el ciclo. Sin embargo no está claro si la quinasa de Inicio pone en marcha la fase S mediante la fosforilación de com ponentes reguladores permitiendo la actividad de la m a quinaria de replicación que ya está presente, o desencadena la fase S mediante la fabricación de los elementos de la maquinaria que se habían perdido. En los ciclos celulares de embriones tempranos la situación es mucho más simple. El embrión dispone de abundantes reservas de transcritos de RNA deri vados de la madre, y todo el aparato para la replicación cromosómica permanece disponible a lo largo de todo el ciclo incluyendo, al parecer, la quinasa de Inicio. El paso a través de la fase M, eliminando el bloqueo de re-replicaciones, es sufi ciente para permitir una nueva replicación del DNA.
Los controles por retroalim entación aseguran que las células com pleten un proceso de ciclo celular antes de com enzar el siguiente3,25 Cada una de las acciones principales del sistema de control del ciclo celular -la activación del MPF al inicio de la mitosis, su inactivación en la transición de la anafase a la metafase, la activación de la quinasa de Inicio en el Inicio- desenca denan un com plejo proceso subordinado que requiere un cierto intervalo de tiempo para completarse. Si el sistema de control inicia la siguiente acción sin que cada uno de estos procesos subordinados se haya completado, es probable que las consecuencias sean fatales o mutagénicas para la célula. Así, si se condu ce a la célula a la mitosis antes de que haya terminado la replicación de su DNA, transmitirá a sus células hijas una serie de cromosomas rotos e incompletos; si progresa hasta la anafase y comienza a dividirse en dos antes de que todos sus cromosomas estén alineados en el huso mitótico, los cromosomas no quedarán repartidos por igual en las células hijas. En la mayoría de las células tales desas tres se evitan mediante controles de retroalimentación que actúan en ciertos puntos de control deteniendo el sistema de control celular hasta que el proceso requerido se haya completado. El control por retroalim entación m ejor estudiado es el que retrasa la mitosis hasta que se com pleta la replicación del DNA. El fenóm eno es fácil de poner de manifiesto en células de mamífero que tengan ciclos celulares típicos. Si mien tras estas células están en fase S se tratan con un inhibidor de la síntesis del DNA, como la afidicolina (que inhibe específicam ente la DNA polimerasa) o como la hidroxiurea (que bloquea la síntesis de los desoxirribonucleótidos), la célula se detiene en fase S y no progresa hacia la mitosis hasta que el inhibidor sea suprimido y se com plete la replicación del DNA. No obstante, si las células en las cuales se inhibe la síntesis del DNA reciben cafeína junto con el inhibidor, las células progresan de forma suicida hacia la mitosis con su DNA replicado de
952
Capítulo 17: El ciclo de división celular
control
G2
+ cafeína
MITOSIS NORMAL
M
+ hidroxiurea
m + hidroxiurea + cafeína
MITOSIS NORMAL
M
M
l {
DETENCION EN LA FASE S ))+(
MITOSIS SUICIDA
Figura 17-31 El DNA replicado de forma incompleta bloquea el comienzo de la mitosis. En los experimentos esquematizados aquí se trataron células de mamífero en cultivo con cafeína y con hidroxiurea, por separado o conjuntam ente. La hidroxiurea bloquea la síntesis del DNA, deteniendo las células en la fase S y retrasando la mitosis. Pero si además de hidroxiurea se añade cafeína, el m ecanism o de retraso falla y las células entran en la mitosis siguiendo con su ciclo típico pero con un DNA replicado incompletamente.
manera incompleta. Ante la ausencia de un inhibidor del DNA la cafeína no causa ningún daño: el sistema de control continúa siguiendo el programa típico, lo cual permite a las células finalizar la replicación del DNA antes de que la mitosis com ience (Figura 17-31). Por lo tanto parece que las células poseen un mecanism o de control por retroalimentación que se inactiva (de manera desco nocida) con la cafeína. El control de retroalim entación actúa como un m ecanis mo de seguridad. En circunstancias normales el dispositivo de seguridad no será necesario ya que el DNA tiene tiempo suficiente para replicarse com pleta mente antes de que se inicie la mitosis. Es más, como mencionábam os ante riormente, en los primeros ciclos celulares del embrión de una rana no existe tal dispositivo de seguridad, y la inhibición de la replicación del DNA no retrasa la entrada en la mitosis.
El DNA dañado genera una señal que retrasa la m itosis25,26 Además, actúan otras señales de retroalimentación reprimiendo el sistema de control celular hasta que se hayan satisfecho algunas condiciones particulares. Tal como hemos mencionado anteriormente, los cromosomas que no están ad heridos al huso mitótico generan una señal de retroalimentación que bloquea la inactivación del MPF (se discute en el Capítulo 18). Otro control por retroali m entación bien caracterizado actúa en el punto de control de la entrada mitótica evitando que las células cuyo DNA está dañado entren en la mitosis antes de que dicha alteración esté reparada. Normalmente la respuesta al DNA dañado se estudia con lesiones de DNA inducidas experimentalmente, como las infringidas por rayos X. Se han aislado muchas mutaciones debidas a radiaciones (rad) en la levadura de gemación, y al menos una, llamada radS, codifica un componente fundamental del mecanismo de control de retroalimentación. Las células mutantes que carecen de radd po seen la maquinaria de reparación del DNA pero no pueden retrasar G2 tras ser irradiadas. Como consecuencia de ello, progresan hacia la mitosis con los cro mosomas dañados: no es sorprendente, por lo tanto, que mueran debido a unas dosis de radiación a las que las células normales sobrevivían. En la Tabla 17-1 se resumen varios de estos genes cuyas funciones están implicadas en la regula ción del ciclo celular de las levaduras. En las células de los mamíferos actúa un dispositivo de seguridad adicional reprimiendo la entrada en la fase S cuando el DNA está dañado. El m ecanismo parece depender de una proteína llamada p53, que se acumula en la célula como respuesta a las alteraciones del DNA y detiene al sistema de control del ciclo celular en Gr. Las mutaciones del gen p53 juegan un papel crucial en la génesis de una amplia proporción de los cánceres humanos, aparentem ente incapacitando el control por retroalim entación y, por lo tanto, aumentando la frecuencia de alteraciones genéticas promotoras de cáncer, como discutimos en el Capítulo 24. Las levaduras y la genética molecular del sistema de control del ciclo celular
953
Tabla 17-1 Algunos genes del ciclo de división celular de las levaduras y sus funciones Nombre del gen en levaduras de gemación
Nombre del gen en levaduras de fisión Producto gènico
Fenotipo del imitante que ha perdido la función del gen
CDC2
potò
paro en la fase S
CDC9
cdc 17
CDC28
cdc2
proteína serina/ treonina quinasa
SW16
cdclO
CLN 1,2,3
?
proteína reguladora de genes necesaria para la transcripción de las ciclinas G, ciclinas G,
CLB 1,2,3,4
cdcl3
ciclinas mitóticas
WEE1
wee 1
proteína tirosina quinasa
cdc25
subunidad catalítica de la DNA polimerasa 8 DNA ligasa
RAD9
?
proteína tirosina fosfatasa proteína de función desconocida
DIS2 SI
dis2
proteína fosfatasa I
paro en G2con DNA replicado de forma imperfecta paro en el Inicio o en el punto de control de la entrada a la mitosis (G2) no entra en la fase S
paro en el Inicio (si los tres genes son inactivos) paro en el punto de control de entrada a la mitosis (G2) paso prematuro por el punto de control de la entrada a la mitosis (G2), y por ello tamaño pequeño paro en el punto de control de entrada a la mitosis (G2) no se retrasa la mitosis cuando el DNA está dañado (pérdida del control por retroalimentación) parada en la mitosis
La tabla sólo muestra una pequeña selección de genes cdc y de genes relacionados que han sido identificados. La terminología es confusa. En cada especie de levadura, los genes cdc se nume ran por orden de descubrimiento -CDC1, CDC2, CDC3,. . . en levaduras de gemación; cdcl, cdc2, cdc3, . .. en levaduras de fisión. Por lo tanto las secuencias numéricas no se corresponden, de manera que el equivalente al gen c d c l de la levadura de fisión se llama CDC28 en la levadura de gemación (ambos genes codifican la quinasa dependiente de ciclina del sistema de control del ciclo celular). Para empeorar las cosas aún más, no existe ningún convenio que regule cómo se llaman los homólogos de estos genes en otros organismos.
Generalmente los controles por retroalim entación en el ciclo celular dependen de señales inhibidoras27 Un argumento general nos sugiere por qué los controles por retroalimentación como los que hem os m encionado se basan en una señal negativa que detiene el sistema de control del ciclo celular, en vez de basarse en una señal positiva que haga progresar al sistema de control hacia adelante cuando el proceso subordi nado se haya completado. Consideremos, por ejemplo, la observación de la adhesión de los crom oso mas al huso mitótico. Una célula necesita ser capaz de detectar la adhesión del último crom osom a a los microtúbulos del huso: si la célula comienza la anafase y empieza a segregar sus crom osom as en las células hijas antes de que esto haya sucedido, una célula hija recibirá una dotación incompleta de cromosomas mientras que la otra célula hija recibirá un exceso de cromosomas. En una célula con muchos cromosomas, si cada uno de ellos envía una señal positiva al siste ma de control una vez se ha adherido, cuando lo hiciera el último cromosoma su señal sería difícil de detectar porque sólo supondría una pequeña fracción de
954
Capítulo 17 : El ciclo de división celular
quinasa de Inicio activada
célula de tam año m enor al m ínim o
DNA alterado (p53)
quinasa de Inicio inactivada
preparación para activar M PF
f
DNA replicado de form a incom pleta
----------------
célula de tam año m enor al m ínim o
cambio de la intensidad total de la señal de “ponerse en marcha”. Por otra parte, si cada cromosoma no adherido al huso envía una señal negativa que inhiba el progreso del sistema de control del ciclo celular, la adhesión del último crom o soma será fácilmente detectable porque significará la desaparición de las seña les de “parada”. Un argumento similar a éste implicaría que la mitosis depende de la consum ación de la replicación del DNA, no porque se requiera una señal positiva de DNA replicado en su totalidad sino porque el DNA no replicado o las horquillas de replicación envían una señal negativa mientras todavía se replican los cromosomas. En la Figura 17-32 se resumen algunos de los controles que actúan en el ci clo celular.
M PF activado
DNA alterado (rad9)
M PF inactivado
crom osom a separado del huso
Figura 17-32 Resumen de los controles de retroalimentación, tamaño y daño en el ciclo celular. Las barras rojas en forma de T representan los puntos de control en la progresión del sistema de control del ciclo celular, que provienen de procesos intracelulares que son incompletos o alterados.
Resumen Las levaduras son un modelo de organismo genéticamente práctico para el estudio de los ciclos celulares típicos en los cuales la célula crece y se divide. En las células normales el ciclo de división corre paralelo al crecimiento de la célula, de forma que se mantenga un tamaño medio típico, mediante controles que actúan en dos puntos del ciclo celular de control de tamaño -uno en G¡ llamado Inicio (más im portante en las levaduras de gemación y en células de animales superiores), y el otro en G2 llamado el punto de control de la entrada mitótica (más importante en las levaduras de fisión). Si la célula todavía no ha alcanzado su tamaño crítico, el sistema de control del ciclo celular se detiene en estos puntos. Los genes que codifi can los componentes del sistema de control del ciclo celular pueden ser identifica dos mediante mutaciones que detienen a la célula en un punto específico del ciclo o le permiten proseguir más allá del punto de control y dividirse dando lugar a célu las de tamaños anormalmente reducidos. Uno de estos genes, identificado en la le vadura de fisión como cdc2, codifica una proteína homóloga y funcionalmente in tercambiable con la subunidad de MPF quinasa dependiente de ciclina de los vertebrados. Dicho gen juega un papel central a lo largo del ciclo celular de la leva dura: en G2 se asocia con la ciclina mitótica formando el MPF y conduciendo a la célula más allá del control de entrada a la mitosis; en G, se asocia con la ciclina G, formando la quinasa de Inicio y conduciendo a la célula a pasar el Inicio. Se cree que cada una de estas activaciones quinasa se producen mediante un mecanismo de explosión autocatalítico que implica otros componentes reguladores, haciendo que el sistema de control del ciclo celular responda a múltiples controles. Estos con troles incluyen señales por retroalimentación de DNA replicado deform a deficiente o dañado que impedirán que se supere el siguiente punto de control hasta que se complete la replicación o se repare el daño.
Controles de la división celular en los animales pluricelulares En los organismos unicelulares, en los cuales cada división celular genera un nuevo individuo, la selección natural favorece a las células que crecen y se divi den más rápidamente y a las que sobreviven más tiempo. Su proliferación sólo
Controles de la división celular en los animales pluricelulares
955
se ve frenada por la disponibilidad de alimento y por las demandas ocasionales del sexo. Por el contrario, en las especies pluricelulares la selección natural no actúa en cada célula sino en el conjunto del organismo. Para producir y m ante ner la intrincada organización del cuerpo los com ponentes celulares tienen que estar sometidos a controles estrictos que limiten su proliferación. La mayor par te del tiempo, la mayoría de las células de un adulto no están creciendo ni divi diéndose, sino que se encuentran en estado de reposo, llevando acabo su fun ción especializada mientras se encuentran fuera del ciclo de división. Debido a que los alimentos son abundantes en los tejidos corporales, las células tienen que frenar su proliferación en condiciones en las cuales las levaduras o las bac terias se lanzarían a proliferar. ¿A qué se debe esta diferencia? Veremos que para las células de un animal pluricelular la abundancia de ali m ento no es suficiente para poner en marcha la división; una célula necesita re cibir señales positivas específicas de otras células. Muchas de estas señales son factores de crecimiento proteicos que se unen a receptores complementarios de la mem brana plasmática estimulando la proliferación celular. Estas señales po sitivas actúan inhibiendo controles intracelulares negativos que, en caso contra rio, frenarían el crecim iento y bloquearían el progreso por el sistema de control celular. Así pues, mientras que una célula de levadura bien alimentada puede proliferar hasta que reciba una señal negativa (por ejemplo, un factor de aparea m iento), una célula animal permanece en reposo a menos que reciba una señal positiva que ponga en marcha su proliferación. En esta sección nos centraremos en las células de mamífero y en cuatro pre guntas: ( 1) ¿Cuál es la naturaleza del sistema de control del ciclo celular en las células de los mamíferos? (2) ¿Cómo se regula la proliferación en las células de los mamíferos, y cóm o se estudia? (3) ¿Cuáles son las señales extracelulares que determinan si la célula debe crecer o dividirse? (4) ¿Cómo inhiben estas señales los controles intracelulares negativos y actúan sobre el sistema de control del ci clo celular? La última pregunta es, con diferencia, la más difícil de responder. La dejaremos para el final y empezaremos examinando de cerca los componentes del sistema de control del ciclo celular comparándolos con los del sistema de control del ciclo celular de las levaduras.
El sistem a de control del ciclo celular es más elaborado que el de las levaduras28 Todos los genes del ciclo celular que hemos visto en las levaduras, incluyendo cdcl, las ciclinas, cdc25, y wee 1, tam bién aparecen en las células de mamífero. Se ha demostrado que todos ellos actúan de forma similar a sus equivalentes de las levaduras, hasta el punto de que una levadura mutante a la cual le falte su copia de gen funcional puede salvarse con la transferencia de un gen de mamífero. Como apuntábamos antes, esto ha proporcionado un camino eficiente para el clonaje de genes del ciclo celular de los mamíferos. Sin embargo, el sistema de control celular de la mayoría de los organismos pluricelulares es m ucho más complejo que el de las levaduras. Aparentemente la duplicación y divergencia de genes ha generado múltiples variantes de los genes fundamentales del ciclo celular y estas variantes, que coexisten en una misma célula, se especializan en funciones ligeramente diferentes. De este modo, m ien tras que en las levaduras un gen de quinasa dependiente de ciclina es suficiente para todos los pasos del ciclo celular, las células humanas necesitan al menos dos o probablem ente más de ellos. Se sabe que dos de estas proteínas -cdc2 y un gen relacionado llamado cdk2- están presentes en la rana Xenopus y tam bién en Drosophila; ambos codifican quinasas cuya activación depende de su unión a ci clinas. Como en las levaduras, los animales superiores también tienen múltiples ciclinas: se han encontrado al menos seis tipos diferentes de ciclina, llamadas ci clina A, B, C, D, E, y F; algunas de ellas son familias de moléculas estrechamente relacionadas entre sí. La inducción de la mitosis en las células de los vertebrados depende de una proteína Cdc2 complejada con ciclina B; existen evidencias de
956
Capítulo 17: El ciclo de división celular
Cdc2
Figura 17-33 Las ciclinas y la proteína Cdk en un ciclo celular norm al de vertebrados. Los vertebrados tienen muchos genes ciclina y muchos genes cd k distintos. Sus productos actúan en varias com binaciones de ciclina/Cdk en diferentes estadios del ciclo. El diagrama, que es especulativo, muestra algunas de estas ciclinas. Las funciones de la Cdk2 y de la ciclina A, en particular, son aún inciertas.
que la proteína Cdk2 complejada con la ciclina E pueden inducir la superación del punto de control Gj (el equivalente al Inicio en los vertebrados), y que la ci clina A complejada con la proteína Cdk2 puede ser necesaria para activar la m a quinaria de replicación del DNA (Figura 17-33). Parece, por lo tanto, que en los mamíferos diferentes proteínas Cdk efectúan varias funciones que en las levadu ras son llevadas a cabo por una única proteína. En células que poseen ciclos regulares, la concentración de la mayoría de las ciclinas que tom an parte en ellos sube y baja en diferentes momentos del ciclo celular, mientras que las concentraciones de las quinasas dependientes de cicli na se mantienen aproximadamente constantes, como ocurre en las levaduras. Actualmente todavía no se conocen en detalle las funciones precisas de la mayo ría de las proteínas del sistema de control del ciclo celular de las células de los mamíferos.
La regulación del crecim iento y de la proliferación de las células de mamífero se estudia norm alm ente en líneas celulares cultivadas29 La observación detallada de las células de mamífero en un animal intacto no es fácilmente accesible. Por ello, la mayoría de los estudios realizados sobre la pro liferación de células de mamífero utilizan células que se hacen crecer en cultivo (Figura 17-34). Sin embargo, esto produce una complicación adicional. Si las cé lulas de los tejidos normales de mamífero se cultivan en condiciones estándar, normalmente sólo podrán propagarse hasta un número determinado de ciclos de división -aproxim adam ente 50 para las células normales del cuerpo humano, por ejemplo; después, las divisiones cesan y la célula finalmente muere; este proceso recibe el nombre de senescencia celular, de la cual trataremos más ade lante. Pero durante la proliferación de algunas células cultivadas, especialmente de roedores, algunas células escapan de la senescencia y se dividen indefinida mente como líneas celulares. Aunque dichas células parecen normales en mu chos aspectos, su inmortalidad refleja la presencia de una o más mutaciones que han alterado sus propiedades de proliferación. De todas formas, a pesar de sus ligeras anomalías, las líneas celulares se usan habitualmente en los estudios so bre el ciclo celular -y en toda la biología celular en general- porque aportan una fuente ilimitada de células estandarizadas y genéticamente homogéneas.
Los factores de crecim iento estim ulan la proliferación de células de m am ífero30 Al principio las células de mamífero se cultivaron en coágulos sanguíneos, y du rante muchas décadas todos los esfuerzos dedicados a la definición de los re querimientos mínimos para la proliferación de las células fueron vanos; incluso en un medio que contuviera los nutrientes típicos definidos químicamente, in-
Controles de la división celular en los animales pluricelulares
Figura 17-34 Electronm icrografía de barrido de células de mamífero proliferando en cultivo. Las células son fibroblastos de rata. (Cortesía de Guenter Albrecht-Buehler.)
957
cluyendo glucosa, aminoácidos y vitaminas, las células sólo crecían si al medio se le añadía suero, el líquido que queda después de que la sangre se haya coagu lado. Al igual que las levaduras cuando se quedan sin nutrientes, las células de mamífero sin suero dejan de crecer y quedan detenidas, normalmente entre la mitosis y la fase S, en un estado de reposo llamado G0. Finalmente se demostró que los com ponentes fundamentales aportados por el suero son unas proteínas muy específicas llamadas factores de crecim iento, la mayoría de las cuales se necesitan sólo en proporciones muy pequeñas (del orden de 10 -9 a 1 0 11M). Uno de los primeros de estos factores en ser identificados fue el factor de crecim iento derivado de las plaquetas, o PDGF (de Platelet-Derived Growth Fac tor) y es característico de muchos otros descubiertos después. El camino hacia su aislamiento empezó observando que los fibroblastos cultivados proliferan si se les suministraba suero pero no si se les suministraba plasma -e l líquido prepara do mediante la extracción de las células de la sangre sin permitir que se produzca la coagulación. Cuando la sangre se coagula, las plaquetas incorporadas al coágu lo se ponen en marcha liberando los contenidos de sus vesículas secretoras (Figu ra 17-35). La capacidad superior del suero para facilitar la proliferación sugiere que las plaquetas contienen uno o más factores de crecimiento. Esta hipótesis se confirmó mostrando que los extractos de plaqueta pueden utilizarse en lugar del suero para la proliferación de fibroblastos. Se demostró que el factor crucial de crecimiento es una proteína, que posteriormente fue purificada y llamada PDGF. Probablemente en el cuerpo la proteína PDGF liberada de coágulos sanguíneos juega un papel importante en la estimulación de la división celular (y en otros procesos) durante la curación de las heridas. El PDGF solam ente es 1 de las aproximadamente 50 proteínas que actúan com o factores de crecim iento. Para cada clase de factor de crecimiento existe un receptor o un conjunto de receptores específicos, cada uno de los cuales algunas células presentan en su superficie y otras no. Las células responden a un factor de crecim iento sólo si disponen de la proteína receptora apropiada (se trata en el Capítulo 15). Además de las proteínas, otras moléculas pueden actuar como factores de crecim iento; un ejemplo de ellas son las hormonas esteroideas, que actúan sobre proteínas receptoras intracelulares. Los factores de crecimiento se pueden dividir en clases de especificidad amplia o reducida. Los factores de es pecificidad amplios, com o el PDGF y el factor de crecimiento epidérmico (EGF, de Epidemial Growth Factor) actúan sobre muchas clases de células. Así, el PDGF actúa sobre una amplia variedad de células diana, entre las cuales se in cluyen fibroblastos, fibras musculares lisas, y células neurogliales, mientras que el EGF no sólo actúa sobre células epidérmicas sino también sobre muchos otros tipos de células, tanto epiteliales como no epiteliales. En el otro extremo encontram os los factores de especialidad reducida como la eritropoyetina, que solam ente induce proliferación de precursores celulares de los glóbulos rojos. Debido a que estos factores se presentan en pequeñas cantidades, son difí ciles de aislar; sin embargo, una vez que el DNA que codifica un factor de creci m iento ha sido identificado y clonado, puede utilizarse para identificar y aislar a una familia entera de genes relacionados con él que codifican otros miembros de la misma familia de factores de crecim iento. Un ejemplo es la familia de fa c tores de crecimiento de fibroblastos (FGF, de Fibroblast Growth Factor) que in cluye al m enos siete miembros. Hoy en día, cuando se aísla un nuevo factor de crecim iento mediante un ensayo biológico, frecuentem ente se encuentra que es idéntico o está em parentado muy de cerca, a otro factor de crecim iento ya conocido. En los animales intactos la proliferación de la mayoría de las células depen de de una combinación específica de factores de crecimiento, más que de un solo factor. De este modo un número pequeño de factores de crecimiento pue den servir, en com binaciones diferentes, para regular selectivamente la prolife ración de cada una de las diferentes clases de células de un animal superior. Aunque algunos factores están presentes en la circulación, la mayoría de ellos se originan en células vecinas de la célula afectada y actúan de mediadores
958
Capítulo 17: El ciclo de división celular
m icrotúbulo
I___________I 1 |jm
Figura 17-35 Una plaqueta. Las plaquetas son células en miniatura, sin núcleo, que circulan por la sangre facilitando la coagulación sanguínea en los lugares dañados. También liberan varios factores que estimulan la curación de las heridas. La plaqueta del diagrama está abierta por la mitad para mostrar las vesículas secretoras que contiene; algunas de ellas contienen el factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF).
Tabla 17-2 Algunos factores de crecimiento proteicos y sus funciones
Factor
Miembros de la familia relacionados
Especificidad amplia o limitada Actividades representativas
Factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF) -tres subtipos factor de crecimiento de Factor de crecimiento transformación a (TGF- a); epidérmico (EGF) proteína Lin-3 (en C. elegans) factor de crecimiento semejante a la Factor de crecimiento insulina II (IGF-II); insulina semejante a la insulina I (IGF-I) activinas; proteínas morfogénicas Factor de crecimiento de transformación (3 de hueso (BMP); proteína decapentaplégica (en Drosophila)-, (TGF-[3) -múltiples proteína Vgl {en Xenopus) subtipos
Factor de crecimiento de los fibroblastos (FGF) -múltiples subtipos Interleuquina-2 (IL-2) Factor de crecimiento neuronal (NGF)
estimula la proliferación de células del tejido conjuntivo y de algunas células neurogliales
amplia
estimula la proliferación de muchos tipos celulares; actúa como señal inductora durante el desarrollo embrionario estimula la supervivencia celular; estimula el metabolismo celular; colabora con otros factores de crecimiento estimulando la proliferación celular potencia o inhibe la respuesta de la mayoría de las células a otros factores de crecimiento, dependiendo del tipo celular; regula la diferenciación de algunos tipos celulares; actúa como señal inductora durante el desarrollo embrionario estimula la proliferación de muchos tipos celulares; inhibe la diferenciación de varios tipos de células madre; actúa como señal inductora durante el desarrollo del embrión estimula la proliferación de los linfocitos T activados estimula la supervivencia y los procesos de prolongación de las ramificaciones nerviosas de algunas clases específicas de neuronas estimula la proliferación, la diferenciación y la supervivencia de precursores de los glóbulos rojos de la sangre estimula la proliferación y la supervivencia de varios tipos precursores celulares sanguíneos
amplia
amplia
amplia
limitada factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF); neurotrofina-3 (NT-3); neurotrofina-4 (NT-4)
Eritropoyetina
Interleuquina-3 (IL-3)
amplia
limitada
limitada
factores estimuladores de colonias hematopoyéticas (CSF) -múltiples tipos
limitada
locales. Además de los factores de crecimiento que estimulan la división celular, existen factores, como algunos miembros de la familia de factores de crecimiento de transformación beta (TGF-$) (de Transforming Growth Factors), que en algu nas células estimulan la proliferación celular y en otras la inhiben. La mayoría de factores de crecimiento efectúan muchas otras acciones además de la regulación del crecimiento y la división celular: pueden controlar la proliferación, la super vivencia, la migración o el funcionamiento de las células, dependiendo de las circunstancias. En la Tabla 17-2 aparece una muestra de los muchos factores de crecim ien to tratados en este libro.
El crecim iento celular y la división celular pueden ser regulados independientem ente31 Una función importante de los factores de crecimiento consiste en la regulación de la síntesis de proteínas y, por consiguiente, del ritmo al que las células crecen. La mayoría de los factores que estimulan la proliferación celular tam bién esti mulan su crecimiento, pero la correspondencia no es siempre exacta. Algunos factores harán crecer a células de una cierta clase pero no las llevarán más allá del punto de control G, de su ciclo, mientras que otros factores las llevarán más allá del punto de control G! pero no las harán crecer. Parece ser que en mam ífe ros no es tan estricta la regla que relaciona el tamaño de la célula con su divi sión, como lo es en las levaduras.
Controles de la división celular en los animales pluricelulares
959
Los factores de crecim iento que actúan independientemente sobre el creci miento y la proliferación celulares son importantes para el animal completo. Las diferentes células especializadas tienen proporciones entre citoplasma y DNA enorm em ente variadas, y algunas células en G0, como las neuronas, pueden ha cerse muy grandes si haberse dividido nunca (Figura 17-36). Variaciones de ta maño celular com o éstas se controlan en parte mediante mecanismos intracelulares que dependen del ciclo celular. Por ejemplo, el crecimiento de ciertos tipos de neuronas depende del factor de crecimiento neuronal (NGF, de Nerve Growth Factor) secretado por el conjunto de células que están en contacto con la neuro na: cuanto mayor sea la cantidad de NGF a la que la neurona tiene acceso, m a yor será su tamaño.
Las células pueden retrasar su división entrando en un estado especializado de no-crecim iento32 Si privamos de suero a las células que están proliferando en un cultivo, deten drán su crecimiento pero continuarán progresando en el ciclo celular hasta que hayan alcanzado la fase Gr Al llegar a esta parte del ciclo, se detienen en un esta do de no-crecim iento, especializado -e l estado de reposo G 0 (“G cero”) al que nos habíamos referido anteriormente. El estado G0es diferente a todos los demás estados de la proliferación que la célula experimenta a lo largo del ciclo. La velo cidad de síntesis de proteínas, por ejemplo, se reduce drásticamente, a menudo hasta el 20% del valor que presentan células que están proliferando. Así pues, la ausencia de factores de crecimiento apropiados lleva a las células a una especie de sueño del ciclo celular, en el cual el sistema de control del ciclo celular es in capaz de progresar más allá del punto de control Gj. Si privamos a una célula de sus nutrientes, com o los aminoácidos, tam bién se detendrá su crecimiento y se bloqueará el paso más allá del punto de control Gp pero desde el punto de vista de la célula esta desnutrición es una experiencia muy diferente a la de no recibir las señales de avanzar por el ciclo de los factores de crecimiento. De hecho está en discusión si en ambas situaciones está implicado el mismo mecanismo de control y resulta dudoso el estrecho parecido entre el tipo de parada de las célu las de mamífero y el punto de control Inicio de las levaduras (por lo cual se han utilizado diferentes nombres, com o “punto de restricción” y “punto de com pro m iso”, para referirse al punto de control Gj de las células mamífero). En los teji dos, los nutrientes son abundantes pero los factores de crecimiento son escasos; por lo tanto se cree que los factores de crecimiento ejercen un control crítico. La capacidad de entrar en G0 es lo que determina las enormes diferencias en la duración del ciclo celular en los diferentes tipos celulares de los organismos pluricelulares. Por ejemplo, en el cuerpo humano algunas células como las neu ronas y las fibras musculares esqueléticas no se dividen en absoluto; otras, como las células del hígado, generalmente se dividen una vez cada uno o dos años; mientras que algunas células epiteliales del intestino se dividen más de dos ve ces al día, renovando continuam ente su tejido de revestimiento (Figura 17-37). La mayoría de las células de los vertebrados se sitúan entre estos extremos: pue den dividirse si surge la necesidad pero lo hacen con poca frecuencia. El ritmo al que se divide la célula varía según las circunstancias externas y según las carac terísticas internas de cada tipo celular particular. Un daño importante en el hí gado hace que las células supervivientes proliferen hasta que se subsane el daño, con una duración de ciclo celular no superior a un día o dos; las células vecinas a una herida estimulan su división para reparar la lesión. Casi todas las variaciones de la velocidad de proliferaciones del cuerpo adulto se producen en el intérvalo de tiempo que las células pasan en reposo en tre la mitosis y el punto de control G,, de forma que las células de división lenta se hallan estacionadas en el estado G0 durante semanas o incluso años. Por el contrario, norm alm ente el tiempo que tarda una célula en progresar desde el co mienzo de la fase S a través de la mitosis es breve (de 12 a 24 horas en los m am í feros) y notoriam ente constante, sin tener en cuenta el intérvalo de tiempo que
960
Capítulo 17 : El ciclo de división celular
neurona
linfocito Figura 17-36 Comparación entre el tamaño de un linfocito y el de una neurona de mamífero (extraída de la retina). Ambas células contienen la misma cantidad de DNA. Una neurona se hace progresivamente más grande durante su desarrollo, mientras permanece en estado G0. Durante este período la proporción entre la cantidad de citoplasma y de DNA aumenta enormemente (por un factor mayor a IO5para algunas neuronas). (Neurona de B.B. Boycott en Essays on thè nervous system [R. Bellairs y E.G. Gray, eds.]. Oxford, U.K.: Clarendon Press, 1974.)
m igración de las células epiteliales desde su nacim iento en el fondo de la cripta hasta su desprendim iento en lo alto de la vellosidad (duración del tránsito: de 3 a 5 días)
LUMEN DEL INTESTINO vellosidad (sin división celular) sección transversal de la vellosidad
células epiteliales cripta tejido conjuntivo laxo
sección transversal de la cripta
células diferenciadas que no se dividen dirección del m ovim iento celular
células de división rápida (duración del ciclo = 11 horas)
células madre de división lenta (duración del ciclo > 24 horas) células diferenciadas que no se dividen
Figura 17-37 División y migración celular en el epitelio de revestimiento del intestino delgado de un ratón. Toda la actividad de división celular se concentra en la parte inferior de los pliegues epiteliales de forma tubular, conocida como cripta. La generación de células nuevas se desplazan hacia arriba formando el epitelio que cubre las vellosidades, donde trabajan en la digestión y absorción de los alimentos desde el lumen intestinal. La mayoría de las células epiteliales tienen una vida muy corta desprendiéndose de la punta de la vellosidad cinco días después de su ascensión desde la cripta. Sin embargo, un anillo de aproximadamente 20 células “inmortales” de división lenta (en rojo) continúa anclado cerca de la base de cada cripta. Cada una de estas células madre se dividirá formando dos células hijas. Por término medio, una célula hija permanece en dicho lugar como una célula madre indiferenciada mientras que la otra acostumbra a migrar hacia arriba diferenciándose y formando parte de la vellosidad epitelial. (Adaptado de C.S. Potten, R. Schofield y L.G. Lajtha, Biochim. Biophys. Acta 560:281-299,1979.)
transcurre entre una división y la siguiente. Ahora debemos centrarnos en la prueba experimental que identificó el punto de control G! como un punto espe cífico del ciclo así como considerar lo que significa la entrada en G0 en términos moleculares.
La ausencia de suero evita el paso por el punto de control G^ 2-33 Las células en cultivo pueden ser observadas al microscopio por cinematografía a intervalos de tiempo. De esta forma resulta fácil determinar el tiempo que cada célula necesita entre una división y la siguiente. Si se ha filmado al menos todo un ciclo celular del cultivo antes de aplicar un tratamiento experimental, tam bién es posible establecer el tiempo transcurrido desde la última mitosis de cada célula en el momento del tratamiento. Así pues se pueden estudiar los efectos de diferentes manipulaciones con condicionantes externos sobre diferentes esta dios del ciclo de división. Estos estudios se han realizado principalmente con fi broblastos. Con un experimento sencillo de este tipo fue suficiente para demos trar que la privación de suero (y por lo tanto de factores de crecimiento) durante al menos 1 hora tiene unas consecuencias dramáticas para las células. Todas las células a las que se les retiró el suero antes de transcurridas 3,5 horas después de haber pasado la mitosis, necesitan 8 horas extra para alcanzar la mitosis después de que se les añada suero nuevamente al medio. Por el contrario, las células de más de 3,5 horas no mostraron ningún retraso y continuaron con el ciclo normal (Figura 17-38). Este comportamiento sitúa el punto de control Gj unas 3,5 horas después de la mitosis, en el caso de la línea celular escogida. Más allá de este punto, las células entran de forma irrevocable en la replicación de su DNA y completan el ciclo de división normal, pero las células que se hallan entre la m i tosis y el punto de control se detienen en el punto de control si echan en falta los factores de crecimiento adecuados. El retraso extra que transcurre antes de que estas células efectúen la mitosis después de que se les haya suministrado suero
Controles de la división celular en los animales pluricelulares
961
Figura 17-38 Efecto de una breve deprivación de suero en varios momentos del ciclo celular. Si deprivamos de suero los fibroblastos durante 1 hora mientras se encuentran en el intervalo comprendido entre la mitosis y el punto de control G, (barra amarilla) dichas células se retrasan cerca de 8 horas en su trayecto hacia la mitosis siguiente; las células que sufren una deprivación similar después del punto de control G, (barra verde oscuro) no sufren tal retraso (aunque se puedan retrasar en el ciclo siguiente).
células susceptibles de retraso 25
20 E 15
nuevamente sugiere que una privación de 1 hora de suero entre las 0 y las 3,5 horas las coloca en un estado alterado -G 0- del que necesitan 8 horas para salir. El efecto de la deprivación de suero es deprimir la síntesis de proteína y el crecim iento celular y se puede simular mediante pequeñas dosis de inhibidores de la síntesis de proteína, tales como la cicloheximida. Los experimentos utili zando tanto la deprivación de suero como la cicloheximida han demostrado que deprimiendo brevemente la síntesis de proteína al final de G2 tam bién se puede inducir la entrada en G0, pero en este caso las células primero pasan por la mitosis y luego se detienen en G0 cuando alcanzan el punto de control Gj. Por otra parte, las células a las que se depriva brevemente de suero durante la fase S o al comienzo de G2 prosiguen a través del punto de control G! con poco o ningún retraso, probablemente porque ya están a más de 8 horas del punto de control. Por lo tanto, los m ecanism os que responden tan dramáticamente a una breve deprivación de suero deben de tener las siguientes propiedades: es imprescindi ble haber pasado el punto de control G, pero sin haber entrado en la mitosis, y aunque se pueden inhibir rápidamente, se necesitan del orden de 8 horas para regenerarse tras la nueva adición de factores de crecimiento o desinhibición de la síntesis de proteínas.
El sistem a de control del ciclo celular puede desensamblarse rápidamente pero sólo puede ensam blarse de nuevo lentam ente34 ¿Qué relación tienen estos fenóm enos con el comportamiento del sistema de control del ciclo celular? Una interpretación simple sería que cuando se retira el suero algunos com ponentes moleculares del sistema de control del ciclo celular desaparecen rápidamente -e n una hora- pero necesitan un período mucho más largo -8 h oras- para reaparecer cuando se restaura el suero. La desaparición y reaparición pueden ocurrir en cualquier momento del ciclo de división, pero únicamente es en el punto de control Gj donde se necesita dicho componente molecular. Una especulación obvia es que el com ponente crítico sea la propia proteína Cdk y que las células de mamífero necesiten esta proteína para superar el punto de control Gv al igual que las células de levadura necesitan la proteína Cdc2 para superar el Inicio. De hecho, si comparamos las células quiescentes G0 con célu las efectuando el ciclo de división, encontram os que las células en G0tienen can tidades muy bajas tanto de proteína Cdk (o al menos de una o más clases distin tas de proteína Cdk) y de todas las ciclinas G,, aunque la presencia de proteínas Cdk y de alguna de las ciclinas Gj (ciclinas C y D) tiene un nivel prácticamente constante a lo largo durante todas las fases del ciclo. Por lo tanto, las células G0 no solamente detienen su control del ciclo celular, sinó que lo desmantelan. Cuando se suministra suero a las células en G0, se produce un retraso de va rias horas hasta que las concentraciones de Cdk y ciclinas Gj alcanzan de nuevo los niveles normales del ciclo; este retraso se corresponde con el que experimen tan las células antes de reincorporarse al ciclo. Si la privación de suero detiene la proliferación celular desensamblando rápidamente el sistema de control del ciclo más que deteniéndolo, no es sorprendente que cuando el entorno sea favorable de nuevo, las células necesiten un cierto tiempo para reensamblar lentamente el sistema de control antes de reincorporarse y continuar el ciclo de nuevo.
962
Capítulo 17 : El ciclo de división celular
punto de control Gi
0
Gì
5 10 punto del ciclo en el que se depriva brevem ente a la célula de suero
M
Ya hemos visto cómo responde el sistema de control del ciclo celular a los factores de crecimiento; a continuación estudiaremos cómo los factores de crecimiento y otras influencias ajustan el comportamiento de proliferación de las células en los tejidos, de forma que se mantenga la forma y la función del cuerpo.
Las células vecinas com piten por los factores de crecim iento35 La proliferación de células en el cuerpo tiene que estar regulada de forma que se mantenga el número de células y su organización espacial. Esta regulación de pende de interacciones de unas células con otras y con la matriz extracelular. Consideremos por ejemplo una lámina epitelial de un mamífero adulto. A medi da que las células van muriendo tienen que producirse células nuevas para ocu par su lugar. La proliferación celular tiene que estar controlada de forma precisa para equilibrar la pérdida de células, de forma que el epitelio ni crezca ni decrez ca. Las nuevas células han de encajar perfectamente en la estructura, de forma que no se desorganice la arquitectura del epitelio. De hecho, en la mayoría de los epitelios sólo se dividen las células que continúan en contacto con la lámina basal subyacente. Las células situadas sobre la lámina basal son sensibles al me nos a dos tipos de señales que rigen su disposición a dividirse: un tipo de señal es la que transporta información referente a la densidad de población local de la célula, y el otro tipo de señal es el que refleja las adhesiones a otras células y a la lámina basal. Ambos tipos de control se pueden comprobar y analizar en las condiciones simplificadas de un cultivo celular, aunque la mayoría de los estu dios se han efectuado con fibroblastos y no está claro cómo se relacionan estos descubrimientos con conjuntos de células organizadas como las epiteliales o las de un órgano tridimensional. Si colocam os células disociadas sobre una placa en presencia de suero, se adherirán a la superficie, se extenderán, y se dividirán hasta que se forme un m onocapa confluente en la cual cada célula se adherirá a la placa y contactará con las células vecinas a todo su alrededor. En este punto las células normales, a diferencia de las células cancerosas (“transformadas”), dejan de dividirse -u n fe nóm eno conocido como inhibición de la división celular dependiente de la den sidad. Si una monocapa de este tipo se “rasga” con una aguja de forma que se genera una franja libre de células sobre la placa, las células de los bordes ocupa rán el espacio vacío y se dividirán (Figura 17-39). Este fenómeno se describió inicialm ente en términos de “inhibición por contacto” de la división celular, pero probablem ente es engañoso que el único responsable del fenómeno sea la interacción célula-célula. La densidad de la población celular a la que se detiene la proliferación celular en la monocapa confluente se increm enta al aumentar la concentración de los factores de crecimiento en el medio. Al hacer circular un flujo de medio fresco sobre la capa confluente de fibroblastos se reduce la limi tación de la difusión para el aporte de factores de crecimiento, e induce a las cé lulas que están en contacto directamente con el flujo del medio a dividirse en unas densidades a las que habitualmente estarían inhibidas (Figura 17-40). Así pues la inhibición de la proliferación celular dependiente de la densidad parece
capa confluente de células en la que falta hilera de células que se han elim inado rascando con una aguja
las células de los márgenes se extienden y se aplanan, aum entando la velocidad de síntesis de proteínas
Controles de la división celular en los animales pluricelulares
Figura 17-39 Regulación de la división celular de una monocapa celular rasgada. Habitualmente, las células situadas en la superficie de una placa de cultivo proliferan hasta que se tocan unas con otras, formando una monocapa confluente. El diagrama muestra lo que ocurre si se rasga la monocapa eliminando una hilera de células. Las células que quedan en los márgenes de la zona vacía de la “herida” se aplanan y empiezan a crecer y a dividirse, hasta que la “herida” esta “curada”. Cuando la monocapa vuelve a ser confluente, la proliferación celular cesa casi completamente.
capa confluente de células reconstruida mediante división celular
963
monocapa confluente: las células no proliferan más
m edio nuevo aplicado a través de las células
reflejar, al menos en parte, la capacidad de una célula para reducir localmente la concentración de factores de crecim iento en el medio, privando así a las células vecinas de ellos. Cálculos basados en las concentraciones conocidas de factores de creci miento en el suero y la velocidad a la que las células eliminan los factores del medio de cultivo apoyan esta hipótesis. Por ejemplo, el PDGF normalmente se halla en el medio a un concentración de 10 “10 M (aproximadamente una m olé cula por cada esfera de 3 pm de diámetro de medio). Un fibroblasto tiene cerca de 105 receptores de PDGF, cada uno con una afinidad muy alta por el factor de crecim iento. Por lo tanto cada célula tiene receptores suficientes para unir todas las moléculas de PDGF que se hallan en una esfera de diámetro -150 pm. Así pues es obvio que las células vecinas compiten por cantidades diminutas de fac tores de crecim iento. Este tipo de com petencia podría ser tan importante para las células de los tejidos como para las células en cultivo, impidiendo que proliferen más allá de una cierta densidad de población, la cual esta determinada por la cantidad de factor de crecim iento asequible.
Las células anim ales norm ales en cultivo necesitan anclarse para superar el Inicio36 La com petencia por los factores de crecim iento no es el único factor que altera el ritmo de la división celular en un cultivo de células. La forma de una célula mientras ésta se extiende y se arrastra sobre el substrato para ocupar el espacio vacío tam bién afecta notablem ente su capacidad para dividirse. Cuando se cultivan fibroblastos normales o células epiteliales en suspensión, sin contacto alguno con superficies sólidas, casi nunca se dividen -u n fenómeno conocido como dependencia de anclaje de la división celular. La relación entre la propagación de las células y su proliferación se puede demostrar cultivando célu las en substratos de grosores variables o permitiendo que las células se establez can en una superficie no pegajosa donde se han puesto previamente pequeños parches pegajosos sobre los que se puede adherir una sola célula pero sin que pueda extenderse mas allá del parche. La frecuencia con la que la célula se divi de aumenta ^ medida que la célula se extiende. Quizás ocurre que las células más extendidas al tener una superficie mayor, pueden capturar más moléculas de factores de crecim iento y conseguir cantidades de nutrientes mayores. Sin embargo, algunas líneas celulares de fibroblastos son prácticamente incapaces de proliferar en suspensión pero se dividen rápidamente si consiguen un punto de anclaje en alguna superficie formando un contacto focal. Ello ocurre incluso si el lugar de adhesión es un parche pequeño en el cual la célula no dispone de espacio suficiente para extenderse (Figura 17-41). Los contactos focales son lu gares de anclaje para los filamentos de actina intracelulares y para las moléculas de la matriz extracelular; éstas y otras observaciones nos indican insistentem en te que el control de la división celular está de alguna forma acoplado con la or ganización del citoesqueleto o depende de señales intracelulares generadas en los lugares de adhesión, o de ambas cosas (Figura 17-42). De hecho, en algunos tipos celulares algunas moléculas de la matriz extracelular específicas, tales
964
Capítulo 17 : El ciclo de división celular
el flujo de m edio estim ula la proliferación celular
Figura 17-40 Consecuencias de la presencia de un medio nuevo sobre la monocapa confluente celular. Las células de una monocapa confluente no se dividen (se indican en gris). Las células (en verde) vuelven a dividirse si se las expone directamente a un medio fresco. Aparentemente, la monocapa confluente ha dejado de dividirse porque en el medio cercano a las células ha disminuido la concentración de factores de crecimiento, por los cuales compiten las células.
suspendida en agar
tB>
colocada sobre un parche adhesivo pequeño
extendida sobre un parche adhesivo grande
50
como la laminina o la fibronectina, pueden actuar como factores de crecim ien to. Las células basales de la epidermis de la piel proporcionan un ejemplo que se trata en el Capítulo 22. Como para otros controles de la proliferación celular, el control del anclaje actúa en el punto de control las células necesitan el anclaje para superar este punto pero no para completar el resto del ciclo. De hecho, mientras progresan por la fase M normalmente aflojan sus uniones y se redondean. Este ciclo de unión y posterior desunió probablemente permite a las células reorganizar sus contactos con otras células y con la matriz extracelular, así como acomodar las células hijas producidas por la división celular y después unirlas fuertemente al tejido antes que se les permita iniciar el próximo ciclo de división. Aunque el m ecanismo de dependencia del anclaje es poco conocido y algu nos de los detalles del fenómeno que acabamos de describir pueden ser peculia ridades de los fibroblastos en cultivo, es bastante probable que las señales intracelulares generadas en los sitios de adhesión jueguen un papel importante en el sistema de control del ciclo celular en muchas clases diferentes de células.
Controles de la división celular en los animales pluricelulares
Figura 17-41 La división celular depende de la form a de la célula y de su anclaje. En el experimento que se muestra aquí, las células se mantienen en suspensión o se permite que se fijen sobre parches de un material adherente (paladio) o sobre un substrato no adherente; el diámetro del parche, que es variable, determina el área sobre la que se puede extender la célula y la probabilidad de que se divida. Al medio de cultivo se le añade timidina-3H y se realiza una autorradiografía para descubrir el porcentaje de células que han entrado en fase S. (A) Las células de la línea celular 3T3 raramente se dividen cuando se mantienen, redondeadas, en suspensión, pero la adherencia a un parche, aunque sea tan pequeño que no permita que la célula se extienda, las capacita para que se dividan más frecuentemente. (B, C) Electronmicrografías de barrido que muestran una célula extendida sobre un parche grande comparado con una célula colocada sobre un parche pequeño. (Micrografías de C. O’Neill, P. Jordán y G. Ireland, C ell 44:489-496, 1986. © Cell Press.)
Figura 17-42 Contactos focales como lugares de emisión de señales intracelulares. Esta micrografía fluorescente muestra un fibroblasto en cultivo sobre un substrato recubierto con fibronectina, molécula de la matriz extracelular. Los filamentos de actina se han marcado de manera que emiten fluorescencia verde, mientras que las proteínas que contienen fosfotirosina se han marcado con un anticuerpo que emite fluorescencia roja. Donde los dos colores se superponen, el color resultante es amarillo. Los filamentos de actina terminan en los contactos focales, en los que la célula se adhiere al substrato. Las proteínas que contienen fosfotirosina también se concentran en estos lugares. Se cree que esto refleja la actuación de un mecanismo de señales intracelulares de tirosina quinasa activado mediante las proteínas transmembrana integrinas que se unen a la fibronectina extracelular y (indirectamente) a los filamentos de actina intracelulares (véase pág. 1071). Se cree que las señales generadas en estos lugares de adhesión facilitan la regulación de la proliferación celular, tanto en fibroblastos como en células epiteliales. (Cortesía de Keith Burridge.)
9 65
Estudios en células cancerosas revelan la existencia de genes implicados en el control de la proliferación celular37 ¿De qué forma las diferentes influencias externas que hemos examinado afectan el interior de la célula regulando la proliferación celular? Concretamente, ¿cómo influye la adhesión de un factor de crecimiento a los receptores de la superficie celular en el funcionamiento del sistema de control del ciclo celular? Mucho de lo que sabemos sobre este aspecto proviene del estudio de células cancerosas, en las cuales el control de la proliferación celular se ha roto. Estas células son mutantes, y debido a que proliferan excesivamente y producen tumores, atraen nuestra atención sobre sus genes mutantes. Como discutimos en el Capítulo 24, el análisis de las alteraciones genéticas en células cancerosas ha revelado un gran número de genes que codifican proteí nas implicadas en el control de la proliferación celular. Dichos genes se podrían clasificar inadecuadamente como genes de proliferación y genes de antiprolifera ción. El producto de los primeros facilita el increm ento del crecimiento celular y el ensam blaje de la maquinaria de control del ciclo celular y conduce a la cé lula más allá del punto de control el producto de los segundos facilita la apli cación de frenos que detendrán todo el sistema de control celular y provocarán su desm antelam iento. Si una m utación en un gen de proliferación causa la sobreexpresión o la hiperactividad de su producto, tendremos como resultado una proliferación celular excesiva característica del cáncer. En estos casos se clasifica el gen m utante com o un oncogén (es decir un gen que provoca cáncer) y el gen de proliferación normal se denominará proto-oncogén. Inversamente, una célula puede verse liberada de las restricciones normales de una prolifera ción normal y ser capaz de dividirse como una célula cancerosa si un gen de an tiproliferación sufre una m utación que lo inactiva. Por ello, a menudo los genes de antiproliferación de las células normales se denominan genes supresores de tum ores. En una célula diploide normal, para que se provoque la pérdida del control de crecim iento (es decir que el fenotipo mutante sea recesivo) tienen que desaparecer o inactivarse las dos copias de un gen supresor de tumores, m ientras que la activación de una sola copia de proto-oncogén es suficiente para provocar un efecto similar (es decir que el fenotipo mutante sea dom inan te) (Figura 17-43). Debido a que han sido más fáciles de aislar, se conocen más genes de proli feración que genes de antiproliferación y probablemente entre los primeros se incluyen genes que codifican proteínas representativas de todas las clases im portantes de proteínas implicadas en la transmisión de las señales estimulado ras desde los receptores de factores de crecim iento hacia el interior de la célula.
dos copias de gen supresor de tum ores
ambos genes supresores de tum ores inactivados
í> t dos copias de proto-oncogén
t
la m utación provoca la sobreactivación de un solo proto-oncogén (oncogénico)
RESULTADO PROLIFERACIÓN CELULAR NORMAL
966
PROLIFERACIÓN CELULAR EXCESIVA
Capítulo 17 : El ciclo de división celular
PROLIFERACIÓN CELULAR EXCESIVA
Figura 17-43 Genes supresores de tumores respecto a proto-oncogenes. El producto de un gen supresor de tumores inhibe el ensamblaje y la activación del sistema de control del ciclo celular; el producto de un protooncogén hace todo lo contrario. La proliferación incontrolada puede resultar de mutaciones que inactiven ambas copias del gen supresor de tumores o que provoquen una fuerte sobreactivación de una copia del proto-oncogén.
factor de crecim iento
Los factores de crecim iento desencadenan cascadas de señales intracelulares30 38 El primer paso en la acción de un factor de crecimiento proteico es su unión a un receptor transmembrana de la superficie de la célula diana. Entonces la por ción intracelular del receptor cataliza la producción de moléculas que actúan como señales intracelulares, transmitiendo el estímulo a otras moléculas. Los detalles de los pasos iniciales de varias de estas cascadas de señalización han sido estudiados a fondo para el caso de diferentes tipos de receptores (se descri ben en el Capítulo 15). La complejidad del sistema aparece porque generalmen te las cascadas no son simples cadenas lineales de transmisión sino que se ram i fican activando muchos componentes interactivos que actúan en paralelo, formando una red de señales altamente interconectada. Vimos en el Capítulo 15 que los receptores de los factores de crecimiento ac tivan cascadas de fosforilación intracelular que provocan cambios en la expre sión de los genes. Los genes inducidos por los factores de crecimiento son de dos clases: los genes de respuesta rápida inducidos dentro de los 15 minutos si guientes a la actuación del factor de crecimiento y sin que se necesaria la síntesis de proteínas, y los genes de respuesta retardada, que no se inducen hasta al menos una hora después de la actuación del factor de crecimiento y de forma dependiente de la síntesis de proteínas. Parece que los genes de respuesta retar dada se inducen a causa de los productos de los genes de respuesta rápida, va rios de los cuales se sabe que son proteínas reguladoras de genes (Figura 17-44). Ambas clases de genes son silenciosos y no se transcriben en las células en G0 pero se inducen a elevados niveles cuando se añaden factores de crecimiento al medio. Si entonces se mantiene la exposición a los factores de crecimiento, el nivel de expresión de los genes cae gradualmente -para algunos genes aparente mente hasta cero y para otros hasta un nuevo valor estable diferente de cero. Por lo tanto el producto de la segunda clase de estos genes se halla presente a unos niveles bajos pero constantes en las células de ciclo normal (Figura 17-45). Así pues la transcripción de estos genes indica la presencia de factores de creci miento en el medio, y un elevado nivel de expresión indica una subida repentina de la concentración de factores de crecimiento. Las señales que recibimos por nuestros sentidos (el olfato, por ejemplo) se comportan de una forma parecida. Los genes de respuesta rápida m ejor estudiados son los proto-oncogenes myc, fos y jun. Los tres genes codifican proteínas reguladoras de genes que ac túan como homo- o heterodímeros (se discuten en el Capítulo 9). Si en ciertos tipos celulares estos genes se sobreexpresan o hiperactivan por efecto de m uta ciones, todos ellos pueden provocar una proliferación incontrolada. Existen evidencias que sugieren que particularmente myc podría tener un papel crítico en el control normal de la proliferación celular. Las células en las que se impide específicam ente la expresión de myc no se dividen incluso en presencia de fac tores de crecim iento. En cambio, las células en las que se activa especialmente
t [Myc]
Controles de la división celular en los animales pluricelulares
prim era quinasa activada segunda quinasa activada 15 min
NÚCLEO
gen regulador de proteínas activado genes de respuesta rápida
genes de respuesta retardada >1 h sistema de control del ciclo celular activado Figura 17-44 Ruta normal que siguen las señales estimuladoras de la proliferación celular provocadas por un factor de crecimiento. Este diagrama muestra algunas de las etapas principales. Omite las etapas intermedias del sistema de liberación. Las rutas de las señales intracelulares se tratan en el Capítulo 15.
Figura 17-45 La respuesta de Myc a un factor de crecimiento. Myc es el producto de un gen myc de respuesta rápida El gráfico muestra los cambios de concentración de la proteína Myc tras un incremento repentino de la concentración de factor de crecimiento hacia un nuevo estado estacionario, lo que provocará la salida de la célula de G0y su proliferación. Los cambios en la concentración de Myc reflejan cambios en la transcripción del gen myc, estimulados mediante la exposición de la célula al factor de crecimiento. La propia proteína Myc inhibe la transcripción de myc, y se cree que su retroalimentación negativa explica por qué el nivel de Myc disminuye desde su valor máximo inicial hasta un valor más bajo pero estable.
967
la expresión de myc independientemente de factores de crecimiento, no pueden entrar en G0, y si están en G0 cuando se les proporciona la proteína Myc, aban donarán G0 y empezarán a dividirse incluso en ausencia de factores de creci miento -u n com portam iento que finalmente las llevará a la muerte celular pro gramada.
Las ciclinas y la Cdk son inducidas por factores de crecimiento tras un largo retraso34 Los genes de respuesta retardada no empiezan a transcribirse hasta bastante después de la adición de un factor de crecimiento, y su transcripción requiere la presencia de productos de genes de respuesta rápida como myc. Entre los pro ductos de los genes de respuesta retardada se cuentan algunos de los com po nentes básicos del propio sistema de control del ciclo celular, incluyendo las proteínas Cdk y varias ciclinas, de las cuales se sospecha que desde el momento de su expresión están implicadas junto con las proteínas Cdk en la conducción de las células más allá del punto de control G,, en la iniciación de la fase S, o en ambos procesos. Así pues podemos trazar de forma tentativa una cadena de efectos estimula dores que nos conducirán desde la unión de un factor de crecimiento hasta el inicio de la replicación del DNA. Se cree que estas señales estimuladoras actúan superando dispositivos inhibidores específicos que reprimen la proliferación en ausencia de señales positivas. Los mecanismos inhibidores son proteínas codifi cadas por los genes de antiproliferación de los que hemos tratado, y que se des cubrieron como genes supresores de tumores en cánceres humanos. El gen de antiproliferación m ejor conocido es el gen retinoblastoma.
La proteína retinoblastom a actúa m anteniendo la proliferación bajo control39 El gen retinoblastom a (Rb) fue inicialmente identificado a través de estudios sobre una predisposición hereditaria para un cáncer poco conocido, que se pro duce en los ojos de algunos niños (se discute en el Capítulo 24). La pérdida de las dos copias de este gen conduce a una proliferación celular excesiva en la retina inmadura, lo cual sugiere que normalmente el producto del gen ayuda a m ante ner controlada la proliferación celular. La clonación del gen retinoblastoma po sibilita explorar cómo ejerce este efecto el producto de gen. La proteína Rb en una molécula abundantes en el núcleo de células de m a mífero. Se une a muchas otras proteínas, incluyendo algunas importantes proteí nas reguladoras de genes, pero su capacidad de unión depende de su estado de fosforilación. Cuando Rb se desfosforila, se une a un conjunto de proteínas regu ladoras que favorecen la proliferación celular, manteniéndolas secuestradas y fuera de acción; la fosforilación de Rb facilita la liberación de estas proteínas, permitiendo que actúen (Figura 17-46). En células normales Rb está siempre presente, independientemente de si las células están en G0 o progresando en el
CÉLULA EN Go proteína Rb activa
proteína reguladora de genes inactiva gen diana
968
Capítulo 17 : El ciclo de división celular
CÉLULA PROLIFERANTE proteína Rb P) fosforilada inactiva proteína reguladora de genes activa transcripción genética gen diana
Figura 17-46 Actuación de la proteína retinoblastoma (Rb). La proteína Rb desfosforilada se une a proteínas reguladoras de genes que estimulan la transcripción de determinados genes (tales como myc) necesarios para la proliferación celular, y los mantiene inactivos. Cuando está fosforilada, Rb se separa de dichas proteínas estimuladoras, permitiendo que activen la proliferación.
Figura 17-47 Cambios en la fosforilación de Rb en una célula que progresa a través del ciclo. Rb se
Rb inactiva
Rb activa
desfosforila cuando la célula sale de la mitosis y se refosforila al final de Gp cuando la célula se prepara para superar el Inicio.
ciclo, aunque su estado de fosforilación es variable. La célula en G0 contiene poco fosfato y parece impedir la transcripción de genes como fos y myc, que son necesarios para la proliferación. Estos genes se transcriben a un ritmo elevado en células mutantes que no tienen una copia funcional del gen Rb y a un ritmo mucho más bajo cuando a estas mismas células se les añade, mediante transfección, una copia funcional del gen Rb. Los factores de crecimiento anulan la inhibición ejercida por Rb haciendo que la proteína se fosforile en múltiples serinas y treoninas. Ahora las células empezarán a expresar la proteína Cdk, superarán el punto de control G,, y co menzarán a sintetizar DNA. En las células proliferantes el grado de fosforilación de la proteína Rb aumenta y disminuye en cada ciclo: aumenta al final de G,, continúa alto en S y G2 y disminuye hasta un estado de desfosforilación cuando la célula está en mitosis (Figura 17-47). In vitro la proteína Rb es un buen subs trato para la fosforilación mediante proteína quinasas de la familia Cdk, lo cual sugiere un posible camino en el cual el estado de fosforilación de Rb podría rela cionarse estrecham ente con el estado del sistema de control del ciclo celular. Se cree que la proteína Rb desfosforilada (activa) actúa en Gx como parte del mecanismo de freno que inhibe el paso más allá del Inicio; también podría per mitir a la célula la entrada en G0 mediante la interrupción de la producción de com ponentes fundamentales del sistema de control del ciclo celular -com o ha cen otras proteínas- cuando el ambiente se vuelve hostil para la proliferación. Pero en la mayoría de las células la situación se complica por la presencia de más de una proteína similar a Rb, y parece que mucho tipos celulares tienen un comportamiento normal incluso en ausencia de la propia proteína Rb. (El ratón transgénico al que le falta el gen Rb progresa de forma casi normal a través de la primera mitad de su desarrollo embrionario, pero entonces muere, mostrando defectos solamente en algunos tejidos determinados.) Mejorar nuestro conoci miento sobre los genes de antiproliferación tales como Rb es una tarea impor tante, ya que deficiencias en estos genes juegan un papel crucial en una gran cantidad de cánceres humanos.
La probabilidad de entrar en G0 aumenta con el número de divisiones celulares: la senescencia celular40 La proliferación celular de un animal superior no se regula sencillamente m e diante el entorno de la célula sino que depende de la historia de la célula a largo plazo de una manera compleja: cada tipo celular diferenciado, en cada estadio de desarrollo animal obedece a unas leyes ligeramente distintas, lo cual refleja diferencias en su maquinaria de control interno. Quizá el ejemplo más simple pero también el más misterioso de los efectos a largo plazo sobre la división ce lular es el fenómeno de la senescencia celular. La mayoría de las células del cuerpo de un mamífero o de un pájaro mues tran una gran reticencia a continuar proliferando indefinidamente, incluso aun que se las alimente cuidadosamente in vitro. Esto las distingue de las células de la línea germinal y de líneas celulares establecidas en cultivo, las cuales se cree que han sufrido un cambio genético que las hace “inmortales”. Por ejemplo, los fibroblastos extraídos de un feto humano normal únicamente duplicarán su poControles de la división celular en los animales pluricelulares
96 9
progenitor del clon (
no se duplican
Figura 17-48 Evidencia de la variación celular respecto a la herencia de la capacidad de división.
W
-cu 40
L li
aj 40 ocho duplicaciones o más . 22, 2 0
! .11
0 1 2 3 4 5 6 7 >8 núm ero de duplicaciones de células hermanas
0 1 2 3 4 5 6 7 >8 núm ero de duplicaciones de células hermanas
blación unas cincuenta veces si las cultivamos en un medio estándar de creci miento. Hacia el final de este período, la proliferación se ralentiza y finalmente se detiene, y las células entran en un estado G0 del que nunca se recuperarán. Células similares extraídas de un adulto de cuarenta años dejan de dividirse tras aproximadamente cuarenta duplicaciones, mientras que las células de un adulto de ochenta años se detienen tras treinta duplicaciones. Los fibroblastos de ani males con una esperanza de vida más corta dejan de dividirse en cultivo tras un número más reducido de ciclos de división. Este fenómeno se ha denominado senescencia celular debido a la correspondencia con el envejecimiento del cuer po. Su relación con la edad del organismo, sin embargo, no está clara. La senescencia celular sorprende por varias razones y ni su función, si es que tiene alguna, ni su mecanismo, están claros. Se han propuesto muchas teo rías para explicar este fenómeno. Algunas sugieren, por ejemplo, que es el resul tado de una acumulación de mutaciones aleatorias nocivas que reflejan simple mente la imprecisión del m ecanismo de reproducción celular; otras sugieren que es el resultado de un mecanismo que se ha desarrollado para protegernos del cáncer mediante la limitación del crecimiento de tumores. Sin embargo se sabe que para algunas clases de células la velocidad de aparición de la senescen cia depende estrecham ente de la concentración de factores de crecimiento en el medio. Aparentemente el proceso refleja cambios del potencial de proliferación que pueden ser regulados por el entorno de la célula. Una característica habitual del desarrollo embrionario son las cortas secuen cias de divisiones celulares que terminan en diferenciación, pero es difícil de imaginar cómo una célula puede calcular a largo plazo de forma precisa el núme ro de sus ciclos de división y detenerse al acabar el ciclo número 50. De hecho, aunque la senescencia ocurre en un momento predecible para una población ce lular determinada, no está programada estrictamente a nivel de las células indivi duales. En un clon de fibroblastos normales aparentemente idénticos que se es tudie en condiciones de cultivo estándar, algunas células se dividen muchas veces y otras, en cambio, sólo unas cuantas. Parece que cada una de las células deja de dividirse como resultado de una transición aleatoria. Las probabilidades de que esta transición ocurra aumentan con cada generación celular sucesiva hasta que no quedan células proliferantes en la población (Figura 17-48). Una posible interpretación de este fenómeno radica en el comportamiento de los telómeros -la s secuencias de DNA repetitivo especiales necesarias en los extremos de los cromosomas. Como tratamos en el Capítulo 8, cuando una célu la se divide, estas secuencias no se replican de la misma forma que el resto del genoma sino que son sintetizadas mediante una enzima, la telomerasa, que ac túa con m enos precisión, creando una variación aleatoria en el número de repe ticiones de la secuencia telomérica del DNA. La senescencia celular está muy re lacionada con la reducción progresiva del número de estas repeticiones, lo cual
970
Capítulo 17: El ciclo de división celular
Las células de un clon varían en el número de divisiones celulares que experimenta cada una de ellas. Aquí, se han estudiado varios pares de células hermanas del mismo clon, y los histogramas muestran el número de células que se dividen un determinado número de veces. Si una célula hermana no se divide ni una sola vez, a la otra hermana le ocurre lo mismo o se divide muy pocas veces {a la izq u ierd a); y si una se duplica ocho veces o más la otra hace lo mismo (a la d erech a). Esto muestra que existen características hereditarias entre las células del mismo clon respecto al número de ciclos de división que son capaces de realizar. No obstante, los distintos estados hereditarios no son perfectamente estables; así pues algunas veces células hermanas se comportan de manera distinta. Estudios posteriores muestran que a medida que la población celular envejece, las células sufren transiciones casuales hacia estadios en los que la capacidad de división es más reducida. (Datos de J.R. Smith y R.G. Whitney, Science 207:82-84,1980.)
Figura 17-49 Dibujos de secciones representativas de túbulos de riñón de larvas de salamandra de diferente grado de ploidía. Las salamandras
10 pm
HAPLOIDE 11 crom osom as
DIPLOIDE 22 crom osom as
PENTAPLOIDE 55 crom osom as
pentaploides tienen células que son más grandes que las de las salamandras haploides, pero los animales y sus órganos individuales tienen el mismo tamaño porque cada tejido del animal pentaploide tiene menos células. Esto indica que el número de células se regula mediante un mecanismo que se basa en el tamaño y en la distancia en vez de en el número de divisiones celulares o en la cantidad de células. (Según G. Fankhauser, en Analysis of Development [B.H. Willer, P.A. Weiss, y V. Hamburger, eds.], pp.126-150. Philadelphia: Sanders, 1955.)
sugiere que la senescencia puede estar provocada por la incapacidad de m ante ner la longitud de los telómeros, quizás porque las células somáticas (en con traste con las células de la línea germinal) son deficientes en telomerasa.
El cuerpo se genera y se m antiene mediante complicados patrones reguladores de la división celular41 Mientras que la vida puede terminar mediante un proceso de senescencia for tuito, comienza con una serie de ciclos de división regulados según unas leyes precisas y complicadas. Esto ocurre así en todos los organismos pluricelulares pero está ilustrado de una forma más llamativa en un gusano nemátodo, Caenorhabditis elegans. El huevo fecundado de C. elegans se divide produciendo un adulto con exactam ente 959 células somáticas nucleadas, cada una de las cuales está generada mediante su propia secuencia de divisiones celulares característi ca y absolutam ente predecible. En general estos fenómenos no son simplemen te una cuestión de llevar el recuento de las divisiones celulares según un patrón temporal. Por ejemplo, salamandras de distinta ploidía tienen el mismo tamaño pero diferente número de células; cada una de las células de un animal pentaploide tiene un volumen cinco veces mayor que las de un animal haploide, y en cada órgano los animales pentaploides sólo han generado una quinta parte de las células de sus parientes haploides, de manera que los órganos son aproxi madam ente del mismo tamaño en las dos clases de animales (Figuras 17-49 y 17-50). Evidentemente, en este caso (y de hecho en la mayoría de los otros casos) el tamaño de los órganos no se regula mediante el recuento de células o de ciclos celulares sino mediante algún mecanismo que en realidad calcula distancias. Tales mecanismos requieren controles posicionales complejos en los cuales los factores de crecimiento pueden jugar un papel importante. Tal como veremos en el Capítulo 21, se empiezan a caracterizar algunos de los genes que rigen los programas de proliferación en el embrión. En el embrión temprano de Droso phila empieza a ser posible explicar los patrones de la división celular según las actividades de com ponentes identificados del sistema de control del ciclo celu-
Figura 17-50 Micrograffas que comparan las células de los cerebros de salamandras haploides y tetraploides. (A) Sección transversal del cerebro de una salamandra haploide. (B) Sección transversal correspondiente a la parte posterior del cerebro de una salamandra tetraploide mostrando que una reducida cantidad de células es compensada por un mayor tamaño celular. (De G. Frankhauser, Int. Rev. CífoZ. 1:165-193,1952.)
Controles de la división celular en los animales pluricelulares
971
lar. Sin embargo, los biólogos que estudian el desarrollo todavía están lejos de saber con detalle de qué forma las quinasas dependientes de ciclina, las ciclinas, los factores de crecimiento, los contactos celulares, los genes de proliferación y antiproliferación -todos los tornillos y las tuercas del control de la división celu lar de los que hemos tratado hasta aquí- trabajan juntos llevando a cabo los com plejos programas de la división celular en desarrollo. Así pues, hasta ahora nuestro conocim iento de la compleja red de controles que rigen la división celular en la sociedad de células que forman un cuerpo adulto es sólo fragmentario. Por ejemplo, cuando se cura una herida en la piel de un vertebrado, cerca de una docena de tipos celulares -desde fibroblastos a cé lulas de Schw ann- tienen que regenerarse en cantidades y posiciones adecuadas para reconstruir el tejido perdido. Estas cuestiones sobre la división celular en los tejidos, que se tratará en profundidad en el Capítulo 22, son básicas para el conocim iento del cáncer, en el que los controles sociales funcionan mal, y en muchísimas otras enfermedades. En el centro mismo de la cuestión tenemos la función del propio ciclo celular -e l mecanismo de reproducción celular del que depende cualquier forma de vida. Los descubrimientos procedentes de los estu dios en ranas y levaduras ya están empezando a aportar nuevas soluciones a problemas urgentes del ser humano.
Resumen Las células de los animales pluricelulares, como por ejemplo los mamíferos, pare cen tener básicamente el mismo sistema de control del ciclo celular que presentan las levaduras, con el principal punto de control en G¡. Sin embargo, a diferencia de las levaduras, normalmente retrasan su proliferación a menos que reciban señales específicas de otras células para llevarla a cabo. Si a una célula normal de mamí fero en cultivo se le priva de estas señales, se detendrá en una variante quiescente del estado G, en la que no hay crecimiento alguno -denominada G0- en la que se inactiva la producción de componentes del sistema de control del ciclo celular y de muchas otras proteínas. Los factores proteicos de crecimiento ejercen influencias extracelulares importantes sobre la proliferación celular. Dichos factores están presentes a concentraciones muy bajas y parece que la competencia por ellos limi ta la densidad de la población celular. Además del requerimiento de factores de crecimiento específicos, la mayoría de las células tienen que estar ancladas a un substrato para poder dividirse. Los factores de crecimiento regulan la proliferación celular a través de una compleja red de cascadas de señales intracelulares, que finalmente regulan la transcripción de genes y el ensamblaje y la activación del sistema de control del ci clo celular. Se han identificado muchos de los componentes proteicos de estas vías señalizadoras mediante el estudio de células cancerosas, en las cuales se han pro ducido mutaciones que han activado genes cuyo producto estimula la proliferación (proto-oncogenes) o que han inactivado genes cuyo producto normalmente retrasa la proliferación (genes supresores de tumores). Entre los proto-oncogenes existen algunas proteínas reguladoras de genes, como Myc, que en algunos tipos celulares son necesarias y suficientes para inducir la proliferación celular. Contrariamente, existen genes supresores de tumores, como Rb, cuyos productos bloquean la prolife ración uniéndose y secuestrando proteínas reguladoras de genes. Aparte de estos controles a corto plazo de la proliferación celular de los organismos pluricelulares, se producen controles a largo plazo, como son los responsables de la progresiva dis minución del potencial de proliferación a medida que las células envejecen o los complicados programas de división celular necesarios durante el desarrollo del em brión. Por ahora, nuestro conocimiento sobre estos controles es bastante limitado.
972
Capítulo 17: El ciclo de división celular
Bibliografia
6. Lohka, M.J.; Hayes, M.K.; Mailer, J.L. Purification of ma
General The Cell Cycle. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. Vol. 56,1991. Cooper, S. Bacterial Growth and Division. San Diego, CA: Academic Press, 1991. Mitchison, J.M. The Biology of the Cell Cycle. Cambridge, UK: Cambridge University Press, 1971. Murray, A.; Hunt, T. The Cell Cycle. Oxford, UK: Oxford University Press, 1993. Pollack, R., ed. Readings in Mammalian Cell Culture, 2nd ed. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Labo ratory, 1981. Varmus, H.; Weinberg, R.A. Genes and the Biology of Can cer. New York: Scientific American Library, 1993. Wilson, E.B. The Cell in Development an Heredity, 3rd ed. New York: Macmillan, 1928.
7.
Citas 1. Baserga, R. The Biology of Cell reproduction. Cambrid ge: Harvard Unviersity Press, 1985. Howard, A.; Pelc, S.R. Nuclear incorporation of P32 as demonstrated by autoradiographs. Exp. Cell Res. 2:178-187,1951. Krishan, A. Rapid flow cytofluorometric analysis of mammalian cell cycle by propidium iodide staining. J. Cell Biol 66:188-193, 1975. 2. Bailly, E.; Bornens, M. Centrosome and cell division. Nature 355:300-301,1992. Creanor, J.; Mitchison, J.M. Patterns of protein synthesis during the cell cyclo of the fission yeast Schizosaccharomyces pombe. J. Cell Sci. 58:263-285,1982. Elledge, S.J.; Zhou, Z.; Allen, J.B. Ribonucleotide reduc tase: regulation, regulation, regulation. Trends Biochem. Sci. 17:119-123, 1992. Johnston, L.H. Periodic events in the cell cycle. Curr. Opin. Cell Biol. 2:274-279,1990. Xu, H.; Kim, U.-J.; Schuster, T.; Grusntein, M. Identifica tion of a new set of cell cycle-regulatory genes that re gulate S-phase trancription of histone genes in Saccharomyces cerevisiae. Mol. Cell Biol. 12:5249-5259,1992. 3. Hartwell, L.H.; Weinert, T.A. Checkpoints: controls that ensure the order of cell cycle events. Science 246:629634,1989. Murray, A.W.; Kirschner, M.W. Dominoes and clocks: the union of two views of the cell cycle. Science 246:614-621,1989. Murray, A.W.; Kirschner, M.W. What controls the cell cycle? Sci. Am. 264(3):56-63,1991. Nurse, P. Universal control mechanism regulating onset of M-phase. Nature 344:503-508,1990. O’Farrell, P.H. Cell cycle control: many ways to skin a cat. Trends Cell Biol. 2:159-163,1992. 4. Kirschner M. The cell cycle then and now. Trends Biochem. Sci. 17:281-285,1992. 5. Browder, L.W.; Erickson, C.A.; Jeffery, W.R. Develop mental Biology, 3rd ed., Chaps. 3 and 5. Philadelphia: Saunders, 1991. Kirschner, M.; Newport, J.; Gerhart, J. The timing of early developmental events in Xenopus. Trends Ge net. 1:41-47, 1985. Bibliografía
8.
9.
10.
11.
turation-promoting factor, an intracellular regulator of early mitotic events. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:3009-3013,1988. Masui, Y.; Markert, C.L. Cytoplasmic control of nuclear behavior during meiotic maturation of frog oocytes. J.Exp.Zool. 177:129-146,1971. Newport, J.W.; Kirschner, M.W. Regulation of the cell cycle during early Xenopus development. Cell 37:731742, 1984. Johson, R.T.; Rao, P.N. Mammalian cell fusion: induc tion of premature chromosome condenstion in in terphase nuclei. Nature 226:717-722,1970. Rao, P.N.; Johnson, R.T. Mammalian cell fusion studies on the regulation of DNA synthesis and mitosis. Na ture 225:159-164, 1970. Gerhart, J.; Wu, M.; Kirschner, M. Cell cycle dynamics of an M-phase-specific cytoplasmic factor in Xenopus laevis oocytes and eggs. J. Cell Biol. 98:1247-1255, 1984. Hara, K.; Tydeman, P.; Kirschner, M. A cytoplasmic clock with the same period as the division cycle in Xenopus eggs. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:462-466,1980' Harvey, E.B. A comparison of the development of nucle ate and non-nucleate eggs of Arbacia punctulata. Biol. Bull. 79:166-187, 1940. Picard, A.; Harricane, M.-C., Labbe, J.C.; Doree, M. Ger minal vesicle components are not requiered for the cell-cycle oscillator of the early starfish embryo. Dev. Biol. 128:121-128, 1988. Evans, T.; Rosenthal, E.T.; Youngblom, J.; Distel, D.; Hunt, T. Cyclin: a protein specified by maternal mRNA in sea urchin eggs that is destroyed at each cleavage division. Cell 33:389-396, 1983. Minshull, J.; Blow, J.J.; Hunt T. Translation of cyclin mRNA is necessary for extracts of activated Xenopus eggs to enter mitosis. Cell 56:947-956,1989. Murray, A.W.; Kirschner, M.W. Cyclin synthesis drives the early embryonic cell cycle. Nature 339:275-280,1989. Murray, A.W.; Solomon, M.J.; Kirschner, M.W. The role of cyclin synthesis and degradation in the control of maturation promoting factor activity. Nature 339: 280-286, 1989. Glotzer, M.; Murray, A.W.; Kirschner, M.W. Cyclin is de graded by the ubiquitin pathway. Nature 349:132138,1991. Sherr, C.J. Mammalian G1 cyclins. Cell 73:1059-1065,1993. Bailly, E.; Pines, J.; Hunter, T.; Bornens, M. Cytoplasmic accumulation of cyclin B1 in human cells: association with a detergent-resistant compartment and with the centrosome./. Cell Sci. 101:529-545, 1992. Belmont, L.D.; Hyman, A.A.; Sawin, K.E.; Mitchison, T.J. Real-time visualization of cell cycle-dependent chan ges in microtuble dynamics in cytoplasmic extracts. Cell 62:579-589,1990. Heald, R.; McKeon, F. Mutations of phosphorylation si tes in lamin A that prevent nuclear lamina disas sembly in mitosis. Cell 61:579-589, 1990. Nigg, E.A. Targets of cyclin-dependent protein kinases. Curr. Opin. Cell Biol. 5:187-193, 1993. Peter, M.; Nakagawa, J.; Doree, M.; Labbe, J.C.; Nigg, E.A. In vitro disassembly of the nuclear lamina and M phase-specific phosphorylation of lamins by cdc2 ki nase. Cell 61:591-602, 1990.
973
Verde, F.; Dogterom, M.; Stelzer, E.; Karsenti, E.; Leibler, S. Control of microtubule dynamics and length by cyclin A- and cyclin B-dependent kinases in Xenopus egg extracts./. Cell Biol. 118:1097-1108,1992. Yanagida, M.; Kinoshita, N.; Stone, E.M.; Yamano, H. Protein phosphatases and cell division cycle control. Ciba Found. Symp. 170:130-146, 1992. 12. Dasso, M.; Newport, J.W. Completion of DNA replica tion is monitored by a feedback system that controls the initiation of mitosis in vitro: studies in Xenopus. Cell 61:811-823, 1990. Kimelman, D.; Kirschner, M.; Scherson, T. The events of the midblastula transition in Xenopus are regulated by changes in the cell cycle. Cell 48:399-407, 1987. Smythe, C.; Newport, J.W. Coupling of mitosis to the completion of S phase in Xenopus occurs via modu lation of the tyrosine kinase that phosphorylates p34cdc2. Cell 68:787-797, 1992. Raff, J.W.; Glover, D. Nuclear and cytoplasmic mitotic cycles coninue in Drosophila embryos in which DNA synthesis is inhibited with aphidicolin. J. Cell Biol. 107:2009-2019, 1988. 13. Blow, J.J.; Laskey, R.A. A role for the nuclear envelope in controlling DNA replication within the cell cycle. Na ture 332:546-548, 1988. Coverly, D.; Downes, C.S.; Romanowski, P.; Laskey, R.A. Reversible effects of nuclear membrane permeabilization on DNA replication: evidence for a positive li censing factor./. Cell Biol. 122:985-992,1993. Hennessy, K.M.; Lee, A.; Chen, E.; Botstein, D. A group of interacting yeast DNA replication genes. Genes Dev. 5:958-969, 1991. Smith, A.V.; Orr-Weaver, T.L. The regulation of the cell cycle during Drosophila embryogenesis: the transi tion to polyteny. Development 112:997-1008, 1991. 14. Forsburg, S.L.; Nurse, P. Cell cycle regulation in the ye asts Saccharomyces cerevisiae and Schizosaccharomyces pombe. Annu. Rev. Cell Biol. 7:227-256, 1991. Hartwell, L.H. Twenty-five years of cell cycle genetics. Genetics 129:975-980, 1991. Hartwell, L.H.; Culotti, J.; Pringle, J.R.; Reid, B.J. Genetic control of cell division cycle in yeast. Science 183:4651, 1974. Pringle, J.R.; Hartwell, L.H. The Saccharomyces cerevi siae cell cycle. In The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, Life Cycle and Inheritance (J.N. Strathern, E.W. Jones, J.R. Broach, eds.), pp. 97-142. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory, 1981.
Nurse, P.; Thuriaux, P.; Nasmyth, K. Genetic control of the cell division cycle in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe. Mol. Gen. Genet. 146:167-178, 1976. Russell, P.; Nurse, P. Negative regulation of mitosis by weel+, a gene encoding a proten kinase homolog. Cell 49:559-567,1987. 17. Dunphy, W.G.; Brizuela, L.; Beach, D.; Newport, J. The Xenopus cdc2 protein is a component of MPF, a cyto plasmic regulator of mitosis. Cell 54:423-431, 1988. Gautier, J.; Norbury, C.; Lohka, M.; Nurse, P.; Mailer, J. Purified maturation-promoting factor contains the product of a Xenopus homolog of the fission yeast cell cycle control gene cdc2+. Cell 54:433-439,1988. Booher, R.N.; Alfa, C.E.; Hymans, J.S.; Beach, D.H. The fission yeast cdc2/cdcl3/sucl protein kinase: regula tion of catalytic activity and nuclear localization. Cell 58:485-497, 1989. Lee, M.G.; Nurse, P. Complementation used to clone a human homologue of the fission yeast cell cycle con trol gene cdc2. Nature 327:31-35, 1988. 18. Nasmyth, K. Control of the yeast cell cycle by the Cdc28 protein kinase. Curr. Opin. Cell Biol. 5:166-179,1993. Solomon, M.J. Activation of the various cyclin/cdc2 pro tein kinases. Curr. Opin. Cell Biol. 5:180-186,1993. 19. Fesquet, D., et al. The M015 gene encodes the catalytic subunit of a protein kinase that activates cdc2 and other cyclin-dependent kinases (CDKs) through phosphorylation of Thrl61 and its homologues. EMBOJ. 12:3111-3121,1993. Gould, K.L.; Nurse, P. Tyrosine phosphorylation of the fission yeast cdc2+protein kinase regulates entry into mitosis. Nature 342:39-45, 1989. Kumagai, A.; Dunphy, W.G. Regulation of the cdc25 protein during the cell cycle in Xenopus extracts. Cell 70:139-151,1992. 20. Edgar, B.A.; O’Farrell, P.H. The three postblastoderm cell cycles of Drosophila embryogenesis are regulated in G2 by string. Cell 62:469-480, 1990. O’Farrell, P.H. Cell cycle control: many ways to skin a cat. Trends Cell Biol. 2:159-163, 1992. 21. Fankhauser, G. Nucleo-cytoplasmic relations in amphi bian development. Int. Rev. Cytol. 1:165-193,1952. Henery, C.C.; Bard, J.B.L.; Kaufman, M.H. Tetraploidy in mice, embryonic cell number, and the grain of the developmental map. Dev. Biol. 152:233-241,1992. Prescott, D.M. Changes in nuclear volume and growth rate and prevention of cell division in Amoeba proteus resulting from cytoplasmic amputations. Exp. Cell Res. 11:94-98, 1956.
Watson, J.D.; Hopkins, N.H.; Roberts, J.W.; Steitz, J.A.; Weiner, A.M. Molecular Biology of the Gene, 4th ed., pp. 550-618. Menlo Park, CA: Benjamin-Cummings, 1987.
22. Beach, D.; Durkacz, B.; Nurse, P. Functionally homolo gous cell cycle control genes in budding and Mission yeast. Nature 300:706-709,1982.
15. Johnston, G.C.; Pringle, J.R.; Hartwell, L.H. Coordina tion of growth with cell division in the yeast Saccha romyces cervisiae. Exp. Cell Res. 150:79-98, 1977.
Cross, F. DAF1, a mutant gene affecting size control, pheremone arrest, and cell cycle kinetics of Saccharomyces cerevisiae. Mol. Cell Biol. 8:4675-4684, 1988.
Nurse, P. Genetic control of cell size at cell division in yeast. Nature 256:547-551, 1975.
Dirick, L.; Nasmyth, K. Positive feedback in the activa tion of G1 cyclins in yeast. Nature 351:754-757, 1991.
16. Hartwell, L.H.; Culotti, J.; Reid, B. Genetic control of cell division in yeast. I. Detection of mutatns. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 66:352-359, 1970.
Reed, S.I. The role of p34 kinases in the G1 to S-phase transition. Annu. Rev. Cell Biol. 8:529-561,1992.
Murray, A.; Hunt, T. The Cell Cycle. Oxford, UK: Oxford University Press, 1993.
974
Capitulo 17 : El ciclo de divisiön celular
Richardson, H.E.; Wittenberg, C.; Cross, F.; Reed, S.I. An essential G1 function for cyclin-like proteins in yeast. Cell 59:1127-1133, 1989.
23. Peter, M.; Gartner, A.; Horecka, J.; Ammerer, G.; Herskowitz, I. FAR1 links the signal transdution pathway to the cell cycle machinery in yeast. 73:747-760,1993.
Cell
24. Roberts, J.M. Turning DNA replication on and off. 5:201-206, 1993.
Opin. Cell Biol.
Curr.
25. Broek, D.; Bartlett, R.; Crawford, K.; Nurse, P. Involve m ent of p 34cdc2 in establishing the dependency of S phase on mitosis. 3 49:388-393, 1991.
Nature
Hartwell, L.H.; W einert, T.A. Checkpoints: controls that ensure the order of cell cycle events. 246:629634, 1989.
Science
Murray, A.W. Creative blocks: cell-cycle checkpoints and feedback controls. 359:599-604, 1992.
Nature
Schlegel, R.; Pardee, A.B. Caffeine-induced uncoupling of mitosis from com pletion of DNA replication in m am m alian cells. 2 3 2 :1 2 6 4 -1 2 6 6 ,1 9 8 6 .
Science
26. Enoch, T.; Nurse, P. M utation of fission yeast cell cycle control genes abolishes dependence of mitosis on DNA replication. 60:665-673, 1990.
Cell
Kuerbitz, S.J.; Plunkett, W.V.; Walsh, W.V.; Kastan, M.B. Wild-type p53 is a cell cycle chekpoint determ inant following irradiation. 89:7491-7495, 1992.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA
Weinert, T.A.; Hartwell, L.H. The RAD9 gene controls the cell cycle response to DNA dam age in Science 2 4 1 :3 1 7 -3 2 2 ,1 9 8 8 .
Saccha-
romyces cerevisiae.
Weinert, T.A.; Hartwell, L.H. Cell cycle arrest of cdc m u tants and specificity of the RAD9 checkpoint. 134:63-80, 1993.
Gene
tics
27. Li, R.; Murray, A.W. Feedback control of mitosis in bud ding yeast. 66:519-531, 1991.
Cell
28. Elledge, S.J.; Spottswood, M.R. A new hum an p34 pro tein kinase, CDK2, identified by com plem entation of a cd c28 m utation in is a hom olog o Egl. 10:2653-2659, 1991.
Saccharomyces cerevisiae, Xenopus EMBO J.
Fang, F.; Newport, J.W. Evidence that the G l-S and G2M transitions are controlled by different cd c2 p ro teins in higher eukaryotes. 66:731-742, 1991.
Cell
Koff, A., et al. Form ation and activation of a cyclin Ecdk2 com plex during the Gt phase of the hum an cell cycle. 2 5 7 :1 6 8 9 -1 6 9 4 ,1 9 9 2 .
Science
Lew, D.J.; Dulic, V.; Reed, S.I. Isolation of three novel hum an cyclins by rescue of G1 cyclin (Cln) function in yeast. 6 6 :1 1 9 7 -1 2 0 6 ,1 9 9 1 .
Cell
Rosenblatt, J.; Gu, Y.; M organ, D.O. Hum an cyclin-dependent kinase 2 is activated during the S and G2 phases of the cell cycle and associates with cyclin A. 89:2824-2828, 1992.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA
Sherr, C.J. M am m alian G1 cyclins. 1993.
Cell 73:1059-1065,
Solomon, M.J. Activation of the various cyclin /cd c2 portein kinases. 5 :1 8 0 -1 8 6 ,1 9 9 3 .
Curr. Opin. Cell Biol.
29. Todaro, G.J.; Green, H. Quantitative studies of the growth of m ouse embryo cells in culture and their developm ent into established cell lines. /. 1 7 :2 9 9 -3 1 3 ,1 9 6 3 .
Cell Biol.
30. Cross, M.; Dexter, T.M. Growth factors in development, transform ation, and tum origenesis. 64:271-280, 1991.
Cell
Massague, J.; Pandiella, A. M em brane-anchored growth factors. Annu. 6 2 :5 1 5 -5 4 1 ,1 9 9 3 .
Rev. Biochem.
Ross, R.; Raines, E.W.; Bowen-Pope, D.F. The biology of platelet-derived growth factor. 46:1 5 5-169, 1986.
Cell
Sporn, M.B.; Roberts, A.B., eds. Peptide Growth Factors and Their Receptors. Berlin: Springer-Verlag, 1990. 31. Loughlin, J.H.; Fallon, J.H., eds. N eurotrophic Growth Factors. San Diego, CA: Academ ic Press, 1992. Purves, D. Body and Brain: A Trophic Theory of Neural C onnections. Cambridge: Harvard University Press, 1988. 32. Brooks, R.F. Regulation of the fibroblast cell cycle by se rum. 2 60:248-250, 1976.
Nature
Goss, R.J. The Physiology of Growth. New York: A cade mic Press, 1978. Pardee, A.B. A restriction point for control of normal animal cell proliferation. 71:1286-1290, 1974.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA
Pardee, A.B. G! events and regulation of cell prolifera tion. Science 2 46:603-608, 1989. Pledger, W.J.; Stiles, C.D.; Antoniades, H.N.; Scher, C.D. An ordered sequence of events in required before BALB/c-3T3 cells becom e com itted to DNA synthe 75:2839-2843, 1978. sis.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA
33. Larsson, O.; Zetterberg, A.; Engstrom , W. C onsequences of parental exposure to serum -free m edium for pro geny cell division./. 75:259-268, 1985.
Cell Sci.
Zetterberg, A. Control of m am m alian cell proliferation. 2:296-300, 1990.
Curr. Opin. Cell Biol.
Zetterberg, A.; Larsson, O. Kinetic analysis of regulatory events in G1 leading to proliferation or quiescence of swiss 3T3 cells. 82:53655369, 1985.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA
34. Furukawa, Y.; Piwnica-W orms, H.; Ernst, T.J.; Kanakura, Y.; Griffin, J.D. gene expression at the G, to S transition in hum an T lym phocytes. 250:805808, 1990.
cdc2
Science
Lee, M.G.; Norbury, C.J.; Spurr, N.K.; Nurse, P. Regula ted expression and phosphorylation of a possible m am m alian cell-cycle control protein. 333: 676-679, 1988.
Nature
Matsushime, H.; Roussel, M.F.; Ashmum, R.A.; Sherr, C.J. Colony-stim ulating factor 1 regulates novel cy clins during the G1 phase of the cell cycle. 65 :701-713, 1991.
Cell
Ninomiya-Tsuji, J.; Nom oto, S.; Yasuda, H.; Reed, S.I.; M atsum oto, K. Cloning of a hum an cDNA encoding a CDC2-related kinase by com plem ntation of a bud ding yeast m utation. 8 8 :9006-9010, 1991.
cdc28
Proc. Natl. Acad. Sci. USA
Sherr, C.J. M am m alian G1 cyclins. 1993.
Cell
73:1059-1065,
35. Dunn, G.A.; Ireland, G.W. New evidence that growth in 3T3 cell cultures is a diffusion-limited process. 312:6 3 -6 5 , 1984.
Natu
re
Holley, R.W.; Kiernan, J.A. “C ontact inhibition” of cell division in 3T3 cells. 6 0 :300-304, 1968.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA
Heldin, C.-H. Structural and functional studies on pla telet-derived growth factor. 11:4251-4259, 1992.
Stoker, M.G.P. Role of diffusion boundary layer in co n tact inhibition of growth. 246:2 0 0-203, 1973.
Massague, J.. The transforming growth factor-p family. 6 :5 9 7 -6 4 1 ,1 9 9 0 .
36. Folkman, J.; M oscona, A. Role of cell shape in growth control. 2 7 3 :3 4 5 -3 4 9 ,1 9 7 8 .
EMBO J.
Annu. Rev. Cell Biol.
Bibliografía
Nature
Nature
97 5
Han, E.K.-H.; Guadagno, T.M.; Dalton, S.L.; Assoian, R.K. A cell cycle and m utational analysis of an ch ora ge-independent growth: cell adhesion and TGF-pi control G l/S transit specifically. /. 122:461471, 1993.
39. Cobrinik, D.; Dowdy, S.F.; Hinds, P.W., M ittnacht, S.; W einberg, R.A. The retinoblastom a protein and the regulation of cell cycling. 17:312-315, 1992.
O’Neill, C.; Jordan, P.; Ireland, G. Evidence for two dis tinct m echanism s of anchorage stimulation in freshly explanted and 3T3 m ouse fibroblasts. 44:489496, 1986.
Curr. Opin. Cell Biol.
Cell Biol.
Cell
Symington, B.E. Fibronectin recep tor m odulates cyclindependent kinase activity. 267:2574425747, 1992.
J. Biol. Chem.
Turner, C.E.; Burridge, K. T ransm em brane molecular assemblies in cell-extracellular m atrix interactions. 3:849-853, 1991.
Curr. Opin. Cell Biol.
37. Bishop, J.M. M olecular them es in oncogenesis. 6 4:235-248, 1991.
Cell
Hartwell, L. Defects in a cell cycle chekpoint m ay be res ponsible for the genom ic instability of can cer cells. 71:543-546, 1992.
Cell
Varmus, H.; W einberg, R.A. Genes and the Biology of C ancer. New York: Scientific Am erican Library, 1993. 38. Almendral, J.M., et al. Complexity of the early genetic response to growth factors in m ouse fibroblasts. 8:2 1 40-2148, 1988.
Mol.
Cell Biol.
Naeve, G.S.; Sharm a, A.; Lee, A.S. Tem poral events regu lating the early phases of the m am m alian cell cycle. 3:26 1 -2 6 8 , 1991.
Curr. Opin. Cell Biol.
Pazin, M.J.; Williams, L.T. Triggering signaling cascades by recep tor tyrosine kinases. 1 7 :3 1 2 -3 1 5 ,1 9 9 2 .
Trends Biochem. Sci.
976
Capítulo 17 : El ciclo de división celular
Trends Biochem. Sci.
Hollingsworth, R.E.; Chen, P.-L., Lee, W .-H. Integration of cell cycle control with transcriptional regulation by the retinoblastom a protein. 5:194-200, 1993.
40. Allsop, R.C., et al. Telomere length predicts replicative capacity of hum an fibroblasts. 89:10114-10118, 1992.
Proc. Natl. Acad. Sci.
USA
Finch, C.E. Longevity, Senescence, and the Genome. Chicago: University of Chicago Press, 1990.
in vitro lifetime of hum an Exp. Cell Res. 37:614-636, 1965.
Hayflick, L. The limited ploid cell strains.
di
Lundblad, V.; Szostak, J.W. a m utant with a defect in te lom ere elongation leads to senescence in yeast. 57:633-643, 1989.
Cell
Rheinwald, J.G.; Green, H. Epidermal gowth factor and the multiplication of cultured hum an epiderm al keratinocytes. 2 6 5:421-424, 1977.
Nature
Smith, J.R.; Whitney, R.G. Intraclonal variation in proli ferative potential of hum an diploid fibroblasts: sto chastic m echanism for cellular aging. 207:8284, 1980.
Science
Drosophila em bryo-in and Trends Genet. 7:125-132, 1991. ed. The Nem atode Caeonorhabditis ele-
41. Glover, D.M. Mitosis in the out of control.
W ood, W.B., Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory, 1988.
gans.
Los mecanismos de la división celular
1
8 ■- 'é <■ -
"f -
•Visión de conjunto de la fase M Mitosis ♦ Citocinesis
En este cap ítu lo verem o s los m eca n ism o s de los aco n te cim ie n to s de la fase M (o división celular) del ciclo celular. E sta fase, que incluye los diferentes estad ios de la división n u clear ( ) y de la división cito p lasm ática ( ), es la cu l
mitosis
citocinesis
m in ació n del ciclo celular. En un períod o relativam en te breve, los co n ten id o s de la célu la m ad re, que se h an duplicado m ed ian te las actividades b iosin téticas de la
célula en interfase citoplasma núcleo
replicación cromosómica (fase S)
interfase p reced en te, se segregan en dos células hijas (Figura 18-1). A nivel m o lecu la r la fase M se in icia m ed ian te u n a c a s ca d a de fosforilacio nes de p ro teín as d e se n c a d e n a d a p o r la a ctiv a ció n de la p ro te ín a q u in asa
MPF
que in d u ce la m itosis, y se te rm in a m ed ian te las desfosforilacion es que siguen a la in activ ació n de M PF a través de la p roteolisis de sus su bu n id ad es de ciclin a (tratad as en el C apítulo 17). Las d esfosforilacion es de p ro teín a que o cu rre n d u ran te la fase M son las ca u sa n te s de la m ay o ría de ca m b io s m o rfológicos que a c o m p a ñ a n a la m itosis: los cro m o so m a s se co n d e n sa n , la en voltu ra n u cle a r se ro m p e, el retícu lo e n d o p la sm á tico y el co m p lejo de Golgi se frag m en tan , la c é lu la afloja sus ad h esio n es a otras célu las y a la m atriz extracelu lar, y el cito esq u eleto se tran sfo rm a facilitando la co m p lica d a o rg an izació n de m o v im ien to s que s e greg arán los cro m o s o m a s y la división celular. D ebido a que la fase M con lleva u n a reo rg an izació n co m p le ta del in terior celular, se c re e que el n ú m e ro de p ro
fase G1
fase G2
MITOSIS
profase, prometafase, metafase, anafase, telofase fase M
teín as que se fosforilan es m u y am p lio, y que p rá ctica m e n te to d as las zo n as de la célu la q u ed an afecta d a s de algu n a m an era. fase Gi
Visión de conjunto de la fase M1 Salvo p eq u eñ as variacio n es, los p ro ce so s que tien en lugar en la fase M p a ra divi dir u n a célu la en dos siguen la m ism a se cu e n cia en to d o s los e u ca rio ta s. Dirigi d as p o r la reo rg an izació n del cito esq u eleto , las célu las aco p lan , utilizan y d e s m o n ta n los m e ca n ism o s n e ce sa rio s p ara se p a ra r las series de c ro m o so m a s d u p licad os y dividir el cito p la sm a en dos m itad es.
Figura 18-1 La fase M del ciclo celular. La fase M em pieza al final de la fase G2 y finaliza al co m en zar la próxim a fase G P Incluye los cin co estadios de la división nu clear (m itosis), y la división citop lasm ática (citocin esis).
Tres características son exclusivas de la fase M: la condensación cromosóm ica, el huso mitótico y el anillo contráctil La p rim era m an ifestació n ap reciab le de la fase M es la p rogresiva c o m p a cta c ió n de la d isp ersa cro m a tin a in terfásica, fo rm an d o u nos c ro m o so m a s en fo rm a de hilo. E sta condensación crom osóm ica es n e ce sa ria p ara la seg reg ació n o rg an i z ad a de cro m o so m a s en dos célu las hijas que te n d rá lugar a co n tin u a ció n , y se
977
Figura 18-2 El citoesqueleto en fase
M. El hu so m itó tico se en sam b la y
microtúbulos del
PROGRESIÓN A TRAVÉS DE LA FASE M
h u s o m it ó t ic o
segrega los cro m osom as. El anillo con tráctil se en sam b la m ás tarde y divide la célu la en dos.
filamentos de actina del a n illo c o n t r á c til
ve a c o m p a ñ a d a p o r la e x te n sa fosforilación de m o lécu las de h isto n a H1 (h asta seis fosfatos p o r m o lé cu la ). Se cre e que la fosforilación de la h isto n a H l, en el c o m ien zo de la fase M, co n trib u y e a la co n d e n sa ció n c ro m o só m ica , ya que su c o n c e n tra c ió n es de a p ro x im a d a m e n te u n a m o lé cu la p o r n u cle o so m a y se sabe q ue p articip a en la c o n d e n sa ció n de los c ro m o so m a s. La co n d e n sa ció n c ro m o s ó m ic a es el preludio de d os p ro ce so s m e c á n ic a m e n te d istintos: (1) - l a seg reg ació n de cro m o so m a s y la fo rm ació n de
mitosis
citocinesis
d os n ú cleo s en lu gar de u n o - y (2) - l a división de la totalid ad de la c é lula en dos. E sto s p ro ce so s se e fe ctú a n p o r d os e stru ctu ra s cito esq u eléticas dife ren tes que a p a re ce n fu g azm en te d u ran te la fase M. La p rim era en fo rm arse es un huso mitótico b ipolar, c o m p u e sto p o r m icro tú b u lo s y p o r sus p ro te ín a a s o ciad as. El h u so m itó tico alin ea los c ro m o s o m a s rep licad o s en un p lan o que s e c cio n a la célu la en dos; e n to n c e s c a d a cro m o s o m a se se p a ra en dos c ro m o so m a s hijos, que so n d esp lazad os h a cia los p olos o p u esto s del m ism o h uso. La seg u n d a e stru ctu ra cito esq u e lé tica n e ce sa ria en la fase M de las célu las an im ales es el anillo contráctil de filam en tos de a ctin a y de m io sin a II, que se fo rm a ligera m e n te m ás tard e ju sto d eb ajo de la m e m b ra n a p lasm ática, en u n plano p e rp e n d icu lar al eje del h uso (Figura 1 8 -2 ); al m ism o tiem p o que se co n tra e el anillo se c o n tra e la m e m b ra n a h a cia d e n tro dividiendo la célu la en dos, aseg u ran d o así que c a d a célu la hija re cib a no ta n sólo un serie c o m p le ta de c ro m o so m a s sino tam b ién la m itad de los co n stitu y e n te s cito p la sm á tico s de la célu la m ad re. Las dos e stru ctu ra s cito e sq u e lé tica s co n tie n e n diferentes series de p ro teín as y, en algu n as célu las esp ecializad as, se p u ed en fo rm ar de m a n e ra in d ep en d ien te. No o b stan te, su fo rm a ció n n o rm a lm e n te está e s tre ch a m e n te co o rd in a d a de form a que la división cito p la sm á tica (citocin esis) tien e lu gar ju sto d esp u és del final de la división n u cle a r (m itosis). En la célu las v egetales o cu rre la m ism a secu e n cia , au n q u e sus p ared es rígidas req u ieren un m e ca n ism o d iferente p ara la cito cin e sis, tal c o m o v erem o s m ás ad elan te. La d escrip ció n de la fase M que a ca b a m o s de h a ce r sólo es aplicable a las célu las e u cario tas. Las célu las b a cte ria n a s no co n tie n e n filam en tos de a ctin a ni m icro tú b u lo s. N o rm a lm e n te p o se e n un solo c ro m o so m a , cu yas co p ias rep lica das se segregan en las célu las hijas, sin n in g u n a c o n d e n sa ció n esp ecial, m e d ia n te un m e ca n ism o que im p lica la a d h e re n cia del c ro m o s o m a a la m e m b ra n a p lasm ática de la b a cte ria . P ro b a b le m e n te la n ecesid ad de u n o s m e ca n ism o s m itó tico s co m p lejo s su rge so la m e n te co n la ev o lu ció n de células que co n tie n e n g ran d es can tid ad e s de DNA e m p a q u e ta d o en un n ú m ero de cro m o so m a s v a ria ble. La fu n ció n p rim ord ial de tales m e ca n ism o s es rep artir los cro m o s o m a s re p licad os de fo rm a p re cisa e n tre las dos célu las hijas: en las célu las de levadura, en las q ue se h a d eterm in ad o co n e xactitu d , se p ro d u ce un e rro r en la seg reg a ció n cro m o s ó m ic a ta n sólo ca d a 105 divisiones celu lares.
La división celular depende de la duplicación del centrosom a2 C o m o se vio en el C ap ítu lo 16 en la m a y o ría de célu las a n im ales el centrosom a
centro organizador de microtúbulos (MTOC,
es el p rin cip al de M icro tu b u le Organ izin g C en ter), u n a n u b e de m a te ria l p e rice n trio la r p o c o definido (la
matriz
del centrosoma ) a s o c ia d o c o n un p a r de centríolos (F ig u ra 1 8 -3 ). D u ran te la in-
terfase la m atriz del c e n tro s o m a n u c le a u n a serie de m icro tú b u lo s c ito p la s m á tico s, q u e se p ro y e c ta n h a c ia el e x te rio r en d ire cc ió n al p e rím e tro ce lu la r co n
978
Capítulo 18 : Los mecanismos de la división celular
1___________________ !
200 nm
I igura 18-3 Un centrosoma. E lectronm icrografía de una secció n gruesa de cen tro so m a de un a célu la de m am ífero en cultivo. (C ortesía de P. W itt y G. Borisy.)
Figura 18-4 La replicación de los centríolos. La pareja de centríolos se
(en
asocia a la matriz del centrosoma En un cierto punto de la fase G, los dos centríolos se separan unos cuantos micrómetros. Durante la fase S, cerca de la base de cada centriolo empieza a crecer un centriolo hijo, en ángulo recto respecto a él. El estiramiento del centriolo hijo acostumbra a completarse a lo largo de la fase G2. Los dos pares de centríolos permanecen juntos, en un complejo centrosómico único, hasta el comienzo de la fase M, cuando el centrosoma se parte en dos y las dos mitades empiezan a separarse. La estructura del centriolo es ilustrada en la Figuras 16-45 y 16-47.
verde).
g
- '
sus extremos “menos” adheridos al centrosoma. Antes de que la célula eucariota se divida, su centrosoma ha de duplicarse para que cada una de sus dos célu las hijas tenga uno. De hecho, los centrosomas duplicados son necesarios para crear las dos células hijas, ya que los centrosomas forman los dos extremos del huso mitótico. Los centrosomas de la mayoría de las especies animales comparten una ca racterística estructural notoria y distintiva: un par de centríolos (tratados en el Capítulo 16). Los centríolos, sin embargo, que se asocian con la matriz del cen trosoma, no son necesarios para la nucleación de los microtúbulos: los centrosomas vegetales no tienen centríolos; los centríolos también faltan durante las primeras divisiones del huevo de ratón; además, células de mamífero en cultivo tratadas con drogas pueden crear husos mitóticos tripolares, en los que un polo del huso carece de centríolos, y sin embargo parece funcionar con normalidad. Por lo tanto, se cree que la matriz del centrosoma, que contiene una serie de proteínas específicas del centrosoma, es la parte fundamental del centrosoma. Si están presentes, los centríolos asociados con la matriz se duplican según un or den estricto, y su comportamiento puede ayudar a la creación de los dos centrosomas mientras la célula entra en la fase M (Figura 18-4). Los procesos de la duplicación y separación del centrosoma se conocen como ciclo del centrosoma. Durante la interfase de cada ciclo celular, los centrío-
citocinesis
Figura 18-5 El ciclo del centrosoma de una célula animal. El centrosoma de una célula en interfase se duplica formando los dos polos del huso mitótico. En la mayoría de las células animales el par de centrosomas (ilustrado aquí como un par de se asocia con la matriz del centrosoma que nuclea los microtúbulos. (En este diagrama el volumen de la matriz del centrosoma está exagerado para facilitar su identificación; en la Figura 18-4 se ilustra una representación más exacta.) La duplicación del centriolo empieza en G! y se completa en G2 (véase Figura 18-4). Inicialmente, los dos pares de centríolos y la matriz de centrosoma asociada permanecen juntos como un complejo único. En los inicios de la fase M este complejo se separa en dos y cada centrosoma nuclea una formación de microtúbulos radiales, llamada áster. Los dos ásteres, que inicialmente permanecen uno al lado del otro cerca de la envoltura nuclear, se separan. Al final de la profase el haz de que interactúan preferentemente entre los dos ásteres, se alarga mientras los dos centros se separan siguiendo caminos opuestos a lo largo de la parte exterior del núcleo. De esta forma se forma rápidamente el huso mitótico. En la metafase la envoltura nuclear se rompe, permitiendo que los microtúbulos del huso interactúen con los cromosomas; en la citocinesis la envoltura nuclear se forma de nuevo alrededor de los dos conjuntos de cromosomas segregados, excluyendo los centrosomas.
verde oscuro)
barras
(verde claro)
microtúbulos polares
profase temprana metafase
profase
Visión de conjunto de la fase M
97 9
^n 3s /K -
" /f
-7fc
(A)
.-• i
los y o tro s co m p o n e n te s del c e n tro s o m a se d up lican p ero p e rm a n e ce n ju n to s co m o un ú n ico co m p lejo en u n a c a ra del n ú cleo . Al in iciarse la m itosis, este co m p lejo se divide en d os y c a d a p areja de cen trío lo s fo rm a p arte de un ce n tro o rg an izad o r de m icro tú b u lo s d istinto que n u cle a u n a fo rm a ció n de m icro tú b u los rad iales llam ad a áster. Los d os á steres se d esp lazan a ca ra s o p u estas del n ú cleo fo rm an d o los dos e x tre m o s de h u so m itó tico . M ien tras finaliza la m itosis y la en voltu ra n u cle a r se reco n stitu y e alred ed o r de los cro m o s o m a s sep arad o s, ca d a célu la hija recib e u n c e n tro so m a (el an tigu o polo del huso) co n sus c ro m o so m as aso ciad o s (Figura 18 -5 ). El ciclo del c e n tro s o m a p u ed e a c tu a r c o n un grad o de in d ep en d en cia s o r p ren d en te de los o tro s p ro ce so s del ciclo celular. Así pues, si se e xtrae físicam en te el n ú cleo de u n h u ev o de erizo de m ar, o si se b lo q u ea la síntesis de DNA m e d ian te afidicolina, que inhibe la síntesis de DNA, los ciclos de d u p licació n y división del c e n tro so m a p ro ce d e n casi co n n orm alid ad , p rim ero p ro d u cien d o d os ce n tro so m a s, luego cu a tro , d esp u és o ch o , etc. En em b rio n es te m p ra n o s de
Drosophila tra ta d o s de fo rm a p a re cid a co n
afidicolina, los c e n tro so m a s prolife ran tes del in terior del em b rió n se d iso cian de su n ú cleo b loq uead o y se d esp la zan a través del cito p la sm a h a cia la m e m b ra n a p lasm ática; cu a n d o a lcan zan esta m e m b ra n a , m e d ia n te sus ásteres, p u ed en m o d ificar la fo rm a de la m e m b ra n a y de su c o rte z a su b y acen te, g en eran d o célu las que co n tie n e n ce n tro so m a s p ero sin n ú cleo (Figura 1 8 -6 ). Los h uevos en división, co n sus reservas de c o m p o n en tes celu lares que los liberan de la d e p e n d e n cia de la tra n scrip ció n gén ica, tien en un co m p o rta m ie n to m a rc a d a m e n te e x cep cio n al; en o tra s células el ciclo del c e n tro so m a d ep en d e de la p re se n cia de un n ú cleo celu lar fu n cion al. E stá claro , sin em b arg o , que el ciclo de división de la célu la en su globalidad d ep en d e de - o al m e n o s e stá o rg an izad o en p arte p o r - el á ste r m icro tu b u lar, el cu al a su vez está org an izad o p o r el ce n tro so m a . Los ce n tro so m a s , y los ce n trío lo s que n o rm a lm e n te se hallan aso cia d o s a ellos h an d ejad o p erp lejo s y h an o b se sio n a d o a los b iólogos celu lares d u ran te m ás de cien añ o s. ¿De q ué e stá n h e ch o s, c ó m o se rep lican , y c ó m o se o rig in a ro n d u ran te el cu rso de la ev o lu ció n ? E stas cu e stio n e s b á sica s c o n tin ú a n sin resp u esta.
Tradicionalmente la fase M se divide en seis estadios La estrateg ia de la división celu lar es extra o rd in a ria m en te co n sta n te en tre los o r g an ism os eu ca rio ta s. Los cin co p rim ero s estad io s de la fase M co n stitu y en la m i tosis (definida in icialm en te c o m o el p erío d o d u ran te el cu al los c ro m o so m a s se h allan co n d e n sa d o s de m a n e ra visible); el sexto estad io, que se so lap a co n el fi-
980
Capítulo 18: Los mecanismos de la división celular
Figura 18-6 Organización citoplasmática mediante los centrosomas y sus ásteres. Si se inyecta afidicolina en un em brión tem prano de Drosophila para bloqu ear la división nuclear, los cen tro so m as y los ásteres que nu clean se sep aran del núcleo en esta célula sincitial y m igran hacia la superficie celular. En el polo posterior, donde n o rm alm en te se form an las “célu las” germ inales, los brotes de la m em b ran a se organizan gracias a los cen troso m as desplazados, obtenien d o com o resultado la form ación de las “célu las” germ inales sin núcleo. (A) E squ em a ilustrativo del proceso de yem as que provoca el áster. (B-D) M icrografías flu o rescentes de “célu las” germ inales sin nú cleo: (B) tin ció n para ver el DNA, m ostrand o que no hay nú cleo; (C) tin ció n co n un anticu erpo para los cen trosom as; (D) tinción para m ostrar los m icrotúbu los asociados con los cen trosom as. (B-D, co rtesía de Jordán Raff.)
CITOCINESIS
Figura 18-7 Cronología normal de la mitosis y la citocinesis de una célula de mamífero. Los períodos
MITOSIS G2
G1
& $
20
&r®
&
40
n?rS> >0 «?
tiiempo (minutos)
60
/
80
varían de unas clases de células a otras, y son mucho más cortos en los ciclos celulares embrionarios. Nótese que la citocinesis empieza antes de la finalización de la mitosis. El comienzo de la profase (y por tanto de toda la fase M) se define como el punto del ciclo celular en que los cromosomas condensados son visibles por primera vez -según un criterio arbitrario, ya que la condensación de cromosomas parece incrementarse continuamente durante el final de G2. El comienzo de la prometafase se define como el momento en que la envoltura nuclear se rompe.
interfase
10 |jm
Figura 18-8 El curso de la mitosis en una célula de mamífero típica. En estas micrografías de células en cultivo de pulmón de tritón, se han visualizado los microtúbulos mediante inmunofluorescencia indirecta, mientras que la cromatina se tiñe con un colorante azul fluorescente. Durante la el centrosoma, compuesto por una matriz asociada con un par de centríolos, forma el foco necesario para las series de microtúbulos de la interfase. En la el único centrosoma contiene dos pares de centríolos (no visibles); en la el centrosoma se divide y los dos ásteres resultantes se separan. La envoltura nuclear se rompe en la permitiendo que los microtúbulos del huso interactúen con los cromosomas. En la la estructura bipolar del huso se clarifica y todos los cromosomas se alinean en la mitad del huso. Las parejas de cromosomas hijos, llamados se separan sincrónicamente en la y, bajo la influencia de los microtúbulos, van desplazándose hacia los polos. En la los polos del huso se han desplazado aún más lejos, aumentando la separación de los dos grupos de cromosomas. En la el núcleo hijo se recompone, y en la la citocinesis es casi completa, con el cuerpo medio persistiendo entre las dos células hijas. (Fotografías cortesía de C.L. Rieder, J.C. Waters y R.W. Colé.)
interfase
prometafase,
cromátidas,
Visión de conjunto de la fase M
profase tardía
anafase tardía telofase
profase temprana
metafase
anafase temprana
telofase tardía,
981
1 PROFASE
c e n tro s o m a s s e p a ra d o s q u e fo r m a r á n lo s p o lo s d e l h u s o
c ito p la s m a m e m b r a n a p la s m á tic a
n u c lé o lo e n d is p e r s ió n
c e n trò m e ro c o n c in e to c o r o s u n id o s
e n v o lt u r a n u c le a r in ta c ta
c r o m o s o m a e n c o n d e n s a c ió n c o n d o s c r o m á tid a s u n id a s a l c e n trò m e ro
LA EN VOLTURA NUCLEAR S E ROM PE
2 PROMETAFASE
1 PROFASE
Tal como se ve al microscopio, la transición de la fase G2 a la fase M del ciclo celular no es un proceso estrictamente definido. La cromatina, que en la interfase se halla difusa, se condensa lentamente formando cromosomas bien definidos, cuyo número exacto es característico de la especie en cuestión. Cada cromosoma se ha duplicado durante la fase S precedente y ahora consta de dos cromátidas hermanas, cada una de las cuales contiene una secuencia de DNA específica conocida como un centrómero, necesaria para la correcta segregación del cromosoma. Hacia el final de la profase los microtúbulos citoplasmáticos que forman parte del citoesqueleto interfásico se despolimerizan y empieza a formarse el principal componente del aparato mitótico, el huso mitótico. Se trata de una estructura bipolar compuesta de microtúbulos y proteínas asociadas. Inicialmente, el huso se ensambla fuera del núcleo entre los centrosomas en separación. 2 PROMETAFASE
LO S C R O M O S O M A S S E DESPLAZAN H ASTA LA PLACA M ETA FÀ SICA
3 METAFASE
La prometafase se inicia bruscamente con la desintegración de la envoltura nuclear, que se rompe originando vesículas de membrana indiferenciables de las vesículas del retículo endoplasmático. Estas vesículas permanecerán visibles alrededor del huso durante la mitosis. Los microtúbulos del huso, que hasta este momento se hallaban fuera del núcleo, pueden entrar en la región nuclear. En cada centrómero maduran complejos proteicos especializados, llamados cinetocoros, y se unen a algunos de los microtúbulos del huso, que entonces recibirán el nombre de microtúbulos cinetocóricos. Los microtúbulos remanentes del huso se llaman microtúbulos polares, mientras que los que son exteriores al huso se llaman microtúbulos astrales. Los microtúbulos cinetocóricos ejercen tensión sobre los cromosomas, los cuales, por tanto, se ven sometidos a movimientos agitados.
3 METAFASE
LO S C IN ETO C O RO S H ERM AN OS S E SEPA RA N REPEN TIN AM EN TE AL INICIO DE LA A N AFASE
982
Panel 18-1 Los seis estadios de la división celular.
Finalmente los microtúbulos cinetocóricos alinean los cromosomas en un plano situado a medio camino de los polos del huso. Cada cromosoma se mantiene en tensión en esta placa metafásica por los cinetocoros apareados y por sus microtúbulos asociados, los cuales están unidos a los polos opuestos del huso.
4 ANAFASE
4 ANAFASE lo s m ic r o t ú b u lo s c in e to c ó r ic o s se a c o r ta n a m e d id a q u e la c r o m á tid a ( c r o m o s o m a ) e s a r r a s tr a d a h a c ia e l p o lo s in c r e m e n t o d e la s e p a r a c ió n d e lo s p o lo s d e l h u s o
m ic r o t ú b u lo p o la r a la r g á n d o s e
m ic r o t ú b u lo c in e to c ó r ic o a c o r tá n d o s e
m ic r o t ú b u lo a s tra l
S E VUELVE A FORM AR UNA EN VOLTURA NUCLEAR
Impulsada por una señal específica, la anafase empieza bruscamente cuando los cinetocoros apareados de cada cromosoma se separan, permitiendo que cada cromátida (ahora denominada cromosoma) sea arrastrada lentamente hacia un polo del huso. Todos los cromosomas que se acaban de separar se desplazan a la misma velocidad, que es de aproximadamente 1 |jm por minuto. Se pueden distinguir dos categorías de movimiento. Durante la anafase A, los microtúbulos cinetocóricos se acortan a medida que los cromosomas se aproximan a los polos. Durante la anafase B, los microtúbulos polares se alargan y los dos polos del huso se separan. Normalmente la anafase sólo dura unos minutos.
5 TELOFASE
En la telofase (telos, fin) los cromosomas hijos separados llegan a los polos y los microtúbulos cinetocóricos desaparecen. Los microtúbulos polares se alargan aún más y se vuelve a formar una envoltura nuclear. La cromatina condensada se expande de nuevo, los nucléolos —que habían desaparecido en la profase— empiezan a reaparecer; la mitosis ha llegado a su fin.
EL SU R C O DE LA SEG M EN TACIÓN DIVIDE LA CÉLULA EN D O S
6 CITOCINESIS e n v o lt u r a n u c le a r c o m p le ta q u e r o d e a lo s c r o m o s o m a s en d e s c o n d e n s a c ió n
a n illo c o n t r á c til q u e g e n e ra el s u r c o d e s e g m e n t a c ió n
El citoplasma se divide mediante un proceso conocido como segmentación, que por lo general empieza en algún momento de la anafase. Este ejemplo ilustra cómo ocurre este proceso en células animales. La membrana de la zona central de la célula, perpendicular al eje del huso y situada en medio de los dos núcleos hijos, se desplaza hacia dentro originando el surco de segmentación que gradualmente se vuelve más profundo, hasta que entra en contacto con los estrechos restos del huso mitótico que quedan entre los dos núcleos. Este estrecho puente, o cuerpo medio, puede persistir durante un cierto tiempo antes de estrecharse aún más y llegar a romperse por cada extremo, produciendo así dos células hijas completas y separadas.
983
(A)
O minutos
(B)
15 m inutos
(C)
17 m inutos
Figura 18-9 El proceso de la mitosis en una célula vegetal típica. Estas micrografías de una
Haemanthus
célula viva de (lirio) fueron tomadas a los tiempos indicados, utilizando microscopía de contraste de fases interdiferencial. Habitualmente estas células presentan cromosomas grandes, de manera que son fáciles de ver. Al nivel microscópico mostrado aquí, las principales fases de la división celular hace más de 100 años que se conocen. (A) los cromosomas están condensados y son claramente visibles en el núcleo celular. (B) y (C) la envoltura nuclear se ha roto y los cromosomas están interactuando con microtúbulos que emergen de los dos polos del huso. Las plantas no tienen centríolos, pero los polos de sus husos contienen proteínas relacionadas con las que se encuentran en la matriz centrosómica de las células animales. Nótese que entre los estadios ilustrados por (B) y (C) sólo han transcurrido 2 minutos. (D) los cromosomas se han alineado en la placa metafásica con sus cinetocoros situados a medio camino entre los dos polos del huso. (E) los cromosomas se han separado en sus cromátidas hermanas, las cuales se desplazan hacia polos opuestos. (F) los cromosomas se descondensan formando los dos núcleos que más tarde serán visibles [indicados con N en (G)]. (G) y (H) se muestran dos estadios sucesivos en la formación del el cual aparece como una línea cuya dirección de crecimiento se indica con flechas en (H). (Cortesía de Andrew Bajer.)
Profase:
Prometafase:
(E) 83 minutos
(F)
124 minutos
(G)
169 minutos
(H)
199 minutos
n al de la m itosis, es la cito cin esis. E sto s seis estad ios fo rm an u n a se cu e n cia d i n á m ica cu y a co m p lejid ad y b elleza son difíciles de a p re cia r en d escrip cio n es e s critas o a p artir de un co n ju n to de fotografías estáticas. La d escrip ció n de la división celu lar se b a sa en o b serv acio n es de dos fu en tes: el estu d io de an im ales vivos m e d ia n te el uso del m icro sco p io ó p tico (a m e n u d o co m b in a d o c o n la m icro cin em ato g rafía) y el estu d io de células fijadas y te ñidas ta n to co n el m icro sco p io ó p tico c o m o co n el ele ctró n ico . En el P anel 18-1 se resu m en b rev em e n te los diferentes estad io s de la división celular. Los cin co
-profase, prometafase, metafase, anafase telofase-
estad io s de la m itosis y tien en lu gar en un o rd en se cu e n cia l e stricto , m ien tras que la cito cin esis em p ieza d u ran te la an afase y c o n tin u a h a sta el fin de la fase M (Figura 1 8 -7 ). En las Figuras 1 8-8 y 18-9 se m u estran m icrografías óp ticas de divisiones celu lares de u n a célula an im al típ ica y de u n a célu la vegetal típica, resp ectiv am en te. E xisten in con tab les varian tes de to d o s los estad ios de la división celular, m o strad o s esq u e m á tica m e n te en el Panel 18-1, ta n to en el reino an im al co m o en el vegetal. M en cio n are m o s algu n as de ellas d espu és de que h ay am o s visto m á s de c e rc a los m ecan ism o s gen erales de la división celular.
Los orgánulos citoplasm áticos grandes se fragmentan durante la fase M asegurando que se heredan correctam ente3 Los p ro ceso s de la división celular tienen que aseg u rar que ca d a célula hija h ered a tod os los co m p o n e n te s celulares fu n dam entales. C om o vim os en el Capítulo 12, los orgánulos co m o las m ito co n d rias y los cloroplastos, p or ejem plo, no pueden en sam b larse esp o n tá n e a m e n te a p artir de sus co m p o n en tes individuales; sólo p u ed en form arse m ed ian te el crecim ien to y la fisión del orgánulo correspon d ien te preexistente, de fo rm a que la célula hija no p od rá co n te n e r ninguno a m en o s que h aya h ered ad o u no o m ás de ellos. De la m ism a form a, no es posible h a ce r nuevas cop ias del com p lejo de Golgi y del retículo en d o p lasm ático sin la p resen cia previa de al m en o s p arte de la e stru ctu ra corresp on d ien te. ¿C óm o se segregan los dife ren tes orgánulos adheridos a la m e m b ra n a cu an d o u n a célula eu cario ta superior
984
Capítulo 18: Los mecanismos de la división celular
Metafase:
Anafase:
Telofase:
Citocinesis:
plano celular,
se divide? Los orgánulos que se p resen ten en grandes can tid ad es se h ered arán co n seguridad si, co m o m ed ia, su n ú m ero se duplica en ca d a g en eració n celular. O tros orgánulos, tales c o m o el com p lejo de Golgi y el retículo en d o p lasm ático (ER), se fraccion an d uran te la m itosis en un con ju n to de fragm en tos y de v esícu las m ás p equ eñ os, p ro b ab lem en te p o rq ue en esta form a altam en te vesiculada se p u ed en distribuir de m a n e ra m ás equitativa cu an d o la célula se divida. P arece que las vesículas del ER se aso cian co n los m icrotú b ulos del huso m itótico, lo que p u ed e ayu dar a distribuirlos eq uitativam en te en tre las dos células hijas.
Resumen
Los procesos de la división celular (la fase M del ciclo celular) consisten en divisio nes nucleares (mitosis) seguidas de divisiones citoplasmdticas (citocinesis). La divi sión nuclear se efectúa mediante un huso mitótico compuesto por microtúbulos, que separan los cromosomas, mientras que la división citoplasmdtica se efectúa mediante un anillo contráctil compuesto por filamentos de actina. La mitosis se or ganiza fundamentalmente mediante el áster microtubular que se forma alrededor de cada uno de los dos centrosomas producidos por duplicación de centrosoma. La duplicación del centrosoma comienza durante las fases SyG 2 del ciclo celular, y en el inicio de la fase M los centrosomas duplicados se separan y se desplazan hacia caras opuestas del núcleo, formando los dos polos del huso mitótico. Los grandes orgánulos membranosos, tales como el complejo de Golgi y el retículo endoplasmá tico, se rompen en muchos fragmentos más pequeños durante la fase M, lo que ase gura su distribución equitativa entre las células hijas durante la citocinesis. Mitosis4 La seg reg ació n del c ro m o so m a se lleva a ca b o m ed ian te u n a m aq u in aria c o m pleja que tien e m u ch a s p artes m óviles. E sta m áq u in a, el h uso m itó tico , está co m p u e sta p rin cip alm en te p o r m icro tú b u lo s, que se utilizan ta n to p a ra e m p u jar co m o p a ra arra stra r: sep ara los p olos del h uso tiran do de ellos, y em p u jan d o a los cro m o so m a s los c o n d u ce h a cia los polos. C o m o h em o s visto, el h u so em p ieza a fo rm arse fu era del n ú cleo m ien tras los cro m o so m a s se c o n d e n sa n d u ran te la profase. C uan d o se ro m p e la en voltu ra n u clear, en la p rofase, los m icro tú b u lo s del h uso son c a p a c e s de c a p tu ra r los cro m o so m a s, que finalm en te se alinean en este p u n to m ed io , fo rm an d o la lla m ada (véase P anel 1 8 -1 ). En la an afase las cro m á tid a s h e rm a n as se sep aran b ru sca m e n te y son co n d u cid as a los polos o p u esto s del h uso, m ien tras q ue el alarg am ien to del h u so a u m e n ta la se p a ra ció n en tre los polos. El
placa metafásica
h u so co n tin u a alarg án d o se d u ran te la telofase m ien tras los c ro m o so m a s van lle-
c e n tro s o m a ( p o lo d e l h u s o )
m ic ro tú b u lo s astrales
Figura 18-10 Las tres clases de microtúbulos de un huso mitótico completamente formado. (A) Imagen confocal del huso mitótico en la metafase de un embrión de con sus microtúbulos marcados con fluorescencia. (B) Diagrama esquemático que identifica las tres clases de microtúbulos del huso. En realidad, los cromosomas son mucho más grandes de lo que aquí se muestra, y a cada cinetocoro se unen muchos microtúbulos. (A, cortesía de William Theurkauf.)
Drosophila,
c in e to c o r o
m ic ro tú b u lo s c in e to c ó ric o s
m ic ro tú b u lo s p o la re s
(B)
Mitosis
985
gan d o a los p olos y se liberan de los m icro tú b u lo s del h uso; finalm en te, en to rn o a ellos se, reco n stru y e la en v o ltu ra n u clear. El en sam b laje del h u so , la ca p tu ra de cro m o s o m a s y su alin eació n en la p la c a m etafàsica, y el p o sterio r alarg am ien to del h uso co n el d esp lazam ien to de los c ro m o so m a s a los p olos, d ep en d en c rítica m e n te de u n a serie de p ro ce so s que o cu rre n en o c e r c a de los e x tre m o s de los m icro tú b u lo s: los m icro tú b u lo s n o son ta n sólo el lu gar d o n d e se localiza el en sam b laje y d esen sam b laje de los m ic ro tú bulos sino tam b ién d o n d e se p ro d u ce la fuerza. V erem o s que se p u ed en distin guir tres tipos d e m icro tú b u lo s del h uso: los microtúbulos polares, que se so la p an en la línea m ed ia del h u so y so n los resp o n sab les de e m p u jar a los p olos del h u so ca u sa n d o su se p a ra ció n ; los microtúbulos cinetocóricos, que se ad hieren al esp ecializad o que fo rm a el ce n trò m e ro de c a d a c ro m o s o m a dupli ca d o y c o n d u ce los c ro m o s o m a s en el h uso; y los microtúbulos astrales, que p a rte n en to d as d ire ccio n e s d esd e los c e n tro so m a s y se cre e que co n trib u y en a
cinetocoro
g en erar las fu erzas q ue se p a ra n los p olos y los sitú an en relació n al resto de la célu la (Figura 1 8 -1 0 ). El co m p o rta m ie n to de ca d a u n a de estas clases de m ic ro tú b ulos es distinto d ebido a las d iferentes estru ctu ra s co n las que e n tran en c o n ta c to sus extre m o s y, p o r tan to , a los diferentes p ro ce so s que allí tien en lugar.
La form ación del huso m itótico en una célula en fase M se acom paña de cam bios sorprendentes en las propiedades dinám icas de los m icrotúbulos5
conjunto de microtúbulos interfásicos
El que p arten del ce n tro so m a en tod as di re ccio n e s se halla en un estad o de inestabilidad d in ám ica, en la que los m icro tú bulos se p olim erizan y d espolim erizan sin ce sa r y co n tin u a m e n te se n u clean n uevos m icrotú b u lo s p a ra equilibrar las p érdidas de los que d esa p a re ce n p or co m p leto m ed ian te la d esp olim erización (se tra ta en el C apítulo 16). D u ran te la p rofase tard ía el ritm o de esto s p ro ce so s ca m b ia d ra m á tica m e n te . La vida m ed ia de un m icro tú b u lo co rrie n te d e c re c e ap ro x im a d a m e n te veinte v eces (de 5 m in u tos a tan sólo 15 segu nd os) (Figura 1 8 -1 1 ), y se cre e que esto refleja un au m en to b ru sco de la p robabilidad de que un m icro tú b u lo típico en crecim ien to se c o n vierta en un m icrotú b u lo que se e n co g e, debido a alguna v ariació n en su extrem o “m á s ” (véase pág. 8 6 8 ). Al m ism o tiem p o se p ro d u ce un gran a u m e n to del n ú m e ro de m icro tú b u lo s que p arten del ce n tro so m a , ap a re n te m en te debido a u n a alteració n del prop io ce n tro so m a , a celeran d o el ritm o al que se n u clean m icro tú
in vitro
bulos n uevos: se p u ed e d e m o stra r m ed ian te un cultivo que los c e n tro s o m as p rofásicos p re se n ta n un in cre m e n to n otab le en su ca p a cid a d p a ra n u clear el crecim ien to de m icro tú b u lo s. E stos dos cam b io s son suficientes p a ra exp licar p or qué el inicio de la fase M se ca ra cte riz a p o r u n a ráp id a tran sició n desde u nos cu an to s m icro tú b u lo s largos que se extiend en desde el ce n tro so m a a la periferia celu lar (la fo rm ació n de m icro tú b u lo s interfásicos) h asta u n a gran can tid ad de p eq u eñ os m icro tú b u lo s que ro d ean c a d a ce n tro so m a (los m icrotú b u los astrales). En algu n as células tam b ién p u ed e a c tu a r un te rce r m e ca n ism o : la d e sco m p o si ción de los m icrotú b u lo s in terfásicos p u ed e ser ace le ra d a p o r u n as p ro teín as que los dividen. La b ase m o lecu lar de esto s cam b io s en la d in ám ica de los m icro tú b u los es in cierta, p ero p a re ce p rob ab le que im plique la fosforilación p o r M PF de u n a o m ás p roteín as que in te ra ctú a n co n los m icrotú b ulos. Los m icro tú b u lo s q ue c re c e n y se e n co g e n rá p id a m e n te e m a n a n en to d as d ireccio n e s a p artir los ce n tro s o m a s p ro fásico s. S u b fo rm acio n es de esto s m ic ro tú b u los astrales se estab ilizan se le ctiv a m e n te de d iferentes m o d o s, fo rm an d o así un h u so m itó tico org an izad o .
Las interacciones entre microtúbulos orientados en direcciones opuestas conducen el ensam blaje del huso6 D u ran te la p rofase, m ien tras la en v o ltu ra n u cle a r e stá to d av ía in tacta, p a re ce q ue algu n os de los m icro tú b u lo s que se salen de ca d a ce n tro so m a en tra n en
986
Capítulo 18 : Los mecanismos de la división celular
c_
:o cu
g-jj 100 (D ■Q. CU 3O'o £ £ <5 C D W "O Rf) OO
INIEFFASE
Q)
ti/2 =
'cu 3
5 m in u t o s
C M_
C D^3
O -S Q.
0 t ie m p o ( m in u t o s )
Figura 18-11 En la fase M los microtúbulos son mucho más dinámicos, por término medio, que en la interfase. Se inyecta tubulina, unida de forma covalente a un colorante fluorescente, a células de mamífero mantenidas en cultivo. Después de que la tubulina fluorescente se incorpore a los microtúbulos celulares, se blanquea toda la fluorescencia de una pequeña región mediante un rayo láser intenso. Se estudia la recuperación de la fluorescencia en la región blanqueada de microtúbulos en función del tiempo, la cual se produce por recambio por microtúbulos formados por tubulina fluorescente no blanqueada procedente de la solución. Se cree que el tiempo necesario para que se produzca el 50% de la recuperación de la fluorescencia (ti/2) es igual al tiempo necesario para que la mitad de los microtúbulos de la región se despolimericen y se vuelvan a formar. (Resultados de W.M. Saxton et al.,/. 99:2175-2187,1984, permiso de copyright de The Rockefeller University Press.)
CellBiol.
Figura 18-12 Modelo de cómo se podría formar un huso mitótico bipolar mediante la estabilización selectiva de microtúbulos que interactúan entre sí. Los nuevos microtúbulos crecen hacia afuera, en direcciones aleatorias, a
/
partir de dos centrosomas cercanos. Se hallan anclados a los centrosomas por sus extremos “menos”. Sus extremos “m ás” son “dinámicamente inestables” y pueden pasar de repente de un crecimiento uniforme [flechas rojas orientadas al exterior) a un acortamiento rápido [flechas rojas orientadas hacia el interior durante el cual, a menudo, se despolimeriza todo el microtúbulo. Si dos microtúbulos de centrosomas opuestos interactúan en una zona de solapamiento, las proteínas asociadas a los microtúbulos entrecruzan los microtúbulos [puntos negros), cubriendo sus extremos “m ás” y estabilizándolos, con lo que disminuye la probabilidad de que despolimericen. Existen pruebas de que las proteínas entrecruzadoras son moléculas motoras de microtúbulos orientadas hacia el extremo “m ás”, que tienden a conducir los microtúbulos en dirección de separar los polos del huso.
)
c o n ta c to co n m icro tú b u lo s de polaridad o p u e sta que cre c e n d esd e el o tro ce n tro so m a (Figura 1 8 -1 2 ). Se c re e que en la región en q ue esto s m icro tú b u lo s se solap an , a m ed io ca m in o en tre los d os ce n tro so m a s, se fo rm an en la ce s cru zad o s q ue estab ilizarán los e x tre m o s de esto s im pidiend o así su d esen sam b laje, u n ien d o en tre sí los dos co n ju n to s de o rie n ta ció n o p u e sta y
microtúhulos polares
co n stitu y en d o el a rm a z ó n b ásico del h uso b ip olar ca ra cte rístico . Se cre e q ue las p ro teín as que esta b le ce n en la ce s cru zad o s co n los m icro tú b u lo s p o lares so n m o lécu las m o to ra s de m icro tú b u lo s o rien tad as h a cia el polo positivo, q ue no
microtúbulos astrales
microtúbulos centrosoma polares (polo del huso)
sólo estab ilizan el h u so b ip olar sino que ta m b ié n a c tú a n em p u jan d o los m icro tú b ulos an tip aralelo s en u n a d ire cció n q ue tien d e a se p a ra r e n tre sí los dos p o los. Así p ues, au n q u e los m icro tú b u lo s p olares e stá n estab ilizad os fren te a un d esen sam b laje cata stró fico , no so n estático s; v ere m o s m ás ta rd e que, in clu so en el h uso m etafásico (Figura 1 8 -1 3 ), que d a la a p a rie n cia de estabilidad, los m ic ro tú b ulos p olares ex p e rim e n ta n co n tin u a m e n te la ad ició n n e ta de m o n ó m e ro s en sus e xtrem o s “m á s ” y la p érd id a n e ta en sus e x tre m o s “m e n o s ” en los polos. P ro b ab lem en te los m icro tú b u lo s p o lares se p a ra n los ce n tro so m a s m ien tras se fo rm a el h u so d u ran te la p rofase. M ás ta rd e dirigirán el alarg am ien to del h uso en la an afase. N o o b sta n te , d u ran te los estad io s in term ed io s del alarg am ien to m itó tico del h u so, éste se m a n tie n e co n tro la d o ; m ien tras q ue los m icro tú b u lo s p o lares e m p u jan , m a n te n ie n d o los p o lo s del h u so se p a ra d o s, los m icro tú b u los cin e to có rico s q ue u n en los p olos del h uso a los cro m o so m a s, estiran c o n tra rrestan d o la fu erza de los m icro tú b u lo s p olares, tal co m o v e re m o s a h o ra.
Figura 18-13 Huso mitótico. Huso metafásico aislado, visualizado con tres técnicas de microscopía óptica: (A) microscopía de contraste de fases interferencial, (B) microscopía de contraste de fases, y (C) microscopía de luz polarizada. (Cortesía de E.D. Salmón y R.R. Segall, J.Cell Biol. 86:355-365,1980, con permiso de copyright de The Rockefeller University Press.)
Mitosis
987
Figura 18-14 El centròmero. Electronmicrografía de barrido de un cromosoma mitótico humano, constituido por dos cromátidas hermanas unidas por su plano horizontal. La región constreñida es el centròmero. (Cortesía de Terry D. Alien.)
c ro m o s o m a m e ta fà s ic o
»^ -
CS24¿
i
*
; TU*'
'
SáM i________ ! 1 (jm
c r o m á tid a
Figura 18-15 Microtúbulos cinetocóricos. Dibujo esquemático de
Los crom osom as replicados se unen a los microtúbulos por sus cinetocoros7 Al inicio de la fase M c a d a c ro m o so m a está replicado y se co m p o n e de dos
tidas hermanas
cromá
a tod o lo largo, co n u n a co n stricció n en u n a ú n ica región llam ad a el centròmero, d ond e la cro m a tin a p a re ce e sta r esp ecialm en te co n d en sad a (Figu ra 18-14). D u ran te la p rofase tard ía en ca d a ce n trò m e ro se en sam b lan com plejos de p roteín as esp ecializados co n o cid o s co m o cinetocoros, de form a que los dos ci n eto co ro s de ca d a c ro m o so m a (uno en ca d a cro m á tid a h erm an a), se hallan dis p uestos en d ireccio n es op u estas. A través de sus cin eto co ro s los cro m o so m a s re p licados se u nirán a un subgrupo distinto de m icrotú b ulos del huso m itótico (Figura 18-15). E stos microtúbulos cinetocóricos se utilizarán finalm ente, en la an afase, p ara arrastra r las dos cro m átid as h erm an as h acia los polos op uestos del
un cromosoma metafàsico que muestra sus dos cromátidas hermanas unidas a microtúbulos cinetocóricos. Cada cinetocoro forma una placa en la superficie del centròmero. Los extremos “m ás” de los microtúbulos se unen a los cinetocoros (no se muestra).
h uso. P ero an tes de este estadio, m ien tras las cro m átid as h erm an as todavía están unidas, ya existe u n a ten sió n g en erad a en los m icrotú b ulos cin eto có rico s, sep a ran d o los cro m o so m a s y a ce rca n d o los polos del huso. En la m ayoría de organism os el cin etocoro es un gran com plejo m ultiproteico que se puede observar al m icroscop io electrónico co m o u n a estructura multilamin ar en form a de p laca (Figura 18-16). V erem os que no se trata sim plem ente de una localización pasiva de anclaje p ara los m icrotúbulos, sino que juega un papel central en el con trol del ensam blaje y desensam blaje de los m icrotúbulos cinetocóricos, ge nerando tensión en ellos y, finalm ente, dirigiendo el m ovim iento crom osom ico.
cinetocoro
dirección del I % movimiento do -,1a cromátida
microtúbulos incluidos
«in el cinetocoro
Figura 18-16 El cinetocoro. (A) Un cromosoma metafásico teñido con un fluorocromo de unión al DNA. (B) Un cromosoma metafásico teñido con anticuerpos humanos que reaccionan con proteínas específicas del cinetocoro, mostrando la presencia de dos cinetocoros, cada uno de ellos asociado a una cromátida. (C) Electronmicrografía de una cromátida en anafase con microtúbulos adheridos a su cinetocoro. La mayoría de los cinetocoros tienen una estructura trilaminar; el que se muestra (de un alga verde) tiene una estructura extraordinariamente compleja con capas adicionales. (A y B, cortesía de Bill Brinkley; C, de J.D. Pickett-Heaps y L.C. Fowke, 23:71-92, 1970, reproducido con permiso de CSIRO.)
Aust. J. Biol. Sci.
1 jim 988
Capítulo 18 : Los mecanismos de la división celular
Figura 18-17 Secuencia de DNA de un centròmero característico de la levadura
Saccharomyces cerevisiae.
m ic r o t ù b u lo a la m is m a e s c a la
e le m e n t o c o n s e r v a d o I
ATAAGTCACATGAT TATTCAGTGTACTA
e le m e n to r ic o e n A T II
e le m e n to c o n s e r v a d o III
88 pares de bases (93% AT)
TGATTTCCGAA ACTAAAGGCTT
La secuencia de DNA mostrada es suficiente para originar una segregación cromosomica completa; actúa ensamblando las proteínas del cinetocoro que atraen a un microtùbulo (en ) al cinetocoro.
verde
CENTROIV!H:;¡ I n i i i VAI >1 ü ;A (CF.N3)
~40 n m
de D N A de fo rm a B
En los cromosom as de la levadura los complejos proteicos cinetocóricos se ensam blan siguiendo secuencias específicas de DNA centrom érico8 La in fo rm ació n que d ete rm in a la co n stru cc ió n de un c in e to co ro en u n a lo cali z a ció n esp ecífica de un c ro m o s o m a se halla en la se cu e n c ia de DNA del c e n trò m ero . En las levad u ras de fisión el DNA c e n tro m é ric o p u ed e ser id en tificad o m ed ian te su efecto en la p ro p a g a ció n de p lásm id os que lo co n tie n e n : un plásm ido que co n te n g a DNA ce n tro m é rico se p u ed e h e re d a r de fo rm a estab le en la m itosis y la m eiosis, c o m o si fu era un cro m o s o m a , m ien tras que un p lásm ido q ue ca re z c a de d ich o DNA (y e sté p re se n te en b ajas can tid ad es) se se g reg ará en las célu las hijas d e fo rm a irregu lar y se p e rd e rá al ca b o d e u n as c u a n ta s divisio n es celu lares. (En el C apítulo 7 vim os có m o se h a utilizado esta p ro p ied ad de los c e n tró m e ro s en la c o n s tru c ció n de v e cto re s p a ra DNA clo n ad o .) E x p e rim e n to s g en ético s m o lecu la re s m u e stra n que c a d a u no de los 17 c ro m o so m a s de la leva
S. cerevisiae
d u ra co n tie n e u n a s e cu e n cia c e n tro m é rica d istinta de u n a longitud de u n o s 110 p ares de b ases (Figura 1 8 -1 7 ). A unque c a d a se cu e n c ia es ú n ica, to d as co n tie n e n regio n es h o m o lo g as su stan ciales y p u ed en ser in vertidas o in te r ca m b ia d a s de cro m o s o m a a c ro m o s o m a sin p erd er su fu n ción . Se h an identificado algunas de las proteínas que form an el cin eto co ro de la le vadura p or su cap acid ad de unirse al DNA ce n tro m érico . El elem ento III del c e n tròm ero de levadura (véase Figura 18-17), p o r ejem plo, se une a un com p lejo de tres p roteínas. Se cree que este com p lejo p roteico inicia la fo rm ació n de un cin e to co ro sencillo que se u ne al extrem o de un sólo m icrotùbulo. U n a de las p ro teí n as purificadas que u nen ce n tró m e ro s es un m o to r de m icrotúbulos dirigida h acia el extrem o “m e n o s”, lo cual p arece suficiente p ara propulsar el cin eto co ro de la le v ad u ra a lo largo de su m icrotù b ulo adherido h acia el polo m itótico. Otras p roteí-
(A )
Mitosis
(B)
(C )
Figura 18-18 Tinción inmunofluorescente de cinetocoros en células en cultivo. Las células de marsupial (células PtK) mostradas en (A) y (B) contienen relativamente pocos cromosomas y se encuentran en fase G, en (A), donde existe un cinetocoro teñido por cada cromosoma, y en fase G2 en (B), donde existen dos cinetocoros teñidos por cada cromosoma. Los anticuerpos utilizados para marcar los cinetocoros son los mismos que los utilizados en la Figura 18-16B. En (C) se muestra un tipo diferente de célula, que se encuentra en metafase; los cinetocoros se han teñido con anticuerpos que reaccionan con una proteína del cinetocoro, y el DNA se ha teñido con un colorante (Cortesía de B.R. Brinkley y D. He.)
rojo.
10 |jm
989
ñ as se u n en a otras secu en cias del ce n tro m e ro y estabilizan su in teracció n co n el m icrotù b ulo. Los cen tró m ero s de m am ífero se co m p o n e n de distintas secu en cias de DNA m u ch o m ás largas y form an cin e to co ro s m u ch o m ás grandes que llegan a unir 30 o 4 0 m icrotú b ulos. Se cre e que la m ay o r p arte de la secu en cia repetitiva (el DNA satélite) de los cen tró m e ro s de m am ífero es im prescindible p ara la organización esp ecial de cro m atin a en el ce n trò m e ro . Pero p arece ser q j: existen secuc
’e
DNA, com p ren d id as en este DNA estructural, que u nen com p lejos proteic eidos a los de los ce n tró m e ro s de las levaduras. El h e ch o de que los en ferm os que p a d e ce n ciertos tipos de
escleroderma (una
en ferm ed ad de cau sa d e sco n o cid a que se aso cia co n u n a fibrosis progresiva del tejido conjuntivo de la piel y de o tros órganos) p ro d u zcan an ticu erp os que re a c c io n an esp ecíficam en te co n los cin eto co ro s, h a facilitado el estudio de las proteínas de cin eto co ro de m am ífero. Si utilizam os estos an ticu erp os p a ra m a rca r células en división m ed ian te in m u n oflu orescen cia, se ob serva un p atrón de p un tos fluores cen tes en el que ca d a p u n to in d ica la posición de un cin eto co ro . S orp ren d en te m en te, si se m a rca n células que no están en división se ob tiene un p atró n similar, de form a que el n ù m ero de p un tos p or célula se co rresp o n d e co n el n ú m ero de cro m o so m as, lo cu al sugiere que los p recu rso res de cin eto co ro s se u n en a cad a cen trò m ero incluso en el n ù cleo interfásico (Figura 18-18). Los au to an ticu erp o s de la esclero d erm a tam b ién p erm iten el clonaje de los genes que codifican m u ch as de las p roteín as aso ciad as co n los cin eto co ro s de m am ífero, de m a n e ra que ah o ra estas p roteínas p u ed en fabricarse en grandes can tid ad es m ed ian te las tecnologías del DNA reco m b in an te. Así p ues em p iezan a caracterizarse las in teraccio n es de u nas p roteín as co n otras, co n el DNA y co n los m icrotúbulos.
Los cinetocoros capturan los microtúbulos nucleados en los polos del huso9 D u ran te la profase, m ien tras se form an los m icrotú b ulos p olares y se alarga el huso, e n co n tra m o s m u ch o s m icrotú b u los tod avía en crecim ien to y que se retraen ráp id am en te d esd e el ce n tro s o m a de c a d a polo, c o n sus e x tre m o s “m á s ” exp lo ran d o al azar to d a la célu la. L a p ro fase te rm in a y co m ie n z a la prometafase cu a n d o la ráp id a fosforilación de la lám in a n u cle a r d e se n c a d e n a la d e sco m p o si ció n de la e n v o ltu ra n u cle a r y los m icro tú b u lo s co n sig u en a c c e d e r a los c ro m o so m as. M ed ian te u n p ro ce d im ie n to que se p u ed e c o m p a ra r al de u n p e sca d o r lan zan d o el sedal, u n m icro tú b u lo a la c a z a p a sa a m en u d o lo su ficien tem en te c e rc a de un cin e to c o ro c o m o p a ra ca p tu ra r el cro m o s o m a . En las célu las de tri tó n , en las cu ales se p u ed e o b serv ar la ca p tu ra inicial, p rim ero se o b serv a có m o el cin e to co ro se ad h iere al co sta d o del m icro tú b u lo y en to n ce s se desliza co n r a pid ez a lo largo del m ism o h a c ia el p olo del h uso (Figura 1 8 -1 9 ). P ro b ab lem en te la ad h esió n lateral al m icro tú b u lo y el d eslizam ien to p o sterio r h a cia el polo son d ebidas a la a ctu a c ió n de la d in eín a (tra ta d a en el C apítulo 16), u n a p ro teín a m o to r de m icro tú b u lo s o rie n ta d a h a cia el e x tre m o “m e n o s ”, que se p u ed e lo c a lizar en el cin e to co ro m e d ia n te el m areaje co n a n ticu e rp o s antid in eín a.
990
Capítulo 18 : Los mecanismos de la división celular
Figura 18-19 Captura de cinetocoros por los microtúbulos. El cinetocoro se une a un costado del microtúbulo en crecimiento y se desliza a lo largo del mismo hacia el polo del huso. En las figuras de la izquierda la señala la dirección en que crece el microtúbulo, mientras que la señala la dirección de deslizamiento del cromosoma. En la figura de la derecha se presenta una reconstrucción tridimensional por ordenador de un cromosoma de tritón en prometafase, a partir de varias secciones finas. Este cromosoma ( no ha hecho más que iniciar su desplazamiento hacia el polo del huso tras la unión de su cinetocoro ( ) a un microtúbulo (De C.L. Rieder y S.P. Alexander, 110:81-95,1990, con permiso de copyright de The Rockefeller University Press.)
flecha roja
gris
flecha
azul)
naranja
Biol.
{blanco). J. Cell
Figura 18-20 Experimento que demuestra que los microtúbulos cinetocóricos metafásicos añaden subunidades por su extremo “más” unido al cinetocoro. En este experimento se inyectó tubulina marcada con fluorescencia a una célula viva, en la que acabó incorporándose a los microtúbulos del huso Entonces se introdujo tubulina marcada con rodamina a una célula en metafase, en la que se incorporó a unos microtúbulos cinetocóricos, concretam ente en el extremo “m ás” ( por el que se unen al cinetocoro. También se observa una cierta incorporación en el centrosoma. (Cortesía de G. Borisy.)
(verde).
naranja)
C ad a cin e to co ro ca p tu ra ca d a vez m ás m icrotú b u los, a m ed id a que se desli za h acia el polo del h uso, d o n d e la densid ad de m icro tú b u lo s es m á s alta. D u ran te este p ro ce so las in te ra ccio n e s iniciales de los m icro tú b u lo s q ue se p ro d u cían en los co stad o s se co n v ierten en in te ra ccio n e s en los e xtrem o s, c o n el cin e to co ro ad h erid o al polo “m á s ” de c a d a m icro tú b u lo . Fin alm en te, el c in e to co ro co n trario , situad o en la o tra cro m á tid a h e rm a n a , será c a p tu ra d o p o r el e x trem o libre de un m icro tú b u lo p ro ce d e n te del p olo co n tra rio del h uso, c o lo c a n do a las cro m á tid a s p ara su seg reg ació n y ten san d o el sistem a de m icro tú b u lo s cin e to có rico s. D ichas ten sio n es se d eben a las p ro p ied ad es esp eciales de los aco p lam ien to s en tre m icro tú b u lo s y cin e to co ro s, que v erem o s a co n tin u a ció n .
Los extremos “más” de los microtúbulos cinetocóricos pueden añadir y perder subunidades de tubulina mientras están adheridos al cinetocoro10 C om o los m icro tú b u lo s p o lares, que d esp u és de e sta b le ce r los co n e x io n e s c ru zad as en el e cu a d o r del h u so co n tin ú a n añ ad ien d o su bu n id ad es a u no de sus extrem o s y p erd ién d olas en el o tro , los m icro tú b u lo s cin e to có rico s tam b ién m a n tie n e n un estad o de flujo d in ám ico . Si se in y ecta tu b ulin a m a rc a d a q u ím i c a m e n te en célu las m itó ticas d u ran te la m etafase, se o b serv a que se in co rp o ra co n tin u a m e n te a d ich os m icro tú b u lo s c e rc a de su p u n to de u nión al cin e to co ro (Figura 1 8 -2 0 ). V erem os b rev em en te que d u ran te la an afase o cu rre la re a cció n inversa, y q ue se p ierd en m o lécu las de tu b ulin a de esto s m icro tú b u lo s c in e to c ó rico s a m ed id a que se d esplaza h a cia el polo del huso. E ste h e ch o h a c e n e ce sa rio q ue ta n to la ad ició n c o m o la p érd id a de m o lécu las de tubulina se p ro d u z ca m ien tras el cin e to c o ro co n se rv a u n a u nión m e cá n ic a fírm e co n los m icro tú b u los. D icha u nión co n tin u a rá siem p re bajo p resión , tan to si las m o lécu las de tu b ulina se añ ad en c o m o si se p ierd en . Así p ues, p a re ce que el c in e to co ro a c tú a co m o un co llar co rred izo , que m a n tie n e u n a a so ciació n lateral co n las su b u n i d ad es de tu bulina p o lim erizad a c e rc a del e x tre m o del m icro tú b u lo m ien tras p erm ite la ad ició n o la p érd id a de m o lécu las de tu b ulin a en d ich o e x tre m o (v éa se Figu ra 1 8 -2 8 , m ás ad elan te). C uan d o se añ a d e n m o lécu las de tubulina, el c o llar se m an tien e en el ex tre m o del m icro tú b u lo d eslizán d ose h a cia atrás; si se pierd en d ich as m o lécu las el collar se m a n tie n e en el e x tre m o d esp lazán d o se h a cia ad elan te.
Los polos del huso repelen los cromosomas11 M ien tras que los m icro tú b u lo s cin e to có rico s tien d en a em p u jar a los c ro m o s o m as h acia el polo, o tra fu erza m ás m isterio sa a c tú a en d ire cció n co n tra ria , re ch azan d o cu alq u ier ob jeto gran d e que se a ce rq u e d em asiad o a los polos. E sto se
Mitosis
991
p u ed e o b serv ar si m ed ia n te m icro ciru g ía se liberan los b razo s de u n cro m o so m a del cin e to co ro . M ien tras que el c in e to co ro se dirige al polo m ás c e rc a n o , sus b razo s tien d en a sep a ra rse de él (Figura 1 8 -2 1 ). El origen de e sta “fu erza de e x clu sión astral”, o “vien to p o la r”, es d e sco n o cid o . P u ed e ser resu ltado de la p re sión de los extrem o s en c re cim ie n to de los m icro tú b u lo s libres que se n u clean sin p a ra r en el p olo; p o r o tra p arte, los b razo s liberados del c ro m o so m a p u ed en
CORTE CON LASER
ad h erirse a m o to re s de m icro tú b u lo s o rien tad o s h a c ia el polo “m á s ” y m ig rar a lo largo de d ich os m icro tú b u lo s; ta m b ié n es posible que o tro s c o m p o n e n te s c e lulares p u ed en d esp lazarse de e ste m o d o a rra stra n d o co n sig o los b razo s del c r o m o so m a . Se co n sid e ra que la fu erza de exclu sión astral ju eg a u n p apel im p o r ta n te en la alin eació n de los cro m o s o m a s en el e c u a d o r del h uso d u ran te la m etafase, h e ch o que tra ta re m o s a co n tin u a ció n . LOS BRAZOS CORTADOS SE SEPARAN DEL POLO
Las cromátidas hijas se unen a polos opuestos del huso m edianté sus cinetocoros12 L ajexp resión ú ltim a de la in te ra cció n en tre los c in e to co ro s y los m icro tú b u lo s es lá seg reg ació n p re cisa de las dos cro m á tid a s hijas de c a d a p ar de c ro m o so m a s a lad os o p u esto s de la célula. E sto req u iere que los c in e to co ro s h e rm a n o s se a d h ieran a los m icro tú b u lo s que p ro c e d a n de p olos o p u esto s; si am b o s c in e to c o ros h e rm a n o s se d esp lazaran h a cia el m ism o polo la división celu lar resu ltan te p ro d u ciría dos célu las d efectu o sas, a u n a le faltaría un c ro m o s o m a y la o tra te n dría u n a co p ia extra. La m a y o r p a rte de la co m p lejid ad de la m itosis rad ica en este req u erim ien to p a ra u n a seg reg ació n ap ro p iad a, y el e rro r m itó tico m ás c o m ú n es que am b as cro m á tid a s h e rm a n a s te rm in e n en u n a de las dos células h i jas. Tal erro r p u ed e p ro d u cirse si un c ro m o s o m a rep licad o n o p u ed e unirse al h u so, si sólo se u n e u n a m itad del h uso o si las d os cro m á tid a s h e rm a n a s no p u ed en sep ararse d u ra n te la an afase. D ebido a q ue los cin e to c o ro s o cu p a n p o sicio n es o p u estas, su te n d e n c ia n a tu ral será u nirse a p olos o p u esto s, p ero esto n o o cu rre siem p re. A co m ie n z o s de la p ro m etafase los d os cin e to c o ro s hijos de un c ro m o s o m a p u ed en ad herirse al m ism o p olo del h u so . T an to é sta c o m o o tras co n fig u racio n es in co rre cta s, que im p ed irían q ue el c ro m o s o m a se seg reg ara de m a n e ra a d e cu a d a si d ich as co n fi g u racio n es se m an tu v ieran , se co rrig en casi siem p re. P a re ce que el equilibrio m ás estab le se p ro d u ce si c a d a cin e to co ro hijo se u n e a un sólo polo distinto. El p o rq u é de esto lo su giere u n ex p e rim e n to d iseñ ad o p a ra averiguar c ó m o se u n en los cro m o so m a s al huso. Se utilizan u n as agujas de cristal e x tre m a d a m e n te finas p a ra in y ectar y d e s p lazar los cro m o so m a s d en tro de u n a célu la viva, en este ca so u n e sp e rm a to cito d e sa lta m o n te s en m eiosis, cu y a m e m b ra n a es so rp re n d e n te m e n te flexible y p erm ite su m an ip u lació n . M ed ian te la m icro m a n ip u la ció n de los c ro m o so m a s d u ran te la p ro m eta fa se , es p osible obligar a los dos c in e to co ro s de un m ism o cro m o s o m a a q ue se u n a n en el m ism o p olo del h uso. E sta situ ació n no es d e m asiad o estab le, p ero si m e d ia n te la agu ja se m a n tie n e n los m icro tú b u lo s cin eto có rico s bajo ten sió n tiran d o su a v e m e n te del c ro m o so m a en la d irecció n o p u e sta al p olo en que se e n c u e n tra n u nidos sus cin e to co ro s, se estab ilizará y a g u a n ta rá h a sta la an afase. P o r lo ta n to los m icro tú b u lo s c in e to có rico s se esta b i lizan m ed ian te ten sió n y n o rm a lm e n te sólo los cro m o s o m a s unidos a po los del h u so se u n irán de fo rm a estab le al h uso.
ambos
Fuerzas bipolares equilibradas m antienen a los cromosomas en la placa m etafásica13 D u ran te la m etafase se p u ed e o b serv ar que los cro m o s o m a s se d esp lazan d e so r d e n a d a m e n te p rim ero en u n a d ire cció n y d esp u és en la o tra, an tes de alinearse a u n a d istan cia eq u id istan te de los dos p olos del h u so fo rm an d o la lo cu al señ ala el inicio de la m e ta fa s e . P ero , ¿qué es lo que les co n d u ce a esta p o sició n p recisa? Si se e jerce u n a p resió n co n s ta n te h a cia los dos p olos del
placa meta-
fásica, 992
Capítulo 18: Los mecanismos de la división celular
Figura 18-21 Demostración de la fuerza de exclusión astral. En este experimento, se cortan por la mitad con un rayo láser unos cromosomas en prometafase que se encuentran unidos temporalmente a un solo polo mediante microtúbulos cinetocóricos. La mitad que se libera del cinetocoro se ve separada rápidamente del polo, mientras que la mitad que permanece unida al cinetocoro se desplaza hacia el polo, reflejando menos repulsión.
(A ) "E S T IR A R "
la fu e r z a d e a tr a c c ió n e s p r o p o r c io n a l a la lo n g it u d d e lo s m ic r o t ú b u lo s c in e to c ó r ic o s
(B) " E M P U J A R "
h u so m ed ian te dos fuerzas iguales so sten id as y o p u estas, los cro m o s o m a s p u e den m a n te n e rse equilibrados en cu alq u ier p o sició n a lo largo del eje del h uso. T iene q ue existir algu n a fo rm a de v ariació n en la p resión ejercid a p o r las fuerzas segú n las d istan cias a los p olos del h u so , de m a n e ra que si algún c ro m o s o m a se d esp laza fu era del p lan o ecu ato rial sufra u n a fuerza n e ta que lo obligue a volver a d ich o plan o. U n a de las h ip ótesis sugiere que la fu erza ejercid a p o r el m icro tú b u lo cin e to có rico a u m e n ta a m ed id a q ue el m icro tú b u lo se alarga; e n to n ce s la fu erza n eta ejercid a so b re ca d a c ro m o s o m a se dirigirá h a cia el polo que esté situad o m ás le jos, y su fu erza n e ta se rá igual a ce ro sólo cu a n d o el c ro m o s o m a se m a n te n g a eq u id istan te d e am b o s p olos (Figura 18-22A ). U n p osible m e ca n ism o q ue p u ed a g en erar u n a fu erza p ro p o rcio n al a la longitud del m icro tú b u lo sería d isp o n er de m o to re s m icro tu b u lares o rien tad o s h a cia el e x tre m o “m á s ” inm ovilizados en u n a m atriz a so cia d a co n el h u so : cu a n to m á s largo sea el m icro tú b u lo , m á s m o to res se ju n tarán , h acien d o re tro ce d e r al m icro tú b u lo h a cia su polo del h uso. El co m p o n e n te d ep en d ien te de la p o sició n , de la fu erza ejercid a sob re el c ro m o s o m a sería su p lem en taria a la fuerza d esarrollad a m e d ia n te la activid ad de las p ro teín as m o to ra s del p rop io c in e to co ro .
la fu e r z a d e e x c lu s ió n a s tra l d is m in u y e c o n la d is ta n c ia al p o lo
Figura 18-22 Dos hipótesis sobre cómo se alinean los cromosomas en la placa metafásica. En ambos casos los cromosomas entran aleatoriamente en el huso durante la prometafase. En (A) los cromosomas se alinean finalmente en el ecuador (la placa metafásica) porque la fuerza de de cada cinetocoro aumenta a medida que cada cinetocoro se aleja del polo. En (B) los cromosomas terminan en el ecuador ya que las fuerzas de exclusión astral los hasta allí. En ambos casos los cromosomas se mantienen bajo tensión en el ecuador debido a un equilibrio de fuerzas.
atracción
empujan
O tra h ip ótesis (Figura 1 8-22B ) p ro p o n e que la fu erza astral de exclu sió n es la resp o n sab le de m a n te n e r el cro m o so m a ce n tra d o , em p u ján d o lo lejos del polo del h u so c o n u n a fu erza ta n to m a y o r cu a n to m ás c e rc a se halle (tal co m o se e s p eraría, p o r ejem plo, si la fu erza se d eb iera a m icro tú b u lo s libres que c re cie ra n en el exterior del p o lo ). De e sta fo rm a tam b ién se a lcan zaría u n equilibrio so la m e n te cu an d o el cro m o s o m a estu viera eq u idistan te de am b o s polos. Las d os h i p ótesis n o se exclu yen m u tu a m e n te , y es posible que en algunos p olos p u ed an a ctu a r am b o s y /o algún o tro m e ca n ism o . Las fuerzas que llevan a los cro m o so m a s a la p laca m etafásica siguen a ctu a n do d uran te la m etafase, y se pued e observar a los cro m o so m a s oscilando adelante y atrás, ajustando sus posicion es co n tin u am en te. Si m ed ian te un rayo láser co rta m o s las uniones de u n p ar de cin eto co ro s durante la m etafase, tod o el c ro m o so m a se d esplaza in m ed iatam en te h a cia el polo al que se m an tien e unido. Igualm ente, si seccio n am o s la u nión en tre las dos crom átid as, am b as se sep ararán y se despla zarán a polos op uestos del huso, tal co m o h a ce n en la anafase. De este m o d o las fuerzas que em p u jan las crom átid as h acia el polo d urante la an afase no em p iezan a actu a r de form a rep en tin a d urante la transición de la anfase a la m etafase sino que se h acen p resen tes en cu an to los m icrotú b ulos se u nen a los cin eto co ro s.
Los microtúbulos son dinámicos en el huso m etafásico14 El h u so m etafásico es un en sam b laje co m p lejo y b on ito, su sp end id o en u n e s ta do de equilibrio d in ám ico que ya está d eb id am en te ten sad o p a ra los su ceso s
Mitosis
99 3
Figura 18-23 El comportamiento dinámico de los microtübulos en el huso metafásico se estudia mediante la fotoactivación de la fluorescencia. A un
hüso metafásico formado in vitro a partir de un extracto de huevos de Xenopus, se le incorporan tres marcadores fluorescentes: tubulina marcada con rodamina {roja) para marcar todos los microtübulos, un colorante azul
que se une a DNA y m arca los cromosomas, y una tubulina marcada con fluorescencia empaquetada, que también se incorpora a todos los microtübulos pero que permanece invisible (porque no es fluorescente) hasta que se activa con luz ultravioleta. En (A) se observa la distribución de los cromosomas y de los microtübulos en el huso. En (B) se utiliza un haz de luz ultravioleta para visualizar la tubulina fluorescente empaquetada, localizada principalmente en la banda izquierda de la placa metafásica. Durante los minutos siguientes (tras 1 1/2 minutos en C, y tras 2 1/2 minutos en D) se observa cómo la señal de la tubulina fluorescente desempaquetada se desplaza hacia el polo izquierdo del huso, lo cual indica que la tubulina se desplaza continuamente hacia el polo aunque el huso (visible en gracias a la tubulina marcada con rodamina fluorescente) permanezca inalterado durante largos períodos. La señal de la fluorescencia empaquetada también disminuye de intensidad, lo cual indica que los microtübulos individuales se despolimerizan y se substituyen sin parar. (De K.E. Sawin y T.J. Mitchison, /. 12:941-954,1991, permiso de copyright de The Rockefeller University Press.)
(A)
J
rojo
Cell Biol.l
que em p ezarán en la anafase. T odos los m icrotü b ulos del huso, p ese a su ap aren te estabilidad, están in tercam b ian d o co n tin u a m e n te subunidades c o n el acervo de tubulina soluble libre: un tratam ien to co n colch icina, que bloq uea el en sam b laje de la tu b u lin a en los m icro tü b u lo s, p ro v o ca q ue to d o el h u so se d e sco m p o n g a ráp id am en te. El co m p o rta m ie n to d in ám ico de los m icro tü b u lo s p olares y cin eto c ó ric o s se h a estu d iad o d ire cta m e n te p erm itien d o que los m icro tü b u lo s in c o r p o ren tu b u lin a q ue se h a co n ju g ad o co v a le n te m e n te a flu o resceín a “e m p a q u e
10 |jm
ta d a ” fotoactivab le (véase pág. 197). Si d ich o s m icro tü b u lo s del h uso m etafásico se m a rc a n c o n u n a franja flu o re sce n te (m ed ian te su exp o sició n a rayos láser), se o b serv a que los m icro tü b u lo s m a rc a d o s se d esp lazan co n tin u a m e n te h a c ia el p olo (Figura 1 8 -2 3 ). E ste ex p e rim e n to d e m u e stra que ta n to en los m icro tü b u lo s p olares co m o en los cin e to c ó ric o s las su bu n id ad es de tu b ulin a se d esplazan co n tin u a m e n te h a c ia los p olos - u n p ro ce so q ue c o n o ce m o s co m o (Figura 1 8 -2 4 , y v éase pág. 8 8 4 ). Las m a rc a s se h a ce n m ás débiles co n el tiem p o , lo cu al in d ica q ue m u ch o s m icro tü b u lo s individuales se d espolim erizan
intercambio
rotatorio
medio
:o
Figura 18-24 Diagrama simplificado del huso mitótico en la metafase. El huso está formado por dos medios husos cada uno de los cuales está compuesto por microtübulos polares, microtübulos cinetocóricos y microtübulos astrales. La polaridad de los microtübulos se indica mediante las puntas de las flechas, que señalan hacia el extremo “más”. Los microtübulos polares que parten de polos opuestos del huso se solapan en una región en la que las proteínas asociadas a microtübulos pueden entrecruzarse con ellos. Nótese la colocación antiparalela de los microtübulos en la zona de solapamiento.
{verde y naranja),
gris),
se d e s e n s a m b la n
p o lim e r iz a n a q u í
e n lo s p o lo s
994
Capítulo 18: Los mecanismos de la división celular
e x tre m o " m á s "
e x tre m o " m e n o s "
d e l m ic r o t ú b u lo
d e l m ic r o t ú b u lo
{sombreada en
METAFASE
s u s tr a c c ió n e n el p o lo
Figura 18-25 Comportamiento de los microtúbulos cinetocóricos en la metafase y en la anafase. (A) Durante
ANAFASE
s u s tr a c c ió n le n ta r á p id a s u s tr a c c ió n e n el p o lo e n el c in e to c o r o s u b u n id a d e s £> A O m a rc a d a s
a d ic ió n e n el c in e to c o r o
i :tt \ V
1
u n a lo n g it u d c o n s ta n te
3 4
5 6
7
8
9 10 11 12
el m ic r o t ù b u lo c in e to c ó r ic o se a c o r ta d e b id o a la d e s p o lim e r iz a c ió n en
el m ic r o t ù b u lo c in e to c ó r ic o m a n tie n e (A )
2
(B
a m b o s e x tre m o s
p or co m p leto y son reem p lazad o s. D ebido a que los m icro tú b u lo s p o lares y cin e to có rico s del h uso m etafásico m a n tie n e n el m ism o ta m a ñ o , tien e que existir
la metafase, se añaden subunidades al extremo “m ás” del microtúbulo, en el cinetocoro, y se eliminan del extremo “menos”, en el polo del huso. Así se produce un flujo constante de subunidades de tubulina hacia el polo, al mismo tiempo que los microtúbulos mantienen una longitud constante y permanecen bajo tensión. (B) En la anafase la cromátida se libera de la unión de su cromátida hermana en la placa metafásica y el cinetocoro se desplaza rápidamente microtúbulo arriba, desplazando en su camino subunidades de su extremo “m ás”. Por lo tanto, la cromátida unida es transportada hacia el polo del huso. Parte del movimiento de la cromátida se debe a la pérdida simultánea de subunidades del extremo “menos” de los microtúbulos en el polo.
un equilibrio p erfecto en tre la ap o rta ció n de su bu n id ad es de tu bulina en los p o los “m á s ” en el e cu a d o r del h uso y la p érd id a de su bu n id ad es de tu b ulin a en los extrem o s “m e n o s ” u nidos a los p olos (Figura 18-25A ). El d esp lazam ien to co n tin u o de las su bu n id ad es de tu b ulin a h a cia los polos del h u so m etafásico tien e p rofu n das im p licacio n es en la co n stru cc ió n del h uso. Se cree que m u ch o s de los e n laces existen tes en tre los m icro tú b u lo s p o lares del h u so, y en tre los m icro tú b u lo s y o tras e stru ctu ra s tales c o m o los cin e to co ro s y los ce n tro so m a s, son p ro d u cid o s p o r p ro teín as m o to ra s de m icro tú b u lo s. D ebi do a que las p ro teín as m o to ra s se a so cia n y d iso cian del m icro tú b u lo c o n tin u a m e n te m ien tras av an zan p o r su ciclo catalítico , su d iseño es ideal p a ra co n tin u a r unidas sob re m icro tú b u lo s cu yas su bu n id ad es no d ejan de d esp lazarse. P u ed en m a n te n e r u n a ten sió n inclu so si el m icro tú b u lo se está alargan d o, m e d ia n te la ad ición de su bu n id ad es, e igu alm en te p u ed en m a n te n e r u n a co m p re sió n c u a n do el m icro tú b u lo se e n co g e debido a la p érd id a de su bu n id ad es.
Las cromátidas herm anas se separan repentinam ente en la anafase15 C o m o vim os en el C apítulo 17, la anafase se d e se n c a d e n a debido a la d e g ra d a ción de la ciclin a y la co n sig u ien te in activ ació n del M PF. Ello co n d u c e b ru s c a m e n te a la división sin cró n ica de c a d a c ro m o so m a en sus cro m á tid a s h erm an as,
<
,
Figura 18-26 Separación de las cromátidas en la anafase. Durante la transición de la metafase (A) a la anafase (B), los microtúbulos del huso separan las cromátidas hermanas -com o se observa en estas células de endosperma de (lirio) teñidas con anticuerpos contra tubulina marcados con oro. (Cortesía de Andrew Bajer.)
Haemanthus
'* 4 ¿ J í f
í
?
' í p
*
î t ú
r
r W
«
Mitosis
2 0 iim
M
i I
T
ÍA )
l
Ww •
11
V
\
S
i
f T
m
995
ca d a u n a de ellas co n un cin e to c o ro . La se p a ra ció n de las cro m á tid a s h e rm a n a s las libera de la fijación que las m a n tie n e en la p la ca m etafásica, y los cin e to co ro s p u ed en e m p e z a r a d esp lazarse h a cia el polo del h u so al que se ad h erirán m e d ian te su s m icro tú b u lo s cin e to có ric o s (Figura 1 8 -2 5 B ). Se cre e que las c ro m á ti das se m a n tie n e n u n id as a lo largo de su lon gitud m e d ia n te p ro teín as c ro m o só m icas que se alteran b ru s c a m e n te de algu n a m a n e ra al co m ie n z o de la an afase, p erm itien d o q ue las cro m á tid a s se se p a re n e in icien su tra y e cto h a cia los polos (Figura 1 8 -2 6 ).
La anafase se retrasa hasta que los todos los cromosomas se posicionan en la placa m etafásica16 La m etafase o cu p a u n a p arte im p o rtan te del períod o m itótico (véase Figura 18-7), en p arte p orq u e las células se d etien en en ella h asta que tod os sus c ro m o so m a s se alin ean de fo rm a a d e c u a d a en la p la ca m etafásica. Si el h uso m itó tico e stá d e s en sam b lad o debido a un tra ta m ie n to c o n co lch icin a, las célu las se d etien en en la m etafase d u ran te h o ra s o días. (Este m é to d o de d ete n ció n del ciclo celu lar se utiliza n o rm a lm e n te p a ra re co g e r g ran d es can tid ad es de célu las en m itosis, lo cu al p erm ite an alizar sus c ro m o s o m a s co n d e n sa d o s.) M ien tras el h uso se halle d esen sam b lad o debido a este tra ta m ie n to , tam b ién se b lo q u ea la in activ ació n del M PF, q ue h ab itu a lm e n te señ aliza la tra n sició n de la m etafase a la an afase. P a re ce q ue cu alq u ier cin e to c o ro q ue no e sté u nido a los m icro tú b u lo s g en era u n a señ al difusible q ue de algu n a m a n e ra estab iliza el M PF, lo cu al n o rm a lm e n te g aran tiza q ue to d o s los c ro m o so m a s e sté n alin ead o s a n tes de que se au to rice la p ro g resió n a la an afase. P o r lo ta n to se e sp era que al d e sm o n ta r el h uso m e d ian te d ro gas se p ro v o q u e u n a señ al fu erte que p ro lo n g u e la m etafase de m a n e ra n otab le.
Dos procesos diferentes separan las cromátidas en la anafase17 C u an d o ca d a c ro m o s o m a se h a dividido c o m o resp u e sta a la p u e sta en m a rc h a de la an afase, sus d os cro m á tid a s se d esp lazan a p olos o p u esto s del h uso, d ond e se en sam b lan d en tro del n ú cleo de u n a n u ev a célula. Su d esp lazam ien to es c o n se cu e n cia de d os p ro c e so s in d ep en d ien tes re la cio n a d o s co n el h uso. El p rim ero , al que se d e n o m in a anafase A, co n siste en el d esp lazam ien to de las cro m á tid a s h a cia el p olo, a c o m p a ñ a d o del a co rta m ie n to de los m icro tú b u lo s cin e to có rico s (véase Fig u ra 1 8 -2 5 B ). El seg u n d o , al que se d e n o m in a anafase B, co n siste en la s e p a ra ció n de los p olos, a c o m p a ñ a d o de la e lo n g ació n de los m icro tú b u lo s p o la res (Figura 1 8 -2 7 ). A n te rio rm e n te esto s d os p ro ce so s se distinguían m ed ian te sus d istintas sen sib ilidad es a los tra ta m ie n to s c o n drogas, p ero a h o ra e stá claro q ue se d eb en a m e c a n ism o s d istintos. L as co n trib u cio n e s relativas de la an afase A y la an afase B a la s e p a ra ció n fi n al de los c ro m o so m a s varía co n sid e ra b le m e n te segú n el o rg an ism o . En las c é lulas de m am ífero la an afase B co m ie n z a p o co d espu és de que las cro m á tid a s h ay an in iciado su viaje h a c ia los p olos y se d etien e cu a n d o el h uso tiene un ta m a ñ o de c e r c a 1 ,5 -2 v e ce s su lon gitud m eta fá sica . E n o tras células, tales c o m o las levad u ras y algu n os p ro to z o o s, p re d o m in a la an afase B y el h u so se alarga h a sta 15 v eces su lon gitud m etafásica.
El desensam blaje de los microtúbulos cinetocóricos se produce durante la anafase A18 U n a fu erza so rp re n d e n te m e n te p o te n te a c tú a so b re los cro m o s o m a s m ien tras se d esp lazan d esd e la p la ca m e ta fá sica h a sta el p olo del h u so . M ed icion es e fe c tu ad as calcu lan d o la d esviación de u n as agujas de cristal delgad as d an u nas esti m as de 10-5 dinas p o r cro m o so m a , u n a fu erza 10 0 0 0 v eces m a y o r de la que n e cesitan los cro m o s o m a s p a ra d esp lazarse a su velocidad habitu al p o r el cito p lasm a. O b viam ente, se n e ce sita n u n o s m o to re s m u y p o d ero so s p a ra d es-
996
Capítulo 18: Los mecanismos de la división celular
ANAFASE A
a c o r t a m ie n t o d e lo s m ic r o tú b u lo s ; d e s p la z a m ie n to d e la s c r o m á tid a s h a c ia lo s p o lo s ; fu e r z a s g e n e ra d a s e n lo s c in e to c o r o s
ANAFASE B
u n a fu e r z a d e s liz a n te (1) se g e n e ra e n tr e lo s m ic r o t ú b u lo s p o la r e s d e p o lo s o p u e s to s , e m p u já n d o lo s y s e p a r á n d o lo s ; u n a fu e r z a d e a tr a c c ió n (2) a c tú a d ir e c t a m e n t e e n lo s p o lo s , s e p a r á n d o lo s
m ic r o t ú b u lo s p o la r e s
p lazar a los cro m o so m a s, y la velocidad de d esp lazam ien to de los cro m o so m a s d eb e de esta r lim itad a p o r algo m á s que p o r la viscosidad . C o m o h e m o s d iscu ti do an terio rm en te, los m ism o s m o to re s p u ed en g en erar la ten sió n sob re los c r o m o so m a s en la p la ca m etafásica. M ien tras ca d a c ro m o s o m a se d esp laza h a cia el polo, sus m icro tú b u lo s cin eto có rico s se d esp olim erizan , de m o d o que en la telofase casi ya h an d e sa p a re ci do. La p érd id a de su bu n id ad es se p u ed e d e te rm in a r m a rca n d o los m icro tú b u lo s c in e to có rico s m ed ia n te su bu n id ad es de tu b ulin a flu o rescen te y rayos láser, c o m o h e m o s d escrita an tes. En e xp erim en to s de este tipo se p u ed e o b serv ar que los m icro tú b u lo s cin e to có rico s se d esp olim erizan p o r am b o s e xtrem o s d u ran te la an afase, y que la m a y o r p a rte de la d esp o lim erizació n se p ro d u ce en los c in e to co ro s, d on d e se h ab ían p olim erizad o p rev iam en te. En u n a célu la de tritó n en cultivo, p o r ejem plo, el m o v im ien to en la an afase A su ced e a u n a v elo cid ad de 2 m ieras p o r m in u to , lo que equivale a u n a d esp o lim erizació n de m icro tú b u lo s de 5 0 su b u n id ad es p o r segu nd o. El 6 0 -8 0 % de esta d esp o lim erizació n tien e lugar en los cin e to co ro s, y el resto en los polos, a la m ism a velocidad que o b serv am o s en la an afase (véase Figu ra 1 8 -2 5 ). El h e ch o de que el cin e to co ro es el lugar p rin ci pal de d esp olim erizació n de m icro tú b u lo s sugiere que al m ism o tiem p o es el lu gar p rin cip al d o n d e se g e n e ra la fu erza que d esp laza los cro m o so m a s. Sin em b arg o , el m e ca n ism o p o r el que se d esp laza el c in e to co ro , y p o r lo ta n to el cro m o so m a , h a cia el polo del h u so d u ran te la an fase A, es d e sco n o cid o . E n la Figu ra 1 8 -2 8 se m u e stra n e sq u e m á tica m e n te dos m o d elo s posibles. En el p rim ero, u n a p ro te ín a m o to r de m icro tú b u lo s o rie n ta d a h a cia el e x tre m o “m e n o s ” en el cin e to co ro hidroliza ATP p a ra d esplazarse a lo largo de su m icro tú b u lo unido, y a m ed id a que q u ed a al d escu b ierto , el e xtrem o “m á s ” del m icro tú b u lo se va d esp olim erizan d o. En el segu nd o m o d elo de d esp o lim erizació n de
Figura 18-27 Los dos procesos que separan las cromátidas hermanas en la anafase. En la las
anafase A arrastradas
cromátidas son hacia polos opuestos por fuerzas asociadas al acortamiento de sus microtúbulos cinetocóricos. Se cree que la fuerza que conduce este movimiento se genera principalmente en el cinetocoro. En la los dos polos del huso se separan. Parece ser que las fuerzas que conducen la anafase B son similares a las que provocan la división y separación del centrosoma en los dos polos del huso en la profase (véase Figura 18-5). Existen evidencias de que dos fuerzas diferentes son las responsables de la anafase B: por un lado la elongación y el deslizamiento de los microtúbulos polares, uno sobre otro, los dos polos; por otro lado, unas fuerzas exteriores ejercidas por los microtúbulos astrales en cada polo del huso los pol.os hacia la superficie celular, alejándolos el uno del otro.
anafase B
separa
atraen
m icro tú b u lo s el cin e to co ro se d esp laza p asiv am en te ya que el c in e to co ro p e r m a n e c e u nido al extrem o del m icro tú b u lo m ien tras éste se d espolim eriza. El r e cie n te d escu b rim ien to de p ro teín as m o to ra s o rien tad as h a cia el polo n egativo h a p ro v o ca d a u n a co rrien te de op in ión en favor del p rim er m o d elo , au n q u e es m u y p ro b ab le que la d esp o lim erizació n co n trib u y a al d esp lazam ien to , quizá a c tu an d o c o m o un “d ire cto r” que lim ita la velocidad de m ig ració n h a cia los polos.
Mitosis
997
d ir e c c ió n d e l d e s p la z a m ie n to d e lo s c r o m o s o m a s
d ir e c c ió n d e l d e s p la z a m ie n to d e lo s c r o m o s o m a s
p r o t e in a c o n a lta a f in id a d p o r la t u b u lin a p o lim e r iz a d a
p r o t e ín a m o to r a d e lo s m ic r o t ú b u lo s d ir ig id a por ATP
m ic r o t ù b u lo c in e to c ó r ic o
m ic r o t ù b u lo c in e to c ó r ic o
(A )
c in e to c o r o
c in e to c o r o
c ro m o s o m a
c ro m o s o m a
el d e s p la z a m ie n to d e lo s c r o m o s o m a s im p u ls a d o p o r e l A T P c o n t r o la el d e s e n s a m b la je d e lo s m ic r o t ú b u lo s
(B)
e l d e s e n s a m b la je d e lo s m ic r o t ú b u lo s im p u ls a e l d e s p la z a m ie n to d e lo s c ro m o s o m a s
Figura 18-28 Dos modelos alternativos de cómo el cinetocoro puede generar una fuerza hacia los polos sobre su cromosoma, durante la anafase. (A) Las proteínas motoras de microtúbulos forman parte del cinetocoro y utilizan la energía de la hidrólisis del ATP para arrastrar el cromosoma a lo largo de los microtúbulos a los que dicho cromosoma está unido. (B) El desplazamiento de los cromosomas está dirigido por el desensamblaje de los microtúbulos: cuando las subunidades de tubulina se disocian, el cinetocoro ha de deslizarse hacia el polo para mantenerse unido a las paredes del microtúbulo.
Dos fuerzas distintas podrían contribuir a la anafase B 19 La an afase B a u m e n ta la d ista n cia en tre los d os polos del h uso, a d iferencia de la an afase A, y se a c o m p a ñ a de la de m icro tú b u lo s. Se c re e que el m is m o m e ca n ism o que se p a ra los ce n tro s o m a s en la p ro m e ta fa se co n tro la los m o vim ien tos en la an afase B. M ien tras los d os p olos se sep aran , los m icro tú b u lo s
elongación
p olares se alargan , p a re ce que p o r p olim erizació n en sus ex tre m o s distales o ex tre m o s “m á s ”. T an to la m agn itu d de la s e p a ra ció n del polo del h u so en la an afase co m o el grad o de su p erp o sició n de los m icro tú b u lo s p o lares en la z o n a m ed ia, varían de fo rm a co n sid erab le de u n as esp ecies a o tras. En m u ch a s d iato m eas, que se c a racterizan p o rq u e en ellas la m itosis o cu rre d en tro de la en v o ltu ra n u clear, las zo n as de su p erp o sició n de m icro tú b u lo s so n e sp e cia lm e n te p ro m in e n te s (Figu ra 1 8 -2 9 ). Estu d ios de re c o n s tru c c ió n de la arq u ite ctu ra trid im en sion al del h uso co m p le to de u n a d ia to m e a a p artir de c e n te n a re s de se ccio n e s finas seriadas exam in ad as al m icro sco p io e le ctró n ico m u e stra n que los m icro tú b u lo s p olares de ca d a m ed io h u so se su p e rp o n e n en u n a región ce n tra l c e rc a del e c u a d o r del h u so y que los m icro tú b u lo s de p olaridad o p u e sta se distribuyen o rd e n a d a m e n te d ejan d o esp acio s e n tre ellos. Según p a re ce d u ran te la an afase esto s d os gru-
región central de microtúbulos solapados
998
Capítulo 18: Los mecanismos de la división celular
microtúbulos polares del huso
Figura 18-29 Deslizamiento de microtúbulos solapados en la anafase. Electronmicrografías que muestran el alargamiento y la reducción del grado de solapamiento de los microtúbulos polares durante la mitosis en una diatomea. (A) Metafase. (B) Anafase tardía. (Cortesía de Jeremy D. Pickett-Heaps.)
^
región reducida de solapamiento 2 pm de los microtúbulos ----------1
Figura 18-30 Modelo probable de actuación de las proteínas motoras de microtúblos en la anafase. En (A) las proteínas motoras dirigidas al extremo “m ás”, de la familia de las quinesinas de entrecruzamiento contiguo, entrecruzan microtúbulos polares antiparalelos y hacen deslizar estos microtúbulos unos respecto a otros, la separación de los dos polos del huso. Las indican la dirección de deslizamiento de los microtúbulos. (B) Proteínas motoras de microtúbulos del extremo “menos” se unen a la corteza celular y a los microtúbulos astrales que apuntan al exterior del huso y los polos del huso alejándolos entre sí.
empujando
(A) LOS POLOS DEL HUSO SON EMPUJADOS PARA SEPARARSE corteza celular
flechas negras
atraen
pos de m icro tú b u lo s p o lares an tip aralelos se deslizan y se p a ra n u no de o tro en la región de su p erp o sició n . Los m ovim ien tos de la an afase tam b ién se p u ed en estu d iar en células Usadas de d iatom ea. En este m od elo el p ro m in en te h uso m itó tico es librem en te a cc e s i ble a las m acro m o lécu las, de form a que se p ued en estu d iar los efectos de varias son d as m acro m o le cu la re s (incluyendo an ticu erp o s esp ecíficos). El m ovim ien to de la an afase A en las d iato m eas se pued e bloq uear m ed ian te un an ticu erp o que re co n o ce las p roteín as m o to ra s de m icrotú b u los de la fam ilia quinesina, lo cual sugiere que los m ovim ien tos p u ed en e sta r dirigidos p or u n a p ro teín a m o to r de esta fam ilia. P arece que esta p ro teín a m o to r se localiza en la z o n a de su p erp o si ción , d on d e p u ed e sep arar los m ed ios h usos (Figura 18-30A ). Se cre e que los m icro tú b u lo s astrales, que se alargan en to d as d ireccio n es d u ran te la an afase, ju eg an un papel ad icion al en los m ov im ien to s de la an afase B. T an to en los h o n g o s c o m o en los an im ales, co rta n d o el ce n tro del h u so n o se b loq u ea la sep aració n de los p olos del h uso, sino que de h e ch o la a celera. E sto sugiere que los m icro tú b u lo s astrales que a p u n ta n h a cia fu era del h uso g en eran u n a fu erza que arra stra los polos p articip an d o en su se p a ra ció n d u ran te la a n afase B, p osib lem en te in te ra ctu a n d o ju n to c o n p ro teín as m o to ra s o rien tad as al extrem o “m e n o s ” q ue se h allan u nidas a la co rte z a celu lar o a otras e stru ctu ra s cito p lasm áticas (Figura 1 8 -3 0 B ). De a cu e rd o co n esta su posición , la in y ecció n de an ticu erp o s co n tra la dineína, u n a p ro te ín a m o to r dirigida h a cia el extrem o “m e n o s ”, p ro v o ca el co lap so del h u so de células en cultivo. P a re ce que e sta fu er za de arrastre tam b ién a c tú a d u ran te el en sam b laje del h uso en la profase, y que u n as fuerzas sim ilares a ella guían la d istrib ución esp ecífica de los h usos, previa a las escision es celu lares asim étricas, c o m o v erem o s m ás ad elan te.
En la telofase se recompone la envoltura nuclear alrededor de los grupos de cromosom as20 Al final de la an afase los c ro m o so m a s se h an sep arad o en d os grupos iguales, u n o en ca d a polo del h uso. En la te lo fa se , el estad io final de la m itosis, se re c o m
Mitosis
999
p o n e u n a en v oltu ra n u cle a r alred ed o r de c a d a grupo de cro m o so m a s, fo rm an d o los d os n ú cleo s hijos de la interfase. H ay que con sid erar al m e n o s tres p artes del com p lejo de la envoltura n uclear (d iscutido en el C apítulo 12) d u ra n te su d esap arició n y re co m p o sició n en la m i
membranas nucleares exterior e interior, lámina nuclear
tosis: (1) las que son co n tin u a s c o n el retícu lo en d o p lasm á tico ; (2) la su b y acen te (u n a fina red de fila m e n to s in term ed io s en fo rm a de h o ja fo rm a d a a p artir de lám in as n u cleares), q ue in te ra ctú a c o n la m e m b ra n a n u cle a r in terior, la cro m a tin a , y los p o ro s n u
poros nucleares
cleares; y (3) los fo rm ad o s p o r g ran d es co m p lejo s p ro teico s. En la p rofase la fosforilación de las lám in as n u cle a re s tien e lugar en varias lo caliza cio n es distintas de c a d a c a d e n a p o lip ep tíd ica, p ro v o ca n d o su d esen sam b laje, y p o r lo ta n to la ro tu ra de la lám in a n u clear. En co n se cu e n cia , quizás co m o re s p u e sta a u n a señ al diferente, las m e m b ra n a s de la en voltu ra n u cle a r se disgregas en p eq u eñ as v esícu las de m e m b ra n a . La rep en tin a tra n sició n d esd e la m e tafase a la an afase in icia la desfosforila ció n de las m u ch a s p ro te ín a s que se fosforilaron en la p rofase; au n q u e las fosfatasas p ertin en tes p e rm a n e c e n activ as d u ra n te la m itosis, no p u ed en a c tu a r sin o p o sició n h a sta que se d esactiv a el M PF. P o co d esp u és de esto, en la telofase, las vesícu las de la m e m b ra n a n u cle a r se a so cia n c o n la superficie de c ro m o so m a s individualizados y se fu sion an e n tre sí, re co m p o n ie n d o las m e m b ra n a s n u cle a res, en volvien d o p a rcia lm e n te gru p os de c ro m o so m a s, an tes de co a le s c e r y re co m p o n e r la en voltu ra n u cle a r co m p le ta (véase Figu ra 1 2 -1 8 ). D u ran te este p ro ceso los p o ro s n u cle a re s se d esen sam b lan y las lám in as desfosforiladas se re a so cia n fo rm an d o la lám in a n u clear; u n a de las p ro teín as de la lám in a (lám ina B) p e rm a n e ce a lo largo de to d a la m itosis co n los frag m en to s de la m e m b ra n a n u clear y es p osible q ue p articip e en la re c o n s tru c c ió n del n ú cleo . T ras la n ueva co n stru cció n del n ú cleo , los p o ro s b o m b e a n p ro teín as n u cleares h a cia el in te rior del n ú cleo , los c ro m o s o m a s se d e sco n d e n sa n , y se re a n u d a la síntesis del RNA, to d o lo cu al p ro v o ca la re a p a rició n de los n u cléo lo s. Se cre e que la d e s c o n d en sació n de la c ro m a tin a p u ed e ser p ro v o ca d a en p arte, p o r la d esfosforilación de las m olécu las de la h isto n a H l.
Xenopus
En e x tra cto s cru d o s de h uevos de se p ro d u ce ta n to el en sam b laje co m o el d esen sam b laje n u cle a r siem p re y cu a n d o esto s e x tra cto s p ro v en g an de célu las que se e n cu e n tre n en el estad io a p ro p iad o del ciclo celu lar (células m itó ticas p a ra el d esen sam b laje y célu las in terfásicas p a ra el en sam b laje). En estos e x tra cto s el p ro ce s o co m p le to que im p lica la lám in a, los p olos n u cleares, y las m e m b ra n a s n u clea re s p a re ce p ro g re sa r c o n n o rm alid ad en re sp u e sta a ciclo s de fosforilación y desfosforilación . Sistem as de este tipo p ro p o rcio n a n un sistem a de en sayo p a ra la id en tificació n y la p u rificació n de p ro teín as que ca ta li zan el en sam b laje y el d esen sam b laje de la en v o ltu ra n u cle a r en la célula, in clu yen d o las p ro teín a s (co m o el M PF) que regu lan d ich o s p ro ce so s. M ien tras que p a ra en sa m b lar u n n ú cle o h ay que su m in istrar DNA a esto s e x tra cto s, se fo rm a rá u n a en v oltu ra n u cle a r co m p le ta alred ed o r de m o lécu las de DNA purificado p ro ce d e n te s de p rá c tica m e n te cu alq u ier o rg an ism o , inclu yen d o virus b a c te ria
in vitro
n os. P o r lo tan to , m ien tras q ue las p ro te ín a s que se u n en al DNA h an e sta r im pli ca d a s en este p ro ce s o , es p o c o p ro b ab le que d u ran te el reen sam b laje n u cle a r se p ro d u zca un re co n o c im ie n to de se cu e n cia s esp ecíficas de DNA. S o rp ren d en tem e n te , la ro tu ra de la en v o ltu ra n u cle a r no es un re q u e rim ie n to p a ra la m itosis. D e h e ch o , v e re m o s a c o n tin u a ció n que en los eu ca rio ta s infe riores la e n v oltu ra n u cle a r n o se d e se n sa m b la d u ran te la m itosis. Se d ice que el h u so de esto s o rg an ism o s es ab ierto en lu gar de ce rra d o .
Resumen
La mitosis comienza con la profase, que se manifiesta mediante un incremento en la fosforilación de proteínas específicas, y se desencadena por la actividad de una proteína quinasa inductora de la mitosis, MPF. Una consecuencia de esta fosforila ción es una estructura microtubular extraordinariamente dinámica, nucleada en 100 0
Capítulo 18: Los mecanismos de la división celular
los centrosomas duplicados que forman los polos de huso. Un subconjunto de los microtúbulos de cada centrosoma se estabiliza, parece ser que estableciendo lazos cruzados con microtúbulos del centrosoma contrario, formando los microtúbulos polares, los cuales se supone que son responsables de la separación de los polos. Tras la rotura de la envoltura nuclear en la prometafase, los cinetocoros de cromo somas condensados pueden capturar y estabilizar otras subformaciones de micro túbulos de los muchos que crecen constantemente en cada polo del huso. Los cineto coros de polos opuesto del huso tiran en direcciones contrarias de los dos cinetocoros de cada cromosoma duplicado, creando una tensión que estabiliza la unión de los cinetocoros. Fuerzas equilibradas sobre los cinetocoros también llevan a los cromosomas al ecuador del huso, formando la placa metafásica. Las subunidades de tubulina de los microtúbulos del huso sufren continuos desplazamientos desde el ecuador hacia los polos del huso. En la anafase, las cromátidas hermanas se separan una de la otra de repente y son atraídas hacia polos opuestos (el movi miento de la anafase A). Mientras, los dos polos del huso se separan (el movimiento de la anafase B). En la telofase, el estadio final de la mitosis, se reconstruye la en voltura nuclear en la superficie de cada grupo de cromosomas separados al desfosforilarse las proteínas que se fosforilaron al comienzo de la fase M.
Citocinesis21 D u ran te la c ito cin e s is el cito p lasm a se divide m e d ia n te un p ro ce so d en o m in ad o
segmentación. A unque n o rm a lm e n te la división n u cle a r y la división cito p la sm à tica están relacio n ad as, so n a co n te cim ie n to s que se p u ed en sep arar; en algunas circu n sta n cia s n o rm ales la división celu lar n o va seguida de la cito cin esis. P or ejem plo el em b rió n te m p ra n o de exp e rim e n ta 13 p ro ce so s de divi
Drosophila
sión celu lar sin que se p ro d u z ca n in gun a división cito p la sm à tica , fo rm án d o se u n a sola célu la gran d e que co n tie n e 6 0 0 0 n ú cleo s d isp u estos c o m o u n a m o n o ca p a c e rc a de la superficie. P o ste rio rm e n te se g en eran célu las m o n o n u cle a d a s p o r seg m en tació n cito p la sm à tica alred ed o r de to d o s esto s n ú cleo s (véase Figura 2 1 -5 1 ). No o b stan te en u n a célu la n o rm al c a d a m itosis viene a c o m p a ñ a d a de u n a citocin esis, que c o m ie n z a en la an afase, co n tin u a en la telofase, y a lca n z a su cu lm in ació n al co m e n z a r la in terfase siguiente.
El huso m itótico determ ina el lugar de la segmentación del citoplasm a durante la citocinesis22 N o rm alm en te el h u so m itó tico d eterm in a d ó n d e y cu á n d o o cu rre la se g m e n ta ció n . En las células an im ales la p rim era m u e stra visible de se g m e n ta ció n es la fo rm ació n de un estran g u lam ien to y un
surco de la m e m b ra n a p la sm á tica
du
ran te la an afase (Figura 1 8 -3 1 ). La fo rm ació n del su rco o cu rre in variab lem en te
Figura 18-31 Electronmicrografías de barrido de la segmentación temprana de un huevo de rana. El surco de la membrana celular se forma por la actividad de un situado debajo de ella. El surco de segmentación en esta célula gigante y esférica es extraordinariamente obvio y bien definido. (A) Imagen a poco aumento de la superficie del huevo. (B) Superficie del surco a mayor aumento. (De H.W. Beams y R.G. Kessel, 64:279-290, 1976. Reproducido con permiso de revista de Sigma Xi.)
anillo contráctil
Am. Sci.
[A>
Citocinesis
I_____I
200 \im
(B)
I--------
25 |jm
Scientist,
American 1001
centrosoma
célula huevo en división
bolita de vidrio
una bolita de vidrio presionada sobre la célula desplaza el huso
el surco se forma sólo en un lado de la célula, produciendo un huevo binucleado
Figura 18-32 Experimento que muestra la influencia de la posición de los ásteres microtubulares en el posicionamiento del plano de segmentación. Si se empuja el huso mitótico de una célula de forma mecánica hacia un lado de la célula, la membrana del surco resultará incompleta, ya que no se producirá en la cara opuesta de la célula. Las segmentaciones siguientes se producirán no sólo en la relación convencional respecto a cada uno de los husos mitóticos sino también entre los dos ásteres adyacentes que no están unidos por un huso mitótico (pero que en esta célula anormal comparten el mismo citoplasma) Al parecer, el haz contráctil de filamentos de actina que produce el surco de segmentación siempre se forma en la región intermedia entre los dos ásteres, lo cual implica que los dos ásteres modifican de alguna manera la región adyacente a la corteza celular.
{flechas amarillas)
ambos núcleos entran en mitosis
la segmentación ocurre entre centrosomas unidos por husos mitóticos y entre los dos centrosomas que simplemente son adyacentes, formándose cuatro células hijas
en el p lan o d e la p la c a m e ta fá sica , en án gulo re c to co n el eje m ay o r del h uso m itó tico . E sto aseg u ra q u e el s u r c o d e s e g m e n ta c ió n p a sa e n tre los d os gru p os de cro m á tid a s, y d e e s ta m a n e ra las d o s célu las hijas re cib a n co p ias id én ticas del m aterial g en ético . Si m e d ia n te m icro m a n ip u la ció n se ca m b ia el h u so p re cisa m e n te en la an afa se te m p ra n a , el s u rco in cip ien te d e sa p a re ce y se d esarrolla o tro su rco d e a cu e rd o c o n la n u ev a lo calizació n del h u so . In gen iosos exp eri m e n to s e fectu ad o s c o n h u ev o s fe cu n d a d o s d e erizo d e m a r d e m u e stra n que el su rco d e se g m e n ta ció n se fo rm a a m ed io ca m in o e n tre los ásteres que p arten de los d o s ce n tro s o m a s in clu so a u n q u e a m b o s ce n tro s o m a s no estén co n e c ta d o s m e d ia n te el h u so m itó tico (Figura 1 8 -3 2 ). Así p ues, lo q ue señ aliza a la c o rte z a p ara q u e in icie el s u rco d e se g m e n ta ció n n o so n los c ro m o s o m a s sino los ásteres m icro tu b u lares. M ás tard e, cu a n d o el p ro ce so d e fo rm a ció n del su rco ya está bien en carrilad o , se p ro d u ce la se g m e n ta ció n au n q u e el h u so y los á steres sean alte rad o s p o r su cció n o se d estru y en c o n co lch icin a . No c o n o c e m o s el m e c a n is m o m e d ia n te el cu al un p a r de m icro tú b u lo s indi c a n la lo calizació n d e la s e g m e n ta ció n en la co rte z a , p ero sin d u d a co n stitu y e un ejem p lo clásico d e c o m u n ic a ció n e n tre los m icro tú b u lo s y los sistem as de fila m e n to s de a ctin a del cito e sq u e le to . U n a h ip ótesis sería q u e las dos fo rm acio n es d e in icro tú b u lo s a strales co n e c ta n c o n la co rte z a celu lar y e sta b le ce n la futura lo calizació n de la se g m e n ta ció n , p o sib le m e n te m e d ia n te el d esp lazam ien to de filam en to s de a ctin a . T am b ién p o d ría o cu rrir q u e la co rte z a p ercib iese un g ra d ien te de C a2+, q u e se e sta b le ce m e d ia n te d e v esícu las se cu e stra d o ra s de C a2+ q ue sab em o s q u e existen en los p o lo s d e h u so . C ualqu iera que sea la señ al e stá claro q u e la c o rte z a e s tá p re p a ra d a p a ra d e te cta rla y am p lificarla. T o d a la c o rte za se e n c u e n tra b ajo te n sió n (véase F ig u ra 1 6 -8 0 ), y si la te n sió n a u m e n ta lo ca l m e n te en la lo caliz a ció n del in icio del su rco o d e c re c e en los polos, los filam en tos de a ctin a se alin earán lo ca lm e n te y a tra e rá n n u ev o s filam en tos, ju n to co n m iosin a-II, p ro ce d e n te s d e la c o rte z a circu n d a n te . Así p u es, el su rco p u ed e ser un sistem a de a u to a m p lifica ció n , q ue se au to o rg a n iz a so b re la b ase de u n a sutil in d icació n inicial.
El huso se reposiciona específicam ente creando divisiones celulares asim étricas23 La m ayo ría de célu las se divide de fo rm a sim étrica. El su rco de se g m en tació n se fo rm a alred ed or del e c u a d o r de la célu la m ad re, de m o d o que las dos células hijas resu ltan tes so n del m ism o ta m a ñ o y tien en p rop ied ad es sim ilares. Tal sim etría en la seg m en tació n es el resu ltado de u n a co lo ca ció n previa del h uso, el cual tien de a cen trarse en el cito p lasm a, de fo rm a que el eje del huso quede alineado a lo
100 2
Capítulo 18: Los mecanismos de la división celular
{flechas rojas).
Figura 18-33 Rotación del huso. (A) Diagrama que muestra un mecanismo que posiblemente subyace a la rotación controlada del huso. La representa una región especializada de la corteza hacia la que los microtúbulos astrales empujan un polo del huso. (B) Micrografías ópticas que muestran la rotación programada exacta del huso mitótico de un gusano nemátodo en el estadio de dos células, preparándose para la segmentación que producirá cuatro células siguiendo un patrón específico. El huso de la célula de la derecha gira casi 90° en el sentído de las agujas del reloj. (Cortesía de Tony Hyman y John White.)
franja roja
C. elegans
de las proteínas motoras de microtúbulos orientadas al "menos"
largo de un eje d eterm in ad o de la célula. Se cree que d ich a p osición se estab lece m ed ian te fuerzas de a tra cció n sob re los m icrotú b ulos astrales, ejercid as p o r p ro teín as m o to r cito p la sm á tica s dirigidas al e x tre m o m e n o s (véase F ig u ra 1 8 -3 0 B ). Sin em b arg o, existen m u ch a s situ acio n es d u ran te el d esarrollo em b rio n ario en las que las célu las se dividen a sim é trica m e n te . En esto s ca so s el su rco c re a d os célu las de diferente ta m a ñ o y d estin ad as a d esarrollarse p or ca m in o s diver g en tes. A m en u d o las divisiones de este tipo se definen e sp a cia lm e n te de fo rm a e x a cta . P or ejem plo, p u ed en g u ard ar u n a relació n p recisa co n la superficie de u n a lám in a epitelial o seg reg ar regiones del cito p lasm a que c o n te n g a n un c o n ju n to de orgán u los distinto. La c o lo ca ció n a sim é trica del h uso m itó tico an ticip a siem p re la p o sició n a sim é trica del su rco . El h uso gira de fo rm a co n tro la d a a d o p tan d o u n a p o sició n a d e cu a d a d en tro de la célu la y o rien tan d o así el p lan o de la división. P a re ce p ro b ab le que esto s m ov im ien to s del h uso se dirijan m ed ian te cam b io s p ro g ram a d o s en regiones localizad as de la co rte z a celu lar y que e n to n ces la co rte z a d esp lace los p olos del h uso a través de sus m icro tú b u lo s astrales (Figura 1 8 -3 3 ). P a re ce que en las células p olarizadas el ce n tro s o m a se p o sicio n a m ed ian te u n m e ca n ism o sim ilar a éste (véase pág. 8 4 8 ). L a división celu lar a sim é trica es e sp ecialm en te im p o rta n te en las célu las v e getales, debido a que estas célu las no p u ed en d esplazarse tras la división; p o r lo ta n to la m orfología de los tejidos viene d eterm in ad a p o r los plan os de división celular. Las p lan tas utilizan u n m e ca n ism o distinto p a ra e sta b le ce r su p lan o de seg m en tació n , que v e re m o s m á s ad elan te.
La actina y la m iosina generan las fuerzas necesarias para la segmentación24 La seg m e n ta ció n se con sigu e m ed ian te la c o n tra c c ió n de un fino anillo c o m p u esto p rin cip alm en te p o r u n a fo rm a ció n su p erp u esta de filam en tos de a ctin a y
Citocinesis
1003
surco de segmentación
anillo contráctil formado por filamentos de actina y miosina
(A)
(C )
0,5 |jm
de filam en tos b ip olares de m iosin a-II. E ste anillo contráctil define el su rco de se g m e n ta ció n . C onsiste en filam en tos o rien tad o s en circu n feren cia, u nidos a la c a ra cito p la sm á tica de la m e m b ra n a p la sm á tica m e d ia n te p ro teín as de an claje n o ca ra cte riz a d a s (Figura 1 8 -3 4 ). El anillo co n trá ctil se en sa m b la en la an afase te m p ra n a . U n a vez en sam b lad o , d esarro lla u n a fu erza su ficien tem en te gran d e c o m o p ara d ob lar u n a d elgad a agu ja de vidrio in se rta d a en la célula. Existen evi d en cias co n v in ce n te s de q ue lo q ue g e n e ra e sta fu erza es el d eslizam ien to de los filam en tos de a ctin a y de m io sin a del anillo co n tráctil, de u n a fo rm a m u y sim ilar a co m o se p ro d u ce en un m ú scu lo . P o r ejem p lo, en célu las m itó tica s Usadas, la se g m e n ta ció n se d etien e cu a n d o se a ñ a d e n su b frag m en to s de m io sin a in activ ad a q ue b lo q u ea los lu gares de a ctin a que n o rm a lm e n te se u n en a la m iosin a. De fo rm a p arecid a, u n a in y e cció n de a n ticu e rp o s an tim io sin a en h uevos de erizo de m a r fecu n d ad o s p ro v o ca la relajació n del su rco de se g m e n ta ció n sin que ello afecte la división n u clear. E n c a d a p u n to de su circu n fe re n cia el anillo co n trá ctil co n tie n e u n h az de u n o s 2 0 filam en tos de a ctin a . D u ran te u n a división celu lar n o rm al el anillo no se v a h acie n d o m á s gru eso a m e d id a q ue el su rco se invagina, lo cu al sugiere que se p ro d u ce u n a p érd id a co n tin u a de filam en tos, re d u cié n d o se así el v o lu m en del anillo. Así p u es, c o m o o tra s e stru ctu ra s cito e sq u e lé tica s y a d iferen cia del m ú scu lo esq u elético , el su rco es d in ám ico . El anillo co n trá ctil se elim ina p o r co m p le to al te rm in a r la se g m e n ta ció n , cu a n d o la m e m b ra n a p la sm á tica del su r co de se g m e n ta ció n se e s tre c h a fo rm a n d o el cuerpo medio, que p e rm a n e c e co m o un p u e n te e n tre las d os célu las hijas. El cu e rp o m ed io co n tie n e los restos d e los d os co n ju n to s de m icro tú b u lo s p o lares, q ue se h allan fu e rte m e n te e m p a q u etad o s p o r m ate ria l d en so de la m atriz (Figura 1 8 -3 5 ). El p ro ce so de cito cin esis req u iere la reo rg an izació n co m p le ta de los fila m e n to s de a ctin a y m io sin a en la c o rte z a p a ra co n seg u ir que se p ro d u z ca el e n sam b laje del anillo co n trá ctil. D u ran te la fase M se ven afe cta d a s o tras fu n cion es de la co rte z a , esp e cia lm e n te la ad h esió n celular. P o r ejem plo, célu las cu ltivadas de tejid os q ue d u ra n te la in terfase se m a n tie n e n ad h erid as a un su b strato d eb i do a fu ertes co n ta c to s c o n m o lécu las extracelu lares de la m atriz, al e n tra r en la fase M se red o n d ea n ; m á s ad elan te, to d av ía en la cito cin esis, las célu las se a p la n an de n uevo. Se c re e q ue d u ra n te la fase M las activid ades de las p ro teín as de ad h esió n tra n sm e m b ra n a , c o m o las in tegrin as (se d iscu te en el Capítulo 19), se e n c u e n tra n de algu n a fo rm a so m etid as a retroin h ib ición , o b ien que se m od ifi c a n las p ro teín as de a d h esió n que u n en estas p ro teín as co n los filam en tos de a c tin a de la co rte z a . C o m o o cu rre c o n o tras m a n ifestacio n es de la fase M, es p ro b ab le q ue esto s cam b io s e sté n m ed iad o s p o r la fosforilación de p ro teín as.
100 4
Capítulo 18: Los mecanismos de la división celular
Figura 18-34 El anillo contráctil. (A) Esquema de un surco de segmentación de una célula en división. (B) Electronmicrografía del borde que crece hacia el interior de un surco de segmentación de una célula animal en división. (C) Una ameba del moho en la que se ha teñido la actina (de y la miosina-II (de La miosina teñida en el anillo contráctil enmascara de alguna manera la actina que también está presente. (B, de H.W. Beams y R.G. Kessel, 64:279290,1976, reproducida con autorización de revista de Sigma Xi; C, cortesía de Yoshio Fukui.)
rojo)
verde).
Am. Sci.
American Scientist,
Figura 18-35 Citocinesis. (A) Electronmicrografía de barrido de una célula animal en cultivo durante su proceso de división; el cuerpo medio todavía une las dos células hijas. (B) Electronmicrografía del cuerpo medio de una célula animal en división. La segmentación es casi completa, pero las dos células hijas permanecen unidas a esta delgada franja de citoplasma. (A, cortesía de Guenter Albrecht-Buehler; B, cortesía de J.M. Mullins.)
En casos especiales, determinados componentes celulares se pueden segregar a una sola célula hija25 M ien tras q ue la m ay o ría de divisiones celu lares p ro d u ce n dos célu las hijas p a re cid as, algu n as divisiones p ro d u ce n célu las hijas m an ifiestam en te desiguales. E ste fen ó m en o se d a p rin cip alm en te en las p rim eras se g m e n ta cio n e s en las que u n h uevo fecu n d ad o gran d e se subdivide en célu las m ás p eq u eñ as d estin ad as a fo rm ar diferentes p artes del cu erp o . Y a h em o s visto que la co lo ca c ió n a sim é trica del h u so d u ran te la división celu lar p u ed e p ro d u cir d os célu las de ta m a ñ o d e s igual, p ero la génesis de célu las hijas b io q u ím icam en te d iferentes es u n p ro b le m a distinto. El c o m p o rta m ie n to de u n a fo rm a ció n ca ra c te rís tica de grán u los en el huevo de u n gu san o n em á to d o C. p ro p o rcio n a un extrao rd in ario ejem plo de
elegans
e ste p ro ce so . E sto s “g rá n u lo s-P ” se distribuyen de m o d o u niform e p o r to d o el cito p lasm a de un h uevo n o fecu n d ad o , p ero se d esplazan h a cia el e x tre m o p o s terio r de la célu la ju sto a n te s de la p rim e ra se g m e n ta ció n y c o n s e cu e n te m e n te son h ered ad os ú n ica m e n te p o r u n a de las dos células hijas. La m ism a clase de p ro ce so de segregación se repite en varias divisiones celulares p osteriores, de fo r m a que, al final, los gránulos se e n cu en tran so lam en te en las células germ inales p rim ordiales, a p artir de las cu ales se p ro d u cen los huevos y los esp erm ato zo id es (Figura 1 8 -3 6 ). Es posible que los grán u los ju eg u en p a rte im p o rta n te en el c o n trol de los d estin os p articu lares de estas células. Los g rán u los-P se d esp lazan al e x tre m o p o sterio r de c a d a célu la in clu so en las células m u tan tes en las que el huso m itótico se d e sco lo ca y se le localiza en á n gulos re cto s resp e cto a su p o sició n n o rm al. A d em ás, la seg reg ació n de grán u los se b lo q u ea m ed ian te la d roga cito ca la sin a D, que inhibe la p olim erizació n de los filam en tos de actin a, p ero no m ed ian te la co lch icin a, lo cu al sugiere que el d es-
Citocinesis
1005
p laza m ien to o rien ta d o de los g rán u lo s-P d ep en d e de los filam en tos de a ctin a p ero n o d e los m icro tú b u lo s. A unque la seg reg ació n desigual de e sto s c o m p o n e n te s p a re ce b asa rse en alg u n a p ro p ied ad a sim é trica del cito esq u eleto b asad o en a ctin a , el m e ca n is m o m o le cu la r q ue g e n e ra su d esp lazam ien to o rien tad o to d avía es d e sco n o cid o .
Figura 18-36 Segregación asim étrica. Estas micrografías muestran la segregación asimétrica controlada de un componente citoplasmático a una célula hija que ocurre en todas las primeras divisiones de un huevo fecundado del nemátodo En la parte superior de la figura se presentan células vistas con microscopía de contraste de fase interferencial y teñidas con un fluorocromo específico para DNA; en la parte inferior de la figura se observan las mismas células pero teñidas con un anticuerpo contra gránulos-P. Estos gránulos (0,5-1 Jim de diámetro), de acción desconocida, se distribuyen al azar por el citoplasma del huevo no fecundado. (Cortesía de Susan Strome.)
C. elegans.
En las células de las plantas superiores, la citocinesis ocurre m ediante un m ecanism o especial26 La m ay o ría d e las célu las d e p lan tas su p erio res e stá n e n ce rra d a s en u n a pared celular rígida, y en e sta s célu las el m e c a n is m o d e la cito cin esis es d istinto al de las célu las an im ales q u e a c a b a m o s d e d escrib ir. En vez de p in zar las dos células hijas m ed ian te u n anillo c o n trá ctil e n la su perficie celu lar, el cito p la sm a de la c é lula vegetal se p a rte p o r la c o n stru cc ió n de u n a n u ev a p ared celu lar en el in terior d e la célu la (Figura 1 8 -3 7 ). E sta p a rtició n d e te rm in a de fo rm a p re cisa la u b ica ció n de las d os célu las hijas re sp e cto a las célu las v ecin as. De aq u í se d e d u ce que los p lan os de la división celu lar, ju n to c o n los de cre cim ie n to celu lar, d e te rm i n an la fo rm a d e la p lan ta. La n u eva p are d tran sv ersal, o p la c a c e lu la r, em p ie z a a e n sam b larse en un p lan o situ ad o e n tre los d o s n ú cleo s hijos y en a so cia ció n c o n los m icro tú b u lo s p o lares del h u so, q ue fo rm an u n a e stru ctu ra cilin d rica llam ad a fra g m o p la s to . El firagm oplasto, q ue c o rre sp o n d e a los m icro tú b u lo s del cu e rp o m ed io de las c é lu las an im ales, co n tie n e d os co n ju n to s d e m icro tú b u lo s que se e n trelazan en sus extre m o s “m á s ” en c re cim ie n to (Figura 1 8 -3 8 ). Los m icro tú b u lo s tien en sus e x tre m o s “m á s ” en g lo b ad o s en un d isco e le ctro n d e n so del p lan o ecu ato rial. Tal co m o se resu m e en la Figu ra 1 8 -3 9 , p a re ce q ue p eq u eñ as v esícu las ro d ead as de m e m b ra n a , p rin cip a lm e n te d eriv ad as del co m p lejo de Golgi y rep letas de p re cu rso re s d e la p ared celu lar, c o n ta c ta n c o n los m icro tú b u lo s en ca d a c a ra del fragm o p lasto y se d ejan tra n sp o rta r p o r ellos h a sta a lca n z a r la región ecu ato rial. Allí se fu sion an e n tre sí fo rm a n d o u n a e s tru c tu ra discoid al ro d e a d a de m e m b ra
placa celular precoz.
na, la Las m o lécu las de p o lisacárid o liberadas p o r estas v e sícu las se en sam b la n en la p la ca celu lar p re co z fo rm a n d o la m atriz de la p ared celu lar p rim aria. E ste d isco tien e a h o ra q ue exp an d irse la teralm en te h a sta al ca n z a r la p ared celu lar p ro g en ito ra. P a ra q ue esto se a posible, los m icro tú b u lo s del frag m o p lasto te m p ra n o se reo rg an izan sin p a ra r en la periferia de la p laca celu lar p reco z, d o n d e a tra e n m á s v esícu las q ue se fu sion an en el e cu a d o r e x te n d ien d o el b o rd e d e la p la ca . E ste p ro ce so se rep ite h a sta que la p la ca celu lar en cre cim ie n to alca n z a la m e m b ra n a p la sm á tica de la célu la p ro g en ito ra. La m e m b ran a p lasm ática y la m e m b ra n a q ue envuelve la p la ca celu lar se fusionan, s e p a ran d o las d os n u ev as célu las hijas p o r co m p le to (véase Figu ra 1 8 -3 7 ). Los fila-
1006
Capítulo 18: Los mecanismos de la división celular
azul
5G j fn m en to s de actin a ta m b ié n a b u n d an en el frag m o p lasto , alin ead o s co n los micro tú b u lo s, p ero su papel fu n cion al en la fo rm ació n de la p la ca celu lar es p o co claro. Algo m ás tard e, las m icrofibrillas de celu lo sa se extien d en d en tro de la p la ca celu lar, co m p le ta n d o la n u ev a p ared celular.
Una red de citoesqueleto determ ina el plano de división de las células vegetales27 N o rm alm en te, el h u so m itó tico en sí m ism o no es su ficiente p ara d e te rm in a r la p o sició n y el ta m a ñ o e x a cto de la p la ca celular. La localizació n de la fu tu ra p laca de u n ión co n la p a re d de la célu la m a d re p a re ce decid irse en algún m o m e n to de G2, an tes del co m ie n z o de la m itosis. Así, el p rim er signo visible de que un célula v egetal su p erio r h a in iciad o su división en u n p lan o d ete rm in a d o se a p re cia ju s
Figura 18-37 Micrografías ópticas secuenciales de una célula vegetal en división. El tiem po transcurrid o en m inutos se indica en la esqu ina inferior d erecha de cada fotografía. Las vesículas que se alin ean form ando la placa celu lar pued en observarse tras 42 m inutos. E n to n ces la placa se extiende por sus bord es hasta que alcanza la pared de la célu la m adre y se fusiona co n ella. (C ortesía de P eter Hepler.)
to d esp u és de q ue d e sa p a re z c a la red de m icro tú b u lo s in terfásico s de la c o rte z a , d u ran te la p re p a ra c ió n de la m ito sis. En este m o m e n to , a p a re ce un franja de m icro tú b u lo s en circu n fe re n cia que fo rm a u n a anillo a lre d e d o r de to d a la c é lu la, ju sto p o r d eb ajo de la m e m b ra n a p la sm á tica . D ebido a que a p a re c e a n te s del co m ie n z o de la p ro fase, e sta fo rm a ció n de m icro tú b u lo s recib e el n o m b re de
franja preprofase (véase F ig u ra 1 8 -3 9 ). La franja se e stre c h a a m ed id a que la célu la p ro g resa h a cia la p rofase, y d e sa p a re ce an tes de a lca n z a r la m etafase, cu a n d o en los alred ed o res ya se h a d e te rm in a d o de algún m o d o el p lan o de di-
Figura 18-38 Micrografía óptica de la citocinesis de una célula vegetal durante la telofase. La placa celu lar tem prana (entre las dos flechas) se está
V
form ando en un plano perpendicu lar al plano de la página del libro. Las dos form acio nes de m icrotúbu los que con tribuyen al fragm oplasto se tiñen utilizando anticu erp os con tra tubulina m arcad os co n oro, m ientras que el DNA de las dos fo rm aciones de crom osom as hijos se tiñen con un coloran te fluorescente. (Cortesía de Andrew Bajer.)
50 (jm Citocinesis
1007
c o m p le jo d e G o lg i
p a r e d c e lu la r m a te rn a
En algún punto de G2 los microtúbulos corticales se recomponen formando la franja que rodea la célula, justo por debajo de la membrana plasmática. Esta franja preprofásica de microtúbulos se estrecha gradualmente y predice con exactitud dónde se unirá la nueva pared celular con la pared celular materna cuando la célula se divida.
f r a n ja p r e p r o fá s ic a d e m ic r o t ú b u lo s
te lo fa s e
En la telofase el fragmoplasto está formado por dos juegos de microtúbulos polares. Las vesículas derivadas del Golgi que transportan precursores de pared celular asociadas con microtúbulos se acumulan en la región ecuatorial y se fusionan formando la placa celular temprana.
v e s íc u la s d e r iv a d a s d e l G o lg i
r e s to s d e m ic r o t ú b u lo s p o la r e s d e l h u s o
c it o c in e s is
Los microtúbulos del fragmoplasto se forman de nuevo en la periferia de la placa celular temprana. En esta región se reclutan nuevas vesículas derivadas del Golgi, y se fusionan al borde de la placa celular, extendiéndola hacia el exterior.
p la c a c e lu la r te m p ra n a
m ic r o t ú b u lo s d e l f r a g m o p la s t o
La membrana de la placa celular en crecimiento se fusiona con la membrana plasmática de la célula madre, completando la nueva pared celular. En cada una de las dos células hijas se restablece la formación cortical de microtúbulos interfásicos.
p la s m o d e s m o s
f o r m a c ió n c o r tic a l d e m ic r o t ú b u lo s in te r f á s ic o s
Figura 18-39 Características principales de la mitosis y de la citocinesis en una célula vegetal superior. (A) Diagramas que muestran células vegetales en G2, telofase, citocinesis, y Gt temprana, resaltando los cambios dinámicos que se producen en la distribución de los microtúbulos a lo largo del ciclo celular. (B) Micrografías de inmunofluorescencia de células de la punta de las raíces de cebolla, mostrando la franja preprofásica de microtúbulos en G2 y el fragmoplasto en citocinesis. Los microtúbulos se tiñen de y los cromosomas de (B, cortesía de Kim Findlay.)
azul.
100 8
Capítulo 18: Los mecanismos de la división celular
verde,
visión: cu a n d o se fo rm e la n u ev a p la ca celular, d u ran te la cito cin esis, c re c e rá p o r los b o rd es h a sta fu sion arse co n la p ared de la célu la p ro g en ito ra, p re cisa m e n te en la z o n a que a n te rio rm e n te o cu p a b a la franja p rep ro fase (véase Figu ra 1 8 -3 9 ). A unque tras la d e sa p a rició n de la franja p rep ro fase se d esp lace el c o n te nido celu lar m e d ia n te cen trifu g ació n , la p la ca celu lar en c re cim ie n to te n d e rá a e n c o n tra r su ca m in o de vu elta al p lan o definido p o r la a n te rio r franja p re p ro fase. A hora sab em o s que la franja p rep rofase co n tien e n u m ero so s filam en tos de a ctin a ad em ás de m icrotú b u los. La p re se n cia de filam entos de a ctin a no se lim i ta a la co rteza celular; en células vacu olizad as tam b ién fo rm an un e stru ctu ra d is coid al radial de filam entos, que cru z a la célula y se c o n e c ta al n ú cleo cen tral en división, su jetán d olo. D espués de la d espolim erización de los m icro tú b u lo s de la franja p rep rofase, los filam en tos radiales de actin a p e rm a n e ce n , y p ro p o rcio n an u n a “m e m o ria ’' a la p laca de división p red eterm in ad a D u ran te la citocin esis, a m ed id a que el fragm op lasto c re c e h acia el exterior, co m o los anillos circu lares de ag u a en u n estan q u e, los b ord es de la p la ca celu lar en crecim ien to co n e c ta n co n la localizació n de la franja p rep rofase m ed ian te filam entos de actin a. P or lo ta n to, la actin a p a re ce te n e r u n a fu n ción im p o rtan te en la división de las células co n p ared au n q u e la co n tra c c ió n no ju egu e en ellas un p apel im p o rtan te. La a ctin a tam b ién está im plicad a en la fo rm ació n del sep tu m en las células de h ongos, lo cu al sugiere que p u ed e co la b o ra r en la co n d u cció n de la citocin esis en to d as las células eu cariotas.
La elaborada fase M de los organismos superiores evolucionó gradualmente a partir de organismos procariotas de fisión28 En las células p ro ca rio ta s la división del DNA y del cito p lasm a están aco p lad as de m an era m u y d irecta. C uan d o el DNA se replica, las dos co p ias del cro m o s o m a se e n cu en tran u nidas a regiones m u y esp ecializadas de la m e m b ra n a p lasm ática, las cu ales se sep aran grad u alm en te p o r el cre cim ie n to h a cia ad en tro de la m e m b ran a existen te en tre ellas. La fisión se p ro d u ce en tre los dos lugares de unión, de m a n e ra que ca d a célu la hija adquiere un c ro m o so m a (Figura 1 8 -4 0 ). C on la evolu ción de los eu cario tas, el g e n o m a in crem en tó su com p lejid ad y los c r o m o so m as a u m e n ta ro n de n ú m ero y de ta m a ñ o . A p aren tem en te en estos o rg a n is m o s fue n ecesario un m e ca n ism o m ás elab orad o p ara rep artir los cro m o so m a s en tre las células hijas. E stá claro que el a p a ra to m itó tico no p ud o h a b e r ev o lu cio n ad o de re p e n te .
Cryphthecodinium
E n m u ch o s eu ca rio ta s prim itivos, co m o el d inoflagelado la m itosis to d av ía d ep en d e de un m e ca n ism o de u n ió n a la m e m b ra n a , au n q u e en este ca so la m e m b ra n a n u cle a r a su m e la fu n ción que en los p r o c a
cohnii,
rio tas d e se m p e ñ a la m e m b ra n a p la sm á tica . La situ ació n in te rm e d ia de esta gran alga u n icelu lar tam b ién se refleja en la b io q u ím ica de sus cro m o s o m a s q ue, c o m o los de los p ro ca rio ta s, tien en u n a ca n tid a d de p ro te ín a a s o cia d a re la tiv am en te e sca sa . La m e m b ra n a n u cle a r de C. p e rm a n e c e in ta c ta d u ra n te la m itosis, y los m icro tú b u lo s del h u so p e rm a n e ce n c o m p le ta m e n te fu era del
cohnii
n ú cleo . La en vo ltu ra n u cle a r se fru n ce en u n a serie de ca n a le s p aralelos p o r los lu gares en q ue los m icro tú b u lo s del h uso eje rce n p resió n (véase Figu ra 1 8 -4 0 ). Los cro m o so m a s se u n en a la m e m b ra n a in te rn a de la en v o ltu ra n u cle a r, en los lu gares o p u esto s a esto s can ales, y su se p a ra ció n e stá to ta lm e n te m e d iad a en el in terio r de esta m e m b ra n a n u cle a r a ca n a la d a . Así, el “h u s o ” e x tra n u cle a r se u ti liza m e ra m e n te p a ra o rd e n a r la m e m b ra n a n u cle a r y p o r lo ta n to define el p la n o de división. En e sta e sp ecie, p a re ce que los cin e to c o ro s se in teg ran en la m e m b ra n a n u clear, p o r lo que p u ed en h a b e r ev o lu cio n ad o a p artir de algún c o m p o n e n te de la m e m b ra n a . El origen evolutivo de los m icro tú b u lo s to d av ía co n stitu y e un m isterio. Son im p o rta n te s p a ra la seg reg ació n c ro m o s ó m ic a in clu so en los e u cario ta s m ás prim itivos, p ero tam b ién e stá n p re se n te s en ax o n e m as flagelares (véase pág. 8 7 5 ). Lo que e stá tod avía p o r d escu b rir es si p rim ero fue el flagelo o el h uso.
Citocinesis
1009
BACTERIAS
membrana plasmática
los cromosomas hijos unidos a la membrana plasmática se separan mediante el crecimiento hacia el interior de la membrana plasmática situada entre ellos
D IN O FLAG ELAD O S CARACTERISTICOS
varios haces de microtúbulos pasan a través de túneles de la envoltura nuclear intacta, estableciendo la polaridad de la división; los cromosomas se separan en asociación con la membrana nuclear interna sin unirse a los haces de microtúbulos
cromosomas
envoltura nuclear intacta
HIPERMASTIGINOS Y A L G U N O S D INO FLAG ELAD O S POCO C O M U N E S
centríolos microtúbulos polares
se forma un huso central único entre los centríolos, en un túnel a través de la envoltura nuclear intacta; los cromosomas están unidos a la membrana nuclear por sus cinetocoros e interaccionan indirectamente con el huso a través de sus microtúbulos cinetocóricos
microtubulos cinetocóricos
LE V A D U R A S Y DIATOM EAS
la envoltura nuclear permanece intacta; en el interior del núcleo se forman microtúbulos polares del huso y se asocian con la envoltura nuclear; un único microtúbulo cinetocórico une cada cromosoma a uno de los polos microtúbulos cinetocóricos centríolos AN IM ALES
el huso empieza a formarse fuera del núcleo; durante la prometafase la envoltura nuclear se rompe permitiendo a los cromosomas que capturen los microtúbulos del huso, que ahora se convertirán en microtúbulos cinetocóricos fragmentos de envoltura nuclear
E n los
hipermastiginos, en los que la en v o ltu ra n u cle a r p e rm a n e c e tam b ién
in ta cta a lo largo de la m itosis, se o b serv a u n a h uso algo m ás avan zad o, au n q u e aú n e xtran u clear. E sto s g ran d es p ro to z o o s del in testin o de los in secto s p ro p o r cio n a n u n ejem plo p a rticu la rm e n te claro de la in d e p e n d e n cia en tre la elo n g a ció n del h u so y los m o v im ien to s de los cro m o s o m a s que se p a ra n las cro m átid as, ya q ue los cin e to c o ro s h e rm a n o s se se p a ra n p o r el cre cim ie n to de la en voltu ra n u cle a r (a la q ue e stá n ad herid os) an tes de ad h erirse al h u so . Sólo cu a n d o los ci n e to co ro s está n c e rc a de los p olos del h u so , ad q u ieren la fibras cin e to có rica s n ece sa ria s p a ra u n irse al h u so . P u esto que las fibras del h u so e stá n sep arad as de los cro m o so m a s p o r la e n v o ltu ra n u clear, d ich as fibras, que se fo rm an en el e x terio r del n ú cleo , se h a n de u nir de algu n a m a n e ra a los cro m o so m a s a través de las m e m b ra n a s n u cleares. T ras p ro d u cirse e sta u nión, los cin e to co ro s se d esp la zan de fo rm a co n v e n cio n a l (véase F ig u ra 1 8 -4 0 ).
101 0
Capítulo 18: Los mecanismos de la división celular
Figura 18-40 Distintos mecanismos de división de los cromosomas utilizados por diferentes organismos. Algunos de estos mecanismos podrían haber sido estadios intermedios en la evolución del huso mitótico de organismos superiores. En todos los ejemplos sólo se muestra la región nuclear central, salvo en el de bacteria.
U n estad io m ás av an zad o en la evolu ción de los m e ca n ism o s m itó tico s p o dría estar rep resen ta d o p o r los o rg an ism o s que fo rm an el h uso d en tro de un n ú cleo in tacto . T an to en las levad u ras c o m o en las d iato m eas el h uso se u ne a los cro m o so m a s p or sus c in e to co ro s y los c ro m o so m a s se segregan de m o d o m u y p arecid o al d escrito p a ra las células de m am ífero -s a lv o que to d o el p ro ce so o cu rre d en tro de los lím ites de la en voltu ra n u clear (véase Figu ra 1 8 -4 0 ). Se cree que la m itosis “a b ie rta ” en org an ism o s su p eriores y la m itosis “c e rra d a ” de leva d u ras y d iato m eas ev o lu cio n aro n de m a n e ra se p a ra d a a p artir de un a n tep asad o co m ú n p arecid o al h uso del h ip erm astigin o m o d ern o . En este m o m e n to no existe n in gun a exp licació n co n v in ce n te de p o r qué an im ales y p lan tas su p eriores h an d esarrollad o un a p a ra to m itó tico que req u ie re la d isolu ción co n tro la d a y reversible de la en voltu ra n u clear.
Resumen
La división celular termina con la división del contenido citoplasmático mediante el proceso denominado citocinesis, y con la descondensación de los cromosomas, con lo cual se reinicia la síntesis de RNA. Parece ser que la citocinesis está dirigida mediante haces organizados de filamentos de actina en células eucariotas tan di versas como las de animales, vegetales y hongos. En las células animales el huso mi tótico determina dónde y cuándo ocurre la citocinesis; el anillo contráctil de actina y miosina forma un puente a medio camino entre los ásteres de los polos del huso. Mientras que la mayoría de las células se dividen simétricamente, en algunos casos el huso se coloca deforma especial generando una división celular asimétrica: por ejemplo una célula determinada se puede dividir en una célula pequeña y una grande, o un componente citoplasmático determinado puede desplazarse a un ex tremo de la célula antes de la citocinesis de modo que sólo sea heredado por una de las células hijas, que de otra forma hubieran sido idénticas. En las células vegetales superiores la citocinesis tiene lugar mediante un mecanismo especial: el citoplasma se divide mediante la construcción de una nueva pared celular, la placa celular, en el interior de la célula. La colocación de la placa celular se determina según la colo cación de la franja metafásica de microtúbulos y filamentos de actina. En algunos protozoos y hongos la organización de la mitosis difiere de la de animales y plan tas, lo cual sugiere la posible y complicada evolución del proceso de división celular de las células eucariotas.
Citas
Bibliografía
1. M cIntosh, J.R.; McDonald, K.L. The m itotic spindle. 2 6 1 (4 ):4 8 -5 6 ,1989.
Am.
General Amos, L.A.; Amos, W.B. Molecules of the Cytoskeleton. New York: Guilford Press, 1991. Conrad, G.W.; Schroeder, T.E., eds. Cytokinesis: m ech a nisms of furrow form ation during cell division. Vol. 582. New York: Academy of Scien ces, 1990. Hyams, J.S.; Brinkely, B.R., eds. Mitosis: M olecules and M e chanism s. San Diego, CA: Academ ic Press, 1989.
N.Y. Acad. Sci.,
Ann.
Mazia, D. Mitosis and the physiology of cell division. In The Cell (J. Brachet, A.E. Mirsky, eds.), Vol. 3, pp. 77-412. London: A cadem ic Press, 1961. Wilson, E.B. The Cell in Developm ent and Heredity, 3rd ed. with corrections. New York: Macmillan, 1925, 1928. Re printed, New York: Garland, 1987. Zim m erm an, A.M.; Forer, A., eds. Mitosis/Cytokinesis. New York: Academ ic Press, 1981.
Bibliografía
Sci.
Swain, K.E.; Scholey, J.M. M otor proteins in cell divi sion. 1 :1 2 2 -1 2 9 ,1 9 9 1 . 2. Gard, D.L.; Hafezi, S.; Zhang, T.; Doxsey, S.J. C entrosom e duplication continues in cyclohexim ide-treated blastulae in the absence of a detectable cell cy cle ./. 1 1 0 :2 0 3 3 -2 0 4 2 ,1 9 9 0 .
Trends Cell Biol.
Xenopus Cell Biol.
Maniotis, A.; Schliwa, M. M icrosurgical rem oval of centrosom es blocks cell reproduction and centriole ge neration in BSC-1 cells. 6 7 :4 9 5 -5 0 4 ,1 9 9 1 . Mazia, D. The chrom osom e cycle and the centrosom e cycle in the m itotic cycle. 100:49-92, 1987.
Cells
Int. Rev. Cytol.
Raff, J.W.; Glover, D.M. C entrosom es, and n ot nuclei, initiate pole cell form ation in embryos. 57:611-619, 1989. 3. Lucocq, J.M.; W arren, G. Fragm entation and partitio ning of the Golgi apparatus during mitosis in HeLa cells. 6:3239-3246, 1987.
Drosophila
Cell
EMBOJ.
1011
McConnell, S.J.; Yaffe, M.P. Interm ediate filament for m ation by a yeast protein essential for organelle in heritance. 2 6 0 :6 8 7 -6 8 9 ,1 9 9 3 .
Science
W arren, G. Mitosis and m em branes. 8 5 8 ,1 9 8 9 .
Nature
342:857-
4. Gelfand, V.I.; Scholey, J.M. Every m otion has its m otor. 359:480-482, 1992.
Nature
Karsenti, E. Mitotic spindle morphogenesis in animal cells. 2:25 1 -2 6 0 , 1991.
Semin. Cell Biol.
M cIntosh, J.R.; Koonce, M.P. Mitosis. 628, 1989.
Science 246:622-
Wadsworth, P. Mitosis: spindle assembly and ch ro m o som e m otion. 5:123-128, 1993.
Curr. Opin. Cell Biol.
5. Belmont, L.D.; Hyman, A.A.; Sawin, K.E.; M itchison, T.J. R eal-tim e visualization of cell cycle dependent ch an ges in m icrotubule dynam ics in cytoplasm ic extracts. 62:579-58 9 , 1990.
Cell
Buendia, B.; D raetta, G.; Karsenti, E. Regulation of the m icrotubule nucleating activity of centrosom es in egg extracts: role of cyclin A-associated p ro tein kinase. 1 1 6 :1 4 3 1 -1 4 4 2 ,1 9 9 2 .
Xenopus
J. CellBiol.
In vitro Xenopus Nature
Gotoh, Y.; Nishida, E.; M atsuda, S.; et al. effects on m icrotubule dynam ics of purified M phase-activated MAP kinase. 349:251-254, 1991. Kuriyama, R.; Borisy, G.G. M icrotubule-nucleating acti vity of cen trosom es in Chinese ham ster ovary cells is independent of the centriole cycle but coupled to the m itotic cy cle ./. 9 1 :822-826, 1981.
CellBiol.
ring chrom osom e attachm ent to the spindle in newt lung cells./. 110:81-95, 1990.
CellBiol.
Vallee, R. Dynein and the kinetochore. 2 0 7 ,1 9 9 0 .
Nature 345:206-
10. M itchison, T.J. M icrotubule dynam ics and kinetochore function in mitosis. 4:527-549, 1988.
Annu. Rev. Cell Biol.
11. Rieder, C.L.; Davison, E.A.; Jensen, L.C.W.; Cassimeris, L.; Salmon, E.D. Oscillatory movem ents of m ono-orien ted chrom osom es and their position relative to the spindle pole result from the ejection properties of the aster and half-spindle./. 103:581-591,1986.
CellBiol.
12. Nicklas, R.B.; Krawitz, L.E.; W ard, S.C. Odd ch rom oso m e m ovem ent and inaccurate chrom osom e distribu tion in mitosis and meiosis after treatm en t with p ro tein kinase inhibitors./. 1 0 4 :9 6 1 -9 7 3 ,1 9 9 3 .
CellSci.
Nicklas, R.B.; Kubai, D.F. M icrotubules, chrom osom e m ovem ent, and reorientation after chrom osom es are detached from the spindle by m icrom anipulation. 9 2 :3 1 3 -3 2 4 ,1 9 8 5 .
Chromosoma
13. Bajer, A.S.; M ole-Bajer, J. Spindle Dynamics and Chro m osom e M ovements. New York: Academ ic Press, 1972. Hays, T.S.; Salmon, E.D. Poleward force at the kineto chore in m etaphase depends on the num ber of kine tochore m icrotubules./. 110:391-404, 1990.
CellBiol.
McNeill, P.A.; Berns, M.W. Chrom osom e behavior after laser microirrdiation of a single kinetochore in m ito tic PtK2 cells./. 88:543-553, 1981.
CellBiol.
Vale, R.D. Severing of stable m icrotubules by a m itotically activated protein in egg extracts. 64:827-839, 1991.
Cell
Oestergren, G. The m echanism of coordination in biva lents and multivalents. The theory of orientation by pulling. 37:85-156, 1951.
6. M cDonald, K.L.; Edwards, M.K.; M cIntosh, J.R. Crosssectional structure of the central m itotic spindle of 8 3 :443-461, 1979.
14. Inoue, S.; Ritter, H.J. Dynamics of m itotic spindle orga nization and function. In M olecules and Cell M ove m ent (S. Inoue, R.E. Stephens, eds.), Society of G ene ral Physiologists Series, Vol. 30, pp. 3-30. New York: Raven Press, 1975.
Xenopus
Diatoma vulgare.J. CellBiol.
Nislow, C.; Lombillo, V.A.; Kuriyama, R.; M cIntosh, J.R. A plus-end-directed m o to r enzym e that m oves anti parallel m icrotubules localizes to the inter zone of m itotic spindles. 3 5 9 :5 4 3 -5 4 7 , 1992.
in vitro Nature
Saunders, W.S.; Hoyt, M.A. Kinesin-related proteins re quired for structural integrity of the m itotic spindle. 70:451-458, 1992.
Cell
Sawin, K.E.; M itchinson, T.J. M itotic spindle assembly by two different pathways 112:925-940, 1991.
in vitro. J. Cell Biol.
7. Rieder, C.L. The form ation, structure and com position of the m am m alian kinetochore and kinetochore fi ber. 79:1-58, 1982.
Int. Rev. Cytol.
8. Bloom, K. The cen trom ere frontier: kinetochore co m p o nents, m icrotubule-based motility, and the CEN-va lue paradox. 7 3 :621-624, 1993.
Cell
Clarke, L.; Carbon, J. The structure and function of yeast centrom eres. 19:29-56, 1985.
Annu. Rev. Genet.
Earnshaw, W.C.; Tomkiel, J.E. C entrom ere and kineto chore structure. 4:86-93, 1992.
Curr. Opin. CellBiol.
Haaf, T.; W arburton, P.E.; Willard, H.F. Integration of h um an a-satelite DNA into sim ian chrom osom es: cen trom ere protein binding and disruption of n o r m al ch rom o so m e segregation. 7 0 :6 8 1 -6 9 6 , 1992.
Hereditas
M itchison, T.J. Polewards m icrotubule flux in the m ito tic spindle: evidence from photoactivation of fluores c e n c e ./. 109:637-652, 1989.
CellBiol.
Salmon, E.D.; Leslie, R.J.; Saxton, W.M.; McIntosh, J.R. Spindle microtubule dynamics in sea urchin embryos. Analysis using fluorescence labeled tubulin and m ea surements of fluorescence redistribution after laser photobleaching./. 99:2 1 6 5 -2 1 7 4,1984.
CellBiol.
Sawin, K.E.; Endow, S.A. Meiosis, mitosis and m icrotuble m otors. 15:399-407, 1993.
Bioessays
15. Murray, A.W.; Szostak, J.W. C hrom osom e segregation in mitosis and meiosis. 1:289-315, 1985.
Annu. Rev. Cell Biol.
Shamu, C.E.; Murray, A.W. Sister chrom atid separation in frog egg extracts requires DNA topoisom erase II acti vity during anaphase./. 1 17:921-934,1992.
CellBiol.
Surana, U.; Amon, A.; Dowzer, C.; et al. Destruction of the CDC28/CLB m itotic kinase is not required for the m etaphase to anaphase transition in budding yeast. 1 2 :1 9 6 9 -1 9 7 8 ,1 9 9 3 .
EMBOJ.
J. Cell Biol.
16. Holloway, S.; Glotzer, M.; King, R.W.; Murray, A.W. Anaphase is initiated by proteolysis rather than by the inativation of m aturation-prom oting factor. 73:1393-1402, 1993.
Rieder, C.L.; Alexander, S.P. Kinetochores are transpor ted polewards along a single astral microtubule du
Hoyt, M.A.; Totis, L.; Roberts, B.T. S. genes re quired for cell cycle arrest in response to loss of m i 66:507-517, 1991. crotubule function.
Cell
9. Euteneuer, U.; M cIntosh, J.R. Structural polarity of kine toch ore m icrotubules in PtK, cells. 89:338-345, 1981.
101 2
Capítulo 18 : Los mecanismos de la división celular
Cell
cerevisiae
Cell
Levan, A. The effect of colchicine in root m itoses in 4 0 :4 7 1 -4 8 6 ,1 9 3 8 .
Allium. Hereditas
Li, R.; Murray, A.W. Feedback control of mitosis in bud ding yeast. 6 6 :5 1 9 -5 3 2 ,1 9 9 1 .
Cell
Rieder, C.L.; Palazzo, R.E. Colcemid and the m itotic cy c le ./. 1 0 2 :3 8 7 -3 9 2 ,1 9 9 2 .
Cell Sci.
Zirkle, R.E. U ltraviolet-m icrobeam irradiation of new t cell cytoplasm : spindle destruction, false anaphase, and delay of true anaphase. 41:516-537, 1970.
Radiat. Res.
17. Ris, H. The anaphase m ovem ent of chrom osom es in the sperm atocytes of grasshoppers. 9 6 :9 0 -1 0 6 ,1 9 4 9 .
Biol. Bull. (Woods
Hole).
18. Coue, M.; Lombillio, V.A.; M cIntosh, J.R. M icrotubule depolymerization prom otes particle and ch rom oso m e m ovem ent 112:1165-1175, 1991.
in vitro. J. Cell Biol.
Gorbsky, G.J.; Sammak, P.J.; Borisy, G.G. M icrotubule dynam ics and chrom osom e m otion visualized in liv 1 0 6 :1 1 8 5 -1 1 9 2 ,1 9 8 8 . ing anaphase cells./.
Cell Biol.
M itchison, T.J.; Salmon, E.D. Poleward kinetochore fi ber m ovem ent occurs during both m etaphase and anaphase-A in newt lung cells. /. 119:5695 8 2 ,1 9 9 2 .
Cell Biol.
Nicklas, R.B. The forces that m ove chrom osom es in m i tosis. 17:431-449, 1988.
Annu. Rev. Biophys. Biophys. Chem.
19. Aist, J.R.; Bayles, C.J.; Tao, W.; Berns, M.W. Direct expe rim ental evidence for the existence, structural basis and function of astral forces during anaphase B 1 0 0 :2 7 9 -2 8 8 ,1 9 9 1 .
Schweisguth, F.; Vincent, A.; Lepesant, J.A. Genetic analysis of the cellularizationof the em bryo. 7 2 :1 5 -2 3 ,1 9 9 1 .
Drosophila
Biol. Cell
22. Bray, D.; White, J.G. Cortical flow in animal cells. 2 3 9 :8 8 3 -8 8 8 ,1 9 8 8 .
ence
Sci
Fluck, R.A.; Miller, A.L.; Jaffe, L.F. Slow calcium waves accom p an y cytokinesis in fish eggs. /. 1 1 5 :1 2 5 9 -1 2 6 5 ,1 9 9 1 .
Medaka
Biol.
Cell
Rappaport, R. Establishm ent of the m echanism of cyto kinesis in anim al cells. 105:245-281, 1986.
Int. Rev. Cytol
23. Hyman, A.A.; W hite, G.J. D eterm ination of cell division axes in the early em bryogenesis of 1 0 5 :2 1 2 3 -2 1 3 5 ,1 9 8 7 .
Caenorhabditis
elegans.J. Cell Biol
Schroeder, T.E. Fourth cleavage of sea urchin blastom eres: m icrotubule patterns and m yosin localization in equal and unequal Gell divisions. 124:9-22, 1987.
Dev. Biol.
24. Cao, L.-G.; W ang, Y.-L. M echanism of the form ation of contractile ring in dividing cultured anim al cells. II. Cortical m ovem ent of m icroinjected actin filaments. /. 1 1 1 :1 9 0 5 -1 9 1 1 ,1 9 9 0 .
Cell Biol.
Fukui, Y.; DeLozanne, A.; Spudich, J.A. Structure and function of the cytoskeleton of a m yo sin-defective m u ta n t./. 1 1 0 :3 6 7 -3 7 8 ,1 9 9 0 .
Cell Biol
Dictyostelium
Karess, R.E.; Chang, X.-J.; Edward, K.A.; et al. The regu latory light chain of non-m uscle myosin is encoded by a gene required for cytokinesis in 6 5 :1 1 7 7 -1 1 8 9 ,1 9 9 1 .
spaghetti-squash, Drosophila. Cell
in
M abuchi, I.; Okuno, M. The effect of m yosin antibody on the division of starfish blastom eres. /. 7 4 :2 5 1 -2 6 3 ,1 9 7 7 .
Hiram oto, Y.; Nakano, Y. M icrom anipulation studies on the m itotic apparatus in sand dollar eggs. 1 0 :1 7 2 -1 8 4 ,1 9 8 8 .
Schroeder, T.E. Dynamics of the contractile ring. In M o lecules and Cell M ovem ent (S. Inoue, R.E. Stephens, eds.), Society of General Physiologists Series, Vol. 30, pp. 305-334. New York: Raven Press, 1975.
vivo.J. Cell Biol.
Cell Motil.
Cytoskeleton.
Hogan, C.J.; Stephens, L.; Shimizu, T.; Cande, W.Z. Phy siological evidence for involvement of a kinesin-related protein during anaphase spindle elongation in diatom central spindles. /. 119:1277-1286, 1992.
Cell Biol.
M cIntosh, J.R.; M cdonald, K.L.; Edwards, M.K.; Ross, B.M. Three-dim ensional structure of the central m i totic spindle of 83:4284 4 2 ,1 9 7 9 .
Diatoma vulgare. J. Cell Biol.
Cell Biol.
25. Cowing, D.W.; Kenyon, C. Expression, of the h om eotic gene during em bryo genesis. 1 1 6 :4 8 1 -4 9 0 ,1 9 9 2 .
mab-5 Caenorhabditis elegans Development
Kemphues, K.J.; Priess, J.R.; M orton, D.G.; Cheng, N. Identification of genes required for cytoplasm ic localizaton in early C. em bryos. 52:311-320, 1988.
elegan
Cell
20. Gerace, L.; Blobel, G. The nuclear lam ina is reversibly depolymerized during mitosis. 1 9 :2 7 7 -2 8 7 ,1 9 8 0 .
Strome, S. G eneration of cell diversity during early em bryogenesis in the n em atode 1 1 4 :8 1 -1 2 3 ,1 9 8 9 .
Gerace, L.; Burke, B. Functional organization of the nu clear envelope. 4 :3 3 5 -3 7 4 ,1 9 8 8 .
26. Lam bert, A.-M. M icrotubule-organizing centers in hig her plants. 5 :1 1 6 -1 2 2 ,1 9 9 3 .
Cell
Annu. Rev. Cell Biol.
M oreno, S.; Nurse, P. Substrates for p34cdc2: 61 :5 4 9 -5 5 1 ,1 9 9 0 .
tas?Cell
in vivo veri-
in vitro: stages of as Cell 48:205-217,
Newport, J. Nuclear reconstitution sembly around protein-free DNA. 1987.
Nigg, E.A. Assembly and cell cycle dynam ics of the nu clear lam ina. 3 :2 4 5 -2 5 3 ,1 9 9 2 .
Semin. Cell Biol.
Swanso, J.A.; McNeil, P.L. N uclear reassem bly excludes large m acrom olecules. 2 3 8 :5 4 8 -5 5 0 ,1 9 8 7 .
Science
21. Mabuchi, I. Biochem ical aspects of cytokinesis. 1 0 1 :1 7 5 -2 1 3 ,1 9 8 6 .
Cytol.
Salmon, E.D. Cytokinesis in anim al cells 1 :5 4 1 -5 4 7 ,1 9 8 9 .
Cell Biol
Satterwhite, L.L.; Pollard, T.D. Cytokinesis. 4 :4 3 -5 2 ,1 9 9 2 .
Cell Biol.
Bibliografía
Int. Rev.
.Curr. Opin. Curr. Opin.
gans. Int. Rev. Cytol.
Caenorhabditis ele
Curr. Opin. Cell Biol
Lloyd, C.W., ed. The Cytoskeletal Basis of Plant Growth and Form . London: A cadem ic Press, 1991. Staiger, C.; Doonan, J. Cell division in plants. 5 :2 2 6 -2 3 1 ,1 9 9 3 .
Opin. Cell Biol.
Curr.
27. Gunning, B.E.S.; Wick, S.M. Preprophase bands, phragm oplasts and spatial control of cytokinesis. /. 2 :1 5 7 -1 7 9 ,1 9 8 5 .
Suppl.
Cell Sci.
Marks, J.; Hagan, I.; Hyams, J.S. Growth polarity and cy tokinesis in fission yeast: the role of the cytoskeleton. /. 5 :2 2 9 -2 4 1 ,1 9 8 6 .
Cell Sci. Suppl
Pickett-Heaps, J.D.; Northcore, D.H. Organization of microtubules and endoplasm ic reticulum during m i tosis and cytokinesis in wheat m eristem s. /. 1 :1 0 9 -1 2 0 ,1 9 6 6 .
Cell Sci.
Wick, S.M. Spatial aspects of cytokinesis in plant cells. 3 :2 5 3 -2 6 0 ,1 9 9 1 .
Curr. Opin. Cell Biol.
1013
28. de Boer, P.A.J. C hrom osom e segregation and cytokine sis in bacteria. 5:232-237, 1993.
Curr. Opin. CellBiol.
D onachie, W.D.; Robinson, A.C. Cell division: param eter values and the process. In and Cellular and M olecular Biology (F.C. Neidhardt et al., eds.), pp. 1578-1593. Washing ton, DC: Am erican Society for Microbiology, 1987.
nella typhimurium:
101 4
Escherichia coli
Salmo
Capítulo 18 : Los mecanismos de la división celular
Heath, I.B. Variant m itoses in lower eukaryotes: indica tors of the evolution of mitosis? 64:180, 1980.
Int. Rev. Cytol.
Kubai, D.F. The evolution of the m itotic spindle. 4 3 :1 6 7 -2 2 7 ,1 9 7 5 .
Rev. Cytol.
Int.
Wise, D. The diversity of mitosis: the value of evolution ary experim ents. 6 6 :5 1 5 -5 2 9 ,1 9 8 8 .
Biochem. CellBiol.
Las células en su contexto social 20 Células germinales y fecundación 21 Mecanismos celulares del desarrollo || Cj|¡fll lillllif 22 Células diferenciadas y conservación de los tejidos j»■ ■■
23 El sistema inmunitario
Un embrión de ratón de 15 días de gestación.
Arabidopsis.
Sección transversal del tallo de la planta con flores Utilizando sondas fluorescentes para la celulosa ( y para la pectina se pone de manifiesto la distribución relativa de estos dos polisacáridos propios de la pared celular o de la matriz extracelular. (Por cortesía de Paul Linstead.)
azul)
{verde),
Adhesión celular, uniones celulares y matriz extracelular
¿¿i • U niones celulares • Adhesión in tercelu lar • La m a triz extracelu lar • R eceptores de la m atriz e x tracelu lar en células an im ales: lasin teg rin as • La pared celu lar de los
E n la m ayoría de los organ ism os pluricelulares, las células se organizan en co n ju n tos coop erativos d en om in ad os que, a su vez, se aso cian form an do grandes
tejidos, órganos.
u nidades funcionales d en om in ad as Las células co n ta cta n , gen eralm ente, co n u n a com p leja red de m acro m o lécu las secretad as, d en om in ad a É sta p articip a en el m an ten im ien to de la estru ctu ra tisular y en los anim ales
matriz extrace-
lular.
p osee u n a organ ización reticular m ed ian te la cual las células p ued en m igrar e interaccio n ar. En m u ch o s caso s las células integrantes de un tejido tam b ién se m a n tienen en su lugar p or m edio de adhesiones intercelulares.
En v erteb rad o s los tejidos prin cip ales son el nervioso, el muscular, el sanguí neo, el linfoide, el epitelial y el conjuntivo. El tejido con ju ntivo y el epitelial re
p resen tan los dos e x tre m o s en los que el papel estru ctu ral que ju ega la m atriz y las ad h esio n es in tercelu lares son ra d ica lm e n te d iferentes (Figura 1 9-1). En el te jido conjuntivo (C apítulo 22) la m atriz extracelu lar es m u y a b u n d an te, m ien tras q ue las célu las están p o co rep resen tad as. La m atriz es rica en p o lím ero s, p rin ci p alm en te co lág en as, siendo la resp o n sab le prin cip al de la re sp u e sta a las te n sio n es a las que está su jeto el tejido. Las células, que se e n cu e n tra n u nidas a dife ren tes co m p o n e n te s de la m atriz, p u ed en e jercer so b re é sta diversas fuerzas, m ien tras que la co n trib u ció n de las u n ion es in tercelu lares es e sca sa . P o r el c o n trario, en los tejidos epiteliales las células se e n cu e n tra n e stre ch a m e n te u nidas fo rm an d o lám in as (d en o m in ad as
epitelios).
La m atriz extracelu lar es e s ca sa y
LUZ INTESTINAL lá m in a de c é lu la s e p ite lia le s
t e jid o c o n ju n t iv o
m u s c u lo lis o
fib r a s c ir c u la r e s f ib r a s lo n g it u d in a le s t e jid o c o n ju n t iv o
lá m in a d e c é lu la s e p ite lia le s
Figura 19-1 Esquema simplificado de un corte transversal de la pared intestinal. Este órgano alargado, en forma de tubo, está constituido por tejido epitelial tejido conjuntivo y tejido muscular Cada tejido es un conjunto organizado de células que se mantienen unidas entre sí mediante uniones célula-célula, célula-matriz extracelular o por ambas.
{rojo), {verde) {amarillo).
1017
está co n stitu id a p rin cip alm en te p o r u n a delgada c a p a d en o m in ad a
lámina basal,
que está en la b ase de las células, las cu ales o cu p a n la m ay o r p arte del volum en. Es en éstas d on d e reside, sob re tod o, la o p o sició n a las ten sion es, m ed ian te fila m en to s in tracelu lares de ca rá c te r p ro teico (co m p o n e n te s del citoesqu eleto) que se en trecru zan en el cito p lasm a de la célu la epitelial, tran sm itien d o la ten sión de u n a célula a o tra; los filam en tos se an clan d irecta o in d irectam en te a p roteín as tra n sm e m b ra n a de la m e m b ra n a p lasm ática, en regiones dond e se localizan u n ion es esp ecializad as co n otras células, o co n la lám in a basal. Las ca p a s de célu las epiteliales tap izan to d as las cavid ad es y superficies li b res del o rg an ism o y, m e d ia n te sus u n io n es esp ecializad as, d o tan a aquéllas de p ro p ied ad es de b a rre ra que restrin g en el m o v im ien to del agua, solu tos y células en tre los diversos co m p a rtim ie n to s del o rg an ism o . C o m o se ilustra en la Figura 19-1, los epitelios se sitúan so b re so p o rtes de tejido con ju ntivo, el cu al p u ed e co n stitu ir u n n exo c o n o tro s tejidos (m u scu lar, p o r ejem plo), los cu ales no p re sen tan , n e ce sa ria m e n te , u n a o rg an izació n epitelial o con ju ntiva. En este cap ítu lo tra ta re m o s in icialm en te de la e stru ctu ra y o rgan ización de las u n ion es célu la-célu la y célu la-m atriz (en co n ju n to d en o m in ad as A co n tin u a ció n estu d iarem o s có m o las células an im ales se re co n o ce n en tre sí e inician la fo rm ació n de u n ion es celu lares en los p ro ce so s de re c o n o c i m ien to celu lar form an d o tejidos y órgan os. F in alm en te tra ta re m o s de la e stru ctu ra y o rgan ización de la m atriz extracelu lar anim al y de la p ared celu lar en plantas.
uniones ce
lulares).
Uniones celulares1 A unque las uniones celulares so n e sp ecialm en te ab u n d an tes e im p o rtan tes en el tejido epitelial, tam b ién se localizan en regiones de c o n ta cto célu la-célu la y c é lu la-m atriz de to d o s los tejidos. La m ay o ría de estas u n io n es tien en un ta m a ñ o que se e n cu e n tra n p o r debajo de la reso lu ció n que p ro p o rcio n a el m icro sco p io óp tico , p o r lo que d eb en ser visualizadas m ed ian te la m icro sco p ía electró n ica, bien sea co n v en cio n a l o b ien c o n la té cn ica de la crio fractu ra. A m bas m u estran que las region es de las m e m b ra n a s p lasm áticas que in te ra ccio n a n (y, a m en u d o, el cito p lasm a su b y acen te y el e sp acio in tercelular) son alta m e n te especializadas. Las u n ion es celu lares p u ed en clasificarse en tres grupos fu n cion ales: (1) uniones de oclusión, q ue im p lican un sellado en tre las células epiteliales, el cu al im pide el trasiego, incluso de p eq u eñ as m o lécu las, en tre las dos superficies del epitelio; (2) uniones de anclaje, las cu ales u nen , m e cá n ica m e n te , las células (y sus cito esq ueletos) a sus vecin as o a la m atriz extracelu lar; y (3) uniones de comunicación que, m ed ian te el p aso de señ ales q u ím icas o e léctricas en tre las células a d y a c e n tes, p erm iten su in te ra cció n .
Tabla 19-1 Clasificación funcional de las uniones celulares 1. Uniones de oclusión (uniones estancas) 2. Uniones de anclaje a. regiones de anclaje de los filamentos de actina (uniones adherentes) i. célula-célula (por ejem plo, bandas de adhesión) ii. célula-m atriz (por ejemplo, co n tactos focales) iii. septadas (sólo en invertebrados) b. regiones de anclaje de los filamentos intermedios i. célula-célula (desm osom as) ii. célula-m atriz ( hem idesm osom as) 3. Uniones de comunicación a. uniones de tipo gap b. sinapsis eléctricas c. plasm odesm os (exclusivam ente en vertebrados)
101 8
Capítulo 19: Adhesión celular, uniones celulares y matriz extracelular
E n la T abla 19-1 se re la cio n a n los p rin cip ales tipos de u n io n es in tercelu la res. T ratarem o s ca d a u n a de ellas a e x ce p ció n de las sinapsis q u ím icas, las c u a les están co n stitu id as exclu siv am en te p o r células nerviosas, que se rá n tra ta d a s e sp ecíficam en te en los C apítulos 11 y 15.
Las uniones estancas form an una barrera de permeabilidad selectiva a través de los epitelios2 A p esar de las gran d es diferencias e stru ctu rales y b io q u ím icas en tre los d iferen tes tipos de epitelios, to d o s tienen , c o m o m ín im o, u n a im p o rta n te fu n ción en co m ú n : co n stitu y en b a rre ra s selectivas de p erm eab ilid ad, sep aran d o fluidos de d iferente co m p o sició n . Las uniones estancas ju eg an un im p o rta n te doble p apel en el m an ten im ien to de e sta fu n ció n de b a rre ra selectiva; un b u en ejem plo ilus trativo es el epitelio intestin al de los m am íferos. Las células epiteliales que tap izan in te rn a m e n te el in testin o delgado m a n tien en la m ay o r p a rte del co n te n id o in testin al en la cavid ad in te rn a (luz in testi nal). Sin em b arg o , sim u ltá n e a m e n te , b o m b e a n n u trien tes de m a n e ra selectiv a a través del epitelio h a cia el p lasm a del tejido con ju ntivo su b y acen te (véase Figu ra
transporte transce-
19 -1 ), el cu al es d ren ad o h a cia los cap ilares san guíneos. E ste d ep en d e de dos grupos de p ro teín as tra n sp o rta d o ra s lo calizad as en la m e m b ra n a p lasm á tica : u n o en el (la región m e m b ra n o s a en c o n ta c to co n la luz intestinal) que b o m b e a n u trien tes h a cia el in terio r de la célula
lular
dominio apical
dominio basolateral
epitelial; otro , situad o en el (basal y lateral) que tra n sp o rta las m ism as m olécu las m e d ia n te difusión facilitad a h a cia el p la sm a situad o en la o tra c a ra m e m b ra n o sa . El m an te n im ie n to de la u n id ireccio n alid ad de este tra n sp o rte im p lica la im posibilidad de m ig ració n re cíp ro ca de los tra n s p o rta d o res en tre u n o y o tro d om in io de la m e m b ra n a . A d em ás, los esp acio s in tercelu la res existen tes en tre las célu las h a n de e sta r sellados p a ra im p ed ir la difusión p a siva h a cia la luz in testin al de los n u trien tes (Figura 1 9 -2 ).
superficie apical
---------.
LUZ INTESTINAL
membranas plasmáticas de las células adyacentes
g lu c o s a )
\———/
simporte de glucosa impulsado
glucosa
BAJA
por Na+
alta concentración de glucosa
transportador pasivo de glucosa superficie basolateral
célula glucosa
SANGRE
Uniones celulares
BAJA
Figura 19-2 Papel de las uniones estancas en el transporte transcelular. En las células epiteliales del intestino delgado, las proteínas transportadoras se hallan confinadas en diferentes regiones de la membrana plasmática. Esta regionalización permite una transferencia vectorial de nutrientes desde la luz intestinal hasta la sangre a través de la lámina epitelial. La figura muestra el transporte activo de la glucosa hacia el interior de la célula, mediante un mecanismo de simporte de glucosa impulsado por Na+, situado en la membrana apical, y posterior difusión de la glucosa hacia el espacio extracelular por un mecanismo de difusión facilitada mediado por transportadores de glucosa situados en la membrana basolateral. Se supone que las uniones estancas confinan las proteínas de transporte en sus dominios de membrana apropiados, actuando como barreras en el seno de la bicapa lipídica de la membrana plasmática; estas uniones también bloquean la difusión de glucosa desde la cara basal del epitelio hacia la luz intestinal.
1019
S I ra l
Figura 19-3 Las uniones estancas permiten a las láminas celulares actuar como barreras en la difusión de solutos. (A) Dibujo esquemático
m o lé c u la t ra z a d o r a
{S)
(A)
0,5 pm
0,5 |jm
Se cree que son las u n ion es e sta n ca s los elem en to s b lo q uean tes de am b o s ti p o s de difusión. E n p rim er lugar, a ctú a n co m o b arreras c o n tra la libre difusión de
donde se muestra cómo una pequeña molécula trazadora extracelular depositada en una de las caras de un epitelio no puede pasar a través de las uniones estancas, las cuales sellan las células adyacentes. (B) Imágenes de microscopía electrónica de células epiteliales en las que se ha depositado en el exterior de la célula, ya sea en la cara apical (a la o bien en la cara basolateral (a la una pequeña molécula trazadora electrodensa; en ambos casos el trazador se detiene en la unión estanca. (B, cortesía de Daniel Friend.)
izquierda) derecha)
las p roteín as de m e m b ra n a en tre los dom in ios ap ical y b asolateral de la m e m b ra n a (véase Figu ra 19 -2 ). Sin em b arg o , se ob serva este tipo de difusión cu an d o las u n ion es esta n ca s se d eso rg an izan al elim inar el C a2+ del m ed io extracelu lar, el cu al es n ecesario p a ra m a n te n e r la integridad de d ich as u niones. En segundo lu gar, co n stitu y en un sistem a de sellado en tre las células vecin as, de tal m a n e ra que las m o lécu las h idrosolubles no p u ed en difundir en tre las células: cu an d o se in y e cta un m a rca d o r electro d en so de bajo p eso m o lecu lar en el esp acio ad y acen te
Figura 19-4 Estructura de una unión estanca localizada entre células epiteliales del intestino delgado. Las uniones estancas se muestran esquematizadas en (A) y observadas mediante criofractura en (B) o mediante microscopía electrónica convencional en (C). Nótese que las células están orientadas con la región apical hacia la parte inferior. En (B), el plano de micrografía es paralelo al plano de la membrana, y la unión estanca aparece como una banda de anastomosadas que rodean cada célula en la lámina. Las hebras de sellado se observan como crestas formadas por partículas intramembrana, situadas en la cara citoplasmática de la fractura (cara P) o sus depresiones complementarias en la cara externa de la fractura (cara E) (véase Figura 19-5). En (C) las uniones se observan como series de conexiones focales entre las hemimembranas externas de las dos membranas plasmáticas que interactúan, correspondiendo cada conexión a una hebra de sellado, observadas en sección transversal. [B y C, de N.B. Gilula, en Cell Communication (R.P. Cox, ed), págs. 1-29. New York: Wiley, 1974. Reimpresión con permiso de John Wiley & Sons, Inc.]
hebras
de sellado
u n io n e s ta n c a
rrpemb.r n a
(B)
1 02 0
Capítulo 19: Adhesión celular, uniones celulares y matriz extracelular
(O
Figu ra 1 9-5 Modelo actual de unión estanca. Se postula que las h eb ras de
m e m b r a n a s p la s m á tic a s in te r a c tu a n te s
e s p a c io in te r c e lu la r
0,6 (jm
h e b ra s d e p a r tíc u la s d e la s u n io n e s e s ta n c a s
m ita d c it o p la s m à tic a d e la b ic a p a lip id ic a c é lu la 1
c é lu la 2
sellado que m an tien en unidas las m em bran as p lasm áticas están con stituid as por h eb ras con tin u as de p roteínas tran sm em b ran a, las cuales e stab lecen co n tacto a través de esp acio intercelular, dando lugar a su sellado. En el esqu em a, se ha separado la m itad citop lasm àtica de un a de las m em b ranas co n el o b jeto de exponer las hebras p roteicas. Se han caracterizad o dos p roteínas periféricas asociadas a la cara citop lasm àtica de las u n ion es estan cas, pero la supuesta proteina tran sm em b ran a no ha sido identificad a todavía. En m icro scop ia electró n ica de criofractu ra las proteínas de la unión estan ca p erm an ecerían co n la m itad cito p lasm àtica (cara P) de la bicap a lipidica para dar el patrón de partículas in tram em b ran a observado en la Figura 19-4B, en lugar de p erm an ecer en la otra m itad com o se m u estra aquí.
a u n a de las caras del epitelio, este m a rca d o r no pued e atravesar las u niones e s ta n ca s (Figura 19-3). Aunque tod as las uniones esta n ca s son im p erm eab les al p aso de m acro m o lé cu la s, su p erm eabilidad resp ecto a m olécu las de p eq u eñ o ta m a ñ o varía m u ch o en los diversos epitelios. Por ejem plo, las uniones e sta n ca s que se en cu en tran en el epitelio que tap iza el intestino delgado son 10 0 0 0 v eces m ás p erm eab les a iones in orgán icos tales c o m o el N a+ que las que tap izan la veji ga u rinaria. Las células epiteliales p ued en m od ificar tran sito riam en te sus u n io nes e stan cas p erm itien d o un a u m en to del flujo de solutos y de agu a a través de
transporte paracelu-
las ab ertu ras de las b arreras de unión. E sta vía (d en o m in ad a ) es esp ecialm en te im p o rtan te en la a b so rció n de am in o ácid o s y m o n o sa cá ri-
lar
dos h acia el lu m en del intestino (donde su co n ce n tra ció n es a v eces su ficiente m e n te alta p ara im pu lsar el tran sp o rte pasivo en la m ism a ad ecu ad a). La estru ctu ra m o lecu lar de las uniones e stan cas no es co n o cid a, au nq u e la criofractu ra revela que están co m p u estas p o r u na red filiforme y an asto m o sad a que ro d ea en su totalidad la zo n a apical de cad a célula epitelial (Figura 19-4A y B). A nivel de la m icro sco p ía electró n ica de transm isión, las uniones se resuelven en u n a serie de con exio n es puntuales en tre las h em im em b ran as externas de las dos células ad y acen tes (Figura 19-4C ). La cap acid ad de las uniones p ara restringir el paso de iones a través de los esp acios intercelulares se in crem en ta logarítm ica m en te co n el n ú m ero de estru ctu ras filiformes de la red, efecto que se esp eraría si cad a u n a actu a ra co m o u n a b arrera independiente. Se cree que estos elem entos
f ila m e n t o s d e l c ito e s q u e le t o
filiformes están co m p u esto s p or largas hileras de proteínas tran sm em b ran a esp e cíficas, situadas en ca d a u n a de las m em b ran as p lasm áticas im plicadas, las cuales se u nen en tre sí d irectam en te ocluyendo el esp acio intercelular (Figura 19-5).
Las uniones de anclaje conectan el citoesqueleto entre células o entre la célula y la matriz extracelular Las u n io n e s d e a n c la je están a m p liam en te distribuidas en los tejidos an im ales. C ap acitan a d eterm in ad o s grupos celu lares, co m o p o r ejem plo los epitelios, p a ra co n stitu irse co m o u n idad es estru ctu rales resisten tes, co n e cta n d o los e le m en to s cito esq u elético s de u n a célu la a los esq u eletos de sus v ecin as, o a la m a triz extracelu lar (Figura 1 9 -6 ). Son e sp ecialm en te ab u n d an tes en los tejidos que están som etid os a ten sion es m e cá n ica s, co m o son los ca so s del m ú scu lo card ía-
Uniones celulares
u n io n e s d e a n c la je m a tr iz e x tr a c e lu la r
Figura 19-6 Uniones de anclaje en un tejido epitelial. R ep resen tación muy esq u em ática de cóm o las un ion es de an claje u n en los filam entos del cito esqu eleto en tre una célu la y otra y entre un a célu la y la m atriz extracelular.
1021
Figura 19-7 Organización de una unión de anclaje. Representación muy esquemática que muestra las dos clases de proteínas que constituyen una unión de anclaje: proteínas de adhesión intracelular y glucoproteínas transmembrana de unión.
co y la ep id erm is. Se lo calizan b ajo d os fo rm as e stru ctu ral y fu n cio n alm en te d i feren tes: (1) (2) y (3) Las u n ion es ad h eren te s son reg io n es de co n e x ió n e n tre fibras de a ctin a, m ien tras
uniones adherentes,
desmosomas
hemidesmosomas.
q ue los d e sm o so m a s y los h e m id e sm o so m a s lo son e n tre filam en tos in te rm e dios (véase T abla 1 9 -1 , pág. 1 0 18). A ntes de e n tra r en la d iscu sió n de los diferentes tipos de u n ion es de an claje, es in teresan te co n sid e ra r b re v e m e n te los p rin cip ios gen erales de su o rg an iza ció n . C o m o q u ed a ilustrad o en la Figu ra 19-7, estas u n ion es están co m p u e sta s
proteínas de adhesión intracelular,
p o r d os clases de p ro teín as: (1) que form an una en la c a ra c ito p la sm á tica y c o n e c ta n el co m p lejo de u n ión a filam en tos de a ctin a o a filam en tos in term ed io s; y (2)
placa
glucoproteínas transmembrana de unión, cu yo s d om in io s cito p la sm á tico s se u n en a u n a o m ás p ro teín as de a d h e
sión in tracelu lar, m ie n tra s q ue sus d o m in io s extracelu lares in te ra ccio n a n c o n la m atriz extracelu lar o co n los d o m in io s extracelu lares de glu co p ro teín as tra n s m e m b ra n a de u n ió n de o tra célula.
uniones septadas,
M u ch o m e n o s se sab e a c e rc a de las las cu ales son exclu si vas de in verteb rad o s. P ro b a b le m e n te d eb erían clasificarse c o m o u n ion es a d h e ren tes, ya que a ctú a n c o m o lugares de co n e x ió n de los filam en tos de actin a, p ero h ay indicios de que en algunos ca so s p ued en a ctu a r c o m o b arreras p e rm e a bles.
Las uniones adherentes conectan haces de fibras de actina entre células o entre la célula y la matriz extracelular3 Las u n io n e s a d h e r e n te s in te r c e lu la re s a p a re c e n b ajo d iferentes fo rm as. En la m ay o ría de los tejid os n o ep iteliales, se d e te cta n c o m o red u cid as reg io n es de ad h esió n c o n fo rm as p u n tu ales o zig zag u ean tes, que c o n e c ta n las fibras de a c ti n a situ ad as en los cito p la sm a s a p icales de célu las a d y a ce n te s. En los epitelios fo rm a n u n a b a n d a d e a d h e s ió n co n tin u a (o ), situ ad a alred ed o r de c a d a célu la epitelial, c e r c a de la m e m b ra n a lum inal y p o r d ebajo de las u n io n es e sta n ca s. En las célu las ep iteliales a d y a ce n te s, las b a n d a s de ad h esió n se e n cu e n tra n en ap o sició n , p e rm a n e cie n d o u n id as a m b a s m e m b ra n a s p o r m e c a n ism o s d ep en d ien te s de C a2+. P a re c e q ue las g lu co p ro teín as tra n sm e m b ra n a de u n ión , q ue m ed ia n d ich a u n ió n , p e rte n e c e n a u n a fam ilia de m o lé cu la s de ad
zonula adherens
cadherinas,
h esió n in tercelu la r d e p en d ien tes de C a2+, d e n o m in a d a s las cu ales tra ta re m o s m ás ad elan te. Las b a n d a s de a d h esió n se d en o m in an , en algunas o ca sio n e s, d e sm o s o m a s en b an d a, a u n q u e el té rm in o p u ed e in d u cir a erro res, y a q ue las b a n d a s de a d h e sió n so n q u ím ica m e n te m u y d iferentes de los v e rd a d ero s d esm o so m a s.
102 2
Capítulo 19 : Adhesión celular, uniones celulares y matriz extracelular
m ic r o v illi q u e se p r o y e c ta n
f ila m e n t o s d e a c tin a e n el in t e r io r d e l m ic r o v illu s
a p a r t ir d e la s u p e r f ic ie a p ic a l
u n ió n e s ta n c a
ha z d e f ila m e n to s d e a c tin a
m e m b ra n a s p la s m á tic a s la te r a le s d e la s c é lu la s e p ite lia le s a d y a c e n te s
Figura 19-8 Bandas de adhesión entre células epiteliales del intestino delgado. Esta banda de adhesión rodea cada una de las células interactuantes. Su característica principal es la de constituir un anillo contráctil de filamentos de actina, situado en la cara citoplasmática de la región membranosa implicada en la unión. Los filamentos de actina se unen de célula a célula mediante proteínas de unión transmembrana (cadherinas), cuyos dominios extracelulares se unen al dominio extracelular de una molécula de cadherina idéntica en la célula adyacente (véase Figura 19-7).
s u p e r f ic ie b a s a l
E n ca d a célu la p u ed e o b servarse un haz de fibras de a ctin a, co n tráctil, que se e n cu e n tra ad y ace n te a la b a n d a de ad h esión , que co rre paralelo a la m e m b ra n a p lasm ática, a la cu al e stá c o n e cta d o m ed ian te un co m p lejo de p ro teín as de
a-, 0 - y y-catenina (se estu d ia m ás ad elan te), vinculina, a-actinina y placoglobina. Los h a ce s de a ctin a se e n cu e n tra n in te rco n e cta d o s a
u n ión que co n tien e n
través de las cad h erin as y p ro teín as de u nión, fo rm an d o u n a ex te n sa red tra n scelu lar (Figura 1 9 -8 ). Se c re e que la co n tra c c ió n de e sta red, que d ep en d e de p ro teín as m o to ra s de tipo m iosin a, p u ed e ser la m e d ia d o ra de un p ro ce so fu n d am en tal en la m orfogén esis an im al: el p leg am ien to de los epitelios c o n stitu yen d o tu b os a n a tó m ico s y otras e stru ctu ra s co rre la cio n a d a s (Figura 19-9). Las u n io n e s a d h e re n te s c é lu la -m a triz c o n e c ta n las célu las y sus h a ce s de a ctin a a la m atriz extracelu lar. Así, p o r ejem plo, fibroblastos cu ltivados sob re su b strato s artificiales que co n tie n e n m o lécu las de la m atriz e xtracelu lar se ad-
lá m in a d e c é lu la s e p ite lia le s
kl*Wtl f ila m e n t o s d e a c tin a a s o c ia d o s a la s b a n d a s d e a d h e s ió n
kW fefefeiM ■ INVAGINACION DE LA LAMINA EPITELIAL CAUSADA POR EL ESTRECHAMIENTO, A NIVEL DE LAS BANDAS DE ADHESIÓN, DE LAS CÉLULAS SITUADAS EN DETERMINADAS
SEPARACION DEL CONDUCTO EPITELIAL DE LA LÁMINA ORIGINAL
.«4
Uniones celulares
Figura 19-9 Invaginación de una lámina epitelial que da lugar a un conducto. Se supone que la contracción orientada de filamentos de actina situados a lo largo de las bandas de adhesión provoca el estrechamiento de las zonas apicales de las células epiteliales, lo cual es importante para el enrollamiento de la lámina epitelial, formándose un conducto (a pesar de que parece que los reordenamientos celulares también juegan un papel importante). Un ejemplo de ello es la formación del tubo neural en los primeros estadios embrionarios de vertebrados (estudiado en el Capítulo 21).
c o n d u c to
1023
h ieren e stre ch a m e n te al su b strato m e d ia n te regiones esp ecializad as de la m e m
placas de adhesión,
b ran a p la sm á tica d e n o m in a d a s c o n ta c to s fo ca le s o c o in c i d ien do co n las zo n a s term in ales de los h a c e s de actin a . En los tejidos las células g en eralm en te esta b le ce n co n ta c to s focales c o n la m atriz e xtracelu lar an álogos a ésto s. Las g lu co p ro teín as tra n s m e m b ra n a de u n ió n que m e d ia n e stas a d h esio n es y q ue c o n e c ta n los h a ce s de fibras de a ctin a a la m atriz e xtracelu lar en estas p lacas p e rte n e ce n a u n a g ran fam ilia de re ce p to re s cé lu la-m atriz d en o m in ad as las cu ales e stu d ia re m o s m ás ad elan te. El d om in io e xtracelu lar de la
integrinas,
in tegrin a se u n e a un c o m p o n e n te p ro te ico de la m atriz extracelu lar, m ien tras que su d om in io in tra ce lu la r se u n e in d ire cta m e n te a h a ce s de filam en tos de a c tin a a trav és de u n a vía co m p le ja de p ro te ín a s de unión, que in clu yen la la a -a c tin in a y la vin cu lin a (Figura 1 9 -1 0 ).
talina,
Las u n io n e s se p ta d a s se e n cu e n tra n en tejidos de in v erteb rad o s. C o m p a r te n m u ch a s ca ra cte rís tic a s c o n las b a n d a s de ad h esió n , c o n las cu ales a v eces co existen : (1) fo rm an u n a b a n d a co n tin u a alred ed o r de los m á rg e n e s de las cé lu las ep iteliales, (2) se c re e q ue ay u d an a m a n te n e r ju n tas las célu las y (3) a ctú a n co m o lu gares de an claje p a ra los filam en tos de a ctin a . P re se n ta n u n a m orfología su m a m e n te esp ecífica, ya q ue las m e m b ra n a s p la sm á tica s que in te ra ccio n a n e s tán u n id as p o r p ro te ín a s de u n ió n m al ca ra cte riz a d a s que se d isp o n en en filas p aralelas c o n u n a reg u lar p erio d icid ad (Figura 1 9 -1 1 ).
Los desmosomas conectan filam entos intermedios entre células; los hem idesm osom as los unen a la lám ina basal4
desmosomas
hemidesmosomas
Los y a c tú a n c o m o re m a ch e s rep artien d o las fu erzas de ten sió n o de cizalla a lo largo del epitelio y del tejido con ju ntivo su b y a ce n te . Los d e s m o s o m a s so n c o n ta c to s in tercelu lares p u n tifo rm es que m a n tie n e n u n id as las célu las (Figura 19-12A ). En el in terio r de las célu las a c tú a n co m o lu ga res de an claje p a ra los filam en to s in term ed io s en fo rm a de cu erd a, los cu ales fo rm an u n a red estru ctu ra l en el c ito p la sm a p ro p o rcio n a n d o u n a cie rta rigidez (Figura 1 9 -1 2 B ). M ed ian te estas u n io n es los filam en tos in term ed io s de las cé lu las ad y a ce n te s está n in d ire cta m e n te c o n e c ta d o s fo rm an d o u n a red co n tin u a que se extien d e a to d o el tejido. El tipo esp ecífico de filam en tos in term ed io s a n clad o s a los d e sm o so m a s d ep en d e del tipo celular: de en la m ay o ría de las célu las ep iteliales y de en las fibras m u scu la re s ca rd ía ca s. La e stru ctu ra gen eral del d e s m o s o m a e stá re p re se n ta d a en la Figu ra 19 -1 2 C . C o n sta de u n a p laca cito p la s m á tic a d en sa, c o m p u e s ta p o r un co m p lejo p ro te ico de an claje in tracelu la r q ue es el resp o n sab le de la u n ió n de los e le m e n to s citoesq u elético s a las p ro te ín a s de u n ión tra n s m e m b ra n a , las cu ales in te ra c tú a n a trav és de sus d om in io s e x tracelu lares m a n te n ie n d o ju n tas las m e m b ra n a s ad y a ce n te s. C o m o en las b a n d a s de ad h esió n , las p ro teín a s de u n ión tra n sm e m b ra n a p e rte n e c e n a la fam ilia de las ca d h e rin a s, m o lé cu la s de a d h esió n in te rce lu lar
desmina
queratina
Figura 19-10 Localización de vinculina en un contacto focal. En estas micrografías de inmunofluorescencia, se observan células en cultivo con un doble mareaje con anticuerpos contra actina y contra vinculina Obsérvese que la vinculina se localiza en los contactos focales, donde los grupos de filamentos de actina conectan con la membrana plasmática. (De B. Geiger, E. Schmid, y W. Franke, 23:189-205, 1983.)
{verde)
(rojo).
Dijferentiation
dep en d ien tes de C a2+. La im p o rtan cia de los d esm o so m as en el m an ten im ien to de la u n ió n in tercelu lar se d e m u e stra en algu n as fo rm as de en ferm ed ad
pénflgo,
de la piel c a ra cte riz a d a p o r la p ro d u cció n de a u to a n ticu e rp o s c o n tra u n a de sus
célula 1
c é lu la 2
20Q nm 102 4
Capítulo 19 : Adhesión celular, uniones celulares y matriz extracelular
Figura 19-11 Unión septada. Electronmicrografía de una unión septada entre dos células epiteliales de un molusco. Las membranas plasmáticas que interaccionan, observadas en sección transversal, están conectadas por filas paralelas de proteínas de unión. Las filas, siguiendo una cierta periodicidad, se observan como barras densas o septos. [De N.B. Gilula, en Cell Communication (R.P. Cox, ed.), pp. 1-29. New York: Wiley, 1974. Reimpresión con el permiso de lohn Wiley & Sons, Inc.]
c a d h e r in a p la c a c it o p la s m á tic a c o n s t it u id a p o r p r o te ín a s d e u n ió n
f ila m e n t o s d e q u e r a t in a a n c la d o s e n la p la c a c it o p la s m á tic a
0,1
[irò
m e m b r a n a s p la s m á tic a s q u e in te r a c t ú a n
0,1 [jnn
(C)
Figura 19-12 Desmosomas. (A) Electronmicrografía de tres desmosomas entre dos células epiteliales en el intestino de rata. (B) Electronmicrografía de un desmosoma entre dos células epidérmicas de un tritón en desarrollo, mostrando claramente su unión a filamentos intermedios. (C) Dibujo esquemático de un desmosoma. Sobre la superficie citoplasmática de cada membrana plasmática que interactúa se sitúa una placa densa compuesta por un conjunto de proteínas de adhesión intracelular (incluyendo y Cada placa se encuentra asociada con una densa red de filamentos de queratina, que están unidos a la superficie de la placa. Algunas glucoproteínas transmembrana de unión, que pertenecen la familia de las cadherinas y que actúan como moléculas de adhesión intercelular, se unen a las placas e interaccionan fuertemente mediante sus dominios extracelulares, manteniendo, unidas las células mediante un mecanismo dependiente de Ca2+. [A, de N.B. Gilula, en Cell Communication (R.P. Cox, ed), pp. 1-29, New York: Wiley, 1974. Reimpresión con el permiso de John Wiley & Sons, Inc.; B, de D.E. Kelly, J. Cell Biol. 28:51-59,1966, con permiso de copyright de The Rockefeller University Press.]
placoglobinas desmoplaquinas).
p ro p ias p ro teín as del tipo de las cad h erin as d esm o so m ales; esto s a n ticu e rp o s se u n en a d e sm o so m a s d eso rg an izad o s en tre las células epiteliales (q u eratin o cito s) cau san d o la relajació n de la e stru ctu ra epitelial, lo cu al in d u ce la fo rm a ció n de ab u n d an tes am p ollas debido a la fuga del fluido tisular. La c o n sta ta ció n de la e s pecificid ad de esto s an ticu e rp o s p o r la ep id erm is sugiere que los d e sm o so m a s
f ila m e n t o s d e q u e r a t in a
desm osom a
p resen tes en o tro s tejidos p u ed en ser b io q u ím icam en te diferentes. Los hemidesmosomas, sem ejan tes m o rfo ló g icam en te a los d e sm o so m a s, difieren de éstos ta n to a nivel fu n cion al co m o b ioq uím ico. En lugar de unir las m e m b ra n a s de las célu las a d y acen tes, u n en el d om in io basal de las célu las y la - u n tipo esp ecializad o de la m atriz e xtracelu lar que se e n cu e n tra en la in terfase en tre el epitelio y el tejido con ju ntivo su b y acen te. Sin em b arg o ,
lámina basal
m ien tras que los filam en tos de q u eratin a a so ciad o s a los d e sm o so m a s esta b le ce n co n ta c to s laterales co n las p lacas d e sm o só m ica s (véase Figu ra 19-1 2 C ), la m ay o ría de los filam en tos relacio n ad o s co n los h e m id e sm o so m a s se an cla n p o r u n a de sus region es term in ales (Figura 1 9 -1 3 ). En los c o n ta c to s focales las p ro te ínas de u nión tra n sm e m b ra n a de los h e m id e sm o so m a s n o p e rte n e ce n a la fam i lia de las cad h erin as del grupo de p ro teín as de ad h esió n celu lar u tilizada p ara
Figura 19-13 Distribución de desmosomas y hemidesmosomas en las células epiteliales del intestino delgado. Las redes de filamentos de queratina de dos células adyacentes están conectadas indirectamente a través de los desmosomas, mientras que los hemidesmosomas permiten su conexión con la lámina basal.
Uniones celulares
lá m in a b a s a l
h e m id e s m o s o m a
1025
Tabla 19-2 Uniones de anclaje
P ro te ín a de u nión tran sm e m b ra n a
U nión
Ligando ex tra ce lu la r
U nión intracelular al citoesqu eleto
Algunas p roteínas de unión extracelu lar
A dherente (célulacélula)
cadherina (cadherina E)
cadherina en células adyacentes
filamentos de actina
D esm osom a
cadherina (desmogleínas y desm ocolinas) integrina
cadherina en células adyacentes proteínas de matriz extracelular proteínas de m atriz extracelular (lámina basal)
filamentos interm edios
cateninas, vinculina, a-actin in a placoglobina desmoplaquinas, placoglobina
filamentos de actina
talina, vinculina, a-actin in a
filamentos intermedios
proteína semejante a la desmoplaquina
A dherente (célulam atriz) H em idesm osom a
integrina (ot6P4, véase pág. 1069)
los d e sm o so m a s sino a la fam ilia de in tegrin as de re ce p to re s de m atriz e x tra c e lular. Las p ro teín a s de u n ió n in tracelu lares en los h e m id e sm o so m a s tam b ién son d iferentes a las de los d e sm o so m a s. Así, au n q u e la term in o lo g ía p a ra las d istintas u n ion es de an claje es con fu sa, los p rin cip ios m o le cu la re s (en v erteb rad o s p o r lo m en o s) es sencilla (Tabla 192). Las in tegrin as en la m e m b ra n a p la sm á tica se u n en a m o lécu las de la m atriz extracelu lar; las cad h e rin a s en la m e m b ra n a p la sm á tica se u n en a ca d h erin as de la m e m b ra n a de la célu la a d y a ce n te . En am b o s ca so s existe u n aco p la m ie n to de los filam en tos del cito esq u eleto , los cu ales p u ed en ser de a ctin a o filam en tos in term ed io s d ep en d ien d o del tipo de p ro te ín a de u n ión utilizada. A d em ás en to d as estas clases de u n io n es de a n claje la ad h esió n d ep en d e de ca tio n e s divalentes extracelu lares, au n q u e el significado de e sta d e p e n d e n cia se d e sco n o ce .
Las uniones de tipo gap perm iten el paso directo de pequeñas m oléculas entre células5 Las u n io n e s d e tip o g ap co n stitu y en , quizás, las u n io n es celu lares m ás in trig an tes. M u estran u n a am p lia d istrib ución, sien d o m u y n u m e ro sa s en la m ay o ría de los tejidos de la p rá c tic a to talid ad de las esp ecies an im ales. A nivel de e lectro n m icro sco p ia co n v e n cio n a l se ob serv an c o m o regiones en las que las m e m b ra n a s de d os célu las ad y a ce n te s se e n cu e n tra n sep arad as p o r un e sp acio u niform e de u n o s 2 -4 n m de am p litu d. Las u n io n es de tipo gap m ed ian la c o m u n ica ció n in tercelu lar al p erm itir el p aso de ion es in o rg án ico s y o tras p eq u eñ as m olécu las h id rosolu b les en tre los resp ectiv o s cito p lasm as, aco p lan d o las célu las ta n to
acoplamiento celular
e lé ctrica co m o m e ta b ó lica m e n te . E ste tien e im p o rta n te s im p licacio n es fu n cio n ales, la m u ch a s de las cu ales ú n ica m e n te e m p e z a m o s a co m p re n d e r. E ste tipo de c o m u n ic a c ió n in tercelu lar fue d e m o stra d o in icialm en te p or m é to d o s fisiológicos en 1958, au n q u e fu eron n e ce sa rio s diez añ o s p a ra d e m o s tra r la co rre la ció n e n tre ese a co p la m ie n to fisiológico y la p re se n cia de u niones de tipo gap ob serv ad as m e d ia n te el m icro sco p io e le ctró n ico . La ev id en cia inicial so b re el a co p la m ie n to celu lar p rovien e de los estu d ios electrofisiológicos sob re p ares de célu las n erviosas c o n e c ta d a s y localizad as en el sistem a nervioso del can g rejo . A p lican do un g rad ien te de voltaje a través de las regiones de u n ión e in sertan d o electro d o s de registro en c a d a u n a de las células in te ra ctu a n te s, se ob servó un in esp erad o flujo e lé ctrico , in d ican d o que los iones in o rg án ico s (p o r
102 6
Capítulo 19 : Adhesión celular, uniones celulares y matriz extracelular
ta d o re s del p o te n cia l e lé ctrico en los tejid os vivos) p o d ían circu la r lib rem en te e n tre las célu las. E xp e rim e n to s p o ste rio re s d e m o s tra ro n que p e q u e ñ a s m o lé c u las de c o lo ra n te s flu o re s c e n te s ta m b ié n p o d ía n p a s a r de u n a cé lu la a o tra a d y a c e n te sin p a s a r p o r el e s p a cio in te rce lu lar, a c o n d ició n de q ue sus p e so s m o le cu la re s n o s o b re p a s a rá n los 1 0 0 0 d a lto n s (F ig u ra 1 9 -1 4 ). E sto s re su lta d o s su g ieren q u e e so s tú n e le s in te rce lu la re s p re s e n ta n u n d iá m e tro fu n cio n al de a lre d e d o r de 1,5 n m , lo cu a l im p lica q ue las célu las a c o p la d a s c o m p a rte n las m o lé cu la s p e q u e ñ a s (co m o los io n e s in o rg á n ico s, a z ú c a re s , a m in o á c id o s , nucle ó tid o s y v itam in as) p e ro n o las m a c ro m o lé c u la s (p ro te ín a s, á c id o s n u cle i c o s así co m o p o lisa cá rid o s). La ev id en cia de que las u n io n es de tipo gap m e d ia n el a co p la m ie n to e lé ctri co y q u ím ico e n tre célu las que se h allan en c o n ta c to p u ed e co n s ta ta rse a p artir d e diversas fu en tes. E xiste u n a c o rre la ció n e n tre la p re se n cia de e stru ctu ra s de este tipo de u n ión y la d e m o stra ció n de aco p la m ie n to , m e d ia n te criterio s quí m ico s o eléctrico s. In v ersam en te, tal a co p la m ie n to no se h a d e m o stra d o e n tre célu las de v erteb ra d o s q ue no p re se n ta n u n io n es de tipo gap. P o r o tra p arte, el a co p la m ie n to elé ctrico y el p aso de co lo ra n te s p u ed e ser b lo q u ead o si se in y e c ta n an ticu e rp o s c o n tra la p ro te ín a p rin cip al de las u n io n es de tipo gap. M ás re cie n te m e n te , la u tilización de m é to d o s m o le cu la re s h a p ro p o rcio n a d o p ru eb as d irectas: cu a n d o e s ta p ro te ín a es reco n stitu id a en b ica p a s lipídicas sin té tica s o
Figura 19 -14 Determinación del tamaño del canal de una unión de tipo gap. Cuando se inyectan moléculas de diversos tamaños en una de las dos células unidas entre sí mediante una unión de tipo gap, las moléculas más pequeñas de unos 1000 daltons pueden pasar a la célula adyacente, pero no las moléculas de tamaño mayor.
cu a n d o el mRNA q ue co d ifica e sta p ro te ín a es in y ectad o en o o cito s de ra n a o en u n a lín ea celu lar d eficiente en u n io n es de tipo gap p u ed e d e m o stra rse electrofisio ló g icam en te la a p a rició n de ca n a le s c o n p ro p ied ad es típ icas de las u n ion es de tipo gap.
Los conexones de las uniones de tipo gap están compuestos por seis subunidades6 L as u n io n es de tipo gap e stá n o rg an izad as en b ase a p ro te ín a s tra n s m e m b ra n a ,
conexones.
q ue fo rm a n e stru c tu ra s d e n o m in a d a s C u an d o los co n e x o n e s de las m e m b ra n a s p la sm á tica s de d os célu las a d y a ce n te s e stá n alin ead o s, fo rm an un ca n a l a cu o so co n tin u o q ue c o n e c ta a m b o s cito p la sm a s (Figura 1 9 -1 5 ). Los c o n e x o n e s e n tra n en c o n ta c to de tal m a n e ra q ue las m e m b ra n a s p la sm á tica s im p licad as se e n c u e n tra n se p a ra d a s p o r u n a “h e n d id u ra ” - d e aq u í el n o m b re de u n io n es de tipo gap o de h e n d id u ra - lo cu al a u m e n ta la d iferen cia c o n las u n io
m e m b r a n a s p la s m á tic a s q u e in te r a c t ú a n v
n es e sta n ca s, y a q ue e n é sta s las m e m b ra n a s e stá n u n id as m ás e s tre c h a m e n te (co m p á re n se F igu ras 1 9 -5 y 1 9 -1 5 ). M ed ian te la té c n ic a de crio fra ctu ra , c a d a c o n e x ó n es ob serv ad o c o m o u n a p a rtícu la in tra m e m b ra n o sa y c a d a u n ió n de tip o gap p u ed e c o n te n e r u n gru p o de m á s de v arios ce n te n a re s de c o n e x o n e s (Figu ra 1 9 -1 6 ). U n co n e x ó n e s tá co m p u e sto p o r un anillo de seis su b u n id ad es p ro teicas id én ticas d en o m in a d a s co n exin as, c a d a u n a de las cu ales co n tie n e c u a tro héli c e s a que atrav iesan la m e m b ra n a . Las seis co n e x in a s fo rm an un can al m a y o r y m ás p erm eab le que el de cin co su bu n id ad es de las b a rre ra s de n e u ro tra n sm iso res de can ales de io n es o q ue el de c u a tro su bu n id ad es (o dom in ios) de la b a rre ra v o ltaica de los ca n a le s ca tió n ico s, que ya h a n sido tra ta d o s en el C apítulo 11 (véase F igu ra 1 1 -3 3 ). E n los diferentes tejidos las u n io n es de tipo gap p u ed en te n e r algunas p ro p ied ad es d iferentes. La p erm eab ilid ad de sus ca n a le s individuales p u ed e variar; p o r ejem plo se sab e que a ctu a lm e n te existen diferencias ap reciab les en tre las co n exin as que fo rm an las u n ion es. E n ratas, p o r ejem plo, se c o n o c e n p o r lo m e n o s 11 co n exin as diferentes, c a d a u n a co d ificad a p o r u n gen sep arad o y distinto, au n q u e a v eces su d istrib u ción tisular e stá solap ad a. Algunos tipos celu lares e x p re san m ás de u n tipo de co n exin a, p ero n o e stá claro si las d iferentes p ro te ín a s de co n e x in a se u n e n algu n a vez d en tro del m ism o co n e x ó n . A p e sa r de las dife ren cias en tre los diferentes isotip os de co n exin a, su estru ctu ra b á sica y fu n cion al se h a co n serv ad o m u y bien a lo largo de la evolu ción . Así, al m e n o s en cultivos celu lares, u n a célu la que exp rese un tipo de co n e x in a p ued e a m en u d o fo rm ar
Uniones celulares
c a n a l e n tr e d o s c é lu la s a d y a c e n te s fo rm a d o p o r d o s conexones
conexon c o m p u e s to p o r s e is s u b u n id a d e s
Figura 19-15 Modelo de unión de tipo gap. El esquema muestra las membranas plasmáticas de dos células adyacentes. Las bicapas lipídicas son atravesadas por complejos proteicos, denominados cada uno de los cuales se supone formado por seis subunidades proteicas idénticas (denominadas Dos conexones unidos a través del espacio intercelular dan lugar a la formación de un canal acuoso continuo entre ambas células.
(rojo)
(verde),
conexones
conexinas).
1027
Figura 19-16 Uniones de tipo gap visualizadas por microscopia electrónica. Sección ultrafína (A) y réplica de criofractura (B) de dos uniones de tipo gap, una grande y otra pequeña, localizadas en fibroblastos en cultivo. En (B) cada unión es observada como un agregado de partículas intramembranosas homogéneas, asociadas exclusivamente a la cara citoplasmàtica de la fractura (cara P). Cada partícula intramembranosa corresponde a un conexón de los esquematizados en la Figura 19-15. [De N.B. Gilula, en Celi Communication (R.P. Cox, ed.) pp. 1-29. New York: Wiley, 1974. Reimpresión con permiso de John Wiley & Sons, Inc.]
unión d e t ip o
gap g ra n d e
mbranas
u n ió n d e t ip o _ Sap pequeña
(A)
I----------------------- 1 200 nm
{B}
u n a u n ión del tipo gap fu n cio n al c o n u n a célu la que exp rese u n a co n e x in a dife ren te, in clu so au n q u e las d os célu las se a n de v erteb rad o s distintos.
La mayor parte de las células em brionarias están acopladas entre sí durante las primeras etapas del desarrollo mediante uniones de tipo gap7 E n tejid os q ue co n tie n e n célu las excitab les e lé ctrica m e n te , el a co p la m ie n to c e lular m e d ia n te u n io n e s de tipo gap tien e u n a fu n ció n obvia. P o r ejem plo, el aco p la m ie n to e lé ctrico e n tre célu las n erv io sas p e rm ite el d esp lazam ien to rá p i do de los p o te n cia le s de a c c ió n de u n a célu la a o tra sin el re tra so que re p re se n ta la sin ap sis q u ím ica; ello es e sp e cia lm e n te v en tajo so en situ a cio n e s en que la v e locid ad y la fiabilidad so n cru ciales, c o m o en algu n as re sp u e sta s de e sca p e que p re se n ta n p e ce s e in se cto s. De m a n e ra sim ilar, en v e rte b ra d o s su p erio res el aco p la m ie n to e lé ctrico sin cro n iz a las c o n tra c c io n e s de las célu las m u scu lares ca rd ía ca s, o las de las célu las m u scu lare s lisas re sp o n sab les del m o v im ien to p e ristáltico del in testin o . N o resu lta ta n ob via la p re se n cia de u n io n es de tipo gap en tejidos que no p re se n ta n activid ad elé ctrica . En p rin cip io en esto s tejidos el co m p a rtir los p e q u eñ o s ion es y m etab o lito s p ro p o rcio n a u n m e ca n ism o p a ra co o rd in a r las a c ti vid ad es de las célu las y p a ra su avizar las flu ctu acio n es al a zar de u n a célu la a otra. P o r ejem plo, algu n a de las activid ad es de las célu las epiteliales, co m o el m o v im ien to ciliar, p u e d e n e sta r co o rd in a d a s m e d ia n te este tipo de unión. De m a n e ra m á s gen eral, p u esto que los m e n sa je ro s in tracelu lares tales c o m o el AM P cíclico y el C a2+ p u e d e n p a sa r a través de las u n ion es de tipo gap, las re s p u estas de las célu las aco p la d a s fren te a las señ alizació n extracelu lar p u ed en p ro p ag arse y co o rd in a rse de e sta m a n e ra . El a co p la m ie n to celu lar m e d ia n te e stas u n io n es d e sem p e ñ a un p apel im p o rta n te e n el tra n scu rso de la em b rio g én esis. A p artir de los estad io s e m b rio n a rios iniciales de los v e rteb rad o s (el estad io de 8 célu las en el ca so de em b rio n es de rató n ), la m a y o r p a rte de las célu las e stá n aco p la d a s e léctrica m e n te . Sin e m b argo, g en eralm en te cu a n d o gru p os esp ecífico s de célu las em b rio n arias e m p ie zan a d esarrollan sus ca ra cte rís tic a s esp ecíficas y em p iezan a diferenciarse, se d esaco p lan del tejid o circu n d a n te . Así, p o r ejem plo, cu a n d o se cie rra el tu b o n eu ral (véase F igu ra 1 9 -9 ) sus células se d esaco p lan del e cto d e rm o extern o .
102 8
Capítulo 19 : Adhesión celular, uniones celulares y matriz extracelular
M ien tras tan to , el co n ju n to de células de c a d a grupo p e rm a n e ce n aco p lad as y así p resen tan u n co m p o rta m ie n to co o p erativ o y siguen de m a n e ra co o rd in a d a u n a m ism a vía de d esarrollo. Es posible que en los em b rio n es el a co p la m ie n to celu lar co n stitu y a u n a vía de señ alización celu lar a larga d istan cia d en tro de un epitelio en d esarrollo. Por ejem plo, u n a p eq u eñ a m o lécu la p u ed e p asar, a través de las u n ion es de tipo gap, desde u n a región tisular d o n d e su co n c e n tra c ió n se m a n tie n e alta h a sta o tra región d on d e su c o n c e n tra c ió n es m ás baja, c reá n d o se así un g rad ien te de c o n c e n tra c ió n u niform e. El valor que alca n z a lo ca lm e n te la c o n c e n tra c ió n p u e de p ro p o rcio n a r a las célu las u n a “in fo rm ació n p o sicio n al” p a ra el co n tro l de su d iferen ciación , en fu n ción de su lo calizació n en el co n ju n to em b rio n ario (se e s tu d ia en el C apítulo 2 1 ). Sin em b arg o , se d e sco n o ce si las u n ion es de tipo gap p resen tan u n a fu n ción a co rd e co n la hip ótesis exp uesta.
La permeabilidad de las uniones de tipo gap está regulada8 C o m o los can ales ió n ico s co n v en cio n ales, los can ales de las u n ion es de tipo gap no p e rm a n e ce n ab ierto s co n tin u a m e n te sino que altern an e n tre e stad o s a b ie r tos y cerrad o s. A d em ás, la p erm eab ilid ad de las u n io n es de tipo gap p u ed e ser d ism inu id a de m a n e ra ráp id a (en cu estió n de segu nd os) y rev ersib lem en te, m e d ian te m an ip u lacio n es exp erim en tales que im pliquen un d escen so del pH o un in cre m e n to de la c o n c e n tra c ió n del C a2+ libre cito p lasm ático s. E stas o b se rv a cio nes in d ican que los can ales de las u n ion es de tipo gap co n stitu y en estru ctu ras d in ám icas que, al igual que los ca n a le s ió n ico s co n v en cio n ales, son regulables: p u ed en sufrir un ca m b io co n fo rm a cio n a l reversible que cierre el ca n a l en re s p u esta a cam b io s en la célula. U n m o d elo in teresan te de tipo de ca m b io c o n fo r m a cio n al se m u estra en la Figu ra 1 9 -17. Se d e sco n o ce el p apel fisiológico del efecto del pH sob re la p erm eab ilid ad de las u n io n es de tipo gap. Sin em b arg o existe un ca so en el que p a re ce claro el co n tro l ejercid o p o r el C a2+. C uan d o u n a célu la es d añ ad a, su m e m b ra n a p las m á tica se h a ce p erm eab le. Así, ion es tales c o m o el C a2+ y el N a+ e n tran en la c é lula, m ien tras que o tro s m etab o lito s valiosos salen de la célula. Si la célu la a fe c tad a co n tin u a estan d o a co p la d a a otras célu las ad y a ce n te s no d añ ad as, éstas p u ed en sufrir severos ca m b io s fu n cion ales. Sin em b arg o , la e n tra d a de C a2+ en la célu la d añ ad a p ro v o ca in m e d ia ta m e n te el cierre de los ca n a le s de las u n io n es de tipo gap, aisland o e ficazm en te a la célu la y previn ien d o, de este m o d o , la p ro p a g ació n de la an o m alía fu n cion al. En la Figu ra 1 9 -1 8 se re su m e n los diversos tipos de u n io n es celu lares p re sen tes en las células epiteliales. E n la z o n a m ás ap ical, sus p o sicio n es relativas son las m ism as en casi to d o s los tipos de epitelio: las u n ion es e sta n ca s se sitúan en las regiones m á s e xtrem as, seguidas de las b an d as de ad h esió n y finalm en te de un grupo de d e sm o so m a s; el co n ju n to así fo rm ad o se d e n o m in a Las u n io n es de tipo gap y o tro s d e sm o so m a s p re se n ta n u n a distrib ución m en o s regular.
complejo de
unión.
CERRADO
alta concentración de Ca2+ o pH bajo Uniones celulares
baja concentración de Ca2+ o pH alto
Figura 19-17 Modelo explicativo de
cómo los canales de las uniones de tipo gap pueden cerrarse en respuesta a un aumento del Ca2+o un descenso del pH del citosol. Una pequeña rotación de cada subunidad cierra el canal. El modelo se basa en un análisis de micrografías obtenidas con el microscopio electrónico a partir de tejidos congelados rápidamente, en los cuales la estructura de los canales de unión de tipo gap supuestamente en estado abierto eran comparados con su estructura en un estado de cierre inducido por Ca2+. Es factible que un mecanismo similar a éste actúe en la apertura y cierre de los canales iónicos explicados en el Capítulo 11. (Según P.N.T. Unwin y P.D. Ennis, 307:609-613, 1984.)
Nature
1029
Figura 19-18 Resumen de los distintos tipos de uniones celulares hallados en el epitelio de células animales. Este esqu em a está basado en las células epiteliales del intestino delgado.
u n ió n e s ta n c a c o m p le jo d e u n ió n
b a n d a d e a d h e s ió n desm osom a
f ila m e n t o s d e q u e r a t in a
u n ió n d e t ip o g a p
lá m in a b a s a l
h e m id e s m o s o m a
En los vegetales, los plasmodesmos realizan muchas de las funciones de las uniones de tipo gap9 Los tejidos vegetales se o rg an izan bajo p rin cip ios d iferentes que los de los an i m ales. E sto se d eb e a que las célu las vegetales e stán a tra p a d a s d en tro de rígidas, co n stitu id as p o r u n a m atriz e xtracelu lar rica en celu losa, co m o
paredes
celulares
exam in a re m o s m ás ad elan te. El siste m a de p ared es celu lares elim in a la n e ce si dad de u n io n es ad h e re n te s p a ra m a n te n e r las célu las en su lugar, p ero persiste la n ece sid ad de u n a co m u n ica c ió n in tercelu lar d irecta. Así, en c o n tra ste c o n las célu las an im ales, las v eg etales tien en sólo u n a clase de u n ion es in tercelu lares, los q ue, c o m o las u n io n es de tipo gap, co n e c ta n d ire cta m e n te el cito p lasm a de las célu las ad y a ce n te s. Sin em b arg o , en los vegetales la p ared celu lar que existe en tre un p ar de c é lulas ad y a ce n te s típ icas tien e p o r lo m e n o s 0,1 |im de esp eso r, de m o d o que se req u iere u n a e stru ctu ra m u y d iferente a las u n io n es de tipo gap p a ra m ed iar la c o m u n ica ció n en tre ellas. Los p la sm o d e sm o s so lu cio n an el p ro b lem a. C on p o
plasmodesmos,
c a s ex ce p cio n e s esp ecializad as, ca d a célu la de u n a p lan ta su p erio r e stá c o n e c ta da a su v ecin a m ed ia n te p la sm o d e sm o s, los cu ales fo rm an u n o s finos ca n a le s cito p la sm á tico s a trav és de las p ared es celu lares. C o m o se m u e stra en la Figura 19-19A , la m e m b ra n a p la sm á tica de u n a célu la co n tin ú a co n la de la v e cin a a
r e tí c u lo e n d o p la s m á t ic o lis o d e s m o t ú b u lo a n illo c it o s ó lic o
m e m b r a n a p la s m a tic a q u e
100 n m
r e v is te el p la s m o d e s m o , c o n e c ta n d o e n tr e s í d o s c é lu la s a d y a c e n te s
103 0
Capítulo 19 : Adhesión celular, uniones celulares y matriz extracelular
Figura 1 9 -1 9 Plasmodesmos. (A) Los canales cito p lasm ático s de los p lasm odesm os atraviesan la pared celular vegetal y co n e cta n en tre sí todas las célu las del vegetal. (B) Cada plasm odesm o está recubierto por la m em bran a plasm ática com ú n a dos células con ectad as. N orm alm ente tam bién co n tien e un a fina estructura tubular, el d esm otú bulo, derivado del retículo end op lasm ático liso.
través de los p lasm o d esm o s, y los cito p lasm as de las dos célu las se co n e c ta n por
membrana
retículo
un can al m ás o m e n o s cilindrico de un d iám etro de 2 0 a 4 0 n m . Así, p u ed e c o n sid erarse que las célu las vegetales fo rm an un sincitio en el cu al m u ch o s n ú cleo s c o m p a rte n u n m ism o cito p lasm a. El ce n tro del can al es atrav esad o p o r u n a e s tru ctu ra e stre ch a cilin drica, el que co n tin ú a co n e lem en to s del r e
desmotúbulo,
tículo en d o p lasm á tico liso en c a d a u n a de las co n exio n es celu lares (Figuras 1919B y 1 9 -2 0 ). E n tre el exterio r del d esm o tú b u lo y la c a ra in tern a del can al cilin drico con stitu id o p o r m e m b ra n a p la sm á tica existe un can al de cito so l a tr a vés del cu al las m o lécu las de p eq u eñ o ta m a ñ o p u ed en p a sa r de u n a célu la a o tra. Los p lasm o d e sm o s se fo rm an n o rm a lm e n te en las p ared es celu lares n u e vas cu an d o están u nidas d u ran te la fase de cito cin esis de la división celular; se fo rm an alred ed or de e lem en to s del retícu lo en d o p la sm á tico liso que q ued an atrap ad o s en la p la ca celu lar en fo rm a ció n (se estu d ia en el C apítulo 18). A p esar de las diferencias rad icales de estru ctu ra en tre los p lasm o d esm o s y las u niones de tipo gap, p a re ce que actú a n de u n a m a n e ra su m a m e n te p arecid a. Pru ebas ob ten id as p o r in y ecció n de m oléculas trazad oras de diferentes ta m a ñ o s sugieren que los p lasm o d esm o s p erm iten el p aso de m oléculas co n un peso m e n o r de u nos 8 0 0 daltons, lo cu al es sem ejan te al lím ite del p eso m o lecu lar de las u niones de tipo gap. Al igual que las u niones de tipo gap, el tran sp o rte a través de los p lasm od esm os está regulado. Así, exp erim en tos realizados m ed ian te la in y e c ción de coloran tes d em u estran que p ued en existir b arreras al d esplazam ien to de m oléculas incluso de bajo p eso m olecular, en tre ciertas células que están c o n e c tad as al p a re ce r p o r p lasm o d esm o s n orm ales; se d e sco n o ce n los m ecan ism o s que restrin gen la co m u n ica ció n en estos caso s. P or el con trario, ciertos virus de v eg e tales p u ed en au m e n ta r los p lasm o d esm o s y utilizar esta vía p ara p asar de u n a c é lula a otra, exten d ien d o así la infección. E stos virus sintetizan p roteínas especiales que se u nen a co m p o n e n te s de los p lasm o d esm o s e in crem en tan n o tab lem en te el tam añ o efectivo del poro. Pero, no e stá claro c ó m o actú a n estas proteínas.
l______ l
25 nm desmotúbulo membrana plasmática
Resumen
La mayoría de las células se unen a otras células o a la matriz extracelular mediante unos puntos especializados de contacto denominados uniones celulares. Estas unio nes se organizan en tres clases funcionales: uniones de oclusión, uniones de anclaje y uniones de comunicación. Las uniones estancas están constituidas fundamental mente por uniones de oclusión que juegan un papel importante en el mantenimien to de las diferencias de concentración de pequeñas moléculas hidrófilos a través de los epitelios, mediante (1) sellado las membranas plasmáticas de las células adya centes, creando una barrera continua de impermeabilidad o semipermeabilidad a través del epitelio y (2) actuando como barreras en la bicapa lipídica, restringiendo la difusión de las proteínas transportadoras entre los dominios apical y basolateral de la membrana en cada célula epitelial. Los principales tipos de uniones de anclaje en tejidos de vertebrados son las uniones adherentes, los desmosomasy los hemidesmosomas. Las uniones adherentes conectan haces de filamentos de actina, mientras que los desmosomasy los hemides mosomas unen filamentos intermedios. Las uniones septadas también actúan como lugares de unión de los filamentos de actina, pero sólo en tejidos de invertebrados. Las uniones de tipo gap son uniones de comunicación compuestas por agrupacio nes de canales proteicos, que permiten el paso del interior de una célula a otra di rectamente, de moléculas de un peso molecular inferior a 1000 daltons. Las células conectadas por estas uniones comparten muchos iones inorgánicos así como otras moléculas pequeñas, por lo que están acopladas química y eléctricamente. Las uniones de tipo gap son importantes en la coordinación de las actividades de las células eléctricamente activas, y se cree que desempeñan un papel de coordinación similar en otros grupos celulares. Los plasmodesmos son las únicas uniones inter celulares presentes en los vegetales; actúan como las uniones de tipo gap, aunque su estructura es completamente distinta. Uniones celulares
Figura 19-20 Plasmodesmos vistos al microscopio electrónico. (A) Sección longitudinal de un plasmodesmo de un helecho acuático. La membrana plasmática delimita el poro y es continua con la de la célula adyacente. También puede observarse el retículo endoplasmático y su asociación con el desmotúbulo central. (B) Un plasmodesmo similar en sección transversal. (Cortesía de R. Overall.)
1031
Adhesión intercelular10 P a ra fo rm ar u n a u nión de an claje, las célu las h an de h ab erse ad herid o u n a a otra. P o sterio rm en te , alred ed o r de las m o lécu las que m ed ian d ire cta m e n te la ad h esió n se h a de fo rm ar un a p a ra to cito esq u elético . El resu ltado es u n a e stru c tu ra b ien definida - u n d e sm o so m a , un h e m id e sm o so m a o u n a u nión a d h eren te o s e p ta d a - fácilm en te identificable m e d ia n te m icro sco p ía ele ctró n ica . E fectiv a m en te, la m icro sco p ia e le ctró n ica p ro p o rcio n a las b ases p a ra la v erd ad era clasi ficació n de las u n io n es de tipo gap. Sin e m b arg o , en los p rim ero s estad ios del d esarrollo de u n a u n ió n de tipo gap, a n te s de que el a p a ra to cito esq u elético se u n a y e sp ecialm en te en los tejidos em b rio n ario s, a m en u d o las células se u n en u n as a o tras sin que estas estru ctu ra s c a ra cte rística s se p o n g an cla ra m e n te de m an ifiesto: m ed ian te la m icro sco p ia e le ctró n ica sólo se p u ed en o b serv ar las dos m e m b ra n a s p lasm á tica s se p a ra d a s p o r un p eq u eñ o h u e co de u n a d eterm in ad a a n ch u ra . Sin em b arg o p ru eb as fu n cio n ales p u ed en d e m o stra r que las dos cé lu las está n u nidas u n a a o tra, y análisis b io q u ím ico s p u ed en revelar qué m olécu las so n las resp o n sab les de la ad hesión. De este m o d o , m ien tras que “u n io n es in te rce lu la re s” y “ad h esio n es in te rce lu lares” p a re ce que so n d os m a n e ra s diferentes de e xp resar el m ism o fen ó m en o , en la p rá c tic a co rre sp o n d e n a d os a p ro x im a cio n e s exp erim en tales diferentes -u n a a p artir de la d e scrip ció n d ad a p o r la m icro s c o p ia e le ctró n ica y la o tra a través de p ru eb as fu n cio n ales y a p ro x im a cio n e s b io q u ím ica s - y a d os visiones d iferen tes - u n a b a sa d a en la e stru c tu ra m a d u ra y la o tra en su d esarrollo. H asta h a c e p o co s a ñ o s e sta s d os a p ro x im a cio n e s no h an em p e z a d o a co n v e rg e r en u n a op in ión u n ificad a d esd e el p u n to de v ista de las b ases m o le cu la re s de las u n io n es y de las ad h e sio n e s celu lares. En el cap ítu lo an te rio r estu d iam o s las es tru ctu ra s de las u n io n es celu lares m a d u ra s. En e sta s e cció n tra ta re m o s de los estu d ios fu n cion ales y b io q u ím ico s de la ad h esió n in tercelu lar que se h a n de p ro d u cir an tes de q ue p u e d a ser o rg an izad a u n a u nión de an claje in tercelu lar p le n a m e n te fu n cio n al; m ás a d elan te en e ste m ism o cap ítu lo , tra ta re m o s de los estu d ios b io q u ím ico s y fu n cio n ales de los m e ca n ism o s de la ad h esió n célu lam atriz. E m p e z a re m o s c o n u n a p re g u n ta de d esarrollo: ¿Qué m e ca n ism o s a se gu ran q ue u n a célu la e m b rio n a ria se u n a a las célu las v ecin as ap ro p iad as en el m o m e n to o p o rtu n o ?
célula fundadora en la lámina basal
Existen dos vías fundam entales mediante las cuales las células animales se unen para form ar tejidos11 M u ch o s de los tejidos sim ples, in clu yen d o la m a y o r p arte de los epitelios, p ro vien en de célu las p re cu rso ra s cu y a p ro g en ie no p u ed e m igrar in d ep en d ien te m e n te al estar a n cla d a s a la m atriz e xtracelu lar y /o a otras célu las (Figura 1 9 -2 1 ). Sin em b arg o , a m ed id a que las célu las se van a cu m u la n d o no p e rm a n e c e n ju n tas de fo rm a pasiva, a m o n to n a d a s d e so rd e n a d a m e n te , sino que, c o m o verem os, la arq u ite ctu ra del tejido se m a n tie n e de fo rm a a ctiv a p o r ad h esio n es selectivas que p ro d u cen las célu las y que van m o d ifican d o p ro g resiv am en te. De este m o d o , si se m e z cla n artificialm en te célu las de d iferentes tejidos em b rion arios, las célu las se clasificarán e s p o n tá n e a m e n te restab lecien d o u n a o rg an izació n m ás n o rm al. E stas ad hesiones selectivas son incluso m ás esen ciales p ara el desarrollo de los tejidos que tienen u nos orígenes m ás com p lejos en los que particip a la m igra ción celu lar en la que u n a población celular invade a o tra y se u ne a ella y en los que quizás tam b ién p articip an o tras células m igratorias, form an do finalm ente u n a estru ctu ra ord en ad a. P or ejem plo, en los em b riones de vertebrados algunas células de la (epitelial), se sep aran del túbulo epitelial neural co n el
cresta neural
que in icialm en te estab an relacion adas, y m igran a través de vías específicas h acia otras m u ch as regiones. P o sterio rm en te se u nen a otras células organizándose y di feren cián d ose en diversos tejidos, incluyendo el sistem a nervioso periférico (Figu-
1032
Capítulo 19 : Adhesión celular, uniones celulares y matriz extracelular
unión intercelular
lámina basal
i«
lámina de células epiteliales
Figura 19-21 El mecanismo más simple mediante el cual las células se unen entre sí formando un tejido. La progenie de células fundadoras es retenida en el tejido epitelial mediante la lámina basal y mecanismos de adhesión intercelular, incluyendo la formación de uniones intercelulares.
Figura 19-22 Ejemplo de un mecanismo más complejo por el que las células se unen entre sí formando un tejido. Células de la cresta neural se segregan del epitelio que form a la superficie superior del tubo neural y m igran form ando diversos tipos celulares y tejidos en todo el em brión. Aquí se m u estran u niéndose y diferenciánd ose, form ando dos grupos de células nerviosas en el sistem a nervioso periférico. Tales grupos de células nerviosas se d en om inan ganglios. En el ganglio, otras células de la cresta neural se d iferencian con stituyend o células de soporte (células satélite) que rodean la neu rona. A unque no se m uestra, las células de la cresta neural proliferan rápid am ente a la vez que m igran.
ra 19-22). Este tipo de p ro ceso requiere, en prim er lugar, de algún m ecan ism o que dirija las células h asta su destino final, co m o la secreció n de u n a m olécu la soluble que atraiga a las células que m igran (por ) o extendiendo m oléculas adhesivas en la m atriz extracelu lar o sobre la superficie de d eterm in adas células, guiando las células m igradoras a lo largo de vías definidas (m ediante
quimiotaxis
orientación de vía). C uando u n a célula m igratoria alcan za su destino, puede re co n o ce r otros tipos celulares ap rop iad os y asociarse co n ellos form an do un tejido.
MIGRACION CELULAR SEGUIDA DE AGREGACIÓN
Las células de vertebrados disociadas pueden reagregarse en tejidos organizados mediante mecanismos de adhesión selectiva célula-célula12 A d iferen cia de los tejidos ad ultos de v erteb rad o s, difíciles de d isociar, los tejidos e m b rio n arios son fáciles de d iso ciar m ed ian te tra ta m ie n to co n bajas c o n c e n tra cio n es de en zim as p ro teo líticas, tales co m o la tripsina, co m b in a n d o en o c a s io n es este tra ta m ie n to co n el se cu e stro del C a2+ y de Mg2+ extracelu lares m e d ia n te u n q u elan te catió n -d iv alen te (co m o el EDTA). E stos reactiv o s d eso rg an izan las in te ra ccio n e s p ro teicas (m u ch as de las cu ales so n d ep en d ien tes de ca tio n e s divalen tes) que m an tie n e n u nidas las células. Es d estacab le que a m en u d o esto s d iso ciad o s celu lares se re a so cia n fo rm an d o e stru ctu ra s que se a sem ejan al tejido original. T ales ca ra cte rística s sugieren que la e stru ctu ra tisular no es
in vitro
p ro p iam en te un p ro d u cto e stá tico sino que se m an tien e activ a m e n te y se esta b i liza p o r un sistem a de afinidades en tre las p rop ias células o en tre éstas y la m a triz extracelu lar. P or lo tan to , el estudio de la reag reg ació n en cultivo de células d iso ciad as p u ed e p ro p o rcio n a r u n a b ase p a ra el estudio del papel que ju ega la ad h esión de las célu las co n o tra s célu las o co n la m atriz en la co n stitu ció n y el m an ten im ien to de la o rg an izació n de los tejidos en el o rg an ism o .
epidermis
Las exp erien cias realizad as en cultivos celu lares de célu las de la p ro p o rcio n an un ejem plo m uy in structivo al re sp e cto . Las célu las ep id érm icas, co n o cid a s co m o se ad h ieren fu ertem en te u n as a otras fo rm an d o
queratinocitos,
u n a c a p a p lu riestratificad a que se ap o y a sob re u n a lám in a basal. Los q u e ra tin o citos del estrato basal de la ep id erm is son relativ am en te ind iferenciados, prolife ran de form a co n tin u a y su p rogen ie a c c e d e a los e strato s su periores, ce sa n d o la división celu lar y d iferen cián d o se to ta lm e n te (véase Figura 2 2 -2 1 ). Sobre un su b strato ad ecu ad o , los q u eratin o cito s d isociad os m an ten id o s en cultivo ta m bién proliferan y se diferencian. Si la co n ce n tra ció n de C a2+ en el m edio de cultivo se m an tien e en un nivel bajo, los sistem as de ad hesión celu lar d ep en d ien tes de C a2+ no so n op erativ o s p o r lo que las célu las c re c e n en fo rm a de m o n o c a p a en la que se m ezclan las células en proliferación y las diferenciadas. Si se a u m en ta la c o n ce n tra ció n de C a2+, la o rg an izació n esp acial de las células se tran sfo rm a in m ed iatam en te: la m o n o c a p a se co n v ierte en un epitelio plu riestratificad o en el q ue las célu las en p roliferación fo rm an u n a ca p a basal que se ad hiere al su b stra to, m ien tras que las célu las en d iferen ciació n so n segregad as h a cia las c a p a s su p eriores, co m o se ob serva en la piel. E ste resu ltado sugiere que el o rd en am ien to estratificad o n o rm al de los q u eratin o cito s en fu n ción de su estad o de d iferen cia ció n se m an tien e p or m e ca n ism o s de ad hesión in tercelu lar d ep en d ien tes de C a2+. U n o de esto s m eca n ism o s im plica la p a rticip ació n de re ce p to re s de la m a triz extracelu lar del tipo de la integrinas, que e stu d iarem o s m ás ad elan te; estos
Adhesión intercelular
1033
Figura 19-23 Adhesión específica de órgano de células disociadas de embriones de vertebrados determinada mediante un ensayo radiactivo de agregación celular. La
c é lu la s e m b r io n a r ia s d e r e tin a d is o c ia d a s
# # O Q O o O O t) •
•••••
•
\O o ° 00 ° pequeño a g re g a d o de c é lu la s d e r e tin a
c é lu la s e m b r io n a r ia s d e h í g a d o d is o c ia d a s
c é lu la s h e p á tic a s m a rc a d a s r a d ia c tiv a m e n te
/
© O
©
© O' c é lu la s d e r e tin a m a rc a d a s r a d ia c tiv a m e n te
pequeño a g re g a d o d e c é lu la s d e h íg a d o
MEZCLA DE CÉLULAS MARCADAS RADIACTIVAMENTE Y AGREGADOS CELULARES
re ce p to re s n o se e n cu e n tra n en las célu las ep id érm icas d iferen ciad as p ero sí en las célu las b asales, las cu ales utilizan las in tegrin as p a ra ad h erirse a la lám in a b asal. O tro de los m e ca n ism o s im p lica la p re se n cia de m o lécu las de ad h esión celu lar del tip o de las ca d h e rin a s, que ta m b ié n v e re m o s m á s ad elan te. U n ejem p lo to d av ía m á s llam ativo del m ism o fen ó m en o se o b serv a cu a n d o célu las d iso ciad as de d os ó rg a n o s em b rio n ario s de v erteb rad o s, tales c o m o el h í gad o y la retin a, se m e z cla n fo rm a n d o artificialm en te u n agregad o: los a g re g a d os m ixto s, se seg reg an p a u la tin a m e n te en fu n ción del tejido (órgano) de o ri gen . Del m ism o m o d o , las célu las d iso ciad as se u n e n co n m ay o r facilidad a los agregad o s de sus p ro p io s tejidos q ue a los de o tro origen (Figura 1 9 -2 3 ). N atu ral m e n te h a n de existir sistem as de re co n o cim ie n to in tercelu lar resp o n sab les de que las célu las del m ism o tejido d iferen ciad o se ad h ieran p re fe re n te m e n te en tre ellas; estas p refere n cia s de a d h esió n p ro b a b le m e n te so n im p o rta n te s en la e s ta bilización de la arq u ite ctu ra tisular. ¿Cuál es la b ase m o le cu la r de e sta ad h esió n in tercelu lar selectiva en los v e r teb rad os? E n la m ay o ría de an im ales p lu ricelulares a ctú a n dos tipos distintos de m o lé c u la s d e a d h e s ió n in te r c e lu la r (CAM, de Cell-Cell A dhesion M olecu les), u n o de ellos d ep en d ien te de C a2+ y o tro in d ep en d ien te de C a2+, que p a re ce n ser los p rin cip ales resp o n sab les de la ad h esió n in tercelu lar esp ecífica de tejido o b serv ad a en estad io s em b rio n ario s te m p ra n o s. A m bas clases de m o lécu las de a d h esió n fu ero n id en tificad as in icialm en te g en eran d o an ticu e rp o s c o n tra m o lé cu las de su perficie y luego estu d ian d o la ca p a cid a d de esto s an ticu erp o s p a ra inhibir la ad h esió n celu lar en el tu b o de en sayo. Los an ticu e rp o s p o co co m u n e s q ue in h ib ían la ad h esió n celu lar fu eron utilizados luego p a ra c a ra cte riz a r y aislar las m o lécu las de ad h esió n re co n o c id a s p o r los an ticu erp o s.
103 4
Capítulo 19 : Adhesión celular, uniones celulares y matriz extracelular
velocidad de adhesión celular puede ser medida determinando el número de células marcadas radiactivamente que se han unido a los agregados celulares a lo largo del tiempo. La velocidad de adhesión es mayor entre células del mismo tipo. En una modificación habitual de este ensayo, las células marcadas con un ligando fluorescente o radiactivo se unen a una monocapa de células en cultivo.
Las cadherinas median la unión célula-célula dependiente de Ca2+ en los vertebrados13 Como hem os indicado al tratar de las uniones intercelulares, las cadherinas son las responsables de la adhesión celular dependiente de Ca2+ en los tejidos de ver tebrados. Las tres primeras cadherinas que se descubrieron se denominaron te niendo en cuenta los principales tejidos en los que se encontraron: así la cadhe rina E se halla en muchos tipos de células epiteliales, la cadherina N en células nerviosas, musculares y del cristalino; y finalmente, la cadherina P se localiza en células placentarias y epidérmicas. Todas estas moléculas pueden ser detectadas de manera transitoria en otros tejidos durante su desarrollo. Además, continua mente se están descubriendo nuevos tipos de cadherinas; actualmente se cono cen por lo menos una docena de ellas. Parece que prácticamente todas las célu las de vertebrados expresan una o más cadherinas, cada una de las cuales está codificada por un gen distinto, siendo la expresión de cada grupo concreto una características del tipo celular. Experimentos in vitro e in vivo han demostrado que las cadherinas son las principales moléculas de adhesión que mantienen las células unidas entre sí durante los primeros estadios embrionarios. In vitro la li beración de Ca2+ extracelular o el tratamiento con anticuerpos anti-cadherina desmontan el tejido, y si la adhesión mediada por la cadherina permanece intac ta, los anticuerpos contra otras moléculas de adhesión no tienen efecto; in vivo, las mutaciones que inactivan la función de las cadherinas provocan un fracaso en el desarrollo del embrión. La mayor parte de las cadherinas son glucoproteínas con un solo dominio transmembrana, constituidas por unos 700-750 residuos de aminoácido. La vo luminosa fracción extracelular de la cadena polipeptídica está normalmente ple gada en 5 dominios, cada uno de los cuales contiene alrededor de 100 residuos de aminoácidos; 4 de estos dominios son homólogos entre sí y probablemente contienen lugares de unión al Ca2+ (Figura 19-24). En ausencia de Ca2+ las cadhe rinas sufren un importante cambio conformacional, como resultado del cual son degradadas rápidamente por enzimas proteolíticas. El significado biológico de la notable dependencia de la función proteica de la cadherina respecto al Ca2+ se desconoce. La cadherina E (también denominada uvomorulina) es la cadherina m ejor caracterizada. Ya la encontram os al estudiar las uniones celulares puesto que habitualmente se concentra en las bandas de adhesión de los tejidos epiteliales maduros donde conecta los filamentos de actina de los citoesqueletos corticales de las células adyacentes manteniéndolas unidas. También es la primera cadhe rina que se expresa durante el desarrollo de los mamíferos, contribuyendo a la compactación, un importante cambio morfológico que tiene lugar en el estadio celular de 8 células del desarrollo embrionario del ratón. Durante la com pacta ción, las células todavía unidas de manera muy laxa, denominadas blastómeros, se van agregando de forma muy com pacta uniéndose mediante uniones interce lulares. Los anticuerpos dirigidos contra la cadherina E bloquean la com pacta ción blastom érica mientras que los anticuerpos contra otras moléculas de la su perficie celular no la bloquean. Parece probable que las cadherinas también jueguen un importante papel en los últimos estadios del desarrollo de los vertebrados, ya que su presencia o ausencia están correlacionadas con los principales procesos morfogenéticos im plicados en la segregación tisular. Así por ejemplo, una vez formado el tubo neural e independizado del ectodermo, las células del neuroepitelio en desarrollo pierden la cadherina E y expresan por el contrario la cadherina N, mientras que las células de la capa ectodérmica continúan expresando la cadherina E (Figura 19-25). Además las células de la cresta neural que forman el sistema nervioso pe riférico, cuando están asociadas con el tubo neural tienen grandes acúmulos de cadherina N en su superficie, dejan de expresarla cuando inician la migración y después vuelven a expresarla de nuevo cuando se agregan formando un ganglio nervioso (véase Figura 19-22). Así pues, los tres grupos celulares que se originan
Adhesión intercelular
NH2
ñ Ca2+
Z1 c Ca2+
=1 tz Ca2+
=3 m
m em brana plasm ática
10 nm
Figura 19-24 Dibujo esquem ático de una típica m olécula de cadherina. La región extracelular de la proteína presenta cinco dominios homólogos, tres de los cuales contienen lugares de unión para el Ca2+. Se cree que el dominio extracelular más lejano a la membrana media la adhesión intercelular; la secuencia His-Ala-Val presente en este dominio parece estar implicada en esta unión ya que los péptidos que tienen esta secuencia inhiben la adhesión mediada por la cadherina. La región citoplasmática interactúa con el citoesqueleto de actina por medio de varias proteínas de unión intracelular, que incluyen tres proteínas del tipo de las cateninas. La a-catenina está estructuralmente relacionada con la vinculina. X representa las proteínas de unión no caracterizadas implicadas en el acoplamiento de las cadherinas a los filamentos de actina.
1035
de un mismo estrato celular presentan patrones distintos de expresión de cadherinas cuando se separan unos de otros, lo cual sugiere que los cambios en la ex presión de la cadherina están implicados en los procesos de separación celulares.
Las cadherinas median la adhesión célula-célula a través de un mecanism o hom offlico14 ¿De qué manera las moléculas de adhesión intercelular, tales como las cadheri nas, median la unión celular? En la Figura 19-26 se ilustran tres posibilidades: (1) las moléculas de una célula pueden unirse a otras moléculas del mismo tipo de células adyacentes (las uniones en este caso se denominan homo/ñicas)] (2) las moléculas de una célula pueden unirse a moléculas de diferente tipo de células adyacentes (en este caso las uniones se denominan heterofílicas)', y (3) los recep tores de superficie celular de células adyacentes pueden estar unidos entre sí a través de moléculas secretadas de enlace multivalente. Estos tres mecanismos se han encontrado en animales. Sin embargo, las cadherinas normalmente utilizan un mecanism o homofflico. Esto se ha demostrado utilizando una línea celular 100 |jm de fibroblastos denominada células L, que no expresan cadherina y que no se unen unas a otras células. Cuando las células L se transfectan con DNA que co Figura 19-25 Distribución de las difica cadherina E, se adhieren entre sí por mecanismos dependiente de Ca2+, y cadherinas E y N durante el esta adhesión se inhibe por anticuerpos contra cadherina E. Como las células desarrollo del sistema nervioso. transfectadas no se unen a las células L no transfectadas, la cadherina E puede Inmunofluorescencia de una sección unir dos células entre sí pero mediante la interacción de moléculas de cadherina transversal de un embrión de pollo E de ambas células. mostrando el tubo neural en desarrollo Si se mezclan células L que expresan cadherinas distintas, las células se semarcado con anticuerpos contra la cadherina E (A) contra la cadherina N paran y se agregan por separado, lo cual indica que las cadherinas se unen pre (B). Obsérvese que las células del ferentem ente a las de su mismo tipo. Una segregación similar a ésta ocurre si las ectodermo dorsal sólo expresan la células L expresan cantidades distintas de la misma cadherina. Por lo tanto, pa cadherina E mientras que las células rece probable que las diferencias tanto cualitativas como cuantitativas en la ex del tubo neural la han perdido, y han presión de las cadherinas deben jugar un papel crucial en la formación de los te adquirido la cadherina N. (Cortesía de jidos; seguramente las diferencias en las cadherinas también explican la mayoría Kohei Hatta y Masatoshi Takeichi.) de los experimentos clásicos de adhesión específica tanto en órganos como en tejidos in vitro. Muchas cadherinas, tales como las E, las N, y las P, actúan como proteínas de unión transm em brana mediando las interacciones entre los filamentos de actina del citoesqueleto de las células que están unidas. Son, como hemos visto, las proteínas de adhesión en torno a las cuales se construyen las uniones adherentes intercelulares. Un dominio citoplasmático altamente conservado de es tas cadherinas interactúa con el córtex de actina por medio de tres proteínas de unión intracelular denominadas cateninas (véase Figura 19-24). Esta interac ción es necesaria para que se produzca adhesión intercelular: las moléculas de cadherina E que carecen de dominio citoplasmático son incapaces de mantener unidas las células. Las cadherinas que se localizan en los desmosomas no interactúan con filamentos de actina sino con filamentos intermedios; su dominio citoplasm ático es distinto y se unen a grupos distintos de proteínas de unión, las cuales a su vez se unen a filamentos intermedios. Las cadherinas no son las únicas proteínas que median la adhesión interce lular dependiente de Ca2+: algunas integrinas también pueden unir células entre
Figura 19-26 Tres mecanismos mediante los cuales las moléculas de superficie celular pueden mediar la adhesión intercelular. Aunque todos
UNION HOMOFILICA
10 3 6
UNION HETEROFILICA
UNION A TRAVES DE UNA MOLÉCULA DE UNIÓN EXTRACELULAR
Capítulo 19: Adhesión celular, uniones celulares y matriz extracelular
estos mecanism os pueden actuar en animales, el que depende de una molécula de unión extracelular parece ser el menos común.
sí mediante interacciones heterofílicas con otras proteínas de superficie celular, si bien la mayoría de las integrinas median la unión de las células a la matriz ex tracelular, como estudiaremos más adelante. Además, una familia de proteínas de unión a carbohidratos de superficie celular (las lectinas) denominadas selectinas actúan en un gran número de adhesiones intercelulares transitorias en la circulación sanguínea, permitiendo por ejemplo a los glóbulos blancos unirse transitoriamente a las células endoteliales de vasos sanguíneos pequeños y así migrar desde la sangre hacia tejidos y zonas inflamadas. Las selectinas contie nen un gran dominio de la lectina altamente conservado que en presencia de Ca2+ se une a un oligosacárido específico de otra célula -otro ejemplo de adhe sión intercelular heterofílica (véase Figura 10-42). Como en el Capítulo 10 ya se trata de las selectinas, no se considerarán aquí en mayor profundidad. Más adelante discutiremos cómo las células pueden regular la actividad ad hesiva de sus integrinas. De una forma similar parece probable que por lo menos algunas células pueden regular la actividad adhesiva de sus cadherinas, aunque se conoce mucho menos acerca de la regulación de las cadherinas que acerca de la regulación de las integrinas. Esta regulación puede ser importante para los re ordenamientos celulares que suceden en los epitelios cuando estas células cam bian de forma y se organizan durante el desarrollo animal.
nh2
nh2
nh2
nh2
La adhesión intercelular independiente de Ca2+ está mediada principalm ente por unas proteínas pertenecientes a la superfamilia de las inmunoglobulinas15 Las moléculas responsables de la adhesión célula-célula independiente de Ca2+ pertenecen principalmente a la antigua y gran superfamilia de las inmunoglobu linas (Ig), denominadas así porque poseen uno o más dominios de tipo Ig que son característicos de las moléculas de anticuerpo (se discute en el Capítulo 23). El ejemplo m ejor estudiado es la m olécula de adhesión de las células neurales (N-CAM de Neural Cell Adhesión Molecule), la cual se expresa en varios tipos ce lulares incluyendo muchas células nerviosas. Es la más común de las adhesiones intercelulares independientes de Ca2+en los vertebrados y, como las cadherinas, parece que une a las células entre sí mediante una interacción homofílica (entre moléculas N-CAM de células adyacentes). Sin embargo algunas proteínas de ad hesión intercelular semejantes a las Ig utilizan un mecanismo heterofílico; algu nas de ellas, denominadas moléculas de adhesión intercelular (ICAM), se expre san en células endoteliales activadas y se unen a las integrinas en la superficie de los glóbulos blancos, colaborando así en atrapar a las células sanguíneas en los lugares de inflamación. Existen por lo menos 20 formas de N-CAM. A diferencia de las cadherinas, cada una de las cuales está codificada por un gen diferente, los distintos mRNA que codifican las N-CAM provienen de la expresión alternativa de un transcrito de RNA codificado por un solo gen. En todas las formas de N-CAM el gran domi nio extracelular de la cadena polipeptídica está plegada en 5 dominios hom ólo gos a los de las inmunoglobulinas. La mayoría de las N-CAM son proteínas transm em brana de un solo paso, con dominios intracelulares de tamaño varia ble que parecen estar implicados en la señalización celular o en la unión al citoesqueleto. Existe una forma de N-CAM que no atraviesa la bicapa lipídica y que se une a la m em brana plasm ática m ediante un enlace covalente al glucosilfosfatidilinositol (GPI), m ientras que otras formas son secretadas y pueden ser incorporadas a la matriz extracelular (Figura 19-27). La glucosilación de las N-CAM proporcionan más diferencias: algunas formas tienen una gran canti dad de ácido siálico (en la inusual forma de varias cadenas, cada una de las cuales contiene cientos de residuos repetidos de ácido siálico) mientras que otras contienen una cantidad mucho menor. En virtud de su carga negativa, las largas cadenas de ácido siálico impiden la adhesión celular, modificando de ese modo la función adhesiva de las N-CAM. En efecto, es posible que en algu nos casos las N-CAM que están fuertem ente cargadas con ácido siálico puedan
Adhesión intercelular
10 nm
Figura 19-27 Dibujo esquemático mostrando cuatro formas de N-CAM. En cada caso, la región extracelular de cada cadena polipeptídica está plegada en cinco dominios sem ejantes a los de las inmunoglobulinas (y uno o dos más dominios denominados fibronectina de tipo II se repiten por causas que aclararemos más adelante). Los enlaces disulfuro (mostrados en rojo) conectan las term inaciones de cada bucle, formando cada uno de los dominios sem ejantes a Ig.
1037
impedir la adhesión más que provocarla. Por ejemplo, en algunas neuronas la presencia de estas cadenas de ácido polisiálico fom entan el crecim iento de unas prolongaciones, probablem ente facilitando que las puntas de estas prolonga ciones se alejen de las células que van encontrando y con las que podrían entrar en contacto. Existen evidencias substanciales de que las N-CAM y sus respectivos hom ó logos sem ejantes a Ig juegan un papel importante en el desarrollo de los verte brados. Cuando se utilizan anticuerpos contra cualquiera de las N-CAM o contra otras moléculas de adhesión intercelular neural de tipo Ig denominadas LJ, y se inyectan a lo largo de la zona de crecim iento desde la retina hacia el cerebro, se altera el patrón normal de crecim iento de las prolongaciones nerviosas. Cuando se utilizan en cultivos celulares estos anticuerpos inhiben la tendencia de las prolongaciones en desarrollo de las células nerviosas a adherirse entre sí for mando haces (fascículos). Al igual que las cadherinas N, las N-CAM se expresan en grandes cantidades en las células del tubo neural en desarrollo; pero cuando las células de la cresta neural se disocian del tubo neural e inician la migración, pierden las N-CAM reexpresándolas de nuevo cuando se agregan formando un ganglio nervioso (véase Figura 19-22). Como en el caso de las cadherinas, las NCAM se expresan tam bién transitoriamente durante estadios críticos del desa rrollo de muchos tejidos no neuronales. A pesar de que las cadherinas y los miembros de la familia de las Ig st -iesan a menudo en las mismas células, las adhesiones mediadas por las cadherinas son mucho más fuertes y casi con toda seguridad son las principales responsa bles de m antener la unión entre células, la segregación de colectivos celulares en tejidos individuales y m antener la integridad del tejido. Parece que las N-CAM y otros miembros de la familia de las Ig contribuyen más a la regulación fina de las interacciones adhesivas durante el desarrollo y la regeneración. Así, la inyección de mRNA que codifica cadherina N a huevos de rana fecundado provoca una sobrexpresión de cadherina N en lugares donde normalmente no se expresa y conduce a una enorm e disrupción de la estructura normal del tejido. Por el con trario, el mismo experimento realizado con mRNA que codifica N-CAM provoca una m enor alteración en el desarrollo, a pesar de que parece que las N-CAM se sobrexpresan en muchas localizaciones anormales. La prueba más crítica para conocer el papel de una proteína en un proceso biológico concreto no consiste en sobrexpresarla sino en suprimir su produc ción modificando el gen correspondiente. Aunque actualmente esto puede rea lizarse en algunos vertebrados, es más fácil hacerlo en invertebrados manipulables genéticam ente, tales com o Drosophila o el nemátodo C. elegans. En Drosophila se ha caracterizado un conjunto de proteínas semejantes a Ig que median la adhesión intercelular independiente del Ca2+. Una de estas proteínas, la fasciclina II, está estrecham ente relacionada con N-CAM: com o N-CAM, tie ne cinco dominios sem ejantes a Ig y actúa por unión homofílica. Se expresa principalmente en un subconjunto de prolongaciones celulares nerviosas y en algunas células gliales con las que contactan durante el desarrollo. Si las dos co pias del gen de la fasciclina II se inactivan por una mutación, el grueso de la es tructura del sistem a nervioso sigue siendo normal pero por lo menos dos de las prolongaciones celulares nerviosas que normalmente expresan la fasciclina II y se adhieren entre sí, dejan de reconocerse y por lo tanto ya no forman haces. Esta observación es consistente con la opinión de que las moléculas de adhe sión intercelular sem ejantes a Ig juegan papeles sutiles pero importantes en el desarrollo.
Muchos tipos de moléculas de superficie celular actúan paralelam ente mediando la adhesión selectiva célula-célula y célula-m atriz16 Todos los estudios realizados nivel de biología celular, bioquímico y morfológico indican que cada célula utiliza diversos mecanismos moleculares para adherirse
1 03 8
Capítulo 19: Adhesión celular, uniones celulares y matriz extracelular
Figura 19-28 Resumen de los mecanismos de adhesión, tanto los que implican complejos de unión como los que no, mediante los cuales las células se adhieren una a otras y a la matriz extracelular. Los
unión estanca
filamentos de actina
<
banda de adhesión (cadherinas)
'LU
CO O
x< <
desm osom a (cadherinas)
_l
filamentos intermedios
unión de tipo
gap
2H -O< X < •LU
O
lám ina basal
M E C A N ISM O S DE ADHESIÓN Q U E IMPLICAN C O M P LE JO S DE UNIÓN
M E C A N IS M O S DE AD HESIÓN Q U E NO IMPLICAN C O M P LE JO S DE UNIÓN
tanto a otras células com o a la matriz extracelular. Algunos de estos mecanismos implican uniones celulares bien estructuradas, mientras que otros no (Figura 19-28). Así, de la misma manera que cada célula de un animal pluricelular con tiene un conjunto de receptores de superficie que le permiten responder especí ficamente a un conjunto complementario de señales químicas solubles tales como hormonas y factores de crecim iento, esta misma célula integrada en un tejido tam bién puede disponer de una com binación (o concentración) particu lar de receptores de superficie celular (moléculas de adhesión celular) que la capacitan para unirse de manera característica a otras células y a la matriz extracelular. Asimismo, de la misma forma en que los receptores para señales quími cas solubles generan señales intracelulares que alteran el comportamiento de las células, tam bién pueden alterarse las moléculas de adhesión celular, a pesar de que en este caso los mecanism os de señalización son menos conocidos. A diferencia de los receptores para señales químicas solubles, que se unen a sus ligandos específicos con una alta afinidad, los receptores que se unen a las moléculas de la superficie celular o a componentes de la matriz extracelular lo hacen generalmente con una baja afinidad. En consecuencia, estos receptores consiguen increm entar enormemente la fuerza de unión mediante la unión si multánea de un gran número de receptores a sus ligandos situados en otra célu la o en la matriz adyacente. A este principio se le podría denominar “principio del Velero”. Hemos visto, sin embargo, que la interacción de los dominios de unión extracelulares de estas moléculas de superficie celular no es suficiente para asegurar la adhesión celular: por lo menos en el caso de las cadherinas, y com o veremos en el de las integrinas, las moléculas de adhesión tam bién han de unirse (vía acoplamiento proteico) al citoesqueleto cortical del interior de la cé lula. Parece que el citoesqueleto facilita y estabiliza la agrupación lateral de las moléculas de adhesión, facilitando la unión de múltiples puntos, lo cual tam-
Adhesión intercelular
mecanism os de unión se muestran en células epiteliales, mientras que los que no implican unión, se muestran en células no epiteliales. Una interacción adhesiva se define como aquella que mediante microscopía electrónica convencional y/o criofractura puede ser observada como una región de contacto especializada. Obsérvese que las integrinas y las cadherinas están implicadas tanto en interacciones de unión com o en interacciones de no-unión célulacélula (cadherinas) y célula-matriz (integrinas). Generalm ente las cadherinas median interacciones de tipo homofílico, mientras que las integrinas median interacciones de tipo heterofílico (véase Figura 19-26). Tanto las cadherinas com o las integrinas actúan com o elem entos de unión transm embrana, y su función depende de cationes divalentes extracelulares; por esta razón, la mayoría de contactos célula-célula y célula-matriz son dependientes de cationes divalentes. Las selectinas e integrinas también pueden actuar como moléculas de adhesión heterofílica célula-célula: las selectinas se unen a carbohidratos, mientras que las integrinas unidas a células se unen a miembros de la superfamilia de las inmunoglobulinas. Las integrinas y los proteoglucanos integrales de m embrana que median la adhesión mediante com plejos que no son de unión a la matriz extracelular serán explicados más adelante.
1039
Figura 19-29 Importancia del citoesqueleto en la adhesión celular.
SIN UNIÓN AL CITOESQUELETO
CON UNIÓN AL CITOESQUELETO
m m m ■* « mmmm
NO AFECTA A LA CELULA
ADHESION CELULAR
bién es necesario para permitir que la célula adherida ejerza tracción sobre la cé lula o la matriz adyacentes (o viceversa) (Figura 19-29). Así pues, es la suma de los tipos específicos de moléculas de adhesión intercelular y de receptores de matriz presentes en las dos células, la concentración de estas moléculas, las uniones citoesqueléticas y la distribución sobre la superficie celular, 10 que determina la afi nidad total con la que dos células se unirán entre ellas o con la matriz.
Los contactos no adhesivos pueden ser los iniciadores de fenómenos de adhesión intercelular específicos de tejido que posteriormente son orientados y estabilizados por contactos de unión16 ¿Cuál de los diversos tipos de uniones intercelulares que se han discutido en este capítulo, si es que puede atribuirse a alguno de ellos, está implicado en la migra ción y el reconocim iento celulares que tienen lugar durante los procesos de for m ación de tejidos y órganos? Una de las estrategias utilizadas para responder a esta pregunta es la observación mediante el microscopio electrónico de los con tactos establecidos entre células adyacentes cuando están migrando unas sobre otras en em briones en desarrollo o en tejidos adultos en proceso de reparación después de una agresión m ecánica. Estos estudios muestran que, a excepción de la reorganización celular dentro de un epitelio, estos contactos generalmente no implican la form ación de uniones intercelulares organizadas. Por el contrario, las mem branas plasmáticas que interactúan, a menudo se sitúan muy próximas y siguen trayectos paralelos dejando un espacio de tan sólo 10-20 nm entre ellas. Como varias proteínas transm em brana conocidas sobresalen de la membrana plasmática más de 10-20 nm, dos proteínas de la superficie celular pueden interactuar entre sí a través de este espacio de 10-20 nm mediando la adhesión entre las células. Este tipo de contacto no incluido en los tipos de unión celular, puede ser óptimo para la locom oción celular -suficientem ente fuertes para soportar la tracción pero no lo bastante como para inmovilizar la célula. Entre las células embrionarias en migración generalmente no se observan contactos de unión (uniones adherentes, desmosomas, hemidesmosomas y, en insectos, uniones septadas), por lo que la formación de tales uniones puede constituir un m ecanism o importante para inmovilizar las células en un tejido organizado cuando se ha formado. Además, se cree que la formación de uniones intercelulares en el epitelio es necesaria para conseguir fuerza mecánica y para ayudar a polarizar y orientar las células constituyentes. Una hipótesis razonable se basa en que las proteínas de adhesión no relacionadas con la unión celular iniciarían la agregación específica en los tejidos, la cual sería entonces orientada 10 4 0
Capítulo 19 : Adhesión celular, uniones celulares y matriz extracelular
Este dibujo ilustra la razón por la cual las moléculas de adhesión celular han de unirse al citoesqueleto para poder mediar una fuerte adhesión célulacélula o célula-matriz. En realidad, muchas de las proteínas de adhesión pueden ser expulsadas de la célula junto con fragmentos de membrana adheridos, y los agujeros dejados en la membrana se vuelven a cerrar al instante.
y estabilizada mediante el conjunto de uniones intercelulares. Muchas de las proteínas transmembrana implicadas pueden difundir en el plano de la m em brana plasmática, por lo que pueden acumularse en los lugares de contacto cé lula-célula o célula-matriz y por tanto ser utilizadas como adhesiones de unión o no de unión. Se ha demostrado que esto sucede para el caso de algunas integri nas y cadherinas, las cuales pueden intervenir en la adhesión celular inicial, para posteriormente pasar a ser parte integral de las uniones celulares. Se está caracterizando un número cada vez mayor de anticuerpos monoclonales y de fragmentos peptídicos, cada uno de los cuales bloquea un solo tipo de moléculas de adhesión intercelular o de receptores de matriz -y a medida que los genes que codifican estas proteínas de superficie celular empiecen a estar disponibles para la manipulación en cultivos celulares y en animales de experi m entación- será posible inactivar los diversos tipos de proteínas de adhesión intercelular y los receptores de matriz, individualmente y en diferentes com bi naciones, para descifrar las bases de reconocimiento y de unión que participan en la morfogénesis de tejidos complejos.
Resumen
Las células disociadas a partir de diversos tejidos embrionarios de vertebrados se reasocian preferentemente con células del mismo origen tisular cuando se cultivan conjuntamente. En los vertebrados estos sistemas de reconocimiento específicos de tejido están mediados principalmente por una familia de proteínas de adhesión in tercelular dependientes de Ca2* denominadas cadherinas, que mantienen las célu las unidas por una interacción homofilica entre proteínas transmembrana de tipo cadherina, de células adyacentes. Para mantener las células unidas, las cadherinas han de estar unidas al citoesqueleto cortical. La mayoría de las células animales también presentan sistemas de adhesión intercelular independientes de Ca2* que principalmente pertenecen a la superfamilia de las inmunoglobulinas, incluyendo moléculas de adhesión de células nerviosas como las N-CAM. Un solo tipo celular puede utilizar múltiples mecanismos moleculares para adherirse a otras células (y a la matriz extracelular), por lo que la especificidad de la adhesión intercelular ob servada en el desarrollo embrionario ha de ser el resultado de la integración de va rios sistemas de adhesión diferentes, algunos de los cuales están asociados con uniones celulares especializadas, mientras que en otros no lo están.
La matriz extracelular de los animales 17 Los tejidos no están formados únicamente por células. Una buena parte de su volumen lo constituye el espacio extracelular, el cual está ocupado por una in trincada red macromolecular que constituyen la matriz extracelular (Figura 1930). La matriz está compuesta por polisacáridos y proteínas muy diversos, secre tados localmente y ensamblados en una red compleja en íntima asociación con la superficie celular. Si la discusión de las uniones celulares la hemos realizado fundamentalmente en el contexto de los tejidos epiteliales, la correspondiente a la matriz se centrará en el tejido conjuntivo (Figura 19-31). En este tejido, la m a triz es más abundante que las células, rodeándolas completamente y determi nando las propiedades físicas del tejido. Los tejidos conjuntivos constituyen el esqueleto arquitectónico del cuerpo de los vertebrados, pero su cantidad pre sente en los diferentes órganos varía considerablemente: desde la piel y el hue so, en los que son los componentes mayoritarios, hasta el cerebro y la médula espinal, en los que únicamente son constituyentes minoritarios. Las variaciones en cuanto a la participación relativa de los diferentes tipos de macromoléculas de la matriz así como los patrones de organización de estas macromoléculas en la matriz extracelular dan lugar a una sorprendente diversi dad de formas, cada una de las cuales está altamente adaptada a los requeri mientos funcionales de cada tejido en particular. La matriz puede calcificarse, La matriz extracelular de los animales
0,1 mm Figura 19-30 Células rodeadas espacios llenos de matriz extracelular. Las células particu mostradas en esta electronmicn a bajo aumento pertenecen al es de una extremidad de pollo. Las células aún no presentan sus características especializadas. (Cortesía de Cheryll Tickle.)
Figura 19-31 Tejido conjuntivo subyacente a un epitelio celular. Está constituido en su mayor parte por una matriz extracelular que es secretada por los fibroblastos.
formando estructuras duras com o en el hueso y el diente, ser transparente como en el caso de la córnea o adoptar formas sem ejantes a tensores, las cuales dan a los tendones su enorm e resistencia a la tracción. En la interfase entre un epitelio y un tejido conjuntivo, la matriz forma una lámina basal, estructura extremada mente delgada pero que al parecer juega un importante papel en el control del com portam iento celular. Aunque en esta sección nos centraremos en la matriz extracelular de los vertebrados, otros organismos fabrican una gran cantidad de materiales relacionados, únicos e interesantes, como las paredes celulares de las bacterias, las cutículas de los gusanos e insectos, las conchas de los moluscos y, como discutiremos más adelante, las paredes celulares de los vegetales. Hasta hace poco se ha considerado que la matriz extracelular de los verte brados actuaba principalmente como un andamio relativamente inerte que es tabilizaba la estructura física de los tejidos. Sin embargo ahora se sabe que la matriz desempeña un papel mucho más activo y complejo en la regulación del com portam iento de las células que entran en contacto con ella -afectando a su desarrollo, su migración, su proliferación, su forma y su función. La matriz ex tracelular presenta una com pleja com posición molecular que corresponde a es tas funciones. Aunque nuestro conocim iento de su organización todavía es frag mentario, recientem ente la caracterización de sus com ponentes principales ha progresado rápidamente.
La matriz extracelular está producida y orientada por las células que engloba17 Las macromoléculas que constituyen la matriz extracelular proceden, funda mentalmente, de una secreción celular de carácter local. Como discutiremos más adelante, estas células tam bién contribuyen a modelar la matriz ya que la orientación de su citoesqueleto influirá en la orientación de la matriz que éstas produzcan. En la mayor parte de los diferentes tipos de tejido conjuntivo, estas macromoléculas son secretadas fundamentalmente por los fibroblastos (Figura 19-32). Sin embargo en algunos tejidos conjuntivos especializados tales como el cartílago y el hueso, son secretados por células relacionadas con los fibroblastos, que reciben denom inaciones específicas, como condroblastos en el caso del car tílago y osteoblastos en el hueso. Las dos clases principales de macromoléculas que conforman la matriz son ( 1) cadenas de polisacáridos del tipo de los glucosaminoglucanos (GAG), los cuales normalmente se hallan unidos a proteínas mediante enlaces covalentes en forma de proteoglucanos, y (2) proteínas fibrosas, pertenecientes a dos tipos funcionales: las de características fundamentalmente estructurales (por ejemplo, colágena y elastina) y las adhesivas (por ejemplo, fibronectina y laminina). Más adelante veremos (en la Figura 19-57) que los com ponentes de ambas clases presentan una gran diversidad de formas y tamaños. Las moléculas de glucosaminoglucanos y de proteoglucanos forman una “subs-
10 4 2
Capítulo 19: Adhesión celular, uniones celulares y matriz extracelular
10 |jm
Figura 19-32 Electronmicrografía de barrido de fibroblastos en el tejido conjuntivo. El tejido corresponde a córnea de rata. La matriz extracelular que rodea los fibroblastos se com pone mayoritariamente de fibrillas de colágena (no hay fibras elásticas en la córnea). Las glucoproteínas, glucosaminoglucanos y proteoglucanos, que normalmente forman un gel hidratado que ocupa los intersticios de la red fibrosa, son digeridos mediante tratamientos enzimáticos y con ácidos. (De T. Nishida et al. Invest. O phthalm ol. Vis. Sci. 29:1887-1890, 1988.)
disacárido repetido
Figura 19-33 Secuencia repetida de disacáridos de la cadena de un glucosaminoglucano (GAG) de tipo dermatán sulfato. Estas cadenas están constituidas típicamente por entre 70 y 200 residuos de azúcar. Existe una gran densidad de cargas negativas a lo largo de la cadena debido a la presencia de grupos sulfato y carboxilo.
c=o ácido ¡durónico
A/-acetilgalactosamina4-sulfato
tancia fundamental”, altamente hidratada, que presenta propiedades de gel y en la que están embebidas las proteínas fibrosas. El gel de polisacárido opone resis tencia a las fuerzas de compresión de la matriz, mientras que las fibras de colá gena oponen resistencia a la tracción. La fase acuosa del gel de polisacárido per mite la difusión de metabolitos, nutrientes y hormonas entre la sangre y las células que conforman los tejidos; las fibras de colágena refuerzan y colaboran en la organización de la matriz, mientras que las de elastina le confieren elastici dad. Las proteínas adhesivas son intermediarias en el anclaje de las células a la matriz: por ejemplo, la fibronectina participa en la adhesión de fibroblastos y de otras células relacionadas a la matriz en el tejido conjuntivo, mientras que la laminina favorece la unión de las células epiteliales a la lámina basal.
Las cadenas de glucosaminoglucano (GAG) ocupan grandes volúmenes, formando geles hidratados18 Los glucosam inoglucanos (GAG) están formados por largas cadenas no ramifi cadas de polisacáridos, compuestas a su vez por unidades repetidas de disacári dos. Se denominan GAG debido a que en dichos disacáridos, uno de los residuos es siempre un aminoazúcar (AT-acetilglucosamina o Af-acetilgalactosamina). En la mayoría de los casos este aminoazúcar se encuentra sulfatado, siendo el se gundo residuo un ácido urónico (glucurónico o idurónico). Debido a la presen cia de grupos sulfato o carboxilo en la mayoría de los residuos glucídicos de los glucosaminoglucanos, éstos presentan una gran carga negativa (Figura 19-33). En función de dichos restos glucídicos, el tipo de enlace entre ellos y el número y localización de los grupos sulfato, se pueden distinguir cuatro grupos principa les de GAG: (1) ácido hialurónico, (2) condroitín sulfato y dermatán sulfato, (3) heparán sulfato y heparina , (4) queratán sulfato. Las cadenas de polisacáridos no presentan la flexibilidad suficiente como para plegarse en estructuras globulares y compactas, que, típicamente, forman las cadenas polipeptídicas. Además, son altamente hidrofilicas. Así pues, los GAG tienden a adoptar conformaciones muy extendidas, ocupando un enorme volumen en relación a su masa (Figura 19-34) y formando geles incluso a con centraciones muy bajas. Su alta densidad de carga negativa es la causa de la cap tación de numerosos cationes, tales como el Na+, que debido a su actividad os mótica, conducen a la acumulación de grandes volúmenes de agua en la matriz. Ello da lugar a una presión de hinchamiento o turgencia que capacita a la matriz para oponerse a las fuerzas de compresión (en contraste con las fibras de coláge na, que se oponen a las fuerzas de tracción). Por ejemplo, la matriz cartilaginosa que reviste la articulación de la rodilla puede soportar presiones de cientos de atmósferas gracias a este mecanismo. La cantidad de GAG del tejido conjuntivo no representa, en general, más del 10% en peso del total de las proteínas fibrosas. Sin embargo, debido a que for man geles hidratados y porosos, las cadenas de glucosaminoglucanos ocupan la
La matriz extracelular de los animales
proteína globular (Pm 50 000)
O glucógeno (Pm ~ 400 000) espectrina (Pm 460 000) colágena (Pm 290 000)
/&OQQÂ
ácido hialurónico (Pm 8 x 10 )
I__________________ | 300 nm
Figura 19-34 Dimensiones y volúmenes relativos ocupados por varias macromoléculas. El esquema muestra varias proteínas, un gránulo de glucógeno, y una molécula hidratada de ácido hialurónico.
1043
disacárido repetido
ácido glucurónico
/V-acetilglucosamina
práctica totalidad del espacio extracelular, constituyendo un soporte mecánico para los tejidos y facilitando, al mismo tiempo, la difusión de moléculas hidrosolubles y la migración celular. La importancia de los GAG se ilustra en enferme dad genética humana poco habitual en la cual se produce una severa deficiencia de la síntesis de disacáridos del tipo de los dermatán sulfatos mostrados en la Fi gura 19-33. Los individuos afectados son enanos, presentan una apariencia de envejecim iento prematuro y tienen defectos generalizados en la piel, articula ciones, musculatura y huesos. Sin embargo hay que resaltar que en invertebrados y en vegetales a menudo existe otro tipo de polisacáridos que son los principales constituyentes de la estruc tura de la matriz extracelular. Así, en plantas superiores -com o veremos más ade lante- existen cadenas de celulosa (poliglucosa) que están densamente empaque tadas en formaciones cristalinas a modo de cintas, constituyendo el componente microfibrilar de la pared celular. En insectos, crustáceos y otros artrópodos, la qui tina (poli-iV-acetilglucosamina) constituye el principal componente del citoesqueleto. La celulosa y la quitina son los biopolímeros más abundantes de la tierra.
Parece que el ácido hialurónico facilita la migración celular durante la morfogénesis y la reparación de los tejidos19 El ácido hialurónico (también denominado hialuronato o hialuronano ) es el GAG de estructura molecular más sencilla. Consta de una secuencia repetida de hasta 25 000 unidades de disacáridos no sulfatados (Figura 19-35). Se encuentra en proporciones variables en todos los tejidos y fluidos de los animales adultos, siendo especialmente abundante en las fases embrionarias iniciales. Su simplici dad induce a considerarlo como una forma inicial en la evolución de los GAG, aunque su estructura no es la típica de la mayoría de los GAG. Todos los demás grupos ( 1) contienen azúcares sulfatados, (2) tienden a presentar ciertos disacá ridos diferentes dispuestos en secuencias más complejas, (3) presentan numero sas cadenas cortas, de menos de 300 residuos glucídicos, y (4) están unidos co valentemente a proteínas que forman proteoglucanos. Además, mientras que los otros GAG son sintetizados dentro de la célula y liberados por exocitosis, el ácido hialurónico es alargado desde la superficie celular mediante un complejo enzi màtico integrado en la mem brana plasmática. Se cree que el ácido hialurónico actúa ofreciendo resistencia a las fuerzas compresivas en los tejidos y articulaciones. También tiene una función impor tante durante el desarrollo embrionario como “rellenador” de espacio, pudiendo ser utilizado para forzar un cambio en la forma de una estructura. De manera se mejante a la espuma de estireno, el ácido hialurónico puede ser producido de forma rápida y barata: al hidratarse, una pequeña cantidad se expande y ocupa un gran volumen (véase Figura 19-34). Por ejemplo, el ácido hialurónico sinteti zado a partir de la cara basai de un epitelio en lámina a menudo se utiliza para crear un espacio libre de células dentro del cual las células pueden migrar; esto tiene lugar durante la formación del corazón, la córnea y algunos otros órganos.
1 044
Capítulo 19 : Adhesión celular, uniones celulares y matriz extracelular
Figura 19-35 Secuencia repetida de disacáridos en el ácido hialurónico, un GAG relativamente simple. Está constituido por una larga cadena de unos 25 000 residuos de azúcar. Obsérvese la ausencia de grupos sulfato.
Figura 19-36 Unión entre una cadena de GAG y su proteína central en una molécula de proteoglucano. En p rim e r lugar se establece un enlace específico entre un tetrasacárido y u n residuo de serina. En la m a y o ría de los casos no está claro cóm o se selecciona el residuo de serina, pero parece que es más im p o rta n te la con form ación local de la p ro te ín a que una d e te rm in a d a secuencia de am inoácidos. El resto de la cadena de
GAG, c on stituid a p rin c ip a lm e n te por la rep etició n de u n disacárido, se sintetiza a con tin u a c ió n , añadiéndose residuo a residuo. En los condroitín
sulfatos, el disacárido está com puesto p or ácido D-glucurónico y Af-acetil-D-
Cuando finaliza la migración celular, el exceso de ácido hialurónico es degradado mediante la enzima hialuronidasa. El ácido hialurónico se sintetiza también en grandes cantidades durante la cicatrización de las heridas, y también es un cons tituyente importante de los fluidos articulares, donde actúa como un lubrificante. Muchas de las funciones del ácido hialurónico dependen de proteínas y proteoglucanos que se unen a él específicamente, algunas de las cuales forman parte de la matriz extracelular mientras que otras son componentes integrales de la superficie celular. Se ha demostrado que algunas de estas moléculas (a ve ces relacionadas con las hialadherinas) presentan dominios homólogos de unión al ácido hialurónico que contienen un grupo característico de residuos de am i noácidos cargados positivamente.
galactosam ina; en los heparán sulfatos es D -glucosam ina (o ácido i.-idurónico) y A f-acetil-D-glucosam ina; en el queratán sulfato es D-galactosa y iV-acetil-D -glucosam ina.
Los proteoglucanos están compuestos por cadenas de GAG unidas covalentemente a una proteína central20 Exceptuando el ácido hialurónico, los demás GAG se encuentran unidos cova lentem ente a una proteína, constituyendo los proteoglucanos, los cuales son sintetizados por la mayoría de células animales. Como en el caso de casi todas las glucoproteínas, la cadena polipeptídica de los proteoglucanos o proteína cen tral (core protein) es sintetizada por ribosomas unidos a membrana, acumulán dose en el interior del retículo endoplasmático rugoso. La unión de las cadenas de polisacárido a la proteína central tiene lugar, fundamentalmente, en el com plejo de Golgi: inicialmente se une un tetrasacárido de unión específico a un res to de serina de la proteína central, el cual actúa como un cebador del crecim ien to de la cadena de polisacárido; posteriormente se añade, en un sólo paso, un residuo glucídico mediante glucosiltransferasas específicas (Figura 19-36). Mientras permanece en el complejo de Golgi, se modifican covalentemente sus residuos mediante una serie de reacciones de sulfatación que tienen lugar de manera secuencial y coordinada, así como mediante diversas reacciones de epimerización. La epimerización altera la configuración de los substituyentes alre dedor de determinados átomos de carbono de la molécula glucídica; la sulfata ción incrementa mucho la carga negativa de los proteoglucanos. En general, los proteoglucanos se diferencian fácilmente de otras glucopro teínas por la naturaleza, cantidad y organización de sus cadenas laterales de glúcidos: por definición, por lo menos una de las cadenas sencillas de azúcares de un proteoglucano ha de ser un GAG. Las glucoproteínas contienen entre un 1% y un 60% en peso de carbohidratos, formando numerosas cadenas de oligosacáridos relativamente cortas y ramificadas. Normalmente la proteína central de los pro teoglucanos es una glucoproteína, pero puede contener hasta un 95% en peso de carbohidratos, generalmente en forma de una larga cadena de GAG no ramificada, de unos 80 residuos glucídicos de media. Así pues, los proteoglucanos pueden ser
La matriz extracelular de los animales
1045
DECORINA
AGRECANO (Pm ~ 3 x 106)
RIBONUCLEASA (Pm ~ 15 000) cadena lateral de oligosacárido corta y ramificada
cadena polipeptídica
100 nm
mucho más largos que las glucoproteínas. Por ejemplo, el agrecano, componente principal del cartílago, tiene una masa de alrededor de 3 x 106 daltons; está com puesto por más de 100 cadenas de GAG, aproximadamente una por cada 20 resi duos de aminoácidos. Sin embargo, muchos proteoglucanos son mucho más pe queños, teniendo tan sólo de 1 a 10 cadenas de GAG; la decorina, por ejemplo, es secretada por los fibroblastos y tiene una sola cadena de GAG (Figura 19-37). En principio, los proteoglucanos tienen una heterogeneidad potencial casi ilimitada. La proteína central tiene un peso molecular que oscila entre los 10 000 y más de 600 000 daltons y tanto el número como el tipo de cadenas de GAG que se unen a ella es variable. Además el patrón repetitivo básico de los disacáridos en cada GAG puede ser modificado por un patrón complejo de grupos sulfato. La heterogeneidad de estos GAG dificulta la identificación y clasificación de los proteoglucanos en función de sus azúcares. Las secuencias de muchas proteínas centrales han sido determinadas m ediante técnicas de DNA recombinante, ob servándose que son extremadamente diversas. Aunque tan sólo han sido identi ficadas unas cuantas familias, existe una característica estructural poco común que distingue claram ente la proteína central del proteoglucano de otras proteí nas, y muchas de ellas tienen uno o más dominios que son homólogos a los en contrados en otras proteínas de la matriz extracelular o de la membrana plasmá tica. Así, es m ejor considerar a los proteoglucanos com o un grupo diverso de glucoproteínas altamente glucosiladas cuyas funciones dependen tanto por su proteína central com o por sus cadenas de GAG.
Las cadenas de proteoglucanos pueden regular las actividades de moléculas secretadas de señalización21 Dada la heterogeneidad estructural de los proteoglucanos, parece improbable que su función en la matriz extracelular se vea limitada a generar un espacio hi dratado alrededor y entre las células. Por ejemplo, sus cadenas de GAG pueden formar geles de poro y densidad de carga variables, que pueden actuar como cri ba selectiva para regular el tráfico de moléculas y de células en función de su ta maño, su carga o ambas cosas a la vez. Existen evidencias de que el proteoglucano del tipo heparán sulfato denominado perlecano tiene esta función en la lámina basal del glomérulo del riñón, la cual filtra las moléculas que pasan a la orina des de la corriente sanguínea (se discute más adelante). Se cree que los proteoglucanos participan fundamentalmente en la señaliza ción química entre las células. In vitro se unen a diversas moléculas señal tales como factores de crecimiento proteicos, lo cual ha permitido suponer que algo pa recido puede ocurrir en los tejidos. Tales uniones pueden aumentar o disminuir la actividad de estos factores. Por ejemplo, el factor de crecimiento fibroblástico (FGF, de Fibroblast Growth Factor), que estimula la proliferación de varios tipos celula res, se une a las cadenas de heparán sulfato de proteoglucanos tanto in vitro como en los propios tejidos. Para algunas células esta unión parece ser un paso obligado para que el FGF active su receptor de superficie celular (una tirosina quinasa transmembrana, estudiada en el Capítulo 15). En la mayoría de los casos las molé culas señal se unen a las cadenas de los GAG de los proteoglucanos, pero esto no
104 6
Capítulo 19: Adhesión celular, uniones celulares y matriz extracelular
Figura 19-37 Ejemplos de proteoglucanos pequeños (decorina) y grandes (agrecano) de la matriz extracelular. Se han comparado con una glucoproteína típica de secreción (la ribonucleasa B pancreática). Todos están dibujados a escala. La proteína central del agrecano y de la decorina tiene cadenas de oligosacáridos y cadenas de GAG, pero no se representan en la figura. El agrecano está constituido típicamente por unas 100 cadenas de condrointín sulfato y unas 30 cadenas de queratán sulfato unidas a una proteína central rica en serina de aproximadamente 3000 aminoácidos. La decorina “decora” la superficie de las fibrillas de colágena, de ahí su nombre.
siempre sucede así: la ubicua proteína reguladora del crecimiento, el factor de cre cimiento transformante (3 (TGF-(3 de Transforming Growth Factor), se une a la pro teína central de varios proteoglucanos de la matriz, incluyendo la decorina; esta unión a la decorina inhibe la actividad del TGF-(3. Los proteoglucanos también se unen y regulan las actividades de otros tipos de proteínas de secreción, tales como enzimas proteolíticas (proteasas) e inhibi dores de las proteasas. La unión a un proteoglucano podría controlar la actividad de una proteína de alguna de las siguientes maneras: ( 1) podría inmovilizar la proteína cerca del lugar donde ésta se produce, restringiendo así el alcance de su acción; (2) podría bloquear estéricamente la actividad de la proteína; (3) podría proporcionar una reserva de proteína para su liberación posterior; (4) podría pro teger a las proteínas de degradaciones proteolíticas, prolongando de este modo su acción, y (5) podría alterar o concentrar la proteína para hacer más efectiva su exposición a los receptores de superficie celular. Se cree que los proteoglucanos actúan de todas estas maneras colaborando en la regulación de las actividades de las proteínas de secreción.
Las cadenas de GAG pueden estar altamente organizadas en la matriz extracelular20,22 Los GAG y los proteoglucanos se asocian formando enormes complejos poliméricos en la matriz extracelular. Por ejemplo, las moléculas de agrecano, el princi pal proteoglucano del cartílago, que se muestra en la Figura 19-37, se unen con el ácido hialurónico en el espacio extracelular formando agregados que son tan grandes como una bacteria (Figura 19-38). Además de asociarse el uno con el otro, los GAG y los proteoglucanos se aso cian con proteínas fibrosas de la matriz tales como la colágena, y con redes pro teicas tales como la lámina basal, creando estructuras extremadamente com ple jas. La organización de las moléculas de proteoglucanos en tejidos vivos es muy difícil de determinar. Debido a que son muy solubles en agua, pueden ser elim i nadas de la matriz extracelular cuando las secciones de los tejidos se exponen a soluciones acuosas durante la fijación; así mismo, cambios de pH, condiciones
— 1 (jm —
Figura 19-38 Agregado de agrecanos en el cartílago fetal bovino. (A) Electronmicrografía de un agregado de agrecanos sombreado con platino. Pueden observarse también muchas moléculas libres. (B) Dibujo esquemático del agregado de agrecanos gigante mostrado en (A). Está constituido por unos 100 monómeros de agrecano (cada uno de los cuales es como el mostrado en la Figura 19-37) unidos de forma no covalente a una cadena sencilla de ácido hialurónico a través de dos proteínas de unión, que a su vez se unen tanto a la proteína central del proteoglucano como a la cadena de ácido hialurónico, estabilizando así el agregado; las proteínas de unión son miembros de la familia de las hialadherinas de proteínas de unión al hialurónico, explicadas anteriormente. El peso molecular de un complejo como éste es de 108o más y ocupa un volumen equivalente al de una bacteria, que es aproximadamente 2 x 10 12cm3. (A, cortesía de Lawrence Rosenberg.)
agregados de agrecanos
proteína central
proteínas de unión
molécula de acido hialuromco
queratán sulfato
La matriz extracelular de los animales
condroitín sulfato
1047
Figura 19-39 Electronmicrografía en la que se observan proteoglucanos de la matriz extracelular de un cartílago de rata. El tejido fue congelado
fibrilla de colágena > •• ^ ,:?■■*
.x !T v ;¿ ;
X*' :f.
^
| | : v
f e
c
K
.. • '
r
;-
,•
" ....
0,5 pm
iónicas u osmóticas, pueden alterar drásticamente su conformación. Así pues, para poderlas visualizar in vivo se han tenido que utilizar métodos especiales (Figura 19-39).
Los proteoglucanos de superficie celular actúan como correceptores No todos los proteoglucanos son com ponentes secretados de la matriz extrace lular. Algunos de ellos, tales com o la serglicina, son constituyentes de los gránulos de secreción, donde intervienen en el empaquetamiento y acumulación de moléculas de secreción. Otros son com ponentes integrales de las membranas plasmáticas y tienen su proteína central insertada a través de la bicapa lipídica, o unida a ésta mediante un anclaje de glucosilfosfatidilinositol (GPI, de glycosylphosphatidylinositol). Entre los proteoglucanos m ejor caracterizados de membrana plasmática se encuentran los sindecanos, los cuales poseen una proteína central que atraviesa la membrana. El dominio extracelular de este proteoglucano transmembrana tiene un número variable de cadenas GAG de condroitín sulfato y heparán sulfa to, mientras que su dominio intracelular se cree que interactúa con la actina del citoesqueleto en el córtex celular. Los sindecanos se encuentran en la superficie de muchos tipos celulares, incluyendo los fibroblastos y las células epiteliales, donde actúan junto con las integrinas como receptores para la colágena, la fibronectina, y otras proteínas de la matriz a las cuales se unen. Como ya hemos mencionado anteriormente, los sindecanos también se unen al factor de creci miento del fibroblasto (FGF) presentándolo a proteínas receptoras de FGF de la misma célula. De un modo parecido, otro proteoglucano de membrana plasmá tica, denominado betaglicano, se une al factor de crecimiento transformante (3 (TGF-P) presentándolo a sus receptores específicos. Así pues, los proteoglucanos de membrana plasmática actúan como corre ceptores que colaboran con proteínas receptoras de superficie celular conven cionales, tanto en la unión celular a la matriz extracelular como iniciando la res puesta de las células a algunos factores de crecimiento. Los proteoglucanos descritos en este capítulo están resumidos en la Tabla 19-3.
Las colágenas son las proteínas más abundantes de la matriz extracelular23 Las colágenas constituyen una gran familia de proteínas fibrosas que se encuen tran en todos los animales pluricelulares. Son secretadas por las células del teji do conjuntivo y por otros tipos celulares. Son los componentes más abundantes de la piel y de los huesos, por lo que son las proteínas más abundantes en mamí feros, constituyendo el 25% de la masa total de proteína en estos animales. El
1048
Capítulo 19: Adhesión celular, uniones celulares y matriz extracelular
rápidamente a -196°C y fijado y contrastado en estas condiciones (método denominado de con gelación substitución), evitando así el colapso de las cadenas de GAG. Las moléculas de proteoglucanos pueden observarse como una fina red filamentosa que contiene una fibrilla de colágena. Las regiones más contrastadas corresponden a las proteínas centrales, mientras que las que muestran una menor intensidad corresponden a las cadenas de glucosaminoglucanos. (Reproducido de E.B. Hunziker y R.K. Schenk, /. C ellB iol. 98: 277-282, 1984, con permiso de copyright de The Rockefeller University Press.)
Tabla 19-3 Algunos proteoglucanos comunes
Proteoglucano
Peso molecular aproximado de la proteína central
Agrecano
210 000
Tipo de cadenas GAG
Número de cadenas GAG Localización
condroitín sulfato + keratán sulfato condroitín sulfato/ dermatán sulfato condroitín sulfato/ dermatán sulfato
-130
heparán sulfato
2-15
1
Betaglicano
36 000
Decorina
40 000
Perlecano
600 000
Serglicina
20 000
condroitín sulfato/ dermatán sulfato
10-15
Sindecano 1
32 000
condroitín sulfato + heparán sulfato
1-3
1
cartílago superficie celular y matriz amplia distribución en tejidos conjuntivos lámina basal vesículas de secreción en glóbulos blancos superficie de fibroblastos y de células epiteliales
rasgo más característico de las moléculas de colágena es su longitud, rigidez y estructura helicoidal de tres hebras, en la cual tres cadenas polipeptídicas de co lágena, denominadas cadenas a, se enrollan sobre sí mismas formando una superhélice sem ejante a un rodillo. Las colágenas son muy ricas en prolina y glici na, las cuales son importantes en la formación de la hélice de tres hebras. Debido a su anillo, la prolina estabiliza la conformación helicoidal en cada una de las cadenas a, mientras que la glicina se encuentra espaciada regularmente, cada tres residuos de aminoácido, a lo largo de la región central de las cadenas a. Al ser el aminoácido más pequeño (sólo tiene un átomo de hidrógeno como cadena lateral), la glicina favorece el denso empaquetamiento de las tres cade nas helicoidales a formando la superhélice de colágena (Figura 19-40). Hasta el momento, se han identificado alrededor de unas 25 cadenas a dis tintas de colágena, cada una de las cuales está codificada por un gen diferente. En los diferentes tejidos se expresan diversas combinaciones de estos genes. Aunque, en principio, se pueden formar más de 10 000 tipos de moléculas de co lágena de triple hélice a partir de las aproximadamente 25 cadenas a, sólo se han identificado 15 tipos de moléculas de colágena. Los principales tipos de coláge na encontrados en el tejido conjuntivo son los tipos I, II, III, V y XI, siendo el tipo I el principal de la piel y huesos, y con diferencia el más abundante. Constituyen las colágenas fibrilares y presentan una estructura fibrosa que hemos descrito
Figura 19-40 Estructura típica de una molécula de colágena. (A) Modelo de una región de una cadena a de colágena en la que cada aminoácido está representado por una esfera. La cadena contiene alrededor de 1000 residuos de aminoácido, estando estructurada como una hélice levógira de tres residuos de aminoácido por vuelta, de los que el tercero es una glicina. Por lo tanto cada cadena a está constituida por secuencias Gly-X-Y, donde X e Y pueden ser cualquier aminoácido (aunque habitualmente X es una prolina e Y una hidroxiprolina). (B) Modelo de una zona de la molécula de colágena en la que las tres cadenas a, cada una de ellas representada en un color distinto, están enrolladas entre sí dando lugar a una triple hélice. La glicina es el único aminoácido pequeño que puede ocupar el eje de la triple hélice. Sólo se muestra una pequeña región de la molécula; la molécula entera tiene unos 300 nm de longitud. (Esquema realizado a partir del modelo propuesto por B.L. Trus.)
La matriz extracelular de los animales
Funciones soporte mecánico; forma grandes agregados con el ácido hialurónico se uneaTGF-P se une a fibrillas de colágena de tipo I y aTGF-P estructural y filtrante en la lámina basal ayuda al empaquetamiento y almacenamiento de moléculas de secreción adhesión celular; se une a FGF
glicina
fie.
1,5 nm
1049
Figura 19-41 Electronmicrografía de fibroblastos rodeados por fibrillas de colágena en el tejido conjuntivo de la piel de un embrión de pollo. Las fibrillas, organizadas en haces orientados perpendicularmente, son sintetizadas por los fibroblastos. Estas células contienen un retículo endoplasmático abundante donde se sintetizan proteínas de secreción tales como la colágena. (De C. Ploetz, E.I. Zycband, and D.E. Birk, /. Struct. Biol. 106:73-81,1991.)
com o la molécula típica de colágena. Una vez secretados al espacio extracelular, estos tipos moleculares se organizan en unos polímeros ordenados denomina dos fibrillas de colágena, delgados (entre 10 y 300 nm de diámetro), de varios cientos de m icrómetros de longitud en tejidos maduros, y bien visibles al m i croscopio electrónico (Figura 19-41 y véase Figura 19-39). Las fibrillas de coláge na se agregan habitualm ente formando haces, las cuales pueden observarse al microscopio electrónico com o fibras de colágena de varios micrómetros de diá metro. Los tipos IX y XII son las denominadas colágenas asociadas a fibrillas, ya que decoran la superficie de las fibrillas de colágena; se cree que unen a las fibri llas entre sí y a otros com ponentes de la matriz extracelular. Los tipos IV y VII son las colágenas form adoras de redes: las moléculas de tipo IV se unen en una especie de lámina o red que constituye la mayor parte de la lámina basal madu ra, m ientras que las moléculas del tipo VII forman dímeros que se ensamblan formando estructuras especializadas denominadas fibras de anclaje, las cuales ayudan a unir la lámina basal del epitelio pluriestratificado al tejido conjuntivo subyacente y por esta razón son especialmente abundantes en la piel. Los tipos de colágena descritos se sistematizan en la Tabla 19-4.
Tabla 19-4 Algunos tipos de colágena y sus propiedades
FORMADORAS DE FIBRILLAS (FIBRILARES)
ASOCIADAS A FIBRILLAS
FORMADORAS DE REDES
Tipo
Fórmula molecular
Fórmula polimerizada
I
[alfl)] 2o2(I)
fibrilla
hueso, piel, tendón, ligamentos, córnea, órganos internos (supone el 90% de la colágena del cuerpo)
II
[
fibrilla
cartílago, disco intervertebral, notocorda, humor vitreo del ojo
Distribución en tejidos
III
[cxl (III)]3
fibrilla
piel, vasos sanguíneos, órganos internos
V
[al(V)] 2ot2 (V)
fibrilla (con tipo I)
como para el tipo I
XI
al(XI)cx2(XI)a3(XI)
fibrilla (con tipo II)
como para el tipo II
IX
a 1(IX) a2 (IX) a3 (IX)
asociación lateral
cartílago
XII
[al (XII)]3 con algunas fibrillas de tipo I
asociación lateral
tendón, ligamentos, algunos otros tejidos
IV
[al(IV)]2a2(IV)
red laminar
lámina basal
VII
[al(VH)]3
fibrillas de anclaje
epitelio escamoso estratificado inferior
Nótese que los tipos I, IV, V y XI están compuestos de 2 o 3 tipos de cadenas a, mientras que los tipos II, III, VII y XII están compuestos única mente de un solo tipo de cadena a cada uno. Solamente se muestran 9 tipos de colágenas, pero hasta ahora se han definido unos 15 tipos de colágena y unos 25 tipos de cadenas a.
105 0
Capítulo 19 : Adhesión celular, uniones celulares y matriz extracelular
La mayoría de las proteínas que contienen un patrón repetitivo de am ino ácidos han evolucionado por duplicaciones de secuencias de DNA. Las colágenas fibrilares se originan, aparentemente, de esta manera. Los genes que codifican las cadenas a de la mayoría de estas colágenas son muy largos (por encim a de las 44 kilobases de longitud) y contienen unos 50 exones. La mayoría de los exones tienen 54 nucleótidos, o múltiplos de 54, lo cual sugiere que estas colágenas se originan por duplicaciones múltiples de un gen inicial que contenía 54 nu cleótidos y que codificaba exactamente repeticiones de seis Gly-X-Y (véase Figu ra 19-40).
Los m oléculas de colágena son secretadas con unas extensiones no helicoidales en cada una de las regiones term inales23,24 Cada una de las cadenas polipeptídicas de colágena es sintetizada por los ribosomas unidos a membrana e incorporada a la luz del retículo endoplasmático (ER) como grandes precursores, denominados procadenas a. Estos precursores no sólo poseen en la región amino terminal el péptido señal necesario para transportar el polipéptido naciente a través de la membrana del ER, sino que también presentan otros aminoácidos suplementarios, denominados propéptidos, situados en las regiones amino y carboxilo terminales. En la luz del ER deter minados residuos de prolina y lisina son hidroxilados para formar hidroxiprolina e hidroxilisina respectivamente, y algunos de los residuos de hidroxilisina son glucosilados. A continuación cada procadena a se combina con otras dos m e diante enlaces de hidrógeno, formando la molécula helicoidal de triple hebra, denominada procolágena. Las formas secretadas de colágenas fibrilares (pero no los otros tipos de colágena), son convertidas en el espacio extracelular en molé culas de colágena mediante la liberación de los propéptidos (véase Figura 19-43). Los residuos de hidroxilisina e hidroxiprolina (Figura 19-42) raramente se encuentran en otras proteínas, aunque la hidroxiprolina es abundante en algu nas proteínas que se encuentran en la pared celular de vegetales. Parece que en la colágena los grupos hidroxilo de estos aminoácidos forman enlaces de hidró geno entre las cadenas colaborando en la estabilización de la hélice de triple he bra. Así por ejemplo, las condiciones que inhiben la hidroxilación de la prolina, tal como una deficiencia de ácido ascòrbico (vitamina C), tienen graves conse cuencias. En el escorbuto, una enfermedad causada por una deficiencia de vita mina C en la dieta que era frecuente en marineros hasta el siglo pasado, las pro cadenas a defectuosas no pueden formar la triple hélice, siendo degradadas dentro de la célula. En consecuencia, debido a la pérdida progresiva del coláge na normal preexistente en la matriz, los vasos sanguíneos adquieren una extre mada fragilidad y los dientes van perdiendo su fijación. Ello implica que en estos tejidos la degradación y renovación de la colágena son relativamente rápidas. Sin embargo, en muchos otros tejidos adultos, se cree que el recambio de la co lágena (así como el de otras macromoléculas de la matriz extracelular) es muy lento: en el tejido óseo, por poner un caso extremo, las moléculas de colágena pueden persistir hasta 10 años antes de que sean degradadas y reemplazadas. Por el contrario, la mayoría de las proteínas celulares tienen vidas medias del or den de horas o días.
H
O
I
II
N— C — C— H
CH
2
ch
2
H — C — OH CH NH
Después de su secreción, las moléculas fibrilares de procolágena son degradadas hasta moléculas de colágena, las cuales se organizan en fibrillas23,24,25 Después de su secreción, los propéptidos de las moléculas de procolágena fibrilar son degradados mediante enzimas proteolíticas específicas en el exterior ce lular. Ello convierte las moléculas de procolágena en moléculas de colágena, las cuales se asocian en el espacio extracelular formando fibrillas de colágena mu cho mayores. Los propéptidos presentan, como mínimo, dos funciones: (1) diri gen la formación intracelular de la triple hebra de las moléculas de colágena; y
La matriz extracelular de los animales
2
®
h id r o x i ü s í n a
en una proteína
O C — N-
/ CH
2
\
/
CHn
CH
OH
h id ro xip ro lin a
en una proteína
Figura 19-42 Residuos de hidroxilisina e hidroxiprolina. Estos aminoácidos modificados son abundantes en la colágena; son sintetizados por enzimas que actúan después de que la lisina y la prolina se hayan incorporado a las moléculas de procolágena.
1051
1. SÍNTESIS DE LA PROCADENA a ..
2. HIDROXILACIÓN DE DETERMINADOS ■ RESIDUOS DE ^ PROLINA Y > LISINA H2N 3. G LUCOS ILACIÓN DE / DETERMINADOS RESIDUOS / DE HIDROXILISINA ' Q COOH H2N propéptido 4. AUTOENSAMBLAJE DE LAS TRES CADENAS PRO a
fibra de colágena 0,5-3 |jm
3 procadenas a 9. AGREGACION DE LAS FIBRILLAS DE COLÁGENA DANDO LUGAR A UNA FIBRA
5. FORMACIÓN DE LA TRIPLE HÉLICE DE PROCOLÁGENA
vesícula de secreccion 'OH OH OH 6. SECRECIÓN
OH ^OHOHOH m olécula de procolágena
com partim iento ER/Golg¡
m em brana plasm atica
10-300 7. ESCISIÓN DE LOS ¿H ^OHOHOH " 8. AUTOENSAMBLAJE nm PROPÉPTIDOS m olécula DE LA FIBRILLA J de colágena
(2) debido a que sólo son eliminados después de su secreción, previenen la for m ación intracelular de las grandes fibrillas de colágena, lo cual sería catastrófico para la célula. El proceso de formación de fibrillas está dirigido en parte por la tendencia que presentan las moléculas de colágena a autoensamblarse, ya que son más de 1000 veces m enos solubles que las moléculas de procolágena. Las fi brillas empiezan a formarse cerca de la superficie celular, a menudo en invagi naciones de la m em brana plasmática formadas por la fusión en tándem de vesí culas secretoras con la superficie celular. Por lo tanto, el citoesqueleto de las regiones más externas puede influir en los lugares, velocidades y orientación del ensam blaje fibrilar. En la Figura 19-43 se resumen los diversos pasos de la síntesis y ensamblaje de las fibrillas de colágena. Dado el gran número de pasos enzimáticos implica dos en la formación de la fibrilla de colágena, no es sorprendente que hayan mu chas enfermedades genéticas que afecten la formación de la fibrilla. Mutaciones que afectan a la colágena ele tipo I causan la osteogénesis imperfecta, caracteriza da por una debilidad ósea que fácilmente conduce a su fractura. Las mutaciones que afectan a la colágena de tipo II causan condrodisplasias , que se caracteriza das por un cartílago anormal que conduce a deformidades en huesos y articula ciones. Las mutaciones que afectan a la colágena de tipo III causan el síndrome de Ehlers-Danlos, que se caracteriza por la fragilidad en la piel y vasos sanguíne os y por articulaciones hipermóviles. Al microscopio electrónico, las fibrillas de colágena presentan estrías trans versales características cada 67 nm, que reflejan el empaquetamiento escalona do y periódico de moléculas de colágena individuales en la fibrilla (Figura 1944). Después de formarse en el espacio extracelular, las fibrillas se refuerzan mediante la formación de enlaces covalentes cruzados entre residuos de lisina de las moléculas de colágena constituyentes (Figura 19-45). Los tipos de enlaces
105 2
Capítulo 19: Adhesión celular, uniones celulares y matriz extracelular
fib rilla de colágena
Figura 19-43 Procesos intra y extracelulares implicados en la formación de una fibrilla de colágena. Obsérvese que las fibrillas de colágena se ensamblan en el espacio extracelular contenido en una gran invaginación de la membrana plasmática. Se muestra el posterior ensamblaje en grandes fibras de colágena, las cuales son visualizadas en el microscopio óptico, a modo de ejemplo de cómo las fibrillas de colágena pueden formar estructuras ordenadas en el espacio extracelular. No se muestran los puentes cruzados que estabilizan los agregados extracelulares.
contrastado débil de una región sin espacios
espacio entre m oléculas de colágena
m olécula de colágena contrastado por metal pesado entre m oléculas
Figura 19-44 El solapamiento de las moléculas de colágena da lugar al patrón estriado observado en fibrillas contrastadas negativamente. (A) Debido a que el agente contrastante sólo ocupa los espacios existentes entre las moléculas, éstos se observarán com o bandas oscuras. En la parte inferior de la figura se muestra una electronmicrografía de una fibrilla contrastada negativamente (B). El solapamiento de las moléculas de colágena potencia la fuerza de tensión del agregado. (B, cortesía de Robert Home.)
covalentes implicados sólo se han encontrado en el colágena y la elastina. Si las uniones cruzadas se inhiben, la fuerza de tensión de las fibrillas disminuye drás ticamente; los tejidos de colágena se vuelven frágiles, y estructuras tales como la piel, los tendones y los vasos sanguíneos tienden a desgarrarse. La extensión y el tipo de uniones cruzadas varía de un tejido a otro: por ejemplo, la colágena tiene muchas uniones cruzadas en el tendón de Aquiles, donde la fuerza tensora es crucial.
Las colágenas asociadas a fibrillas organizan estas fibrillas26 A diferencia de los GAG, los cuales resisten fuerzas de compresión, las fibrillas de colágena forman estructuras que resisten fuerzas de tracción. Las fibrillas pue den presentar un diámetro muy variable y están organizadas de distintas m ane ras en los diferentes tejidos. Por ejemplo, en la piel de los mamíferos están orga nizadas espacialmente a modo de un cesto de mimbre, lo que permite la oposición a las tracciones ejercidas desde múltiples direcciones. En los tendones están organizadas en haces paralelos alineados a lo largo del eje principal de tensión. Por último, en el tejido óseo adulto y en la córnea se disponen en lámi nas delgadas y superpuestas, de forma que las fibrillas de cada lámina discurren paralelamente una a otra, pero forman un ángulo recto con las de las capas ad yacentes. Esta misma organización se observa en la piel del renacuajo, la cual sirve como ejemplo de este tipo de disposición (Figura 19-46).
enlaces intram oleculares
enlaces interm oleculares
La matriz extracelular de los animales
Figura 19-45 Enlaces covalentes intra
e intermoleculares en las fibrillas de colágena formados entre cadenas laterales de lisina modificadas. Los enlaces se forman siguiendo una serie de pasos. En primer lugar, algunos residuos de lisina y de hidroxilisina son desaminados por la enzima extracelular lisil oxidasa, que da lugar a grupos aldehido altamente reactivos. Estos grupos reaccionan espontáneamente formando enlaces covalentes entre sí o con otros residuos de lisina o hidroxilisina. La mayoría de los puentes se forman entre los cortos segmentos no helicoidales de los extremos de la molécula de colágena.
1053
Las propias células del tejido conjuntivo determinan el tamaño y la organi zación de las fibrillas de colágena. Las células pueden expresar uno o más de los genes que codifican los diferentes tipos moleculares de procolágena fibrilar. Pero incluso fibrillas compuestas por una misma mezcla de moléculas de colá gena fibrilar presentan diferentes organizaciones en tejidos diferentes. ¿Cómo se consigue? Parte de la respuesta radica en que las células pueden regular la dis posición de las moléculas de colágena después de su secreción mediante la for m ación de fibrillas de colágena directoras que están en íntima relación con la m em brana plasm ática (véase Figura 19-43). Además, como la organización es pacial de las fibrillas de colágena refleja, al menos en parte, sus interacciones con otras moléculas de la matriz, las células pueden influir en esta organización secretando, junto con las colágenas fibrilares, diferentes tipos y cantidades de otras m acrom oléculas de la matriz. Se cree que las colágenas asociadas a fib ri llas, tales com o las moléculas de colágena de los tipos IX y XII, son especial m ente im portantes en este sentido. Difieren de las colágenas fibrilares en varios aspectos. (1) Su estructura helicoidal de triple hebra está interrumpida por uno o dos cortos dominios no helicoidales, los cuales hacen que las moléculas sean más flexibles que las moléculas de colágena fibrilares. (2) No son fragmentadas después de la secreción, reteniendo así sus propéptidos. (3) No se agregan entre sí formando fibrillas en el espacio extracelular, sino que se unen de forma pe riódica a la superficie de fibrillas formadas por colágenas fibrilares: las m olécu las del tipo IX se unen a fibrillas de colágena del tipo II en el cartílago, la córnea y el vitreo del ojo (Figura 19-47), mientras que las moléculas del tipo XII se unen a fibrillas que contienen colágena del tipo I en tendones y otros tejidos. Se cree que las colágenas asociados a fibrillas median las interacciones de fibrillas de colágena entre sí y con otras macromoléculas de la matriz. De esta forma inter vienen parcialmente en la organización de las fibrillas en la matriz.
Las células participan de la organización de las fibras de colágena que secretan ejerciendo tensiones m ecánicas sobre la m atriz27 Existe otra vía m ediante la cual las células secretoras de colágena pueden deter minar la organización espacial de la matriz que producen. Los fibroblastos actú an sobre la colágena que han secretado, ejerciendo tracciones y desplazándose sobre ellas -colaborando en su com pactación en láminas y en la formación de fi bras. Este papel m ecánico que asumen los fibroblastos en la conformación de las matrices de colágena se ha demostrado, de forma patente, en los cultivos ce-
m olécula de colágena de tip o IX (A)
1054
5 nm Figura 19-46 Electronmicrografía correspondiente a una sección transversal de piel de renacuajo. Obsérvese el ordenamiento multilaminar de las fibrillas de colágena, en el que las sucesivas capas de fibrillas están orientadas en ángulos rectos. Dicho ordenamiento se encuentra también en el hueso maduro y en la córnea. (Cortesía de Jerome Gross.)
(O
fib rilla de colágena de tipo II
Figura 19-47 Colágena del tipo IX. (A) Dibujo esquemático de la unión de moléculas de colágena de tipo IX unidas, siguiendo un patrón periódico, a la superficie de una fibrilla conteniendo colágena de tipo II. (B) Electronmicrografía obtenida mediante sombreado por rotación de una fibrilla que contiene colágena de tipo II recubierta por moléculas de colágena de tipo IX obtenidas de cartílago; (C) molécula individual de colágena de tipo IX. (B y C, de L. Vaughan et al.,/. C ellB iol. 106:991-997, 1988, reproducido con permiso de copyright por The Rockefeller University Press.)
Capítulo 19: Adhesión celular, uniones celulares y matriz extracelular
Figura 19-48 Formación de la matriz extracelular por las células. Micrografía de la región situada entre dos fragmentos del corazón embrionario de pollo (rico tanto en fibroblastos como en fibras musculares) que han crecido en cultivo sobre un gel de colágena durante cuatro días. Entre los explantes se ha formado una densa lámina de fibras alineadas de colágena, probablemente como resultado de la fuerza de tracción ejercida por los fibroblastos sobre la colágena. (De D. StopackyA.K. Harris, Dev. Biol. 90:383-398,1982.)
hilares. Cuando los fibroblastos son cultivados en una placa en la que existe una matriz gelificada de fibrillas de colágena distribuidas totalmente al azar, las célu las tiran de la matriz, ejerciendo tracción sobre la colágena situado a su alrede dor, lo cual hace que el gel se contraiga hasta alcanzar un volumen que es una pequeña fracción de su volumen inicial; mediante estrategias similares, un gru po de fibroblastos puede rodearse de una cápsula de fibras de colágena, densa mente empaquetadas y orientadas siguiendo una circunferencia. Cuando dos pequeños fragmentos de tejido embrionario que contienen fi broblastos se colocan separados sobre un gel de colágena, la colágena tiende a organizarse formando una estrecha banda de fibras alineadas que conectan am bos explantes (Figura 19-48). Posteriormente, los fibroblastos migran a partir de dichos explantes siguiendo estas fibras de colágena. En consecuencia, los fibro blastos ejercen una influencia sobre la alineación de las fibras de colágena y, recí procamente, éstas afectan la distribución de los fibroblastos. Probablemente los fibroblastos juegan un papel similar a éste en la generación de un ordenamiento, de largo alcance, sobre la matriz extracelular del organismo -p or ejemplo, facili tando la formación de tendones y ligamentos, o también las densas y resistentes láminas de tejido conjuntivo que encapsulan y unen la mayoría de órganos.
La elastina confiere a los tejidos su elasticidad28 Muchos tejidos de vertebrados, como la piel, los vasos sanguíneos y los pulmo nes, han de ser elásticos y resistentes a la tensión para ser funcionales. Una red de fibras elásticas en la matriz extracelular de estos tejidos les confiere la capa cidad de recobrar su conformación inicial después de una deformación transito ria. Las fibras elásticas son por lo menos cinco veces más extensibles que una banda de goma con la m isma área de sección transversal. Intercaladas con las fi bras elásticas, se encuentran largas fibras de colágena, inelásticas, que limitan la capacidad de extensión, evitando el desgarro tisular. El componente principal de las fibras elásticas es la elastina, una proteína muy hidrofóbica, de unos 750 residuos de aminoácidos de longitud, y que, como la colágena, es extraordinariamente rica en prolina y glicina, pero a diferencia de ella no está glucosilada y presenta un bajo contenido en hidroxiprolina y carece de hidroxilisina. Las moléculas de elastina son secretadas al espacio extracelular y se ensam blan formando fibras elásticas próximas a la membrana plasmática, generalmente en zonas invaginadas de la superficie celular. Después de la secre ción, las moléculas de elastina forman numerosos puentes cruzados, dando lu
La matriz extracelular de los animales
1055
Figura 19-49 Red de ñbras elásticas. Electronmicrografías a bajo aumento que muestran un segmento de la aorta de perro (A), y a mayor aumento, la densa red de fibras elásticas orientadas en otra capa del mismo vaso sanguíneo (B). El resto de com ponentes han sido digeridos por medio de enzimas y ácido fórmico. (De K.S. Haas, S.J. Phillips, A.J. Comerota, y J.W. White, Anat. Rec. 230:86-96, 1991.)
(A)
1 mm
gar a una extensa red de filamentos y láminas (Figura 19-49). Dichos puentes se forman entre residuos de lisina, mediante el mismo mecanismo que por el que se forman en las moléculas de colágena. La elastina está constituida en su mayor parte por dos tipos de segmentos cortos que se alternan a lo largo de la cadena polipeptídica -segm entos hidrofóbicos que son los responsables de las propiedades elásticas de la molécula, y segmentos de hélice a ricos en alanina y lisina que forman puente cruzados en tre moléculas adyacentes. Cada segmento está codificado por un exón diferente. Sin embargo todavía se discute la conformación de las moléculas de elastina en las fibras elásticas y cómo la estructura de estas fibras justifica sus propiedades elásticas. Desde un punto de vista, la cadena polipeptídica de elastina, como las cadenas poliméricas en una goma corriente, adoptan una conformación de “es piral al azar”, y es esta estructura la que permite a la red estirarse y contraerse como una banda elástica (Figura 19-50). Las fibras elásticas no sólo están compuestas por elastina. El núcleo de la elastina está cubierto por una envoltura de microfibrillas, cada una de las cuales tiene un diámetro de unos 10 nm. Las fibras elásticas siempre contienen microfibrillas, pero las microfibrillas también pueden encontrarse en matrices extracelulares que no contienen elastina. Las microfibrillas están constituidas por varias glucoproteínas distintas, incluyendo la glucoproteína fibrilina, que parece jugar un papel esencial en el mantenimiento de la integridad de las fibras elásticas. Al-
fibra elástica
EXTENSION
RELAJACION m olécula de elastina
105 6
Capítulo 19 : Adhesión celular, uniones celulares y matriz extracelular
Figura 19-50 Estiramiento de una red de moléculas de elastina. Las moléculas de elastina están unidas entre sí mediante enlaces covalentes (indicados en rojo) dando lugar a una red entrecruzada. El modelo muestra cómo cada molécula de elastina puede expandirse y contraerse como una espiral al azar, de modo que el conjunto de la red también puede hacerlo, como una goma elástica.
gunas mutaciones del gen de la fibrilina dan lugar al síndrome de Marfan, una en fermedad genética humana relativamente común que afecta a los tejidos conjun tivos ricos en fibras elásticas; en los individuos afectados de forma más severa, la aorta (cuyas paredes son ricas en elastina -véase Figura 19-49) es propensa al desgarro. Se cree que las microfibrillas juegan un importante papel en el ensam blaje de las fibras elásticas. Aparecen antes que la elastina durante el desarrollo de los tejidos y parece que constituyen un andamio sobre el cual son depositadas las moléculas de elastina secretadas. Cuando la elastina es depositada, las microfibrillas empiezan a desplazarse hacia la periferia de la fibra en crecimiento.
La fibronectina es una proteína extracelular adhesiva que contribuye a la adhesión de la célula a la matriz29 La matriz extracelular contiene varias proteínas adhesivas diferentes de la colá gena que típicamente presentan varios dominios, cada uno de los cuales tiene lugares de unión específicos para otras macromoléculas de la matriz y para re ceptores de la superficie celular. De esta forma estas proteínas facilitan tanto la organización de la matriz como el anclaje de las células a la matriz. La primera de ellas en ser bien caracterizada fue la fibronectina, una voluminosa glucoproteína presente en todos los vertebrados. La fibronectina es un dímero com pues to por dos subunidades muy largas unidas mediante un par de enlaces disulfuro situados cerca del extremo carboxilo terminal. Cada subunidad está plegada en una serie de dominios semejantes a un rodillo, funcionalmente distintos, sepa rados por regiones flexibles de la cadena polipeptídica (Figura 19-51A y B). A su vez, estos dominios están compuestos por unos módulos más pequeños, cada uno de los cuales se repite en serie, y está codificado por un exón independiente, lo que sugiere que el gen de la fibronectina, como los genes de la colágena, se producen por duplicaciones múltiples de exones. El principal tipo de módulo, denominado repetición de fibronectina tipo III, tiene unos 90 residuos de ami noácido de longitud y se repite al menos 15 veces en cada subunidad (Figura 1951C). Esto también se ha encontrado en otras proteínas de matriz, así como en algunas proteínas plasmáticas y citoplasmáticas. Una manera de analizar una proteína compleja multifuncional como la fi bronectina es cortar la molécula en sus diferentes dominios y determinar su fun ción. Para ello, la proteína fue tratada con bajas concentraciones de una enzima proteolítica, que corta la cadena polipeptídica en las regiones de conexión entre
'ív<
4-
♦Va-
Figura 19-51 Estructura de un dímero de fibronectina. Como se muestra esquemáticamente en (A), las dos cadenas polipeptídicas son similares pero no idénticas (están sintetizadas por el mismo gen pero son el resultado de una maduración diferencial de mRNA), y están unidas por puentes disulfuro cerca del extremo carboxilo. Cada cadena tiene por lo menos 2500 residuos de aminoácido y está plegada en cinco o seis dominios en forma de varilla conectados mediante segmentos polipeptídicos flexibles. Cada dominio se especializa en la unión a una molécula determinada o a una célula, como se indica en tres de los dominios. Para simplificar no se muestran todos los lugares de unión (por ejemplo, existen otros lugares de unión a la célula). (B) Electronmicrografía de moléculas sombreadas con platino; las flech a s señalan el extremo carboxilo. (C) Estructura tridimensional, determinada por resonancia magnética nuclear, de una secuencia repetida de fibronectina de tipo III. Es el principal tipo de módulo de repetición de fibronectina, y también ha sido encontrado en muchas otras proteínas. La secuencia Arg-GlyAsp (RGD) muestra la región aislada del mayor lugar de unión a la célula (indicado en a zu l en [A]) que describimos en el texto. (B, de J. Engel et al., /. Mol. Biol. 150:97-120, 1981. Academic Press Inc. [London] Ltd.; C, adaptado de A.L. Main, T.S. Harvey, M. Barón, J. Boyd e I.D. Campbell, Cell 71:671-678,1992. © Cell Press.)
«
'-é» HOOC (C )
La matriz extracelular de los animales
1057
los dominios alargados pero deja estos dominios intactos, de modo que puede estudiarse la capacidad de unión de cada dominio. De esta forma se demostró que un dominio se unía a la colágena, otro a receptores específicos de superficie de varios tipos celulares y así sucesivamente (véase Figura 19-51). Cuando se ha aislado un dominio responsable de la unión a células, por ejemplo, su secuencia de aminoácidos puede ser determinada y pueden prepararse péptidos corres pondientes a diferentes segmentos del dominio. Estos péptidos fueron utilizados para localizar las regiones responsables de la unión celular, y luego identificar una secuencia tripeptídica específica (Arg-Gly-Asp, o RGD), que fue encontrada en una de las repeticiones de tipo III (véase Figura 19-51C) como una caracterís tica básica del lugar de unión. Incluso péptidos muy cortos que contienen esta secuencia RGD com piten con la fibronectina por el lugar de unión de las células, inhibiendo su adhesión a la fibronectina de la matriz. Si estos péptidos se inm o vilizan sobre una superficie sólida, las células se adhieren a ella. La secuencia RGD no está restringida a la fibronectina. De hecho su presencia es habitual en diversas proteínas extracelulares de adhesión, siendo reconocida por varios miembros de receptores de superficie de la familia de las integrinas que unen di chas proteínas (se estudia más adelante). Sin embargo, cada receptor reconoce su propio grupo reducido de moléculas de la matriz, lo cual indica que la fuerte unión al receptor requiere algo más que la secuencia RGD.
Las diversas form as de fibronectina son producto de una maduración alternativa del RNA29,30 La fibronectina puede presentar diversas formas (isoformas), incluyendo tam bién la denominada fibronectina plasmática, la cual es soluble y circula por san gre y por otros fluidos del organismo, donde se cree que incrementa la coagula ción de la sangre, la cicatrización de las heridas y la fagocitosis. El resto de formas se organizan en la superficie celular depositándose en la matriz extrace lular com o filam entos de fibronectina muy insolubles. En estas formas de la m a triz y de superficie celular, los dímeros de fibronectina se unen a otros mediante enlaces disulfuro complementarios; a diferencia de las moléculas de colágena fibrilar, las cuales en solución se autoensamblan generando fibrillas, las m olécu las de fibronectina se unen en filamentos sólo en la superficie de ciertas células, lo que sugiere que son proteínas complementarias necesarias para la formación de filamentos. Todas las formas de fibronectina están codificadas por un solo gen de unos 50 kilobases de longitud y que contiene alrededor de 50 exones de tamaño simi lar. La transcripción produce una única molécula de RNA, la cual puede recombinarse alternativamente por tres regiones, dependiendo del tipo celular y del estadio de desarrollo de que se trate. En humanos se producen alrededor de 20 RNA m ensajeros distintos, cada uno de los cuales codifica alguna subunidad de fibronectina distinta. Por ejemplo, la fibronectina plasmática, que es secretada principalmente por las células hepáticas, carece de dos repeticiones del tipo III que se encuentran en formas de fibronectina asociadas a células y matriz. En al gunos casos la maduración alternativa añade o suprime un lugar de unión celular específico de un tipo de célula: uno de estos lugares es utilizado por los linfocitos para adherirse a la fibronectina. Probablem ente la maduración alternativa permite a la célula sintetizar el tipo de fibronectina que sea más apropiada para las necesidades del tejido. El modelo de recom binación de RNA para la fibronectina en el estadio em briona rio temprano es diferente del observado después del desarrollo; pero si la piel del adulto se lesiona, el modelo de recom binación del RNA para la fibronectina en la base de la herida cam bia de nuevo al modelo observado en las primeras etapas del desarrollo. Estas observaciones indican que las formas de fibronecti na producidas en el estadio embrionario temprano y en heridas cicatrizantes son apropiadas sobre todo para promover las migraciones celulares y la prolife ración requerida para el desarrollo del tejido y su reparación.
10 5 8
Capítulo 19: Adhesión celular, uniones celulares y matriz extracelular
La importancia crucial de la fibronectina en el desarrollo animal ha sido de mostrada de manera espectacular a partir de experimentos de inactivación génica (knockout). Por ejemplo, ratones en los que ambas copias del gen que codifica la fibronectina están inactivadas por mutación, mueren en los primeros estadios de la embriogénesis. El ratón mutante tiene múltiples defectos morfológicos, en tre los que se incluyen anomalías en la formación de la notocorda, somitos, cora zón, vasos sanguíneos, tubo neural y membranas extraembrionales.
Las glucoproteínas de la matriz ayudan a determinar las vías de m igración celular31 La fibronectina no sólo juega un papel importante en la adhesión celular a la matriz, sino que tam bién actúan como guía de las migraciones celulares en los embriones de vertebrados. Por ejemplo, se han encontrado grandes acúmulos de fibronectina en la vía seguida por células mesodérmicas en migración duran te la fase de gástrula en anfibios (estudiada en el Capítulo 21). La migración de estas células puede inhibirse, durante el desarrollo embrionario del anfibio, m e diante la inyección de diversos ligandos que alteren la capacidad de las células a unirse a la fibronectina: tanto anticuerpos contra la fibronectina como péptidos que contengan el tripéptido de unión celular RGD pero que carezcan de los do minios de unión a la matriz de la fibronectina y anticuerpos contra las integrinas que actúan como receptores para la fibronectina en todas estas células, inhiben la migración. Probablemente la fibronectina estimula la migración celular facili tando la unión de las células a la matriz. El efecto debe de estar finamente equili brado de manera que las células en migración se adhieran a la matriz, pero no permanezcan inmovilizadas sobre ella. Se cree que m uchos tipos de moléculas adhesivas de la matriz juegan un pa pel como guías de los desplazamientos celulares morfogenéticos, y continua mente se van descubriendo otros nuevos tipos. Por ejemplo, la tenascina es un gran complejo glucoproteico de seis cadenas polipeptídicas similares o idénticas unidas mediante enlaces disulfuro que irradian desde un centro como los radios de una rueda (véase Figura 19-57). Como en la fibronectina, cada una de las ca denas polipeptídicas está compuesta por varios tipos de secuencias de am ino ácidos cortas que están repetidas muchas veces; una repetición de fibronectina del tipo III, por ejemplo, se repite ocho o más veces en cada cadena. Cada cadena polipeptídica se pliega en un número de dominios funcionales distintos, uno de los cuales se une a proteoglucanos transmembrana del tipo sindecanos, mientras que otro se une a la fibronectina. La tenascina presenta una distribución mucho más restrictiva que la fibronectina y es mucho más abundante en la matriz ex tracelular de tejidos embrionarios. A diferencia de la fibronectina, puede esti mular o inhibir la adhesión celular, dependiendo del tipo celular; se cree que las funciones adhesivas y antiadhesivas están mediadas por diferentes dominios proteicos. Existen evidencias crecientes de que también las interacciones an tiadhesivas, como las adhesivas, juegan un importante papel como guías de las migraciones celulares, como veremos en el Capítulo 21 .
Las m oléculas de colágena de tipo IV se ensam blan formando una red lam inar que facilita la form ación de la lám ina basal32 Hasta ahora, nuestro estudio acerca de la matriz extracelular se ha centrado en las estructuras que ocupan el espacio intercelular. Pero en ciertos lugares, espe cialmente en la cercanía de los epitelios, la matriz extracelular puede organizar se como una delgada lámina resistente -la lámina basal. La construcción de la lámina basal depende de algunos tipos especializados de moléculas de la matriz extracelular, incluyendo una variedad especializada de colágenas, de las que nos ocuparemos ahora. Las moléculas de colágena de tipo IV poseen una estructura más flexible que las colágenas fibrilares: su hélice de tres hebras está interrumpida en 26 re-
La matriz extracelular de los animales
1059
170 nm dominio globular C-terminal monomeros
extremo N-terminal ■dominios de triple hélice ASOCIACIÓN RÁPIDA "CABEZA-CABEZA" A TRAVÉS DE LOS DOMINIOS GLOBULARES C-TERMINALES
dímeros
ASOCIACIONES LATERALES MEDIANTE LOS DOMINIOS DE TRIPLE HÉLICE QUE FORMAN REDES LAMINARES
red laminar poligonal
ASOCIACIONES COVALENTES LENTAS A TRAVES DE LAS COLAS N-TERMINALES, QUE FORMAN UN CONJUNTO DE REDES LAMINARES ESTRATIFICADAS red multiestratificada
giones, lo cual permite plegamientos múltiples. De manera semejante a las colá genas asociadas a fibrillas, una vez secretadas no se fraccionan sino que conser van las regiones terminales que impiden el empaquetamiento longitudinal de las fibrillas. Por el contrario, interactúan a través de sus dominios terminales no fraccionados uniéndose fuera de la célula formando una red flexible de tipo la minar y multicapa. Estudios realizados con el microscopio electrónico de prepa raciones de ensam blajes de moléculas de colágena de tipo IV, sugieren que estas moléculas se asocian por su extremo carboxilo terminal formando dímeros, los cuales luego darán lugar a una extensa trama a través de asociaciones amino ter minales con otras tres moléculas y con asociaciones laterales posteriores que se presentan en la Figura 19-52. Estas asociaciones se estabilizan mediante la for mación de enlaces disulfuro y otras uniones cruzadas covalentes entre las m olé culas de colágena. La red resultante forma un andamio insoluble al cual se unen otros com ponentes de la lámina basal a través de asociaciones específicas con moléculas de colágena de tipo IV.
La lám ina basal está com puesta fundam entalmente por colágena de tipo IV, proteoglucanos de tipo heparán sulfato, lam inina y entactina33 Las láminas basales están constituidas por una matriz extracelular especializa da que se organiza en capas delgadas (40-120 nm de grosor) y flexibles que subyacen a las superficies y conductos epiteliales; tam bién rodean las fibras mus culares y las células de Schwann (las cuales se sitúan alrededor de los axones
1060
Capítulo 19 : Adhesión celular, uniones celulares y matriz extracelular
Figura 19-52 Hipótesis sobre cómo se ensamblan las moléculas de colágena de tipo IV formando una red multilaminar. El modelo se basa en las electronmicrografías obtenidas mediante sombreado por rotación del ensamblaje de estas moléculas in vitro. (Basado en P.D. Yurchenco, E.C. Tsilibary, A.S. Charonis y H. Furthmayr, /. Histochem. Cytochem. 34:93-102, 1986.)
tejido conjuntivo . ................ • * *
m.
GLOMÉRULO RENAL
LÁMINA EPITELIAL
MUSCULO
lám ina basal
— -
1 . J
>
.... '.nr ‘
m
m em brana plasmática de la fibra m uscular
y
LUZ
;
j: ’
;* 1• j ', ■
i
í
j# ¡# J
célula endotelial SANGRE /
1
tejido conjuntivo lám ina basal
• ... ’■ORINA lám ina basal célula epitelial
periféricos de las neuronas formando la envoltura de mielina). De esta manera las láminas basales constituyen el elemento separador entre estas células o entre láminas celulares y el tejido conjuntivo adyacente. En otras localizaciones, tales como el glomérulo renal y los alvéolos pulmonares, las láminas basales se sitúan entre dos capas celulares diferentes, y actúan de filtro altamente selectivo (Figura 19-53). Sin embargo, las láminas basales tienen otras funciones que las simple mente estructurales o filtrantes. Pueden determinar la polaridad celular, in fluenciar el metabolismo celular, organizar las proteínas de las membranas plas máticas adyacentes, inducir la diferenciación celular y actuar como “autopistas” específicas para la migración celular. La lámina basal es sintetizada fundamentalmente por las células que se apoyan en ella (Figura 19-54). Como se observa al microscopio electrónico des pués de realizar una fijación y contrastado convencionales, la mayoría de las lá minas basales constan de dos capas diferentes: una que muestra una baja electrodensidad (lámina lúcida o rara), y que se encuentra adyacente al dominio basal de la mem brana plasmática de las células que se apoyan en ella -típ ica mente las células epiteliales- y otra que muestra una mayor opacidad electrónica {lámina densa) justo por debajo de aquélla. En algunos casos puede existir una tercera capa, rica en fibrillas de colágena (la lámina fibrorreticular ), que conecta la lámina basal con el tejido conjuntivo subyacente. Algunos biólogos celulares utilizan el término membrana basal, para describir la estructura de las tres m em branas, que habitualmente es suficientemente gruesa para ser vista mediante el microscopio óptico; otros biólogos celulares utilizan los términos lámina basal y mem brana basal, de forma indiferente. En la lámina basal de algunos epitelios pluriestratificados, tales com o el epitelio escamoso pluriestratificado que consti tuye la epidermis de la piel, la lámina densa está adosada al tejido conjuntivo
Figura 19-53 Tres modelos de organización de las láminas basales (lín ea s a m a r illa s ). Rodean ciertas células (como las fibras musculares), se hallan en la región basal de los epitelios, y se interponen entre dos capas epiteliales (tal com o sucede en el glomérulo renal). Obsérvese que en esta última estructura histológica ambas capas epiteliales presentan espacios entre ellas de tal manera que la lámina basal constituye una barrera permeable, la cual es determ inante en el paso de las moléculas de la orina a la sangre.
Figura 19-54 Electronmicrografía de barrido de una lámina basal de la córnea de un embrión de pollo. Alguna de las células epiteliales (E) han sido extraídas, dejando al descubierto así la superficie superior de la lámina basal (BL). La red de fibrillas de colágena (C) del tejido conjuntivo subyacente interactúa con la superficie inferior de la lámina. (Cortesía de Robert Trelstad.)
10 |im
La matriz extracelular de los animales
1061
subyacente mediante unas fibrillas de anclaje constituidas por moléculas de co lágena de tipo VII. En un tipo de enfermedad, que es devastadora para la piel, o no existen estas conexiones o están destruidas, y la epidermis y su lámina basal se separan del tejido conjuntivo subyacente. Aunque su com posición exacta varía de un tejido a otro e incluso de una re gión a otra en la misma lámina, la mayoría de láminas basales maduras contie nen colágena de tipo IV (véase Figura 19-52), muchos proteoglucanos del tipo heparán sulfato denominados perlecanos y glucoproteínas como la laminina y la entactina. La lam inina es una de las primeras proteínas de matriz extracelular sintetizadas durante el desarrollo embrionario; y en las primeras etapas del de sarrollo, la lámina basal tiene poca o incluso nada de colágena de tipo IV y cons ta principalmente de una red de laminina. La laminina es un gran complejo fle xible (de unos 850 000 daltons) formado por tres largas cadenas polipeptídicas, dispuestas en forma de cruz y unidas mediante enlaces disulfuro (Figura 19-55). Como muchas otras proteínas de la matriz extracelular, también presenta varios dominios funcionales: uno de unión a la colágena de tipo IV, otro al heparán sul fato, otro a la entactina, y dos o más a los receptores de la laminina situados en la superficie celular. Como la colágena de tipo IV, las moléculas de laminina pueden autoensamblarse in vitro formando una lámina, en gran parte a través de interacciones entre los extremos de los brazos de laminina. Cada molécula de entactina, que posee forma de pesa de gimnasia, se une a cada molécula de laminina en el lugar donde los brazos cortos se entrecruzan con los largos. La en tactina tam bién se une a la colágena de tipo IV, por lo que se cree que actúa com o un puente adicional entre la colágena de tipo IV y la red de laminina de la lámina basal (Figura 19-56). En la Figura 19-57 se comparan las formas y tamaños de algunas moléculas de la matriz extracelular estudiadas en este capítulo.
Las lám inas basales realizan diversas y com plejas funciones34 En el glomérulo renal, una lámina basal extraordinariamente gruesa, actúa como un filtro molecular, regulando el paso de macromoléculas de la sangre a la orina (véase Figura 19-53). Aparentemente, los proteoglucanos del tipo heparán sulfato
cadena A
dom inios globula
dom inios a-helicoidales superenrollados
20 nm
¡íiÉ - ••lllÉ arv.
(B)
í*.* ‘ •
1________________________ i 100 nm
Figura 19-55 Estructura de la laminina. Dibujo esquemático de la molécula de laminina representado en (A), y electronmicrografías de moléculas de laminina sombreadas con platino representadas en (B). La glucoproteína multidominio está formada por tres polipéptidos (A, B, y B2), que mediante enlaces disulfuro dan lugar a una estructura asim étrica en forma de cruz. Cada una de las cadenas polipeptídicas está constituida por más de 1500 residuos de aminoácido. Se han identificado tres tipos de cadenas A, tres tipos de cadenas B p y dos tipos de cadenas B2, las cuales pueden asociarse formando 18 isoformas diferentes de laminina. Algunas de estas isoformas presentan una distribución tisular característica. Existen tam bién varias isoformas de colágena de tipo IV con distribuciones tisulares específicas. Así pues, la lámina basal es químicamente diversa, lo cual no es sorprendente en vista de su diversidad funcional. [B, de J. Engel et al., J.M oLBiol. 150:97-120,1981. © Academic Press Inc. (London) Ltd.]
106 2
Capítulo 19: Adhesión celular, uniones celulares y matriz extracelular
SÍMBOLOS entactina
lam im na
colágena de tipo IV
colagena de tipo IV Figura 19-56 Modelo actual de la estructura molecular de una lámina basal. La lámina basal (A) está formada
perlecano lam im na
son fundamentales para llevar a cabo esta función, ya que cuando las cadenas de GAG son degradadas mediante enzimas específicas, desaparecen las propie dades filtrantes de la lámina basal. La lámina basal también puede actuar como una barrera selectiva para el desplazamiento de las células. Así, por ejemplo, la lámina sobre la que se apoya un epitelio impide que los fibroblastos del tejido conjuntivo establezcan contacto con las células epiteliales. Sin embargo, no es obstáculo para el paso de células tales como macrófagos, linfocitos o procesos nerviosos. La lám ina basal constituye un elemento importante para la regenera ción de tejidos dañados. Cuando ello sucede en tejidos como el muscular, el nervioso o el epitelial, la lámina basal se mantiene, proporcionando un entra mado a través del cual las células regeneradas pueden migrar, lo cual permite una reconstrucción de la arquitectura del tejido original. En algunos casos, como en la piel o la córnea, la lámina basal se altera por ejemplo por la adición de fibronectina, la cual facilita la migración celular necesaria para la reparación de heridas. Un ejemplo de la importancia de la lámina basal en la regeneración tisular lo proporciona el estudio de la unión neuromuscular, mediante la cual las neu ronas transmiten su estímulo a las fibras musculares esqueléticas. En la zona de contacto neuromuscular, las terminaciones nerviosas de la neurona motora for man una sinapsis con la célula muscular. La lámina basal que rodea a la célula muscular separa el nervio de la membrana plasmática de la célula muscular en la sinapsis. La región sináptica de la lámina basal es característica desde el punto de vista químico: por ejemplo, se han encontrado isoformas características de
La matriz extracelular de los animales
por interacciones específicas entre las proteínas de colágena de tipo IV, la laminina y la entactina y el proteoglucano perlecano (B). En (B) las flechas conectan moléculas que pueden unirse directam ente unas con otras. (Basado en P.D. Yurchenco y J.C. Schittny, FASEBJ. 4:1577-1590,1990.)
1063
fibronectina
<
ácido hialurónico colágena fib rila r " decorina
perlecano
Cb* ■*
tenascina
a9recano
colágena de tipo IV
100 nm
colágena de tipo IV y de laminina. Esta lámina basal de unión juega un papel central en la reconstrucción de la sinapsis después de una lesión de un nervio o de un músculo. Evidencias en este sentido provienen principalmente de experi m entos realizados en ranas. Si un músculo de rana y su nervio motor se dañan, la lámina basal que rodea cada célula muscular permanece, de forma que pue den reconocerse los lugares de antiguas uniones neuromusculares. Si se perm i te que el nervio m otor se regenere pero el músculo no, los axones nerviosos re conocen los lugares sinápticos originales en los huecos de la lámina basal y se diferencian formando term inales nerviosos de apariencia normal. Así, la lámina basal de unión puede por sí misma guiar la regeneración de los nervios motores terminales. Experimentos similares a éstos muestran que la lámina basal también con trola la localización de los receptores de acetilcolina que se agrupan en la unión neuromuscular de la m em brana plasmática de la célula muscular (se estudia en el Capítulo 11). Si el músculo y el nervio son destruidos, y se permite que el mús culo se regenere pero el nervio no, los receptores para acetilcolina sintetizados por el músculo regenerado se localizan predominantemente en la región de las antiguas uniones, a pesar de que el nervio esté ausente (Figura 19-58). Así, la lámina basal de unión coordina, aparentemente, la organización es pacial local de los com ponentes en cada una de las dos células que forman la unión neuromuscular. Extractos de lámina basal de unión contienen una nueva proteína de matriz denominada agrina, la cual, cuando se une a células muscu lares en cultivo, inicia el ensam blaje de estructuras sinápticas en su membrana plasmática. Se ha demostrado que las neuronas motoras sintetizan agrina, y se cree que la depositan (al igual que otras macromoléculas especializadas) en la lámina basal de la unión neuromuscular en desarrollo y que estas moléculas lo calizadas en la matriz ayudan a ensamblar y estabilizar la conexión sináptica. La agrina es tam bién sintetizada por muchos otros tipos de neuronas, de forma que es posible que dirija el ensam blaje de receptores y de otras macromoléculas postsinápticas en sinapsis localizadas en cualquier lugar del sistema nervioso. Es probable que la lámina basal tam bién desempeñe un sofisticado papel com o guía de las migraciones celulares durante el desarrollo embrionario. Así, en el gusano nemátodo Caenorhabditis elegans la mutación de un gen que codi fica una proteína sem ejante a la laminina interrumpe el desplazamiento de cier tas células mesodérmicas y axones nerviosos que migran hacia la lámina basal
1 06 4
Capítulo 19 : Adhesión celular, uniones celulares y matriz extracelular
Figura 19-57 Esquema comparativo de las formas y tamaños de algunas de las principales macromoléculas de la matriz extracelular. La proteína está representada en verde y el glucosaminoglucano en rojo.
Figura 19-58 Experimentos de regeneración que indican el carácter especial de la lámina basal de unión en una unión neuromuscular.
estructura residual de la lámina basal nervio cortado célula m uscular1, cortada para que degenere
FIBRA NERVIOSA REGENERADA
lám ina basal de unión
union neurom uscular
MUSCULO Y NERVIO DEGENERADOS
el nervio regenerado vuelve al lugar de unión original
■<
FIBRA MUSCULAR REGENERADA
nuevos receptores de acetilcolina se concentran en el lugar de unión original
Cuando el nervio se regenera y el músculo no lo hace, después de que ambos han sido dañados (parte su p erior de la figura), la lámina de unión dirige el nervio en regeneración hacia el lugar de la sinapsis original. Cuando se regenera el músculo pero no el nervio (parte in ferior de la figura), la lámina de unión provoca una nueva síntesis de receptores de acetilcolina que se acumulan en el lugar sináptico original (el músculo se regenera a partir de las células satélite localizadas entre la lámina basal y la célula muscular original -n o representada, pero véase pág. 1262). Estos experimentos muestran que la lámina basal unida controla la localización de otros com ponentes de la sinapsis -e n ambos lados de la lámina.
de la epidermis subyacente. Sorprendentemente, sólo están afectadas las migra ciones a lo largo del eje dorsoventral del embrión; las migraciones a lo largo del eje anteroposterior de la misma lámina basal se producen con normalidad. Es tos hallazgos, así como los referentes a regeneración de la unión neuromuscular en la rana, sugieren que aún nos queda mucho por conocer sobre las especializaciones funcionales de la lámina basal.
La degradación de los com ponentes de la matriz extracelular está estrecham ente controlada35 La regulación del recambio de las macromoléculas de la matriz extracelular es importantísima para diversos procesos biológicos. Por ejemplo, existe una de gradación rápida cuando el útero involuciona después de un parto, o cuando la cola del renacuajo se reabsorbe durante la metamorfosis. Una degradación más localizada de los com ponentes de la matriz es necesaria cuando las células migran a través de la lámina basal, lo que sucede, por ejemplo, cuando los glóbulos blancos migran a través de la lámina basal vascular en respuesta a una infección o a una herida, o cuando las células cancerosas migran desde su lugar de origen hacia órganos distantes a través del torrente sanguíneo o de conductos linfáti cos, en un proceso conocido como metástasis. Incluso la matriz extracelular de animales adultos, aparentemente estática, está sometida a un lento recambio continuo debido a la degradación y a la resíntesis. En cada uno de estos casos los com ponentes de la matriz son degradados por enzimas proteolíticas extracelulares que son secretadas localmente por las células. Muchas de estas proteasas pertenecen a una de las dos clases generales: algunas son metaloproteasas, cuya actividad depende de su unión a Ca2+ o a Zn2+, mientras que otras son serina proteasas, las cuales tienen un residuo serina muy reactivo en su centro activo. Ambas, metaloproteasas y serina proteasas, cooperan en la degradación de proteínas de la matriz tales como colágena, laminina y fibronectina. Algunas de las metaloproteasas, como las colagenasas, son muy específicas, degradando determinadas proteínas en lugares específicos, de manera que la integridad estructural de la matriz es destruida por una proteolisis limitada; de esta manera la migración celular puede estar facilitada por una actividad proteolítica relativamente reducida.
La matriz extracelular de los animales
1065
Una importante serina proteasa implicada en la degradación de la matriz es el activador del plasminógeno de tipo uroquinasa (U-PA, de Urokinase-type Plas minogen Activator). Actúa como desencadenante específica en una cascada proteolítica: su diana inmediata es el plasminógeno, un precursor inactivo muy abundante en la sangre y que se acumula en los lugares de reestructuración del tejido tales como heridas, tumores y lugares inflamados. U-PA degrada un único enlace del plasminógeno dando lugar a la proteasa activa plasmina. A diferencia de U-PA, la plasmina tiene una amplia especificidad, degradando una gran va riedad de proteínas, incluyendo la fibrina (un com ponente de los coágulos san guíneos), la fibronectina y la laminina. Existen algunos mecanismos que aseguran que la degradación de los com ponentes de la matriz esté rigurosamente controlada. En primer lugar, igual que el plasminógeno, muchas proteasas son secretadas como precursores inactivos que pueden activarse localmente. En segundo lugar, la acción de las proteasas está restringida a áreas específicas mediante la secreción de diversos inhibidores de proteasas, tales como los inhibidores tisulares de metaloproteasas (TIMP, de Tissue Inhibitors of MetalloProteases) y los inhibidores de serina proteasas, co nocidos como serpins. Estos inhibidores son específicos de determinadas protea sas y se unen fuertemente a la enzima activa bloqueando su actividad. Una idea atractiva es que los inhibidores sean secretados por células de la periferia de áreas de degradación activa con el fin de proteger la matriz no implicada; así mismo estos inhibidores tam bién pueden proteger proteínas de superficie celular que sean necesarias para la adhesión o la migración. En tercer lugar, muchas células tienen en su superficie receptores que unen proteasas tales como U-PA, confi nando de ese modo a la enzima sólo donde es necesaria: esta unión de U-PA a un receptor se ha encontrado por ejemplo en células nerviosas en crecimiento y en el borde de avance de los glóbulos blancos en migración, donde puede actuar limpiando el camino que permita la migración de la célula; esta actividad parece ser un requisito para algunos tipos de células cancerosas en procesos de m etás tasis (Figura 19-59).
Resumen
Las células del tejido conjuntivo se encuentran incluidas en una compleja matriz extracelular, la cual no solamente une las células entre sí, sino que también influye (A) células con receptores de proteasa funcionales
proteasa activa (U-PA) CRECIMIENTO TUMORAL Y METÁSTASIS
106 6
(B) células con receptores de proteasa bloqueados
proteasa inactiva (U-PA mutante) CRECIMIENTO TUMORAL SIN METÁSTASIS
Capítulo 19: Adhesión celular, uniones celulares y matriz extracelular
Figura 19-59 Importancia de la proteasa unida a un receptor de superficie celular. (A) Síntesis y secreción de U-PA, una serina proteasa que se une a proteínas receptoras U-PA de superficie celular en células cancerosas de próstata humana. En (B) las mismas células han sido transfectadas con DNA que sobrexpresa una forma inactiva de UPA, la cual se une a receptores de U-PA impidiendo que la proteasa activa se una a la superficie celular. Ambos tipos de células secretan U-PA activa, crecen rápidamente, y producen tumores cuando son inyectadas en animales experimentales, pero las células de (A) provocan una metástasis general, mientras que esto no sucede en (B). Para poder formar metástasis, las células tumorales han de migrar a través de la lámina basal y de otras matrices extracelulares que encuentran a su paso dentro o fuera de la sangre. Este experimento sugiere, por lo tanto, que para poder facilitar la migración a través de la matriz, las proteasas deben estar unidas a la superficie celular.
en su desarrollo, su polaridad y su comportamiento. La matriz contiene diversas proteínas formadoras de fibras intercaladas en el interior de un gel hidratado com puesto por una reddeglucosaminglucanos (GAG). Los GAG constituyen un grupo heterogéneo de largas cadenas de polisacáridos cargados negativamente, los cuales (exceptuando el ácido hialurónico) se unen covalentemente a una proteína dando lugar a moléculas de proteoglucanos. Estos proteoglucanos ocupan un gran volunten y forman geles hidratados en el espacio extracelular. También se encuentran proteoglucanos en la supeificie celular donde desempeñan funciones como correceptores facilitando la unión de las células a la matriz y respondiendo a factores de crecimiento. Las proteínas formadoras de fibras pueden dividirse en dos grandes grupos funcionales: unas fundamentalmente estructurales (colágenas y elastina) y otras fundamentalmente adhesivas (como la fibronectina y la laminina). Las colágenas fibrilares (tipos I, II, III, Vy XI) son alargadas, semejantes a rodillos, y sus molécu las helicoidales de triple hebra se agregan formando largas fibrillas en el espacio extracelular; a su vez estas fibrillas pueden ensamblarse formando estructuras va riadas altamente ordenadas. Las moléculas de colágena asociadas a fibras, tales como los tipos IX y XII, decoran la superficie de las fibras de colágena e influyen en las interacciones de las fibras entre sí y con otros componentes de la matriz. Las mo léculas de colágena de tipo IV se organizan en una red laminar que es un compo nente crucial de todas las láminas basales maduras, las cuales también contienen las proteínas laminina y entactina y el proteoglucanos del tipo de los heparán sul fatas, el perlecano. Las moléculas de elastina forman una extensa red de fibras y láminas, enlazadas por puentes cruzados, que tienen la capacidad de estiramiento y retracción, proporcionando elasticidad a la matriz. La fibronectina y la lamini na son buenos ejemplos de grandes glucoproteínas adhesivas de la matriz form a das por múltiples dominios; la primera de ellas está ampliamente distribuida en el tejido conjuntivo, mientras que la segunda se localiza fundamentalmente en la lámina basal. Mediante sus múltiples dominios de unión, estas proteínas facilitan la adhesión celular y colaboran eficazmente en la organización de la matriz extracelular. Receptores de la matriz extracelular en células animales: las integrinas Para entender cómo interacciona la matriz extracelular con las células, es nece sario identificar tanto las moléculas de la superficie celular (los receptores de la matriz) que se unen a los diversos componentes de la matriz, como a los propios com ponentes de la matriz extracelular. Debido a las múltiples interacciones que se producen entre las macromoléculas de la matriz en el espacio extracelular, el establecim iento de un límite entre los com ponentes de la membrana plasmática y la matriz extracelular constituye un ejercicio semántico. Sin embargo, la unión última a la célula requiere de una proteína transmembrana que una la matriz al citoesqueleto cortical de las células. Ya hemos visto que algunos proteoglucanos con proteínas centrales transmembrana actúan como correceptores para los com ponentes de la matriz, pero los principales receptores en las células anim a les para la mayoría de proteínas de la matriz extracelular, incluyendo la coláge na, la fibronectina y la laminina, son las integrinas, una gran familia de proteí nas de unión, transmembrana y homologas. Las integrinas difieren de los receptores de hormonas de la superficie celu lar y de otras moléculas señal solubles en que se unen a sus ligandos con una re lativamente baja afinidad {Ka = 106 - 10 9litros/mol) y en que habitualm ente se presentan a concentraciones a nivel de la superficie celular entre 10 y 100 veces mayores. Esta situación tiene sentido ya que la unión simultánea pero débil a un gran número de moléculas de la matriz permite a las células explorar su me dio sin dejar de unirse a él. Si la unión fuera demasiado fuerte, las células proba blem ente podrían llegar a pegarse irreversiblemente a la matriz sin poder
Receptores de la matriz extracelular en células animales: las integrinas
1067
unión a la matriz
desplazarse -u n problema que no se presenta si la unión depende de múltiples adhesiones débiles. Éste es un ejemplo del “principio Velero” comentado ante riormente.
Las integrinas son heterodímeros transm em brana36 Las integrinas son receptores de crucial importancia debido a que constituyen los mecanism os principales de que disponen las células para unirse a la matriz extracelular y responder a ella. Están constituidas por dos subunidades glucoproteicas transm em brana unidas entre sí no covalentemente, denominadas a y (3; ambas contribuyen a la unión de las células a las proteínas de la matriz (Figu ra 19-60). Parece que algunas integrinas se unen únicamente a un tipo de macromolécula de la matriz, como la fíbronectina o la laminina, mientras que otras se unen a más de una: por ejemplo, una integrina que está presente en fibroblas tos se une a colágena, fíbronectina y laminina. Una subfamilia de integrinas re conoce la secuencia RGD presente en éstas y en otras proteínas de la matriz, mientras que otras reconocen otras secuencias o dominios. Una misma m olécu la de integrina localizada en diferentes tipos celulares puede presentar diferen tes afinidades por el ligando, por lo que puede especularse que determinados factores adicionales pueden interactuar con las integrinas modulando su activi dad. La unión de las integrinas a sus ligandos depende de cationes bivalentes extracelulares (Ca2+ o Mg2+, dependiendo de la integrina), lo cual refleja la presen cia de tres o cuatro dominios de unión a cationes divalentes en la gran región ex tracelular de la cadena a. Esta propiedad puede utilizarse para purificar integrinas: las proteínas de mem brana plasmática solubles en detergente se ha cen pasar a través de una columna de afinidad que contiene una proteína de la matriz extracelular o un péptido con la secuencia RGD, y las integrinas que se han unida son luego eluidas de la columna mediante lavado con una solución li bre de cationes divalentes. El tipo de cationes divalentes puede influir tanto la afinidad como la especificidad de la unión de una integrina a sus ligandos, aun que, como en el caso de las cadherinas, todavía no conocem os el significado fi siológico de la regulación de este catión. Muchas proteínas de la matriz de vertebrados son reconocidas por varias in tegrinas: por ejemplo, por lo menos 8 integrinas se unen a la fíbronectina, y un mínimo de 5 a la laminina. Se han definido alrededor de 20 heterodímeros de in tegrina, constituidos por 9 tipos de subunidades P y 14 tipos de subunidades a, y otros se están caracterizando. Su diversidad se incrementada por la maduración alternativa de algunos RNA de integrinas. Las cadenas PP que forman dímeros con al menos 9 cadenas a distintas, se han localizado en casi todas las células de vertebrados: por ejemplo, a 5P, es un receptor de la fíbronectina y oc^ es un re ceptor para la laminina en muchos tipos celulares. En cambio, las cadenas P2, que forman dímeros con 3 tipos de cadenas a, se expresan exclusivamente en la superficie de los leucocitos y juegan un papel esencial permitiendo a estas célu las com batir las infecciones. Una de estas integrinas (32 (aLP2) es la denominada LFA-1 (de Lynfocite Function Associated, asociada a la función linfocitaria); otra (aMP2) es la denominado Mac-1 debido a que se encontró fundamentalmente en macrófagos. Las integrinas del tipo (32 median principalmente la unión entre cé lulas y no entre las células y la matriz, uniéndose a ligandos específicos de otra célula, como las células endoteliales de los vasos sanguíneos: los ligandos, a ve ces denominados contrarreceptores, son miembros de la superfamilia de inmunoglobulinas de moléculas de adhesión celular, estudiadas anteriormente. Las integrinas P2, por ejemplo, permiten a los glóbulos blancos unirse firmemente y atravesar el revestimiento endotelial de los vasos sanguíneos en los lugares de infección. Los humanos que padecen la enfermedad genética denominada defi ciencia de adhesión leucocitaria no pueden sintetizar la subunidad (32; como con secuencia de ello, sus glóbulos blancos son deficientes en todos los receptores del grupo P2, y sufren repetidas infecciones bacterianas. Las integrinas del tipo P3
1068
Capítulo 19 : Adhesión celular, uniones celulares y matriz extracelular
cadena (3 catión divalente dom inios ricos en cisteína
cadena a
mem brana plasmática HOOC unión a la a-actinina y a la talina
citosol
__________ i
10 nm
Figura 19-60 Estructura en subunidades de un receptor matriz de superficie celular de tipo integrina. Las electronmicrografías de receptores aislados sugieren que la molécula tiene una morfología aproximadamente como la mostrada en el esquema, con un extremo globular que se proyecta más de 20 nm sobre la bicapa lipídica. Al unirse a una proteína de la matriz en el exterior celular y al citoesqueleto de actina (mediante las proteínas de anclaje talina y a-actinina) en el interior de la célula, la proteína actúa como un elemento de unión transmembrana. Tanto las cadenas a como las (3 están glucosiladas (no se muestra en la figura), y se unen entre sí mediante enlaces no covalentes. En el receptor de la fíbronectina representado, la cadena a es sintetizada inicialmente como una sola cadena polipeptídica de unos 140 000 daltons, la cual es posteriormente escindida en una pequeña región transmembrana y un gran fragmento extracelular, los cuales permanecen unidos entre sí mediante un enlace disulfuro; este fragmento extracelular está plegado en cuatro dominios de unión a cationes divalentes. La región extracelular de la cadena P contiene una región rica en cisteína que se repite, estableciendo puentes disulfuro intracatenarios; la cadena p tiene una masa de unos 100 000 daltons.
han sido localizadas en diversas células, entre ellas las plaquetas sanguíneas, y se unen a varias proteínas de la matriz incluyendo el fibrinógeno-, las plaquetas interactúan con el fibrinógeno durante la coagulación de la sangre y los indivi duos que presentan la enfermedad de Glanzmann, deficientes genéticamente en integrinas del tipo p3, sangran fácilmente. En Drosophila se han descrito dos integrinas que comparten una subunidad (3 común. Si ambas copias del gen que codifica esta subunidad P están mutadas, las moscas mueren en el estado larvario; se desarrollan con normalidad hasta que empiezan las primeras contracciones musculares, momento en que los músculos se desinsertan de sus lugares de unión a la matriz extracelular.
Las integrinas pueden interaccionar con el citoesqueleto para unir las células a la matriz extracelular37 Las integrinas actúan como acopladores transmembrana (o "integradores”) m e diando las interacciones entre el citoesqueleto y la matriz extracelular que son necesarias para que las células se adhieran a la matriz. La mayoría de las integri nas se asocian a haces de filamentos de actina. (La integrina localizada en hemidesmosomas -oc6(34- es una excepción ya que se asocia a filamentos interm e dios.) Tras la unión de una integrina típica a su ligando de la matriz, la cola citoplasmático de la cadena (3 se une a la talina y a la a-actinina, iniciando el en samblaje de un complejo de proteínas de unión intracelulares que unen la inte grina a los filamentos de actina en el córtex celular; se cree que así es como se forman los contactos focales entre las células y la matriz extracelular, como dis cutimos anteriormente. Si el dominio citoplasmático de la cadena (3 se suprime mediante la utilización de técnicas de DNA recombinante, las integrinas mutantes permanecen unidas a sus ligandos pero ya no establecen fuertes adhesiones celulares o grupos de contactos focales. Así pues, parece que las integrinas interaccionan con el citoesqueleto para que las células se unan a la matriz, de la misma forma en que las cadherinas deben interactuar con el citoesqueleto para mantener unidas las células entre sí. Como discutimos anteriormente, parece que la unión transmembrana con el citoesqueleto es un requisito general impor tante para las uniones célula-matriz y célula-célula: sin tales anclajes internos, el lugar de unión está predispuesto a ser eliminado de la célula (véase Figura 1929). Las uniones al citoesqueleto también pueden agrupar las integrinas, dando lugar a una importante agregación de elementos de unión celular (otra vez el principio Velero). Como estudiaremos a continuación, las interacciones que median las inte grinas entre la matriz extracelular y el citoesqueleto actúan en ambas direccio nes y desempeñan un importante papel en la orientación tanto de las células como de la matriz en un tejido.
Las integrinas perm iten al citoesqueleto y a la matriz extracelular com unicarse a través de la m em brana plasm ática37,38 La matriz puede influir en la organización del citoesqueleto celular. Esto puede ser demostrado mediante cultivos de fibroblastos transformados (semejantes a cancerosos) (se estudian en el Capítulo 24). A menudo las células transformadas sintetizan menos fibronectina que las células normales, presentando com porta mientos diferenciales: por ejemplo, se adhieren de forma deficiente al substrato y carecen de la capacidad para aplanarse o desarrollar los haces organizados de filamentos de actina conocidos como fibras de estrés. Ello contribuye a la ten dencia que muestran las células cancerosas de separarse del tumor primario y propagarse hacia otras partes del cuerpo. En algunos casos la deficiencia en fi bronectina parece ser, al menos en parte, responsable de esta morfología anor mal: si las células han crecido en una matriz de filamentos organizados de fibro nectina, se aplanan y las fibras de estrés intracelulares se alinean con los filamentos de fibronectina extracelulares.
Receptores de la matriz extracelular en células animales: las integrinas
1069
Figura 19-61 Alineación de los filamentos de fibronectina extracelular con los haces de filamentos de actina. La fibronectina de dos fibroblastos de rata mantenidos en cultivo se observa mediante la utilización de anticuerpos unidos a la rodamina (A), mientras que la actina se visualizada mediante anticuerpos específicos unidos a la fluoresceína (B). (De R.O. HynesyA.T. Destree, Cell 15:875-886,1978. © Cell Press.)
(A)
(B)
|________________ 50 pm
Esta interacción entre la matriz extracelular y el citoesqueleto es recíproca en tanto que los filamentos de actina pueden influir la orientación de las moléculas de fibronectina secretadas. Por ejemplo, los filamentos de fibronectina extracelulares se organizan sobre o cerca de la superficie de fibroblastos en cultivo ali neándose con las fibras de estrés intracelulares adyacentes (Figura 19-61). Si es tas células son tratadas con una droga com o la citocalasina, que desorganiza los filamentos de actina, los filamentos de fibronectina se disocian de la superficie celular (exactamente com o lo hacen durante la mitosis cuando las células se re dondean). Estas interacciones recíprocas entre la fibronectina extracelular y los filamentos de actina intracelulares a través de la membrana plasmática están mediadas fundamentalmente por las integrinas. El citoesqueleto de las células puede ejercer fuerzas que orientan las macromoléculas de la matriz y éstas, a su vez, pueden organizar el citoesqueleto de las células que contactan con ellas, por lo que la matriz puede propagarse, en prin cipio, de una célula a otra (Figura 19-62), creando estructuras orientadas a gran escala, com o vimos anteriormente (véase pág. 1055). Las integrinas actúan como adaptadores en estos procesos de ordenamiento, mediando las interacciones entre las células y la matriz que las rodea.
la orientación que presenta el citoesqueleto en la célula (? ) induce la orientación del conjunto m olecular secretado que constituye la m atriz extracelular de las inm ediaciones
Las células pueden regular la actividad de sus integrinas39 Mientras que las integrinas de muchas células están constantem ente en un esta do competente-adhesivo, las integrinas de las células sanguíneas tienen que ser activadas antes de que puedan mediar la adhesión celular. Tales adhesiones re guladas permiten probablem ente a las células sanguíneas circular libremente hasta que son activadas por un estímulo adecuado; debido a que las integrinas no necesitan ser sintetizadas de novo, la respuesta puede ser rápida. Por ejem plo, las plaquetas pueden ser activadas mediante el contacto con un vaso san guíneo dañado o por alguna de las moléculas de señalización solubles. El estí mulo activa vías de señalización intracelular, las cuales a su vez activan de forma rápida y permanente una integrina (33 en la m em brana de la plaqueta, alterando su conform ación de manera que ahora su dominio extracelular puede unirse al Figura 19-62 De qué forma la matriz extracelular puede propagar de una célula a otra un orden dentro de un tejido. Para simplificar, la figura representa un esquema hipotético en el cual una célula influye en la orientación de las células vecinas. Sin embargo, es más probable que todas las células puedan afectar la orientación de las demás.
1070
Capítulo 19: Adhesión celular, uniones celulares y matriz extracelular
la m atriz orientada establece contacto con las células @ y induciendo, a su vez, la orientación de los citoesqueletos
las células (¿ ) y ( 3 ) secretan y orientan los elem entos de la m atriz más próxim a, propagando así la orientación a las células ( 4 ) y ( 5 )
matriz extracelular
señal activadora
/p~~—
•
ACTIVACION CELULAR
R E G U LA C IÓ N DEL L U G A R DE U N IÓ N A LA M ATRIZ
ligando para la integrina
integrina inactiva
ACTIVACION DE I A IN T F f iR IN A
integrina activada
señalización intracelular en cascada
membrana plasmática
matriz extracelular LAS INTEGRINAS SE DISOCIAN DEL CÓRTEX DE ACTINA
R E G U L A C I Ó N DE LA UN IÓN A L CITO ESQ UELETO
integrinas agrupadas en un contacto focal
citoesqueleto de actina
fibrinógeno, proteína coagulante de la sangre, con una gran afinidad, estimulan do así la agregación plaquetaria y la formación del coágulo sanguíneo (Figura 19-63A). De un modo parecido, la débil unión de los linfocitos T tanto a su antígeno específico situado en la superficie de una célula presentadora de antígenos com o a una célula infectada por un virus (se explica en el Capítulo 23), desenca dena señales intracelulares en las células T, las cuales conducen a una rápida ac tivación transitoria de una integrina CLFA-1) en las células T. La integrina activa da permite a los linfocitos T adherirse fuertemente a la célula diana, de modo que permanecen en contacto con ella el tiempo suficiente para ser estimulados; la integrina vuelve luego a su estado inactivo para permitir que los linfocitos T se liberen. La mayoría de los mecanismos mediante los cuales algunas señales in tracelulares activan los lugares de unión de una integrina en una célula sanguí nea son desconocidos. Otros fenómenos intracelulares pueden inactivar las integrinas. Por ejemplo, la fosforilación de un residuo de serina en el extremo citoplasmático de una inte grina del tipo Pj durante la mitosis de células en cultivo debilita la capacidad de unión de la integrina a la fibronectina, lo cual puede explicar por qué estas célu las se redondean y se liberan del substrato durante la mitosis. De manera seme jante, en algunas células cancerosas la fosforilación de un residuo de tirosina en el extremo citoplasmático de una integrina unida a la fibronectina, disminuye la capacidad de la integrina para unirse a la talina, lo cual parece que contribuye a la relativamente baja adhesión de estas células a la fibronectina (Figura 19-63B).
Figura 19-63 Las células pueden regular la actividad de sus integrinas. En (A) la activación celular induce un cambio del lugar de unión extracelular de la integrina, de modo que ahora puede mediar la adhesión celular. En (B) la fosforilación de la tirosina del extremo citoplasmático de las integrinas disminuye su capacidad de unión al citoesqueleto de actina. Debido a que las integrinas han de unirse al citoesqueleto para poder mediar una fuerte adhesión de la célula a la matriz, la fosforilación provoca que las integrinas relajen su unión con la matriz extracelular.
Las integrinas pueden activar cascadas de señalización intracelular40 Las macromoléculas de la matriz extracelular presentan notables efectos sobre la conducta de las células en cultivo, afectando a su forma, su polaridad, su m o vimiento, su metabolismo, su desarrollo y otras funciones específicas. Muchos de estos efectos implican cambios en la expresión génica, y casi todos son lleva dos a cabo por las integrinas. Ya explicamos que las integrinas actúan como aco-
Receptores de la matriz extracelular en células animales: las integrinas
1071
Tabla 19-5 Familias de moléculas de adhesión celular Dependencia de Homofflica o Ca2+o de Mg2+ heterofflica
Asociaciones con el citoesqueleto
Asociaciones de uniones celulares
cadherinas E, N, P
sí
homofflica
filamentos de actina (vía cateninas)
bandas de adhesión
cadherinas desmosomales
sí
homofflica
filamentos intermedios (vía desmoplaquinas, placoglobinas y otras proteínas)
desmosomas
Miembros de la familia de las Ig
N-CAM, L1
no
homofflica o heterofflica
desconocida
no
Selectinas (células de la sangre + células endoteliales exclusivamente)
Selectina P (véase pág. 537)
sí
heterofflica
desconocida
no
Integrinas de las células sanguíneas
LFA-1 (aLb2), Mac-1 (aMb2)
sí
heterofflica
filamentos de actina
no
muchos tipos
sí
heterofflica
filamentos de actina (vía talina, vinculina y otras proteínas)
contactos focales
a6b 4
sí
heterofflica
filamentos intermedios
hemidesmosomas
sindecanos
no
heterofflica
filamentos de actina
no
Algunos miembros de la familia ADHESIÓN CÉLULA-CÉLULA Cadherinas
ADHESIÓN CÉLULA-MATRIZ Integrinas
Proteoglucanos transmembrana
piadores transm em brana conectando las moléculas de la matriz extracelular a los filamentos de actina del córtex celular y que de este modo regulan la forma, la orientación y el movimiento celulares. Sin embargo existen evidencias crecientes de que la agrupación de integrinas en los lugares de contacto con la matriz (o con otras células) puede tam bién activar algunas vías de señalización intracelular, incluyendo la vía de fosfolípidos de inositol; además, algunas proteínas intracelulares, incluyendo una tirosina quinasa localizada en los contactos focales, son fosforiladas en residuos de tirosina. Aunque se desconocen los mecanismos moleculares, es posible que las agrupaciones de integrinas generen señales intracelulares que inicien el ensam blaje de un complejo de señalización en la cara citoplasmática de la m em brana plasmática, como hacen las tirosina quinasas li gadas a receptores de factores de crecim iento (se explica en el capítulo 15). Fre cuentem ente la señalización mediante integrinas y receptores de factores de crecim iento es necesaria para una respuesta celular óptima: por ejemplo, mu chas células en cultivo no proliferan en respuesta a factores de crecimiento a menos que las células se unan a través de integrinas a las moléculas de la matriz extracelular. El reto está en determinar cómo interactúan estas cascadas de se ñalización influyendo a conductas celulares complejas tales como la expresión génica y la proliferación celular. En la Tabla 19-5 se resumen las moléculas de adhesión celular explicadas en este capítulo.
Resumen
Las integrinas son los receptores principales que utilizan las células animales para unirse a la matriz extracelular. Son heterodímeros que actúan como acopladores transmembrana mediando interacciones bidireccionales entre la matriz extracelu107 2
Capítulo 19: Adhesión celular, uniones celulares y matriz extracelular
lar y el citoesqueleto de actina. También actúan como transductores de señales, ac tivando varias vías de señalización intracelular cuando son activadas mediante la unión a la matriz. Una célula puede regular la actividad adhesiva de sus integrinas mediante la alteración de sus lugares de unión o su unión a filamentos de actina.
La pared celular de los vegetales La pared celular es una matriz extracelular compleja que rodea las células vege tales. Fue la gruesa pared celular del corcho, visible con un microscopio rudi mentario, la que en 1663 permitió a Robert Hooke distinguir con claridad las cé lulas y darles después dicho nombre. Las paredes de las células vegetales colindantes, unidas entre sí formando la planta (Figura 19-64), son generalmen te gruesas, fuertes, y, lo más importante de todo, más rígidas que la matriz celu lar sintetizada por las células animales. Durante la evolución de estas paredes relativamente rígidas, que pueden tener muchos micrómetros de grosor, las cé lulas vegetales primitivas perdieron la capacidad para desplazarse y adoptaron un estilo de vida sedentario que ha persistido en todas las plantas hasta nuestros días.
La com posición de la pared celular depende del tipo celular41 En una planta pluricelular, la mayoría de células se producen en regiones deno minadas meristemos, como se verá en el Capítulo 21. Estas nuevas células gene ralmente son pequeñas en comparación con su tamaño final, y para poder cre cer posteriormente, sus paredes, denominadas paredes celulares primarias,
Figura 19-64 Paredes celulares vegetales. (A) Electronmicrografía de una punta de raíz de un junco, mostrando un modelo organizado de células que resulta de una secuencia ordenada de divisiones celulares en células con paredes celulares rígidas. (B) Sección de una pared celular típica separando dos células vegetales adyacentes. Las dos bandas transversales oscuras se corresponden con los plasmodesmos que atraviesan la pared. (A, cortesía de Brian Gunning; B, cortesía de Jeremy Burgess.)
La pared celular de los vegetales
1073
son delgadas y semirrígidas. Cuando se detiene el crecimiento y la pared ya no se ha de expandir más, la pared primaria simplemente se conserva o, más fre cuentem ente, se sintetiza una rígida pared celular secundaria, ya sea por engra samiento de la pared primaria o bien por el depósito de nuevas capas por debajo de las antiguas. Además de su papel estructural o “esquelético”, la pared celular tam bién protege a las células subyacentes e interviene en el transporte de los fluidos dentro de la planta. Cuando las células vegetales se especializan, produ cen tipos de paredes adaptadas especialmente, en función de las cuales pueden reconocerse y clasificarse los distintos tipos celulares. Las paredes celulares primarias de plantas superiores varían enormemente en cuanto a com posición y organización pero todas las matrices extracelulares están diseñadas según un principio común: obtienen su fuerza de tracción de las largas fibras y su resistencia a la compresión de la matriz de proteínas y polisacáridos en la cual se insertan estas fibras. Las fibras de las paredes celulares de las plantas superiores están constituidas generalmente por polisacáridos como la celulosa, la m acromolécula orgánica más abundante de la tierra. El resto de la matriz está constituido predominantemente por otros dos tipos de polisacári dos, hemicelulosa y pectina, y proteínas estructurales. Todas estas moléculas se mantienen unidas mediante una com binación de enlaces covalentes y no covalentes formando una estructura com pleja cuya composición depende del tipo celular.
Las fuerzas de tensión de las paredes celulares perm iten a las células vegetales desarrollar una presión de turgencia42 El medio acuoso extracelular de una célula vegetal está constituido por el fluido contenido en las paredes que rodean la célula. Aunque el fluido de la pared celu lar de la planta contiene más solutos que el agua del medio externo de la planta (el suelo, por ejemplo), es hipotónico respecto al interior celular. Este desequili brio osmótico es la causa de que la célula desarrolle una gran presión hidrostática interna, o presión de turgencia, que empuja hacia la pared celular, exacta mente com o la cámara de una rueda empuja contra la cubierta. La presión de turgencia aumenta justo en el punto donde la célula está en equilibrio osmótico, impidiendo la entrada neta de agua a pesar del desequilibrio salino (véase Panel 11-1, pág. 552). Esta presión es vital para las plantas debido a que es la principal fuerza impulsora de la expansión de la célula durante el crecimiento, y propor ciona la mayor parte de la rigidez mecánica, característica de los tejidos vegeta les vivos. Compárense, por ejemplo, las hojas marchitas de una planta deshidra tada con las hojas turgentes de una planta hidratada correctamente. Es la fuerza m ecánica de la pared celular la que permite a las células vegetales mantener esta presión interna.
La pared celular está constituida por microfibrillas de celulosa entretejidas con una red de polisacáridos y proteínas43 La fuerza de tensión de la pared celular primaria la proporciona la celulosa. Una molécula de celulosa se com pone de una cadena lineal de por lo menos 500 re siduos de glucosa unidos entre sí covalentem ente formando una estructura a modo de cinta, la cual se estabiliza por enlaces de hidrógeno dentro de la cade na. Además, se forman enlaces de hidrógeno entre moléculas adyacentes de ce lulosa que hacen que estas moléculas se unan fuertemente unas con otras for mando series paralelas superpuestas, constituyendo un haz de 60 a 70 cadenas de celulosa, de forma que cada una de ellas tiene la misma polaridad. Estos agregados cristalinos sum am ente ordenados, de muchos micrómetros de longi tud, son las denominadas m icrofibrillas de celulosa. Diferentes grupos de mi crofibrillas están ordenados en capas o láminas, separadas unas de otras por unos 20-40 nm y conectadas por largas moléculas de hemicelulosa, que se unen por enlaces de hidrógeno a la superficie de las microfibrillas. La pared celular
107 4
Capítulo 19 : Adhesión celular, uniones celulares y matriz extracelular
Figura 19-65 Modelo a escala de una porción de pared celular primaria que muestra las dos mayores redes de polisacáridos. Las capas de
lámina media
pectina
pared celular prim aria celulosa m em brana plasmática
microfibrillas de celulosa ordenadas ortogonalmente [verde) forman una red mediante enlaces de hidrógeno con moléculas de hemicelulosa (rojo). Esta red es paralela a la red de polisacáridos de tipo pectina (azul). La red de celulosa y de hemicelulosa absorbe fuerzas de tracción, mientras que la red de pectina resiste la compresión. La celulosa, la hemicelulosa y la pectina se presentan a partes iguales en la pared celular primaria. La lámina media es rica en pectina y cem enta las células adyacentes.
hemicelulosa
primaria está constituida por varias de dichas láminas dispuestas en una red multilaminar (Figura 19-65). Las hem icelulosas son un grupo heterogéneo de polisacáridos ramificados que se unen fuertemente entre sí y a la superficie de cada microfibrilla de celulo sa, facilitando la unión de las microfibrillas formando una red compleja. Sus funciones son análogas a las de las colágenas asociadas a fibrillas que hemos es tudiado anteriormente. Existen muchos tipos de hemicelulosas, pero todas ellas presentan una larga estructura lineal central compuesta por un solo tipo de azú car, del cual sobresalen cortas cadenas de otros glúcidos. La composición de azúcares de ambas estructuras varía en función de la especie vegetal y de su es tadio de desarrollo, siendo los glúcidos de la estructura central los que forman enlaces de hidrógeno con las microfibrillas de celulosa. Coexistiendo con esta red de microfibrillas de celulosa y hemicelulosas exis te otra red de polisacáridos entrelazados constituida por pectinas (véase Figura 19-65). Las pectinas constituyen un grupo heterogéneo de polisacáridos ramifi cados que contienen numerosos residuos de ácido galacturónico, cargados ne gativamente. A causa de su carga negativa, las pectinas están muy hidratadas y asociadas a cationes, y se asemejan a los glucosaminglucanos de las células ani males debido a la gran cantidad de espacio que ocupan. Cuando se añade Ca2+ a una solución de moléculas de pectina, produce enlaces cruzados entre ellas que dan lugar a un gel semirrígido (es lo que sucede cuando se añade pectina a un zumo de fruta para obtener jalea). Ciertas pectinas son especialmente abundan tes en la lámina media, región central especializada de la pared que une las pa redes de las células vecinas; se supone que tales puentes de Ca2+ contribuyen a mantener unidos entre sí ios com ponentes de la pared celular. Si son tratados con un agente quelante del Ca2+, todos los tejidos vegetales se disocian en sus com ponentes celulares. Las uniones covalentes también intervienen en la unión de los diferentes componentes de la pared celular vegetal, pero se conoce muy poco acerca de su naturaleza. Además de las dos redes constituidas por polisacáridos, que están presentes en todas las paredes celulares primarias de las plantas, existe una contribución variable de proteínas estructurales. Una clase de estas proteínas contiene gran des cantidades de hidroxiprolina, como la colágena. Se cree que estas proteínas refuerzan la pared y que son producidos en grandes cantidades como una res puesta local al ataque de microorganismos. Durante la diferenciación las células
La pared celular de los vegetales
1075
Figura 19-66 Orientación de las microfíbrillas de celulosa en la pared celular primaria de una célula de zanahoria en crecimiento. Esta electronmicrografía de una réplica sombreada de una pared celular congelada rápidamente y sublimada extensivamente muestra la disposición paralela de las microfíbrillas de celulosa, orientadas perpendicularmente al eje de elongación de la célula. Las microfíbrillas están unidas entre sí y entrelazadas formando un com plejo andamiaje de moléculas de matriz (compárese con Figura 19-65). (Cortesía de Brian Wells y Keith Roberts.)
200
J im
utilizan proteínas estructurales para modificar determinadas regiones de sus paredes, generando así la extensa gama de paredes secundarias especializadas funcionalm ente y que son características de los tipos celulares maduros (véase Panel 1-1, págs. 18-19). Para que una célula vegetal crezca o cam bie de forma, la pared celular tiene que ensancharse o deformarse, pero debido a su estructura cristalina, las microfibrillas de celulosa individuales no pueden estirarse. Estos estiramientos o de formaciones de las paredes celulares deben implicar deslizamiento de unas microfibrillas sobe otras, la separación de microfíbrillas adyacentes, o ambas cosas a la vez. Como veremos a continuación, la dirección en la que se alargan las cé lulas en crecim iento depende de la orientación de las microfíbrillas de celulosa que se oponen a la deformación de la pared primaria, la cual depende a su vez de la orientación de los microtúbulos del córtex celular subyacente cuando se depositó la pared.
presión de turgencia
t
Los microtúbulos orientan la deposición de la pared celular44 La forma final de la célula vegetal en crecimiento, y por lo tanto la forma final de la planta, viene determinada por la expansión celular controlada. La expansión se produce en respuesta a la presión de turgencia en una dirección que depende de la disposición de las microfíbrillas de celulosa en la pared. Por consiguiente, las células anticipan su morfología futura controlando la orientación de las microfibrillas que se depositan en la pared. A diferencia de muchas otras macromoléculas de la matriz, que se sintetizan en el retículo endoplasmático y en el com plejo de Golgi y son secretadas, la celulosa, como el ácido hialurónico, se va prolongando desde la superficie celular mediante un complejo enzimàtico inte gral de la m em brana plasmática (la celulosa sintasa), el cual utiliza precursores de glúcidos unidos a nucleótidos suministrados por el citosol. A medida que se van sintetizando, las cadenas nacientes de celulosa se ensamblan espontánea mente formando microfíbrillas en la superficie extracelular de la membrana plasmática -lo cual da lugar a una capa o lámina en la que todas las microfibrillas tienen más o menos la misma alineación (Figura 19-65). Cada lámina nueva se forma por la parte interior de la ya existente, de manera que la pared está constituida por láminas ordenadas concéntricam ente, situándose la más anti-
1 07 6
Capítulo 19: Adhesión celular, uniones celulares y matriz extracelular
Figura 19-67 La orientación de las microfíbrillas de celulosa de la pared celular influye en la dirección en la que las células se alargan. Las células en (A) y (B) parten con una forma idéntica (representada aquí como cubos) pero con diferente orientación de las microfíbrillas de celulosa de sus paredes. Aunque la presión de turgencia es uniforme en todas las direcciones, la debilidad de la pared celular provoca que cada célula se elongue en una dirección perpendicular a la orientación de las microfíbrillas, las cuales tienen una gran fuerza de tensión. La forma final de un órgano o de un brote viene determinada por la dirección en la que se expanden las células.
(B)
Figura 19-68 Red cortical de gua en la cara externa. La mayor parte de microfibrillas de las células en creci microtúbulos en una cálida vegetal. miento se disponen de manera perpendicular al eje de elongación celular (Figu (A) Sección de una célula de raíz de ra 19-66); aunque la orientación de las microfibrillas de las láminas externas heno mostrando un ordenamiento puede ser diferente, lo que influye de forma predominante en la dirección de la cortical de los microtúbulos que se expansión celular es la orientación de las láminas internas (Figura 19-67). encuentran debajo de la m em brana Una pista importante para comprender cómo se produce esta orientación plasmática. Estos microtúbulos están fue el descubrimiento de que la mayoría de los microtúbulos citoplasmáticos del orientados perpendicularmente al eje córtex de la célula vegetal se disponen con la misma orientación que las microfi longitudinal de la célula. (B) Célula brillas de celulosa que se van depositando en aquella región. Estos microtúbulos aislada de la punta de la raíz de una corticales constituyen lo que se denomina la red cortical, situándose muy próxi cebolla. (C) La misma célula teñida por inmunofluorescencia que muestra el mos a la cara citoplasmática de la membrana plasmática y unidos a ella por pro ordenamiento cortical transversal de teínas mal caracterizadas (Figura 19-68). En muchos tipos y formas de células los microtúbulos. (A, cortesía de Brian vegetales se observa una orientación congruente de la red cortical de microtú Gunning; B y C, cortesía de Kim bulos (en el interior de la membrana plasmática) y las microfibrillas de celulosa Goodbody.) (en la cara externa de esta membrana), y se presenta durante la deposición tanto de la pared celular primaria como de la secundaria. Si la totalidad del sistema de microtúbulos corticales se desensambla m e diante el tratamiento de un tejido vegetal con una droga despolimerizadora de microtúbulos, las consecuencias en la posterior deposición de celulosa no son tan claras como podría esperarse. El tratamiento con la droga no afecta la pro ducción de nuevas microfibrillas de celulosa, y en algunos casos las células pue den continuar depositando nuevas microfibrillas siguiendo la orientación preexis tente. Sin embargo, cualquiera de los cambios que normalmente se producirían en el patrón de depósito de microfibrillas entre las láminas consecutivas está blo queado invariablemente. Aparentemente la orientación de las microfibrillas pre existentes puede propagarse incluso en ausencia de microtúbulos, pero cualquier cambio en la deposición de las microfibrillas de celulosa requiere que existan m i crotúbulos intactos para determinar la nueva orientación. Estas observaciones son coherentes con el siguiente modelo. Se cree que los com plejos que sintetizan la celulosa de la membrana plasmática generan y van segregando las moléculas de celulosa. Probablemente a medida que se sinteti zan las moléculas de celulosa y se autoensamblan formando las microfibrillas, el
La pared celular de los vegetales
1077
extrem os distales de m icrofibrillas de celulosa en la pared preexistente
Figura 19-69 Modelo sobre cómo la orientación cortical de los microtúbulos puede determinar la orientación de las microfibrillas de celulosa que se depositan. Los
m em brana plasmática
ESPACIO EXTRACELULAR
com plejo celulosa sintasa
CITOSOL m icrotùbulo adherido a la m em brana plasmática
extremo distai de cada microfibrilla forma enlaces cruzados con la capa anterior del material de la pared. Sin embargo, durante el crecimiento los extremos proximales de los complejos sintetizadores podrían tener que desplazarse a lo largo de la membrana en la dirección de síntesis. Puesto que las microfibrillas de celulosa en crecimiento son muy rígidas, cada capa de microfibrillas tendería a desplazarse por la membrana en la misma orientación que la capa anterior, y el siguiente com plejo de celulosa sintasa lo haría a lo largo de la trayectoria de las microfibrillas preexistentes. Sin embargo, los microtúbulos pueden cambiar esta dirección pre determinada en la que se desplazan los complejos sintasa: pueden crear barreras en la membrana plasmática que actúen como las orillas de un canal constriñendo el desplazamiento de los complejos sintasa a ejes paralelos (Figura 19-69). Desde este punto de vista la síntesis de celulosa puede tener lugar con independencia de los microtúbulos pero está determinada espacialmente cuando los microtúbulos corticales están presentes ya que definen los dominios de membrana dentro de los cuales el complejo enzimàtico puede moverse. Las células vegetales cambian su dirección de elongación y, por tanto, su fu turo plano de crecim iento y división mediante un repentino cambio en la orien tación de su red cortical de microtúbulos. Puesto que las células vegetales no pueden desplazarse (están aprisionadas por sus paredes), la morfología de un vegetal pluricelular depende del control de la orientación de estos microtúbulos durante su desarrollo. No se sabe cómo se regula la organización de estos m icro túbulos, si bien se ha demostrado que pueden reorientarse rápidamente en res puesta a estímulos extracelulares, incluyendo los factores de crecimiento vege tales de bajo peso molecular tales como el etileno y el ácido giberélico.
Resumen
Las células vegetales están rodeadas por una rígida matriz extracelular, en forma de una pared celular, que es la responsable de la mayoría de las características típi cas del tipo de vida vegetal. La pared celular está constituida por resistentes microfibrillas de celulosa incluidas en una matriz altamente entrecruzada de polisacáridos (principalmente pectinas y hemicelulosa) y glucoproteínas. Una ordenación cortical de microtúbulos puede determinar la orientación de las microfibrillas de celulosa que se depositan, las cuales, a su vez, determinan la manera en que las cé lulas se expanden y por consiguiente la forma final de las células, así como sus pa trones de división celular. 107 8
Capítulo 19 : Adhesión celular, uniones celulares y matriz extracelular
grandes com plejos celulosa sintasa son proteínas integrales de membrana que continuamente sintetizan microfibrillas de celulosa en la cara externa de la membrana plasmática. Los extremos distales de las rígidas microfibrillas se integran en la textura de la pared, mientras que su elongación, en los extremos proximales, empuja el complejo sintasa a lo largo del plano de la membrana. Debido a que la red cortical de los microtúbulos está próxima a la membrana plasmática, confinando los com plejos a surcos m embranosos definidos, la orientación del microtúbulo determina el eje a lo largo del cual se depositan las microfibrillas.
Bibliografía Citas 1. Bolck, G.; Clark, S., eds. Junctional Complexes of Epit helial Cells. Ciba Symposium 125. New York: Wiley, 1987. Farquhar, M.G.; Palade, G.E. Junctional complexes in various epithelia. J. Cell Biol. 17:375-412,1963. Gilula, N.B. Junctions between cells. In Cell Communi cation (R.P. Cox, ed.), pp. 1-29. New York: Wiley, 1974. Goodenough, D.A.; Revel, J.P. A fine structural analysis of intercellular junctions in the mouse liver. ]. Cell Biol 45:272-290,1970. Staehelin, L.A.; Hull, B.E. Junctions between living cells. Sci.Am. 238(5):141-152,1978. 2. Anderson, J.M.; Baida, M.S.; Fanning, A.S. The structure and regulation of tight junctions. Curr. Opin. Cell Biol. 5:772-778,1993. Diamond, J.M. The epithelial junction: bridge, gate and fence. Physiologist 20:10-18,1977. Handler, J.S. Overview of epithelial polarity. Annu. Rev. Physiol 51:729-740,1989. Madara, J.L. Tight junction dynamics: is paracellular transport regulated? Cell 53:497-498,1988. Madara, J.L.; Dharmsathaphorn, K. Occluding junction structure-function relationships in cultured epithe lial monolayer. J. Cell Biol. 101:2124-2133,1985. Schneeberger, E.E.; Lynch, R.D. Structure, function and regulation of cellular tight junctions. Am. J. Physiol. 262-647-661,1992. Simons, K.; Fuller, S.D. Cell surface polarity in epithelia. Annu. Rev. Cell Biol. 1:243-288,1985. van Meer, G.; Gumbiner, B.; Simons, K. The tight junc tion does not allow lipid molecules to diffuse from one epithelial cell to the next. Nature 322:639-641, 1986. 3. Burridge, K.; Fath, K.; Kelly, T.; Nuckolls, G.; Turner, C. Focal adhesions: transmembrane junctions between the extracellular matrix and the cytoskeleton. Annu. Rev. Cell Biol. 4:487-526,1988. Geiger, B.; Ginsberg, D. The cytoplasmic domain of adherens-type junctions. Cell Motil. Cytoskel. 20:1-6, 1991. Geiger, B.; Volk, T.; Volberg, T. Molecular heterogeneity of adherens junctions./. CellBiol. 101:1523-1531,1985. Noirot-Timothee, C.; Noirot, C. Septate and scalariform junctions in arthropods. Int. Rev. Cytol. 63:97-140,1980. Turner, C.E.; Burridge, K. Transmembrane molecular assemblies in cell-extracellular matrix interactions. Curr. Opin. CellBiol. 3:849-853,1991. 4. Buxton, R.S.; Magee, A.I. Structure and interactions of desmosomal and other cadherins. Semin. Cell Biol. 3:157-167,1992. Buxton, R.S., et al. Nomenclature of the desmosomal cadherins./. CellBiol. 121:481-483,1993. Legan, P.K.; Collins, J.E.; Garrod, D.R. The molecular biology of desmosomes and hemidesmosomes: what’s in a name? Bioessays 14:385-393,1992. Schwarz, M.A.; Owaribe, K.; Kartenbeck, J.; Franke, W.W. Desmosomes and hemidesmosomes: constitu tive molecular components. Annu. Rev. Cell Biol. 6:461-491,1990.
Bibliografía
5. Bennett, M.V.L., et al. Gap junctions: new tools, new answers, new questions. Neuron 6:305-320,1991. Beyer, E.C. Gap junctions. Int. Rev. Cytol. 137:1-38, 1993. Furshpan, E.J.; Potter, D.D. Low-resistance junctions between cells in embryos and tissue culture. Curr. Top. Dev. Biol. 3:95-127,1968. 6. Kumar, N.M.; Gilula, N.B. Molecular biology and genet ics of gap junction channels. Semin. Cell Biol. 3:3-16, 1992. Stauffer, K.A.; Unwin, N. Structure of gap junction channels. Semin. CellBiol. 3:17-20,1992. 7. Warner, A. Gap junctions in development-a perspecti ve. Semin. CellBiol. 3:81-91,1992. 8. Bennett, M.V.L.; Verselis, V.K. Biophysics of gap junc tions. Semin. CellBiol. 3:29-47,1992. Sgaz, J.C.; Berthoud, V.M.; Moreno, A.P.; Spray, D.C. Gap junctions: multiplicity of controls in differentia ted and undifferentiated cells and possible functio nal implications. Adv. Second Messenger PhosphoproteinRes. 27:163-198,1993. 9. Deom, C.M.; Lapidot, M.; Beachy, R.N. Plant virus mo vement proteins. Cell 69:221-224,1992. Gunning, B.E.S.; Robards, A.W.; eds. Intercellular Com munication in Plants: Studies on Plasmodesmata. New York: Springer-Verlag, 1976. Lucas, W.J.; Wolf, S.. Plasmodesmata: the intercellular organelles of green plants. Trends Cell Biol. 3:308315,1993. 10. Piggot, R. The Adhesion Molecule Facts Book. San Die go, CA: Academic Press, 1993. 11. Bronner-Fraser, M. Environmental influences on neural crest cell migration./. Neurobiol. 24:233-247,1993. Le Douarin, N.; Smith, J. Development of the peripheral nervous system from the neural crest. Annu. Res. Cell Biol. 4:375-404,1988. 12. Gerisch, G. Univalent antibody fragments as tools for the analysis ofcell interactions in Dictyostelium. Curr. Top. Dev. Biol. 14:243-270, 1980. Hennings, H.; Holbrook, K.A. Calcium regulation of cell cell contact and differentiation of epidermal cells in culture. An ultrastructural study. Exp. Cell Res. 143:127-142,1983. Moscona, A.A.; Hausman, R.E. Biological and biochemi cal studies on embryonic cell-cell recognition . In Cell and Tissue Interactions, Society of General Phy siologists Series (J.W. Lash, M.M. Burger, eds.), Vol. 32, pp. 173-185. New York: Raven Press, 1977. Roth, S.; Weston, J. The measurement of intercellular adhesion. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 58:974-980,1967. 13. Geiger, B.; Ayalon, O. Cadherins. Annu. Rev. Cell Biol. 8:307-332,1992. Takeichi, M. Cadherins: a molecular family important in selective cell-cell adhesion. Annu. Rev. Biochem. 59:237-252,1990. 14. Hynes, R.O. Specificity of cell adhesion in development: the cadherin superfamily. Curr. Opin. Genet. Dev. 2:621-624,1992. Kemler, R. Classical cadherins. Semin. Cell Biol 3:149155,1992. Stappert, J.; Kemler, R. Intracellular associations of ad hesions molecules. Curr. Opin. Neurobiol. 3:60-66, 1993.
1079
15.
16.
17.
18.
19.
20.
Takeichi, M. Cadherin cell adhesion receptors as a morp hogenetic regulator. Science 251:1451-1455,1991. Tsukita, S.; Tsukita, S.; Nagatuchi, A.; Yonemura, S. Mo lecular linkage between cadherins and filaments in cell-cell adherens junctions. Curr. Opin. Cell Biol. 4:834-839,1992. Edelman, G.M.; Crossin, K.L. Cell adhesion molecules: implications for a molecular histology. Annu. Rev. Biochem. 60:155-190, 1991. Grenningloh, G.; Rehm, E.J.; Goodman, C.S. Genetic analysis of growth cone guidance in Drosophila: fasciclin II functions as a neuronal recognition molecu le. Cell 67:45-57,1991. Kintner, C. Molecular bases of early neural develop ment in Xenopus embryos. Annu. Rev. Neurosci. 15:251-284,1992. Walsh, F.S., Doherty, P. Factors regulating th expression and function of calcium-independent cell adhesion molecules. Curr. Opin. Cell Biol. 5:791-796, 1993. Ekblom, P.; Vestweber, D.; Kemler, R. Cell-matrix inter actions and cell adhesion during development. Annu. Rev. Cell Biol. 2:27-48, 1986. Hortsch, M.; Goodman, C.S. Cell and substrate adhe sion molecules in Drosophila. Annu. Rev. Cell Biol. 7:505-557, 1991. Hynes, R.O.; Lander, A.D. Contact and adhesive specifi cities in the associations, migrations, and targeting of cells and axons. Cell 68:303-322,1992. Schweighoffer, T.; Shaw, S. Adhesion cascades: diversity through combinatorial strategies. Curr. Opin. Cell Biol. 4:824-829, 1992. Birk, D.E.; Silver, F.H.; Trelstad, R.L. Matrix assembly. In Cell Biology of Extracellular Matrix (E.D. Hay, ed.), 2nd ed., pp. 221-254. New York: Plenum Press, 1991. Hay, E.D., ed. Cell Biology of Extracellullar Matrix, 2nd ed. New York: Plenum Press, 1991. Kreis, T.; Vale R. Guidebook to the Extracellular Matrix and Adhesion Proteins. Oxford, UK: Oxford Univer sity Press, 1993. Piez, K.A.; Reddi, A.H., eds. Extracellular Matrix Bioche mistry. New York: Elsevier, 1984. Reichardt, L.F.; Tomaselli, K.J. Extracellular matrix mo lecules and their receptors: functions in neural deve lopment. Annu. Rev. Neurosci. 14:531-570,1991. Jackson, R.L.; Busch, S.J.; Cardin, A.D. Glycosaminoglycans: molecular properties, protein interactiosn and role in physiological processes. Physiol. Rev. 71:481539,1991. Quentin, E.; Gladen, A.; Roden, L.; Kresse, H. A genetic defect in the biosynthesis of dermatan sulfate prote oglycan: galactosyltransferase I deficiency in fibro blasts from a patient with a progeroid syndrome. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87:1342-1346,1990. Prehm, P. Hyaluronate is synthesized at plasma mem branes. Biochem. J. 220:597-600, 1984. Toole, B. Proteoglycans and hyaluronan in morphoge nesis and differentiation. In Cell Biology of Extracel lular Matrix (E.D. Hay, ed.), 2nd ed., pp. 305-341. New York: Plenum Press, 1991. Hardingham, T.E.; Fosang, A.J. Proteoglycans: many forms and many functions. FASEB J. 6:861-870, 1992. Hascall, V.C.; Heinegärd, D.K.; Wight, T.N. Proteogly cans: metabolism and pathology. In Cell Biology of Extracellular Matrix (E.D. Hay, ed.), 2nd ed., pp. 149176. New York: Plenum Press, 1991.
1080
21.
22.
23.
24.
25.
26.
27.
28.
Kjellen, L.; Lindahl, U. Proteoglycans: structures and in teractions. Annu. Rev. Biochem. 60:443-475, 1991. Ruoslahti, E. Structure and biology of proteoglycans. Annu. Rev. Cell Biol. 4:229-255, 1988. Flaumenhaft, R.; Rifkin, D.B. The extracellular regula tion of growth factor action. Mol. Biol. Cell 3:10571065,1992. Massagne, J. A helping hand from proteoglycans. Curr. Biol. 2:117-119, 1991. Ruoslahti, E.; Yamaguchi, Y. Proteoglycans as modula tors of growth factor activities. Cell 64:867-869,1991. Wight, T.N.; Kinsella, M.G.; Qwarnström, E.E. The role of proteoglycans in cell adhesin, migration and proli feration. Curr. Opin. Cell Biol. 4:793-801,1992. Bemfield, M., et al. Biology of syndecans: a family of tranmembrane heparan sulfate proteoglycans. Annu. Rev. Cell Biol. 8:365-393,1992. Scott, J.E. Supramolecular organization of extracellular matrix of glycasminoglycans in vitro and in the tis sues. FASEB J. 6:2639-2645, 1992. Burgeson, R.E. New collagens, new concepts. Annu. Rev. Cell Biol. 4:551-577,1988. Kucharz, E.J. The Collagens: Biochemistry and Patho physiology. New York: Springer-Verlag, 1992. Linsenmayer, T.F. Collagen. In Cell Biology of Extracel lular Matrix (E.D. Hay, ed.), 2nd ed., pp. 7-44. New York: Plenum Press, 1991. Mayne, R.; Brewton, R.G. New members of the collagen superfamily. Curr. Opin. Cell Biol. 5:883-890, 1993. Van der Rest, M.; Garrone, R. Collagen family of pro teins. FASEB J. 5:2814-2823, 1991. Olsen, B.R. Collagen biosynthesis. In Cell Biology of Ex tracellular Matrix (E.D. Hay, ed.), 2nd ed., pp. 177220. New York: Plenum Press, 1991. Eyre, D.R.; Paz, M.A.; Gallop, P.M. Cross-linking in col lagen and elastin. Annu. Rev. Biochem. 53:717-748, 1984. Ploetz, C.; Zycband, E.I.; Birk, D.E. Collagen fibril as sembly and deposition in the developing dermis: segmental deposition in extracellular compartments. J. Struct. Biol. 106:73-81, 1991. Prockop, D.J. Mutations in collagen genes as a cause of connective-tissue diseases. N. Engl. J. Med. 326:540546, 1992. Linsenmayer, T.F. Collagen. In Cell Biology of Extracel lular Matrix (E.D. Hay, ed.), 2nd ed., pp. 7-44. New York: Plenum Press, 1991. Van der Rest, M.; Mayne, R. Type IX collagen. In Struc ture and Function of Collagen Types (R. Mayne, R.E. Burgeson, eds.), pp. 195-219. New York: Academic Press, 1987. Stopak, D.; Harris, A.K. Connective tissue morphogen esis by fibroblast traction I. Tissue culture observa tions. Dev. Biol. 90:383-398, 1982. Cleary, E.G.; Gibson, M.A. Elastin-associated microfi brils and microfibrillar proteins. Int. Rev. Connect. Tissue Res. 10:97-209, 1983. Gosline, J.M.; Rosenbloom, J. Elastin. In Extracellular Matrix Biochemistry (K.A. Piez, A.H. Reddi, eds.), New York: Elsevier, 1984. Indik, Z., et al. Structure of the elastin gene and alterna tive splicing of elasin mRNA: implications for human disease. Am. J. Med. Genet. 34:81-90, 1989.
Capítulo 19: Adhesión celular, uniones celulares y matriz extracelular
29.
30.
31.
32.
33.
34.
35.
36.
37.
Ramirez, F.; Pereira, L.; Zhang, H.; Lee, B. The fibrillinmarfan syndrome connection. Bioessavs 15:589-594, 1993. Hynes, R.O. Fibronectins. Sei. Am. 254(6):42-51,1986. Hynes, R.O. Fibronectins. New York: Springer-Verlag, 1989. Mosher, D.R., ed. Fibronectin. New York: Academic Press, 1988. D’Souza, S.E.; Ginsberg, M.H.; Plow, E.F. Arginyl-glycylaspartic acid (RGD): a cell adhesion motif. Trends Biochem. Sei. 16:246-250, 1991. Schwarzbauer, J.E. Alternative ssplicing of fibronectin: three variants, three functions. Bioessays 13:527-533, 1991. Chiquet-Ehrismann, R. Anti-adhesive molecules of the extracellular matrix. Curr. Opin. Cell Biol. 3:800-804, 1991. Erickson, H.P. Tenascin-C, tenascin-R and tenascin-X: a family of talented proteins in search of functions. Curr. Opin. CellBiol. 5:869-876, 1993. Yurchenco, P.D.; Furthmayr, H. Self-assembly of base ment membrane collagen. Biochemistry 23:18391850,1984. Burgeson, R.E., et al. Type VII collagen. In Structure and Function of Collagen Types (R. Mayne, R.E. Burge son, eds.), pp. 145-172. New York: Academic Press, 1990. Inoue, S. Ultrastructure of basement membranes. Int. Rev. Cytol. 117:57-98,1989. Tryggvason, K. The laminin family. Curr. Opin. Cell Biol. 5:877-882, 1993. Yurchenco, P.D.; Schittny, J.C. Molecular architecture of basement membranes. FASEB J. 4:1577-1590,1990. Farquhar, M.G. The glomerular basement membrane: a selective macromolecular filter. In Cell Biology of Ex tracellular Matrix (E.D. Hay, ed.), 2nd ed., pp. 365418. New York: Plenum Press, 1991. Wadsworth, W.G.; Hedgecock, E.M. Guidance of neuroblast migrations and axonal projection in Caenorhabditis elegans. Curr. Opin. Neurobiol. 2:36-41,1992. Birkedal-Hansen, H.; Werb, Z.; Welgus, H.G. Matrix Metalloproteinases and Inhibitors. Stuttgart, Ger.: Gus tav, Fisher, Verlag, 1992. Chen, W.-T. Membrane proteases: roles in tissue remo deling and tumour invasion. Curr. Opin. Cell Biol. 4:802-809, 1992. Anderson, D.C.; Springer, T.A. Leukocyte adhesion defi ciency: an inherited defect in the Mac-1, LFA-1 and P150,95 glyucoprotein. Annu. Rev. Med. 38:175-194, 1987. Brown, N.H. Integrins hold Drosophila together. Bioes says 15:383-390,1993. Ruoslahti, E. Integrins are receptors for extracellular matrix. In Cell Biology of Extracellular Matrix (E.D. Hay, ed.), 2nd ed., pp. 343-364. New York: Plenum Press, 1991. Sastry, S.K.; Horwitz, A.F. Integrin cytoplasmic domains: mediators of cytoskeletal linkages and extra-and in tercellular initiated transmembrane signaling. Curr. Opin. CellBiol. 5:819-831, 1993.
Bibliografía
Solowska, J., et al. Expression of normal and mutant avian integrin subunits in rodent cells. J. Cell Biol. 109:853-861, 1989. Turner, C.E.; Burridge, K. Transmembrane molecular assemblies in cell-extracellular matrix interactions. Curr. Opin. CellBiol. 5:849-853,1991. 38. Burridge, K.; Fath, K.; Kelly, T.; Nuckolls, G.; Turner, C. Focal adhesions: transmembrane junctions between the extracellular matrix and the cytoskeleton. Annu. Rev. CellBiol. 4:487-526,1988. 39. Ginsberg, M.H.; Du, X.; Plow, E.F. Inside-out integrin signalling. Curr. Opin. CellBiol. 4:766-771, 1992. Hynes, R.O. Integrins: versatility, modulation, and sig naling. Curr. Opin. CellBiol. 4:766-771,1992. Hynes, R.O. Integrins: versatility, modulation, and sig naling in cell adhesion. Cell 69:11-25,1992. Phillips, D.R.; Charo, I.F.; Scarborough, R.M. GPIIb-IIIa: the responsive integrin. Cell 65:359-362, 1992. 40. Damsky, C.H.; Werb, Z. Signal transduction by integrin receptors for extracellular matrix: cooperative pro cessing of extracellular information. Curr. Opin. Cell Biol. 5:772-781,1992. Juliano, R.L.; Haskill, S. Signal transduction from the ex tracellular matrix./. CellBiol. 120:577-585, 1993. Schwartz, M.A. Transmembrane signalling by integrins. Trends. CellBiol. 2:304-308, 1992. 41. Bacic, A.; Harris, P.J.; Stone, B.A. Structure and function of plant cell walls. In Biochemistry of Plants: A Compre hensive Treatise (J. Preiss, ed.), Vol. 14: Carbohydrates, pp. 298-371. San Diego, CA: Academic Press, 1988. Fry, S.C. The Growing Plant Cell Wall: Chemical and Metabolic Analysis. New York: Wiley, 1988. Tanner, W.; Loewus, F.A., eds. Encyclopedia of Plant Physiology, New Series, Vol. 13B: Plant Carbohydra tes II, Extracellular Carbohydrates. Heidelberg: Springer-Verlag, 1982. 42. Street, H.E.; Opik, H. The Physiology of Flowering Plants, 3rd ed. London: Edward Arnold, 1984. 43. Bolwell, G.P. Dynamic aspects of the plant extracellular matrix. Int. Rev. Cytol. 146:261-324, 1993. Levy, S.; Staehelin, L.A. Synthesis, assembly and func tion of plant cell wall macromolecules. Curr. Opin. CellBiol. 5:856-862, 1992. Roberts, K. Structures at the plant cell surface. Curr. Opin. CellBiol. 2:920-928, 1990. Varner, J.E.; Lin, L.-S. Plant cell wall architecture. Cell 56:231-239,1989. 44. Brown, R.M. Cellulose microfibril assembly and orien tation: recent developments./. CellSci. (Suppl. 2): 1332,1985. Delmer, D.P. Cellulose biosynthesis. Annu. Rev. Plant Physiol. 38:259-290, 1987. Herth, W. Plant cell wal formation. In Botanical Micros copy (A.W. Robards, ed.), pp. 285-310. New York: Ox ford University Press, 1985. Lloyd, C.W., ed. The Cytoskeleton in Plant Growth and Development. New York: Academic Press, 1982.
1081
Electronmicrografía de barrido de espermatozoides sobre la superficie de un óvulo de erizo de mar. (Por cortesía de Brian Dale.)
Células germinales y fecundación
20 Las v en tajas del sexo Meiosis O ocitos E sperm atozoides Fecu n d ación
P a ra la re p ro d u cció n n o es im p rescin d ib le el sexo. Los o rg an ism o s u n icelu lares p u ed en rep ro d u cirse m e d ia n te u n a sim ple división m itó tica . La m ay o ría d e las p lan tas se p ro p ag a n v e g e ta tiv a m e n te m e d ia n te la fo rm a ció n d e ag reg ad o s p luri celu lares q ue, p o ste rio rm e n te , se se p a ra rá n de la p lan ta m a d re . D e m a n e ra s e m e ja n te en el reino an im al u n a plu ricelular p u ed e p ro d u cir d e sce n d ie n tes p o r g e m a ció n (Figura 2 0 -1 ). Las a n é m o n a s y los g u san o s m a rin o s p u ed en
Hydra
dividirse en d os m itad es, re g e n e ra n d o c a d a u n a de las z o n a s d e la m itad q u e les falta. Así m ism o , existen esp ecies de lag arto s re p re se n ta d a s e x clu siv am en te p o r h em b ras, las cu ales se re p ro d u ce n sin a p a re a m ie n to . A unque e s ta re p ro d u c c ió n a s e x u a l es sim ple y d irecta, d a lu gar a u n a d e sce n d e n cia q ue es g e n é tica m e n te id én tica al o rg an ism o p a te rn o . En ca m b io , la re p ro d u c c ió n se x u a l im p lica la m e z cla d e los g en o m a s p ro ce d e n te s de d os individuos d istintos, p a ra p ro d u cir d escen d ien tes q ue su elen d iferen ciarse g e n é tica m e n te e n tre sí y ta m b ié n de sus d os p ro g en ito res. P a re c e p u es q ue la re p ro d u cció n sexu al h a d e p re se n ta r g ra n d es ven tajas, d ad o q ue h a sido a d o p ta d a p o r la gran m ay o ría de las p lan tas y de los an im ales. M u ch o s p ro ca rio ta s y e u ca rio ta s u n icelu lares in clu so, h a n d e s a rro llado la ca p a cid a d de rep ro d u cirse sexu alm en te. E ste cap ítu lo e stá d ed icad o a la m aq u in aria celu lar de la re p ro d u cció n sexual. A ntes de estu d iar c o n detalle c ó m o a c tú a e s ta m aq u in aria, n o s d e te n d re m o s a co n sid e ra r p o r q ué existe y qué b en eficios a p o rta.
Las ventajas del sexo El ciclo de la re p ro d u cc ió n sexu al su p o n e u n a a lte rn a n cia de g e n e ra cio n e s de célu las h a p lo id e s - c a d a u n a d e las cu ales co n tie n e u n a d o ta ció n sen cilla de c r o m o s o m a s - c o n g e n e ra cio n e s de célu las d ip lo id es - c a d a u n a de las cu ales c o n tien e u n a d o ta ció n d oble d e cro m o s o m a s . La m e z cla de los g e n o m a s se co n sig u e p o r m ed io d e la fusión de d o s célu las h aploid es fo rm an d o u n a célu la diploide. P o sterio rm en te, cu a n d o u n d esce n d ie n te d e la célu la diploide se divide p o r m e dio del p ro ce so d e (Figura 2 0 -2 ) se g e n e ra n n u ev as célu las haploid es. D u ran te la m eio sis y a n te s d e q u e los cro m o s o m a s se a n rep artid o s en co n ju n to s h aploid es, los cro m o s o m a s d e la d o ta ció n diploide in te rca m b ia n DNA m e d ia n te
meiosis
Figura20-1 Fotografía de una Hydra en la que se están formando dos nuevos organismos por gemación Los descendientes, genéticamente idénticos al padre, se separarán de él y vivirán independientemente. (Por cortesía de Amata Hornbruch.)
(flechas).
recombinación génica.
el p ro ce so d e D e e s ta m a n e ra , c a d a célu la de la n u ev a g e n e ra ció n h ap lo id e recib e u n a d o ta ció n g én ica d iferente, de m a n e ra q ue ca d a cro m o s o m a p re se n ta u n o s g en es q ue p ro v ien en de u n a célu la de la g e n e ra ció n h ap loid e an terio r y o tro s d e o tra . Así, a trav és de ciclo s de h aploidía, fusión c e lu
1083
lar, diploidía y meiosis desaparecen las antiguas com binaciones de genes y se crean otras com binaciones nuevas.
En los anim ales pluricelulares, la fase diploide es com pleja y larga m ientras que la haploide es sencilla y corta Las células proliferan mediante divisiones mitóticas. En la mayoría de los orga nismos que se reproducen sexualmente, la proliferación tiene lugar durante la fase diploide. Algunos organismos primitivos, como ciertos tipos de levaduras, son excepcionales en el sentido de que son las células haploides las que prolife ran m itóticam ente mientras que las células diploides, una vez formadas, entran directamente en meiosis. En las plantas ocurre un caso menos extremo, ya que presentan divisiones mitóticas tanto en la fase haploide como en la diploide. Sin embargo, en las plantas más primitivas la fase haploide es muy breve y sencilla, mientras que la diploide ocupa un largo período de desarrollo y proliferación. Casi todos los animales pluricelulares, incluidos los vertebrados, se encuentran durante la práctica totalidad del ciclo vital en un estadio diploide: las células ha ploides tiene una corta existencia, no se dividen y están altamente especializa das para realizar la fusión sexual (Figura 20-3). Las células haploides que están especializadas para la fusión sexual reciben el nombre de gametos. Típicam ente se forman dos tipos de gametos: uno es grande e inmóvil y se denomina oocito (o huevo ) y el otro es pequeño y móvil y se denomina espermatozoide (Figura 20-4). Durante la fase diploide que sigue a la fusión de los gametos, las células proliferan y se diversifican formando un or ganismo pluricelular complejo. En la mayoría de los animales se puede estable cer una distinción útil entre las células de la línea germinal, de la que derivará la siguiente generación de gametos, y las células somáticas, que forman el resto del organismo y mueren sin dejar progenie. En cierto sentido, las células som áti cas únicam ente existen para ayudar a las células de la línea germinal (células germinales) a sobrevivir y propagarse.
organism os diploides
organism os haploides <8>
©
APAREAMIENTO
I 0
I
i
O
6
esperm atozoide óvulo haploide haploide
zigoto diploide
------- 1 1-----1
MEIOSIS
FECUNDACIÓN
I
I
células haploides zigoto diploide
t
G
MITOSIS
O
G
0
MITOSIS
ÁAAA
GGGCOGOG organism os haploides organism os diploides EUCARIOTAS SUPERIORES
1 08 4
CIERTOS EUCARIOTAS INFERIORES
Capítulo 2 0 : Células germinales y fecundación
LAS CÉLULAS HAPLOIDES SE FUSIONAN FORMANDO UNA CÉLULA DIPLOIDE
LA CÉLULA DIPLOIDE SE DIVIDE FORMANDO CÉLULAS HAPLOIDES
Figura 20-2 Ciclo vital sexual. Implica una alternancia de generaciones de células haploides y diploides.
Figura 20-3 Células haploides y diploides en el ciclo vital de eucarjotas superiores y algunos eucariotas inferiores. Las células de los organismos eucariotas superiores proliferan durante la fase diploide, formando un organismo pluricelular; sólo los gametos son haploides. En algunos eucariotas inferiores, en cambio, las células haploides proliferan, y la única célula diploide es el zigoto, que existe transitoriamente después del apareamiento. Las células haploides se han dibujado en rojo y las diploides en azul.
Figura 20-4 Electronmicrografía de barrido de un oocito de almeja con numerosos espermatozoides dispuestos en su superficie. A pesar de que se han unido al óvulo muchos espermatozoides, únicam ente uno de ellos lo fecundará, com o discutimos más adelante. (Por cortesía de David Epel.)
La reproducción sexual confiere una ventaja competitiva a los organismos que se encuentran en un ambiente que cam bia de form a imprevisible1 La maquinaria de la reproducción sexual es elaborada, y los recursos que se de dican a ella son importantes. ¿Por qué apareció y qué beneficios reporta? M e diante la recom binación genética los individuos sexuados engendran una des cendencia imprevisiblemente desigual, cuyos genotipos tienen, por razones de azar, tantas probabilidades de representar un cambio para mejorar como para empeorar. Por lo tanto, ¿por qué deberían tener los individuos sexuados una ventaja competitiva frente a los individuos que se reproducen de una manera fiable, a través de un proceso asexual? Este problema deja aún perplejos a los ge netistas, pero la conclusión general parece ser que la redistribución de los genes a través de la reproducción sexual ayuda a la especie a sobrevivir en un am bien te que sufre alteraciones imprevisibles. Si un progenitor produce numerosos descendientes, con una gran variedad de com binaciones génicas, existen más probabilidades de que como mínimo uno de sus descendientes tenga el conjun to de características necesarias para sobrevivir. Se han propuesto otras muchas ideas para explicar las ventajas competitivas de la reproducción sexual. Una de ellas sugiere cómo pudo suceder una de las primeras etapas en la evolución del sexo. La evolución depende en gran manera de la com petencia entre individuos que son portadores de alelos, o variantes, al ternativos producidos por mutación de determinados genes. Supongamos que dos individuos de una población sufren mutaciones beneficiosas que afectan a diferentes loci genéticos y, por consiguiente, a dos funciones distintas. En una es pecie estrictamente asexual, cada uno de estos individuos dará lugar a un clon de descendientes mutantes, y los dos clones competirán hasta que uno triunfe sobre el otro: una de las dos mutaciones beneficiosas se difundirá a través de la población mientras que la otra, a la larga, se perderá. Supongamos ahora que uno de los mutantes originales posee una particularidad adicional, determinada genéticamente, que lo capacita para incorporar ocasionalmente genes de otras células. Durante el período competitivo, la adquisición de genes de una célula del clon competidor implica, probablemente, la producción de una célula porta dora de ambas mutaciones beneficiosas. Tal célula tendrá una probabilidad ma yor de éxito que las otras, y dicho éxito asegurará la propagación del rasgo que la
Las ventajas del sexo
1085
capacita para incorporar genes de otras células. De esta forma, esta rudimenta ria capacidad sexual puede haber sido favorecida por la selección natural. Cualquiera que sean los orígenes del sexo, es notable que la práctica totali dad de los organismos com plejos actuales hayan evolucionado a través de gene raciones de reproducción sexual y no de reproducción asexual. La mayoría de los organismos asexuados, aunque son abundantes, han permanecido sencillos y primitivos. Vamos a examinar ahora con detalle los m ecanismos celulares del sexo, em pezando con los procesos de la meiosis, en la que se produce la recom binación genética y las células diploides de la línea germinal se dividen produciendo ga metos haploides. Después consideraremos los gametos en sí mismos y, final mente, el proceso de la fecundación, en el cual los gametos se fusionan forman do un nuevo organismo diploide.
Resumen La reproducción sexual implica una alternancia cíclica de estados diploide y haploide: las células diploides se dividen mediante la meiosis formando células ha ploides y las células haploides procedentes de dos individuos se fusionan de dos en dos formando nuevas células diploides. En el proceso, los genomas se mezclan y recombinan produciendo individuos que poseen nuevas dotaciones de genes. La ma yor parte del ciclo vital de las plantas y de los animales superiores transcurre en la fase diploide, siendo la fase haploide muy corta. La reproducción sexual se ha visto favorecida por la evolución debido a que la recombinación genética al azar aumen ta la probabilidad de producir, como mínimo, algunos descendientes que puedan sobrevivir en un ambiente cuya variabilidad es imprevisible.
Meiosis2 La com prensión de que las células germinales son haploides y, por consiguiente, se tienen que producir mediante un tipo especial de división celular, se obtuvo com o resultado de una observación, la cual también fue una de las primeras en sugerir que los crom osom as son los portadores de la información genética. En 1883 se descubrió que mientras que el huevo fecundado de un determinado gu sano contiene cuatro cromosomas, los núcleos del oocito y del espermatozoide sólo contienen dos cromosomas. La teoría crom osóm ica podría explicar, por tanto, la vieja paradoja de que a menudo las contribuciones materna y paterna al carácter de la progenie parecen iguales, a pesar de la enorme diferencia de ta maño entre el oocito y el espermatozoide (véase Figura 20-4). El hallazgo im plicaba tam bién que las células germinales se han de formar a través de un tipo especial de división nuclear, mediante el cual la dotación crom osóm ica queda dividida exactam ente por la mitad. Este tipo de división se denom ina m eiosis, cuya raíz griega significa disminución. (No existe conexión con el térm ino “m itosis”, el cual proviene del vocablo griego mitos, cuyo signifi cado es hilo, que hace referencia a que cuando los cromosomas se condensan durante la división nuclear -proceso que tiene lugar tanto en las divisiones mitóticas com o en las m eióticas- se parecen a un hilo.) El comportamiento de los crom osom as durante la m eiosis se presentó m ucho más complejo de lo que se esperaba. Por ello no fue hasta el inicio de la década de 1930, y como resultado de concienzudos estudios citológicos y genéticos, que pudieron establecerse las principales características de la meiosis.
La meiosis im plica dos divisiones nucleares en lugar de una sola Exceptuando los cromosomas que determinan el sexo (cromosomas sexuales), cada núcleo diploide contiene dos versiones muy semejantes de cada uno de los otros cromosomas (los autosomas), una de los cuales proviene del padre y la otra de la 1086
Capítulo 2 0 : Células germinales y fecundación
madre. Ambas versiones se denominan homólogas, y en la mayoría de las células existen de forma completamente separada, como cromosomas independientes. Cuando cada cromosoma se duplica mediante la replicación del DNA, inicial mente las copias gemelas de los cromosomas completamente replicados perma necen estrechamente asociadas, y se denominan cromátidas hermanas. En una división mitótica (descrita en el Capítulo 18), las cromátidas hermanas se alinean sobre el huso dirigiendo sus fibras cinetocóricas hacia polos opuestos. Cuando las cromátidas hermanas se han separado una de la otra, en la anafase, se denomi nan cromosomas. De esta manera las células hijas formadas por mitosis heredan una copia de cada cromosoma paterno y otra de cada cromosoma materno. Por el contrario, un gameto haploide, producido por divisiones de una célula diploide durante la meiosis, ha de contener la mitad del número original de cro mosomas -u n solo miembro de cada uno de los pares de cromosomas hom ólo gos- de forma que el gameto dispone de la copia paterna o de la copia la materna de cada gen, pero no de ambas. Este requerimiento implica una nueva exigencia de la maquinaria de la división celular; el m ecanismo que se ha desarrollado para conseguir que se produzca esta distribución adicional requiere que los crom oso mas homólogos se reconozcan entre sí y se apareen físicamente antes de alinear se sobre el huso. Este apareamiento de las copias de cada cromosoma paterno y materno es específico de la meiosis. Más adelante discutiremos de qué forma cada cromosoma reconoce a otro de forma correcta. Dado un mecanism o para el apareamiento de los cromosomas homólogos maternos y paternos y su posterior separación sobre el huso, las células podrían, en principio, producir la meiosis mediante la simple modificación de un solo ci clo mitótico celular en el que la duplicación cromosómica (fase S) se omitiera: si los cromosomas homólogos no duplicados se aparearan antes de la fase M, la di visión celular resultante podría producir directamente dos células haploides. Sin embargo, por razones que desconocem os el proceso meiótico actual es más complejo. Antes de que los cromosomas homólogos se apareen, cada uno de ellos se replica produciendo dos cromátidas hermanas, como si se tratara de una división mitótica. Las características típicas de la meiosis sólo se hacen eviden tes después de la replicación del DNA. En lugar de separarse, las cromátidas her manas se comportan com o una unidad, como si la duplicación cromosómica no hubiera tenido lugar: cada uno de los cromosomas homólogos duplicados se em pareja con su compañero, formando una estructura denominada bivalente , que contiene cuatro cromátidas. Las estructuras bivalentes se alinean sobre el huso y, en la anafase, los dos homólogos duplicados (cada uno de ellos formado por dos cromátidas hermanas) se separan, desplazándose hacia polos opuestos. A consecuencia de que las cromátidas hermanas se comportan como una uni dad, cuando la célula meiótica se divide cada célula hija recibe dos copias de uno de los dos homólogos. Por lo tanto, las dos progenies de esta división (divi sión I de la meiosis) contienen una cantidad doble de DNA, pero difieren de las células diploides normales en dos aspectos: ( 1) cada una de las dos copias de DNA de cada cromosoma deriva de uno de los dos cromosomas homólogos pre sentes en la célula original (excepto que se haya producido recom binación gené tica), y (2) estas dos copias se heredan como cromátidas hermanas estrecha mente asociadas, como si fueran un único cromosoma (véase Figura 20-5). Ahora, se puede producir la formación de los verdaderos núcleos de los ga metos de manera bastante sencilla, a través de una segunda división celular, la división II de la meiosis, sin que se produzca otra replicación del DNA. Los cro mosomas se alinean sobre un segundo huso y las cromátidas hermanas se sepa ran como en una mitosis normal produciendo células con un contenido haploi de de DNA. Así pues, la meiosis consta de dos divisiones celulares sucesivas que se producen tras una sola fase de replicación de DNA, por lo que a partir de cada célula que sufre la meiosis se producen cuatro células haploides. En la Figura 206 se comparan la meiosis y la mitosis. A veces el proceso meiótico se desarrolla de manera anormal y los hom ólo gos no se separan -fenóm eno conocido como no-disyuncidn. En este caso, al-
Meiosis
hom ólogo paterno hom ólogo m aterno } REPLICACIÓN DEL DNA
i
AREAMIENTO DE CROMOSOMAS HOMÓLOGOS
LOS PARES HOMÓLOGOS DE CROMOSOMAS DUPLICADOS SE ALINEAN SOBRE EL HUSO
DIVISIÓN CELULAR I DE LA MEIOSIS
Figura 20-5 Acontecimientos que se producen durante la primera división celular de la meiosis. Para mayor claridad únicamente se muestra un par de cromosomas homólogos. El apareamiento de cromosomas homólogos (simplemente “homólogos”) es típico de la meiosis. Cada cromosoma se ha duplicado y se halla unido a su cromátida hermana antes de que se produzca el emparejamiento. Como se muestra mediante la formación de los cromosomas parte de los cuales son rojos y parte son negros, el apareamiento de los cromosomas durante la meiosis produce entrecruzamiento (recombinación génica) entre cromosomas homólogos, como se explica en el texto.
1087
DIVISIÓN CELULAR NORMAL
MEIOSIS hom ólogo paterno hom ólogo m aterno REPLICACION DEL DNA
'I # REPLICACION DEL DNA
"APAREAMIENTO DE CROMOSOMAS HOMÓLOGOS
> '1 0 S PARES HOMOLOGOS DE CROMOSOMAS DUPLICADOS ***. SE ALINEAN SOBRE EL HUSO
LOS CROMOSOMAS DUPLICADOS SE ALINEAN INDIVIDUALMENTE SOBRE EL HUSO
/ 7IW
A
DIVISIÓN CELULAR 11
w ■ M s-
/
i
A. ill
%
'i '
V
DIVISION CELULAR
gunas de las células haploides producidas carecen de algún cromosoma, m ien tras que otras poseen más de una copia. Tales gametos forman embriones anor males, la mayoría de los cuales mueren. Sin embargo, algunos de ellos sobrevi ven: por ejemplo, el síndrome de Down en humanos está causado por una copia extra del crom osom a 21 a causa de la no-disyunción durante las divisiones meióticas I o II.
La redistribución génica aum enta debido al entrecruzamiento entre las cromátidas homólogas no herm anas3 A menos de que se trate de gametos idénticos, los descendientes de los mismos padres nunca son genéticam ente iguales. Ello es debido a que, mucho antes de que se fusionen los dos gametos, se producen dos tipos de redistribuciones génicas durante la meiosis.
108 8
Capítulo 2 0 : Células germinales y fecundación
DIVISION CELULAR
Figura 20-6 Comparación entre las divisiones mitótica y meiótica. Como en la figura anterior, únicam ente se muestra un par de cromosomas homólogos. En la meiosis, tras la replicación del DNA, se requieren dos divisiones nucleares (y celulares) para producir los gametos haploides. Por lo tanto, cada célula diploide que entra en una meiosis da lugar a cuatro células haploides mientras que cada célula diploide que se divide por mitosis produce dos células diploides.
Figura 20-7 Dos contribuciones principales a la redistribución del material génico que se producen durante la meiosis. (A) La distribución independiente de los homólogos paterno y materno durante la primera división meiótica produce 2 " gametos haploides diferentes para un organismo con n cromosomas. Aquí n - 3, por lo que existen 8 gametos diferentes posibles. (B) El entrecruzamiento durante la profase meiótica I intercambia segmentos de cromosomas homólogos, redistribuyendo los genes de los cromosomas. Debido a las muchas diferencias en la secuencia de DNA que siempre existen en cualquier par de homólogos, ambos mecanismos incrementan la variabilidad genética de los organismos que se reproducen sexualmente.
Un tipo de redistribución es una consecuencia de la distribución al azar en tre las células hijas de los distintos homólogos paternos y maternos, durante la división meiótica I, a consecuencia de la cual cada gameto adquiere una dota ción diferente de los cromosomas maternos y paternos. Sólo debido a este pro ceso, un individuo puede, en principio, producir 2n gametos genéticamente di ferentes, donde n es el número haploide de cromosomas (Figura 20-7A). Así, en los humanos, cada individuo puede producir por lo menos 223= 8,4 x 106gametos genéticamente diferentes. Sin embargo, el número real de variantes es mucho más elevado debido a un segundo tipo de distribución, denominada entrecru zamiento crom osóm ico, que tiene lugar durante la meiosis. Se produce durante la larga fase de la división meiótica I, en el cual se intercambian fragmentos de cromosomas homólogos. En cada par de cromosomas humanos se producen por término medio entre dos y tres entrecruzamientos durante esta fase. Este proceso mezcla el contenido genético de cada uno de los cromosomas de los ga metos, tal como se indica en la Figura 20-7B. El entrecruzamiento cromosómico supone la rotura de la doble hélice de DNA de una cromátida materna y de una cromátida paterna homologa, de for ma que se intercambian fragmentos entre dos cromátidas no hermanas de una forma recíproca mediante un proceso conocido como recombinación génica general. Los detalles moleculares de este proceso se estudian en el Capítulo 6. Las consecuencias de cada proceso de recom binación pueden ser observadas citológicamente en las últimas etapas de la división meiótica I, cuando los dos cromosomas están altamente condensados. En esta etapa, las cromátidas her manas están estrecham ente colocadas una junto a otra a lo largo de toda su lon gitud. Los dos homólogos duplicados (materno y paterno) permanecen conecta dos físicamente por unos puntos determinados. Cada uno de estos puntos, llamado quiasma, corresponde a un entrecruzamiento entre dos cromátidas no hermanas (Figura 20-8). En esta etapa de la meiosis, cada par de homólogos duplicados, o bivalente, está unido como mínimo por un quiasma. Muchos bivalentes contienen más de un quiasma, lo cual indica que se pueden producir múltiples entrecruzamientos entre los homólogos.
El apareamiento m eiótico cromosóm ico culmina con la form ación del complejo sinaptoném ico4
tres pares de crom osom as hom ólogos materno paterno
DISTRIBUCION INDEPENDIENTE DE LOS CROMOSOMAS MATERNOS Y PATERNOS HOMÓLOGOS DURANTE LA DIVISIÓN MEIÓTICA I
gam etos posibles (A)
ENTRECRUZAMIENTO DURANTE LA PROFASE DE LA MEIOSIS
\
m aterno
paterno
Durante la primera profase meiótica ocurren complejos cambios morfológicos en los cromosomas cuando se aparean (sinapsis) y cuando empiezan a separarse
quiasma Figura 20-8 Cromosomas homólogos apareados durante la transición hacia la metafase de la división meiótica I. Con anterioridad, durante la profase, se ha producido un único entrecruzamiento que da lugar a un quiasma. Obsérvese que las cuatro cromátidas están dispuestas en dos pares de cromátidas hermanas y que las dos cromátidas de cada par están estrechamente alineadas por su eje longitudinal y unidas por los centrómeros. Por ello, la unidad de cuatro cromátidas recibe el nombre de bivalente.
Meiosis
centrom eros
crom átidas herm anas
1089
PAQUITENO cromátida 1 cromátidas hermanas paternas
cromátidas hermanas maternas
cromátida 2
f\T^énsam blaje def elemento central ~L \ del complejo
cromátida 3 cromátida 4
INTERFASE
DIPLOTENO SEGUIDO DE DIACINESIS
ZIGOTENO T IE M P O
(desinapsis ), durante la primera profase meiótica. Tradicionalmente esta profase está dividida en cinco etapas secuenciales -leptoteno, zigoteno, paquiteno, diplo teno y diacinesis- definidas por estos cam bios morfológicos. El acontecimiento más notable es el inicio de la sinapsis crom osómica íntima en el zigoteno, cuan do entre los dos grupos de cromátidas hermanas de cada bivalente se empieza a desarrollar una estructura compleja, denominada complejo sinaptonémico. Se dice que el paquiteno empieza en cuanto la sinapsis se completa, y generalmen te persiste durante días, hasta que empieza la desinapsis en la fase de diploteno, m om ento en que se observan por primera vez los quiasmas (Figura 20-9). La recom binación génica requiere una estrecha aposición entre los crom o somas recom binantes. El complejo sinaptonémico, que se forma inmediata mente antes del paquiteno y desaparece inmediatamente después, mantiene los crom osom as homólogos unidos y estrecham ente alineados formando un biva lente; se ha sugerido que juega un papel importante en el proceso de recom bi nación. El com plejo sinaptonémico está formado por un largo núcleo proteico, en forma de escalera, en cuyos lados opuestos se hallan los dos homólogos for mando un largo par crom osóm ico lineal. Las cromátidas hermanas de cada ho mólogo se m antienen estrecham ente empaquetadas entre sí, y su DNA se ex tiende desde el mismo lado de la escalera proteica, formando una serie de bucles (Figura 20-10). No se sabe por qué se alinean las zonas homólogas de los cromosomas. Es poco probable que se produzca una conexión continua a lo largo de los crom o somas que interactúan, ya que la crom atina de un homólogo está claramente se parada de la de su compañero en el complejo sinaptonémico. Se ha propuesto que la interacción inicial entre cromosomas homólogos está mediada por inter acciones de pares de bases complementarias del DNA en regiones discretas a lo largo de cada cromosoma. Este reconocim iento puede ocurrir durante el zigote no o incluso antes, cuando los cromosomas todavía no están muy condensados; tras la condensación de los cromosomas, la formación del complejo sinaptoné mico debe empaquetar entre sí las zonas remanentes de los cromosomas.
Se cree que los nódulos de recom binación median los intercam bios de crom átidas5 Aunque el complejo sinaptonémico proporciona la trama estructural necesaria para los acontecim ientos de la recom binación, probablemente no es el m ecanis mo a través del cual ambos cromosomas se mantienen unidos. Se cree que el proceso activo de recom binación se halla mediado por unos grandes nódulos de recom binación, que son grandes ensam blajes que contienen proteínas, de un diámetro de unos 90 nm. (Como referencia, una gran molécula proteica globular de un peso molecular de 400 000 daltons tiene un diámetro de aproximadamen te 10 nm.) Los nódulos de recom binación se hallan situados a intervalos en el complejo sinaptonémico, dispuestos como pelotas de baloncesto sobre una es-
109 0
Capítulo 2 0 : Células germinales y fecundación
Figura 20-9 Curso temporal de la sinapsis y de la desinapsis cromosómica durante la profase meiótica I. Tan sólo se muestra un bivalente. El estadio de paquiteno se define como el período durante el que existe un complejo sinaptonémico completamente formado. En los gametos de los animales hembra el posterior estadio de diploteno es un período enormemente largo de crecimiento celular, durante el cual los cromosomas se hallan descondensados y transcribiendo muy activamente. Ello acaba con la diacinesis -el estado de transición a la metafase- en el cual los cromosomas se vuelven a condensar y cesa la transcripción. En los gametos macho el diploteno y la diacinesis son breves y menos diferenciados.
calera, entre las dos cromátidas hermanas (véase Figura 20-10). Se cree que mar can la localización de una gran “maquinaria de recom binación” multienzimática que une entre sí regiones del DNA de las cromátidas materna y paterna a través del complejo sinaptonémico de 100 nm de anchura. La evidencia de que el nòdulo de recom binación presenta esta función es indirecta: (1) el número total de nódulos es aproximadamente igual al número de quiasmas observados posteriormente en la profase. (2) Los nódulos están dis tribuidos a lo largo del complejo sinaptonémico como lo están los fenómenos de entrecruzamiento. Por ejemplo, como ocurre con los fenómenos de entrecruzamiento, los nódulos se hallan ausentes de las regiones del complejo sinaptoné mico que m antienen unida la heterocromatina. Además, medidas genéticas y citológicas indican que la presencia de un fenómeno de entrecruzamiento impide que ocurra otro fenómeno de entrecruzamiento en cualquier lugar próximo del cromosoma; de forma análoga, generalmente los nódulos no se producen muy próximos unos de otros. (3) Algunas mutaciones de Drosophila causan una dis tribución anormal de los fenómenos de entrecruzamiento a lo largo de los cro mosomas, así como una intensa disminución de la frecuencia de recom bina ción. En estos mutantes se encuentran menos nódulos de recombinación, con una alteración paralela a la de la distribución del entrecruzamiento. Esta corre lación sugiere claramente que la localización de cada fenómeno de entrecruza miento viene determinada por un nodulo de recombinación. (4) Se cree que la recom binación gènica implica una síntesis de una cantidad limitada de DNA en el punto de cada entrecruzamiento (se discute en el Capítulo 6). La autorradiografía mediante el microscopio electrónico muestra cómo los precursores ra diactivos de DNA se incorporan preferentemente en el DNA paquiténico, en los nódulos de recom binación o cerca de ellos. Aproximadamente existen tantos nódulos como fenómenos de recom bina ción, por lo que parece que los nódulos de recombinación son extremadamente eficientes en provocar la recom binación de las cromátidas de homólogos opues tos. Sin embargo aún es muy poco lo que se conoce acerca de su estructura o de su mecanism o de acción.
nòdulo de recombinación
cromatina de las cromátidas hermanas paternas 1 y 2
ejes proteicos (elementos laterales)
cromatina de las cromátidas hermanas maternas 3 y 4
Figura 20-10 Complejo sinaptonémico típico en el que se muestran los elementos laterales y centrales. También se muestra un nódulo de recombinacidn. El esquema sólo muestra una pequeña sección del largo complejo en forma de escalera. En organismos tan diversos como las levaduras y el hombre se forma un complejo sinaptonémico similar; todavía no sabemos nada respecto a las moléculas proteicas que forman este complejo.
Los quiasmas desempeñan un importante papel en la segregación crom osóm ica durante la meiosis Además de mediar la redistribución gènica, parece que el entrecruzamiento cro mosomico es crucial en la mayoría de los organismos para la correcta segregación de los dos homólogos en los núcleos hijos. Ello es debido a que cada quiasma ge nerado por un entrecruzamiento juega un papel análogo al del centròmero en una división mitótica, manteniendo los homólogos materno y paterno unidos al huso hasta la anafase I. En algunos organismos mutantes que presentan una baja frecuencia de entrecruzamientos meióticos, algunos cromosomas no presentan quiasmas. Estos pares no se segregan de manera normal y una alta proporción de los gametos resultantes contienen un exceso o un defecto de cromosomas -lo cual constituye un ejemplo de no-disyunción. Existen, como mínimo, dos diferencias fundamentales entre los procesos de separación de los cromosomas en la división meiótica I y en la mitosis (véase Fi gura 20-6). (1) A lo largo de la mitosis (y en la división meiótica II, la cual se pare ce a una mitosis), las cromátidas hermanas se mantienen unidas únicamente en el centròmero: los cinetocoros (complejos proteicos asociados con los centrómeros; se tratan en el Capítulo 18) de cada cromátida hermana presentan las fibras cinetocóricas dirigidas hacia direcciones opuestas, de forma que durante la anafase las cromátidas son estiradas hacia células hijas diferentes. En la metafase I de la meiosis, por el contrario, los cinetocoros de ambas cromátidas hermanas parecen fusionados de manera que sus fibras presentan la misma orientación y los brazos de las cromátidas hermanas se hallan estrechamente unidos; además, los cromosomas homólogos paterno y materno se mantienen unidos entre sí a través del quiasma. (2) Durante la mitosis (y la división meiótica II) el desplaza-
Meiosis
1091
miento de las cromátidas hacia los polos está mediado por un mecanismo que separa entre sí los dos cinetocoros hermanos (iniciándose la anafase), lo cual permite a las cromátidas hermanas segregarse en células hijas diferentes. En la anafase I de la meiosis, sin embargo, este desplazamiento hacia los polos está iniciado por la ruptura de las fuerzas, poco conocidas, que han permitido m an tenerse unidos entre sí los brazos de las cromátidas hermanas, así como por la disolución de los quiasmas que unían los cromosomas homólogos paterno y materno; consecuentem ente, las cromátidas hermanas permanecen em pareja das pero los homólogos paterno y materno se segregan en células hijas diferen tes. En la Figura 20-11 se ilustran los diferentes sistemas a través de los que se separan los cromosomas en las divisiones meióticas I y II.
Figura 20-11 Comparación de los mecanismos de alineamiento cromosómico (en la metafase) y de separación cromosómica (en la anafase) en las divisiones meióticas I y I I . Los mecanismos implicados en la división meiótica II son los mismos que ocurren en la mitosis (véase Capítulo 18).
LOS BRAZOS DE LAS CROMATIDAS HERMANAS SE SEPARAN anafase m eiótica I
BREVE INTERFASE A LA QUE SIGUE EL ESTABLECIMIENTO DE CINETOCOROS INDIVIDUALES PARA CADA CROMÁTIDA HERMANA
109 2
Capítulo 20 : Células germinales y fecundación
El apareamiento de los cromosomas sexuales asegura que tam bién ellos se segreguen6
RATON LEPTOTENO
Hemos explicado de qué forma los cromosomas homólogos se aparean durante la división meiótica I de forma que luego se segregan cuidadosamente entre las células hijas. Pero, ¿qué sucede con los crom osom as sexuales, que no son ho mólogos en los machos de los mamíferos? Las hembras tienen dos cromosomas X, que se aparean y se segregan de la misma forma que los otros homólogos, pero los machos tienen un cromosoma X y un cromosoma Y, que han de apa rearse durante la primera metafase de la meiosis para que el espermatozoide contenga un cromosoma Y o un cromosoma X pero no ambos o ninguno de ellos. El apareamiento necesario es posible gracias a una pequeña región de ho mología entre los cromosomas X e Y, situada en uno de sus extremos. En esta zona ambos cromosomas se aparean y se entrecruzan durante la primera profa se meiótica. El quiasma correspondiente a esta pequeña recom binación genéti ca es suficiente para mantener apareados los cromosomas X e Y en el huso, de manera que normalmente sólo se forman dos tipos de espermatozoides: unos conteniendo un cromosoma Y, que darán lugar a embriones masculinos, y otros con un cromosoma X, que originarán embriones femeninos.
ZIGOTENO
PAQUITENO
DIPLOTENO DIACINESIS 12
La división m eiótica II es sem ejante a la mitosis Cuando la larga profase I (que puede ocupar más del 90% de la meiosis) ha con cluido, dos divisiones celulares sucesivas, sin que exista ningún período de sínte sis de DNA, concluyen la meiosis (véase Figura 20-6). Todo el ciclo celular meiótico, que concluye con una división meiótica inicial de la célula, se denomina división meiótica I, y es con diferencia más compleja y dura mucho más tiempo que el segundo ciclo de división meiótica, denominado división meiótica II (Figu ra 20-12). Incluso la replicación preparatoria del DNA durante el primer ciclo ce lular tiende a ser mucho más larga que una fase S normal, y las células tienden a mantenerse durante días, meses o incluso años en la primera profase meiótica, dependiendo de las especies y de cuándo se forme el gameto. (Aunque tradicio nalmente se ha denominado profase, esta prolongada fase de la división meiótica I es semejante a la fase G2 de una división celular normal en la que la envoltura nuclear permanece intacta y tan sólo desaparece cuando se inicia la formación de las fibras del huso en la profase I, dando paso a la metafase I.) Después de finalizada la división meiótica I, las membranas nucleares se forman de nuevo alrededor de los dos núcleos hijos, iniciándose una breve in terfase. Durante este período, los cromosomas pueden descondensarse un poco, pero normalmente se condensan de nuevo y empieza la profase II. Durante este intervalo no se produce síntesis de DNA, por lo que en algunos organismos pare ce que los cromosomas pasan casi directamente de una fase de división a la si guiente. En todos los organismos la profase II es breve: la envoltura nuclear se rompe cuando se forma el nuevo huso, tras lo cual se suceden rápidamente la metafase II, la anafase II y la telofase II. Como en la mitosis, en cada cromátida hermana se forma un grupo de fibras cinetocóricas que se extienden en direc ciones opuestas a partir del centròmero. Además, las dos cromátidas hermanas se mantienen unidas en la placa metafàsica hasta que se liberan por la brusca separación de sus cinetocoros durante la anafase (véase Figura 20-11). Así, y a diferencia de la división I, la división II se parece mucho a una mitosis. La única diferencia importante estriba en que en ella existe una sola copia de cada cro mosoma, y no dos. Una vez formadas las envolturas nucleares alrededor de los cuatro núcleos haploides producidos durante la telofase II, la meiosis ha termi nado (véase Figura 20-6). Los principios de la meiosis son los mismos en plantas y en animales, y en machos y en hembras. Sin embargo, la producción de game tos supone algo más que la meiosis, y los procesos necesarios para ello sí son claram ente diferentes para el oocito y el espermatozoide. Como veremos, al final de la meiosis un oocito de vertebrado ya está completamente maduro (y en algu-
Meiosis
(A)
finalización de la división m eiótica I y toda la división m eiótica II
LIRIO
LEPTOTENO
-o 3
ZIGOTENO
PAQUITENO DIPLOTENO DIACINESIS
(B)
finalización de la división "meiótica I y toda la división m eiótica II
Figura 20-12 Comparación de los tiempos necesarios para cada una de las etapas de la meiosis. Se indican los tiempos aproximados para un mamífero macho (ratón) y para el tejido androgénico de una planta (lirio). Los tiempos difieren para los gametos masculino y femenino (espermatozoide y oocito) de una misma especie, así como para los mismos gametos de especies diferentes. Por ejemplo, en un hombre la meiosis dura 24 días, en comparación con los 12 del ratón. Sin embargo, en todos los casos la profase meiótica I es más larga que el resto de las etapas meióticas juntas.
1093
nos casos incluso fecundado), mientras que al final de la meiosis un espermato zoide no ha hecho m ás que empezar su diferenciación.
Resumen Los oocitos y los espermatozoides se forman de la misma manera, a través de la meiosis. En este proceso, dos divisiones celulares sucesivas, posteriores a un ciclo de replicación de DNA, dan lugar a cuatro células haploides a partir de una sola célula diploide. La meiosis está dominada por la profase de la división meiótica I, que pue de ocupar él 90% o más del periodo meiótico total En cuando empieza esta profase, cada cromosoma estáformado por dos cromátidas hermanas estrechamente unidas entre sí. Durante esta prolongada profase I, cuando los cromosomas homólogos se alinean cuidadosamente, ocurren fenómenos de entrecruzamiento cromosómico. Se cree que cada fenómeno de entrecruzamiento está mediado por un gran nòdulo de recombinación y da lugar a la formación de un quiasma, que persiste hasta la anafase I. En la primera división celular meiótica, un miembro de cada par cromosómi co, compuesto aún por cromátidas hermanas unidas, se distribuye a cada célula hija. Luego se produce una segunda división celular, sin replicación del DNA, y cada cromátida hermana se segrega hacia una célula haploide distinta.
Oocitos En todos los em briones de vertebrados, durante las etapas iniciales del desarro llo, determinadas células se diferencian com o progenitoras de los gametos. Estas células germinales primordiales migran hacia las gónadas en desarrollo, deno minadas crestas genitales, que forman los ovarios en las hem bras y los testículos en los machos. Tras un período de proliferación mitótica, estas células sufren una meiosis y se diferencian en gametos maduros -oocitos o espermatozoides. Después, tras el apareamiento y la fusión de un oocito y de un espermatozoide, se inicia la embriogénesis, con la posterior producción en el em brión de nuevas células primordiales, iniciándose nuevamente el ciclo.
El oocito es la única célula de un anim al superior que es capaz de desarrollarse produciendo un nuevo individuo
oocito hum ano
Los óvulos son las células animales más notables, por lo menos en un aspecto: una vez activados, pueden dar lugar a un nuevo individuo completo en tan sólo cues tión de días o semanas. Ninguna otra célula de un animal superior posee esta capa cidad. En general, la activación es una consecuencia de la fecundación -la fusión de un espermatozoide con un oocito. Sin embargo, estrictamente el espermatozoide no es necesario para ello. Un oocito puede ser activado artificialmente mediante procedimientos químicos no específicos o mediante tratamientos físicos; por ejem plo, un oocito de rana puede ser activado pinchándolo con una aguja. Verdadera mente algunos organismos, entre los que se encuentran incluso vertebrados, como algunos lagartos, se reproducen normalmente a través de oocitos que son activados en ausencia de espermatozoides -lo cual se denomina partenogénesis. A pesar de que un huevo da lugar a todos los tipos celulares del organismo adulto (es decir, es totipotente), en sí mismo es una célula altamente especializada, equipada únicamente para la sola función de generar un nuevo individuo. Vamos a considerar ahora brevemente alguna de sus características especiales, antes de dis cutir cómo se desarrolla hasta el momento en el que es apto para la fecundación.
oocito de gallina
Un oocito está altam ente especializado para su desarrollo independiente, presentando grandes reservas nutritivas y una com pleja cubierta protectora7 Los oocitos de la mayoría de los animales son células gigantes, con una gran cantidad de reservas de todos los materiales necesarios para que el desarrollo
109 4
Capítulo 20 : Células germinales y fecundación
O
oocito de rana Figura 20-13 Tamaño real de tres óvulos. El humano tiene un diámetro de 0,1 mm.
inicial del embrión consiga alcanzar el estadio de un nuevo individuo capaz de alimentarse por sí mismo. Antes de alcanzar este punto, la célula gigante se divi de en muchísimas células menores, sin que se produzca crecimiento neto. Los mamíferos son una excepción de este principio, ya que el embrión puede iniciar antes su crecimiento tomando nutrientes de la madre; por ello, un oocito de m a mífero, a pesar de ser una célula grande, no lo tiene que ser tanto como por ejem plo el de una rana o de un ave. Típicamente, los oocitos tienen una forma esférica u ovoide, de un diámetro de unos 100 (im en humanos y en erizos de mar (los cuales com en larvas diminutas), de 1 a 2 mm en anfibios y peces, y de muchos centímetros en aves y reptiles (Figura 20-13). Una célula somática típica, por el contrario, tiene un diámetro de sólo unos 10-20 |jm (Figura 20-14). El citoplasma del oocito contiene reservas nutritivas en forma de vitelo, que es rico en lípidos, proteínas y polisacáridos y que habitualmente se halla en es tructuras discretas denominadas plaquetas vitelinas. En algunas especies cada plaqueta vitelina está rodeada por una mem brana mientras que en otras no lo está. En los óvulos que darán lugar a grandes animales que se desarrollan fuera de la madre, el vitelo puede representar más del 95% del volumen celular m ien tras que en los mamíferos, cuyos embriones son alimentados por la madre, constituye mucho menos, si es que existe. Las cubiertas oocitarias constituyen otra peculiaridad de los oocitos. Son una especialización de la matriz extracelular y están formadas fundamentalmen te por glucoproteínas, algunas de las cuales están segregadas por el oocito y otras por células acompañantes. En muchas especies la cubierta principal es una capa adyacente a la m embrana plasmática del oocito; en los oocitos de los no mamífe ros, tales como los erizos de mar o los pollos, se denominan cubiertas vitelinas mientras que en los oocitos de los mamíferos constituyen la zona pelúcida (Figu ra 20-15). Esta capa protege al oocito de agresiones mecánicas, y en algunos casos actúa como una barrera específica de especie para los espermatozoides, admi tiendo únicamente los de la misma especie o de especies estrechamente relacio nadas (se discute más adelante). A menudo, los oocitos de los no mamíferos pre sentan otras capas exteriores que envuelven la cubierta vitelina, segregadas por células acompañantes o foliculares. Por ejemplo, cuando los óvulos de rana pa san desde el ovario al oviducto (el conducto que los conduce hacia el exterior), se rodean de varias capas adicionales de consistencia gelatinosa segregadas por las células epiteliales que revisten el oviducto. Análogamente, la “clara” (albúmina) y la cáscara de los huevos de gallina se añaden (después de la fecundación) a medi da que los huevos pasan por el oviducto. La cubierta vitelina de los óvulos de los insectos está rodeada de una capa gruesa y resistente denominada corion, segre gada por células foliculares que rodean cada óvulo en el ovario. Muchos oocitos (incluidos los de mamíferos) contienen unos gránulos de secreción especializados situados inmediatamente por debajo de la membrana plasmática, en la zona periférica o córtex del citoplasma del oocito. Cuando el oocito es activado por un espermatozoide, estos gránulos corticales liberan su contenido por exocitosis; el contenido de los gránulos altera la cubierta del ooci to de tal manera que impide que se produzca la fusión de más de un espermato zoide con el oocito (véase más adelante).
célula somática típica
oocito hum ano o de erizo de m ar
oocito típico de rana o de pez 1 mm = 1000 nm Figura 20 -1 4 Tam año relativo de varios óvulos. Se com paran con una célula som ática típica.
Los oocitos se desarrollan por etapas8 Un oocito es un óvulo en desarrollo; su diferenciación en un óvulo maduro (u ovum ) supone series de cambios que se producen en momentos que están coor-
Figura 20-15 La zona pelúcica. (A) Electronmicrografía de barrido de un óvulo de hámster, mostrando la zona pelúcica. En (B), la zona (a la que están unidos muchos espermatozoides) se ha separado para poner de manifiesto la membrana plasmática subyacente del óvulo, que contiene numerosos microvilli. (De D.M. Phillips,/. Ultrastruct. Res. 7 2 :1-12,1980.)
Oocitos
1095
CELULAS GERMINALES PRIMORDIALES
ENTRAN EN LA GÓNADA ♦
OOGONIA
LAS OOGONIAS, DIPLOIDES, SE DIVIDEN REPETIDAMENTE POR MITOSIS EN EL OVARIO
OOCITO PRIMARIO LA DIVISION MEIOTICA I QUEDA DETENIDA EN LA PROFASE, MIENTRAS CRECE EL OOCITO PRIMARIO
DESARROLLO POSTERIOR DEL OOCITO PRIMARIO gránulos corticales
MADURACION DEL OOCITO PRIMARIO: FINALIZACIÓN DE LA DIVISIÓN MEIÓTICA I OOCITO SECUNDARIO DIVISION II DE LA MEIOSIS Oy c/) h>'Q Qy
segundo cuerpo polar
OOCITO MADURO
dinados con las etapas de la meiosis mediante las que las células germinales atraviesan sus dos divisiones finales, altamente especializadas. Los oocitos han desarrollado m ecanism os especiales para detener el proceso de la meiosis: per m anecen suspendidos en la etapa de profase I durante largos períodos de tiem po mientras el oocito aumenta de tamaño y, en muchos casos, vuelven a dete nerse en la m etafase II esperando la fecundación. Los detalles del desarrollo del oocito (oogénesis) varían según la especie, pero las etapas generales son similares, como se muestra en la Figura 20-16. Las células germinales primordiales migran hacia la gónada en formación, convir tiéndose en oogonias , las cuales proliferan mediante ciclos de división celular 1096
Capítulo 2 0 : Células germinales y fecundación
Figura 20-16 Etapas de la oogénesis. Las oog on ias se desarrollan a partir de las células germinales primordiales que al principio de la embriogénesis migran hacia la gónada en desarrollo. Tras un cierto número de divisiones mitóticas, las oogonias empiezan la división meiótica I recibiendo entonces el nombre de oocitos prim arios. En los mamíferos, los oocitos primarios se forman muy temprano (entre los 3 y los 8 meses de gestación en el embrión humano) y permanecen en la profase de la división m eiótica I hasta que la hembra es sexualmente madura. En este momento y de forma periódica un pequeño número de oocitos madura bajo la influencia hormonal, completando la división m eiótica I y constituyéndose en oocitos secu n d arios los cuales, finalmente, pasan por la división m eiótica II y se convierten en óvulos maduros (ova). El momento en el que el oocito es liberado por el ovario y es fecundado varía de una especie a otra. En la mayoría de los vertebrados la maduración de los oocitos se encuentra detenida en la metafase de la meiosis II, y el oocito secundario sólo completa la meiosis II tras la fecundación. Finalmente, todos los cuerpos polares degeneran. En la mayoría de los animales el oocito en desarrollo se halla rodeado por células accesorias especializadas que ayudan a aislarlo y a nutrirlo (no se muestran).
ordinaria durante un período anterior a su diferenciación en oocitos primarios. En este estadio se inicia la primera división meiótica: el DNA se replica de m ane ra que cada cromosoma está compuesto por dos cromátidas, los cromosomas homólogos se emparejan a lo largo de sus ejes longitudinales, y tienen lugar entrecruzamientos entre sus cromátidas. Posteriormente la célula permanece dete nida en la profase de la división I de la meiosis (en un estado equivalente al que hemos señalado antes, de la fase G2 del ciclo de división ordinaria) durante un período de tiempo que varía, desde algunos días hasta varios años, según las es pecies. Durante este largo período (o, en algunos casos, en el inicio de la madu rez sexual), los oocitos primarios sintetizan la cubierta y los gránulos corticales y en el caso de los grandes oocitos de los no mamíferos, acumulan ribosomas, vi telo, glucógeno, lípidos y el mRNA que posteriormente dirigirá la síntesis de las proteínas necesarias para el crecimiento embrionario inicial y para la puesta en marcha del programa de desarrollo. En muchos oocitos las intensas actividades biosintéticas se reflejan en la estructura de los cromosomas, los cuales se des condensan y forman bucles laterales adquiriendo un aspecto “plumulado”, que indica que están en activa síntesis de RNA (se discute en el Capítulo 8). La fase siguiente del desarrollo de los oocitos se denomina maduración oocitaria y generalmente no tiene lugar hasta la madurez sexual, cuando es esti mulada por hormonas. Bajo esta influencia hormonal la célula recupera su pro gresión a través de la división I de la meiosis: los cromosomas vuelven a condensarse, la envoltura nuclear se fragmenta (lo cual se toma como punto de inicio de la maduración) y en la anafase I los cromosomas homólogos replicados se segregan, dando lugar a dos núcleos hijos cada uno de los cuales contiene la mitad del número inicial de cromosomas. Al finalizar la división I, el citoplasma se divide asimétricamente produciendo dos células muy diferentes en tamaño: una de ellas es un pequeño corpúsculo polar, y la otra es un gran oocito secun dario, el precursor del óvulo En esta etapa, cada cromosoma todavía está com puesto por dos cromátidas hermanas. Estas cromátidas no se separan hasta la división II de la meiosis, cuando se distribuyen en dos células mediante un pro ceso que es idéntico a la mitosis, tal como hemos descrito anteriormente. Des pués de esta separación final de los cromosomas, en la anafase II, el citoplasma del gran oocito secundario se divide nuevamente de forma asimétrica produ ciendo un óvulo maduro (u ovum) y un segundo pequeño corpúsculo polar, cada uno de los cuales contiene una dotación haploide de cromosomas (véase Figura 20-16). Debido a estas dos divisiones asimétricas del citoplasma, los óvu los conservan su gran tamaño a pesar de sufrir dos divisiones meióticas. Ambos corpúsculos polares son pequeños y generalmente degeneran. En la mayoría de los vertebrados la maduración oocitaria sigue hasta la metafase de la meiosis II, momento en el que se detiene hasta la fecundación. En la oocitación el oocito secundario detenido es liberado del ovario y, si tiene lugar la fecundación, el oocito es estimulado a completar la meiosis y transformarse en óvulo.
Los oocitos crecen hasta alcanzar su gran tamaño por medio de mecanism os especiales8,9 Una célula som ática de un diámetro de 10 a 20 |im necesita, en general, 24 ho ras para duplicar su masa como preparación para su división celular. A esta ve locidad de biosíntesis esta misma célula necesitaría mucho tiempo para alcan zar la masa miles de veces superior de un oocito de mamífero, de un diámetro de 100 |im, o la masa 105 veces superior de un oocito de insecto, de un diáme tro de 1000 (im. Sin embargo, algunos insectos sólo viven unos cuantos días y consiguen producir óvulos de diámetros que superan incluso las 1000 jim. Es evidente, pues, que los oocitos han de disponer de m ecanism os especiales para alcanzar su gran tamaño. Una estrategia sencilla para crecer rápidamente consiste en disponer de co pias extra de genes. Así, el oocito retrasa el final de su primera división meiótica
Oocitos
1097
mientras crece, manteniendo un duplicado del conjunto diploide de cromoso mas. De esta forma contiene doble cantidad de DNA para sintetizar RNA en com paración con una célula somática en fase del ciclo celular. Algunos oocitos tam bién alcanzan grandes tam años acumulando DNA extra: producen nu merosas copias extra de algunos genes. En el Capítulo 8 hemos señalado que las células somáticas de la mayoría de los organismos necesitan entre 100 y 500 co pias de los genes que codifican los RNA ribosómicos para producir suficiente cantidad de ribosomas para la síntesis proteica. Los oocitos necesitan un núm e ro incluso mayor de ribosomas para atender la síntesis proteica en los m om en tos iniciales de la embriogénesis, por lo que en los oocitos de muchos animales los genes que codifican los RNA ribosómicos son amplificados específicamente; algunos oocitos de anfibios, por ejemplo, contienen entre 1 y 2 millones de co pias de dichos genes. Para su crecimiento, los oocitos pueden depender también de las activida des sintéticas de otras células. El vitelo por ejemplo, un constituyente fundamen tal de los grandes oocitos, se sintetiza habitualmente fuera del ovario y el oocito lo importa. En aves, anfibios e insectos, las proteínas del vitelo son producidas por las células del hígado (o sus equivalentes), que secretan estas proteínas a la sangre. En los ovarios los oocitos importan las proteínas vitelínicas del medio extracelular mediante un proceso de endocitosis mediada por receptor (véase Fi gura 13-28). El soporte nutritivo puede provenir también de células foliculares del ovario. Existen dos tipos celulares accesorios que presentan estas caracterís ticas. En algunos invertebrados algunas de las células progenie de la oogonia no se transforman en oocitos sino en células nodriza. Habitualmente estas células están conectadas al oocito mediante puentes citoplasmáticos a través de los cua les las macromoléculas pueden pasar directamente al citoplasma del oocito (Fi gura 20-17). Las células nodriza de los oocitos de los insectos sintetizan muchos
célula folicular
20 (im
célula nodriza
oocito
puente citoplasm àtico
Figura 20-17 Células nodriza y células foliculares asociadas en un oocito de Drosophila. Las células nodriza y el oocito provienen de una oogonia común, cada una de las cuales genera un oocito y 15 células nodriza (de las cuales en esta figura únicamente se observan 7). Estas células permanecen unidas a través de puentes citoplasmáticos que se han producido por la división celular incompleta. Las células foliculares se desarrollan independientemente a partir de células del mesodermo.
lá m in a .__ basal citoplasm a del oocito
zona pelúcida
células foliculares 10 [im
50 pm
Figura 20 -1 8 Electronm icrograffa de oocitos prim arios en desarrollo en el ovario de conejo. (A) Estadio inicial del desarrollo del oocito primario. No se han desarrollado todavía ni la zona pelúcica ni los gránulos corticales, y el oocito se encuentra rodeado por una monocapa de células foliculares aplanadas. (B) Un oocito primario más maduro, mostrado a una ampliación seis veces m enor porque es mucho mayor que el oocito de (A). Este oocito ha adquirido una fina zona pelúcida y está rodeado de diversas capas de células foliculares y de una lámina basal, que aíslan el oocito de otras células del ovario. El oocito primario junto con sus células foliculares circundantes recibe el nom bre d e fo líc u lo prim ario. Las células foliculares están conectadas entre sí y con el oocito mediante uniones de tipo gap. (Copyright 1979. Urban & Schwarzenberg, Baltimore-Munich. Reproducido con permiso de The Cellular Basis of Mammalian Reproduction, editado por Jonathan Van Blerkom y Pietro Motta. Todos los derechos reservados.)
10 9 8
Capítulo 2 0 : Células germinales y fecundación
de los productos -ribosom as, mRNA, proteínas y otros com puestos- que los ooci tos de los mamíferos han de producir por sí mismos. El otro tipo de células accesorias del ovario que colaboran en la nutrición de los oocitos en desarrollo son células somáticas denominadas células foliculares, que se encuentran tanto en invertebrados como en vertebrados. Se disponen como si se tratara de una capa epitelial alrededor del oocito (Figura 20-18 y véase la Figura 20-17), al que están unidas únicamente a través de uniones de tipo “gap”, las cuales permiten el intercambio de pequeñas moléculas, pero no de macromoléculas. Estas células no pueden proporcionar al oocito macromoléculas ya formadas a través de estas uniones de comunicación, pero pueden colabo rar en el suministro de precursores, de menor tamaño, a partir de los cuales están formadas las macromoléculas. Además, frecuentemente las células foliculares se cretan macromoléculas que contribuyen a la formación de las cubiertas oocitarias, son importadas por el oocito mediante endocitosis o actúan como recepto res de superficie celular del oocito controlando el patrón espacial y las simetrías axiales del huevo (se discute en el Capítulo 21).
Resumen
Los oocitos se desarrollan por etapas a partir de células germinales que migran en la gónada en estadios muy tempranos del desarrollo, transformándose en oogonias. Tras la proliferación mitótica, las oogonias se transforman en oocitos primaríos que inician la división meiótica I, y se paran en la profase durante días o años, dependiendo de las especies. Durante este período de paro de la profase I, los ooci tos primarios crecen, sintetizan una cubierta y acumulan ribosomas, mRNA y pro teínas, a menudo utilizando la ayuda de otras células, como las células accesorias que los rodean. En el proceso de maduración los oocitos primarios completan la di visión meiótica I formando un pequeño corpúsculo polar y un gran oocito secunda rio, el cual progresa hasta la metafase de la división meiótica II. En esta etapa, en muchas especies el oocito se para hasta que es estimulado por la fecundación, com pletando la meiosis e iniciando el desarrollo embriológico.
Espermatozoides En la mayoría de especies sólo existen dos tipos de gametos, y son radicalmente diferentes entre sí. El oocito es una de las células mayores del organismo m ien tras que el espermatozoide suele ser la más pequeña. El óvulo y el espermato zoide están optimizados en sentidos diferentes para la propagación de los genes que transportan. El óvulo es una célula inmóvil y ayuda a la supervivencia de los genes maternos proporcionando grandes reservas de materiales crudos para el crecim iento y desarrollo, así como proporcionando una cubierta protectora efi caz. El espermatozoide, por el contrario, está optimizado para la propagación de los genes paternos utilizando las reservas maternas: habitualmente es altamente móvil y aerodinámico para conseguir velocidad y eficiencia en la tarea de la fe cundación. La com petencia entre los espermatozoides es feroz, y la gran mayo ría de ellos sucumbe en su misión: de los miles de millones de espermatozoides que son liberados durante la vida reproductora de un hombre, muy pocos de ellos conseguirán fecundar un óvulo.
Los espermatozoides están altam ente adaptados para depositar su DNA en un oocito10 Los espermatozoides típicos son células “desguarnecidas”, equipadas con un potente flagelo que los propulsa a través de un medio acuoso, pero carecen de orgánulos citoplasmáticos como ribosomas, retículo endoplasmático o comple jo de Golgi, los cuales son innecesarios para la tarea de ceder el DNA al óvulo. Por otro lado, el espermatozoide presenta muchas mitocondrias colocadas es Espermatozoides
1099
tratégicamente en el lugar donde pueden alimentar el flagelo con mayor eficien cia. El espermatozoide suele estar formado por dos regiones morfológica y fun cionalm ente diferentes, rodeadas por una misma membrana plasmática: la cola, que impulsa al espermatozoide hacia el oocito y le ayuda a penetrar a través de la envoltura del oocito, y la cabeza, que contiene un núcleo haploide condensado (Figura 20-19). El DNA del núcleo está densa y extremadamente empaquetado, de modo que su volumen está reducido al mínimo para el transporte. Los cro mosomas de los espermatozoides de muchas especies carecen de las histonas que presentan las células somáticas y están empaquetados con proteínas de ele vada carga positiva denominadas protaminas. En la cabeza de la mayoría de espermatozoides, en estrecha aposición con el extremo anterior de la envoltura nuclear, se encuentra una vesícula secretora es pecializada, denominada vesícula acrosómica (Figura 20-19). Esta vesícula con tiene enzimas hidrolíticas que ayudan al espermatozoide a atravesar la envoltu ra externa del óvulo. Cuando un espermatozoide entra en contacto con un oocito, el contenido de la vesícula se libera por exocitosis -la denominada reac ción acrosómica; en algunos espermatozoides esta reacción también expone o li bera unas proteínas específicas que colaboran en la unión del espermatozoide a la envoltura del oocito. La cola móvil de un espermatozoide es un largo flagelo cuyo axonema cen tral sale de un corpúsculo basal situado inmediatamente detrás del núcleo. Como ya hemos descrito en el Capítulo 16, el axonema está formado por dos microtúbulos centrales simples rodeados por nueve dobletes de microtúbulos dis puestos ordenadamente. El flagelo de algunos espermatozoides (incluido el de los mamíferos) se diferencia de los otros flagelos en que la ordenación habitual de 9 + 2 del axonema está rodeada además por nueve fibras densas externas compuestas principalmente por quitina (Figura 20-20). Estas densas fibras son rígidas y no contráctiles, y no se sabe qué papel desempeñan en el movimiento activo del flagelo, que está provocado por el deslizamiento de los dobletes adya centes de microtúbulos. El movimiento flagelar está impulsado por la proteína motora dineína, que utiliza la energía de hidrólisis del ATP para hacer deslizar los microtúbulos unos respecto a otros, como se discute en el Capítulo 16; el ATP está generado por mitocondrias altamente especializadas, situadas en la parte anterior de la cola del espermatozoide (denominada la porción media), donde se necesita el ATP (véanse Figuras 20-19 y 20-20).
cabeza
porción media
m itocondria
m em brana plasmática cola
flagelo
10 |im Figura 20-19 Un espermatozoide humano. Se muestra una sección longitudinal.
En muchas especies de m amíferos los espermatozoides se producen de m anera continua11 En los mamíferos existen diferencias importantes en el modo en que se produ cen los oocitos (oogénesis) y también en el sistema en el que se producen los es permatozoides (espermatogénesis). Ya hemos descrito que en la mujer, por ejemplo, la oogonia prolifera únicamente en el feto, entra en meiosis después del parto y se para en forma de oocitos en la primera profase meiótica, que pue de m antenerse durante más de 50 años. Los oocitos maduran a partir de esta do tación estrictam ente limitada y ovulan a intervalos, generalmente uno cada vez, desde el momento de la pubertad. En el hombre, en cambio, la meiosis y la es permatogénesis no empieza en los testículos hasta la pubertad y desde entonces se produce de manera continua en la pared epitelial de unos tubos muy largos, Figura 20-20 Dibujo de la porción media de un espermatozoide humano visto en una sección transversal al m icroscopio electrónico. El núcleo del flagelo está formado por un axonema rodeado por nueve fibras densas. El axonema está formado por dos microtúbulos sencillos rodeados por nueve microtúbulos dobles. La mitocondria (mostrada en verde) está bien situada para proporcionar el ATP necesario para el movimiento flagelar; su estructura espiral, poco habitual (véase Figura 20-19), resulta de la fusión de mitocondrias individuales durante la diferenciación de la espermátida.
1100
Capítulo 20 : Células germinales y fecundación
m icrotúbulos del axonema m itocondria
fibras densas exteriores 0,5 |am
CÉLULA GERMINAL PRIMORDIAL ENTRA EN LA GONADA ♦
ESPERMATOGONIA
LA ESPERMATOGONIA DIPLOIDE SE DIVIDE POR MITOSIS DENTRO DEL TESTÍCULO
ESPERMATOCITO PRIMARIO
z < -o y ¡-
>'2
Figura 20-21 Las diversas etapas de la espermatogénesis. Las esp erm atog on ias se desarrollan a partir de las células germinales primordiales que migran hacia los testículos durante las primeras fases de la embriogénesis. Cuando el animal alcanza la madurez sexual, la espermatogonia empieza a proliferar rápidamente, generando alguna progenie que retiene la capacidad de continuar dividiéndose indefinidamente (como células madre de espermatogonias) y otra progenie (espermatogonia en maduración) que después de un número limitado de ciclos de división normal inician la meiosis hacia esp erm atocitos prim arios. Éstos continúan a través de la división meiótica I hasta transformarse en esp erm atocitos secu n darios. Después de com pletar la división m eiótica II, estos espermatocitos producen esp erm á tid a s haploides que se diferencian pasando a esp erm atozoid es maduros. La espermatogénesis se diferencia de la oogénesis (Figura 20-16) en varios aspectos: ( 1 ) a partir de la pubertad, continuamente existen nuevas células que inician la meiosis, (2 ) cada célula que empieza la meiosis da lugar a cuatro gametos maduros, y no a uno sólo, y (3) los espermatozoides maduros se forman por un proceso elaborado de diferenciación celular que empieza después de que se com plete la meiosis.
DIVISION MEIOTICA I
ESPERMATOCITO SECUNDARIO
O o
cn i— >o Q
ESPERMATIDAS DIFERENCIACION
a s
§
ESPERMATOZOIDES MADUROS
densamente enrollados, que reciben el nombre de túbulos seminíferos. Las célu las germinales inmaduras, denominadas espermatogonias, están situadas alre dedor del borde externo de estos tubos, junto a la lámina basal, donde proliferan continuam ente por ciclos de división celular ordinaria. Algunas de las células hi jas dejan de proliferar y se diferencian a espermatocitos primarios. Estas células entran en la primera profase meiótica, en la que se emparejan con cromosomas homólogos participando en el entrecruzamiento, y después continúan con la di-
Espermatozoides
1101
célula de Sertoli
espermatogonia
làmina basai
X I \I 7t— espermatogonia
'" 0
ìì'
SS
espermatocito primario
200 Mm ni •> espermatocito secundario
!
¡f
I •>
-W—i— espermátida
m K m
^
y i I
espermátida en diferenciación
lámina basal que rodea el túbulo seminífero
células de Leydig
(A)
visión I de la meiosis produciendo dos espermatocitos secundarios, cada uno de los cuales contiene 22 cromosomas autosómicos duplicados y un cromosoma X o Y duplicado. Los dos espermatocitos secundarios progresan a través de la divi sión meiótica II produciendo cuatro espermátidas, cada una de las cuales tiene un número haploide de cromosomas simples. A continuación, estas espermáti das haploides sufren la diferenciación morfológica a espermatozoides (Figura 20-21), que escapan a la luz del túbulo seminífero (Figura 20-22). Seguidamente los espermatozoides pasan al epididimo, un tubo enrollado situado sobre los testículos, donde son almacenados y sufren la maduración final. Un rasgo fascinante de la espermatogénesis es que las células germinales masculinas en desarrollo no completan la división citoplasmàtica (citocinesis) durante la mitosis y la meiosis. En consecuencia, grandes clones de células hijas diferenciadas descendientes de una espermatogonia madura permanecen co nectadas por puentes citoplasmáticos, formando un sincitio (Figura 20-23). Es tos puentes citoplasmáticos persisten hasta el mismo final de la diferenciación de los espermatozoides, cuando son liberados al lumen del túbulo. Esto explica la observación de que los espermatozoides maduros surgen sincrónicamente en cualquier área de un túbulo seminífero. Pero, ¿cuál es la función de esta disposi ción sincital? A diferencia de los oocitos, los espermatozoides sufren la mayor parte de su diferenciación después de que sus núcleos hayan terminado la meiosis, siendo pues haploides. Sin embargo, la presencia de puentes citoplasmáticos significa que cada espermatozoide haploide en desarrollo comparte un citoplasma co mún con sus vecinos, de forma que puede ser abastecido con todos los produc tos de un genoma diploide completo. Así pues, el genoma diploide dirige la dife renciación de los espermatozoides tal como lo hace en la diferenciación de los óvulos.
11 0 2
Capítulo 20 : Células germinales y fecundación
espermatozoide en el lumen
(B)
Figura 20-22 Dibujo muy simplificado de una sección transversal de un túbulo seminífero de un testículo de mamífero. (A) Todos las fases de la espermatogénesis mostradas tienen lugar mientras los gametos en desarrollo están en íntima asociación con las células de Sertoli, que son grandes células que se extienden desde la lámina basal hasta el lumen del túbulo seminífero; son análogas a las células foliculares del ovario. La espermatogénesis depende de la testosterona secretada por las células de Leydig, localizadas entre los túbulos seminíferos. (B) Las espermatogenias en división se encuentrar a lo largo de la lámina basal. Algunas de estas células dejan de dividirse y entran en meiosis convirtiéndose en espermatocitos primarios. Posteriormente los espermatozoides son liberados al lumen. En el hombre, para que un espermatocito complete la meiosis y se transforme en espermátida transcurren 24 días y otras 5 semanas para que se desarrolle hasta espermatozoide. Los espermatozoides sufren una maduración posterior y se vuelven móviles en el epidídimo: sólo entonces son espermatozoides completamente maduros.
espermatogonia
MITOSIS
espermatogonias
I
«
\
f \ 0 J
espermatocitos Primarios
DIVISIÓN MEIÓTICA I
espermatocitos secundarios
Figura 20-23 Puentes citoplasmáticos entre los espermatozoides en desarrollo y sus precursores. La progenie en maduración de una misma espermatogonia permanece conectada entre sí por medio de puentes citoplasmáticos, durante su diferenciación hasta espermatozoides maduros. Para mayor simplicidad sólo se muestran dos espematogonias unidas que inician la meiosis, produciendo ocho espermátidas haploides que se mantienen conectadas. En realidad, el número de células unidas que pasan por las dos divisiones meióticas y que se diferencian juntas, es mucho mayor del que se muestra aquí.
Resumen
Normalmente, un espermatozoide es una célula pequeña, compacta y altamente es pecializada para la tarea de fecundar un óvulo. Mientras que en muchos organis mos hembra el conjunto total de oocitos se produce antes del parto, en los machos las nuevas células germinales entran en meiosis continuamente a partir del inicio de la madurez sexual, y cada esperínatocito primario produce cuatro espermato zoides maduros. La diferenciación de los espermatozoides ocurre después de la meiosis, cuando los núcleos son haploides. Sin embargo las espermatogonias y los espermatocitos en maduración no completan la citocinesis, por lo que la progenie de una espermatogonia se desarrolla en forma de un gran sincitio. Esto permite que la diferenciación esté dirigida por los productos de ambos genes paternos.
Fecundación12 Una vez liberados, tanto el oocito como el espermatozoide están destinados a morir en'cuestión de horas a menos que se encuentren y se fusionen entre sí en el proceso de fecundación. A través de la fecundación, el oocito y el espermato
Fecundación
1103
zoide se salvan: el oocito se activa iniciando su programa de desarrollo, y los nú cleos de los dos gametos se fusionan formando el genoma de un nuevo organis mo. El m ecanism o de la fecundación ha sido ampliamente estudiado en inverte brados marinos, especialmente en el erizo de mar. En estos organismos la fecundación ocurre en el agua del mar, donde se liberan grandes cantidades de espermatozoides y de óvulos. Esta fecundación externa es más fácil de estudiar que la fecundación interna de los mamíferos, la cual ocurre en el conducto re productor de las hembras después del apareamiento. Sin embargo, a finales de los años 1950 resultó posible fecundar óvulos de mamífero (más concretam ente, oocitos secundarios -véase Figura 20-16) in vitro, abriendo la vía de análisis de los procesos celulares y moleculares que se producen en la fecundación de los mamíferos. El progreso en el conocimiento de la fecundación de los mamíferos ha producido beneficios médicos substan ciales: oocitos de mamíferos fecundados in vitro pueden desarrollarse en el inte rior de individuos normales cuando son trasplantados al interior del útero. De esta forma ha sido posible que muchas mujeres que eran estériles gestaran un niño normal. Ahora centrarem os muestra atención sobre la fecundación en m a míferos.
El contacto con la cubierta pelúcida estim ula al espermatozoide a sufrir la reacción acrosóm ica13 De los 300 millones de espermatozoides humanos eyaculados durante un coito, únicamente 200 alcanzarán el lugar de la fecundación en el oviducto. Una vez allí, el espermatozoide ha de migrar a través de la capa de células foliculares que rodean el óvulo y entonces unirse y atravesar la envoltura del óvulo -la zona pe lúcida. Finalmente ha de fusionarse con la membrana plasmática del óvulo. Para ser com petentes en el cumplimiento de estas tareas, normalmente los esperm a tozoides eyaculados de mamíferos han de ser modificados por secreciones del tracto reproductor de las hembras, un proceso denominado c a p a c ita c ió n , que en humanos requiere entre 5 y 6 horas. Parece que la capacitación supone tanto una alteración de la composición de lípidos y glucoproteínas de la membrana plasmática del espermatozoide como un incremento de su metabolismo y movi lidad; el mecanismo de este proceso todavía es poco claro. Cuando un espermatozoide capacitado ha atravesado la capa de células foli culares; se une a la z o n a p e lú c id a (véase Figura 20-15). Habitualmente la zona pelúcida actúa com o una barrera de fecundación entre especies, de forma que a menudo al eliminarla tam bién se elimina la barrera. Por ejemplo, un esperm ato zoide humano fecundará oocitos de hámster si se les ha eliminado previamente la zona pelúcida mediante enzimas específicas; no es sorprendente que tales hí bridos no lleguen a desarrollarse. Sin embargo, los oocitos de hámster liberados de la zona pelúcida se utilizan para estudiar la capacidad de fecundación de es permatozoides humanos in vitro (Figura 20-24). La zona pelúcida de los oocitos de mamífero está compuesta únicamente por tres glucoproteínas. Dos de ellas, ZP2 y ZP3, se ensamblan formando fila mentos, m ientras que la otra, ZP1, entrecruza los filamentos formando una red tridimensional. ZP3 actúa com o receptor del espermatozoide: las unión especí fica de especie de los espermatozoides a la zona pelúcida está mediada por una molécula (que puede ser la enzima galactosil transferasa) de la superficie de la cabeza del espermatozoide, que se une a O-oligosacáridos a ZP3 de la zona pe lúcida. Una vez unido, el espermatozoide es inducido a producir la re a c c ió n a c r o s ó m ic a mediante la cual el contenido del acrosoma se libera por exocitosis (Figura 20-25). Al m enos en el ratón, ZP3 es la que dispara esta reacción acrosó mica, activando un com plejo m ecanismo señalizador intracelular que induce un influjo de Ca2+ en el citosol del espermatozoide que probablemente es el res ponsable de iniciar la exocitosis. La reacción acrosóm ica libera proteasas y hialuronidasa, que son esenciales para la penetración del espermatozoide a través de la zona pelúcida, y expone
11 0 4
Capítulo 20 : Células germinales y fecundación
Figura 20-24 Electronm icrografía de barrido de un espermatozoide humano entrando en contacto con un óvulo de hám ster. La zona pelúcica
del oocito ha sido eliminada, quedando al descubierto la membrana plasmática, que contiene numerosos microvilli. La habilidad de un espermatozoide determinado para penetrar en un oocito de hámster se utiliza como ensayo de fertilidad; una penetración de más del 10-25% de los oocitos se considera un valor normal. (Por cortesía de David M. Phillips.)
Figura 20-25 La reacción acrosóm ica que ocurre cuando un espermatozoide de mamífero fecunda un oocito. Se cree que en el ratón una sola proteína de la zona pelúcida, la ZP3, es la responsable tanto de la unión del espermatozoide como de la inducción de la reacción acrosómica. Obsérvese cómo un espermatozoide de mamífero interacciona tangencialmente con la membrana plasmática del oocito, de modo que la fusión se produce más en el lado que en la punta de la cabeza del espermatozoide. En los ratones, la zona pelúcica es de 7 |j,m de diámetro y el espermatozoide la cruza a una velocidad de aproximadamente 1 nm/min.
otras proteínas de la superficie del espermatozoide que se unen a ZP2, lo cual contribuye a mantener el espermatozoide fuertemente unido a la zona mientras la está perforando. Además, la reacción acrosómica expone una proteína de la mem brana plasmática del espermatozoide que media la unión y la fusión de esta membrana con la del oocito, como veremos a continuación.
La reacción cortical del oocito contribuye a asegurar que sea fecundado por un solo espermatozoide14 A pesar de que a un mismo oocito se le pueden unir muchos espermatozoides, normalmente sólo uno de ellos se fusiona con la membrana plasmática del óvu lo e inocula su núcleo en el citoplasma del oocito. Si se fusiona más de un esper matozoide -situación que recibe el nombre de poliespermia- se forman husos mitóticos adicionales que producen una segregación anormal de los crom oso mas durante la segmentación; se producen células no diploides y rápidamente se detiene el desarrollo. Dos mecanismos son los responsables de conseguir que cada oocito sea fecundado por un solo espermatozoide. Parece que una rápida despolarización de la membrana del oocito, causada por la fusión del primer es permatozoide, impide que otros espermatozoides se fusionen, actuando así como un rápido bloqueo primario de poliespermia. Sin embargo, el potencial de membrana recupera su valor normal muy poco después de la fecundación, de forma que es necesario un segundo mecanismo que asegure un bloqueo secun dario de poliespermia a largo plazo. Este mecanismo está constituido por la re acción cortical del óvulo. Cuando el espermatozoide se fusiona con la membrana plasmática del óvulo, activa la vía de señalización celular de fosfolípidos de inositol (discutido en el Ca pítulo 15) en el óvulo. Esta activación, a su vez, genera un incremento local de la concentración citosólica de Ca2+, que como una onda se esparce por toda la célula. Parece que el incremento del Ca2+ citosólico activa el oocito e inicia la reacción cortical, en la que los gránulos corticales liberan su contenido mediante exocitosis.
Fecundación
1105
Figura 20-26 Dibujo esquemático que ilustra cóm o se cree que la reacción cortical de un óvulo de ratón impide que otros espermatozoides entren en el óvulo. El contenido de los
e s p e r m a t o z o id e u n id o n ú c le o d e l e s p e r m a t o z o id e
3 2 ZP1 ZP
ZP
z o n a p e lú c id a
m e m b r a n a p la s m á tic a d e l o o c ito g r à n u lo c o r tic a l q u e c o n t ie n e e n z im a s h id r o lí tic a s R E A C C IÓ N C O R T IC A L (E X O C IT O S IS )
c o n t e n id o d e l g r à n u lo c o r tic a l, y a s e c r e ta d o
B L O Q U E O DE L A P O L IE S P E R M IA
s e g u n d o e s p e r m a t o z o id e
ZP
2 f r a c c io n a d a
ZP
3 m o d if ic a d a
z o n a p e lú c id a a lte r a d a
Si se incrementa artificialmente la concentración citosólica de Ca2+-directamente mediante una inyección de Ca2+ o indirectamente utilizando un ionóforo de Ca2+ (se discute en el Capítulo 11)- los óvulos de todos los animales estudiados hasta ahora, incluidos los mamíferos, se activan. Por el contrario, impidiendo que los ni veles de Ca2+ se incrementen mediante la inyección de un quelante de Ca2+ como el EGTA, se inhibe la activación del oocito en respuesta a la fecundación. Las enzi mas liberadas por la reacción cortical cambian la estructura de la zona pelúcida, la cual se “endurece”, de forma que el espermatozoide ya no puede unirse a ella, constituyendo un bloqueo secundario tardío de poliespermia. Entre los cambios que tienen lugar en la zona, hay que destacar la degradación proteolítica de ZP2 y la hidrólisis de grupos de azúcares sobre ZP3 (Figura 20-26).
Una proteína de fusión transm em brana de la m em brana plasm ática del espermatozoide cataliza la fusión esperm atozoide-oocito15 Cuando el espermatozoide ha penetrado en la cubierta extracelular del oocito, interactúa con su m em brana plasmática entre las puntas de los microvilli de la superficie del oocito (véase Figura 20-24). Entonces, los microvilli vecinos se
1106
Capítulo 2 0 : Células germinales y fecundación
gránulos corticales, una vez liberado, eliminan los carbohidratos de ZP3 de forma que ya no puede unirse a la membrana plasmática del espermatozoide, y fracciona parcialmente ZP2 endureciendo la zona pelúcida. En conjunto, estos dos cambios proporcionan un bloqueo a la poliespermia.
alargan rápidamente y se agrupan alrededor del espermatozoide asegurando que quede unido fuertemente, de forma que pueda fusionarse con el oocito. Tras la fusión, todo el espermatozoide es transferido al oocito, empezando por la cabeza, a medida que los microvilli son reabsorbidos. En hámsteres parece que una sola proteína transmembrana denominada PH-30, que queda expuesta so bre la superficie del espermatozoide durante la reacción acrosómica, media tan to la unión del espermatozoide a la membrana plasmática del óvulo como la fu sión de ambas membranas plasmáticas. La proteína está compuesta por dos subunidades transmembrana glucosiladas denominadas a y p, que se mantienen unidas entre sí mediante uniones no covalentes (Figura 20-27). El dominio extracelular de la subunidad a contiene una región hidrofóbica de unos 20 residuos de aminoácidos, que se parece a la región fusogénica de proteínas víricas de fusión, que median la fusión de los vi rus revestidos con las células con las que interactúan (se discute en el Capítulo 13). Durante mucho tiempo se ha sospechado que las fusiones inter e intracelulares de mem brana que se producen en las células eucariotas están catalizadas por proteínas de fusión parecidas a las que se presentan en las cubiertas de los virus; PH-30 es la primera de estas proteínas que se conoce con detalle. El dominio amino terminal extracelular de la subunidad p de PH-30 se pare ce a un dominio de algunas proteínas que se unen a las integrinas, los receptores de superficie celular que permiten a las células animales adherirse a la matriz extracelular (se discute en el Capítulo 19). Estas y otras evidencias indirectas su gieren que la subunidad P de PH-30 se une a una integrina de la membrana plas mática del óvulo, contribuyendo así a que el espermatozoide se adhiera a la su perficie del oocito, preparándose para la fusión. A medida que se va conociendo m ejor la biología celular de la fecundación de los mamíferos y se van definiendo las moléculas que participan en las dife rentes etapas del proceso, va siendo posible diseñar nuevas estrategias de contracepción. Por ejemplo, una aproximación que se está estudiado consiste en inmunizar machos o hembras con moléculas necesarias para la reproducción, esperando que los anticuerpos producidos inhiban las actividades de estas mo léculas. Además de las diferentes hormonas y receptores hormonales que parti cipan en la reproducción, ZP3 y PH-30 pueden ser moléculas diana adecuadas para esta estrategia. Una aproximación alternativa podría consistir en adminis trar oligosacáridos o péptidos correspondientes a ligandos, como es el caso del dominio de unión a integrinas de PH-30, que actúen en la fecundación. Peque ñas moléculas de este tipo pueden bloquear la fecundación compitiendo con el ligando normal.
p o s ib le d o m in io de u n ió n a in te g rin a
p o s ib le re g ió n fu s o g é n ic a
re p e tic io n e s s e m e ja n te s a EGF
~| membrana J plasmática del espermatozoide
C IT O S O L
cadena a
cadena
P
Figura 20-27 La proteina PH -30 de la m em brana del espermatozoide de hám ster. Las subunidades a y p,
ambas glucosiladas (no se muestra), se hallan asociadas entre sí de manera no covalente. La similitud de la secuencia de aminoácidos en la misma zona de ambas subunidades, semejante a EGF, sugiere su evolución a partir de una proteina progenitora
El espermatozoide proporciona un centríolo al zigoto16 Una vez fecundado, el óvulo se denomina zigoto. Sin embargo, la fecundación no se completa hasta que los dos núcleos haploides (llamados pronúcleos) se fu sionan y combinan sus cromosomas formando un solo núcleo diploide. En ooci tos fecundados de mamíferos ambos pronúcleos no se fusionan directamente como ocurre en muchas otras especies: se acercan uno a otro pero permanecen independientes hasta que la membrana de cada uno de ellos se rompe en prepa ración para la primera división meiótica (Figura 20-28). En la mayoría de anim a les, incluido el hombre, el espermatozoide contribuye al zigoto con algo más que con su DNA: también aporta un centríolo. El centríolo del espermatozoide entra en el oocito con el núcleo y la cola del espermatozoide, y en algunas especies se replica y colabora en la organización del ensamblaje del primer huso mitótico en el zigoto (véase Figura 20-28). Ello explica por qué a veces aparecen husos multipolares o extramitóticos en casos de poliespermia, en que varios espermatozoi des aportan centríolos al oocito. La fecundación marca el principio de uno de los fenómenos más remarca bles de toda la biología -e l proceso de la embriogénesis, en el cual el zigoto se desarrolla formando un nuevo individuo. Éste es el tema del próximo capítulo.
Fecundación
1107
núcleo haploide del oocito
crom osom as
CITOSOL
centriolo m aterial pericentriolar
anoxem a de la cola del esperm atozoide núcleo haploide del esperm atozoide
LAS ENVOLTURAS NUCLEARES SE INTERDIGITAN, LOS CROMOSOMAS SE HAN DUPLICADO
REPLICACION DE LOS CENTRÍOLOS, LA ENVOLTURA NUCLEAR SE ROMPE
LOS CROMOSOMAS DEL OOCITO Y DEL ESPERMATOZOIDE SE ALINEAN SOBRE UN SOLO HUSO METAFÁSICO
Figura 20 -2 8 Unión de los pronúcleos del espermatozoide y del oocito tras la fecundación en mamíferos. Los
pronúcleos migran hacia el centro del oocito. Cuando se encuentran, sus envolturas nucleares se interdigitan. Los centríolos se replican, las envolturas nucleares se rompen y los cromosomas de ambos gametos se integran en un huso mitótico común, que media la primera división del zigoto. (Adaptado a partir de dibujos sobre electronmicrografías proporcionadas por Daniel Szollósi.)
Resumen
En los mamíferos la fecundación empieza cuando la cabeza de un espermatozoide se une, de una manera específica de la especie, a la zona pelúcida que rodea el óvu lo. Esto induce una reacción acrosómica en el espermatozoide, el cual libera el con tenido de su vesícula acrosómica, incluyendo enzimas que ayudan a que el esper matozoide digiera la zona pelúcida en su camino hasta la membrana plasmática del oocito, para poder fusionarse con ella. La fusión está catalizada por una proteí na transmembrana localizada en la membrana plasmática del espermatozoide. Este proceso activa el oocito para que produzca la reacción cortical, mediante la cual los gránulos corticales liberan su contenido, incluyendo enzimas que alteran la zona pelúcida previniendo así la fusión de otros espermatozoides. El desarrollo del zigoto empieza después de que los pronúcleos haploides del espermatozoide y del óvulo se hayan puesto en contacto, mezclando sus cromosomas hasta form ar un solo núcleo diploide.
Bibliografía General Austin, C.R.; Short, R.V., eds. Reproduction in Mammals: I. Germs Cells and Fertilization, 2nd ed. Cambridge, UK: Cambridge University Press, 1982. Gilbert, S.F. Biología del desarrollo. Barcelona: Ediciones Omega, S.A., 1988. Knobil, E.; Neill, J.D., eds. The Physiology of Reproduction, Vols. 1 and 2. New York: Raven Press, 1988. Metz, C.B.; Monroy, A., eds. Biology of Fertilization, Vols. 13. New York: Academic Press, 1985. Wassarman, P.M. ed. Elements of Mammalian Fertilization. Boca Raton, FL: CRC Press, 1990.
110 8
Capítulo 2 0 : Células germinales y fecundación
Citas 1. Maynard Smith, J. Evolution of Sex. Cambridge, UK: Cambridge University Press, 1978. Williams, G.C. Sex and Evolution. Princeton, NJ: Prince ton University Press, 1975. 2. Evans, C.W.; Dickinson, H.G., eds. Controlling Events in Meiosis. Symposia of the Society for Experimental Biology, Vol. 38. Cambridge, UK: Company of Biolo gists, 1984. Moens, P.B. Meeiosis. New York: Academic Press, 1987. 3. John, B.; Lewis, K.R. The Meiotic Mechanism. Oxford Biology Readers (J.J. Head, ed.). Oxford, UK: Oxford University Press, 1976. Jones, G.H. The control of chiasma distribution. In Con trolling Events in Meiosis (C.W. Evans, H.G. Dickin
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
son, eds.). Symposia of the Society for Experimental Biology, Vol.. 38, pp. 293-320. Cambridge, UK: Com pany of Biologists, 1984. Orr-Weaver, T.L.; Szostak, J.W. Fungal recombination. Microbiol Rev. 49:33-58, 1985. Moses, M.J. Synaptonemal complex. Annu. Rev. Genet. 2:363-412, 1968. Roeder, G.S. Chromosome synapsis and genetic recom bination: their roles in meiotic chromosome segrega tion. Trends Genet. 6:385-389,1990. von Wettstein, D.; Rasmussen, S.W.; Holm, P.B. The sy naptonemal complex in genetic segregation. Annu. Rev. Genet. 18:331-413, 1984. Carpenter, A.T.C. Recombination nodules and synapto nemal complex in recombination-defective females of Drosophila melanogaster. Chromosoma 75:259263, 1979. Carpenter, A.R.C. Gene conversion, recombination no dules, and the initiation of meiotic synapsis. Bioes says 6:232-236, 1987. Buckle, V.; Mondello, C.; Darling, S.; Craig, I.W.; Goodfellow, P.N. Homologous expressed genes in the hu man sex chromosome pairing region. Nature 317: 739-741, 1985. Chandley, AC. Meiosis in man. Trends Genet. 4:79-84,1988. Solari, A.J. The behavior of the XY pair in mammals. Int. Rev. Cytol. 38:273-317,1974. Austin, C.R. The egg. In Reproduction in Mammals: I. Germ Cells and Fertilization (C.R. Austin, R.V. Short, eds.), 2nd ed., pp. 46-62. Cambridge, UK: Cambridge University Press, 1982. Dietl, ]., ed. The Mammalian Egg Coat: Structure and Function. Berlin: Springer-Verlag, 1989. Gilbert, S.F. Developmental Biology, pp. 37-41. Sunder land, MA: Sinauer, 1991. Baker, T.G. Oogenesis and ovulation. In Reproduction in Mammals: I. Germs Cells and Fertilization (C.R. Austin, R.V. Short, eds.), 2nd ed., pp. 17-45. Cambrid ge, UK: Cambridge University Press, 1982. Browder, L.W. Oogenesis. New York: Plenum Press, 1985. Metz, C.B.; Monroy, A., eds. Model Systems and Ooge nesis. Biology of Fertilization, Vol. 1. Orlando, FL: Academic Press, 1985. Gilbert, S.F. Developmental Biology, pp. 812-815. Sun derland, MA: Sinauer, 1991. Spradling, A. Developmental genetics of oogenesis. In Drosophila Development (M. Bate, A. Martinez-Arias, eds.), pp. 1-69. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1993. Bellve, A.R.; O’Brien, D.A. The mammalian spermatozo on: structure and temporal assembly. In Mechanisms and Control of Animal Fertilization (J.F. Hartmann, ed.), pp. 56-137. New York: Academic Press, 1983. Fawcett, D.W.; Bedford, J.M., eds. The Spermatozoon. Baltimore: Urban & Schwarzenberg, 1979. Clermont, Y. Kinetics of sparmatogenesis in mammals: seminiferous epithelium cycle and spermatogonial renewal. Physiol. Rev. 52:198-236,1972.
Bibliografía
Metz, C.B.; Monroy, A., eds. Biology of the Sperm. Bio logy of Fertilization, Vol. 2. Orlando, FL: Academic Press, 1985. Setchell, B.P. Spermatogenesis and spermatozoa. In Re production in Mammals: I. Germ Cells and Fertiliza tion (C.R. Austin, R.V. Short, eds.), 2nd ed., pp. 63101. Cambridge, UK: Cambridge University Press, 1982. 12. Dunbar, B.S.; O’Rand, M.G., eds. A Comparative Over view of Mammalian Fertilization. New York: Plenum Press, 1991. Garbers, D.L. Molecular basis of fertilization. Annu. Rev. Biochem. 58:719-742,1989. Longo, F.J. Fertilization. London: Chapman and Hall, 1987. Metz, C.B.; Monroy, A., eds. The Fertilization Response of the Egg. Biology of Fertilization, Vol. 3. Orlando, FL: Academic Press, 1985. Wassarman, P.M. Early events in mammalian fertiliza tion. Annu. Rev. Cell Biol. 3:109-142, 1987. Yanagimachi, R. Mammalian fertilization. In The Phy siology of Reproduction (E. Knobil, J.D. Neill, eds.), Vol. 1, pp. 135-185. New York: Raven Press, 1988. 13. Florman, H.M.; Babcock, D.F. Progress toward unders tanding the molecular basis of capacitation. In Ele ments of Mammalian Fertilization (P.M. Wassarman, ed.), Vol. 1: Basic Concepts, pp. 105-132. Boca Raton, FL: CRC Press, 1990. Kopf, G.S.; Gerton, G.L. The mammalian sperm acrosome and acrosome reaction. In Elements of Mamma lian Fertilization (P.M. Wassarman, ed.), Vol. 1: Basic Concepts, pp. 153-204. Boca Raton, FL: CRC Press, 1990. Wassarman, P.M.; Mortillo, S. Structure of the mouse egg extracellular coat, the zona pellucida. Int. Rev. Cytol. 130:85-110, 1991. 14. Ducibella, T. Mammalian egg cortical granules and the cortical reaction. In Elements of Mammalian Fertili zation (P.M. Wassarman, ed.), Vol. 1: Basic Concepts, pp. 205-232. Boca Raton, FL: CRC Press, 1990. Jaffe, L.A.; Cross, N.L. Electrical regulation of sperm-egg fusion. Annu. Rev. Physiol. 48:191-200,1986. Wassarman, P.M. Mouse gamete adhesion molecules. Biol. Reprod. 46:186-191, 1992. 15. Blobel, C.P., et al. A potential fusion peptide and an integrin ligand domain in a protein active in sperm-egg fusion. Nature 356:248-252, 1992. 16. Schatten, H., et al. Behavior of centrosomes during ferti lization and cell division in mouse oocytes and in sea urchin eggs. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:105-109, 1986. Sathananthan, A.H., et al. Centrioles in the beginning of human development. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 4806-4810,1991. Szollosi, D., et al. Sperm penetration into inmmature mouse oocytes and nuclear changes during matura tion: an EM study. Biol. Cell 69:53-64,1990.
1109
I.a mosca D rosophila m elan ogaster. (For cortesía de T.B. Lewis.)
Mecanismos celulares del desarrollo
i r
>>,« Movimientos morfogénicos; la forma del mapa corporal Diversificación celular en el embrión animal temprano Memoria celular, determinación celular concepto de valores El gusano nemátodo: los genes , ■ i i desarrollo i ii y controladores del las leyes del comportamiento celular
Drosophila y la genética Un animal o una planta pluricelulares son un clon ordenado de células que con tienen el mismo genoma pero que presentan especializaciones distintas. La es tructura final puede ser enormemente com pleja pero se genera por un limitado repertorio de actividades celulares. Las células crecen, se dividen y mueren. For man uniones m ecánicas y generan fuerzas para sus desplazamientos y movi mientos. Se diferencian mediante la expresión o inhibición de determinados grupos de proteínas. Producen señales moleculares que afectan a las células ve cinas y a su vez responden a señales que las células vecinas les envían. El geno ma, repetido de forma idéntica en todas las células, define las reglas según las cuales las diferentes actividades celulares posibles entrarán en juego. Mediante este proceso, en cada célula se establecen las directrices que conducirán el com plicado proceso del desarrollo pluricelular por el que se genera un organismo adulto a partir de un huevo fecundado. En este capítulo, en lugar de estudiar un organismo en detalle, ilustraremos los principios generales del desarrollo mediante referencias a las especies que m e jor ilustren cada principio. Primero veremos cómo los movimientos y las divisio nes celulares dan forma al embrión animal y cómo se establecen las diferencias entre células según un patrón espacial. Después consideraremos cómo actúa la memoria celular para perpetuar dicho patrón espacial de diferenciación y permite el almacenaje de nuevos detalles a medida que crece el animal. En la parte central del capítulo examinaremos los mecanismos genéticos fundamentales de control, tomando como ejemplo el nemátodo Caenorhabditis elegans y la mosca Drosophi la melanogaster. Veremos cómo la genética molecular ha revelado similitudes no tables en el desarrollo de las más diversos grupos de animales. Debido a que las lombrices y las moscas son primos nuestros, lo que aprendamos a partir de ellos nos proporciona una información crucial sobre el desarrollo de los mamíferos. Las dos últimas partes de este capítulo se pueden leer como módulos sepa rados: revisamos el desarrollo de plantas con flores y nos preguntamos hasta qué punto siguen los mismos principios que rigen el desarrollo animal, y luego revisamos los mecanismos especiales mediante los cuales el sistema nervioso desarrolla su extraordinaria red.
molecular del patrón de formación. I. Génesis del mapa corporal
Drosophila y la genética
molecular del patrón de formación. II. Genes selectores homeóticos y « i J modelaje de las partes del cuerpo El desarrollo vegetal El desarrollo neural
Movimientos morfogénicos y la forma del mapa corporal1 Empezaremos considerando cómo se forma la estructura geométrica de un em brión temprano de vertebrado. Nos centraremos en el desplazamiento de las cé-
1111
lulas hacia sus posiciones correctas. En los apartados siguientes consideraremos la adopción por parte de las células de los caracteres diferenciados correctos. Tradicionalmente se distinguen tres fases en el desarrollo de un vertebrado -y por supuesto de muchas otras clases de animales. Durante la primera fase el huevo fecundado se segmenta y forma muchas células más pequeñas, las cuales se organizan formando un epitelio y realizan una com pleja serie de desplaza mientos, llamados gastrulación y neurulación, que determinan el mapa básico del cuerpo -u n a cavidad intestinal y un tubo neural rudimentarios. Durante la segunda fase se forman los rudimentos de los diversos órganos del cuerpo, tales como las extremidades, los ojos, el corazón, etc.- proceso denominado organo génesis. En la tercera fase las pequeñas estructuras que se han generado de esta forma crecen hasta alcanzar su tamaño adulto. Estas fases no están claramente delimitadas en el tiempo sino que se solapan. La rana Xenopus laevis (Figura 211) nos servirá para seguir el desarrollo de un huevo fecundado hasta el inicio de la organogénesis. Al igual que en otros anfibios, todo el proceso a partir de la fe cundación ocurre fuera de la madre, y el embrión en desarrollo es resistente y fácil de manipular para la experimentación.
La polaridad del em brión de anfibio depende de la polaridad del huevo2 El huevo de Xenopus es una célula grande, aproximadamente de un milímetro de diámetro, rodeada por una cápsula o cubierta extracelular gelatinosa. La m a yor parte del volumen celular está ocupado por plaquetas vitelinas, que son agregados lipoproteicos rodeados por una membrana. El vitelo está concentrado en el extremo inferior del huevo, denominado polo vegetativo; el extremo supe rior se denomina polo animal. Las regiones animal y vegetativa contienen con juntos distintos de moléculas de mRNA, diferentes cantidades de vitelo y de otros com ponentes celulares, y tienen destinos diferentes. En líneas generales, el extremo vegetativo del huevo está destinado a la formación de tejidos internos (particularmente el tubo digestivo), mientras que el extremo animal dará lugar a los tejidos externos (por ejemplo la piel). La fecundación inicia una compleja se rie de desplazamientos que finalmente doblarán la región vegetativa hacia el in terior, formarán el intestino, y a lo largo del proceso establecerán los tres ejes del cuerpo: el anteroposterior, desde la cabeza a la cola; el dorsoventral, de la espal da al vientre; y el mediolateral, desde el plano medio a derecha e izquierda. La asimetría animal-vegetativa de un huevo no fecundado define solamente uno de los dos ejes finales del cuerpo -e l anteroposterior- pero la fecundación desencadena una distorsión del contenido del huevo creando una asimetría adi cional que determina una diferencia dorsoventral: el córtex citoplasmático del huevo, exterior, rico en actina, gira bruscam ente respecto al centro del huevo, de tal modo que el polo animal del córtex se inclina ligeramente hacia la futura cara ventral (Figura 21-2). La dirección del giro viene determinada por el punto de entrada del espermatozoide -quizá por efecto del centrosoma que el espermato-
huevo fecundado
1 mm
1/2 hora, 1 célula
4 horas, 64 células
blástula 6 horas, 10 000 células
gástrula 10 horas, 30 000 células
néurula
32 horas, 170 000 células
Figura 21-1 Sinopsis del desarrollo del huevo de Xenopus laevis desde el huevo recién fecundado hasta el renacuajo autosuficiente. La fotografía superior muestra la rana adulta. Las fases del desarrollo se han dibujado vistas de lado, salvo
en el caso del embrión de 10 horas y del embrión de 19 horas, que se han dibujado desde abajo y desde arriba respectivamente. Salvo los adultos, todos las fases se muestran a la misma escala. (Fotografía por cortesía de Jonathan Slack; dibujos según P.D. Nieuwkoop y J. Faber, Normal table of Xenopus laevis [Daudin]. Amsterdam: North-Holland, 1956.)
1 11 2
Capítulo 2 1 : Mecanismos celulares del desarrollo
Figura 21-2 Primer desplazamiento morfogénico después de la fecundación de un huevo de rana. El córtex del huevo (una capa de escasas mieras de profundidad) gira aproximadamente 30° en relación al centro del huevo, en una dirección determinada por el lugar de entrada del espermatozoide. En las especies que presentan pigmentación en el polo animal, la rotación genera una franja gris creciente (media luna gris) opuesta al punto de entrada del espermatozoide.
POLO AN IM AL
POLO VEGETATIVO
zoide introduce en el óvulo. En muchas especies de anfibios aparece una banda de pigmentación clara, llamada media luna gris, opuesta al punto de entrada del espermatozoide, que es debida a que los gránulos de pigmento se desplazan a causa del giro. En los alrededores de la media luna gris el córtex del hemisferio vegetativo se yuxtapone con la región central del citoplasma del hemisferio ani mal, creando una región especial, crucial para la organización del eje dorsoventral del cuerpo, tal como veremos más adelante. El punto de entrada del espermatozoide corresponde, más o menos, con el futuro vientre; el lado opuesto formará las estructuras de la espalda y el dorso, incluida la médula espinal. Los tratamientos que bloquean la rotación permiten que la segmentación del huevo se produzca con normalidad pero se forma un embrión con un intestino central y sin asimetría dorsoventral.
La segm entación produce muchas células a partir de una célula inicial3 La rotación cortical se completa aproximadamente una hora después de la fe cundación y dispone la escena para la segmentación, en la cual una única y gran célula huevo se subdivide repetidamente por mitosis, dando lugar a muchas cé lulas más pequeñas, o blastóm eros, sin que se produzca cambio en la masa total (Figura 21-3). Para sobrevivir, el embrión ha de alcanzar rápidamente un estado en el que pueda empezar a alimentarse, nadar y escaparse de los depredadores; estas primeras divisiones celulares son extraordinariamente rápidas, con un ci clo de aproximadamente 30 minutos. Parece que la elevada velocidad de replicación del DNA y de la mitosis imposibilita que se produzca transcripción génica (aunque se produce síntesis de proteínas), de forma que la segmentación del
3 horas, 8 células
1 hora, 1 célula
huevo fecundado
Figura 21-3 Etapas de segmentación en X enopus. Los dibujos muestran una serie de visiones laterales. Las fotografías están tomadas desde arriba. Las escisiones subdividen rápidamente el huevo en muchas células más pequeñas. La división celular es sincronizada durante las 12 primeras escisiones, aunque las divisiones son asimétricas, de forma que el número de células vegetativas inferiores, cargadas de vitelo, es menor y son más grandes. Las asimetrías del huevo y los patrones de segmentación varían de unas especies animales a otras. En los mamíferos, cuyos óvulos pequeños y simétricos contienen poco vitelo, las tres primeras escisiones dividen la célula en ocho blastómeros idénticos. En el otro extremo, tenemos como ejemplo el huevo cargado de vitelo de las aves, cuya segmentación no se completa en el vitelo, permaneciendo todos los núcleos adheridos al polo animal; entonces el embrión se desarrolla a partir de un grupo de células situadas encima del vitelo. (Fotografías cortesía de Jonathan Slack.)
fase de 2 células
fase de 4 a 8 células
Movimientos morfogénicos y la forma del mapa corporal
fase de 16 células
blástula 1113
embrión depende casi totalmente de la reservas de RNA, de proteínas y de otros materiales acumulados en el huevo mientras se desarrolló como oocito en el in terior de la madre. La única biosíntesis crucial necesaria es la de DNA, y la extra ordinariamente rápida replicación de DNA es posible gracias a la presencia de un número elevadísimo de orígenes de replicación, muy cercanos entre sí en el DNA cromosómico. Tras aproximadamente 12 ciclos de segmentación (7 horas), la velocidad de la división celular baja bruscam ente y comienza la transcripción del genoma del embrión. Parece que este cambio, denominado la transición de la media blástu la, se inicia debido a que se alcanza una proporción crítica entre DNA y citoplas ma: la transición puede verse acelerada o retrasada si aumentamos o reducimos artificialmente la cantidad de DNA presente en el huevo.
La blástula es una cavidad rodeada por un epitelio4 Desde el inicio, las células del embrión no se unen entre sí sólo mecánicamente, sino que tam bién están acopladas por medio de uniones de tipo gap a través de las que pueden pasar iones y pequeñas moléculas, transportando m ensajes que pueden participar en la coordinación del comportamiento celular. Mientras tan to, en las regiones más externas del embrión existen uniones estancas entre blastómeros que generan una soldadura que aísla el interior del embrión del medio externo. Aproximadamente en la fase de 16 células se empieza a bombear Na+ a través de las m embranas celulares hacia los espacios intercelulares del interior del embrión, y el agua sigue al Na+ como resultado del gradiente de presión os mótica que se produce. Los espacios intercelulares del interior del embrión se agrandan formando una sola cavidad, el b la s to c e le , y ahora el embrión se deno mina b lá s tu la (Figura 21-4). Las células que forman la superficie exterior de la blástula se organizan en una capa epitelial, que será decisiva en la coordinación de su comportamiento posterior.
La gastrulación transform a una esfera hueca de células en una estructura triestratificada con un intestino primitivo5,6 Cuando las células de la blástula han quedado ordenadas formando la capa epi telial, pueden iniciarse los desplazamientos coordinados de la g a s tru la c ió n . Este espectacular proceso transforma la simple esfera hueca de células en una es tructura pluriestratificada, con un tubo digestivo central y una simetría bilateral: como consecuencia de una complicada invaginación, muchas de las células si tuadas en la periferia del huevo se desplazan al interior del mismo. El desarrollo posterior depende de las interacciones entre las tres capas de células, interna, externa, y media que se han generado de esta forma La gastrulación -form ación de un tubo digestivo mediante la invaginación de células situadas en el exterior, hacia el interior del embrión tem prano- es un paso fundamental en el desarrollo de prácticam ente todos los grupos animales. El embrión transparente de erizo de mar proporciona uno de los ejemplos más claros e ilustrativos de este proceso. La Figura 21-5 muestra la secuencia de
11 14
Capítulo 2 1 : Mecanismos celulares del desarrollo
Figura 21-4 La blástula. En esta fase las células forman un epitelio que envuelve una cavidad llena de fluido, el blastocele. Las células se asocian eléctricamente mediante uniones de tipo gap y las uniones estancas cercanas a la superficie externa crean una soldadura que aísla el interior del embrión del medio externo. Obsérvese como en Xenopus la pared del blastocele tiene varias células de grosor y que sólo las células más externas se encuentran fuertemente unidas formando un epitelio.
células m esenquim atosas prim arias en m igración futura boca L tubo ' digestivo pj|¡ futuro tm esqueleto (A)
100 [jm
(E)
(F)
(G)
Figura 21-5 La gastrulación en el erizo de mar. El punto de partida de la gastrulación del erizo de mar es una simple blástula: una capa de cerca de 1000 células que envuelve una cavidad esférica. (A) Una electronmicrografía de barrido muestra el plegamiento interior inicial del epitelio en el polo vegetativo. (B) Un primer grupo de células del mesénquima se liberan del epitelio en el polo vegetativo de la blástula. (C) Estas células se arrastran por la cara interior de la pared de la blástula. (D) Mientras, en el polo vegetativo, el epitelio continúa invaginándose. (E y F) El epitelio continúa su invaginación y se extiende formando un tubo intestinal largo: las célula que se invaginan cambian activamente su empaquetamiento sin alterar demasiado su forma celular normal, convirtiendo así su formación inicial de cúpula aplanada en un tubo digestivo largo y estrecho. Este tipo de movimiento de tejidos, en el que una capa de células se alarga en una dirección al mismo tiempo que se acorta en la otra, es una de las causas principales del remodelaje durante el desarrollo animal y se denomina extensión convergente. Al mismo tiempo, algunas células de la capa epitelial que se invagina proyectan filopodios hacia el interior de la cavidad del blastocele; dichos filopodios entran en contacto con las paredes de la cavidad, se adhieren a ella, y se contraen, contribuyendo así a dirigir el desplazamiento invaginante. (G) El extremo del tubo digestivo entra en contacto con la pared de la blástula en la localización donde aparecerá la futura boca. Aquí se fusionará el epitelio formando un agujero. (A, de R.D. Burke, R.L. Myers, T.L. Sexton, y C. Jackson, Dev.Biol. 146:542-557,1991; B-G según L. Wolpery T. Gustafson, Endeavour 26:85-90, 1967.)
acontecim ientos, comenzando a partir de una sencilla blástula hueca. Esquemá ticamente, las células situadas en el polo vegetativo se invaginan, formando un tubo que finalmente entrará en contacto con el epitelio cerca del polo opuesto del embrión, formando la boca. Mientras tanto, en determinados puntos salen células del epitelio invaginado y se desplazan por el interior de la cavidad del cuerpo formando el tejido conjuntivo embrionario, o mesénquima. En la estructura triestratificada formada por la gastrulación, la lámina inter na, el tubo digestivo primitivo, es el endodermo ; la lámina externa, es decir el epitelio que ha permanecido externo, es el ectodermo; y entre ambos está el mesodermo, la capa más laxa de tejido formada por células mesenquimatosas. Éstas son las tres hojas germinales iniciales características de los animales superiores. La organización del embrión en estas tres capas se corresponde, a grandes ras gos, con la organización del adulto -intestino en el interior, epidermis en el exte rior, y tejido conjuntivo y músculo entre ambos. Globalmente se puede decir que estas tres capas de tejidos adultos derivan respectivamente del endodermo, del ectodermo y del mesodermo, aunque existen excepciones. El proceso de la gastrulación es más complejo en el huevo de Xenopus que en el de erizo de mar. Sin embargo, es importante conocer sus principios básicos ya que los ejes fundamentales del cuerpo de un vertebrado se generan por los desplazamientos de la gastrulación. Los detalles de este proceso se describen en la Figura 21-6. El tejido situado junto a la media luna gris, a un lado del polo ve getativo, juega un papel fundamental. Aquí la gastrulación comienza con una pequeña invaginación que se extiende gradualmente formando el blastoporo -u n a línea de penetración que finalmente se curva rodeando el polo vegetativo. El lugar donde comienza la invaginación define el labio dorsal del blastoporo; este tejido juega un papel importante en las complejas series de movimientos que se producen a continuación y a partir de él se producirán las estructuras
Movimientos morfogénicos y la forma del mapa corporal
1115
POLO ANIM AL
línea media ventral
labio dorsal del blastoporo POLO VEGETATIVO
línea media dorsal
tapón vitelino
ectoderm o (epidermis)
imágenes exteriores
ectoderm o (placa neural)
ectoderm o neural ectoderm o no-neural
blastocele tapón vitelino
vitelo
labio dorsal del blastoporo (A)
1 mm secciones transversales
endoderm o de la cubierta del intestino
m esoderm o
placa lateral endoderm o
notocorda — labio del blastoporo som itos vitelo
(B)
Figura 21 -6 La gastrulación en Xenopus. (A) Las imágenes exteriores (arriba) muestran el embrión como un objeto semitransparente, la visión es lateral; las secciones transversales (abajo) están extraídas del plano medio (el plano en el que se cruzan las líneas dorsales y ventrales). Las direcciones del movimiento celular se indican mediante flechas rojas. La gastrulación se inicia cuando aparece una corta invaginación, el primer signo del futuro blastoporo, en el exterior de la blástula. La invaginación se extiende gradualmente, curvándose alrededor de la blástula hasta que cierra el círculo envolviendo un grupo de células con abundante vitelo (que finalmente quedarán encerradas en el intestino y serán digeridas). Mientras esto ocurre, varias capas de células se repliegan alrededor del labio del blastoporo y se desplazan hacia el interior del embrión. Al mismo tiempo el epitelio externo de la región del polo animal se extiende ocupando el lugar de la capas celulares que se han replegado. Finalmente, el epitelio del hemisferio animal se extiende de esta forma cubriendo la superficie externa del embrión en su totalidad, y a medida que se completa la gastrulación, el círculo del blastoporo se contrae quedando reducido prácticamente a un punto. (B) Mapa del destino de las diferentes zonas del embrión temprano de Xenopus (visto lateralmente) al iniciar la gastrulación, que muestra los orígenes de las células que formarán las tres capas germinales como resultado de los movimientos en la gastrulación. Las distintas partes del mesodermo (placa lateral, somitas y notocorda) derivan de células situadas más profundamente en la franja rayada, de cuyo epitelio se segregarán posteriormente; las otras células, incluidas las más superficiales de la franja rayada, darán lugar al ectodermo (azul y rojo, en la parte superior) o al endodermo (amarillo, parte inferior). En resumen, las primeras células que se pliegan hacia el interior de huevo, es decir que involucionan, efectúan movimientos en el interior del embrión formando las estructuras endodérmicas y mesodérmicas más anteriores, mientras que las últimas células en involucionar forman las estructuras más posteriores. (Según R.E. Keller, /. Exp. Zool. 216:81-101,1981.) dorsales del eje principal del cuerpo. Como ocurre en el erizo de mar, el resulta do final del proceso completo es una estructura triestratificada: un capa de ecto dermo externa, un tubo interno de endodermo formando el rudimento del in testino, y entre ellos un capa de mesodermo. De nuevo, la boca se desarrolla como un orificio formado en un punto anterior en el que el endodermo y el ec todermo entran en contacto directo sin intervención del mesodermo. La transformación que se ha producido durante la gastrulación se puede re sumir dibujando sobre la superficie del embrión, al inicio de la gastrulación, un m apa de destino que indique las regiones destinadas a formar específicamente cada una de las partes del cuerpo del adulto; en la Figura 21-6B se muestra uno de estos mapas.
Los movimientos de gastrulación se organizan alrededor del labio dorsal del blastoporo6,7 El labio dorsal del blastoporo desempeña una función central no sólo en el sen tido geométrico, sino también como fuente de control. Si se secciona el labio dorsal de un blastoporo de un embrión normal al comienzo de la gastrulación y dicho labio se injerta en otro embrión en posición diferente, el embrión receptor
11 16
Capítulo 2 1 : Mecanismos celulares del desarrollo
del dador se injerta en un lugar anorm al en el receptor
invaginación el embrión doble se desarrolla con casi la totalidad de tejidos originarios del receptor
inicia la gastrulación tanto en su propio labio dorsal como en el lugar del injerto (Figura 21-7). Los movimientos de gastrulación del segundo punto conllevan la formación de un segundo conjunto completo de estructuras corporales, de for ma que se obtiene un embrión doble (gemelos siameses). Realizando injertos de este tipo entre especies que tengan células de pig m entación diferente, de manera pueda distinguirse el tejido receptor del tejido implantado, se ha podido demostrar que el labio del blastoporo injertado atrae epitelio receptor hacia su propio sistema de endodermo invaginado y de mesodermo. Evidentemente el labio dorsal del blastoporo proporciona alguna señal (o señales) que coordinan los movimientos de la gastrulación y, directa o indi rectamente, el patrón de especialización de los tejidos de su alrededor. Debido a este papel crucial en la organización de la construcción del eje principal del cuerpo, el labio dorsal del blastoporo es conocido como el Organizador (u Orga nizador de Spemann, su codescubridor). Es el más antiguo y famoso ejemplo de un centro embrionario de señales -u n a función que trataremos más adelante cuando consideremos cómo se controla la diversifícación celular.
Figura 21-7 Papel del Organizador. Diagrama de un experimento que muestra cómo el labio dorsal de un blastoporo (Organizador de Spemann) inicia y controla los movimientos de la gastrulación y cómo, en consecuencia, si se trasplanta organiza la formación de un segundo conjunto de estructuras corporales. La fotografía muestra un renacuajo de axolote bicéfalo y con dos colas resultado de dicho injerto; en X enopus se obtienen resultados muy similares a éste. (Fotografía cortesía de Jonathan Slack.)
Cambios activos del em paquetamiento celular suministran una fuerza conductora para la gastrulación1,6i 8 La gastrulación comienza con cambios en la forma de las células situadas en el blastoporo. En los anfibios estas células reciben el nombre de células en botella: tienen cuerpos anchos y cuellos estrechos que les sirven para anclarse a la su perficie del epitelio (Figura 21-8), y pueden contribuir a curvar el epitelio y ple garlo hacia el interior, produciendo la muesca inicial observada desde el exte rior. Cuando se ha formado este primer pliegue, las células pueden continuar desplazándose al interior de la capa formando el tubo digestivo y el mesodermo. Como en el erizo de mar, parece que el desplazamiento sea guiado por una com binación de mecanismos, aunque el principal de ellos es el re-empaquetamiento de células, especialmente el de las células situadas en la parte dorsal de la zona marginal junto al labio blastoporo (véase Figura 21-8). En este punto se produce la e x te n s ió n co n v e rg e n te . Pequeños fragmentos de tejido de la zona marginal
1 epitelio del polo animal en expansión 2 células m esodérm icas que m igran sobre la capa de fibronectina 3 células en botella que ayudan a curvar el epitelio en invaginación
4 zona m arginal que experim enta la extensión convergente
Movimientos morfogénicos y la forma del mapa corporal
Figura 2 1-8 Los movimientos celulares de la gastrulación. Embrión de X enopus en gastrulación seccionado en el mismo plano que en la Figura 21-6; se indican los cuatro tipos principales de movimientos implicados en la gastrulación. El epitelio del polo animal se expande mediante la reorganización celular, haciéndose más fino a medida que se ensancha. La migración de las células mesodérmicas por encim a de la matriz de fibronectina revistiendo el techo del blastocele puede contribuir al estiramiento de los tejidos invaginados. Sin embargo, la fuerza principal en la conducción de la gastrulación en X enopus es la extensión convergente de la zona marginal. (Según R.E. Keller, /. Exp. Zoo/. 216:81 -101,1981.)
1 117
(B)
los lam elipodios intentan situarse sobre las superficies de las células vecinas, tirando de ellas hacia el interior tal com o indican las flechas
dorsal aislados en cultivo se estrechan y se alargan espontáneamente gracias a una reorganización celular, tal como harían en el embrión durante el proceso de convergencia hacia la línea media dorsal, doblándose hacia dentro alrededor del labio blastopórico, y alargándose hasta formar el eje principal del cuerpo. En la Figura 21-9 se presenta una visión característica de los mecanismos que acom pañan la extensión convergente.
Las tres capas germinales formadas por la gastrulación tienen destinos distintos9,10,u> 12 El endoderm o forma un tubo, el primordio del tracto digestivo, desde la boca hasta el ano. No sólo da lugar a la faringe, al esófago, al estómago y a los intesti nos, sino tam bién a muchas glándulas asociadas. Por ejemplo, las glándulas sa livales, el hígado, el páncreas, la tráquea y los pulmones, se desarrollan a partir de las paredes del tracto digestivo inicial y crecen hasta convertirse en sistemas de tubos ramificados que se abren al tubo digestivo o la faringe. El endodermo for ma los componentes epiteliales de estas estructuras -e l revestimiento del intesti no y las células secretoras del páncreas, por ejem plo- mientras que los elementos musculares y fibrosos que actúan de soporte derivan del mesodermo. La diferenciación del mesodermo está guiada por el Organizador en el labio dorsal del blastoporo, que parece ser una fuente de moléculas señal que regulan las alternativas entre los posibles destinos mesodérmicos. A su vez, las señales procedentes de los distintos grupos de células especializadas controlan el patrón básico de especializaciones del endodermo y del ectodermo e inician la forma ción del sistema nervioso, como veremos más adelante. Tras la gastrulación, la capa m esodérmica del embrión queda fragmentada en zonas diferentes situadas a derecha e izquierda del cuerpo. Una especialización muy precoz del mesoder mo, conocida como notocorda, define el eje central del cuerpo y efectúa la sepa ración. Se trata de una delgada varilla de células, de aproximadamente 80 (J.m de diámetro, con ectodermo por encim a de ella, endodermo por debajo y mesoder mo a cada lado (véase Figura 21-12). Tam bién deriva de las células del Organiza dor. Al pasar alrededor del labio dorsal del blastoporo y desplazarse hacia el in terior del embrión, estas células forman una columna de tejido que se alarga espectacularm ente por extensión convergente. Las células de la notocorda tam bién se hinchan debido a las vacuolas, de modo que la varilla se alarga todavía más estirando el embrión. En los cordados más primitivos, que no tienen vérte bras, la notocorda se conserva como substituto primitivo de la columna verte bral. En los vertebrados actúa de centro alrededor del cual se agrupan las células mesodérmicas formando las vértebras. Así la notocorda es el precursor de la co lumna vertebral, tanto en sentido evolutivo como en el de desarrollo. En general, el mesodermo da lugar a los tejidos conjuntivos del cuerpo -p ri mero a una red tridimensional laxa de células conocida como mesénquina (véa-
1 11 8
Capítulo 2 1 : Mecanismos celulares del desarrollo
Figura21-9 La extensión convergente y su base celular. (A) Patrón de la extensión convergente en la zona marginal de la gástrula, tal como se aprecia desde la cara dorsal. Las flechas azules indican la convergencia hacia la línea media dorsal, las flechas rojas indican la extensión del eje anteroposterior. Este esquema es demasiado simple para ilustrar el movimiento de involución que se produce paralelamente a éste, por el cual las células se pliegan hacia el interior del embrión. (B) Esquema del comportamiento celular que sirve de base a la extensión convergente. Las células se agrupan y forman lamelipodios, mediante los cuales intentan situarse encima de las células vecinas. La alineación de los movimientos lamelipodiales a lo largo del eje común causa la extensión convergente. Probablemente, es un proceso cooperativo, debido a que las células ya alineadas ejercen fuerzas sobre sus vecinas para que se alineen como ellas. (B, según J. Shih y R. Keller, Development 116:901-914,1992.)
SECCIONES TRANSVERSALES placa neural
ectoderm o tubo neural I
cresta neural
ectoderm o tubo neural so m ito IMÁGENES EXTERIORES 14Vi horas
187.* horas
207* hüras
se Figura 19-30) y finalmente al tejido cartilaginoso, al tejido óseo y al tejido fi broso, incluida la dermis (capa interna de la piel). Los túbulos del sistema uroge nital tam bién se forman a partir de él, así como el sistema vascular, incluidos el corazón, los vasos sanguíneos y las células de la sangre. Estos tejidos mesodérmicos especializados derivan de células situadas a diferentes distancias del labio dorsal del blastoporo, de forma que la notocorda tiene el origen más dorsal y las células sanguíneas el más ventral. Al finalizar la gastrulación, la capa del e c to d e rm o cubre el embrión, dando finalmente lugar a la epidermis (capa externa de la piel). Además, la totalidad del sistema nervioso tam bién deriva del ectodermo. Mediante un proceso conocido como n e u ru la c ió n , una ancha región central del ectodermo se engrosa, se enro lla formando un tubo y se separa del resto de la capa celular (Figura 21-10). El tubo así formado a partir del ectodermo recibe el nombre de tu b o n e u ra l, y for mará el encéfalo y la médula espinal. Los mecanismos de la neurulación depen den, como los de la gastrulación, de cambios en el empaquetamiento celular y en la forma celular; en la Figura 21-11 se muestra cómo puede organizarse el citoesqueleto provocando cambios en la forma celular que pueden hacer que el epitelio se enrolle en forma de tubo. La neurulación se produce por una interacción entre la notocorda subya cente y el mesodermo adyacente a la misma. Si.de un embrión de anfibio en gas trulación se extrae un fragmento de mesodermo dorsal del área situada justo por debajo del futuro tubo neural y se implanta directamente bajo el ectodermo -e s decir en la región ventral- de otro embrión en gastrulación, el ectodermo de esta región se engrosará y se enrollará formando un fragmento de un tubo neural co locado fuera de sitio. A lo largo de la línea en la que el tubo neural se separa de la futura epider mis, numerosas de células ectodérmicas se liberan de la capa epitelial y emigran individualmente hacia el exterior a través del mesodermo. Estas células pertene cen a la c r e s t a n e u ra l; formarán casi la totalidad del sistema nervioso periférico (incluidos la mayoría de los ganglios sensoriales y todos los ganglios simpáticos y las células de Schwann que forman las vainas de m ielina de los nervios peri féricos) así com o las células pigmentarias de la piel. En la cabeza, las células de la cresta neural se diferencian en cartílago, hueso, y otros tejidos conjuntivos, los cuales derivan del mesodermo en las otras zonas del cuerpo. Éste es uno de los varios ejemplos que contradicen el patrón general según el cual las tres capas
Movimientos morfogénicos y la forma del mapa corporal
24 horas
2YiU horas
Figura 21-10 Form ación del tubo neural en Xenopus. Las imágenes
exteriores son de la cara dorsal. Las secciones transversales están cortadas por donde indica la línea discontinua. (Según T.E. Schroeder, /. Embryol. Exp. Morphol. 23:427462,1970. © Company of Biologists Ltd.)
I
los m icrotúbulos se alargan, haciendo pgggggj
\
¿g il !í JÉlil
'fe
A
j
los haces apicales de filam entos de actina se contraen, estrechando las células por sus ápices — ^ haces apicales de filam entos de actina
' #
1# \ *
Figura 21-11 Curvatura de un epitelio debida a cambios en la forma celular mediados por microtúbulos y filamentos de actina. A partir de observaciones de la
neurulación de salamandras y tritones, en los que el epitelio tiene sólo una capa de células de grosor. A medida que los extremos apicales de la célula se estrechan, su superficies membranosas superiores se arrugan.
1119
cresta neural
tubo neural notocorda — cavidad digestiva
Figura 21-12 Sección transversal (esquemática) del tronco de un embrión de anfibio después de cerrar su tubo neural. (Según T. Mohun, R. Tilly, R. Mohun y J.M. Slack, Cell 22:9-15,1980. © Cell Press.)
yema de la cola placa mesodérm ica lateral endoderm o y vitelo ectoderm o (epidermis)
germinales producen las células de las tres capas concéntricas correspondientes del cuerpo adulto. Los órganos sensoriales, por los que la luz, los sonidos, los olores, etc., inciden sobre el sistema nervioso, también son de origen ectodérmico: algunos derivan del tubo neural, otros de la cresta neural, y otros de la capa externa del ectodermo (véase Figura 21-102). Por ejemplo, la retina se origina como una expansión del encéfalo y por lo tanto deriva de células del tubo neural, mientras que las células olfativas de la nariz se diferencian directamente a partir del epitelio ectodérmico que reviste la cavidad nasal.
El mesodermo situado a cada lado del eje del cuerpo se fragmenta en somitos, de los que derivan las células musculares13 A cada lado del recién formado tubo neural se encuentra una extensa capa de mesodermo (Figura 21-12). A partir de la región dorsal de este mesodermo -m ás gruesa y m edial- se forman los tejidos musculares y esqueléticos del eje central del cuerpo. Inicialm ente consiste en un una lámina gruesa y continua de tejido, situada a cada lado del cuerpo. Pronto esta lámina se rompe en bloques separa dos, o som itos, que forman las series repetitivas de vértebras y músculos seg mentados (Figura 21-13). Los somitos se forman uno tras otro, sucesivamente, empezando por la cabeza y acabando por la cola (Figura 21-13). La segmenta ción acarrea cambios entre las conexiones de las células mesodérmicas. El m e canismo que controla los surcos que separan un somito de su vecino, según un patrón regular, continúa siendo un misterio (aunque se sabe que el proceso físi co de form ación de somitos viene prefigurado por un patrón de segmentación de la expresión de ciertos genes). Cada somito se corresponde con una unidad en la secuencia final de ele mentos articulados. La masa de somitos forma los músculos esqueléticos del
pre-som ito 1 12 0
Capítulo 2 1 : Mecanismos celulares del desarrollo
m aduro
Figura 21-13 Form ación de somitos en Xenopus. (A) Fotografías de embriones en tres fases consecutivas, tomadas lateralmente y marcadas con anticuerpos específicos anti-células musculares mostrando la formación de somitos. (B) Diagramas explicativos. En el esquem a superior de muestra una visión lateral del embrión; la línea intermitente señala el plano en el que se ha efectuado la sección horizontal que se muestra justo debajo. El diagrama inferior es un esquema aumentado de las células mesodérmicas en pleno proceso de reagrupación formando los somitos. En X enopus, inicialmente las futuras células de los somitos están orientadas en ángulo recto respecto a los ejes del cuerpo y entonces rotan en grupos durante la formación de los somitos. La parte principal de cada somito formará tejido muscular y se llama m io to m o ; la parte interna situada frente a la notocorda es el origen de las vértebras y costillas y se denomina esclerotom o; la más exterior, es decir la parte dorsal (en los vertebrados superiores, aunque no en X enopus), contribuirá a la formación de la dermis (el tejido conjuntivo de la piel) y se denomina d erm atom o.
Figura 21-14 (izquierda) Clasificación. Las células procedentes de diferentes partes del embrión temprano de anfibio se clasificarán según sus orígenes. En este experimento clásico primero se desagregan la células mesodérmicas, las células de la placa neural y las células epidérmicas, y luego se dejan reagrupar en una mezcla aleatoria. Se clasifican dando lugar a una formación con reminiscencias de un embrión típico, con un “tubo neural” interno, una epidermis externa, y un mesodermo entre ambos. (Modificado de P.L. Townes y J. Holtfreter, J. Exp.Zool. 128:53-120,1955.)
Figura 21-15 (derecha) Cadherinas en el embrión temprano. Ilustración de la variación de los patrones de expresión de tres cadherinas en estadios sucesivos de los embriones tempranos de pollo o ratón, observados mediante secciones transversales efectuadas en el tubo neural y los somitos en desarrollo. Las células que expresan el mismo tipo de cadherinas permanecen unidas entre sí y tienden a segregarse de las otras células. Así pues, el patrón de cadherinas contribuye a la regulación del patrón de desplazamientos morfogénicos implicados en la formación del tubo neural, de la notocorda, de los somitos, de la cresta neural y de los esclerotomos. (Según M. Takeichi, Trends Genet. 8:213-217,1987.) segmento, mientras que un subconjunto de sus células forma los tejidos corres pondientes a las vértebras y otros tejidos conjuntivos como la dermis. Los somi tos también son el origen de casi todas las células del músculo esquelético en el resto del cuerpo: estas células derivan de precursores que abandonan los somi tos antes de diferenciarse de forma manifiesta.
ectoderm o (placa neural)
m esoderm o
endoderm o
cresta neural
epiderm is
tubo neural
som ito notocorda
esclerotom o
E
CLAVE tipo de cadherinas N E+N E+P N+P
Los patrones cam biantes de moléculas de adhesión celular regulan los movimientos m orfogénicos14 Los movimientos de los tejidos en el embrión van acompañados de cambios en los caracteres químicos de las células. Por ejemplo, una célula puede alterar su forma o su movimiento mediante la activación de la producción de una proteína citoesquelética. Cambiando el conjunto de moléculas de adhesión que presenta en su superficie puede romper adherencias anteriores y establecer otras nuevas. Las células de una región determinada pueden desarrollar propiedades en su su perficie que causarán su adhesión entre ellas y su segregación de un grupo de células vecinas cuya superficie es químicamente distinta. Experimentos clásicos en embriones tempranos de anfibios demuestran que los efectos la adhesión selectiva célula-célula pueden ser tan fuertes que producen una reconstrucción aproximada de la estructura normal incluso des pués de que las células hayan sido disociadas artificialmente y mezcladas al azar (Figura 21-14). Como se expone en el Capítulo 19, estudios realizados en em briones de pollo y de ratón sugieren que este comportamiento depende, al m e nos en parte, de una familia de glucoproteínas homologas de adhesión célulacélula dependientes de Ca2+-las cadherinas. Estas y otras moléculas de adhesión célula-célula independientes de Ca2+ tal como las moléculas N-CAM, se expre san de forma distinta en los diferentes tejidos del embrión temprano; anticuer-
Movimientos morfogénicos y la forma del mapa corporal
1121
pos dirigidos contra ellas interfieren con la adhesión selectiva normal entre célu las de tipo similar. Los cam bios de los patrones de expresión de la diferentes cadherinas se co rresponden estrecham ente con los cam bios de los patrones de asociación celu lar que se producen durante la gastrulación, la neurulación y la formación de somitos (Figura 21-15); el patrón de cadherinas puede regular y conducir par cialmente las transformaciones del embrión temprano. Particularmente, parece que las cadherinas juegan un papel central en el control de la formación y diso lución de capas epiteliales y agrupaciones de células. Las cadherinas no sólo unen células entre sí, sino que también proporcionan un anclaje para los fila mentos intracelulares de actina en las localizaciones de adhesión célula-célula (véase Capítulo 19): de esta forma ayudan a regular el patrón de fuerzas y des plazamientos que se producen en el tejido en desarrollo de acuerdo con el pa trón de adhesiones. Aparte de unirse unas con otras, las células pueden adherirse a componentes de la matriz extracelular como la fibronectina y la laminina. Estas adhesiones se producen gracias a las integrinas las cuales, como las cadherinas, actúan de co nectares transmembrana conectando los lugares de adhesión del exterior de la célula con los filamentos de actina del interior. Las interacciones entre la célula y la matriz son importantes para los desplazamientos de ciertas clases de células que se sueltan de sus células vecinas y migran en el embrión, avanzando lenta mente por los espacios libres entre las células. Invasiones como éstas, que vere mos a continuación, hacen que la mayoría de los tejidos del cuerpo adulto de un vertebrado estén constituidos por combinaciones de células derivadas de zonas del embrión temprano muy distantes entre sí.
Células m igratorias invaden los tejidos del em brión de form a estrictam ente controlada11,15,16 Hasta este mom ento hemos establecido dos clases de células migratorias -las de la cresta neural y las que abandonan los somitos formando los músculos esque léticos. Otro grupo importante de células migratorias son las precursoras de las células de la sangre, de las células germinales y de los diferentes grupos de neu ronas pertenecientes al sistema nervioso central. Estas migraciones celulares pueden establecerse marcando las células al com ienzo de su trayecto, con colorantes no tóxicos, o incluso mejor con un marcador heredable genéticam ente. La mayor parte de nuestro conocimiento proviene de estudios mediante injerto de células de embriones de codorniz en embriones de pollo. Aunque la codorniz es parecida al pollo en muchos aspec tos, sus células se pueden distinguir, en cortes histológicos, gracias a una gran masa de heterocromatina, intensam ente teñida, que se encuentra asociada al nucléolo. Mediante este marcador nucleolar podemos identificar las células in jertadas que han emigrado abandonando la localización donde fueron implan tadas. Por ejemplo, si se substituye un tejido somítico de codorniz antes de que aparezcan las yemas de sus extremidades, por un tejido somítico de un embrión de pollo muy temprano, todas las células musculares de las extremidades que se desarrollen serán originarias de codorniz (Figura 21-16). Evidentemente las futu ras células musculares migran desde los somitos hacia la región de la futura ala y permanecen allí, mezcladas de forma discreta con las células de los tejidos co nectivos de las yemas de las extremidades, hasta el momento oportuno para su diferenciación. Figura 21-16 Origen m igratorio de las Abras musculares de las extremidades. Si se substituyen las células de los somitos de la extremidad de un embrión de pollo por células de somitos de codorniz a los dos días de incubación y luego se secciona el ala del pollo una semana más tarde, se puede ver cómo la fibras musculares del ala del pollo derivan de las células de somitos de codorniz injertadas.
1 12 2
Capítulo 2 1 : Mecanismos celulares del desarrollo
EMBRIÓN DE CODORNIZ
extracción de som itos en EMBRIÓN DE POLLO desarrollo de la región donde se / J h\ desarrollará la yema i del ala e injerto en el [ / L em brión de pollo
ala en desarrollo
sección que muestra la distribución de células de codorniz en el antebrazo
m úsculo
situación original de la células de la cresta neural
tubo neural
ectoderm o
ganglio sensorial
som ito
ganglio sim pático glándula adrenal
notocorda aorta
glándula entérica
cavidad celómica tubo digestivo
De una forma parecida se puede seguir la dispersión de células proceden tes de la cresta neural. Estas células migran a través del embrión por vías espe cíficas (Figura 21-17) y se establecen en localizaciones determinadas de forma exacta. Mientras una célula que migra se desplaza a través del embrión, va re petidamente extendiendo proyecciones que le permiten conocer su entorno in mediato (Figura 21-18) mediante sutiles indicios a los que es especialmente sensible gracias a su específico surtido de proteínas receptoras de superficie. En el interior de la célula, estas proteína receptoras están conectadas con el citoesqueleto, responsable del desplazamiento celular. Algunos com ponentes de la matriz extracelular, como la fibronectina, proporcionan lugares de adhesión que facilitan el avance de la célula; otros, como el proteoglucano condroitín sulfato, inhiben el desplazamiento y repelen la inmigración. De la misma for ma, las células no migratorias situadas a lo largo de los caminos de migración pueden tener superficies receptoras o repelentes, o incluso pueden extender filopodios que entren en contacto con la célula migratoria, afectando su com por tam iento. El tira y afloja incesante entre las tentativas opuestas de adhesión, conduce a las células a desplazarse en la dirección más favorable hasta que la célula encuentra una localización en la que puede establecer una adhesión du radera. Otros factores tam bién pueden jugar un papel importante, com o son la quimiotaxis y las interacciones entre las células migratorias. Otro medio para controlar la distribución de células migratorias es la regula ción de su supervivencia y proliferación. Parece que tanto las células germinales como las precursoras de células sanguíneas y las células pigmentarias derivadas de la cresta neural, están gobernadas en este aspecto por el mismo mecanismo básico de control. Tal mecanismo implica a un receptor transmembrana perte neciente a la membrana de la células migratorias, denominado proteína Kit, y a
Movimientos morfogénicos y la forma del mapa corporal
Figura 21-17 Principales vías de m igración celular de la cresta neural. Ilustración que muestra un esquema de una sección transversal de un embrión de pollo en la parte media de su cuerpo. Las células que inician su camino justo debajo del ectodermo formarán células pigmentarias de la piel; las células que tom en el camino profundo vía somitas formarán los ganglios sensoriales, los ganglios simpáticos y partes de las glándulas adrenales. Las glándulas digestivas, de la pared del intestino, se forman con células procedentes de la cresta neural que migrarán a lo largo del cuerpo, y darán origen tanto a la región del cuello com o a la región sacra. (Véase también Figura 19-22.)
Figura 2 1-18 Migración de células de la cresta neural. Esta serie de fotografías de un embrión vivo de pez cebra, observadas mediante contraste de fases interferencial, muestran una célula de la cresta neural emitiendo prolongaciones de tanteo en varias direcciones antes de tomar la dirección ventral correcta (parte baja de la cuarta fotografía). Las fotografías se tomaron a intervalos de cinco minutos, aproximadamente. (Cortesía de Suresh Jesuthasan.)
1123
Figura 21-19 Consecuencias de mutaciones en el gen kit. Tanto la niña como el ratón son heterocigotos debido a una mutación que conlleva la pérdida de funciones que los deja con sólo la mitad de la cantidad normal de producto del gen kit. En ambos casos la pigmentación es deficiente debido a que las células pigmentarias dependen del producto de kit como receptor para un factor de supervivencia. (Cortesía de RAFleischman, de Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88:1088510889,1991. © 1991 Macmillan Magazines Ltd.) un ligando, denominado factor Steel, fabricado por las células del tejido a través del cual las células migran y/o en el que llegan a establecerse. Individuos con mutaciones en los genes de cualquiera de estas proteínas tienen deficiencias en su pigmentación, en el suministro de células sanguíneas y en la producción de células germinales (Figura 21-19). Parece que el factor Steel en una forma ligada a la m em brana es necesario para activar correctam ente la proteína Kit y capaci tar todos estos tipos de células para sobrevivir y proliferar.
El plano estructural del cuerpo de los vertebrados se forma primero en m iniatura y después se m antiene a medida que el em brión crece9 Normalmente, en el mom ento que se forman los somitos el embrión mide unos cuantos milímetros y consta de alrededor de 105 células. Aunque hasta ahora nos hemos referido principalmente a Xenopus, su escala y forma generales son muy parecidas a la de un pez, una salamandra, un pollo, o un ser humano (véase Fi gura 1-36). Posteriormente estas especies de embrión crecerán y alcanzarán ta maños y formas muy diferentes, pero de momento se puede observar que com parten el mapa estructural básico del cuerpo de los vertebrados. El sistema nervioso central está representado por el tubo neural, con un engrosamiento en un extremo para el encéfalo; un tubo de endodermo representa el tubo digestivo y sus derivados; los somitos representan los segmentos del tronco; el mesodermo más periférico no segmentado representa los otros tejidos conjuntivos, incluido el sistema vascular; y el ectodermo, la epidermis de la piel. Durante el crecim ien to posterior todos estos com ponentes aumentarán de tamaño, multiplicándose por un factor de cien veces o más en longitud, y de un millón o más respecto a su volumen y número de células. No obstante se conservará la misma organización básica del cuerpo.
Resumen
Los huevos de la mayoría de los organismos son células grandes, que contienen re servas de nutrientes y otros componentes especificados por el genoma materno. En los anfibios, el primer desplazamiento de importancia tras la fecundación es una rotación del córtex del huevo en relación a su núcleo. La asimetría producida por esta rotación, junto con la asimetría original debida a la distribución de conteni dos del huevo antes de la fecundación, define los futuros ejes anteroposterior y dorsoventral del cuerpo. Durante las posteriores divisiones de segmentación el huevo se subdivide en células mucho más pequeñas, sin que ocurra crecimiento alguno. Pronto se desarrollará una cavidad en el interior del embrión, mientras se or ganizan las células de su alrededorformando una capa epitelial. Entonces se invagina parte del epitelio, transformando el embrión en una estructura triestratifica1 12 4
Capítulo 2 1 : Mecanismos celulares del desarrollo
da, formada por un tubo interno epitelial de endodermo, una capa epitelial exter na de ectodermo, y una capa intermedia de células mesodérmicas que se han sepa rado de la capa epitelial original. Durante este proceso de gastrulación las células epiteliales cambian activamente su empaquetamiento celular, lo cual parece que proporciona una fuerza mayor que conduce los desplazamientos. El endodermo revestirá al intestino y sus derivados, el ectodermo formará la epidermis y el sistema nervioso, y el mesodermo los músculos, los tejidos conjunti vos, el sistema cardiovascular y el tracto urogenital. El desarrollo de todas estas es tructuras depende de las interacciones entre las tres capas germinales y implica desplazamientos celulares posteriores. Por ejemplo, el mesodermo dorsal induce al ectodermo suprayacente a engrosarse, enrollarse y separarse, formando el tubo y la cresta neural. Justo en medio del mesodermo dorsal una varilla de células especia lizadas, denominada notocorda, se alargará formando el eje central del embrión. Las anchas láminas de mesodermo que están a cada lado de la notocorda se seg mentan formando los somitos, de los cuales derivarán las vértebras y los músculos esqueléticos. En varias lugares, algunas células migratorias, como las células de la cresta neural, se liberan de sus vecinos originales y migran a través del embrión para colonizar nuevas regiones. Moléculas de adhesión célula-célula, como las cadherinas y las integrinas, ayudan a guiar las migraciones y a controlar la cohe sión celular selectiva en el epitelio.
Diversificación celular en el embrión animal temprano17,18 Un huevo fecundado puede convertirse en una margarita o en un roble, en un erizo de mar o en un ser humano. El resultado final está determinado por el genoma: la secuencia lineal de los nucleótidos A, G, C y T del DNA del organismo tiene que dirigir la producción de una variedad de tipos de celulares química mente distintos dispuestos según un patrón espacial muy exacto. La biología del desarrollo intenta explicar cómo ocurre esto. Cualquier discusión del problema, en este y en siguientes apartados, se basa en un hecho fundamental: todas las células del cuerpo heredan el mismo genoma del huevo. No importa lo diferen tes que puedan parecer las células -e n músculos, huesos, o nervios, en raíces, ta llos u h o jas- todas contienen el mismo conjunto de instrucciones genéticas. Una de las primeras y más contundentes demostraciones de este principio proviene de experimentos de trasplante de núcleos utilizando huevos de anfibio (Figura 21-20). Un huevo normal de anfibio es tan grande que utilizando una pi peta fina de cristal se puede inyectar en el interior del huevo un núcleo extraído de otra célula. Antes se ha destruido el núcleo del huevo receptor mediante irra diación ultravioleta. El desarrollo del huevo se activa con pinchazos producidos por la pipeta fina usada para inyectar el núcleo. De este modo se puede com pro bar si el núcleo de una célula somática diferenciada contiene un genoma com pleto equivalente al de un huevo fecundado típico y si es igual de válido para el desarrollo. La respuesta es afirmativa: se puede producir un renacuajo completo a partir de un huevo al que se le ha substituido el núcleo por el de un queratinocito de la piel o por el de un núcleo de un glóbulo rojo de la sangre. Debemos ad mitir que estos experimentos también presentan limitaciones. Sólo han tenido éxito con núcleos de un grupo limitado de tipos de células diferenciadas y sólo en algunas especies. Pero actualmente existe un conjunto contundente de evi dencias que apuntan a esta misma conclusión. Con sólo unas cuantas excepcio nes (véase Figura 23-37), el genoma permanece intacto durante el desarrollo. Los genes se pueden activar o permanecer inactivos, las células del cuerpo se di ferencian no porque contengan genes diferentes sino porque expresan genes distintos. En el Capítulo 9 examinamos los mecanismos intracelulares que regu lan la expresión génica. En el presente capítulo hemos de considerar cómo se originan las diferencias entre las células y cómo se coordinan espacial y tempo-
Diversificación celular en el embrión animal temprano
1125
Figura 21 -20 Trasplante nuclear.
adulta ' #
huevo no fecundado
destrucción del núcleo con radiación UV
\í/
células de la piel en placa de cultivo
núcleo en una pipeta
\ núcleo inyectado en el huevo
blástula norm al
renacuajo
raímente dentro de un organismo pluricelular. En este apartado veremos cómo se coordinan los primeros pasos de la diversificación celular en los embriones tempranos, tomando com o ejemplo ranas y ratones.
Las diferencias iniciales entre los blastómeros de Xenopus surgen a partir de la segregación espacial de determinantes en el huevo2,17,19 En la mayoría de especies de plantas y animales el huevo es en sí mismo quími cam ente asimétrico, concentrando algunos componentes en regiones determi nadas del citoplasma o de la membrana. Como resultado de ello, desde el inicio ya existen diferencias entre las células que se forman en la segmentación porque reciben porciones distintas de material debido a su localización asimétrica. La importancia de tales determinantes localizados del huevo varía de unas especies a otras. Teóricam ente siempre se ha distinguido entre dos tipos de desarrollo opuestos: en el desarrollo en mosaico, determinantes localizados del huevo dise ñan por completo el futuro patrón del cuerpo, de forma que las interacciones célula-célula posteriores no tienen ninguna consecuencia; en el desarrollo regu lador, los determinantes localizados del huevo no cuentan para nada, de forma que el patrón corporal se genera totalm ente gracias a las interacciones célulacélula. En realidad, la posición de la mayoría de las plantas y animales está entre ambos extremos. Por lo que se sabe hasta el momento, no existe ninguno desa rrollo que sea com pletamente en mosaico -las interacciones reguladoras siem pre juegan un papel importante; com o veremos más adelante, los huevos de ma mífero parecen ser com pletamente reguladores. Xenopus representa un caso intermedio característico.
1 12 6
Capítulo 2 1 : Mecanismos celulares del desarrollo
Esquema de un experimento que demuestra que el núcleo de una célula diferenciada de la piel de una rana adulta contiene todo el material genético necesario para controlar la formación de un renacuajo completo. La flecha discontinua de la parte inferior de la figura indica que para conceder al genoma trasplantado el tiempo suficiente para que se adapte a un entorno embrionario se requiere un paso más de transferencia en el que se extrae uno de los núcleos del embrión temprano cuando comienza su desarrollo y se repone en un segundo huevo anucleado. (Modificado de J.B. Gurdon, Gene expression During Cell Differentiation. Oxford, UK: Oxford University Press, 1973.)
Figura 21-21 Inducción m esodérm ica en Xenopus. Las células
entorno experim ental del tejido del polo animal tejido del polo animal
tejido del ------polo vegetativo en un em brión norm al
cultivado de form a aislada
cultivado en com binación con tejido del polo vegetativo
tejido ectodérm ico y un poco de tejido m esodérm ico
sólo tejido ectodérm ico
principalm ente tejido m esodérm ico
del polo animal de la blástula, que normalmente sólo forman el ectodermo, formarán tejidos mesodérmicos si se cultivan conjuntamente con células del polo vegetativo. En un desarrollo normal, probablemente una interacción inductiva de este tipo sucede durante una fase más temprana; cuando se cultiva de forma aislada, la región ecuatorial de la blástula es capaz de formar tejidos mesodérmicos.
destino del tejido del polo anim al
Las asimetrías del huevo de Xenopus se manifiestan de varias formas -e n la localización excéntrica del núcleo, en la distribución del vitelo y los gránulos de pigmento, en el citoesqueleto y, quizás la más significativa, en la distribución de unos mRNA determinados. Las asimetrías del huevo dotan a los blastómeros tempranos con caracteres diferentes según sean animales o vegetativos, dorsales o ventrales. Tanto la alteración artificial de la disposición de los blastómeros tempranos como la aplicación de tratamientos como la centrifugación o la ra diación ultravioleta que desplazan los contenidos del huevo antes de su segmen tación e impiden que ocurra la rotación cortical que en condiciones normales sigue a la fecundación provocan drásticas perturbaciones en el mapa embriona rio del cuerpo.
Interacciones inductivas generan nuevos tipos de células en un patrón cada vez más detallado20 Las diferencias iniciales entre los blastómeros tempranos sólo determinan las bases del patrón del embrión. Para generar todos los tipos celulares, los blastó meros han de interactuar unos con otros. Si colocamos el embrión temprano de Xenopus en un medio desprovisto de Ca2+ y Mg2+, los blastómeros perderán su cohesión, y podrán separarse y desarrollarse por separado; unos van a desarro llar las características propias del ectodermo, mientras que otros desarrollarán las características propias del endodermo; pero ninguno de ellos activará la ex presión de los genes característicos del mesodermo, como por ejemplo el gen de actina específico del músculo. Pero si las células del polo animal de la blástula se colocan cerca del las células vegetativas, algunas de las células del polo animal cam bian su vía de desarrollo ectodérmica por la vía mesodérmica (Figura 21-21).
© 1 (!)
© C°)
© C es inducida por B a partir de A
B[cji
D y E son inducidas por C a partir de A y B
(
Figura 21-22 Modelaje mediante inducciones secuenciales. Series de
interacciones inductivas pueden generar muchos tipos de células partiendo de unas pocas.
cj
c¿ )
(!)
Diversificación celular en el embrión animal temprano
© 1127
M oogenesis
fecundación y rotación cortical
VV
DV VV inducción del Organizador y del m esoderm o por señales de las células vegetativas
El cambio de vía de las células debido a la influencia de un grupo adyacente de células se denomina inducción. En el transcurso de un desarrollo normal, las in ducciones interactivas pueden ocurrir entre células que eran adyacentes desde el inicio del proceso -p or ejemplo en la inducción m esodérm ica- o entre células cuya proximidad se debe a movimientos morfogénicos como la gastrulación. Mediante una serie de inducciones consecutivas se pueden generar muchos ti pos de células distintos derivados de interacciones entre unos cuantos tipos ce lulares (Figura 21-22). Tal como hemos destacado, las asimetrías del huevo de Xenopus determi nan no sólo el eje animal como el vegetativo del cuerpo, y en consecuencia la di visión del embrión en ectodermo, mesodermo y endodermo, sino también los ejes dorsoventral y anteroposterior. Parece de nuevo que en la organización del eje dorsoventral actúa un mecanismo inductivo. Experimentos de injerto indi can que todos los blastómeros vegetativos pueden inducir mesodermo pero que no todos lo hacen de la misma forma: los blastómeros vegetativos dorsales son únicos en tanto que inducen a las células situadas encima de ellos a asimilar los caracteres especiales del Organizador de Spemann. Como vimos anteriormente, a su vez el Organizador produce una señal que induce a su alrededor la forma ción de un conjunto de especializaciones del mesodermo. Posteriormente, el pa-
W nt m RNA inyectado en un blastóm ero vegetativo ventral
DV g f ádorsalización orí del m esoderm o debido a una señal procedente del Organizador Figura 21 -23 Modelo de tres señales para la inducción m esodérm ica en el embrión tem prano de Xenopus.
Parece que se necesitan al menos tres señales, actuando de la forma indicada, para explicar los resultados de los experimentos sobre injertos. De hecho cada una de las “señales” podría ser producto de una compleja combinación de moléculas señal. (Según J. Slack, From Egg to Embryo, 2nd ed. Cambridge, UK: Cambridge University Press, 1991.)
activina
FGF
noggin
bloqueo de la recepción de señales
bloqueo de la recepción de señales
hibridación in situ
control
I
É
1
r
experim ental inducción de un segundo O rganizador, de aquí la existencia de un segundo eje corporal
I
°>
no hay inducción de m esoderm o, la gastrulación fracasa
experimental faltan los tejidos ventral y posterior
expresado en la región del O rganizador; la proteína puede dorsalizar el m esoderm o ventral
Figura 21-24 Algunas moléculas señal implicadas en la inducción m esodérm ica de Xenopus. Se presenta el resultado
de un experimento representativo para cada una de las cuatro clases de factores. Aunque las cuatro clases de factores pueden tener efectos considerables en la inducción del mesodermo, sus papeles exactos respecto al modelo de tres señales ilustrado en la Figura 21-23 todavía no se conoce con certeza. Las familias de factores Wnt, activina y FGF (factor de crecimiento de los fibroblastos, de Fibroblast Growth Factor) son muy conocidas en otros contextos como moléculas señal célula-célula; la activina (como Vgl -véase Figura 21-25) pertenece a la superfamilia de factores de crecimiento TGF-|3. La recepción de señales de activina o de FGF se puede bloquear inyectando mRNA que codifica una forma defectuosa del receptor proteico correspondiente, a la que le falta el dominio intracelular e interfiere con la función del receptor normal. (Fotografía de S. Sokol y al., Cell 67:741-752,1991.© Cell Press; A. Hemmati-Brivanlou y D.A. Melton, Nature 359:609-614,1992. © 1992 Macmillan Magazines Ltd.; E. Amaya, T.J. Musci, y M.W. Kirschner, Cell 66:257270,1991.© Cell Press; y W.C. Smithy R.M. Harland, Cell 70:829-840,1992.© Cell Press.)
1 12 8
Capítulo 2 1 : Mecanismos celulares del desarrollo
(A)
(B)
huevo no fecundado recién puesto
mRNA de Vg1 concentrado en córtex vegetativo
huevo fecundado
la rotación cortical activa la proteína Vg1 en la región dorsal vegetativa
blástula tem prana
la proteína Vg1 activada induce al Organizador
Figura 21-25 Localización de Vgl y su supuesto papel inductor en el embrión d e Xenopus. (A) Hibridación in situ,
mostrando su localización en la región vegetativa cortical del oocito (el futuro huevo). (B) Diagramas que ilustran una hipótesis de cómo actúa Vgl. El mRNA del Vgl se sintetiza en el oocito y queda localizado, mediante mecanismos desconocidos, en las regiones corticales vegetativas de la célula. Igual que otros miembros de la superfamilia TGF-J3, la forma activa de la proteína Vgl es un fragmento segmentado del precursor de longitud completa. El control del paso de activación de la segmentación es desconocida. Si se inyecta mRNA que codifica Vgl de tamaño normal en un embrión temprano, se produce muy poco del fragmento activo y no se observa efecto alguno en el modelaje del embrión. Pero si se modifica el mRNA para que codifique un precursor que ya está segmentado para producir el fragmento activo de Vgl, las consecuencias son dramáticas: se puede inducir un eje corporal completo, de un modo que sugiere que el fragmento de Vgl está imitando la señal que normalmente procede de los blastómeros dorsales vegetativos y que induce el desarrollo del Organizador. Según otra propuesta, Vgl actúa como esta señal durante el desarrollo normal, y la producción de fragmento activo de Vgl se localiza en los blastómeros dorsales vegetativos mediante un proceso que consta de dos fases. Primero, el mRNA es liberado en el extremo vegetativo del huevo; entonces la rotación cortical que sigue a la rotación crea las condiciones especiales en la parte dorsal del córtex vegetativo, de forma que el precursor de proteínas se segmenta produciendo el fragmento activo. Entonces éste se libera de los blastómeros dorsales vegetativos induciendo la formación de un Organizador. (A, cortesía de Douglas Melton.)
trón creado en el mesodermo inducirá patrones de especialización local en el ectodermo y en el endodermo con los que entra en contacto. Así pues parece que existen al menos tres señales inductivas que actúan en los primeros estadios del desarrollo de Xenopus, cuyos orígenes son: los blastó meros vegetativos ventrales, los blastómeros vegetativos dorsales y el Organiza dor (Figura 21-23). ¿Qué son estas señales desde el punto de vista químico? Pare ce que están implicados miembros de al menos cuatro familias de proteínas señal secretadas. Aunque sus papeles exactos en el desarrollo típico no están nada cla ros, se cree que ya están todas presentes en el embrión temprano de Xenopus, y todas ellas producen efectos inductores dramáticos si se suministran artificial mente. Al menos en dos de las cuatro clases, el bloqueo artificial de la función produce embriones que carecen de partes importantes del cuerpo (Figura 21-24). Tales observaciones no explican, sin embargo, por qué la localización de las señales inductivas que circulan entre los blastómeros del embrión de Xenopus viene determinada por el patrón de asimetrías del huevo no segmentado. En el caso de la proteína Vgl, que es miembro de la superfamilia TGF-P de factores se ñal secretados, se puede entrever por qué ocurre. Se ha localizado una reserva de mRNA materno que codifica la proteína localizada en la parte vegetativa del huevo antes de su fecundación. Se cree que la proteína se produce en su forma precursora en las regiones vegetativas, y que se puede activar en la región vege tativa dorsal, liberándose de los blastómeros vegetativos dorsales induciendo al Organizador (Figura 21-25).
Un sencillo gradiente de morfógeno puede organizar un com plejo patrón de respuestas celulares21 Existen muchas maneras por las cuales las señales que pasan de una parte a otra del embrión pueden controlar el patrón de formación (Figura 21-26). El Organi-
Diversificación celular en el embrión animal temprano
1 129
888888888880S8
ooooooo##ooooooo
ooooooo##ooooooo
ooooooo##ooooooo ooooooo##ooooooo ooooooo##ooooooo ooooooo##ooooooo (A) señales intracelulares
(B) señales intercelulares de largo alcance
zador constituye un ejemplo de una estrategia de un interés particular: un pe queño trozo de tejido de una región determinada adquiere un carácter especial y se convierte en la fuente de una señal que se introduce en los tejidos vecinos y controla su comportamiento. Por ejemplo, la señal podría tomar la forma de una molécula difusible secretada por centro emisor de señales. Supongamos que tal substancia se degrada lentam ente a medida que difunde a través del tejido cir cundante. La concentración será constante y alta cerca de la fuente y disminuirá gradualmente al alejarse de ella, estableciéndose un gradiente de concentración (Figura 21-27). Las células que se encuentren a distancias distintas de la fuente estarán expuestas a distintas concentraciones y por tanto se volverán diferentes. Una sustancia com o ésta, cuya concentración es “leída” por las células para des cubrir su posición relativa respecto a una cierta señal o baliza, se denomina morfógeno. Se cree que los gradientes de morfógeno constituyen una vía común de suministro de información posicional a las células o de control de su patrón de diferenciación, a pesar de que en muy pocos casos se ha identificado el m or fógeno químicamente. ¿Cómo responden las células a un gradiente de morfógeno? La concentra ción del morfógeno difusible debe presentar un gradiente muy suave, y sin em bargo muchas de las especializaciones importantes del desarrollo son discretas: por ejemplo, no existen series graduales de tipos celulares adultas intermedias entre cartílago y músculo, o entre hueso y nervio. Teóricamente, en una pobla ción inicialmente uniforme pueden aparecer diferencias marcadas a través de un umbral de respuesta a una señal cuya variación de concentración es muy suave. Si existe una retroalimentación positiva en cada célula que responde que amplifi ca el efecto de un pequeño incremento de la señal, células expuestas a intensida des sólo ligeramente distintas de la señal pueden verse abocadas a vías de desa rrollo completamente distintas, en función de si la concentración a la que están expuestas es superior o inferior a un umbral determinado. Si existen varios um brales de respuesta a una señal, un solo morfógeno puede controlar el patrón de varias opciones celulares diferentes. Por ejemplo, se ha demostrado que cuando las células procedentes del polo animal de un embrión temprano de Xenopus son expuestas a la molécula señal activina (véase Figura 21-24), se desarrollan como epidermis si la concentración es baja, en músculo si es un poco más elevada y en notocorda si es un poco más alta. Sin embargo, la función normal de la activina
Figura 21-27 Gradiente de morfógeno. Si una substancia es producida por una fuente puntual y a medida que difunde a partir de esta fuente se va degradando, se produce un gradiente de concentración cuyo máximo se encontrará en la fuente. La substancia puede actuar como morfógeno, cuya concentración local controlará el comportamiento de las células según su distancia respecto a la fuente.
11 30
Capítulo 2 1 : Mecanismos celulares del desarrollo
(C) señales intercelulares de corto alcance Figura 21-26 Tres tipos de señales para tres estilos de form ación de patrones. (A) Las señales
intracelulares pueden organizar los determinantes citoplasmáticos dentro del huevo, que heredarán los distintos blastómeros cuando el huevo se divida. (B) Señales difusibles de largo alcance procedentes de un centro señal pueden dirigir el patrón global de especialización celular en el tejido envolvente. (C) Interacciones de corto alcance, célula-célula, pueden crear un mosaico de células minúsculas que se encuentran en diferentes estados; a menudo juegan un papel crucial en la toma final de decisiones sobre la diferenciación en tejidos complejos como la retina y otros epitelios sensoriales.
distancia de la fu e n te --------- ►X
en el embrión de Xenopus intacto es incierta, y la naturaleza de las señales produ cidas por el Organizador de Spemann todavía no es conocida.
Las células pueden reaccionar de forma distinta a una señal según el momento en que la reciban: función de un reloj intracelular22 Generalmente, a medida que se produce el desarrollo, las células embrionarias cam bian su carácter a pesar de que su entorno permanezca inalterado. Si extrae mos célula del polo animal de una blástula de Xenopus y las m antenemos aisla das in vitro, se diferenciarán espontáneam ente en epidermis aproximadamente al mismo tiempo en que lo harían en condiciones normales. En este sentido, las células actúan como si estuvieran controladas por una especie de reloj intrace lular. Las células cam bian espontáneam ente su estado interno, por lo que pue den responder de forma diferente a una señal inductora en función del m om en to en que la reciban. Si por ejemplo extraemos un fragmento del epitelio del polo animal de una gástrula temprana y lo insertamos en el rudimento del ojo de un embrión más desarrollado, este fragmento será inducido (de forma inade cuada) a convertirse en un trozo de tejido parecido al tubo neural; en cambio, si le permitimos que madure unas horas in vitro antes de injertarlo en el mismo entorno, se convertirá (de forma adecuada) en un cristalino; si se cultiva in vitro un período todavía más largo, pierde la capacidad para responder a la influencia inductora del ojo rudimentario en ambos sentidos. De estos hechos se puede concluir una cuestión general importante: la di versidad celular y los patrones espaciales pueden aparecer a partir de una sim ple señal inductora invariable que actúe en una sucesión de célula idénticas, en distintos m omentos (Figura 21-28). Ya hemos visto por ejemplo que las partes del eje central del cuerpo se forman secuencialmente durante la gastrulación, involucionando primero las zonas anteriores alrededor del labio del blastoporo y las zonas posteriores después. De acuerdo con una teoría, las diferencias en la edad a la cual las células sobrepasan el labio dorsal y reciben la influencia del Organizador de Spemann son la causa de las diferencias de carácter celular en tre las zonas anterior y posterior del mesodermo y el endodermo y análogamen te en todo el cuerpo. Así pues la estrategia general de formación de patrones puede resumirse así; ( 1) los patrones son resultado de simples asimetrías, (2) los detalles se generan secuencialm ente mediante interacciones célula-célula, y el patrón de diversifi cación celular resultante depende tanto de (3) las señales posicionales entre las células, como de (4) programas intracelulares que cambian con el tiempo la res puesta celular a estas señales. Las diferentes especies com binan de forma distinta estos cuatro elementos básicos. Ahora consideraremos el caso especial de un embrión temprano de m a mífero, que tiene algunas propiedades reguladoras notables.
Figura 21 -28 La influencia temporal. Una señal invariable actúa sobre células similares pero de edades diferentes, lo cual puede evocar respuestas diferentes. Los patrones espaciales pueden producirse de esta forma, permitiendo que una señal invariable actúe en momentos distintos sobre diferentes miembros de una formación de células inicialmente similares.
En los mamíferos, el protegido entorno uterino permite un tipo extraordinario de desarrollo temprano9,23 El em brión de mamífero actúa de forma distinta del de otros animales en mu chos aspectos. Al desarrollarse en el entorno protegido del útero, no tiene la m is ma necesidad que los embriones de la mayoría de las demás especies de com pletar rápidamente los estadios iniciales del desarrollo. Además, el desarrollo de una placenta proporciona pronto alimento procedente de la madre, por lo que el huevo no necesita tener grandes reservas de alimentos básicos como el vitelo. El huevo de ratón tiene un diámetro aproximado de tan sólo 80 |im, por lo que su volumen es 2000 veces menor que el de un huevo de un anfibio común. Sus divisiones de segmentación no se producen más rápidamente que las divisiones de muchas células somáticas ordinarias, y la transcripción genética ya se inicia en el estadio de 2 células. Además, mientras que las etapas más avanzadas del desarrollo de los mamíferos son fundamentalmente similares a los de otros ver-
Diversificación celular en el embrión animal temprano
1131
huevo fecundado de ratón
2 células de 1 1/2 días
órula, de , „8mcélulas 01, ,, de ------------------► . ., 2 1/ 2 dias compactacion
sección del blastocisto de 4 días
. 16 células ,, de, 3_ días
cuerpo polar
pelúcida
pronúcleos materno y paterno
celular interna
trofoectoderm o
5G |jm tebrados com o Xenopus, los mamíferos empiezan por dar un gran rodeo en su desarrollo, formando un conjunto de complicadas estructuras -principalm ente el saco amniótico y la placenta- que envuelven y protegen al embrión y que pro porcionan las condiciones idóneas para intercambiar metabolitos con la madre. Estas estructuras, com o el resto del cuerpo, derivan del huevo fecundado pero se denominan extraembrionarias debido a que se eliminan en el parto y no forman parte del animal adulto. En la Figura 21-29 se resumen los estadios tempranos del desarrollo del ra tón. Inicialm ente el huevo está rodeado por una cubierta celular transparente, la zona pelúcida. Tras la fecundación, el huevo se segmenta dentro de la cubierta formando un grupo celular con forma de mora denominado mórula. En algún momento entre los estadios de 8 células y de 16 células, la superficie de la móru la se alisa y adquiere una apariencia casi esférica a medida que las células modi fican sus uniones y el grupo se vuelve más compacto (Figura 21-30), y las células situadas en el exterior de la esfera se unen entre sí mediante uniones herm éti cas, aislando el interior de la mórula del medio externo. Poco después, los espa cios intercelulares internos se ensanchan dando lugar a una cavidad central que se llenará de fluido -e l blastocele. En este estadio la mórula ya se ha convertido en un blastocisto. Las células del blastocisto forman una lámina esférica que en vuelve el blastocele, en la que se destaca un polo debido a una mayor acumula ción de células. Como se observa en la Figura 21-29, la capa celular externa es el
Figura 2 1 -29 Las prim eras etapas del desarrollo del ratón. (Fotografías por cortesía de Patricia Calarco, de G. Martin, Science 209:768-776, 1980. Copyright 1980 the AAAS.)
Figura 2 1-30 Electronm icrografía de barrido de un embrión tem prano de ratón. Se ha extraído la zona pelúcida. (A) Fase de dos células. (B) Fase de cuatro células (además de los cuatro blastómeros se observa un cuerpo polar). (C) Mórula de ocho a dieciséis células -s e produce la com pactacion. (Cortesía de Patricia Calarco y C.J. Epstein, Dev. Biol. 32:208-213, 1973.)
1 13 2
Capitulo 2 1 : Mecanismos celulares del desarrollo
I________
10 pm
trofoectodermo ; el grupo de células situadas en el interior del trofoectodermo, en el polo más grueso, se denomina masa celular interna. De la masa celular interna deriva todo el embrión. El trofoectodermo es el precursor de la placenta y es el primer componente que aparece del futuro siste ma de estructuras extraembrionarias. Cuando la zona pelúcida se ha formado, las células del trofoectodermo entran en contacto con la pared del útero, de for ma que el embrión queda implantado. Mientras tanto, la masa celular interna crece y empieza a diferenciarse. Parte de ella da lugar a estructuras extraembrio narias, como el saco vitelino, y el resto participa en la formación del embrión mediante procesos de gastrulación, neurulación, etc., que son muy parecidos a los de otros vertebrados, a pesar de que notables distorsiones geométricas difi culten nuestra percepción de ellas.
Todas las células del em brión animal temprano tienen el mismo potencial de desarrollo24 Hasta que llegan al estadio de 8 células, las células del embrión temprano de mamífero conservan su capacidad de desarrollarse en cualquier parte del em brión adulto. Si el embrión temprano se partiera en dos, se producirían un par de gemelos idénticos -u n a única célula produciría dos individuos totalmente normales. De forma parecida, si una de las dos células de un embrión de ratón bicelular se destruyen mediante pinchazos con una aguja, y se coloca el “medio em brión” resultante en un útero de una madre adoptiva para que se desarrolle, en muchos casos nacerá un ratón completamente normal. Inversamente, dos embriones de ratón de ocho células cada uno se pueden com binar formando una mórula gigante, la cual se desarrollaría formando un ratón de tamaño normal (Figura 21-31). Tales criaturas, producto de agregados de células genéticam ente diferentes, se denominan quim eras. Las quimeras también pueden generarse inyectando células de un embrión temprano de un genotipo en el interior de un blastocisto de otro genotipo. Las células inyectadas se incorporan a la masa celular interna del blastocisto receptor desarrollándose un animal quimérico. Es incluso posible conseguir una quimera inyectando de esta forma una sola célula; de esta forma se puede estudiar la capacidad de desa rrollo de una célula aislada. Una de las conclusiones más importantes derivadas de estos estudios es que inicialmente las células de un embrión temprano de mamífero (hasta que alcanzan el estadio de 8 células) son idénticas y no tienen restringida ninguna de sus capacidades: todas ellas son totipotentes. Aparente mente los determinantes localizados no juegan ningún papel en el huevo de m a mífero, y el patrón de diversificación celular del embrión se genera posterior mente, y de forma completa, mediante las interacciones de unas células con otras y con su entorno.
em brión de ratón en la em brión de ratón en la fase de 8 células, cuyos fase de 8 células, cuyos padres son blancos padres son negros
la zona pelúcida de cada huevo se elim ina m ediante un tratam iento con proteasas
los em briones se colocan juntos y se fusionan incubándolos a 37°
el desarrollo de los em briones fusionados continúa in vitro hasta la fase de blastocisto
el blastocisto se transfiere a un ratón pseudofecundado que actúa com o nodriza
la cría de ratón tiene cuatro padres (además de la nodriza) Figura 21-31 Procedim iento para generar un ratón quimérico. Se
combinan dos tipos de mórulas de genotipo diferente.
Las células madre em brionarias de los mamíferos m uestran cómo señales procedentes del entorno pueden controlar el ritmo y la vía de desarrollo25 El desarrollo temprano de los mamíferos está altamente regulado. El futuro de cada célula se determina a través de interacciones con sus vecinas. Los experi mentos con ratones que acabamos de describir lo ilustran perfectamente. Las células de un medio-embrión o de un embrión quimérico doble tienen que ajus tar su comportamiento para poder generar un animal completamente normal en cuanto a su patrón y a su tamaño. Sin embargo, cuando las circunstancias de desarrollo son mucho más anormales, las células embrionarias pueden quedar totalm ente fuera de control. De este fenómeno hemos de aprender varias leccio nes importantes. Si se inyecta un embrión temprano normal de ratón en el riñón o en el testí culo de un adulto, el embrión queda rápidamente desorganizado y desaparecen los controles normales de la proliferación celular. El resultado de ello es un gro-
Diversificación celular en el embrión animal temprano
1133
testo crecim iento denominado teratoma, cuya composición es una masa desor ganizada de células que contienen muchas variedades de tejidos diferenciados -piel, hueso, epitelio glandular, e tc m e z c la d o s con células madre indiferenciadas que continúan dividiéndose y generan todavía más tejidos diferenciados. Teratomas de propiedades parecidas a éstas también pueden aparecer espontá neam ente en las gónadas a partir de células germinales como resultado de va rios accidentes del desarrollo. Es posible derivar cánceres transplantables a partir de los teratomas. Tales teratocarcinomas crecerán ilimitadamente hasta que maten a su huésped. Se pueden conservar indefinidamente implantando de forma seriada muestras de las células tumorales de un huésped a otro y se observa que los teratocarcino mas siempre contienen algunas células madres indiferenciadas, junto con una gran variedad de tipos de células diferenciadas producto de las células madre. Las células madre de los teratocarcinom as tam bién pueden m antenerse en cul tivo com o líneas celulares permanentes. Podría pensarse que las células madre de los teratocarcinomas, como otros ti pos de cáncer, se originan por mutaciones de genes responsables de los controles normales del comportamiento celular (Capítulo 24). Sin embargo, las observacio nes siguientes sugieren que no es ése el caso. Se pueden obtener células madre con propiedades muy parecidas a éstas colocando la masa celular interna normal en un cultivo y dispersando las células al inicio de su proliferación. Una vez dispersa das, si las mantenemos en condiciones idóneas en el cultivo, algunas de estas cé lulas continuarán dividiéndose indefinidamente sin alterar su características. Las líneas de células madre embrionarias (ES, de Embrionic Stem) son similares a las lí neas celulares derivadas de teratocarcinoma, pero se pueden generar a partir de embriones normales con una frecuencia tan alta que es poco probable que sean producto de mutaciones. Por el contrario, parece que al separar las células de sus vecinas normales y colocarlas en un medio de cultivo adecuado, el curso normal de su programa de cambios temporales de caracteres celulares se detiene, lo cual permite que las células continúen dividiéndose indefinidamente sin diferenciarse. Parece que la presencia en el medio de un factor de crecimiento proteico denomi nado factor inhibidor de leucemia (LIF, de Leukemia Inhibitory Factor), es crucial para la detención del programa de desarrollo. Con un coctel un poco más comple jo de factores de crecimiento podríamos inducir el mismo tipo de comportamiento en células germinales embrionarias en cultivo. El estadio en el que se detienen las ES, los teratocarcinomas, o las células madre derivadas de células germinales parece ser equivalente al de las células de la masa celular interna normal. Ello puede ponerse de manifiesto tomando las células de una placa de cultivo e inyectándolas dentro de la cavidad del blasto cele de un blastocito normal (Figura 21-32). Las células inyectadas quedan in corporadas a la masa celular interna del blastocisto y pueden contribuir en la formación de un ratón quimérico aparentem ente normal. Los descendientes de las células madre inyectadas están presentes en prácticamente todos los tejidos del ratón, donde se diferenciarán ordenadamente y de forma apropiada para su localización y pueden incluso formar células germinales viables. Esta capacidad de las células ES constituye la base de una técnica muy utilizada gracias a la cual se generan ratones con una mutación diseñada por ingeniería genética en cual quier gen escogido cuyo DNA se haya clonado. Para producir tales ratones “de genes fuera de com bate” (gene-knockout), se construyen células ES mutantes seleccionando para una inserción de DNA que substituya el gen escogido por una versión modificada artificialmente; la célula ES mutante se utiliza entonces para producir un ratón quimérico que contenga la mutación en sus células ger minales (véase pág. 353). El comportamiento sorprendentemente adaptable de las células ES demues tra que las señales del entorno no sólo determinan qué opciones seguir entre di ferentes vías de diferenciación, sino que en algunos casos también ponen en marcha o detienen el reloj del desarrollo celular -e s decir los procesos que con ducen el progreso de la célula desde que es un embrión hasta su estado adulto.
1 1 34
Capítulo 2 1 : Mecanismos celulares del desarrollo
células ES derivadas de una cepa pigm entada de ratón
blastocisto receptor de una cepa albina de ratón
se mantiene una pipeta de succion
grupo de células ES en una m icropipeta
células ES inyectadas en el interior de la cavidad del blastocisto
las células inyectadas se incorporan a la masa celular interna del blastocisto huésped el blastocisto se desarrolla en una nodriza, form ando un ratón quim érico sano Figura 21-32 Producción de un ratón quimérico con células ES o células madre de teratocarcinom a. El
experimento demuestra que las células madre pueden combinarse con las células de un blastocisto normal formando un ratón quimérico sano.
Resumen
En el transcurso del desarrollo embrionario a partir de un huevo fecundado se ge neran muchos tipos de células. Los genomas de la células diferenciadas son idénti cos; lo que las distingue es el patrón de expresión de sus genes. Generalmente, algu nas de las diferencias entre las células del embrión temprano tienen su origen en una distribución desigual de los determinantes localizados citoplasmáticos del huevo antes de su segmentación, pero la mayoría de ellas surgen más tarde a partir de diferencias localizadas en el entorno de las células del embrión. Por ejemplo, en el embrión temprano de Xenopus, las células animales y vegetativas heredan deter minantes citoplasmáticos distintos del huevo, y luego algunas de las células anima les reciben una influencia de las células vegetativas que las induce a desarrollarse como mesodermo en vez de ectodermo. Esta inducción mesodérmica parece estar mediada por familias de factores proteicos de crecimiento que también contribuyen a regular el crecimiento y la diferenciación del organismo adulto. Los huevos de mamífero son excepcionales dado que son esencialmente simé tricos. Así, inicialmente todas las células de un embrión temprano de mamífero son iguales y solamente se diferencian a través de la interacción de unas con otras. Me diante interacciones célula-célula, las células de dos embriones tempranos de ratón ajustan su futuro y colaboran formando un único ratón quimérico. Células de un embrión temprano de ratón, alejadas de las influencias típicas de sus vecinas, pue den proliferar deforma inadecuada dando lugar a teratocarcinomas, de los cuales se pueden obtener células madre embrionarias. Sin embargo, estas células recupe ran un comportamiento normal cuando se implantan en un embrión temprano normal, y sus descendientes se diferencian según su entorno y pueden contribuir a la formación de un animal quimérico normal.
Memoria celular, determinación celular y el concepto de valores posicionales Las células no sólo han de ser diferentes, sino que han de permanecer diferencia das tras la desaparición de las influencias originales responsables de la diversifi cación celular. A pesar del continuo recambio y resíntesis de prácticamente to dos los com ponentes celulares, en el adulto muchos tipos de células tienen características distintivas que se mantienen estables y heredables, incluso cuan do el entorno cambia. Así, cuando una célula pigmentaria se divide, sus hijas continúan siendo células pigmentarias; cuando un queratinocito de la piel se di vide, sus hijas continúan siendo queratinocitos; y, aunque un fibroblasto puede convertirse en otro tipo de célula perteneciente a un tejido conjuntivo, como una célula cartilaginosa, nunca se convertiría en una neurona o en una célula del hígado; y así sucesivamente. Las diferencias entre tipos celulares se deben, en último término, a las distintas influencias a que han sido sometidas las célu las en el embrión, pero dichas diferencias se mantienen debido a que las células recuerdan de alguna manera los efectos de pasadas influencias y los transmiten a sus descendientes. Como veremos en este apartado, la memoria celular -y los tipos de información celular, especialmente la posicional, que las células con servan como consecuencia- son elementos centrales de los mecanismos de modelaje que hacen posible un organismo pluricelular complejo.
A menudo las células quedan determinadas para su futuro papel especializado mucho antes de que se diferencien m anifiestam ente15,26 La existencia de una memoria celular se hace patente en la persistencia y estabi lidad de los estados diferenciados de las células del cuerpo adulto (véase Capítu lo 22). Pero habitualmente, el carácter final de una célula ha sido decidido a tra vés de una secuencia com pleja de influencias que afectaron a sus progenitoras
Memoria celular, determinación celular y el concepto de valores posicionales
1135
durante el desarrollo y este carácter puede haber sido establecido y fijado mu cho antes de que se manifieste la diferenciación. Por ejemplo, a través de varias series de decisiones tomadas antes, durante y justo después de la gastrulación, algunas células de los somitos de un vertebrado se especializan, en un estadio muy temprano, como precursoras de las células del músculo esquelético; enton ces migran desde los somitos a otras regiones, entre ellas a las regiones donde se formarán las extremidades (véase Figura 21-16). Estos precursores de células musculares carecen de las grandes cantidades de proteínas contráctiles especia lizadas que se encuentran en las células musculares maduras; de hecho, superfi cialm ente se parecen mucho a las otras células del rudimento de las extremida des. Pero después de varios días empiezan a fabricar grandes cantidades de las proteínas típicas del músculo, mientras que las otras células de las extremida des, con las que están mezcladas, se diferencian en varios tipos de células de te jido conjuntivo. Por lo tanto, la decisión de desarrollarse en célula muscular o en célula del tejido conjuntivo se había tomado mucho antes de que tal diferencia ción se manifestase abiertamente, y se registra en cada célula como un cambio molecular que no tiene ninguna consecuencia apreciable en la apariencia exter na de la célula. Se dice que una célula que ha tomado una decisión sobre su desarrollo está determinada. Dado que dicho concepto es parte fundamental del lenguaje de la biología del desarrollo, nos será útil contar con una definición formal: una célula está d e te rm in a d a si ha sufrido un cambio autoperpetuante de carácter interno que la diferencia, a ella y a su progenie, de las otras células del embrión, y que las obliga a tomar una vía de desarrollo especializada. Normalmente, el término d ife re n c ia c ió n se reserva para designar la especialización celular manifiesta, es decir, referida a la especialización de un carácter celular muy evidente. General mente una célula ya está determinada antes de su diferenciación, aunque en al gunos casos ambos procesos ocurren simultáneamente. De hecho, la diferencia ción puede ocurrir sin determinación, siempre que la especialización del carácter celular sea reversible.
El mom ento de la determ inación celular puede ponerse de m anifiesto por medio de experimentos de trasplante27 Para comprobar si una célula o un grupo de células está determinado, se ha de demostrar que estas células tienen un carácter distintivo que se mantiene incluso aunque las circunstancias se alteren experimentalmente. La técnica más común consiste en trasplantar las células a un entorno experimental (Figura 21-33). Un ejemplo sencillo de este tipo de experimento nos lo proporcionan los es tudios con embriones de anfibios. Como apuntábamos anteriormente, es posible trazar el mapa futuro de la blástula o de una gástrula temprana, indicando qué partes de la misma se desarrollarán, según su proceso normal, y en qué se con-
dador
antes de m anifestar la diferenciación huésped
Figura 21-33 Prueba estándar de determinación.
\
tras la manifestación de la diferenciación FUTURO NORMAL
1 13 6
NO DETERMINADO
Capítulo 2 1 : Mecanismos celulares del desarrollo
DETERMINADO
vertirán. Por ejemplo, las células de una región están destinadas a convertirse en epidermis si su desarrollo sigue el curso normal, mientras que el destino de las de otras regiones será convertirse en cerebro. Para establecer cuándo estos dos gru pos de células quedan determinados para seguir sus vías de diferenciación parti culares, se secciona un bloque de células de la futura región epidérmica y se las sitúa en la futura región encefálica, y viceversa. Si la células se trasplantan en el estadio de gástrula temprana, no muestran memoria alguna de sus orígenes y se diferencian de la forma más apropiada para sus nuevas localizaciones. No obs tante, si el mismo experimento se realiza un poco más tarde, en la gástrula tardía, las futuras células del cerebro trasplantadas a una localización epidérmica se di ferenciarán como tejido neuronal desplazado y las futuras células epidérmicas trasplantadas a una localización cerebral se diferenciarán como epidermis des plazada. Esto demuestra que ambos grupos de células han quedado determina dos en algún momento entre el estadio de gástrula temprana y tardía.
La determ inación y la diferenciación celulares reflejan la expresión de genes reguladores28 Del fenómeno de determinación celular surgen tres cuestiones moleculares: ¿Qué molécula o moléculas definen el estado de determinación de una célula; qué mecanismo de memoria mantiene este estado; y cómo se acoplan determi nación y diferenciación? En general, el carácter de una célula está dirigido por la com binación de las proteínas reguladoras de genes que contiene. Estas proteí nas controlan su patrón de expresión génica. En el caso ampliamente estudiado del músculo, visto en el Capítulo 9, las proteínas de la fam ilia MyoD estrecha mente relacionadas con las proteínas miogénicas (MyoD, Myf5, MRF4 y miogenina) desempeñan un papel crucial en dicha regulación. En circunstancias apro piadas estas proteínas pueden activar la expresión de genes específicos del músculo, como la actina y la miosina musculares; la introducción de un m iem bro de la familia MyoD dentro de los fibroblastos y de otros tipos celulares dis tintos puede convertirlos en células precursoras del músculo. En un desarrollo normal, los genes que codifican las proteínas de la familia MyoD inician su ex presión muy pronto en las células precursoras del músculo a medida que éstas dejan los somitos, lo cual sugiere que la presencia de estas proteínas define el estadio de determinación celular. Si por ejemplo se elimina el gen miogenina mediante recom binación génica dirigida, las células musculares no consiguen desarrollarse. El conjunto de genes sujetos a activación por la actuación de los miembros de la familia MyoD incluye al menos algunos de los genes de esta misma familia. Por esta razón, normalmente la expresión de un miembro de la familia conlleva también la expresión de otros miembros. Además, algunas de estas proteínas re guladoras actúan directamente en su propio gen manteniendo la expresión del gen una vez ha sido activada. La retroalimentación positiva resultante de una ac tivación mutua y de una auto-activación proporciona un mecanismo posible de memoria celular, tal como se vio en el Capítulo 9. Aun así todavía existe un problema: las células precursoras de músculo no empiezan a fabricar grandes cantidades de proteínas específicas del músculo hasta días, semanas o quizá años después de haber abandonado los somitos. ¿Cómo pueden continuar sin diferenciarse durante tanto tiempo una vez que han quedado determinadas? El mecanismo podría depender de otras proteínas que interactúan con miembros de la familia MyoD regulando su acción. Como se vio en el Capítulo 9, MyoD y sus parientes pertenecen a la superfamilia hélice-buclehélice, cuyos miembros dimerizan unos con otros, se unen al DNA y activan la expresión génica. La eficiencia de la activación génica depende de la correcta elección del compañero para efectuar la dimerización. Aparentemente, la regula ción de la disponibilidad de compañeros apropiados para la dimerización de una proteína de la familia MyoD bastará para que la célula pueda cambiar de un esta do determinado, en el cual la proteína sólo es capaz mantener la producción de
Memoria celular, determinación celular y el concepto de valores posicionales
1137
Figura 21-34 Circuito del control gènico para la determ inación de una ñbra muscular. En este diagrama simplificado sólo se muestran dos
miembros representativos de la familia de genes MyoD -el propio myoD y el gen miogenina. La activación mutua y la auto-activación de estos genes por parte de sus propios productos crea una retroalimentación positiva que conlleva la expresión autoperpetuante de los genes. Id es una proteína hélicebucle-hélice codificada por el gen inhibidor de la unión a DNA; gracias a su dimerización con otras proteínas hélice-bucle-hélice, y particularmente debido a su competición con miembros de la familia MyoD para obtener compañeros de dimerización adecuados, se cree que dificulta la expresión tardía de genes musculares específicos. Sin embargo el sistema de control completo es mucho más complicado de lo que sugiere este diagrama.
miembros de la familia MyoD, a un estado ya diferenciado, en el cual la proteína activa toda la variedad de genes musculares específicos (Figura 21-34).
El estado de determ inación puede estar controlado por el citoplasm a o puede ser intrínseco a los crom osom as29 La memoria celular, tal como se manifiesta en el fenómeno de la determinación, es uno de los principales problemas que desafían a la biología molecular. En el Capítulo 9 vimos algunos de los mecanismos moleculares a través de los cuales al gunos patrones de expresión gènica pueden convertirse en autoperpetuantes. En el contexto de la determinación celular pueden distinguirse tres grandes categorí as de memoria celular, que podrían denominarse respectivamente: memoria cito plasmàtica, autocrina y nuclear. El mecanismo que acabamos de apuntar sobre las proteínas miogénicas es un ejemplo de memoria citoplasmàtica. En este caso los componentes codificados por el conjunto de genes activos están presentes en el citoplasma, y actúan directa o indirectamente sobre el genoma manteniendo la expresión selectiva de este conjunto determinado de genes. Una consecuencia de este mecanismo es que si un núcleo tomado de un tipo de célula diferenciada se inyecta en el citoplasma de otro tipo celular, debería de modificar su patrón de expresión gènica para encajar con el carácter del citoplasma huésped. Los experi mentos de trasplante nuclear efectuados en huevos de anfibio que estudiamos anteriormente proporcionan un ejemplo de esta clase de comportamiento. El m ecanism o de memoria autocrina es una variante del mecanismo cito plasmàtico. Tam bién depende de la síntesis de productos que estimulan su pro pia producción, pero con la característica especial de que estos productos se se gregan al medio extracelular y actúan sobre el exterior de la célula para que la célula permanezca en el estado óptimo para su producción. Este mecanismo tie ne un efecto secundario importante: debido a que las células vecinas comparten el mismo entorno extracelular, tenderán a actuar colectivamente, adoptando el mismo estado porque están expuestas a las substancias que ellas mismas produ cen, y por lo tanto una célula individual trasplantada a un medio nuevo tenderá a cam biar su carácter para ajustarse al de las células que la rodean por todos la dos. Así pues, un grupo celular puede actuar como determinado aunque una cé lula de este grupo aislada no lo esté. Parece que estos “efectos comunitarios” de la determ inación celular son bastante corrientes y se han estudiado con profun didad en el embrión temprano de Xenopus. A diferencia de las memorias citoplasmàtica y autocrina, la memoria nuclear depende de cam bios autoperpetuantes que son intrínsecos de los cromosomas -cam bios que definen la selección de genes que se expresan, sin alterar la se cuencia de DNA. La inactivación del cromosoma X (véase pág. 476) y la actividad heredable (véase pág. 481) son ejemplos claros de ello. La base de la memoria nuclear son las modificaciones heredadas en la cromatina o en el DNA; la m e moria citoplasmàtica, por el contrario, permite que dos genes idénticos coexis tan con diferentes estados en una única célula, uno expresado y el otro inhibido, aunque ambos estén expuestos al mismo entorno intracelular.
1 13 8
Capítulo 21 : Mecanismos celulares del desarrollo
En los temas concernientes a la memoria celular nuestra ignorancia es pro funda, todavía, y en la mayoría de los casos aún no podemos discernir si la m e moria es citoplasmática o nuclear.
Las células de los tejidos en desarrollo recuerdan sus valores posicionales30 En el embrión animal las señales posicionales y las interacciones actúan a dis tancias cortas, aproximadamente a un milímetro o incluso menos, y estas in fluencias dejan su huella en el carácter celular a través de la memoria celular. A medida que el cuerpo se va desarrollando, otras influencias más avanzadas ac túan sobre cada una de sus regiones, creando nuevas diferencias dentro de cada clase de células y trazando niveles de detalle cada vez más finos sobre el mapa corporal básico original. Así pues cuando las células quedan sometidas a un modo de diferenciación particular, normalmente quedan especificadas regionalmente: adquieren marcas bioquímicas distintas de dirección, o valores posicionales, que reflejan su loca lización en el cuerpo. El valor posicional de una célula guiará su com portam ien to en fases consecutivas del patrón de formación -la manera en que responderá a señales posicionales posteriores, las vías de interacción con sus vecinas, y toda la variedad de modos de diferenciación abiertos a ella misma y a su progenie. Se dice que las influencias que controlan la elección del valor posicional proporcio nan a la célula la información posicional. La existencia y la naturaleza de valores posicionales almacenados en la m e moria se demuestra mediante experimentos sobre injertos llevados a cabo entre un muslo y un ala de pollo, ambos en desarrollo. Tanto el muslo como el ala adultos tienen músculo, hueso, piel, etc., y prácticamente la misma proporción de tejidos diferenciados. La diferencia entre ambas extremidades no radica en la clase de tejidos, sino en su distribución espacial. ¿Cómo se produce esta diferen cia? A simple vista podría parecer más simple explicar la diferencia en términos de la presencia de una distribución espacial de señales distinta para las extremi dades anterior y posterior, ambas en desarrollo, que ordenara directamente a las células qué estado diferenciado deben adoptar. Un simple experimento utilizan do injertos demuestra que esta visión es profundamente errónea. En el embrión de pollo, el ala y el muslo se originan casi simultáneamente en forma de pequeñas yemas con forma de lengua que se proyectan desde el costado (Figura 21-35). Al principio las células de los dos pares de yemas de las
Figura 21-35 D esarrollo de un em brión de pollo. (A) Un embrión de pollo después de tres días de incubación, ilustrando las localizaciones iniciales de las yemas tempranas de las extremidades. (B) Electronmicrografía de barrido que muestra una vista dorsal de la yema del ala y los somitos adyacentes, un día después; la yema ha crecido convirtiéndose en una proyección con forma de lengua de aproximadamente lm m de largo, 1 mm de ancho, y 0,5 mm de grosor. (A, según W.H. Freeman y B. Bracergirdle; An Atlas of Embriology. London: Heinemann, 1967; B, cortesía de Paul Martin.)
vesícula auditiva cerebro posterior notocorda cerebro m edio cerebro anterior yema del ¿i Iei tubo neural som ilos yema de la pata
(Bl
Memoria celular, determinación celular y el concepto de valores posicionales
500 |_im
1 139
Figura 2 1 -3 6 Futuro tejido del muslo injertado en el extrem o de la yema de un ala form a dedos del pie. (Según J.W. Saunders et al., Dev. Biol. 1:281301,1959.)
extremidades aparecen similar y uniformemente indiferenciadas (véase Figura 19-30). Entonces se puede seccionar una pequeña cantidad de tejido no diferen ciado de la base de la yema del muslo, procedente de la región que normalmente daría lugar a parte de la cadera, e injertarse en la punta del extremo de la yema del ala. El injerto no formará la parte del ala correspondiente ni tampoco una pieza desplazada de tejido de la cadera, sino un dedo del pie (Figura 21-36). Este experi mento demuestra que las células de las yemas del muslo temprano ya están deter minadas como muslo, aunque su determinación sólo implica que formarán parte de la extremidad posterior sin concretar la parte del muslo que formarán: todavía pueden reaccionar ante influencias de la yema del ala, formando así estructuras adecuadas para el extremo de la extremidad más que para la base. Al parecer, el sistema de señales que controla las diferencias entre las partes de las extremida des es el mismo para el muslo y para el ala. La diferencia entre las dos extremida des deriva de una diferenciación presente en los estados internos de sus células en el inicio del desarrollo de las extremidades. Aunque las células parecen iguales y están destinadas a dar lugar a la misma variedad de tipos celulares diferencia dos, son no equivalentes, y presentan valores posicionales distintos. Así pues la especialización del comportamiento de las células de las extremidades se desarrolla de forma combinada: primero, y según la información que reciban, formarán par te del ala o del muslo; luego señales presentes en el interior de la yema de la extre midad especifican componentes más detallados de valor posicional, indicando la colocación exacta en la extremidad. Una de las revelaciones más notables de la genética molecular moderna ha sido que casi todos los animales parecen utilizar los mismos mecanismos m ole culares altamente conservados para retener los valores posicionales situados a lo largo del todo el eje corporal (de la cabeza a la cola), y algunos de estos mismos productos genéticos también pueden actuar especificando valores posicionales en la extremidades de los vertebrados. Tendremos que aplazar nuestras teorías sobre estos importantes controladores del patrón corporal hasta que hayamos estudiado la mosca del vinagre, Drosophila, cuyos mecanismos fueron los prime ros en ser descubiertos y caracterizados.
yema de la pata
yema del ala
masa de tejido m esodérm ico que habría form ado las estructuras del m uslo
presunto tejido del m usculo injertado en el extrem o de la yema del ala
dedos del pie acabados parte superior en garra del ala y antebrazo ala resultante
El patrón de valores posicionales controla la proliferación celular y se regula a través de intercalación31 Un aspecto crucial del patrón de formación es la regulación de la proliferación celular, a través de la cual las diferentes partes del patrón alcanzan sus tamaños adecuados. Muy a menudo, tanto el crecim iento como el patrón de valores posi cionales dependen de un estrecho acoplamiento de interacciones célula-célula continuas. Partiendo de estudios realizados sobre la regeneración que ocurre en varios organismos cuando se yuxtaponen fragmentos de tejido con valores posi cionales distintos y se concede el tiempo necesario para que crezcan y se adap ten, se ha deducido una ley sencilla, cuyos principios al parecer son bastante co rrientes. Quizás su ejemplo más claro sean los estudios realizados sobre la pata de la cucaracha (Figura 21-37).
fém ur
tibia Figura 2 1 -37 La pata de la cucaracha. Mediante mudas sucesivas la cucaracha se hace cada vez más grande (por proliferación celular), pero no cam bia su estructura básica. La pata se reviste de una cutícula segregada por una capa epidérmica y que es reemplazada en cada muda. El patrón de la cutícula refleja el patrón de valores posicionales que subyacen a la capa epidérmica.
114 0
Capítulo 2 1 : Mecanismos celulares del desarrollo
trocánter trocánter tarso
garras
(B)
Figura 21 -38 Regeneración intercalada. Si se injertan regiones de la tibia de la cucaracha que no se corresponden, se intercalará (mediante proliferación celular) un tejido nuevo [verde), para rellenar los vacíos en el patrón de valores posicionales (numerados de 1 a 10). En el caso de (A) la intercalación restablece la parte ausente. En (B) la intercalación genera una tercera parte central de la tibia entre las dos partes centrales ya presentes. Las quetas indican la polaridad del tejido intercalado. En ambos casos la continuidad se restablece en el patrón final de los valores posicionales.
Las cucarachas pertenecen a la clases de insectos que no presentan una m e tamorfosis radical de la larva al adulto, sino una progresión gradual a través de una serie de formas juveniles separadas por mudas, en las cuales se elimina la capa de cutícula vieja y se genera una nueva capa mayor. La cucaracha juvenil tiene extremidades bien diferenciadas, pero sus células diferenciadas - a diferen cia de las extremidades hum anas- todavía son capaces de responder a las in fluencias que controlan el desarrollo del patrón de la extremidad y pueden rege nerar dicha extremidad si ésta se ve perturbada. Así pues, los mecanismos del sistema de patrón de formación se pueden poner a prueba mediante operacio nes realizadas bastante después del período de desarrollo embrionario. Si a una cucaracha le amputamos dos patas por uno de sus segmentos m e dios -e s decir por la tib ia- pero por distintos niveles, el fragmento distal de una pata puede ser injertado en el muñón proximal del otro, de modo que la pata com puesta sane aun careciendo de la parte central de la tibia. A pesar de ello, la pata que aparece tras la muda parece normal: la parte media del patrón ha re generado la parte que echaba en falta (Figura 21-38A). Más sorprendente es el resultado de una variante de esta operación. Se corta la tibia de una de las cuca rachas cerca del extremo proximal y otra tibia de otra cucaracha cerca del extre mo distal. Antes injertam os las dos partes seccionadas más pequeñas de ambas patas, pero en esta variación injertaremos el fragmento y el muñón más gran des. El resultado de este injerto será una pata excesivamente grande cuyo frag m ento central es el doble de lo normal (Figura 21-38B). Dejamos que el animal efectúe la muda. La pata resultante, en lugar de tener un tamaño más o menos normal, todavía es más larga porque se ha desarrollado una tercera parte cen tral entre las dos que ya existían. Tal como se ilustra en la Figura 21-38B, las quetas de esta nueva región apuntan en dirección contraria a las de las del resto de la tibia. Se pueden realizar muchas operaciones de este tipo, y todas ellas apuntan hacia la existencia en la epidermis del insecto de un sistema de valores posicionales que convierten en no equivalentes a las células situadas en posiciones dis tintas a lo largo del eje de la extremidad, hecho que va parejo al control de la proliferación celular. Es útil describir el valor posicional mediante una escala
Memoria celular, determinación celular y el concepto de valores posicionales
1141
numérica cuyo máximo se halla en un extremo del segmento de la extremidad y el mínimo en el otro extremo. En las operaciones descritas anteriormente, se unen células con valores posicionales muy diferentes. Como resultado de ello obtendremos células nuevas producto de la proliferación celular de las células vecinas al punto de injerto. Estas células nuevas adquieren valores posicionales interpolados entre los de los dos conjuntos cuya confrontación provocamos (Fi gura 21-38). Este comportamiento se define como principio de intercalación: la
proliferación celular local está provocada por discontinuidades en los valores p o sicionales, y las células recién form adas adoptan valores posicionales intermedios para restablecer la continuidad del patrón. La proliferación celular terminará sólo cuando se hayan intercalado células que hayan recuperado todos los valo res posicionales perdidos inicialm ente y hayan quedado situadas según el pa trón de separación intercelular que les corresponde. Todo este proceso se deno mina regeneración por intercalación. La ley de intercalación, con el corolario de que la proliferación celular conti núa hasta que se consigue un cierto espaciamiento de los valores posicionales, es un principio organizador muy potente en los sistemas en que actúa. A partir de un patrón más o menos especificado y “en miniatura” -u n gradiente de morfógeno, por ejem plo- puede causar la construcción de un patrón completo y muy preciso de valores posicionales que regulará el crecimiento de todas las partes del patrón hasta que adquieran su tamaño normal: todo lo que se necesi ta es que el patrón inicial sea cualitativamente -e s decir, topológicam ente- co rrecto. Parece ser que el mismo principio dirige muchos procesos de organogé nesis y regeneración celular en insectos y también en crustáceos y anfibios. Incluso en criaturas como los mamíferos, cuyas estructuras perdidas no acos tumbran a regenerarse en el adulto, el principio de la ley de intercalación puede contribuir a la regulación del crecim iento y del patrón de formación durante el desarrollo embrionario. Desgraciadamente no se conocen los mecanismos m o leculares que originan esta forma crucial de control de crecimiento.
Resumen
Las células embrionarias no sólo han de diferenciarse sino que dicha diferencia ción debe mantenerse tras la desaparición de las señales que iniciaron la diversifi cación celular. Para que ello ocurra es necesaria la memoria celular, ya que permi te que las células queden determinadas particularmente para desempeñar un papel especializado mucho antes de que se diferencien abiertamente. Los mecanis mos de la memoria celular pueden ser citoplasmáticos, implicando moléculas del citoplasma que actuarán retroactivamente en su núcleo para mantener su propia síntesis; autocrinos, implicando moléculas segregadas que actúan retroactivamen te en la célula; o nucleares, implicando procesos de modificación de cromatina o DNA. En algunos casos el estado de determinación se ha relacionado con la expre sión de genes reguladores específicos, como los genes miogénicos para las células musculares. Los diferentes tipos de células de un embrión se producen según un patrón re gular espacial. Normalmente, el origen de la formación de este patrón son las asi metrías en el huevo y continúa mediante interacciones célula-célula en el embrión. Las señales espaciales que coordinan el patrón deformación suministran informa ción posicional a las células, y el almacenaje de una de estas informaciones por parte de las células se denomina valor posicional. Por ejemplo, las células de un ru dimento temprano de la extremidad posterior o anterior de un embrión de verte brado adquieren valores posicionales diferentes, convirtiendo a las células de las extremidades anterior y posterior no equivalentes en su carácter intrínseco, mucho antes de que el patrón de diferenciación celular se haya determinado. En muchos animales el patrón de valores posicionales se acopla estrechamente al control de proliferación celular según un principio de intercalación muy simple. Según este principio, la discontinuidad de valores posicionales provoca una proli feración celular local, y las células recién formadas adoptan valores posicionales 1 14 2
Capítulo 2 1 : Mecanismos celulares del desarrollo
intermedios para restablecer la continuidad del patrón. Es muy probable que este mecanismo actúe en el desarrollo embrionario típico corrigiendo inadecuaciones en la especificación inicial de información posicionaL
El gusano nemátodo: los genes controladores del desarrollo y las leyes del comportamiento celular32 En el caso de las células, como en el de los ordenadores, la memoria hace que com plejos programas de comportamiento celular sean posibles; muchas células a la vez, todas ellas avanzando gracias a su complejo programa de desarrollo, pueden generar un cuerpo adulto muy complejo. Algunos de los pasos que la cé lula da en el transcurso de su desarrollo son autónomos, mientras que otros se ven afectados por señales de otras células. Así pues, las células del embrión pue den compararse a un conjunto de pequeños ordenadores, o autómatas, actuan do en paralelo e intercambiando información unos con otros. Las leyes que de terminan el comportamiento celular están codificadas en los genes celulares. Cada célula contiene el mismo genoma y, por lo tanto, su comportamiento sigue las mismas reglas, pero existe una gran variedad de estados celulares; las leyes dirigen el desarrollo a lo largo de vías alternativas según una com binación de la información que la célula ha conseguido retener en su memoria y las señales del entorno que recibe. Los modelos por ordenador muestran que incluso un pro grama muy sencillo puede conducir a los individuos autómatas (células) de un sistema como éste a producir patrones sorprendentemente complejos; la simple observación del desarrollo normal del patrón no basta para deducir las leyes que rigen el programa. El reto, por lo tanto, consiste en descifrar experimentalmente las leyes subyacentes al desarrollo celular y esclarecer cómo los genes especifi can estas leyes. El gusano nemátodo Caenorhabditis elegans ofrece condiciones excepciona les para este estudio, y se ha convertido en uno de los principales modelos de la genética del desarrollo. Aquí, lo utilizamos para ilustrar varios principios genera les, pero reservamos el estudio más detallado de la genética del desarrollo del patrón de formación para el próximo apartado, sobre Drosophila, de la cual se ha conseguido una visión más completa gracias a más años de investigación y muchos más medios.
C aen o rh ab d itis eleg an s es anatóm ica y genéticam ente sencillo33 Como animal adulto, C. elegans tiene una longitud aproximada de 1 mm y sólo consta de alrededor de 1000 células somáticas y de entre 1000 y 2000 células ger minales (exactamente 959 núcleos de células somáticas más aproximadamente 2000 células germinales en un sexo; y exactamente 1031 núcleos de células so máticas más aproximadamente 1000 células germinales en el otro sexo) (Figura 21-39). Se ha reconstruido, célula a célula, la anatomía del nemátodo, mediante
--------------------------------------------------------------------- 1,2 m m -----------------------------------------------------------------------------H DORSAL ANTERIOR intestino huevos gónada POSTERIOR
Figura 21-39 Caenorhabditis elegans. Visión lateral de un ejemplar hermafrodita adulto. Nótese que el tejido llamado hipodermis del nemátodo corresponde a la epidermis de otros animales. (De J.E. Sulston y H.R. Horvitz, Dev. Biol. 56:110-156, 1977.)
El gusano nemátodo: los genes controladores del desarrollo y las leyes del comportamiento celular
1143
el estudio al microscopio electrónico de secciones seriadas. El mapa corporal de este nemátodo sencillo es básicam ente el mismo que el de la mayoría de los ani males superiores dado que consta de un cuerpo alargado con una simetría bila teral rudimentaria, compuesto por los mismos tejidos básicos (nervio, músculo, intestino y piel) organizados según el mismo patrón básico (boca y encéfalo en el extremo anterior, y ano en el posterior). La pared externa del cuerpo está com puesta de dos capas: la epidermis protectora, o “piel”, y la capa muscular subya cente. Un sencillo tubo de células endodérmicas forma el intestino. Un segundo tubo, situado entre el intestino y la pared del cuerpo, constituye la gónada; la com posición de su pared es a base de células somáticas, con las células germi nales en el interior de la misma. C. elegans tiene dos sexos -u n o hermafrodita y otro masculino. El hermafrodita podría describirse como una hembra que pro duce un número reducido de espermatozoides: puede reproducirse tanto por autofecundación, sirviéndose de sus propios espermatozoides, como por fecun dación cruzada tras la transferencia de espermatozoides de un macho a través de la cópula. La autofecundación tiende a producir una progenie homozigótica, que facilita la utilización de C. elegans como un organismo excepcionalmente adecuado para los estudios genéticos. La relativa sencillez de la anatom ía de C. elegans queda reflejada de la mis ma m anera en la sencillez de su genoma. Se calcula que el animal tiene en sus pares homólogos de cromosomas un total de 3000 genes “esenciales”, (es decir, genes en los que las mutaciones son letales o de consecuencias fácilmente detectables en el fenotipo) y cuatro o cinco veces este mismo número de genes no esenciales. El genoma haploide consta de aproximadamente 108 pares de nucleótidos de DNA, lo que representa cerca de 20 veces más que E. coli, aproxima damente igual que Drosophila, y 30 veces menos que los seres humanos. Actual mente, mediante mutaciones se han identificado más de 900 genes esenciales. Entre ellos existen genes que influyen en características visibles como el tamaño y el com portam iento del gusano, genes que codifican proteínas conocidas como la miosina y genes que controlan el curso del desarrollo. Se han realizado mapas de casi todo el genoma mostrándolo cómo una gran serie de segmentos solapa dos de DNA, representados por una biblioteca de clones genómicos ordenados (véase pág. 339), y se han iniciado esfuerzos sistemáticos para determinar la se cuencia com pleta de DNA del organismo.
El desarrollo del nem átodo es prácticam ente invariable34 C. elegans comienza a vivir como una sola célula. El huevo fecundado da lugar, por medio de divisiones celulares repetidas, a 558 células que forman un peque ño gusano en el interior de la cáscara del huevo. Una vez fuera del huevo, se pro ducen más divisiones que provocarán el crecimiento y la maduración sexual del gusano a medida que pasa por los cuatro estadios larvarios sucesivos separados por las correspondientes mudas. Tras la última muda se alcanza el estado adul to, y el gusano hermafrodita inicia la producción de sus propios huevos. Todo el proceso de desarrollo, de huevo a huevo, dura solamente tres días. Puesto que el C. elegans es pequeño y transparente, se puede observar cómo sus células se dividen, migran, se diferencian y mueren en el embrión, y se pue de seguir el linaje desde el huevo hasta el organismo adulto. Esta sencilla técnica de observación directa ha servido para describir el comportamiento y el linaje de todas las células desde el huevo hasta el animal adulto. Esto ha hecho posible un análisis de lin aje pormenorizado, que es mucho más difícil de realizar en ani males de mayor tamaño, en los cuales cada una de las células ha de ser marcada en estadios tempranos para poder identificarla a ella y a su progenie. Además, en animales mayores los pormenores del linaje celular presentan muchas varia ciones aleatorias, incluso entre especím enes genéticamente idénticos. Por el contrario, en el nemátodo las estructuras somáticas se desarrollan según un li naje celular invariable y predecible, y cada una de las muchas divisiones celula res se produce en el momento preciso. Esto significa que los precursores celula-
1 144
Capítulo 2 1 : Mecanismos celulares del desarrollo
HUEVO
10
eclosión II II II II
I I I I I I I I
I I
I I
! I
I I
I I I I l i l i
I I I I
I I I I
intestino POSTERIOR
ANTERIOR
res siguen el mismo patrón de divisiones celulares en cada individuo, y salvo contadas excepciones, se puede predecir el futuro de cada célula hija a partir de su posición en el árbol genealógico (Figura 21-40). La descripción com pleta del linaje celular del C. elegans nos proporciona una respuesta inmediata a una pregunta fundamental. El nemátodo, igual que muchos animales, se forma a partir de un número relativamente elevado de cé lulas que se pueden clasificar en un número mucho menor de tipos celulares diferenciados. Dada la importancia de los antecedentes celulares, cabe la tenta ción de suponer que todas las células de un mismo tipo celular son descendien tes de una única “célula fundadora” que ha seguido una sola vía de desarrollo. Sin embargo, el análisis del linaje demuestra que generalmente esto no es cier to, ni para nemátodos ni para otros animales. Así, en C. elegans (salvo pocas ex cepciones como las células intestinales y las células de la línea germinal) cada clase de células diferenciadas -hipodérm icas, neuronas, musculares, de la gónad a- derivan de varias células fundadoras que se originan en ramas separadas del árbol genealógico (véase Figura 21-40). De este modo, células de carácter parecido no tienen por qué ser parientes cercanos. Por el contrario (aunque ra ramente), células de carácter distinto pueden tener un parentesco muy próximo en cuanto a linaje; por ejemplo, algunas de las neuronas de C. elegans son her manas de las musculares. Entonces, el problema consiste en comprender las leyes que actúan en cada rama del árbol genealógico generando un conjunto determinado de tipos celula res, cada uno de ellos en un número adecuado.
Figura 21 -40 Árbol genealógico de las células que form an el intestino de C. eleg a n s. El huevo (a rr ib a ) se ha dibujado a la misma escala que el adulto (abajo). Obsérvese que mientras que las células intestinales se forman a partir de un único clon (como hacen las células germinales), las células de la mayoría de los demás tejidos no lo hacen.
Los genes de control del desarrollo definen las leyes del com portam iento celular que generan el mapa corporal35 Para explicar cómo el genoma define las leyes del desarrollo, necesitamos poder identificar los genes que controlan las opciones de desarrollo de las células. Las
El gusano nemátodo: los genes controladores del desarrollo y las leyes del comportamiento celular
1 145
mutaciones en estos genes dificultarán el desarrollo, aunque las mutaciones no son las únicas que lo hacen. Por ejemplo, algunas mutaciones interrumpen to dos los linajes celulares y causan la muerte prematura del embrión simplemente porque destruyen los genes “constitutivos” que toda célula necesita para sobre vivir y proliferar. Otras mutaciones afectan genes que codifican proteínas que determinados tipos de células diferenciadas necesitan para poder realizar su función especializada; el mapa corporal será básicam ente normal, pero algunos tipos celulares, aunque inidentificables, funcionarán mal. Por el contrario, mu taciones en genes específicam ente implicados en el control de opciones de de sarrollo trastornan el mapa corporal: normalmente dan lugar a tipos diferencia dos de células normales dispuestas anormalmente o en cantidades anormales como resultado de alteraciones específicas en el árbol genealógico. Identificados de esta manera, los genes de control del desarrollo, se pueden clasificar según las partes del árbol genealógico afectadas y, por lo tanto, si conocem os las leyes del com portam iento celular que generan esta parte del árbol, los genes se pue den clasificar según las leyes de las que son responsables. Para ilustrar los principios del análisis genético de un mecanismo de desa rrollo, veremos un ejemplo de interacción célula-célula en el nemátodo -la in ducción de la vulva.
La inducción de la vulva depende de un amplio conjunto de genes controladores del desarrollo36 La vulva -e l orificio por el que el gusano hermafrodita pone sus huevos- es una obertura ventral en la hipodermis (piel) formada por 22 células producto de lina jes especiales de tres células precursoras de la hipodermis. Una única célula de la gónada, que no se divide, denominada célula de anclaje, adhiere, o “ancla”, la
D ESA RRO LL O NORM AL DE LA VULVA
CELULA DE AN CLA JE MU ER TA
ELIMINACION DE TO D AS LAS CÉLULAS DE LA GÓNADA, EXC E PT O LA CÉLULA DE ANC LA JE
restos de células muertas de la gónada célula de anclaje
gónada célula de anclaje hipoderm is
. vulva en desarrollo (A)
la vulva no se desarrolla célula de anclaje
vulva 1 146
Capítulo 2 1 : Mecanismos celulares del desarrollo
Figura 21-41 Inducción de la vulva. (A) Experimentos que demuestran que para que se desarrolle la vulva es necesaria una influencia inductiva procedente de la célula de anclaje. (B) Visión amplificada de las células de la hipodermis ventral adyacente a la gónada, en los alrededores de la célula de anclaje, con un esbozo de los diagramas del árbol genealógico típico de su progenie en la parte inferior. Las seis células (y ninguna otra) son capaces de responder a la influencia inductora de la vulva, pero normalmente sólo tres de estas células están expuestas a ella.
vulva en desarrollo a la gónada subyacente (el útero) originando un pasaje que los huevos atravesarán para alcanzar el mundo exterior. Experimentos en los que se utilizan técnicas de microcirugía demuestran que la célula de anclaje es responsable de la inducción de las tres células hipodérmicas más cercanas para formar la vulva (Figura 21-41). Si destruimos la célula de anclaje con un rayo lá ser, estas células no dan lugar a la vulva sino que producen células hipodérmicas típicas. Si se altera la posición de la célula de anclaje en relación a las células hi podérmicas, se varía la futura localización de la vulva: las tres células que nor malmente originan la vulva se encuentran flanqueadas por otras tres células que tam bién son capaces de hacerlo si se exponen a las señales de la célula de ancla je. Así pues, la célula de anclaje induce la diferenciación celular en C. elegans del mismo modo que los blastómeros del polo vegetativo inducen la diferenciación mesodérmica en el embrión temprano de Xenopus. La única célula necesaria para la inducción es la de anclaje: si destruimos todas las células de la gónada salvo la célula anclaje, la vulva se desarrollará con normalidad. Para identificar los genes implicados en un momento determinado del desa rrollo, tenem os que buscar mutaciones que interrumpan el proceso, mediante el estudio de la progenie de una gran población de animales que han sido expues tos a agentes mutantes. De este modo se encuentran mutantes que tienen un fe notipo “sin vulva”, en los que las células hipodérmicas se comportan como si no hubieran recibido la señal de la célula de anclaje. Otro gran grupo de mutantes tienen un fenotipo “multivulva”, en el que las seis células hipodérmicas capaces de responder a la señal de la célula de anclaje se comportan como si todas ellas hubieran recibido la señal, de modo que el gusano forma varias estructuras en forma de vulva en vez de una sola. Entonces se estudian las mutaciones indivi duales que dan lugar a fenotipos similares para ver si los genes afectados son los mismos o si son distintos, tal como se explica en el Panel 21-1, págs. 1148-1149. Una vez se ha identificado de esta forma, un conjunto relevante de genes, por regla general todavía podremos descubrir más componentes del sistema bus cando mutaciones en otros genes que supriman los efectos nocivos de m utacio nes en algún gen ya identificado. Dichas mutaciones supresoras extragénicas pueden ser raras y sólo son favorables a nivel genético en organismos como C. elegans en los que son fáciles de encontrar; si se encuentran, sin embargo, a menudo identifican genes cuyo productos proteicos interactúan directamente con los productos del gen identificado previamente (por ejemplo, se puede com pensar la modificación de la forma de una molécula proteica mediante una modificación com plem entaria de la forma de su proteína compañera). Se han identificado más de 30 genes implicados en el control del desarrollo de la vulva.
Pruebas genéticas microquirúrgicas revelan la lógica del control del desarrollo; el clonaje y la secuenciación de genes nos ayudan a descubrir su bioquím ica37 Nuestro estudio se centrará ahora en tan sólo cinco de los genes controladores de la vulva, llamados lin-3, let-23, sem-5, let-60 y lin-45. El deterioro de la fun ción de cualquiera de ellos a causa de mutaciones conlleva la misma consecuen cia -u n fenotipo sin vulva. Por el contrario, un cambio genético que provoque un exceso de cualquiera de estos productos génicos o una actividad excesiva o no regulada -e n otras palabras, un incremento de funciones- puede producir lo contrario: un efecto multivulva. Por lo tanto, los cinco genes son imprescindi bles para que se produzca la inducción de la vulva, lo cual sugiere que fácilm en te todos ellos podrían ser eslabones de una misma cadena de causas y efectos; es decir, que los cinco genes podrían pertenecer a una única secuencia génica. Ya se vio en el Capítulo 15 cómo se definía mediante análisis genético el proceso de señalización que controla la especialización de un tipo celular particular del ojo de Drosophila. Para determinar el orden en que actúan los genes controladores de la vulva, se ha utilizado un tipo de análisis parecido, como se explica en la Fi gura 21-42. De hecho, parece que los cinco genes están situados en una única
El gusano nemátodo: los genes controladores del desarrollo y las leyes del comportamiento celular
1 147
GENES Y FENOTIPOS G en:
u n id a d f u n c io n a l d e h e r e n c ia , n o r m a lm e n t e c o r r e s p o n d e al s e g m e n to d e D N A q u e c o d ific a u n a s o la p r o t e ín a .
G e n o m a : c o n ju n to d e g e n e s d e u n o r g a n is m o . lo c u s : lo c a liz a c ió n d e l g e n e n un g e n o m a
átelos: formas alternativas del gen
T ip o s a lv a je : el tip o
M u t a n t e : s e d if e r e n c ia d e l
m á s h a b itu a l
t ip o s a lv a je e n u n c a m b io g e n é t ic o (u n a m u t a c ió n )
h e t e r o z ig o t o a /A
h o m o z ig o t o A /A
h o m o z ig o t o a /a
G E N O T IP O : c o n ju n t o e s p e c ífic o d e a le lo s q u e f o r m a n e l g e n o m a d e u n in d iv id u o
F E N O T IP O : c a r a c te r e s v is ib le s d e u n in d iv id u o
el a le lo A es d o m in a n t e ( r e s p e c to a a ); el a le lo a e s r e c e s iv o ( r e s p e c to a A ) En el e je m p lo ilu s tr a d o (p a r te s u p e r io r ), el fe n o t ip o d e un h e te r o z ig o to e s el m is m o q u e el d e u n o d e lo s h o m o z ig o to s ; e n lo s c a s o s e n q u e e s d if e r e n t e d e lo s d o s , s e d ic e q u e lo s d o s a le lo s s o n c o - d o m in a n t e s .
CROMOSOMAS
EL CICLO HAPLOIDE-DIPLOIDE DE REPRODUCCIÓN SEXUAL
u n c r o m o s o m a e n el in ic io d e l c ic lo c e lu la r , e n la fa s e G v’ la b a r ra r e p r e s e n ta u n a d o b le
centròm ero
h é lic e la r g a d e D N A
brazo "p" corto
brazo "q" largo ------ 1
—
---------------'
u n c r o m o s o m a al fin a l d e l c ic lo c e lu la r , e n m e t a f a s e ,
madre
f o r m a d o p o r d o s c r o m á t id a s h e r m a n a s id é n tic a s (c a d a
r------ __________________ u n a d e las c u a le s c o n tie n e u n a d o b le h é lic e d e D N A ) —
I
brazo
brazo/
"p" corto
"q" largo ^
.^ ^ a u to s o m a s
S
z' //O
'
r o m p ie n d o la c é lu la e n m e t a f a s e y Cu)
/
V
\ /m i \
m aterno
\
3
3
CT—
/
Pa terno 2
fl n
\
\
p a re s d e a u to s o m a s (c ro m o s o m a s
FUSIÓN SEXUAL (FECUNDACIÓN)
h e r e d a d o s s im é t r ic a m e n t e d e a m b o s
( j) ) U
DIPLOIDE
y dos cromosomas sexuales—uno X
/
materno 2
/ /
de la m adre y otro Y del padre. La / c a n t id a d y lo s tip o s d e c r o m o s o m a s
\ \ Y
/
s e x u a le s v a r ía n d e u n o s o r g a n is m o s
OH W
/
a o tr o s , al ig u a l q u e la c a n tid a d d e
y
/
r
crom osom a materno i i— y ------------crom osom a paterno
P a ra s im p lific a r, el c ic lo se r e p re s e n ta s o la m e n te
p a re s d e a u to s o m a s .
p a ra un c r o m o s o m a /p a r d e c ro m o s o m a s .
cromosomas sexuales
MEIOSIS Y RECOMBINACION GENICA
genotipo Ab
C u a n to m a y o r s e a la d is ta n c ia e n tr e lo s d o s lo c i, m a y o r s e rá la
crom osom a m aterno crom osom a paterno
esperm atozoide
e ' e j e m P l ° ¡lu s tr a d o e s q u e m á t ic a m e n t e , a p a r e c e n tr e s
p r o g e n ito r e s , e x c e p t o lo s a s e x u a le s )
\ \
\
paterno
oocito
t iñ e n d o lo s c r o m o s o m a s d is p e r s o s .
y
{
\U (y
\
)rv \ (A v )
f) n
HAPLOIDE
a p o s ic ió n e n m e t a f a s e p r e p a r a d a
fra te rn o 1
(y / / / ¿y / ' paterno .i
MEIOSIS
U n c o n ju n t o t íp ic o d e c r o m o s o m a s d ip lo id e s , ta l c o m o s e v e e n u n a
^
/
DIPLOIDE
u n id a s al c e n t r ó m e r o .
p o s ib ilid a d d e r e c o m b in a c ió n
MEIOSIS Y RECOMBINACION
p o r e n t r e c r u z a m ie n t o e n u n
lugar de entrecruzam iento
p u n t o e n tr e a m b o s lo c i. S i se r e c o m b in a n u n a p r o p o r c ió n x %
genotipo aB
d e g a m e t o s , e s ta r á n s e p a r a d o s p o r u n a d is ta n c ia e n el m a p a g e n é t ic o d e x u n id a d e s d e m a p a (o x c e n t im o r g a n s ) .
g e n o tip o
1148
Panel 21-1 Revisión de genética clásica.
gametos haploides (oocitos o espermatozoides)
TIPOS DE MUTACIONES I
o
\
~~
L................... i ).... z ........ : ... J . u ......i d e le c ió n : s u p r im e u n s e g m e n t o d e u n c r o m o s o m a
m u ta c ió n p u n tu a l: c a m b io d e u n ú n ic o lu g a r d e l g e n o m a c o r r e s p o n d ie n t e a u n p a r d e n u c le ó tid o s o u n a p a r te m u y p e q u e ñ a d e u n g e n
in v e r s ió n : in v ie r te u n s e g m e n to d e un c r o m o s o m a
tr a n s lo c a c ió n : s e c c io n a u n s e g m e n t o d e u n c r o m o s o m a y lo u n e a o tr o c r o m o s o m a
m u ta c ió n le ta l: p r o v o c a la m u e r t e p r e m a t u r a d e un o r g a n is m o e n d e s a r r o llo . m u ta c ió n c o n d ic io n a l: p r o d u c e u n e fe c to fe n o t íp ic o s ó lo
m u t a c ió n d e in c r e m e n t o d e f u n c ió n : a u m e n t o d e la a c t iv id a d d e l g e n o e x p r e s ió n d e l g e n e n c o n d ic io n e s in a d e c u a d a s ; n o r m a lm e n t e e s ta s m u t a c io n e s r e c ib e n e l n o m b r e d e
b a jo c ie r ta s c o n d ic io n e s , d e n o m in a d a s c o n d ic io n e s re s tric tiv a s ; e n o tr a s c o n d ic io n e s — las c o n d ic io n e s p e rm is iv a s — e s te e fe c to n o s e o b s e r v a . P a ra u n a m u t a c ió n s e n s ib le a la te m p e ra tu ra , la c o n d ic ió n r e s tr ic tiv a m á s c o m ú n e s la t e m p e r a t u r a a lta m ie n t r a s q u e la c o n d ic ió n p e r m is iv a e s la te m p e r a t u r a b a ja ,
d o m in a n te s .
m u ta c ió n d e p é r d id a d e fu n c ió n : r e d u c e o e lim in a la a c tiv id a d d e l g e n . S o n la s m u t a c io n e s m á s típ ic a s . N o r m a lm e n t e la s m u ta c io n e s d e p é r d id a d e fu n c ió n s o n re c e s iv a s — g e n e r a lm e n t e lo s o r g a n is m o s p u e d e n fu n c io n a r c o n n o r m a lid a d m ie n tr a s r e te n g a n a l m e n o s u n a c o p ia n o r m a l d e l g e n a fe c ta d o . m u ta c ió n n u la : e lim in a p o r c o m p le t o la a c tiv id a d d e l g e n .
m u t a c ió n d o m in a n t e n e g a tiv a : m u t a c ió n a c tiv a d o m in a n t e q u e b lo q u e a la a c t iv id a d g é n ic a , p r o v o c a n d o u n f e n o t i p o d e p é r d id a d e f u n c ió n in c lu s o e n p r e s e n c ia d e u n a c o p ia n o r m a l d e l g e n . El f e n ó m e n o o c u r r e c u a n d o el p r o d u c t o d e l g e n m u t a n t e in t e r f ie r e c o n e l p r o d u c t o d e l g e n n o r m a l, m u t a c ió n s u p r e s o r a : e lim in a el e fe c to f e n o t íp ic o d e o tr a m u t a c ió n , y el in d iv id u o c o n a m b a s m u t a c io n e s p a r e c e n o r m a l. El g e n a f e c t a d o p o r la p r im e r a m u t a c ió n p r e s e n ta e n su in t e r io r u n a m u t a c ió n s u p r e s o r a in tra g é n ic a ; un s e g u n d o g e n p r e s e n ta u n a m u t a c ió n s u p r e s o r a e x tra g é n ic a ; a m e n u d o el p r o d u c t o d e e s te s e g u n d o g e n in te r a c tú a d ir e c t a m e n t e c o n el p r o d u c to d e l p r im e r g e n .
¿DOS GENES O UNO SOLO? S i d o s m u t a c io n e s d e te r m in a d a s p r o d u c e n el m is m o f e n o t ip o ,
E n el t ip o m á s s im p le d e p r u e b a d e c o m p le m e n t a c ió n , u n in d iv id u o
¿ c ó m o p o d e m o s d is c e r n ir si s o n m u ta c io n e s d e l m is m o g e n ? S i las
h o m o z ig o t o p a ra u n a m u t a c ió n s e c ru z a c o n u n in d iv id u o q u e
m u t a c io n e s s o n re c e s iv a s (y la m a y o r ía lo s o n ), p o d r e m o s e n c o n t r a r
e s h o m o z ig o t o p a ra la o tr a m u t a c ió n . El f e n o t ip o d e su d e s c e n d ie n t e
la r e s p u e s ta m e r c e d a u n a p r u e b a d e c o m p le m e n t a c ió n .
r e s p o n d e la p r e g u n t a .
C O M P L E M E N T A C IÓ N :
N O C O M P L E M E N T A C IÓ N :
M U T A C I O N E S E N D O S G E N E S D IS T IN T O S
D O S M U T A C I O N E S IN D E P E N D IE N T E S E N E L M I S M O G E N
madre hom ozigoto m utante
padre hom ozigoto mutante
m adre hom ozigoto m utante
padre ho
m utante
el d e s c e n d ie n t e h íb r id o p r e s e n ta un f e n o t ip o n o r m a l:
el d e s c e n d ie n t e h íb r id o p r e s e n ta u n f e n o t ip o m u t a n t e :
c o n t ie n e u n a c o p ia n o r m a l d e c a d a g e n
n o p r e s e n ta c o p ia s n o r m a le s d e l g e n m u t a d o
1149
ACTIVIDADES DE LOS GENES la actividad de cada gen depende de la actividad del gen precedente
A
B
C
FENOTIPO tipo salvaje
hshhhhhshsot
m utación de pérdida de función en A y m utación de increm ento de función en B
increm ento de función
m utación de increm ento de función en A y m utación de pérdida de función en C
pérdida de función
secuencia genética: lin-3 ocupando la primera posición, seguido de let-23, y en este orden sem-5, let-60 y finalmente lin-45. Así pues, por ejemplo una mutación de increm ento de función de lin-3 no tiene ningún efecto sobre el fenotipo de un animal que tam bién contenga una mutación que conlleve la pérdida de fun ción de let-23; la doble m utante carece de vulva debido a que el componente que abre la secuencia no puede hacer nada si el componente siguiente sobre el que debería actuar ha desaparecido. El problema siguiente consiste en relacionar las actuaciones de los genes con células determinadas del embrión. Por ejemplo, ¿es necesario lin-3 en las células de anclaje que producen la señal de inducción o en las células hipodérmicas que responden a ella? La genética molecular nos proporciona una fácil respuesta para el caso de lin-3 : el gen se ha clonado y se ha demostrado su ex presión en la célula de anclaje y en ninguna otra parte de la zona circundante (Figura 21-43). Parece que los otros cuatro genes, por el contrario, actúan de un modo distinto en las células hipodérmicas, y una mutación de incremento de función en uno de ellos puede causar un fenotipo multivulva incluso si se ha destruido la célula de anclaje. Para com pletar el panorama vamos a relatar el camino definido genética mente para moléculas proteicas y su bioquímica. Se han clonado y secuenciado los cinco genes lin-3, let-23, sem-5, let-60 y lin-45, y en cada caso la secuencia in dica una posible función: lin-3 codifica una proteína similar a una molécula se ñal segregada muy conocida en los vertebrados -e l factor de crecimiento epidér mico (EGF); let-23 codifica un receptor de tirosina quinasa homóloga a los miembros de la familia de receptores de EGF de vertebrados; como vimos en el Capítulo 15, sem-5 codifica la proteína que contiene los dominios SH2 y SH3, presente en muchas proteínas que se unen directamente a dichos receptores y que actúan sobre otros com ponentes intracelulares; y let-60 y lin-45 son hom ó logos respectivamente a los genes de vertebrados ras y raf, cuyos productos transmiten señales de estos receptores al interior de la célula, como se vio en el Capítulo 15. Por lo tanto, es posible que la proteína Lin-3 sea la molécula señal segregada por la célula de anclaje, que la proteína Let-23 sea el receptor trans mem brana de las células hipodérmicas a las que se adhiere, y que las proteínas Sem-5, Let-60 y Lin-45 sean conectores de la vía de señales intracelulares, a tra-
Figura 21 -42 Los genes se pueden ordenar en una secuencia génica mediante pruebas efectuadas con imitantes dobles. Se dice que un gen A se sitúa p o r en cim a de un gen B si su producto normalm ente regula la actividad de B (o el producto de B) y p o r d e b a jo si la regulación es al revés. Si al gen superior le basta con regular la actividad del gen inferior para afectar el fenotipo del gen inferior, diremos que ambos genes están ligados en una misma secu en cia génica. En este caso, m utaciones de cualquier gen tendrán consecuencias similares en los fenotipos. Para descubrir el orden de los genes en una secuencia, utilizamos mutantes dobles para determinar cuál de los dos genes determina de forma más directa al fenotipo. El estudio dependerá de que encontrem os m utaciones específicas de A y de B que tengan consecuencias opuesta sobre el fenotipo cuando se presentan por separado. En el ejemplo ilustrado se com bina una mutación (dominante) de increm ento de función en el gen B, que lo activa independientemente de toda regulación procedente de los genes superiores, con una mutación (recesiva) de pérdida de función en A o C: la doble mutante (A,B) tiene un fenotipo de increm ento de función, que implica que A se sitúa antes de B, mientras que la mutante (B,C) tiene un fenotipo de pérdida de función, que implica que C se sitúa detrás de B.
Figura 21 -43 Expresión de lin-3 en la célula de anclaje. Un embrión de C. elegan s ha sido transfectado con un gen informador artificial que consiste en la región de control de lin-3 acoplada al gen que codifica la enzima P-galactosidasa, cuya presencia es fácilmente detectable mediante una reacción histoquímica que da una coloración azul. Sólo se tiñe de azul la célula de anclaje, lo cual implica que el gen lin-3 sólo se activa en la célula de anclaje. (Cortesía de Russell Hill.)
1 15 0
Capítulo 2 1 : Mecanismos celulares del desarrollo
CÉLULA HIPODÉRMICA
<
Lin-3 (EGF)
C Z b/\í
G e>
Let-60 (Ras)
Lin-45 (Raf)
Let-23 (receptor EGF)
Figura 21 -44 Camino que sigue la inducción de la vulva en C. elegans. Los diagramas muestran las funciones de los productos génicos que se han identificado. Los nom bres de las proteínas homologas en los vertebrados se indican entre paréntesis.
vés de la cual la unión del ligando con el receptor ejerce sus efectos finales sobre la expresión génica y la determinación celular (Figura 21-44). De hecho, el análi sis genético de este sistema del gusano nemátodo en desarrollo proporciona una de las visones más claras que tenem os sobre la organización de la vía de señales que parece que se ha conservado en la mayoría del reino animal. Como vimos en el Capítulo 15, un camino muy similar a éste aparece del análisis de sevenless mutantes de Drosophila (véase pág. 817).
Mutaciones heterocrónicas identifican los genes que especifican cam bios en las leyes del comportamiento celular a medida que transcurre el tiem po38 Tal como saben los programadores de ordenadores, pequeños cambios en el programa pueden tener consecuencias drásticas en el resultado que se obtiene al ejecutar dicho programa. De forma parecida, una mutación sobre un gen de control que altere una sola ley del comportamiento celular puede provocar un árbol genealógico totalmente anormal. Las mutaciones heterocrónicas en C. ele gans constituyen un buen ejemplo de este fenómeno, ya que provocan un com portamiento en ciertos conjuntos de células que sería normal en otros estadios del desarrollo. Por ejemplo, una célula hija puede comportarse igual que una cé lula madre o abuela mientras que la célula descendiente de la hija puede com portarse de nuevo de la misma manera, etc., lo cual hace que una parte del pa trón genealógico se repita indefinidamente. La Figura 21-45 muestra los diagramas de linaje para una serie de m utacio nes de un gen llamado lin-14, que ilustran este fenómeno: en lugar de progresar
tipo salvaje
prim er estado larvario
segundo estado larvario tercer estado larvario cuarto estado larvario
m utante lin-14 de pérdida de función T
rfti
m utante lin-14 de increm ento de función T
Figura 21-45 Mutaciones heterocrónicas del gen lin-14 de C. elegans. Sólo se muestran las consecuencias en uno de los muchos linajes afectados. La mutación (recesiva) de pérdida de función de lin-14 provoca la aparición prematura del patrón de división y diferenciación celular característico de la larva madura; la mutación (dominante) de incremento de función provoca el efecto contrario. La X indica una muerte celular programada. Las líneas verdes representan las células que contienen pro teína Lin-14, las líneas rojas las que no. En un desarrollo típico el inicio de la nutrición larvaria marca el inicio de la desaparición de Lin-14. (Según V. Ambros y H.R. Horvitz, Science 226:409-416, 1984. © the AAAS; y P. Arasu, B. W ightm an y G. Ruvkun, G row th Dev. Aging. 5:1825-1833,1991.)
El gusano nemátodo: los genes controladores del desarrollo y las leyes del comportamiento celular
1151
mediante series normales de divisiones celulares características del primero, se gundo, tercero y cuarto estados larvarios para detenerse tras el cuarto, muchas de las células que presentan una mutación de incremento de función de lin-14 repiten los patrones característicos del primer estado larvario, hasta un máximo de cinco ciclos - o m udas- y persisten en la formación de un tipo de cutícula in madura. Las mutaciones que implican pérdida de función del gen lin-14 tienen un efecto inverso: hacen que las células adopten precozmente estados adultos, saltándose los estados intermedios, de forma que el animal alcanza su estado fi nal prematuramente con un número anormalmente reducido de células. El gen lin-14 ha sido clonado, y también se ha descubierto que la pro teína que codifica se concentra en el núcleo celular. En un ejemplar normal, la proteí na está presente en la mayoría de las células somáticas del embrión tardío y en el primer estadio larval temprano, pero en el segundo estadio larval su concen tración disminuye hasta casi cero. Las mutantes lin-14 que entran precozmente en el estado adulto presentan un nivel de proteína Lin-14 reducido, mientras que las mutantes que continúan repitiendo los primeros ciclos del primer esta dio larvario presentan una expresión de la proteína Lin-14 durante un período extraordinariamente largo (debido a una mutación en la porción reguladora del gen). Así el efecto de la proteína Lin-14 consiste en mantener las células en un estado inmaduro, y su maduración normal depende de su desaparición. Pode mos suponer que este producto génico es solamente uno de los muchos cuyas concentraciones en las células provocan cambios en las reglas del comporta miento celular a lo largo del desarrollo.
El “tem po” del desarrollo no está controlado mediante el ciclo de división celular39 El ejemplo que acabam os de ver nos conduce a un problema fundamental del desarrollo. El genoma tiene que definir un conjunto de reglas que dirijan tanto la división com o la especialización de la célula, y ambos procesos han de estar co ordinados. ¿Cómo se coordina la división celular durante el desarrollo, y cómo se coordina a su vez con la especialización celular? Una sugerencia es que existan cambios de su estado interno que esperen el paso de la célula a través del ciclo de división: por decirlo de algún modo, la cé lula pasaría a la fase siguiente como lo hizo a través de la mitosis. Esta idea pare ce tentadora, especialmente cuando se describe el desarrollo en términos de diagramas de linaje, pero las pruebas van en contra de esta hipótesis. A menudo las células de embriones en desarrollo continúan diferenciándose de forma casi normal incluso cuando se impide artificialmente la división celular. Obviamen te, tiene que haber anomalías, aunque sólo sea porque una sola célula no dividi da no pueda diferenciarse de dos formas a la vez. Pero parece que en la mayoría de los casos que hemos estudiado las divisiones celulares no son las manecillas del reloj que establecen el “tem po” del desarrollo, sino que la célula cambia su estado químico con el tiempo independientemente de la división celular, y este estado cam biante controla tanto la decisión de dividirse como la decisión sobre cómo y cuándo especializarse.
Las células mueren ordenadamente como parte del programa de desarrollo40 Un C. elegans hermafrodita genera 1030 núcleos de células somáticas en el trans curso de su desarrollo, pero 131 de las células mueren. Estas m u e rte s c e lu la re s p ro g ra m a d a s ocurren según un patrón absolutamente predecible, y sin causar problemas. Mientras que las células que mueren a causa de heridas o envenena mientos normalmente se hinchan y explotan, vertiendo su contenido sobre sus vecinas, estas muertes de células normales ocurren mediante un proceso cono cido como a p o p to s is , en el que el núcleo celular se condensa, la célula se seca y el cuerpo m archito es engullido y digerido rápidamente por sus células vecinas
1 15 2
Capítulo 2 1 : Mecanismos celulares del desarrollo
(Figura 21-46). La muerte celular programada es una característica típica del de sarrollo animal y probablemente el destino de un porcéntaje substancial de las células producidas por la mayoría de los animales. Debido a que la apoptosis ocurre rápidamente y sin dejar rastro, es fácil que las muertes pasen desapercibidas. La muerte celular puede ser tan importante como la división celular para generar un individuo con los tipos celulares nece sarios y en las cantidades y localizaciones correctas. Por ejemplo, en los verte brados regula la cantidad de neuronas (como veremos más adelante), elimina los tipos de linfocitos no deseables (Capítulo 23), elimina las células que han ter minado su función (como cuando el renacuajo pierde su cola durante la m eta morfosis) y ayuda a esculpir la forma de los órganos en desarrollo (por ejemplo, creando vacíos entre los dígitos eliminando las células situadas entre los rudi mentos de los dígitos de la yema de la extremidad). Se cree que la muerte de las células normales son suicidios en los que la célu la activa un programa de defunción y se autoinmola. La mayor evidencia de que las células animales tienen un programa intrínseco de muerte procede de estu dios genéticos sobre C. elegans, en el que dos genes, denominados ced-3 y ced-4 (iced, de cell death abnormal, muerte celular anormal), que han verificado la n e cesidad de que ocurran 131 muertes de células normales. Si uno de estos genes es inactivado mediante una mutación, las células cuyo destino inicial era la muerte sobrevivirán, diferenciándose en tipos celulares fácilmente reconocibles como las neuronas. Por el contrario, la sobreexpresión o la expresión desplazada de ced-3 y ced-4 (como resultado de mutaciones de pérdida de función que inactivan otro gen, ced-9, que normalmente reprime el programa de muertes) hace que mueran muchas células que en condiciones normales sobrevivirían. Se conocen las secuencias de aminoácido de estas tres proteínas Ced. La proteína Ced-4 es nueva y podría actuar antes que Ced-3, que es una proteasa. La secuencia de aminoácidos de Ced-9 es idéntica en un 23% a la de una proteí na de mamífero Bcl-2 (el producto del proto-oncogén bcl-2) que, como Ced-9, reprime la muerte celular programada en muchos tipos de células de mamífero. Al transferir el gen humano bcl-2 a C. elegans, actúa como inhibidor de la muerte celular normal en el gusano e incluso es capaz de rescatar mutantes ced-9 que de otra manera morirían en etapas tempranas del desarrollo. Estos importantes descubrimientos indican que tanto el mecanismo de la muerte celular progra mada como su regulación se han conservado a lo largo de la evolución, desde los gusanos hasta los humanos, lo cual confirma que la capacidad de suicidarse de este modo es una propiedad fundamental de las células animales.
r
a
«fti V_________ )
la célula se suicida
V.
la célula m uerta es engullida por una célula vecina
el cadáver es digerido y no queda rastro de él -
í
\
v_________y Figura 21 -46 Muerte celular por apoptosis en La muerte depende de la expresión de los genes ced-3 y ced-4 en la célula que va a morir, mientras que la expresión de otros genes en las células vecinas controlan la absorción y la eliminación de sus restos.
C. elegans.
Resumen C aenorhab d itis elegans tiene dos características que hacen de él un organismo atractivo para investigar la base genética del desarrollo: primera, su análisis gené tico es sencillo porque su tiempo de generación es corto y su genoma pequeño; se gunda, el curso normal de su desarrollo es extraordinariamente reproducible y se ha estudiado detalladamente, de manera que una célula de una posición determi nada del cuerpo tiene el mismo linaje en todos los individuos, y este linaje se conoce a la perfección. Al igual que en otros organismos, el desarrollo depende de interac ciones célula-célula y de procesos autónomos de células. Por ejemplo, experimentos de destrucción celular demuestran que el desarrollo de la vulva depende de una se ñal de inducción, y los genes necesarios para esta inducción se pueden identificar a través de mutaciones que interrumpen el desarrollo de la vulva. El análisis molecu lar genético revelan las junciones individuales de estos genes y muestran que algu nos de ellos codifican componentes de la vía de señalización que también actúa en los vertebrados. El análisis de linaje de mutantes conduce al descubrimiento de muchos otras clases importantes de genes, incluyendo genes cuyos productos esta blecen deforma temporal los cambios de las reglas del comportamiento celular du rante el desarrollo y genes que serán responsables de la muerte celular programada -una característica invariable en el desarrollo de todos los animales.
El gusano nemátodo: los genes controladores del desarrollo y las leyes del comportamiento celular
1153
Drosophila y la genética molecular del patrón de formación. I. Génesis del mapa corporal41 La afirmación básica de la genética clásica es que la estructura de un organismo está controlada por sus genes. Los mecanismos del control genético de la estruc tura del cuerpo continuaron siendo un misterio durante casi un siglo, y mucho tiempo después de que se descubriera el papel del DNA en los procesos de la he rencia. Desde hace pocos años se está llenando este vacío de nuestro conoci miento. En el apartado anterior utilizamos el gusano nemátodo para describir algunos de los principios más importantes según los cuales los genes de control del desarrollo organizan los procesos del desarrollo. Pero la mosca Drosophila melanogaster (Figura 21-47) es el organismo que más ha contribuido a la trans formación de nuestro conocim iento sobre el control que los genes ejercen sobre la formación del mapa corporal. Tras décadas de estudios genéticos, culminados con investigaciones sistemáticas a gran escala, se ha conseguido un amplio catá logo de genes de control del desarrollo de la mosca cuya función específica es definir el patrón espacial de los tipos celulares y de las partes del cuerpo. Ahora es posible no sólo identificar los genes básicos, sino también observar cómo tra bajan: mediante una hibridación in situ utilizando sondas de DNA o de RNA se puede observar directamente cómo se definen los estados internos de las células del embrión m ediante la expresión de conjuntos de genes reguladores. Gracias al análisis de mutantes, animales transgénicos y animales que constituyen una masa confusa de células mutantes y no mutantes, se puede avanzar más y des cubrir cómo actúa cada gen como una parte de un sistema que define la organi zación del cuerpo. Además, la m osca ha abierto una puerta fundamental para conocer nuestro propio desarrollo, ya que los genes que controlan el patrón del cuerpo de Drosophila tienen equivalentes muy cercanos en los animales supe riores, incluidos nosotros mismos Nuestro tratado sobre la genética del desarrollo de Drosophila está dividido en dos apartados. El primero trata los procesos del embrión temprano y describe la creación del mapa básico del cuerpo, con un rudimento de la cabeza en un ex tremo, y un rudimento posterior en el otro extremo y entre ambos una serie or denada de segmentos -la s unidades modulares básicas a partir de las cuales es tán construidos todos los insectos. El segundo apartado trata de procesos más avanzados y habla del aparato genético que dota a las células de valores posicionales que diferencian las células de un segmento de las del siguiente; estos pro cesos aseguran que, por ejemplo, la cabeza desarrollará antenas y el tórax desa rrollará patas -y no al contrario, como veremos que ocurre en algunas mutantes.
1154
Capítulo 2 1 : Mecanismos celulares del desarrollo
Figura 21-47 D r o so p h ila m e la n o g a ster. Vista dorsal de una m osca adulta normal. (A) Fotografía. (B) Dibujo. (Fotografía cortesía de E.B. Lewis.)
El cuerpo del insecto se construye mediante la modulación de un patrón fundamental de unidades de repetición41,42 El programa del desarrollo de Drosophila, desde el huevo hasta el adulto, está re sumido en la Figura 21-48. El período de desarrollo embrionario comienza en la fe cundación y dura aproximadamente un día, al final del cual el embrión abandona la cáscara del huevo y se convierte en larva. Entonces la larva pasa por tres esta dios, o crisálidas, separados por mudas en las cuales se deshace de su cutícula vie ja y se reviste de una nueva. Al final de la tercera crisálida se convierte en pupa. Dentro de la pupa se produce una remodelación radical del cuerpo, y finalmente, unos nueve días después de la fecundación, emerge una mosca adulta, o imago. La mosca está formada por una cabeza, tres segmentos torácicos (numerados de T I a T3), y ocho o nueve segmentos abdominales (numerados de Al a A9). Aun que cada segmento es diferente de los demás, todos se construyen de acuerdo con un mapa parecido. Por ejemplo, del segmento T I salen un par de patas, de T2 un par de patas y un par de alas, y de T3 un par de patas y un par de balancines -p e queñas protuberancias de gran importancia para el vuelo que han evolucionado a partir del segundo par de alas que poseían los insectos más primitivos. La segmen tación casi repetitiva se desarrolla durante las primeras horas tras la fecundación, aunque es más obvia en la larva, en la que los segmentos se parecen más a los del adulto. En el embrión se puede observar que los rudimentos de la cabeza, o al m e nos las partes de la futura boca en el adulto, también están segmentados (Figura 21-49). No obstante en los dos extremos del animal encontramos estructuras ter minales muy especializadas que no están derivadas de segmentos.
F E C U N D A C IO N
0 días
C 3 huevo
D ESAR R O LLO E M B R IO N A R IO
1 día
E C L O S IO N
¿ TU TTTU y
larva
tres estadios larvarios separados por mudas
5 días
P U P A C IO N
M E T A M O R F O S IS
partes de . . , , la cabeza torax abdom e"
2 horas
_____________
5-8 horas
Figura 21 -48 Sinopsis del desarrollo de D r o so p h ila desde el huevo hasta la mosca adulta.
/ (B)
10 horas
0,5 mm Figura 21-49 Los orígenes de los segmentos corporales de D r o so p h ila durante el desarrollo embrionario. Los embriones se presentan en vista lateral en los dibujos (A-C) y corresponden a las electronmicrografías de barrido (D-F). (A y D) A las 2 horas, el embrión se encuentra en el estadio de bla sto d erm o sin citial (véase Figura 21-51) y no se aprecia segm entación alguna, aunque se puede trazar el mapa de destino mostrando las futuras regiones segmentadas (icoloread a s en A). (B y E) A las 5-8 horas, el embrión se encuentra en el estadio de b a n d a g erm in a l ex ten d id a : la gastrulación ya ha tenido lugar, la segmentación ha comenzado a ser visible, y el eje segmentado del cuerpo ha aumentado de longitud, curvándose sobre sí mismo por el extremo de la cola de forma que encaja dentro de la cáscara del huevo. (C y F) A las 10 horas, el eje del cuerpo se ha contraído y se ha erguido de nuevo, y todos los segmentos están definidos claramente. Las estructuras de la cabeza, externamente visibles en este estadio, se pliegan posteriormente en el interior de la larva, para emerger de nuevo cuando la larva experimente la pupación transformándose en adulta. (D y E, cortesía de Rudi Turner y Anthony Mahowald; F, cortesía de Jane Petschek.)
Drosophila I. Génesis del mapa corporal
1155
Figura 21-50 Segmentos de
em brión
A l 1A 21A3| A4| A 5 1A 6 1A71A 81A9/10 PARTES
segmentos
ABDOMEN
parasegmentos internalizados en la larva larva recién puesta
El lugar donde se traza el límite entre un segmento y el siguiente es en parte convencional. Cuando tratemos los patrones de la expresión génica veremos que es apropiado hablar en términos de un total de 14 parasegmentos (numera dos desde P1 a P14) que son mitades de segmento fuera de registro con los seg mentos tradicionales (Figura 21-50).
Drosophila inicia su desarrollo como un sincitio41’43 El huevo de Drosophila tiene aproximadamente 400 |im de largo y 160 |im de diá metro, y presenta una polaridad muy definida. Al igual que los huevos de otros insectos, empieza su desarrollo de una forma poco usual: varias series de divisio nes nucleares sin que se produzca división celular, dan lugar a un sincitio. Las divisiones nucleares tempranas son sincrónicas y extremadamente rápidas, pro duciéndose aproximadamente cada 8 minutos. Las nueve primeras divisiones generan un conjunto de núcleos, la mayoría de los cuales migran desde el centro del huevo hacia la superficie, donde forman una m onocapa denominada blasto dermo sincitial. Después de cuatro rondas más de divisiones nucleares, la m em brana plasmática crece hacia el interior, desde la superficie del huevo, envol viendo cada núcleo, y por lo tanto el blastodermo sincitial se convierte en un blastodermo celular compuesto por unas 6000 células separadas (Figura 21-51). Un pequeño subgrupo de núcleos situados en el extremo posterior del huevo es segregado a células unos cuantos ciclos antes; estas células polares son las célu las germinales primordiales que darán lugar a oocitos o espermatozoides. Como en el huevo de un anfibio en segmentación, parece que los rápidos ci clos de replicación de DNA dificultan la transcripción, de tal modo que hasta la fase de blastodermo celular el desarrollo depende mayoritariamente -aunque no exclusivam ente- de las reservas maternas del mRNA y de las proteínas que se han acumulado en el huevo antes de la fecundación. Tras la celularización, la di visión celular continúa, siguiendo una vía más convencional, asincrónicamente y a una velocidad más baja, y la velocidad de transcripción aumenta espectacu larmente. El blastodermo celular equivale a la blástula hueca de un anfibio o de un eri zo de mar, incluso aunque su interior esté lleno de vitelo en lugar de ser una cavi dad llena de fluido. La gastrulación se produce cuando finaliza la celularización, y aunque la geometría de este proceso es muy diferente de la del insecto, el resulta do general es sumamente parecido. Las células endodérmicas se desplazan hacia el interior mediante movimientos celulares coordinados, formando el intestino que se extiende a lo largo del eje del embrión. El mesodermo que envuelve el ru-
115 6
Capítulo 2 1 : Mecanismos celulares del desarrollo
Drosophila y sus correspondencias con las regiones del blastodermo. Téngase en cuenta que los extremos del blastodermo se corresponden con estructuras no segmentadas que forman grandes zonas internas de la larva como, por ejemplo, los rudimentos segmentales de las zonas bucales del adulto. En D rosophila, la segmentación puede describirse en términos de segmentos o parasegmentos: la relación se muestra en la parte inferior de la figura. Los parasegmentos normalmente corresponden a patrones más sencillos de expresión génica. El número exacto de segmentos abdominales es discutible: ocho están bien definidos, y es probable que exista un noveno.
células somáticas
huevo fecundado
muchos núcleos en un sincitio
(A )
células polares (células germ inales prim ordiales)
los núcleos m igran hacia la periferia y se empiezan a form ar los lím ites celulares
Figura 21-51 Desarrollo del huevo de D r o so p h ila desde la fecundación hasta el estadio de blastodermo. (A) Diagramas esquemáticos. (B) Vista de superficie y (C) fotografías al microscopio óptico de secciones del núcleo blastodérmico durante la mitosis en la transición desde el estadio sincitial al blastodérmico. La actina está teñida de verde, la tubulina de n aran ja. (A, según H.A.Schneiderman, en Insect Development [P.A. Lawrence, ed.], pp. 3-34. Oxford, UK: Blackwell, 1976; B y C, cortesía de W. Therkauf.)
dimento del intestino ocupa el espacio entre éste y la capa exterior envolvente de ectodermo. Si marcamos las células y las seguimos durante sus complejos movimientos de gastrulación, podremos dibujar un mapa futuro de la monocapa de células si tuada en la superficie del blastodermo (Figura 21-52). El futuro mapa es espe cialmente sencillo en una sección transversal a través de la mitad del embrión, con el futuro mesodermo situado ventralmente y el ectodermo a cada lado por encim a de él. Como en un vertebrado, los cordones de las células nerviosas que corren a lo largo del cuerpo derivan de parte del ectodermo: un subgrupo de cé lulas se separarán en este ectodermo neurogénico de sus vecinas, escaparán de la capa epitelial, y se desplazarán hacia el interior del embrión convirtiéndose en precursores de neuronas. Para el mesodermo, el ectodermo y el cordón nervio so, se mantiene aproximadamente la posición de las células a lo largo del eje an teroposterior durante la gastrulación debido a que sus desplazamientos se pro ducen en el plano transversal. Sin embargo, el intestino se forma mediante la invaginación de dos grupos de células situados en extremos opuestos del em brión; ambas invaginaciones se encuentran en la mitad del embrión y finalm en te forman un tubo intestinal continuo. A medida que la gastrulación se completa, en la superficie del embrión apa recen una serie de muescas y protuberancias que definirán la subdivisión del cuerpo en parasegmentos a lo largo de su eje anteroposterior (véase Figura 2149). Pruebas más sutiles demuestran que las características principales de este patrón de segmentos ya estaban establecidas en el estado de blastodermo celu lar, antes del inicio de la gastrulación.
A N T E R IO R
P O S T E R IO R
DORSAL
VENTRAL
V IS T A L A T E R A L
Drosophila I. Génesis del mapa corporal
m em brana extraem brionariá epiderm is dorsal sistema nervioso y epidermis ventral parte posterior del conducto digestivo mesoderm o parte anterior S E C C IO N T R A N S V E R S A L del conducto CENTRAL digestivo
(B)
(C)
Figura 21-52 Mapa de destino de un embrión de D r o so p h ila en la fase de blastodermo celular. Vista lateral y en sección transversal del embrión, ilustrando la relación entre la subdivisión dorsoventral en los principales tejidos futuros y el patrón anteroposterior de los futuros segmentos. Una línea gruesa limita la región que formará estructuras segmentales. Durante la gastrulación las células situadas a lo largo de la línea media ventral se invaginan formando el mesodermo, mientras que las células destinadas a formar el intestino se invaginan cerca de los dos extremos del embrión. Así pues, aunque los dos extremos del embrión se encuentran situados en puntos opuestos y lejanos, comparten funciones y destino. (Según V. Hartenstein, G.M. Technau y J.A. Campos-Ortega, W ilhem R ou x’Arch. Dev. Biol. 194:213-216,1985.)
1157
Dos sistemas ortogonales definen el mapa geométrico del embrión44 Se necesitan dos coordenadas para definir cada una de las posiciones en el blastodermo y, de forma correspondiente, se pueden distinguir dos conjuntos de ge nes de polaridad del huevo que actúan independientemente en el inicio del de sarrollo definiendo los dos ejes principales del embrión -e l dorsoventral y el anteroposterior. Estos genes definen las coordinadas espaciales del embrión es tableciendo gradientes de morfógenos en el huevo. Los genes de polaridad del huevo se descubrieron tras investigaciones ex haustivas en busca de mutantes que transtornasen la polaridad del huevo. De esta forma se descubrieron 12 genes polares dorsoventrales del huevo. Salvo uno de ellos, todos los demás tienen el mismo fenotipo mutante de pérdida de fun ción en el que el embrión se dorsaliza -e s decir, todas sus células toman un ca rácter dorsal, de modo que las estructuras ventrales no se forman. El gen restan te tiene el fenotipo de pérdida de función contrario: el embrión se ventraliza. Veremos que tales genes son com ponentes de un sistema único que establece el gradiente morfogénico en el embrión temprano. Por el contrario, el conjunto de genes anteroposteriores puede subdividirse según sus fenotipos mutantes en tres subsistemas , responsables de la definición de partes diferentes del eje anteroposterior (Figura 21-53). El grupo anterior (4
A N T E R IO R
P O S T E R IO R
bicoid
1158
Capítulo 2 1 : Mecanismos celulares del desarrollo
T E R M IN A L
torso
Figura 21-53 Dominios de los sistemas de genes de polaridad del huevo: anteriores, posteriores y terminales. Los diagramas muestran los destinos de diferentes regiones del huevo/embrión temprano, y las regiones que no pueden desarrollarse si los sistemas anterior, posterior o terminal son deficientes, se indican en blan co. Los diagramas centrales muestran esquem áticam ente la apariencia de la larva normal y de las larvas mutantes que carecen de un gen del sistema anterior (el bicoid, por ejemplo), del sistema posterior (el nanos, por ejemplo), o del sistema terminal (el torso, por ejemplo). Los diagramas inferiores muestran la apariencia de las larvas en que no funciona ninguno de los tres sistemas de genes o sólo uno de ellos. Las letras que aparecen debajo de cada larva especifican qué sistemas permanecen intactos (A P T para una larva normal, -P T para una larva que tiene deficiencias en su sistema anterior pero que conserva los sistemas posterior y terminal intactos, etc.). La inactivación de un gen determinado provoca la pérdida del conjunto correspondiente de estructuras corporales; las partes del cuerpo que se forman son producto de los sistemas de genes que permanecen funcionales. Obsérvese que las larvas con un defecto en el sistema anterior todavía pueden formar estructuras terminales en su extremo anterior, pero son del tipo que normalmente encontramos en el extremo posterior del cuerpo más que de la parte frontal la cabeza. (Ligeramente modificado a partir de D. St. Johnson y C. NüssleinVolhard, Cell 68:201-219,1992. © Cell Press.)
genes) controla la parte anterior del eje. El grupo posterior (11 genes) controla la parte posterior del eje. Por último, el grupo terminal (6 genes conocidos) contro la los dos extremos del embrión, que comprenden las estructuras terminales es pecializadas no segmentadas y particularmente el par de regiones -u n a anterior y otra posterior- de las que se deriva el intestino. Al igual que el sistema dorsoventral, cada uno de estos tres subsistemas establece un gradiente morfogénico -u n o en la mitad anterior del embrión, otro en la mitad posterior (aunque es dis cutible) y otro que actúa simétricamente en ambos extremos del embrión. Las mutaciones de pérdida de función que inactivan uno de estos subsistemas cau san la pérdida de la estructura anterior, posterior o terminal correspondiente. Las cuatro señales espaciales primarias -anterior, posterior, terminal y ven tral- organizan el modelaje del embrión gracias al control que ejercen sobre la expresión de otro grupo de genes, que interpretan, pulen y almacenan la infor m ación que suministran las señales primarias.
Influencias procedentes de las células que envuelven el huevo marcan el inicio del modelaje del embrión44,45 Los genes de polaridad del huevo son transcritos desde el genoma materno du rante la oogénesis, y sus productos actúan poco después de la fecundación, y en algunos casos incluso antes de ella. Así pues, el fenotipo del embrión se determi na a través de los alelos presentes en la madre (y en sus oocitos) más que por la com binación de genes maternos y paternos que posee el propio embrión. Los genes que actúan de este modo se denominan genes de efecto m aterno. Fueron descubiertos al buscar los fenotipos mutantes adecuados de embriones produci dos a partir de huevos puestos por madres que parecían normales pero que con tenían mutaciones genéticas que convertían a sus huevos en anormales (Figura 21-54). Normalmente, la mutación de efecto materno es recesiva, y las madres que producen huevos defectivos son homozigotas para el gen mutante. Figura 21-54 Herencia de una mutación recesiva de efecto materno.
esperm atozoide el citoplasm a todavía proc contiene productos m/m maternos ©
zigoto
DESARRO LLO NORMAL
el citoplasm a ya no contiene ningún producto ©
m/+
El patrón de herencia se inicia con unos abuelos heterozigotos (m/+) para la mutación (m) que es recesiva al gen normal (+). A la izquierda de cada animal se muestra su genotipo. El color rojo denota la presencia de un producto génico normal (+). El producto génico actúa sólo al iniciarse el desarrollo, y la apariencia de una animal maduro refleja el conjunto de com ponentes especificados maternos presentes en el huevo. Nótese que el espermatozoide no contribuye significativamente con estos productos génicos en el huevo. El patrón de herencia de una mutación de efecto materno dominante es distinto pero podría generar unos efectos muy parecidos.
zigoto
DESARRO LLO A N O R M A L
Drosophila I. Génesis del mapa corporal
1159
célula folicular
Figura 21-55 Oocito de Drosophila en su folículo. El oocito deriva de una
oocito
célula acompañante
las células foliculares proporcionan señales ventrales
las células foliculares proporcionan señales term inales
Cuando se ha identificado un gen, ya se puede investigar su campo de ac ción a través de la creación y el análisis de mosaicos genéticos -m oscas que con tienen porciones clonadas y marcadas de células en las que el gen que interesa está ausente o mutado. (Más adelante explicaremos cómo se efectúa este sor prendente truco de microcirugía genética.) Utilizando este método se puede de mostrar que la mayoría de los genes de polaridad del huevo son imprescindibles para el linaje del oocito, mientras que en las células foliculares que envuelven al oocito en el ovario son suficientes unos cuantos. Los genes requeridos en las cé lulas foliculares proporcionan influencias que actúan en el exterior del huevo lo calizando las fuentes de los gradientes morfogénicos terminales y ventrales que se desarrollarán en el interior de las células (Figura 21-55). Además, los produc tos localizados suministrados al oocito en crecimiento, por medio de las células nodriza gigantes a las que está conectado por un extremo, definen la polaridad anteroposterior del huevo. Para observar cóm o se establecen los patrones en el interior del huevo, pri mero nos centraremos en el sistem a dorsoventral.
El eje dorsoventral se define en el interior del embrión mediante una proteína reguladora de genes con un gradiente de concentración intranuclear44,45,46 La función de las células foliculares en el establecimiento del gradiente dorsoventral del huevo de Drosophila consiste en suministrar una molécula señal lo calizada que se une a un receptor en el exterior del huevo y de este modo con trola la distribución de una proteína reguladora de genes en el interior del huevo. Este sistema puede analizarse genéticamente a mediante un método muy parecido al utilizado anteriormente para analizar el sistema que induce la vulva en el gusano nemátodo. Siete de los genes del sistema dorsoventral parti cipan en la producción de la señal extracelular localizada; uno de ellos, denomi nado Toll, codifica el receptor transm em brana de la molécula señal, y los pro ductos de los otros tres actúan en el interior del embrión, siempre después de Toll. El último gen del efecto materno de la vía señal codifica una proteína regu ladora de genes y se denomina dorsal. La molécula señal extracelular fabricada por las células foliculares sólo se genera de forma activa en la superficie ventral del huevo y forma un gradiente que se refleja en una activación selectiva de la proteína Toll y finalmente en un gradiente de concentración de la proteína Dor sal en el núcleo del embrión. La proteína dorsal pertenece a la misma familia que la proteína reguladora de genes de vertebrados NF-kB (véase Figura 15-32) y podría actuar de modo si milar a ella. En el huevo recién puesto tanto el mRNA dorsal (detectado median te la hibridación in situ) como la proteína que codifica (detectada con anticuer pos), se distribuyen uniformemente en el citoplasma. No obstante, tras la migración del núcleo a la superficie del embrión para formar el blastodermo,
1160
Capítulo 2 1 : Mecanismos celulares del desarrollo
célula germinal que se divide cuatro veces dando lugar a una familia de 16 células que permanecen en com unicación unas con otras a través de puentes citoplasmáticos. Un miembro de la familia se convierte en oocito, mientras que los otros se convierten en células nodriza, que generan muchos de los com ponentes necesarios para el oocito, y se los transfieren a través de los puentes citoplasmáticos. Las células foliculares que envuelven parcialmente el huevo tienen un origen diferente; son la fuente de las señales ventrales y terminales que polarizan al huevo.
Figura 21 - 56 El gradiente de la proteína Dorsal y su interpretación. (A) Gradiente de concentración de la proteína Dorsal en el núcleo del blastodermo, puesto de manifiesto mediante un anticuerpo. (B) Interpretación del gradiente Dorsal por genes que demarcan los distintos territorios dorsoventrales; para simplificar sólo se muestran dos genes representativos. Los procesos posteriores efectuarán subdivisiones más com plejas de estos territorios. Particularmente, el gen d ecap en tap lég ico (dpp) codifica un factor segregado que actúa como morfógeno local controlando el modelaje detallado del ectodermo. (A, según S. Roth, D. Stein y C. NüssleinVolhard, Cell 59:1189-1202, 1989. © Cell Press.)
(B)
cubierta vitelina (cubierta del huevo)
dpp transcrito
proteina Dpp
^ --------1-------100 nm
m em brana extraem brionaria epiderm is dorsal
ectoderm o neurogénico 1 gradiente de proteína Dorsal intranuclear
2 genes zigoto regulados por la proteína Dorsal
3 la proteina Dpp segregada form a un gradiente dorsal inductivo
4 territorios dorsoventrales especificados
m esoderm o
tiene lugar una notable redistribución de la proteína Dorsal: dorsalmente la pro teina permanece en el citoplasma pero ventralmente se concentra en el núcleo, y entre estos dos extremos existe un gradiente uniforme de localización nuclear (Figura 21-56). Parece ser que la distribución de la proteína Dorsal entre el nú cleo y el citoplasma está controlada, al menos en parte, por el producto de un gen llamado cactus. La proteína Cactus es homologa a la proteína I-kB que inhi be NF-kB en las células de los vertebrados impidiendo que migre al interior del núcleo (véase Figura 15-32). Análogamente, se cree que la proteína Cactus se une a la proteína Dorsal, atrapándola en el citoplasma; también se supone que la proteína Toll transmite la señal que pone en marcha la fosforilación de la pro teina Dorsal, provocando su disociación de la proteína Cactus de forma que ésta pueda entrar en el núcleo. Ya en el interior del núcleo la proteína Dorsal activa o desactiva, en función de su concentración, la expresión de diferentes grupos de genes. De esta forma el gradiente de localización nuclear de la proteina crea una serie de territorios dorsoventrales -franjas distintivas de células que aparecen a todo lo largo del embrión. Por ejemplo, donde la concentración de la proteína Dorsal es más alta, un gen específico del mesodermo, denominado twist, activa su expresión princi palmente en la zona ventral. En cambio, donde la concentración de proteína Dorsal es más baja, un gen decapentaplégico (dpp), puede activarse, especifican do estructuras dorsales. En la región intermedia, donde la concentración de la proteína Dorsal es lo bastante alta para reprimir a dpp pero demasiado baja para activar twist, las células se especializan convirtiéndose en ectodermo neurogénico (véase Figura 21-56). Los productos de los genes regulados directamente por la proteína Dorsal generan, a su vez, señales más locales que definen subdivisiones más delicadas del eje dorsoventral. Particularmente, dpp codifica una proteína segregada de la superfamilia TGF-(3, que podría formar un gradiente morfogénico local en la re gión dorsal del embrión. La acción de esta proteína tiene reminiscencias de la acción de la activina, miembro también de la familia TGF-(3, en el desarrollo
Drosophila I. Génesis del mapa corporal
1161
SISTEMA DORSOVENTRAL
SISTEMA TERMINAL
SISTEMA ANTERIOR
determ inan • ectodermic vs. m >dermo vs, endoderm o; ■estructuras term inales
determ inan . células germ inales vs. células somáticas; • cabeze vs cola; ’ segmentos coiporales
temprano de Xenopus. A partir de experimentos inyectando mRNA de dpp, se cree que las concentraciones más altas de proteína Dpp causan el desarrollo del tejido más dorsal -la mem brana extraembrionaria-, las concentraciones intermedias causan el desarrollo del ectodermo dorsal, y concentraciones muy bajas permiten el desarrollo del ectodermo neurogénico. Como el sistema dorsoventral, el sistem a term inal depende de un receptor transm em brana que detecta las señales localizadas transmitidas por las células foliculares para generar gradientes de proteínas reguladoras de genes en el inte rior del embrión (Figura 21-57). Estos gradientes definen el endodermo del in testino y algunas estructuras terminales, por lo que pueden clasificarse, junto con el sistema dorsoventral, com o parte del aparato que define las tres capas germinales del insecto. Por lo tanto, los sistemas dorsoventral y terminal de la mosca que utilizan moléculas segregadas que actúan como señales inductivas, son comparables a los m ecanism os inductivos que determinan las capas germi nales en el embrión temprano de Xenopus. Por el contrario, los sistemas anterior y posterior de los genes de polaridad del huevo establecen gradientes que dependen de acumulaciones localizadas de mRNA específicos en el interior del huevo (véase Figura 21-57). Estos gradientes controlan las diferencias entre la cabeza y la cola, y definen las series de segmen tos corporales a lo largo del eje cabeza-cola, como veremos de forma detallada en el sistema anterior. Primero nos detendremos brevemente en discutir la función específica del sistem a posterior: la especialización de las células germinales.
El sistema posterior define las células germinales y también los segmentos corporales posteriores47 En prácticam ente todos los animales estudiados, las células germinales primor diales -lo s precursores de la próxima generación de gam etos- se distinguen de las células somáticas -q u e formarán el resto de los tejidos del cuerpo- en un es tadio muy temprano del desarrollo (véase Figura 21-51). En muchas especies el huevo contiene com ponentes citoplasmáticos localizados -visibles como gránulos polares en C. elegans y Drosophila, o plasma germinal en Xenopus- segrega dos al interior de las células primordiales germinales durante la segmentación del huevo y que probablem ente incluyen o se asocian con determinantes del ca rácter de las células germinales. Generalmente estos com ponentes se concen tran en el extremo posterior o vegetativo del huevo, y las células que los heredan migran de este punto para colonizar las gónadas. Los genes de efecto materno de Drosophila necesarios para la formación de las células germinales pueden ser identificados mediante el descubrimiento de los mutantes que producen hijos que carecen de células germinales. Esta descenden cia anómala también carece de segmentos corporales posteriores, lo que indica que estos genes pertenecen al sistema posterior de genes de polaridad del huevo. Los productos de muchos de estos genes se localizan en el polo posterior -en tre ellos, probablem ente, los determinantes del carácter de célula germinal. El gra diente morfogénico que organiza los segmentos corporales posteriores depende
1 16 2
Capítulo 2 1 : Mecanismos celulares del desarrollo
SISTEMA POSTERIOR
Figura 21-57 Organización de los cuatro sistemas de gradiente de polaridad del huevo,
de los m ecanism os que crean y localizan los determ inantes celulares germina les. Un gen fundamental de este sistem a es oskar. Generalmente, la proteína y el mRNA de oskar se localizan en el polo posterior del huevo. En su ausencia no se desarrolla ninguna célula germinal, y si artificialmente se desplaza el mRNA de oskar hacia el extremo anterior del huevo, las células germinales se forma rán en aquella localización. Además, se puede demostrar que el mRNA locali zado de oskar controla la localización de otros com ponentes -productos de otros genes del grupo posterior implicados en el desarrollo de los segmentos corporales posteriores y de las células germinales. Mediante su localización en el polo posterior del huevo, estos productos pueden quedar incorporados de forma específica a las células que allí se formen, determinando su futuro como células germinales.
El mRNA localizado en el polo anterior codifica una proteína reguladora de genes que constituye el gradiente morfogénico anterior44,48 Si se pincha cuidadosamente el huevo de Drosophila por su extremo anterior, permitiendo que salga de una pequeña cantidad del citoplasma más anterior, el embrión no podrá desarrollar los segmentos de la cabeza. Si se inyecta citoplas ma perteneciente al extremo posterior de otro huevo en la localización donde se ha perdido el citoplasma anterior, se desarrolla un segundo conjunto de seg mentos abdominales, con la polaridad invertida, en la mitad anterior del huevo receptor (Figura 21-58). Este experimento demuestra que el control del modelaje de los segmentos del eje anteroposterior se efectúa por medio de substancias lo calizadas en los extremos del huevo. Estas substancias se han identificado gra cias a investigaciones genéticas, comenzando con la búsqueda de mutaciones que imiten las consecuencias de la pérdida de citoplasma anterior o posterior. De forma más destacada, las madres que son homozigotos para una mutación en el gen de la polaridad del huevo bicoid, producen embriones que carecen de las estructuras de la cabeza y el tórax, y cuyas estructuras abdominales se extien den sobre una fracción anormalmente larga del cuerpo. Sin embargo, tales em briones mutantes pueden salvarse de un desarrollo anómalo si en su extremo anterior se inyecta citoplasma procedente del extremo anterior de un huevo normal. Así pues el gen bicoid normal es imprescindible para fabricar cierto pro ducto en el extremo anterior del huevo que puede actuar como fuente emisora de influencias de largo alcance que controlan el patrón del desarrollo de las zo nas anteriores.
anterior
posterior
huevo fecundado norm al
pinchazo para facilitar la salida de parte del citoplasm a
inyección, en el extrem o anterior del huevo huésped, del citoplasma posterior de un huevo dador
el em brión se desarrolla hasta el estadio larvario
Drosophila I. Génesis del mapa corporal
Figura 21-58 Determinantes localizados en los extremos del huevo de Drosophila controlan su polaridad anteroposterior. Se extrae una pequeña cantidad de citoplasma anterior del huevo y se reemplaza inyectando citoplasma posterior. La larva doble-posterior resultante (fotog rafía d e la d er ech a ) se compara con un control normal (fotografía d e la izqu ierda); la substitución del citoplasma en un extremo del huevo tiene consecuencias a largo plazo, ya que convierte a todos los segmentos más anteriores en un duplicado especular de los tres últimos segmentos abdominales. Las larvas se muestran con iluminación de campo oscuro. (De H.G. Frohnhófer, R. Lehmann y C. Nüsslein-Volhard, /. Embryol. Exp. M orphol. 97 [Suppl]:169-179,1986. con autorización de Company of Biologists Ltd.)
1163
GRADIENTE DE LA PROTEÍNA BICOID
P A T R O N DE S E G M E N T A C IÓ N R E S U L T A N T E
100
0 copias génicas
100
1 copia gènica
50
100
distancia desde el extrem o anterior (% de la longitud del huevo) Figura 21 -59 El gradiente de la proteína Bicoid en el huevo de Drosophila y sus consecuencias en el patrón de segmentos. El gradiente se manifiesta por tinción con un anticuerpo contra la proteína Bicoid; el patrón segmentado se manifiesta con un anticuerpo contra el producto de un gen de regla par, ev en -skip p ed (que veremos más adelante). Se com paran em briones que contienen cero, una y cuatro copias respectivamente del gen b ico id normal. Con la dosis cero de bicoid , no se forman segmentos con carácter anterior; al aumentar la dosis génica se forman segmentos cada vez más alejados del extremo anterior del huevo, como sería de esperar si su posición se determinara por medio de la concentración local de la proteína Bicoid. En las gráficas se presentan las medidas de esta concentración, indicadas por la intensidad de tinción. A pesar de las diferencias de posición y de espaciamiento de los rudimentos segmentales en los em briones con una o cuatro dosis del gen, ambos embriones se convertirán en larvas adultas de proporciones normales. Los m ecanism os que probablemente son responsables de esta regulación se explican en la página 1140. (Ligeramente adaptado de W. Driever y C. Nüsslein-Volhard, Cell 54:83-104,1988 . © Cell Press.)
La hibridación in situ demuestra que el mRNA de bicoid se sintetiza origi nalm ente en el ovario por las células nodriza conectadas al oocito (véase Figura 21-55). A medida que el mRNA bicoid atraviesa los distintos puentes citoplasmáticos en el interior del oocito, queda anclado por su cola 3 ’ no transcrita a un com ponente del citoplasma -probablem ente una parte del citoesqueleto- en el extremo anterior del oocito. La transcripción del mRNA empieza cuando el hue vo es puesto, dando lugar a un gradiente de concentración de la proteína Bi coid, con el punto más alto del gradiente en el extremo anterior del embrión. La concentración del gradiente puede alterarse genéticamente mediante la cons trucción de m utantes que contengan copias múltiples del gen bicoid normal: al aumentar la dosis génica en la madre, tam bién lo hace la concentración de la proteína en el huevo. Los segmentos del embrión resultante se desplazan de forma correspondiente hacia el polo posterior, como harían si la determinación
1164
Capítulo 2 1 : Mecanismos celulares del desarrollo
G EN G AP
(Krüppel)
G E N DE R E G L A PA R
(even-skipped)
G E N DE P O L A R ID A D DE SEGM ENTO
(gooseberry)
de sus localizaciones fuera debida a las informaciones posicionales derivadas de la concentración local de proteína Bicoid (Figura 21-59). Por lo tanto, esta pro teína encaja perfectamente con la definición de un morfógeno. Como la proteí na Dorsal, la proteína Bicoid se une al DNA y su función es regular la expresión de otros genes.
Figura 21 -60 Ejemplos de los fenotipos de mutaciones que afectan a tres tipos de genes de segmentación. En cada caso las áreas sombreadas en verde sobre la larva normal (izqu ierda) están suprimidas en el mutante o están substituidas por duplicados especulares de regiones no afectadas. Convencionalmente, las mutaciones dominantes se escriben con letras en mayúscula y las m utaciones recesivas en minúscula. Varias de la mutaciones de modelaje de D rosop h ila se clasifican com o dominantes debido a que tienen un efecto apreciable en el fenotipo del heterozigoto, a pesar de que su característica más importante, las consecuencias letales, son recesivas, es decir, sólo son apreciables en el homozigoto. (Modificado de C. Nüsslein-Volhard y E. Wieschaus, N ature 287:795-801, 1980. © 1980 Macmillan Magazines Ltd.)
Tres clases de genes de segmentación subdividen el embrión49 Los productos de los genes de polaridad del huevo proporcionan, pues, gradien tes globales de señales. Las influencias que actúan sobre el sistema anterior deri van del mRNA bicoid localizado en el extremo anterior del huevo antes de la fe cundación, y toman la forma de un gradiente anteroposterior de la proteína reguladora de genes Bicoid. El gradiente dirige la creación de una serie de seg mentos corporales discretos. Este proceso depende de la acumulación de genes de segm entación, de los cuales han sido caracterizados cerca de 25. Cualquier mutación en uno de estos genes altera el número de segmentos o la organiza ción interna básica del huevo sin que la polaridad global del huevo quede afec tada. Los genes de segmentación actúan en estadios más avanzados que los ge nes de polaridad del huevo, cuando el embrión transcribe su propio genoma en vez de depender del mRNA materno almacenado. Debido a que son los transcri tos de los genes embrionarios, y no los transcritos de los genes maternos, los que determinan el fenotipo, estos genes se clasifican como genes de efecto zigoto en vez de genes de efecto materno. Los genes de segmentación se clasifican habitualmente en tres grupos se gún sus fenotipos mutantes y los estadios en los cuales actúan (Figura 21-60). Primero encontram os un grupo de al menos seis genes gap, cuyos productos marcan las subdivisiones más básicas del embrión. Las mutaciones en un gen gap eliminan un grupo o más de segmentos adyacentes, y las mutaciones de ge nes gap diferentes provocan varios defectos de solapamiento parcial. Por ejem plo, en el gen mutante Krüppel, la larva carece de seis segmentos, desde T I a A5, ambos inclusive. Los siguientes genes de segmentación en actuar son un conjunto de ocho genes de regla par. Las mutaciones de estos genes provocan una serie de supre siones que afectan segmentos alternos, dejando al embrión con sólo la mitad de sus segmentos habituales. Mientras que todos los genes mutantes de regla par presentan esta periodicidad de dos segmentos, difieren en la posición exacta de las supresiones relativas a los límites segmentales o parasegmentales. Por ejem plo el mutante de regla par even-skipped, que se estudia en el Capítulo 9, carece de todos sus segmentos pares, mientras que el mutante de regla par fushi tarazu
Drosophila I. Génesis del mapa corporal
1165
(ftz) carece de todos sus parasegmentos impares, y el muíante de regla par hairy carece de una serie de regiones de amplitud similar pero con registro distinto a las unidades parasegmentales. Por último, existen al m enos 10 genes de polaridad de segmento. Las m uta ciones en estos genes producen larvas con un número normal de segmentos pero una parte de cada segmento está suprimida y reemplazada por una imagen especular duplicada de todos o sólo parte del resto de los segmentos. Por ejem plo, en el caso de los mutantes gooseberry, se reemplaza la mitad posterior de cada segmento (es decir, la mitad anterior de cada parasegmento) con una ima gen especular aproximada de la mitad anterior del segmento adyacente (véase Figura 21-60). Luego estudiaremos, paralelamente al proceso de segmentación, un grupo de genes más evolucionados, los genes selectores homeóticos, que definen y pre servan las diferencias entre un parasegmento y el siguiente. Los fenotipos de varios mutantes de segmentación sugieren que los genes de segmentación forman un sistema coordinado que subdivide progresivamente el embrión en dominios cada vez más pequeños a lo largo del eje anteroposte rior, que se diferencian según diferentes patrones de expresión génica. Así, otra vez la genética molecular proporciona las herramientas necesarias para investi gar el funcionamiento de este sistema.
La expresión localizada de los genes de segmentación está regulada por una jerarquía de señales de posición50,51 Se han clonado la mayoría de los genes de segmentación, y la secuenciación de los cDNA revela que cerca de las tres cuartas partes de ellos, incluyendo todos los genes gap, codifican proteínas reguladoras de genes. Por lo tanto, sus accio nes sobre otro u otros genes pueden estudiarse comparando la expresión génica en em briones normales y en embriones mutantes. En efecto, se puede fotogra fiar la activación y desactivación de genes en patrones cambiantes utilizando las
regiones en las que se transcriben los genes en el em brión tem prano
hunchback
Krüppel
| Int | Mn | M x | La | T I | T2 | T3 I A1 | A2 | A3 | A4 | A5 | A6 | A7 | A8 | A9/10 PARTES DE LA CABEZA 1 TORAX 1 ABDOMEN 10 11 12 13 14 regiones deficientes hunchback cuando los genes están m utados
hunchback
Krüppel (A)
Figura 21-61 Dominios espaciales de los genes gap hunchback y Krüppel. Ambos genes codifican proteínas reguladoras de genes de la clase de dedos de zinc. (A) Diagrama de los principales dominios anteriores de hunchback y Krüppel que ilustra el modo en que los defectos provocados por una ausencia de producto funcional de hunchback o Krüppel se extienden por los alrededores de la región en la que normalmente se hallan los transcritos génicos. (B) Distribución normal de los transcritos de hunchback y Krüppel observada tras una hibridación in situ en el estadio blastodérmico. (C) Distribución típica de la proteína Krüppel {en rojo) y de la proteína Hunchback {en verde) tal como se manifiestan con anticuerpos fluorescentes. La región de solapamiento, en la que están presentes ambas proteínas, aparece en amarillo', una tinción más sensible revelaría un solapamiento más extenso. Las proteínas se distribuyen fuera de sus dominios respectivos de transcripción génica y es posible que actúen como morfógenos locales participando en la regulación de la expresión de otros genes (genes gap y genes de regla par incluidos). (A, adaptado de M. Hülskamp y D. Tautz, Bioessays 13:261-268,1991; B, cortesía de Diethard Tautz; C, cortesía de Jim Williams, Steve Paddock, Sean Carroll, y Howard Hugues Medical Institute.)
116 6
Capítulo 2 1 : Mecanismos celulares del desarrollo
Krüppel
(C )
Figura 21 -62 Patrón de expresión de f t z en el blastodermo de Drosophila. La hibridación in situ muestra que el gen se transcribe siguiendo un patrón de siete bandas que se corresponden al patrón de defectos en los mutantes ftz. Las bandas de expresión de ftz aparecen com o manchas negras debido a los granos autorradiográficos de plata presentes en esta sección longitudinal. (Cortesía de Philip Ingham.)
sondas adecuadas para detectar los transcritos.génicos. Analizando por este m é todo mutantes que carecen de un gen de segmentación determinado, se puede empezar a deducir la lógica del sistema de control génico. Ya hemos visto como la hibridación in situ de embriones normales ha ayu dado a demostrar que los transcritos de gen bicoid son la fuente de una señal posicional: los transcritos se localizan en un extremo del huevo, a pesar de que los efectos de una mutación en el gen se extienden sobre gran parte del em brión. De forma similar puede demostrarse que los genes gap generan a su vez (directa o indirectamente) señales posicionales que ayudan a controlar el patrón del desarrollo en zonas vecinas que se extienden más allá de sus propios domi nios de expresión. Por ejemplo, los mutantes defectuosos en los genes gap Krüppel o hunchback presentan anomalías en la región en que se detectan los trans critos génicos de un embrión normal y también en varios segmentos más alejados (Figura 21-61). Se cree que, al igual que la proteína Bicoid, las proteínas reguladoras de genes codificadas por genes gap como Krüppel y hunchback, se distribuyen com o morfógenos difusibles a partir de los lugares en que estos ge nes se transcriben. El nivel siguiente de modelaje espacial, más delicado, lo marcan los genes de regla par. Algunos de estos genes tam bién pueden codificar proteínas que se distribuyen por difusión ejerciendo efectos sobre células vecinas al lugar en que
fuente de señales
Figura 21 -63 Dos estrategias para utilizar los gradientes de concentración de señales para especificar un patrón detallado de células en diferentes estadios. En (A) existe un solo gradiente de señal, y las células seleccionan sus estados respondiendo adecuadamente a pequeños cambios producidos en la concentración de la señal. En (B) el gradiente inicial de la señal controla el establecimiento de un pequeño número de señales más locales, las cuales controlarán el establecimiento de otras señales todavía más locales, y así sucesivamente. Debido a la multiplicidad de señales locales, las células no tienen que responder de forma muy precisa a una única señal para generar una disposición espacial correcta de estados celulares. El caso B se corresponde de forma mucho más estrecha con la estrategia del embrión real.
A (A)
B
C
D
E
fr
■
H
I
estados celulares
fuente de señales
gradiente de señales
(B) Drosophila I. Génesis del mapa corporal
estados celulares 1167
se transcriben estos genes; en cambio, otros parecen afectar sólo el desarrollo de las regiones en las que son transcritos. Por ejemplo, los transcritos del gen ftz normal ocurren en siete "bandas cebra” en forma de circunferencia, en el esta dio de blastodermo (Figura 21-62), de aproximadamente cuatro células de an cho cada una, pareciéndose en amplitud y localización a la de los rudimentos de los parasegmentos pares perdidos en un mutante ftz. En conjunto, todas estas informaciones implican que los productos de los genes de polaridad del huevo proporcionan señales posicionales globales que activan la expresión de genes gap concretos en regiones determinadas, y enton ces los productos de los genes gap proporcionan un segundo nivel de señales posicionales que actúan localmente regulando detalles más sutiles del modelaje afectando la expresión de otros genes, incluidos los genes de regla par. De este modo los gradientes globales producidos por los genes de polaridad del huevo organizan la creación de un patrón detallado a través de un proceso de subdivi siones secuenciales por medio de una jerarquía de controles posicionales. Ésta es una estrategia de confianza: debido a que las señales posicionales globales no tienen que definir detalles sutiles, los núcleos individuales que responden a di chas señales no tienen por qué reaccionar con una precisión absoluta a peque ñas diferencias de concentración de señal (Figura 21-63).
El producto de un gen de segmentación controla la expresión de otro gen generando un patrón detallado41,50,51*52 La jerarquía de relaciones de control existentes entre los niveles consecutivos de genes de segmentación puede ponerse de manifiesto mediante la observación del patrón de expresión de un gen determinado cuando otro gen queda desacti vado debido a una mutación. Por ejemplo, en un embrión mutante que carezca del producto normal Krüppel, las bandas ftz no puede desarrollarse justamente en la región del blastodermo que corresponde al defecto en el mutante Krüppel. Así pues, el producto de Krüppel regula, directa o indirectamente, la expresión del gen ftz. En cambio en un mutante ftz, la distribución del producto del Krüp pel normal no se ve alterada, lo que indica que el producto de ftz no regula la ex presión del gen Krüppel. Tam bién existen interacciones entre genes del mismo nivel de la jerarquía reguladora. Por ejemplo, los genes gap Krüppel y hunchback se expresan en re giones adyacentes del blastodermo, existiendo un límite muy marcado entre el territorio anterior de hunchback y el territorio posterior de Krüppel (véase Figura 21-61). La represión del gen de expresión Krüppel por la proteína reguladora de genes Hunchback ayuda a establecer este límite, asegurando una correlación adecuada entre los dominios de expresión de ambos genes. Interacciones de este tipo contribuyen a dirigir el patrón de expresión periódica de los genes de regla par, estableciendo un acuerdo de reproducción exacta de exclusiones y solapamientos mutuos que se repite de forma fidedigna en cada unidad de segmento doble del blastodermo de todos los embriones normales (Figuras 21-64 y 21-65).
segmentos
A5
parasegm entos hairy
P1
P2
pairea
A8
A9/10
P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 P10 P11 P12 P13 P14
□
[
i
□
i
i
genes de regla par
] | |
fushi-tarazu
116 8
A7
|_____
even-skipped
engrailed
A6
¡_j
I
I
I
I
I
Capítulo 2 1 : Mecanismos celulares del desarrollo
gen de polaridad del segmento
Figura 21 -6 4 Cómo definen los genes de regla par los segmentos del blastodermo de . El
Drosophila
diagrama muestra el patrón de transcripción de cuatro de los ocho genes de regla par conocidos, y de uno de los genes de polaridad del segmento, engrailed. Aunque individualmente cada gen de regla par sólo define una alteración con una distancia de repetición de dos segmentos, el conjunto completo de genes de regla par combinados, por medio de su patrón de adyacencia y solapamiento, define potencialmente una subdivisión mucho más compleja del blastodermo en bandas de sólo una célula de amplitud, al igual que las que expresa el gen engrailed. (Según M. Akam, Development 101:1-22, 1987, con autorización de Company of Biologists Ltd.)
Figura 21 -65 Form ación de las bandas ftz y eve en el blastoderm o de
Drosophila. Tanto el gen ftz como el gen eve son de regla par. Sus patrones de expresión (coloreados en marrón para ftz y gris para eve) primero se 3 horas después de la fecundación
372
horas después de la fecundación
encuentran difusos pero se definen rápidamente en bandas. (Según P.A. Lawrence, The Making of a Fly. Oxford, UK: Blackwell, 1992.)
De este modo se distinguen, hasta el más mínimo detalle, bandas de células di ferentes alrededor del blastodermo por medio de diferentes combinaciones de expresiones de genes de regla par -la anchura de una sola célula, que correspon de aproximadamente a una cuarta parte de la anchura de un futuro segmento o un parasegmento. La totalidad de este detallado proceso de modelaje depende de las largas ex tensiones de secuencias de DNA que controlan la expresión de cada uno de los genes de segmentación. Estas regiones reguladoras unen muchas copias de pro teínas reguladoras de genes producidas por un subgrupo de otros genes de seg mentación, y el gen se activa o desactiva según la combinación de proteínas que se consigue. En el Capítulo 9 (véase pág. 456) nos centramos en un gen de seg mentación determinado y vimos cómo la decisión de la transcripción o no trans cripción de un gen se efectúa en base a todas estas señales de entrada.
Los genes de polaridad del huevo gap y de regla par generan un patrón transitorio que es recordado por otros genes41,50,52 Durante las primeras horas siguientes a la fecundación, los genes gap y los genes de regla par se activan uno tras otro. Sus productos mRNA aparecen primero en patrones que sólo se aproximan a la imagen final; luego, al cabo de poco tiempo -y mediante una serie de ajustes interactivos- la confusa distribución inicial se resuelve por sí misma dando lugar a un sistema regular bien definido de bandas (véase Figura 21-65). Pero este sistema es de por sí inestable y transitorio. A m e dida que el embrión progresa a través de la gastrulación y las etapas posteriores, el patrón regular de segmentos de los productos de los genes gap y de regla par se desintegra. Sin embargo, sus acciones han dejado un sello permanente en for ma de conjunto de mareajes (valores posicionales) sobre las células del blasto dermo. Estos mareajes posicionales se graban en la activación continuada de al gunos genes de polaridad de segmentos y de genes selectores homeóticos que mantienen la organización segmentada de la larva y el adulto.
Los genes de la polaridad de segmento marcan las subdivisiones básicas de cada parasegmento53 Los genes de polaridad de segmento se expresan según un patrón que se repite de un parasegmento al siguiente. El gen engrailed proporciona un buen ejemplo de ello (Figura 21-66). Sus transcritos de RNA están dispuestos en el blastodermo en una serie de 14 bandas, del tamaño de una célula, y que corresponden a las porciones más anteriores de los futuros parasegmentos. Las bandas aparecen en una relación establecida con las bandas de expresión de los genes de regla par (véase Figura 21-64). Nuevamente el patrón está controlado de un modo com bi natorio por los productos del conjunto de genes que le antecede en la jerarquía y se ve mejorado y detallado por medio de interacciones entre los propios genes de polaridad de segmento. A través de la expresión de distintos segmentos de ge nes de polaridad en varias bandas de células, cada futuro parasegmento queda subdividido en el estadio del blastodermo celular en al menos tres regiones dis tintas. Las diferencias químicas persistirán, mantenidas por la transcripción continuada de al menos algunos de los genes de polaridad del segmento, des-
Drosophila I. Génesis del mapa corporal
1169
Figura 21 -66 Patrón de expresión de
engrailed, un gen de polaridad de
em brión de 10 horas
100-----|jm
pués de la desaparición de la mayor parte de los productos de los genes de regla par (véase Figura 21-66). Algunos de los genes de polaridad del segmento que se expresan de este modo -incluyendo, especialmente uno llamado wingless- codi fican proteínas secretadas que tam bién actúan durante el desarrollo posterior como señales espaciales dentro del parasegmento regulando los detalles de su crecim iento y modelaje interno. Además de regular los genes de polaridad del segmento, los productos de los genes de regla par colaboran con los productos de los genes gap (y quizás con los genes de polaridad del huevo) provocando la activación localizada y pre cisa de un conjunto de mareajes espaciales más desarrollado -e s decir, los genes selectores homeóticos, que distinguirán un parasegmento de otro de forma per manente. En el próximo apartado examinaremos en detalle estos genes selecto res y consideraremos su función en la m emoria celular.
Resumen
Igual que otros insectos D rosoph ila se construye a partir de una serie de unidades modulares repetidas denominadas segmentos, con estructuras no segmentóles es pecializadas en cada extremo del cuerpo. Cada subdivisión importante de cada seg mento se distingue por medio de la expresión de una selección de genes de control particular que define su udirección p o sta lE l origen del patrón está en la simetría del huevo: la información posicional la proporcionan cuatro gradientes estableci dos por los productos de cuatro grupos de genes de efecto materno llamados genes de polaridad del huevo. Los cuatro grupos de genes controlan cuatro diferenciacio nes básicas del mapa corporal de los animales: dorsal versu s ventral, endodermo versu s mesodermo y ectodermo, células germinales versu s células somáticas, y ca beza versu s cola. Los genes de polaridad del huevo actúan estableciendo distribu ciones escalonadas de proteínas reguladores de genes en el huevo y el embrión tem prano, pero los gradientes los establecen de modo distinto los diferentes ejes del huevo. La polaridad dorsoventral se define mediante una señal localizada proceden te de las células foliculares que rodean el huevo. La molécula señal se une a los re ceptores transmembrana presentes en la superficie ventral del huevo, lo que con ducirá finalmente a una concentración intranuclear escalonada de la proteína Dorsal reguladora de genes, a lo largo del eje dorsoventral del embrión temprano. La proteína Dorsal regula la expresión de otros genes, incluido dpp, cuyo producto actúa a su vez como gradiente morfogénico definiendo subdivisiones más sutiles del eje dorsoventral, como hacen las señales inductoras tempranas que actúan en X enop u s.
En el caso del grupo anterior de genes de polaridad del huevo, el gradiente sur ge a partir de un depósito de mRNA producto del gen bicoid, localizado en el extre mo anterior del huevo. Debido a que el huevo del insecto se desarrolla inicialmente 117 0
Capítulo 2 1 : Mecanismos celulares del desarrollo
segmento. Las fotografías ilustran el patrón de engrailed en un embrión de 5 horas (en el estadio de banda germinal extendida), un embrión de 10 horas y un adulto (al que se le han extraído las alas para este experimento). El patrón se hace visible gracias a un anticuerpo (marrón) contra la proteína Engrailed (para embriones de 5 a 10 horas) o (para el adulto) mediante la construcción de un linaje de Drosophila que contiene secuencias de control del gen engrailed acopladas a la secuencia que codifica la enzima p-galactosidasa, cuya presencia es fácilmente detectable por medio de métodos histoquímicos a través del producto azul de la reacción que cataliza. Nótese que una vez establecido, el patrón de engrailed se preserva durante todo el transcurso de la vida del animal. (Cortesía de Tom Kornberg y Cory Hama.)
como un sincitio, la proteína Bicoid transcrita a partir de este mRNA es capaz de di fundir el citosol a lo largo de la longitud del embrión, dirigiendo la organización global de su mitad anterior. La concentración del gradiente Bicoid pone en marcha la expresión ordenada de los genes gap, genes de regla par, genes de polaridad del segmento y genes selectores homeóticos. Estos genes, a través de un jerarquía de in teracciones, quedan expresados en algunas regiones del embrión y en otras no, subdividiendo el cuerpo deform a progresiva en una serie regular de unidades segmentales y subsegmentales.
y la genética molecular del patrón de formación. II. Genes selectores homeóticos y modelaje de las partes del cuerpo41,50
D r o s o p h ila
Las primeras observaciones sobre el sistema de genes del patrón de formación se efectuaron hace más de 70 años, con el descubrimiento del primer grupo de mu taciones en Drosophila que provocaban perturbaciones extrañas en la organiza ción de la m osca adulta. Por ejemplo, en la mutación Antennapedia de la cabeza surgen patas en vez de antenas (Figura 21-67), mientras que en la mutación bithorax, aparecen porciones de un par extra de alas donde normalmente deberían surgir unos apéndices mucho más pequeños denominados balancines. Estas mutaciones, llamadas homeóticos, transforman unas partes del cuerpo en estruc turas adecuadas para otras posiciones. Un grupo completo de genes selectores homeóticos determina el carácter anteroposterior de los segmentos de la mosca. En este apartado seguimos el desarrollo de Drosophila a través de las últimas eta pas en la formación de la mosca adulta. Al final de este apartado veremos que es tos mismos genes tienen un papel crucial en el modelaje del cuerpo de otros ani males, incluso los seres humanos.
Los genes selectores homeóticos del complejo bithorax y del complejo Antennapedia definen las diferencias entre parasegmentos54,55 Los genes selectores homeóticos que aquí nos interesan se encuentran todos ellos concentrados en una de las dos estrechas agrupaciones de genes, conoci das como complejo bithorax y complejo Antennapedia. Cada complejo contie ne varios genes con funciones análogas: los del complejo bithorax controlan las diferencias entre los segmentos torácicos y abdominales del cuerpo, mientras que los del complejo Antennapedia controlan las diferencias entre los segmen tos torácicos y los de la cabeza. En otros insectos los grupos de genes correspon dientes se encuentran en un único complejo, denominado complejo HOM; por lo tanto se piensa que los complejos Antennapedia y bithorax son las dos m ita des de un único complejo HOM que se dividió en el curso de la evolución de la mosca. Cada gen homeótico selector tiene un dominio de actuación propio, de finido por la región del cuerpo que queda afectada si se produce una mutación en este gen. Generalmente, el dominio tiene unos límites bien marcados despla zados de los límites de los segmentos convencionales aproximadamente medio segmento, lo que indica que el dominio es un parasegmento o un bloque de pa rasegmentos (véase Figura 21-50). Muchas de las mutaciones de los genes selectores homeóticos tienen un fe notipo letal recesivo y sólo permiten que el embrión sobreviva poco tiempo a su nacimiento. En consecuencia son las observaciones efectuadas en embriones y larvas muy tempranas las que nos proporcionan la visión más clara y en algunos aspectos más completa de la función de los genes selectores homeóticos. Las larvas que son deficientes en todos los genes del complejo bithorax tie nen una estructura especialmente simple: la cabeza y el tórax son normales has ta el parasegmento P4, pero los 10 parasegmentos restantes se convierten en el
Drosophila II. Genes selectores homedticos y modelaje de las partes del cuerpo
Figura 21 -67 Mutación homeótica.
La mosca que aquí se presenta es una mutante Antennapedia. Sus antenas se convierten en estructuras de pata debido a una mutación del gen Antennapedia que provoca su expresión en la cabeza. Compárese con la mosca normal que aparece en la Figura 21-47. (Cortesía de Matthew Scott.)
1171
Figura 21 -6 8 Consecuencias de la supresión de la m ayoría de los genes del complejo bithorax. (A) Una larva normal de Drosophila observada con
iluminación de campo oscuro; (B) la larva mutante en la que se ha suprimido la mayoría del complejo bithorax. En el mutante todos los parasegmentos posteriores a P5 tienen el aspecto de P5. (Cortesía de Gary Struhl; A, de Nature 293:36-41. © 1981 Macmillan Journals Ltd.)
carácter P4. Las supresiones parciales del complejo bithorax provocan transfor maciones que son menos generales (Figura 21-68). Estas observaciones, y descu brimientos análogos en el complejo Antennapedia, ilustran la función funda mental de los genes selectores hom eóticos respecto a la definición de las diferencias entre los parasegmentos: cuando se pierden estos genes, los paraseg mentos no se diferencian unos de otros.
Los genes selectores homeóticos codifican un sistema de marcadores moleculares de dirección50,56 Como los genes de segmentación, los genes selectores homeóticos se activan primero en el blastodermo. Desde que se clonó el DNA completo de los comple jos Antennapedia y bithorax, disponemos de sondas de DNA que permiten esta blecer el mapa del patrón espacial de transcripción de cada uno de los genes se lectores hom eóticos, mediante hibridación in situ. Las conclusiones obtenidas de estos estudios son sorprendentes: según una primera aproximación, habi tualmente cada gen hom eótico selector se expresa en las regiones que se desa rrollan con anomalías, por ejemplo debido a una mala colocación, si el gen está ausente o mutado. De esta forma se puede considerar a los productos de los genes selectores como marcadores moleculares de dirección de las células de cada parasegmen to. Si se cam bian los marcadores de dirección, el parasegmento se comporta como si estuviera colocado en otro lugar. Debido a que los genes de segmenta ción contribuyen al control de la activación de los genes selectores homeóticos, el patrón de expresión del gen hom eótico selector se sitúa en el mismo registro que los límites de los parasegmentos definidos por medio de los productos de genes de regla par y de polaridad del segmento. De esta forma la combinación del producto de un gen hom eótico selector (o una suma de tales productos) con un conjunto de productos de genes de segmentación definirá con precisión una sola dirección, que únicamente tomarán las células de una subdivisión de un segmento. Aunque el patrón de expresión de los genes selectores homeóticos sufre ajustes com plejos a medida que avanza el desarrollo, estos genes continúan ju gando un papel crucial en el transcurso del desarrollo posterior de la mosca. De algún modo equipan a las células con una m emoria de su valor posicional.
Las regiones de control de los genes selectores homeóticos actúan como chips de memoria de información posicional54,57,58,59 Como se vio en el Capítulo 9, los productos de los genes selectores homeóticos son proteínas reguladoras de genes, todos son homólogos entre sí y todos con tienen una secuencia homeobox muy conservada que codifica un homeodominio de unión a DNA (de una longitud de 60 aminoácidos) en las proteínas corres pondientes. Aunque muchos otros genes tam bién contienen un homeobox, el tipo de secuencia hom eobox encontrada en los genes selectores homeóticos es característica. En los com plejos de genes Antennapedia y bithorax existen ocho genes se lectores hom eóticos (a los que, por convenio, nos referiremos colectivamente com o com plejo HOM). Sus secuencias codificantes están repartidas en medio de una cantidad mucho mayor de DNA regulador -cerca de un total de 650 000
1 17 2
Capítulo 2 1 : Mecanismos celulares del desarrollo
100 [jm
Cromosom a 3 parasegm entos ' 0 ' 1 I 2 I 3 I 4 I 5 I 6 I 7 I 8 I 9 , 10I 11' 12I 13I 14I
i m
labial
labial — proboscipedia Deform ed Sex combs reduced Antennapedia P2 — U ltrabithorax abdom inal A ----------1 A bdom inal B
com plejo Antennapedia
com plejo bithorax
Antennapedia
U ltrabithorax
Figura 21 -69 Comparación de los patrones de expresión y las localizaciones crom osóm icas de los genes del complejo HOM. La secuencia de los genes en cada una de las dos subdivisiones del complejo cromosómico se corresponde con la secuencia espacial en que se expresan los genes. Obsérvese que la mayoría de los genes se expresan a un elevado nivel a través de uno de los parasegmentos (color oscuro) y a nivel menor en alguno de los parasegmentos adyacentes (color intermedio, cuando la presencia de los transcritos es necesaria en un fenotipo normal, color claro donde dicha presencia no lo es). En las regiones donde se solapan los dominios de expresión, normalmente el gen que determina el fenotipo local es el gen localmente activo más “posterior”. Los diagramas en la parte baja de la figura representan los patrones de expresión génica de embriones en la fase de banda germinal extendida, aproximadamente 5 horas después de la fecundación.
D eform ed
pares de nucleótidos. Este DNA incluye localizaciones para la fusión de los pro ductos de genes de polaridad del huevo y de genes de segmentación -com o bicoid, hunchback y even-skipped. El DNA regulador del complejo HOM actúa como un intérprete de las muchas unidades de información posicional que le proporcionan todos estos factores, y, como respuesta ante ellos, decidirá si se transcribe un grupo determinado de genes selectores homeóticos o no. Sin em bargo, todavía existen grandes incógnitas acerca del cómo se organiza el sistema de control HOM y cómo actúa. Una característica notable es que la secuencia en la que los genes se ordenan a lo largo del cromosoma tanto en el complejo Antennapedia como en el bithorax, se corresponde casi exactamente con el orden en que los genes se expresan a lo largo del eje corporal (Figura 21-69). Es como si los genes fueran activados en serie por un proceso que se extiende cada vez más lejos a lo largo del cromosoma en proporción directa a un indicador intracelular de distancia, presente a lo largo del eje corporal. No está claro si estas órdenes son tan solo un accidente evolutivo o si realmente reflejan la implicación de algún mecanismo que se propaga a lo largo del cromosoma, aunque luego veremos que ésta es una característica del complejo HOM altamente conservado en el curso de la evolución.
Drosophila II. Genes selectores homedticos y modelaje de las partes del cuerpo
1173
Existe un rom pecabezas todavía más complejo. El complejo HOM sirve para diferenciar cada parasegmento del siguiente, pero el número de genes selectores hom eóticos es más pequeño que el número de parasegmentos. Por ejemplo, el complejo bithorax contiene sólo tres genes, pero de él dependen las diferencias entre 10 parasegmentos (véase Figura 21-69). Además, existen muchas m utacio nes, que afectan a diferentes localizaciones del complejo, y que alteran el carác ter anteroposterior de únicamente un solo parasegmento o incluso de parte de un parasegmento. La mayoría de estas mutaciones se encuentran en regiones de control no codificantes y que también están ordenadas a lo largo del cromosoma en una secuencia que imita hasta el más mínimo detalle el orden anatómico de las regiones que afectan. Esto sugiere que las diferencias entre las regiones del cuerpo no se definen únicamente por la presencia de productos de varios genes selectores homeóticos, sino más sutilmente por alguna clase de diferencia per sistente en los estados de las regiones de control asociadas con los genes. Desde este punto de vista, una región de control no debe describirse como un simple interruptor sino como algo más parecido a un microchip de ordenador: recibe entradas de información (en forma de factores reguladores y otras moléculas que se unen a él), produce una respuesta de salida (en forma de órdenes de transcribir o no el gen hom eótico selector), y puede almacenar un rastro de m e moria (una unidad de información posicional) que afecta el modo en que las en tradas de información calculan las salidas de información. De este modo el valor posicional de una célula no se reflejará necesariamente en un nivel fijo de expre sión de los genes selectores hom eóticos sino en un modo de control particular de este gen en respuesta a las condiciones cambiantes. De mom ento todo esto son especulaciones, cuya confirmación pasa por te ner respuesta a una tercera pregunta, tal vez la más importante: ¿Qué m ecanis mo m antiene el rastro de memoria? Como vimos anteriormente (véase pág. 1137) una posibilidad es que el m ecanismo implique una retroalimentación po sitiva, en la que el producto de un gen, una vez producido, estimule su propia transcripción. Parece que al menos algunos genes selectores homeóticos tienen esta propiedad. Por ejemplo, el gen Deformed (perteneciente al complejo Antennapedia) tiene muchas localizaciones de unión para la proteína Deformed en su región de control superior, y en algunas células estas localizaciones son suficien tes para m antener la actividad de la proteína una vez ésta se ha desencadenado. No obstante, estos efectos autoestimuladores no son suficientes para mantener el rastro de memoria en la mayoría de las células. Se ha descubierto que es nece sario un conjunto adicional completo de genes, llamado grupo Polycomb, para m antener inactivos a los genes selectores hom eóticos no expresados: si se inac tiva cualquiera de los genes del grupo Polycomb mediante mutaciones, los ge nes selectores hom eóticos se activan primero siguiendo un patrón normal, pero luego se activa de forma indiscriminada por todo el embrión (Figura 21-70A). La proteína Polycomb está unida a la crom atina de los genes que ella controla (Figura 21-70B). Además, parece ser que genes relacionados están implicados en otras regiones en el control de la estructura de cromatina, lo cual sugiere que alguna modificación persistente de la crom atina del com plejo de genes HOM podría ser la transmisora de la memoria de valor posicional.
La mosca adulta se desarrolla a partir de un conjunto de discos imagínales que contienen información posicional60 En Drosophila, el patrón básico de expresión de los genes selectores homeóticos ya se establece en el embrión y no sólo determina la estructura de la larva, sino que todavía es capaz de determinar las estructuras de la mosca adulta. Para apreciar la función completa de estos genes como portadores de memoria posi cional, es necesario tener una idea aproximada de la curiosa vía a través de la que se desarrolla la m osca adulta, o imago. La m osca adulta se forma mayoritariamente a partir de grupos de células, denominadas células imagínales, que permanecen en un rincón de cada seg-
117 4
Capítulo 2 1 : Mecanismos celulares del desarrollo
Figura 21-70 Actuación de genes del grupo Polycomb. (A) Fotografía de un *
n *
# s
"M
#*
BX-C ♦4
% * «
V' %•m, s' wv % \
%
f* # «♦
ANT-C^
(A}
100 pm
(B)
mentó de la larva, y que aparentemente no están diferenciadas. El origen de la mayoría de las células imagínales del cuerpo adulto se encuentra en la epider mis embrionaria -e l epitelio que envuelve al cuerpo. Permanecen conectadas a la epidermis de la larva, y su destino será formar las estructuras epidérmicas de la m osca adulta. Las células imagínales de la cabeza, el tórax, y los genitales se organizan en discos im agínales; otros grupos de células imagínales constituirán el abdomen. Tam bién existen grupos de células imagínales en las visceras de la larva que darán lugar a los órganos internos de la mosca. Los discos imagínales han sido el principal objetivo de los estudios detallados en este ámbito. Hay 19 discos imagínales, dispuestos en nueve pares situados en sendos lados de la lar va, más otro disco en la línea media (Figura 21-71). Los discos son bolsas de epi telio, con forma de globos deshinchados y apretujados, que se evaginan (se des pliegan desde el interior hacia el exterior), se extienden y se diferencian durante
embrión mutante que carece de un gen extra sex combs (esc) y que desciende de una madre que también carecía de este gen. El gen pertenece al grupo Polycomb. Prácticamente todos los segmentos se han transformado pareciéndose al más posterior de los segmentos abdominales (compárese con Figura 21-68). En el mutante, el patrón de expresión de los genes selectores homeóticos, que inicialmente era casi normal, es inestable de una forma tal que pronto todos los genes situados a lo largo del eje corporal intercambiarán posiciones. (B) Visualización del patrón que normalmente rige la unión de la proteína Polycomb a los cromosomas gigantes de Drosophila por medio de un anticuerpo contra Polycomb. La proteína se une al complejo Antennapedia (ANT-C) y al complejo bithorax (BX-C) así como a 60 localizaciones más. (A, según G. Struhl, Nature 293:36-41,1981. © 1981 Macmillan Journals Ltd; B, cortesía de B. Zink y R. Paro, de R. Paro, Trends Genet. 6:416-421,1990.)
Figura 21-71 Los discos imagínales de la larva de y las estructuras adultas a que dan lugar.
Drosophila
(Según J.W. Fristrom et al., en Problems in Biology: RNA in Development [E.W. Hanley,ed.], p. 382. Salt Lake City: University of Utah Press, 1969.)
labial
clipeo
dorsal
balancín
Drosophila II. Genes selectores homedticos y modelaje de las partes del cuerpo
1175
la-metamorfosis. A partir de un par de discos se desarrollan las antenas y los ojos, de otro las alas y parte del tórax, de otro el primer par de patas, y así sucesi vamente. Las células de un disco imaginal se parecen a las de otro disco, y cuando se diferencian, dan lugar a conjuntos de tipos celulares especializados generalmen te bastante similares. Pero experimentos con injertos demuestran que de hecho las células ya están determinadas regionalmente y que son no equivalentes. Si se substituye un disco imaginal por otro en la larva y permitimos que ésta atraviese la metamorfosis, veremos que el disco trasplantado se diferenciará de forma au tónoma, y dará lugar a la estructura que le corresponde según su origen, inde pendientem ente de su nueva localización. Esto implica que los discos imagína les están controlados por algún tipo de memoria de su posición original. Mediante un ingenioso procedimiento de injertos que permite que los discos imagínales proliferen durante un largo período antes de su diferenciación, se puede demostrar que esta memoria celular se hereda de forma estable (con es casos errores) a través de un número indefinido de generaciones celulares (Figu ra 21-72). Los genes selectores homeóticos son componentes fundamentales de este mecanismo de memoria. Si se eliminan estos genes de cualquier disco imaginal en cualquier estadio del largo período que conduce hasta la diferenciación en la me tamorfosis, las células se diferenciarán dando lugar a estructuras incorrectas, tal como harían si pertenecieran a un segmento distinto del cuerpo. Esto se puede demostrar gracias a la poderosísima técnica de recombinación mitótica inducida por rayos X -d e hecho, una especie de cirugía genética para células individuales que posibilita la generación de clones mutantes de un genotipo determinado en cualquier momento del desarrollo, tal como veremos a continuación.
Los genes selectores homeóticos son esenciales para la memoria de la información posicional de las células de los discos imagínales61 Una breve exposición a la radiación con rayos X puede provocar, como efecto se cundario al daño causado en el DNA, un entrecruzamiento entre cromosomas ho mólogos de una célula en división -norm alm ente, dicho entrecruzamiento sólo se produciría en la meiosis. Como ilustra la Figura 21-73, si la célula es heterozigota por un gen de la región del entrecruzamiento cromosómico, es posible que el re-
larva
parte del disco injertada en la cavidad abdom ina
m etam orfosis
parte del disco injertada en otra larva las estructuras adultas se diferencian a partir de células de discos imagínales
las células de disco im aginal proliferan en la mosca adulta y se pueden trasplantar de form a seriada de un adulto a otro se tom a una muestra y se im planta en una larva para com probar la determ inación de las células de los discos imagínales
117 6
Capítulo 21 : Mecanismos celulares del desarrollo
se form an las mismas estructuras adultas que en las células originales del disco
Figura 21 -72 Experimentos que permiten comprobar el estado de determinación de las células de los discos imagínales. El método de ensayo consiste en implantar células en la larva que está a punto de sufrir metamorfosis; las células se diferenciarán formando estructuras adultas reconocibles que, sin embargo, se encuentran en el interior de la mosca tras la metamorfosis sin integrarse en ella. Las células del disco se pueden examinar de inmediato o pueden implantarse en el abdomen de las moscas adultas, que servirán como cámara de cultivo natural. Las condiciones hormonales de la mosca adulta permiten que los discos imagínales que hayan traspasado la metamorfosis continúen su proliferación durante un tiempo indefinido, sin diferenciarse, antes de que se efectúe el ensayo de la determinación celular. En ambos casos, las células se suelen diferenciar formando las estructuras propias del disco del que derivan originalmente.
(A) MITOSIS NORMAL
(B) RECOMBINACION MITOTICA
materno paterno los crom osom as se i replican y se recom binanl
los crom osom as se replican
A
la célu la se divide
r-~—i
i1— —M -----------■----------- .1
' B
& r O
O
sultado del proceso sea un par de células hijas homozigotas: una recibirá dos co pias del alelo materno del gen y la otra recibirá dos copias del alelo paterno .1La coincidencia del entrecruzamiento se puede detectar si el animal escogido tam bién es heterozigoto para una mutación en un gen de mareaje -por ejemplo, un gen de pigmentación- que se encuentre cerca del gen que nos interesa, de forma que ambos sufran juntos el entrecruzamientos. De esta manera, se pueden gene rar “a medida” clones de células mutantes homozigotas marcadas (Figura 21-74). Las consecuencias más importantes de las mutaciones en los genes selecto res hom eóticos acostumbran a ser recesivas: sólo en el organismo homozigoto
los rayos X provocan la recom binación m itótica en una célula en proliferación de epitelio del disco ¡maginal -O
-o
Figura 21-73 Comparación de la recombinación mitótica (B) con la mitosis normal (A). Los diagramas siguen el destino de un solo par de cromosomas homólogos, uno procedente del padre (sombreado ) y otro procedente de la madre (no sombreado). Estos cromosomas contienen un locus para un gen de pigmentación (u otro gen de mareaje) con un alelo A de tipo salvaje (un pequeño cuadrado blanco en el cromosoma paterno) y un alelo a con mutación recesiva (un pequeño cuadrado rojo en el cromosoma materno) de modo que una célula homozigota A/A o heterozigota Ala tiene un aspecto normal (ilustrado en blanco) y una célula homozigota a/a presenta un aspecto alterado (ilustrado en naranja). La recombinación por intercambio de DNA entre cromosomas maternos y paternos puede dar lugar a un par de células hijas, una homozigota A/A y consecuentemente de aspecto normal y la otra a/a y por lo tanto visiblemente diferente. La recombinación mitótica es un accidente raro que ocurre sin la intervención del aparato especializado que facilita la recombinación durante la meiosis. Una breve exposición a rayos X provoca una mayor frecuencia de recombinaciones.
-o
Figura 21 -74 La utilización de la recombinación mitótica para generar un clon de células mutantes marcadas genéticamente en el ala de Drosophila. Cuanto más temprano sea el estadio en que ocurra la recombinación, mayor será el clon resultante.
Drosophila II. Genes selectores homedticos y modelaje de las partes del cuerpo
1177
mutante es visible la transformación homeótica. Si utilizamos la recombinación mitótica podremos generar un clon de células mutantes homeóticas homozigotas marcadas en un disco imaginal y estudiar su comportamiento en un medio heterozigoto, con un fenotipo normal. El descubrimiento es que las células m ar cadas, y sólo las marcadas, presentan la transformación hom eótica (siempre que estén situadas en el dominio de acción del gen hom eótico selector); este hecho se produce tanto si la recom binación se provocó en una fase temprana del desa rrollo como en una fase tardía. Por ejemplo, una larva de 2 días heterozigota para una m utación que elimina la función del gen Ultrabithorax (Ubx) (del com plejo bithorax), puede ser tratada con radiación por rayos X para producir los clones aislados de células homozigotos en sus discos imaginales que contienen gen Ubx no funcional. Estos clones, si están situados en el disco del balancín, darán lugar a parches de tejido del ala en el balancín. Estas y otras observaciones indican que la memoria de información posicional de la célula depende de la ac tividad continuada de un gen hom eótico selector común. Además, esta memoria se expresa de forma independiente en cada célula -cad a célula mantiene su es tado de forma independiente de las demás, dependiendo sólo de su propia his toria y de su genoma, sin tener en cuenta a sus vecinas.
Los genes selectores homeóticos y los genes de polaridad del segmento definen los compartimientos del cuerpo53,62 Las diferencias recordadas definidas por los genes selectores homeóticos son dis cretas: existe una gran diferencia en la expresión gènica en células situadas en parasegmentos adyacentes. Lo mismo ocurre con algunos de los genes de polari dad, como engrailed (véase Figura 21-66), cuyas diferencias en la expresión se corresponden con la gran diferencia existente entre células situadas en la parte posterior del parasegmento y las situadas en la parte anterior. Así pues, por m e dio de la expresión diferente de estos dos tipos de genes, el cuerpo se subdivide en una serie de regiones discretas que constan de células en diferentes estados de determinación. En la frontera entre una región y la siguiente parece que las célu las no pueden mezclarse, como si existiera una cohesión selectiva entre las célu las que contienen el mismo mareaje de dirección molecular, que las mantuviera segregadas de las células con un mareaje diferente (Figura 21-75). De este modo,
vena central del ala
lím ite del com partim iento clon en el ala
com partim iento posterior ala que presenta los com partim ientos posterior y anterior
Figura 21-75 Compartimientos. (A) Las formas de los clones marcados del ala de Drosophila revelan la existencia de límites de compartimiento. El borde de cada clon marcado, donde entra en contacto con el límite, es recto. Incluso si un clon marcado ha sido alterado genéticamente de forma que crezca más rápidamente que el resto del ala y por lo tanto sea más grande, este clon respetará dicho límite (último dibujo). Obsérvese que el límite del compartimiento no coincide con la vena que discurre por el centro del ala. (B) Patrón de expresión del gen engrailed en el ala, puesto de manifiesto por la misma técnica que en la Figura 21-66. Los límites del compartimiento coinciden con los límites de expresión del gen engrailed. (A, según F.H.C. Cricky P.A. Lawrence, Science 189:340-347,1975. © 1975 the AAAS; B, cortesía de Cory Hama y Tom Kornberg.)
117 8
Capítulo 21 : Mecanismos celulares del desarrollo
un clon de crecim iento rápido respeta el lím ite entre los com partim ientos posterior y anterior
500 |jm
por ejemplo, si mediante recombinación mitótica se genera en el ala un clon de células marcadas genéticamente, aunque normales por todo lo demás, se observa que el clon está estrictamente restringido a uno u otro lado de un límite marcado de forma muy precisa en la frontera entre los dos parasegmentos en los que se construyen las alas. Una subdivisión del cuerpo definida de esta manera en el ala o en otro órgano se denomina compartimiento (Figura 21-75). Por definición, el límite de un compartimiento es la frontera existente entre dos poblaciones de células que, debido a presentar diferentes estados de diferen ciación, no pueden mezclarse. Como el estado de determinación normalmente no es reversible, cada compartimiento tiene que ser una unidad autosuficiente. No puede reclutar células de los compartimientos adyacentes ni transferirles ex cedentes celulares. Sin embargo, puede regular su organización interna y su ta maño según el principio de intercalación, visto anteriormente, mediante reajus tes que no violan esta limitación. Así pues, en relación a la regulación del patrón y del crecimiento, cada compartimiento parece comportarse como un módulo más o menos independiente durante el desarrollo normal (aunque durante la re generación que sigue a un trastorno importante algunas veces alteran su carác ter y sus alianzas de compartimiento). Algunas de las señales morfogénicas que actúan en el disco imaginal contro lando estos procesos, han sido identificadas. Parece ser que incluyen productos de los genes dpp y wingless, que, como sabemos, son activos en el modelaje del embrión temprano (véase Figura 21-56). Pero todavía no sabemos en términos de genética molecular cómo se organizan estos sistemas de señales o cómo cola boran con los genes selectores hom eóticos proporcionando a cada comparti miento su patrón interno característico y haciendo que detenga su crecimiento una vez haya alcanzado el tamaño adecuado. De este modo, si seguimos las vías genéticas de formación de patrones hasta estadios cada vez más avanzados y detallados, llegaremos a un punto donde la cadena de causa-efecto se desvanece. No obstante, en el último estadio del pro ceso, mientras las células se preparan para la diferenciación final, se puede reto mar la pista, y podemos establecer los mecanismos genéticos que controlan al gunos de los detalles más minúsculos del modelaje de la superficie del cuerpo de la mosca, tal como muestra la distribución de sus quetas sensitivas.
La expresión localizada de proteínas específicas reguladoras de genes antecede la producción de quetas sensitivas63 Las moscas tienen muchas quetas repartidas por todo su cuerpo -unas grandes y otras pequeñas. Las mayores actúan de baliza en la superficie de la mosca: son relativamente escasas, muy espaciadas entre sí y ocupan unas posiciones prede cibles con exactitud. Las pequeñas están mucho más cerca unas de otras y están dispuestas en regiones de la superficie corporal bien definidas. Estas quetas son órganos sensitivos en miniatura -com ponentes del sistema nervioso periférico. Unas responden a estímulos químicos, otras a estímulos mecánicos, pero todas ellas han sido construidas de forma parecida. Su estructura puede verse en su forma más simple y estereotipada, la queta mecanosensorial. Cada una de ellas, no importa si es grande o pequeña, consta de cuatro células: una célula lanza, una célula alveolar, una célula de la vaina glial y una neurona (Figura 21-76). El movimiento de la célula alveolar de la queta excita la neurona, que enviará una señal al sistema nervioso central. El origen de las células de la queta de la mosca adulta se encuentra en el dis co imaginal epitelial, siendo las cuatro nietas de una única célula sensorial m a dre. Estas células se diferencian de las futuras células epidérmicas que la rodean durante la última fase larvaria (Figura 21-77). Antes de referirnos al patrón de di ferenciación de las quetas, hemos de explicar cómo se controla la génesis de las células sensoriales madre, y luego cómo se diferencian entre ellas las cuatro nie tas de esta célula madre.
Drosophila II. Genes selectores homedticos y modelaje de las partes del cuerpo
Figura 21 -76 Estructura básica de una queta m ecanosensorial.
Diagrama que representa las cuatro células de la queta.
1179
Figura 21-77 Células madre sensoriales del ala del disco imaginal. Las células madre sensoriales (aquí azuladas) se ponen de manifiesto con facilidad en esta muestra especial de Drosophila, que contiene un gen marcador artificial lacZ que, por casualidad, se ha insertado en el cromosoma colindante a una región de control, lo cual provoca su expresión selectiva en los genes sensoriales madre. Animales como éste nos proporcionan una vía de detección y de estudio de regiones de control específicas del genoma -la llamada técnica enhancer-trap, activación-caza. La tinción púrpura nos muestra el patrón de expresión del gen scute; ello antecede la producción de las células sensoriales madre y desaparece progresivamente a medida que las células se desarrollan. (Según P. Cubas, J.-F. de Celis, S. Campuzano y J. Modolell, Genes Dev. 5:996-1008, 1991.)
Hay dos genes, denominados achaete y scute, cruciales en el inicio de la for m ación de quetas en el disco imaginal epitelial. Estos genes tienen funciones si milares que a menudo se solapan, y codifican proteínas reguladoras de genes de la clase hélice-bucle-hélice estrecham ente emparentadas entre sí (estudiadas en el Capítulo 9). Ambos genes pertenecen a un grupo de genes homólogos muy re lacionados, todos del complejo achaete-scute. La hibridación in situ demuestra que la expresión de achaete y scute se produce exactamente en las regiones en las que se formarán las quetas. Las mutaciones que eliminan la expresión de es tos genes en algunas de sus localizaciones habituales bloquean el desarrollo de quetas precisam ente en estas mismas zonas. Las mutaciones que provocan la expresión en localizaciones adicionales y extrañas causan la aparición de quetas en estas regiones no habituales. Pero la expresión de los genes achaete y scute es transitoria, y sólo una minoría de las células que inicialmente los expresan se convertirán en células sensoriales madre; las demás se convertirán en células epidérmicas típicas. El estado que se define mediante la expresión de achaete y scute se denomina proneural. Las células proneurales están preparadas para to mar la vía de diferenciación neurosensorial, pero esto depende de interacciones competitivas entre ellas, por lo que no todas lo consiguen.
La inhibición lateral regula el patrón detallado de tipos celulares diferenciados63,64 Las células proneurales, que expresan achaete, scute o ambos, están situadas en grupos en el disco imaginal epitelial -u n pequeño grupo de menos de 30 células si se trata de una queta grande, o un grupo amplio y uniforme de centenares o miles de células si se trata de una región con quetas pequeñas. En el primer caso sólo un miembro del grupo de células se convierte en una célula madre sensorial; en el segundo lo hacen muchas de las células distribuidas por la re gión proneural. Las células sensoriales madre casi siempre están separadas unas de otras por una cantidad mínima de células epidérmicas. Experimentos con m osaicos genéticos demuestran que todas las células que toman la vía de diferenciación celular de las células sensoriales madre envían una señal a sus vecinas para evitar que ellas hagan lo mismo; esto se denomina inhibición la te ral (Figura 21-78). Si m ediante procedim ientos genéticos impedimos a una cé-
1180
Capítulo 2 1 : Mecanismos celulares del desarrollo
Figura 21 -78 Inhibición lateral. Inicialmente todas las células de la . muestra son equivalentes; todas tienden a desarrollarse como células sensoriales madre, y cada una envía una señal inhibidora a sus vecinas para que no sigan esta vía de diferenciación. Ello genera una situación altamente competitiva. En cuanto una célula toma ventaja en la competencia, esta ventaja se magnifica. Cuanto más cerca está la célula vencedora de diferenciarse como madre sensorial, mayor será la inhibición que padecen sus vecinas, y éstas, por el contrario, a medida que pierden su capacidad para convertirse en una célula sensorial también perderán su capacidad de inhibir a otras células. Así pues, la inhibición lateral conduce a las células adyacentes a destinos diferentes; es decir todo lo contrario del efecto comunitario tratado en la pág. 1138.
Figura 21 -79 Consecuencias de la inactivación de la inhibición lateral. La fotografía muestra parte del tórax de una mosca que contiene una porción mutante (generada por una recombinación mitótica inducida por rayos X) en la que el gen neurogénico Delta ha sido parcialmente inactivado. La reducción de la inhibición lateral ha provocado que casi todas las células de la porción mutante (en el centro de la fotografía) se desarrollen como células sensoriales madre, lo que produce un gran exceso de quetas sensoriales en esta zona. Las zonas constituidas por células mutantes que contengan mutaciones más extremas, con pérdida completa de la inhibición lateral, aparentemente no forman quetas, debido a que toda la progenie de células sensoriales madre se desarrollará como neuronas en lugar de diversificarse formando tanto las neuronas como las partes externas de la estructura de la queta. (Cortesía de Patricia Simpson.)
lula que se convierta en una célula sensorial madre, una de las células proneurales circundantes, liberada de la inhibición lateral, se convertirá en célula madre en su lugar. Fue en estudios de embriones mutantes donde se identificaron por primera vez los genes responsables de la inhibición lateral. Ya en el embrión, tanto el complejo achaete-scute como los genes de la inhibición lateral, controlan el de sarrollo del sistema nervioso central y periférico, justo del mismo modo en que luego controlarán el desarrollo de los órganos sensoriales del sistema nervioso periférico en los discos imaginales. En ambos casos, las mutaciones que elimi nan la inhibición lateral causan un efecto simple y sorprendente: se producen grandes cantidades de células neuronales a expensas de células epidérmicas (Fi gura 21-79). Generalmente se denomina a los genes según su fenotipo mutante; he aquí por qué los genes responsables de la inhibición lateral reciben la confusa denominación de genes neurogénicos. Forman un sistema genético de al m e nos siete miembros. El gen neurogénico más conocido se llama Notch. Codifica una proteína transm em brana cuya posible función es la de actuar como receptora de la señal de inhibición lateral. Experimentos con mosaicos genéticos demuestran que las células que carecen de Notch no responden a la señal y prosiguen la vía de dife renciación neuronal. Parece ser que otra proteína transmembrana relacionada codificada por el gen neurogénico Delta es una proteína ligando que se une a Notch y lo activa; al parecer, la inhibición lateral se transmite por medio de con tactos célula-célula. Por debajo de Notch, actúan intracelularmente los produc tos de otros genes neurogénicos que interpretan la señal y suprimen la diferen ciación neural. Puede demostrarse que este mismo mecanismo de inhibición lateral de pendiente de Notch actúa por duplicado en la formación de las quetas -prim e ro, obligando a las vecinas de las células sensoriales madre a seguir una vía de diferenciación distinta, convirtiéndose así en células epidérmicas, y segundo, haciendo que las cuatro nietas de la célula madre sigan vías de diferenciación distintas dando lugar a los cuatro com ponentes de la queta. En ambos casos la vía por defecto es la neural y la inhibición lateral proporciona una interacción competitiva que obliga a que las células adyacentes se diferencien de maneras distintas. Este mismo conjunto de genes neurogénicos no sólo media en la inhibición lateral tantas veces como sea necesario durante el desarrollo del sistema nervio so, sino que tam bién es imprescindible durante el modelaje detallado de mu chos otros tejidos de la mosca. De hecho, la inhibición lateral es una estrategia crucial para el control de los patrones de diferenciación pluricelulares de todo el mundo animal, y seguramente tam bién del mundo vegetal; los tipos de patrones de diferenciación que puede generar son múltiples, desde el estoma de una hoja a los fotorreceptores oculares. En los vertebrados se han encontrado genes ho mólogos de los genes neurogénicos, por lo que es probable que conserven los mismos mecanismos moleculares, y que éstos actúen al menos en algunos de
Drosophila II. Genes selectores homeóticos y modelaje de las partes del cuerpo
1181
estos casos. En la parte final de este apartado consideramos hasta qué punto
Drosophila es un modelo universal para la genética molecular del patrón de for mación.
Los genes de control de desarrollo de Drosophila tienen homólogos en los vertebrados65 La teoría de la evolución nos dice que todos los animales son primos nuestros. Es bastante fácil apreciar parecidos familiares del ser humano con un ratón, o incluso con un pez, y establecer homologías entre partes de su cuerpo y del nuestro. Pero si nos comparamos con moscas o gusanos, de los cuales nos sepa ramos hace aproximadamente 600 millones de años, las correspondencias no están tan claras. Es cierto que podemos reconocer algunos tipos celulares fami liares -com o neuronas, células musculares estriadas o espermatozoides. Con un grado de coincidencia menor se pueden apreciar similitudes en el plano corpo ral, con el intestino en el centro y la cabeza en un extremo. ¿Pero hasta dónde llegan estas similitudes? Aunque los fósiles no han proporcionado ninguna res puesta clara al respecto, la genética molecular ha comenzado a hacerlo. Las com paraciones de secuencias génicas ponen de manifiesto que una proporción sorprendentemente amplia de los genes de un animal como la mos ca tienen, de modo inconfundible, homólogos en vertebrados, y viceversa. Tales analogías han sido comprobadas para la mayoría de los genes de control de de sarrollo que hem os mencionado en el transcurso de este capítulo. ¿Pero se usan estos genes de control con las mismas com binaciones y para propósitos hom ó logos, de forma que se conserva el mismo sistema genético de control del desa rrollo? Al comparar un ser humano con una mosca, las diferencias que aprecia remos de entrada parecen fundamentales, tanto en el desarrollo como en la estructura final. Por ejemplo, los huevos de los vertebrados no atraviesan un es tadio sincitial como hacen los insectos, y por lo tanto su modelaje pluricelular inicial no puede controlarse por medio de gradientes morfogénicos como Bicoid de Drosophila, establecido mediante la difusión intracelular de una proteína a través del citoplasma compartido por muchos núcleos. Y todavía más, cuando nos fijamos en estadios un poco más avanzados, encontramos un patrón consi derable de correspondencias anatómicas. Sin la ayuda de la genética molecular nunca habríamos podido discernir esta cuestión. La genética molecular nos re vela en animales muy diferentes la presencia de marcas posicionales señal pare cidas que se expresadas en partes del cuerpo que de otra manera nunca podría mos haber considerado que tuvieran nada en común. El complejo génico HOM ha sido fundamental en la elaboración de esta nueva visión sobre nuestra rela ción con moscas y gusanos.
anterior
posterior
- (jâ b yÇ p b ^ j------------(jM y Ç ^ y -Ç ^ f^ U b xy^ b d -^ ^ b d -^ -------------------------------------------
i
t
t ;= i = ^
t
HoxC , (Hox 3)
HoxD,-© — GlXD -------------CIXZ)-GD^ID®-GE>-
(Hox 4)
1182
Capítulo 21 : Mecanismos celulares del desarrollo
Figura 21 -80 Comparación entre el complejo HOM de un insecto y los complejos Hox de un mamífero. La línea superior ilustra la distribución de los genes de los complejos Antennapedia y bithorax de Drosophila; a continuación se muestran los genes correspondientes a los cuatro complejos Hox de un mamífero (ratón o humano), también en su distribución cromosómica. Los genes que presentan un predominio anterior en los dominios de expresión están dispuestos en la parte izquierda, y los que presentan un predominio posterior en los dominios de expresión están dispuestos en la parte derecha. Los cinco complejos están alineados de modo que los genes con secuencias más parecidas estén en la misma columna. Se cree que los complejos han sufrido la siguiente evolución: primero, en algún ancestro común a gusanos, moscas y vertebrados, un único gen selector homeótico primordial sufrió una duplicación repetida formando una serie de tándems de estos genes -un complejo HOM. En el sublinaje de Drosophila este complejo único se dividió en dos complejos separados, Antennapedia y bithorax, mientras que en el linaje que conduce a los mamíferos se replicó repetidamente dando lugar a los cuatro complejos Hox. Así pues, el gen labial (lab) de Drosophila es identifiable por medio de su subsecuencia como equivalente de Hoxa-1, Hoxb-1 yHoxd-1; el gen proboscipedia (pb) es el equivalente de Hoxa-2 y Hoxb-2; y así sucesivamente. Aparentemente, el paralelismo no es perfecto debido a algunos genes individuales se han duplicado y otros se han perdido tras la divergencia de los cromosomas. (Basado en M.P. Scott, Cell 71:551-553,1992. © Cell Press.)
Los mamíferos tienen cuatro complejos HOM homólogos59,66 Debido a que el homeodominio de los genes selectores homeóticos ha sido muy conservado durante la evolución, ha sido relativamente fácil descubrir hom ólo gos de los genes de Drosophila en otras clases de animales. Éstos se han encon trado en prácticamente todos los tipos de criaturas -e n Hydra, en nemátodos y gusanos de tierra, en escarabajos, moluscos y erizos de mar, en peces, en ranas, en pájaros y en mamíferos. Cabe destacar que en los casos en que se ha investiga do adecuadamente, resulta que estos genes se agrupan en complejos parecidos al complejo HOM de los insectos. En el ratón encontramos cuatro complejos de este tipo -denom inados complejos HoxA, HoxB, HoxC y HoxD- cada uno de los cuales se halla en un cromosoma distinto. Los genes individuales de cada com plejo pueden reconocerse por sus secuencias homeobox, como homólogos de miembros específicos del conjunto de genes de Drosophila. Al parecer cada uno de los cuatro complejos Hox en los mamíferos es, sin entrar en detalles, el equiva lente de un complejo HOM completo de insecto (es decir, un complejo Antennapedia más un complejo bithorax) (Figura 21-80). La distribución de los genes en el interior de cada secuencia Hox es básicamente la misma que en el complejo HOM en los insectos, lo cual sugiere que el origen de los cuatro complejos verte brados radica en las duplicaciones de un único complejo primordial y que su dis tribución básica se ha conservado. Cuando se examinan los patrones de expre sión de genes Hox de los embriones de los vertebrados mediante hibridación in situ, resulta que los miembros de cada complejo se expresan en series de la cabe za a la cola al lo largo del eje corporal, como en el caso de Drosophila (Figura 2181). El patrón es más fácil de observar en el tubo neural. Salvo escasas excepcio nes, este orden anatómico encaja con la distribución cromosómica de genes en cada complejo, y los genes correspondientes en los cuatro complejos Hox tienen los dominios de expresión anteroposteriores prácticamente idénticos. Los dominios de expresión génica definen un sistema detallado de corres pondencias entre las regiones del cuerpo de los insectos y las regiones del cuer po de los vertebrados. Como muestra la Figura 21-82, los parasegmentos de la mosca se corresponden a series de segmentos de la parte anterior del embrión de vertebrados marcados de forma parecida. En el cerebro posterior esta serie de segmentos se denominan rombómeros. Los tejidos colaterales al cerebro posterior presentan la segmentación en series de arcos branquiales, prominentes en todos los embriones de vertebrados -lo s precursores del sistema de branquias de los pe ces y de las mandíbulas y las estructuras del cuello en los mamíferos; cada par de rombómeros del cerebro posterior corresponde a un arco branquial (véase Figura 21-82). En el cerebro posterior, igual que en Drosophila, los límites de los domi nios de expresión de los genes Hox se alinean con los límites de los segmentos anatómicos. Y al igual que en los compartimientos de Drosophila, las células de un rombómero no se mezclan con las del rombómero siguiente. Sin embargo, todavía no está claro hasta qué punto se parecen los detalles de los mecanismos que establecen la segmentación del cerebro posterior y del arco branquial de un vertebrado y los que generan los parasegmentos de un in-
Figura 21-81 Dominios de expresión de los genes Hox en un ratón. Las fotografías muestran en embriones enteros los dominios de expresión de genes del complejo HoxB (mancha azul). Los dominios de expresión se visualizan gracias a la hibridación in situ o, como en estos ejemplos, generando un ratón transgénico que contiene la secuencia de control del gen Hox acoplada a la secuencia de la (3-galactosidasa, cuya presencia se detecta por mareaje histoquímico. Cada gen se expresa en una larga extensión de tejido con un límite anterior bien definido. Cuanto más anterior sea la posición del gen en su complejo cromosómico, más anterior será el límite anatómico de su expresión. De este modo, salvo pequeñas excepciones, los dominios anatómicos de genes sucesivos forman un conjunto ordenado, distribuido según el orden de los genes en el complejo cromosómico. (Cortesía de Robb Krumlauf.)
Hoxb-4
Hoxb-2
vista dorsal
vista lateral
Drosophila II. Genes selectores homedticos y modelaje de las partes del cuerpo
vista dorsal
vista lateral 1183
Figura 21-82 Correspondencias entre las regiones del cuerpo de un insecto y las de un vertebrado, como definen los genes de expresión HOM y Hox. Representación de un embrión de Drosophila en el estadio de banda germinal, con sus parasegmentos coloreados de acuerdo con los genes HOM que expresan. El código de colores es el mismo que en la Figura 21-80, y también es el mismo para el patrón de expresión del gen HoxB del tubo neural de un embrión de vertebrado. Para simplificar, no se ilustra la expresión de los otros tejidos del vertebrado. En las regiones en que los dominios de expresión de dos o más genes HOM/Hox se solapan, la coloración de los genes corresponde al más “posterior” de los genes expresados, tanto en la mosca como en el vertebrado. Los puntos que presenten la coincidencia de varios límites de expresión de genes distintos aparecerán rayados. Obsérvese que de igual forma que los dominios de expresión de la mosca están relacionados con los parasegmentos, los dominios de expresión de los vertebrados están relacionados con los rombómeros (segmentos del cerebro posterior). Cada par de rombómeros se asocia con un arco branquial (un rudimento branquial modificado), al que transmite inervación. El patrón de expresión de los genes Hox en los arcos branquiales (no está ilustrado) encaja con los rombómeros asociados.
secto. Aunque, por ejemplo, los vertebrados presentan homólogos de los genes engrailed y wingless, estos genes no se expresan de una forma segmental repeti tiva en el cerebro an terio r..
Los genes Hox definen los valores posicionales en los vertebrados tal como ocurre en los insectos67 A pesar de las incertidumbres que se plantean en los mecanismos de segmenta ción, pocas dudas pueden existir sobre la condición homologa de nuestro eje de cabeza a la cola respecto al de un insecto y respecto a que esencialmente el mis mo conjunto de genes marca los valores posicionales anteroposteriores de nues tras células. Al parecer, los genes Hox no tienen tan sólo patrones de expresión similares a los genes del complejo del insecto, sino que también presentan fun ciones reguladoras parecidas. Los vertebrados tienen cuatro clases de complejos de genes Hox que actúan más o menos en paralelo a lo largo del eje corporal, donde en el insecto actúa un solo complejo HOM. Por lo tanto, no basta con eli minar o provocar la expresión deficiente de un gen Hox para conseguir que una región experimente una transformación hom eótica de consideración y adopte el carácter de otra. De todas formas, gracias a la ingeniería genética se ha conse guido que un ratón con alteraciones en un solo complejo de genes Hox presente anomalías localizadas que se podrían interpretar como transformaciones horneóticas incompletas. Este hecho ilustra una de las dificultades principales que presenta el análisis de la genética de los sistemas de control del desarrollo de los vertebrados. El genoma vertebrado es muy grande, y debe su gran tamaño fundamentalmente a las duplicaciones génicas que se han ido produciendo en el curso de la evolu ción. Así, contiene muchas copias diferentes de genes que en moscas o nemátodos están representados en solitario: los cuatro complejos Hox son un ejemplo típico de ello. Las múltiples versiones de un gen tienen funciones solapadas y parcialmente intercambiables, y esta redundancia parcial hace muy difícil iden tificar la función básica de un gen en solitario, de la misma forma que resulta di fícil, poniendo o quitando un solo tornillo, demostrar la función de uno de los muchos tornillos que tiene una puerta en sus bisagras. He aquí por qué los datos aportados por modelos de organismos más simples como Drosophila y Caenorhabditis elegans son tan importantes. Sin embargo ello no quiere decir que la importancia de un gen individual sea superflua en el conjunto de genes de un vertebrado; a medida que avanza la evolución, los genes duplicados divergen y comienzan a adoptar funciones nue-
118 4
Capítulo 2 1 : Mecanismos celulares del desarrollo
vas y cada vez más especializadas que los distinguen unos de otros. Los viejos com ponentes pueden adaptarse organizando el desarrollo de los nuevos tipos de estructuras que se añadirán a las ya existentes. Las extremidades de los verte brados superiores nos proporcionan un ejemplo muy interesante de todo ello.
Subconjuntos de los genes Hox se expresan distribuidos a lo largo de los dos ejes ortogonales de las yemas de las extremidades de los vertebrados68 En este mismo capítulo ya hemos utilizado las yemas de las extremidades del embrión de pollo para demostrar que las células de regiones distintas se distin guen unas de otras mediante una propiedad que denominamos valor posicional. Esta característica de la memoria celular decide si las estructuras que se forma rán serán de la pata o del ala, del omóplato o del antebrazo, del pulgar o del m e ñique. La genética molecular ha revelado lo que significa “valor posicional” en términos moleculares de la yema de la extremidad. Ya sabemos que a lo largo del eje corporal, en moscas y vertebrados, los va lores posicionales se definen mediante el estado de expresión de los genes Hox/HOM. La hibridación in situ demuestra que esto es cierto para las yemas de las extremidades de un embrión de ratón y también de pollo -aunque existe una pequeña diferencia. En lugar de encontrar que los cuatro complejos Hox se ex presan de forma similar, mediante patrones solapantes, igual que en el cerebro posterior, se observa que un subconjunto de miembros del complejo HoxD se expresa en una serie de dominios distribuidos a lo largo de un eje de la extremi dad (probablemente el anteroposterior) y que un subconjunto de miembros del complejo HoxA se expresan en serie a lo largo de un eje distinto (probablemente el proximodistal) (Figura 21-83). Para comprobar si estos genes realmente con trolan el modelaje de la extremidad, se ha utilizado un retrovirus como vector de expresión en el embrión de pollo para introducir un gen Hox particular dentro de las células de la yema de la extremidad, forzando la expresión del gen en una
ANTERIOR 3'
cerebro anterior
médula espinal
yema de la extrem idad anterior som itos
Figura 21 -83 Patrones de expresión de los genes Hox de las yemas de las extremidades de los vertebrados. (A) Diagrama esquemático del patrón de expresión de los miembros expresados en la parte posterior del complejo Hox de un embrión de 12 días. (B) Comparación entre los patrones de expresión de los genes de pollo HoxD (ChoxD) y HoxA (ChoxA) en la yema de la extremidad anterior de un embrión de pollo de 4 días. En el pollo y en el ratón, los genes HoxD definen el patrón de los dominios antero-posteriores; los genes HoxA definen el patrón proximodistal. (A, según D. Duboule, BioEssays 14:375384, 1992.© ICSU Press; B, según Y. Yokouchi, H. Sasaki, y A. Kuroiwa, Nature 353:443-445, 1991. © 1991 Macmillan Magazines Ltd.)
Dxa-10 Hoxa-11
yema de la extrem idad posterior
proxim al
anterior distal
(A)
5'
POSTERIOR
(B)
Drosophila II. Genes selectores homedticos y modelaje de las partes del cuerpo
posterior
1185
localización inadecuada. Si se fuerza a las células pertenecientes a la región en la que se desarrollará el primer dedo del pie a que expresen el gen Hox característi co del segundo dedo ( ), su comportamiento se verá alterado, y en la lo calización del primer dedo se desarrolla un duplicado del segundo dedo. Evi dentemente, cuando el vertebrado desarrolla las extremidades, combina los diferentes conjuntos de genes Hox de formas distintas para controlar el modelaje del em brión y tam bién del principal eje corporal. Ahora, el problema central de la embriología de los vertebrados es descubrir cóm o se regulan los genes Hox. Varios estudios señalan que el ácido retinoico puede controlar la expresión de los genes Hox en las yemas de las extremidades y a lo largo del eje principal del cuerpo, pero la forma en que se ejerce tal control y el papel que juega en el desarrollo normal son, aún, preguntas sin respuesta. En este mom ento los genes HOM/Hox constituyen el ejemplo más especta cular de conservación de mecanism os de control del desarrollo. Pero el camino iniciado con las homologías genéticas descubiertas mediante las secuencias ge nética durante los últimos años nos concede esperanzas para pensar que pronto podremos constatar muchas coincidencias más, y no menos importantes, en el desarrollo de vertebrados e invertebrados. Los estudios genéticos tradicionales y moleculares de organismos pequeños com o moscas y gusanos, más accesibles, nos dan las pautas para aclarar los mis terios del desarrollo de todo el mundo animal. Pero, ¿y si vamos un poco más le jos y afirmamos que tam bién nos abren las puertas del desarrollo vegetal?, o, ¿es que el desarrollo de las plantas actúa según un conjunto de principios y m eca nismos com pletam ente distintos? Con esta pregunta abordamos el siguiente apartado.
Hoxd-11
Resumen
Los genes selectores homeóticos definen las diferencias entre los segmentos del cuer po desde la cabeza hasta la cola: proporcionan a las células una memoria de su va lor posicional. Mutaciones en estos genes pueden convertir un segmento corporal al carácter de otro, y la supresión en masa de estos genes causa larvas que tienen todos los segmentos corporales iguales. Se observan transformaciones parecidas en las es tructuras externas del cuerpo de la mosca adulta, derivadas de los discos imagína les de la larva. Experimentos con trasplantes demuestran que las células de los dis cos tienen memoria a largo plazo de sus valores posicionales, y esta memoria depende de la presencia continuada de genes selectores homeóticos. Todos los genes selectores homeóticos codifican proteínas que unen DNA, y to das contienen secuencias homeobox muy bien conservadas. En el genoma se agru pan en dos conjuntos que podrían ser partes separadas de un único conjunto de ge nes ancestral denominado complejo HOM. La distribución cromosómica de estos genes en cada parte del complejo encaja con la distribución espacial de sus domi nios de expresión en el cuerpo. El mecanismo molecular del fenómeno de la memo ria es desconocido, pero se cree que depende de cambios autoperpetuantes en el es tado de las regiones de control del complejo HOM. La expresión conjunta de los patrones de los genes HOM y de los genes de pola ridad del segmento, subdivide el cuerpo en compartimientos, cuyas células no se mezclan. Los procesos posteriores generan un patrón de diferenciación celular de tallado en el interior de cada compartimiento. La inhibición lateral, mediada por los llamados genes neurogénicos, juega un papel central en el estadio final de di versificación celular. Determina que células que se hallan en contacto unas con otras se diferencien deformas distintas, lo cual ayuda a organizar la creación de conjuntos de células con especializaciones minúsculas que contribuirán a la for mación de quetas sensoriales. Gran parte de los genes de control del desarrollo identificados en moscas y gu sanos tienen homólogos en otras clases de animales, incluidos los vertebrados. En algunos casos se ha demostrado que los genes correspondientes tienen funciones en el desarrollo, lo cual implica que los mecanismos fundamentales del desarrollo 1186
Capítulo 2 1 : Mecanismos celulares del desarrollo
animal se han conservado incluso cuando el aspecto externo del cuerpo ha evolu cionado hasta ser completamente diferente. Al parecer, prácticamente todos los animales contienen complejos de genes HOM, de organización parecida a los de los insectos: los mamíferos presentan cuatro complejos, denominados complejos Hox, y se cree que sus productos definen los valores posicionales que controlan el patrón anteroposterior de zonas de la región del cerebro anterior y del tronco. Los complejos Hox también han adquirido nuevas junciones como especificadores de información posicional en partes del cuerpo de los vertebrados evolucionadas más recientemente, como son las extremidades. El desarrollo vegetal69 Las plantas y los animales están separados aproximadamente por mil millones de años de historia evolutiva. Ambos han desarrollado su organización plurice lular de forma independiente pero a partir del mismo conjunto de herramientas -e l conjunto de genes heredados de su antepasado eucariota unicelular común. La mayoría de diferencias entre sus estrategias de desarrollo provienen de dos particularidades básicas de las plantas. La primera es que las plantas consiguen su energía de la luz solar, no ingiriendo otros organismos. Esta característica de fine un plan corporal distinto. Y la segunda, que sus células están encerradas en paredes celulares semirrígidas que las mantienen en grupos compactos, evitando que se desplacen como hacen las células animales. Esta segunda característica determina un conjunto distinto de movimientos que definen la forma del cuer po, y unos mecanismos de desarrollo distintos que puedan hacer frente a un en torno variable. El desarrollo animal está muy protegido frente a los cambios del entorno, y el embrión genera la misma estructura corporal definida genéticamente sin que ésta se vea afectada por condicionantes externos. El desarrollo de la mayoría de las plantas, en cambio, está influido dramáticamente por el entorno: debido a que no pueden desplazarse a su entorno adecuado, las plantas se adaptan al m e dio que les corresponde alterando el curso de su desarrollo. Su estrategia es oportunista. Un órgano determinado -e s decir una hoja, una flor o una raízpuede ser generado a partir de un huevo fecundado mediante diferentes vías, según las informaciones del entorno. Una hoja de begonia plantada en el suelo puede desarrollar una raíz; la raíz puede dar un brote; el brote, si recibe la luz su ficiente, puede desarrollar hojas y flores. Normalmente, la planta adulta está compuesta por muchas copias de un pequeño conjunto de módulos estándar, tal como se ilustra en la Figura 21-84. Las posiciones y momentos en que se generan estos módulos están muy influi dos por el entorno, provocando variaciones en la estructura de toda la planta. Las opciones entre los módulos alternativos y su organización en toda la planta depende de informaciones del entorno y de señales hormonales de largo alcan ce, que en el control del desarrollo animal juegan un papel mucho menos im portante. Aunque el desarrollo global de una planta -la forma de sus raíces y ramas, el número de sus hojas o flores- puede ser altamente variable, su organización de tallada a pequeña escala no lo es. Una hoja, una flor o incluso un embrión vege tal temprano, tienen una estructura tan precisa como cualquier órgano de un animal. La organización interna del módulo vegetal presenta esencialmente los
Figura 21 -84 Ejemplo simple de la construcción modular de las plantas. Cada módulo (coloreados en diferentes tonos de verde) consta de un tallo, una hoja y una yema que contiene un centro de crecimiento potencial, o meristemo. La yema se forma en el nudo, punto de nacimiento de la rama, donde la hoja diverge del tallo. Los módulos derivan secuencialmente de la actividad continua de los meristemos apicales.
El desarrollo vegetal
mismos problemas en el control genético de su patrón de formación que los del desarrollo animal, y se solucionan de formas análogas. En este apartado nos centraremos en los mecanism os celulares de desarrollo de la plantas con flores. Examinaremos tantos sus diferencias como sus similitudes con los animales.
El desarrollo embrionario empieza con el establecimiento del eje raíz-brote y se detiene en el interior de la semilla70 A pesar de la asombrosa variedad de las plantas con flores, su origen es relativa mente reciente. Los ejemplares fósiles más tempranos son de hace 125 millones de años, frente a los 350 millones de años de fósiles de animales vertebrados. Este hecho contribuye a explicar por qué algunos aspectos de su forma y desa rrollo son extraordinariamente constantes. La estrategia básica de su reproduc ción sexual está resumida esquem áticam ente en el Panel 21-2, página 1189. El huevo fecundado, o zigoto, de una planta superior empieza dividiéndose asim é tricamente, estableciendo la polaridad del futuro embrión. Un producto de esta división es una célula pequeña con un citoplasma denso, que se transformará en el embrión propiamente dicho. El otro producto es una célula grande y vacuolada, que se divide de nuevo y forma una estructura llamada el suspensor, que en algunos aspectos es comparable al cordón umbilical de los mamíferos. El sus pensor mantiene unido el embrión al tejido nutritivo adyacente y proporciona una vía para el flujo de nutrientes. Durante el siguiente estadio del desarrollo, la célula embrionaria diploide prolifera formando una bola de células que adquiere rápidamente una estructu ra polarizada. Comprende dos grupos clave de células proliferativas -u n o en el extremo del suspensor del embrión que generará una raíz en un extremo y otro en el polo opuesto que generará un brote (Figura 21-85). El eje principal raízbrote establecido de este modo es análogo al eje cabeza-cola de un animal. Al mismo tiempo empieza a ser posible distinguir las futuras células epidérmicas, que forman la capa más externa del embrión, las futuras células de tejido básico, que ocupan la mayoría del interior del embrión, y las futuras células de tejido vascular, que forman el núcleo central del embrión. Estos tres conjuntos de cé lulas pueden comparase a las tres capas germinales de un embrión animal. Un poco más tarde durante el desarrollo, el rudimento del brote empieza a producir las hojas embrionarias de la semilla, o cotilédones -u n o en el caso de los monocotiledóneas y dos en el caso de las dicotiledóneas. Normalmente, el desarrollo
embrión
globular
cotiledon
suspensor
prim ordio de ía raíz
118 8
Capítulo 2 1 : Mecanismos celulares del desarrollo
Figura 21-85 Dos estadios de la embriogénesis de la planta Arabidopsis thaliana. (Según G. Jürgens, U. Mayer, R.A. Torres-Ruiz, T. Berleth, y S. Miséra, Development [SuppLJ 1:27-38, 1991.)
LA FLOR P é ta lo : d is tin ta s e s tr u c tu r a s e n f o r m a d e h o ja , g e n e r a lm e n t e c o lo r e a d a s c o n t o n o s b r illa n t e s , q u e a c tú a n d e s is t e m a p o lin iz a d o r ,
Las f lo r e s , q u e c o n tie n e n la s c é lu la s r e p r o d u c to r a s d e las p la n ta s s u p e r io r e s , s u r g e n a p a r t ir d e lo s m e r is te m o s a p ic a le s d e b r o te s v e g e ta le s (v é a n s e F ig u r a s 2 1 - 8 4 y 2 1 - 8 8 ). C u lm in a n su c r e c im ie n t o a p a r t ir d e -e s te m e r is t e m o . F a c to r e s m e d io a m b ie n t a le s , c o m o el r it m o c ir c a d ia n o o la t e m p e r a t u r a , a c tiv a n el c a m b io d e d e s a r r o llo v e g e ta l f lo r a l. A s í p u e s la s c é lu la s estigma g e r m in a le s a p a r e c e n e n el t r a n s c u r s o d e l d e s a r r o llo d e la p la n ta , y lo h a c e n a p a r tir d e la s c é lu la s s o m á t ic a s , y n o a p a r t ir d e
!
.
\
X t!
es
'
/
/ E s ta m b r e : ó r g a n o q u e c o n t ie n e c é lu la s q u e s u fr e n m e io s is y f o r m a n g r a n o s h a p lo id e s
w '-c o -
/
d e p o le n , c a d a u n o d e lo s c u a le s c o n t ie n e / d o s c é lu la s e s p e r m á t ic a s m a s c u lin a s . ~ C u a n d o t r a n s f e r im o s el p o le n a un e s t ig m a , g e r m in a , y el t u b o p o lín ic o de polen
'
J /
0,5 mm sépalo óvulos en el ovario
estam bre yema tem prana de flor La e s tr u c tu r a d e la f lo r e s v a r ia d a y c a r a c te r ís tic a d e c a d a e s p e c ie ; c o m p r e n d e c u a tr o f o r m a c io n e s d e e s tr u c tu r a s c o n c é n tr ic a s q u e p o d r ía n c o n s id e r a r s e h o ja s m o d ific a d a s ,
LA SEMILLA
/ /
grano/^ÍA
u n a lín e a c e lu la r g e r m in a l c o m o los a n im a le s .
pétalo
p o r e je m p lo a t r a y e n d o in s e c to s .
] //
fr
j I c o n d u c e lo s d o s e s p e r m a t o z o id e s células ¡4 / in m ó v ile s al o v a rio . esperm át¡cas\ / m P is tilo : ó r g a n o q u e c o n t ie n e u n o o núcleo m á s o v a r io s , c a d a u n o d e lo s c u a le s del tubo \ \ c o n t ie n e ó v u lo s . C a d a ó v u lo e s polínico — h u é s p e d d e c é lu la s q u e a t r a v ie s a n la
Lv
m e io s is , f o r m a n d o u n s a c o e m b r io n a r io q u e c o n t ie n e la c é lu la h u e v o f e m e n in a (o o s f e r a ) . E n la f e c u n d a c ió n , u n a c é lu la e s p e r m á t ic a se f u s io n a c o n la c é lu la h u e v o c o n s t r u y e n d o el f u t u r o e m b r ió n d ip lo id e , m ie n t r a s q u e la o tr a s e f u s io n a c o n d o s n ú c le o s d e l s a c o e m b r io n a r io c o n s t it u y e n d o el t e jid o t r ip lo id e e n d o s p é r m ic o . S é p a lo s : e s tr u c tu r a s e n f o r m a d e h o ja q u e f o r m a n u n r e v e s t im ie n t o p r o t e c t o r d u r a n t e el d e s a r r o llo flo r a l t e m p r a n o .
EL EMBRION
U n a s e m illa c o n s ta d e un e m b rió n q u ie s c e n te , res e rva s n u tritiv a s y la e n v o ltu ra . A l fin a l d e su d e s a rro llo el c o n te n id o d e a g u a p u e d e h a b e r d e s c e n d id o d e s d e un 9 0 a un 5 % . Está p ro te g id a p o r un fru to c u y o s te jid o s s o n d e o rig e n m a te rn o .
m eristem o apical del brote huevo fecundado
La o o s fe r a f e c u n d a d a d e l in t e r io r d e l s a c o e m b r io n a r io c re c e f o r m a n d o u n e m b r ió n , s ir v ié n d o s e d e lo s n u tr ie n te s t r a n s p o r t a d o s d e s d e el e n d o s p e r m o p o r m e d io d e l s u s p e n s o r . U n a s e r ie c o m p le ja d e d iv is io n e s c e lu la r e s , ilu s tr a d a a q u í p o r u n a h ie r b a p e q u e ñ a lla m a d a z u r r ó n d e p a s to r , o r ig in a u n e m b r ió n
envoltura de la sem illa I "
'cotilédones (reservas nutritivas)
c o n u n m e r is t e m o a p ic a l d e la ra íz , u n m e r is t e m o a p ic a l d e l b r o te , y u n a ( m o n o c o t ile d ó n e a s ) o d o s (d ic o t ile d ó n e a s ) h o ja s o c o tilé d o n e s . El d e s a r r o llo se d e t ie n e e n e s te e s t a d io , y el s a c o e m b r io n a r io , q u e c o n t ie n e el e m b r ió n , s e c o n v ie r t e a h o r a e n u n a s e m illa p r e p a r a d a p a r a su d is p e r s ió n y c a p a z d e s o b r e v iv ir e n c ir c u n s ta n c ia s a d v e rs a s .
m eristem o \ apical^-de la raíz suspensor
dos hojas o cotilédones
GERMINACION P a ra q u e u n e m b r ió n c o n tin ú e su d e s a r r o llo e s n e c e s a r io q u e su s e m illa g e r m in e , u n p r o c e s o q u e d e p e n d e d e fa c to r e s in te r n o s (e s ta d o q u ie s c e n te ) y d e fa c to r e s m e d io a m b ie n t a le s , c o m o el a g u a , la t e m p e r a t u r a y el o x íg e n o . L as r e s e r v a s n u t r it iv a s p a r a la fa s e t e m p r a n a d e la g e r m in a c ió n p u e d e n s e r t a n t o el e n d o s p e r m o (m a íz ) c o m o lo s c o tilé d o n e s ( g u is a n t e s y ju d ía s ). H a b it u a lm e n t e , p r im e r o e m e r g e la ra íz p r im a r ia d e la s e m illa , p a r a a s e g u r a r el s u m in is t r o d e a g u a n e c e s a r io p a ra la p lá n tu la d e s d e el c o m ie n z o . El c o tile d o n (e s ) p u e d e (n ) a p a r e c e r p o r e n c im a d e l s u e lo , c o m o e n la ju d ía d e ja r d ín m o s t r a d a a q u í, o c o n t in u a r d e b a jo d e l s u e lo , c o m o e n lo s g u is a n te s . En a m b o s c a s o s lo s c o tilé d o n e s a c a b a r á n p o r e x t in g u ir s e . A h o r a el m e r is t e m o a p ic a l p u e d e m o s tr a r su c a p a c id a d p a r a el c r e c im ie n to c o n tin u o , p r o d u c ie n d o el p a tr ó n típ ic o d e n u d o s , in t e r n u d o s y y e m a s (v é a s e F ig u r a 2 1 -8 4 ).
germ inación de una judía de jardín prim eras hojas foliares sem illa todavía no germ inada
raíz prim aria
cotilédones
cotiledon m archito
'raíces laterales
Panel 21-2 Características generales del desarrollo temprano de las plantas con flores.
1189
se detiene poco después de este estadio, y el embrión queda empaquetado en una semilla, especializada para la dispersión y para la supervivencia en condicio nes adversas. El em brión en la semilla se estabiliza por deshidratación, y puede permanecer latente durante un período de tiempo muy largo -incluso centena res de años. Cuando se rehidratan, las semillas germinan y continúa el desarrollo embrionario.
Los módulos repetitivos de una planta son generados secuencialmente por los meristemos71 Sin entrar en detalles, el em brión de un insecto o de una animal vertebrado es un modelo rudimentario a pequeña escala del organismo maduro, y los detalles de la estructura del cuerpo se completan progresivamente a medida que éste aumenta de tamaño. El embrión de la planta crece hasta convertirse en adulto de manera bastante diferente: las partes de la planta adulta se generan secuen cialmente por medio de grupos de células que proliferan estableciendo las es tructuras periféricas de la planta. Estos grupos de células, todos importantes, se denominan m eristem os apicales (véase Figura 21-84). Cada meristemo está for mado por una población de células madre autorrenovables. A medida que estas células se van dividiendo, producen una progenie que emergerá desde la región meristemática, crecerá, y finalmente se diferenciará. Aunque los meristemos apicales del tallo y de la raíz generan todas las variedades básicas de células n e cesarias para formar las hojas, las raíces y los tallos, muchas células situadas fue ra de los meristemos apicales conservan la capacidad de proliferar posterior mente. De esta forma los árboles y otras plantas perennes, por ejemplo, son capaces de aumentar el grosor de sus tallos y raíces a medida que pasan los años. Los rudimentos de los meristemos apicales de la raíz y del tallo ya están de terminados en el embrión. En cuanto el revestimiento de la semilla se rompe du rante la germinación, se produce un extraordinario aumento de tamaño de las células no meristemáticas, emergiendo primero una raíz que establece inmedia tam ente un anclaje en el suelo, y luego un tallo (Figura 21-86). A continuación, en los meristemos apicales tienen lugar divisiones celulares rápidas y continuas: en el meristemo apical de una raíz de maíz, por ejemplo, las células se dividen cada 12 horas, produciendo 5 x 105 células cada día. Las raíces y los tallos, que crecen rápidamente, escudriñan el entorno circundante -las raíces increm en tando su capacidad de captación de agua y sales minerales del suelo, y los brotes aumentando su capacidad de fotosíntesis (véase Panel 21-2, pág. 1189).
brote de m eristem o apical (escondido) cotMedon (hoja de la semilla)
w
La forma de cada nueva estructura depende de la orientación de la división celular y de la expansión72 Las células vegetales, encerradas en el interior de sus paredes celulares, no pue den arrastrarse y tampoco pueden cambiar su posición a medida que crece la planta, pero pueden dividirse, y pueden hincharse, estirarse y curvarse. Por lo tan to, la morfogénesis de una planta en desarrollo depende de una serie ordenada de divisiones seguidas de una expansión celular orientada de forma muy precisa. La mayoría de las células producidas en el extremo del meristemo de la raíz, por ejemplo, pasan por tres fases distintas de desarrollo -la división, el crecimiento (elongación) y la diferenciación. Estas tres fases, que se solapan en el espacio y en el tiempo, dan lugar a la arquitectura característica del extremo de la raíz. Aunque a menudo el proceso de diferenciación celular empieza mientras la cé lula todavía está creciendo, es relativamente fácil distinguir en el extremo de una raíz una zona de división celular, una zona de elongación celular orientada (que afecta el crecim iento longitudinal de la raíz) y una zona de diferenciación celular (Figura 21-87). El plano exacto en el que las células se dividen es crucial para la morfogéne sis de la planta, debido a que afecta la dirección de la elongación de la planta, y los cambios en el plano de división están a menudo asociados con procesos
119 0
Capítulo 2 1 : Mecanismos celulares del desarrollo
m eristem o apical de la raíz Figura 21 -86 Una plántula de A ra b id o p sis. Los objetos marrones situados a la derecha de la joven plántula son las dos mitades de la envoltura de la semilla desechada. (Cortesía de Catherine Duckett.)
cilindro vascular que contiene xilem a y el floem a en desarrollo ZONA DE DIFERENCIACIÓN DE LA CÉLULA
Figura 21-87 Extremo de una raíz en crecimiento. (A) Organización de los 2 mm finales del extremo de una raíz. Se indican las zonas aproximadas en las que es posible encontrar células que se dividen, se alargan y se diferencian. (B) Meristemo apical y la cofia radicular del extremo o de una raíz de maíz, presentando las series ordenadas de las células producidas. (B, según P.H. Raven, R.F. Everty S.E. Eichhorn, Biology of Plants, 4th ed. New York: Worth, 1986.)
pelos radiculares corteza epiderm is
ZONA DE ELONGACIÓN DE LA CÉLULA
ZONA DE DIVISIÓN DE LA CÉLULA
m eristem o apical cofia radicular
(A)
{B!
100 ¡jm
morfogénicos, como la producción de primordios foliares o de pétalos (Figura 21-88). Los mecanismos intracelulares especiales que controlan el plano de la división celular se tratan en el Capítulo 18. En la fase de expansión controlada que generalmente sigue a la división ce lular, las células hijas pueden a menudo aumentar su volumen cincuenta veces o más. Esta expansión está conducida por una turgencia de base osmótica que presiona las paredes celulares de la planta hacia el exterior, y su dirección está determinada por la orientación de los fibrillas de celulosa de la pared celular que conducen la expansión a lo largo de un único eje (véase Figura 19-68). A su vez, la orientación de la celulosa está aparentemente controlada por la orientación de formaciones de microtúbulos situados justo por debajo de la membrana plas mática, los cuales parecen guiar la deposición de celulosa (visto en el Capítulo 19). Estas orientaciones pueden ser modificadas con rapidez mediante regula dores del crecimiento de la planta, como el etileno y el ácido giberélico (Figura 21-89), pero los mecanismos moleculares subyacentes a estas dramáticas redis tribuciones del citoesqueleto son desconocidos.
división división periclinal anticlinal (aumentos en diámetro y área superficial)
división transversal (aum ento en longitud) (A) El desarrollo vegetal
estambre
Figura 21-88 Relación entre el plano de división, la expansión celular y la morfogénesis. (A) Los tres planos de división celular que presenta un órgano vegetal típico. Las variaciones en la proporción de cada uno de ellos, combinadas con una expansión celular orientada, pueden ser las responsables de los patrones morfogénicos que actúan en las plantas. (B) Sección longitudinal de un yema floral joven de una vincapervinca (hierba doncella). Las pequeñas cúpulas de células destinadas a convertirse en las diferentes partes de la flor son producto de una combinación de los nuevos planos de divisiones celulares y de expansión celular orientada determinadas por refuerzos anulares de celulosa en la pared celular. (Según N.H. Boke, Am. J. Bot. 36:535-547, 1949.)
1191
Cada módulo de la planta crece a partir de un conjunto microscópico de primordios de un meristemo73 Los meristemos apicales son autoperpetuantes: continúan sus funciones indefi nidamente mientras la planta sobreviva, y son responsables del continuo creci miento y desarrollo de la planta. Pero los meristemos apicales también dan lugar a un segundo tipo de crecimiento, cuyo desarrollo está altamente limitado y cul mina con la formación de estructuras como una hoja o una flor, de tamaño y for ma determinada y con una esperanza de vida corta. Así pues, a medida que el brote se va alargando, su meristemo apical deja detrás de él una secuencia orde nada de nudos donde han crecido hojas, e internudos (segmentos del brote). De esta forma la actividad continua del meristemo produce una cantidad de m ódu los similares, cuyo número no para de aumentar; cada uno de estos módulos está formado por un brote, una hoja y una yema (véase Figura 21-84). Los módu los se conectan unos con otros mediante tejido de soporte y de transporte, y los sucesivos módulos están situados unos respecto a otros, de forma precisa, dan do lugar a una estructura de formas repetidas. Este modo de desarrollo interacti vo es característico de las plantas y se observa en muchas otras estructuras a parte del sistema tallo-hoja (Figura 21-90). Aunque el módulo final es grande, su organización, como la de un embrión animal, está mapada primero a escala microscópica. En el ápice del brote, en un espacio de un milímetro o incluso menor, se encuentra una cúpula central, pe queña y baja, rodeada por un conjunto de protuberancias de distintos tamaños (Figura 21-91). La cúpula central es el meristemo apical; cada una de las protu berancias que la rodean es un primordio foliar. Esta pequeña región, por lo tan to, contiene los rudimentos ya diferenciados de varios módulos completos. M e diante un programa muy preciso de proliferación celular y expansión celular, cada primordio foliar y sus células adyacentes crecen formando una hoja, un nudo y un entrenudo. Mientras, el meristemo apical da lugar a un nuevo pri mordio foliar, generando cada vez más módulos, en una sucesión potencial mente infinita. La organización en serie de los módulos de la planta está contro lada, de este modo, por procesos del ápice del brote. Las señales locales dentro de una pequeña región determinan el patrón del primordio -la posición de un rudimento foliar en relación con el siguiente, el espacio existente entre ambos rudimentos y su localización en relación al meristemo apical.
de dos reguladores del crecimiento vegetal, el gas etileno y el ácido giberélico. Estos reguladores ejercen efectos rápidos y de consecuencias opuestas sobre la orientación de los microtúbulos corticales de las células de brotes jóvenes de guisantes. (B) Célula típica de una planta tratada con etileno, sus microtúbulos presentan una orientación longitudinal. (C) Célula típica de una planta tratada con ácido giberélico, sus microtúbulos presentan una orientación transversal. Se depositan microfibrillas de celulosa paralelas a los microtúbulos. Debido a su influencia sobre la orientación de la expansión celular, el ácido giberélico y el etileno favorecen el crecimiento en direcciones contrarias: las plántulas tratadas con etileno desarrollan brotes bajos y gruesos (A), mientras que las plántulas que reciben tratamiento con ácido giberélico desarrollan brotes altos y delgados (D).
Figura 21-90 El modelaje repetitivo de las plantas. Una colocación correcta de los módulos sucesivos de un único meristemo apical produce estas complicadas aunque regulares formas en las hojas (A), flores (B) y frutos (C). (A, según John Sibthorp, Flora Graeca. London: R.Taylor, 18061840; B, según Pierre Joseph Redouté, Les Lliliacées. París: chez l’Auteur, 1807; C, según Christopher Jacob Trew, Uitgezochte planten. Amsterdam: Jan Christiaan Sepp, 1771-cortesía todos ellos de John Innes Foundation.)
119 2
Capítulo 2 1 : Mecanismos celulares del desarrollo
100 gm
100 pm
No se conoce prácticam ente nada sobre los mecanismos que median los procesos centrales del modelaje en el reino vegetal. Todas las estrategias que he mos tratado sobre el modelaje de la formación de los animales -com o las basa das en morfógenos locales, los mecanismos del reloj celular y la inhibición late ral- también podrían darse en el reino vegetal. No obstante, estudios detallados del destino y el linaje de las células en el ápice del brote y en el ápice de la raíz están empezando a aportar parte de esta información básica esencial, y empie zan a ser identificados algunos de los genes fundamentales del control del desa rrollo. La proteína reguladora de genes codificada por el gen Knotted, por ejem plo, se expresa en la parte central del meristemo; una sobreexpresión de esta proteína en una planta de tabaco provoca que las células foliares actúen como meristemo, generando nuevos órganos a partir de la propia hoja.
Figura 21-91 Ápice del brote de una planta joven de tabaco. (A) Electronmicrografía de barrido que muestra el ápice del brote con dos primordios foliares emergiendo secuencialmente, visibles aquí como dos protuberancias laterales a cada lado de la cúpula del meristemo apical. (B) Sección fina de un ápice similar mostrando que el primordio foliar más joven surge de un grupo reducido de células (aproximadamente 100) de las cuatro o cinco capas más exteriores. (C) Diagrama muy esquemático que muestra que la apariencia secuencial del primordio foliar tiene lugar sobre una distancia reducida y en una fase muy temprana del desarrollo del brote. Finalmente el crecimiento del ápice formará internudos que distribuirán ordenadamente las hojas a lo largo del tallo (véase Figura 21-84). (A y B, según R.S. Poethig e I.M. Sussex, Planta 165:158-169, 1985.)
Señales hormonales de largo alcance coordinan los procesos del desarrollo en partes distantes de la planta74 Para que un tallo se ramifique, han de generarse nuevos meristemos, y es m e diante el control de estos procesos que el entorno ejerce una parte importante de su influencia sobre la forma de la planta. En cada nudo, en su ángulo agudo, o axila, entre la rama foliar y el tallo, se forma una yema. Esta yema contiene un nido de células, derivado del meristemo apical, que ha conservado un carácter meristemático (y que expresa Knotted). Dichas células han conservado su capa cidad para transformarse en el meristemo apical de una nueva rama, pero tam bién tienen la alternativa de permanecer en estado latente. El modelaje de la ra mificación de la planta está regulado por esta opción, en cuya elección participa el entorno. Partes distantes de la planta que reciben influencias de entornos dis tintos reaccionan frente a ellos individualmente mediante cambios en su desa rrollo. Sin embargo, la planta debe de continuar actuando al unísono. Esto exige que las opciones del desarrollo y los procesos de una parte de la planta afecten a las opciones del desarrollo del resto del organismo. Es preciso que existan seña les de largo alcance que den lugar a tal coordinación. Como saben los jardineros, por ejemplo, cortando el extremo de una rama se puede estimular su crecimiento lateral: extrayendo el meristemo apical des aparece también una inhibición que afecta a los meristemos axilares en estado latente, permitiéndoles que formen nuevos ápices. En este caso la señal de largo alcance procedente del meristemo apical, o al menos un componente funda mental del sistema de señal, ha sido identificada. Es una auxina, un miembro de
El desarrollo vegetal
1193
uno de las cinco clases conocidas de reguladores del crecimiento vegetal (de nominados algunas veces hormonas vegetales), los cuales ejercen poderosas in fluencias sobre el desarrollo vegetal. Las otras cuatro clases conocidas son las giberelinas, las citoquininas, el ácido abscídico y el gas etileno. Tal como se muestra en la Figura 21-92, todas ellas son pequeñas moléculas que atraviesan fácilmente las paredes celulares. Todas están sintetizadas por la mayoría de las células vegetales y pueden tanto actuar localmente como ser transportadas in fluyendo a distancia en otras células diana. La auxina, por ejemplo, se transporta de una célula a otra a la velocidad aproximada de un centímetro por hora desde el extremo de un brote hacia su base. Cada factor regulador de crecimiento tiene múltiples efectos, que están modulados por otros reguladores del crecimiento y por señales procedentes del entorno y del estatus nutritivo. Así pues, la auxina sola puede estimular la formación de la raíz, pero conjuntamente con la giberelina puede estimular la prolongación del tallo, con la citoquinina puede suprimir el crecimiento lateral del brote, y con el etileno puede estimular el crecimiento la teral de la raíz. Los receptores que reconocen estos reguladores del crecimiento empiezan a ser caracterizados, y los mecanismos de sus actuaciones continúan siendo un misterio.
H
\
/
C= C
H
/ \
H
H
etileno
o^
^
ch3
cooh
ácido abscísico (ABA, de "abscisic acid")
-CH2COOH
ácido ¡ndol-3-acético (IAA, "indole-3-acetic acid") [una auxina] CH2OH
Arabidopsis se utiliza como organismo modelo para la genética molecular de las plantas75 La investigación sistem ática en busca de mutaciones que afecten el modelaje del embrión vegetal ha facilitado que se empiecen a identificar los genes que dirigen el desarrollo vegetal y que se empiece a dilucidar su funcionamiento. Este enfo que precisa de una planta que sea, como Drosophila o Caenorhabditis elegans, pequeña, de reproducción rápida, y apropiada para los estudios genéticos. El papel de “planta modelo” recayó en un pequeño vegetal, el berro común de pa red A rabidopsis thalian a (Figura 21-93), ya que se pueden hacer crecer un gran número de individuos en el interior de un tubo de ensayo y producir millares de brotes por planta al cabo de 8 a 10 semanas. Arabidopsis también presenta la ventaja para el análisis molecular de tener el genoma vegetal más pequeño co nocido (7 x 107 pares de nucleótidos), comparable al de la levadura (2 x 107 pares de nucleótidos), C. elegans (10 8 pares de nucleótidos) y Drosophila (10 8 pares de nucleótidos). Se han llevado a cabo cultivos celulares y se han establecido m éto dos de transformación génica, se ha aislado un gran número de mutantes de in terés y ahora disponemos de una notable colección de clones de DNA genómico. Arabidopsis presenta, al igual que C. elegans, una ventaja importante sobre Dro sophila para los estudios genéticos: como muchas otras plantas con flor, se pue de reproducir como hermafrodita debido a que una sola flor produce tanto las células huevo como el polen que las puede fecundar. Por lo tanto, cuando una flor que es heterozigota debido a una mutación letal recesiva se autofecunda, una cuarta parte de sus semillas presentará el fenotipo embrionario homozigoto (Figura 21-94). Mediante la utilización de mutágenos para generar decenas de millares de plantas mutantes, e inspeccionando de este modo su progenie, se ha identificado hasta el momento un total de 50 genes distintos que controlan la formación de los patrones embrionarios de Arabidopsis. Como en Drosophila, los genes del mode laje pueden agruparse según sus fenotipos mutantes homozigotos (Figura 21-95). Unos son necesarios para la formación de la raíz de la semilla, otros para el tallo de la semilla y otros para el ápice de la semilla con sus cotilédones. Otro tipo de genes es necesario para la formación de los tres tejidos básicos -la epidermis, el tejido fundamental y el tejido vascular- y todavía otra clase de genes es necesaria para los cambios programados de la forma celular que dan al embrión de la semi lla su forma alargada. Ahora que poseemos este catálogo de genes fundamentales, pronto debería de ser posible dar otro paso y descubrir su funcionamiento. Pero a partir de la gran cantidad de fenotipos mutantes, ya parece probable que el m o delaje del embrión se pueda explicar conceptualmente de la misma forma que
1194
Capítulo 2 1 : Mecanismos celulares del desarrollo
zeatina [una citoquinina]
COOH
ácido giberélico (GA3, "gibberellic acid") [una giberelina] Figura 21-92 Reguladores del crecimiento vegetal. Fórmula de una molécula representativa de cada uno de los cinco grupos de moléculas reguladoras naturales del crecimiento vegetal.
Figura 21-93 Arabidopsis thaliana. Esta pequeña planta pertenece a la familia de la mostaza (o crucifera). Es una hierba que carece de valor económico pero de gran valor para estudios genéticos del desarrollo vegetal. (Cortesía de Chris Sommerville).
para los animales. Tal como veremos ahora, lo mismo puede decirse de los pro cesos posteriores del desarrollo por los que se genera una flor.
Los genes selectores homedticos definen las partes de una flor76 Los meristemos tienen que elegir entre otras opciones de desarrollo además de elegir entre permanecer en estado latente o iniciar el crecimiento; dichas opcio nes también se ven influidas frecuentemente por el entorno. La decisión más importante es la de formar una flor (Figura 21-96). El cambio que se produce a partir del desarrollo meristemático hacia la for mación de la flor está desencadenado, normalmente, por la luz. Mediante unos mecanismos poco conocidos basados en la absorción de la luz por medio de unas proteínas específicas denominadas fitocromos, las células del meristemo son capaces de modificar su patrón de expresión génica en respuesta a un cam bio en la longitud del día, y de esta forma, de experimentar el cambio de estado que marca el inicio el desarrollo de la flor. A través de este cambio de su estado, el meristemo apical abandona sus opciones de continuar el crecimiento vegeta tivo y apuesta su futuro en la producción de gametos. Sus células se embarcan en un estricto programa de crecimiento y diferenciación finito: por medio de
sem illa mutada
plántula
25% m/m
sector de células m utantes del m eristem o
25% +/+
50% m/+
generación F2
El desarrollo vegetal
vainas de sem illas procedentes de:
100% +/+
Figura 21 -94 Producción de imitantes de Arabidopsis. Una semilla, que contiene un embrión pluricelular, se trata con un mutágeno químico y se deja que se convierta en una planta. En condiciones normales, esta planta será un mosaico de clones de células portadoras de varias mutaciones inducidas. Normalmente, cada flor producida por esta planta estará compuesta por células que pertenezcan al mismo clon, todas ellas portadoras de la misma mutación, m, en forma heterozigota (m/+). La autofecundación de flores individuales a través de su propio polen generará vainas de semillas, cada una de las cuales contendrá una familia de embriones la mitad de los cuales, por término medio, serán heterozigotos (m/+), una cuarta parte serán homozigotos mutantes im/m), y una cuarta parte serán homozigotos de tipo salvaje (+/+).
1195
Figura 21 -95 Plántulas mutantes de
una modificación de los mecanismos ordinarios que generan las hojas, se forman siguiendo un orden muy preciso una serie de ápices especializados o verticilos -habitualm ente primero los sépalos, luego los pétalos, más adelante los estam bres portadores de las anteras que contienen el polen, y finalmente los pistilos que contienen las dos células huevo (véase Panel 21-2, pág. 1189). Al final de este proceso ha desaparecido el meristemo, pero entre su progenie ha producido cé lulas germinales. Las series de hojas modificadas que forman una flor pueden comparase con las series de segmentos corporales que forman una mosca. En las plantas, igual que en las moscas, se pueden encontrar mutaciones homeóticas que convierten una parte del patrón al carácter de otra parte. Los fenotipos mutantes pueden agruparse en tres clases (Figura 21-97) en las que se modifican conjuntos de ór ganos diferentes pero solapados. Esta primera clase, ilustrada por la mutante apetala2 de Arabidopsis, tienen los dos verticilos externos transformados: los sé palos están transformados en pistilos y los pétalos en estambres. El segundo tipo, ilustrado por apetala3, tiene los dos verticilos medio transformados: los pé talos están convertidos en sépalos y los estambres en pistilos. El tercer tipo, ilus trado por agamous, tiene sus dos verticilos centrales transformados, con una
pistilo
pétalo
119 6
Capítulo 21 : Mecanismos celulares del desarrollo
Figura 21-96 Estructura de la flor d e A ra b id o p sis. (A) Fotografía. (B) Dibujos. (C) Imagen esquemática de una sección transversal. El plano básico, ilustrado en (C), es común a la mayoría de las plantas dicotiledóneas con flores.
pistilo
estániurc peiaío
¡A)
A ra b id o p sis. Comparación entre una plántula normal (A) y cuatro tipos de mutantes (B-E) que carecen de alguna parte distinta del patrón apicobasal: (B) presenta estructuras que carecen de su apéndice, (C) presenta apéndice y raíz pero carece del tallo que las une, (D) carece de raíz, y (E) forma los tejidos del tallo pero presenta carencias en ambos extremos. Las plántulas han sido transparentadas para mostrar los tejidos vasculares de su interior (puntos claros). (Según U. Mayer et al., Nature 353:402-407, 1991. © 1991 Macmillan Magazines Ltd.)
uülamurü
Figura 2 1-97 Flores de Arabidopsis que presentan mutaciones homeóticas. (A) En agamous, los estambres se convierten en pétalos y los pistilos en el meristemo floral; (B) en apetala3, los pétalos se convierten en sépalos y los estambres en pistilos; (C) en apetala2, los sépalos se convierten en pistilos y los pétalos en estambres. Otro gen, pistillata, presenta un fenotipo mutante parecido a la apetala3\ de este modo es posible identificar las tres clases funcionales de genes selectores homeóticos. (D) En una mutante triple que carezca de las tres funciones, todos los órganos de la flor se convierten en hojas. (A-C, cortesía de Leslie Sieburth; D, cortesía de Mark Running.)
<0/
consecuencia más drástica: los estambres están convertidos en pétalos, la flor carece de pistilos y en su lugar las células centrales se comportan como un m e ristemo floral, el cual empieza de nuevo todo el proceso del desarrollo, generan do otro conjunto anómalo de sépalos y pétalos que anida dentro del primer m e ristemo y, potencialmente, otro conjunto anidado dentro del segundo meristemo, y así indefinidamente. Estos fenotipos identifican tres clases de ge nes selectores homeóticos, los cuales, al igual que los genes selectores hom eóti cos de Drosophila, codifican proteínas reguladoras de genes. Estas proteínas de finen las diferencias del estado celular que otorgan a las diferentes partes de una flor normal sus distintos caracteres. La hibridación in situ confirma que los ge nes se expresan según los patrones previstos de acuerdo con esta interpretación (Figura 21-98). En una mutante triple en la cual las tres funciones génicas están ausentes, se obtiene en lugar de una flor una sucesión infinita de hojas anidadas de forma compacta. Por lo tanto las hojas representan un “estado básico” en el cual no se expresa ninguno de estos genes selectores homeóticos, mientras que los otros tipos de órganos son el resultado de la expresión de genes en com bina ciones diferentes. Con la boca de dragón Antirrhinum majus se han llevado a cabo estudios si milares a éste y se ha identificado un conjunto parecido de fenotipos y genes. La secuenciación de genes revela que, a pesar de la larga distancia en la evolución existente entre Antirrhinum y Arabidopsis, los fenotipos homeóticos correspon dientes surgen a partir de mutaciones en genes homólogos: las plantas, como los animales, han conservado sus sistemas de genes selectores homeóticos. Otra vez, el conjunto de estos genes parece haber surgido por duplicación génica: va rios de ellos, necesarios en los diferentes órganos de la flor, tienen secuencias claramente homólogas. No son de la clase homeobox pero están relacionados con otra familia de proteínas reguladoras de genes (la denominada familia MADS) presente en levaduras y vertebrados.
El desarrollo vegetal
1197
verticilo 2 pétalo (ab)
verticilo 3 estam bre (be)
verticilo 1 sépalo (a)
= gen a (apetala2) expresado en el m eristem o
verticilo 4 pistilo (c)
= gen b (apetala3) expresado en el m eristem o = gen c (agam ous) expresado en el m eristem o
flo r norm al
Figura 21 -98 Expresión de los genes selectores homeóticos en la flor de (A) Diagrama de los patrones normales de expresión de los tres genes cuyos fenotipos mutantes se ilustran en la Figura 21-97. Los tres genes codifican proteínas reguladoras de genes. El sombreado de color en la flor nos indica los órganos que desarrolla cada verticilo del meristemo, lo cual no implica que los genes selectores homeóticos estén aún activos en este estadio. (B) Patrones de una mutante en la que el gen apetala3 es defectuoso. Debido a que el carácter de los órganos de cada verticilo se define por el conjunto de genes selectores homeóticos que expresan, los estambres y los pétalos se convierten en sépalos y pistilos. Las consecuencias de carencias de un gen de clase a, como apetala2, son un poco más complejas: la ausencia de un producto génico de clase a permite que el gen de clase c se exprese tanto en el exterior como en el interior de ambos verticilos, haciendo que estos verticilos exteriores se desarrollen como pistilos y estambres, respectivamente. La deficiencia de genes de clase c impide que la región central sufra la diferenciación terminal como pistilo, de forma que continúa su crecimiento como meristemo generando cada vez más sépalos y pétalos.
Arabidopsis. verticilo 2 sépalo (a) verticilo 1 sépalo (a)
verticilo 3 pistilo (c) verticilo 4 pistilo (c)
Las investigaciones sobre la genética molecular del desarrollo vegetal aca ban de comenzar. Por el m omento, no se conoce casi nada, por ejemplo acerca de los sistemas genéticos responsables de la com unicación local célula-célula ni sobre la señalización posicional en la formación del patrón vegetal. Sin em bar go, ya está claro que plantas y animales, a pesar de sus diferencias, han encon trado de forma independiente soluciones muy similares a muchos de los proble mas fundamentales del desarrollo pluricelular.
Resumen
El desarrollo de una planta con flores, igual que el de un animal, empieza con la di visión de un huevo fecundado formando un embrión con una organización polari zada: la parte apical del embrión forma primero el brote, la parte basal (la raíz) y la parte media (el tallo). Primero la división celular se da a lo largo de todo el cuer po del embrión. No obstante, a medida que el embrión crece, la adición de nuevas células queda restringida a regiones pequeñas denominadas meristemos. Los meristemos apicales, situados en el extremo del brote y en el de la raíz, persisten du rante toda la vida de la planta, concediéndole la capacidad de crecer secuencialmente añadiendo nuevas partes del cuerpo a su periferia. Habitualmente, el brote genera series repetitivas de módulos, cada uno de los cuales consta de un segmento de tallo, una hoja y una yema axilar. Una yema axilar es un nuevo meristemo en potencia, capaz de dar lugar a un rama lateral; el entorno puede controlar el desa rrollo de la planta regulando la activación de sus yemas. Las señales del entorno 119 8
Capítulo 2 1 : Mecanismos celulares del desarrollo
axón (desde menos de 1 mm a más de 1mm de longitud)
Jas dendritas reciben las señales de entrada de las sinapsis soma celular
25 [jm
las ramas terminales de los axones establecen sinapsis sobre las células diana
Figura 21 -99 Neurona típica de un vertebrado. Las flechas señalan las direcciones en que se transmiten las señales. La neurona representada pertenece a la retina de un mono. Las neuronas más largas y grandes de un humano tiene una extensión de cerca de 1 millón de |im y su axón un diámetro de 15 |im. (Ilustración de la neurona de B.B. Boycott en Essays on the Nervous System [R. Bellairs y E.G. Gray, eds.]. Oxford, UK: Clarendon Press, 1974.)
también pueden provocar que el meristemo apical pase deformar hojas a formar flores. Señales de largo alcance mediadas por hormonas vegetales coordinan los procesos de este desarrollo que tienen lugar en partes distantes de la planta. Sin embargo, la organización interna de cada módulo de la planta está contro lada por mecanismos deformación de patrones muy estrictos, análogos a los que controlan el desarrollo animal. Estos mecanismos actúan en las proximidades del meristemo apical, donde las posiciones relativas de los rudimentos foliares y otros órganos están inicialmente mapados a escala microscópica. El patrón de hojas mo dificadas -sépalos, pétalos, estambres y pistilos- de una flor se establecen deforma similar. La base genética del patrón deformación de las plantas puede analizarse del mismo modo que el de Jos animales. La pequeña hierba A rabidopsis th alian a es muy utilizada como "planta modelo” en tales estudios. Los genes que controlan la organización del embrión, análogos a los genes de polaridad del huevo y los genes de segmentación de D rosophila, pueden ser identificados. La secuencia de las par tes en una flor está controlada por genes selectores homeóticos estrechamente aná logos (aunque no homólogos) a los de los animales. El desarrollo neural 77 Las células nerviosas, o neuronas, son unas de las más antiguas de todos los ti pos de células animales especializadas, y son tan importantes para las medusas y anémonas marinas como para los gusanos, las moscas o los humanos. Su es tructura es distinta a la de cualquier otro tipo de célula; los problemas que plan tea el desarrollo del sistema nervioso no están presentes en otros tejidos. Por en cim a de todo, lo que sorprende más de una neurona es su forma enormemente extendida, formada por un largo axón y dendritas que conectan con otras célu las por medio de las sinapsis (Figura 21-99). El principal desafío del desarrollo neural consiste en explicar cómo crecen los axones y las dendritas, cómo en cuentran sus compañeros adecuados, y cómo establecen sinapsis selectivas con ellos generando una red funcional (Figura 21-100). Muchos de los com ponentes característicos del sistema nervioso -lo s diver sos tipos de neuronas, células sensoriales y m usculares- se originan en lugares del embrión muy diferentes e inicialmente están desconectados entre sí. Así
Figura 21 -100 La compleja organización de las conexiones de las células nerviosas. Este dibujo semiesquemático ilustra una sección transversal de una pequeña parte del cerebro de mamífero -el bulbo olfativo de un perro, impregnado con la técnica de Golgi. Las manchas negras son neuronas; las líneas delgadas son axones y dendritas, mediante las cuales se interconectan varios conjuntos de neuronas siguiendo reglas muy precisas. (Según C. Golgi, Riv. sper. freniat. Reggio-Emilia 1:405-425,1875; reproducido por M. Jacobson, Developmental Neurobiology, 3rd ed. New York: Plenum, 1992.)
El desarrollo neural
1199
génesis de las neuronas
crecimiento de axones y dentritas
refinamiento de las conexiones sinápticas
fe
pues, durante la primera fase del desarrollo neural (Figura 21-101), se desarro llan las diferentes partes del sistema neural, según sus programas locales, que actúan de acuerdo a los principios de diversificación celular comunes a otros te jidos del cuerpo que ya hemos visto. La fase siguiente implica un tipo de morfo génesis exclusiva del sistema nervioso: se establece, a lo largo de rutas específi cas, un conjunto provisional pero ordenado de conexiones entre las diferentes partes del sistema nervioso, mediante el crecimiento de axones y dendritas, gra cias al cual pueden empezar a interactuar. En la tercera y última fase, que se prolongará en la vida adulta, las conexiones se ajustan y perfeccionan a través interacciones entre los diferentes componentes, mediante un mecanismo que depende de las señales eléctricas que transmiten y reciben.
Las reservas de neuronas generadas en el inicio del desarrollo neural no se reemplazarán posteriormente78 En todos los animales, el sistema nervioso se desarrolla a partir del ectodermo. Como hemos visto en este capítulo, en los vertebrados, en los cuales nos centra remos, el sistema nervioso deriva principalmente de dos grupos de células -las células del tubo neural (una invaginación del ectodermo) y las células de la cres ta neural (una población de células que se liberan del ectodermo neuronal y migran hacia otras regiones del embrión). El tubo neural forma el sistema nervioso central (la médula espinal y el cerebro, incluyendo la retina del ojo), mientras que la cresta neural da lugar a la mayoría de las neuronas y a las células de sos tén del sistema nervioso periférico (Figura 21-102).
Figura 21-102 Diagrama de un embrión temprano de pollo (2 l/2 días), que muestra los orígenes del sistema nervioso. El tubo neural (en verde claro) ya está cerrado, salvo en el extremo de su cola, y yace internamente bajo el ectodermo, al que pertenecía originalmente (véase Figura 21-10). La cresta neural (en rojo) yace dorsalmente bajo el ectodermo, dentro o encim a del tubo neural. Además, los p la c o d o s (en verde oscuro), engrosamientos de la superficie del ectodermo de la cabeza, dan lugar a algunas células transductoras sensoriales y neuronas de esta región, incluyendo las de la nariz y del oído. Las células de la retina del ojo, por el contrario, tienen su origen en el tubo neural.
120 0
Capítulo 2 1 : Mecanismos celulares del desarrollo
Figura 21-101 Las tres fases del desarrollo neural.
tubo neural placodo/ vesícula auditiva cresta neural
ojo placodo nasal corazón
de los ganglios sensoriales craneales som ito vaso sanguíneo
pliegues neurales (el tubo neural aún no se ha cerrado)
Figura 21 -103 Formación del tubo neural. Electronmicrografía de barrido
to r n
cresta neural ectoderm o
tubo neural
que muestra una sección transversal del tronco de un embrión de pollo de dos días de edad. El tubo neural está a punto de cerrarse y separarse del ectodermo; en este estadio consta (en el pollo) de un epitelio de un grosor de una sola célula. (Cortesía de lean Paul Revel).
notocorda
El tubo neural, que trataremos más profundamente, consta inicialmente de un epitelio de una sola capa (Figura 21-103) que genera tanto las neuronas como las células de sostén, denominadas gliales, es decir las células del sistema ner vioso central. Durante el proceso se transforman formando una estructura más gruesa y com pleja con muchas capas de células de distintos tipos. Debido a que las neuronas ya diferenciadas no se dividen, se puede asignar un “nacim iento” a cada una de ellas, definido como el momento en que ocurre la mitosis final que generará la neurona a partir de una célula precursora de neuronas en división. Tanto en los vertebrados superiores como en los inverte brados, todos los nacimientos de las neuronas de un tipo determinado general mente ocurren en el transcurso de un período estrictamente limitado, tras el cual no se producirán más neuronas de este tipo. Cada región del tubo neural en desarrollo tiene su propio programa de divisiones celulares, y las neuronas con momentos distintos de nacimientos normalmente tendrán funciones distintas. Las células neurales madre no acostumbran a persistir una vez completada la producción de células nerviosas, por lo que las poblaciones de células nerviosas solamente se podrán regular disminuyendo de número, mediante la muerte ce lular, como veremos más adelante.
El momento y el lugar de nacimiento de una neurona determinarán sus conexiones79 Antes de emitir al exterior su axón y sus dendritas, la neurona inmadura o su precursora acostumbran a migrar desde su lugar de nacimiento y se establecen en alguna otra localización. Las células gliales muy a menudo proporcionan una vía para la migración en el sistema nervioso central. Por ejemplo, el tubo neural de un embrión de un vertebrado contiene un armazón de células gliales radia les. Cada una de estas células se extiende desde el interior del tubo hacia su superficie exterior, una distancia que en la corteza cerebral del cerebro en desa rrollo de un primate puede llegar a representar hasta 2 cm. Las futuras neuronas atraviesan sus últimas divisiones celulares cerca del lumen del tubo neural y entonces se trasladan hacia el exterior arrastrándose sobre las células gliales (Figura 21-104).
El desarrollo neural
1201
superficie externa del tubo neural en desarrollo y í
Figura 21-104 Migración de neuronas inmaduras a lo largo de las células gliales radiales. Los diagramas se basan en reconstrucciones efectuadas a partir de la corteza cerebral de un mono (parte del tubo neural). Las neuronas nacen cerca de la superficie luminal interna del tubo neural y migran hacia el exterior. Las células gliales radiales pueden considerarse como las células supervivientes del epitelio columnar original del tubo neural, sorprendentemente estiradas como el grosor de la pared del tubo. (Según P. Rakic,/. Comp. Neurol. 145:61-84, 1972.)
prolongación - d e las células gliales radiales t
' t m
neurona en m igración
ti i"
núcleo ' t t > 1
i
1 1 i superficie interna de un tubo neural en desarrollo
soma celular de una célula glial radial 10 pm
Sucesivas cohortes de células migrantes, nacidas en momentos distintos, se establecen en posiciones distintas. Por ejemplo, en la corteza cerebral, las neuro nas están dispuestas en capas según su momento de nacimiento, como resulta do de una migración en la que las células nacidas más tarde adelantan a las que nacieron antes. Gracias al trasplante de células entre embriones jóvenes y em briones maduros se puede demostrar que las diferentes opciones de futuro ya es taban tomadas antes de iniciar la migración; reflejan diferencias entre los carac teres intrínsecos de las células producidas en momentos distintos -diferencias que influirán tam bién en las conexiones sinápticas que se formarán posterior mente. De este modo, en la corteza cerebral las células nacidas primero (capas internas) enviarán sus axones hacia el exterior de la corteza, mientras que las c é lulas nacidas más tarde (capas externas) enviarán sus axones hacia las regiones del interior de la corteza. La relación entre el momento del nacimiento y las co nexiones de los axones se mantiene incluso en ratones mutantes cuyas migracio nes son anormales e invierten las posiciones finales de las células nacidas prime ro con las que lo hacen posteriormente, lo que confirma que las conexiones reflejan el carácter intrínseco de las neuronas, más que su localización final (Figura 21-105). No menos importante que el mom ento de nacimiento de una neurona es el lugar en que lo hace. Las células de diferentes regiones del tubo neural tienen valores posicionales distintos que controlan las conexiones que formarán. Estas diferencias dependientes de la posición son apreciables tanto en el patrón de ex presión de los genes Hox, que ya hemos visto, com o en un gran grupo de otros genes que codifican proteínas reguladoras de genes y otras moléculas regulado ras. Se conocen muy pocos de los mecanism os que generan las diferencias m o leculares entre la futuras neuronas, pero los que se conocen parecen ser muy parecidos a los m ecanism os del patrón de formación que vimos anteriormente. Sin embargo, la cuestión que hemos de afrontar ahora es otra: ¿Cómo actúan las
1 20 2
Capítulo 21 : Mecanismos celulares del desarrollo
CORTEZA DE RATON REELER
CORTEZA DE RATÓN NORMAL
aunque estén mal emplazadas, las células piram idales pequeñas, de nacim iento posterior, envían axones a otras regiones de la corteza .f c
•Ai ! !
aunque estén mal situadas, las células piram idales grandes y de form a irregular, de nacim iento tem prano, envían axones a regiones situadas fuera de la corteza
p p
Figura 21 -105 Comparación entre la disposición de capas de neuronas de la corteza de ratones normales y reeler. En el mutante reeler una anomalía en la migración celular provoca una inversión aproximada de la relación habitual entre el momento del nacimiento neuronal y la posición de las neuronas. Sin embargo las neuronas emplazadas de forma incorrecta se diferencian y realizan las conexiones adecuadas según el momento de su nacimiento.
kTkm
células nerviosas recién nacidas, equipadas con sus marcadores específicos, para establecer un patrón de conexiones bien ordenado?
Cada axón o dendrita se extiende gracias a un cono de crecimiento situado en su extremo77,80 Por regla general, los axones y las dendritas.empiezan a desarrollarse a partir del cuerpo de la célula nerviosa poco después de que el soma celular haya alcanzado su localización final. La secuencia de los procesos que se producen se observó originalmente sobre tejido embrionario intacto mediante el método de impreg nación de Golgi (véase Figura 21-106). Esta técnica, y otros métodos que se desa rrollaron posteriormente, han revelado un engrosamiento irregular y erizado en el extremo de cada prolongación en desarrollo de la célula nerviosa. Parece ser que esta estructura, que se denomina cono de crecimiento, se arrastra a través del tejido de su alrededor. Esto incluye la maquinaria que produce el movimiento y el mecanismo que dirige el extremo de cada prolongación por el camino ade cuado. La mayor parte de los conocim ientos de que disponemos sobre las propie dades de los conos de crecimiento procede de estudios realizados en cultivos tisulares y celulares. Es posible observar cómo una neurona empieza a extender sus prolongaciones: primero son todas iguales, hasta que uno de los conos de crecimiento acelera su prolongación bruscamente, identificándose esta prolon gación con el axón y presentando el conjunto de proteínas específicas del axón
cono de crecim iento de una neurona sensorial entrando en la médula espinal
I ¡ ¡}¿J
soma celular de una neurona sensorial soma celular de una interneurona cono de crecim iento de una interneurona que permanece dentro de la médula espinal
soma celular de una m otoneurona El desarrollo neural
cono de crecim iento de una m otoneurona abandonando la médula espinal
Figura 21-106 Los conos de crecimiento de la médula espinal en desarrollo de un embrión de pollo de 3 días. El dibujo muestra una sección transversal impregnada con la técnica Golgi. Aparentemente la mayoría de las neuronas tiene inicialmente una única prolongación alargada: el futuro axón. Los conos de crecimiento de las interneuronas permanecen dentro de la médula espinal, los de las motoneuronas salen de ella (emprendiendo su camino hacia los músculos) y los de las neuronas sensoriales crecen hacia interior de la médula espinal desde el exterior (donde se hallan sus cuerpos celulares). Muchas de las células de las regiones más centrales de la médula espinal embrionaria aún están proliferando y no han empezado a diferenciarse como neuronas o células gliales. (De S. Ramón y Cajal, Histología del sistema nervioso del hombre y los vertebrados. París: Maloine, 1909-1911; reeditado, Madrid: C.S.I.C., 1972.)
1203
Figura 21 -107 Formación de axones y dendritas en cultivo. Se ha aislado
(Figura 21-107). El contraste entre el axón y las dendritas, establecido en este es tadio, provocará que ambos tipos de prolongaciones crezcan hacia direcciones distintas, siguiendo caminos diferentes, y así desempeñando funciones distintas en la formación de las sinapsis. La distinción entre el axón y la dendrita no es a menudo fácil de observar en una neurona aislada en un cultivo, y es conveniente referirse a ambos tipos de prolongaciones como: neuritas. El cono de crecimiento situado en el extremo de una neurita de crecim iento rápido típico, avanza a una velocidad de 1 mm por día. La neurita consta de una extensión ancha y aplanada como la palma de una mano, con numerosas y largas microespinas o filopodios que se extienden como dedos a partir de ella (Figura 21-108). Estos filopodios permanecen en continua actividad: unos se retraen hacia el cono de crecimiento mientras que otros se alargan, ondulándose y adhiriéndose al substrato. Las “membranas” o “velos” existentes entre los filopodios forman lamelipodios, con una membrana fruncida. Todas estas características, al igual que la configuración interna del citoesqueleto, sugieren que el cono de crecimiento avanza arrastrándose de un modo muy parecido al del borde anteriór de una célula como un neutrófilo o un fibro blasto, como vimos en el Capítulo 16. El cono de crecim iento explora con sus filopodios y lamelipodios las regio nes del medio situadas en posiciones más avanzadas, en todas direcciones. Si estas protuberancias entran en contacto con una superficie poco favorable, se retraen; si entran en contacto con una superficie más favorable, se mantienen estiradas, orientando la extensión de todo el cono en esa dirección. De esta for ma el cono de crecim iento se puede guiar mediante sutiles variaciones de las propiedades de superficie del substrato sobre el que se desplaza.
1G |jm
1204
Capítulo 2 1 : Mecanismos celulares del desarrollo
una neurona joven del cerebro de un mamífero y se ha colocado en un cultivo para su desarrollo, donde emitirá prolongaciones. Una de estas prolongaciones, el futuro axón, ha empezado a crecer más rápidamente que las otras (las futuras dendritas) y se ha bifurcado. (A) Fotografía en contraste de fases; (B) patrón de impregnación con faloidina fluorescente, que se une a los filamentos de actina. La actina se concentra en los extremos de las prolongaciones de los conos de crecimiento, que son muy activos extendiéndose y en otras actividades de los lamelipodios. (Cortesía de Kimberly Goslin, según Z.W. Hall, An Introduction to Molecular Neurobiology. Sunderland, MA: Sinauer, 1992.)
Figura 21 -108 Conos de crecimiento neural. (A) Electronmicrografía de barrido de los conos de crecim iento presentes en el extremo de una neurita emitida por una neurona simpática en cultivo. En este caso, un cono de crecim iento se ha divido en dos. Observénse los numerosos filopodios y el aspecto tenso de la neurita, debido a la tensión generada por el movimiento hacia adelante de los conos de crecimiento, que a menudo son los únicos puntos de adhesión firme al substrato. (B) Electronmicrografía de barrido del cono de crecim iento de una neurona sensorial in vivo, arrastrándose por la superficie interna de la epidermis de un renacuajo de X enopus. (A, de D. Bray, en Cell Behaviour [R. Bellairs, A. Curtís, y G. Dunn, eds.]. Cambridge, UK: Cambridge University Press, 1982; B, de A. Roberts, B rain Res. 118:526-530, 1976.)
El cono de crecimiento conduce in vivo a la neurita en desarrollo a través de una vía definida con precisión8184 En general en los animales vivos los conos de crecimiento se desplazan hacia sus destinos a lo largo de rutas establecidas, sirviéndose de múltiples señales para encontrar su camino. Muy a menudo toman rutas que ya han sido utilizadas an teriormente por otras neuritas, siguiéndolas mediante guías de contacto. Como consecuencia de ello, las fibras nerviosas de un animal adulto suelen estar agru padas formando haces compactos y paralelos (denominados fascículos o tractos fibrosos ). Es probable que el avance de los conos de crecimiento a lo largo de los axones esté mediado por moléculas de adhesión célula-célula homofílicas -glucoproteínas de membrana que capacitan a las células que las expresan para ad herirse a otras células que también las expresen. Como vimos en el Capítulo 19, dos de las clases más importantes de estas moléculas son las que pertenecen a la superfamilia de las inmunoglobulinas, como N-CAM, y a la familia de las cadherinas dependientes de Ca2+, como la cadherina N. Generalmente existen m iem bros de ambas familias en las superficies de los conos de crecimiento, de los axones y de muchos otros tipos celulares sobre los que se arrastran los conos de crecimiento, incluyendo la& células gliales del sistema nervioso central y las cé lulas musculares de la periferia del cuerpo. Los conos de crecimiento también migran sobre com ponentes de la matriz extracelular, especialmente la laminina, a la cual se adhieren mediante receptores de la matriz de la superficie celular de la familia de las integrinas (tratados en el Capítulo 19). En algunos casos se puede demostrar la importancia de una molécula de adhesión célula-célula o célula-matriz simplemente bloqueando su función con un anticuerpo y observando los trastornos causados sobre el crecimiento del axón. Sin embargo, por regla general un cono de crecimiento utiliza varios siste mas de adhesión en sus migraciones, y si utilizamos anticuerpos contra uno solo de ellos, los efectos serán mínimos; sólo cuando se aplican múltiples anticuer pos, de modo que se bloqueen todos a la vez, se retrasa seriamente el viaje del cono de crecimiento. En principio, diferentes combinaciones de moléculas de ad hesión proporcionan una gran variedad de propiedades de superficie de los conos de crecimiento y una sutil y compleja selección de vías de acuerdo con las com bi naciones de moléculas presentes en las superficies de las células que se encuen tran a lo largo de la ruta. Todavía desconocem os hasta qué punto son suficientes las diferentes com binaciones de proteínas de adhesión como N-CAM, cadherina N e integrinas en la membrana del cono de crecimiento para explicar por qué algunos conos de crecimiento escogen una ruta mientras otros escogen otra, o por qué un conjun to de axones, cuando han llegado a su región diana, son capaces de generar for maciones ordenadas de sinapsis. Seguramente las moléculas de adhesión no son las únicas influencias que participan en estos procesos. Los contactos que un cono de crecim iento establece con las superficies celulares y con la matriz pue den dar lugar a señales intracelulares que, por ejemplo, pueden inhibir activa mente cualquier avance. Substancias difundidas a través del medio extracelular también pueden dar lugar a gradientes que proporcionen un guía. Por ejemplo, en la médula espinal en desarrollo existe un grupo de neuronas cuyos axones se desplazan ventralmente, hacia la placa básica del tubo neural, cruzando, por esta ruta, hacia el otro lado del tubo. Si colocamos estas neuronas en cultivo cer ca de un explante de la placa básica, sus axones orientarán de nuevo su creci miento hacia él, lo cual implica que las células especializadas de la placa básica secretan moléculas que tienen un efecto de guía quimiotáctica.
Los tejidos diana liberan factores neurotróficos que controlan el crecimiento y la supervivencia de las células nerviosas82,85 La mayoría de los tipos de neuronas del sistema nervioso central y periférico de los vertebrados se producen en cantidades excesivas: un 50% o incluso más de es-
E1 desarrollo neural
1205
tas neuronas morirán poco después de alcanzar su destino, aunque su aspecto sea perfectam ente normal y saludable hasta el momento de su muerte. Por ejemplo, aproximadamente la mitad de todas las motoneuronas que envían axones hacia el músculo esquelético mueren pocos días después de entrar en con tacto con sus células musculares diana. La muerte a gran escala de neuronas po dría reflejar el resultado de una competencia. Cada tipo de célula diana libera una cantidad limitada de factor neurotrófico específico, que necesitan para so brevivir las neuronas que inervarán esta diana: aparentemente las neuronas compiten para conseguir este factor, y las que no consiguen una cantidad sufi ciente mueren por muerte celular programada. Este proceso aparentemente inúti, proporciona una medio simple y elegante para ajustar el número de neu ronas de cada tipo al número de células diana que inervan. El primer factor neurotrófico que se identificó, y con diferencia el m ejor ca racterizado, se conoce simplemente como factor de crecimiento nervioso, o NGF (de Nerve Growth Factor). Fue descubierto accidentalmente en el transcur so de unos experimentos en los que se trasplantaron tejidos extraños y tumores a embriones de pollo. Los trasplantes de un tumor concreto quedaron excepcio nal y densamente inervados y provocaron un engrosamiento sorprendente en algunos grupos de las neuronas periféricas en las proximidades del injerto. Sólo se vieron afectadas dos clases de neuronas: las neuronas sensoriales y las neuro nas simpáticas (una subtipo de neuronas periféricas que controlan la contrac ción del músculo liso y la secreción de las glándulas exocrinas). La búsqueda de una causa para este fenóm eno condujo hasta una proteína específica, NGF, y demostró que si se administran anticuerpos anti-NGF a un ratón mientras su sistema nervioso está en desarrollo, la mayoría de las neuronas simpáticas y al gunas neuronas sensoriales mueren. Esto mismo ocurre en un cultivo: las neu ronas simpáticas y algunas de las neuronas sensoriales mueren en ausencia de NGF; en presencia de NGF, sobreviven y emiten neuritas (Figura 21-109). De for ma similar, algunas clases de neuronas del sistema nervioso central dependen de NGF. El NGF está producido por tejidos inervados por neuronas dependientes de NGF. Manipulaciones experimentales confirman que a mayor cantidad de tejido diana, mayor será el número de neuronas que sobrevivan, y se puede demostrar que este efecto es consecuencia del NGF porque puede ser simulado mediante la manipulación directa de las concentraciones de NGF. Después de que haya terminado la fase de muerte celular, el NGF continúa manteniendo una función reguladora de la densidad de inervación controlando la cantidad de procesos que emitirá el axón. Este m ecanismo es esencial para la restitución de la inerva ción, por ejemplo en tejidos dañados de la piel o del músculo liso. El NGF actúa sobre un tejido intacto de la misma forma que lo hace sobre una placa de cultivo (véase Figura 21-109), preservando la supervivencia de células y estimulando lo calm ente la actividad de los conos de crecimiento y así ajustando el suministro de inervación a las necesidades de la diana. El NGF es sólo uno de los miembros de la familia de factores neurotróficos homólogos (denominados neurotrofinas) que son responsables de este tipo de
Figura 21-109 Efectos del NGF sobre la génesis de neuritas. Micrografías de campo oscuro de un ganglio cultivado durante 48 horas en presencia (arriba) o ausencia [abajo) de NGF. Las neuritas se desarrollan y crecen en y desde las neuronas simpáticas sólo en presencia de NGF en el medio. Cada cultivo también contiene células de Schwann (gliales) que han migrado del ganglio; tales células no se ven afectadas por el NGF. El efecto que ejerce sobre los conos de crecimiento es local, directo, rápido e independiente de cualquier comunicación con el soma celular; al eliminar el NGF del medio, los conos de crecimiento deprivados, detienen su desplazamiento durante uno o dos minutos. El efecto de NGF sobre la supervivencia celular es menos inmediato y se asocia con la asimilación de NGF por endocitosis y su transporte intracelular de retorno al soma celular. (Cortesía de Naomi Kleitman.)
120 6
Capítulo 2 1 : Mecanismos celulares del desarrollo
control
Figura 21-110 Conexiones entre el ojo y el cerebro de un renacuajo de
Xenopus. En este espécimen se ha inyectado una molécula trazadora en el interior de un ojo (objeto oscuro situado en la izquierda), ha sido asimilada por las neuronas presentes, y transportada a lo largo de sus axones, lo cual pone de manifiesto las rutas que toman hacia el tectum óptico en el cerebro. (Cortesía de Jeremy Taylor.) regulación de las diferentes partes del sistema nervioso de los vertebrados. Se unen a una familia complementaria de proteínas receptoras transmembrana (denominadas así debido a un proto-oncogén llamado trk que codifica una de ellas); estas proteínas pertenecen a la clase de receptores tirosina quinasa vistos en el Capítulo 15. Se espera que los factores neurotróficos sean útiles en el trata miento de las enfermedades neurológicas, como la enfermedad de Alzheimer y la enfermedad de las motoneuronas (la enfermedad de Lou Gehrig), en las que las neuronas degeneran y mueren inadecuadamente. Ahora volvamos al problema del modelaje espacial de las conexiones ner viosas.
tectum
Los valores posicionales de las neuronas guían la formación de mapas neuronales ordenados: doctrina de la especificidad neuronal86 Normalmente las aportaciones de información procedentes de órganos senso riales trazan mapas o se proyectan de forma ordenada sobre las regiones senso riales del sistema nervioso central, y las salidas de información de las regiones motoras del sistema nervioso central se trazan de manera ordenada sobre los músculos. Así pues, células nerviosas similares pertenecientes a regiones distin tas de la retina de un vertebrado emiten sus axones estableciendo sinapsis con neuronas de regiones correspondientes distintas del tectum óptico del cerebro intermedio (Figura 21-110); de la misma forma, motoneuronas similares entre sí de distintas localizaciones de la médula espinal emiten sus axones hacia diferen tes músculos. En principio, los conos de crecimiento se podrían canalizar hacia sus varios destinos simplemente como consecuencia directa de los puntos de partida, como los conductores de una autopista multivía en la que estuviera prohibido cam biar de carril. Esta posibilidad fue comprobada en el sistema visual median te un famoso experimento en los años cuarenta. Si seccionam os el nervio óptico de una rana, éste se regenera. Los axones de la retina crecen hacia el interior del tectum óptico, restituyendo la visión normal. Si, además, en el mismo momento en que se secciona el nervio se hace girar el ojo, de forma que las células origi nalm ente ventrales de la retina queden en la posición de células dorsales de la retina, todavía se restituiría la visión, pero con una carencia notable: el animal se comporta como si percibiera el mundo al revés. Las células retínales mal em pla zadas establecen conexiones apropiadas de acuerdo con su posición original, no con sus posición reales (Figura 21-111). Evidentemente las células están dotadas de valores posicionales que contienen una memoria de su posición original, de modo que las células de localizaciones opuestas en la retina son intrínsecam en te diferentes. Igual que ocurre en la corteza de un ratón reeler (véase Figura 21105), es el carácter intrínseco, y no la posición, el que elige la localización diana. Tal no equivalencia entre neuronas se denomina especificidad neuronal.
Los axones de lados opuestos de la retina responden de forma distinta al gradiente de las moléculas repelentes del tectum87 Una vez han alcanzado el tectum, los axones retínales tienen que escoger, según su carácter individual, qué región del tectum inervarán. Por ejemplo, los axones de la retina nasal se proyectan hacia el tectum posterior, y los de la retina tem poral (el lado más alejado de la nariz) se proyectan hacia el tectum anterior. Esta opción se controla mediante diferencias del carácter intrínseco de las células de
El desarrollo neural
1207
tectum derecho
tectum izquierdo
tem poral
tem poral ventral
retina derecha
ventral retina izquierda
las neuronas de cada retina em iten sus axones hacia el tectum opuesto, estableciendo un mapa ordenado (A-a, V-v, etc.)
se secciona el nervio óptico derecho y se hace girar el ojo derecho; los extrem os seccionados de los axones de la retina degeneran
diferentes partes del tectum. Así pues, el mapa neuronal depende de la corres pondencia entre los dos sistemas de marcadores posicionales, uno situado en la retina y el otro en el tectum. Experimentos in vitro con tejidos de embrión de pollo aportan alguna luz sobre la naturaleza de los marcadores del tectum y la forma en que los axones retínales responden ante ellos. Se colocan fragmentos de retina en un cultivo, permitiéndoles que emitan axones sobre el substrato que está revestido de vesí culas de mem brana preparadas a partir de células tectales (Figura 21-112). El re vestimiento está dispuesto en bandas, de forma que se alternan bandas de m em brana del tectum anterior con bandas de membrana del tectum posterior. En función de los detalles de la preparación, los axones de la retina nasal pueden no presentar preferencia alguna y crecer indiscriminadamente o presentar una preferencia, la adecuada, por la membrana del tectum posterior. Los axones procedentes de la retina temporal crecen de forma consistente sólo a lo largo de bandas de la mem brana del tectum anterior, en concordancia con su destino habitual. Sorprendentemente, esto no ocurre porque la membrana del tectum anterior sea particularmente adhesiva o atractiva, sino porque la membrana del tectum posterior es especialmente repelente: los filopodios que la tocan se colapsan y se retraen. De hecho, si se hace gotear sobre ellos una suspensión de mem brana del tectum posterior, los conos de crecimiento de los axones tempo rales (pero no los nasales) se colapsan y retroceden. En el caso de una prepara ción de m embranas del tectum anterior, no se produce colapso alguno. Los efectos peculiares de la membrana del tectum posterior sobre la células de la retina temporal se deben a una glucoproteína inhibidora específica que está distribuida en gradiente desde la parte posterior hasta la parte anterior del tectum. En otras partes del sistema nervioso se puede demostrar que otras mo-
p A P A P A P A P tem poral
1208
Capítulo 21 : Mecanismos celulares del desarrollo
nasal
las neuronas de cada parte de la retina, a pesar de estar desplazadas, regeneran sus conexiones con la m ism a parte del tectum a la que estaban conectadas antes Figura 21-111 Regeneración de las conexiones entre el ojo y el cerebro de un anfibio después de la rotación de un ojo. Los axones de cada parte de la retina girada se regeneran y vuelven a conectar con la parte del tectum adecuada a sus posiciones origin ales en los cuerpos retínales. De este modo, por ejemplo, la luz que cae sobre la parte ventral de la retina girada es percibida como si cayera sobre la parte dorsal, y el animal percibe el mundo al revés; si colocamos alimento por encim a de él, el animal se agachará, etc.
Figura21-112 La selectividad de los axones de la retina en crecimiento sobre las membranas del tectum. El substrato del cultivo ha sido revestido con bandas alternas de membrana preparadas tanto a partir del tectum posterior (P) com o del tectum anterior (A); las bandas del tectum anterior son visibles gracias a la impregnación con marcadores fluorescentes en las bandas verticales de ambos lados de la película. Los axones de la neuronas procedentes de la mitad temporal de la retina (en crecim iento desde la izquierda) siguen las bandas de membrana del tectum anterior pero evitan las membranas del tectum posterior, mientras que los axones de la mitad nasal de la retina (en crecim iento desde la derecha) hacen lo contrario. Así pues el tectum anterior difiere del tectum posterior y la retina nasal de la temporal, y las diferencias guían el crecim iento selectivo de los axones. Estos experimentos se han efectuado con células procedentes de un embrión de pollo. (De Y. von Boxberg, S. Diess y U. Scharwz, N euron
10:345-357, 1993.)
léculas de superficie tienen funciones análogas a las de los repelentes de los co nos de crecimiento. Estos sistemas básicos de marcadores son adecuados para definir la orientación anteroposterior en el mapa del tectum óptico de la rana. Sin embargo, para trazar el mapa completo con precisión son necesarios otros mecanism os completamente distintos.
Los patrones difusos de las conexiones sinápticas se definen mediante la eliminación de la sinapsis dependiente de actividad88,89 En un animal normal el mapa retinotectal es inicialmente confuso e impreciso. Estudios en ranas y peces demuestran que el axón primero se prolonga de forma profusa en el tectum estableciendo multitud de sinapsis distribuidas a todo lo largo de una ancha área del tectum que se solapa con los territorios inervados por otros axones. Estos territorios se ordenan posteriormente a través de la eli m inación de sinapsis y los retrocesos de las prolongaciones de los axones. Este perfeccionamiento del mapa mediante la eliminación de sinapsis está regido por dos reglas de com petición que, actuando juntas, crean un orden espacial: ( 1) los axones procedentes de regiones distantes de la retina, que tienden a excitar se en mom entos alternos, compiten por dominar el territorio tectal disponible, pero (2) los axones de localizaciones vecinas a la retina, que tienden a excitarse al mismo tiempo, inervan territorios vecinos del tectum porque colaboran para mantener sus sinapsis con células tectales compartidas (Figura 21-113). El m e canismo subyacente a ambas reglas depende de la actividad eléctrica y de la se ñalización procedentes de sinapsis ya establecidas. Si se bloquean todas las ac ciones potenciales por medio de una toxina que se une los canales Na+regulados por voltaje, la eliminación de sinapsis se inhibe y el mapa continúa confuso. El fenómeno de la eliminación de sinapsis dependiente de actividad se produce en prácticam ente todas las partes en desarrollo del sistema nervioso de un vertebrado. Primero, se establecen muchas sinapsis y se distribuyen sobre una región diana muy amplia; luego el sistema de conexiones se reduce a través de procesos competitivos que dependen de la actividad eléctrica y las señales si nápticas. El proceso de eliminación de sinapsis no tiene nada que ver con la eli minación del exceso de neuronas a través de la muerte celular, ya que tiene lu gar después de que el período la muerte neuronal normal haya finalizado. Los m ecanismos celulares de la eliminación de sinapsis comienzan a ser comprendidos gracias a experimentos efectuados sobre la inervación del mús-
Figura 21-113 El mapa retinotectal se acaba de perfilar mediante la eliminación de sinapsis. Inicialmente el mapa es confuso porque cada axón de la retina se ramifica inervando amplias zonas de una ancha región de tectum, solapando las regiones inervadas por otros axones retinales. El mapa se acaba de perfilar mediante la eliminación de sinapsis. En los lugares en que los axones de partes distantes de la retina establecen sinapsis en la misma célula tectal, se produce una com petencia, y las conexiones establecidas por uno de los axones desaparecen. Pero los axones procedentes de células que sean vecinas a la retina cooperan, manteniendo sus sinapsis sobre células del tectum compartidas. Así pues, cada axón retinal termina inervando un territorio tectal reducido, adyacente y en parte superpuesto al territorio inervado por axones procedentes de localizaciones vecinas a la retina.
neuronas tectales
MAPA INICIAL CONFUSO: CONEXIONES DIFUSAS
El desarrollo neuronal
MAPA FINAL PERFILADO: CONEXIONES DIFUSAS ELIMINADAS
1209
FIBRA MUSCULAR ESTIMULADA REPETIDAMENTE MIENTRAS LA NEURONA PERMANECE EN REPOSO
ESTIMULACIÓN REPETIDA Y SIMULTÁNEA DE LA FIBRA MUSCULAR Y DE LA NEURONA
smapsis fibra muscula
LA SINAPSIS SE DEBILITA
LA SINAPSIS PERMANECE FUERTE
culo esquelético en embriones de vertebrados, donde habitualmente cada célula muscular recibe sinapsis de varias neuronas distintas, aunque al final sólo sea una la que inervará. Para el análisis in vitro de este mecanismo se utilizan cocultivos de motoneuronas y células musculares. Se puede identificar una célula muscular inervada por una única neurona y entonces excitar directamente la cé lula muscular m ediante un goteo constante de acetilcolina mediante una microaguja cercana de su superficie. Así, la sinapsis establecida por la neurona sobre la fibra muscular estará perm anentem ente debilitada, a menos que se estimule eléctricam ente a la neurona de modo que se active en sincronía con el goteo de acetilcolina sobre la fibra muscular; en este caso la sinapsis permanece en bue nas condiciones (Figura 21-114). El debilitamiento, o represión, de la sinapsis re fleja un cam bio en la zona presináptica, que provoca que el extremo del axón li bere m enos neurotransmisor cuando la neurona se activa. Es fácil de demostrar que la represión sináptica depende de la entrada de Ca2+ en el músculo a través de los canales catiónicos asociados con los receptores de acetilcolina. De algún modo, un increm ento brusco de la concentración intracelular de Ca2+ hace que las célula postsináptica rechacen los terminales axónicos que establecen sinap sis sobre su superficie en las inmediaciones, pero los terminales axónicos que acaban de ser activados son inmunes a este rechazo. Estos y otros resultados sugieren una interpretación sencilla de las reglas de com petencia que rigen la eliminación sináptica en el sistema retinotectal. Los axones de regiones distantes de la retina no se activan al mismo tiempo y por tanto com piten entre sí. Cuando un axón se activa, la(s) sinapsis establecida(s) por otro axón sobre una célula diana tectal compartida se debilita(n) hasta el punto en que uno solo de los axones quedará al mando de la célula. Por el con trario, los axones de células vecinas de la retina tienden a activarse sincrónica mente, y por lo tanto no com piten entre sí sino que mantienen las sinapsis de las células tectales compartidas, creando un mapa preciso y ordenado en que las células de la vecindad de la retina se proyectan hacia localizaciones cercanas del tectum (véase Figura 21-113).
La experiencia moldea el patrón de conexiones sinápticas del cerebro89,90 Este mismo “principio de activación” que se aplica a las sinapsis y la actividad neuronal contribuye a organizar nuestro desarrollo cerebral en función de la ex periencia. En el cerebro de un mamífero, los axones que transmiten las entradas de información procedentes de ambos ojos se juntan en la región de la corteza cerebral, donde constituyen dos mapas superpuestos del campo visual externo, un mapa percibido por el ojo derecho y el otro por el izquierdo. La organización y el desarrollo de las proyecciones corticales procedentes de ambos ojos han
121 0
Capítulo 2 1 : Mecanismos celulares del desarrollo
Figura 21-114 Eliminación de las sinapsis y su dependencia del patrón de excitación. En el experimento que aquí ilustramos esquemáticamente, se ha permitido que una neurona y una fibra muscular procedentes de un embrión de pollo establezcan una sinapsis in vitro. Entonces se procede a la estimulación de la fibra muscular mediante la aplicación de gotas de acetilcolina (imitando la estimulación neural); esta técnica se aplica tanto sola como en sincronía con la excitación eléctrica de la neurona. Los resultados ilustran un principio general: cada excitación de una célula diana tiende a causar el rechazo de las sinapsis cuyo axón terminal presináptico ha permanecido inactivo, y a mantener las sinapsis cuyo axón ha estado activo en este momento.
sido estudiadas en profundidad, tanto mediante investigaciones anatómicas com o mediante pruebas fisiológicas en las que se estudia qué tipos de estímulos visuales excitan células determinadas corticales. Estos estudios revelan una sen sibilidad extraordinaria respecto a la experiencia en edades tempranas: si, du rante un se cubre un ojo privándole de estímulos visuales, el ojo tapado pierde sus conexiones sinápticas con la corteza y queda práctica e irre versiblemente ciego. De acuerdo con el principio de activación, ha tenido lugar una com petencia en la que las sinapsis de la corteza visual establecidas por axo nes inactivos se eliminan, mientras que las sinapsis establecidas por axones acti vos se consolidan. De este modo el territorio cortical se asigna a axones portado res de información y no se desperdicia con los axones que carecen de ella. Pero el principio de activación también actúa de formas mucho más sutiles estableciendo las conexiones nerviosas que permiten ver. Por ejemplo, la capaci dad de ver en profundidad -visión en estéreo- depende de la presencia en la cor teza visual de células receptoras de entradas de información procedentes de am bos ojos, transmitiendo información acerca de la misma región del campo visual, pero desde ángulos ligeramente distintos. Las células de conducción binocular nos permiten comparar la visión que obtenemos a través del ojo derecho con la que obtenemos del izquierdo, de modo que seamos capaces de derivar informa ción sobre las distancias en relación a objetos situados a nuestro alrededor. Sin embargo, si se impide que ambos ojos observen la misma escena al mismo tiem po durante un período crítico -p or ejemplo, cubriendo primero un ojo y luego el otro en días alternos o simplemente como consecuencia de un estrabismo infan til- prácticamente no se conservarán células de convección binocular en la corte za y la capacidad de ver en estéreo será casi irrecuperable. Evidentemente, según el principio de activación, las entradas de información procedentes de cada ojo recibidas por una neurona de conducción binocular sólo se mantienen si las dos entradas de información se activan sincrónicamente con frecuencia, como ocu rre cuando los dos ojos observan juntos una misma escena. Ya vimos en el Capítulo 15 que los cambios sinápticos que subyacen a la memoria en muchas partes de cerebro giran en torno al comportamiento de un tipo particular de receptor para el neurotransmisor glutamato -e l receptor NMDA. El flujo de Ca2+ hacia el interior de la célula postsináptica, a través de ca nales abiertos por este receptor, desencadena cambios duraderos en la fuerza de las sinapsis de esta célula, tal como ocurre con la entrada de Ca2+ en una célula muscular vía los canales de receptores de acetilcolina, que durante el desarrollo afecta las sinapsis establecidas por las motoneuronas. Los cambios inducidos por el mecanismo dependiente de NMDA en el cerebro adulto obedecen a principios muy próximos al principio de activación del desarrollo. De hecho, el perfecciona miento y el remodelaje de las conexiones sinápticas que acabamos de describir en los sistemas visuales en desarrollo de mamíferos y anfibios puede bloquearse gracias a un inhibidor del receptor NMDA. En consecuencia, tanto la memoria como los ajustes en el desarrollo pueden depender de los mismos mecanismos fundamentales. La base molecular del mecanismo gracias al cual la experiencia moldea nuestros cerebros es uno de los mayores desafíos que el sistema nervio so presenta a la biología celular.
período crítico,
Resumen
El desarrollo del sistema nervioso consta de tres fases: primero, se generan las célu las nerviosas por medio de divisiones celulares; luego, cuando han dejado de divi dirse, las células emiten axones y dendritas estableciendo sinapsis con células ale jadas, entablando así comunicaciones; por último, el sistema de comunicaciones sinápticas se perfecciona y remodela según el patrón de actividad eléctrica de la red neuronal. Los axones y las dendritas crecen mediante conos de crecimiento que existen en sus extremos, siguiendo vías específicas trazadas por otras células y por la matriz extracelular situadas a lo largo del trayecto. Los conos de crecimiento están guiados El desarrollo neural
1211
por diversas clases de moléculas de adhesión así como por señales intracelulares y factores que inhiben y repelen el crecimiento de los conos. Conos de crecimiento pro cedentes de neuronas distintas, no equivalentes, responden de modo desigual a estas señales, y de esta forma se establece el mapa neuronal -proyecciones ordenadas de formaciones de neuronas, una encima de otra. Cuando los conos de crecimiento han alcanzado sus dianas, se producen dos tipos de ajustes básicos. Primero, muchas de las neuronas que inervan mueren como consecuencia de una competencia por fac tores de supervivencia como el NGF (factor de crecimiento nervioso) secretados por el tejido diana. La muerte celular ajusta la cantidad de inervación al tamaño de la diana. Segundo, las sinapsis individuales retroceden de algunas localizaciones y se refuerzan en otras, generando un patrón de conexiones ordenado con mayor precisión. Este proceso depende de la actividad eléctrica: las sinapsis más activas se refuerzan, y neuronas distintas que contactan con la misma célula diana acos tumbran a mantener sus sinapsis en la diana compartida sólo si ambas se activan sincrónicamente con frecuencia. De este modo la estructura del cerebro puede ajustarse reflejando las conexiones entre sucesos del mundo exterior. Los mecanis mos moleculares que subyacen a estos mecanismos pueden ser similares a los res ponsables de la formación de recuerdos en la vida adulta. Bibliografia General Browder, L.W.; Erickson, C.A.; Jeffery, W.R. Developmental Biology, 3rd ed. Philadelphia: Saunders, 1991. Gilbert, S.F. Biologia del desarrollo. Barcelona: Ediciones Omega, S.A., 1988. Larsen, W.J. Human Embryology. New York: Churchill Li vingstone, 1993. Slack, J.M.W. From Egg to Embryo: Regional Specification in Early Development, 2nd ed. Cambridge, UK: Cam bridge University Press, 1991. Spemann, H. Embryonic Development and Induction. New Haven: Yale University Press, 1938. Reprinted, New York: Garland, 1988. Wilkins, A.S. Genetic Analysis of Animal Development, 2nd ed. New York: Wiley-Liss, 1993. Wolpert, L. The Triumph of the Embryo. Oxford, UK: Oxford University Press, 1991. Citas 1. Bard, J.B.L. Morpohgenesis: The Cellular and Molecular Processes of Developmental Anatomy. Cambridge, UK: Cambridge University Press, 1990. Bray, D. Cell Movements. New York: Garland, 1992. Slack, I.M.W., ed. Early Amphibian Development. J. Embryol. Exp. Morphol. Suppl. 89, 1985. Trinkaus, I.P. Cells into Organs: The Forces That Shape the Embryo, 2nd ed. Englewood Cliffs, NJ: PrenticeHall, 1984. 2. Gerhart, ]., et al. Cortical rotation of the Xenopus egg: consequences for the anteroposterior pattern of embryonic dorsal development. D evelopment 107 (Suppl.):37-51, 1989. Vincent, I.P.; Oster, G.F.; Gerhart, J.C. Kinematics of gray crescent formation in Xenopus eggs: the displa cement of subcortical cytoplasm relative to the egg surface. Dev. Biol. 113:484-500, 1986. 3. Gilbert, S.F. Developmental Biology, 3rd ed., pp. 75-114. Sunderland, MA: Sinauer, 1991.
1 21 2
Capítulo 2 1 : Mecanismos celulares del desarrollo
4.
5.
6.
7.
8.
Kirschner, M.; Newport, J.; Gerhart, J. The timing of early developmental events in Xenopus. Trends Ge net. 1:41-47, 1985. Wilson, E.B. The Cell in Development and Heredity, 3rd ed. with corrections. New York: Macmillan, 1925, 1928. Reprinted, New York: Garland, 1987. Furshpan, E.J.; Potter, D.D. Low-resistance junctions between cells in embryos and tissue culture. Curr. Top. Dev. Biol. 3:95-128, 1968. Guthrie, S.C.; Gilula, N.B. Gap junctional communica tion and development. Trends Neurosci. 12:12-16, 1989. Kalt, M.R. The relationship between cleavage balstocoel formation in Xenopus laevis. II. Electron microscopic observations. J. Embryol. Exp. Morphol. 26:51-66, 1971. Gustafson, T.; Wolpert, L. Cellular movement and con tact in sea urchin morphogenesis. Biol. Rev. 42:442498, 1967. Hardin, I.D.; Cheng, L.Y. The mechanisms and mecha nics of archenteron elongation during sea urchin gastrulation. Dev. Biol. 115:490-501, 1986. Stern, C.D.; Ingham, P.W., eds. Gastrulation. Develop m ent Suppl. 1992. Fristom, D. The cellular basis of epithelial morphogene sis. Tissue Cell 20:645-690, 1988. Gerhart, I.; Keller, R. Region-specific cell activities in amphibian gastrulation. Annu. Rev. Cell Biol. 2:201229, 1986. Spemann, H.; Mangold, H. Induction of embryonic primordia by implantation of organizers from a diffe rent species. Roux’s Archiv. 100:599-638, 1924. (En glish translation in Foundations of Experimental Embryology, 2nd ed. [B.H. Willier, I.M. Oppenhei mer, eds.] New York: Hafner, 1974.) Shi, J.; Keller, R. Cell motility driving mediolateral inter calation in explants of Xenopus laevis. Development 116:901-914, 1992. Spemann, H. Embryonic Development and Induction. New Haven: Yale University Press, 1938. Reprinted, New York: Garland, 1988.
9. Balinsky, B.I. Introducción a la embriología. Barcelona: Ediciones Omega, S.A., 1983. Beddington, R.S.P.; Smith, J.C. Control of vertebrate gastrulation: inducing signals and responding genes. Curr. Opin. Genet. Dev. 3:655-661, 1993. Langman, J. Medical Embryology, 5th ed. Baltimore, Williams & Wilkins, 1985. Romer, A.S.; Parsons, T.S. The Vertebrate Body, 6th ed. Philadelphia: Saunders, 1986. 10. Adams, D.S.; Keller, R.; Koehl, M.A. The mechanics of notochord elongation, straightening and stiffening in the embryo of Xenopus laevis. Development 110:115130, 1990. Yasuo, H.; Satoh, N. Function of vertebrate T gene. Na ture 364:582-583, 1993. 11. Anderson, D.J. The neural crest lineage problem: neuropoiesis? Neuron 3:1-12, 1989. Le Douarin, N. The Neural Crest. Cambridge, UK: Cam bridge University Press, 1982. Marusich, M.F.; Weston, J.A. Development of the neural crest. Curr. Opin. Genet. Dev. 1:221-229, 1991. 12. Morriss-Kay, G.; Tuckett, F. The role of microfilaments in cranial neurulation in rat embryos: effects of short-term exposure to cytochalasin D. /. Embryol. Exp. Morphol. 88:333-348, 1985. Odell, G.M.; Oster, G.; Alberch, P.; Burnside, B. The me chanical basis of morphogenesis. I. Epithelial folding and invagination. Dev. Biol. 85:446-462, 1981. Ruiz i Altaba, A.; Jessell, T.M. Midline cells and the orga nization of the vertebrate neuraxis. Curr. Opin. Ge net. Dev. 3:633-640, 1993. 13. Keynes, R.J.; Stern, C.D. Mechanisms of vertebrate seg mentation. Development 103:413-429, 1988. 14. Hynes, R.O.; Lander, A.D. Contacte and adhesive speci ficities in the associationss, migrations, and targeting of cells and axons. Cell 68:303-322, 1992. Nose, A.; Nagafuchi, A.; Takeichi, M. Expressed recom binant cadherins mediate cell sorting in model sys tems. Cell 54:993-1001, 1988. Takeichi, M. Cadherin cell adhesion receptors as a morp hogenetic regulator. Science 251:1451-1455, 1991. Townes, P.L.; Holtfreter, J. Directed movements and se lective adhesion of embryonic amphibian cells. J. Exp.Zool. 128:53-120, 1955. 15. Chevalier, A.; Kieny, M.; Mauger, A. Limb-somite rela tionship: origin of the limb musculature. J. Embryol. Exp. Morphol. 41:245-258, 1977. Christ, B.; Jacob, H.J.; Jacob, M. Experimental analysis of the origin of the wing musculature in avian em bryos. Anat. Embryol. 150:171-186, 1977. 16. Bronner-Fraser M. Mechanisms of neural crest migra tion. Bioessays 15:221-230, 1993. Bronner-Fraser, M. An antibody to a receptor for fibronectin and laminin perturbs cranial neural crest de velopment in vivo. Dev. Biol. 2:67-74, 1990. Morrison-Graham, K.; Takahashi, Y. Steel factor and ckit receptor: from mutants to a growth-factor system. Bioessays 15:77-83, 1993. 17. Gurdon, J.B. The generation of diversity and pattern in animal development. Cell 68:185-199, 1992. 18. DiBerardino, M.A.; Orr, N.H.; McKinnell, R.G. Feeding tadpoles cloned from Rana erythrocyte nuclei. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:8231-8234, 1986.
Bibliografía
19.
20.
21.
22.
23.
Gurdon, J.B. Transplanted nuclei and cell differentia tion. Sci. Am. 219(6):24-35, 1968. McKinnell, R.G. Cloning-Nuclear Transplantation in Amphibia. Minneapolis: University of Minnesota Press, 1978. Davidson, E.H. Gene Activity in Early Development, 3rd ed., pp. 411-524. Orlando, FL: Academic Press, 1986. Horvitz, H.R.; Herskowitz, I. Mechanisms of asymmetric cell division: two Bs or not two Bs, that is the ques tion. Cell 68:237-255,1992. Rebagliati, M.R.; Weeks, D.L.; Harvey, R.P.; Melton, D.A. Identification and cloning of localized maternal RNAs from Xenopus eggs. Cell 42:769-777, 1985. Wilson, E.B. The Cell in Development and Heredity, 3rd ed., pp. 1035-1121. New York: Macmillan, 1925, 1928. Reprinted, New York: Garland, 1987. Amaya, E.; Musci, T.J.; Kirschner, M.W. Expression of a dominant negative mutant of the FGF receptor dis rupts mesoderm formation in Xenopus embryos. Cell 66:257-270, 1991. Cho, K.W.Y.; Blumberg, B.; Steinbeisser, H.; De Robertis, E.M. Molecular nature of Spemann’s organizer: the role of the Xenopus homeobox gene goosecoid. Cell 67:1111-1120, 1991. Dale, L.; Howes, G.; Price, B.M.J.; Smith, J.C. Bone morphogenetic protein 4: a ventralizing factor in Xe nopus development. Development 115:573-585, 1992. Hemmati-Brivanlou, A.; Melton, D.A. A truncated activin receptor inhibits mesoderm induction and for mation of axial structures in Xenopus embryos. Natu re 359:609-614, 1992. Slack, J.M.W. From Egg to Embryo: Regional Specifica tion in Early Development, 2nd ed. Cambridge, UK: Cambridge University Press, 1991. Smith, W.C.; Harland, R.M. Injected Xwnt-8 RNA acts early in Xenopus embryos to promote formation of a vegetal dorsalizing center. Cell 67:753-765, 1991. Smith, W.C.; Knecht, A.K.; Wu, M.; Harland, R.M. Secre ted noggin protein mimics the Spemann organizer in dorsalizing Xenopus mesoderm. Nature 361:547-549, 1993. Thomsen, G.H.; Melton, D.A. Processed Vgl protein is an axial mesoderm inducer in Xenopus. Cell 74:433441, 1993. Green, J.B.A.; Smith, J.C. Graded changes in the dose of a Xenopus activin A homologue elicit stepwise transi tions in embryonic cell fate. Nature 347:391-394, 1990. Lewis, J.; Slack, J.M.W.; Wolpert, L. Thresholds in deve lopment./. Theor. Biol. 65:579-590, 1977. Wolpert, L. Positional information and pattern forma tion. Curr. Top. Dev. Biol. 6:183-224, 1971. Servetnick, M.; Grainger, R.M. Changes in neural and lens competence in Xenopus ectoderm: evidence for an autonomous developmental timer. Development 112:177-188, 1991. Austin, C.R.; Short, R.V., eds. Embryonic and Fetal De velopment, 2nd ed. Reproduction in Mammls, Ser., Book 2. Cambridge, UK: Cambridge University Press, 1982. Fleming, T.P.; Johnson, M.H. From egg to epithelium. Annu. Rev. Cell Biol. 4:459-485,1988. Kaufman, M.H. The Atlas of Mouse Development. Lon don: Academic Press, 1992.
1213
24. Gardner, R.L. Clonal analysis of early mammalian deve lopment. Philos. Trans. R. Soc. Lond. (Biol.) 312:163178, 1985. Kelly, S.J. Studies of the developmental potential of 4and 8-cell stage mouse blastomeres. J. Exp. Zool. 200:365-376,1977. McLaren, A. Mammalian Chimeras. Cambridge, UK: Cambridge University Press, 1976. Tarkowski, A.K. Experiments on the development of iso lated blastomeres of mouse eggs. Nature 184:12861287, 1959. 25. Capecchi, M.R. The new mouse genetics: altering the genome by gene targeting. Trends Genet. 5:70-76, 1989. Illmensee, K.; Stevens, L.C. Teratomas and chimeras. Sci.Am. 240(4):120-132, 1979. Papaioannou, V.E.; Gardner, R.L.; McBurney, M.W.; Babinet, C.; Evans, M.J. Participation of cultured teratocarcinoma cells in mouse embryogenesis. J. Embryol. Exp. Morphol. 44:93-104,1978. Robertson, E.J. Pluripotential stem cell lines as a route into the mouse germ line. Trends Genet. 2:9-13, 1986. Williams, R.L., et al. Myaloid leukemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells. Nature 336:685-687, 1988. 26. Weiss, P.A. Principles of Development, pp. 289-437. New York: Holt, 1939. 27. Spemann, H. Ober die Determination der ersten Organanlagen des Amphibienembryo I-VI. Arch. Entw. Mech. Org. 32:448-555,1918. 28. Buckingham, M. Making muscle in mammals. Trends Genet. 8:144-149, 1992. Weintraub, H., et al. The myoD gene family: nodal point during specification of the muscle cell lineage. Scien ce 251:761-766,1991. 29. Gurdon, J.B. A community effect in animal develop ment. Nature 336:772-774,1988. Lyon, M.F. Epigenetic inheritance in mammals. Trends Genet. 9:123-128, 1993. Paro, R. Mechanisms of heritable gene repression dur ing development of Drosophila. Curr. Opin. Cell Biol. 5:999-1005,1993. Riggs, A.D.; Pfeiffer, G.P. X-chromosome inactivation and cell memory. Trends Genet. 8:169-174,1992. 30. Held, L.I., Jr. Models for Embryonic Periodicity. Far mington, CT: Karger, 1992. Lewis, J.H.; Wolpert, L. The principle of non-equivalen ce in development./. Theor. Biol. 62:479-490, 1976. Saunders, J.W., Jr.; Gasseling, M.T.; Cairns, J.M. The dif ferentiation of prospective thigh mesoderm grafted beneath the apical ectodermal ridge of the wing bud in the chick embryo. Dev. Biol. 1:281-301,1959. Theories of biological pattern formation. Philos. Trans. R. Soc. Lond. (Biol.) 295:425-617, 1981. Wolpert, L. Pattern formation in biological develop ment. Sci. Am. 239(4): 154-164, 1978. 31. Bohn, H. Tissue interactions in the regenerating cockro ach leg. In Insect Development (P.A. Lawrence, ed.), Royal Entomological Society of London Symposium No. 8, pp. 170-185. Oxford, UK: Blackwell, 1976. Bryant, P.J. The polar coordinate model goes molecular. Science 259:471-472,1993.
121 4
Capítulo 2 1 : Mecanismos celulares del desarrollo
32. 33.
34.
35.
36.
37.
38.
39.
Bryant, P.J.; Bryant, S.V.; French, V. Biological regenera tion and pattern formation. Sci. Am. 237(1):66-81, 1977. Bryant, P.J.; Simpson, P. Intrinsic and extrinsic control of growth in developing organs. Q. Rev. Biol. 59:387415,1984. Lewis, J. Simpler rules for epimorphic regeneration: the polar-coordinate model without polar coordinates. J. Theor. Biol. 88:371-392,1981. Wolfram, S. Cellular automata as models of complexity. Nature 311:419-424,1984. Sulston, J., et al. The C. elegans genome sequencing pro ject: a beginning. Nature 356:37-41, 1992. Wood, W.B., et al. The nematode Caenorhabditis ele gans. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory, 1988. Kenyon, C. Cell lineage and the control of Caenorhabdi tis elegans development. Philos. Trans. R. Soc. Lond. (Biol.) 312:21-38,1985. Sulston, J.E.; Horvitz, H.R. Post-embryonic cell lineage of the nematode, Caenorhabditis elegans. Dev. Biol. 56:110-156, 1977. Sulston, J.E.; Schierenberg, E.; White, J.G.; Thompson, J.N. The embryonic cell lineage of the nematode Cae norhabditis elegans. Dev. Biol. 100:64-119, 1983. Schnabel, R. Early determinative events in Caenorhab ditis elegans. Curr. Opin. Genet. Dev. 1:179-184,1991. Sternberg, P.W.; Horvitz, H.R. The genetic control of cell lineage during nematode development. Annu. Rev. Genet. 18:489-524,1984. Ferguson, E.L.; Sternberg, P.W.; Horvitz, H.R. A genetic pathway for the specification of the vulval cell linea ges of Caenorhabditis elegans. Nature 326:259-267, 1987. Sulston, J.E.; White, J.G. Regulation and cell autonomy during postembryonic development of Caenorhabdi tis elegans. Dev. Biol. 78:577-597,1980. Han, M.; Golden, A.; Han, Y.; Sternberg, P.W. C. elegans lin-45 raf gene participates in let-60 ras-stimulated vulval differentiation. Nature 363:133-140,1993. Hill, R.J.; Sternberg, P.W. The gene lin-3 encodes an in ductive signal for vulval development in C. elegans. Nature 358:470-476, 1992. Sternberg, P.W.; Horvitz, H.R. Signal transduction du ring C. elegans vulval induction. Trends Genet. 7:366371,1991. Ambros, V.; Horvitz, H.R. The lin-14 locus of Caeno rhabditis elegans controls the time of expression of specific postembryonic developmental events. Genes Dev. 1:398-414,1987. Chalfie, M.; Horvitz, H.R.; Sulston, J.E. Mutations that lead to reiterations in the cell lineages of C. elegans. Cell 24:59-69, 1981. Ruvkun, G.; Wightman, B.; Biirglin, T.; Arasu, P. Domi nant gain-of-function mutations that lead to misregulation of the C. elegans heterochronic gene lin-14, and the evolutionary implications of dominant mu tations in pattern-formation genes. Development (Suppl. 1) 1991:47-54. Cooke, J. Properties of the primary organisation field in the embryo of Xenopus laevis. IV. Pattern formation and regulation following early inhibition of mitosis. J. Embryol. Exp. Morphol. 30:49-62,1973.
Edgar, L.G.; McGhee, J.D. DNA synthesis and the con trol of embryonic gene expression in C. elegans. Cell 53:589-599, 1988. Harris, W.A.; Hartenstein, V. Neuronal determination without cell division in Xenopus embryos. Neuron 6:499-515,1991. Rollins, M.B.; Andrews, M.T. Morphogenesis and regu lated gene activity are independent of DNA replica tion in Xenopus embryos. Development 112:559-569, 1991. Satoh, N. Towards a molecular understandig of differntiation mechanisms in Ascidian embryos. Bioessays 7:51-56,1987. 40. Ellis, R.E., Yuan, J.V.; Horvitz, H.R. Mechanisms and functions of cell death. Annu. Rev. Cell Biol. 7:663698,1991. Vaux, D.L.; Weisman, I.L.; Kim, S.K. Prevention of pro grammed cell death in Caenorhabditis elegans by hu man bcl-2. Science 258:1955-1957,1992. 41. Lawrence, P.A. The Making of a Fly: The Genetics of Animal Design. Oxford, UK: Blackwell Scientific, 1992. 42. Martinez-Arias, A.; Lawrence, P.A. Parasegments and compartments in the Drosophila embryo. Nature 313:639-642, 1985. 43. Campos-Ortega, JA.; Hartenstein, V. The Embryonic De velopment of Drosophila melanogaster. Berlin: Sprin ger, 1985. Foe, V.E.; Alberts, B.M. Studies of nuclear and cytoplas mic behavior during the five mitotic cycles that pre cede gastrulation in Drosophila embryogenesis. /. ~ Cell Sci. 61:31-70,1983. Leptin, M.; Grünewald, B. Cell shape changes during gastrulation in Drosophila. Development 110:73-84, 1990. Technau, G.M. A single cell approach to problems of cell lineage and commitment during embyogenesis of Drosophila melanogaster. Development 100:1-12,1987. 44. St. Johnston, D.; Nüsslein-Volhard, C. The origin of pat tern and polarity in the Drosophila embryo. Cell 68:201-219,1992. 45. Anderson, K.V.; Schneider, D.S.; Morisato, D.; Ferguson, E.L. Extracellular morphogens in Drosophila dorsalventral patterning. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 58,1993. 46. Ferguson, E.L.; Anderson, K.V. Decapentaplegic acts as a morpohgen to organize dorsal-ventral pattern in the Drosophila embryo. Cell 7:451-461,1992. Govind, S.; Steward, R. Coming to grips with cactus. Curr. Biol. 3:351-354,1993. Klingler, M.; Erdelyi, M.; Szabad, J.; Nüsslein-Volhard, C. Function of torso in determining the terminal anlagen of the Drosophila embryo. Nature 335:275-277, 1988. Roth, S., Stein, D.; Nüsslein-Volhard, C. A gradient of nuclear localization of the dorsal protein determines dorsovental pattern in the Drosophila embryo. Cell 59:1189-1202,1989. Rushlow, C.A.; Han, K.; Manley, J.L.; Levine, M. The gra ded distribution of the dorsal morphogen is initiated by selective nuclear transpot in Drosophila. Cell 59:1165-1177,1989. 47. Ephrusi, A.; Lehmmann, R. Induction of germ cell for mation by oskar. Nature 358:387-392,1992.
Bibliografía
Gilbert, S.F. Developmental Biology, 3rd ed., pp. 273281. Sunderland, MA: Sinauer, 1991. Wilson, J.E.; Macdonald, P.M. Formation of germ cells in Drosophila. Curr. Opin. Genet. Dev. 3:562-565, 1993. 48. Driever, W.; Nüsselin-Volhard, C. A gradient of bicoid protein in Drosophila embryos. Cell 54:83-93, 1988. Driever, W.; Nüsslein-Volhard, C. The bicoid protein de termines position in the Drosophila embryo in a concentration-dependent manner. Cell 54:95-104,1988. Lawrence, P.A. Background to bicoid. Cell 54:1-2, 1988. Nüsslein-Volhard, C.; Forhnhöfer, H.G.; Lehmann, R. Determination of anteroposterior polarity in Drosop hila. Science 238:1675-1681,1987. 49. Nüsslein-Volhard, C.; Wieschaus, E. Mutations affecting segment number and polarity in Drosophila. Nature 287:795-801,1980. 50. Akam, M. The molecular basis for metameric pattern in the Drosophila embryo. Development 101:1-22, 1987. Ingham, P.W. The molecular genetics of embryonic pat tern formation in Drosophila. Nature 335:25-34, 1988. Scott, M.P.; O’Farrell, P.H. Spatial programming of gene expression in early Drosophila embryogenesis. Annu. Rev. Cell Biol. 2:49-80,1986. 51. Hafen, E.; Kuroiwa, A.; Gehring, W.J. Spatial distribution of transcripts from the segmentation gene fushi tarazu during Drosophila embryonic development. Cell 37:833-841,1984. Hoch, M.; Jäckle, H. Transcriptional regulation and spa tial patterning in Drosophila. Curr. Opin. Genet. Dev. 3:566-573, 1993. Hülskamp, M.; Tautz, D. Gap genes and gradients-the logic behind the gaps. Bioessays 13:261-268,1991. 52. Small, S.; Levine, M. The initiation of pair-rule stripes in the Drosophila blastoderm. Curr. Opin. Genet. Dev. 1:255-260,1991. 53. Ingham, P.W.; Martinez-Arias, A. Boundaries and fields in early embryos. Cell 68:221-235,1992. Kornberg, T.B.; Tabata, T. Segmentation of the Droso phila embryos. Curr. Opin. Genet. Dev. 3:585-593, 1993. Struhl, G.; Basler, K. Organizing activity of wingless pro tein in Drosophila. Cell 72:527-540,1993. 54. Lewis, E.B. A gene complex controlling segmentation in Drosophila. Nature 276:565-570,1978. 55. Beeman, R.W.; Stuart, J.J.; Brown, S.J.; Denell, R.E. Structure and function of the homeotic gene com plex (HOM-C) in the beetle, Tribolium castaneum. Bioessays 14:439-444,1993. Morata, G.; Lawrence, P.A. Homeotic genes, compart ments and cell determination in Drosophila. Nature 265:211-216,1977. 56. Akam, M.E. Segments, lineage boundaries and the do mains of expression of homeotic genes. Philos. Trans. R. Soc. Lond. (Biol.) 312:179-187,1985. Harding, K.; Wedeen, C.; McGinnis, W.; Levine, M. Spa tially regulated expression of homeotic genes in Dro sophila. Science 229:1236-1242,1985. 57. Akam, M. The molecular basis of metameric pattern in the Drosophila embryo. Development 101:1-22,1987.
1215
58.
59. 60.
61.
62.
63.
64.
65.
McGinnis, W., et al. A conserved DNA sequence in homeotic genes of the Drosophila Antennapedia and Bithorax complexes. Nature 308:428-433,1984. Bender, W., et al. Molecular genetics of the bithorax complex in Drosophila melanogaster. Science 221:2329, 1983. Bergson, C.; McGinnis, W. An autoregulatory enhancer element of the Drosophila homeotic gene Deformed. EMBO J. 9:4287-4297,1990. Paro, R. Mechanisms of heritable gene repression dur ing development of Drosophila. Curr. Opin. Cell Biol. 5:999-1005, 1993. Peifer, M.; Karch, F.; Bender, W. The bithorax complex: control of segmental identity. Genes Dev. 1:891-898, 1987. McGinnis, W.; Krumlauf, R. Homeobox genes and axial patterning. Cell 68:283-302, 1992. Ashburner, M.; Wright, T.F., eds. The Genetics and Bio logy of Drosophila, Vol. 2C. London: Academic Press, 1978. Hadorn, W. Transdetermination in cells. Sci. Am. 219(5):110-120, 1968. Nöthiger, R. Clonal analysis in imaginal discs. In Insect Development (P.A. Lawrence, ed.), Royal Entomolo gical Society of London Symposium No. 8, pp. 109117. Oxford, UK: Blackwell, 1976. Stern, C. Genetic Mosaics and Other Essays. Cambridge: Harvard University Press, 1968. Struhl, G. Genes controlling segment specification in the Drosophila thorax. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:7380-7384, 1982. Couso, J.P.; Bate, M.; Martinez-Arias, A. A wingless-dependent polar coordinate system in Drosophila ima ginal discs. Science 259:484-489, 1993. García-Bellido, A.; Lawrence, P.A.; Morata, G. Compart ments in animal development. Sci. Am. 241(1):102111, 1979. Simpson, P.; Morata, G. Differential mitotic rates and patterns of growth in compartments in the Drosophi la wing. Dev. Biol. 85:299-308,1981. Campuzano, S.; Modolell, J. Patterning of the Drosophi la nervous system: the achaete-scute complex. Trends Genet. 8:202-208, 1992. Ghysen, A.; Dambly-Chaudiére, C. Genesis of the Dro sophila peripheral nervous system. Trends. Genet. 5:251-255, 1989. Ghysen, A.; Dambly-Chaudiére, C.; Jan, L.Y.; Jan, Y.N. Cell interactions and gene interactions in peripheral neurogenesis. Genes Dev. 7:723-733, 1993. Hartenstein, V.; Posakony, J.W. A dual function of the Notch gene in Drosophila sensillum development. Dev. Biol. 142:13-30, 1990. Heitzler, P.; Simpson, P. The choice of cell fate in the epidermis of Drosophila. Cell 64:1083-1092, 1991. Sternberg, P.W. Falling off the knife edge. Curr. Biol. 3:763-765, 1993. McGinnis, W.; Garber, R.L.; Wirz, J.; Kuroiwa, A.; Gehrin, W.J. A homologous potein-coding sequence in Dro sophila homeotic genes and its conservation in other metazoans. Cell 37:403-408,1984. Müller, M.M.; Carrasco, A.E.; De Robertis, E.M. A homeobox-containing gene expressed during oogenesis in Xenopus. Cell 39:157-162, 1984.
1216
Capítulo 2 1 : Mecanismos celulares del desarrollo
66. Biirglin, T.R.; Ruvkun, G. The Caenorhabditis elegans homeobox gene cluster. Curr. Opin. Genet. Dev.
67.
68.
69.
70.
71.
72.
73.
74.
75.
3:615-620, 1993. De Robertis, E.M.; Oliver, G.; Wright, C.V.E. Homeobox genes and the vertebrate body plan. Sci. Am. 263(l):26-33, 1990. Wilkinson, D.G.; Krumlauff, R. Molecular approaches to the segmentation of the hindbrain. Trends Neurosci. 13:335-339, 1990. Holland, P. Homeobox genes in vertebrate evolution. Bioessays 14:267-273,1992. Krumlauf, R. Mouse Hox genetic functions. Curr. Opin. Genet. Dev. 3:621-625, 1993. Izpisúa-Belmonte, J.-C.; Tickle, C.; Dollé, P.; Wolpert, L.; Duboule, D. Expression of the homeobox Hox-4 ge nes and the specification of position in chick wing development. Nature 350:585-589, 1991. Morgan, B.A.; Tabin, C.J. The role of homeobox genes in limb development. Curr. Opin. Genet. Dev. 3:668-674, 1993. Cutter, E.G. Plant Anatomy, 2nd ed., Part 1, Cells and Tissues; Part 2, Organs. London: Arnold, 1978. Esau, K. Anatomy of Seed Plants, 2nd ed. New York: Wi ley, 1977. Walbot, V. On the life strategies of plants and animals. Trends Genet. 1:165-169,1985. Chasan, R.; Walbot, V. Mechanisms of plant reproduc tion: questions and approaches. Plant Cell 5:11391146, 1993. Johri, B.M. Embryology of Angiosperms. Berlin: Sprin ger-Verlag, 1984. West, M.A.L.; Harada, J.J. Embryogenesis in higher plants: an overview. Plant Cell 5:1161-1169,1993. Harper, J.L., ed. Growth and Form of Modular Organ isms. London: Royal Society, 1986. (En esta colección hay varios artículos importantes.) Meinke, D.W. (guest ed.). Plant developmental genetics. Seminars Dev. Biol. 4:1-89,1993. Gunning, B.E.S. Microtubules and cytomorhogensis in a developing organ: the root primordium of Azolla pinnata. In Cytomorphogenesis in Plants (O. Kiermayer, ed.), pp. 301-325. New York: Springer, 1981. Lloyd, C.W., ed. The Cytoskeletal Basis of Plant Growth and Form. New York: Academic Press, 1991. Becraft, P.W.; Freeling, M. Cell interactions in plants. Curr. Opin. Genet. Dev. 2:571-575, 1992. Lyndon, R.F. Plant Development: The Cellular Basis. London: Unwin Hyman, 1990. Steeves, T.A.; Sussex, I.M. Patterns in Plant Develop ment, 2nd ed. New York: Cambridge University Press, 1989. Rothenberg, M.; Ecker, J.R. Mutant analysis as an expe rimental approach towards understanding plant hor mone action. Seminars Dev. Biol. 4:3-13, 1993. Jürgens, G. Pattern formation in the flowering plant embryo. Curr. Opin. Genet. Dev. 2:567-570, 1992. Koncz, C.; Chua, N.-H.; Schell, J., eds. Methods in Arabidopsis Research. River Edge, NJ: World Scientific Pu blishing, 1992. Mayer, U.; Torres Ruiz, R.A.; Berleth, T.; Miséra, S.; Jür gens, G. Mutations affecting body organization in the Arabidopsis embryo. Nature 353:402-407, 1991. Meyerowitz, E.M. Arabidopsis, a useful weed. Cell 56: 263-269, 1989.
76. Coen, E.S.; Carpenter, R. The metamorphosis of flowers. Plant Cell 5:1175-1181,1993. Coen, E.S.; Meyerowitz, E.M. The war of the whorls: ge netic interactions controlling flower development. Nature 353:31-37,1991. 77. The Brain. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 55, 1990. Brown, M.C.; Hopkins, W.G.; Keynes, R.J. Essentials of Neural Development. Cambridge, UK: Cambridge University Press, 1990. Hall, Z.W. An Introduction to Molecular Neurobiology. Sunderland, MA: Sinauer, 1992. Jacobson, M. Developmental Neurobiology, 3rd ed. New York: Plenum Press, 1991. Nicholls, J.G.; Martin, A.R.; Wallace, B.G. From Neuron to Brain, 3rd ed. Sunderland, MA: Sinauer, 1992. Purves, D.; Lichtman, J.W. Principles of Neural Develop ment. Sunderland, MA: Sinauer, 1985. 78. Williams, R.W.; Herrup, K. The control of neuron num ber. Annu. Rev. Neurosci. 11:423-453, 1988. 79. Caviness, V.S. Neocortical histogenesis in normal and reeler mice: a developmental study based on [3H] thymidine autoradiography. Dev. Brain Res. 4:293-302, 1982. Rakic, P. Mode of cell migration to the superficial layers of the fetal monkey neocortex. /. Comp. Neurol. 145:61-84,1972. 80. Goslin, K.; Banker, G. Experimental observations on the development of polarity by hippocampal neurons in culture./. Cell Biol. 108:1507-1516, 1989. Harrison, R.G. The outgrowth of the nerve fiber as a mode of protoplasmic movement. /. Exp. Zool. 9:787846, 1910. Mitchison, T.; Kirschner, M. Cytoskeletal dynamics and nerve growth. Neuron 1:761-772,1988. 81. Chang, S.; Rathjen, F.G.; Raper, J.A. Extension of neun tes on axons is impaired by antibodies against speci fic neural cell adhesion molecules. /. Cell Biol. 104:355-362, 1987. Dodd, J.; Jessell, T.M. Axon guidance and the patterning of neuronal projections in vertebrates. Science 242:692-699, 1988. Neugebauer, K.M.; Tomaselli, K.J.; Lilien, J.; Reichardt, L.F. N-cadherin, NCAM and integrins promote reti nal neurite outgrowth on astrocytes in vitro. J. Cell Biol. 107:1177-1187,1988. Rutishauser, U. Adhesion molecules of the nervous sys tem. Curr. Opin. Cell Biol. 3:709-715, 1993. 82. Campenot, R.B. Local control of neurite development by nerve growth factor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:4516-4519, 1977. 83. Luo, Y.; Raible, D.; Raper, J.A. Collapsin: a protein in brain that induces the collapse and paralysis of neu ronal growth cones. Cell 75:217-227, 1993. Schwab, M.E.; Kapfhammer, J.P.; Bandtlow, C.E. Inhibi tors of neurite outgrowth. Annu. Rev. Neurosci. 16:565-595,1993. 84. Patel, N.; Poo, M.-M. Orientation of neurite growth by extracellular electric fields. /. Neurosci. 2:483-496, 1982.
Bibliografía
85.
86.
87.
88.
89.
90.
Tessier-Lavigne, M.; Placzek, M. Target attraction: are developing axons guided by chemotropism? Trends Neurosci. 15:303-310,1991. Wilson, S.W. Clues from clueless. (Axonal guidance mu tants in Drosophila.) Curr. Biol. 3:536-539, 1992. Ebendal, T.; Olson, L.; Seiger, A.; Hedlund, K.-O. Nerve growth factors in the rat iris. Nature 286:25-28, 1980. Greene, L.A. The importance of both early and delayed responses in the biological actions of nerve growth factor. Trends Neurosci. 7:91-94,1984. Thoenen, H. The changing scene of neurotrophic fac tors. Trends Neurosci. 14:165-170, 1991. Sanes, J.R. Topographic maps and molecular gradients. Curr. Opin. Neurobiol. 3:67-74,1993. Sperry, R.W. Chemoaffinity in the orderly growth of ner ve fiber patterns and connections. Proc. Natl. Acad. Sci.. USA 50:703-710,1963. Cox, E.C.; Muller, B.; Bonhoeffer, F. Axonal guidance in the chick visual system: posterior tectal membranes induce collapse of growth cones from temporal reti na. Neuron 4:31-37, 1990. Tessier-Lavigne, M. Down the slippery slope. Curr. Biol. 2:353-355, 1992. Brown, M.C.; Jansen, J.K.S.; Van Essen, D. Polyneuronal innervation of skeletal muscle in new-born rats and its elimination during maturation./. Physiol. 261:387422, 1976. Jennings, C.G.B.; Burden, S.J. Development of the neu romuscular synapse. Curr. Opin. Neurobiol. 3:75-81, 1976. Lo, Y.-J.; Poo, M.-M. Activity-dependent synaptic com petition in vitro: heterosynaptic suppression of deve loping synapsess. Science 254:1019-1022, 1991. Shatz, C.J. The developing brain. Sci. Am. 267(3) :60-67, 1992. Constantine-Paton, M.; Cline, H.T.; Debski, E. Patterened activity, synaptic convergence, and the NMDA receptor in developing visual pathways. Annu. Rev. Neurosci. 13:129-154,1990. Goodman, C.S.; Shatz, C.J. Developmental mechanisms that generate precise patterns of neuronal connecti vity. Cell 72/Neuron 10 (Suppl.):77-98,1993. Hockfield, S.; Kalb, R.G. Activity-dependent structural changes during neuronal development. Curr. Opin. Neurobiol. 3:87-92, 1993. Barlow, H. Visual experience and cortical development. Nature 258:199-204,1975. Cline, H.T.; Debski, E.A.; Constantine-Paton, M. Nmethyl-D-aspartate receptor antagonist desegregates eye-specific stripes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 4342-4345, 1987. Hubei, D.H.; Wiesel, T.N. Binocular interaction in stri ate cortex of kittens reared with artificial squint. /. Neurophysiol. 28:1041-1059, 1965. Hubei, D.H.; Wiesel, T.N.; Le Vay, S. Plasticity of ocular dominance columns in monkey striate cortex. Philos. Trans. R. Soc. Lond. (Biol.) 278:377-409,1977. Stryker, M.P.; Harris, W.A. Binocular impulse blockade prevents the formation of ocular dominance col umns in cat visual cortex. /. Neurosci. 6:2117-2133, 1986.
1217
Consecuencias del recambio tisular, vistas en una sección histológica de un hueso compacto. Los pequeños segmentos negros alargados son los espacios ocupados por células maduras del hueso (osteocitos) incluidas en la matriz del hueso. Las bandas alternantes brillantes y oscuras son capas de la matriz que contienen colágena orientada (visibles con la ayuda de luz polarizada). El patrón proviene del proceso de continua erosión y reconstrucción, según el cual el hueso antiguo es destruido por los osteoclastos (células semejantes a macrófagos) y se deposita hueso nuevo, en capas, por los osteoblastos (precursores de los osteocitos).
Células diferenciadas y conservación de los tejidos
En el transcurso de unos cuantos días o semanas, un único óvulo fecundado da lugar a un complejo organismo pluricelular formado por células diferenciadas dispuestas según un patrón preciso. Por regla general, el patrón del cuerpo de un animal se establece a pequeña escala y luego crece. Durante el desarrollo em brionario, los diferentes tipos celulares quedan determinados cada uno en su lu gar apropiado. En el período posterior de crecimiento, las células proliferan, pero salvo algunas excepciones, sus características específicas permanecen más o menos fijas. El organismo puede continuar creciendo durante toda la vida, como sucede en la mayoría de crustáceos y de peces, o puede dejar de crecer al alcanzar un cierto tamaño, com o sucede en las aves y en los mamíferos. Pero in cluso cuando se detiene el crecimiento, en muchas especies la proliferación ce lular continúa. Así, el organismo adulto de un vertebrado puede equipararse a un ecosistem a estable en el que una generación de individuos (células en este caso) sucede a la anterior sin que se altere la organización del sistema en su con junto. Todavía se desconoce de qué forma se alcanza el equilibrio exacto entre proliferación y muerte celular. En este capítulo se discute cómo nacen, viven y mueren las células en los te jidos y de qué forma se mantiene la organización de dichos tejidos. Nos centra remos en los vertebrados superiores y al considerar el problema del m anteni miento y de la renovación de los tejidos, vamos a intentar ilustrar un poco la notable variedad de estructuras, funciones e historias vitales que se encuentran entre sus tipos celulares especializados.
Mantenimiento del estado diferenciado 1 Los tejidos del cuerpo se diferencian notablemente en muchos aspectos, pero to dos ellos tienen ciertas necesidades básicas, satisfechas por lo general, por distin tos tipos celulares, tal como se ilustra para la piel en la Figura 22- 1. Todos ellos necesitan una fuerza mecánica, que en muchas ocasiones está proporcionada por un trama de sostén formada por la matriz extracelular, segregada principal mente por los fibroblastos. Por otro lado, todos los tejidos necesitan un aporte sanguíneo para recibir nutrientes y eliminar productos residuales, y por ello es tán surcados por vasos sanguíneos limitados por células endoteliales. De forma análoga, la mayoría de los tejidos están inervados y poseen axones de células ner viosas, junto con las células de Schwann que los rodean. Con frecuencia también existen macrófagos que eliminan las células muertas y la matriz superflua, así
1219
(A)
epidermis tejido conjuntivo laxo de la dermis nervios sensoriales
tejido conjuntivo denso de la dermis
vaso sanguíneo
tejido conjuntivo adiposo de la hipoderm is
epidermis
tejido conjuntivo denso de la dermis
tejido conjuntivo laxo de la dermis
0,5 mm
queratinocitos célula pigm entaria (m elanocito) célula con función m acrofágica (célula de Langerhans)
fibroblasto linfocito m acròfago
fibra elástica
fibra de colágena
célula endotelial de un capilar
como linfocitos y otros leucocitos que combaten las infecciones. Pueden existir melanocitos que proporcionan una pigmentación protectora o decorativa. La ma yoría de estos tipos celulares, auxiliares de la función específica del tejido, se ori ginan fuera de él e invaden el tejido en el transcurso del desarrollo (células endoteliales, axones de células nerviosas, células de Schwann y melanocitos ) o de forma continua durante toda la vida (macrófagos y otros glóbulos blancos). Este complejo sistema de sostén es necesario para mantener las principales células es pecializadas del tejido: las células contráctiles del músculo, las células secretoras de las glándulas o las células hematopoyéticas de la médula ósea, por ejemplo. Por ello, casi todos los tejidos son una com pleja com binación de muchos ti pos celulares que deben continuar siendo diferentes unos de otros y al mismo tiempo coexistir en un mismo ambiente. Por otro lado, la organización del con junto debe preservarse a pesar de que en la mayoría de tejidos las células mue ren continuam ente y tienen que ser reemplazadas. El mantenimiento o conser vación de la forma y de la función del tejido es en gran parte posible gracias a dos propiedades fundamentales de las células. Gracias a la memoria celular (véa se el Capítulo 21) las células diferenciadas mantienen de forma autónoma su ca rácter distinto y lo transmiten a su progenie. Al mismo tiempo cada tipo de célula especializada detecta continuam ente las características de su entorno y regula su proliferación y sus propiedades en función de las circunstancias; de hecho, la elevada supervivencia de la mayor parte de células depende de las señales de otras células. Los mecanismos celulares responsables de la memoria celular se han discutido en el Capítulo 9, mientras que las formas de respuesta de las célu las a las señales ambientales se consideran en el Capítulo 15. En esta sección pre liminar sobre el comportamiento de las células en los tejidos hacemos una breve revisión de ciertas evidencias sobre la estabilidad y la heredabilidad del estado diferenciado y consideramos hasta qué punto este estado puede ser modificado mediante influencias ambientales.
1220
Capítulo 2 2 : Células diferenciadas y conservación de los tejidos
Figura 22-1 Piel de mamífero. (A) Esquemas que muestran la arquitectura celular de la piel gruesa. (B) Fotografía de una sección transversal de la planta del pie humano, teñida con hematoxilinaeosina. La piel puede considerarse como un gran órgano constituido por dos tipos principales de tejidos: tejido epitelial (la ep id erm is) en la parte externa y tejido conjuntivo, que constituye la capa de la dermis (a partir de la cual se fabrica la piel) y la capa más profunda de tejido adiposo: la h ipod erm is. Cada tejido se halla constituido por varios tipos celulares. La dermis y la hipodermis se hallan altamente irrigadas por vasos sanguíneos y nervios. Algunas fibras nerviosas penetran incluso en la epidermis.
Figura 22-2 Desarrollo del ojo de los vertebrados. La retina se desarrolla a partir de la vesícula óptica, una evaginación epitelial de la región del cerebro anterior del tubo neural. (A) El epitelio neural entra en contacto con el ectodermo que recubre el exterior de la cabeza. (B) Este contacto induce la invaginación del ectodermo para formar una lente. Al mismo tiempo, la porción externa de la vesícula óptica se invagina, reduciéndose la luz vesicular a una interfase o entre dos capas que constituyen una estructura en forma de copa. (C) La capa de la copa óptica adosada al cristalino se diferencia en la retina neural, que contiene las células fotorreceptoras y las neuronas que transmiten los estímulos visuales al cerebro (véase Figura 22-6). La otra capa se diferencia en el ep itelio p ig m en tario de la retina. Sus células se hallan provistas de numerosos gránulos de melanina y el conjunto forma una cámara oscura para el sistema fotorreceptor (que sirve para reducir la cantidad de luz reflejada, de forma similar a una cubierta de pintura negra en el interior de una cámara fotográfica).
La mayoría de las células diferenciadas recuerdan su carácter esencial incluso en un nuevo entorno2 Diversos experimentos sobre cultivos celulares demuestran que a pesar de que las células se separen de su entorno habitual, tanto las propias células como su progenie mantienen intacta su programación original. Consideremos, por ejem plo, las células epiteliales que forman la capa pigmentada de la retina (Figura 22-2). Debido a que dichas células manifiestan su carácter especializado produ ciendo unos gránulos de melanina de color pardo oscuro, resulta fácil estudiar su grado de diferenciación. Cuando estas células de la retina de embrión de po llo se aíslan y se mantienen en cultivo, proliferan formando clones. Células aisla das tomadas de estos clones dan lugar a subclones de células epiteliales pigmen tadas similares. De esta forma se puede m antener el estado diferenciado a lo largo de más de 50 generaciones celulares. Sin embargo, el comportamiento de las células no es independiente de su entorno. En ciertos medios de cultivo o en condiciones de hacinamiento extre mo las células quizás puedan sobrevivir, pero no sintetizan pigmento, o muy poco. Pero incluso si no pueden expresar su carácter diferenciado, las células permanecen determinadas como células pigmentarias: cuando se las expone a condiciones de cultivo más favorables, empiezan nuevamente a sintetizar pig mento. Existe una o dos excepciones conocidas a esta regla. En algunas especies de vertebrados, bajo determinadas condiciones, las células pigmentarias de la retina se transdiferencian en células del cristalino o en células de la retina neu ral, pero no se ha encontrado ninguna manipulación de dichas condiciones que pueda ser la causa de este tipo de diferenciación, en lugar de diferenciarse por ejemplo en células sanguíneas, células hepáticas o en células cardíacas. De for ma parecida, la mayoría de los tipos celulares especializados, incluyendo las cé lulas sanguíneas, las células hepáticas y las células cardíacas, mantienen en cul tivo su carácter esencial. En el organismo, al igual que en los cultivos, la mayor parte de las células di ferenciadas se comportan como si su carácter básico estuviera determinado de forma irreversible por su proceso de desarrollo. Las células epidérmicas, por ejemplo, permanecen como tales en la mayor parte de ambientes distintos. Si se prepara una suspensión de células epidérmicas a partir de la piel de la cola de rata y se inyecta bajo la cápsula del riñón, las células crecen formando quistes constituidos por una auténtica epidermis, similar a la de la superficie corporal.
tejido conjuntivo prosencéfalo (epitelio del tubo neural) luz de la vesícula óptica
ectoderm o de la cabeza
copa óptica
(C)
epitelio pigm entario de la retina epitelio neural de la retina
cornea en desarrollo
vesícula del cristalino
El estado diferenciado se puede modular por el entorno celular1,3 Aunque no se producen transformaciones radicales, las características de mu chas células diferenciadas pueden estar fuertemente influidas por el entorno. Los posibles reajustes pueden clasificarse en su mayoría como modulaciones del
Mantenimiento del estado diferenciado
1221
estado diferenciado, es decir, cambios reversibles entre fenotipos celulares estre chamente relacionados. Las células hepáticas, por ejemplo, ajustan su síntesis de enzimas específicas (mediante cambios en los niveles de mRNA) en función de las concentraciones ambientales de la hormona esteroidea hidrocortisona, y la producción de proteínas de la leche por las células de la glándula mamaria puede ponerse en marcha o detenerse en función de los cambios de la matriz extracelular. Los fibroblastos y otras células afines -la familia de son un caso especial. Estas células son extraordinariamente adaptables y pueden presentar varias interconversiones: los fibroblastos, por ejemplo, pue den transformarse, aparentem ente de forma reversible, en condrocitos. Estas transformaciones tienen su importancia en la reparación de heridas y fracturas óseas así como en otros procesos patológicos. Se discutirán más adelante, en este capítulo. Sin embargo, estas conversiones de un tipo celular diferenciado en otro suelen darse de forma muy restringida: la célula transformada continúa perteneciendo a la familia de células del tejido conjuntivo. En muchos tejidos adultos normales tienen lugar importantes, aunque restringidos, cambios del es tado diferenciado, en los que las células recién diferenciadas se generan a partir de -precursoras que no manifiestan el carácter maduro diferen ciado pero se especializan en dividirse y producir una progenie que sí lo m ani festará. Distintos tipos de células madre quedan determinadas para la produc ción de distintos tipos de células diferenciadas y no son intercambiables. Sin embargo, la mayoría de los tejidos adultos están formados por un núm e ro diferente de líneas celulares determinadas de forma irreversible. El número y las relaciones espaciales de estos com ponentes deben mantenerse funcional mente por mecanism os que no requieran que un tipo de célula diferenciada se transforme en otro, sino que dependan de complejas interacciones entre distin tos tipos celulares.
células del tejido conjun
tivo-
células madre
Resumen
La mayoría de las células diferenciadas de los tejidos adultos mantienen su especialización, incluso cuando se trasladan a un ambiente nuevo. Generalmente los estados de diferenciación son estables y no intercambiables, pero algunas células especializadas, incluso, pueden alterar algunas de sus propiedades en respuesta a determinados requerimientos ambientales. Además, en muchos tejidos adultos se generan deforma continua nuevas células diferenciadas a partir de células madre que se muestran indiferenciadas. Las transformaciones celulares más relevantes tienen lugar en la familia de células del tejido conjuntivo que incluye a los fibro blastos y los condrocitos. Tejidos con células permanentes 4 No todas las poblaciones celulares del cuerpo están sujetas a renovación. Algu nos tipos celulares se han generado en cantidad suficiente en el embrión y se conservan durante toda la vida adulta; parece que nunca se dividen y, si son des truidos, no se pueden reemplazar. Casi todas las células nerviosas son perma nentes en este sentido. Tam bién lo son otros tipos de células, como -e n los ma m íferos- las fibras musculares del corazón, las células ciliadas del conducto auditivo externo (Figura 22-3) y las células del cristalino del ojo. Aunque todas estas células tienen una vida extremadamente larga y viven necesariam ente en medios protegidos, son diferentes en otros aspectos y resulta difícil encontrar una razón general para que tengan que ser permanentes e irremplazables. Para las células del músculo cardíaco y las células ciliadas del conducto auditivo resulta absolutamente difícil encontrar una razón. En el caso de las células nerviosas parece probable que un recambio celular masivo en el adulto resultase desventajoso en líneas generales, ya que en el adulto sería difícil restablecer el com plejo y preciso patrón de conexiones nerviosas que se ha
122 2
Capítulo 2 2 : Células diferenciadas y conservación de los tejidos
células de sostén
células ciliadas externas
mem brana tectorial
estereocilios células ciliadas internas
m em brana basal
fibras nerviosas
Las células del centro del cristalino del ojo de un adulto son residuos del embrión5 Muy pocas estructuras del cuerpo de un adulto están formadas por las mismas moléculas que fueron producidas en el embrión. El cristalino del ojo es una de las pocas estructuras cuyas células no sólo se han conservado, sino que m antie nen su contenido. El cristalino se forma a partir del ectodermo, en el lugar en que las vesículas ópticas en desarrollo entran en contacto con él: en este punto el ectodermo se engruesa, se invagina y, finalmente se estrangula y separa en forma de la vesícu la del cristalino (Figura 22-2). El cristalino se origina por lo tanto como una capa de células, formada a partir de un epitelio, de un grosor de una sola célula y que se dispone rodeando una cavidad central. Pronto, las células de la parte poste rior de la vesícula del cristalino (orientadas hacia la retina), sufren una notable transformación. Dichas células sintetizan y se llenan de cristalinas, las proteínas características del cristalino. Durante el proceso se alargan enormemente dife renciándose a fibras del cristalino (Figura 22-4). Con el tiempo, sus núcleos se desintegran y cesa la síntesis proteica. De esta manera, la parte del epitelio de la vesícula del cristalino dirigida hacia la retina se expande formando un grueso cuerpo refractario, constituido por largas y numerosas células sin vida, íntima mente unidas entre sí (Figura 22-5). La cavidad central de la vesícula se oblitera y en la región frontal del epitelio de la vesícula del cristalino -la parte dirigida hacia el exterior- permanece formada por una fina capa de células cuboidales. El crecimiento del cristalino depende de la proliferación de las células frontales, que empuja a algunas de las células de esta región alrededor del borde del crista lino, hacia la parte posterior (véanse Figuras 22-4 y 22-5A). A medida que las cé lulas se desplazan hacia atrás, dejan de dividirse, aumentan su velocidad de sín tesis de cristalinas y se diferencian en fibras cristalinas. Las fibras adicionales del cristalino continúan formándose de esta manera durante toda la vida, aunque a una velocidad decreciente. Los tipos de cristalinas de las primeras generaciones de fibras del cristalino son diferentes de los de las generaciones posteriores, del mismo modo que las
Tejidos con células permanentes
5 [im Figura 22-3 Células ciliadas del oído. (A) Esquema de la sección transversal del aparato auditivo (órgano de Corti) en el oído interno de un mamífero, donde se observan las células ciliadas auditivas situadas en una com pleja estructura de células de sostén y rodeadas por una masa de matriz extracelular (denominada m embrana tectorial). (B) Electronmicrografía de barrido en la que se observa la superficie apical de algunas célula ciliadas del oído, con su característica ordenación en hileras de los microvilli gigantes (denominados estereocilios). Las células ciliadas auditivas actúan como transmisores, generando una señal eléctrica com o respuesta a las vibraciones sonoras que llegan al órgano de Corti y provocan la inclinación de los estereocilios. En los mamíferos, las células ciliadas auditivas que se producen en el embrión poseen un único ciclo vital: si se destruyen por una enfermedad o por ruido excesivamente fuerte, no se regeneran y se produce sordera permanente. (B, de R.G. Kessel y R.H. Kardon, Tissues and Organs: A Text-Atías of Scanning Electron Microscopy. San Francisco: Freeman, 1979. Copyright © 1979 W.H. Freeman and Company.)
1223
hemoglobinas de los eritrocitos fetales son distintas de las de los eritrocitos adultos. Sin embargo, los eritrocitos se renuevan pero las fibras envejecidas del cristalino no lo hacen. Por ello, en el centro del cristalino adulto se encuentran fibras que fueron producidas en la fase embrionaria y que todavía presentan los tipos de cristalinas características de este período temprano. Las diferencias de índice de refracción, entre los tipos embrionarios precoces de cristalinas y las producidas más tarde ayudan a evitar al cristalino del ojo las aberraciones ópti cas que existen en las lentes simples construidas con un medio homogéneo como es el vidrio.
La mayoría de las células permanentes renuevan sus componentes: las células fotorreceptoras de la retina6 Existen pocas células tan inmutables como las fibras del cristalino. Por regla ge neral, incluso aquellas células que persisten durante toda la vida sin dividirse su fren una renovación de sus constituyentes. Así, las células del músculo cardíaco y las células nerviosas, aunque no se dividen, son metabólicamente activas y capa ces no sólo de sintetizar RNA y proteínas, sino también de alterar su tamaño y su estructura durante la vida adulta. Las células del músculo cardíaco, por ejemplo, renuevan cada una o dos semanas su contenido de moléculas proteicas y tienden a ajustar el equilibrio entre síntesis y degradación de proteínas así como a aumen tar de tamaño a medida que la carga del corazón aumenta -por ejemplo debido a un incremento sostenido de la presión sanguínea. Las células nerviosas también renuevan su contenido proteico de forma continua; además, muchas células ner viosas pueden regenerar axones y dendritas que hayan perdido. El proceso de renovación de los constituyentes celulares queda ilustrado de manera particularmente clara en las células nerviosas altamente especializadas que forman los fotorreceptores de la retina. La retina neural (véase Figura 22-2) consta de varias capas de células organizadas de una forma aparentemente complicada. Las neuronas que transmiten las señales visuales al cerebro (deno minadas célu las g an glion ares d e la retina) están situadas más cerca del mundo exterior, de modo que la luz, focalizada por el cristalino, debe pasar a través de
(B)
vesícula em brionaria del cristalino
células del epitelio anterior del cristali fibra prim aria del cristalino
crista lin o adulto (no a escala)
fibra del cristali recién form ada centro del cristalino adulto, form ado por las fibras prim arias del cristalino originadas en el em brión; los núcleos ya no son visibles lám ina basal Figura 22-4 D esarrollo del cristalino del ojo hum ano. La proliferación sólo
se presenta en las células del epitelio anterior del cristalino, que se desplazan hacia la región posterior y se diferencian en fibras del cristalino.
l________ I
20 um
Figura 22-5 Estructura del cristalino maduro. (A) Micrografía óptica de una
lá m in a b a s a l ( d e s p r e n d id a )
1224
100 p m
parte del cristalino donde se observa la unión entre la fina capa del epitelio anterior que cubre la parte frontal del cristalino y las fibras diferenciadas de la parte posterior. (B) Electronmicrografía de barrido de una región del cristalino. Las fibras del cristalino se hallan densamente apiladas, como tablones en un almacén de madera. Cada fibra es una única célula muerta y alargada que puede alcanzar hasta 12 mm de longitud. (A, por cortesía de Peter Gould; B, de R.G. Kessel y R.H. Kardon, Tissues and Organs: A Text-Atlas of Scanning Electron Microscopy. San Francisco: Freeman, 1979. Copyright © 1979 W.H. Freeman and Company.)
Capítulo 2 2 : Células diferenciadas y conservación de los tejidos
ellas para alcanzar las células fotorreceptoras. Los fotorreceptores, que se clasifi can en conos o bastones según su forma, se disponen con sus extremos fotorre ceptores, o segmentos externos, parcialmente hundidos en el epitelio pigmenta rio (Figura 22-6). Los conos y bastones presentan diferentes complejos proteicos fotosensibles con pigmento visual: los bastones son especialmente sensibles a niveles bajos de luz, mientras que los conos (de los que existen tres tipos distin tos, cada uno con respuestas espectrales diferentes) detectan el color y los deta lles más finos. Parece que el segmento externo de un fotorreceptor es un cilio modificado con una ordenación característica de microtúbulos similar a la de los cilios en la zona donde dicho segmento externo se une al resto de la célula (Figura 22-7). El resto del segmento externo está casi completamente ocupado por un denso apilamiento de membranas en el que se hallan los complejos foto sensibles; la luz absorbida en dicha zona produce una respuesta eléctrica, tal como se discutió en el Capítulo 15. En el extremo opuesto las células fotorrecep toras forman sinapsis con las interneuronas retinianas, que propagan la señal hasta las células ganglionares de la retina (véase Figura 22-6). Los fotorreceptores son células permanentes incapaces de dividirse. Pero las moléculas proteicas fotosensibles no son permanentes. Existe una renova ción continua, que se puede poner de manifiesto mediante la inyección de ami-
Figura 22-6 Esquema de la estructura de la retina. La estimulación de los
células -------epiteliales pigm entadas - i '
cono fotorreceptor bastón fotorreceptor
í* \*
fitt h
******
f
i
i
m
í
»
fotorreceptores por la luz se transmite por las interneuronas hacia las células ganglionares, que envían la señal al cerebro. Los espacios entre las neuronas y los fotorreceptores en la retina neuronal se hallan ocupados por una población de células especializadas de sostén, que no aparecen en la figura. (Modificado de J.E. Dowling y B.B. Boycott, Proc. R. Soc. Lond. [B io l] 166:80-111,1966.)
>¥
/
v
interneuronas
célula ganglionar (neurona)
t
#
i
t
Tejidos con células permanentes
# t
luz incidente
#
axones nerviosos hacia el cerebro
i 1225
Figura 22-7 Esquema de un bastón fotorreceptor. (A) Esquema.
discos de m em brana fotorreceptora
segm ento externo
m em brana plasmática cilio de conexión segm ento interno
útleo
noácidos radiactivos, los cuales se incorporan a dichas moléculas. En los basto nes, (aunque curiosamente no los conos) esta renovación se organiza en una se cuencia ordenada de producción, que puede ser analizada siguiendo el trayecto en el interior de la células de una serie de moléculas proteicas marcadas radiac tivamente después de un breve pulso de aminoácido radiactivo (Figura 22-8). Las proteínas marcadas radiactivamente pueden detectarse gradualmente en su desplazamiento desde el com plejo de Golgi en el segmento interno de la célula hasta la base de la pila de m embranas que ocupa el segmento externo. Desde allí se desplazan gradualmente hacia el extremo opuesto a medida que se incorpora material nuevo en la base de la pila. Finalmente (en la rata, después de unos 10 días) una vez alcanzado el extremo del segmento externo, las proteínas m arca das y las m embranas a las que se han incorporado, son fagocitadas (absorbidas y digeridas) por las células del epitelio pigmentario.
Resumen
Algunas células de los mamíferos -incluyendo las células nerviosas, las células del músculo cardíaco, las células receptoras sensoriales de luz y sonido y las fibras del cristalino- persisten a lo largo de toda la vida sin dividirse y sin ser substitui1226
Capítulo 2 2 : Células diferenciadas y conservación de los tejidos
Realmente existen unos 1000 discos fotorreceptores en el segmento externo. (B) Electronmicrografía de parte de un fotorreceptor de tipo cono, mostrando la base del segmento externo y el cilio modificado que lo conecta al segmento interno. (A, de T.L. Lentz, Cell Fine Structure. Philadelphia: Saunders, 1971; B, de M.J. Hogan, J.A. Alvarado, y J.E. Weddell, Histology of the Human Eye: An Atlas and Textbook. Philadelphia: Saunders, 1971.)
Figura 22 -8 Renovación de la
célula epitelial pigmentada
proteína de membrana en un bastón.
fXíD
Se administra un pulso de leucina 3H y mediante autorradiografía se sigue su paso a través de la célula. Los pu n tos rojos indican zonas de radiactividad. El método revela únicam ente la leucina que se ha incorporado a las proteínas; el resto se elimina mediante lavado durante la preparación del tejido. La leucina incorporada se observa primero concentrada cerca del com plejo de Golgi (1), y desde allí pasa a la base del segmento externo a un disco recién sintetizado de membrana fotorreceptora (2). Los nuevos discos se forman a una velocidad de tres o cuatro por hora (en un mamífero), desplazando a los discos viejos hacia el epitelio pigmentado (3-5).
das. En las fibras maduras del cristalino, los núcleos celulares han degenerado y la síntesis proteica se ha detenido de modo que la parte central del cristalino adulto está formada por proteínas cristalinas producidas durante la vida embrionaria. En la mayor parte del resto de células permanentes, la actividad de biosíntesis con tinúa y existe una renovación constante de componentes celulares. En los bastones retinianos, por ejemplo, se sintetizan nuevas capas de membrana fotorreceptora cerca del núcleo, que se desplazan constantemente hacia el exterior, hasta que son absorbidas y digeridas por las células del epitelio pigmentario. Renovación por bipartición simple7 La mayoría de poblaciones celulares diferenciadas de un vertebrado no son per manentes: las células mueren continuam ente y son reemplazadas. En el adulto, las nuevas células diferenciadas pueden generarse de dos maneras distintas: ( 1) pueden formarse mediante la bipartición simple de las células diferenciadas existentes, que se dividen dando pares de células hijas del mismo tipo, o (2) pue den formarse, tal como se explicará con detalle más tarde en este capítulo, a par tir de células madre relativamente indiferenciadas, mediante un proceso que im plica un cam bio en el fenotipo celular. Las velocidades de renovación celular varían de un tejido a otro. El tiempo de renovación puede ser de menos de una semana, como sucede en el revesti miento epitelial del intestino delgado (que se renueva mediante células madre) hasta más de un año, tal como sucede en el páncreas (que se renueva por bipar tición simple). Muchos tejidos, cuyas velocidades normales de renovación son muy bajas, se pueden estimular para que produzcan nuevas células a mayor ve locidad cuando existe necesidad de ello. En esta sección trataremos dos ejemplos de poblaciones celulares que se re nuevan por bipartición simple -las células hepáticas y las células endoteliales.
Las funciones del hígado como interfase entre el tracto digestivo y la sangre7,8 La digestión es un proceso complejo. Las células que revisten el tracto digestivo segregan a la luz intestinal diversas substancias, como ácido clorhídrico y enzi
Renovación por bipartición simple
1227
Figura 22-9 Algunas de las células especializadas que se encuentran en el revestimiento epitelial del intestino. A menudo las posiciones vecinas en la capa epitelial están ocupadas por células de tipos distintos (véase Figura 22-16B). (Según T.L. Lenz, Cell Fine Structure. Philadelphia: Saunders, 1971.)
la célula oxíntica del estóm ago segrega HCI
la célula con ribete en cepillo del intestino delgado (enterocito) absorbe nutrientes
mas digestivas, para hidrolizar las moléculas de los alimentos hasta nutrientes sencillos. Las células absorben estos nutrientes desde la luz intestinal y luego los liberan a la sangre para que puedan ser utilizados por las restantes células del cuerpo. Todas estas actividades están reguladas de acuerdo con la composición del alimento digerido y con los niveles circulantes de metabolitos. El complejo conjunto de funciones se realiza mediante una distribución del trabajo: algunas de las células están especializadas en la secreción de ácido clorhídrico, otras en la secreción de enzimas, otras en la absorción de nutrientes, otras en la produc ción de hormonas peptídicas que, como la gastrina, regulan las actividades di gestivas y m etabólicas, etc. (Figura 22-9). Algunos de estos tipos celulares se ha llan situados en la pared intestinal; otros se hallan agrupados en grandes glándulas que se com unican en el intestino y que en el embrión se forman a par tir del epitelio intestinal.
1228
Capítulo 2 2 : Células diferenciadas y conservación de los tejidos
bilis hacia el intestino conducto biliar fibroblasto canalículo biliar hepatocito célula de Kupffer sinusoide
célula endotelial
(A)
1___________I 100
50 nm
Figura 22-10 La estructura del hígado. (A) Electronmicrografía de barrido de un fragmento de hígado mostrando capas irregulares de hepatocitos y numerosos pequeños capilares, o sinusoides, por donde circula la sangre. Los conductos mayores son vasos que distribuyen y recogen la sangre que fluye a través de los sinusoides. (B) Estructura microscópica del hígado (muy esquematizada). Los hepatocitos están separados de la corriente sanguínea por una única capa de células endoteliales con células intercaladas de carácter macrofágico, las célu las d e Kupffer. Pequeños poros en la capa endotelial permiten el intercambio de moléculas y de pequeñas partículas entre los hepatocitos y la corriente sanguínea protegiendo a los hepatocitos de los embates que les ocasionaría el contacto directo con las células sanguíneas en circulación. Además de intercambiar materiales con la sangre, los hepatocitos forman un sistema de diminutos canalículos biliares en los que segregan la bilis, que pasa finalmente al intestino a través de los conductos biliares. La estructura real es menos regular que la que sugiere este esquema. (A, de R.G. Kessel y R.H. Kardon, Tissues and Organs: A Text-Atlas of Scanning Electron Microscopy. San Francisco: Freeman, 1979. Copyright © 1979 W.H. Freeman and Company.)
El hígado es la mayor de estas glándulas. En el embrión, se desarrolla como una región en la que discurre una vena principal junto a la pared del tubo intes tinal primitivo, de forma que en el órgano adulto mantiene una relación extraor dinariamente interrelacionada con la sangre. Las células del hígado que derivan del primitivo epitelio intestinal -lo s hepatocitos- están dispuestos en hileras ra diales orientadas hacia unos espacios llenos de sangre denominados sinusoides (Figura 22-10A). La sangre está separada de la superficie de los hepatocitos por una única capa de células endoteliales aplanadas que reviste los lados de cada hilera de hepatocitos (Figura 22-10B). Esta estructura facilita la función principal del hígado, que se basa en el intercambio de metabolitos entre los hepatocitos y la sangre. El hígado es el lugar principal en el que los nutrientes que se han absorbido del intestino y luego se han transferido a la sangre son procesados para su utili zación por las otras células del cuerpo; la mayor parte del aporte sanguíneo que recibe proviene directamente del tracto intestinal (por la vía de la vena porta). Los hepatocitos son responsables de la síntesis, degradación y almacenamiento de un gran número de substancias que juegan un papel fundamental en el m eta bolismo de todos los carbohidratos y lípidos del cuerpo; a su vez segregan la m a yoría de las proteínas que se encuentran en el plasma sanguíneo. Al mismo tiempo, los hepatocitos permanecen conectados a la luz intestinal mediante un sistema de conductos diminutos (o canalículos) y conductos mayores (véase Fi-
Renovación por bipartición simple
1229
gura 22-10B) a través de los cuales el hígado segrega hacia el intestino un agente emulsionante, la bilis, que interviene en la absorción de las grasas. A diferencia de lo que sucede con el resto del tracto digestivo, parece que en la población de hepatocitos existe muy poca distribución de funciones: cada hepatocito parece capaz de realizar la m isma amplia gama de funciones metabólicas y secretoras. Los hepatocitos tienen un estilo de vida diferente del de las células que re visten la luz del intestino. Estas últimas, expuestas al contenido abrasivo y corro sivo del intestino, no pueden vivir largo tiempo por lo que han de ser rápida mente reemplazadas mediante una aportación continua de nuevas células. Los hepatocitos, alejados del contacto directo del contenido intestinal, viven mucho más tiempo y se renuevan a una velocidad baja, pero controlada exactamente.
La pérdida de células hepáticas estimula la proliferación de células hepáticas9 Incluso en los tejidos que presentan una renovación lenta de las células, un pe queño pero persistente desequilibrio entre la velocidad de producción y la velo cidad de pérdida de células conduciría al desastre. Si cada semana se dividieran un 2 % de las células hepáticas de un ser humano y sólo se perdieran un 1% de ellas el hígado crecería hasta sobrepasar, en 8 años, el peso de todo el re<
123 0
Capítulo 2 2 : Células diferenciadas y conservación de los tejidos
resultado de un tratamiento con fenobarbital, por ejemplo) la muerte celular se incrementará automáticamente para volver a rebajar el numero de células. To davía se desconoce de qué forma se mantienen los niveles de los factores de su pervivencia.
La regeneración requiere el crecimiento coordinado de los constituyentes de los tejidos10 Como ocurre en los demás órganos, el hígado es una com binación de tipos celu lares. Además de los hepatocitos y de las células endoteliales que revisten sus si nusoides, en el hígado existen macrófagos especializados (células de Kupffer), que engloban a las partículas que circulan por la corriente sanguínea y fagocitan los eritrocitos viejos, y un reducido número de fibroblastos, que proporcionan una tenue trama de sostén de tejido conjuntivo (véase Figura 22-10B). Todos es tos tipos celulares son capaces de dividirse. Para que se produzca una regenera ción óptima, su proliferación ha de estar coordinada de forma adecuada. La importancia de la regeneración equilibrada de los diferentes tipos celula res se demuestra precisamente cuando se presenta una situación de desequili brio. Si los hepatocitos, por ejemplo, se intoxican repetidamente con tetracloruro de carbono o con alcohol, a intervalos tan frecuentes que no puedan recuperarse por completo entre los ataques, los fibroblastos aprovechan la situa ción y el hígado queda obstruido de forma irreversible por tejido conjuntivo, de jando poco espacio para que los hepatocitos crezcan incluso después de la des aparición de los agentes tóxicos. Esta afección denominada cirrosis es frecuente en los alcohólicos crónicos. De forma similar, a menudo la regeneración del músculo esquelético altamente lesionado se ve seriamente obstaculizada por un crecim iento demasiado rápido de su tejido conjuntivo, de modo que el tejido ci catricial substituye a las fibras musculares contráctiles. Sin embargo, para que se lleguen a producir estos desequilibrios es necesario que se produzca una altera ción importante del tejido; en circunstancias normales de renovación, actúan unos mecanismos todavía muy poco conocidos que regulan la proliferación y la supervivencia celular a la vez que aseguran la permanencia de una proporción adecuada de los distintos tipos celulares.
Las células endoteliales revisten todos los vasos sanguíneos11 En contraposición con los ejemplos anteriores de comportamiento mal coordi nado de los fibroblastos, las células endoteliales que constituyen el revestimien to de los vasos sanguíneos tienen una notable capacidad para adaptar su núme-
Figura 22-11 Corte transversal de una arteria de pequeño calibre. (A) Esquema de un fragmento de la pared. Las células endoteliales, aunque poco conspicuas, son el com ponente fundamental de la pared. Compárese con el capilar de la Figura 22-12. (B) Electronmicrografía de barrido de una sección transversal de una arteriola (arteria muy pequeña), mostrando el revestimiento interno de células endoteliales y la capa circundante de músculo liso y de tejido conjuntivo colágeno. Una ligera contracción del músculo liso ha hecho que el revestimiento endotelial del vaso quedara plegado. A causa de la fijación, el revestimiento endotelial se ha arrugado separándose de la pared muscular y dejando un pequeño espacio entre ambos. (B, de R.G. Kessel y R.H. Kardon, Tissues and Organs: A Text-Atlas of Scanning Electron Microscopy. San Francisco: Freeman, 1979. Copyright © 1979 W.H. Freem an and Company.)
revestimiento endotelial
músculo liso
colágena
tejido conjuntivo laxo m úsculo liso lámina elástica (fibras de elastina) revestimiento endotelial
lámina basal
(A)
I_____ I
100 |am
Renovación por bipartición simple
1231
Figura 22-12 Electronmicrografía de un fino capilar, en sección transversal. La pared está formada por una única célula endotelial, rodeada por una lámina basal. Obsérvense las pequeñas vesículas “transcitósicas” que según una teoría posibilitan el transporte hacia dentro y hacia fuera en estos tipos de capilares: los materiales solubles son absorbidos por las vesículas mediante endocitosis en la superficie luminal de la célula y expulsados por exocitosis en la superficie externa, o viceversa. (De R.P. Bolender,/. Cell Biol. 61:269-287, 1974. Reproducido con permiso de copyright de the Rockefeller University Press.)
núcleo de la célula endotelial
lám ina basal
luz del capilar
vesículas transcitósicas
2 pm
ro y su disposición a las exigencias locales. Casi todos los tejidos dependen del suministro de sangre, y el aporte sanguíneo depende de las células endoteliales. Estas células crean un sistema de sostén vital adaptable, propagándose hasta las más recónditas regiones del cuerpo. Si las células endoteliales no se extendieran y remodelaran la red de los vasos sanguíneos, el crecimiento y la reparación de los tejidos resultaría imposible. Los vasos sanguíneos de mayor calibre son las arterias y las venas, que poseen una gruesa y resistente pared de tejido conjuntivo y de musculatura lisa (Figura 22-11 A). La pared interna está revestida por una única capa, extraordinariamen te fina, de células endoteliales separadas de las capas externas por una lámina basal. La cantidad de tejido conjuntivo y de musculatura lisa de la pared del vaso varía según su diámetro y función, aunque el revestimiento epitelial siempre se halla presente (Figura 22-1 IB). En las ramas más finas del árbol vascular -lo s ca pilares y los sinusoides- las paredes están formadas exclusivamente por una sola capa de células endoteliales y por una lámina basal (Figura 22-12). De esta for ma, las células endoteliales revisten todo el sistema vascular, desde el corazón hasta los más finos capilares, y controlan el paso de materiales -a sí como el tránsito de glóbulos blancos- hacia el interior y el exterior de la corriente sanguí nea. El estudio embrionario revela además que las arterias y las venas se desa rrollan a partir de pequeños vasos sencillos formados únicamente por células endoteliales y por una lámina basal: el tejido conjuntivo y la musculatura lisa se forman más adelante, cuando se necesitan, bajo la influencia de señales produ cidas por las células endoteliales.
Las nuevas células endoteliales se generan por bipartición simple de células endoteliales ya existentes12 En todo el sistema vascular del adulto, las células endoteliales conservan la ca pacidad de división celular y de movimiento. Si, por ejemplo, se destruye una re gión de la pared de la aorta y se disgregan las células endoteliales, las células en doteliales más próximas proliferan y migran hacía dicha zona recubriendo la
123 2
Capítulo 2 2 : Células diferenciadas y conservación de los tejidos
superficie expuesta. Las células endoteliales recién formadas consiguen recubrir incluso la superficie interna de los tubos de plástico que se utilizan en cirugía para reemplazar las zonas destruidas de los vasos sanguíneos. La proliferación de las células endoteliales se puede demostrar utilizando timidina 3H para m arcar las células que están sintetizando DNA. En los vasos normales la proporción de células endoteliales que queda marcada es especial mente elevada en las zonas de ramificación de las arterias, donde la turbulencia y el desgaste consiguiente de las células endoteliales parece estimular la prolifera ción celular. Sin embargo, las células endoteliales se regeneran generalmente con bastante lentitud, con unas vidas medias de meses o incluso años. Las células endoteliales no sólo reparan el revestimiento de los vasos san guíneos existentes sino que tam bién generan nuevos vasos sanguíneos. Deben hacerlo en los tejidos embrionarios para adaptarse al crecimiento, en los tejidos adultos para resistir los ciclos recurrentes de remodelación y reconstrucción y en los tejidos adultos lesionados para soportar el proceso de reparación.
Los capilares se forman mediante proliferación13,14 Los vasos siempre se originan como capilares que surgen de pequeños vasos ya existentes. Este proceso de angiogénesis se produce como respuesta a señales específicas. Se puede observar claramente en los conejos, practicando un pe queño agujero en la oreja y fijando fragmentos de cubreobjetos de vidrio a am bos lados, generando una fina cámara de paredes transparentes hacia la que pueden crecer las células que rodean la herida. La angiogénesis también se pue de observar en estructuras de por sí transparentes, como la córnea del ojo. Los productos irritantes aplicados a la córnea inducen el crecimiento de nuevos va sos sanguíneos, a partir del borde de tejido que rodea la córnea, el cual se halla muy vascularizado, alcanzando el centro de la córnea que normalmente no pre senta vascularización. Así, la córnea queda vascularizada a través de una inva sión de células endoteliales en el grueso tejido colágeno de la córnea. Observaciones de este tipo revelan que las células endoteliales que forma rán un nuevo capilar crecen desde la pared de un capilar o pequeña vénula em i tiendo largas expansiones o pseudópodos (Figura 22-13). Inicialmente, las célu las forman un brote macizo que luego se vacía hasta formar un tubo. Este proceso continúa hasta que el brote encuentra otro capilar, con el que se conec ta, permitiendo así la circulación de la sangre. Experimentos sobre cultivos de muestran que células endoteliales colocadas en un medio que contenga los fac tores de crecimiento adecuados forman espontáneamente tubos capilares incluso si se hallan aisladas de otros tipos de células. El primer signo de la for mación del capilar en cultivo es la aparición en una célula de una vacuola alar gada que al principio está rodeada por el citoplasma (Figura 22-14A). Las células contiguas desarrollan vacuolas similares y, al final, distribuyen sus vacuolas de tal modo que las vacuolas quedan ordenadas de forma continua de una célula a
glóbulo rojo
célula endotelial
Figura 22-13 Angiogénesis. Un nuevo capilar sanguíneo se forma como un brote a partir de una célula endotelial de la pared de un pequeño vaso ya existente. Este esquema se basa en las observaciones realizadas en las células de la cola transparente de un renacuajo vivo. (Según C.C. Speidel, A m .J. Anat. 52:1 -7 9 , 1933.)
luz del capilar
esta célula endotelial generará una nueva rama capilar
una prolongación de tipo pseudópodo guía el desarrollo del nuevo capilar a medida que crece hacia el tejido conjuntivo circundante
Renovación por bipartición simple
la célula endotelial se divide
se form an vacuolas en las células las vacuolas se unen contiguas generando la luz del capilar en crecim iento el proceso se repite a medida que el nuevo capilar se alarga
1233
Figura 22-14 Formación in vitro de un capilar. Las células endoteliales en
100 kJtn
otra, formando un capilar (Figura 22-14B). El proceso está estrechamente rela cionado con la naturaleza de la matriz extracelular en el entorno de las células: la formación de los capilares es activada por los componentes de la lámina basal, com o la laminina, que puede ser segregada por las células endoteliales. Los capilares que se desarrollan en un cultivo puro de células endoteliales no contie nen sangre y no circula nada por su interior, lo cual indica que no son necesarios ni el flujo ni la presión sanguíneos para la formación de una red capilar.
La angiogénesis está controlada por factores de crecimiento liberados por los tejidos próximos14 En los animales vivos las células endoteliales forman nuevos capilares en donde son necesarios. Es bien conocido que cuando las células, en los tejidos, quedan privadas de oxígeno, liberan factores angiogénicos que inducen el crecimiento capilar. Probablem ente por este motivo, casi todas las células de los vertebrados se sitúan a m enos de 50 pm de un capilar. De forma similar, después de produ cirse una herida, en la proximidad del tejido lesionado se estimula un desenca denamiento del crecim iento de nuevos capilares (Figura 22-15). Substancias irri tantes locales o infecciones tam bién pueden producir una proliferación de nuevos capilares, la mayoría de los cuales entran en regresión y desaparecen cuando remite la inflamación. La angiogénesis tam bién es importante en el crecimiento tumoral. El creci miento de un tumor sólido se halla limitado por el flujo sanguíneo: si no fuera invadido por capilares, un tumor dependería de la difusión de nutrientes proce dentes de la periferia y no podría alcanzar más que un diámetro de unos cuantos milímetros. Para que se pueda producir un crecimiento mayor, el tumor ha de inducir la formación de una red capilar que invada la masa tumoral. Un peque-
control
1234
I---------------1
100 |jm
60 horas después de la lesión
Capítulo 2 2 : Células diferenciadas y conservación de los tejidos
lOOgm
cultivo desarrollan vacuolas internas que se unen entre sí dando lugar a una red de tubos capilares. Las fotografías (A) y (B) muestran los estadios sucesivos del proceso; la flecha en (A) indica la formación de una vacuola en una célula endotelial. Los cultivos se han realizado a partir de pequeños agregados de dos a cuatro células procedentes de reducidos segmentos del capilar. Estas células se establecen en una placa de cultivo recubierta de colágena y forman una pequeña colonia aplanada que aumenta de tamaño a medida que las células proliferan. La colonia se extiende por toda la placa y, al cabo de unos 20 días, en las regiones centrales se forman tubos capilares. Una vez iniciada la formación de los tubos, las ramificaciones no tardan en aparecer y a los 5-10 días ya resulta visible una extensa red de tubos, tal como se observa en la Figura (B). (De J. Folkman y C. Haudenschild, N ature 288:551-556,1980. © Macmillan Journals Ltd.)
Figura 22-15 Formación de nuevos capilares como respuesta a una lesión. Electronmicrografía de barrido de moldes del sistema de vasos sanguíneos en el borde de la córnea, donde se observa la reacción a una lesión. Los moldes se realizan mediante una inyección de resina en el interior de los vasos, dejando que dicha resina polimerice; con ello se pone de manifiesto la forma de la luz del capilar com plementaria al contorno de las células. Sesenta horas después de la lesión, numeroso capilares empiezan a brotar de nuevo hacia el área lesionada, que se halla junto a la parte superior de la figura. El crecim iento orientado de los vasos refleja una respuesta quimiotáctica de las células endoteliales a un factor angiogénico liberado en la zona de la herida. (Cortesía de Peter C. Burger.)
ño fragmento de un tumor de este tipo implantado en la córnea provoca un rá pido crecimiento de vasos sanguíneos desde el borde vascularizado de la córnea hasta la zona del implante, y la velocidad de crecimiento del tumor aumentará bruscam ente en el momento en que los vasos lleguen a él. En todos estos casos las células endoteliales invasoras han de responder a una señal producida por el tejido que necesita aporte sanguíneo. La respuesta de las células endoteliales consta por lo menos de cuatro elementos. Primero, las células han abrirse paso a través de la lámina basal que rodea a los vasos ya exis tentes; durante la angiogénesis las células endoteliales segregan proteasas, que les permiten la digestión de distintos materiales a su paso por la lámina basal del capilar o vénula originaria. Segundo, las células endoteliales han de desplazarse hacia el origen de la señal. Tercero, tienen que proliferar. Cuarto, tienen que for mar conductos. En algunos casos, algunos de los componentes de esta respuesta com pleja pueden conseguirse en ausencia de los restantes. Sin embargo, tam bién se han identificado factores de crecimiento que pueden manifestar conjun tamente los cuatro com ponentes de la respuesta angiogénica. El más importan te de estos factores es una proteína conocida como factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF, de Vascular Endothelial Growth Factor -relacionado en parte con el factor de crecimiento derivado de las plaquetas [PDGF, de Platelet-Derived Growth Factor]). Este factor actúa de forma selectiva en las células endoteliales estimulando la angiogénesis en circunstancias muy diferentes, y parece ser el agente responsable de la elevada irrigación sanguínea que presen tan algunos tumores. Otros factores de crecimiento, incluyendo algunos m iem bros de la familia del factor de crecimiento de los fibroblastos, también estimulan la angiogénesis pero al mismo tiempo influyen en otros tipos celulares próximos a las células endoteliales. Estos tipos de factores angiogénicos se liberan durante la reparación , inflamación y crecimiento de los tejidos; son fabricados por dis tintos tipos celulares, incluidos los macrófagos, los mastocitos y los adipocitos. También se ha identificado un cierto número de inhibidores normales que pue den bloquear la formación de nuevos vasos sanguíneos. Así la angiogénesis, al igual que el control de la proliferación celular en general, parece que es regulada por complejas com binaciones de señales, más que por un solo tipo de señal.
Resumen
La mayoría de poblaciones de células diferenciadas de los vertebrados están sujetas a recambio por medio de la muerte y la división celular. En algunos casos» como el de los hepatocitos del hígado, las células completamente diferenciadas simplemen te se dividen, produciendo células hijas del mismo tipo. Tanto la velocidad de proli feración como la supervivencia de los hepatocitos están controladas para mantener el número total de células apropiado. Si se destruye una gran parte del hígado, los hepatocitos restantes incrementan su velocidad de división restaurando dicha pér dida; si se incrementa transitoriamente la proliferación de los hepatocitos median te tratamiento con drogas, el aumento del número de células es inmediatamente compensado por un aumento de la muerte celular, recuperándose el número nor mal de células. Estos mecanismos de control en un tejido, normalmente mantienen el número de células de cada tipo en un equilibrio apropiado. Sin embargo, como respuesta a una lesión ocasional, la reparación puede darse de forma desequilibra da, como ocurre en lesiones repetidas del hígado en las que los fibroblastos crecen demasiado rápidamente en relación al crecimiento de los hepatocitos, de forma que los hepatocitos quedan substituidos por tejido conjuntivo. Las células endoteliales forman una monocapa celular que reviste todos los va sos sanguíneos y regula los intercambios entre la corriente sanguínea y los tejidos subyacentes. Los nuevos vasos sanguíneos se desarrollan a partir de las paredes de pequeños vasos ya existentes, a través del crecimiento de células endoteliales que tienen la capacidad de formar capilares cuando crecen aisladas en cultivo. En el organismo, los tejidos anóxicos, lesionados o en crecimiento, estimulan la angiogé nesis mediante la liberación de factores de crecimiento angiogénicos. Dichos factoRenovación por bipartición simple
1235
res atraen células endoteliales y las estimulan para que segreguen proteasas, proliferen y formen nuevos capilares. Renovación por medio de células madre: la epidermis 7,15 Ahora pasamos de las poblaciones celulares que se renuevan por duplicación simple a las que se renuevan mediante la intervención de células m adre (stem cells). Estas poblaciones varían ampliamente, no sólo en cuanto al carácter celu lar y a la velocidad de renovación, sino tam bién en cuanto a la geometría de la substitución celular. En el revestimiento del intestino delgado, por ejemplo, las células están dispuestas en forma de epitelio monoestratifícado. Este epitelio re cubre la superficie de las vellosidades que se proyectan hacia la luz intestinal y reviste las criptas que descienden hasta el tejido conjuntivo subyacente (Figura 22-16). Las células madre se encuentran en una posición resguardada, en el fon do de las criptas. Las células diferenciadas que se generan a partir de ellas se transportan hacia arriba por un movimiento de deslizamiento en el plano de la capa epitelial, hasta que llegan a las superficies libres de las vellosidades; en el extremo de las vellosidades las células mueren y son expulsadas a la luz intesti nal. Otro ejemplo lo encontram os en el epitelio que forma la cubierta externa de la piel, denominada epidermis. La epidermis es un epitelio pluriestratificado y las células en diferenciación se desplazan hacia el exterior desde su lugar de ori gen, en dirección perpendicular al plano de la capa celular. En el caso de las cé lulas sanguíneas, el patrón espacial de producción resulta caótico. Sin embargo antes de entrar en más detalles hem os de detenernos a considerar qué es una célula madre.
m igración de las células epiteliales desde su "nacim iento" en el fondo de la cripta hasta su desprendim iento en el extrem o de la vellosidad (el tiem po de tránsito es de 3 a 5 días)
LUZ INTESTINAL vellosidad (sin división celular) sección transversal de una vellosidad
vellosidadcélulas absorbentes ■ con ribete en cepillo
células epiteliales cripta tejido conjuntivo laxo
células caliciform es^ que segregan mucus
células que se dividen rápidam ente (tiem po del ciclo = 11 horas)
(A)
1 23 6
Figura 22-16 Renovación del revestimiento del intestino. (A) Esquema que muestra el modelo de renovación y proliferación celular de las células madre en el epitelio que forma el revestimiento del intestino delgado. Las células diferenciadas que no se dividen en la base de las criptas poseen un ciclo vital definido, que finaliza con la muerte celular programada y son reemplazadas continuamente por el linaje de células madre. (B) Micrografía de una sección de una región del revestimiento del intestino delgado, mostrando las vellosidades y las criptas. Obsérvese como las células caliciformes, que segregan mucus (teñidas de rojo), están entremezcladas con las células absorbentes con ribete en cepillo (enterocitos) del epitelio de las vellosidades. Véase en la Figura 22-9 la ultraestructura de dichas células.
células diferenciadas que no se dividen
células madre que se dividen lentam ente (tiem po del ciclo > 24 horas)
Capítulo 2 2 : Células diferenciadas y conservación de los tejidos
cripta -
(B)
I---------
100 p
célula madre
Las células madre pueden dividirse sin límite y dar lugar a una progenie diferenciada16 Las propiedades que definen a una célula madre son las siguientes: 1. No está totalmente diferenciada (es decir, no se encuentra al final del pro ceso de diferenciación).
2. Se puede dividir sin límites, por lo menos durante el ciclo vital del animal. 3. Cuando se divide, cada célula hija puede permanecer como célula madre, o puede iniciar una vía que conduce irreversiblemente hacia la diferencia ción terminal (Figura 22-17). Las células madre son necesarias siempre que se presenta la exigencia recu rrente de reemplazar células diferenciadas, las cuales no pueden dividirse por sí mismas. En diversos tejidos el estado terminal de diferenciación celular es in compatible, por cuestiones obvias, con la división celular. El núcleo celular, por ejemplo, puede destruirse, como sucede en las capas más externas de la piel, o puede ser expulsado como ocurre en los eritrocitos de los mamíferos. También es posible que el citoplasma esté sobrecargado de estructuras, como por ejem plo de miofibrillas en las fibras musculares estriadas, que dificulten la mitosis y la citocinesis. En otras células diferenciadas de forma terminal, las propiedades químicas de la diferenciación han de ser incompatibles con la división celular de algún modo más sutil. En cualquiera de estos casos, la renovación ha de depen der de las células madre. La misión de la célula madre no consiste en llegar a diferenciarse sino en producir células que se diferencien. A consecuencia de ello las células madre tienen a menudo un aspecto poco conspicuo, por lo que resultan difíciles de identificar. Pero esto no quiere decir que todas las células madre sean iguales. No están diferenciadas de forma terminal pero sí están determinadas (véase pág. 1136): la célula satélite muscular, que origina el músculo esquelético; la cé lula madre epidérmica, que origina las células epidérmicas queratinizadas; la espermatogonia, que origina el espermatozoide; la célula basal del epitelio olfati vo, que origina las neuronas olfativas (Figura 22-18), etc. Las células madre que dan lugar a un único tipo de célula diferenciada reciben el nombre de unipotencialesy las que dan lugar a muchos tipos celulares reciben el nombre de pluripo-
tenciales. Los tejidos que se forman a partir de células madre plantean importantes cuestiones. Hemos de considerar qué tipo de factores determinan el que una cé lula madre se divida o permanezca quiescente, qué es lo que condiciona que una célula hija, una vez formada, permanezca como célula madre o se diferencie y de qué forma se regula el proceso una vez ha entrado en la vía de la diferencia ción. Por otro lado, cabe considerar cuántas células mueren y cómo se controla la supervivencia. Empezaremos nuestro estudio con la epidermis, que por su
cilios m odificados
célula basal (célula m adrw
neurona olfativa — célula de sostén
axón (hacia el cerebro)
Renovación por medio de células madre: la epidermis
V.
célula diferenciada de form a term inal Figura 22-17 Definición de una célula madre. Cada una de las células hijas procedentes de la división de una célula madre puede permanecer como célula madre o iniciar el proceso hacia la diferenciación terminal.
Figura 22 -1 8 Esquema de una sección transversal del epitelio olfativo. En este epitelio, especializado
en la percepción de olores, se pueden distinguir tres tipos celulares: células de sostén, células basales y neuronas olfativas. Por autorradiografía se demuestra que las células basales son las células madre de la producción de neuronas olfativas, las cuales, pues, constituyen una de las pocas excepciones a la regla general de que las neuronas son células permanentes. Cada neurona olfativa sobrevive aproximadamente un mes (en los mamíferos) antes de ser substituida. De la cabeza globular de la neurona olfativa se proyectan entre seis y ocho cilios modificados, los cuales, según parece, contienen los receptores olfativos. El axón que se extiende desde el otro extremo de la neurona, transmite el mensaje hasta el cerebro. Cada vez que una célula basal se diferencia y se convierte en una neurona olfatoria se ha de desarrollar un nuevo axón, que tendrá que establecer las conexiones apropiadas.
1237
capa de escamas m uertas queratinizadas capa de células granulares capa de células espinosas capa de células basales lám ina basal tejido conjuntivo de la derm is
|«-100 |jnn-H
(A)
sencilla organización espacial facilita el estudio de la historia natural de sus cé lulas madre y del destino de su progenie.
Las células madre epidérmicas se encuentran en la capa basal17,18 La capa epidérmica de la piel y el revestimiento epitelial del tracto digestivo son los dos tejidos que sufren el contacto más directo y perjudicial con el ambiente externo. En ambos casos, las células diferenciadas maduras desaparecen rápida mente en los lugares más expuestos y son substituidas gracias a la proliferación de células m enos diferenciadas en nichos más resguardados.
filam entos de queratina desmosom a que conecta dos células entre sí
100 |jm Figura 22-19 Sección transversal de la epidermis de mamífero. (A) Esquema. (B) Microfotografía de una sección transversal de la planta del pie (tinción de hematoxilina y Van Gieson). Las células granulares entre las células espinosas y las escamas aplanadas se hallan en la penúltima fase de queratinización; aparecen granuladas debido a que contienen unos agregados que se tiñen de oscuro, formados por un material denominado qu eratoh ialin a, que al parecer participa en la com pactación intracelular y en el ensamblaje de la queratina. La queratohialina está formada básicamente por una proteína conocida como filag rin a. Además de las células destinadas a la queratinización, las capas profundas de la epidermis contienen un número reducido de células de carácter bastante diferente (no se observan aquí) -com o las células d e Langerhans de carácter macrofágico, derivadas de la médula ósea; los m elanocitos, derivados de la cresta neural y las célu las d e M erkel, que están asociadas con terminaciones nerviosas de la epidermis. Véase también Figura 22-1.
H------- 5 p m --------►( Figura 22 -2 0 Una célula espinosa. Esquema de una electronmicrografía de una sección de la epidermis, mostrando los haces de filamentos de queratina que atraviesan el citoplasma y se insertan en los desmosomas puntuales que unen la células contiguas. Obsérvese que entre las células adyacentes quedan unas aberturas en canal que permiten la libre difusión de nutrientes a través de las capas m etabólicam ente activas de la epidermis. Más externamente, a nivel de las células granulares, hay una barrera impermeable formada a partir de un material cem entante que segregan las células granulares a partir de las vesículas denominadas g rán u los d e m em b ra n a d e revestim iento. (De R.V. Krstic, Ultrastructure of the Mammalian Cell: An Atlas. Berlín: Springer,1979.)
1238
Capítulo 2 2 : Células diferenciadas y conservación de los tejidos
La epiderm is es un epitelio pluriestratificado constituido mayoritariamente por queratinocitos (denominados así debido a que su actividad característica di ferenciada es la síntesis de proteínas denominadas queratinas que forman los fi lamentos intermedios) (Figura 22-19). Estas células varían de aspecto de una capa a otra. Las que se hallan en la capa más interna, adheridas a una lámina basal subyacente, se denominan células basales y normalmente son éstas las que presentan mayor número de mitosis. Por encim a de las células basales se hallan unas cuantas capas de grandes células espinosas (Figura 22-20), cuyos num ero sos desmosomas -zonas de anclaje de gruesos haces de filamentos de queratin a - se visualizan al microscopio óptico como finas espinas alrededor de la su perficie celular (de ahí su nombre). Por encim a del estrato espinoso se extiende la capa granular (véase Figura 22-19). Esta capa marca la frontera entre la zona profunda m etabólicam ente activa y la zona externa de la epidermis, constituida por células muertas cuyos orgánulos intracelulares han desaparecido. Estas cé lulas más externas se reducen a escamas repletas de queratina densamente em paquetada. La mem brana plasmática de las escamas y de las células granulares más externas se halla reforzada por su cara citoplasmática por una capa fina (12 nm), resistente y entramada que contiene una proteína intracelular denominada involucrina. Normalmente las propias escamas se hallan tan comprimidas y son tan delgadas que sus límites se visualizan con dificultad al microscopio óptico, aunque tratándolas con hidróxido sódico se hinchan ligeramente y con una tin ción adecuada se puede observar en las regiones más finas de la piel una dispo sición ordenada de forma geométrica. Las escamas están apiladas en ordenadas columnas hexagonales que se entrelazan en los bordes (Figura 22-21), de forma que una columna presenta una altura de 10-20 células y se apoya sobre una base de unas 10 células basales.
Las células epidérmicas en diferenciación sintetizan una secuencia de queratinas diferentes a medida que maduran18 Una vez descrita la imagen estática, pasemos ahora a la imagen funcional. Mien tras algunas células basales se dividen, incorporándose a la población celular de la capa basal, otras (sus hermanas o primas) salen de la capa celular basal y en-
escama desprendiéndose de la superficie escamas queratinizadas capa de células granulares capa de células espinosas capa de células basales lámina basal
Figura 22-21 Organización en columnas de las escamas de la capa epidérmica de la piel. La estructura se visualiza hinchando las escam as queratinizadas con una solución de hidróxido sódico. Este tipo de organización en columnas sólo se presenta en los lugares en los que la epidermis es más fina. Algunos estudios sugieren que cada una de dichas columnas es una “unidad proliferativa”, que corresponde a una única célula madre de las 10-12 células basales en las que se apoya la columna.
tejido conjuntivo de la derm is H----------30 |am
célula basal periférica pasando hacia la capa de células espinosas
célula basal en división
Renovación por medio de células madre: la epidermis
1239
tran en la capa de células espinosas, siendo éste el primer paso de su movimien to ascendente. Cuando llegan a la capa granular, las células empiezan a perder sus núcleos y orgánulos citoplasmáticos y se transforman en las células escam o sas queratinizadas de la capa córnea. Finalmente, las células escamosas queratinizadas se descaman en la superficie de la piel y son arrastradas, en forma de polvo, por el aire. El período que transcurre desde el momento en que se forma una célula en la capa basal de la piel humana hasta el momento en que se des prende de su superficie, oscila entre dos y cuatro semanas según la región del cuerpo de que se trate. Las transformaciones moleculares que acompañan este proceso se pueden estudiar analizando cortes finos de epidermis paralelos a la superficie o capas sucesivas de células obtenidas por sucesivas aplicaciones y desprendimientos de cinta adhesiva. Por ejemplo, las moléculas de queratina, que se hallan en gran cantidad en todas las capas de la epidermis, se pueden extraer e identificar. Exis ten varios tipos de queratinas (estudiados en el Capítulo 16), codificadas por una amplia familia de genes homólogos, cuya diversidad se ve incrementada progre sivamente mediante la maduración alternativa de los transcritos génicos. A m e dida que el nuevo queratinocito en la base de la columna se transforma en la es cam a de la parte superior (véase Figura 22-21) expresa una sucesión de distintas selecciones del conjunto de genes que codifican queratina. Durante este proceso otras proteínas características, como la involucrina, también se sintetizan en función de un programa coordinado de diferenciación celular terminal.
Las células madre epidérmicas son un subconjunto de las células basales19 Si cada fragmento de epidermis se mantiene indefinidamente mediante la proli feración de sus células basales, entre dichas células basales debe existir por lo menos una célula cuya línea de descendientes no muera durante el ciclo vital del animal. A esta célula se le denomina célula madre inmortal (Figura 22-22). En principio, la división de una célula madre inmortal podría generar dos células hijas inicialmente similares, cuyos diferentes destinos pueden estar generados por diversas circunstancias. En el caso opuesto, la división de la célula madre puede ser siempre asimétrica: podría ocurrir que una, y sólo una, de las células hijas heredara una característica especial indispensable para ser inmortal, m ien tras que la otra podría presentar algún tipo de alteración desde el momento de su formación, de tal modo que se vería forzada a diferenciarse y, finalmente, a morir. En este último caso no podría haber nunca ningún incremento del núm e ro de células madre inmortales existentes, lo cual se contradice con los hechos. Si se destruye un fragmento de epidermis, la lesión se repara gracias a las células epidérmicas sanas cercanas que migran y proliferan hasta cubrir el área afecta da. En este proceso se establece un nuevo fragmento de epidermis renovado, lo que implica que las células madre inmortales adicionales se han generado para compensar la pérdida. De este modo, el destino de las células hijas debe estar regulado al menos parcialmente por las circunstancias externas. Un posible factor determinante de este destino puede ser el contacto de las células con la lámina basal o con el teji do conjuntivo expuesto en una lesión, con una pérdida de dicho contacto se des encadena el proceso de la diferenciación terminal y el mantenimiento del con tacto tiende a preservar el potencial de la célula madre. Sin embargo, estudios in vitro han demostrado que éste no es el único determinante del destino de la cé lula basal. Los queratinocitos basales pueden disociarse de la epidermis intacta y proliferar en una placa de cultivo, dando lugar a nuevas células basales y a células di ferenciadas terminales. Incluso en una población de queratinocitos basales cul tivados en que todos aparecen indiferenciados, existe una gran variabilidad en la capacidad de proliferación. Cuando se aíslan las células y se comprueba su ca pacidad para formar nuevas colonias, algunas carecen totalmente de la capaci-
124 0
Capítulo 2 2 : Células diferenciadas y conservación de los tejidos
célula madre inm ortal
/
■■■■■ /, k #C 4
A
K
\
## #l<»■ /, \ • • J k\ ••1 / T
Figura 22-22 Célula madre inmortal. Cada zona de epidermis con capacidad de renovación debe contener en cada generación celular por lo menos una célula madre “inmortal”, cuyos descendientes todavía se encontrarán presentes en aquella zona en un futuro lejano. Las flechas indican las líneas de descendencia. En el dibujo se muestra una célula madre inmortal que ocupa la misma posición en cada generación celular. Se pueden formar otras células basales químicamente distintas, de tal forma que se vean obligadas a abandonar la capa basal y a diferenciarse; también pueden ser células madre, equivalentes a la célula madre inmortal en cuanto a su carácter y sólo mortales en el sentido de que su descendencia será desplazada posteriormente desde la capa basal y desprendida en la superficie de la piel.
dad de dividirse, otras desarrollan únicamente unos cuantos ciclos de división y más tarde se detienen, y otras todavía pueden dividirse lo suficiente para formar nuevas colonias. Las células basales difieren también en la expresión de los re ceptores de la matriz extracelular de la familia de las integrinas (estudiados en el Capítulo 19): las células que poseen mayor número de dichos receptores y m a yor capacidad de unión a los componentes de la lámina basal son las que pre sentan un mayor potencial de proliferación. Esto sugiere que no todas las células basales son similares in vivo y que el mero contacto de dichas células con la lá mina basal no es suficiente para mantenerlas como células madre. Mejor dicho, al parecer las células madre constituyen un pequeño subconjunto -alrededor de un 10% - de la población de células basales que están programadas para generar una cierta proporción del linaje destinada a la diferenciación terminal, incluso antes de haber abandonado la capa basal. De hecho, si se cultivan queratinocitos en un medio deficiente en Ca2+, que permite mantenerlos en monocapa y por tanto en una posición basal, algunos emprenden una diferenciación terminal a pesar de su localización, como indica la síntesis de involucrina; dichas células diferenciadas emergen de la capa basal en el momento en que se aumenta la concentración de Ca2+. No obstante, el contacto con la matriz extracelular ejerce una influencia crí tica en la selección del destino de la célula, que evidentemente no está progra mada de forma rígida. Si se mantienen las células en suspensión, en lugar de po der dispersarse y adherirse al fondo de la placa de cultivo, todas ellas cesan de dividirse y se diferencian. No obstante, algunas células no se diferenciarán ni en suspensión, si el medio incluye fibronectina (un componente minoritario de la lámina basal y un com ponente mayoritario de la matriz extracelular que provo ca la migración de los queratinocitos durante la curación de las heridas). Las cé lulas que manifiestan dicha respuesta a la fibronectina son las que poseen las in tegrinas adecuadas. En condiciones normales, posiblemente la existencia de dichos receptores mantiene las células unidas a la lámina basal, conservando la posibilidad de permanecer como células madre; la pérdida o inactivación de los receptores provoca la expulsión desde la capa basal, confirmando con ello la opción de la diferenciación; la expulsión de la capa basal por otras causas que provocan la pérdida de receptores obliga a la célula a diferenciarse de forma pre matura.
La proliferación de las células basales se regula en función del grosor de la epidermis20 Sea cual sea la influencia de la lámina basal, deben intervenir controles adicio nales para regular el índice de producción y el índice de mantenimiento de las células epidérmicas. Por ejemplo, si se extirpan las capas externas de la epider mis, la velocidad de división de las células basales aumenta. Después de una hi pertrofia transitoria, se restablece el grosor normal y la velocidad de división de la capa basal disminuye hasta los valores normales. Es como si la extirpación de las capas diferenciadas liberara a las células de la capa basal proliferativa de una influencia inhibidora y fueran sometidas de nuevo a esta inhibición en cuanto las capas externas recuperan su grosor habitual. Es bien conocido que los queratinocitos en cultivo responden a una gran va riedad de hormonas y factores de crecimiento, incluyendo el factor de creci miento epidérmico (EGF, de Epidermal Growth Factor), pero los mecanismos moleculares que regulan su proliferación en el organismo continúan siendo un problema todavía sin resolver, de gran importancia clínica. Las consecuencias de un control defectuoso de la proliferación celular basal se observan en la pso riasis. En este trastorno cutáneo tan frecuente, la velocidad de proliferación de las células basales está muy aumentada -la epidermis se vuelve más gruesa y las células se expulsan de la superficie de la piel al cabo de una semana de haber surgido de la capa basal, antes de haber tenido tiempo de queratinizarse por completo.
Renovación por medio de células madre: la epidermis
1241
hembra virgen
leche expulsada en el conducto
grànulo secretor de proteina de la leche
gotitas de grasa de la leche
hem bra embarazada
* >4
ns
com plejo de Golgi célula m ioepitelial
hembra lactante ite o »1 *
conducto
7
alvéolos dilatados por la leche
'<áí célula alveolar
lám ina basal expansión de una célula m ioepitelial
______________I 10 pm
Figura 22-23 La glándula mamaria. (A) Esquema del crecimiento de los alvéolos a partir de los conductos de la glándula mamaria durante el embarazo y la lactancia. Únicamente se muestra una pequeña parte de la glándula. La glándula “en reposo” presenta una reducida cantidad de tejido glandular inactivo, englobado en una gran masa de tejido conjuntivo de tipo adiposo. Durante el embarazo tiene lugar una intensa proliferación de tejido glandular a expensas del tejido adiposo; las porciones secretoras de la glándula desarrollan preferentemente alvéolos. (B) Uno de los alvéolos de la glándula mamaria secretores de leche, con una red de células mioepiteliales {verde) a su alrededor. Las células mioepiteliales se contraen y provocan la expulsión de la leche del alvéolo como respuesta a la hormona oxitocina, la cual, a su vez, se libera como respuesta refleja ante el estímulo de succión. (C) El mismo tipo de célula alveolar secretora produce las proteínas y las grasas de la leche. Las proteínas se segregan de manera normal por exocitosis mientras que la grasa se libera en forma de gotitas rodeadas por membrana plasmática que se desprenden de la célula (B, según R. Krstic; Die Gewebe des Menschen und der Säugetiere. Berlin: Springer-Verlag, 1978; C, de D.W. Fawcett, A Textbook of Histology, 1Ith ed. Philadelphia: Saunders, 1986.)
Las células secretoras de la piel están agrupadas en glándulas que tienen su propia cinética de población21 En ciertas regiones especializadas de la superficie del cuerpo, a partir de la epi dermis embrionaria se desarrollan, además de las células queratinizadas antes descritas, otros tipos de células. En particular, secreciones tales como el sudor, las lágrimas, la saliva y la leche se producen en células situadas en glándulas profundas, que se originan com o invaginaciones de la epidermis pero que tie nen patrones de renovación distintos a los de las regiones queratinizadas. La glándula m amaria presenta un interés especial a causa del control hor monal de sus procesos de división y diferenciación celular. La producción de le che debe empezar cuando ha nacido un bebé y debe terminar cuando éste es destetado. Una glándula m amaria “en reposo” está formada por un sistema ra mificado de conductos excretores rodeados de tejido conjuntivo; estos conduc tos están revestidos en sus porciones secretoras por una única capa de células epiteliales relativamente inactivas, que actúan como células madre. Como pri mer paso hacia la producción de leche a gran escala, las hormonas que circulan
124 2
Capítulo 2 2 : Células diferenciadas y conservación de los tejidos
por la sangre durante el embarazo hacen que las células de los conductos proliferen y que las porciones terminales de los conductos crezcan y se ramifiquen, formando pequeñas bolsas dilatadas o alvéolos, que contienen células secreto ras (Figura 22-23). La secreción de leche se inicia sólo cuando, tras el nacimiento del bebé, estas células son estimuladas por distintas combinaciones de horm o nas circulantes en la madre. Más tarde, cuando el lactante es destetado, las célu las secretoras mueren y la mayor parte de los alvéolos desaparecen; los macrófagos eliminan las células muertas y la glándula revierte a su estado de reposo. La degradación de la lámina basal parece que desempeña un papel crítico en dicho proceso de involución. En la glándula mamaria la división celular viene regulada no sólo por hor monas sino tam bién por señales locales que se transmiten entre las células del epitelio y entre las células epiteliales y el tejido conjuntivo o estroma, donde las células epiteliales se hallan inmersas. Mutaciones en los genes implicados en es tos controles locales provocan el desarrollo del cáncer, tal como se verá en el Ca pítulo 24, y es mediante estudios sobre el cáncer de mama que se han dilucidado algunos de estos mecanismos de control.
Resumen
Muchos tejidos, especialmente los que tienen un desgaste y una proliferación rápi dos -tales como el revestimiento intestinal, la capa epidérmica de la piel y los teji dos hematopoyéticos- se renuevan mediante células madre. Las células madre, por definición, no están totalmente diferenciadas y poseen la capacidad de dividirse durante el ciclo vital del organismo produciendo unos linajes celulares que se dife rencian y otros que continúan como células madre. En la piel, las células madre de la epidermis se encuentran en la capa basal, adheridas a la lámina basal El linaje celular procedente de las células madre se diferencia al abandonar dicha capa y, a medida que se desplaza hacia el exterior, sintetiza una serie de tipos de queratina diferentes hasta que, finalmente, sus núcleos degeneran produciendo una capa ex terna de células queratinizadas muertas que continuamente se van desprendiendo de la superficie de la pieL Únicamente una mínima parte de células basales son cé lulas madre. El destino de las células originadas a partir de una célula madre está controlado parcialmente por interacciones con la lámina basal y en parte por otros factores muy poco conocidos. Estos factores posibilitan que durante las procesos de reparación se formen dos células madre a partir de una de ellas, y regulan la veloci dad de proliferación de las células basales según el grosor de la epidermis. Las glándulas conectadas a la epidermis, como las glándulas mamarias, poseen sus propias células madre y sus patrones de renovación celular característicos. Renovación por medio de células madre pluripotenciales: formación de las células sanguíneas22,23 La sangre presenta muchos tipos celulares con funciones muy diversas, que abarcan desde el transporte de oxígeno hasta la producción de anticuerpos. Al gunas de estas funciones celulares tienen lugar enteramente en el sistema vas cular, mientras otras utilizan dicho sistema vascular sólo como medio de trans porte y llevan a cabo su función en otro lugar. Sin embargo, todas las células sanguíneas presentan similitudes en su ciclo vital. Todas ellas tienen una vida de duración limitada y todas se reproducen de forma continua a lo largo de toda la vida del animal. La característica más notable, sin embargo, es que todas ellas se generan en último término a partir de una célula madre común de la médula ósea. Esta célula madre hematopoyética (o formadora de sangre) es, por lo tanto, pluripotencial, ya que da lugar a los distintos tipos de células sanguíneas dife renciadas.
Renovación por medio de células madre pluripotenciales: formación de las células sanguíneas
1 243
I________ 10 |jm
Las células sanguíneas se pueden clasificar en rojas y blancas (Figura 22-24). Los glóbulos rojos, o eritrocitos, permanecen en el interior de los vasos sanguí neos y transportan 0 2 y C 0 2 unidos a la hemoglobina. Los glóbulos blancos, o leucocitos, com baten las infecciones y, en algunos casos, fagocitan y digieren substancias residuales. Para llevar a cabo sus funciones, los leucocitos, a dife rencia de los eritrocitos, se han de abrir paso a través de las paredes de los vasos sanguíneos de pequeño calibre y han de migrar hacia los tejidos. Además la san gre presenta una gran número de plaquetas, que no son células completas sino pequeños fragmentos celulares disgregados o “minicélulas” derivadas del cito plasma cortical de grandes células denominadas megacariocitos. Las plaquetas se adhieren de forma específica a las células endoteliales que revisten los vasos sanguíneos lesionados, donde intervienen en la reparación de las roturas y bre chas así como en el proceso de la coagulación sanguínea.
Existen tres tipos principales de glóbulos blancos: los granulocitos, los monocitos y los linfocitos22’23 Todos los glóbulos rojos son similares entre sí, com o también los son las plaque tas; sin embargo existen varios tipos distintos de glóbulos blancos. Tradicional mente se agrupan en tres grandes categorías, denominadas granulocitos, m ono citos y linfocitos, en base a su aspecto al microscopio óptico. Todos los granulocitos contienen numerosos lisosomas y vesículas secreto ras (o gránulos) y se subdividen en tres clases en función de la morfología y de las propiedades tintoriales de estos orgánulos (Figura 22-25). Las características tintoriales reflejan diferencias importantes en cuanto a sus propiedades quími cas y a su función: los neutrófilos (también denominados leucocitos polimorfonucleares debido a su núcleo multilobulado) constituyen el tipo de granulocitos más numeroso; fagocitan y destruyen pequeños organismos -especialm ente bacterias. Los basófilos segregan histamina (y en algunas especies, serotonina) que actúa en las reacciones inflamatorias, están estrechamente relacionados con la función de los mastocitos, que se encuentran en los tejidos conjuntivos pero que también se originan a partir de las células madre hematopoyéticas. Los eosinófilos intervienen en la destrucción de parásitos y modulan las respuestas inflamatorias de tipo alérgico. Una vez han abandonado la circulación sanguínea, los monocitos (véase Fi gura 22-25D) se transforman en macrófagos, que junto con los neutrófilos son los principales “fagocitos profesionales” del organismo. Tal como se vio en el Capítulo 13, los distintos tipos de células fagocíticas contienen lisosomas que se fusionan con las vesículas fagocíticas recién formadas (fagosomas), exponiendo los microorganismos fagocitados a la acción de complejos enzimáticos, a molé culas altamente reactivas de superóxido ( 0 2 ) y a hipoclorito (HOC1, el ingre diente activo de la lejía), así como a una mezcla concentrada de hidrolasas liso-
124 4
Capítulo 2 2 : Células diferenciadas y conservación de los tejidos
Figura 22 -2 4 Electronm icrografía de barrido de células sanguíneas de mamífero en un vaso sanguíneo de pequeño calibre. Las células mayores, más esféricas y con una superficie rugosa, son leucocitos; las células menores, lisas y aplanadas, son eritrocitos. (De R.G. Kessel y R.H. Kardon, Tissues and Organs: A Text-Atlas of Scanning Electron Microscopy. San Francisco: Freeman,1979. Copyright ©1979 W.H. Freeman and Company.)
(A)
neutrófilo linfocito eosinófilo m onocito glòbulo rojo
20 |jm
Figura 22-25 Los glóbulos blancos de la sangre. (A-D) Electronmicrografías en que se muestran respectivamente, un neutrófílo, un basófilo, un eosinófilo y un m onocito. En la Figura 23-4 se han presentado electronmicrografías de linfocitos. Cada uno de los tipos celulares representados aquí tiene una función distinta, que se refleja en los diferentes tipos de gránulos de secreción y de lisosomas que contiene. Cada célula presenta un solo núcleo, aunque presenta una forma lobulada irregular, y en (B), (C) y (D) las conexiones entre los lóbulos se hallan fuera del plano de la sección. (E) Micrografía de un frotis sanguíneo teñido con la técnica de Romanowsky, que tiñe intensam ente los glóbulos blancos. (A-D, cortesía de Dorothy Bainton; E, cortesía de David Masón.)
2 ti m
somales. Los macrófagos, sin embargo, son mucho más grandes y presentan una vida más larga que los neutrófilos. Son responsables de eliminar las células alte radas, envejecidas y muertas de muchos tejidos y son los únicos capaces de in gerir grandes microorganismos, como los protozoos. Existen dos tipos principales de linfocitos, ambos implicados en respuestas inmunes: los linfocitos B fabrican anticuerpos, mientras que los linfocitos T m a tan células infectadas por virus y regulan la actividad de otros glóbulos blancos. Además existen células de carácter linfocitario denominadas células asesinas (cé lulas NKde Natural Killer Cells) que destruyen ciertos tipos de células tumorales y de células infectadas por virus. La producción de linfocitos es un tema especia lizado que será discutido con detalle en el Capítulo 23. Ahora vamos a centrar nos principalmente en el proceso de formación de los otros glóbulos blancos, tam bién denominados, en conjunto, células mieloides. En la Tabla 22-1 se resumen los distintos tipos de células sanguíneas y sus funciones.
Renovación por medio de células madre pluripotenciales: formación de las células sanguíneas
1245
Tabla 22-1 Células sanguíneas
Tipo celular
Funciones principales
Glóbulos rojos (eritrocitos)
transportan 0 2y C 0 2
Concentraciones características en sangre humana (células/litro) 5 x 10 12
Glóbulos blancos (leucocitos)
Granulocitos Neutrófilos (leucocitos fagocitan y destruyen bacterias invasoras polimorfonucleares) Eosinófilos destruyen parásitos y modulan respuestas inflamatorias de tipo alérgico Basófilos liberan histamina y serotonina en ciertas reacciones inmunitarias Monocitos se convierten en macrófagos en los tejidos, mediante fagocitosis y digestión de microorganismos invasores, cuerpos extraños y células envejecidas
Linfocitos Células B Células T
Células asesinas (células NK) Plaquetas (fragmentos celulares procedentes de megacariocitos de la médula ósea)
fabrican anticuerpos matan células infectadas por virus y regulan la actividad de otros leucocitos matan células infectadas por virus y algunas células tumorales inician el proceso de coagulación
5x
109
2
x
108
4x
107
4x
108
2 x 109 1 x 109 1 x 108 3x
1 0 11
El cuerpo humano contiene alrededor de 5 litros de sangre, que supone un 7% del peso del cuerpo. Los glóbulos rojos constituyen alrededor de un 45% de este volumen y los glóbulos blancos alrededor de un 1 %, el resto es el plasm a sanguíneo líquido.
La producción de los distintos tipos de células sanguíneas en la médula ósea se halla controlada individualmente22,24 La mayoría de los glóbulos blancos no actúan en la sangre sino en otros tejidos. La sangre únicam ente los transporta a los lugares donde se necesitan. Una infec ción local o una herida en algún tejido rápidamente atrae a los glóbulos blancos hacia la región afectada, como parte de una respuesta inflamatoria que actúa contra la infección o reparando la herida. La respuesta inflamatoria es compleja y está provocada por distintas moléculas señal producidas localmente por mastocitos, por term inaciones nerviosas, por plaquetas y por glóbulos blancos, así como por la activación del com plem ento (discutido en el Capítulo 23). Algunas de estas moléculas señal actúan cerca de los capilares, provocando una dismi nución de la adhesión entre las células endoteliales pero incrementando la ad herencia de la superficie de estas células al paso de los glóbulos blancos. Así, los glóbulos blancos quedan atrapados en la superficie interna del vaso como mari posas en un cazamariposas, de donde pueden escapar deslizándose entre las cé lulas endoteliales y atravesando la lámina basal con la ayuda de las enzimas di gestivas; la unión inicial a las células endoteliales se realiza mediante selectinas (estudiadas en el Capítulo 10) y la unión más fuerte que necesitan las células sanguíneas para atravesar la pared de los vasos sanguíneos se realiza mediante integrinas (estudiadas en el Capítulo 19). Otras moléculas actúan com o agentes quim iotácticos para distintos tipos de glóbulos blancos, provocando una polari-
12 4 6
Capítulo 22 : Células diferenciadas y conservación de los tejidos
Figura 22-26 Migración de los glóbulos blancos desde la circulación sanguínea durante la respuesta inflamatoria. La respuesta se inicia a través
célula endotelial
de distintas moléculas señal producidas localm ente por diversas células (principalmente del tejido conjuntivo) o por activación del complemento. Algunos de estos agentes intermediarios actúan a nivel de las células capilares endoteliales, provocando la pérdida de su adhesión a las células próximas de forma que los capilares se vuelven más permeables; la estimulación de las células endoteliales provoca la expresión de selectin as -m oléculas de la superficie celular que reconocen carbohidratos específicos localizados en la superficie de los leucocitos de la sangre y provocan su adhesión al endotelio. Otros agentes intermediarios actúan com o factores quimiotácticos dirigiendo el avance de los lecucocitos que penetran entre las células endoteliales de los capilares hacia el tejido circundante.
zación en dichas células la cual las hace avanzar hacia el lugar de origen de la sustancia quimiotáctica. El resultado de todo ello es que en el tejido afectado pe netran un gran número de glóbulos blancos (Figura 22-26). Otras moléculas señal, producidas en el transcurso de la respuesta inflama toria, pasan a la sangre y estimulan a la médula ósea para que produzca más leu cocitos, liberándolos hacia la circulación sanguínea. La médula ósea constituye el objetivo principal de esta regulación ya que, con excepción de los linfocitos y de algunos macrófagos, la mayoría de los tipos de glóbulos blancos en los m am í feros adultos se generan únicamente en la médula ósea. La regulación tiende a ser específica para cada tipo celular: algunas infecciones bacterianas, por ejem plo, provocan un aumento selectivo de neutrófilos, mientras que las infecciones por protozoos y por otros parásitos provocan un incremento selectivo de eosinófílos. (Por este motivo se realizan rutinariamente recuentos diferenciales de glóbulos blancos para emitir el diagnóstico de infecciones y de otras enfermeda des inflamatorias.) En otras circunstancias, se incrementa selectivamente la producción de eri trocitos -p o r ejemplo, en individuos que viven en altitudes elevadas, donde el oxígeno es más escaso. Esta formación de células sanguíneas (hematopoyesis) implica necesariam ente la existencia de complejos controles, bajo los cuales la producción de cada tipo de células sanguíneas se regula individualmente, de forma que pueden variar de acuerdo con las necesidades. El comprender cómo actúan dichos controles constituye un problema de gran importancia médica, y se han conseguido grandes progresos en este campo en los últimos años. En animales intactos, la hematopoyesis es más difícil de analizar que la re novación celular de un tejido como la capa epidérmica de la piel. En la epider mis existe una organización espacial regular que facilita el seguimiento del pro ceso de renovación y la localización de las células madre; sin embargo, en el caso de los tejidos hematopoyéticos esto no es así. En cambio, las células hematopoyéticas presentan un tipo de vida nómada que las hace más accesibles a otros tipos de estudios experimentales. Las células hematopoyéticas dispersas pueden transferirse fácilmente, sin alteraciones, de un animal a otro; además, en estas células mantenidas en cultivo se puede observar y analizar la proliferación y la diferenciación de células individuales y de su progenie. Por este motivo, se dispone de más datos sobre las moléculas que controlan la producción de célu las sanguíneas que sobre los mecanismos de control de producción celular a ni vel de otros tejidos de mamíferos.
glóbulo blanco en el interior del capilar Z 7T
EXP OSI CION A LOS AG EN TE S INTERMEDIARIOS DE LA INFLAMACIÓN LIBERADOS POR EL T E J ID O LESIONADO
QU IM IOT AXI S HACIA LOS A G E N T E S R E S P O N S A B L E S DE LA ATRACCIÓN LI BER AD OS POR EL T E J ID O LESIONADO
glóbulos blancos en el tejido conjuntivo
La médula ósea contiene las células madre hematopoyéticas22,25 En la médula ósea se pueden distinguir los diferentes tipos de células sanguíneas y sus precursores inmediatos por su aspecto característico (Figura 22-27). Todas ellas se hallan entremezcladas unas con otras, así como con los adipocitos y con otras células del estroma (células conjuntivas) que forman una delicada red estruc tural de fibras de colágena y de otros componentes de la matriz extracelular. Ade-
Renovación por medio de células madre pluripotenciales: formación de las células sanguíneas
1247
leutrófilo s n m aduros
precursores de los eritrocitos
(A)
50 |jm
eosi notilo inm aduro
m onocito inm aduro
eritrocito
linfocito inm aduro
10 |jm
Figura 22-27 La médula ósea. (A) Micrografía de una sección teñida. Los amplios espacios vacíos corresponden a adipocitos, cuyo contenido en lípidos se ha disuelto en el transcurso del procesado de la muestra. La célula gigante con núcleo lobulado es un megacariocito. (B) Electronmicrografía a bajos aumentos. Este tejido constituye la fuente principal de nuevas células sanguíneas (exceptuando los linfocitos T, que se producen en el timo). Obsérvese que las células sanguíneas inmaduras de un tipo determinado tienden a agruparse en “grupos familiares”. (A, cortesía de David Masón; B, de J.A.G. Rhodin, Histology: A Text and Atlas. New York: Oxford University Press, 1974.)
Figura 22 -2 8 Los megacariocitos. (A) Esquema de un megacariocito situado entre distintas células de la médula ósea. Su enorme tamaño es el resultado de la elevada poliploidía de su núcleo. Un megacariocito produce alrededor de 10 000 plaquetas, las cuales se extienden mediante largas expansiones que se introducen a través de los poros de las paredes de los sinusoides adyacentes. (B) Electronmicrografía de barrido del interior de un sinusoide en la médula ósea, en la que se observan las expansiones de los megacariocitos. (B, de R.G. Kessel y R.H. Kardon, Tissues and Organs: A TextAtlas of Scanning Electron Microscopy. San Francisco: Freeman, 1979. Copyright © 1979, W.H. Freeman and Company.)
prolongación del m egacariocito em itiendo plaquetas
células sanguíneas en form ación
1 24 8
célula endotelial de la pared del sinusoide glóbulo rojo
m egacariocito
20 nm
Capítulo 2 2 : Células diferenciadas y conservación de los tejidos
plaquetas
expansiones m egacariocito
glóbulo rojo
más, todo el tejido conjuntivo está altamente irrigado por vasos sanguíneos de pa redes muy finas (denominados sinusoides sanguíneos) al interior de los cuales van a parar las nuevas células. También se hallan presentes los megacariocitos; estas células, a diferencia de otras células sanguíneas, permanecen en la médula ósea después de haber madurado, lo cual constituye una de sus características más re marcables; además son extraordinariamente grandes (con un diámetro de más de 60 ^m) y presentan un núcleo con elevada poliploidía. Normalmente se hallan adosados junto a los sinusoides y extienden sus expansiones a través de los poros del revestimiento endotelial de estos vasos; las plaquetas se fragmentan a nivel de sus expansiones y son arrastradas por la sangre (Figura 22-28). Debido a la compleja ordenación celular de la médula ósea, resulta difícil la identificación de las precursores inmediatos de las células maduras. Las células que se hallan en estadios tempranos del desarrollo, antes de que inicien ningún tipo de diferenciación, son muy similares en su aspecto y no existe ninguna característica visible que permita reconocer las últimas células madre constituidas. Para su iden tificación y caracterización, se necesita una prueba funcional, que consiste en el mareaje de la progenie de cada célula. Como veremos, esto puede realizarse in vitro simplemente examinando las colonias que producen las células previamente aisla das. El sistema hematopoyético, sin embargo, puede ser manipulado de forma que los clones celulares puedan reconocerse in vivo en el animal intacto. Si se expone un animal a una dosis elevada de rayos X, las células hem ato poyéticas se destruyen y el animal muere a los pocos días como consecuencia de su incapacidad de producir nuevas células sanguíneas. El animal irradiado pue de salvarse, sin embargo, mediante una transfusión de células extraídas de la médula ósea de un donante sano inmunológicamente compatible. Evidente mente, entre estas células existen algunas (alrededor de 1 célula de cada 10 000) que pueden colonizar el huésped irradiado y proporcionarle un nuevo tejido h e matopoyético de forma permanente. Uno de los tejidos en el que se desarrollan las colonias es el bazo, que en ratones normales constituye un área adicional muy importante de hematopoyesis. Cuando se examina el bazo de un ratón irra diado al cabo de una o dos semanas después de la transfusión de células proce dentes del donante sano, se observa un cierto número de nódulos diferenciados en cada uno de los cuales se puede localizar una colonia de células mieloides (Figura 22-29); algunas de las colonias que se presentan al cabo de dos semanas pueden contener más de un millón de células. El carácter discreto de los nódu los sugiere que cada uno de ellos puede corresponder a un clon de células des cendientes de una única célula inicial, de forma similar a como crece una colo nia bacteriana en una placa de cultivo; mediante marcadores genéticos puede demostrarse que esto es lo que sucede realmente. La célula fundadora de este tipo de colonia se denomina célula form adora de colonias, o CFC (de Colony-Forming Cell), también conocida como unidad formadora de colonias, CFU. Las células formadoras de colonias son heterogé neas. Ciertas colonias se hallan constituidas por un sólo tipo de célula mieloide, mientras que otras se hallan constituidas por diversos tipos. Algunas células for man grandes colonias mediante varios ciclos de división, mientras que otras se dividen con menor frecuencia y forman colonias más reducidas. La mayoría de las colonias mueren después de generar un número restringido de células san guíneas diferenciadas. Sin embargo, un reducido número de colonias son capa ces de autorrenovarse produciendo, además de células sanguíneas diferencia das, más células formadoras de colonias. Se asume que las células fundadoras de tales colonias capaces de autorrenovarse son las células madre hematopoyéticas que se presentan en la médula ósea trasplantada.
la irradiación con rayos X detiene la producción de células sanguíneas; el ratón m oriría si no recibiera ningún tratam iento posterior
INYECCION DE CELULAS DE MÉDULA ÓSEA PROCEDENTES DE UN DONANTE SANO
el ratón sobrevive; 2 semanas después de la inoculación, en la circulación se pueden detectar numerosas células sanguíneas sanas
EL EXAMEN DEL BAZO REVELA LA PRESENCIA DE NÓDULOS NO HABITUALES EN SU SUPERFICIE cada nodulo del bazo contiene un clon de células hem atopoyéticas, descendiente de una de las células de la médula ósea Figura 22-29 El experimento de formación de colonias en el bazo. El bazo de un animal intensamente irradiado queda sembrado con células de la médula ósea procedentes de la transfusión de un donante sano. Este experimento, desarrollado en 1961, revolucionó los estudios sobre la hematopoyesis, al permitir por primera vez que células mieloides precursoras pudieran ser analizadas.
Las células madre pluripotenciales dan lugar a todos los tipos de células sanguíneas26 Con frecuencia en una colonia del bazo originada a partir de una sola célula madre se pueden encontrar juntos todos los tipos de células mieloides. Así pues, la célula
Renovación por medio de células madre pluripotenciales: formación de las células sanguíneas
1249
madre hematopoyética es pluripotencial: puede dar lugar a muchos tipos celulares. Las colonias del bazo no parecen contener linfocitos, pero otros estudios demues tran que estas células se forman a partir de la misma célula madre que origina to das las demás células mieloides. En la demostración de esta teoría se han utilizado marcadores genéticos que permiten identificar los componentes de una colonia in cluso después de que se hayan liberado a la circulación sanguínea. Para ello se han utilizado algunos tipos de marcadores clónales, pero la utilización de un retrovirus (un vector retrovírico que contiene un gen marcador) diseñado para este fin ha per mitido alcanzar plenamente este objetivo. Este virus marcador, al igual que otros retrovirus, puede insertar su genoma en los cromosomas de la célula que infecta, aunque se hayan eliminado los genes que posibilitan la generación de nuevas in fecciones por partículas víricas. Así pues, el marcador queda confinado en la proge nie de las células infectadas inicialmente, de forma que la progenie de una de estas células se puede distinguir de la progenie de otras células ya que las zonas de inser ción del virus en el cromosoma son distintas. Para analizar los linajes hematopoyéticos, las células de la médula ósea se infectan in vitro con el vector retrovírico e inmediatamente se transfieren a un receptor irradiado letalmente; entonces se pueden utilizar sondas de DNA para marcar la descendencia de células individua les infectadas en los diferentes tejidos hematopoyéticos y linfoides del huésped. Estos experimentos no sólo confirman que todas las clases de células san guíneas -tan to mieloides como linfoides- derivan de una célula madre común (Figura 22-30) sino que tam bién permiten seguir el pedigree de las células san guíneas durante largos intervalos de tiempo. Meses más tarde, cuando el siste ma hematopoyético ha tenido tiempo de estabilizarse totalmente después de la transfusión, prácticam ente todas las células sanguíneas del ratón huésped irra diado son descendientes de un número muy reducido -e n algunos casos sola mente de u n a- de las células transfectadas iniciales. Una única célula madre pluripotencial posee evidentemente la capacidad de generar un clon indefinida mente grande de progenie de células, entre las cuales, presumiblemente, se ori ginan nuevas células madre con una capacidad similar, así como células dife renciadas definitivamente.
El número de células sanguíneas especializadas se amplifica por divisiones de células progenitoras determinadas22,27 En cuanto una célula se ha diferenciado en eritrocito o granulocito o en algún otro tipo de célula sanguínea, parece que no existe marcha atrás: el estado de di ferenciación es irreversible. Así pues, en alguna etapa de su desarrollo, alguna descendencia de una célula madre pluripotencial ha de ser determinada de for ma irreversible hacia una línea particular de diferenciación. Esto se observa cla ramente a partir de una simple observación microscópica de médula ósea en la que esta determinación se produce mucho antes de la división final que da lugar a la célula madura diferenciada: se pueden reconocer células precursoras espe cializadas que todavía siguen proliferando pero que ya muestran señales de ha ber iniciado la diferenciación. En este sentido parece que la determinación hacia una línea particular de diferenciación va seguida de una serie de divisiones celu lares que amplifican el número de células de un tipo especializado. Así pues, el sistema hematopoyético puede considerarse como una jerar quía de células. Células m adre pluripotenciales dan lugar a células progenito ras determinadas, que están destinadas irreversiblemente a ser las células an cestrales de uno solo o de unos cuantos tipos de células sanguíneas. Las células progenitoras determinadas se dividen rápidamente, pero únicamente un núme ro limitado de veces. Al final de esta serie de divisiones amplificadas evolucionan a células diferenciadas terminales, que generalmente ya no vuelven a dividirse y mueren al cabo de unos cuantos días o semanas. Las células pueden morir tam bién en alguna de las etapas iniciales del proceso. Estudios de células en cul tivo constituyen una vía adecuada para determinar cómo se regulan estos m eca nismos celulares -proliferación, diferenciación y muerte.
1250
Capítulo 2 2 : Células diferenciadas y conservación de los tejidos
TIMO
¿célula madre linfoide?
O
(# )
CFC-T
célula T
CFC-B
célula B
CFC-Eosina
eosinófilo
CFC-Bas
basófilo
m
C(?
O
célula madre pluripotencial
m
¿célula madre m ieloide?
CFC-mix
O
CFC-GM
plaquetas CFC-MEG
m egacariocito
(• ) BFC-E
CFC-E
eritrocito
Figura 22-30 Esquema tentativo de la hematopoyesis. Normalmente la célula madre pluripotencial se divide de tarde en tarde generando nuevas células madre pluripotenciales (autorregeneradoras) o célu las p rog en itoras d eterm in ad as (también denominadas CFC, de Colony Forming Cells), que se hallan determinadas de forma irreversible para producir sólo unos cuantos tipos celulares de la sangre. Las células progenitoras son estimuladas a dividirse por factores específicos de crecim iento, pero estas células van perdiendo progresivamente su capacidad de división y acaban evolucionando a células sanguíneas diferenciadas, que generalmente sólo viven durante unos cuantos días o semanas. En mamíferos adultos todas estas células se desarrollan principalmente en la médula ósea -excepto los linfocitos T, que se originan en el timo, y los macrófagos y los osteoclastos, que se forman a partir de los m onocitos en la mayoría de los tejidos. La parte más conflictiva del esquema reside en el lugar que corresponde a los precursores de los linfocitos T y B. Asimismo, las células madre pluripotenciales pueden dar lugar a varios tipos de células de otros tejidos no representadas en este esquema, como las células NK, los mastocitos y una gran variedad de tipos de células que presentan los antígenos (se estudiarán en el Capítulo 23); sin embargo, las vías a través de las cuales estas células se desarrollan son desconocidas.
Los factores que regulan la hematopoyesis pueden analizarse en cultivo28 Las células hematopoyéticas pueden sobrevivir, proliferar y diferenciarse en cul tivo si y sólo si se hallan provistas de factores de crecimiento o acompañadas de células que produzcan estos factores; si se ven privadas de dichos factores, las células mueren. Por ejemplo, se puede conseguir que células madre pluripoten ciales proliferen durante largo tiempo cultivando células hematopoyéticas aisla das de la médula ósea encim a de una capa de células del estroma de la médula ósea, lo cual posiblemente mimetiza las condiciones de la propia médula ósea; este tipo de cultivos puede generar todos los tipos de células mieloides. Por otro lado, células hematopoyéticas aisladas de la médula ósea se pueden cultivar en una matriz semisólida de agar diluido o de metilcelulosa, añadiendo artificial mente al medio factores derivados de otras células. Debido a que las células no pueden migrar en la matriz semisólida, las células descendientes de cada célula precursora aislada permanecen juntas en forma de colonias fáciles de recono-
Renovación por medio de células madre pluripotenciales: formación de las células sanguíneas
1251
cer. Por ejemplo, se puede observar cómo un progenitor neutrófilo determinado llega a formar una colonia de cientos de neutrófilos. Este tipo de sistema de cul tivo, desarrollado a mitad de la década de 1960, constituye un sistema de análisis de los factores que regulan la hematopoyesis y, por lo tanto, permite purificarlos y estudiar su actividad. Estas substancias se encuentran en forma de glucoproteínas y generalmente se denominan citopoyetinas o factores estimuladores de colonias, o CSF (de Colony-Stimulating Factors). Del creciente número de CSF que se han definido y purificado, algunos circulan por la sangre y actúan como hormonas, mientras que otros actúan en la médula ósea tanto como mediadores segregados locales com o señales ligadas a la membrana que actúan mediante el contacto célula a célula. El más conocido de los CSF que actúan como una hor m ona es la glucoproteína eritropoyetina, que se fabrica en el riñón y regula la eritropoyesis (la formación de los glóbulos rojos).
eritroblasto
La eritropoyesis depende de la hormona eritropoyetina29 El eritrocito constituye, con diferencia, el tipo de célula más numeroso de la san gre (véase Tabla 22-1). Cuando está maduro es como un paquete lleno de hem o globina que prácticam ente no contiene ninguno de los orgánulos celulares habi tuales. El eritrocito de un mamífero adulto carece incluso de núcleo, de retículo endoplasmático, de mitocondrias y de ribosomas; todos estos componentes han sido expulsado de la célula durante el curso de su desarrollo (Figura 22-31). Por lo tanto, el eritrocito no puede crecer ni dividirse; la única vía posible de fabricar más eritrocitos es a partir de las células madre. Además, los eritrocitos tienen un ciclo vital limitado -d e unos 120 días en la especie humana o de 55 días en los ratones. Los eritrocitos envejecidos son fagocitados y digeridos por los macrófagos del hígado y del bazo, que eliminan hasta 1011 eritrocitos envejecidos en cada uno de nosotros cada día. La falta de oxígeno o una disminución del número de eritrocitos estimula a las células del riñón a sintetizar y segregar mayores cantidades de eritropoyeti na hacia la circulación sanguínea. La eritropoyetina, a su vez, estimula la pro ducción de más eritrocitos. El cambio producido en la velocidad de liberación de nuevos eritrocitos a la circulación sanguínea se detecta al cabo de 1 o 2 días después de increm entarse los niveles de eritropoyetina en la sangre circulante por lo que probablem ente la horm ona actúa sobre las células que constituyen los precursores más directos de los eritrocitos maduros. Se pueden identificar las células que son sensibles a la eritropoyetina culti vando células de la médula ósea sobre una matriz semisólida en presencia de esta hormona. Al cabo de unos cuantos días aparecen colonias de unos 60 eri trocitos, cada una de las cuales se forma a partir de una única célula progenitora eritroide determinada. Esta célula se conoce como célula form adora de colo nias de eritrocitos o CFC-E (de Erythrocyte Colony-Forming Cell), la cual da lu gar a eritrocitos maduros al cabo de seis ciclos de división o menos. Las CFC-E todavía no contienen hemoglobina y derivan de un tipo de progenitor inicial cuya proliferación no depende de la eritropoyetina. Las mismas CFC-E depen den de la eritropoyetina tanto para su supervivencia como para su proliferación: si se elimina la eritropoyetina de los cultivos, rápidamente las células experi mentan la muerte celular programada. Un segundo CSF, llamado interleuquina 3 (IL-3), activa la supervivencia y la proliferación de las células progenitoras eritroides tempranas. En su presencia se forman colonias eritroides más grandes, de más de 5000 eritrocitos cada una, las cuales se desarrollan a partir de cultivos de células de la médula ósea durante un proceso que requiere una semana o 10 días. Estas colonias derivan de las cé lulas progenitoras eritroides denominadas células formadoras rápidas de eri trocitos, o BFC-E (de Erythrocyte Burst-Forming Cells). Las BFC-E se distinguen de la célula madre pluripotencial en que tienen una capacidad limitada de proli feración y dan lugar a colonias que sólo contienen eritrocitos, incluso bajo con diciones de cultivo que permiten a otras células progenitoras originar otras cla-
125 2
Capítulo 22 : Células diferenciadas y conservación de los tejidos
Figura 22-31 Esquema del desarrollo un glóbulo rojo (eritroblasto). Se muestra cómo la célula expulsa el núcleo y se convierte en un eritrocito inmaduro (reticu locito), que más tarde abandona la médula ósea roja y pasa a la corriente sanguínea. El reticulocito elimina sus mitocondrias y ribosomas un día o dos antes de convertirse en un eritrocito maduro. Los clones de eritrocitos se forman en la médula ósea, en la superfìcie de un macròfago, que fagocita y digiere los núcleos desprendidos por los eritroblastos.
célula madre
ses de células sanguíneas diferenciadas. Se diferencian de las CFC-E en su insen sibilidad a la eritropoyetina, y en que su descendencia ha de llevar a cabo 12 di visiones antes de convertirse en eritrocitos maduros (para lo cual ha de estar presente la eritropoyetina). Estas células tam bién difieren de las CFC-E en su ta maño, de forma que ambas pueden separarse por sedimentación. Así pues, se cree que las BFC-E son un tipo de células progenitoras determinadas en la dife renciación de los eritrocitos y que constituyen un antepasado temprano de las CFC-E (Figura 22-32).
En la producción de los neutrófilos y de los macrófagos influyen múltiples CSF28 30 Los dos tipos de células fagocíticas especializadas, los neutrófilos y los macrófa gos, se forman a partir de una célula progenitora común denominada célula progenitora de granulocitos y m acrófagos o GM (de Granulocyte/Macrophage Progenitor Cell). Al igual que otros granulocitos (eosinófilos y basófilos), los neu trófilos circulan por la sangre únicamente durante unas horas antes de migrar desde los capilares hacia los tejidos conjuntivos u otras áreas específicas, donde sobreviven durante unos cuantos días y luego mueren y son fagocitados por los macrófagos. Los macrófagos, por el contrario, pueden sobrevivir durante meses o quizá incluso años fuera de la corriente sanguínea, donde pueden ser activa dos por señales locales reiniciando su proliferación. Hasta ahora se han definido hasta siete tipos distintos de CSF que estimulan la formación de colonias de neutrófilos y de macrófagos y se sabe que algunos o todos ellos actúan, en distintas combinaciones, regulando la producción selecti va de estas células in vivo. Estos CSF son sintetizados por varios tipos celulares -incluyendo las células endoteliales, fibroblastos, macrófagos y linfocitos- y su concentración en sangre aumenta rápidamente de forma característica como respuesta a la infección bacteriana de un tejido, aumentando así el número de células fagocíticas liberadas desde la médula ósea hacia la sangre circulante. IL-3 es uno de los factores menos específico y actúa tanto sobre células madre pluripotenciales com o sobre la mayor parte de las células progenitoras determ ina das, incluyendo las células progenitoras GM. Los otros factores actúan de forma más selectiva sobre las células progenitoras determinadas GM y su descenden cia diferenciada (Tabla 22-2), aunque en muchos casos afectan también a otros linajes de la familia hematopoyética.
2 eritrocitos m aduros Figura 22-32 El desarrollo de los glóbulos rojos. Interrelaciones entre las células BFC-E, las células CFC-E y el eritrocito maduro. Las células BFC-E y CFC-E son células progenitoras eritroides determinadas. Las BFC-E son sensibles al factor IL-3 pero no a la eritropoyetina, mientras que las CFC-E responden a la eritropoyetina. Las series de divisiones celulares que tienen lugar en este linaje bajo la influencia de la eritropoyetina dan un potente sistema de control de la producción de eritrocitos sin interferir en la producción de otros tipos celulares.
Tabla 22-2 Algunos factores estimulantes de colonias (CSF) que influyen en la formación de células sanguíneas Factor
Tamaño (en ratones)
Células diana
Células productoras
Receptores
Eritropoyetina
51 000 daltons
CFC-E
células del riñón
Interleuquina 3 (IL-3)
25 000 daltons
Granulocito/ macròfago CSF (GM-CSF) Granulocito CSF (G-CSF) Macròfago CSF (M-CSF) Factor Steel (factor de células madre)
23 000 daltons
célula madre pluripotencial, la linfocitos T, células mayor parte de células epidérmicas progenitoras, muchas células diferenciadas de forma terminal células progenitoras GM y linfocitos T, células neutrófilos endoteliales, fibroblastos
familia de las citoquinas familia de las citoquinas
células progenitoras GM y neutrófilos 70 000 daltons células progenitoras GM y (dimero) macrófagos 40-50 000 daltons célula madre hematopoyética (dimero)
25 000 daltons
macrófagos, fibroblastos fibroblastos, macrófagos, células endoteliales células de estroma en médula ósea y en muchas otras células
Renovación por medio de células madre pluripotenciales: formación de las células sanguíneas
familia de las citoquinas familia de las citoquinas familia de receptores tirosina quinasa familia de receptores tirosina quinasa
1253
subunidad común ¡3
IL-3 subunidad a del receptor IL-3
GM-CSF___
+
subunidad com ún (3
señal
subunidad re del receptor CM-CSF
señal receptores de baja afinidad
receptores de alta afinidad
Todos estos CSF, al igual que la eritropoyetina, son glucoproteínas que ac túan a bajas concentraciones (~ 1 0 12M) mediante su unión a receptores especí ficos de superficie, como estudiamos en el Capítulo 15. Algunos de dichos recep tores son tirosina quinasas transmembrana. Los restantes pertenecen a otra gran familia de receptores (denominada a veces la familia de receptores citoquinas), cuyos miembros se com ponen generalmente de dos o más subunidades, una de las cuales se encuentra con frecuencia entre algunos tipos de receptores (Figura 22-33) Los CSF no sólo actúan sobre las células precursoras provocando la formación de un linaje de células diferenciadas, sino que también activan fun ciones especializadas (tales como la fagocitosis y la destrucción de células diana) de células diferenciadas de forma terminal. Las proteínas producidas artificial mente a partir de los genes clonados para estos factores (en ocasiones conside rados como factores recombinantes debido a que se han formado utilizando tec nología del DNA recombinante) son fuertes estimuladores de la hematopoyesis en animales experimentales. Actualmente se utilizan en pacientes humanos para estimular la regeneración del tejido hematopoyético y aumentar la resis tencia a las infecciones -u n a impresionante demostración de cómo la investiga ción biológica básica de la célula y los experimentos con animales pueden con tribuir a la m ejora de un tratamiento médico. También se han descrito factores que estimulan el desarrollo de los restantes tipos de células mieloides, tales como los megacariocitos y los eosinófilos. Una vez más, existe una gran cantidad de dichos factores, y presentan una actividad solapada tal como se comprueba en los ensayos de laboratorio. No es fácil descu brir de forma precisa cuáles son sus funciones particulares en condiciones natu rales. Quizá la prueba más directa para conocer la función normal de un CSF es inactivar dicho CSF o su receptor en un organismo vivo y estudiar las consecuen cias. Esto se ha aplicado a algunos CSF. Anticuerpos anti-G-CSF, que neutralizan la actividad del G-CSF -u n CSF que estimula la producción de neutrófilos in vitro- se ha demostrado que producen un marcado descenso del número de neu trófilos cuando se inyectan a perros sanos, estableciéndose que el G-CSF es nece sario para la producción normal de neutrófilos. Los estudios genéticos pueden ser todavía mas demostrativos. Por ejemplo, ratones con una mutación en el gen que codifica el M-CSF son deficientes en macrófagos, así como en osteoclastos, que también se desarrollan a partir de los monocitos. Dado que los osteoclastos son necesarios para la resorción ósea (tal como estudiaremos más adelante) di chos ratones producen cantidades excesivas de hueso que invade la médula ósea y produce huesos anormalmente engrosados, disminuyendo así la formación de células sanguíneas -u n a alteración denominada osteopetrosis.
125 4
Capítulo 2 2 : Células diferenciadas y conservación de los tejidos
Figura 22-33 Reparto de subunidades entre los receptores CSF. Los receptores IL-3 humanos y los receptores GM-CSF poseen subunidades a distintas y subunidades (3 comunes. Sus ligandos se unen a las subunidades a con una baja afinidad, lo cual desencadena el ensamblaje de los heterodímeros que se unen al ligando con alta afinidad.
Las células madre hematopoyéticas dependen del contacto con células que expresan el factor Steel31 Los CSF que actúan en células madre pluripotenciales son los menos conocidos. Tal como hemos visto, IL-3 correspondería a este grupo. Otro factor parecido de im portancia fundamental se ha esclarecido a partir de análisis de ratones mutantes que presentan una curiosa com binación de defectos: una reducción del número de glóbulos rojos (anemia), de células germinales (esterilidad) y de célu las pigmentarias (manchas blancas en la piel). Tal como vimos en el Capítulo 21, este síndrome se origina a partir de mutaciones en algunos de estos dos genes: uno, denominado c-kit, codifica un receptor tirosina quinasa; el otro, denomi nado Steel, codifica su ligando. Todos los tipos celulares afectados por las muta ciones derivan de células precursoras móviles, y al parecer para que estos tipos celulares se produzcan en cantidades normales, dichas células precursoras de ben expresar en cada caso el receptor (Kit) y proveerse del ligando (Steel) a partir de su entorno. Al igual que IL-3, el factor Steel actúa en algunos de los linajes de células sanguíneas determinadas, incluyendo el linaje eritroide, así como en las células madre pluripotenciales, pero tiene un efecto reducido sobre sí mismo. Básica mente potencia los efectos de otros CSF incrementando notablemente el núm e ro y tamaño de todos los tipos de colonias de clones de células sanguíneas en cultivo. Tam bién constituye un CSF poco corriente en otro aspecto. Se encuen tra tanto en la forma vesicular como en la forma segregada, generadas por m a duración alternativa del mRNA, y parece que la forma vesicular es la más impor tante: los ratones mutantes que fabrican la forma segregada del factor Steel pero no la forma vesicular presentan deficiencias acusadas. Ello implica que la hem a topoyesis normal requiera el contacto directo célula-célula entre la célula madre hematopoyética y la célula del estroma que expresa el Steel y que únicamente mediante este contacto el factor Steel logra la activación de la proteína receptora Kit de forma eficiente. Debemos considerar dicho factor Kit como un correcep tor (como veremos en el Capítulo 23) que tiene que activarse simultáneamente con los receptores para los factores tales como IL-3 para la estimulación de la hematopoyesis. Esto podría ayudar a explicar por qué la hematopoyesis tiene lu gar únicamente en ciertos entornos especiales, como los que se hallan entre las células del estroma de la médula ósea, mientras que otros tejidos no manifiestan la invasión y la colonización aunque siempre se encuentren algunas células he matopoyéticas en la circulación sanguínea.
El comportamiento de una célula hematopoyética depende parcialmente del azar28,32 Llegados a este punto vamos a considerar una cuestión fundamental. Los CSF se han definido como factores que estimulan la producción de colonias de células sanguíneas diferenciadas. Pero, ¿qué efecto preciso ejerce un CSF sobre una célula hematopoyética individual? Un factor de este tipo podría controlar la velocidad de división celular o el número de ciclos de división que la célula progenitora presen ta en el transcurso de la diferenciación, o podría actuar tempranamente influyen do en su determinación; o podría actuar simplemente incrementando la probabi lidad de supervivencia celular (Figura 22-34). Mediante el seguimiento de un cultivo de células hematopoyéticas ha sido posible demostrar que un solo CSF, el GM-CSF, puede ejercer todos estos efectos distintos. Sin embargo, todavía no que da claro cuáles son las actividades que in vivo son más importantes. El comporta miento de las células madre pluripotenciales continúa siendo especialmente difí cil de determinar: estas células esenciales son escasas y se hallan muy dispersas -m enos de 1 de cada 1000 células de la médula ósea- y son extremadamente difí ciles de identificar claramente. Además, estudios in vitro indican que existe una elevado componente de azar en la forma de comportarse de la célula hematopoyética. El CSF no dicta di
Renovación por medio de células madre pluripotenciales: formación de las células sanguíneas
1255
PARAMETROS CONTROLABLES célula madre
1. Frecuencia de división de la célula madre 2. Probabilidad de m uerte de la célula madre 3. Probabilidad de que la célula madre descendiente se convierta en una célula progenitora responsable de la form ación de un tipo celular determ inado
4. Duración del ciclo de división de la célula progenitora determ inada 5. Probabilidad de m uerte de la célula progenitora
/A Ay
6. Núm ero de divisiones de las células progenitoras determ inadas que se producen antes de la diferenciación term inal 7. Ciclo vital de las células diferenciadas
célula sanguínea diferenciada term inal
rectam ente lo que debe hacer cada célula sino que actúa regulando probabilida des. En cultivos de células hematopoyéticas, incluso cuando las células seleccio nadas constituyen una población lo más homogénea posible, se produce una marcada variabilidad en cuanto a tamaños y a menudo en cuanto a característi cas de las colonias a que dan lugar. Dos células hermanas que se separen inm e diatamente después de una división y que se cultiven aparte bajo condiciones idénticas, frecuentem ente darán lugar a colonias que contengan distintos tipos de células sanguíneas, o los mismos tipos pero en cantidades distintas. Así pues parece que tanto en la programación de la división celular como en el proceso de la determinación de una célula en una vía particular de diferenciación parti cipan una serie de acontecim ientos aleatorios a nivel individual, aunque el com portamiento de un sistema multicelular en su conjunto se regula de forma más precisa.
La regulación de la supervivencia celular es tan importante como la regulación de la proliferación celular33 Aunque estas observaciones muestran que los CSF no son estrictamente necesa rios para ordenar a las células hematopoyéticas cómo deben diferenciarse o cuántas veces tienen que dividirse, los CSF son necesarios para el m antenim ien to de las células vivas: el comportamiento defectuoso de las células en ausencia de los CSF es suicida. En principio, los CSF deberían regular el número de los distintos tipos de células sanguíneas de forma completa mediante el control se lectivo de la supervivencia celular y existen evidencias de que el control selectivo de la supervivencia celular juega un papel fundamental en la regulación normal del número de células sanguíneas y, tal como vimos anteriormente para los hepatocitos, tam bién de muchos otros tipos celulares. Al parecer, en muchos teji dos las células están programadas para destruirse a sí mismas si no reciben se ñales específicas para su supervivencia. Ya hemos visto la importancia y el mecanismo de la muerte celular programada durante el desarrollo (véase pág. 1152); es un factor igualmente importante para el recambio y la renovación de las poblaciones celulares en el individuo adulto (Figura 22-35). Los genes que la
1256
Capítulo 2 2 : Células diferenciadas y conservación de los tejidos
Figura 22-34 Algunos de los parámetros que pueden regular la producción de un tipo determinado de células sanguíneas. Estudios in vitro sugieren que los factores estimuladores de colonias (CSF) pueden afectar todos estos aspectos de la hematopoyesis.
Figura 22-35 Muerte celular por apoptosis. La electronmicrografía muestra una célula apoptótica de la glándula mamaria. La muerte celular apoptótica es un hecho normal en dicha glándula, estabilizando la proliferación de las células epiteliales mamarias que se da en cada ciclo menstrual. Obsérvese la desintegración de la envoltura nuclear y las zonas oscuras de la cromatina condensada. Puede compararse con una zona de una célula normal, visible a un lado de la figura. (Cortesía de David Ferguson.)
regulan se han conservado durante la evolución hasta el punto que al menos uno de dichos genes, denominado bcl-2, que codifica un inhibidor intracelular de la muerte celular programada en células de mamíferos, puede llevar a cabo la misma función en células de un gusano nemátodo. Una frecuencia de muerte celular demasiado baja puede ser tan peligrosa para la salud de un organismo pluricelular como un exceso de proliferación, y las mutaciones que inhiben la muerte celular debido a una sobreexpresión del bcl-2 se hallan implicadas en el desarrollo del cáncer, tal como se verá en el Capítulo 24. El cantidad de muerte celular programada en el sistema hematopoyético de los vertebrados es enorme; por ejemplo, miles de millones de neutrófilos m ue ren de esta forma cada día en el hombre adulto. Aunque el m ecanismo de la muerte celular programada continúa siendo un misterio, generalmente las célu las que mueren experimentan una serie de cambios morfológicos característicos denominados apoptosis, durante los cuales la célula, incluido el núcleo, se con traen condensándose y con frecuencia se fragmentan. Por el contrario, las célu las que mueren accidentalmente, como resultado de una lesión aguda, general mente se hinchan y estallan -u n proceso denominado necrosis celular. Mientras las células que mueren por necrosis liberan su contenido citosólico al espacio extracelular y provocan una respuesta inflamatoria, las células que mueren por apoptosis desaparecen de una forma más eficiente para el organismo: rápida mente son fagocitadas por los macrófagos (u otras células vecinas) lo cual no provoca la liberación de com ponentes citosólicos ni respuesta inflamatoria. Una vez en el interior del macròfago, la célula apoptótica rápidamente se fragmenta y sus com ponentes básicos son reutilizados. Para activar este dispositivo, las células apoptóticas cambian la com posi ción química de su superficie de forma que puedan ser reconocidas por los m a crófagos. El m ecanismo de reconocim iento depende del tejido y del tipo de célu la sanguínea. En algunos casos una lectina de la superficie del macròfago parece que reconoce los grupos de azúcares alterados de la superficie de la célula apop tótica. En otros casos una integrina (como hemos visto en el Capítulo 19) de la superficie del macròfago reconoce una proteína de la matriz extracelular deno minada trombospondina, que es segregada por el macròfago y parece que actúa como puente entre éste y la célula apoptótica; se desconoce el m ecanismo por el cual la trombospondina se une a la célula apoptótica. En algún otro caso el m a cròfago es capaz de reconocer la fosfatidilserina, un fosfolípido cargado negati-
Renovación por medio de células madre pluripotenciales: formación de las células sanguíneas
1257
vamente que norm alm ente se localiza en la subcapa citosólica de la bicapa lipídica de la m em brana plasmática (véase Figura 10-11) pero aparentemente se resitúa en la subcapa extracelular de las células sanguíneas apoptóticas. Inde pendientem ente del sistema de reconocim iento utilizado, los macrófagos reac cionan frente a las células apoptóticas de forma específica: las engloban y las di gieren, pero no segregan señales inductoras de inflamación como ocurre cuando fagocitan y digieren células necróticas. Ésta es la segunda razón por la que la necrosis celular se asocia con la inflamación y la apoptosis no. Si bien los biólogos han centrado mucho más la atención en el control de la proliferación celular que en el control de la supervivencia, se observa claramente que ambos tipos de controles pueden servir para regular el número de células. Am bos tipos de controles dependen de señales específicas producidas por otras célu las, que aseguran que una célula se divida únicamente cuando se necesitan más cé lulas y que una célula sobreviva sólo cuándo y dónde se la necesita. El desafío reside en poder definir todas las señales que regulan la supervivencia y la prolifera ción de cada tipo celular, para determinar cómo se controlan sus niveles para equi librar la proliferación y la muerte celular de acuerdo con las distintas necesidades del organismo, y comprender cómo una única célula integra todas estas señales extracelulares y decide si vivir o morir y si dividirse o permanecer quiescente.
Resumen
Los principales tipos de células sanguíneas proceden de una célula madre pluripotencial común. En el individuo adulto las células madre se localizan principalmente en la médula ósea, donde normalmente se dividen, de tarde en tarde, produciendo más células madre (autorregenerantes) y varias células progenitoras determinadas que pueden dar lugar a uno o varios tipos de células sanguíneas. Las células progeni toras determinadas se dividen profusamente bajo la influencia de varias moléculas proteicas señal (denominadas factores estimuladores de colonias o CSF) y posterior mente se diferencian en células sanguíneas adultas, que generalmente mueren al cabo de unos cuantos días o semanas. Los estudios sobre la hematopoyesis han pro gresado enormemente gracias a experimentos in vitro, en los cuales las células madre o las células progenitoras implicadas forman colonias de tipo clónico cuando se culti van en una matriz semisólida. El linaje de células madre parece ejercer su selección entre vías de desarrollo alternativas de una forma parcialmente casual. La muerte celular, controlada por la disponibilidad de los CSF, también juega un papel funda mental en la regulación del número de células sanguíneas diferenciadas; depende de la activación de un suicidio intracelular programado y es capaz de contribuir a la re gulación del número de células en muchos otros tejidos y en otros grupos de animales. Génesis, modulación y regeneración del músculo esquelético34 El término “m úsculo” se aplica a un gran número de tipos celulares, todos ellos especializados en la contracción, pero distintos en otros aspectos. Como se dijo en el Capítulo 16, el sistema contráctil compuesto por actina y miosina es una característica básica de las células animales en general, aunque las células de tipo muscular han desarrollado este sistema hasta un grado elevado: los mam í feros poseen cuatro categorías principales de células especializadas en la con tracción: células del músculo esquelético, células musculares del corazón (o car díacas), fibras musculares lisas y células mioepiteliales (Figura 22-36). Estos tipos de células se diferencian en cuanto a función, estructura y desarrollo. Aunque todas ellas generan fuerzas de contracción mediante sistemas organizados de fi lam entos de actina y de miosina, las moléculas de actina y de miosina utilizadas son algo distintas en cuanto a su secuencia de aminoácidos, tienen una distribu ción espacial distinta y el control de la contracción se produce a través de su asociación con distintos conjuntos de proteínas.
125 8
Capítulo 2 2 : Células diferenciadas y conservación de los tejidos
Las células del músculo esquelético, cuyo aparato contráctil se discute en detalle en el Capítulo 16, son las responsables de prácticam ente todos los movi m ientos que están bajo control voluntario. Estas células pueden ser muy largas (2 o 3 cm de largo y 100 jxm de diámetro en un humano adulto) por lo que a m e nudo se les denomina fibras musculares. Cada una de ellas es un sincitio que contiene varios núcleos en un citoplasma común. Los otros tipos de células musculares son más convencionales, y tienen un solo núcleo. Las células m us culares cardíacas se parecen a las células musculares esqueléticas en que sus filamentos de actina y miosina están alineados de una forma muy ordenada, formando series de unidades contráctiles denominadas sarcómeros, de forma que las células tienen una apariencia estriada. Las células del músculo liso re ciben este nombre porque, contrariamente, no tienen aspecto estriado. Las funciones del músculo liso son muy variadas y abarcan desde la propulsión del alimento a lo largo del tracto digestivo hasta la erección de los pelos como res puesta al frío o al miedo. Las células mioepiteliales tam bién carecen de estrías pero, a diferencia de los demás tipos de fibras musculares, se hallan en los epi telios y derivan del ectodermo. Forman el músculo dilatador del iris y también actúan expulsando la saliva, el sudor y la leche de las glándulas correspondien tes (véase Figura 22-36E). Las cuatro categorías principales de fibras m uscula res se pueden dividir en varios subtipos, cada uno de los cuales tiene sus rasgos característicos.
(A)
célula de m úsculo cardíaco
célula de m úsculo liso
célula m ioepitelial
..
Figura 22-36 Las cuatro clases de células musculares de un mamífero. (A) Esquemas (a escala). (B-E) Electronmicrografías de barrido, en las que aparecen (B) músculo esquelético del cuello de hámster, (C) músculo cardíaco de rata, (D) músculo liso de la vejiga urinaria de cobaya y (E) células mioepiteliales en un alvéolo secretor de una glándula mamaria de rata lactante. Las flechas en (C) señalan los discos intercalares -u niones entre los extremos de las células musculares del corazón; las células de la musculatura esquelética de los grandes músculos unen un extremo con otro de forma similar. Obsérvese que el músculo liso se ha presentado en esta figura a menos aumentos que los restantes. (B, por cortesía de Junzo Desaki; C, de T. Fujiwara, en Cardiac Muscle en Handbook of Microscopic Anatomy [E.D. Canal ed.]. Berlín: Springer Verlag, 1986; D, por cortesía de Satoshi Nakasiro; E, de T. Nagato, Y. Yoshida, A. Yoshida, e Y. Uehara, Cell a n d Tissue Res. 209:1-10,1980.)
célula de m úsculo esquelético I
11
I______ I
50 |im
c é lu la s d e
m úsculo cardíaca
fibras célula m ioepitelial célula secretora de lechc
haz de células de m úsculo liso 50 um
Génesis, modulación y regeneración del músculo esquelético
10 [jm
1259
ÍA) 100 | jm
Los mecanism os de la contracción muscular se han visto en el Capítulo 16; en este capítulo vamos a considerar cómo se genera y se mantiene el tejido mus cular. Nos centraremos en la célula del músculo esquelético, que presenta un modelo especial de desarrollo y tam bién una notable capacidad para modular su carácter diferenciado, así como una estrategia especial de regeneración.
Las nuevas células del músculo esquelético se forman por fusión de los mioblastos2,35 En el capítulo anterior describíamos cómo ciertas células, originadas a partir de los somitos de un embrión de vertebrado en un estadio muy temprano, quedan determi nadas como mioblastos (es decir, precursoras de las células del músculo esquelético) y migran hacia el tejido conjuntivo embrionario adyacente o mesénquima. Tal como se trató en el Capítulo 9, parece que la determinación de constituir un mioblasto (y también la de constituir un fibroblasto) depende de la activación de uno o más genes miogénicos, que codifican proteínas reguladoras de genes, de la familia hélice-buclehélice. Después de un período de proliferación, los mioblastos se fusionan entre sí formando células del músculo esquelético plurinucleadas (Figura 22-37). Al fusionar se sufren un marcado cambio de fenotipo que depende de la activación coordinada de un conjunto de genes específicos de la célula muscular. Una vez se ha producido la fusión, los núcleos ya no replican más su DNA. La fusión implica moléculas de ad hesión célula-célula que intervienen en el reconocimiento entre los mioblastos. Mioblastos que se han mantenido en proliferación en un cultivo celular du rante dos años todavía conservan la capacidad de diferenciarse y de fusionarse formando fibras musculares en respuesta a un cambio adecuado de las condi ciones de cultivo. Parece que la presencia en el medio del factor de crecimiento de fibroblastos (FGF, de Fibroblast Growth Factor) es esencial para mantener la proliferación de los mioblastos e impedir su diferenciación: si se elimina el FGF, las células detienen rápidamente sus procesos de división, se fusionan y se dife rencian. Sin embargo, el sistema de controles es complejo. Por ejemplo, para di ferenciarse los mioblastos deben adherirse a la matriz extracelular. Por otro lado, el proceso de fusión es cooperativo: los mioblastos que se fusionan segre gan factores que incitan a otros mioblastos a fusionarse. En el animal intacto los mioblastos y las fibras musculares se sostienen en las mallas de una red de tejido conjuntivo formada por los fibroblastos. Esta red coordina el desarrollo muscu lar y controla la ordenación y la orientación de las fibras musculares.
1260
Capítulo 22 : Células diferenciadas y conservación de los tejidos
35 |jm Figura 22-37 Fusión de m ioblastos en cultivo. Micrografías de contraste de fases de mioblastos en cultivo, en las que se observa cómo las células van proliferando, se alinean y luego se fusionan formando células musculares plurinucleadas. A mayores aumentos (C) se observan las estriaciones transversales que empiezan a visualizarse al desarrollarse el aparato contráctil {flech a roja), así como las acumulaciones de numerosos núcleos dentro de una misma célula {flechas verdes). (Cortesía de Rosalind Zalin.)
(B)
I-------------------1 100
|_j m
Las fibras musculares pueden modular sus propiedades mediante cambios de las proteínas isoformas que poseen36 Generalmente cuando una célula de músculo esquelético se ha formado, se mantiene durante todo el ciclo vital del animal. Durante este período, crece, m a dura y modula sus características según los requerimientos funcionales. El genoma contiene múltiples copias variantes de los genes que codifican la mayoría de las proteínas características de la célula muscular esquelética, y además los transcritos de RNA de estos genes pueden madurar de distintas formas. Como resultado de ello, para los com ponentes del aparato contráctil se pueden produ cir numerosas variantes proteicas (isoformas). A medida que la célula va madu rando, se van produciendo distintas selecciones de isoformas proteicas, adapta das a las sucesivas demandas de velocidad, fuerza y resistencia en el feto, en el recién nacido y en el adulto. En el músculo de un individuo adulto, se pueden encontrar adosados distintos tipos de fibras musculares esqueléticas, cada uno de ellos con un conjunto distintos de proteínas isoformas y con distintas propie dades funcionales (Figura 22-38).
Figura 22-38 Fibras musculares rápidas y lentas. Dos cortes consecutivos de un mismo fragmento de músculo de pollo se han teñido con dos anticuerpos fluorescentes, cada uno específico para una isoforma distinta de la miosina II. En (A) células especializadas en la producción de contracciones rápidas se tiñen con anticuerpos contra miosina “rápida”; en (B) las células especializadas en la producción de contracciones lentas y sostenidas se tiñen con anticuerpos contra miosina “lenta”. Las células de contracción rápida se conocen como fibras musculares blancas, debido a su contenido relativamente bajo en una proteína de color rojo que une oxígeno, la mioglobina; las células musculares lentas se denominan fibras musculares rojas debido a su mayor contenido en dicha proteína. Las células pueden ajustar su carácter lento o rápido mediante cambios de la expresión génica según el tipo de estímulo nervioso que reciben. (De G. Gauthier et al., /. Cell Biol. 92:471-484, 1982, con permiso de copyright de The Rockefeller University Press.)
En el adulto persisten algunos mioblastos como células madre quiescentes37 Un músculo puede crecer de tres maneras: sus fibras musculares diferenciadas pueden aumentar en número, en longitud o en grosor. Debido a que las fibras musculares esqueléticas no pueden dividirse, la mayor parte de ellas se forman por fusión de mioblastos. El número fibras musculares esqueléticas plurinuclea das que tiene un adulto se alcanza en una etapa temprana -e n la especie hum a na antes del nacimiento. El enorme incremento posterior del volumen muscular se produce por aumento del volumen de las células. El crecimiento en longitud depende de la incorporación de más mioblastos a una célula plurinucleada ya formada, principalmente por fusión a nivel de los extremos, con lo cual se incre menta el número fie núcleos de cada célula. En contraposición, el crecimiento en grosor, tal como ocurre en los músculos de los levantadores de pesas, depen de de un increm ento del volumen muscular y del número de las miofibrillas contráctiles que contiene cada fibra muscular más que de variaciones del núm e ro de las fibras musculares o de sus núcleos. En el adulto, sin embargo, persiste un pequeño número de mioblastos en forma de células inactivas, pequeñas y aplanadas, en estrecho contacto con la
Figura 22-39 Autorradiografía de una sola célula muscular plurinucleada con células satélite asociadas. La fibra se ha aislado a partir de una rata adulta y se ha transferido a un medio de cultivo que contenía timidina 3H y un extracto de un músculo lesionado, que estimula la división de las células satélite. Las células satélite en división (flechas) aparecen marcadas radiactivamente (los granos de plata se visualizan como puntos negros); los núcleos de la célula muscular no tienen posibilidad de proliferar y permanecen sin marcar. (De R. Bischoff, Dev. Biol. 115:140-147,1986.)
Génesis, modulación y regeneración del músculo esquelético
20 |jm
1261
célula muscular madura y localizados a nivel de la lámina basal. Si se lesiona el músculo o se trata artificialmente con FGF, estas denominadas células satélite se activan y proliferan (Figura 22-39) y su descendencia puede fusionarse forman do nuevas fibras musculares. Las células satélite constituyen las células madre de la musculatura esquelética de un adulto, que normalmente se mantienen en reserva en un estado quiescente pero que son utilizables cuando se requiere una autorrenovación de células diferenciadas de forma terminal. Aunque este m ecanism o de reparación muscular funciona bien en animales pequeños com o el ratón, es m enos eficiente en el hombre. Por ejemplo, en la distrofia muscular, las fibras musculares esqueléticas diferenciadas mueren de bido a un defecto genético en la proteína del citoesqueleto distrofina (véase pág. 917). Como resultado de ello, las células satélite proliferan formando nuevas fi bras musculares; pero dicha respuesta regenerativa no consigue ajustarse a la le sión y las fibras musculares quedan finalmente reemplazadas por tejido conjun tivo, bloqueando cualquier posibilidad posterior de regeneración.
Resumen
Las células del músculo esquelético constituyen una de las principales categorías celulares de los vertebrados especializadas en la contracción; son responsables del movimiento voluntario. Cada célula del músculo esquelético es un sincitioyse de sarrolla por la fusión de mioblastos. Los mioblastos son estimulados para proli/erar por factores de crecimiento, como el FGF, pero una vez se han fusionado, ya no pueden volver a dividirse. Generalmente la fusión de los mioblastos se halla aco plada con el programa de la diferenciación de la fibra muscular, en la cual varios genes que codifican las proteínas específicas del músculo actúan deforma coordi nada. En el músculo del individuo adulto persisten algunos mioblastos (en estado quiescente) como células satélite; cuando se lesiona un músculo, estas células se reactivan, proliferando y fusionándose, y reemplazando las fibras musculares perdidas. Los fibroblastos y sus transformaciones: la familia de las células del tejido conjuntivo38 En el individuo adulto, la mayor parte de las células diferenciadas pueden agru parse en familias cuyos miembros se hallan estrechamente relacionados entre sí en función de su origen y de sus características. Un ejemplo importante lo cons tituye la familia de las células del tejido conjuntivo, cuyos componentes no sólo están relacionados sino que tam bién son interconvertibles en un alto grado. Esta familia incluye fibroblastos, condrocitos y osteocitos, células todas ellas especiali-
célula ósea (osteoblasto/osteocito)
célula cartilaginosa ¡ginosa Figura 22-40 La familia de células del (condrocito) :ito) ... _ , _ . ||f|ͧ|||\
MÂ
célula del m úsculo liso célula adiposa (adipocito)
12 6 2
Capítulo 2 2 : Células diferenciadas y conservación de los tejidos
tejido conjuntivo. Las flechas senalan las interconversiones que posiblemente tienen lugar entre las células de la familia del tejido conjuntivo. Para mayor simplicidad, el fibroblasto aparece como un tipo celular único, aunque de hecho se desconoce cuántos tipos de fibroblastos existen y si la diferenciación potencial de los distintos tipos puede restringirse de formas distintas.
Figura 22-41 El fibroblasto. (A) Micrografia en contraste de fases de un fibroblasto en cultivo. (B) Esquemas de una célula viva similar a un fibroblasto, de la cola transparente de un renacuajo, en el que aparecen los cambios de forma y de posición en días sucesivos. Obsérvese que los fibroblastos en cultivo se aplanan pero que en los tejidos pueden presentar morfologías más complejas, formando diferentes expansiones. (A, por cortesía de Daniel Zicha; B, dibujado a partir de E. Clark, Am. J. Anat. 13:351379,1912.)
zadas en la secreción de la colágena de la matriz extracelular y que en conjunto son las responsables del soporte arquitectónico del cuerpo, así como los adipocitos y las fibras musculares lisas, que parecen tener un origen común con las an teriores. En la Figura- 22-40 se ilustran estos tipos celulares y las interconversiones que tienen lugar entre ellos. Las células del tejido conjuntivo juegan un papel fundamental en el sostén y en la reparación de la mayor parte de los teji dos y órganos; la adaptabilidad de su carácter diferenciado constituye uno de los aspectos más importantes de las respuestas frente a distintos tipos de lesiones.
Los fibroblastos cambian sus características en respuesta a señales de la matriz extracelular38,39 Los fibroblastos son las células menos especializadas de la familia del tejido con juntivo. Se hallan dispersas en el tejido conjuntivo de todo el cuerpo, donde se gregan una matriz extracelular blanda rica en colágena de tipo I o de tipo III, tal com o vimos en el Capítulo 19. Cuando se lesiona un tejido, los fibroblastos migran hacia la herida, proliferan y producen grandes cantidades de colágena, la cual contribuye al aislamiento y reparación de los tejidos dañados. Su capacidad para desplazarse en el momento de una lesión, junto con el sistema de vida soli tario que presentan, podría explicar por qué los fibroblastos son las células que crecen más fácilmente en cultivo -u n a característica que las ha hecho el elem en to fundamental en los estudios de biología celular (Figura 22-41). Tal como se indica en la Figura 22-40, parece que los fibroblastos son las cé lulas más versátiles del tejido conjuntivo, ya que poseen una notable capacidad para diferenciarse en otros miembros de la misma familia. Sin embargo, existen algunos puntos oscuros acerca de dichas interconversiones. Existe una eviden cia clara de que los fibroblastos de distintas partes del cuerpo son intrínseca mente distintos y está totalmente comprobado que todos los fibroblastos de una región determinada son equivalentes. Ante la falta de evidencias que prueben lo contrario, lo más sencillo es suponer que efectivamente son equivalentes, aun que es igualmente posible que el tejido conjuntivo pueda contener una mezcla de linajes procedentes de fibroblastos distintos, algunos de ellos capaces de transformarse en condrocitos, otros en adipocitos, etc., en lugar de que un solo tipo de fibroblasto posea múltiples capacidades de desarrollo. Es posible tam bién que puedan coexistir los fibroblastos “maduros” incapaces de transformar se junto con fibroblastos "inmaduros” (frecuentemente denominados células mesenquimáticas), los cuales pueden dar lugar a una gran variedad de tipos ce lulares maduros. A pesar de estas indeterminaciones, a partir de estudios realizados tanto in vivo como in vitro, existe una evidencia clara de que las células del tejido con juntivo pueden sufrir cam bios radicales de sus características. En este sentido, si se obtiene una preparación de matriz ósea mediante raspado del hueso hasta obtener un polvo fino, se elimina por disolución el com ponente mineral duro y se implanta en la capa dérmica de la piel, algunas de las células (posiblemente fibroblastos de la dermis) se transforman en células cartilaginosas y, algo más tarde, otras lo hacen en células óseas, de tal forma que constituyen una pequeña protuberancia de hueso que se completa con una cavidad medular. Este tipo de experimentos sugiere que los com ponentes de la matriz extracelular pueden in-
Los fibroblastos y sus transformaciones: la familia de las células del tejido conjuntivo
día 2
(B)
día 4
1263
fluir notablem ente en la diferenciación celular del tejido conjuntivo. Veremos más adelante que transformaciones celulares muy similares a éstas son impor tantes en la reparación espontánea de fracturas óseas. De hecho, se ha detecta do que la matriz ósea contiene en su interior concentraciones elevadas de algu nos factores de crecim iento que pueden afectar el comportamiento de las células del tejido conjuntivo, incluyendo, en particular, el factor (3 de transfor m ación del crecim iento TGF-(3 (de Transforming Growth Factor (3), y un conjun to de diversas proteínas morfogenéticas del hueso (BMP, de Bone Morphogenetic Proteins) que pertenecen a la superfamilia TGF-p. Estos factores constituyen po tentes reguladores del crecimiento, diferenciación y síntesis de la matriz por cé lulas del tejido conjuntivo, ejerciendo distintas acciones que dependen del tipo de célula diana y de la com binación con otros factores y componentes de la m a triz que se hallan presentes. Cuando se inyectan en un organismo vivo, pueden inducir formación de cartílago, de hueso o de matriz fibrosa, según la zona y las circunstancias de la inyección.
La matriz extracelular puede influir en la diferenciación de las células del tejido conjuntivo, afectando a su adhesión y a su forma40 La matriz extracelular puede influir en el estado de diferenciación de las células del tejido conjuntivo, mediante efectos físicos o químicos. Esto se ha demostra do en estudios realizados sobre cultivos de células cartilaginosas o condrocitos. Bajo condiciones de cultivo apropiadas, estas células proliferan y mantienen su carácter diferenciado, manteniendo durante muchas generaciones la síntesis de grandes cantidades de una matriz cartilaginosa notablemente característica, que las rodea por completo. Sin embargo, bajo condiciones en las que las células se mantienen a una densidad relativamente baja y permanecen en forma de monocapa en la placa de cultivo, tiene lugar una transformación. Las células pierden la forma redondeada típica de los condrocitos, se aplanan contra el substrato y dejan de fabricar matriz cartilaginosa. Concretamente dejan de producir coláge na de tipo II -la característica del cartílago- y en su lugar empiezan a producir colágena de tipo I -la característica de los fibroblastos. Al cabo de un mes de cul tivo, casi todas las células han modificado la expresión génica de la colágena y presentan aspecto de fibroblastos. Probablemente los cambios bioquímicos de ben de producirse de forma brusca, ya que sólo unas cuantas células fabrican si multáneamente ambos tipos de colágena. Algunas líneas de evidencia sugieren que los cambios bioquímicos están in ducidos, al menos en parte, por cambios producidos en la forma y en la adhe sión celular. Por ejemplo, las células del cartílago que han realizado la transición al carácter fibroblástico pueden irse separando poco a poco de la placa de culti vo y transferirse a una placa de agar. Al formar el depósito de gel a su alrededor, el agar m antiene las células en suspensión sin ningún tipo de adhesión al subs trato, viéndose obligadas a adoptar una forma redondeada. En estas condicio nes, las células revierten inmediatamente al carácter de condrocitos y empiezan a fabricar de nuevo colágena de tipo II. La forma y la adhesión de la célula puede controlar la expresión génica mediante señales intracelulares generadas en for ma de contactos focales, tal como vimos en el Capítulo 16. Para la mayoría de tipos celulares y especialmente para las células del teji do conjuntivo, las posibilidades de anclaje y adhesión dependen de la matriz circundante, que generalmente está elaborada por las propias células. De este modo una célula puede crear un entorno que posteriormente actúa sobre sí misma reforzando el estado diferenciado. Además, la matriz extracelular que segrega una célula forma parte tanto de su propio entorno como del de las célu las vecinas, lo cual provoca un mismo tipo de diferenciación en estas células próximas. Por ejemplo, se puede observar que un grupo de condrocitos que constituyen un nódulo de cartílago se expande, tanto en el organismo en desa rrollo com o en una placa de cultivo, debido a la conversión en condrocitos de los fibroblastos vecinos.
126 4
Capítulo 2 2 : Células diferenciadas y conservación de los tejidos
núcleo
gotas lipídicas célula precursora sim ilar a un fibroblasto
adipocito
Figura 22-42 Desarrollo de un adipocito. Una célula precursora similar a un fibroblasto se convierte en una célula adiposa madura mediante acumulación y coalescencia de gotas lipídicas. El proceso es, por lo menos parcialmente, reversible, tal como indican las flechas. Las células en los estadios temprano e intermedio pueden dividirse, pero la célula adiposa madura ya no puede hacerlo.
Distintas moléculas señal actúan de forma secuencial regulando la producción de adipocitos41 Se cree que las células adiposas o adipocitos también se originan a partir de cé lulas similares a los fibroblastos, tanto en condiciones normales de desarrollo de los mamíferos com o en circunstancias patológicas -p or ejemplo, en la distrofia muscular, en la que las fibras musculares mueren y gradualmente son reempla zadas por tejido adiposo. La diferenciación de la célula adiposa se inicia con la producción de enzimas específicas, seguida de una acumulación de gotas lipídicas que posteriormente se fusionan y ensanchan hasta que toda la célula queda enorm em ente dilatada, de forma que tan sólo queda un fino cordón de citoplas ma alrededor de la masa lipídica (Figura 22-42). El proceso puede estudiarse en cultivo (utilizando líneas celulares de fibro blastos como las células 3T3 de ratón), de forma que se pueden analizar los fac tores que influyen en ellos. En un principio se observó que el desarrollo de célu las adiposas en cultivo requería la presencia de suero bovino fetal, un aditivo corriente para los medios de cultivo. El factor crucial del suero que desencadena la diferenciación celular fue posteriormente identificado como hormona del cre cimiento -u n a proteína que normalmente segrega a la circulación sanguínea la hipófisis. Se ha demostrado que la hormona del crecimiento estimula la diferen ciación tanto del condrocito como de la célula adiposa, y que actúa de esta for ma tanto in vivo como in vitro. Sin embargo la hormona de crecimiento no es la única molécula señal segregada que regula el desarrollo de la célula adiposa. Los precursores celulares de los adipocitos que se han estimulado mediante la hor mona de crecim iento se vuelven sensibles a IGF -1 (de Insulinlike Growth Factor1), el cual estimula la proliferación de los adipocitos en diferenciación. La diferenciación de las células adiposas, al igual que la de los condrocitos, tam bién está influida por factores que afectan a la forma y al anclaje celulares. La diferenciación de las células 3T3 a células adiposas, por ejemplo, queda inhi bida si las células se dejan expandir sobre una placa de cultivo recubierta con fibronectina, a la que se adhieren fuertemente. Sin embargo, esta inhibición re vierte mediante el tratamiento con el fármaco citocalasina, que disgrega los filamentos de actina y provoca que las células se dispongan en la periferia. Todos estos experimentos con células del tejido conjuntivo ilustran un con cepto recurrente: la diferenciación viene regulada por una com binación de se ñales solubles y de contactos con la matriz extracelular. Los efectos de cada uno de estos factores dependen de las características de la célula afectada lo cual, a su vez, depende de la historia del desarrollo de la célula.
El hueso se remodela continuamente por medio de las células que lo constituyen42 El hueso constituye una modalidad muy densa y especializada del tejido con juntivo. Como el hormigón armado, la matriz ósea está formada principalmente por una m ezcla de fibras resistentes (fibrillas de colágena de tipo I), que resisten las fuerzas de presión, y de partículas sólidas (fosfato cálcico y cristales de hidro-
Los fibroblastos y sus transformaciones: la familia de las células del tejido conjuntivo
1265
xiapatita), que resisten la compresión. El volumen ocupado por la colágena es prácticam ente igual que el que ocupa el fosfato cálcico. En el hueso adulto las fi brillas de colágena se ordenan en capas regulares en forma estratificada, de tal manera que las fibrillas de cada capa se disponen paralelas entre sí, pero per pendiculares respecto a las fibrillas de las capas contiguas. A pesar de proporcionar esta gran rigidez el hueso no es, aunque parezca lo contrario, un tejido inmutable y permanente. Atravesando su dura matriz extracelular se hallan conductos y cavidades ocupados por células vivas, que alcan zan alrededor de un 15% del peso del hueso compacto. Estas células se hallan implicadas en un incesante proceso de remodelaje: un tipo de células destruye la matriz ósea envejecida mientras que otras células depositan matriz ósea nue va. Este m ecanismo posibilita una continua renovación y substitución de la m a triz en el interior del hueso. El hueso únicamente puede crecer por aposición, es decir, mediante el de pósito de matriz adicional y de células sobre las superficies libres del tejido duro. En el embrión, este proceso debe producirse de forma coordinada con el creci miento de los demás tejidos, de modo que el patrón corporal pueda aumentar de escala sin que se alteren radicalmente sus proporciones. Para la mayor parte del esqueleto y en particular para los huesos largos de las extremidades y del tronco, el crecim iento coordinado se consigue mediante una com pleja estrate gia. En el embrión se forma primero un conjunto de diminutos “modelos a esca la” de los huesos, a base de cartílago. Cada modelo a escala crece, y a medida que se forma más cartílago, el cartílago viejo se substituye por hueso. El creci miento y la erosión del cartílago y el depósito de hueso durante el desarrollo es tán coordinados de una forma tan ingeniosa que el hueso adulto, aunque pueda tener medio metro de largo, tiene casi la misma forma que el modelo cartilagi noso inicial, que únicamente medía unos cuantos milímetros.
Los osteoblastos segregan matriz ósea, mientras que los osteoclastos la erosionan40,42,43 El cartílago es un tejido sencillo, constituido por un único tipo de células -lo s condrocitos- inmersos en una matriz más o menos uniforme. Esta matriz carti laginosa es deformable, y el tejido crece por expansión a medida que los condro citos se dividen y segregan nueva matriz (Figura 22-43). El hueso es un tejido más complejo. La matriz ósea está segregada por los osteoblastos, que se hallan en la periferia de la matriz existente y depositan nuevas capas de hueso sobre ellas. Algunos osteoblastos permanecen libres en la periferia, mientras que otros quedan gradualmente englobados en su propia secreción. Este material recién fabricado (formado principalmente por colágena de tipo I) recibe el nombre de osteoide. Se transforma rápidamente en matriz ósea dura, mediante el depósito de cristales de fosfato cálcico en su interior. Una vez aprisionada en la matriz dura, la célula original formadora de hueso, llamada ahora osteocito, ya no tiene oportunidad de dividirse, aunque continúa segregando a su alrededor, en pe queñas cantidades, más cantidad de matriz. El osteocito, al igual que el condrocito, ocupa una pequeña cavidad o laguna en la matriz, pero a diferencia del condrocito no está aislado de los otros osteocitos. Desde cada laguna parten unos diminutos conductos o canalículos, que albergan las prolongaciones celuFigura 22-43 Crecimiento del cartílago. El tejido se expande a medida que los condrocitos se dividen y producen más cantidad de matriz. La matriz recién sintetizada, con la que se rodea cada célula, está sombreada en verde oscuro. El cartílago también puede crecer incorporando fibroblastos del tejido periférico y convirtiéndolos en condrocitos.
126 6
Capítulo 2 2 : Células diferenciadas y conservación de los tejidos
célula osteogénica (precursora del — osteoblasto)
Figura 22-44 Depósito de matriz ósea por los osteoblastos. Los osteoblastos que revisten la superficie del hueso segregan la matriz orgánica del hueso (osteoide) y se transforman en osteocitos al quedar englobados por esta matriz. La matriz se calcifica poco después de haber sido depositada. Parece que los propios osteoblastos derivan de las células madre osteogénicas que se hallan estrecham ente relacionadas con los fibroblastos.
osteoblasto osteoide (m atriz ósea no calcificada) m atriz ósea calcificada prolongación celular en el conducto calcóforo osteocito 10 |jm lares del osteocito que reside en ellas, permitiéndole formar uniones de com uni cantes con los osteocitos adyacentes (Figura 22-44). Aunque los osteocitos no segregan ni erosionan cantidades apreciables de matriz por sí mismos, es proba ble que desempeñen un papel importante en el control de las actividades de las células que sí lo hacen. La matriz ósea es generada por los osteoblastos, y se erosiona por los osteoclastos (Figura 22-45). Estas grandes células plurinucleadas se originan, al igual que los macrófagos, a partir de células madre hematopoyéticas de la médula ósea. Las células precursoras se liberan como monocitos hacia la corriente san. guinea y se agrupan en las áreas de resorción ósea, donde se fusionan dando lu gar a osteoclastos plurinucleados que se fijan a las superficies de la matriz ósea y la destruyen. Los osteoclastos son capaces de abrir profundos túneles en la subs tancia intercelular del hueso compacto, formando cavidades que posteriormen te son invadidas por otras células. Un capilar sanguíneo crece hacia el centro de cada túnel y las paredes del túnel quedan tapizadas por una capa de osteoblas tos (Figura 22-46). Para producir la estructura estratificada del hueso compacto,
lisosomas
Figura 22-45 Sección transversal de un osteoclasto. Esta célula gigante
varios núcleos
cierre herm ético
m atriz ósea
multinucleada erosiona la matriz ósea. El “ribete estriado” es una zona de secreción de ácidos (que disuelven los minerales del hueso) y de hidrolasas (que digieren los com ponentes orgánicos de la matriz). Los osteoclastos varían en cuanto a forma, son móviles, y a menudo forman prolongaciones que reabsorben el hueso en distintas zonas. Se originan a partir de los m onocitos y se pueden considerar macrófagos especializados. (De R.V. Krstic: Ultrastructure of the Mammalian Cell: An Atlas. Berlin: Springer, 1979.)
ribete estriado del osteoclasto
Los fibroblastos y sus transformaciones: la familia de las células del tejido conjuntivo
1267
Figura 22-46 El remodelado del hueso compacto. Los osteoclastos, osteoblasto que actúan juntos como un pequeño quiescente (célul grupo, excavan un túnel a través del ósea lim itante) hueso viejo, avanzando a una vaso sanguineo < velocidad de aproximadamente 50 |im pequeño calibre al día. Los osteoblastos penetran tras célula endotelial ellos en el túnel, revisten sus paredes y hueso nuevo empiezan a formar hueso nuevo m atriz ósea nueva depositando matriz a una velocidad de todavía no calcificada fibroblasto 1-2 nm al día. Al mismo tiempo, un hueso viejo capilar crece a lo largo del centro del osteocito túnel. Finalmente, el túnel quedará tejido conjuntivo laxo lleno de capas concéntricas de hueso formado de nuevo, únicamente con un estrecho conducto central. Cada uno capilar creciendo osteoblasto a pu de estos conductos, además de dentro del túnel de depositar hue constituir una vía de acceso para los form ado de nue\ osteoclasto excavando osteoclastos y los osteoblastos, que llenará el túr un túnel a través del excavado contiene uno o más vasos sanguíneos hueso viejo que transportan los nutrientes que las células óseas necesitan para sobrevivir. 100 pm De esta manera cada año se substituye un 5-10% del hueso de un mamífero adulto sano. (Según Z.F.G. Jaworski, B. estos osteoblastos depositan capas concéntricas de hueso recién formado, que Duck y G. Sekaly, J. Anat. 133.397-405, gradualmente llena la cavidad, dejando únicamente un estrecho canal que ro 1981.) dea al nuevo vaso sanguíneo. Muchos de los osteoblastos quedan atrapados en la matriz ósea y sobreviven en los anillos concéntricos que forman los osteocitos. Al mismo tiempo que algunos de los túneles se llenan de hueso, otros que dan perforados por los osteoclastos, que de este modo se abren paso a través de sistemas concéntricos más antiguos. Las consecuencias de este remodelaje constante se ponen claram ente de manifiesto en los bonitos patrones estratifi Figura 22-47 Sección transversal de cados de la matriz que se observan en el hueso compacto (Figura 22-47). una región compacta externa de un Todavía existen muchos problemas no resueltos en cuanto a estos procesos. hueso largo. La micrografía muestra Por ejemplo, los huesos presentan una marcada capacidad de adaptación frente los límites de los túneles formados por a la carga que deben soportar, debido al remodelaje de su estructura, lo cual im los osteoclastos y posteriormente rellenados por los osteoblastos plica que el depósito y la erosión de la matriz están de alguna forma controlados durante períodos sucesivos de por un desgaste m ecánico local. No se conocen los mecanismos que determinan remodelaje del hueso. La sección se ha preparado mediante la técnica de desgaste. La matriz dura ha quedado conservada, pero no así las células. Sin embargo, las lagunas y los conductos calcóforos que habían estado ocupados por los osteocitos son claramente visibles. Los anillos concéntricos claros y oscuros en alternancia corresponden a una conducto antiguo orientación alternante de las fibras de colágena en las sucesivas capas de la conducto nuevo matriz ósea depositada por los osteoblastos que en vida revestían la laguna ósea pared del conducto. (Este modelo se revela aquí observando la muestra entre filtros polaroid parcialmente cerrados.) Obsérvese cómo el sistema más viejo de capas concéntricas de hueso de la parte inferior derecha se ha cortado parcialmente y se ha reemplazado por sistemas más 100 pm nuevos.
126 8
Capítulo 22 : Células diferenciadas y conservación de los tejidos
que la matriz sea depositada por los osteoblastos o bien sea erosionada por los osteoclastos localizados en una determinada superficie ósea, aunque probable mente jueguen un papel importante los factores de crecimiento sintetizados por las células óseas, aprisionados en la matriz y liberados, posiblemente, cuando la matriz se degrada o se desgasta de una forma adecuada.
Durante el desarrollo, los osteoclastos erosionan el cartílago y se abren paso en el hueso44 La substitución del cartílago por hueso en el transcurso del desarrollo parece que depende tam bién de las actividades de los osteoclastos. A medida que el cartílago madura, en algunas regiones sus células se ensanchan enormem ente a expensas de la matriz que las rodea, y la propia matriz se va mineralizando, al igual que el hueso, por depósito de cristales de fosfato càlcico. Los condrocitos hinchados mueren, dejando grandes cavidades vacías. Los osteoclastos y los va sos sanguíneos invaden las cavidades y erosionan la matriz cartilaginosa resi dual, mientras que los osteoblastos siguen su recorrido empezando a depositar matriz ósea. El único residuo de cartílago que permanece en el hueso adulto es una fina capa que forma una cubierta lisa en la superficie de los huesos a nivel de las articulaciones óseas (Figura 22-48). Sin embargo, en el tejido conjuntivo que rodea el hueso persisten algunas células capaces de formar más cartílago. Si el hueso se rompe, las células próxi mas a la fractura llevan a cabo la reparación mediante una rudimentaria pero efectiva recapitulación del proceso embrionario original, depositando primero cartílago para llenar la rotura y substituyendo luego ese cartílago por hueso.
Figura 22-48 Desarrollo de un hueso largo. Los huesos largos, como el fémur o el húmero, se desarrollan a partir de un modelo cartilaginoso en miniatura. El cartílago no calcificado se ha dibujado en verde, el cartílago calcificado en negro, el hueso en marrón y los vasos sanguíneos en rojo. El cartílago no se transforma en hueso, sino que gradualmente se substituye por éste debido a la acción de los condroclastos y de los osteoblastos, que invaden el cartílago en asociación con los vasos sanguíneos. Los osteoclastos erosionan el cartílago y la matriz ósea, mientras que los osteoblastos segregan matriz ósea. El proceso de osificación empieza en el embrión y no termina hasta el final de la pubertad. El hueso resultante consiste en un cilindro vacío de paredes gruesas constituidas por hueso compacto que limitan una cavidad central ocupada por la médula ósea. Téngase en cuenta que no todos los huesos se desarrollan de esta manera. Los huesos membranosos del cráneo, por ejemplo, no se forman a partir de un modelo cartilaginoso sino directamente como placas óseas. (Adaptado de D.W. Fawcett, A Textbookof Histology, llth ed. Philadelphia: Saunders, 1986.)
La estructura del cuerpo está estabilizada mediante su armazón de tejido conjuntivo y mediante la cohesión selectiva de las células45 Un hueso, al igual que un organismo completo, es un sistema dinámico que mantiene su estructura mediante un equilibrio entre actividades opuestas de numerosas células especializadas. Cualquier sistema dinámico plantea un pro blem a de estabilidad, lo cual hace que nos planteemos una cuestión de tipo ge neral sobre el mantenimiento de la estructura del cuerpo. Hemos visto que las célulasfde tejidos distintos mantienen su estado diferenciado, se producen nue vas células de forma controlada reemplazado a las que se han perdido y se re nueva y remodela la matriz extracelular. Pero, ¿por qué los diferentes tipos de
Los fibroblastos y sus transformaciones: la familia de las células del tejido conjuntivo
1269
la com presión en esta zona favorece el depósito de hueso
EL HUESO SE
EL HUESO SE DESPLAZA DE SU POSICIÓN CORRECTA
la pérdida de compresión en esta zona favorece la erosión del hueso
HUESO REMODELADO
células no van quedando paulatinamente desordenados y desplazados? ¿Por qué toda la estructura no cede, se deforma o cam bia sus proporciones cuando las zo nas viejas son substituidas por zonas nuevas? Hasta cierto punto, evidentemente, el cuerpo cede y se deforma con el paso del tiempo -esto forma parte del envejecimiento. Pero tiene lugar de forma muy lenta. El esqueleto, a pesar de su constante remodelación, proporciona un arma zón rígido cuyas dimensiones cam bian muy poco. Ello se debe en parte a que las regiones de un hueso se renuevan no todas a la vez sino poco a poco, al igual que un edificio cuyos ladrillos se substituyeran uno a uno. Junto a un tipo de re novación tan conservador actúan mecanism os hom eostáticos activos. Por ello pequeñas desviaciones de un hueso respecto a su forma normal constituyen pa trones de desgaste alterados que regulan la remodelación del hueso de tal forma que el hueso llega a recuperar su forma normal (Figura 22-49). El crecim iento y renovación de muchas de las partes blandas del cuerpo es tán controlados tam bién hom eostáticam ente, de modo que cada componente se adapta a su nicho. La epidermis se extiende manteniendo cubierta la superfi cie corporal, y si se lesiona, las células crecen cubriendo la lesión y detienen su migración cuando han cumplido esta misión; el tejido conjuntivo crece justo lo necesario para llenar el vacío creado por una herida; etc. Sin embargo se necesi ta algo más. Los diversos tipos de células diferenciadas se deben mantener no sólo en las cantidades relativas correctas. La renovación tisular implica necesa riamente movimientos celulares. Estos movimientos han de estar limitados de alguna manera; las células han de estar sometidas a restricciones territoriales. Estas restricciones son de diversos tipos. Por ejemplo, a menudo las glándu las y otros grupos celulares especializados se hallan contenidos dentro de cápsu las resistentes de tejido conjuntivo. Muchos tipos de células mueren si se en cuentran fuera de su entorno normal, privadas de unos factores de crecimiento específicos de los que depende su supervivencia. Posiblemente la estrategia más importante para m antener las diferentes células en su lugar sea la estrategia de la adhesión intercelular selectiva: células del mismo tipo tienden a unirse unas con otras, ya sea en masas sólidas, com o el músculo liso, o en capas epiteliales, tales com o el revestimiento del intestino. Tal como se describió en Capítulo 19, este m ecanism o posibilita, por ejemplo, que células epidérmicas disociadas se reagrupen espontáneam ente formando un epitelio correctamente ordenado. En un sentido más amplio, las capas de células epiteliales sirven para dividir el or ganismo en diferentes compartimientos, manteniendo así las distintas células debidamente separadas y confinadas a sus territorios correspondientes. Los controles y equilibrios que preservan la estructura del cuerpo y la orga nización celular frente a continuos procesos de recambio y de renovación son sumamente intrincados y sutiles. La im portancia de dichos controles queda cla ramente en evidencia cuando fallan, tal como veremos al tratar el tema del cán cer en el último capítulo de este libro.
127 0
Capítulo 2 2 : Células diferenciadas y conservación de los tejidos
Figura 22-49 Remodelado de un hueso largo de la pierna después de una fractura, reparada fuera de su posición correcta. La deformación que se origina en el hueso recientemente reparado lo somete a tensiones anómalas. Donde las fuerzas de compresión se han incrementado, el nivel de depósito de hueso aumenta respecto al nivel de erosión; en la zona donde las fuerzas disminuyen, el nivel de depósito disminuye en relación al nivel de erosión. De esta manera el hueso se remodela gradualmente hasta recuperar su forma normal.
Resumen
La familia de células del tejido conjuntivo incluye los fibroblastos, los condrocitos, las células del tejido óseo, los adipocitos y las fibras de la musculatura lisa. Al pare cer, los fibroblastos pueden llegar a transformarse en cualquier otro de los miem bros de dicha familia -en algunos casos deforma reversible- aunque no queda cla ro si es una característica de un único tipo de fibroblasto pluripotencial o de una mezcla de distintos tipos de fibroblastos con potencial más restrictivo. Dichas transformaciones de los tipos celulares del tejido conjuntivo están reguladas por la propia composición de la matriz extracelular circundante, por la forma celular y por las hormonas y los factores de crecimiento. Tanto el cartílago como el hueso están constituidos por células inmersas en una matriz sólida. El cartílago presenta una matriz deformable y puede crecer por hinchamiento, mientras que el hueso es rígido y sólo puede crecer por aposición en sus superficies. No obstante, el hueso está sometido a una constante remodelación a través de la acción combinada de los osteoclastos, que erosionan la matriz, y los osteoblastos, que la segregan. Algunos osteoblastos quedan atrapados en la matriz en forma de osteocitos y desempeñan una cierta función en la regulación de la re novación de la matriz ósea. La mayoría de huesos largos se desarrollan a partir de “modelos” cartilaginosos en miniatura que, al crecer, actúan como moldes para el depósito de hueso mediante la acción combinada de los osteoblastos y los condroclastos. Análogamente, en la reparación de una fractura ósea en el adulto, la fisura se llena primero con cartílago, que más tarde es substituido por hueso. Aunque el hueso, al igual que otros tejidos, está sometido a una continua renovación, este proceso dinámico se regula de tal forma que la estructura global queda preservada. De este modo, y mediante otro tipo de mecanismos como la adherencia intercelular selectiva, la organización del cuerpo se mantiene de forma estable a pesar de que la mayor parte de sus componentes se reemplazan continuamente. Apéndice Catálogo de las células del cuerpo humano adulto ¿Cuántos tipos celulares distintos existen en un ser humano adulto? En otras pa labras, ¿cuántas vías de expresión del genoma humano existen en un adulto nor mal? Un voluminoso tratado de histología citará unos 200 tipos, con sus deno minaciones específicas. Estos nombres tradicionales no son, como los nombres de los colores, unas etiquetas para las distintas partes de un sistema continuo que se ha subdividido arbitrariamente. En su mayor parte representan categorías discretas claramente distintas. Dentro de una determinada categoría celular a menudo existe una cierta variación -las fibras de músculo esquelético que m ue ven el globo ocular son pequeñas, mientras que las que mueven la pierna son grandes; las células auditivas ciliadas de diferentes partes del oído pueden estar adaptadas a distintas frecuencias de sonido; y así sucesivamente. Pero no existe ningún sistema continuo de tipos celulares adultos, intermedios en cuanto a ca rácter, entre, por ejemplo, la fibra muscular y la célula auditiva ciliada. La clasificación histológica tradicional se basa en la forma (morfología) y en la estructura de la célula observada al microscopio y en su naturaleza química, determinada por su afinidad a diversos colorantes. Métodos más útiles revelan nuevas subdivisiones dentro de la clasificación tradicional. Así, la inmunología moderna ha demostrado que la vieja categoría de “linfocitos” incluye más de 10 tipos celulares bastante diferentes. Análogamente los exámenes farmacológicos y fisiológicos revelan que existen muchas variedades distintas de fibras muscula res lisas -las de la pared del útero, por ejemplo, son altamente sensibles a los estrógenos, y en las últimas fases del embarazo, a la oxitocina, mientras que las de la pared intestinal no muestran esta sensibilidad. Otro tipo importante de diver sidad se ha revelado mediante experimentos embriológicos como los discutidos
Apéndice
1271
en el Capítulo 21. Dichos experimentos demuestran que, en muchos casos, célu las aparentem ente similares de regiones distintas del cuerpo no son equivalen tes, es decir, son intrínsecam ente diferentes en cuanto a sus capacidades de de sarrollo y a sus influencias sobre otras células. Así, dentro de categorías como la de “fibroblasto” probablemente existen muchos tipos celulares distintos, dife rentes quím icam ente en aspectos que aún no podemos apreciar directamente. Por estas razones, cualquier clasificación de los tipos celulares del cuerpo ha de ser algo arbitraria con respecto a la exactitud de las subdivisiones. En la rela ción que ofrecemos a continuación sólo constan los tipos celulares del hombre adulto que un tratado moderno de histología reconocería como diferentes, agru pados más o menos en familias según su función. No hemos intentado subdividir la clase de neuronas del sistema nervioso central. Asimismo, en el caso de un único tipo celular, como el queratinocito que recibe convencionalmente una su cesión de nombres diferentes a medida que madura, hemos indicado sólo dos entradas -u n a para la célula diferenciada y una para la célula madre. Con estas importantes salvedades, las 210 variedades de células del catálogo representan una lista más o menos exhaustiva de las diferentes maneras en que un genoma determinado de mamífero se puede expresar en el fenotipo de una célula nor mal del cuerpo adulto.
Células epiteliales queratinizadas
queratinocito de la epidermis (= célula epidérmica diferenciada célula basal de la epidermis (célula madre) queratinocito de las uñas de manos y pies célula basal de lecho ungueal (célula madre) célula de la vaina pilosa medulares corticales cuticulares célula de la vaina de la raíz pilosa cuticulares de la capa de Huxley de la capa de Henle externas célula de la matriz pilosa (célula madre) Células de los epitelios de barrera estratificados húmedos
célula epitelial superficial del epitelio escamoso pluriestratificado de la córnea, de la lengua, cavidad oral, esófago, ano, uretra distal, vagina célula basal de estos epitelios (célula madre) célula del epitelio urinario (reviste la vejiga y los conductos urinarios) Células epiteliales especializadas en la secreción exocrina
células de la glándula salival célula mucosa (secreción rica en polisacáridos) célula serosa (secreción rica en enzimas glucoproteicas) célula de glándula lingual de von Ebner (secreción para lavar los botones gustativos)
127 2
célula de glándula mamaria, segrega leche célula de glándula lacrimal, segrega lágrimas célula de glándula ceruminosa del oído, segrega cera célula de glándula sudorípara ecrina, segrega pequeñas moléculas (célula oscura) célula de glándula sudorípara ecrina, segrega pequeñas moléculas (célula clara) célula de glándula sudorípara apocrina (secreción odorífera, sensible a las hormonas sexuales) célula de glándula de Molí del párpado (glándula sudorípara especializada) célula de glándula sebácea, segrega sebo rico en lípidos célula de glándula de Bowman de la nariz (secreción para lavar el epitelio olfativo) célula de glándula de Brünner del duodeno, segrega una solución alcalina de mucus y enzimas células de la vesícula seminal, segrega componentes del líquido seminal, junto con fructosa (como combustible para los movimientos del espermatozoide) célula de glándula prostética, segrega otros componentes del líquido seminal célula de glándula bulbouretral, segrega mucus célula de glándula de Bartholin, segrega lubricante vaginal célula de glándula de Littré, segrega mucus célula del endometrio del útero, sobre todo segrega carbohidratos célula calciforme aislada de los tractos
Capítulo 22 : Células diferenciadas y conservación de los tejidos
respiratorio y digestivo, segrega mucus célula mucosa del revestimiento del estómago célula zimógena de glándula gástrica, segrega pepsinógeno célula oxíntica de glándula gástrica, segrega HC1 célula acinar del páncreas, segrega enzimas digestivas y bicarbonato célula de Paneth del intestino delgado, segrega lisozima pneumocito de tipo II del pulmón, segrega surfactante célula de Clara del pulmón (función desconocida) Células especializadas en la secreción de hormonas
células de la hipófisis anterior, segregan hormona del crecimiento hormona folículo estimulante hormona luteinizante prolactina hormona adrenocorticotrópica hormona estimulante de la tiroides célula de la hipófisis intermedia, segrega hormona estimuladora de los melanocitos células de la hipófisis posterior, segregan oxitocina vasopresina células del tracto intestinal y respiratorio, segregan serotonina endomorfina somatostatina gastrina secretina colecistoquinina insulina glucagón bombesina
células de la glándula tiroides, segregan hormonas tiroideas calcitonina células de la glándula paratiroides, segregan hormona paratiroidea célula oxífila (función desconocida) células de la glándula suprarrenal, segregan epinefrina norepinefrina hormonas esteroides mineralocorticoides glucocorticoides células de las gónadas, segregan testosterona (célula de Leydig del testículo) estrógeno (célula de la teca interna del folículo ovárico) progesterona (célula del cuerpo lúteo del folículo ovárico eclosionado) célula del aparato yuxtaglomerular del riñón célula yuxtaglomerular (segrega renina f (inciertas, pero probablemente relacionadas célula de la mácula densa < funcionalmente; posiblemente célula peripolar implicadas en célula mesangial la secreción de eritropoyetina)
Células epiteliales de absorción intestinal, glándulas exocrinas y tracto urogenital célula con ribete en cepillo del intestino (con microvilli) (= enterocito) célula del conducto estriado de las glándulas exocrinas célula epitelial de la vesícula biliar célula con ribete en cepillo del túbulo proximal del riñón célula del túbulo distal del riñón célula no ciliada del conducto eferente célula principal del epidídimo célula basal del epidídimo
Células especializadas en el metabolismo y en el almacenamiento hepatocito (célula hepática) células adiposas (adipocitos) grasa blanca grasa parda lipocito del hígado
Células epiteliales que actúan primariamente como barrera y revisten el pulmón, el intestino, las glándulas exocrinas y el tracto urogenital pneumocito de tipo I (reviste el espacio aéreo del pulmón) célula de conducto pancreático (célula centroacinar) célula de conducto no estriado de glándula sudorípara, glándula salival, glándula mamaria, etcétera (varias) célula parietal de glomérulo renal
Apéndice
podocito de glomérulo renal célula del segmento delgado del asa de Henle (en el riñón) (= túbulo descendente) célula del conducto colector (en el riñón) célula del conducto de la vesícula seminal, la glándula prostática, etc. (varias)
Células epiteliales que revisten cavidades internas cerradas del cuerpo células endoteliales vasculares de vasos sanguíneos y linfáticos fenestradas continuas esplénicas célula sinovial (reviste cavidades articulares, segrega en gran parte ácido hialurónico) célula serosa (reviste las cavidades peritoneal, pleural y pericárdica) célula escam osa que reviste el espacio endolinfático del oído célula escamosa células columnares del saco endolinfático con microvilli sin microvilli célula “oscura” célula de la membrana vestibular (parecida a la célula del plexo coroideo) célula basal de la stria vascularis célula marginal de la stria vascularis célula de Claudius célula de Boettcher célula del plexo coroideo (segrega líquido cefalorraquídeo) célula escam osa de la pía-aracnoides células del epitelio ciliar del ojo pigmentadas no pigmentadas célula “endotelial” de la córnea
Células ciliadas con función de propulsión del tracto respiratorio del oviducto y del endometrio uterino (en la mujer) del rete testis y del conducto eferente (en el hombre) del sistema nervioso central (célula ependimaria que reviste las cavidades cerebrales)
Células especializadas en la secreción de matriz extracelular epiteliales: ameloblasto (segrega el esmalte dentario) célula del planum semilunatum del aparato vestibular del oído (segrega proteoglucanos) célula interdental del órgano de Corti (segrega la “m em brana” tectorial que cubre las células ciliadas del órgano de Corti) no epiteliales (tejido conjuntivo): fibroblastos (varios -d el tejido conjuntivo laxo, de la córnea, del
tendón, del tejido reticular de la médula ósea, roja y amarilla, etc.) pericito del capilar sanguíneo célula del núcleo pulposo del disco intervertebral cem entoblasto/cem entocito (segrega un cem ento parecido a hueso en la raíz de los dientes odontoblasto/odontocito (segrega la dentina de los dientes) condroblasto/condrocito del cartílago hialino del fibrocartílago del cartílago elástico osteoblasto/osteocito célula osteoprogenitora (célula madre de los osteoblastos) hialocito del cuerpo vitreo del ojo célula estrellada del espacio perilinfático del oído
Células contráctiles células del músculo esquelético rojas (lentas) blancas (rápidas) intermedias haz muscular -sa co nuclear haz muscular -cad en a nuclear célula satélite (célula madre) células del músculo cardíaco ordinarias nodales fibra de Purkinje células del músculo liso (varias) células mioepiteliales del iris de las glándulas exocrinas
Células de la sangre y del sistema inmunitario glóbulo rojo (eritrocito) megacariocito macrófagos monocito macrófago del tejido conjuntivo (varios) célula de Langerhans (en la epidermis) osteoclasto (en el hueso) condroclasto (en el cartílago) célula dendrítica (en los tejidos linfoides) célula microglial (en el sistema nervioso central) neutrófilo eosinófilo basófilo célula cebada linfocito T célula T auxiliar célula T supresora célula T asesina linfocito B IgM IgG IgA IgE célula asesina células madre para la sangre y para el sistema inmunitario (varias)
1273
Transductores sensoriales fotorreceptores bastones conos sensible al azul sensible al verde sensible al rojo auditivos célula ciliada interna del órgano de Corti célula ciliada externa del órgano de Corti aceleración y gravedad célula ciliada de tipo I del aparato vestibular del oído célula ciliada de tipo II del aparato vestibular del oído gusto célula del botón gustativo de tipo II olor neurona olfatoria célula basal del epitelio olfatorio (célula madre para las neuronas olfatorias) pH sanguíneo célula del cuerpo carotídeo tipo I tipo II tacto célula de Merkel de la epidermis neuronas sensoriales primarias especializadas en el tacto (varias) temperatura
neuronas sensoriales primarias especializadas en la temperatura sensibles al frío sensibles al calor dolor neuronas sensoriales primarias especializadas en el dolor (varias) configuraciones y fuerzas en el sistema musculoesquelético neuronas sensoriales primarias propioceptivas (varias)
célula satélite (rodea a los cuerpos celulares de los nervios periféricos) célula glial entérica Neuronas y células gliales del sistema nervioso central neuronas (inmensa variedad de tipos -aún mal clasificados) células gliales astrocito (varios) oligodendrocito
Neuronas autónomas
Células del cristalino
colinérgicas (varias) adrenérgicas (varias) peptidérgicas (varias)
célula del epitelio anterior del cristalino fibra del cristalino (célula que contiene cristalina)
Células de sostén de los órganos de los sentidos y neuronas periféricas
Células pigmentarias
células de sostén del órgano de Corti célula del pilar interno célula del pilar externo célula falángica interna célula falángica externa célula marginal célula de Hensen célula de sostén del aparato vestibular célula de sostén del botón gustativo (célula del botón gustativo de tipo I) célula de sostén del epitelio olfativo célula de Schwann
melanocito célula del epitelio pigmentario de la retina Células germinales oogonia/oocito espermatocito espermatogonia (célula madre para el espermatocito) Células nodrizas célula folicular ovárica célula de Sertoli (en el testículo) célula epitelial del timo
Bibliografía
Coon, H.G. Clonal stability and phenotypic expression of chick cartilage cells in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 55:66-73, 1966.
General Burkitt, H.G.; Young, B.; Heath, J.W. Wheater’s Functional Histology, 3rd ed. Edinburgh: Churchill Livingstone, 1993. Clark, W.E. Le Gros. The Tissues of the Body, 6th ed. Oxford, UK: Clarendon Press, 1971. Cormack, D.H. Essential Histology. Philadelphia: Lippincott, 1993. Fawcet, D.W. (Bloom and Fawcett) A Textbook of Histology, 11th ed. Philadelphia: Saunders, 1986. Goss, R.J. The Physiology of Growth. New York: Academic Press, 1978. Krstic, R.V. Illustrated Encyclopedia of Human Histology. Berlin: Springer-Verlag, 1984. Weiss, L., ed. Cell and Tissue Biology: A Textbook of Histol ogy, 6th ed. Baltimore: Urban and Schwartzenberg, 1988.
Eguchi, G.; Kodama, R. Transdifferentiation. Curr. Opin. Cell Biol. 5:1023-1028, 1993. Watt, F.M. Cell culture models of differentiation. FASEB J. 5:287-294, 1991. Yaffe, D. Retention of differentiation potentialities du ring prolonged cultivation of myogenic cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 61:477-483, 1968. 3. Anderson, J.E. The effect of steroid hormones on gene transcription. In Biological Regulation and Develop ment (R.F. Goldberger, K. Yamamoto, eds.), Vol. 3B, pp. 169-212. New York: Plenum Prss, 1983. Hay, E.D. Extracellular matrix alters epithelial differen tiation. Curr. Opin. Cell Biol. 5:1029-1035, 1993. Okada, T.S.; Kondoh, H., eds. Commitment and Instabi lity in Cell Differentiation. Curr. Top. Dev. Biol. 20, 1986. 4. Goss, R.J. The Physiology of Growth. New York: Acade mic Press, 1978.
Citas 1. Clark, W.E. Le Gros. The Tissues of the Body, 6th ed. Ox ford, UK: Clarendon Pres, 1971. Montagna, W. The skin. Sci. Am. 212(2):56-66, 1965. 2. Cahn, R.D.; Cahn, M.B. Heritability of cellular differen tiation: clonal growth and expression of differentia tion in retinal pigment cells in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 55:106-114, 1966.
1 274
Richardson, G. Hair-cell regeneration: keep the noise down. Curr. Biol. 3:759-762, 1993. 5. Clayton, R.M. Divergence and convergence in lens cell differentiation: regulation of the formation and spe cific content of lens fibre cells. In Stem Cells and Tis sue Homeostasis (B. Lord, C. Potten, R. Cole, eds.), pp. 115-138. Cambridge, UK: Cambridge University Press, 1978.
Capítulo 22 : Células diferenciadas y conservación de los tejidos
Goss, R.J. The Physiology of Growth, pp. 210-225. New York: Academic Press, 1978. Maisel, H., ed. The Ocular Lens: Structure, Function, and Pathology. New York: Dekker, 1985. Wistow, G.J.; Piatigorsky, J. Lens crystallins: the evolu tion and expression of proteins for a highly speciali zed tissue. Annu. Rev. Biochem. 57:479-504, 1988. 6. Fawcett, D.W. (Bloom and Fawcett) A Textbook of His tology, 11th ed. Philadelphia: Saunders, 1986. Gevers, W. Protein metabolism in the heart. /. Mol. Cell. Cardiol. 16:3-32, 1984. Young, R.W. Visual cells. Sci. Am. 223(4):80-91, 1970. 7. Leblond, C.P. The life history of cells in renewing sys tems. Am. J. Anat. 160:114-158, 1981. Wright, N.A.; Alison, M.R. Biology of Epithelial Cell Po pulations, Vols. 1-3. Oxford, UK: Oxford University Press, 1984. 8. Fawcett, D.W. (Bloom and Fawcett) A Textbook of His tology, 11th ed., pp. 679-715. Philadelphia: Saunders, 1986. Louvard, D.; Kedinger, M.; Hauri, H.P. The differentiating intestinal epithelial cell: establishment and mainte nance of functions through interactions between ce llular structures. Annu. Rev. Cell Biol. 8:157-195,1992. Moog, F. The lining of the small intestine. Sci. Am. 245(5):154-176, 1981. 9. Bursch, W.; Taper, H.S.; Lauer, B.; Schulte-Hermann, R. Quantitative histological and histochemical studies on the occurence and stages of controlled cell death (apoptosis) during regression of rat liver hyperplasia. Virchows Arch. B Cell Pathol. 50:153-166, 1985. Fausto, N. Hepatocyte differentiation and liver progeni tor cells. Curr. Opin. Cell Biol. 2:1036-1042, 1990. Furlong, R.A. The biology of h epatocyte growth factor/ scatter factor. Bioessays 14:613-617, 1992. Goss, R.J. The Physiology of Growth, pp. 251-266. New York: Academic Press, 1978. Nakamura, T., et al. Molecular cloning and expression o f human hepatocyte growth factor. Nature 342:440443,1989. 10. McGee, J.O’D.; Issacson, P.G.; Wright, N.A., eds. Oxford Textbook of Pathology, Vol. 1, pp. 365-389. Oxford, UK: Oxford University Press, 1992. Robbins, S.L.; Cotran, R.S.; Kumar, V. Pathologic Basis of Disease, 4th ed. Philadelphia: Saunders, 1989. 11. Campbell, J.H.; Campbell, G.R. Endothelial cell influen ces on vascular smooth muscle phenotype. Annu. Rev. Physiol. 48:295-306,1986. Development of the Vascular System. Ciba Found. Symp. 100. London: Pitman, 1983. Fawcett, D.W. (Bloom and Fawcett) A Textbook of His tology, 11th ed., pp. 367-405. Philadelphia: Saunders, 1986. Ryan, U.S., ed. Endothelial Cells, Vols. 1-3. Boca Raton, FL: CRC Press, 1988. 12. Goss, R.J. The Physiology of Growth, pp. 120-137. New York: Academic Press, 1978. Hobson, B.; Denekamp, J. Endothelial proliferation in tumours and normal tissues: continuous labelling studies. Br.J. Cancer 49:405-413, 1984. 13. Folkman, J. What is the evidence that tumors are angiogenesis dependent? J. Natl. Cancer Inst. 82:4-6, 1990.
Bibliografía
14.
15.
16.
17.
18.
19.
Folkman, J. The vascularization of tumors. Sci. Am. 234(5):58-73, 1976. Folkman, J..; Haudenschild, C. Angiogenesis in vitro. Nature 288:551-556, 1980. Grant, D.S., et al. Two different laminin domains medi ate the differentiation of human endothelial cells into capillary-like structures in vitro. Cell 58:933-943, 1989. Madri, J.A.; Pratt, B.M. Endothelial cell-matrix interac tions: in vitro models of angiogenesis. J. Histochem. Cytochem. 34:85-91, 1986. Kalebic, T.; Garbisa, S.; Glaser, B.; Liotta, L.A. Basement membrane collagen: degradation by migrating en dothelial cells. Science 221:281-283, 1983. Klagsbrun, M.; D’Amore, P.A. Regulators of angiogene sis. Annu. Rev. Physiol. 53:217-239, 1991. Klagsbrun, M.; Soker, S. VEGF/VPF: the angiogenesis factor found? Curr. Biol. 3:699-702, 1993. Shweiki, D.; Itin, A.; Soffer, D.; Keshet, E. Vascular en dothelial growth factor induced by hypoxia may me diate hypoxia-initiated angiogenesis. Nature 359:843845, 1992. Cairnie, A.B.; Lala, P.K.; Osmond, D.G., eds. Stem Cells of Renewing Cell Populations. New York: Academic Press, 1976. Cheng, H.; Leblond, C.P. Origin, differentiation, and re newal of the four main ephithelial cell types in the mouse small intestine. V. Unitarian theory of the ori gin of the four epithelial cell types. Am. J. Anat. 141:537-562, 1974. Graziadei, P.P.C.; Monti Graziadei, G.A. Continuous nerve cell renewal in the olfactory system. In Hand book of Sensory Physiology, Vol. IX: Development of Sensory Systems (M. Jacobson, ed.), pp. 55-82. New York: Springer-Verlag, 1978. Bereiter-Hahn, J.; Matoltsy, A.G.; Richards, K.S. eds. Biology of the Integument. Vol. 2: Vertebrates. New York: Springer, 1986. MacKenzie, I.C. Ordered structure of the stratum corneum of mammalian skin. Nature 222:881-882, 1969. Sengel, P. Morphogenesis of skin. Cambridge, UK: Cam bridge University Press, 1976. Stenn, K.S. The skin. In Cell and Tissue Biology: A Text book of Histology (L. Weiss, ed.), 6th ed., pp. 539-572. Baltimore: Urban and Schwartzenberg, 1988. Fuchs, E. Epidermal differentiation. Curr. Opin. Cell Biol. 2:1028-1035, 1990. Fuchs, E.; Green, H. Changes in keratin gene expression during terminal differentiation of the keratinocyte. Cell 19:1033-1042, 1980. Green, H. The keratinocyte as differentiated cell type. Harvey Lect. 74:101-139, 1979. Barrandon, Y.; Green, H. Three clonal types of kerati nocyte with different capacities for multiplication. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:2302-2306, 1987. Green, H. Cultured cells for the treatment of disease. Sci. Am. 265(5):96-102, 1991. Green, H. Terminal differentiation of cultured human epidermal cells. Cell 11:405-415, 1977. Jones, P.H.; Watt, F.M. Separation of human epidermal stem cells from transit amplifying cells on the basis of differences in integrin function and expression. Cell 73:713-724, 1993. 1275
20.
21.
22.
23.
24.
25.
26.
Martin, P.; Hopkinson-Woolley, J.; McCluskey, J. Growth factors and cutaneous wound repair. Prog. Growth Factor Res. 4:25-44,1992. Watt, F.M. Selective migration of terminally differenti ating cells from the basal layer of cultured human epidermis./. Cell Biol. 98:16-21, 1984. Barrandon, Y.; Green, H. Cell migration is essential for sustained growth of keratinocyte colonies: the roles of transforming growth factor-alpha and epidermal growth factor. Cell 50:1131-1137, 1987. Elder, J.T., et al. Overexpression of transforming growth factor alpha in psoriatic epidermis. Science 243:811814,1989. Read, J.; Watt, F.M. A model for in vitro studies of epi dermal homeostasis: proliferation and involucrin synthesis by cultured human keratinocytes during recovery after stripping off the suprabasal layers. /. Invest. Dermatol. 90:739-743, 1988. Fawcett, D.W. (Bloom and Fawcett) A Textbook of His tology, 11th ed., pp. 568-576, 901-912. Philadelphia: Saunders, 1986. Neville, M.C.; Neifert, M.R. Lactation: Physiology, Nutri tion, and Breast-Feeding. New York: Plenum Press, 1983. Patton, S. Milk. Sci. Am. 221(l):58-68,1969. Richards, R.C.; Benson, G.K. Ultrastructural changes ac companying involution of the mammary gland in the albino rat ./. Endocrinol. 51:127-135, 1971. Talhouk, R.S.; Bissell, M.J.; Werb, Z. Coordinated expres sion of extracellular matrix-degrading proteinases and their inhibitors regulates mammary epithelial func tion during involution. J. Cell Biol. 118:1271-1282, 1992. Dexter, T.M.; Spooncer, E. Growth and differentiation in the hemopoietic system. Annu. Rev. Cell Biol. 3:423441, 1987. Golde, D.W. The stem cell. Sci. Am. 265(6):86-93, 1991. Weiss, L., ed. Cell and Tissue Biology: A Textbook of Histology, 6th ed., pp. 423-478. Baltimore: Urban and Schwartzenberg, 1988. Wintrobe, M.M. Blood, Pure and Eloquent. New York: McGraw-Hill, 1980. McGee, J.O’D.; Isaacson, P.G.; Wright, N.A., eds. Oxford Textbook of Pathology, Vol. 1, pp. 236-258 and 321347. Oxford, UK: Oxford University Press, 1992. Zucker, M.B. The functioning of blood platelets. Sci. Am. 242(6):86-103, 1980. McEver, R.P. Leukocyte-endothelial cell interactions. Curr. Opin. Cell Biol. 4:840-849,1992. Robbins, S.L.; Cotran, R.S.; Kumar, V. Pathologic Basis of Disease, 3rd ed. Philadelphia: Saunders, 1984. Taussig, M.J. Processes in Pathology and Microbiology, 2nd ed. Oxford, UK: Blackwell, 1984. Magli, M.C.; Iscove, N.N.; Odartchenko, N. Transient nature of haematopolietic spleen colonies. Nature 295:527-529, 1982. Till, J.E.; McCulloch, E.A. A direct measurement of the radiation sensitivity of normal mouse bone marrow cells. Radiat. Res. 14:213-222, 1961. Jordan, C.T.; Lemischka, I.R. Clonal and systemic analy sis of long-term hematopoiesis in the mouse. Genes Dev. 4:220-232, 1990.
1 27 6
27. 28.
29.
30.
31.
32.
33.
Wu, A.M.; Till, J.E.; Siminovitch, L.; McCulloch, E.A. Cytological evidence for a relationship between normal hematopoietic colony-forming cells and cells of the lymphoid system./. Exp. Med. 127:455-462,1968. Till, J.E.; McCulloch, E.A. Hemopoietic stem cell differ entiation. Biochim. Biophys. Acta 605:431-459, 1980. Metcalf, D. The Hemopoietic Colony-Stimulating Fac tors. Amsterdam: Elsevier, 1984. Metcalf, D. Clonal analysis of proliferation and differen tiation of paired daughter cells: action of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor on granu locyte-macrophage precursors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:5327-5330, 1980. Ogawa, M. Review: differentiation and proliferaton of haematopoietic stem cells. Blood 81:2844-2854,1993. Goldwasser, E. Erythropoietin and the differentiation of red blood cells. Fed. Proc. 34:2285-2292,1975. Heath, D.S.; Axelrad, A.A.; McLeod, D.L.; Shreeve, M.M. Separation of the erythropoietin-responsive progeni tors BFU-E and CFU-E in mouse bone marrow by unit gravity sedimentation. Blood 47:777-792, 1976. Ihle, J.N., et al. Biologic properties of homogeneous in terleukin 3./. Immunol. 131:282-287,1983. Suda, J. et al. Purified interleukin-3 and erythropoietin support the terminal differentiation of hemopoietic progenitors in serum-free culture. Blood 67:10021006, 1986. Metcalf, D. The hemopoietic regulators-an embarrass ment of riches. Bioessays 14:799-805,1992. Metcalf, D. The Florey Lecture, 1991. The colony-stimulating factors: discovery to clinical use. Phil. Trans. Roy. Soc. Lond. (Biol.) 333:147-173, 1991. Sthal, N.; Yancopoulos, G.D. The alphas, betas, and ki nases of cytokine receptor complexes. Cell 74:587580, 1993. Yoshida, H., et al. The murine mutation osteopetrosis is in the coding region of the macrophage colony sti mulating factor gene. Nature 345:442-444, 1990. Flanagan, J.G.; Chan, D.C.; Leder, P. Transmembrane form of the kit ligand growth factor is determined by alternative splicing and is missing in the Sld mutant. Cell 64:1025-1035, 1991. Morrison-Graham, K.; Takahashi, Y. Steel factor and c-kit receptor: from mutants to a growth factor sys tem. Bioessays 15:77-83, 1993. Spangrude, G.J.; Heimfeld, S.; Weissman, I.L. Purifica tion an characterization of mouse hematopoietic stem cells. Science 241:58-62, 1988. Suda, T.; Suda, J.; Ogawa, M. Disparate differentiation in mouse hemopoietic colonies derived from paired progenitors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:2520-2524, 1984. Whetton, A.D.; Dexter, T.M. Influence of growth factors and substrates on differentiation of haemopoietic stem cells. Curr. Opin. Cell Biol. 5:1044-1049, 1993. Raff, M.C. Social controls on cell survival and cell death. Nature 356:397-400,1992. Savill, J.; Hogg, N.; Ren, Y.; Haslett, C. Thrombospondin cooperates with CD36 and the vitronectin receptor in macrophage recognition of neutrophils undergoing apoptosis./. Clin Invest. 90:1513-1522,1992. Vaux, D.L.; Weisman, I.L.; Kim, S.K. Prevention of pro grammed cell death in Caenorhabditis elegans by hu man bcl-2. Science 258:1955-1957, 1992.
Capítulo 22 : Células diferenciadas y conservación de los tejidos
34.
35.
36.
37.
38.
39.
Williams, G.T.; Smith, C.A.; Spooncer, E.; Dexter, T.M.; Taylor, D.R. Haemopoietic colony stimulating factors promote cell survival by suppressing apoptosis. Na ture 343:76-79, 1990. Wyllie, A.H.; Duvall, E. Cell death. In Oxford Textbook of Pathology (McGee, J.O’D.; Isaacson, P.G.; Wright, N.A., eds.), Vol. 1, pp. 141-157. Oxford, UK: Oxford University Press, 1992. Buckingham, M. Making muscle in mammals. Trends Genet. 8:144-148, 1992. Cormack, D. Ham’s Histology, 9th ed., pp. 388-420. Phi ladelphia: Lippincott, 1987. Emerson, C.P., Jr. Skeletal myogenesis: genetics and embryology to the fore. Curr. Opin. Genet. Devel. 3:265-274, 1993. Devlin, R.B.; Emerson, C.P. Jr. Coordinate regulation of contractile protein synthesis during myoblast differ entiation. Cell 13:599-611, 1978. Königsberg, I.R. Diffusion-mediated control of myoblast fusion. Dev. Biol. 26:133-152, 1971. Olsen, E.N. Interplay between proliferation and differ entiation within the myogenic lineage. Dev. Biol. 154:261-272, 1992. Rosen, G.D., et al. Roles for the integrin VLA-4 and its counter receptor VCAM-1 in myogenesis. Cell 69:1107-1119, 1992. Weintraub, H., et al. The myoD gene family: nodal point during specification of the muscle cell lineage. Scie nce 251:761-766, 1991. Buckingham, M.E. The control of muscle gene expres sion: a review of molecular studies on the production and processing of primary transcripts. Brit. Med. Bull. 45:608-629, 1989. Lomo, T.; Westgaard, R.H.; Dahl, H.A. Contractile prop erties of muscle: control by pattern of muscle activity in the rat. Proc. R. Soc. Lond. (Biol.) 187:99-103, 1974. Plasticity of the Neuromuscular Systems. Ciba Found. Symp. 138,1988. Stockdale, F.E. Myogenic cell lineages. Dev. Biol. 154:284-298, 1992. Bischoff, R. Proliferation of muscle satellite cells on in tact myofibers in culture. Dev. Biol. 115:129-139, 1986. Goldspink, G. Development of muscle. In Differentia tion and Growth of Cells in Vertebrate Tissues (G. Goldspink, ed.), pp. 69-99. London: Chapman and Hall, 1974. Moss, F.P.; Leblond, C.P. Satellite cells as the source of nuclei in muscles of growing rats. Anat. Rec. 170:421435,1971. Tinsley, J.M., et al. Dystrophin and related proteins. Curr. Opin. Genet. Devel. 3:484-490,1993. Fawcett, D.W. (Bloom and Fawcett) A Textbook of Histo logy, 11th ed., pp. 136-187. Philadelphia: Saunders, 1986. Gabbiani, G.; Rungger-Brändle, E. The fibroblast. In Tis sue Repair and Regeneration (L.E. Glynn, ed.), pp. 150. Handbook of Inflammation, Vol. 3. Amsterdam: Elsevier, 1981. Clark, R.A.F.; Henson, P.M., eds. The Molecular and Ce llular Biology of Wound Repair. New York: Plenum Press, 1988.
Bibliografía
40.
41.
42.
43.
44. 45.
Conrad, G.W.; Hart, G.W.; Chen, Y. Differences in vitro between fibroblast-like cells from cornea, heart, and skin of embryonic chicks. J. Cell Sci. 26:119-137, 1977. Reddi, A.H.; Gay, R.; Gay, S.; Miller, E.J. Transitions in collagen types during matrix-induced cartilage, bone, and bone marrow formation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5589-5592, 1977. Rosen, V.; Thies, R.S. The BMP proteins in bone forma tion and repair. Trends Genet. 8:97-102,1992. Wozney, J.M., et al. Novel regulators of bone formation: molecular clones and activities. Science 242:15281534, 1988. Benya, P.D.; Schaffer, J.D. Dedifferentiated chondrocy tes reexpress the differentiated collagen phenotype when cultured in agarose gels. Cell 30:215-224, 1982. Caplan, A.I. Cartilage. Sci. Am. 251(4):84-94, 1984. Zanetti, N.C.; Solursh, M. Induction of chondrogenesis in limb mesenchymal cultures by disruption of the actin cytoskeleton./. Cell Biol. 99:115-123, 1984. Johnson, P.R.; Greenwood, M.R.C. The adipose tissue. In Cell and Tissue Biology: A Textbook of Histology (L. Weiss, ed.), 6th ed., pp. 189-209. Baltimore: Urban and Schwartzenberg, 1988. Spiegelman, B.M.; Ginty, C.A. Fibronectin modulation of cell shape and lipogenic gene expression in 3T3 adipocytes. Cell 35:657-666,1983. Sul, H.S. Adipocyte differentiation and gene expression. Curr. Opin. Cell Biol. 1:116-1121, 1989. Zezulak, K.M.; Green, H. The generation of insulin-like growth factor- 1-sensitive cells by growth hormone action. Science 233:551-553,1986. Cell and Molecular Biology of Vertebrate Hard Tissues. Ciba Found. Symp. 136,1988. Fawcett, D.W. (Bloom and Fawcett) A Textbook of His tology, 11th ed., pp. 188-238. Philadelphia: Saunders, 1986. Jee, W.S.S. The skeletal tissues. In Cell and Tissue Biol ogy: A Textbook of Histology (L. Weiss, ed.), 6th ed., pp. 211-254. Baltimore: Urban and Schwartzenberg, 1988. Seyedin, S.M.; Rosen, D.M. Matrix proteins of the skel eton. Curr. Opin. Cell Biol. 2:914-919,1990. Marcus, R. Normal and abnormal bone remodeling in man .Annu. Rev. Med. 38:129-141,1987. Osbody, P.; Krukowski, M.; Oursler, M.J.; Salino-Hugg, T. The origin, development, and regulation of osteo clasts. Bioessays 7:30-34, 1987. Vaughan, J. The Physiology of Bone, 3rd ed. Oxford, UK: Clarendon Press, 1981. Cormack, D. Ham's Histology, 9th ed., pp. 312-320. Phi ladelphia: Lippincott, 1987. Currey, J. The Mechanical Adaptations of Bone. Prince ton, NJ: Princeton University Press, 1984. Goss, R.J. The Physiology of Growth. New York: Acade mic Press, 1978. Rogers, S.L. The Aging Skleton. Springfield, IL: Thomas, 1982. Sinclair, D. Human Growth After Birth, 4th ed. Oxford, UK: Oxford University Press, 1985.
1277
Pequeña célula T citotóxica preparándose para matar una gran célula tumoral. (De D. Zagury, J. Bernard, N. Thierness, M. Feldman y G. Berke, Eur. J. Immunol. 5:818-822,1975.)
El sistema inmunitario •Base celular de la inmunidad •Propiedades funcionales de los anticuerpos •La estructura fina de los anticuerpos •La generación de la diversidad de los anticuerpos •Los receptores de las células T y sus subclases • Las moléculas MHC y la 4/ | , presentación del antígeno a las células T .....
.*•
Nuestro sistema inmunitario nos salva de una muerte segura por infección. Un vertebrado que nazca con un sistema inmunitario gravemente defectuoso mori rá pronto, a menos que se adopten medidas extraordinarias para aislarlo de un ejército de agentes infecciosos -bacterias, virus, hongos y otros parásitos. Todos los vertebrados tienen un sistema inmunitario, mientras que los invertebrados presentan sistemas de defensa más primitivos, que a menudo se basan princi palmente en células fagocíticas. Estas células (principalmente macrófagos y neutrófílos) desempeñan también un papel importante en la defensa de los ver tebrados contra la infección, aunque sólo constituyen una parte de una estrate gia de defensa mucho más compleja y sofisticada. La inmunología, el estudio del sistema inmunitario, nació a partir de la ob servación habitual de que las personas que se recuperan de ciertas infecciones son “inmunes” a la enfermedad a partir de entonces; es decir, rara vez sufren de nuevo la misma enfermedad. La inmunidad es altamente específica: un individuo que se recupera del sarampión queda protegido contra el virus del sarampión, pero no contra otros virus comunes como el de las paperas o el de la varicela. Esta especificidad es una característica fundamental de la respuesta inmunitaria. Muchas de las respuestas del sistema inmunitario inician la destrucción y eliminación de los organismos invasores y de todas las moléculas tóxicas produ cidas por ellos. Estas reacciones inmunitarias son destructivas, por lo que es im portante que únicamente se produzcan contra moléculas que son extrañas al or ganismo huésped y no frente a moléculas del propio huésped. Esta capacidad de distinguir entre moléculas extrañas y moléculas propias es otro rasgo fundamen tal del sistema inmunitario. En ocasiones el sistema inmunitario no distingue de una forma adecuada y reacciona de forma destructiva contra las propias molé culas del huésped; estas enfermedades autoinmunitarias pueden ser fatales. El sistema inmunitario evolucionó en el sentido de proteger a los vertebra dos contra la infección por parte de microorganismos y parásitos mayores, pero la mayor parte de lo que sabemos sobre la inmunidad procede de estudios sobre las respuestas inmunitarias en los animales de laboratorio ante inyecciones de substancias no infecciosas, tales como proteínas y polisacáridos extraños. Casi cualquier macromolécula, siempre que sea extraña al receptor, puede inducir una respuesta inmunitaria; las substancias capaces de desencadenar una res puesta inmunitaria reciben el nombre de antígeno (generador de anticuerpo). Es importante subrayar que el sistema inmunitario puede distinguir antígenos muy similares entre sí -p or ejemplo, dos proteínas que se diferencien en un solo aminoácido, o dos isómeros ópticos de la misma molécula.
..
...
-:r .
..
• Las células T cito tóxicas • Células T colaboradoras y activación de las células í •Selección del repertorio de células T
1279
Existen dos clases principales de respuestas inmunitarias:(l) respuestas por anticuerpos y (2) respuestas inmunitarias mediadas por células. Las respuestas por anticuerpos implican la producción de anticuerpos, que son proteínas que reciben el nombre de inmunoglobulinas. Los anticuerpos circulan por la sangre y penetran en otros fluidos corporales donde se unen específicamente al antígeno extraño que los ha inducido. La unión del anticuerpo inactiva a virus y toxi nas bacterianas (como la del tétanos o la botulínica) bloqueando su capacidad de unirse a los receptores de las células del huésped. La unión de los anticuerpos tam bién marca a los microorganismos invasores para su destrucción, facilitando su ingestión por una célula fagocítica o mediante la activación de un sistema de proteínas sanguíneas, denominadas colectivamente complemento, que destruirá a los invasores. La respuesta m ediada por células, la segunda clase de respuestas inmunita rias, implica la producción de células especializadas que reaccionan con los antígenos extraños situados sobre la superficie de otras células del huésped. La cé lula reactiva, por ejemplo, puede matar a las células del huésped infectadas por virus, que presenten antígenos víricos en su superficie, eliminando así la célula infectada antes de que el virus se haya replicado. En otros casos, la célula reacti va segrega señales químicas que activan a los macrófagos para que destruyan a los microorganismos invasores. El principal reto de la inmunología ha sido entender cómo el sistema inmunitario reconoce específicam ente y reacciona de forma agresiva frente a un nú mero casi ilimitado de macromoléculas extrañas distintas, evitando al mismo tiempo reaccionar con las decenas de miles de macromoléculas propias diferen tes producidas por las células del huésped. Empezaremos nuestra discusión so bre el sistema inmunitario considerando las células que son las responsables principales de los dos tipos de inmunidad. A continuación consideraremos las características estructurales y funcionales de los anticuerpos que posibilitan a las células reconocer y destruir los antígenos extracelulares. Después de discutir cómo se genera la diversidad de los anticuerpos, consideraremos las caracterís ticas especiales de las respuestas inmunitarias mediadas por células, que son cruciales en la defensa contra los microorganismos intracelulares.
Base celular de la inmunidad El sistem a inm unitario humano está compuesto por billones de linfocitos1 Las células responsables de la especificidad inmunitaria pertenecen a una clase de glóbulos blancos conocido como linfocitos. Se encuentran en grandes canti dades en la sangre, en la linfa (el líquido incoloro de los vasos linfáticos que co nectan los nódulos linfáticos del cuerpo) y en órganos linfoides especializados como el timo, los nódulos linfáticos, el bazo y el apéndice (Figura 23-1). En el cuerpo humano existen ~2 x 10 12 linfocitos, lo cual hace que el sistema inmunitario sea comparable, en masa celular, al hígado o al cerebro. Aunque los linfocitos fueron reconocidos hace tiempo como uno de los principales com po nentes de la sangre, su papel central en la inmunidad no fue demostrado hasta finales de los años 1950. La prueba se obtuvo a partir de experimentos en los que se irradiaba intensam ente a ratas o ratones para matar la mayor parte de sus gló bulos blancos, incluidos los linfocitos. En estas condiciones estos animales son incapaces de producir respuestas inmunitarias, por lo que es posible transferir les varios tipos de células y determinar cuáles son las que corrigen la deficiencia. Únicam ente los linfocitos restauraron la respuesta inmunitaria de los animales irradiados (Figura 23-2). Como se recuperaban tanto las respuestas con anti cuerpos como las respuestas mediadas por células, estos experimentos estable cieron que los linfocitos son los responsables de ambos tipos de respuestas in munitarias. En el momento en que fueron realizados estos experimentos, los
1 280
Capítulo 23 : El sistema inmunitario
Figura 23-1 Los órganos linfoides humanos. Los linfocitos se desarrollan en el timo y en la médula ósea (en amarillo), los cuales se denominan por este motivo órganos linfoides primarios (o centrales). Los linfocitos recién formados migran desde estos órganos primarios hacia los órganos linfoides secundarios (o periféricos) (en azul], donde pueden reaccionar con el antígeno. En el dibujo sólo se muestran algunos de los órganos linfoides secundarios; por ejemplo, muchos linfocitos se encuentran en la piel y en los pulmones.
linfocitos se encontraban entre las células de los vertebrados menos conocidas; ahora se encuentran entre las células que conocem os mejor.
Los linfocitos B producen las respuestas humorales con anticuerpos; los linfocitos T producen las respuestas mediadas por células2 Durante los años 1960 se descubrió que los dos tipos principales de respuestas inmunitarias están mediadas por dos clases diferentes de linfocitos: las células T que se originan en el timo y son responsables de la inmunidad mediada por cé lulas, y las células B, que en los adultos se originan en la médula ósea y en el feto en el hígado, que producen los anticuerpos. Esta dicotomía del sistema linfoide fue demostrada inicialmente en animales con inmunodeficiencias inducidas ex perimentalmente. Se encontró que la extirpación del timo a un animal recién nacido perjudica de forma pronunciada las respuestas mediadas por células pero ejerce mucho menos efecto sobre las respuestas con anticuerpos. En las aves tam bién fue posible demostrar el efecto contrario debido a que las células B se desarrollan en un órgano linfoide discreto asociado al intestino, la bolsa de Fabricio, que es exclusivo de las aves. La extirpación de la bolsa de Fabricio en el
Figura 23-2 El experimento clásico que demuestra que los linfocitos son los responsables del reconocimiento y de la respuesta ante los antígenos extraños. Una característica importante de todos estos experimentos de transferencia de células es que las células se transfieren entre animales de la misma cepa consanguínea. Los miembros de una cepa consanguínea son genéticamente idénticos. Si se transfieren los linfocitos a un animal genéticam ente diferente que ha sido irradiado, estos linfocitos reaccionan contra los antígenos “extraños” del huésped y pueden matar al animal.
antígeno antígeno RESPUESTA INMUNITARIA NORMAL
anim al norm al
antígeno
antígeno NO SE PRODUCE RESPUESTA INMUNITARIA
CONTROL
Base celular de la inmunidad
el anim al irradiado recibe linfocitos de un anim al norm al
RESPUESTA INMUNITARIA RECUPERADA
el animal irradiado recibe otras células de un animal norm al
NO SE PRODUCE RESPUESTA INMUNITARIA
EXPERIMENTO
1281
momento de la eclosión disminuye la capacidad del ave para producir anticuer pos pero ejerce muy poco efecto sobre la inmunidad mediada por células. Por otra parte, estudios realizados con niños recién nacidos con una inmunidad de ficiente demostraron que algunos de estos niños no podían producir anticuer pos pero tenían una inmunidad mediada por células normal, mientras que otros presentaban la deficiencia opuesta; además, los que tenían una deficiencia se lectiva en el tipo de respuestas mediadas por células, casi siempre presentaban anomalías en el timo. Uno de los rasgos más sorprendentes de estos estudios sobre animales inmunodeficientes estribaba en que los individuos deficientes en células T (porque su timo había sido extirpado o era anormal) no sólo eran incapaces de producir respuestas inmunitarias mediadas por células sino que además presentaban unas respuestas de anticuerpos algo deficientes. Ahora sabemos cuál es la expli cación. Existen dos tipos principales de células T -células T colaboradoras y célu las T citotóxicas. Las células T colaboradoras intensifican las respuestas de otros glóbulos blancos, y algunas de dichas células T colaboran con las células B en la producción de las respuestas por anticuerpos. Las células T citotóxicas, por el contrario, destruyen las células infectadas; debido a que se hallan directamente implicadas en la defensa contra la infección, a diferencia de las células T colabo radoras, las células T citotóxicas (junto con las células B) en ocasiones se deno minan células efectoras.
Los linfocitos se desarrollan en los órganos linfoides primarios y reaccionan con los antígenos extraños en los órganos linfoides secundarios3 Los linfocitos se desarrollan a partir de células madre hematopoyéticas pluripotenciales, que dan lugar a todas las células sanguíneas, incluidos los eritrocitos, los leucocitos y las plaquetas. Estas células madre, que han sido estudiadas en el Ca pítulo 22, están localizadas primariamente en los tejidos hematopoyéticos -e l hí gado en fetos y la médula ósea en adultos. Las células T se desarrollan en el timo a partir de células precursoras procedentes de los tejidos hematopoyéticos, por vía sanguínea. En los mamíferos las células B se desarrollan a partir de células madre en los propios tejidos hematopoyéticos; sin embargo, en las aves las células B se desarrollan en la bolsa de Fabricio a partir de células precursoras que han migra do hasta allí a partir de los tejidos hematopoyéticos, a través de la sangre. El timo, los tejidos hematopoyéticos y la bolsa de Fabricio se conocen como órganos lin-
tejido hem atopoyético
tim o
Figura 23-3 El desarrollo de las células T y B. Los órganos
órganos linfoides
RESPUESTA INMUNITARIA MEDIADA POR CÉLULAS RESPUESTA DE ANTICUERPOS
bolsa de Fabricio (únicam ente aves) 128 2
Capítulo 23 : El sistema inmunitario
linfoides primarios, donde se desarrollan los linfocitos a partir de células precursoras, están reseñados en los recu adros am arillos.
foides (centrales) prim arios, debido a que son centros donde se desarrollan los linfocitos a partir de las células precursoras (Figura 23-1). Tal como veremos más adelante, la mayoría de los linfocitos mueren poco después de haberse formado en un órgano linfoide primario. Otros, sin embargo, maduran y migran vía sanguínea hacia los órganos linfoides (periféricos) secun darios -principalmente, los nodulos linfáticos, el bazo y los nodulos linfáticos asociados al epitelio del tracto gastrointestinal, tracto respiratorio y la piel (véase Figura 23-1). En estos órganos linfoides secundarios es principalmente donde las células T y las células B reaccionan con los antígenos extraños (Figura 23-3). El grueso de la migración de los linfocitos desde el timo y la bolsa de Fabricio se produce en las primeras etapas del desarrollo, por lo que la extirpación de estos órganos en los animales adultos tiene relativamente poco efecto sobre las respuestas inmunitarias; ésta es la razón de que su papel en la inmunidad tarda ra tanto tiempo en ser descubierto. Por el contrario, la médula ósea de los m am í feros continúa generando grandes cantidades de nuevas células B (~5 x 107/día en un ratón) durante toda la vida. Figura 23-4 Electronmicrografías de linfocitos en reposo y activados. El
Los marcadores de superficie celular permiten distinguir y separar las células T de las células B2,4 Las células T y las células B sólo son morfológicamente diferenciables después de haber sido estimuladas por un antígeno. Las células T y B no estimuladas (“en re poso”) tienen un aspecto muy similar, incluso al microscopio electrónico: ambas son pequeñas, sólo algo mayores que los eritrocitos, y tienen un núcleo volumi noso (Figura 23-4A). Ambas se activan por antígenos, pasando entonces a proliferar y a diferenciarse. Las células B activadas se convierten en células secretoras de anticuerpos, las más maduras de las cuales son las células plasmáticas, que pre sentan un retículo endoplasmático rugoso bien desarrollado (Figura 23-4B). En cambio, las células T activadas presentan muy poco retículo endoplasmático y no segregan anticuerpos, aunque segregan una gran variedad de mediadores deno minados linfoquinas, interleuquinas o citoquinas (Figura 23-4C). Ambos tipos de linfocitos, T y B, se presentan en todos los órganos linfoides secundarios, por lo que ha sido necesario encontrar sistemas para distinguir y separar ambos tipos celulares y sus numerosos subtipos, con el fin de estudiar sus propiedades individuales. Afortunadamente, existen numerosas diferencias en las glucoproteínas de la membrana plasmática de los diferentes tipos de lin focitos que se pueden utilizar como marcadores distintivos. Por ejemplo, los an-
linfocito en reposo en (A) puede ser una célula T o una célula B pues resulta difícil distinguirlas morfológicamente hasta que hayan sido activadas. La célula B activada (una célula plasmática) en (B) está repleta de un extenso retículo endoplasmático (ER) rugoso, que se halla distendido, con moléculas de anticuerpo. La célula T activada en (C) presenta relativamente poco ER rugoso pero está llena de ribosomas libres. Obsérvese que las tres células se muestran al mismo aumento. (A, por cortesía de Dorothy Zucker-Franklin; B, por cortesía de Cario Grossi; A y B, de D. Zucker-Franklin et al., Atlas of Blood Cells: Function and Pathology, 2nd ed. Milán, Italia: Edi. Ermes, 1988; C, por cortesía de Stefanello de Petris.)
(C) célula T activa
(B) célula B activa (célula plasm ática)
Base celular de la inmunidad
1
1
pm
jjrn
1283
Figura 23-5 La teoría de la selección clonal. Un antígeno activa únicamente
célula precursora PROLIFERACIÓN Y DIVERSIFICACION DEL LINAJE CELULAR distintos clones de células B en reposo (vírgenes)
B1
B2
B3
UNION DEL ANTIGENO A UN CLON ESPECÍFICO
•• • •• B2
PROLIFERACIÓN {EXPANSIÓN CLONAL) Y MADURACIÓN
I I I ! células B secretoras de anticuerpos de un solo clan
B2
82
t
ticuerpos que reaccionan con la proteína Thy-1, la cual se encuentra en las célu las T del ratón pero no en las B, son ampliamente utilizados para eliminar o pu rificar células T de una población mixta de linfocitos. Así mismo, los anticuerpos contra las proteínas CD4 y CD8, que veremos más adelante, se utilizan muy a menudo para distinguir y separar células T colaboradoras de células T citotóxicas, respectivamente, tanto en el ratón como en el hombre.
El sistem a inm unitario actúa m ediante la selección clonal5 El rasgo más notable del sistema inmunitario estriba en que puede responder a millones de antígenos extraños diferentes de una manera altamente específica -p o r ejemplo, mediante la producción de anticuerpos que reaccionan específi cam ente con el antígeno que ha inducido su formación. ¿Cómo puede el sistema inmunitario producir sem ejante diversidad de anticuerpos específicos? La res puesta empezó a dilucidarse en los años 1950 con la teoría de la selección clo nal. Según dicha teoría cada animal genera primero aleatoriamente una gran va riedad de linfocitos y posteriormente se seleccionan específicamente las células que reaccionan contra los antígenos extraños que el animal ha ido encontrando. La teoría de la selección clonal se basa en la idea de que durante el desarrollo, cada linfocito queda destinado a reaccionar con un antígeno concreto, antes de haber sido expuesto a este antígeno. Una célula expresa este destino en forma de unas proteínas receptoras de la superficie celular que se adaptan específicam en te al antígeno. La unión del antígeno a los receptores activa la célula haciendo que prolifere y madure. Por consiguiente, un antígeno extraño estimula selecti vamente a aquellas células que expresan unos receptores complementarios y es pecíficos del antígeno y que por consiguiente ya están destinadas a responder ante el antígeno. Esto es lo que hace que las respuestas inmunitarias sean espe cíficas del antígeno. El término “clonal” de “la selección clonal” deriva del postulado de que el sistema inmunitario está compuesto por millones de familias diferentes, o clones de células, cada uno de los cuales consta de células T o B descendientes de un an cestro común. Cada célula ancestral ya está destinada a producir un tipo de pro teína receptora determinada, específica del antígeno, y todas las células de cada clon tienen la misma especificidad antigénica (Figura 23-5). Así, según la teoría de la selección clonal, el sistema inmunitario actúa según el principio de “lo ya confeccionado” y no de “lo hecho a medida”.
128 4
Capítulo 23 : El sistema inmunitario
aquellos clones de linfocitos que ya están destinados a responder ante él. Una célula destinada a responder ante un antígeno concreto expresa receptores de superficie celular que reconocen específicam ente al antígeno y todas las células del clon expresan el mismo receptor. Se cree que el sistema inmunitario consta de millones de clones diferentes de linfocitos, cientos de los cuales pueden ser activados por un antígeno particular (véase más adelante). Aunque sólo se muestran las células B, las células T actúan de forma similar.
Figura 23-6 Dos tipos de experimentos que apoyan la teoría de selección clonal. Para una mayor
EXPERIMENTO 2
EXPERIMENTO 1
antígeno A altam ente radiactivo
las células con receptores para el antígeno A se adhieren a las esferas recubiertas con antígeno A y son elim inadas
-m
simplicidad, los receptores de la superficie celular se han dibujado únicamente en los linfocitos que están destinados a responder al antígeno A; de hecho, sin embargo, todos las células T y B tienen receptores específicos para el antígeno en su superficie. Los experimentos se han realizado principalmente con células B, puesto que las células T reconocen un antígeno sólo cuando éste se ha unido a la superficie de una célula huésped, como veremos mas adelante.
las células con receptores para el antígeno A resultan • * irradiadas letalm ente
los ratones no responden al antígeno A, pero sí a otros antígenos Existen muchas pruebas que apoyan los principios de la teoría de selección clonal. Por ejemplo, cuando los linfocitos de un animal que no ha sido inmuniza do se incuban en un tubo de ensayo con un antígeno cualquiera de una serie de antígenos marcados radiactivamente -p or ejemplo A, B, C y D - sólo una propor ción muy reducida de los linfocitos (<0,01%) se unen a cada uno de los antíge nos, lo cual sugiere que sólo unas cuantas células pueden responder a A, B, C o D. Ello se confirma haciendo que el antígeno A sea tan altamente radiactivo que cualquier célula que se una a él quede irradiada letalmente; la población restante de linfocitos ya no es capaz de producir respuesta inmunitaria ante A, aunque todavía puede responder a los antígenos B, C o D. El mismo efecto se puede con seguir con una columna de afinidad de cuentas de vidrio recubiertas con el antí geno A y haciendo pasar luego los linfocitos a través de la columna. Las células con receptores para A quedan retenidas en la columna mientras que las otras cé lulas la atraviesan; por ello, las células que salen de la columna ya no pueden responder ante A, pero responden normalmente a otros antígenos (Figura 23-6). Estos dos experimentos indican primero que los linfocitos están destinados a responder a un antígeno determinado antes de haber estado expuestos a él, y segundo, que los linfocitos tienen receptores en su superficie que unen específi cam ente el antígeno. Por consiguiente quedan confirmadas dos de las prediccio nes principales de la teoría de la selección clonal. Aunque la mayoría de experi mentos de este tipo se han realizado en células B y en respuestas de anticuerpos, otros experimentos indican que las respuestas mediadas por células T también se desarrollan por la selección clonal. En la actualidad sabemos que los receptores específicos de antígenos tanto para las células T como para las células B se hallan codificados por genes que se ensamblan a partir de series de segmentos génicos mediante una única forma de
Base celular de la inmunidad
1 285
recom binación genética que tiene lugar en una etapa temprana del desarrollo celular, antes de encontrarse con el antígeno. Veremos más adelante cómo el proceso de ensam blaje genera la enorme diversidad de receptores que capacita al sistema inmunitario para responder prácticamente a una diversidad ilimitada de antígenos.
t
| 0=C
residuo de lisina
H -C -C H 2-C H 2-C H 2-C H 2-N H -
La mayoría de antígenos estim ulan muchos clones diferentes de linfocitos6 La mayoría de macromoléculas, incluidas prácticam ente todas las proteínas y gran parte de los polisacáridos, pueden actuar como antígenos. Las zonas de un antígeno que se com binan con el lugar de unión para los antígenos de una m o lécula de anticuerpo o con el receptor de un linfocito, reciben el nombre de de term inantes antigénicos (o epítopos). La mayoría de antígenos tienen varios de term inantes antigénicos diferentes que estimulan la producción de anticuerpos o la respuesta de células T. Algunos determinantes son más antigénicos que otros, de modo que la reacción que provocan puede dominar la respuesta gene ral; se dice que tales determinantes son inmunodominantes. Como cabría esperar de un sistema que actúe por selección clonal, general mente cada determinante antigénico activará muchos clones, cada uno de los cuales produce un lugar de unión al antígeno con una afinidad característica para el determinante. Por ejemplo, incluso una estructura relativamente simple como el grupo dinitrofenol (DNP), que se muestra en la Figura 23-7, puede ser “mirada” de muchas maneras distintas. Así, cuando está acoplado a una proteí na, suele estimular la producción de cientos de especies diferentes de anticuer pos anti-DNP, cada una de ellas producida por un clon de células B diferente. Tales respuestas se denominan policlonales. Cuando sólo responden unos cuan tos clones, se dice que la respuesta es oligoclonal, y cuando toda la respuesta está producida por un solo clon de células B o T, se habla de respuesta monoclonal. Las respuestas a la mayoría de antígenos son policlonales. Incluso los antígenos que activan muchos clones sólo estimulan una frac ción muy reducida de la población linfocitaria total. Para asegurar que estos po cos linfocitos sean expuestos al antígeno, los antígenos son recogidos por células presentadoras de antígeno especializadas en los órganos linfoides secundarios, a través de los cuales circulan continuam ente linfocitos T y B. Los antígenos que entran a través del intestino son atrapados por los tejidos linfoides asociados al intestino; los que penetran a través de la piel o el tracto respiratorio son reteni dos localm ente y/o transportados vía linfática hasta los nodulos linfáticos loca les; y los que entran en la sangre son filtrados en el bazo.
La mayoría de los linfocitos recirculan continuam ente7 La mayoría de las células T y B recirculan continuamente entre la sangre y los ór ganos linfoides secundarios. En un nodulo linfático, por ejemplo, los linfocitos abandonan la circulación pasando con dificultad entre células endoteliales espe cializadas; tras filtrarse a través del nodulo se acumulan en pequeños vasos linfá ticos que abandonan el nodulo y conectan con otros vasos linfáticos, que a su vez atraviesan otros nodulos linfáticos situados más lejos. Circulando a través de va sos cada vez mayores, los linfocitos entran finalmente en el vaso linfático princi pal (el conducto torácico ), que los devuelve a la circulación sanguínea. Esta recir culación continua no sólo asegura que los linfocitos apropiados entren en contacto con el antígeno sino que también asegura que los linfocitos apropiados se encuentren entre sí: veremos que las interacciones entre linfocitos determina dos constituyen una parte crucial de la mayoría de las respuestas inmunitarias. La recirculación de linfocitos depende de interacciones específicas entre la superficie celular del linfocito y la superficie de células endoteliales especializa das que recubren el interior de pequeñas venas en los órganos linfoides secun darios; debido al extraordinario tamaño de sus células endoteliales, dichas venas
1 28 6
Capítulo 2 3 : El sistema inmunitario
no2 g r u p o d im t r o f e n il
(DNP)
esqueleto del polipéptido Figura 23-7 El grupo dinitrofenol (DNP). Aunque es demasiado reducido para inducir una respuesta inmunitaria por sí mismo, cuando se acopla en forma covalente a una lisina de la cadena lateral de una proteína, tal como se ilustra aquí, el DNP estimula la producción de muchas especies diferentes de anticuerpos, que se unen específicam ente a dicho grupo.
Figura 23-8 Dibujo muy simplificado de un nódulo linfático humano. Las
cortex (principalm ente células B) paracórtex (principalm ente células T)
folículo linfoide vénula postcapilar de endotelio alto
m édula
seno m arginal senos m edulares vaso linfático eferente arteria 3 mm
se denominan vénulas postcapilares de endotelio grande (Figura 23-8). Muchos tipos celulares de la sangre entran en contacto con dichas células endoteliales grandes, pero sólo los linfocitos se adhieren y migran entonces fuera de la co rriente sanguínea. Distintas subpoblaciones de linfocitos migran a través de dis tintos tejidos linfoides: por ejemplo, mientras que la mayoría de linfocitos migran hacia los nodulos linfáticos, algunos migran preferentemente hacia las placas de Peyer en el intestino delgado y constituyen, efectivamente, un subsis tem a intestinal específico de linfocitos especializados en la respuesta frente a antígenos que penetran en el cuerpo desde el intestino. Dichas migraciones están dirigidas por los diferentes receptores buscado res en los linfocitos y por los ligandos de dichos receptores (en muchos casos denominados localizadores de receptores, “counterreceptors”) en las células en doteliales. Ambos tipos de receptores y de localizadores de receptores se han identificado mediante anticuerpos monoclonales que se unen bien a la superfi cie de distintos linfocitos o bien a la de células endoteliales altas especializadas e inhiben la capacidad de los linfocitos para unirse a las células endoteliales en cortes de tejido de órganos linfoides secundarios así como para recircular in vivo. Por ejemplo, la migración de los linfocitos hacia los nodulos linfáticos de pende de una proteína de adhesión celular denominada selectina E, que perte nece a la familia de selectinas de las lectinas de superficie celular, como se vio en el Capítulo 10. Este receptor buscador, que se encuentra en la mayoría de linfo citos, se une de forma específica a los grupos azúcar de un detector de recepto res altamente glucosilado, similar a la mucina que se expresa únicamente en la superficie de las células del endotelio alto que revisten las vénulas postcapilares de los nodulos linfáticos (véase Figura 23-8). La unión de la selectina E induce a los linfocitos a adherirse débilmente a las células endoteliales y a deslizarse len.tam ente por su superficie. El deslizamiento prosigue hasta que se activa otro sis tem a más fuerte de adhesión. Dicha adhesión fuerte, que está facilitada por un miembro de la familia de las moléculas de adhesión celular integrinas de la su perficie de los linfocitos (como vimos en el Capítulo 19), permite a los linfocitos detener su deslizamiento y desplazarse al exterior del vaso sanguíneo hacia el nodulo linfático (Figura 23-9). Se cree que otros receptores buscadores de linfocitos son los responsables de la segregación de las células T y B en áreas diferentes en el nódulo linfático (véase Figura 23-8). Una vez han sido activados por el antígeno, la mayoría de los linfocitos pierden muchos de sus receptores buscadores iniciales y adquieren otros nuevos: en lugar de migrar a través de los órganos linfoides migran a través de tejidos no linfoides hacia los centros de inflamación. La migración de los lin focitos activados y de otros glóbulos blancos de la sangre hacia los centros de in flamación está facilitada ampliamente por diversas combinaciones de selectinas e integrinas (tal como hemos visto en el Capítulo 10).
Base celular de la inmunidad
células B están localizados primariamente en el córtex, donde están agrupadas en estructuras llamadas folículos linfoides. Las células T se encuentran mayoritariamente en el paracórtex. Ambos tipos de linfocitos penetran en el nódulo linfático procedentes de la sangre, pasando por unas pequeñas venas denominadas vénulas postcapilares de endotelio grande y migran después hacia sus áreas respectivas. Finalmente tanto las células T como las B migran a los senos medulares y abandonan el nódulo pasando por el vaso linfático eferente. Este vaso desem boca en la corriente sanguínea, permitiendo que los linfocitos empiecen otro ciclo de circulación a través de un órgano linfoide secundario. Los antígenos extraños que entran en el nódulo linfático son expuestos en la superficie de células
presentadoras de antígeno especializadas: un tipo de estas células
(células dendríticas con interdigitaciones) presenta los antígenos a las células T en el área paracortical; se cree que otro tipo de células (células dendríticas foliculares) están implicadas en la activación de las células B de memoria (se discutirá más adelante) en el centro activado (denominado un centro germinativo) de los folículos linfoides.
1287
lám ina basal
í# [# ]#
#
#
1; . I
#
Figura 23-9 Migración de un linfocito desde la corriente sanguínea hacia un nòdulo linfático. Un linfocito
i I
ADHESIÓN DÉBIL Y ADHESIÓN FUERTE Y DESPLAZAMIENTO MIGRACIÓN (selectina-dependiente) (integrina-dependiente)
linfocito célula de endotelio alto de la vénula postcapilar
f* *
*T
Ii
vénula postcapilar
r*
1
1 * 1 * i•
1•
J a
i
V
circulante se adhiere débilmente a la superficie de las células especializadas de endotelio alto. Dicha adhesión inicial, mediada por la selectina E de la superficie del linfocito, es tan débil que provoca que el linfocito se desplace a lo largo de la superficie de las células endoteliales. El linfocito activa rápidamente un sistema de adhesión más fuerte, mediado por una integrina, que permite a la célula detenerse en su desplazamiento y migrar hacia fuera de la vénula entre las células endoteliales.
La memoria inmunológica se debe a la expansión clonal y a la maduración de los linfocitos8 Como el sistema nervioso, el sistema inmunitario tiene la capacidad de recordar. Por ello, tras estar expuestos a determinados virus desarrollamos una inmuni dad para toda la vida frente a muchas enfermedades víricas comunes, lo cual constituye la inmunización. Este mismo fenómeno se puede poner fácilmente de manifiesto en animales experimentales. Si a un animal se le inocula el antígeno A, su respuesta inmunitaria (ya sea por anticuerpos o mediada por células) aparecerá al cabo de un período de retraso de varios días, aumentando de ma nera rápida y exponencial para luego volver a disminuir, aunque de forma más gradual. Éste es el curso característico de una respuesta inmunitaria primaria, que se produce en la primera exposición de un animal a un antígeno. Si se dejan transcurrir algunas semanas o meses, o incluso años, y de nuevo se inyecta al animal el antígeno A, se producirá una respuesta inmunitaria secundaria, muy distinta de la respuesta primaria: el período de retraso es más breve y la respues ta es mayor y su duración más prolongada. Estas diferencias indican que el ani mal ha “recordado” su primera exposición al antígeno A. Si al animal se le admi nistra un antígeno distinto (por ejemplo el antígeno B), en lugar de una segunda inyección de antígeno A, típicam ente la respuesta será de tipo primario y no se cundario; por consiguiente, la respuesta secundaria refleja una m em oria inmu nológica específica del antígeno A (Figura 23-10). La teoría de la selección clonal proporciona una trama conceptual útil para comprender la base celular de la memoria inmunológica. En un animal adulto, las células T y B de los órganos linfoides secundarios son una mezcla de células
coo
Figura 23-10 Respuestas prim aria y secundaria de anticuerpos. La
100
Q_
respuesta primaria al antígeno A
respuesta secundaria al antígeno B
respuesta primaria al antígeno B
Q-
10 prim era inyección del antígeno A
1288
Capítulo 23 : El sistema inmunitario
20
30
40
50
60 —► tiempo (días) tt segunda inyecc ón del antígeno A y prim era inyec :ión del antígeno B
respuesta secundaria es más rápida e intensa que la respuesta primaria y es específica para A, lo cual indica que el sistema inmunitario ha “recordado” específicamente el haberse encontrado anteriormente con el antígeno A. Si se miden las respuestas mediadas por células T y no las respuestas de anticuerpos de células B, se obtienen pruebas de memoria inmunológica del mismo tipo.
Figura 23-11 Modelo de los fundamentos celulares de la memoria inmunitaria. Cuando las células T o B vírgenes son estimuladas por su antígeno específico, proliferan y maduran; algunas se activan dando lugar a una respuesta, mientras que otras se transforman en células de memoria. Durante una exposición posterior al mismo antígeno, las células de memoria responden más rápidamente que las células vírgenes: proliferan y se desarrollan dando lugar a células activadas y a más células de memoria. En el modelo que se presenta aquí, cada célula virgen individual puede desarrollarse ya sea en célula de memoria o en célula activada, dependiendo de las condiciones. En un modelo alternativo (que no se muestra en la figura) las células vírgenes que maduran a células de memoria son diferentes de las que maduran en células activadas. Se desconoce cuál de estos modelos es el correcto.
que se hallan por lo menos en tres fases discretas de maduración, que se pueden denominar células vírgenes (o “naíve cells”), células con memoria y células activa das. Cuando las células vírgenes se encuentran con un antígeno por primera vez, algunas de ellas se estimulan para multiplicarse y se transforman en células activadas -e s decir, en células dedicadas activamente a producir una respuesta (las células activadas T realizan respuestas mediadas por células, mientras que las células activadas B secretan anticuerpo). Otras células vírgenes se estimulan para multiplicarse y diferenciarse en células de m em oria -e s decir, en células que no producen respuesta pero que fácilmente se inducen a transformarse en células activadas, ante un encuentro posterior con el mismo antígeno (Figura 23-11). Mientras que las células vírgenes y las células de memoria pueden vivir durante meses o incluso años, las células efectoras mueren por muerte celular programada en unos cuantos días. Las células de memoria responden mucho más rápidamente al antígeno que las células vírgenes. Veremos más adelante que una de las razones que explica esta capacidad de respuesta incrementada de las células B de memoria es que sus receptores presentan una mayor afinidad por el antígeno. Por el contrario, las cé lulas de memoria T parecen responder al antígeno más rápidamente que las célu las vírgenes T no debido a la presencia de receptores de alta afinidad para el antí geno, sino porque que se adhieren de forma más fuerte a otras células y traducen las señales extracelulares de forma más eficiente. Según este esquema, la memo ria inmunológica se genera durante la respuesta primaria, en parte porque la pro liferación de la célula virgen, desencadenada por el antígeno, genera muchas cé lulas de memoria -proceso conocido como expansión clonal- y en parte porque las células vírgenes se diferencian en células de memoria que son capaces de res ponder más fácilmente al antígeno que una célula virgen. Los antígenos pueden persistir en los tejidos linfoides durante largo tiempo constituyendo una respues ta primaria y se cree que una estimulación continua mediante un antígeno con tribuye al mantenimiento de dicha memoria a largo plazo.
células de m em oria
células activadas
I
segunda exposición al antígeno
r.... .
e
células de m em oria
células activadas
La falta de respuesta ante los antígenos propios es debida a una tolerancia inmunológica adquirida9 ¿Por qué es capaz en sistema inmunitario de diferenciar entre las moléculas extra ñas y las moléculas propias? Una posibilidad estriba en que el animal hereda unos genes que codifican los receptores para los antígenos extraños pero no para los antígenos propios, de modo que su sistema inmunológico esté constituido genéti camente para responder únicamente a los antígenos extraños. También es posible que el sistema inmunitario sea, de forma inherente, capaz de responder tanto a los antígenos extraños como a los propios, pero que durante el desarrollo “aprenda” a no responder a los antígenos propios. Se ha demostrado que esta segunda explica ción es la correcta. La primera prueba de ello fue una observación realizada en 1945. Normalmente, cuando se trasplantan tejidos de un individuo a otro, se reco nocen como extraños por el sistema inmunitario y son destruidos. Pero se observó
Base celular de la inmunidad
1289
que los mellizos dizigóticos de bóvidos, que se desarrollan a partir de dos óvulos fe cundados y que por lo tanto no son idénticos, intercambiaban células sanguíneas in útero como resultado de la fusión espontánea de sus placentas; se demostró que estos mellizos aceptaban mutuamente los injertos cutáneos. Más tarde, estos hechos se reprodujeron experimentalmente en pollos, permitiendo la fusión de los vasos sanguíneos de dos embriones distintos; también se realizaron en rato nes, introduciendo en un neonato de ratón células del bazo de una cepa distinta, donde sobrevivían durante la mayor parte de la vida del receptor. En ambos ca sos, cuando los animales maduraron, los injertos procedentes del animal unido o del animal donante fueron aceptados (Figura 23-12), mientras que los injertos de un “tercero” fueron rechazados. Así, la presencia continua de antígenos no pro pios iniciada antes de que el sistema inmunitario haya madurado, conduce a una ausencia permanente de respuesta ante los antígenos no propios determinados. El estado resultante de la ausencia inducida de respuesta inmunológica a determina dos antígenos recibe el nombre de tolerancia inmunológica adquirida. Existen claras evidencias de que la ausencia de respuesta del sistema inmu nitario de un animal frente a sus propias macromoléculas (tolerancia inmunoló gica natural) se adquiere de la misma forma y, por lo tanto, no es innata. Por ejemplo, los ratones normales no pueden producir una respuesta inmunitaria contra su propia proteína del com plem ento C5, pero un ratón muíante que ca rezca del gen que codifica C5 (siendo por otro lado genéticamente idéntico en todo lo demás a un ratón normal) puede producir respuesta inmunitaria frente a esta proteína. El m antenim iento de la autotolerancia requiere la presencia cons tante de autoantígenos. Si un animal elimina un antígeno como el C5 recupera la capacidad de respuesta a dicho antígeno en unos cuantos días o semanas. Así, es evidente que el sistema inmunitario es genéticamente capaz de responder a lo propio pero aprende a no hacerlo. El proceso de aprendizaje que posibilita la autotolerancia puede implicar tanto la elim inación de linfocitos autorreactivos (deleción clonat) como la inacti vación funcional de las células pero manteniéndolas vivas (anergia clonat). Como veremos más adelante, muchos linfocitos autorreactivos se eliminan o inactivan cuando encuentran por primera vez un antígeno en los órganos linfoides primarios. Al parecer, los linfocitos formados nuevamente en dichos órga nos no se activan por unión al antígeno aunque son eliminados o inactivados por dicho antígeno. Alguna vez la tolerancia ante los antígenos propios desaparece, haciendo que las células T o B (o ambas) reaccionen contra los antígenos de sus propios tejidos. La miastenia gravis es un ejemplo de estas enferm edades autoinm unitarias. Los individuos afectados producen anticuerpos contra los receptores de acetilcolina de sus propias células del músculo esquelético; los anticuerpos in terfieren en el funcionamiento normal de los receptores, de modo que estos pa cientes se debilitan y pueden morir por incapacidad para respirar.
Figura 23-12 Tolerancia inmunológica. El injerto cutáneo que muestra esta fotografía, trasplantado de un ratón pardo adulto a un ratón blanco adulto, ha sobrevivido durante muchas semanas únicamente porque el segundo animal fue convertido en inmunológicamente tolerante gracias a la inyección de células del ratón pardo desde el momento del nacimiento. (Por cortesía de Leslie Brent, de I. Roitt, Essential Immunology, 6th ed. Oxford, U.K.: Blackwell Scientific, 1988.)
1 29 0
Capítulo 23 : El sistema inmunitario
Resumen El sistema inmunitario evolucionó en el sentido de defender a los vertebrados de la infección. Está compuesto por millones de clones de linfocitos. Los linfocitos de cada clon comparten un receptor determinado de la superficie celular que les per mite unirse a un “determinante antigénico” concreto, consistente en una disposi ción específica de átomos de una zona de la molécula. Existen dos clases de linfoci tos: las células B, que se forman en la médula ósea y producen anticuerpos, y las células T, que se forman en el timo y desarrollan respuestas inmunitarias mediadas por células. Durante las primeras fases del desarrollo de los linfocitos, muchos linfocitos que reaccionarían contra determinantes antigénicos de macromoléculas propias son eliminados o inactivados; a consecuencia de ello, normalmente el sistema in munitario reacciona sólo contra antígenos extraños. La unión de un antígeno ex traño a un linfocito inicia una respuesta por parte de la célula que ayuda a elimi nar el antígeno. Como parte de esta respuesta, algunos linfocitos proliferan y maduran a células de memoria, que son capaces de responder más rápidamente que las células vírgenes frente al antígeno. Así, la próxima vez que aparezca el mis mo antígeno la respuesta inmunitaria será más rápida e intensa.
Propiedades funcionales de los anticuerpos10 Los vertebrados mueren rápidamente a causa de una infección si no son capa ces de producir anticuerpos. Los anticuerpos nos defienden de la infección m e diante la inactivación de los virus y de las toxinas bacterianas, así como median te el reclutamiento del sistema del complemento y de varios tipos de glóbulos blancos de la sangre que matan a los microorganismos extracelulares y a parási tos más grandes. Los anticuerpos, sintetizados exclusivamente por las células B, son producidos en millones de formas, cada una de las cuales tiene una secuen cia de aminoácidos y un lugar de unión al antígeno diferentes. Conocidos colec tivamente como inm unoglobulinas (abreviado, Ig), se encuentran entre los com ponentes proteicos más abundantes de la sangre, constituyendo aproxima damente un 20% en peso del total de proteínas plasmáticas. En esta sección des cribiremos las cinco clases de anticuerpos que se encuentran en los vertebrados superiores, cada una de las cuales media una respuesta biológica característica tras su unión al antígeno.
Los receptores de las células B específicos para los antígenos son moléculas de anticuerpo11 Como predice la teoría de la selección clonal, todas las moléculas de anticuerpo producidas por cada célula B tienen el mismo lugar de unión para el antígeno. Los primeros anticuerpos producidos por una célula B recién formada no se se cretan, sino que quedan insertados en la membrana plasmática, donde actúan como receptores para el antígeno. Cada célula B tiene aproximadamente 105 moléculas de anticuerpo en su membrana plasmática. Cada una de dichas m olé culas de anticuerpo se halla asociada de forma no covalente con una serie cons tante de cadenas polipeptídicas transmembrana implicadas en transmitir seña les al interior de la célula cuando el lugar de unión extracelular para el antígeno se halla ocupado por un antígeno. Dichos polipéptidos constantes tienen la fina lidad de acoplar los receptores de los antígenos de las células B a uno o más miembros de la familia Src de proteínas tirosina quinasas (incluyendo la Lyn quinasa), de forma que cuando se une un antígeno se activa una cascada de fos forilaciones (véase Figura 23-54B). Cada célula B produce una sola clase de anticuerpo, con un único lugar de unión al antígeno. Cuando una célula virgen o una célula B con memoria es acti vada por un antígeno (con la ayuda de las células T colaboradoras), prolifera y
Propiedades funcionales de los anticuerpos
1291
madura convirtiéndose en una célula secretora de anticuerpos. Las células acti vadas producen y segregan grandes cantidades de anticuerpos solubles (en vez de unidos a membrana), con un lugar de unión para el antígeno igual al de los anticuerpos de la superficie celular que inicialmente habían servido de recepto res para el antígeno (Figura 23-13). Las células B activadas pueden empezar a se cretar anticuerpos mientras todavía son linfocitos pequeños, pero la fase final de su proceso de maduración es una gran célula plasmática (véase Figura 23-4B) que secreta anticuerpos a gran velocidad, del orden de unas 2000 moléculas por segundo. Parece que las células plasmáticas han dedicado una parte tan grande de su maquinaria de síntesis de proteínas a la producción de anticuerpos que son incapaces de crecer y dividirse, muriendo la mayoría de ellas al cabo de va rios días.
antígeno
célula B en reposo
receptor ^ - / del antígeno { g ^
PROLIFERACION Y MADURACIÓN
/ B
B
B ‘S
VA
Las células B pueden ser estimuladas a segregar anticuerpos en una placa de cultivo12 Dos adelantos realizados en los años 1960 revolucionaron la investigación sobre las células B. El primero fue el desarrollo de la prueba de la placa hemolítica, que hizo posible identificar y contar células B activadas secretoras de anticuerpos contra un antígeno específico. En la forma más sencilla de esta prueba, se toman linfocitos (generalmente del bazo) de animales que se habían inmunizado contra eritrocitos de oveja (SRBC, de Sheep Red Blood Cells). Luego, estos linfocitos se incluyeron en agar, junto con un exceso de SRBC, de modo que la placa contenía un “césped” de SRBC inmovilizados y algunos linfocitos. En estas condiciones las células son incapaces de moverse, pero cualquier anticuerpo anti-SRBC que sea secretado por una célula B difundirá hacia el exterior y recubrirá los SRBC de las proximidades de la célula secretora. Una vez recubiertos de anticuerpo, los SRBC se pueden matar añadiendo complemento. De esta manera, la presencia de cada célula secretora de anticuerpo viene indicada por la presencia de un punto claro, o placa, en la capa opaca de SRBC. Esta misma prueba se puede utilizar para con tar las células que producen anticuerpos contra otros antígenos, tales como pro teínas y polisacáridos, acoplando químicamente estos antígenos a la superficie de los SRBC. El segundo avance importante fue la demostración de que las células B pue den ser inducidas a segregar anticuerpos exponiéndolas al antígeno en un ensa yo en tubo o en la placa de cultivo, donde las interacciones celulares se pueden manipular y el entorno se puede controlar. Esto condujo al descubrimiento de que la mayoría de antígenos necesitan, para estimular a las células B vírgenes a secretar anticuerpos, tanto los células T colaboradoras como las células presen tadoras de antígeno especializadas , tal como veremos más adelante.
A
Y
V
y y y
Y
-<
B
v y A r
y
Y -<
A u
anticuerpos segregados Figura 23-13 Activación de una célula B. Cuando se activan células B en reposo mediante un antígeno para que proliferen y maduren a células secretoras de anticuerpos, producen y segregan anticuerpos con un único tipo de lugar de unión, que es el mismo que en los anticuerpos unidos a membrana actuaba como receptor del antígeno.
Los anticuerpos tienen dos lugares idénticos de unión al antígeno13 Las moléculas más sencillas de anticuerpo tienen forma de Y con dos lugares idénticos de unión al antígeno, uno en cada punta de los dos brazos de la Y (Fi gura 23-14). Como tienen dos lugares de unión al antígeno, se dice que son bi valentes. Cuando las moléculas de antígeno tienen tres o más determinantes antigénicos, las moléculas de anticuerpo bivalentes pueden establecer enlaces cruzados entre moléculas de antígeno, formando amplias redes (Figura 23-15), que pueden ser fagocitadas y degradadas rápidamente por los macrófagos. La eficiencia de la unión del antígeno y la formación de enlaces cruzados se ve al tam ente increm entada por la presencia en los anticuerpos de una región bisa gra flexible, que permite variar la distancia entre los dos lugares de unión al an tígeno (Figura 23-16). El efecto protector de los anticuerpos no se debe simplemente a su capaci dad para unir el antígeno. Tam bién participan en diversas actividades mediadas por el pie de la molécula en forma de Y. Esta parte de la molécula determina lo que le sucederá al antígeno después de unirse al anticuerpo. Veremos qüe anti-
129 2
Capítulo 2 3 : El sistema inmunitario
Figura 23-14 Representación sencilla de una molécula de anticuerpo. Obsérvese que los dos lugares de unión al antígeno son idénticos.
o rT
un determ inante antigénico
A
tres o más determ inantes antigénicos
dos determ inantes antigénicos
<#>
A
> ^ y< 'J lL .
J L -
y
J L
cuerpos con lugares de unión al antígeno iguales pueden tener uno cualquiera de los diferentes tipos de pie, cada uno de los cuales confiere al anticuerpo pro piedades funcionales distintas, como por ejemplo la capacidad de activar el complemento o de unirse a células fagocíticas.
Una molécula de anticuerpo está compuesta por dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénticas13 La unidad estructural básica de una m olécula de anticuerpo consta de cuatro ca denas polipeptídicas, dos cadenas ligeras (L) idénticas (cada una de ellas de unos 220 aminoácidos) y dos cadenas pesadas (H) (de “heavy”) idénticas (gene ralmente de unos 440 aminoácidos). Las cuatro cadenas se mantienen unidas entre sí gracias a una com binación de uniones no covalentes y covalentes (enla ces disulfuro). La molécula está compuesta por dos mitades idénticas, con el lu gar de unión al antígeno igual, y normalmente tanto la cadena ligera como la ca dena pesada cooperan entre sí formando la superficie de unión al antígeno (Figura 23-17). Las enzimas proteolíticas papaína y pepsina rompen las moléculas de anti cuerpo en diferentes fragmentos característicos. La papaína produce dos frag mentos Fab (de Fragment Antigen Binding) idénticos, cada uno de los cuales presenta un lugar de unión al antígeno, y un fragmento Fe (llamado así porque cristaliza con facilidad). En cambio, la pepsina produce un fragmento F(ab’)2 llamado así porque consta de dos fragmentos F(ab’) unidos covalentemente (cada uno de ellos algo mayor que un fragmento Fab); el resto de la molécula se degrada en fragmentos menores (Figura 23-18). Los fragmentos F(ab ’)2 son biva lentes, por lo que todavía pueden, a diferencia de los fragmentos Fab monova lentes, formar enlaces cruzados con los antígenos, y precipitar. Ninguno de estos fragmentos conserva las otras propiedades biológicas de las moléculas de anti cuerpo intactas debido a que carecen de la región del pie (Fe) en la que se basan estas propiedades.
Figura 23-15 Interacciones antígenoanticuerpo. Debido que los anticuerpos tienen dos lugares idénticos de unión al antígeno, pueden formar enlaces cruzados entre antígenos. El tipo de com plejo antígeno-anticuerpo que forman depende del número de determinantes antigénicos del antígeno. Aquí se muestra la unión de una sola especie de anticuerpo (un anticuerpo monoclonal) a un antígeno que presenta una, dos o tres copias de un mismo tipo de determinante antigénico. Los antígenos con dos determinantes antigénicos pueden formar pequeños complejos cíclicos o cadenas lineales con el anticuerpo, mientras que los antígenos con tres o más determinantes antigénicos pueden formar grandes redes tridimensionales que precipitan rápidamente en la solución. La mayoría de antígenos poseen muchos determinantes antigénicos distintos (véase Figura 2325A) y los distintos anticuerpos que reconocen estos determinantes diferentes pueden cooperar formando enlaces cruzados con el antígeno (no se muestra en la figura).
región bisagra de la m olécula de anticuerpo
Existen cinco clases diferentes de cadenas pesadas, cada una de las cuales tiene propiedades biológicas distintas10,14 En los vertebrados superiores existen cinco clases diferentes de anticuerpos, IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, cada una de las cuales tiene su propia clase de cadena pesa da a, 8, e, y y |i, respectivamente; las moléculas de IgA tienen cadenas a, las m o léculas de IgG tienen cadenas y, etc. Además, existen varias subclases de inmunoglobulinas IgG e IgA; por ejemplo: en humanos existen cuatro subclases de IgG (IgGl, IgG2, IgG3 e IgG4) constituidas respectivamente por las cadenas pe-
Propiedades funcionales de los anticuerpos
Figura 23-16 La región bisagra de una molécula de anticuerpo. Debido a su flexibilidad, la región bisagra aumenta la eficiencia de la unión del antígeno y de la formación de enlaces cruzados.
1 293
lugar de unión al antígeno
lugar de unión al antígeno
H2N
NH2
cadena ligera
HOOC
Figura 23-17 Ilustración esquemática de una molécula típica de anticuerpo. Está compuesta por dos cadenas pesadas idénticas y dos cadenas ligeras idénticas. Obsérvese que los centros de unión al antígeno están formados por un complejo de las regiones amino terminales de ambas cadenas ligeras y pesadas, pero que la región de la cola y las regiones en bisagra están formadas únicamente por cadenas pesadas.
COOH
sadas y,, y2, y3 y y4. Las diferentes cadenas pesadas imparten una conformación distintiva a las regiones de bisagra y de pie de los anticuerpos y confieren a cada clase y subclase unas propiedades características. La IgM, cuya cadena pesada es siempre |i, es la primera clase de anticuerpo que producen las células B en desarrollo, aunque posteriormente muchas célu las B pasan a producir otras clases de anticuerpo (como veremos más adelante). Inicialm ente el precursor inmediato de una célula B, denominado célula pre-B, sólo fabrica cadenas |j., las cuales se asocian con cadenas de polipéptidos no li-
ROTURA POR LA PAPAÍNA
Figura 23-18 Fragmentos de anticuerpo Fab y F(ab’)2. Estos fragmentos se producen cuando las moléculas de anticuerpo son degradadas con las enzimas proteolíticas papaína y pepsina, respectivamente.
ROTURA POR LA PEPSINA
pepsina
lugares de unión al antígeno -S-S^
pepsina
lugares de unión al antígeno
?-S-SJ
un fragm ento Fe 129 4
Capítulo 23 : El sistema inmunitario
de Fe
lugares de unión
Figura 23-19 Una molécula pentamérica de IgM. Las cinco subunidades están unidas entre sí por enlaces disulfuro. Una única cadena J, que presenta una estructura similar a la de un único dominio de Ig (se estudia más adelante), está unida por enlaces disulfuro entre dos cadenas pesadas |i. La cadena J es necesaria para el proceso de polimerización. La adición de cada una de las cuatro subunidades sucesivas de la cadena IgM requiere una cadena J, que se desprende, excepto la última, que queda retenida.
bacteria recubierta de anticuerpos IgG geras (con frecuencia denominadas substituyentes de las cadenas ligeras) y si tuadas en la membrana plasmática. En cuanto incrementa la síntesis de las ca denas ligeras, éstas se combinan con las cadenas 11, desplazando las cadenas li geras substituyentes, formando una molécula de IgM de cuatro cadenas (con dos cadenas \i y dos cadenas ligeras), que se insertan en la membrana plasmáti ca. Ahora la célula tiene receptores en su superficie a los que puede unirse el antígeno; en este momento la célula recibe el nombre de célula B virgen. Muchas células B vírgenes empiezan también a producir moléculas IgD de superficie ce lular, con el mismo lugar de unión a antígeno que las moléculas IgM. La IgM no es sólo la primera clase de anticuerpo en aparecer en la superficie celular de las células B en desarrollo, sino que también es la clase principal de Ig secretada a la sangre en las primeras fases de una respuesta primaria de anti cuerpos. La forma de IgM de secreción se compone de cinco unidades de cuatro cadenas, teniendo así un total de diez lugares de unión para el antígeno. Cada pentámero contiene una copia de otra cadena polipeptídica denominada cade na J (de “joining”). Las células secretoras de IgM producen la cadena I y la inser tan covalentemente entre dos regiones adyacentes del pie (Fe) (Figura 23-19). La unión del antígeno a las regiones Fab de la IgM pentamérica secretada induce a las regiones Fe a unirse, y por tanto a activar al primer com ponente del sistema del complemento. Tal como veremos más adelante, cuando el antígeno se encuentra en la superficie de un microorganismo invasor, la activación resul tante del sistema del complemento inicia un ataque bioquímico que mata al m i croorganismo. A diferencia de las IgM, las moléculas de IgD raramente son se cretadas por una célula B activa; sus funciones -adem ás de las que presentan como receptores para el antígeno- son desconocidas. La clase principal de inmunoglobulinas que se hallan en la sangre es la de las IgG, que se producen en grandes cantidades durante las respuestas inmunitarias secundarias. Además de activar el sistema del complemento, la región Fe de una molécula de IgG se une a receptores específicos de macrófagos y de neutrófilos. Estas células fagocíticas, en gran parte mediante estos receptores Fe, se unen, ingieren y destruyen a los microorganismos infectantes que han sido re cubiertos por anticuerpos IgG producidos en respuesta a la infección (Figura 2320). Algunos tipos de glóbulos blancos que expresan receptores Fe pueden tam bién matar células eucariotas extrañas recubiertas de IgG, sin fagocitarlas.
Propiedades funcionales de los anticuerpos
región Fe de un anticuerpo IgG _
\é
*
receptor Fe ¥
m acròfago o neutrófilo
Figura 23-20 Fagocitosis activada por anticuerpo. Una bacteria cubierta por anticuerpos IgG es fagocitada eficazmente por un macròfago o un neutrófilo, los cuales tienen receptores de superficie capaces de unirse a la región Fe de las moléculas de IgG. La unión de esta bacteria recubierta de anticuerpos a estos receptores Fe del macròfago activa el proceso de fagocitosis.
1295
Las moléculas de IgG son los únicos anticuerpos que pueden pasar de la madre al feto a través de la placenta. Las células de la placenta que se hallan en contacto con la sangre materna tienen receptores Fe que unen moléculas de IgG y median su paso hacia el feto. En primer lugar, los anticuerpos son captados de la sangre materna mediante una endocitosis mediada por receptor, y luego son transportados a través de la célula en el interior de vesículas y son liberados por exocitosis a la sangre fetal (proceso denominado transcitosis, tal como se descri be en el Capítulo 13). Otras clases de anticuerpos no se unen a estos receptores por lo que no pueden atravesar la placenta. La IgG también se segrega en la le che m aterna y es captada por el recién nacido desde el intestino hacia la sangre. La IgA es la principal clase de anticuerpos que se hallan presentes en las se creciones (saliva, lágrimas, leche y secreciones respiratorias e intestinales) (Figu ra 23-21). Se transporta a través de las células de un epitelio de secreción desde el medio extracelular hasta el material de secreción por otro tipo de receptor Fe que es el único de los epitelios de secreción (Figura 23-22). La región Fe de las moléculas de IgE se une con una elevada afinidad (Ka = 10 10 litros/m ol) a otra clase de receptores Fe. Estos receptores se localizan en la superficie de los mastocitos de los tejidos y de los basófilos de la sangre; a su vez, las moléculas de IgE unidas a ellos actúan como receptores para el antígeno. La unión del antígeno desencadena la secreción por parte de las células de una serie de aminas biológicamente activas, particularmente histamina (Figura 23-23). Es tas aminas causan una dilatación y un aumento de la permeabilidad de los vasos sanguíneos siendo en gran parte las responsables de las manifestaciones clínicas de reacciones alérgicas como la fiebre del heno, el asma y la urticaria. En circuns tancias normales, los cambios que sufren los vasos sanguíneos están pensados para ayudar a las glóbulos blancos de la sangre, a los anticuerpos y a los compo nentes del complemento a penetrar en los lugares de inflamación. Los mastocitos también segregan factores que atraen y activan a una clase especial de glóbulos blancos denominados eosinófilos, los cuales pueden matar varios tipos de parási tos, especialmente si los parásitos se hallan recubiertos de anticuerpos IgE o IgA. En la Tabla 23-1 se resumen las propiedades de los distintos tipos de anti cuerpos en el hombre.
Los anticuerpos pueden tener cadenas ligeras pero no de ambos tipos
k
o A.,
cadenas
cadena ligera
cadena J
com ponente secretor
Figura 23-21 Diagrama altamente esquemático de una molécula dimérica de IgA, la cual se presenta en las secreciones. Además de los dos monómeros de IgA, existe una única cadena J y una cadena polipeptídica adicional denominada com p on en te secretor, el cual parece que protege las molécula de IgA de la digestión por las enzimas proteolíticas de las secreciones.
Además de las cinco clases de cadenas pesadas, los vertebrados superiores tie nen dos tipos de cadenas ligeras, k y A,, que pueden estar asociadas con cualFigura 23-22 Mecanismo de transporte de una molécula dimérica de IgA a través de una célula epitelial.
fC
FLUIDO EXTRACELULAR
CÉLULA EPITELIAL
£
dím ero IgA
....
LUMEN
<—
:
...:
com ponente secretor :/
TRANSCITOSIS
receptor Fe unido a m em brana
i? 129 6
Capítulo 23 : El sistema inmunitario
La molécula de IgA, así como la cadena J que contiene el dímero, se une a un receptor Fe transm embrana especializado de la superficie no luminal de la célula epitelial secretora. Los com plejos receptor-IgA son ingeridos por endocitosis mediada por receptor, transportados a través del citoplasma de la célula epitelial en vesículas, y secretados en el lumen del lado opuesto de la célula por exocitosis. Cuando queda expuesto en el lumen, la parte del receptor Fe, que está unido al dímero de IgA (el co m p o n en te secretor), se escinde de su cola transm embrana, liberando así el anticuerpo, tal como se muestra en la Figura 23-21.
vesícula secretora que contiene histamina
IgE
receptor Fe específico de IgE
EL ANTÍGENO MULTIVALENTE FORMA ^ <~ ENLACES CRUZADOS ENTRE MOLÉCULAS DE IgE ADYACENTES
quiera de las cadenas pesadas. Una determinada molécula de anticuerpo contie ne siempre cadenas ligeras idénticas y cadenas pesadas idénticas; por consi guiente, sus dos lugares de unión al antígeno siempre son idénticos. Esta sim e tría es crucial para la función de formación de enlaces cruzados que tienen los anticuerpos secretados. Por consiguiente, una molécula de IgG puede tener ca denas ligeras k o X pero no ambas a la vez. Por el momento no se han identifica do diferencias en la función biológica de estos dos tipos de cadenas ligeras.
La intensidad de una interacción antígeno-anticuerpo depende tanto del número de lugares de unión ocupados como de la afinidad de cada lugar de unión10,15 La unión de un antígeno a un anticuerpo, al igual que la unión de un substrato a una enzima, es reversible. Está mediada por la suma de numerosas fuerzas nocovalentes, cada una de las cuales es relativamente débil: enlaces hidrofóbicos, fuerzas de van der Waals, interacciones iónicas, etc. Estas fuerzas débiles sólo son eficaces cuando la molécula de antígeno está lo bastante cerca para permitir que alguno de sus átomos puedan encajar en los huecos complementarios exis tentes en la superficie del anticuerpo. Las regiones complementarias de una uni dad de anticuerpo de cuatro cadenas son sus dos lugares idénticos de unión al antígeno, mientras que la región correspondiente del antígeno es un determi nante antigénico (Figura 23-24). La mayoría de las macromoléculas antigénicas presentan muchos determinantes antigénicos diferentes; si dos o más de ellos son idénticos (como sucede en un polímero con estructura repetitiva), se dice que el antígeno es multivalente (Figura 23-25).
LIBERACIÓN DE HISTAMINA POR EXOCITOSIS
Figura 23-23 Función de las IgE en la secreción de histamina por los mastocitos. Un mastocito (o un basófilo) se une a las moléculas de IgE después de que hayan sido segregadas por las células B activadas; los anticuerpos IgE solubles se unen a las proteínas receptoras Fe de la superficie celular del mastocito que reconoce específicamente la región Fe de estos anticuerpos. Las moléculas IgE adquiridas pasivamente por el mastocito sirven como receptores de superficie celular para el antígeno. Así, a diferencia de las células B, cada mastocito (y basófilo) presenta un conjunto de anticuerpos de superficie celular con una gran variedad de centros de unión al antígeno. Cuando una molécula de antígeno se une a estos anticuerpos IgE unidos a membrana formando enlaces cruzados con los de las células cercanas, activa al mastocito a que libere histamina por exocitosis.
UNION DE ALTA UNION DE BAJA AFINIDAD AFINIDAD determ inante antigénico lugar de unión al antígeno de la molécula de anticuerpo
Tabla 23-1 Propiedades de las clases principales de anticuerpos humanos Clase de anticuerpo Propiedades Cadenas pesadas Cadenas ligeras Número de unidades de cuatro cadenas Porcentaje respecto al total de Ig en sangre Activa el complemento Atraviesa la placenta Se une a macrófagos y neutrófilos Se une a mastocitos y basófilos
IgG
Figura23-24 Unión del antígeno al anticuerpo. Un determinante antigénico
a
e
KO X
KO X
de una macromolécula interacciona con el lugar de unión del antígeno de dos moléculas distintas de anticuerpo, una de alta afinidad y otra de baja afinidad. El determinante antigénico se mantiene en el lugar de unión gracias a la acción de varias fuerzas débiles, no covalentes y en el lugar de mayor adaptación al antígeno posee una gran afinidad. Obsérvese que normalmente tanto las cadenas pesadas como las ligeras de la molécula de anticuerpo contribuyen al lugar de unión al antígeno.
IgD 8
Y
K OÀ,
K OÀ ,
KO X
5
1
1
1o2
1
10
<1
75
15
<1
++++
++
-
+
-
-
+
-
-
-
-
-
-
+
Propiedades funcionales de los anticuerpos
cadena pesada
IgE
IgA
IgM
-
cadena ligera
1297
La reacción reversible de unión entre un antígeno con un único determi nante antigénico (indicado por Ag) y un anticuerpo con un único lugar de unión al antígeno (indicado por Ab) se puede expresar de la siguiente manera: Ag + Ab ^ AgAb El punto de equilibrio depende de las concentraciones de Ag y de Ab y de la intensidad de su interacción. Evidentemente, a medida que aumente la concen tración de Ag mayor será la fracción de Ab que se asociará con él. Generalmente, la fuerza de la interacción se expresa como la constante de afinidad (K J (véase Figura 3-9), donde *
(A)
_ [AgAb] [Ag] [Ab]
(los corchetes indican la concentración de cada com ponente en el equilibrio). La constante de afinidad, denominada a veces constante de asociación, se puede determinar midiendo la concentración de Ag libre necesaria para ocupar la mitad de los lugares de unión al antígeno del anticuerpo. Cuando están ocu pados la mitad de estos lugares, [AgAb] = [Ab] y Ka - II [Ag]. Por lo tanto el valor inverso de esta concentración de antígeno que produce la mitad de la unión má xima es igual a la constante de afinidad del anticuerpo por el antígeno. Los valo res habituales oscilan desde cifras tan bajas como 5 x 104 hasta cifras tan altas como 10 11 litros/mol. La constante de afinidad para la cual una molécula de inmunoglobulina deja de ser considerada como anticuerpo para un determinado antígeno, es algo arbitraria, pero es poco probable que un anticuerpo con una Ka inferior a 104 sea biológicamente eficaz; además, es poco probable que las célu las B que posean receptores de baja afinidad por un antígeno sean activadas por dicho antígeno. La afinidad de un anticuerpo para un antígeno determinante refleja la fuer za de la unión de una sola copia de un determinante antigénico a un solo lugar de unión del antígeno, y es independiente del número de lugares de unión. Sin embargo, cuando un antígeno que transporta múltiples copias de un mismo de term inante antigénico se com bina con un anticuerpo multivalente, la fuerza de dicha unión se increm enta notablem ente debido a que para que el antígeno y el anticuerpo puedan disociarse, se han de romper simultáneamente todas las uniones antígeno-anticuerpo. Así, una molécula característica de IgG puede unirse a un antígeno multivalente con una fuerza de por lo menos 50-100 veces mayor si en lugar de participar un sólo lugar de unión participan todos los luga res de unión al antígeno. La fuerza total de la unión de un anticuerpo multiva lente a un antígeno multivalente se designa como la avidez de la interacción. Si la afinidad de los lugares de unión de una molécula de IgG y de IgM es la misma, la molécula de IgM (con 10 lugares de unión) tendrá una avidez muy su perior por un antígeno multivalente que una molécula de IgG (que tiene dos lu gares). Esta diferencia de avidez, a menudo de 104 veces o más, es importante debido a que generalmente los anticuerpos producidos en las primeras fases de una respuesta inmunitaria tienen afinidades muy inferiores a las que muestran los producidos más tarde. (El aumento de la afinidad media de los anticuerpos producidos después de un tiempo de la inmunización, denominado madura ción de la afinidad, se estudiará más adelante.) Debido a su elevada avidez total, las IgM -la principal clase de Ig producida en las primeras fases de las respuestas inm unitarias- pueden actuar de forma eficaz a pesar de que cada uno de sus lu gares de unión presente una afinidad baja.
La utilización del com plem ento por los anticuerpos contribuye a la lucha contra las infecciones bacterianas16 El com plem ento, denominado así porque complementa y amplifica la acción de los anticuerpos, es una de las formas principales a través de la cual los anticuer pos defienden a los vertebrados contra la mayoría de las infecciones bacterianas.
1298
m últiples determ inantes antigénicos diferentes
Capítulo 23 : El sistema inmunitario
m últiples determ inantes antigénicos idénticos (un antígeno m ultivalente) (B) Figura 23-25 Moléculas con múltiples determinantes antigénicos. (A) Una proteína globular con varios determinantes antigénicos diferentes. Generalmente distintas regiones de una cadena polipeptídica pueden quedar juntas en la estructura plegada, formando cada uno de los determinantes antigénicos de la superficie de la proteina. (B) Una estructura polimèrica con muchos determiantes antigénicos idén ticos; una molécula de este tipo recibe el nombre de an tíg en o m ultivalente.
Los individuos que presentan alguna deficiencia en uno de los componentes centrales del complemento (denominado C3) están sujetos a repetidas infeccio nes bacterianas, como si fueran individuos deficientes en anticuerpos. . El sistema de complemento consta aproximadamente de 20 proteínas solu bles que principalmente se producen en el hígado y circulan por la sangre y por el fluido extracelular. La mayoría de ellas son inactivas a menos que se activen a través de una respuesta inmunitaria, o de forma más directa por un microorga nismo invasor. La última consecuencia de la activación del complemento es el ensam blaje de los denominados componentes tardíos del complemento que for man grandes complejos proteicos, denominados complejos de ataque de m em brana, que producen perforaciones en la membrana de un microorganismo y pueden llegar a destruirlo. Una de las funciones principales del complemento es atacar la membrana de las células microbianas, por lo que su activación se concentra sobre la m em brana celular microbiana, activada por los anticuerpos que están unidos al m i croorganismo o por los polisacáridos de la cubierta microbiana; ambos activan los componentes tempranos del complemento. Existen dos grupos de com ponen tes tempranos, que pertenecen a dos vías diferentes de activación del com ple mento, la vía clásica y la vía alternativa. Los componentes tempranos de ambas vías actúan localmente activando C3, el componente más importante del com plemento, cuya fragmentación provoca no sólo el ensamblaje de los complejos de ataque de membrana sino también la selección de distintos tipos de glóbulos blancos (Figura 23-26). Los com ponentes tempranos y C3 son proenzimas que se activan secuencialmente por escisión proteolítica limitada: la escisión de cada proenzima de la secuencia, activa el componente que genera una serina proteasa que escinde la siguiente proenzima de la secuencia, y así sucesivamente. Como que cada enzi ma activada escinde varias moléculas de la siguiente proenzima de la cadena, la activación de los com ponentes tempranos constituye una cascada proteolítica amplificada. Así cada molécula activada al inicio de la secuencia provoca la pro ducción de varios com ponentes activos, incluyendo muchos complejos de ata que de membrana. Muchas de estas escisiones liberan un pequeño fragmento peptídico, y de este modo se expone en el fragmento mayor un lugar de unión a membrana, el cual se une estrecham ente a la membrana de la célula diana y ayuda a llevar a cabo la siguiente reacción de la secuencia, provocando temporalmente la for mación de complejos de ataque de membrana. Esta forma de activación del
unión del anticuerpo
polisacárido m icrobiano
C1 C2
VIA CLÁSICA
C4
VÍA ALTERNATIVA
ESCISION DE C3
C5 C6 C7 C8 C9
■ JB R I M I E N T O DE LOS ÌO O R G A N IS M O S IN JC CI ÓN DE LA OCI TO SIS
\
SELECCIÓN DE LAS CÉLULAS INFLAMATORIAS
Figura 23-26 Fases principales de la activación del complemento por las vías clásica y alternativa. En ambas vías, normalmente las reacciones de la activación del com plem ento tienen lugar sobre la superficie del microorganismo invasor, com o por ejemplo una bacteria. C1-C9 y los factores B y D son los com ponentes reactivos del sistema de complemento; otros tipos de com ponentes (no se muestran en la figura) regulan el sistema. Los com p on en tes tem pran os están señalados dentro de las fle c h a s grises, mientras que los com pon en tes tardíos se hallan dentro de la fle c h a m arrón.
I /
^ LISIS ^
T/ iu
_
\
' i '
Propiedades funcionales de los anticuerpos
1299
Figura 23-27 La compleja estructura de Cl. La unión de dos o mas
com plejo C1
m olécula de IgG
antígeno de unión de m em brana
com plem ento está confinada principalmente a la zona de la superficie celular donde ha comenzado. El fragmento mayor de C3 se denomina C3b. Éste se une de forma covalente a la superficie de una célula diana. Una vez allí no sólo actúa como una proteasa que cataliza las etapas siguientes de la cascada del comple mento sino que tam bién es reconocido por proteínas receptoras específicas de los macrófagos y de los neutrófilos que increm entan la capacidad de dichas cé lulas para fagocitar la célula diana. El fragmento más pequeño de C3 (denomi nado C3a) actúa independientemente como una señal difusible que provoca una respuesta inflamatoria, estimulando a los glóbulos blancos de la sangre a migrar hacia el foco de la infección. Generalmente la vía clásica se activa por agregados de anticuerpos IgG o IgM unidos a los antígenos de la superficie de un microorganismo. La primera etapa de esta vía queda ilustrada en la Figura 23-27. Por el contrario, la vía alter nativa se activa mediante los polisacáridos de la cubierta celular de los microor ganismos, incluso en ausencia de anticuerpos, aunque la activación de la vía clá sica tam bién activa la vía alternativa mediante una retroalimentación positiva. Por consiguiente, la vía alternativa proporciona una primera línea de defensa contra la infección, antes de que la respuesta inmunitaria pueda ponerse en marcha, y una vez la respuesta inmunológica ha empezado también amplifica los efectos de la vía clásica. Las moléculas de mem brana C3b inmovilizadas, producidas tanto por la vía clásica como por la alternativa desencadenan una cascada posterior de reaccio nes que provocan el ensam blaje de los com plejos de ataque de m em brana a partir de los últimos com ponentes (Figura 23-28). Dichos complejos se forman en la m em brana cerca del lugar de activación de C3; en las electronmicrografías teñidas negativamente tienen un aspecto característico. En estas micrografías se
m em brana plasmática
1300
Capítulo 23 : El sistema inmunitario
moléculas de IgG (o una molécula pentamérica de IgM; no se muestra) a la superficie de un microorganismo capacita a sus regiones Fe para unirse al primer com ponente de la vía clásica, C l, que es un gran com plejo integrado por tres subcom ponentes -C lq , C lr y C ls. Cuando C lq se une a los complejos antígeno-anticuerpo, activa a Clr, que adquiere actividad proteolítica, rompiendo C ls e iniciando así la cascada proteolítica. Obsérvese que C lq está integrado por seis subunidades idénticas, cada una de ellas con una cabeza globular (que lo une al anticuerpo) y una cola similar a la colágena.
Figura 23-28 Ensamblaje de los componentes tardíos del complemento, formando el complejo de ataque de membrana. Cuando se produce C3b tanto por la vía clásica como por la vía alternativa, queda inmovilizado sobre la membrana, donde provoca la escisión de una proteína del com plemento denominada C5 produciendo C5a (no se muestra en la figura) y C5b. C5b permanece unido de forma laxa a C3b (no se muestra en la figura) y se ensambla rápidamente con C 6 y C7 formando C567, que se une entonces firmemente a la membrana vía C7, tal como se ilustra en la figura. Este complejo añade una molécula de C8 formando C5678. La unión de una molécula de C9 a C5678 induce un cambio conform acional en C9 que expone una región hidrofóbica, insertándose en la bicapa lipídica de la célula diana, próxima a C8 . Esto inicia una reacción en cadena en la que C9 alterado se une a una segunda molécula de C9, la cual sufre un cambio de conform ación y se inserta en la bicapa; a su vez, esta molécula puede unir otra molécula de C9, etc. De esta manera por cada molécula de C9 se forma un gran canal transmembrana.
puede observar cómo forman poros acuosos a través de la membrana (Figura 2329). Por esta razón, y debido a que perturban la estructura de la bicapa lipídica en sus proximidades, hacen agujeros en la membrana. Las moléculas pequeñas salen o entran de la célula a través de estos complejos mientras que las macromoléculas permanecen en el interior, de forma que se interrumpe el mecanismo normal de la célula para controlar el balance de agua. Por consiguiente, el agua penetra en el interior de las células por ósmosis, causando su hinchamiento y ex plosión. El proceso es tan eficiente que un pequeño número de complejos de ataque de membrana (quizás uno sólo) puede matar un glóbulo rojo. Incluso un virus con cubierta, que no presenta un gradiente de presión osmótica grande a través de su membrana y no es susceptible por tanto a esta lisis osmótica, puede ser destruido por estos complejos, posiblemente debido a que estos complejos de ataque desorganizan la membrana vírica. Las propiedades destructoras autoamplificantes de la cascada del comple mento hacen necesario que los componentes clave activados sean rápidamente inactivados después de haber sido generados, para evitar que el ataque se extien da a las células del huésped que se hallen en las proximidades. La desactivación se consigue por lo menos de dos maneras. En primer lugar, en la sangre existen unas proteínas inhibidoras específicas que finalizan la cascada, bien fijando o bien escindiendo ciertos componentes cuando se han activado por escisión pro teolítica. En segundo lugar, muchos de los componentes activados de la cascada son inestables; a menos que se unan inmediatamente a un componente apropia do de la cadena o a una membrana próxima, son inactivados rápidamente.
Figura 23 -29 Electronmicrografías
de lesiones de la membrana plasmática de un glóbulo rojo, obtenidas con tinción negativa. La lesión en (A) está vista d e fren te mientras que en (B) está vista de lado, como si fuera un canal transmembrana. El colorante negativo llena el canal, por lo que aparece de color negro. (De R. Dourmashkin, Im m u n olog y 35:205-212, 1978.)
Resumen Una molécula de anticuerpo típica es una proteína en form a de Y con dos lugares idénticos de unión al antígeno en los extremos de los brazos de la Y (las regiones Fab) y diversos lugares de unión para los componentes del complemento y/o para varios receptores de superficie celular, en el pie de la Y (región Fe). Los anticuerpos defienden a los vertebrados de la infección, inactivando virus y toxinas bacterianas y reclutando complemento y diversas células para matar e ingerir a los microorga nismos invasores. Cada clon de células B produce moléculas de anticuerpo con un único tipo de lugar de unión al antígeno. Inicialmente, las moléculas se insertan en la membra na plasmática, donde actúan como receptores para el antígeno. La unión del antí geno a dichos receptores activa determinadas células B (habitualmente con la ayu da de las células T colaboradoras) para multiplicarse y madurar, convirtiéndose en células con memoria o en células secretoras de anticuerpo, las cuales secretan anti cuerpos cuyo lugar de unión al antígeno es igual al que tenían los anticuerpos uni dos a la membrana de las células B. Cada molécula de anticuerpo consta de dos cadenas pesadas idénticas y dos cadenas ligeras idénticas. Típicamente, los lugares de unión al antígeno están fo r mados por parte de ambos tipos de cadenas, pesadas y ligeras. Existen cinco clases de anticuerpos (IgA, IgD, IgE, IgG e IgM), cada uno de los cuales tiene una cadena pesada característica (a, 8, X., y y jjl, respectivamente). Las cadenas pesadas tam bién form an la región Fe del anticuerpo, la cual determina a qué proteínas se unirá el anticuerpo y, por consiguiente, cuáles serán ¡as propiedades biológicas de cada clase de anticuerpo. Cualquiera de los dos tipos de cadena ligera (k o k) puede aso ciarse con cualquier clase de cadena pesada. Sin embargo, parece que el tipo de ca dena ligera no tiene influencia sobre las propiedades del anticuerpo. El sistema del complemento coopera con los anticuerpos defendiendo a los ver tebrados de las infecciones. Los componentes tempranos son proenzimas que circu lan por la sangre y se activan secuencialmente en una serie amplificada ele reaccio nes proteolíticas limitadas. El componente más importante del complemento es la proteína C3 que se activa por escisión proteolítica y se une a la membrana de una célula microbiana, donde colabora en la iniciación del ensamblaje local de los componentes tardíos del complemento y en la inducción de la fagocitosis de la célu Propiedades funcionales de los anticuerpos
1301
la microbiana. Los componentes tardíos constituyen grandes complejos de ataque de membrana en la membrana de la célula microbiana y de este modo destruyen el microorganismo invasor.
La estructura fina de los anticuerpos Existen tantas formas diferentes de anticuerpos, que cada uno de ellos constitu ye una mínima fracción de las moléculas de Ig de la sangre de un individuo no inmunizado. Este hecho colocó a los bioquímicos frente a un difícil problema, único en química de proteínas: cómo obtener suficiente cantidad de cada una de las moléculas de anticuerpo para determinar su secuencia de aminoácidos y su estructura tridimensional. El problema se resolvió gracias al descubrimiento de que las células de un tipo de cáncer, conocido como mielom a múltiple (dado que se desarrollan múl tiples tumores en la médula ósea, o tejidos mieloides), secretan a la sangre del paciente grandes cantidades de una única especie de anticuerpo. El anticuerpo es homogéneo, o monoclonal, ya que el cáncer suele empezar con el crecim ien to incontrolado de una sola célula , y en el mieloma múltiple esta célula es una célula plasmática secretora de anticuerpos. El anticuerpo, que se acumula en la sangre, recibe el nom bre de proteína del mieloma. La estructura detallada de los anticuerpos fue establecida inicialmente con el estudio de las proteínas de mieloma presentes en la orina y en la sangre de es tos pacientes, o de ratones a los que se les había inducido experimentalmente un tumor similar al del mieloma múltiple. Posteriormente ha sido posible conse guir células B secretoras de anticuerpo inmortales, al fusionarlas con células de mieloma no secretoras de anticuerpo. Los hibridomas resultantes proporcionan una fuente rápida de anticuerpos monoclonales, que pueden ser producidos en cantidades ilimitadas contra cualquier antígeno deseado, tal como se vio en el Capítulo 4. En la actualidad pueden producirse cantidades ilimitadas de anti cuerpos homogéneos mediante la tecnología del DNA recombinante.
Las cadenas ligeras y las cadenas pesadas presentan regiones constantes y regiones variables10,13 La comparación de las secuencias de aminoácidos de distintas proteínas de m ie loma reveló un rasgo notable de importantes implicaciones genéticas. Tanto las cadenas pesadas como las cadenas ligeras tienen una secuencia variable en su ex tremo amino terminal y una secuencia constante en su extremo carboxilo termi nal. Por ejemplo, al comparar las secuencias de aminoácidos de muchas cadenas k diferentes de mieloma se observa que las mitades carboxilo terminales o son iguales o sólo muestran pequeñas diferencias, mientras que las mitades amino terminales son com pletam ente diferentes. Por consiguiente, las cadenas ligeras tienen una región constante de aproximadamente 110 aminoácidos de longitud y una región variable del mismo tamaño. La región variable de las cadenas pe sadas (en su extremo amino terminal) también tiene unos 110 aminoácidos de longitud, mientras que la región constante tiene unos 330 o 440 aminoácidos, dependiendo de la clase de inmunoglobulina de que se trate (Figura 23-30).
CADENA LIGERA región variable
región constante (tipo k o tip o
I----------------II
H tN —I
I
CADENA PESADA H oN -l — —
X)
I
1—COOH I— —
i__________ i[________________________________i
región variable
130 2
Capítulo 23 : El sistema inmunitario
Figura 23-30 Zonas variables y constantes de las cadenas de inmunoglobulina. Las cadenas ligeras
región constante (tipos a, 5, e , y o
.........
y las cadenas pesadas de una molécula de Ig tienen distintas regiones constantes y variables.
región variable de la cadena pesada
regiones hipervariables de la cadena pesada
región variable cadena ligera
Figura 23-31 Regiones hipervariables del anticuerpo. Dibujo altamente esquemático que ilustra cómo las tres regiones hipervariables de cada cadena ligera y pesada forman, en conjunto, el lugar de unión al antígeno de una molécula de anticuerpo. A veces a las regiones hipervariables se les denomina regiones determinantes de la complementariedad. La estructura tridimensional real de un lugar de unión al antígeno se muestra en la Figura 23-35.
Los extremos amino terminales de las cadenas ligeras y de las cadenas pesa das son los que se unen entre sí formando el lugar de unión al antígeno (véase Figura 23-17), y la variabilidad de sus secuencias de aminoácidos constituye la base estructural de la diversidad de estos lugares de unión. La existencia de las regiones variable y constante en las moléculas de anticuerpo plantea importan tes cuestiones genéticas que consideraremos más adelante. Antes de que fuera posible investigar directamente estas cuestiones genéticas, los estudios estruc turales de las proteínas de mieloma revelaron otros rasgos importantes de la es tructura de los anticuerpos.
Las cadenas ligeras y las cadenas pesadas contienen tres regiones hipervariables cada una, que en conjunto forman el lugar de unión al antígeno17 El estudio detallado de las secuencias de aminoácidos de una gran diversidad de cadenas Ig muestra que la variabilidad de las regiones variables de las cadenas ligeras y pesadas está restringida en su mayor parte a tres pequeñas regiones h i pervariables de cada cadena. Las restantes zonas de la región variable, conoci das como regiones de armazón , son relativamente constantes. Estos hallazgos condujeron a la predicción de que el lugar de unión al antígeno está formado por tan sólo los 5 a 10 aminoácidos de cada región hipervariable (Figura 23-31). Dicha predicción se confirmó más tarde gracias a estudios mediante difracción de rayos X de las moléculas de anticuerpo (véase más adelante). En relación con el tamaño del lugar de unión al antígeno de una molécula de anticuerpo, gene ralmente el determinante antigénico que es reconocido de forma específica por un anticuerpo es comparativamente más pequeño: por ejemplo puede ser de menos de unos 25 residuos de aminoácido de una proteína globular de superfi cie (véase Figura 23-35) y puede llegar a ser tan pequeño como un grupo dinitrofenol (véase Figura 23-7).
Las cadenas ligeras y las cadenas pesadas están plegadas en dominios repetitivos similares10,18 Tanto las cadenas ligeras como las cadenas pesadas están formadas por seg mentos repetitivos -cad a uno de ellos de una longitud de unos 110 aminoácidos y con enlaces disulfuro entre cisteínas de la misma cadena- que se pliegan inde pendientemente formando unidades funcionales compactas, o dominios. Como muestra la Figura 23-32, una cadena ligera consta de un dominio variable (VL) y otro constante (CL), en cambio la mayoría de las cadenas pesadas constan de un dominio variable (VH) y tres dominios constantes (C„l, C „2 y C,,3). (Tanto las ca denas n como las cadenas e tienen un dominio variable y cuatro constantes.) Los dominios variables son los responsables de la unión al antígeno, mientras que
La estructura fina de los anticuerpos
1303
los dominios constantes de las cadenas pesadas (excepto el CH1) forman la re gión Fe, la cual determina las demás propiedades biológicas del anticuerpo. La similitud existente entre los diferentes dominios sugiere que probable mente las cadenas de Ig surgieron durante la evolución gracias a una serie de duplicaciones génicas, empezando con un gen primordial que codificaba un do minio de 110 aminoácidos de función desconocida. Esta hipótesis se ve confir mada por el descubrimiento de que cada dominio de la región constante de una cadena pesada está codificado por una secuencia codificadora aislada (exón) (Figura 23-33).
Figura 23-32 Dominios de la inmunoglobulina. Las cadenas ligeras y las cadenas pesadas de una molécula de Ig están plegadas en dominios repetitivos, que son parecidos entre sí. Las zonas variables (en azul) de las cadenas ligeras y de las cadenas pesadas (VLy VH) forman los lugares de unión al antígeno, mientras que los dominos constantes de las cadenas pesadas (principalmente CH2 y CH3) determinan las otras propiedades biológicas de la molécula. Las cadenas pesadas de los anticuerpos IgM e IgE tienel un domino constante adicional (Ch4). Las interacciones hidrofóbicas entre los dominios de cadenas Ig adyacentes juegan un papel importante en mantener juntas las cadenas en la molécula de Ig: por ejemplo, CLse une a CH1 y los dominios CH3 se unen entre sí.
Estudios por difracción de rayos X han revelado la estructura tridim ensional de los dominios de las Ig y de sus lugares de unión al antígeno19 Aunque se conozca la secuencia completa de aminoácidos de una gran proteína, no es posible todavía deducir su estructura tridimensional; generalmente hay que realizar estudios por difracción de rayos X sobre proteínas cristalizadas. Se han cristalizado varios fragmentos tanto de proteína de mieloma como de anti cuerpos, así como de una molécula intacta de IgG, y los estudios sobre su estruc tura por rayos X han confirmado las predicciones de los inmunoquímicos. Lo
secuencias codificantes Ch3
DNA
intrón intrón TRANSCRIPCIÓN RNA MADURACION DEL RNA POR CORTE Y EMPALME ChI bisagra C»2 CH3 TRADUCCIÓN Ch I bisagra Ch2 Ch3 H2N
■COOH región constante de la cadena pesada
130 4
mRNA
Capítulo 23 : El sistema inmunitario
Figura 23-33 Organización de las secuencias de DNA que codifican la región constante de una cadena pesada de Ig. Las secuencias codificantes (exones) de cada dominio y de la región bisagra están separadas por secuencias no codificantes (intrones). Las secuencias intrónicas se eliminan mediante la maduración de los transcritos primarios de RNA, que da lugar al mRNA. Se cree que la presencia de intrones en la secuencia de DNA puede haber facilitado las duplicaciones accidentales de segmentos de DNA que, en el transcurso de la evolución, han dado lugar a los genes de los anticuerpos (se discute en el Capítulo 8). Las secuencias de DNA y de RNA que codifican la región variable de la cadena pesada no se muestran en la figura.
dom inio VL
(A)
dom inio VH
dom inio C L
\¡ cadenas ligeras
d o m in io va riable (VL)
2 nm
Figura 23-34 La estructura plegada de una molécula de anticuerpo IgG, basada en estudios de cristalografía por rayos X. (A) Cada residuo de aminoácido de la proteína se ha dibujado como una pequeña esfera. Una de las cadenas pesadas se ha dibujado en azul claro y la otra en azul oscuro, con los dominios de las cadenas ligeras en amarillo. Todas las moléculas de anticuerpo están glucosiladas: la cadena de oligosacáridos unida a la región C(I2 está representada en rojo. (B) Configuración de la cadena polipeptídica de una cadena ligera. Las regiones varible y constante están formadas por dos láminas (3-una con tres hebras (verde) y otra con cuatro (amarillo). Las láminas están unidas por un enlace disulfuro (negro). Todas las regiones hipervariables (rojo) forman bucles en el extremo distal del dominio variable, donde forman el lugar de unión al antígeno. (A, según E.W. Silverton, M.A. Navia y D.R. Davies, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 75:5140, 1977; B, según M. Schiffer, R.L. Girling, K.R. ElyyA.B. Edmundson, Biochemistry 12:4620,1973. Copyright 1973 American Chemical Society.)
d o m in io constante (CL)
que todavía es más importante, estos estudios han revelado la forma en que es tán construidos millones de lugares diferentes de unión al antígeno, siguiendo un patrón estructural común. Tal como se ilustra en la Figura 23-34, cada dominio de las Ig tienen estruc turas tridimensionales muy similares, basadas en lo que ahora se denomina el plegamiento de las inmunoglobulinas. A grandes rasgos, cada dominio es un cilindro (de 4 x 2,5 x 2,5 nm) compuesto por un “bocadillo” de dos capas protei cas extendidas: una capa contiene tres hebras de cadena polipeptídica mientras que la otra contiene cuatro hebras. En cada capa las hebras adyacentes son anti paralelas y forman una lámina (3. Las dos capas son más o menos paralelas y es tán conectadas entre sí por un único enlace disulfuro intracatenario. Veremos más adelante que muchas otras proteínas de la superficie de los linfocitos y de otras células, muchas de las cuales actúan como moléculas de adhesión célulacélula (estudiadas en el Capítulo 19) contienen dominios similares y por tanto son miembros de un amplio número de proteínas de la superfamilia de las in
munoglobulinas. Los dominios variables de las moléculas de Ig presentan la característica propia de tener su conjunto particular de tres regiones hipervariables, que se disponen en tres bucles hipervariables (véase Figura 23-34B). Tal como se había predicho, los bucles hipervariables de los dominios variables ligero y pesado es tán agrupados formando un lugar de unión al antígeno. Un principio importan te que se deduce de estos estudios es que la región variable de una molécula de anticuerpo consta de una estructura rígida altamente conservada, con unos bu cles hipervariables unidos entre sí en uno de los extremos. Por consiguiente, es posible generar una enorme diversidad de lugares de unión al antígeno cam-
La estructura fina de los anticuerpos
1305
Figura 23-35 Estructura tridimensional de un complejo antígeno-anticuerpo, determ inada por análisis de difracción de rayos X. El antígeno proteico, que es la enzima lisozima, se muestra en verde. El lugar de unión al antígeno del fragmento Fab del anticuerpo está formado por la cadena ligera (en a m a r illo ) y la cadena pesada (en azul). Unos 20 residuos de aminoácido del lugar de unión están en contacto con un número similar de residuos de la superficie de la lisozima. En (B) se han separado el antígeno y el anticuerpo para mostrar sus superficies de contacto complementarias. La porción de antígeno protuberante de la superficie com plementaria (en rojo) es un residuo de glutamina. En (C) las moléculas separadas han sufrido una rotación de unos 90 grados alrededor del eje vertical (A) para mostrar las superficies que interactúan; las cadenas laterales de aminoácidos que interactúan se muestran en rojo, con la glutamina protuberante en rosa. En otras moléculas de anticuerpo que han sido estudiadas de esta forma, el lugar de unión al antígeno (para un determinante antigénico pequeño) está formado por una hendidura mucho más profunda. (De A. Amit, R. Mariuzza, S. Phillips, y R. Poljak, Science 233:747-753, 1986. Copyright 1986 por AAAS.)
biando sólo la longitud y la secuencia de aminoácidos de los bucles hipervariables, sin alterar la estructura tridimensional global necesaria para la función del anticuerpo. El análisis por rayos X de cristales de fragmentos de anticuerpo unidos a un antígeno o a un determinante antigénico ha revelado con exactitud de qué for ma cooperan, en determinados casos, los bucles hipervariables de los dominios variables ligero y pesado entre sí formando la superficie de unión al antígeno (Figura 23-35). Las dimensiones y la forma de cada lugar diferente varían según la conform ación de la cadena polipeptídica de los bucles hipervariables la cual, a su vez, viene determinada por la secuencia de aminoácidos de las cadenas la-
1306
Capítulo 23 : El sistema inmunitario
terales de los bucles. La forma de los lugares de unión varían mucho dependiendo del anticuerpo -desde hendiduras, hasta surcos que se adaptan a las superficies ondulantes, e incluso protuberancias. Los ligandos más pequeños tienden a unir se a depresiones poco profundas, mientras que los más grandes tienden a unirse a superficies más accidentadas. Además, los lugares de unión pueden alterar su for ma para que la unión con el antígeno pueda encontrar mejor al ligando. Así pues, en la actualidad los principios generales de la estructura de los anticuerpos están claros.
Resumen Cada inmunoglobulina ligera y pesada consta de una región variable de unos 110 residuos de aminoácidos en su extremo amino terminal y de una región constante, que en la cadena ligera es del mismo tamaño que la región variable y en la cadena pesada es tres o cuatro veces mayor. Cada cadena estáformada por dominios repeti tivos, plegados deforma similar: una cadena ligera tienen una región variable (VL) y una región constante (CL), mientras que las cadenas pesadas tienen una región va riable (VH) y tres o cuatro regiones constantes (CH). La variación de la secuencia de aminoácidos en las regiones variables de las cadenas ligeras y pesadas está restringi da fundamentalmente a varias pequeñas regiones hipervariables; forman bucles que sobresalen de la superficie y se juntan formando el lugar de unión al antígeno.
La generación de la diversidad de los anticuerpos Se estima que el hombre puede producir por lo menos 10 15 moléculas de anti cuerpo diferentes -su repertorio preinmunitario de anticuerpos incluso en ausen cia de estimulación por antígenos. Los lugares de unión al antígeno de muchos anticuerpos pueden presentar reacción cruzada con varios determinantes antigénicos relacionados entre sí pero diferentes, y por lo que parece el repertorio preinmunitario es lo suficientemente amplio como para asegurar que siempre haya un lugar de unión a antígeno que encaje con un determinante antigénico potencial cualquiera, aunque esta unión sea de baja afinidad. Los anticuerpos son proteínas, y las proteínas están codificadas por genes. Por consiguiente, la diversidad de los anticuerpos plantea un problema genético particular: ¿cómo puede un animal producir más anticuerpos que genes hay en su genoma? (Se cree que el genoma humano, por ejemplo, contiene menos de 105 genes.) Este problema no es tan formidable como podría parecer a primera vista. Debido a que las regiones variables de las cadenas ligeras y pesadas contri buyen al lugar de unión al antígeno, un animal con 1000 genes que codifiquen cadenas ligeras y 1000 genes que codifiquen cadenas pesadas podrían combinar sus productos de 1000 x 1000 maneras diferentes formando 106lugares de unión distintos (asumiendo que cualquier cadena ligera puede combinarse con cual quier cadena pesada formando un lugar de unión al antígeno). Sin embargo, el sistema inmunitario de los mamíferos ha desarrollado mecanismos genéticos únicos que lo capacitan para generar un número casi ilimitado de cadenas lige ras y de cadenas pesadas diferentes de una forma altamente económica, fusio nando segmentos génicos separados antes de que sean transcritos. Las aves y los peces utilizan estrategias muy diferentes para diversificar los anticuerpos, pero centraremos nuestra discusión en los mecanismos que utilizan los mamíferos.
Durante el desarrollo de las células B, los genes de los anticuerpos se ensamblan a partir de segmentos génicos aislados20 La primera evidencia directa de que el DNA se reordena durante el desarrollo de las células B procede de experimentos realizados en 1976, en los cuales se compa ró el DNA de embriones tempranos de ratón que no producen anticuerpos, con el DNA de una línea celular de mieloma de ratón que sí los produce. Los experimenLa generación de la diversidad de los anticuerpos
1307
célula de m ielom a de ratón que produce cadenas ligeras específicas
secuencias — codificantes de las regiones V y C en un m ism o fragm ento
V:
célula de em brión de ratón no productora de Ig
secuencia codificante de la región C las secuencias codificantes de las regiones V y C están en fragm entos secuencia diferentes codificante de la región V
tos mostraron que las secuencias codificantes específicas de la región variable (V) y de la región constante (C) utilizadas por las células del mieloma estaban presen tes en el mismo fragmento de restricción de DNA en las células de mieloma pero no en dos fragmentos de restricción distintos de los embriones, lo cual demostraba que las secuencias de DNA que codifican una molécula de anticuerpo se reordenan en alguna fase de la diferenciación de las células B (Figura 23-36). Actualmente se sabe que existe un acervo diferente de segmentos génicos para cada uno de los tipos de cadenas de Ig -cad enas ligeras k , cadenas ligeras X y cadenas pesadas - a partir del cual se sintetiza una única cadena polipeptídica. Cada acervo se halla en un crom osom a diferente y norm almente contiene un gran número de segmentos génicos codificantes de la región V de una cadena de Ig y un m enor número de segmentos génicos codificantes de la región C. Du rante el desarrollo de la célula B, para cada una de las dos cadenas de Ig a sinte tizar se ensam bla una secuencia codificante com pleta por recom binación espe cífica de lugar (se estudia en el Capítulo 6), juntando la secuencia codificante de la región V con la secuencia codificante de la región C. Además de reunir los segmentos génicos individuales del gen que codifica un anticuerpo, estas reor denaciones tam bién activan la transcripción a partir del gen promotor mediante cambios en las posiciones relativas de las secuencias activadoras y silenciadoras que actúan sobre el promotor. Así, una cadena completa de Ig sólo puede sinte tizarse después de que haya ocurrido una reordenación génica. Como veremos, el proceso de reunión de los segmentos génicos contribuye a la diversidad de los lugares de unión al antígeno de varias maneras.
Cada región V está codificada por más de un segmento génico21 Cuando se analizaron las secuencias de DNA genómico que codifican las regio nes V y C, se encontró que la región C está codificada por un solo segmento gé-
130 8
Capítulo 23 : El sistema inmunitario
Figura 23-36 Experimento que demostró directamente la reordenación del DNA durante el desarrollo de la célula B. Las dos sondas radiactivas utilizadas eran específicas de las secuencias de DNA codificantes de la región C y de la región V de la cadena ligera del mieloma.
regiones del DNA que se van a unir &
DNA de la línea germ inal
i............ .. ..........
VI
V2
V3
J1 J2 J3 J4 REORDENACION DEL DNA DURANTE LA DIFERENCIACIÓN DE LA CÉLULA B
DNA de la célula B ..
V3
V2
VI
C
J3 J4
TRANSCRIPCION 5' transcrito de RNA
V 3 \\ J3 J4
C
MADURACION DEL RNA
mRNA
5'
3'
V3 J3 C TRADUCCION
NH2 cadena ligera I
1
V3 J3 C
COOH 1
nico C de una cadena Ig, mientras que cada una de las regiones V están codifica das por uno o dos segmentos génicos. Cada una de las regiones V de una cadena ligera está codificada por una secuencia de DNA ensamblada a partir de dos fragmentos génicos -u n segmento gènico V largo y un segmento de unión corto, o segmento gènico / (no confundir con la proteína cadena J, véase Figura 23-19), codificado en otro lugar del genoma. La Figura 23-37 ilustra los mecanismos ge néticos que participan en la producción de un polipéptido de una cadena ligera intacta a partir de segmentos génicos V,JyC separados. Cada región V de una cadena pesada está codificada por una secuencia de DNA ensamblada a partir de tres segmentos génicos -u n segmento V, un seg mento / y un segmento de diversidad o segmento gènico D. La Figura 23-38 muestra la organización de los segmentos génicos implicados en la producción de cadenas pesadas. El elevado número de segmentos génicos V, J y D heredados que son disponi bles para la codificación de las cadenas de Ig contribuye substancialmente por sí mismo a la diversidad de los anticuerpos, pero la unión combinatoria de estos segmentos (denominada diversificación combinatoria) aumenta ampliamente esta contribución. Por ejemplo, cualquiera de los aproximadamente 300 segmen tos V del acervo de segmentos génicos de la cadena ligera k que existen en el ra tón, puede unirse a cualquiera de los 4 segmentos / (véase Figura 23-37), de for ma que a partir de este acervo se pueden formar al menos 1200 (300 x 4) regiones V diferentes de cadena k. De forma similar, cualquiera de los aproximadamente
VI
V2
Vn
DNA de la línea germ inal
D1D2 Dn '^ ¡t V
J 1 J4
La generación de la diversidad de los anticuerpos
Cji
C§
Cy
Cg
Co
Figura 23-37 Proceso de unión V-J que participa en la producción de una cadena ligera k en el ratón. En el DNA de la “línea germinal” (en la que los genes de las inmunoglobulinas no se expresan y por consiguiente no se reordenan), el grupo de los cuatro segmentos génicos /está separado del segmento génico C por un corto intrón, y separado de los aproximadamente 300 segmentos génicos V, por varios pares de nucleótidos. Durante el desarrollo de la célula B, el segmento génico Velegido {V3 en este caso) se desplaza quedando exactamente junto a uno de los segmentos génicos J (J3 en este caso). El gen/“extra” (J4) y la secuencia intrónica se transcriben (junto con los segmentos génicos unidos V3, J3yQy luego son eliminados durante la maduración del RNA, generando moléculas de mRNA en las cuales las secuencias V3, J3yC son contiguas. Luego, estos mRNA se traducen a cadenas ligeras k . Un segmento génico /codifica unos 15 aminoácidos del extremo carboxilo terminal de la región V, y la unión de los segmentos V-J coincide con la tercera región hipervariable de la cadena ligera. Figura 23-38 El conjunto de segmentos génicos de la cadena pesada en el ratón. Se cree que el ratón contiene entre 100 y 1000 segmentos V, al menos 12 segmentos D, 4 segmentos /y un grupo ordenado de segmentos C, cada uno de de los cuales codifica una clase diferente de cadenas pesadas. El segmento D codifica los aminoácidos de la tercera región hipervariable de la región V, que forma parte del segmento /. La figura no ha sido dibujada a escala. Por ejemplo, los segmentos génicos J1 y Ca se hallan separados por unos 200 000 pares de nucleótidos. Además se han omitido muchos detalles: por ejemplo, existen cuatro segmentos génicos Cy (Cy/, Cy2a, Cy2by Cy3); cada segmento génico C está compuesto por múltiples exones (veáse Figura 23-33); y los segmentos génicos VHestán agrupados en el cromosoma en conjuntos de familias homólogas. Los mecanismos genéticos implicados en la producción de una cadena pesada son los mismos que los que se muestran en la Figura 23-37 para las cadenas ligeras, con la excepción de que en este caso se necesitan dos etapas en la reordenación del DNA en lugar de una: primero, un segmento D se une a un segmento /, y luego un segmento Vse une a los segmentos D/reordenados.
1309
500 segmentos V del acervo de la cadena pesada que existen en el ratón puede unirse a cualquiera de los 4 segmentos / y a cualquiera de los, al menos, 12 seg mentos D, para codificar como mínimo 24 000 (500 x 4 x 12) regiones V diferentes de cadena pesada. Éstas son sólo estimaciones aproximadas ya que no se conoce el número exacto de segmentos génicos Vque existen en estos acervos. La diversificación com binatoria resultante del ensam blaje, en diferentes com binaciones, de los segm entos génicos V, J y D heredados, que acabamos de ver, constituye un importante m ecanism o de diversificación de los lugares de unión al antígeno de los anticuerpos. Se estima que únicamente mediante este mecanismo, un ratón podría producir al menos 1000 regiones VL diferentes y del orden de 25 000 regiones VHdiferentes. Estas regiones podrían luego com binarse entre sí produciendo 25 x 106 lugares diferentes de unión al antígeno. Además, como veremos ahora, el propio mecanismo de unión también aumenta ampliamente este número de posibilidades (probablemente en más de 108 ve ces), haciéndolo mayor que el número total de células B de un ratón (alrededor d e 5 x 108).
La unión im precisa de los segmentos génicos aumenta la diversidad de las regiones V 21,22 Todavía no se conoce con detalle el mecanismo por el cual segmentos génicos que pueden estar alejados entre sí cientos de miles de bases de nucleótidos, se unen formando una secuencia codificante funcional de la región VL o VH. Cada segmento génico está flanqueado por secuencias de DNA conservadas, que su puestamente actúan com o centros de reconocim iento para un sistema de re com binación específica de lugar, de forma que se asegura que sólo se recombinen los segmentos génicos adecuados. Así, por ejemplo, un segmento V siempre se unirá a un segmento / o D y no a otro segmento V. Parece que dos genes estre cham ente ligados, denominados rag-1 y rag-2 (de Recombination Activating Ge nes, genes activadores de recombinación) codifican las proteínas específicas de los linfocitos del sistema de recombinación V(D)J. Así, si se transfecta un fibro blasto con ambos tipos de genes, se puede conseguir experimentalmente una reordenación de segmentos génicos Ig introducidos, lo suficiente para que la cé lula B se desarrolle normalmente. Además, los ratones transgénicos que son de ficientes en ambos genes son incapaces de iniciar reordenaciones V(D)J y en consecuencia no poseen ni células B ni células T funcionales. (Las células T utili zan una reordenación similar para ensamblar los genes que codifican sus recep tores específicos de antígenos.) En la mayoría de los casos de recom binación específica de lugar, la unión del DNA es precisa, pero durante la unión de los segmentos génicos del anti cuerpo (y del receptor de la célula T), a menudo se pierde un número variable de nucleótidos de los extremos de los segmentos de recom binación y, en el caso de la cadena pesada, se pueden insertar uno o más nucleótidos, elegidos de for ma aleatoria. Esta pérdida y ganancia de nucleótidos en los sitios de unión [de nominada diversificación de em palm e (junctional diversification)] aumenta enorm em ente la diversidad de las secuencias codificantes de la región V creadas por recom binación, específicam ente en la tercera región hipervariable. En este caso, el increm ento de la diversificación cuesta un precio ya que, en muchas ocasiones, producirá un corrimiento de la pauta de lectura de forma que se pro ducirá un gen no funcional; habitualmente, en el desarrollo de las células B se producen uniones “improductivas” de este tipo.
La hiperm utación som ática dirigida por el antígeno acaba de afinar las respuestas de anticuerpos23 Tal como vimos anteriormente, a medida que va transcurriendo el tiempo tras la inmunización se produce un aumento progresivo de la afinidad de los anticuer pos producidos contra el antígeno inmunizante. Este fenómeno, que se conoce
1310
Capítulo 23 : El sistema inmunitario
como m aduración de la afinidad, es único para los anticuerpos (no ocurre en los receptores de las células T) y se debe a la acumulación de mutaciones puntuales específicas en las secuencias codificantes de la región V, tanto de las cadenas pe sadas como de las ligeras. Dichas mutaciones tienen lugar después de ensam blarse las regiones codificantes, una vez que las células B han sido estimuladas por el antígeno y por las células T colaboradoras para generar células con m e moria en el centro activado (también denominado centro germinal) de un folícu lo linfoide, en un órgano linfoide secundario (véase Figura 23-8). Las mutaciones puntuales tienen lugar a una velocidad de alrededor de una mutación por se cuencia de región V codificante en cada generación celular, que es aproximada mente un millón de veces mayor que la velocidad de mutación espontánea en otros genes; por eso, el proceso se denomina hipermutación somática. No se conoce el mecanismo que posibilita que los cambios de nucleótidos puedan di rigirse al DNA de una parte especificada de forma precisa del genoma. Únicamente una pequeña parte de estas mutaciones puntuales se reflejarán en los receptores de antígeno, los cuales presentarán un incremento de la afini dad para el antígeno. Sin embargo, el bajo número de células B que expresen es tos receptores de alta afinidad serán estimuladas preferentemente por el antíge no para sobrevivir y proliferar, mientras que las restantes células B sufrirán muerte celular programada. Así, como resultado de ciclos repetidos de hipermu tación somática y selección de antígenos dirigidos, en el transcurso de una res puesta inmunitaria se producen anticuerpos de elevada y creciente afinidad, lo cual proporciona una protección progresivamente mejor contra los antígenos agresores.
CELULA PRO-B aterna
1 i
La unión de los segmentos génicos de los anticuerpos está regulada asegurando que las células B sean m onoespecíficas24 Tal como predice la teoría de la selección clonal, las células B son monoespecífi cas. O sea, todos los anticuerpos que produce una célula B poseen lugares de unión al antígeno iguales. Esto garantiza que los lugares de unión al antígeno de algunas moléculas de anticuerpo sean idénticos y, por tanto, que los anti cuerpos segregados puedan formar grandes redes de antígenos entrecruzados, que de este modo provocan la eliminación del antígeno (véase Figura 23-15). Esto también asegura que una célula activada segregue anticuerpos con una es pecificidad similar a la de los anticuerpos unidos a la membrana de las células B que se habían estimulado inicialmente. La necesidad de monoespecificidad significa que debe existir algún m eca nismo que asegure que, cuando los genes de las Ig se activan durante el desarro llo de una célula B, cada una de dichas células B produzca un sólo tipo de región VL y un sólo tipo de región VH. Las células B, como otras células somáticas, son diploides, por lo que cada célula tiene seis acervos de segmentos génicos codifi cantes de anticuerpos: dos acervos de genes de cadena pesada (uno de cada pro genitor) y cuatro acervos de cadena ligera (uno k y otro X de cada progenitor). Si las reordenaciones del DNA ocurren independientemente en cada uno de los acervos de cadena pesada y de cadena ligera; una sola célula podría producir hasta ocho anticuerpos diferentes, cada uno de los cuales tendría un lugar dis tinto de unión al antígeno. Sin embargo, cada célula B sólo utiliza dos de los seis acervos de segmentos génicos: uno de los cuatro acervos de genes de cadena li gera y uno de los dos acervos de genes de cadena pesada. Así, cada célula B debe escoger, no sólo entre los acervos de cadena ligera, k y X, sino también entre sus acervos materno y paterno de genes de cadena ligera y de cadena pesada (Figura 23-39). Este tipo de elección, se denomina exclusión alélica y parece que única mente ocurre en los genes codificantes de anticuerpos (y los de receptores de cé lulas T). Para otras proteínas codificadas por genes autosómicos [excepto para las que son codificadas por genes sujetos a actividad heredable (genomic imprinting) estudiados en el Capítulo 9], parece que tanto los genes maternos como los paternos de una célula se expresan casi por igual.
La generación de la diversidad de los anticuerpos
p at er na
K yiétámmmMMiml
K
1
X m m m m sm m
CELULA PRE-B ¡terna
paterna
%H conjunto gènico conjunto gènico de cadena pesada de cadena ligera seleccionado CELULA B seleccionado
Figura 23-39 Desarrollo de una célula B. Este esquema muestra las selecciones secuenciales de la activación de los genes de Ig que deben realizar las células B para producir anticuerpos con un solo tipo de lugar de unión al antígeno. Se cree que la selección entre los conjuntos de segmentos génicos materno y paterno ha de ser al azar.
1311
Todavía no conocem os el mecanismo de exclusión alélica y la elección del tipo de cadena ligera, k o ^ , que se produce durante el desarrollo de las célula B. Una posibilidad reside en que las células B son monoespecíficas, simplemente debido a que la probabilidad de que una serie de reordenaciones se den en más de un conjunto de genes para cada cadena Ig es muy baja. Sin embargo, éste no constituye el único m ecanismo, como resulta evidente de algunos tipos de regu lación por retroalimentación negativa del sistema de recombinación V(D)I, por el que una reordenación funcional en un conjunto de segmentos génicos supri me las reordenaciones en los conjuntos restantes que codifican el mismo tipo de cadena polipeptídica. Por ejemplo, en los clones de células B aislados a partir de ratones transgénicos que expresan una reordenación del gen de la cadena \i, la reordenación de los genes endógenos de la cadena pesada generalmente que da suprimida únicamente si la cadena |i codificada por el transgén se inserta en la m em brana plasmática. Se han obtenido resultados similares a éstos para las cadenas ligeras. Por consiguiente parece que para que actúe la retroalimenta ción negativa, el producto de un ensam blaje de genes de cadena pesada o ligera debe expresarse en la superficie celular, lo cual indica que en la regulación del proceso participan señales extracelulares. El ensamblaje de las secuencias codificantes de la región V de una célula B en desarrollo tiene lugar en una secuencia ordenada, con un solo segmento cada vez, generalmente empezando con el acervo de la cadena pesada. En este con junto, los segmentos D se unen primero a los segmentos en ambos cromoso mas paternos. Después se realiza la unión de VHa D/Hen uno de estos cromoso mas. Si esta reordenación produce un gen funcional, la producción resultante de cadenas \i completas (que siempre son las primeras cadenas pesadas que se pro ducen) conduce a su expresión en la superficie celular asociada a una cadena li gera substituyente. Estos receptores de la superficie celular posibilitan que la cé lula B reciba señales de las células cercanas (denominadas células del estroma) y dichas señales suprimen otras reordenaciones de los segmentos génicos codifi cantes de la región VH, de forma que puede incrementar la velocidad de las reor denaciones de VL. En ratones, por lo menos, la reordenación de VL generalmente ocurre primero en un acervo de segmentos génicos k , y sólo si falla esta reordena ción, se reordena el otro acervo k o los acervos X. Si en algún momento la unión “en fase” VL a JL conduce a la producción de cadenas ligeras, éstas se combinan con las cadenas |li preexistentes formando moléculas de anticuerpo IgM, las cua les se insertan en la membrana plasmática. Los receptores IgM de la superficie celular permiten a las células B recién formadas recibir señales extracelulares que suprimen posteriores recombinaciones V(D)J por inactivación de la expresión de los genes rag-1 y rag-2. Si una célula B en desarrollo no consigue ensamblar la se cuencia codificante funcional, tanto de la región funcional VHcomo de la región funcional VL, es incapaz de producir moléculas de anticuerpo, y muere. No se han encontrado diferencias biológicas entre las cadenas ligeras k y X, pero el hecho de tener dos acervos distintos de segmentos génicos codificantes de cadenas ligeras supone una ventaja obvia: aumenta las probabilidades de que una célula pre-B que ha ensamblado con éxito una secuencia codificante de la región V„ continúe con éxito con el ensam blaje de una secuencia codificante de la región VL, convirtiéndose en una célula B.
Cuando las células B son estimuladas por un antígeno, pasan de la producción de anticuerpo ligado a la m em brana a la producción de la form a segregada del mismo anticuerpo25 De los mecanism os genéticos que determinan el lugar de unión al antígeno de un anticuerpo, pasemos ahora a los mecanism os que determinan sus propieda des biológicas -lo s responsables de la forma de la región constante de la cadena pesada que será sintetizada. La elección de los segmentos génicos particulares que codifican el lugar de unión al antígeno es irreversible durante toda la vida de una célula B y de su progenie, pero el tipo de región CHproducida cambia du
1312
Capítulo 2 3 : El sistema inmunitario
rante el desarrollo de una célula B. Los cambios son de dos tipos: cambio de una forma ligada a mem brana a una forma secretada de la misma región CH, y cam bios en la clase de región CHproducida. Todas las clases de anticuerpos pueden producirse tanto en forma ligada a m em brana como en forma soluble y secretada. La forma ligada a mem brana ac túa como un receptor para el antígeno en la superficie de la célula B, mientras que la forma soluble se produce sólo después de que la célula haya sido estimu lada por un antígeno para convertirse en célula secretora de anticuerpos. La única diferencia entre ambas formas reside en el extremo carboxilo terminal de la cadena pesada: las cadenas pesadas de las moléculas de anticuerpo Ig ligadas a membrana, por ejemplo, tienen un extremo carboxilo hidrofóbico que las an cla en la bicapa lipídica de la m em brana plasmática de la célula B mientras que las moléculas de Ig secretadas tienen un extremo carboxilo hidrofílico que les permite escapar de la célula. El paso al carácter de producción de moléculas de Ig tiene lugar debido a que la activación de las células B por el antígeno (y por las células T colaboradoras) induce un cambio en la forma en que se procesan los transcritos de RNA de Ig en el núcleo (véase Figura 9-78).
Las células B pueden cambiar la clase de anticuerpo que producen26 Durante el desarrollo, muchas de las células B pasan de producir una determi nada clase de anticuerpo a producir otra -proceso denominado cam bio de clase. Todas las células B empiezan su vida de síntesis de anticuerpos produ ciendo moléculas de IgM, que insertan en la membrana plasmática donde ac tuarán de receptores para el antígeno. Antes de interaccionar con el antígeno, muchas células B cambian y producen moléculas tanto de IgM como de IgD, las cuales actuarán como receptores de antígeno ligados a membrana. Tras la esti mulación por el antígeno, algunas de estas células se activan y secretan anti cuerpos IgM, que son los dominantes en la respuesta primaria de anticuerpos. Otras células estimuladas por el antígeno cambian y producen anticuerpos IgG, IgE o IgA; las células con memoria expresan una de estas tres clases de m olécu las en su superficie, mientras que las células B activadas, las segregan. Las m olé culas de IgG, IgE e IgA reciben colectivamente el nombre de clases secundarias de anticuerpo debido a que se cree que únicamente se producen después de la estimulación por el antígeno y porque dominan en las respuestas secundarias de anticuerpos. Como hemos visto, cada una de estas diferentes clases de anticuer pos se especializan en el ataque contra microorganismos mediante diferentes procesos y en lugares distintos. Como la clase de un anticuerpo viene determinada por la región constante de su cadena pesada, el hecho de que las células B puedan cambiar la clase de anticuerpo que producen sin alterar el lugar de unión al antígeno implica que una misma secuencia codificante de la región VH(que especifica la zona de la ca dena pesada que se une al antígeno) puede asociarse secuencialmente con dife rentes segmentos génicos CH. Ello supone importantes implicaciones funciona les. Significa que en un animal un lugar de unión al antígeno particular, seleccionado por antígenos ambientales, puede distribuirse entre las diferentes clases de inmunoglobulinas, adquiriendo de esta manera las propiedades bioló gicas propias de cada clase. El cambio de clase sucede mediante dos mecanismos moleculares diferen tes. Parece que cuando las células B vírgenes pasan de producir únicamente IgM ligada a mem brana a producir simultáneamente IgM e IgD ligadas a membrana, el cambio es debido a un cambio en el procesamiento del RNA. Las células pro ducen grandes transcritos primarios de RNA que contienen la secuencia codifi cante ensamblada de la región VHjunto con las secuencias C^ y C8; entonces se producen moléculas de IgM e IgD por maduración diferencial de estos transcri tos de RNA (Figura 23-40). Por el contrario, la maduración final a célula B activada que segrega una de las clases secundarias de anticuerpos está acompañada por un cambio irreversi-
La generación de la diversidad de los anticuerpos
unión V-J 5'
V3 J4
Cu
C§
Cy
Cg
C«
3' DNA
TRANSCRIPCION V3 J4 Cj^
C§ transcrito
D4 DOS TIPOS DE MADURACION DEL RNA V3 ^
mRNA
V3 Cg
D4 J4 D4 J4 TRADUCCIÓNj cadena (i
V3 C,
V3 Cg
D4 J4
D4 J4
IgM
IgD
cadena §
Figura 23 -4 0 Síntesis sim ultánea de IgM y IgD. Las células B que producen simultáneamente moléculas de IgM y de IgD ligadas a la membrana plasmática, las cuales tienen los mismos lugares de unión al antígeno, producen transcritos largos que contienen las dos secuencias y C5. Estos transcritos maduran de dos maneras diferentes produciendo moléculas de mRNA que tienen la misma secuencia codificante de la región V„ (V3D4J4) unida a una secuencia C o a una secuencia Cs.
1313
VDJ ensam blado Cn
C£
C5
VDJ Cu IgM
DNA DELECION DE DNA POR MADURACION POR CORTE Y EMPALME DEL DNA CERCA DE LAS SECUENCIAS DE CAMBIO
Ce
C6
TRANSCRIPCION, PROCESAMIENTO DEL RNA Y TRADUCCIÓN
VDJ DNA
ble a nivel de DNA -u n proceso denominado recombinación del cambio de clase (class switch recombination). Ello supone la delección de todos los segmentos génicos Cu que se hallan en dirección 5 ’ (si se considera la dirección sobre la hebra codificante) del segmento gènico CHparticular que la célula está destinada a ex presar (Figura 23-41). La evidencia de que esta etapa del cambio de clase implica la delección del DNA procede de experimentos realizados en células de mieloma: células de mieloma secretoras de IgG carecen del DNA codificante de las regiones CMy C8, mientras que las que secretan IgA carecen del DNA codificante de todas las demás clases de regiones C de la cadena pesada.
Resumen Los anticuerpos se producen a partir de tres acervos de segmentos génicos diferen tes que codifican respectivamente las cadenas ligeras k, las cadenas ligeras k y las cadenas pesadas. En cada acervo, los segmentos que codifican las distintas zonas de las regiones variables de las cadenas ligeras y pesadas se unen mediante recom binación específica de lugar durante la diferenciación de la célula B. Los acervos de la cadena ligera contienen uno o más segmentos génicos constantes (C) y grupos de segmentos variables (V) y de segmentos de unión (J). El acervo gènico de las cadenas pesadas contiene un grupo de segmentos génicos C y grupos de segmentos V, de di versidad (D) y J. Para producir una molécula de anticuerpo, un segmento gènico VL se recombina con un segmento gènico JLproduciendo una secuencia de DNA codifi cante de la región Vde la cadena ligera; un segmento gènico VHse recombina con un segmento D y uno JHproduciendo un secuencia de DNA codificante de la región Vde la cadena pesada. Cada uno de los segmentos génicos ensamblados se cotranscribe con la secuencia apropiada de la región C, dando lugar a una molécula de mRNA que codifica la cadena polipeptídica completa. Combinando de diversas maneras los segmentos génicos heredados que codifican las regiones VLy Vlp los vertebrados puede producir miles de cadenas ligeras diferentes y miles de cadenas pesadas dife rentes. Debido a que el lugar de unión al antígeno se forma donde se juntan V¡ y VH en el anticuerpo final, las cadenas ligeras y pesadas pueden asociarse formando anticuerpos con millones de lugares diferentes de unión al antígeno. Esta cifra se ve enormemente incrementada por la pérdida y la ganancia de nucleótidos en el lugar de unión de los segmentos génicos, así como por las mutaciones somáticas, que ocu rren con una frecuencia muy elevada en el ensamblaje de secuencias codificantes de regiones Vdespués de la estimulación por el antígeno. Todas las células B producen inicialmente anticuerpos IgM. Algo más tarde pa san a producir anticuerpos de otras clases pero con el mismo lugar de unión al an tígeno que tenían los anticuerpos IgM originales. Este cambio de clase permite que los mismos lugares de unión al antígeno se distribuyan entre anticuerpos con pro piedades biológicas diferentes. 1 31 4
Capítulo 23 : El sistema inmunitario
VDJ Ca I 1
igA
Figura 23-41 Un ejemplo de la reordenacidn del DNA que sucede en la recombinación de cambio de clase. Cuando una célula B que produce anticuerpos IgM a partir de una secuencia de DNA ensamblada VDJ es estimulada por el antígeno para madurar a una célula secretora de anticuerpos IgA, suprime el DNA entre la secuencia VDJ y el segmento génico Ca. Las secuencias de DNA específicas (.secu en cias d e cam bio, que en la figura aparecen como esferas negras) se localizan en dirección 5 ’ de cada segemento génico CH(excepto C6), se recombinan entre sí suprimiendo el DNA intermedio. Se cree que el tipo de recombinación de cambio de clase está mediado por una recom b in asa d e cam b io, que se dirige a las secuencias apropiadas de cambio cuando éstas se vuelven accesibles bajo la influencia de señales extracelulares (linfoquinas) segregadas por las células T colaboradoras, como veremos más adelante.
Los receptores de las células T y sus subclases Las diversas respuestas de las células T reciben el nombre colectivo de reaccio nes inmunitarias mediadas por células. Al igual que las respuestas por anticuer pos, son altamente específicas para el antígeno y son importantes para la defen sa de los vertebrados contra la infección. Sin embargo, las células T se diferencian de las células B en varios aspectos importantes. Primero, actúan únicamente en un radio limitado, interactuando directamente con otras células del cuerpo, a las que destruyen o señalan de al gún modo (nos referiremos a dichas células como células diana)] las células B, por el contrario segregan anticuerpos que pueden actuar a distancia. Segundo, las células T se especializan en el reconocimiento de un antígeno extraño única mente cuando éste se localiza en la superficie de una célula diana. Por este m oti vo la forma de un antígeno reconocido por las células T es distinta del que reco nocen las células B: mientras que las células B reconocen un antígeno intacto, las células T reconocen fragmentos peptídicos de proteínas antigénicas que han sido parcialmente degradadas en el interior de la célula diana y luego transpor tadas y expuestas sobre la superficie celular. De este modo las células T son ca paces de detectar la presencia de microorganismos que proliferan en el interior de las células, así como de detectar antígenos extracelulares que han sido ingeri dos por las células. Existen dos clases principales de células T -células T citotóxicas y células T colaboradoras. Las células T citotóxicas destruyen directamente las células que han sido infectadas por un virus o algún otro microorganismo intracelular. Las células T colaboradoras, por el contrario, contribuyen a estimular las respuestas de otras células: por ejemplo, colaboran activando macrófagos y células B.
Los receptores de la célula T son heterodímeros similares a los anticuerpos27 Debido a que las respuestas de las células T dependen del contacto directo con un célula diana, los receptores del antígeno producidos por las células T, a dife rencia de los anticuerpos producidos por las células B, existen únicamente en la forma ligada a membrana y no son segregados. Por este motivo, resultó difícil aislar los receptores de las células T, y no fue hasta 1983 que se identificaron bio químicamente por primera vez. Tanto en células T colaboradoras como en célu las T citotóxicas los receptores están compuestos por dos cadenas polipeptídicas (denominadas a y (3) unidas entre sí por un enlace disulfuro, cada una de las cuales contiene dos dominios similares a Ig y comparte con los anticuerpos la propiedad característica de presentar una región amino terminal variable y una región carboxilo terminal constante (Figura 23-42). Los conjuntos de genes codificantes de las cadenas a y (3 se localizan en cro mosomas diferentes y contienen, como los conjuntos génicos de los anticuerpos, segmentos génicos V, D, J y C separados, los cuales se juntan por recombinación específica de lugar durante el desarrollo de las células T en el timo. Con una sola ex cepción, todos los mecanismos utilizados por las células B para generar diversidad en los anticuerpos, también se utilizan por las células T para generar diversidad en sus receptores; en particular utilizan el mismo sistema de recombinación V(D)J, requiriéndose las proteínas codificadas por los genes rag-1 y rag-2 estudiados ante riormente. El mecanismo que al parecer no actúa en la génesis de diversidad de los receptores de la célula T es la hipermutación somática estimulada por el antígeno por lo que la afinidad de los receptores permanece baja {Ka ~ 104 litros/mol) in cluso en una respuesta inmunitaria avanzada. Más adelante estudiaremos cómo los mecanismos de adhesión intercelular no específicos del antígeno estrechan fuertemente la unión de una célula T a su célula diana, contribuyendo a com pen sar la baja afinidad de los receptores de la célula T. Un número reducido de células T, en lugar de producir cadenas a y (3, pro ducen un tipo de receptor heterodímero distinto, compuesto por cadenas y y 8.
Los receptores de las células T y sus subclases
cadena a H2N
cadena p nh2
C1TOSOL Figura 23-42 Un receptor heterodímero de una célula T. El receptor está compuesto por una cadena polipeptídica a y una (3. Cada cadena tiene aproximadamente 280 residuos de aminoácido de longitud y posee una porción extracelular que está plegada en dos dominios con aspecto de Ig -u n o variable (V) y el otro constante (C). Se cree que el sitio de unión al antígeno formado por un dominio Vuy otro Vp (sombreados en azul) es similar en dimensiones y geometría globales al lugar de unión al antígeno de una molécula de anticuerpo. Sin embargo, a diferencia de los anticuerpos, que presentan dos lugares de unión al antígeno, los receptores de la célula T presentan uno sólo lugar de unión. El heterodímero a l (3 mostrado está asociado de forma no covalente con un gran conjunto de proteínas invariables (no se muestran) que colaboran con la célula T activada cuando los receptores de la célula T se unen al antígeno. Una célula T típica tiene alrededor de 20 000 complejos receptores de este tipo en su superficie.
1 31 5
Dichas células surgen temprano en el desarrollo y se localizan principalmente en los epitelios (por ejemplo, en la piel y en el intestino), donde proporcionan una primera línea de defensa contra los microorganismos que intentan penetrar en dichas capas celulares. Como ocurre en el caso de los receptores de antígeno en las células B, los re ceptores de las células T se halla estrecham ente asociados a la membrana plas mática por un número invariable de proteínas, que se hallan implicadas en la transmisión de la señal desde un receptor activado por el antígeno al interior de la célula. Más tarde estudiaremos con más detalle estas proteínas.
Las diferentes respuestas de las células T están mediadas por distintas clases de células T 28 Las dos clases principales de células T poseen funciones muy diferentes. Las cé lulas T citotóxicas destruyen células que hospedan microorganismos nocivos, mientras que las células T colaboradoras contribuyen a activar las respuestas de otros glóbulos blancos, principalmente por la secreción de diversos mediadores locales, denominados en conjunto linfoquinas, interleuquinas o citoquinas. Así las células T citotóxicas proporcionan protección contra microorganismos pató genos, com o virus y algunas bacterias intracelulares, que se multiplican en el ci toplasma de la célula huésped, donde quedan resguardadas del ataque de los anticuerpos. La forma más eficiente de prevenir que tales microorganismos in vadan dichas células es destruyendo las células infectadas antes de que puedan proliferar los microorganismos. Por el contrario, las células T colaboradoras son cruciales en la estimulación de respuestas frente a los microorganismos extracelulares y a sus productos tóxicos. Existen dos tipos de células T colaboradoras: las células TH1, que activan a los macrófagos para que destruyan los microorga nismos que han ingerido, y las células TH2, que estimulan la proliferación y la se creción de anticuerpos de las células B. Tanto las células T citotóxicas como las células T colaboradoras reconocen al antígeno en forma de fragmentos peptídicos que se generan a partir de la de gradación de proteínas antigénicas extrañas en el interior de la célula diana, y ambos tipos, por tanto, dependen de la presencia de proteínas especiales de la célula diana que se unan a dichos fragmentos, transportándolos hasta la superfi cie celular, donde los presentan a las células T. Estas proteínas especiales se de nominan moléculas MHC debido a que están codificadas por un complejo de ge nes denominado el complejo principal de histocompatibilidad (MHC, de Major Histocompatibility ComplexJ. Existen dos clases distintas de moléculas MHC que son estructural y funcionalmente distintas: las moléculas MHC de clase I, que presentan péptidos extraños a las células citotóxicas y las moléculas MHC de clase II que presentan péptidos extraños a las células colaboradoras. Antes de examinar los diferentes mecanism os con que se procesan las proteínas antigéni cas para exhibirlas a los dos tipos de células T, debemos estudiar de forma más precisa las propias moléculas MHC, que juegan un papel muy importante en la inmunidad por células T.
Resumen Existen por lo menos dos subclases funcionalmente distintas de células T: células T citotóxicas, que destruyen células infectadas, especialmente las que son infectadas por un virus, y células T colaboradoras, que contribuyen a activar tanto a las célu las B productoras de anticuerpos como a los macrófagos que ingieren y destruyen los microorganismos invasores. Ambos tipos de células T expresan receptores simi lares a los anticuerpos en su superficie celular, que están codificados por genes en samblados a partir de segmentos génicos múltiples durante el desarrollo de la célu la Ten el timo. Estos receptores reconocen fragmentos de proteínas extrañas que se exhiben en la superficie de las células huésped asociadas con las moléculas MHC. 1316
Capítulo 23 : El sistema inmunitario
Las moléculas MHC y la presentación del antígeno a las células T29 Las moléculas MHC se reconocieron mucho antes de que se entendiese cuál era su función normal. Inicialmente se creyó que eran los antígenos diana principa les en las reacciones de trasplante. Generalmente cuando se intercambian in jertos de órganos entre individuos adultos de la misma especie (aloinjertos ) o de especies diferentes (.xenoinjertos), estos injertos son rechazados. En los años 1950, experimentos realizados con injertos de piel entre diferentes cepas de ra tón demostraron que el rechazo del injerto es una respuesta inmunitaria frente a antígenos extraños de la superficie de las células injertadas. Más tarde se demos tró que estas reacciones están mediadas principalmente por células T y que es tán dirigidas contra versiones genéticamente “extrañas” de las glucoproteínas de la superficie celular denominadas moléculas de histocompatibilidad (“histo” sig nifica tejido). Con diferencia, las más importantes de estas moléculas son las de la familia de proteínas codificadas por el grupo de genes del complejo principal de histocompatibilidad (MHC). Las moléculas MHC se expresan en todas las cé lulas de los vertebrados superiores. Su existencia se demostró por primera vez en ratones, recibiendo el nombre de antígenos H-2 (antígenos de histocompatibilidad-2). En humanos, estas moléculas se denominan antígenos HLA (de Human-Leucocyte-Associated antigens) debido a que se describieron por primera vez en leucocitos. Tres propiedades notables de las moléculas MHC confundieron a los inmunólogos durante mucho tiempo. En primer lugar, las moléculas MHC son, con mucha diferencia, los antígenos diana preferidos de las reacciones de transplante mediadas por células T. En segundo lugar, una fracción extraordinariamente grande de células T son capaces de reconocer las moléculas MHC extrañas: mien tras que, por ejemplo, menos de un 0,001% de las células T de un individuo res ponden frente a un antígeno vírico típico, más del 0, 1% de ellas responden frente a un antígeno MHC extraño. En tercer lugar, muchos de los loci que codifican las moléculas MHC son los más polimórficos que se conocen en vertebrados supe riores; es decir, en una especie existe un número extraordinariamente grande de alelos (formas alternativas de un mismo gen) en cada locus (a menudo más de 100), cada uno de los cuales se presenta en una frecuencia relativamente alta en la población. Por esta razón, y debido a que cada individuo tiene cinco o más loci codificadores de moléculas MHC (véase más adelante), es raro que dos indivi duos posean conjuntos idénticos de proteínas MHC, lo cual hace muy difícil el emparejamiento de un donante y un receptor para el trasplante de órganos en humanos (excepto en el caso de gemelos genéticamente idénticos). Un vertebrado no necesita protegerse de la invasión de células extrañas de vertebrados; por lo tanto, esta aparente obsesión de sus células T por las molécu las MHC extrañas y el acusado polimorfismo de estas moléculas constituía un gran rompecabezas para los inmunólogos. Este rompecabezas sólo se resolvió tras el descubrimiento de que las moléculas MHC actúan concentrando las células T so bre las células del huésped que presentan antígenos extraños en su superficie y que las células T responden a las moléculas MHC extrañas de la misma forma que a las moléculas MHC propias que poseen antígenos extraños unidos a ellas.
Existen dos clases principales de moléculas MHC29 Las proteínas MHC de clase I y de clase II presentan estructuras muy similares. Ambas son heterodímeros transmembrana cuyos dominios extracelulares amino terminales se unen al antígeno para la presentación a las células T. Cada gen MHC de clase I codifica una cadena polipeptídica transmembrana (denominada a), la mayor parte de la cual se pliega en tres dominios extracelula res globulares (a p oc2 y ctg). Todas las cadenas a están asociadas de forma no covalente a una pequeña proteína extracelular no glucosilada denominada $2-mi-
Las moléculas MHC y la presentación del antígeno a las células T
1317
cadena a
P2-
cadena (5
-
m icroglobulina ESPACIO EXTRACELULAR
HOOC
m em brana plasmática
CITOSOL
COOH
COOH (A) PROTEÍNA MHC DE CLASE I
(B) PROTEÍNA MHC DE CLASE II
croglobulina, que no atraviesa la membrana y está codificada por un gen que no pertenece al grupo de genes MHC (Figura 23-43A). La P2-microglobulina y el do minio oc3, que son los más próximos a la membrana, son homólogos a un domi nio de inmunoglobulina Ig. Los dos dominios amino terminales de la cadena a, que son los más alejados de la membrana, se unen al antígeno y contienen los aminoácidos polimórficos (variables) que son reconocidos por las células T en las reacciones de trasplante. Al igual que las moléculas MHC de clase I, las m oléculas MHC de clase II son heterodímeros con dos dominios conservados, similares a Ig, que se hallan próximos a la membrana. Sin embargo, en estas moléculas ambas cadenas (a y (3) están codificadas por MHC, y ambas atraviesan la membrana (Figura 23-43B). La presencia de dominios parecidos a las Ig en las proteínas de clase I y de clase II sugiere que las moléculas MHC y los anticuerpos poseen una historia evoluti va común. En la Figura 23-44 se muestran las localizaciones de los genes que co difican las proteínas MHC de clase I y de clase II en ratones y en el hombre.
Figura 23-43 Proteínas MHC de clase I y de clase II. (A) La cadena a de la molécula de clase I presenta tres dominios extracelulares a ,, a 2 y a 3, codificados por exones diferentes. Está asociada de forma no covalente con una cadena polipeptídica menor, p2-microglobulina, que no está codificada por el MHC. El dominio a 3 y la p2-microglobulina son similares a los de una inmunoglobulina. Mientras que la P2-microglobulina es invariable, la cadena a es extremadamente polimórfica, principalmente en sus dominios a , y a 2. (B) En las moléculas MHC de clase II, ambas cadenas son polimórficas (la (3 más que la a), principlamente en los dominios a t y P,; los dominios a 2 y P2 son similares a los de una inmunoglobulina. Así, existen notables similitudes entre las proteínas MHC de clase I y las de clase II. En ambas, los dos dominios más externos (sombreados en azul) interaccionan entre sí formando un surco que une el antígeno extraño y lo presenta a las células T. Todas las cadenas están glucosiladas con excepción de la P2-microglobulina (no se muestra en el esquema).
Figura 23-44 Los complejos génicos
H-2 y HLA. Este dibujo esquemático com plejo H-2 crom osom a 17 de ratón
H-2A
H-2K
a
H-2E [i
H-2D H-2L
a
centrom er
crom osom a 6 hum ano
HLADP
HLADQ
HLADR
P a
p a
p a
HLA-B HLA-C
com plejo HLA
131 8
Capítulo 23 : El sistema inmunitario
HLA-A
muestra la localización de los loci que codifican las subunidades transmembrana de las proteínas MHC de clase I {en verde claro) y de clase II {en verde oscuro). Existen tres tipos de proteínas de clase I (H-2K, H-2D y H-2L en el ratón y HLA-A, HLA-B y HLA-C en humanos). En el ratón existen dos tipos de loci MHC de clase II {H-2A y H-2E) y más de tres tipos en humanos de los que sólo se muestran tres {HLA-DP, HLA-DQ y HLA-DR). Cada locus de clase II codifica al menos una cadena a y al menos una cadena p, pero algunos codifican más de una cadena a o p (no se muestra en la figura).
surco de unión al antígeno
péptido en el surco de unión al antígeno
enlace S-S
p2-m icroglobulm a
COOH
ESPACIO EXTRACELULAR
(B) VISTA SUPERIOR Figura 23-45 (A) Estructura de una proteína MHC de clase I humana determinada por análisis de difracción de rayos X de cristales de la parte extracelular de la molécula. La parte extracelular
m em brana plasmática
CITOSOL
HOOC (A) VISTA DE PERFIL
de la proteína se escindió del segmento transm em brana con la enzima proteolítica papaína antes de la cristalización. Los dos dominios más próximos a la membrana plasmática (a 3 y P2-microglobulina) son similares a un dominio de inmunoglobulina típico (véase Figura 23-34B), mientras que los dos dominios más alejados de la membrana (a, y a 2) son muy similares entre sí, y juntos forman un surco de unión al péptido en la parte superior de la molécula. Se cree que las moléculas MHC de clase II tienen una estructura muy similar. (B) Visto desde arriba, el surco de unión al antígeno contiene los pequeños péptidos que copurificaban con la proteína MHC. Ésta es la parte de la molécula MHC que interacciona con el receptor de la célula T. (De P.J. Bjorkman, M.A. Saper, B. Samraoui, W.S. Bennett, J.L. Strominger y D.C. Wiley, N ature 329:506512, 1987.)
Estudios por difracción de rayos X revelan el lugar de unión al antígeno de las proteínas MHC así como el péptido de unión30 Cualquier individuo posee únicamente un reducido número de tipos de m olécu las MHC, que han de ser capaces conjuntam ente de presentar a las células T fragmentos de péptidos de prácticamente cualquier proteína extraña. Así cada molécula MHC tiene la capacidad de unirse a un gran número de péptidos dife rentes. La base estructural de dicha versatilidad surge de los análisis por cristalo grafía de rayos X de moléculas MHC. Como se muestra en la Figura 23-45A, una proteína MHC de clase I presenta un único lugar de unión al péptido, localizado en un extremo de la molécula. Este lugar consiste en un profundo surco entre dos largas hélices a derivadas de los dominios a , y a 2, casi idénticos entre sí; la base del surco está formada por ocho hebras (3 derivadas de los mismos dominios. El surco es suficientemente grande como para alojar un péptido de unos 10 residuos de aminoácidos. En rea lidad, cuando se analizó una proteína MHC de clase I mediante cristalografía por rayos X, se encontró que este surco contenía una zona de baja densidad, que Las moléculas MHC y la presentación del antígeno a las células T
1319
Figura 23-46 Ilustración muy esquemática de un péptido en el surco de unión de una molécula MHC de clase I. Desde esta perspectiva el esqueleto peptídico se muestra como una serie de bolas rojas, cada una de las cuales representa uno de los nueve residuos de aminoácido. Los esqueletos de los “residuos de anclaje” en los extremos del péptido se unen a los pliegues conservados de los bordes del surco.
posiblemente correspondía al péptido de unión que había cocristalizado con la proteína MHC (Figura 23-45B). Este descubrimiento implicaba que este surco era el lugar de unión al antígeno y sugería que una vez que el péptido se une a este lugar, se disocia muy lentamente. Esta conclusión se apoya en la observa ción de que células expuestas durante un corto período de tiempo a fragmentos de una proteína vírica pueden conservar durante algunos días su propiedad de ser dianas para las células T citotóxicas específicas. Sin embargo, en soluciones acidificadas, los péptidos de unión pueden ser eluidos a partir de moléculas MHC de clase I aisladas, y efectivamente se ha encontrado que poseen una longi tud de 8 a 10 residuos de aminoácidos. Casi todos los aminoácidos polimórficos de la proteína MHC (los que varían entre formas alélicas de este tipo de m olécu la) se localizan en el interior del surco, donde se supone que unen el antígeno, o en los bordes del surco, donde serían accesibles para el reconocimiento por el re ceptor de la célula T. Se han encontrado distintos péptidos que se unen al surco de una proteína MHC de clase I m ediante una com binación de contactos variables e invaria bles. En cada caso se considera el péptido com o una cadena extendida de 8 a 10 aminoácidos, con el eje peptídico invariable de aminoácidos terminales en cada extremo del surco (Figura 23-46). Otras regiones del péptido se unen a “bolsas específicas” formadas por porciones polimórficas de la proteína MHC, mientras que las cadenas laterales de algunos residuos se dirigen al exterior, en una posición que sea reconocida por los receptores de las células T citotóxicas. Debido a que las bolsas conservadas en los extremos del surco de unión reco nocen características del esqueleto peptídico que son comunes a muchos pép tidos pero no a las cadenas laterales de los aminoácidos, que varían, una única proteína MHC de clase I puede unirse a una amplia variedad de péptidos de se cuencias diferentes. A su vez la distinta especificidad de las bolsas a lo largo del surco asegura que cada forma alélica de molécula MHC se una y presente su propio y característico conjunto de péptidos. Así, los numerosos tipos de m olé culas MHC de clase I de un individuo pueden presentar un amplio rango de proteínas extrañas a las células T citotóxicas, pero en cada individuo lo hacen de maneras muy parecidas. Las moléculas MHC de clase II poseen una estructura tridimensional muy parecida a la de las moléculas de clase I, pero su surco de unión al antígeno aloja péptidos m ucho más largos y heterogéneos, alcanzando un tamaño de 15 a 24 residuos de aminoácidos. Así, aunque un individuo produce probablemente me-
1320
Capítulo 23 : El sistema inmunitario
CÉLULA TCITOTÓXICA
CELULA T COLABORADORA
receptor de la célula T fragm ento de la proteína extraña
fragm ento de la proteína extraña
célula presentadora de antígeno
célula diana infectada
nos de 20 tipos de moléculas de clase II, cada una de las cuales presenta un úni co lugar de unión al antígeno, parece que en conjunto estas moléculas consi guen unir y presentar una variedad aparentemente ilimitada de péptidos extra ños a las células T colaboradoras, que juegan un papel crucial en casi todas las respuestas inmunitarias.
Las m oléculas MHC de clase I y de clase II tienen funciones distintas29
Figura 23-47 Las células T citotóxicas y colaboradoras reconocen distintas moléculas MHC. Las células T citotóxicas reconocen los antígenos víricos extraños en asociación con las proteínas MHC de clase I en la superficie de cualquier célula del huésped, mientras que las células T colaboradoras reconocen a los antígenos extraños en asociación con las proteínas de clase II en la superficie de una célula presentadora de antígeno, com o un macròfago o una célula B. El antígeno extraño unido a una molécula MHC de clase I se sintetiza en la célula diana, mientras que el antígeno extraño unido a una molécula MHC de clase II se ha captado por endocitosis y se ha procesado antes de ser presentado en la superficie celular (no se muestra en la figura). En las reacciones de trasplante, las células colaboradoras también reaccionan contra las glucoproteínas de clase II extrañas, y las células citotóxicas reaccionan contra las glucoproteínas de clase I extrañas.
Las moléculas MHC de clase I se expresan prácticamente en todas las células nucleadas, posiblemente debido a que las células T citotóxicas deben ser capa ces de concentrarse en cualquier célula del cuerpo que haya sido infectada por un microorganismo intracelular, como un virus. Por el contrario, las moléculas MHC de clase II se hallan normalmente restringidas a células especializadas, como las células B, macrófagos y otras células presentadoras de antígenos, que extraen los antígenos del líquido extracelular e interactúan con las células T co laboradoras (Figura 23-47). En la Tabla 23-2 se resumen las características prin cipales de las dos clases de proteínas MHC.
Tabla 23-2 Propiedades de las moléculas MHC de clase I y II Clase I Loci genéticos
Clase II
H-2K, H-2D, H-2L en el ratón; agrupaciones H-2A y H-2E en el HLA-A, HLA-B, HLA-C ratón; DP, DQ, DR y algunas en el hombre
otras en el hombre
Estructura de la cadena
cadena a + P2-microglobulina cadena a + cadena p
Distribución celular
la mayoría de células nucleadas
células presentadoras de antígeno (incluyendo células B), células epiteliales del timo y algunas otras
Intervienen en la presentación del antígeno a
células T citotóxicas
células T colaboradoras
Origen de los fragmentos peptídicos
proteínas producidas en el citosol
proteínas extracelulares y de membrana plasmática, endocitadas
Dominios polimórñcos
a + a2
«i + pi
Las moléculas MHC y la presentación del antígeno a las células T
1321
Un aspecto im portante es que las células T citotóxicas concentran su ataque en las células que producen antígenos extraños, mientras que las células T cola boradoras concentran su colaboración en células que extraen los antígenos ex traños del líquido extracelular. El primer tipo de célula diana constituye una amenaza, pero el segundo tipo es esencial para la defensa inmunitaria del orga nismo. El sistema inmunitario debe ser capaz de deshacerse de los antígenos ex traños extracelulares, de numerosas bacterias que se multiplican fuera de las cé lulas, y de algunas toxinas proteicas segregadas, como la toxina tetánica y la toxina botulínica, que pueden ser letales. Las células T colaboradoras contribu yen a eliminar estos patógenos ya sea colaborando con las células T para la pro ducción de anticuerpos contra los microorganismos o bien contra sus toxinas, activando a los macrófagos para que destruyan los microorganismos ingeridos. Para garantizar la dirección correcta de las funciones citotóxica y colabora dora, cada uno de los dos tipos principales de células T, además del receptor del antígeno que reconoce un complejo peptídico-MHC, también expresa un corre ceptor que reconoce una parte no polimórfica de la clase apropiada de molécula MHC, tal como veremos a continuación.
Las proteínas CD4 y CD8 actúan como correceptores de unión a MHC en las células T colaboradoras y citotóxicas, respectivamente31 Generalmente la afinidad de los receptores de la célula T para los complejos peptídicos MHC de la célula diana es demasiado baja para inducir una interac ción funcional entre las dos células. Son necesarios los receptores accesorios para contribuir a estabilizar dicha interacción aumentando la fuerza total de la adhe sión intercelular; cuando estos receptores tam bién ejercen un papel directo en la activación de la célula T generando sus propias señales intracelulares, se de nominan correceptores. A diferencia de los receptores de la célula T o de las m o léculas MHC, los receptores accesorios no se unen al antígeno y son invariables y no polimórficos. Los más importantes y mejor conocidos de los correceptores de las células T son las proteínas CD4 y CD8, que son proteínas transmembrana de paso único con dominios extracelulares similares a las Ig. Al igual que los receptores de la célula T, reconocen a las proteínas MHC, pero, a diferencia de los receptores de células T, se unen a las zonas no variables de la proteína, lejos del surco de unión al péptido. CD4 se expresa en las células T colaboradoras y se une a las moléculas MHC de clase II, mientras que CD8 se expresa en las células T citotóxicas y se une a las moléculas MHC de clase I (Figura 23-48). Así CD4 y CD8 contribuyen al reconocim iento de la célula T, contribuyendo a que la célula se concentre en un tipo concreto de moléculas MHC, y en un tipo concreto de células diana. La cola citoplasmática de estas proteínas transmembrana se halla asociada con un miembro de la familia de proteínas quinasa Src específicas de tirosina, denom i nada proteína Lck, la cual fosforila varias proteínas celulares en los residuos de tirosina y de este modo participa en la activación de la célula T. Las proteínas CD4 y CD 8 no sólo se requieren para aumentar la fuerza de adhesión intercelular y para contribuir a activar la célula T, sino que también son necesarias para el desarrollo de la célula T: si se inactivan los genes que co difican CD4 o CD 8 en ratón mediante recom binación genética vectorial, no se desarrollan ni las células T colaboradoras ni las células T citotóxicas. Irónica mente, CD4 tam bién funciona como receptor para el virus del SIDA (HIV), per mitiendo que el virus infecte a las células T colaboradoras.
Resumen Las moléculas MHC de clase Iy de clase II son las proteínas más polimórficos que se conocen -es decir, muestran una gran variabilidad genética de un individuo a otro- y juegan un papel crucial en la presentación de proteínas antigénicas extra ñas a las células T citotóxicas y a las células T colaboradoras, respectivamente. 1 32 2
Capítulo 23 : El sistema inmunitario
proteina CD8
proteína MHC de clase I
célula infectada zona no polim órfica
proteina CD4
célula presentadora de antígeno
proteína MHC de clase Figura 23-48 Los correceptores CD4 y CD8 de la superficie de las células T. Obsérvese que estas proteínas se unen a la región invariable de la molécula MHC que ha unido la célula T receptora, de forma que se m antienen adosados a los receptores de la célula T durante el proceso de activación celular. Los anticuerpos contra CD4 y CD 8 son ampliamente utilizados para distinguir entre células T colaboradoras y células T citotóxicas.
Mientras que las moléculas de la clase I se expresan en casi todas las células de los vertebrados, las moléculas de la clase II quedan restringidas a unos cuantos tipos celulares que interactúan con las células T colaboradoras, como son los linfocitos B y los macrófagos. Ambas clases de moléculas MHC poseen dominios similares a Ig y un único surco de unión al péptido, que une pequeños fragmentos de péptidos deri vados de proteínas extrañas. Cada molécula MHC puede unir una característica y gran cantidad de conjuntos de péptidos, que se producen intracelularmente por de gradación proteica. Después de su formación en el interior de la célula diana, los complejos péptidos-MHC son transportados a la superficie celular donde son reco nocidos por los receptores de la célula T. Además de sus receptores específicos de antígeno que reconocen los complejos MHC-péptido de la superficie de las células dia na, las células T expresan los correceptores CD4 o CD8, que reconocen regiones no polimórficas de las moléculas MHC en las células diana: las células colaboradoras expresan CD4, que reconoce las moléculas MHC clase II, mientras las células T citotóxicas expresan CD8 que reconoce las moléculas MHC de clase I.
Las células T citotóxicas Como estudiamos anteriormente, las células T citotóxicas nos defienden contra microorganismos como los virus que crecen en el interior de las células, lejos del alcance de los anticuerpos. Las células T citotóxicas, a diferencia de los anticuer pos, pueden reconocer estas células infectadas debido a que las moléculas MHC de clase I envían continuam ente fragmentos de las proteínas microbianas a la superficie celular, donde pueden ser detectadas por las células T. En esta sección estudiaremos cómo se generan dichos fragmentos y se reparten entre las m olé culas MHC de clase I, y consideraremos cómo las células T citotóxicas destruyen las células diana infectadas.
Las células T citotóxicas reconocen fragmentos de proteínas víricas en la superficie de células infectadas por virus32 La primera prueba clara de que las moléculas MHC presentan los antígenos ex traños a las células T surgió de un experimento con células T citotóxicas realiza do en 1974, que demostró que las células T citotóxicas de ratón infectadas por un virus podrían destruir células cultivadas infectadas con el mismo virus, sólo si dichas células expresaban alguna de las moléculas MHC de la misma clase I de ratón infectado (Figura 23-49). Este experimento demostró que las células T de cualquier individuo sólo reconocerá un antígeno determinado cuando dicho antígeno se halle asociado a las formas alélicas de moléculas MHC expresadas por ese mismo individuo, un fenómeno conocido como restricción MHC. Sin em bar go, no fue hasta 10 años después, que se descubrió la naturaleza química de los antígenos víricos reconocidos por las células T citotóxicas. En los experimentos
las células T matan a las células diana virus A
fibroblastos 5 de ratón de la ( ^ ( f ^ cepa X infectados • con el virus B fibroblastos del ratón de la cepa X infectados con el virus A fibroblastos del ratón de la cepa Y infectados con el virus A
Las células T citotóxicas
NO
C~a " c '>
SI
(/ fc O
NO
Figura 23-49 El experimento clásico que demuestra que las células T citotóxicas reconocen el antígeno vírico y algún aspecto de la superficie de la célula diana huésped. Ratones de la cepa X se infectan con el virus A. Al cabo de siete días, los bazos de estos ratones contienen células T citotóxicas capaces de destruir fibroblastos en cultivo de la cepa X infectados por el virus. Tal com o se esperaba, estas células T citotóxicas únicam ente destruyen los fibroblastos infectados por el virus A, pero no por otro virus B; así pues, las células T citotóxicas son específicas del virus. Sin embargo estas mismas células son incapaces de destruir fibroblastos de ratones de la cepa Y infectados con el mismo virus A, lo cual indica que las células T citotóxicas no solamente reconocen los virus sino también alguna diferencia genética entre ambos tipos de fibroblastos. Gracias a la utilización de cepas especiales de ratones (conocidas como cep as congénitas) que o bien son genéticamente idénticas excepto para los alelos de sus loci MHC de clase I o son genéticamente diferentes excepto para dichos alelos se encontró que la destrucción de células diana infectadas requiere que dichas células expresen al menos uno de los alelos MHC de la misma clase expresados por el ratón infectado inicialmente. Esto indicaba que las proteínas MHC de clase I son necesarias para presentar los antígenos víricos unidos a superficie a las células T citotóxicas.
1 323
con células infectadas por el virus de la gripe se encontró de forma inesperada que algunas células T citotóxicas reconocían específicamente proteínas internas del virus que en la partícula del virus intacta no debían ser accesibles. La prueba siguiente sugería que las células T estaban reconociendo fragmentos degradados de las proteínas internas del virus. Debido a que la célula T puede reconocer mi núsculas cantidades de antígeno (sólo unos cuantos centenares de moléculas), únicamente una pequeña fracción de los fragmentos generados a partir de las proteínas víricas llegan a alcanzar la superficie celular, donde atraen y son ataca das por las célula T citotóxicas. Sin embargo, el misterio no ha sido desvelado to davía. Se sabe que casi todas las proteínas de una célula se degradan continua mente (Capítulo 5), por lo que no resulta difícil comprender que en una célula infectada se producen fragmentos peptídicos de proteínas víricas internas. Al igual que otras proteínas celulares, las proteínas víricas son sintetizadas por los ribosomas citosólicos y, como se explicó en el Capítulo 12, se requieren m eca nismos especiales para que estas proteínas dejen el citosol, atravesando una membrana, hacia el interior de algún otro compartimiento. Generalmente las proteínas destinadas a la superficie celular empiezan su trayecto pasando desde el citosol hacia la luz del retículo endoplasmático (ER) (Figura 23-50). El rom pe cabezas de cóm o los fragmentos de las proteínas víricas alcanzan la superficie celular se solucionó con el descubrimiento de un sistema de transporte remar cable que poseen las células de los vertebrados para transportar dichos péptidos desde el citosol hasta la luz del ER. Una vez en el interior del retículo, los pépti dos pueden unirse a las moléculas MHC que se encuentran allí y de este modo pueden ser transportados con ellas hacia la superficie celular.
Los transportadores ABC codificados por MHC transfieren fragmentos peptídicos desde el citosol hasta la luz del ER33 Como se señaló en el Capítulo 5, en el citosol la degradación proteolítica se lleva a cabo principalmente por un mecanismo dependiente de ATP y de ubiquitina que actúa en los proteosomas, los cuales constituyen grandes complejos de enzi mas proteolíticas construidas a partir de subunidades proteicas muy distintas. Aunque probablem ente todos los proteosomas se encuentran capacitados para generar fragmentos peptídicos que se unirán a las moléculas MHC de clase I, se cree que algunos de ellos están especializados en este objetivo debido a que contienen dos subunidades que están codificadas por genes localizados en la re gión crom osóm ica MHC. El m ecanismo mediante el cual los péptidos se transportan desde el citosol hasta la luz del ER se descubrió a través de observaciones en células mutantes en las que las moléculas MHC de clase I no se expresan en la superficie celular sino que se degradan en el interior del ER. Los genes mutantes de dichas células pro porcionaron las subunidades para codificar una proteína perteneciente a la fa milia de los transportadores ABC, que estudiamos en el Capítulo 11. Esta proteí na transportadora se localiza en la membrana del ER y utiliza la energía de hidrólisis del ATP para bom bear péptidos desde el citosol hacia la luz del ER. Los genes que codifican estas dos subunidades están en la región cromosómica MHC, y si algunos de estos genes es inactivado por una mutación, las células son incapaces de suministrar péptidos a las moléculas MHC de clase I. El hecho de que en estas células mutantes las moléculas MHC de clase I sean degradadas en el ER sugiere que normalmente para que las moléculas MHC se plieguen y/o en samblen de forma apropiada, han de unirse a péptidos. En células no infectadas por virus los fragmentos peptídicos provienen de las proteínas citosólicas y nu cleares normales que son degradadas en el proceso de reciclaje normal de proteí nas; dichos péptidos se transportan a la superficie celular por moléculas MHC pero no son antigénicos debido a que las células T citotóxicas que deberían re conocerlos han sido eliminadas o inactivadas durante el desarrollo de la célula T, tal como veremos más adelante. En la Figura 23-51 se muestra un esquema
132 4
Capítulo 23 : El sistema inmunitario
fragm ento peptídico
retículo endoplasm ático
cadena polipeptídica MHC de clase I Figura 23-50 El problema del péptido transportador. ¿Cómo pasan los fragmentos peptídicos fabricados en el citosol hacia la luz del ER, donde se fabrican las moléculas MHC de clase I? Se requiere un proceso especial de transporte.
célula T citotóxica RNA vírico cubierta del virus
célula diana
ENDOCITOSIS Y ENTRADA ALENDO SOM A
ensam blaje de una m olécula MHC de clase I con un péptido de unión
endosoma endosoma
1
proteína vírica interna
FUSIÓN DEL VIRUS CON LA MEMBRANA DEL ENDOSOMA Y SALIDA DEL RNA VÍRICO HACIA EL CITOSOL
REPLICACIÓN Y TRADUCCIÓN DEL RNA VÍRICO proteína vírica interna
PROTEOLIS1S DE ALGUNAS MOLÉCULAS DE PROTEÍNA VÍRICA POR LOS PROTEOSOMAS
cadena a de la MHC de clase 1 \
P2 -m icroglobulina
A
RECONOCIMIENTO POR UNA CÉLULA T CITOTÓXICA TRANSPORTE DE UNA MOLÉCULA MHC DE CLASE I CON EL PÉPTIDO DE UNIÓN A TRAVÉS DEL GOLGI HASTA LA SUPERFICIE CELULAR
LA UNIÓN DEL PÉPTIDO A LA CADENA a ESTABILIZA EL ENSAMBLAJE DE LA CADENA a CON LA fc-MICROGLOBULINA; EL COMPLEJO ES TRANSPORTADO HASTA EL GOLGI
transportador ABC
TRANSPORTE DEL PÉPTIDO HACIA LA LUZ DEL ER
general de cómo se procesan las proteínas víricas para su presentación a las cé lulas T citotóxicas. Cuando se activan las células T por un antígeno, segregan varias moléculas señalizadoras, incluido el interferón- 7 , que intensifica notablemente las res puestas antivíricas. El interferón-y induce la expresión de muchos genes de la re gión crom osóm ica MHC, incluyendo los que codifican las proteínas MHC de clase I (y de clase II), las dos subunidades de los proteosomas, y las dos subunidades de la bom ba peptídica localizada en el ER. Así, toda la maquinaria que se requiere para la presentación del antígeno vírico a las células T citotóxicas entra en acción de forma coordinada mediante el interferón-y, creando una retroalimentación positiva que amplifica la respuesta inmunitaria y culmina con la muerte de la célula infectada.
Las células T citotóxicas inducen a las células diana infectadas a destruirse a sí m ism as34 Cuando una célula citotóxica ha reconocido un péptido vírico unido a una m olé cula MHC de clase I en la superficie de una célula diana, su trabajo consiste en destruir a la célula antes de que el virus que da lugar al péptido pueda producir nuevas partículas víricas que puedan salir de la célula infectada. Si se marca una célula T citotóxica con anticuerpos anti-tubulina, en el momento de destruir su célula diana, se observa que su centrosoma se orienta hacia el punto de contacto con la célula diana (Figura 23-52). Por otro lado, el mareaje con anticuerpos muestra que en el córtex de la célula T en el lugar de contacto se concentra talina, una proteína que contribuye a unir los receptores de la superficie celular con los filamentos corticales de actina. Se cree que la agregación de receptores de la célula en el lugar de contacto conduce a una alteración local, dependiente de talina, de los filamentos de actina del córtex celular; entonces, un mecanismo de pendiente de microtúbulos desplaza el centrosoma y el complejo de Golgi aso ciado hacia el lugar de contacto, enfocando la maquinaria de destrucción sobre la célula diana. Se ha observado una polarización similar del citoesqueleto cuan do una célula T colaboradora interactúa funcionalmente con una célula diana. El mecanismo por el cual las células T citotóxicas destruyen sus células dia na no se conoce con certeza. Al parecer, utilizan como mínimo dos estrategias,
Las células T citotóxicas
Figura 23-51 Procesamiento de una proteína vírica para presentarla a las células T citotóxicas. Una célula T citotóxica destruirá a una célula infectada por un virus cuando reconozca fragmentos de una proteína extraña unida a moléculas MHC de clase I en la superficie de la célula infectada. Aunque no todos los virus entran en la célula por la vía que utiliza este virus de RNA recubierto, los fragmentos de las proteínas víricas internas siempre siguen la vía representada en la figura. Únicam ente se degrada una pequeña proporción de proteínas víricas sintetizadas en el citosol, pero es una cantidad suficiente para atraer y sufrir el ataque de una célula T citotóxica.
1 325
(O
que al parecer actúan induciendo a la célula diana a llevar a cabo la muerte celu lar programada (también denominada apoptosis, véase pág. 1257). En una de es tas estrategias, la unión a una célula diana estimula en dichas células T citotóxicas la liberación de una proteína formadora de poros denominada perforina que es homologa al com ponente C9 del complemento y polimeriza en la célula diana de la mem brana plasmática formando cadenas transmembrana. La perfo rina se alm acena en vesículas secretoras y se libera por exocitosis en el punto de contacto con la célula diana. Las vesículas secretoras también contienen serina proteasas y otras proteínas, que se cree que juegan algún papel en la destrucción de la célula diana, quizás entrando a la célula diana por los canales de perforina y induciendo la muerte celular programada. Por el contrario, la segunda estrate gia implica la activación de un receptor de la célula T citotóxica en la superficie de la célula diana, lo cual señaliza la célula diana para llevar a cabo la muerte ce lular programada.
Resumen Las células T citotóxicas destruyen directamente las células diana infectadas que exponen fragmentos de proteínas microbianas en su superficie. Algunas de las pro teínas microbianas que se sintetizan en el citosol de la célula diana son degradadas por los proteosomas, y algunos de losfragmentos peptídicos resultantes son bombea dos por un transportador ABC hacia el lumen del ER, donde se unen a las moléculas MHC de clase I. A continuación, los complejos peptídicos-MHC son transportados a la superficie de la célula diana, donde son reconocidos por células T citotóxicas. Se cree que dichas células destruyen las células diana infectadas induciéndolas a lle var a cabo la muerte celular programada.
Células T colaboradoras y activación de las células T35 A diferencia de las células T citotóxicas, las células T colaboradoras no actúan directamente destruyendo células infectadas o eliminando microorganismos, sino estimulando a los macrófagos para que resulten más efectivos en la des trucción de los patógenos, y colaborando con otros tipos de linfocitos en su res puesta frente al antígeno. La importancia decisiva de las células T colaboradoras
132 6
Capítulo 2 3 : El sistema inmunitario
[________________
10 |.irn
Figura 23-52 Células T citotóxicas durante el proceso de destrucción de células diana en cultivo. Las células se observan por microscopía electrónica en (A) y (B) y por microscopía de inmunofluorescencia tras la tinción con anticuerpos anti-tubulina en (C). Las células T citotóxicas se obtuvieron de ratones inmunizados con las células diana, que son células tumorales extrañas. En (A) y (C) se muestran células T uniéndose a la célula diana y en (B) después de haber destruido la célula diana. Al contrario de lo que ocurre en una placa de cultivo, en un animal la célula diana destruida debería ser fagocitada por las células vecinas en lugar de desintegrarse de la forma que aquí se indica. Obsérvese que en la célula T, el centrosom a y los microtúbulos que irradian de él están orientados hacia el punto de contacto con la célula diana (C). (A y B, de D. Zagury, J. Bernard, N. Thierness, M. Feldman y G. Berke, Eur. J. Im m unol. 5:818-822, 1975; C, reproducido de B. Geiger, D. Rosen y G. Berke,/. Cell. Biol. 95:137-143, 1982, con permiso de copyright de The Rockefeller University Press.)
en la inmunidad se ha puesto claramente de manifiesto de una forma dramática por la devastadora epidemia del síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA). La enfermedad está causada por un retrovirus (virus de la inmunodeficiencia humana, HIV, de Human Immunodeficiency Virus) que reduce el núme ro de células T colaboradoras por un mecanismo desconocido, dañando así el sistema inmunitario y haciendo al paciente susceptible de contraer una infec ción por microorganismos que normalmente no son peligrosos. Como resultado de ello, la mayoría de los pacientes de SIDA mueren a causa de una infección al cabo de varios años del inicio de los síntomas. En esta sección estudiamos cómo las moléculas MHC de clase II de las célu las presentadoras de antígeno adquieren fragmentos peptídicos de las proteínas captadas por endocitosis y los presentan a las células T colaboradoras. Más tarde discutimos la multiplicidad de señales que se requiere para activar las células T colaboradoras y cómo dichas células, una vez activadas, contribuyen a activar a las células B y a los macrófagos.
Las células T colaboradoras reconocen fragmentos de proteínas antigénicas extrañas endocitadas, asociadas con proteínas MHC de clase II36 Antes de que las células T colaboradoras puedan ayudar a otros linfocitos en la respuesta contra el antígeno, primero han de activarse a sí mismas. Esta activa ción tiene lugar cuando las células T colaboradoras reconocen un antígeno uni do a proteínas MHC de clase II en la superficie de células presentadoras de antí geno especializadas, que se encuentran en muchos tejidos. Estudiaremos estas células con detalle más adelante. Como en el caso de los antígenos víricos presentados a las células T citotóxi cas, los antígenos presentados a las células T colaboradoras por las células pre sentadoras de antígeno son fragmentos de degradación de la proteína extraña, que se unen a las moléculas MHC de clase II exactamente de la misma manera que los péptidos derivados de virus se unen a las moléculas MHC de clase I. Pero tanto el origen de los fragmentos peptídicos presentados como la vía que siguen para encontrar las moléculas MHC, son diferentes de lo que sucede con los frag mentos peptídicos presentados por las moléculas MHC de clase I a las células T citotóxicas. En lugar de obtenerse a partir de proteínas extrañas sintetizadas en el interior de la célula diana, los péptidos presentados a las células T colaboradoras se obtienen a partir de microorganismos extracelulares o de sus productos, que han sido ingeridos por las células presentadoras de antígeno y degradados en el entorno acídico de los endosomas. Estos péptidos no tienen que ser bombeados a través de la membrana porque no se originan en el citosol; se han generado en un compartimiento que es topológicamente equivalente al espacio extracelular. Nunca penetran en la luz del ER, donde se sintetizan y ensamblan las moléculas MHC de clase II, sino que se unen a los heterodímeros de clase II pre-ensamblados en un compartimiento endosómico tardío. Una vez se ha unido el péptido, la molécula MHC de clase II altera su conformación atrapando al péptido en el sur co de unión para su presentación a la superficie de las células T colaboradoras. Para que la presentación de péptidos derivados de las proteínas extrañas ex tracelulares sea efectiva, las moléculas MHC de clase II recién sintetizadas no han de unirse prematuramente con péptidos derivados de proteínas sintetizadas de forma endógena en el lumen del ER. Para que no se produzca esta unión pre matura, un polipéptido no polimórfico, denominado la cadena invariable, actúa por lo menos de dos formas. Primero se asocia con heterodímeros MHC de clase II recién sintetizados en el ER de tal forma que impide que se unan a otros pépti dos en la luz del ER. Segundo, dirige a las moléculas MHC de clase II desde la red trans del Golgi al compartimiento endosomal, donde la cadena invariable se li bera por proteolisis, permitiendo a las moléculas MHC de clase II unirse a los fragmentos peptídicos derivados de las proteínas captadas por endocitosis (Fi gura 23-53). De este modo las diferencias funcionales entre las moléculas MHC
Células T colaboradoras y activación de las células T
1327
célula T colaboradora célula presentadora de antígeno
antígeno proteico plegado ENDOCITOSIS Y ENTRADA EN ELENDOSOMA
RECONOCIMIENTO POR UNA CÉLULA T COLABORADORA LIBERACIÓN DEL COMPLEJO PÉPTIDO-MHC DE CLASE II A LA MEMBRANA PLASMÁTICA PARA SU RECONOCIMIENTO POR UNA CÉLULA T \ COLABORADORA
PROTEOLISIS LIM ITADA DEL ANTÍGENO PROTEICO + PROTEOLISIS DE LA CADENA INVARIABLE + UNIÓN DEL PÉPTIDO DERIVADO DEL ANTÍGENO A LA PROTEÍNA MHC LA CADENA INVARIABLE DIRIGE LA PROTEÍNA LIBERACION DE LOS PEPTIDOS MHC DE CLASE II HACIA DE CADENA INVARIABLE Y DE " ELENDOSOMA TARDÍO ALGUNOS PÉPTIDOS DERIVADOS com plejo DEL ANTÍGENO AL LISOSOMA de Golgi PARA SU POSTERIOR /, DEGRADACIÓN cadena invariable
red trans del Golgi
lisosoma
de clase I y de clase II se mantienen: las primeras presentan moléculas que pro ceden del citosol, las segundas presentan moléculas que proceden del espacio extracelular. Muchas de las moléculas MHC de clase I y de clase II de la superficie celular de una célula diana poseen péptidos derivados de las propias proteínas en el sur co de unión -para las moléculas de clase I, fragmentos de proteínas citosólicas y nucleares degradadas y para las moléculas de clase II, fragmentos degradados de membrana y proteínas séricas que pasan a través del sistema endosoma-lisosoma. Sólo una pequeña fracción de las moléculas MHC de clase II de la superficie de una célula presentadora de antígeno estarán unidas a péptidos. Sin embargo, esto es suficiente para iniciar una respuesta inmunitaria, debido a que sólo unos cuantos centenares de dichas moléculas son suficientes para activar una célula T colaboradora, como unos cuantos centenares de complejos peptídicos MHC de clase I de una célula diana son suficientes para activar de una célula T citotóxica.
Las células T colaboradoras se activan por las células presentadoras de antígeno37 Al igual que para que una célula B pueda proliferar y diferenciarse en una célula secretora de anticuerpo y pueda funcionar, primero ha de ser activada, una célu la T ha de ser activada para proliferar y diferenciarse antes de que pueda destruir a una célula diana infectada o colaborar con un macròfago o con una célula B. Generalmente la activación inicial de una célula T tiene lugar cuando reconoce a un péptido extraño unido a una molécula MHC de la superficie celular de una célula diana apropiada. Para una célula T colaboradora la diana adecuada es una célula presentadora de antígeno. Las células presentadoras de antígeno derivan de la médula ósea y com prenden un grupo heterogéneo de células, en el que se incluyen células dendríticas con interdigitaciones en los órganos linfoides, células de Langerhans en la piel, así como las células B y los macrófagos que a continuación serán las diana de la colaboración de las células T. lunto con las células epiteliales del timo, que tienen un papel especial en el desarrollo de la célula T (se estudiará más adelan te), y las células activadas de algunos mamíferos, estas células presentadoras de antígeno especializadas son los únicos tipos celulares que normalmente expresan las moléculas MHC de clase II (véase Tabla 23-2). Además de las moléculas MHC
132 8
Capítulo 23 : El sistema inmunitario
Figura 23-53 Procesamiento de un antígeno proteico extracelular para su presentación a una célula T colaboradora. Una visión actual de cómo se forman los complejos péptido-MHC de clase II en los endosomas y se liberan a la superficie de una célula presentadora de antígeno.
de clase II, las células presentadoras de antígeno también expresan una segunda molécula de superficie celular, llamada B7, que juega un papel crucial participan do en la activación de las células T, tal como veremos más adelante.
El receptor de una célula T form a parte de un gran com plejo de señalización en la m em brana plasm ática38 La activación de una célula T citotóxica o colaboradora constituye un com plica do proceso que todavía no se comprende del todo. El heterodímero receptor de la célula T reconoce péptidos extraños unidos a moléculas MHC de la superficie de la célula diana. Como en el caso de las células B, el receptor se encuentra aso ciado a un conjunto de cadenas polipeptídicas transmembrana invariables (de nominado el com plejo CD3) que transduce el proceso de unión extracelular a señales de activación intracelular. Se cree que el complejo CD3 activa uno o más miembros de la familia Src tirosina quinasas, incluyendo la proteína Fyn, que fosforilan varias proteínas celulares, incluidos los componentes del propio CD3 y la enzima fosfolipasa C-y, la cual activa la vía de señalización de fosfolípidos de inositol descrita en el Capítulo 15. En la Figura 23-54 se comparan los receptores de las células T y B y sus cadenas polipeptídicas asociadas. La activación de las células T no se produce únicamente por la acción de los receptores de la células T y el complejo CD3. También juegan papeles importan tes una diversidad de correceptores. Ya hemos visto los correceptores CD4 y CD 8 y también se han definido sus asociados Lck quinasa y algunos otros. En el proceso de activación de la célula T parece que dichos receptores y correcepto res, así como sus asociados, las tirosina quinasas similares a Src, se ensamblan formando un gran complejo de señalización en la membrana plasmática de la célula T. Sin embargo, incluso este gran complejo de señalización es insuficiente para activar por sí mismo a la célula T colaboradora: se requiere otra vía de seña lización independiente.
Para activar la célula T colaboradora se requieren dos señales simultáneas39 Para activar la célula T colaboradora, una célula presentadora de antígeno ha de proporcionar como mínimo dos señales. Ya hemos visto la señal 1: la suministra un péptido extraño unido a una molécula MHC de clase II de la superficie de la cé lula presentadora, que activa el complejo receptor de la célula T ilustrado en la Fi gura 23-54A. Dependiendo del tipo de célula T colaboradora (como veremos más adelante), la señal 2 la suministra tanto una señal química segregada, como la interleuquina-1 (IL-1), o bien la molécula señalizadora B7 unida a la membrana plas mática de la superficie de la célula presentadora de antígeno. B7 es reconocida por una proteína correceptora denominada CD28, que se encuentra en la superficie de la célula T colaboradora y es miembro de la superfamilia de Ig. Si las células T cola boradoras reciben ambos tipos de señales, se activan para proliferar y segregar una gran variedad de interleuquinas. Por el contrario, si reciben la señal 1 sin la señal 2, se alteran de tal forma que ya no pueden ser activadas aunque reciban ambas se-
Figura 23-54 Comparación entre los receptores del antígeno de células T y los de células B. En ambos casos los receptores (negro) se asocian con cadenas polipeptídicas transm embrana invariables [verde) que actúan como transductores de señal. Las cadenas invariables asociadas con el receptor de la célula T forman el complejo CD3, mientras que los que se asocian con el receptor de la célula B se denominan Ig-a, Ig-(3 e Ig-y. En ambos casos por lo menos una de las cadenas invariables se une a una tirosina quinasa similar a Src (rojo). Todas las cadenas que se muestran, excepto las cadenas CD3-£ y las quinasas similares a Src, presentan dominios extracelulares similares a Ig y, por tanto, son miembros de la superfamilia Ig.
Células T colaboradoras y activación de las células T
(A) com plejo receptor de la célula T
proteína Fyn (B) com plejo receptor de la célula B receptor de la célula B (Ig)
Lyn 1329
S E Ñ A L(1 ACTIVACION SE Ñ A L(2
células presentadoras de antígeno SEÑAL INACTIVACION
Figura 23-55 Se requieren dos señales para la activación de la célula T colaboradora. La señal 2 puede ser proporcionada tanto por una señal segregada, como la interleuquina-1 (IL-1) o por una proteína unida a membrana de la superficie de la célula presentadora de antígeno, como la proteina B7. La señal 1 sin la señal 2 puede inactivar la célula T. Las proteínas accesorias asociadas con el receptor de la célula T (ilustrado en la Figura 23-54A) que se requieren para generar dicha señal 1 no se muestran en la figura.
ñales (Figura 23-55). Se ha sugerido que éste puede ser el mecanismo por el que las células T se vuelven tolerantes, tal como estudiaremos más tarde. Cuando una célula T colaboradora o citotóxica ha sido estimulada por un an tígeno, son necesarias otras proteínas accesorias de su superficie para aumentar la fuerza de unión de la célula T a la célula diana. Por ejemplo, en el Capítulo 19 vi mos que la estimulación de una célula T activa a la pro teína LFA-1 asociada a la función linfocitaria, un miembro de la familia de las proteínas de adhesión celular de las integrinas, de forma que LFA-1 puede unirse a su ligando de la célula diana; el ligando se denomina molécula 1 de adhesión intercelular (ICAM-1, de Intercellu lar Adhesion Molecule) y constituye un miembro de la superfamilia de las Ig. En la Tabla 23-3 se resumen algunos de los correceptores y otras proteínas accesorias de la superficie de las células T.
Tabla 23-3 Algunas proteínas accesorias de la superfìcie de las células T Peso molecular Proteína* aproximado CD3
CD4
cadena y = 25 000 cadena 8 = 20 000 cadena e = 20 000 cadena £ = 16 000 55 000
Super familia Ig Ig Ig Ig
Se expresa en
Ligando en la célula diana
ayuda a transmitir la señal entre el complejo MHC-antígeno unido a los receptores de la célula T
todas las células T células T colaboradoras
MHC de clase II
CD8
70 000 (homodímero o heterodímero)
Ig
células T citotóxicas
MHC de clase I
CD28
80 000 (homodímero)
Ig
B7
LFA-1
cadena a, = 190 000 cadena b 2= 95 000
muchas células T citotóxicas y colaboradoras la mayoría de leucocitos, incluyendo las células T
integrina
Funciones
ICAM-1
estimula la unión entre las células presentadoras de antígeno y las células B; señaliza las células T favorece la adhesión entre las células diana infectadas; señaliza las células T proporciona la señal 2 a algunas células T estimula la adhesión célula-célula
* CD significa agrupaciones de diferenciación (de cluster o f differentiation), ya que cada una de las proteínas CD fue definida originalmente como un “antígeno de diferenciación” de célula T reconocida por múltiples anticuerpos monoclonales. Su identificación fue posible gracias a estudios de colaboración a gran escala mediante los cuales se generaron, en muchos laboratorios, cientos de estos anticuerpos, fueron com parados entre sí y se encontró que consistían en relativamente pocos grupos (o “agrupaciones”), cada uno de los cuales reconocía una única proteína de la superficie celular.
133 0
Capítulo 23 : El sistema inmunitario
Las células T colaboradoras, una vez activadas, se estimulan a sí mismas y a otras células T para proliferar mediante la secreción de interleuquina-2 40 La acción combinada de las señales 1 y 2 provoca la proliferación de las células T colaboradoras mediante un curioso mecanismo indirecto. Dicho mecanismo provoca en las células T la estimulación de su propia proliferación por secreción simultánea de un factor de crecimiento denominado interleuquina-2 (1L-2) y la síntesis de receptores de superficie celular que se unen a él. La unión de IL-2 a estos receptores estimula la proliferación de la célula T. Mediante este mecanis mo autocrino, las células T colaboradoras pueden continuar proliferando tras haber dejado la superficie de la célula presentadora de antígeno (Figura 23-56). La célula T colaboradora también puede estimular la proliferación de cualquier otra célula T, incluyendo las células T citotóxicas, que primero haya sido induci da a expresar receptores de IL-2. Sin embargo, debido a que la expresión de re ceptores de IL-2 es estrictamente dependiente de la estimulación por antígeno, IL-2 sólo provoca la proliferación de aquellas células T que han reaccionado con su antígeno específico. Cuando se descubrieron los requerimientos necesarios para la proliferación de las células T, fue posible producir líneas de células T específicas de antígeno que proliferan indefinidamente en cultivo, mediante la administración de IL-2 y la estimulación periódica con antígeno para mantener la expresión de recepto res de IL-2. Entonces se pueden aislar células de estos cultivos y generar clones de células T. Estos clones han tenido una importancia crítica en el estudio de las células T. Junto con los hibridomas de células T (que son análogos a los hibridomas de células B secretoras de anticuerpos monoclonales mencionados ante riormente y que se producen por fusión de células T específicas de un antígeno con una célula T de una línea tumoral), los clones de células T posibilitan el ais lamiento de los receptores de células T y de sus genes. También han sido am pliamente utilizados para estudiar los mecanismos de activación de las células T y del papel de las células T colaboradoras en la estimulación de las respuestas de otras células, como las células B y los macrófagos.
Para responder ante un antígeno, la mayoría de las células B necesitan la participación de las células T colaboradoras41 El papel de las células T colaboradoras en las respuestas de anticuerpos de las células B se descubrió por primera vez a mediados de los años 1960, a partir de experimentos en los que a ratones irradiados se les inyectaban células del timo o de la médula ósea con un antígeno. Los ratones que habían recibido sólo células de médula ósea o células de timo eran incapaces de producir anticuerpos; pero si se inyectaba una mezcla de células de timo y de médula ósea, producían gran des cantidades de anticuerpos. Más tarde se mostró que el timo suministra célu-
Figura 23-56 Estimulación de la proliferación de la célula T por IL-2. Las señales 1 y 2 activan a la célula T colaboradora para
célula presentadora de antígeno
receptor de IL-2
L th
PROLIFERACION fra g m e n to / SEÑAL del antígeno
célula T colaboradora en reposo
célula T colaboradora activada
Células T colaboradoras y activación de las células T
/
producir receptores de IL-2 y segregar IL-2. La unión de IL-2 a sus receptores estimula el crecim iento y la división de la célula. Cuando se elimina el antígeno, la célula T detiene temporalm ente la producción de IL-2 y de receptores de IL-2, de tal manera que se detiene su proliferación. Veremos más adelante que algunas células T colaboradoras no producen IL-2; su proliferación, al igual que la de las células T citotóxicas, se estimula por IL-2 fabricada por las células T colaboradoras cercanas.
1331
las T, mientras que la médula ósea suministra células B. El uso de un marcador específico para distinguir entre las células T y las células B inyectadas mostró que las células secretoras de anticuerpos eran sólo las células B, lo cual llevó a la conclusión de que las células T debían colaborar con las células B en la respues ta frente al antígeno. Sin embargo, existen algunos antígenos, entre los que se cuentan muchos polisacáridos bacterianos, que pueden estimular la proliferación y diferencia ción en células secretoras de anticuerpos sin la ayuda de las células T. Con fre cuencia estos antígenos independientes de células T son grandes polímeros con determinantes antigénicos idénticos repetidos (véase Figura 23-25B); su unión a múltiples puntos de las moléculas de anticuerpo unidas a la membrana, que en las células B actúan com o receptores para los antígenos, puede generar una se ñal suficientem ente intensa para activar directamente las células B; sin embar go, sólo algunas células B pueden activarse de esta forma. Debido a que estos antígenos no activan a las células T colaboradoras, tampoco inducen las células B de memoria ni provocan el cambio de clase de los anticuerpos (ambos proce sos requieren la colaboración de las células T), por lo que provocan principal mente la producción de anticuerpos IgM de baja afinidad.
La activación de las células B por células T colaboradoras se produce tanto por señales unidas a la m em brana como por señales segregadas42 Mientras que las células presentadoras de antígeno, como las células dendríticas y los macrófagos, son omnívoras e ingieren y presentan antígenos inespecíficamente, generalmente una célula B sólo presenta un antígeno, que reconoce espe cíficamente. En una respuesta primaria de anticuerpos las células T colaborado ras normalmente se activan por unión a un antígeno extraño ligado a una proteína MHC de clase II de la superficie de una célula presentadora de antígeno de tipo omnívoro -com o la célula dendrítica con interdigitaciones en un órgano linfoide secundario. Una vez activada, la célula T colaboradora puede colaborar en la activación de una célula B que expone específicamente en su superficie el mismo complejo de antígeno extraño y proteínas MHC de clase II. La exposición del antígeno en la superficie de la célula B refleja la selectividad con que capta las moléculas extrañas del líquido extracelular. Dichas moléculas se seleccionan por su unión a los anticuerpos ligados a membrana específicos (receptores antigéni cos) de la superficie de la célula B y se ingieren por endocitosis mediada por re ceptores; más tarde son degradados y reciclados hacia la superficie celular en forma de péptidos unidos a proteínas MHC de clase II. Así, la célula T colabora dora activa las células que producen anticuerpos ligados a membrana que reco nocen específicam ente al antígeno que ha activado inicialmente a la célula T. En las respuestas secundarias de anticuerpos, las propias células B de memoria pue den actuar com o células presentadoras de antígeno y activar a las células T cola boradoras, de forma que sigan siendo las siguientes dianas de las células T colabo radoras. Las acciones mutuas de refuerzo entre las células T y las células B provocan una respuesta inmunitaria que es a la vez intensa y altamente selectiva. Cuando una célula T colaboradora se ha activado y ha entrado en contacto con una célula B, dicho contacto inicia una reordenación del citoplasma de la célula colaboradora que orienta el centrosoma y el complejo de Golgi hacia la célula B, tal com o se describió para una célula T citotóxica al contactar con su célula diana (véase Figura 23-52). Sin embargo, se cree que en este caso la orien tación capacita a la célula T colaboradora a dirigir las moléculas señalizadoras unidas a mem brana y segregadas hacia la superficie de la célula B. La molécula señalizadora unida a m em brana es una proteína transmembrana de la superfi cie celular denominada ligando CD40, que se expresa en la superficie de las cé lulas T colaboradoras activadas, pero no en reposo. Se reorganiza mediante la proteína transm em brana CD40 de la superficie de la célula B. Para que las célu las T colaboradoras activen las células B para proliferar y madurar a células de
133 2
Capítulo 23 : El sistema inmunitario
CÉLULA T COLABORADORA
CÉLULA B
célula presentadora de antígeno (o célula B)
célula T colaboradora
Figura 23-57 Comparación entre las señales requeridas para activar la célula B y la célula T colaboradora. Obsérvese que la señal 2 puede proporcionarla tanto una molécula señalizadora segregada (una interleuquina) como una interacción en forma de contacto intercelular.
memoria y secretoras de anticuerpos se requiere la interacción entre el ligando CD40 y CD40. Esta interacción es crítica para la colaboración de la célula T: aquellos individuos que pierden el ligando CD40 debido a una mutación en el gen que codifica la proteína, únicamente pueden producir anticuerpos IgM y son inmunodeficientes agudos: son susceptibles de contraer las mismas infec ciones que afectan a los pacientes de SIDA, en los que las células T colaborado ras han sido destruidas. Las señales segregadas por las células T proporcionan una colaboración adi cional activando a las células B para proliferar y madurar y, en algunos casos, cambiando la clase de anticuerpo que producen. La interleuquina-4 (IL-4) constituye este tipo de señal. Estimula la proliferación y la maduración de las cé lulas B y estimula el cambio a la producción de anticuerpos IgE e IgGl: si en un ratón se inactiva el gen IL-4 mediante recom binación genética vectorial, el ratón es incapaz de producir IgE y fabrica muy poca IgG l. Así, la mayoría de células B, al igual que las células T, requieren múltiples señales de activación, una de ellas proporcionada por la unión del antígeno a las moléculas Ig unidas a mem brana y las otras proporcionadas por las células T co laboradoras; como ocurre en el caso de las células T, si una célula B recibe sola mente la primera señal, puede ser inactivada funcionalmente. En la Figura 23-57 se comparan las señales que se requieren para la activación de las células T cola boradoras y las células B.
Algunas células T colaboradoras activan las células T citotóxicas y los macrófagos mediante la secreción de interleuquinas43 Existen por lo menos dos subclases funcionalmente distintas de células T cola boradoras, que pueden distinguirse por las interleuquinas que segregan. Las cé lulas Th1 segregan IL-2 e interferón-y, y están implicadas principalmente en la colaboración con las células T citotóxicas y los macrófagos. Las células TH2 se gregan IL-4 e IL-5 y están implicadas en la colaboración con las células B y los eosinófilos. Vimos anteriormente que la IL-2 segregada por las células T colabo radoras activadas puede estimular a las células T citotóxicas activadas (así como a otras células T colaboradoras) a proliferar. Las células T estimuladas también segregan otras interleuquinas, como el interferón-y, que contribuye a la activa ción de las células T citotóxicas para que destruyan células infectadas diana y aumenta la eficiencia de los macrófagos para la fagocitosis y para la destrucción de los microorganismos invasores. La capacidad de las células T de atraer y acti var macrófagos es especialmente importante en la defensa de infecciones por
Células T colaboradoras y activación de las células T
1333
Tabla 23-4 Propiedades de algunas interleuquinas* Interleuquina (IL)
Peso molecular aproximado
IL-1
Fuente
Diana
Acción
15 000
células presentadoras de antígeno
células T colaboradoras
ayuda en la activación
IL-2
15 000
algunas células T colaboradoras
todas las células T y células B activadas
estimula la proliferación
IL-3
25 000
algunas células T colaboradoras
varias células hematopoyéticas
estimula la proliferación
IL-4
20 000
algunas células T colaboradoras
células B
estimula la proliferación, maduración y clasificación en IgE e IgGl
IL-5
20 000
las mismas células T colaboradoras que producen IL-4
células B, eosinófilos
estimula la proliferación y maduración
IL-6
25 000
algunas células T colaboradoras y macrófagos
células B activadas, células T
estimula la maduración de las células B a células secretoras de Ig; colabora en la activación de las células T
interfe rón-y
25 000 (dímero)
las mismas células T colaboradoras que producen IL-2
células B, macrófagos, células endoteliales
activa diversos genes MHC y macrófagos
* Las interleuquinas son péptidos y proteínas secretados que principalmente median interacciones locales entre células blancas de la sangre (leucocitos) pero que no unen antígeno; las que son secretadas por linfocitos también se denominan linfoquinas. Se conoce la secuencia de aminoácidos de todas las proteínas listadas. Las fuentes, células diana y las funciones listadas son las más relevantes para el sistema inmunitario, pero la mayoría de las interleuquinas tienen muchas más fuentes, dianas y acciones de las que se muestran aquí. Éste es el caso de IL-1 e IL-6, que también son producidas por células no sanguíneas y actúan sobre muchos tipos de células diana diferentes de las células sanguíne as; por consiguiente se denominan con más exactitud, citoquinas.
microorganismos que pueden sobrevivir a la simple fagocitosis por macrófagos no activados. La tuberculosis es una de estas infecciones. La secreción de interleuquinas desencadenada por el antígeno es el funda mento de la conocida prueba epidérmica de la tuberculina. Si se inyecta tuberculina (un extracto de la bacteria causante de la tuberculosis) en la piel de indi viduos que han sido inmunizados contra la tuberculosis o han sufrido la enfermedad, (y por consiguiente poseen las células T de memoria apropiadas) se produce en la piel una respuesta inmunitaria característica. Se inicia en el sitio de la inyección por la secreción de interleuquinas por las células T colaborado ras de memoria, que reaccionan a la tuberculina. Las interleuquinas atraen a los macrófagos (y a los linfocitos) hacia el lugar de la administración, causando de este modo la hinchazón característica de una reacción positiva a la tuberculina. Otro importante efecto del interferón-y es la inducción de la expresión de las glucoproteínas MHC de clase II en la superficie de algunas células (como las células endoteliales) que normalmente no las expresan. Esto capacita a estas cé lulas para la presentación del antígeno a las células T colaboradoras. Tal como se vio anteriormente, el interferón-y tam bién increm enta la eficiencia con que las células diana presentan el péptido vírico asociado con moléculas MHC de clase I para que sean reconocidas por las células T citotóxicas. En la Tabla 23-4 aparecen algunas de las interleuquinas segregadas por las células T colaboradoras, o por las células presentadoras de antígeno.
Resumen Las células Tcolaboradoras activan a las células By a los macrófagos. Dichas célu las son activadas a su vez cuando reconocen fragmentos peptídicos derivados de proteínas extrañas extracelulares que las células especializadas presentadoras
133 4
Capítulo 2 3 : El sistema inmunitario
de antígeno han captado por endocitosis. Las proteínas ingeridas se degradan en los endosomas y algunos de los fragmentos peptídicos resultantes se unen a las mo léculas MHC de clase II, formando complejos que son transportados a la superficie celular, donde las células T colaboradoras los reconocen. La activación de las célu las T colaboradoras requiere por los menos dos señales: la señal 1 la suministran el complejo peptídico MHC, mientras que las señal 2 la proporciona tanto la proteína B7 de la superficie de las célula presentadora del antígeno como una señal segrega da por dicha célula. Una vez activadas, las células T colaboradoras estimulan su propia proliferación mediante la secreción de interleuquina-2 y activan sus células diana mediante una combinación de moléculas unidas a membrana y moléculas señal segregadas.
Selección del repertorio de células T Las células T se desarrollan en el timo. De forma notable, más del 95% de las célu las que se fabrican mueren antes de ser capaces de madurar y migrar hacia los ór ganos linfoides periféricos. Este excedente es debido sobre todo a los estrictos procesos de selección que actúan durante el desarrollo de las células T aseguran do que únicamente sobrevivan aquellas células que tengan receptores potencial mente funcionales. En esta sección vamos a estudiar los procesos de selección positiva y negativa que colaboran en la configuración del repertorio de las células T. Ello nos conducirá a considerar por qué los individuos difieren genéticamente en su respuesta inmunitaria y por qué las moléculas MHC que presenta el antíge no a las células T presentan una variabilidad genética tan acusada.
Las células T que reconocen péptidos asociados a las moléculas MHC propias son seleccionadas positivamente durante su desarrollo en el tim o44 Hemos visto anteriormente que las células T reconocen el antígeno en asocia ción con las propias moléculas MHC pero no asociadas con moléculas MHC ex trañas, es decir, que presentan la restricción MHC. Dicha restricción refleja un proceso de selección positiva durante el desarrollo del timo, por lo cual las célu las inmaduras que sean capaces del reconocimiento de péptidos extraños pre sentados por las moléculas MHC propias son seleccionadas para sobrevivir, mientras que las restantes, que no podrían ser utilizadas por el organismo, mue ren. Esta restricción MHC es una propiedad adquirida del sistema inmunitario que se pone de manifiesto cuando las células T se desarrollan en el timo. Por ejemplo, si un timo de la cepa Y es transplantado a un ratón de la cepa X que ha sido irradiado para eliminar todas sus células T maduras y al que des pués se le ha transplantado médula ósea fresca para proveerlo de células nuevas, estas células T de la cepa X se desarrollan en el timo de la cepa Y. En la mayoría de experimentos de este tipo, las células T maduras de la cepa X producidas re conocen antígenos extraños asociados con glucoproteínas MHC de la cepa Y pero no con proteínas MHC de la cepa X, lo que sugiere que el timo dicta la es pecificidad de la restricción MHC. Dado que las células T se desarrollan en el timo, se seleccionan las que puedan reconocer antígenos en asociación con los tipos de moléculas MHC expresadas, y sobreviven y proliferan. Experimentos si milares demuestran que las células epitelioides del timo son las responsables del proceso de selección positiva. La vía más directa para el estudio del proceso de selección es el seguimiento del destino de un conjunto de células T de especificidad conocida. Esto puede realizarse utilizando ratones transgénicos que expresan un par específico de ge nes de receptores de célula T, a y (3, derivados de un clon de células T de especi ficidades MHC y antigénica conocidas. Como en el caso de los genes para inmunoglobulinas en las células B, la expresión de transgenes de receptores de células T reordenados inhibe la reordenación de genes de receptores de células Selección del repertorio de células T
1335
T endógenos, asegurando la exclusión alélica, de forma que en estos ratones transgénicos una gran proporción de las células T expresa únicamente el recep tor transgénico. Así, puede ser fácilmente controlado el destino de las células T con una especificidad conocida. Este tipo de experimentos demuestran que las células T transgénicas maduran y se reparten en los tejidos linfoides periféricos tan sólo si el ratón transgénico también expresa la misma forma alélica de la m o lécula MHC tal como es reconocida por el receptor de la células T transgénica; si el ratón no expresa la molécula MHC apropiada, las células T transgénicas m ue ren en el timo. Así, tal como sugieren los experimentos de transplante de timo, la supervivencia y maduración de una célula T depende de la pugna entre su recep tor y las moléculas MHC expresadas en el timo. Formando parte de este proceso de selección positivo, las células T citotóxicas se seleccionan en función del reco nocimiento de moléculas MHC de clase I mientras que las células T colaborado ras se seleccionan en función del reconocimiento de las moléculas MHC de clase II. De esta forma, ratones obtenidos por ingeniería genética que carecen de m o léculas MHC de clase I de la superficie celular pierden específicamente células T citotóxicas, mientras que ratones que carecen de moléculas MHC de clase II ca recen específicamente de células T colaboradoras. La selección positiva deja todavía por resolver un gran problema. Si las célu las T en desarrollo con receptores que reconocen péptidos propios asociados con moléculas MHC propias maduraran en el timo y migraran hacia los tejidos linfoides periféricos, deberían causar estragos. Para evitar este desastre se re quiere un segundo proceso de selección negativa en el timo.
Las células T en desarrollo que reaccionan fuertem ente con los péptidos propios unidos a m oléculas MHC propias son eliminadas en el tim o44,45 Tal como vimos previamente, una característica fundamental del sistema inmunitario es que puede distinguir lo “propio” de lo “no propio” y normalmente no reacciona contra moléculas propias. Dicho estado de autotolerancia inmunológica se adquiere principalmente durante el desarrollo de las células T. Aunque algunas células B autorreactivas se inactivan o eliminan durante su desarrollo, parece que el principal m ecanism o para la autotolerancia es la delección en el timo del desarrollo de las células T autorreactivas -e s decir, células T cuyos re ceptores se unen fuertemente al complejo de un péptido propio unido a una molécula MHC propia. Debido a que la mayoría de células B requieren células T colaboradoras para responder frente al antígeno, la eliminación de células T co laboradoras autorreactivas también asegura que las células B autorreactivas sean inocuas. Por consiguiente, no es suficiente para el timo seleccionar a favor de las célu las T que reconocen moléculas MHC propias; debe también seleccionar contra aquellas células T que reconocen moléculas MHC propias que forman complejos con péptidos propios -e n otras palabras, para sobrevivir debe escoger sólo aque llas células T que sean capaces de reconocer moléculas MHC propias que forman complejos con péptidos extraños, aún cuando estos péptidos no se hallen pre sentes en el timo en desarrollo. Se cree que tales células T se unen débilmente en el timo a moléculas MHC propias que son transportadas por péptidos propios emparejados a los receptores de la célula T. Así puede alcanzarse el objetivo pro puesto (1) asegurando que mueran las células T que se unan fuertemente a los complejos MHC-péptidos en el timo al tiempo que (2) se facilita la supervivencia de las células que se unan débilmente y (3) se permite la muerte de aquellas célu las T que no se unan en absoluto. El proceso 2 es la selección positiva que ya he mos visto. El proceso 1 se denomina selección negativa (Figura 23-58). La prueba más convincente de la selección negativa proviene una vez más de experimentos con ratones transgénicos. Después de la introducción de trans genes de receptores de célula T que codifican un receptor que reconoce, por ejemplo, un antígeno peptídico específico masculino, en el timo y en órganos
133 6
Capítulo 2 3 : El sistema inmunitario
igura 23-5 8 Selección positiva y egativa en el timo. Sólo se
célula precursora DIVERSIFICACIÓN DE LOS RECEPTORES DE LA CÉLULA T (TCR, de "T cell receptors"!
no hay expresión de TCR
TCR que no reconocen MHC propia (o MHC propia ■péptido propio)
1CR con fuerte re< onocim iento de MHC propia (o MHC propia + péptido propio)
(0 )
•
• FUERTE POR DEFECTO
MUERTE POR DEFECTO
SELECCIÓN NEGATIVA (m uerte señalizada)
TCR con reconocim ei to débil de MHC pr )f ia (o MHC propi; + péptido propio)
SELECCIÓN POSITIVA (supervivencia señalizada) SUPERVIVENCIA y
MADURACIÓN célula muerta
T T„>
«„I
Te
l i l i
I Te
íleccionan para sobrevivir, madurar y íigrar hacia los órganos linfoides eriféricos aquellas células que tienen ?ceptores que reconocen péptidos Ktraños asociados a moléculas MHC ropias; todas las células restantes Kperimentan la muerte celular rogramada. En el transcurso del roceso de la selección positiva, las álulas T colaboradoras (TH) y las ¿lulas T citotóxicas (Tc) divergen por n mecanism o desconocido, de tal irma que las células colaboradoras apresan el correceptor CD4 pero no el D 8 y reconocen péptidos extraños sodados a moléculas MHC de lase II, mientras que las células T itotóxicas expresan CD8 pero no CD4 reconocen péptidos extraños sodados a moléculas MC de clase I 10 se muestran en la figura).
hacia los órganos linfoides periféricos
linfoides periféricos de ratones hembra se encuentran grandes cantidades de cé lulas T maduras que expresan el receptor transgénico, pero se encuentran muy pocas en los ratones macho, en los que las células mueren en el timo antes de te ner oportunidad de madurar. Al igual que la selección positiva, la selección n e gativa requiere la interacción de un receptor de célula T y un correceptor CD4 o CD 8 con una molécula MHC apropiada. Sin embargo, a diferencia de la selec ción positiva que tiene lugar principalmente en la superficie de las células epite liales del timo, la selección negativa se produce principalmente en la superficie de otras células, como las células dendríticas o los macrófagos, que se forman en la médula ósea y migran hacia el timo. Al igual que las células epiteliales, poseen en su superficie tanto moléculas MHC de clase I como de clase II. Los mecanismos responsables de la selección positiva y negativa de las célu las T en el timo se desconocen, pero en ambos casos se cree que se halla impli cada la muerte celular programada (estudiada en los Capítulos 21 y 22). Parece que durante la selección positiva las células epiteliales del timo proporcionan señales de supervivencia para unirse débilmente a las células T, evitando la autodestrucción de las células T. En la selección negativa, por el contrario, las células derivadas de las células derivadas de la médula ósea señalizan la unión fuerte de las células T para destruirse a sí mismas (Figura 23-58). La supresión en el timo de células T autorreactivas no puede eliminar todas las células T potencialm ente autorreactivas, ya que algunas moléculas propias no se hallan presentes en el timo. Probablemente algunas de las células T con receptores que reconocen este tipo de moléculas propias son eliminadas des pués de abandonar el timo, pero las otras pueden ser funcionalmente inactivadas mediante un proceso denominado anergia clonal (para distinguirlo de la deleción clonal, en el que mueren las células autorreactivas; véase pág. 1290). Aunque el m ecanism o molecular de anergia clonal es incierto, se ha postulado que las células T reconocen péptidos propios unidos a moléculas MHC de la su perficie de células de tejidos que son incapaces de proporcionar la señal 2; como se verá más adelante, la señal 1 sin la señal 2 puede inactivar una célula T sin destruirla.
Selección del repertorio de células T
1337
Algunas formas alélicas de moléculas MHC no son efectivas en la presentación de antígenos específicos a las células T: genes de la respuesta inm unitaria {Ir)46 A diferencia de los genes MHC de clase I, que se reconocieron por primera vez por su efecto en el rechazo de injertos, los genes MHC de clase II se identificaron por primera vez por su efecto en las respuestas inmunitarias dependientes de células T a antígenos solubles específicos. Cuando se inmunizan varios animales con un antígeno sencillo, algunos de ellos producen enérgicas respuestas de pendientes de células T mientras que otros no responden en absoluto. Estudios genéticos indicaron que la capacidad de responder al antígeno estaba controla da por un único gen, denominado gen de respuesta inmunitaria (/r) (de Immune Response); a menudo, las respuestas a diferentes antígenos estaban controla das por Ir diferentes. Los genes Ir que controlan la respuesta de las células T colaboradoras frente a un antígeno mapan uno u otro de los loci MHC de clase II mientras que los que controlan la respuesta de las células T citotóxicas frente a un antígeno mapan uno u otro de los loci MHC de clase I. Estas observaciones resultaban extremadamente incomprensibles, pero una vez reconocido que las proteínas MHC juegan un papel crucial en la unión y presentación del antígeno a las células T, podrían explicarse fácilmente: un indi viduo que no responde a un antígeno sencillo (normalmente un antígeno con un solo determinante antigénico) posiblemente carece de una molécula MHC que pueda unirse a él, presentando de forma efectiva el determinante antigénico a una célula T apropiada. Esta explicación se basa en estudios realizados in vitro que mostraron que las moléculas MHC de clase II purificadas procedentes de un animal que responde inmunológicamente al antígeno pueden unir el péptido re lacionado, mientras que las procedentes de un animal que no responde, no pue den hacerlo. Sin embargo, en algunos casos parece que el responsable de la falta de res puesta genética a antígenos específicos es otro mecanismo. Es probable que al gunas com binaciones de moléculas MHC propias con péptidos extraños se pa rezcan a algunas com binaciones de moléculas MHC y péptidos propios. Debido a que las células T colaboradoras que reaccionan frente a estas combinaciones son eliminadas por selección negativa durante su desarrollo en el timo, un ani mal puede ser genéticam ente incapaz de responder a estos péptidos extraños.
El papel de las proteínas MHC en la presentación del antígeno a las células T proporciona una explicación de las reacciones de trasplante y del polimorfismo MHC47 El papel de las proteínas MHC en la unión y presentación de antígenos extraños a las células T proporciona una explicación de por qué muchas células T respon den frente a moléculas MHC extrañas, rechazando por consiguiente injertos de órganos extraños. Posiblemente, proteínas MHC extrañas con un péptido endó geno en su surco de unión al péptido constituyen complejos que pueden pare cerse a moléculas MHC propias que forman complejos con péptidos extraños. Por ejemplo, algunos clones de células T citotóxicas que reaccionan frente a un antígeno vírico en asociación con una molécula MHC de clase I propia, también reaccionan frente a una molécula MHC de clase I extraña en ausencia del antíge no vírico (Figura 23-59). La función de las proteínas MHC presentadoras de antígeno puede explicar tam bién el amplio polimorfismo de estas moléculas. En la lucha evolutiva entre los microorganismos patógenos y el sistema inmunitario de los vertebrados, los microorganismos tenderán a cam biar sus antígenos para evitar la asociación a las moléculas MHC. Cuando uno de ellos lo logre, será capaz de extenderse por una población com o una epidemia. En estas circunstancias, el escaso número de individuos que produzcan una molécula MHC nueva que pueda asociarse con un antígeno del microorganismo alterado tendrá una gran ventaja selectiva.
1338
Capítulo 23 : El sistema inmunitario
péptido extraño
molécula MHC propia
célul
péptido endógeno
Figura 23-59 Mimetismo de una molécula MHC extraña. Una molécula MHC extraña con un péptido endógeno unido al surco de unión puede parecerse a una molécula MHC propia con un péptido extraño (como un péptido vírico) unido a ella. Se cree que ésta sería la explicación de por qué tantas de nuestras células T pueden activarse mediante moléculas MHC extrañas en las reacciones de trasplante.
m olécula MHC extraña
Además, los individuos con dos alelos diferentes para cada molécula MHC (heterozigotos) tendrán mayores posibilidades de resistir la infección que los indivi duos que tengan los dos alelos idénticos en cualquier locus MHC dado, y posee rán una mayor capacidad para presentar antígenos procedentes de una amplia gama de patógenos. Así, la selección tenderá a promocionar y mantener una gran diversidad de moléculas MHC en la población. Esta hipótesis de que las enferme dades infecciosas han proporcionado la fuerza conductora para el polimorfismo MHC ha sido consolidada recientemente por las observaciones sobre individuos de África occidental que poseen un alelo específico de MHC y presentan una sus ceptibilidad reducida frente a una forma severa de malaria; mientras que el alelo raramente se encuentra en otras regiones, se encuentra en un 25% de la pobla ción de Africa occidental, donde dicha forma de malaria es generalizada. Si una mayor diversidad de MHC significa una mayor resistencia a la infec ción, ¿por qué poseemos tan pocos loci que codifican estas moléculas, y por qué no hemos desarrollado estrategias para incrementar su diversidad -m ediante maduración alternativa de RNA, por ejemplo, o mediante mecanismos de recom binación genética encaminados a diversificar los anticuerpos? Posiblemente, sea debido a que cada vez que una nueva molécula MHC se añade al repertorio, las células T que reconocen péptidos propios asociados con una nueva molécula de MHC deben eliminarse para mantener la autotolerancia. La eliminación de di chas células T debería contrarrestar la ventaja de añadir la nueva molécula MHC. Así, el número de moléculas MHC que expresamos puede representar un equili brio entre las ventajas de presentar una gran diversidad de péptidos extraños a las células T y las desventajas de restringir el conjunto de células T.
Las moléculas de reconocim iento inmunitario pertenecen a una antigua superfamilia48 La mayoría de las proteínas que median el reconocimiento célula-célula o el re conocim iento de antígenos en el sistema inmunitario contienen elementos es tructurales relacionados, lo cual sugiere que los genes que las codifican poseen una historia evolutiva común. Incluidos en esta superfamilia Ig se encuentran los anticuerpos, los receptores de las células T, las proteínas MHC, los correcepto res CD4, CD8 y CD28, la mayoría de las cadenas polipeptídicas invariables aso ciadas con los receptores de células B y T, y los varios receptores Fe de linfocitos y de otros glóbulos blancos -todos ellos contienen uno o más dominios de inmunoglobulina o con aspecto de inmunoglobulina (unidades de homología Ig). En realidad, un 40% de los aproximadamente 150 polipéptidos que han sido carac terizados de la superficie de los glóbulos blancos pertenecen a esta superfamilia. Cada uno de estos dominios con aspecto de inmunoglobulina consta de unos 70-110 aminoácidos de longitud y parece que se pliega según una estructura ca racterística con aspecto de “bocadillo” formada por dos láminas (3 antiparalelas, estabilizadas normalmente por un enlace disulfuro conservado. Muchas de estas
Selección del repertorio de células T
1 339
Figura 23-60 Algunas de las proteínas de membrana pertenecientes a la superfamilia de las inmunoglobulinas. Los dominios
enlace disulfuro
Thy-1
receptor Fe
proteína MHC de clase I
proteína MHC de clase II
receptor de célula T
inm unoglobulina
I__________________________________ generados por reagrupam iento de segmentos génicos
com plejo CD3
moléculas son dímeros u oligómeros mayores en los cuales los dominios con as pecto de inmunoglobulina de una cadena interaccionan con las de la otra (Figu ra 23-60). Normalmente, la mayoría de los aminoácidos de cada dominio con aspecto de inmunoglobulina están codificados por un exón, y parece probable que la fa milia supergénica entera evolucionara a partir de un gen codificante de un único dominio con aspecto de inmunoglobulina -sim ilar al que codifica la P2-microglobulina (véase Figura 23-45A) o la proteína Thy-1 (véase Figura 23-60)- que pueden haber participado en la mediación de las interacciones célula-célula. Existen evidencias que demuestran que este gen primordial surgió antes de que los vertebrados divergieran de sus antepasados invertebrados, hace unos 400 millones de años. Probablemente los miembros de la nueva familia surgieron por duplicación de genes y de exones; sucesos de duplicación similares a éstos dieron lugar probablemente a los segmentos génicos múltiples codificantes de los anticuerpos y de los receptores de las células T.
Resumen
El conjunto de células T se mantienen principalmente por una combinación de pro cesos de selección positiva y negativa que actúan en el timo durante el desarrollo de las células T. Dichos procesos aseguran que sólo sobrevivan y maduren las células T con receptores potencialmente útiles mientras que las otras sufren la muerte celu lar programada: las células T que sean capaces de reconocer péptidos extraños que forman complejos con moléculas MHC propias son seleccionadas positivamente, mientras que las células T que reaccionan fuertemente con péptidos propios que forman complejos con moléculas MHC propias son eliminadas. La mayoría de las proteínas implicadas en el reconocimiento intercelular y en el reconocimiento antigénico en el sistema inmunitario, incluyendo los anticuer 134 0
Capítulo 2 3 : El sistema inmunitario
de la inmunoglobulina se muestran en color gris y los dominios de unión al antígeno en azul. La superfamilia de las inmunoglobulinas también incluye muchas proteínas de superficie celular implicadas en las interacciones célulacélula fuera del sistema inmunitario, tales como la molécula de adhesión celular neural (N-CAM) estudiada en el Capítulo 19 y los receptores para diferentes factores de crecim iento estudiados en los Capítulos 15 y 17 (no se muestran en la figura).
pos, los receptores de células Ty las moléculas MHC así como los distintos correcep tores estudiados en este capítulo, pertenecen a la antigua superfamilia Ig, que se cree que ha evolucionado a partir de un gen primordial que codifica un único do minio con aspecto de inmunoglobulina.
Bibliograffa General Abbas, A.K.; Lichtman, A.H.; Pober, J.S. Cellular and Mole cular Immunology. Philadelphia: Saunders, 1991. Golub, E.S.; Green, D.R. Immunology: A Synthesis, 2nd ed. Sunderland, MA: Sinauer, 1991. Janeway, C.; Travers, P. Immunobiology: London and New York: Current Science and Garland, 1994. Kuby, J. Immunology. New York: W.H. Freeman, 1992. Paul, W.E., ed. Fundamental Immunology. New York: Raven Press, 1984. Citas 1. Gowans, J.L.; McGregor, D.D. The immunological acti vities of lymphocytes. Progr. Allergy 9:1-78,1965. 2. Greaves, M.F.; Owen, J.J.T.; Raff, M.C. T and B Lympho cytes: Origins, Properties and Roles in Immune Re sponses. Amsterdam: Excerpta Medica, 1973. 3. Cooper, M.; Lawton, A. The development of the immu ne system. Sci. Am. 231(5):59-72,1974. Ikuta, K.; Uchida, N.; Friedman, J.; Weissman, I.L. Lymphocyte development from stem cells. Annu. Rev. Immunol. 10:759-784, 1992. Owen, J.J.T. Ontogenesis of lymphocytes. In B and T Cells in Immune Recognition (F. Loor, G.E. Roelants, eds.), pp. 21-34. New York: Wiley, 1977. 4. Barclay, A.N., et al. The Leucocyte Antigens Facts Book. San Diego, CA: Academic Press, 1993. Moller, G., ed. Functional T Cell Subsets Defined by Monoclonal Antibodies. Immunol. Rev. 74,1983. Raff, M.C. Cell-surface immunology. Sci. Am. 234(5):3039,1976. Reinherz, E.L.; Schlossman, S.F. The differentiation and function of human T lymphocytes. Cell 19:821-827, 1980. 5. Ada, G.L. Antigen binding cells in tolerance and immu nity. Transplant. Rev. 5:105-129, 1970. Ada, G.L.; Nossal, G. The clonal selection theory. Sci. Am. 257(2):62-69,1987. Burnet, F.M. The Clonal Selection Theory of Acquired Immunity. Nashville, TN: Vanderbilt University Press, 1959. Jerne, N.K. The immune system. Sci. Am. 229(l):52-60, 1973. Wigzell, H. Specific fractionation of immunocompetent cells. Transplant Rev. 5:76-104, 1970. 6. Laver, W.G.; Air, G.M.; Webster, R.G.; Smith-Gill, S.J. Epitopes on protein antigens: misconceptions and realities. Cell 61:553-556,1990. Pink, J.R.L.; Askonas, B.A. Diversity of antibodies to cross-reacting nitrophenyl haptens in inbred mice. Eur. J. Immunol. 4:426-429,1974.
Bibliografía
7. Bevilacqua, M.P. Endothelial-leukocyte adhesion mol ecules. Annu. Rev. Immunol. 11:767-804, 1993. Gowans, J.L.; Knight, E.J. The route of re-circulation of lymphocytes in the rat. Proc. R. Soc. Lond. (Biol.) 159:257-282, 1964. Mackay, C.R. Homing of naive, memory and effector lymphocytes. Curr. Opin. Immunol. 5:423-427,1993. Picker, L.J.; Butcher, E.C. Physiological and molecular mechanisms of lymphocyte homing. Annu. Rev. Im munol. 10:561-591, 1992. Springer, T.A. Adhesion receptors of the immune sys tem. Nature 346:425-434,1990. 8. Gray, D. Immunological memory. Annu. Rev. Immunol. 11:49-77, 1993. Mackay, C.R. Immunological memory. Adv. Immunol. 53:217-265, 1993. Sprent, J. Lifespans of naive, memory and effector lymphocytes. Curr. Opin. Immunol. 5:433-438, 1993. Vitetta, E.S., et al. Memory B and T cells. Annu. Rev. Im munol. 9:193-217, 1991. 9. Billingham, R.E.; Brent, L.; Medawar, P.B. Quantitative studies on tissue transplantation immunity. III. Acti vely acquired tolerance. Philos. Trans. R. Soc. Lond. (Biol.) 239:357-414, 1956. Harris, D.E.; Cairns, L.; Rosen, F.S.; Borel, Y. A natural model of immunologic tolerance. Tolerance to muri ne C5 is mediated by T cells and antigen is required to maintain unresponsiveness. /. Exp. Med. 156:567584, 1982. Lindstrom, J. Immunobiology of myasthenia gravis, ex perimental autoimmune myasthenia gravis and Lambert-Eaton syndrome. Annu. Rev. Immunol. 3:109132,1985. Nossal, G.J.V. Cellular and molecular mechanisms of B lymphocyte tolerance. Adv. Immunol. 52:283-331, 1992. Owen, R.D. Immunogenetic consequence of vascular anastomoses between bovine twins. Science 102:400401,1945. Schwartz, R.H. Acquisition of immunologic self-tolerance. Cell 57:1073-1081,1989. 10. Davies, D.R.; Metzger, H. Structural basis of antibody function. Annu. Rev. Immunol. 1:87-118, 1983. Kabat, E.A. Structural Concepts in Immunology and Immunochemistry, 2nd ed. New York: Holt, Rinehart and Winston, 1976. Nisonoff, A.; Hopper, J.E.; Spring, S.B. TheAntibody Mo lecule. New York: Academic Press, 1975. 11. DeFranco, A.L. Structure and function of the B cell anti gen receptor. Annu. Rev. Cell Biol. 9:377-410, 1993. Moller, G., ed. Lymphocyte Immunoglobulin: Synthesis and Surface Representation. Transplant. Rev. 14,1973. Reth, M. Antigen receptors on B lymphocytes. Annu. Rev. Immunol. 10:97-122,1992.
1341
12. Dutton, R.W.; Mishell, R.I. Cellular events in the immu ne response. The in vitro response of normal spleen cells to erythrocyte antigens. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 32:407-414, 1967. Jerne, N.K., et al. Plaque forming cells: methodology and theory. Transplant. Rev. 18:130-191, 1974. 13. Edelman, G.M. The structure and function of antibod ies. Sci.Am. 223(2):34-42, 1970. Porter, R.R. Structural studies of immunoglobulins. Science 180:713-716, 1973. 14. Burton, D.R.; Woof, J.M. Human antibody effector func tion. Adv. Immunol. 51:1-84, 1992. Ishizaka, T.; Ishizaka, K. Biology of immunoglobulin E. Progr. Allergy 19:60-121, 1975. Koshland, M.E. The coming of age of the immunoglo bulin J chain. Annu. Rev. Immunol. 3:425-454,1985. Kraehenbuhl, J.-P., Neutra, M.R. Transepithelial trans port and mucosal defense II: secretion of IgA. Trends Cell Biol. 2:170-174, 1992. Metzger, H. The receptor with high affinity for IgE. Im munol. Rev. 125:37-48, 1992. Morgan, E.L.; Weigle, W.O. Biological activities residing in the Fc region of immunoglobulin. Adv. Immunol. 40:61-134, 1987. Ravetch, J.V.; Kinet, J.-P. Fc receptors. Annu. Rev. Im munol. 9:457-492, 1991. 15. Berzofsky, J.A.; Berkover, I.J. Antigen-antibody interac tions. In Fundamental Immunology (W.E. Paul, ed.), pp. 595-644. New York: Raven Press, 1984. Davies, D.R.; Sheriff, S.; Padlan, E.A. Antibody-antigen complexes./. Biol. Chem. 263:10541-10544, 1988. 16. Miiller-Eberhard, H.J. Molecular organization and func tion of the complement system. Annu. Rev. Biochem. 57:321-348, 1988. Reid, K.B. Activation and control of the complement system. Essays Biochem. 22:27-68, 1986. Reid, K.B.M.; Day, A.J. Structure-function relatioships of the complement components. Immunol. Today 10:177-180, 1989. Tomlinson, S. Complement defense mechanisms. Curr. Opin. Immunol. 5:83-89,1993. 17. Capra, J.D.; Edmundson, A.B. The antibody combining site. Sci. Am. 236(l):50-59,1977. Wu, T.T.; Kabat, E.A. An analysis of the sequences of the variable regions of Bence Jones proteins and myelo ma light chains and their implications for antibody complementarity./. Exp. Med. 132:211-250, 1970. 18. Sakano, H., et al. Domains and the hinge region of an immunoglobulin heavy chain are encoded in separa te DNA segments. Nature 277:627-633, 1979. 19. Alzari, P.M.; Lascombe, M.-B.; Poljak, R.J. Three-dimen sional structure of antibodies. Annu. Rev. Immunol. 6:555-580, 1988. Davies, D.R.; Padlan, E.A.; Sheriff, S. Antibody-antigen complexes. Annu. Rev. Biochem. 59:439-473, 1991. Standfield, R.L.; Fieser, T.M.; Lerner, R.A.; Wilson, I .A. Crystal structures of antibody to a peptide and its complex with peptide antigen at 2.8 A. Science 248:712-719, 1990. 20. Hozumi, N.; Tonegawa, S. Evidence for somatic rearran gement of immunoglobulin genes coding for variable and constant regions. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73:3628-3632, 1976.
1342
Capitulo 23 : El sistema inmunitario
21. Alt, F.W.; Blackwell, T.K.; Vancopoulos, G.D. Develop ment of the primary antibody repertoire. Science 238:1079-1087, 1987. Leder, P. The genetics of antibody diversity. Sci. Am. 246(5):72-83, 1982. Lieber, M.R. The mechanism of V(D)J recombination: a balance of diversity, specificity and stability. Cell 70:873-876, 1992. Schatz, D.G.; Oettinger, M.A.; Schlissel, M.S. V(D)J re combination: molecular biology and regulation. Annu. Rev. Immunol. 10:359-383,1992. Tonegawa, S. Somatic generation of antibody diversity. Nature 302:575-581,1983. 22. Oettinger, M.A.; Shatz, D.G.; Gorka, C.; Baltimore, D. RAG-1 and RAG-2, adjacent genes that synergistically activate V(D)J recombination. Science 248:1517-1523, 1990. Thompson, C.B. RAG knockouts deliver a one/two punch. Curr. Biol. 2:180-182,1992. 23. Berek, C. Somatic mutation and memory. Curr. Opin. Immunol. 5:218-222,1993. French, D.L.; Laskov, R.; Scharff, M.D. The role of soma tic hypermutation in the generation of antibody di versity. Science 244:1152-1157, 1989. Kocks, C.; Rajewsky, K. Stable expression and somatic hypermutation of antibody V regions in B-cell devel opmental pathwatys. Annu. Rev. Immunol. 7:537559, 1989. Liu, Y.-J.; Johnson, G.D.; Gordon, J.; MacLennan, I.C.M. Germinal centres in T-cell-dependent antibody re sponses. Immunol. Today 13:17-21, 1992. Nossal, G.J.V. The molecular and cellular basis of affin ity maturation in the antibody response. Cell 68:1-2, 1992. 24. Chen, J.; Alt, F.W. Gene rearrangement and B-cell deve lopment. Curr. Opin. Immunol. 5:194-200,1993. Rolink, A.; Melchers, F. Molecular and cellular origins of B lymphocyte diversity. Cell 66:1081-1094, 1991. 25. Early, P., et al. Two mRNAs can be produced from a sin gle immunoglobulin |i gene by alternative RNA pro cessing pathways. Cell 20:313-319, 1980. 26. Esser, C.; Radbruch, A. Immunoglobulin class switch ing: molecular and cellular analysis. Annu. Rev. Im munol. 8:717-735, 1990. Finkelman, F.D., et al. Lymphokine control of in vivo immunoglobulin isotype selection. Annu. Rev. Im munol. 8:303-333, 1990. Harriman, W.H.; Volk, H.; Defranoux, N.; Wabl, M. Im munoglobulin class switch recombinations. Annu. Rev. Immunol. 11:361-384,1993. Snapper, C.M.; Mond, J.J. Towards a comprehensive view of immunoglobulin class switching. Immunol. Today 14:15-17, 1993. 27. Allison, J.P.; Lanier, L.L. The structure, function and se rology of the T cell antigen receptor complex. Annu. Rev. Immunol. 5:503-540, 1987. Chan, A.C.; Irving, B.A.; Weiss, A. New insights into Tcell antigen receptor structure and signal tranduction. Curr. Opin. Immunol. 4:246-251,1992. Davis, M.M. T cell receptor gene diversity and selection. Annu. Rev. Biochem. 59:475-496, 1990. Haas, W.; Pereira, P.; Tonegawa, S. Gamma/delta cells. Annu. Rev. Immunol. 11:637-685,1993.
Marrack, P.; Kappler, J. The T cell receptor. Science 238:1073-1079,1987. 28. Kupfer, A.; Singer, S.J. Cell biology of cytotoxic and hel per T-cell function. Annu. Rev. Immunol. 7:309-337, 1989. Rammensee, H.-G., Falk, K.; Rotzschke, O. MHC mol ecules as peptide receptors. Curr. Opin. Immunol. 5:35-44, 1993. Swain, S.L., et al. Helper T-cell subsets: phenotype, function and the role of lymphokines in regulating their development. Immunol. Rev. 123:115-144, 1991. 29. Aufray, C.; Strominger, J.L. Molecular genetics of the human histocompatibility complex. Adv. Human Ge net. 15:197-247, 1987. Bach, F.H.; Sacks, D.H. Transplantation immunology. N. Engl. J. Med. 317:489-492, 1987. Hood, L.; Steinmetz, M.; Malissen, B. Genes of the ma jor histocompatibility complex of the mouse. Annu. Rev. Immunol. 1:529-568, 1983. Moller, G., ed. Molecular Genetics of Class I and II MHC Antigens. Immunol. Rev. 84 and 85, 1985. 30. Bjorkman, P.J.; Parham, P. Structure, function and di versity of class I major histocompatibility complex molecules. Annu. Rev. Biochem. 59:253-288, 1990. Brown, J.H., et al. Three-dimensional structure of the human class II histocompatibility antigen HLA-DR1. Nature 364:33-39,1993. Matsumura, M.; Fremont, D.H.; Peterson, P.A.; Wilson, I.A. Emerging principles for the recognition of pepti de antigens by MHC class I molecules. Science 257:927-934, 1992. Silver, M.L.; Guo, H.-C.; Storminger, J.L.; Wiley, D.C. Atomic structure of a human MHC molecule presen ting an influenza virus peptide. Nature 360:367-369, 1992. Zhang, W., et al. Crystal structure of the major histo compatibility complex class I H-2Kb molecule contai ning a single viral peptide: implications for peptide binding and T-cell receptor recognition. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:8403-8407,1992. 31. Janeway, C.A., Jr. The T cell receptor as a multicompo nent signalling machine: CD4/CD8 coreceptors and CD45 in T cell activation. Annu. Rev. Immunol. 10:645-674,1992. Ledbetter, J.A., et al. CD4, CD8 and the role of CD45 in T cell activation. Curr. Opin. Immunol. 5:334-340, 1993. Miceli, M.C.; Parnes, J.R. Role of CD4 and CD8 in T cell activation and differentiation. Adv. Immunol. 53:59122,1993. 32. Townsend, A.R. Recognition of influenza virus proteins by cytotoxic T lymphocytes. Immunol. Res. 6:80-100, 1987. Yewdell, J.W.; Bennink, J.R. Cell biology of antigen pro cessing and presentation to major histocompatibility complex class I molecule-restricted T lymphoccytes. Adv. Immunol. 52:1-123, 1992. Zinkernagel, R.M.; Doherty, P.C. MHC-restricted cyto toxic T cells: studies on the biological role of poly morphic major transplantation antigens determining T-cell restriction-specificity, function and responsi veness. Adv. Immunol. 27:51-177,1979. 33. Bijlmakers, M.-J.; Ploegh, H.L. Putting together an MHC class I molecule. Curr. Opin. Immunol. 5:21-26, 1993.
Bibliografía
34.
35.
36.
37.
38.
39.
40.
De Maeyer, E.; De Maeyer-Guignard, J. Interferon-y. Curr. Opin. Immunol. 4:321-326, 1992. Driscoll, J.; Finley, D. A controlled breakdown: antigen processing and the turnover of viral proteins. Cell 68:823-825, 1993. Goldberg, A.L.; Rock, K.L. Proteolysis, proteasomes and antigen presentation. Nature 357:375-379, 1992. Rammensee, H.-G., Falk, K.; Rotzschke, O. Peptides na turally presented by MHC I molecules. Annu. Rev. Immunol. 11:213-244, 1992. Schaerer, E.; Tschopp. J. Cytotoxic T cells keep their se crets. Curr. Biol. 3:167-169,1993. Taylor, M.K.; Cohen, J.J. Cell-mediated cytotoxicity. Curr. Opin. Immunol. 4:338-343, 1992. Yagita, H., et al. Role of perforin in lymphocyte-media ted cytolysis. Adv. Immunol. 51:215-242, 1992. Noelle, R.; Snow, E.C. T helper cells. Curr. Opin. Immu nol. 4:333-337,1992. Pantaleo, G.; Graziosi, C.; Fauci, A.S. The immunopathogenesis of human immunodeficiency virus infec tion. N. Engl. J. Med. 328:327-335, 1993. Cresswell, P. Chemistry and functional role of the inva riant chain. Curr. Opin. Immunol. 4:87-92, 1992. Germain, R.N.; Margulies, D.H. The biochemistry an cell biology of antigen processing and presentation. Annu. Rev. Immunol. 11:403-450, 1993. Unanue, E.R. Cellular studies on antigen presentation by class II MHC molecules. Curr. Opin. Immunol. 4:63-69, 1992. Knight, S.C.; Stagg, A.J. Antigen-presenting cell types. Curr. Opin. Immunol. 5:374-382, 1993. Steinman, R.M. The dendritic cell sytem and its role in immunogenicity. Annu. Rev. Immunol. 9:271-296, 1991. Cambier, J.C. Signal transduction by T-and B-cell anti gen receptors: converging structures and concepts. Curr. Opin. Immunol. 4:257-264, 1992. Izquierdo, M.; Cantrell, D.A. T-cell activation Trends Cell Biol. 2:268-271, 1992. Klausner, R.D.; Samelson, L.E. T cell antigen receptor activation pathways: the tyrosine kinase connection. Cell 64:875-878, 1991. Malissen, B.; Schmitt-Verhulst, A.-M. Transmembrane signalling through the T-cell-receptor-CD3 complex. Curr. Opin. Immunol. 5:324-333, 1993. Weiss, A. T cell antigen receptor signal transduction: a tale of tails and cytoplasmic protein-tyrosine kinases. Cell 73:209-212, 1993. Dinarello, C.A. Interleukin-1 and its biologically related cytokines. Adv. Immunol. 44:153-205, 1989. Hogg, N.; Landis, R.C. Adhesion molecules in cell inter actions. Curr. Opin. Immunol. 5:383-390, 1993. Jenkins, M.K.; Johnson, J.G. Molecules involved in T-cell costimulation. Curr. Opin. Immunol. 5:361-367, 1993. Linsley, P.S.; Ledbetter, J.A. The role of the CD28 recep tor during T cell responses to antigen. Annu. Rev. Im munol. 11:191-212,1993. Schwartz, R.H. Costimulation of T lymphocytes: the role of CD28, CTLA-4, and B7/BB1 in interleukin-2 produc tion and immunotherapy. Cell 71:1065-1068,1992. Schwartz, R.H. T cell energy. Sci. Am. 269(2):62-71, 1993. Fathman, C.G.; Frelinger, J.G. T-lymphocyte clones. Annu. Rev. Immunol. 1:633-656,1983.
1343
Manami, Y.; Kono, T.; Miyazaki, T.; Taniguchi, T. The IL-2 receptor complex: its structure, function and target genes. Ann«. Rev. Immunol. 11:245-267, 1993. Smith, K.A. Interleukin-2. Curr. Opin. Immunol. 4:271276.1992. Taniguchi, T.; Minami, Y. The IL-2/IL-2 receptor sys tem: a current overview. Cell 73:5-8, 1993. 41. Claman, H.N.; Chaperon, E.A. Immunologic comple mentation between thymus and marrow cells-a mo del for the two-cell theory of immunocompetence. Transplant. Rev. 1:92-113,1969. Davies, A.J.S. The thymus and the cellular basis of im munity. Transplant. Rev. 1:43-91,1969. 42. Chesnut, R.W.; Grey, H.M. Antigen presentation by B cells and its significance in T-B interactions. Adv. Im munol. 39:51-94,1986. Lederman, S., et al. Non-antigen signals for B-cell growth and differentiation to antibody secretion. Curr. Opin. Immunol. 5:439-444, 1993. Moller, G., ed. IL-4 and IL-5: Biology and Genetics. Im munol. Rev. 102,1988. Noelle, R.J.; Ledbetter, J.A.; Aruffo, A. CD40 and its li gand, an essential ligand-receptor pair for thymusdependent B-cell activation. Immunol. Today 13:431433.1992. Parker, D.C. T cell-dependent B cell activation. Annu. Rev. Immunol. 11:331-360,1993. 43. Arai, K., et al. Cytokines: coordinators of immune and inflammatory responses. Annu. Rev. Biochem. 59:783836,1990. Dawson, M.M. Lymphokines and Interleukins. Chiches ter, UK: Open University Press, 1991. Mosmann, T.R.; Coffman, R.L. TH1 and TH2 cells: diffe rent patterns of lymphokine secretion lead to diffe rent functional properties. Annu. Rev. Immunol. 7:145-174, 1989.
1344
Capitulo 23 : El sistema inmunitario
44.
45. 46.
47.
48.
Mosmann, T.R., et al. Diversity of cytokine synthesis and function of mouse CD4+ T cells. Immunol. Rev. 123:209-229,1991. Stout, R.D. Macrophage activation by T cells: cognate and non-cognate signals. Curr. Opin. Immunol. 5:398-403,1993. Benoist, C.; Mathis, D. Generation of the a(3 T-cell re pertoire. Curr. Opin. Immunol. 4:156-161,1992. Kruisbeek, A.M. Development of a(3 T cells. Curr. Opin. Immunol. 5:227-332,1993. Rothenberg, E.V. The development of functionally re sponsive T cells. Adi;. Immunol. 51:85-214,1992. von Boehmer, H. Thymic selection: a matter of life and death. Immunol. Today 13:454-458,1992. von Boehmer, H.; Kisielow, P. How the immune system learns about self. Sci. Am. 265(4):74-81, 1991. Miller, J.F.A.P.; Morahan, G. Peripheral T cell tolerance. Annu. Rev. Immunol. 10:51-69,1992. Mengle-Gaw, L.; McDevitt, H.O. Genetics and expres sion of murine IA antigens. Annu. Rev. Immunol. 3:367-396, 1985. Schwartz. R.H. Immune response (Ir) genes in the muri ne major histocompatibility complex. Adv. Immunol. 39:31-201, 1986. Benoist, C.; Mathis, D. Demystification of the alloresponse. Curr. Biol. 1:143-144, 1991. Hill, A.V.S., et al. Common West African HLA antigens are associated with protection from severe malaria. Nature 352:595-600,1991. Hunkapiller, T.; Hood, L. Diversity of the immunoglo bulin gene superfamily. Adv. Immunol. 44:1-63,1989. Williams, A.F.; Barclay, A.N. The immunoglobulin superfamily-domains for cell surface recognition. Annu. Rev. Immunol. 6:381-406,1988.
En los países prósperos del mundo, aproximadamente una de cada cinco perso nas morirá de cáncer; sin embargo, ésta no es la razón por la que le dedicamos un capítulo de este libro al tema del cáncer. Las enfermedades cardíacas causan más muertes y en todo el mundo otros problemas sanitarios, como la malnutrición y las infecciones parasitarias, son más graves. Sin embargo, en el contexto de la biología celular, el cáncer tiene una importancia única, ya que la familia de enfermedades agrupadas bajo ese título refleja alteraciones de las pautas de comportamiento más fundamentales de las células en un organismo pluricelu lar. Para comprender el cáncer y para idear procedimientos racionales para tra tarlo, debemos comprender tanto los procesos internos de las células como sus interacciones sociales en los tejidos del cuerpo. Así, el esfuerzo dedicado a la in vestigación del cáncer no sólo ha beneficiado al propio tratamiento del cáncer sino tam bién un área más amplia del conocim iento médico. Ya hemos comentado muchos de los aspectos relacionados con la investiga ción del cáncer en los capítulos anteriores. En este capítulo de conclusión exa minaremos la enfermedad en sí misma. En la primera sección consideraremos la naturaleza del cáncer y la historia natural de la enfermedad desde el punto de vista celular; en la segunda sección nos centraremos en su base molecular.
El cáncer como un proceso de microevolución1 El cuerpo de un animal puede contemplarse como una sociedad o ecosistema cuyos miembros son células, que se reproducen por división celular y que están organizadas en conjuntos de células que colaboran entre sí, o tejidos. En nuestra observación anterior sobre el m antenimiento de los tejidos (en el Capítulo 22), nuestros puntos de interés eran similares a los del ecólogo; nacimientos celula res, muertes, hábitats, limitaciones territoriales, el mantenimiento del tamaño de las poblaciones y cosas por el estilo. El único tópico ecológico manifiesta mente ausente era el de la selección natural: no comentamos nada sobre com petencia o mutación entre células somáticas. La razón es que, en lo que a ello respecta, un cuerpo sano es una sociedad muy particular, en la que el autosacrificio, más que la competencia, es la norma: todos los linajes de células somáticas están condenados a morir, sin dejar progenie pero dedican su existencia a sus tentar las células germinales, que son las únicas que tienen la oportunidad de sobrevivir. No se trata de ningún misterio, porque el cuerpo es un clon, y el genom a de las células somáticas es el mismo que el de las células germinales; por
1345
tanto, con su autosacrificio por el bien de las células germinales, las células so máticas ayudan a propagar copias de sus propios genes. En contraste por consiguiente con las células de vida independiente como las bacterias, que compiten para sobrevivir, las células de un organismo plurice lular están comprometidas a colaborar. Cualquier mutación que origine un comportamiento no altruista de miembros individuales de la cooperativa arries gará el futuro de la totalidad de la empresa. Por tanto, la mutación, la com peten cia, y la selección natural actuando dentro de la población de células somáticas son los ingredientes básicos del cáncer: una enfermedad en la que las células mutadas individualmente empiezan a prosperar a expensas de sus vecinas, pero que finalmente destruyen toda la sociedad celular, y mueren. En esta sección com entarem os el desarrollo del cáncer como un proceso de microevolución que se produce en una escala temporal de meses o años en una población de células del cuerpo, pero que depende de los mismos principios de mutación y selección natural que gobiernan la evolución a largo plazo de todos los organismos vivos.
Los cánceres difieren en función del tipo celular del que derivan2 Las células cancerosas están definidas por dos propiedades hereditarias: ellas y su progenie ( 1) se reproducen a pesar de las restricciones normales y (2) invaden y colonizan territorios norm alm ente reservados para otras células. La com bina ción de estas características es lo que hace a los cánceres especialmente peligro sos. Una célula anormal aislada que no prolifere más que sus vecinas normales, no produce ningún daño significativo, sean cuales sean las otras propiedades desagradables que pueda tener; pero si su proliferación está fuera de control, producirá un tumor o neoplasma -u n a masa de células anormales creciendo inexorablemente. Sin embargo, si las células neoplásicas permanecen agrupadas en una masa única, se dice que el tumor es benigno y generalmente puede con seguirse una curación com pleta extrayendo la masa quirúrgicamente. Un tumor se considera canceroso sólo si es maligno, es decir, si sus células tienen la capa cidad de invadir el tejido circundante. La capacidad invasora implica, general mente, la habilidad de liberarse, entrar en el torrente sanguíneo o en los vasos linfáticos, y formar tumores secundarios o metástasis en otros lugares del cuer po (Figura 24-1). Cuanto más ampliamente produzca metástasis un cáncer, más difícil resultará de erradicar. Los cánceres se clasifican de acuerdo con el tejido y con el tipo celular a par tir de los que se originan. Los cánceres procedentes de células epiteliales se deno minan carcinom as; los que proceden de tejido conjuntivo o de células muscula res se denominan sarcom as. Entre los cánceres que no encajan en ninguna de
túbulos glandulares norm ales (sección transversal)
túbulos glandulares neoplásicos
cápsula de tejido conjuntivo fibroso del tum or benigno
túbulos glandulares norm ales
túbulos glandulares invasivos cancerosos
Figura 24-1 Metástasis. Los tumores malignos típicamente producen metástasis, haciendo que el cáncer sea difícil de erradicar. El dibujo muestra las localizaciones más frecuentes de metástasis en la médula ósea procedentes de un carcinom a de próstata. (De Union Internationale Contre le Cancer, TNM Atlas: Illustrated Guide to the Classification of Malignant Tumors, 2nd ed. Berlin: Springer-Verlag, 1986.)
Figura 24-2 Contraste entre un tumor glandular benigno (adenoma) y una tumor glandular maligno (adenocarcinoma). Estos tumores pueden tener muchas formas; el diagrama ilustra esquem áticam ente los tipos que pueden encontrarse en la mama.
ADENOMA (BENIGNO)
13 4 6
Capítulo 24 : Cáncer
ADENOCARCINOMA (MALIGNO)
Tabla 24-1 Incidencia de cáncer y mortalidad por cáncer en Estados Unidos, 1993 Tipo de cáncer
N.° de casos nuevos cada año
1 170 000 Número total de cánceres 992 700 Cánceres de epitelios: carcinomas Cavidad oral y faringe 29 800 236 900 Órganos digestivos (total) Colon y recto 152 000 Páncreas 27 700 24 000 Estómago 15 800 Hígado y sistema biliar Sistema respiratorio (total) 187 100 Pulmón 170 000 Mama 183 000 Piel (total) (>700 000)* 32 000 Melanoma maligno 244 400 Tracto reproductor (total) Próstata 165 000 22 000 Ovario 13 500 Cuello uterino 31000 Útero (endometrio) 79 500 Órganos urinarios (total) 52 300 Vejiga Cánceres de los sistemas hematopoyético e inmunitario: leucemias y linfomas 93 000 Cánceres del sistema nervioso central y 18 250 del ojo: gliomas, retinoblastoma, etc. Cánceres de tejidos conjuntivos, músculos 8000 y vasculatura: sarcomas Todos los demás cánceres + lugares no 57 050 especificados
N.° de muertes cada año
(3%) (21%) (14%) (2%) (1%) (3%) (7%) (4%)
528 300 417 175 7700 120 325 57 000 25 000 13 600 12 600 154 200 149 000 46 300 9100 6800 59 950 35 000 13 300 4400 5700 20 800 9900
(79%) ( 1%) (23%) ( 11%) (5%) (3%) (2%) (29%) (28%) (9%) (2%) ( 1%) (11%) (7%) (3%) ( 1%) (1%) (4%) (2%)
(8%)
50 000
(9%)
(2%)
12 350
(2%)
(1%)
4150
( 1%)
(5%)
43 425
(8%)
(85%) (3%) (20%) (13%) (2%) (2%) ( 1%) (16%) (15%) (16%)
* Los cánceres de piel que no son melanomas no se han incluido en el número total de cánce res, ya que la mayoría de ellos se curan fácilmente y muchos de ellos no se registran. En el mundo entero, los cinco tipos más frecuentes de cáncer son los de pulmón, estómago, mama, colon/recto y cuello uterino, y el número total de casos nuevos de cáncer cada año so brepasa los 6 millones. Obsérvese que sólo aproximadamente la mitad de la gente que desarro lla un cáncer muere por esta causa. (Datos para EEUU de American Cáncer Society, Cáncer Facts and Figures, 1993.)
estas dos amplias categorías se encuentran las diversas formas de leucemia, deri vadas de células hematopoyéticas, y los cánceres derivados de células del sistema nervioso. La Tabla 24-1 enumera los tipos de cáncer más frecuentes en Estados Unidos, indicando su incidencia y la frecuencia de muertes que producen. Cada una de las grandes categorías tiene muchas subdivisiones de acuerdo con el tipo celular de que se trate, la localización en el cuerpo y la estructura del tumor; mu chos de los nombres utilizados están fijados por tradición sin que tengan ningu na base racional moderna. Paralelamente a la serie de nombres para tumores malignos, existe una serie de nombres relacionados para tumores benignos: un adenoma, por ejemplo, es un tumor epitelial benigno con una organización glan dular, siendo el tipo de tumor maligno correspondiente un adenocarcinoma (Fi gura 24-2); un condroma y un condrosarcoma son, respectivamente, tumores de cartílago benigno y maligno. Aproximadamente el 90% de los cánceres humanos son carcinomas, quizás porque la mayor parte de la proliferación celular del cuer po se produce en los epitelios, o quizás porque los tejidos epiteliales están ex puestos más frecuentemente a las diversas formas de lesión física y química que favorecen el desarrollo del cáncer.
El cáncer como un proceso de microevolución
1347
Cada cáncer tiene características que reflejan su origen. Así, por ejemplo, las células de un carcinoma de células basales epidérmico, derivadas de una estirpe de células queratinocíticas de la piel, generalmente continuarán sintetizando fi lamentos intermedios de citoqueratina, mientras que las células de un melanoma, derivadas de una célula pigmentaria de la piel, a menudo (aunque no siem pre) continuarán produciendo gránulos de pigmento. Los cánceres que se originan a partir de diferentes tipos celulares son, en general, enfermedades muy distintas. El carcinom a de células basales, por ejemplo, sólo es invasivo de forma local y raramente forma metástasis, mientras que el melanoma es mucho más maligno y rápidamente produce un número de metástasis mucho mayor (comportamiento que recuerda las tendencias migratorias de los precursores de las células pigmentarias normales durante el desarrollo, discutido en el Capítulo 21). Generalmente, el carcinom a de células basales puede eliminarse fácilmente mediante cirugía, consiguiéndose la curación completa; sin embargo, una vez que el melanoma maligno ya ha formado metástasis, resulta normalmente im posible de extirpar, por lo que resulta fatal.
100
E 10 E
0,1
m uerte del paciente (1012células) el tum or empieza a detectarse por palpación (109 células) el tum or empieza a verse por rayos X (108 células)
1 10 20 30 40 la población de células tum orales se duplica
La mayoría de cánceres derivan de una sola célula anormal3 Incluso cuando el cáncer ha producido metástasis, normalmente puede deter minarse su origen como un único tum or primario que procede de un órgano determinado y probablemente derivado por división celular de una sola célula que ha sufrido algún cambio hereditario que le permite crecer más que a sus ve cinas. Pero cuando se detecta por primera vez un tumor típico, ya tiene miles de millones de células (Figura 24-3), a menudo incluye muchas células normales -p o r ejemplo fibroblastos en el tejido conjuntivo de sostén que está asociado al carcinoma. ¿Qué evidencia tenem os de que las células cancerosas sean, en efec to, un clon descendiente de una única célula anormal? Una manera de demostrarlo consiste en el análisis del DNA de las células. En casi todos los pacientes con leucemia mielógena crónica, por ejemplo, los glóbulos blancos leucém icos se distinguen de las células normales por una anor malidad crom osóm ica específica (el llamado cromosoma Filadelfia, originado, como se muestra en la Figura 24-4, por una translocación entre los brazos largos
Figura 24-3 Crecimiento de un tum or hum ano típico com o el tum or de m am a. El diámetro del tumor se representa en una escala logarítmica. Pueden transcurrir años antes de que el tumor sea apreciable.
Figura 24-4 Translocación entre los
cromosomas 9 y 22 responsable de la leucemia mielógena crónica. El
> <
y <
9
menor de los dos cromosomas anormales resultantes se denomina cromosom a Filadelfia, nombre de la ciudad donde la anomalía se registró por primera vez.
22
9q+
22q-
(Ph1)
1348
Capítulo 24 : Cáncer
de los cromosomas 9 y 22). Cuando el DNA del lugar de la translocación es clo nado y secuenciado, se observa que el lugar de ruptura y de reunión de los frag mentos translocados es idéntico en todas las células leucémicas de un mismo paciente, pero que difiere ligeramente (en varios cientos o miles de pares de ba ses) de un paciente a otro, como cabría esperar si cada caso de leucemia surgie se a partir de un accidente único que se produjera en una sola célula. Posterior mente veremos cómo las translocaciones Filadelfia conducen a leucemia por una inactivación inadecuada de un determinado gen. Otro modo de demostrar que un cáncer tiene un origen monoclonal consis te en utilizar el fenómeno de la inactivación del cromosoma X. Una mujer nor mal es una mezcla al azar, o un mosaico, de dos clases de células -las que tienen inactivado el cromosoma X paterno y las que tienen inactivado el cromosom a X materno (se com enta en el Capítulo 9). La inactivación de uno de los crom oso mas X ocurre al azar en cada célula en una fase temprana del desarrollo em brio nario, pero una vez se ha producido, la elección es irreversible; por lo tanto cuando la célula se divide pasa a su descendencia su estado de inactivación del crom osom a X. Por lo tanto, el estado de inactivación del cromosoma X -m aterno o paterno- puede utilizarse como un marcador hereditario para deducir el linaje de las células del cuerpo. En la gran mayoría de los tumores que se han analiza do -tan to benignos como m alignos- se ha encontrado que todas las células tumorales tenían inactivado el mismo cromosoma X, lo cual sugiere que estas cé lulas derivan de una sola célula alterada (Figura 24-5).
Probablem ente la mayoría de cánceres se inician por un cambio en la secuencia de DNA de una célula4 Si bien es cierto que una sola célula anormal genera un tumor, esta célula ha de transferir su anormalidad a su progenie; la anomalía ha de ser hereditaria. Un primer problema para comprender un cáncer es descubrir si la anomalía heredi taria es debida a un cambio genético -e s decir, una alteración en Ja secuencia de DNA de la célula- o a un cambio epigenético -e s decir, un cambio en la pauta de expresión génica sin que exista ningún cambio en la secuencia de DNA. Los cam bios epigenéticos heredables reflejan una memoria celular y constituyen una característica muy conocida del desarrollo normal, como se manifiesta en la estabilidad del estado diferenciado de las células y en fenómenos tales como la inactivación del cromosoma X; a priori no existe ninguna razón obvia por la que estos cambios no puedan estar implicados en el desarrollo de procesos can cerígenos. En algún caso -com o en un tipo de cáncer raro y extraordinario, el teratocarcinom a (véase Capítulo 2 1 )- existen evidencias de que su origen es epige nético. Sin embargo, existen buenas razones para pensar que la mayoría de los cánceres se inician debido a un cambio genético. Así, a menudo puede observar se que las células de un determinado tipo de cáncer comparten una misma anormalidad en su secuencia de DNA, como se ha comentado para la leucemia mielógena crónica; en la segunda parte de este capítulo se comentarán muchos otros ejemplos de ello. Una evidencia de que el cambio genético puede ser una causa de cáncer proviene del estudio de agentes que se sabe que conducen a la enfermedad. La correlación entre carcinogénesis (la generación de cáncer) y mutagénesis (la producción de una cambio en la secuencia del DNA) está clara para tres clases de agentes: los cancerígenos químicos (que habitualmente cau san simples cambios locales en la secuencia de nucleótidos), las radiaciones ionizantes, como los rayos X (que típicamente causan roturas de cromosomas y translocaciones) y los virus (que introducen en las células DNA ajeno). El papel de los virus en el cáncer se comentará posteriormente; ahora pasaremos a co mentar los cancerígenos químicos. En general, no puede responsabilizarse completamente a un único suceso o a una causa única, de la aparición de un cáncer dado: como veremos, por regla general los cánceres son el resultado de que en una célula se produzcan de for ma aleatoria varios accidentes independientes, cuyos efectos son acumulativos.
El cáncer como un proceso de microevolución
Figura 24-5 Evidencia que demuestra el origen monoclonal de los cánceres, a partir del análisis de mosaicos de inactivación del cromosoma X. Como resultado de un proceso al azar, que se produce en una fase tem prana del embrión, prácticam ente todos los tejidos normales del cuerpo de una mujer son una mezcla de células que presentan diferente heredabilidad del cromosom a X inactivado (indicada aquí por la mezcla de células rojas y células grises en el tejido normal). Sin embargo, cuando se determina la expresión de un gen marcador ligado a X en las células de un cáncer, generalmente se obtiene que todas ellas tienen el mismo crom osom a X inactivado. Esto implica que todas ellas derivan de una única célula cancerosa inicial.
1349
AFLATOXINA
AFLATOXINA-2,3-EPÓXIDO
AGENTE CANCERÍGENO UNIDO A GUANINA EN EL DNA
Sin embargo, se conocen algunos agentes extraordinariamente cancerígenos que aumentan la probabilidad de los sucesos críticos hasta el punto de que, dada una dosis lo suficientem ente alta de dicho compuesto, se hace práctica mente inevitable que al m enos una célula del cuerpo se convierta en cancerosa. El compuesto 2-naftilamina, utilizado en la industria química a principios de si glo, es un ejemplo notorio de ello: en una fábrica británica, todos los hombres contratados para destilarlo (y que, por lo tanto, estuvieron sometidos a una ex posición prolongada) desarrollaron con el tiempo cáncer de vejiga. Muchos compuestos químicos bastante dispares también se han mostrado cancerígenos cuando son ingeridos por animales experimentales o son aplica dos repetidamente sobre su piel. Algunos de estos agentes cancerígenos actúan directamente sobre las células diana; muchos otros actúan sólo después de ha ber sido modificados a una forma más reactiva a través de un proceso metabòli co -especialm ente por una serie de enzimas intracelulares conocidas como las citocromo P-450 oxidasas, que normalmente ayudan a convertir las toxinas in geridas y los materiales liposolubles ajenos en compuestos menos dañinos y fá ciles de excretar, pero que con ciertas substancias fracasan en esta tarea convir tiéndolas, por el contrario, en cancerígenos directos (Figura 24-6). Aunque los agentes cancerígenos químicos conocidos son muy diversos, la mayoría de ellos tienen al menos una propiedad en común: producen mutaciones. En un ensayo clásico utilizado para poner de manifiesto la capacidad mutagénica, el agente cancerígeno se mezcla con un extracto activador preparado a partir de células de hígado de rata (para mimetizar el procesamiento bioquímico que se produce en un animal intacto) y se añade a un cultivo de bacterias especialmente diseñado para el ensayo; a continuación se determina la frecuencia de mutación resultan te de las bacterias (Figura 24-7). Muchos de los compuestos que según este ensa yo se clasifican como mutagénicos también producen mutaciones y lo aberra ciones crom osóm icas cuando se ensayan en células de mamíferos. Cuando los resultados sobre capacidad mutagénica obtenidos a partir de diversas fuentes se com binan y se analizan, se encuentra que la mayoría de los agentes canceríge nos son mutágenos. Sin embargo, existe una minoría significativa de agentes carcinógenos que no aparentan ser mutagénicos. Posteriormente se comentará cómo las substan cias no mutagénicas pueden estimular el desarrollo de un cáncer afectando el com portam iento de células mutantes preexistentes. Pero en primer lugar hemos de considerar con qué frecuencia es probable que surjan estas células mutantes en el curso normal de los acontecim ientos.
Una sola m utación no es suficiente para causar cáncer1,5 En un cuerpo humano se producen en el curso de una vida normal aproximada mente 1016divisiones celulares; en un ratón, debido a su menor número de célu las y a su ciclo vital más corto, el número de divisiones es aproximadamente de 1012. Incluso en un entorno que esté libre de mutágenos, las mutaciones se pro-
1 35 0
Capítulo 24 : Cáncer
Figura 2 4-6 Activación metabòlica de un agente cancerígeno. Muchos agentes cancerígenos químicos han de ser activados por una transformación metabolica antes de que puedan reaccionar con el DNA y causar mutaciones. El compuesto que se presenta aquí es la a fla to x in a B l, una toxina de un moho (Aspergillus fla v u s oryzae) que crece sobre el grano y los cacahuetes cuando se alm acenan en condiciones húmedas en áreas tropicales. Parece que esta substancia contribuye al desarrollo de cáncer de hígado en los trópicos y se asocia a mutaciones específicas del gen p53 (comentado más adelante en este capítulo).
NO MUTÁGENO
Salmonella
cultivo de dependiente de histidina
extracto de hígado homogeneizado
INCUBAR 2 DIAS A 37°C
compuesto ensayado, potencialmente mutágeno
ducirán espontáneam ente con una frecuencia estimada de aproximadamente 10-6 mutaciones por gen y por división celular -u n valor que depende de limita ciones fundamentales en la precisión de la replicación y de la reparación del DNA. Por lo tanto, en el curso de la vida de cualquier ser humano es probable que en cada gen se haya producido una mutación en unas 1010 ocasiones dife rentes, y en un ratón en unas 106 ocasiones. Entre las células mutantes resultan tes cabe esperar que muchas de ellas presenten alteraciones en genes relaciona dos con la regulación de la división celular y que, por lo tanto, desobedezcan las restricciones normales sobre la proliferación celular. Desde este punto de vista, el problema no es por qué se produce el cáncer, si no por qué se produce con tan poca frecuencia. Evidentemente, una única mutación no es suficiente para convertir una cé lula sana típica en una célula cancerosa que prolifere sin restricciones, porque de ser así no seríamos organismos viables. Diversas líneas de evidencia indican que en realidad la génesis de un cáncer requiere que se produzcan en la misma célula varios accidentes independientes y raros. Una indicación de este tipo pro viene de estudios epidemiológicos sobre la incidencia de cáncer en función de la edad. Si fuera suficiente una sola mutación que se produjera con una probabili dad fija por año, la probabilidad de desarrollar cáncer en cualquier año dado de bería ser independiente de la edad. Sin embargo, en la mayoría de tipos de cán cer la incidencia se increm enta abruptamente con la edad -típicam ente como elevada a la tercera, a la cuarta o a la quinta potencia (Figura 24-8). A partir de estas estadísticas se ha estimado que se requieren entre tres y siete sucesos inde pendientes al azar, cada uno de ellos de baja probabilidad, para que una célula normal se transforme en cancerosa; los números más bajos corresponden a leu cemias y los más altos a carcinomas. Ahora que se han identificado mutaciones específicas responsables del de sarrollo de cáncer, ha sido posible probar en ratones transgénicos los efectos de estos genes mutantes; como veremos posteriormente, los resultados proporcio nan evidencias adicionales y más directas de la hipótesis de que una única mu tación es insuficiente para producir un cáncer. La hipótesis también está corro borada por muchos estudios anteriores del fenómeno de la progresión tum oral según la cual un desorden inicialmente benigno del comportamiento celular evoluciona gradualmente hasta un cáncer en pleno desarrollo. Por otra parte, estas observaciones sobre cómo evolucionan los tumores, proporcionan ideas sobre la naturaleza de los múltiples cambios que deben suceder para que una
El cáncer como un proceso de microevolución
MUTÁGENO
CONTAR LAS COLONIAS DE BACTERIAS INDEPENDIENTES DE HISTIDINA
Figura 24-7 Ensayo de Ames para determinar la capacidad mutagénica. El ensayo utiliza una cepa de la bacteria S alm o n ella que necesita histidina en el medio a causa de un defecto en un gen necesario para la síntesis de histidina. Los mutágenos pueden producir otro cam bio en este gen que revierta el defecto, generándose una bacteria que no necesite histidina. Para aum entar la sensibilidad del ensayo, la bacteria también tiene un defecto en su mecanism o de reparación del DNA, lo cual la hace especialm ente susceptible a agentes que dañen el DNA. La mayoría de com puestos que son mutagénicos por ensayos com o éste también son cancerígenos, y vice versa.
1351
180
100
160
gráfica log-log
140 120 100
10
80 60
/
40
/
20
10
20
30
40
50
(A)
60
70 80 edad
10 (B)
20
30
40 50 60 70 80 edad
célula normal se transforme en cancerosa y sobre los factores que controlan su producción.
Los cánceres evolucionan mediante etapas lentas a partir de células alteradas benignas1,5,6 Para los cánceres que tienen una causa externa identificable, casi siempre existe un largo intervalo entre el (los) suceso(s) causal(es) y el inicio de la enfermedad: la incidencia de cáncer de pulmón no empieza a aumentar abruptamente hasta después de 10 o 20 años de fumar con intensidad; la incidencia de leucemias en Hiroshima y Nagasaki no aumentó marcadamente hasta unos 5 años después de la explosión de las bom bas atómicas, y no alcanzó su máximo hasta transcurri dos 8 años; generalmente, los trabajadores industriales expuestos a agentes can cerígenos químicos durante un período limitado de tiempo no desarrollan los cánceres característicos de su ocupación hasta 10, 20 o incluso más años des pués de la exposición (Figura 24-9); etc. Durante este largo período de incuba ción, las presuntas células cancerosas experimentan cambios sucesivos. La leu cemia mielógena crónica, mencionada anteriormente, proporciona un ejemplo claro y simple al respecto. Esta enfermedad empieza como un desorden caracte rizado por una sobreproducción no letal de glóbulos blancos y continúa así du-
100
más de 5 años de exposición
80
de 3 a 4 años de exposición
60 40 20
menos de 2 años de exposición
año desde el inicio de la exposición
1352
Capítulo 24 : Cáncer
Figura 24-8 Incidencia de cáncer en función de la edad. El número de nuevos casos de cáncer de colon diagnosticados en mujeres en Inglaterra y Gales en un año se expresa en función de la edad de diagnóstico y en relación al número total de individuos en cada grupo de edad; los mismos datos se presentan en una escala lineal ordinaria en (A) y en una escala logarítmica en (B). La incidencia de cáncer aumenta abruptamente en función de la edad, en este ejemplo aproximadamente elevada a la quinta potencia [esto es, la pendiente de la recta log-log en (B) es aproximadamente 5]. Si una sola mutación fuese suficiente para desencadenar el cáncer, y esta mutación tuviera la misma probabilidad de ocurrir en cualquier momento, la incidencia debería ser independiente de la edad (es decir, la pendiente de la gráfica debería ser 0). Ello sugiere que una célula debe acumular los efectos disruptivos de aproximadamente seis accidentes independientes antes de que origine un cáncer de este tipo; la frecuencia de cada uno de estos acontecimientos es un factor limitante en la incidencia del cáncer. (Datos de C. Muir er al., Cáncer Incidence in Five Continents, Vol. V. Lyon: International Agency for Research on Cáncer, 1987.)
Figura 24-9 Retraso de la aparición de cáncer tras la exposición a un agente cancerígeno. La gráfica muestra el retraso hasta que se produce la aparición del cáncer de vejiga en una serie de 78 hombres que habían estado expuestos al cancerígeno 2-naftilamina; se agrupan según la duración de su exposición. (Modificado de J. Cairns, Cáncer: Science and Society. San Francisco: W.H. Freeman, 1978. Según M.H.C. Williams, en Cáncer, Vol. III (R.W. Raven, ed.). London: Butterfield, 1958.)
rante varios años hasta que se convierte en una enfermedad de progresión m u cho más rápida que generalmente finaliza, a los pocos meses, con la muerte. En la fase crónica temprana, las células leucémicas del cuerpo se distinguen sim plemente porque presentan la translocación de cromosomas mencionada ante riormente. En la siguiente fase aguda de la enfermedad, el sistema hematopoyético queda invadido por células que no sólo muestran esta anormalidad crom osóm ica sino también otras varias. Parece como si las células del clon mu íante inicial hubiesen sufrido más mutaciones que las hicieran proliferar más rá pidamente (o dividirse más veces antes de diferenciarse), de forma que llegan a exceder numéricamente a las hematopoyéticas normales e incluso a sus primas que únicamente tenían el desorden primario. Parece que los carcinomas y otros tumores sólidos evolucionan de un modo similar a éste. En humanos, muchos de estos cánceres no se diagnostican hasta un estadio relativamente tardío, sin embargo en algunos casos es posible obser var las primeras etapas del desarrollo de la enfermedad. Al final de este capítulo discutiremos otro ejemplo -e l cáncer colon-rectal. Los cánceres de la cérvix ute rina (el cuello del útero) proporcionan otro ejemplo al respecto. Estos cánceres derivan del epitelio cervical multilaminar, que tiene una organización similar a la de la epidermis de la piel (comentado en el Capítulo 22). Normalmente la pro liferación se produce sólo en la capa basal, generando células que entonces se desplazan hacia la superficie exterior, diferenciándose a lo largo de este despla zamiento en células aplanadas ricas en queratina, que no se dividen y que final mente se descaman de la superficie (Figura 24-10A y E). Sin embargo, cuando se
'J * i l a » --» ■él
* • v :*
* * ils
m* célula en división en la lám ina basal
«
*
^
v. •
%• » *
V%* , íi' i i j
f
■'i e
%
f
•
:M •
%
®% /
• .V *
células diferenciadas con el núcleo condensado
%
•
* %
lám ina basal
TEJIDO CONJUNTIVO (A) norm al
1 *4 êX f
». ’ . ,* • • • • > •
» » * ' * - - # Ke> t y
«te®
I
*■ % Vii*'
* * * i ■ ■■•/ « ' * «•■'".yV* * » * • • « M# *¡ '.: i. « ' ......... ,
* *
s (B) displasia
(F) carcinom a in situ/ carcinom a m aligno
El cáncer como un proceso de microevolución
(C) carcinom a in situ
(D) carcinom a m aligno
Figura 24-10 Etapas de progresión en el desarrollo de cáncer en el epitelio del cuello uterino. (A-D) Diagramas esquemáticos. En la displasia, las células más superficiales todavía muestran algunos signos de diferenciación, aunque es incompleta; se observan células en proliferación anormalmente alejadas de la capa basal. En el carcinoma in situ, las células de todas las capas están proliferando y aparentemente están indiferenciadas. La verdadera malignidad empieza cuando las células cruzan la lámina basal y empiezan a invadir el tejido conjuntivo subyacente. Pueden transcurrir varios años desde los primeros signos de displasia hasta el inicio del cáncer claramente maligno. (E) Fotografía de una sección de un epitelio cervical normal. (F) Fotografía de una sección de una carcinoma cervical que empieza a ser invasivo; la flecha apunta a las células que están en el proceso de paso desde el epitelio al tejido conjuntivo inferior. (E y F, cortesía de Andrew Hanby.)
1353
10
examinan muchas muestras de este epitelio, obtenidas de diferentes mujeres, no es raro encontrar placas de displasia, en las que las células en división no están confinadas en la capa basal, y además se presenta algún desorden en el proceso de diferenciación (Figura 24-10B). Las células se descaman de la superficie en estadios anormalmente tempranos de diferenciación, y la presencia de la displa sia puede detectarse raspando una muestra de células de la superficie y obser vándolas al m icroscopio (técnica de “frotis de Papanicolaou” -Figura 24-11). A menudo las placas displásicas permanecen inocuas o incluso remiten espon táneam ente; sin embargo, menos frecuentem ente pueden progresar, durante un período de varios años, hasta producir placas del llamado carcinoma in situ (Fi gura 24-10C). En estas lesiones más graves (a veces denominadas de forma algo engañosa ya que no son plenamente malignas), la pauta normal de división y di ferenciación celulares está seriamente desorganizada, y todas las capas del epi telio están formadas por células indiferenciadas en proliferación, que a menudo son muy variables en tamaño y cariotipo; sin embargo, las células anormales to davía están confinadas en el lado epitelial de la lámina basal. En esta etapa, aún es fácil conseguir una curación com pleta destruyendo o extirpando quirúrgica mente el tejido anormal. Sin este tratamiento, la placa anormal todavía puede permanecer inofensiva o entrar en regresión; pero se estima que entre un 20 y un 30% de casos se desarrollará, de nuevo durante un período de varios años, hasta producir un carcinom a cervical realmente maligno (Figura 24-10D y F), cuyas células se escapan del epitelio, cruzando la lámina basal, y empiezan a in vadir el tejido conjuntivo subyacente. La curación mediante la cirugía se vuelve progresivamente más difícil a medida que se extiende el crecimiento invasivo.
La progresión de los tumores implica rondas sucesivas de m utación y selección natural6,7 Como ilustran los dos ejemplos que acabam os de comentar, parece que en ge neral los cánceres aparecen por un proceso en el cual una población inicial de células ligeramente anormales, descendientes de un único ancestro mutante, evoluciona de mal en peor a través de ciclos sucesivos de mutación y selección natural. Esta evolución implica un gran com ponente de azar y generalmente re quiere muchos años; mucha gente muere de otras enfermedades antes de que el cáncer haya tenido tiempo de desarrollarse. Para comprender la causalidad del cáncer es esencial comprender los factores que pueden acelerar el proceso. En general, se esperaría que la velocidad de evolución, ya sea en una pobla ción de células que aprovechan las oportunidades para mostrar comportamien to canceroso en el cuerpo o bien sea en una población de organismos que se adaptan a un nuevo entorno en la superficie de la Tierra, dependiera de cuatro
135 4
Capítulo 24 : Cáncer
Figura 24-11 Fotografías de cálidas recogidas por raspado de la superfìcie del cuello uterino (técnica de Papanicolaou o “Pap smear”). (A) Normal; las células son grandes y bien diferenciadas, con núcleos muy condensados. (B) Displasia; las células están en varias etapas de diferenciación, algunas de ellas bastante inmaduras. (C) Carcinoma invasivo; todas las células aparecen indiferenciadas, con escaso citoplasma y núcleo relativamente grande; entre los restos acompañantes hay algunos glóbulos blancos. (Cortesía de Winifred Gray.)
parámetros principales: ( 1) la velocidad de mutación, es decir, la probabilidad por gen y por unidad de tiempo de que cualquier miembro dado de la población sufra un cambio genético; (2) el número de individuos de la población; (3) la ve locidad de reproducción, es decir, el promedio del número de generaciones pro ducidas por unidad de tiempo; y (4) la ventaja selectiva de que disponen los indi viduos mutantes con éxito, es decir, el cociente entre el número de células hijas sobrevivientes y fértiles por unidad de tiempo que producen estas células mu tantes respecto al número de células sobrevivientes y fértiles producidas por las células no mutantes. Los estudios experimentales sobre la inducción del cáncer en animales ilustran estos principios sobre evolución.
El desarrollo de un cáncer puede estar estimulado por factores que no alteran la secuencia de DNA de las células6,8 Las etapas por las que progresa una lesión inicialmente benigna hasta transfor mase en un cáncer se pueden observar más fácilmente en la piel. Por ejemplo, pueden producirse cánceres de piel en ratones aplicando repetidamente sobre la piel un carcinógeno químico mutagénico, como el benzo[a]pireno (un consti tuyente del alquitrán y del humo del tabaco), o el compuesto relacionado, dimetilbenzo[a]antraceno (DMBA). Sin embargo, generalmente una sola aplicación del agente cancerígeno no produce por si sola ningún tumor o ninguna otra anormalidad permanente. A pesar de ello, esta substancia causa alteraciones ge néticas latentes, lo cual se puede detectar a través de una mayor incidencia de cáncer cuando las células están expuestas ya sea a tratamientos posteriores con la misma substancia o a otro tipo de agresiones, bastante distintas. Un carcinó geno que siembra la semilla del cáncer de esta forma se dice que actúa como un iniciador tum oral. El solo hecho de herir la piel que ha sido expuesta una sola vez a uno de estos iniciadores puede suponer que se desarrollen cánceres a par tir de algunas de las células del borde de la herida. Alternativamente, la exposi ción repetida durante un período de meses a ciertas substancias conocidas como prom otores tumorales, que en sí mismos no son mutagénicos, pueden producir cáncer selectivamente en una piel que previamente ha sido expuesta a un iniciador tumoral. Los promotores tumorales más ampliamente estudiados son los ésteres deforbol como el acetato de tetradecanoilforbol (TPA, de TetradecanoylPhorbol Acetate), de los que hemos tratado en otro contexto como activa dores artificiales de la proteína quinasa C (y en consecuencia como agentes que activan parte de la vía de señalización intracelular del fosfatidilinositol, com en tado en el Capítulo 15. Estas substancias causan cáncer con una frecuencia alta tan sólo si se aplican después de un tratamiento con un iniciador mutagénico (Figura 24-12).
iniciador
prom otor
*
CANCER
CANCER
H NO CÁNCER
H NO CÁNCER
*
* * *
El cáncer como un proceso de microevolución
CANCER
tiempo
Figura 24-12 Algunos programas posibles de exposición a un iniciador tumoral (mutagénico) y a un promotor tumoral (no mutagénico) y sus consecuencias. Tan sólo aparece cáncer si la exposición al promotor sigue a la exposición del iniciador, y sólo si la intensidad de la exposición al promotor excede un cierto umbral. También puede producirse cáncer como resultado de la exposición repetida solamente al iniciador.
1355
iniciador tum oral
célula norm al
prom otor tum oral o producción de una herida
m utación creada en un gen de proliferación silencioso
el prom otor o la herida inducen la expresión génica
Como cabe esperarse de un daño genético, los cambios ocultos producidos por un iniciador tumoral son irreversibles: así, se pueden poner de manifiesto mediante tratamiento con un promotor tumoral incluso después de un largo in tervalo de tiempo. Aparentemente, el efecto inmediato del promotor es estimu lar la división celular (o hacer que las células que normalmente seguirían una di ferenciación terminal continúen dividiéndose); la exposición previa al iniciador provoca el crecim iento de una gran cantidad de pequeños tumores benignos pa recidos a verrugas, denominados papilomas. Cuanto mayor es la dosis previa del iniciador mayor es el número de papilomas inducido; parece que cada papiloma (al menos para dosis bajas del iniciador) consiste en un único clon de células descendiente de una célula mutante producida por el iniciador. Probablemente tanto la herida como la aplicación del promotor actúan induciendo la expresión de algunos de los genes que directa o indirectamente afectan a la proliferación celular. Estos genes pueden permanecer quiescentes en el epitelio en reposo, de manera que cualquier m utación que se haya producido en respuesta al iniciador pasa inadvertida; al inducir la expresión génica, el promotor o el estímulo de la herida pueden poner de manifiesto las mutaciones y permitirles empezar a in fluir en la proliferación celular (Figura 24-13). Un papiloma típico puede contener aproximadamente 105 células. Si se in terrumpe la exposición al promotor tumoral casi todos los papilomas entran en regresión y la piel recupera una apariencia prácticamente normal -com o cabría esperar a partir de la hipótesis ilustrada en la Figura 24-13. Sin embargo, en unos cuantos tipos de papilomas se producen cambios adicionales que permiten que el crecim iento continúe de forma incontrolada, incluso después de que se haya retirado el promotor. Estos cambios parecen originarse de vez en cuando en cé lulas de papiloma individuales, con una frecuencia aproximadamente igual a la esperada para las mutaciones espontáneas. De esta forma, una pequeña propor ción de los papilomas progresan hasta convertirse en cánceres. Así, aparente mente el promotor tumoral favorece el desarrollo del cáncer, al menos en este sistema, expandiendo la población de células que llevan una mutación inicial: cuantas más células haya, y más veces se dividan, mayor será la probabilidad de que al m enos una de ellas sufra otra mutación que la adelante un paso en el ca mino hacia la malignidad. Aunque los cánceres que se producen naturalmente no surgen necesariam ente a través de la secuencia específica de distintos pasos de iniciación y promoción que acabam os de describir, su evolución puede estar gobernada por principios similares a éstos. Estos cánceres naturales también evolucionaran a una velocidad que depende de la frecuencia de mutaciones y de factores que afecten la supervivencia, la proliferación y la expansión de ciertos tipos de células mutantes, después de que dichas células hayan aparecido.
La mayoría de cánceres se producen por com binaciones evitables de causas am bientales9 Generalmente, el desarrollo de un cáncer comprende muchas etapas, cada una de las cuales está gobernada por múltiples factores: algunos de ellos son depen dientes de la constitución genética de los individuos, otros son dependientes de su entorno y de su modo de vida. Por lo tanto, cambiando nuestro medio am biente o nuestros hábitos podemos, en principio, ser capaces de reducir nota-
135 6
Capítulo 24 : Cáncer
EXPANSIÓN ANORMAL DEL CLON MUTANTE
Figura 24-13 Una hipótesis propuesta para explicar el efecto de los promotores tumorales sobre el desarrollo de tumores. Un iniciador causa la mutación en un gen que normalmente no se expresa en células en reposo. El promotor activa el gen mutado y, provocando la división celular, aumenta el número de células que contienen la mutación. Alternativamente, el gen mutante puede expresarse de forma constitutiva pero no tener efecto hasta que el promotor active otros genes necesarios para la proliferación celular.
Tabla 24-2 Variación entre países en la incidencia de algunos cánceres comunes Lugar de origen del cáncer Población de alta incidencia Localización Pulmón Mama Próstata Cuello del útero Estómago Hígado Colon Melanoma Nasofaríngeo Esófago Vejiga Útero Ovario Recto Laringe Páncreas Labio Riñón Cavidad Oral Leucemia Testículo
Población de baja incidencia
Incidencia* Localización
Incidencia*
EEUU (Nueva Orleans, negros) 110 India (Madrás) 5,8 Hawaii ( hawaianos) 94 Israel (no judíos) 14,0 EEUU ( Atlanta, negros) 91 China (Tianjín) 1,3 Brasil (Recife) 83 Israel (no judíos) 3,0 Japón (Nagasaki) 82 Kuwait (kuwaitíes) 3,7 34 Canadá (Nueva Escocia) 0,7 China (Shangai) EEUU (Connecticut, blancos) 34 India (Madrás) 1,8 Australia (Queensland) 31 Japón (Osaka) 0,2 Hong Kong 30 Reino Unido (Sudoeste) 0,3 Francia (Calvados) 30 Rumania (Cluj urbano) 1,1 Suiza (Basilea) 28 India (Nagpur) 1,7 EEUU (San Francisco 26 India (Nagpur) 1,2 BayArea, blancos) Nueva Zelanda 26 Kuwait (kuwaitíes) 3,3 (isleños polinesios) Israel (europeos y 23 Kuwait (kuwaitíes) 3,0 nacidos en EEUU) Brasil (Sao Paulo) 18 Japón (Miyagi rural) 2,1 EEUU (Los Ángeles, coreanos) 16 India (Poona) 1,5 Canadá (Newfoundland) 15 Japón (Osaka) 0,1 Canadá (NWT y Yukon) 15 India (Poona) 0,7 Francia (Bas-Rhin) 14 India (Poona) 0,4 12 India (Nagpur) 2,2 Canadá (Ontario) Suiza (Vaud urbano) 10 China (Tianjín) 0,6
’ Incidencia = número de casos nuevos por año por cada 100 000 personas, ajustado para una distribución de edades estandarizada (para eliminar efectos debidos,meramente a la distribu ción de la edad de la población). Los valores de cáncer de mama, cuello de útero, útero, y ovario son en mujeres; el resto de datos son en hombres. Adaptado de V.T. DeVita, S. Hellman, and S.A. Rosenberg (eds.), Cáncer: Principies and Practice of Oncology, 4th ed. Philadelphia: Lippincott, 1993; basado en datos de C. Muir et al, Cáncer Incidence in Five Continents, Yol. 5, Lyon: International Agency for Research on Cáncer, 1987.
blem ente nuestra posibilidad de desarrollar casi cualquier tipo dado de cáncer. Esto se demuestra más claramente comparando la incidencia de cáncer en dife rentes países: casi cualquier cáncer que sea común en un país se presenta con valores de incidencia varias veces menor en algún otro país (Tabla 24-2); las po blaciones de emigrantes tienden a adquirir el patrón de incidencia de cáncer tí pico del país de adopción, lo cual implica que las diferencias en cuanto a inci dencia son debidas a factores ambientales, no genéticos. A partir de estos resultados se estima que el 80-90% de cánceres se podrían evitar. Por desgracia los distintos tipos de cánceres tienen diferentes factores ambientales de riesgo, y un país que se escapa a uno de esos factores de riesgo no tiene mayor probabili dad que otros países de escapar del resto de factores; así, la incidencia de cáncer en general (entre individuos de una determinada edad) es similar entre los dife rentes países estudiados. Sin embargo existen algunos subgrupos de individuos cuyo austero modo de vida parece que reduce el número total de muertes por cáncer: por ejemplo, la incidencia de cáncer entre los estrictos mormones de Utah es de aproximadamente la mitad que entre los americanos en general. Estas observaciones epidemiológicas indican que el cáncer puede evitarse, pero sigue siendo difícil identificar los factores ambientales específicos del ries go o establecer cóm o actúan. Ciertamente algunos factores actúan como inicia-
E1 cáncer como un proceso de microevolución
1357
Figura 24-14 Efectos del parto sobre el riesgo de padecer cáncer de mama. La probabilidad relativa de desarrollar cáncer de mama en algún momento de la vida de una mujer está representada en función de la edad a la que dio a luz su primer hijo. La gráfica muestra el valor de la probabilidad respecto a la de las mujeres sin hijos. Cuanto mayor es la espera antes de dar a luz el primer hijo, mayor es la probabilidad de cáncer de mama, lo cual sugiere que la exposición a ciertas com binaciones de hormonas sexuales puede estimular el desarrollo de cáncer. A partir de estudios de laboratorio se dispone de cierta evidencia de que la primera gestación com pleta puede producir un cambio epigenético permanente en las células de la mama, alterando su respuesta posterior a las hormonas. Muchos otros factores -p o r ejemplo, el contenido en grasa de la d ieta- están también altamente correlacionados con el cáncer de mama, y algunas mujeres son portadoras de genes que aumentan el riesgo a la enfermedad. (De J. Cairns, Cáncer: Science and Society. San Francisco: W.H. Freeman, 1978. Conforme a B. MacMahon, P. Coley J. Brown,/. Nati. C áncerInst. 50:21-42, 1973.)
dores tumorales mutagénicos, provocando directamente un cambio genético; otros probablemente actúen como promotores tumorales, ayudando a aumentar la población de células obligadas a progresar, a través de sucesivas mutaciones, hasta conseguir un cáncer en pleno desarrollo. Probablemente tanto los agentes cancerígenos del humo del tabaco como la aflatoxina producida en los cacahue tes tropicales (véase Figura 24-6), pertenecen fundamentalmente a la primera categoría, mientras que las hormonas reproductoras que circulan en el cuerpo de una mujer durante diferentes etapas de su vida podrían pertenecer a la se gunda categoría. La im portancia de estas hormonas queda establecida en la es trecha correlación existente entre el historial reproductor de la mujer y el riesgo a desarrollar cáncer de mama; probablem ente estas hormonas afectan la inci dencia de cáncer a través de su influencia sobre la proliferación celular en la mama (Figura 24-14). Es posible que algunos otros factores también actúen por otros cam inos -p o r ejemplo, causando cambios epigenéticos heredables. Evi dentemente, no es necesario comprender cómo actúan los agentes causantes de cáncer para poder identificarlos y aprender cómo evitarlos. En este sentido, la epidemiología sobre el cáncer ha tenido éxitos notables y en el futuro probable mente tendrá muchos más; simplemente m encionando el riesgo de fumar, en América del Norte y en Europa ha contribuido a reducir el número total de muertes por cáncer del orden del 30%. La prevención del cáncer no es sólo m e jor que su curación sino que, dado nuestro estado actual de conocimiento, tam bién parece que puede llevarse a cabo más fácilmente.
La búsqueda de curaciones para el cáncer es dura pero no im posible10 La dificultad de curar un cáncer es como la de librarse de las malas hierbas. Las células cancerosas pueden ser extirpadas quirúrgicamente o destruidas con agentes tóxicos o con radiación, pero es difícil erradicarlas todas y cada una de ellas. La cirugía raramente puede descubrir todas las metástasis, y los tratamien tos que matan a las células cancerosas generalmente también son tóxicos para las células normales. Además, con que queden unas cuantas células cancerosas, pueden proliferar y producir un resurgimiento de la enfermedad; a diferencia de las células normales, pueden desarrollar resistencia a los tóxicos utilizados en su contra. A pesar de todo ello, la perspectiva no es desesperada. A despecho de las dificultades, se han desarrollado curas efectivas utilizando drogas anticancero sas (solas o en com binación con otros tratamientos) contra algunos cánceres que anteriormente eran muy letales (especialmente el linfoma de Hodgkin, el cáncer de testículo, el coriocarcinoma, algunas leucemias y algunos otros tipos de cáncer de la infancia). Además, para el caso de algunos de los cánceres más comunes, una cirugía apropiada o una radioterapia local permiten la recupera
1358
Capítulo 2 4 : Cáncer
1,4
1,0
m ujeres sin hijos • •«
0,6
0,2
15 25 35 edad a la que la m ujer tiene su prim er hijo
ción de una gran proporción de pacientes si la enfermedad se diagnostica en una etapa razonablemente temprana. En algunos casos, tratamientos efectivos, están basados en el entendimiento de las causas de un tipo específico de cáncer. Por ejemplo, los estrógenos parecen actuar como promotores naturales del cán cer de mama (Figura 24-14), y el tratamiento con un antagonista de estrógenos, como el fármaco tamoxifeno, es efectivo en la mayoría de pacientes de cáncer de mama, evitando o retardando la recurrencia de la enfermedad. Incluso cuando la curación parece estar fuera de nuestro alcance, se dispone de tratamientos que prolongan la vida o al menos alivian la dolencia. Una gran parte de la investigación clínica sobre el cáncer se centra en el pro blema de cómo matar selectivamente las células cancerosas. En su mayoría, los métodos actuales aprovechan diferencias relativamente sutiles existentes entre las células normales y las neoplásicas con respecto a su velocidad de prolifera ción, a su metabolismo y a la sensibilidad a la radiación; estos métodos tienen efectos tóxicos locales desagradables. Algunos tipos de células cancerosas son es pecialmente vulnerables al ataque selectivo porque dependen de hormonas espe cíficas o porque sus superficies tienen características químicas no usuales que pueden ser reconocidas por anticuerpos. Sin embargo, en general el progreso en el difícil problema de la selectividad anticancerosa ha sido lento -u n a cuestión de ensayo y error con una dosis igual de adivinación y de cálculo racional. En la búsqueda de métodos mejores para controlar la supervivencia, la pro liferación y la expansión de las células cancerosas, es importante examinar más detalladamente las estrategias mediante las que estas células prosperan y se multiplican.
El crecim iento canceroso depende a menudo de desórdenes de la diferenciación celular11 Hasta ahora hemos destacado que las células cancerosas desafían los controles normales de la división celular: ésta es su propiedad sobresaliente. De todos m o dos para que un tumor crezca sin límites han de cumplirse otros requisitos. Por ejemplo, las células del tumor han de estimular el desarrollo de vasos sanguíne os que les proporcionarán los nutrientes y el oxígeno necesarios para crecer, como se com enta en el Capítulo 22. Sin embargo, muchos tejidos están organi zados de tal manera que incluso un aumento incontrolado en la frecuencia de divisiones celulares no producirá por sí mismo un tumor de crecimiento cons tante. El ejemplo del cuello uterino, comentado anteriormente, ilustra este pun to. Como ocurre con la epidermis de la piel y de muchos otros epitelios, el epite lio del cuello uterino normalmente se renueva continuam ente descamando en su superficie externa las células diferenciadas de forma terminal y generando cé lulas que las reemplazan a partir de las células madre en la lámina basal. En pro medio, cada división normal de una célula madre genera una célula madre hija y una célula que está condenada a la diferenciación terminal y a la suspensión de la división celular. Si la célula madre simplemente se dividiera más rápidamen te, las células diferenciadas de forma terminal se producirían y se descamarían más rápidamente, con lo que se seguiría m anteniendo un equilibrio entre géne sis y destrucción. Por tanto, si una célula madre transformada va a generar un clon de progenie en crecim iento constante, las pautas básicas deben estar tras tornadas: o bien más del 50% de las células hijas deben permanecer como célu las madre, o el proceso de diferenciación debe estar descontrolado de manera que las células hijas embarcadas en esta ruta retengan la capacidad de seguir dividiéndose indefinidamente y evitar ser descartadas al final de la línea de producción (Figura 24-15). Probablemente, el desarrollo de tales propiedades es la causa de la progre sión desde una displasia benigna del cuello uterino a un carcinom a in situ y a un cáncer maligno (véase Figura 24-10). Consideraciones similares a éstas también son válidas para el desarrollo de cáncer en otros tejidos que dependen de células madre, como la piel, el revestimiento del intestino, y el sistema hematopoyético.
El cáncer como un proceso de microevoiución
1359
/ /
y \
A \
//i\//i\/ii\ li II
«Iffí*
m
•v v
•
/m /m/m/m
a
células que no se dividen y que finalm ente son descartadas (A) RUTA NORMAL
(B) LA CELULA MADRE FRACASA EN LA PRODUCCIÓN DE UNA SOLA CÉLULA QUE NO SEA CÉLULA MADRE EN CADA DIVISIÓN Y POR ELLO PROLIFERAN FORMANDO UN TUMOR
Por ejemplo, parece que varias formas de leucemia surgen por una disfunción del programa normal de diferenciación, de tal forma que un progenitor determi nado de un tipo particular de célula sanguínea continúa dividiéndose indefini damente en lugar de diferenciarse terminalmente en la forma normal, después de un número estrictam ente limitado de ciclos de división (se trata en el Capítu lo 22). En general, las mutaciones o los cambios epigenéticos que bloquean la maduración normal de las células hacia un estado terminal diferenciado en el que no se dividen o que alteran el programa natural de muerte celular, deben ju gar un papel esencial en muchos tipos de cáncer. Por lo tanto, existen algunas expectativas de que en el tratamiento del cáncer las drogas que estimulan la di ferenciación celular puedan convertirse en una alternativa o un complemento útil a las drogas que simplemente m atan las células en división.
Para form ar m etástasis, las células cancerosas han de ser capaces de cruzar la lám ina basal12 Lo que hace al cáncer difícil de erradicar, quirúrgicamente o por irradiación lo calizada, es su habilidad para formar metástasis. Para diseminarse ampliamente por el cuerpo, las células de un tumor sólido típico han de ser capaces de dismi nuir su adhesión a sus vecinas originales, escapar del tejido de origen, atravesar otros tejidos hasta llegar a un vaso sanguíneo o linfático, cruzar la lámina basal y el revestimiento endotelial del vaso para entrar a la circulación, salir de la cir culación en otra parte del cuerpo y sobrevivir y proliferar en el nuevo entorno en el que se encuentren (Figura 24-16). Cada uno de estos pasos requiere distin tas propiedades. Por ejemplo, en una gran variedad de carcinom as estudiados la disminución de la adhesión a las células vecinas en un epitelio depende de la pérdida de expresión de cadherina E, una molécula de adhesión entre células del epitelio, m ientras que la habilidad en atravesar tejidos parece depender de la producción de enzimas proteolíticas que permitan degradar la matriz extracelular. Los últimos pasos son probablem ente los más difíciles: muchos tum o res liberan a la circulación un número bastante grande de células, pero sólo una pequeña proporción de ellas consiguen fundar colonias de metástasis. Algunos tipos de células normales -especialm ente los glóbulos blancos- ya tienen algunas o todas las propiedades necesarias para diseminarse a través del cuerpo, pero probablemente, para muchos cánceres la habilidad para formar
136 0
Capítulo 24 : Cáncer
tum or (C) LAS CÉLULAS HIJAS NO SE DIFERENCIAN NORMALMENTE Y POR ELLO PROLIFERAN FORMANDO UN TUMOR Figura 24-15 Control normal y alterado de la producción de células a partir de cálidas madre. (A) Estrategia normal para producir nuevas células diferenciadas. (B y C) Dos tipos de alteraciones que pueden producir la proliferación desenfrenada característica del cáncer. Nótese que una velocidad excesiva de división celular de las células madre no tendría este efecto por sí sola, ya que cada división celular produce una sola célula madre.
tu m o r benigno en el epitelio bronquial
lámina basal
ruptura a través de la lám ina basal
se invade el capilar
tejido conjuntivo
^ viaje a través de la sangre (menos de 1 de cada 1000 células sobrevivirá form ando metástasis)
se adhiere a la pared del capilar en el hígado
escapa del capilar (extravasación)
prolifera form ando metástasis en hígado
« metástasis requiere mutaciones adicionales o cambios epigenéticos. Se cree que estas transformaciones, como otras implicadas en el desarrollo del cáncer, ocu rren al azar en la población tumoral inicial: sólo aquellas pocas células que ad quieran las propiedades necesarias para formar metástasis y lleguen por casuali dad a un entorno adecuado serán capaces de fundar tumores secundarios. De acuerdo con este concepto de evolución a través de variación al azar y selección natural, se observa que las células de un mismo tumor son heterogéneas en cuanto a su capacidad de formar metástasis (Figura 24-17). A la larga, la compresión de los mecanismos moleculares de la formación de metástasis debería permitir el diseño de tratamientos para bloquearla. Se han hecho algunos progresos en este sentido. Por ejemplo, se ha demostrado que para que las células tumorales crucen una lámina basal deben tener receptores de laminina que permitan a las células adherirse a la lámina, y han de segregar colagenasa de tipo IV, que las ayude a digerir la lámina (Figura 24-18). En anim a les de experimentación se ha demostrado que los anticuerpos u otros reactivos que bloquean la unión a laminina o la actividad de la colagenasa de tipo IV impi den la formación de metástasis. Queda por ver si los pacientes de cáncer pueden ser ayudados por tratamientos que detengan de esta manera la expansión por metástasis.
Las mutaciones que aum entan la frecuencia de mutación aceleran el desarrollo del cáncer1,13
Figura 24-16 Etapas en el proceso de metástasis. Este ejemplo ilustra la expansión de un tumor desde un órgano como el pulmón o la vejiga hasta el hígado. Las células tumorales pueden entrar directam ente al torrente circulatorio cruzando la pared de un vaso sanguíneo -co m o aquí se esquem atiza- o, quizás más frecuentemente, cruzando la pared de un vaso linfático. Finalmente los vasos linfáticos descargan su contenido (linfa) en el torrente circulatorio pero a menudo las células tumorales que han entrado en un vaso linfático quedan atrapadas en nodulos linfáticos, produciendo metástasis en estos nodulos linfáticos. Diversos estudios en animales demuestran que de cada mil células tumorales malignas que entran en el torrente circulatorio, generalmente sobrevive una que produce un tumor en otro sitio del cuerpo.
Como hemos remarcado, la incidencia de tumores y su velocidad de progresión de benignos a malignos dependen de la frecuencia de mutación. La velocidad de
El cáncer como un proceso de microevolución
1361
clon derivado de una sola célula SE INYECTAN LAS MUESTRAS EN s. RATONES HUÉSPED
mutación puede ser alta tanto debido a la presencia de mutágenos en el entorno como debido a defectos intracelulares en la maquinaria que gobierna la replicación, la recom binación y la reparación del DNA. Por ejemplo, las personas que padecen xeroderma pigmentosum, un trastorno genético poco frecuente, tienen un defecto en el sistema de enzimas necesarias para reparar el tipo de alteración en el DNA que se produce por irradiación con luz ultravioleta; en consecuencia, la más ligera exposición de la piel a la luz del sol provocará cánceres de piel. Una predisposición más general al cáncer se observa en el relativamente común sín drome HNPCC, com o veremos en la página 1383, en el síndrome de Bloom, la anemia de Fanconi y la ataxia telangiectasia. En estos raros trastornos genéticos, la anomalía se hereda a través de la línea germinal y por tanto está presente en todas las células del cuerpo. Sin embargo, pueden aparecer defectos genéticos del metabolismo del DNA, similares a éstos, a través de mutaciones originadas en células somáticas. De hecho, mutaciones que provocan un aumento en la ve locidad de mutación parecen ser un factor importante en el desarrollo de m u chos cánceres. Algunas de estas mutaciones facilitan pequeños cambios locales en la secuencia de DNA. Otros, particularmente comunes, facilitan alteraciones importantes del genoma. A menudo, las células cancerosas muestran una variabilidad anormal en el tamaño y en la forma de sus núcleos así como en el número y estructura de sus cromosomas; de hecho, la morfología anormal del núcleo es una de las caracte rísticas clave utilizadas por los patólogos para diagnosticar un cáncer (Figura 2419). Cuando se hacen crecer células cancerosas en cultivo, a menudo se observa que tienen un cariotipo extraordinariamente inestable: los genes aparecen am plificados o mutilados y los cromosomas se pierden, se duplican o se translocan con una frecuencia mucho mayor que en las células normales en cultivo. Esta variabilidad crom osóm ica sugiere que las células sufren algún error heredable en la maquinaria o control de la replicación, reparación, recombinación o segre gación de los cromosomas. Este defecto, producido por una mutación somática, podría ser el responsable del aumento en la probabilidad de aparición de muta ciones posteriores en otras clases de genes, y por lo tanto proporciona una vía fácil hacia la acumulación de mutaciones múltiples necesarias para el compor tamiento canceroso. Estudios de genética molecular han revelado un m ecanis mo que explica esta desestabilización del cariotipo de las células cancerosas, como se verá en la última parte del capítulo cuando se discute el papel de una proteína conocida como proteína p53. Figura 24-18 Tres etapas del proceso de cruce de una lámina basal, una tarea que las células tumorales invasivas han de ser capaces de realizar. Algunas de las evidencias experimentales de este mecanism o se presentan en la Figura 19-59.
1 36 2
Capítulo 2 4 : Cáncer
Figura 24-17 Experimento demostrativo de que existen diferencias heredables clonalmente entre las células de un único tumor con respecto a su habilidad para formar metástasis. Se subclonan células derivadas de una sola línea celular cancerosa, y se estudian alícuotas estándar de cada subclón mediante inyección en el torrente circulatorio de ratones huésped. Los subclones difieren marcadamente en el número de metástasis que producen por ratón.
UNIÓN A LAMININA
receptor de
1 colágena de tipo IV en la lámina basal DIGESTIÓN DE LA LÁMINA BASAL POR COLAGENASA DE TIPO IV
Figura 24-19 Variabilidad y tamaño anormales del núcleo de una célula cancerosa. La fotografía muestra una sección del epitelio de mama de una paciente con carcinoma de Paget, en el cual la epidermis está invadida por células cancerosas originadas en la mama. Las células cancerosas pueden ser diferenciadas de las normales por su núcleo anormalmente grande y polimorfo; también por el borde de espacio claro que rodea a cada una de ellas. (Cortesía de Andrew Hanby.)
El increm ento de la capacidad de mutar de las células cancerosas confiere a estas células una cierta capacidad de evadirse de la destrucción producida por drogas anticancerosas10,14 Cualquiera que sea el origen de la mutabilidad anormalmente alta de las células cancerosas, casi todas las poblaciones de células tumorales malignas son hete rogéneas en muchos aspectos y son capaces de evolucionar a una velocidad alarmante cuando se someten a nuevas presiones de selección. Esto agrava las dificultades de la terapia contra el cáncer. Para matar la mayoría de las células neoplásicas en un paciente con cáncer pueden utilizarse, en tratamientos repe tidos, drogas que son tóxicas selectivamente para las células en división, pero ra ramente es posible matarlas todas: generalmente una pequeña proporción de ellas es resistente a la droga, y el efecto que ha tenido el tratamiento ha resultado ser el de favorecer la expansión y evolución de las células con esta característica. Lo que es peor: a menudo las células expuestas a una droga desarrollan re sistencia no sólo a esta droga, sino también a otras drogas a las cuales nunca han estado expuestas. Frecuentemente, este fenómeno de resistencia múltiple a las drogas se correlaciona con un cambio curioso en el cariotipo: se observa que la célula contiene pares de cromosomas adicionales de muy pequeño tamaño -lo s llamados pares de cromosomas diminutos- o que tiene una región de tinción ho mogénea interpolada en el patrón normal de bandas de uno de sus cromosomas regulares. Ambas aberraciones consisten en ampliaciones masivas del número de copias de un pequeño segmento del genoma. El clonaje de este DNA amplifi cado ha revelado que a menudo contiene un gen específico, conocido como gen de resistencia múltiple a las drogas (mdrl, de MultiDrug Resistence), el cual co difica una ATPasa de transporte unida a membrana (perteneciente a la superfamilia de transportadores ABC, comentada en el Capítulo 11) que al parecer im pide la acumulación intracelular de ciertas clases de drogas lipofílicas, bombeándolas hacia el exterior de la célula. La amplificación de otros tipos de genes tam bién puede conferir a la célula cancerosa una ventaja selectiva: así, el gen de la enzima dihidrofolato reductasa (DHFR) a menudo resulta amplificado en respuesta a la quimioterapia contra el cáncer con metotrexato -u n antagonis ta del ácido fólico- y los protoncogenes myc (comentados posteriormente), cu yos productos estimulan la proliferación celular, también son amplificados de forma similar en algunos cánceres (Figura 24-20). Los defectos en la replicación, recom binación y reparación del DNA pueden ayudar a las células cancerosas a evolucionar al aumentar su capacidad de mu tar, pero también pueden hacer que las células sean más vulnerables a ciertos ti pos de ataque. Esto puede explicar la observación -aprovechada en terapia- de
El cáncer como un proceso de microevolución
1363
(A)
(B)
que es más fácil matar, por irradiación o por exposición a drogas específicas que interfieren con el metabolismo del DNA, a las células de muchos tumores que a las células normales. A medida que vamos aprendiendo acerca de los m ecanis mos moleculares de la replicación, recom binación y reparación del DNA, em pieza a ser posible diseñar ensayos para determinar con precisión los defectos en estas funciones en casos individuales de cáncer, como muestra la última sec ción de este capítulo. Utilizando este tipo de información deberíamos estar más capacitados para matar las células delincuentes mediante drogas diseñadas de tal forma que aprovechen sus debilidades particulares.
Resumen
Las células cancerosas, por definición, proliferan desafiando los controles norma les (es decir, son neoplásicas) y son capaces de invadir y colonizar los tejidos que las rodean (es decir, son malignas). Originan tumores secundarios o metástasis, por lo que resulta muy difícil erradicarlas quirúrgicamente. Se cree que la mayoría de cánceres se originan a partir de una única célula que ha experimentado una muta ción somática, pero para que la progenie de esta célula se transforme en cancerosa ha de sufrir más cambios, los cuales probablemente requieren varias mutaciones adicionales. Este fenómeno de progresión tumoral, que generalmente dura muchos años, refleja la evolución por mutación y selección natural entre las células somáti cas; la velocidad de este proceso está acelerada por agentes mutagénicos (iniciado res tumorales) así como por ciertos agentes no mutagénicos (promotores tumorales) que afectan a la expresión génica, estimulan la proliferación celular y alteran el equilibrio ecológico de células mutantes y no mutantes. Así, en el desarrollo de un cáncer dado contribuyen muchos factores; algunos de estos factores son caracterís ticos del entorno que se podrían evitar, por lo que, en principio, una gran propor ción de cánceres se pueden prevenir. En la investigación sobre el cáncer, se han dedicado muchos esfuerzos a la búsqueda deformas para curar la enfermedad exterminando las células cancero sas sin afectar a sus vecinas normales. Una aproximación racional a este proble ma requiere conocer las propiedades especiales de las células cancerosas que les permiten evolucionar, multiplicarse y expandirse. Así, a menudo parece que la proliferación de las células neoplásicas está asociada a un bloqueo de la diferen ciación, por lo que la progenie de una célula madre puede continuar dividiéndose en lugar de entrar en un estado terminal de no división; en principio, la prolifera ción puede frenarse estimulando la diferenciación celular. Para que las células tu morales se transformen en malignas han de ser capaces de cruzar la lámina basal; se pueden diseñar anticuerpos que interfieran con esta capacidad, de forma que obstaculicen la formación de metástasis. A menudo se observa que las células can136 4
Capítulo 2 4 : Cáncer
Figura 24-20 Los cambios cromosómicos en las células cancerosas reflejan la amplificación génica. En estos ejemplos los números de copias de un proto-oncogén myc han sido amplificados. Los cromosomas están marcados en rojo fluorescente, mientras que las copias múltiples del gen myc se han localizado mediante una hibridación in situ utilizando una sonda marcada con fluorescencia amarilla. (A) Cariotipo de una célula en la cual las copias del gen myc están presentes como cromosomas dobles diminutos (manchas amarillas pareadas). (B) Cariotipo de una célula en la cual aparecen copias múltiples del gen myc en una región marcada homogéneamente (amarillo) interpolada en uno de los cromosomas normales. (Normalmente se ven copias únicas de genes myc como minúsculas manchas amarillas en otros lugares del genoma.) En células cancerosas que tienen otros genes amplificados se ven estructuras similares a éstas. (Cortesía de Denise Sheer.)
cerosas presentan una capacidad de mutar anormalmente elevada; esto acelera la evolución del complejo grupo de propiedades que son necesarias para la neoplasia y la malignidad y ayuda a las células cancerosas a desarrollar resistencia a las dro gas anticancerosas. Al mismo tiempo, sin embargo, los defectos en el metabolismo del DNA que son la causa de esta capacidad de mutar pueden hacer que las células cancerosas sean especialmente vulnerables a un ataque terapéutico diseñado de forma adecuada. Genética molecular del cáncer15 El cáncer es el resultado de una serie de accidentes genéticos al azar sujetos a se lección natural, por lo que no es probable que se produzcan dos casos de cáncer genéticam ente idénticos, incluso aunque sean de la misma enfermedad. No obstante, en todos los cánceres cabe esperar que participe una alteración de las restricciones normales sobre proliferación celular; para cada tipo celular existe un número finito de mecanismos por los que se puede producir esta alteración. De hecho, parece que en el cáncer los responsables de la mayor parte de la des regulación de la división celular son algunos cambios en un grupo relativamente pequeño de genes. La identificación y caracterización de muchos de estos genes ha sido uno de los grandes triunfos de la biología molecular. La proliferación celular puede estar regulada directamente a través del m e canismo que determina si una célula pasa el punto de restricción o “inicio” del ciclo de división celular, como se indica en el Capítulo 17, o indirectamente -p or ejemplo, a través de la regulación del mecanismo que somete la célula a diferen ciación terminal o a muerte celular programada. En cualquier caso, los genes re guladores normales pueden clasificarse, de forma laxa, en aquellos cuyos pro ductos ayudan a estimular la proliferación celular y aquellos cuyos productos ayudan a inhibirla. Por lo tanto existen dos caminos de mutación hacia la proli feración celular incontrolada y la invasividad que son características del cáncer. El primero consiste en conseguir que un gen estimulador se vuelva hiperactivo: este tipo de mutación tiene un efecto dominante -e s suficiente con que el cam bio afecte a una de las dos copias del gen en la célula; el gen alterado se denomi na un oncogén (siendo el alelo normal un proto-oncogén; del griego onkos, tu mor). El segundo consiste en inactivar im gen inhibidor: este tipo de mutación tiene un efecto recesivo -para que la célula quede libre de la inhibición es nece sario que las dos copias del gen en la célula estén inactivadas o delecionadas; al gen perdido se le llama, en espera de un nombre mejor, un gen supresor de tu mores. Los genes mutados con efectos dominantes -e s decir los oncogenes- pueden identificarse directamente tomando DNA procedente de células tumorales y bus cando fragmentos que cuando se introducen en células normales les hagan com portarse como células tumorales. A finales de los años 1970 se diseñaron técnicas que permitieron alcanzar este propósito; se desarrollaron después de estudios más tempranos de procesos similares que ocurren de forma natural, cuando los virus trasladan su material genético desde una célula a otra. Este trabajo facilitó el camino hacia el descubrimiento masivo de oncogenes y proto-oncogenes. En esta sección trataremos de los oncogenes y de los supresores de tumores. Concluimos presentando el estudio de una variedad común de cáncer, en el que los pasos de la progresión tumoral pueden relacionarse con una serie de muta ciones identificadas.
Los retrovirus pueden actuar como vectores para los oncogenes que modifican el com portam iento celular16,17>18 Los virus juegan un papel remarcable en la investigación de las causas del cán cer humano. A pesar de que los virus no desempeñan ningún papel importante en la mayoría de cánceres humanos, son una de las causas predominantes de
Genética molecular del cáncer
1365
Tabla 24-3 Algunos cambios que normalmente se observan cuando un cultivo celular es transformado por un virus tumoral
1. Anormalidades relacionadas con la membrana plasmática A. Activación del transporte de metabolitos B. Abultamiento excesivo de la membrana plasmática C. Aumento de movilidad de las proteínas de la membrana plasmática 2. Anormalidades de adherencia A. Disminución de la adhesión a superficies; por lo tanto son capaces de mantener una morfología redondeada B. Incapacidad de los filamentos de actina de organizarse en fibras de estrés C. Disminución de la red externa de fibronectina D. Incremento de la producción de activador de plasminógeno, causando un incremento de la proteolisis extracelular 3. Anormalidades de crecimiento y división A. Crecimiento hasta una densidad celular extraordinariamente alta B. Disminución del requerimiento de factores de crecimiento C. Disminución de la dependencia de anclaje (pueden crecer incluso sin unión a una superficie rígida) D. “Inmortalidad” (pueden continuar creciendo indefinidamente) E. Pueden causar tumores cuando son inyectadas a animales susceptibles
cáncer en algunas especies animales; el análisis de los virus animales de tumora les han proporcionado una de las claves del conocim iento del mecanismo gene ral del cáncer. El primer virus tumoral animal fue descubierto hace más de 80 años en po llos que están sujetos a infecciones que generan tumores en el tejido conjuntivo, o sarcomas. El agente infeccioso fue caracterizado como un virus -e l virus del sarcoma de Rous, que ahora sabemos que es un virus de RNA. Como los otros vi rus de RNA tumorales descubiertos, hasta ahora, es un retrovirus. Cuando in fecta a una célula, su RNA es copiado a DNA mediante una transcripción inversa y el DNA se inserta en el genoma huésped, donde puede persistir y heredarse en las generaciones de células sucesivas. En la Figura 6-82 se presenta el ciclo vital de un retrovirus y se muestra cómo su genoma sufre una transcripción inversa, se integra en el DNA huésped y cómo sale y entra de la célula huésped. Pero, ¿de qué forma una infección vírica genera tumores? La solución a este problema, como para otros muchos casos de biología celular, depende del desa rrollo de un ensayo adecuado por el cual pueda determinarse la capacidad de generar tumores de distintas cepas de virus. El ensayo, ampliamente utilizado, consiste simplemente en la proliferación de fibroblastos sobre una placa de cul tivo. Si se añade al medio de cultivo un virus tumoral activo, en pocos días apa recen pequeñas colonias de células transform adas que proliferan anormalmen te. Cada una de estas colonias es un clon que deriva de una única célula que ha sido infectada por el virus y ha incorporado de manera estable el material gené tico del virus. Una vez liberadas de los controles sociales de división, las células transformadas crecen más que las normales en la placa de cultivo, como ocurre en el cuerpo, y por lo tanto generalmente son fáciles de seleccionar. Las células transformadas, normalmente, presentan un complejo síndrome de anormalida des (se resumen en la Tabla 24-3). Por ejemplo, tienden a perder la inhibición de la división celular dependiente de la densidad celular (véase Figura 17-39) y se apilan en capas a medida que proliferan (Figura 24-21). Además, a menudo cre cen independientes de anclaje y son capaces de dividirse incluso cuando se mantienen en suspensión; presentan una forma alterada y se adhieren escasa mente al substrato y a otras células, manteniendo una apariencia redondeada que recuerda a la de una célula normal en mitosis; pueden ser capaces de proli-
13 6 6
Capítulo 24 : Cáncer
monocapa de células norm ales inhibidas por contacto
Figura 24-21 Pérdida de inhibición por contacto. Habitualmente las células cancerosas, a diferencia de la mayoría de las células normales, cuando ya han formado una capa confluente continúan creciendo y se apilan unas sobre otras.
m ulticapa de células cancerosas no Inhibidas placa de plástico de cultivo de tejido
ferar incluso en ausencia de factores de crecimiento; son inmortales y en cultivo no alcanzan la etapa de senescencia; cuando son inyectadas de nuevo en una animal huésped adecuado, pueden generar tumores. Este comportamiento desregulado de las células transformadas puede de berse a un oncogén transportado por el virus pero que no es necesario para la supervivencia o la reproducción del propio virus. Esto fue demostrado por pri mera vez gracias al descubrimiento de un mutante de los virus del sarcoma de Rous que se multiplica de forma normal pero que no transforma la células hués ped. La pérdida de capacidad transformadora corresponde a la pérdida o inacti vación de un gen, que recibió el nombre de src (Figura 24-22). Este gen específi co del virus del sarcoma de Rous es responsable de la transformación celular in vitro y de la formación de tumores in vivo, pero es una carga innecesaria desde el punto de vista de la propagación del propio virus.
Los retrovirus recogen oncogenes por accidente16,17,19 Si el gen src es perjudicial para el animal e innecesario para el virus, ¿por qué está presente y de dónde procede? Cuando una copia del gen src marcado ra diactivamente es utilizada como sonda para localizar secuencias emparentadas mediante hibridación DNA-DNA, se encuentra que el genoma de las células nor males de vertebrados contiene secuencias muy similares, pero no idénticas, al gen src de virus del sarcoma de Rous. Este equivalente del gen src vírico (v-src) que se encuentra en células normales se denomina c -src (o simplemente src). Es el proto-oncogén que corresponde al oncogén v-src. Evidentemente, el gen es tomado accidentalm ente por el retrovirus del genoma de una célula huésped
Genética molecular del cáncer
Figura 24-22 Transformación celular por el virus del sarcoma de Rous. Las imágenes de m icroscopia electrónica de barrido muestran células en cultivo infectadas con una forma del virus del sarcoma de Rous, portador de una m utación sensible a la temperatura en el gen responsable de la transformación (el oncogén v-src). (A) Las células están transformadas y a baja temperatura (34°C) tienen una forma redondeada anormal, a la cual el producto del oncogén es funcional. (B) Debido a un increm ento de la temperatura (39°C) aparece el producto del oncogén y las células se adhieren fuertem ente a la superficie de cultivo y recobran su apariencia aplanada. (Cortesía de G. Steven Martin.)
1367
capucha
gag.
virus del sarcom a de Rous HHI-
capucha (A)
gag
DNA de la célula huésped
exón I
Il
5'
WËiMl&iiÊiinÊM
poi
intrón I
H I
región que codifica el dom inio de la quinasa I---------------------- 1 ■ ■ ■1 ■ ■ !■ ■ ■ ■ proto-oncogén c-src de pollo 1 3' T
(B)
src
TT
oncogén
Tabla 24-4 Oncogenes que se identificaron a través de su presencia en retrovirus transformantes Origen del virus
Tumor inducido por el virus
proteína (tirosina) quinasa
ratón gato
leucemia de las células pre-B sarcoma
erb-B
proteína (tirosina) quinasa: receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGF)
pollo
eritroleucemia; fibrosarcoma
fes
proteína (tirosina) quinasa
gato/pollo sarcoma
fins
proteína (tirosina) quinasa: receptor del factor estimulador de colonias de macrófagos (M-CSF)
gato
sarcoma
ratón pollo
osteosarcoma fibrosarcoma
Onco gén
Función del proto-oncogén
abl
fos jun
1 los productos se asocian J
formando la proteína reguladora del gen AP-1
kit
proteína (tirosina) quinasa: receptor del factor Steel
gato
sarcoma
raf
proteína (serina/treonina) quinasa activada por Ras
pollo/ ratón
sarcoma
myc
proteína reguladora de gen de la familia HLH
pollo
sarcoma; mielocitoma; carcinoma
H-ras
proteína que une GTP
rata
sarcoma; eritroleucemia
K-ras
proteína que une GTP
rata
sarcoma; eritroleucemia
reí
proteína reguladora de gen relacionada con NFkB
pavo
reticuloendoteliosis
sis
factor de crecimiento derivado de plaquetas, cadena B
mono
sarcoma
src
proteína (tirosina) quinasa
pollo
sarcoma
136 8
Capítulo 24 : Cáncer
Figura 24-23 Estructura del virus del sarcoma de Rous. (A) Organización del genoma vírico comparada con la de un retrovirus más típico (virus de la leucemia murina). El virus del sarcoma de Rous es diferente de la mayoría de los retrovirus que transportan oncogenes en que éste ha retenido los tres genes víricos completos necesarios para el ciclo vital ordinario del víricos: gag (que produce una poliproteína que se fragmenta generando las proteínas de la cápside), pol (que produce la transcriptasa inversa y una enzima implicada en integrar el cromosoma vírico en el genoma del huésped) y env (que produce la glucoproteína de la cubierta). En otros retrovirus oncogénicos, uno o varios de estos genes víricos se han perdido total o parcialmente debido al intercambio con la adquisición del oncogén transformante y, por lo tanto, sólo se pueden generar partículas infecciosas del virus transformante en una célula que sea infectada simultáneamente con un virus auxiliar, no defectuoso y no transformante, que suministre las funciones perdidas. (A menudo el oncogén transformante se fusiona a un fragmento residual de gag, conduciendo a la producción de una proteína híbrida oncogénica que contienen parte de la secuencia de Gag.) (B) Interrelación entre el oncogén v-srcy el proto-oncogén celular c-src del que se ha derivado. Los intrones presentes en c-src han sido suprimidos (por maduración por corte y empalme) de v-src; además, v-src contiene mutaciones que alteran la secuencia de aminoácidos de la proteína v-src, haciéndola hiperactiva y desregulada como proteína tirosina quinasa específica. El virus del sarcoma de Rous ha sido escogido (por los investigadores sobre cáncer) por su capacidad para transformar células en células neoplásicas, lo cual realiza con una velocidad y eficiencia poco habituales.
anterior y sufre la mutación durante el proceso (Figura 24-23). El resultado es un gen cuya función está perturbada y conduce a un cáncer, por lo que tanto el gen como el virus que lo transporta llaman la atención del científico. En efecto, el re trovirus ha clonado en nuestro beneficio. De esta forma se han identificado un gran número de oncogenes en otros retrovirus (Tabla 24-4). Cada uno de ellos nos ha conducido al descubrimiento del proto-oncogén correspondiente que se presenta en la célula normal.
Un retrovirus puede transform ar una célula huésped insertando su DNA en un lugar próximo a un proto-oncogén del huésped20 Existen dos caminos por los cuales un proto-oncogén puede pasar a oncogén una vez incorporado en un retrovirus: la secuencia del gen puede ser alterada o truncada de forma que codifique una proteína con una actividad anormal, o el gen puede quedar bajo el control de promotores y activadores potentes del genoma del virus, generándose producto en exceso o en circunstancias inapropia das. Los retrovirus tam bién pueden ejercer efectos oncogénicos similares por otro camino. Las copias en DNA del RNA del virus pueden ser simplemente in sertadas en el genoma de la célula huésped en zonas cercanas a proto-oncogenes o incluso en los propios proto-oncogenes. La disrupción genética resultante se denomina m utación por inserción, y el genoma alterado lo hereda toda la progenie de la célula huésped originaria. Las inserciones más o menos al azar de las copias en DNA del RNA vírico en el DNA de la célula huésped ocurren como parte del ciclo vital normal de retrovirus y, al menos en un caso bien docum en tado, la inserción en cualquier lugar de una zona de 10 000 pares de nucleótidos de un proto-oncogén puede causar una activación anormal de este gen. La mutagénesis por inserción proporciona un sistema importante para identificar proto-oncogenes, que pueden ser localizados por su proximidad al DNA del virus insertado. A menudo los proto-oncogenes identificados de este modo resultan ser los mismos que los descubiertos por el otro camino -com o homólogos de los oncogenes que los retrovirus transportan de una célula a otrapero tam bién se han descubierto otros nuevos proto-oncogenes (Tabla 24-5). Un ejemplo de ellos es el gen Wnt-1, activado por mutagénesis por inserción en cánceres de m am a de ratones infectados con el virus de tumor mamario (Figura 24-24). Este gen resulta ser estrechamente homólogo al gen wingless de Droso phila, que participa en la com unicación célula-célula que regula los detalles del patrón corporal de la mosca, como se com enta en el Capítulo 21.
Diferentes investigaciones sobre la base genética del cáncer convergen sobre disfunciones de un mismo pequeño grupo de proto-oncogenes17,21 Mientras que algunos autores siguieron la línea de investigación que conducía desde los retrovirus hasta los oncogenes, otros escogieron una aproximación más directa y buscaron secuencias de DNA en células cancerosas humanas que pudieran provocar proliferación incontrolada al ser introducidas en células no cancerosas. El ensayo se realizó en cultivo de células, utilizando como huésped no canceroso una línea particular de células 3T3 derivadas de ratón -células NIH 3T 3- y transfectándolas con DNA obtenido de células tumorales humanas. Los
Tabla 24-5 Algunos oncogenes que no se identificaron por su presencia en retrovirus transformantes Sistemas de detección
Oncogenes
Wnt-1 {int-l),fgf-3 {int-2), Notch-1 {int-3), Ick Amplificación L-myc, N-myc Transfección neu, N-ras, trk, ret Translocación bel-2, RARa Mutación por inserción
Figura 24-24 Mutagénesis por inserción. En este ejemplo el proceso activa un gen llamado W nt- 1 ~ (anteriormente se llamaba in t- 1 ) que produce cáncer de mama en ratones infectados con el virus de tumor mamario de ratón (MMTV, de Mouse Mammary Tumor Virus). Las fle c h a s indican los lugares de integración de MMTV observados en 19 tumores aislados diferentes. Obsérvese que las inserciones pueden activar la trancripción del gen Wnt-1 desde lugares que están alejados a más de 10 000 pares de nucleótidos a uno u otro lado del gen. Este efecto se atribuye a una secuencia de DNA que es un potente activador y que está presente en las repeticiones terminales del genoma de MMTV.
exones
Genética molecular del cáncer
1369
hallazgos fueron dramáticos: se detectaron oncogenes en muchas líneas de célu las cancerosas humanas y en varios casos estos oncogenes resultaron ser alelos mutantes de algunos de los mismos proto-oncogenes que habían sido identifi cados con la estrategia retrovírica o de genes relacionados muy estrechamente con ellos. Por ejemplo, se encontró que uno de cada cuatro tumores humanos contenía un miembro mutado de la familia de los genes ras, que habían sido descubiertos com o oncogenes transportados por retrovirus que causan sarco mas en ratas. Así, dos líneas independientes de investigación convergieron en los mismos genes. Otro enfoque que tam bién condujo a algunos de estos mismos proto-onco genes se basa en el estudio del cariotipo de las células tumorales. Como se m en cionó anteriormente, en casi todos los pacientes con leucemia mielógena cróni ca, las células leucém icas muestran la misma translocación de cromosomas, entre los cromosomas 9 y 22; de modo similar, en el linfoma de Burkitt existe re gularmente una translocación entre el cromosoma 8 y uno de los tres crom oso mas que contienen los genes que codifican las moléculas de anticuerpo. En am bos tipos de cáncer se encontró que el punto de ruptura de la translocación, lugar donde parte de un crom osom a está unido a otro, coincidía exactamente con la localización de un proto-oncogén ya conocido a partir de estudios retrovíricos -a b l en la leucem ia mielógena crónica, myc en el linfoma de Burkitt. De forma similar, se sabe que algunas translocaciones análogas entre cromosomas están asociadas con algunos otros tipos de cáncer. A partir de estudios de secuenciación de DNA parece que en algunos casos la translocación transforma un proto-oncogén en un oncogén al fusionar el proto-oncogén con otro gen de manera que se produzca una proteína alterada (Figura 24-25); en otros casos, la translocación traslada un proto-oncogén a un entorno cromosómico inapropia do que activa su transcripción de forma que la proteína normal se produce en cantidades excesivas.
Un proto-oncogén puede ser convertido en oncogénico de muchas m aneras17,22 Hasta ahora se han descubierto unos 60 proto-oncogenes (las Tablas 24-4 y 24-5 muestran una pequeña selección de ellos); cada uno de estos proto-oncogenes se puede transformar en un oncogén que juega un papel dominante en cánceres de una clase u otra. Muchos de estos genes han sido encontrados repetidamente en diferentes formas m utantes y en varias formas diferentes de cáncer, lo cual sugiere que posiblem ente la mayoría de los proto-oncogenes de mamíferos ya están identificados.
gen b e re n el crom osom a 22
gen abl en el crom osom a 9
5'
5'
3'
3' Á
punto de ruptura
TRANSLOCACIÓN Ph 5'
3' gen fusionado bcr/abl
TRADUCCIÓN
I
1370
Capítulo 24 : Cáncer
]
proteína de fusión Bcr/Abl
Figura 24-25 Conversión del protooncogén abl en un oncogén, en pacientes con leucemia mielógena crónica. La translocación cromosóm ica responsable une el gen bcr del cromosom a 22 con el gen a b l del cromosoma 9, generando así un cromosoma Philadelphia (véase Figura 24-4). La proteína de fusión resultante tiene el extremo amino terminal de la proteína Bcr unido al extremo carboxilo terminal de la proteína tirosina quinasa Abl; por lo tanto, el dominio quinasa Abl probablemente resulta activo de una forma no apropiada, produciendo una proliferación excesiva de un clon de células hematopoyéticas en la médula ósea.
receptor de PDGF receptor de EGF lerbB] receptor de M-CSF Ifm s]
proteínas Ras [H-ras] [N-ras] [K-ras]
receptores de factores de crecim iento que actúan vía proteínas con actividad tirosina quinasa
proteínas de unión a GTP
[fes]
proteínas citoplasm áticas tirosina quinasa específicas
proteína quinasa Src [src]
proteínas con actividad tirosina quinasa asociadas a m em brana/citoesqueleto
receptor de horm ona tiroidea [erbA]
receptores de factores de crecim iento de tipo esferoide
proteínas serina/treonina quinasa
Pero, ¿qué funciones realizan estos genes en una célula sana para que las mutaciones que se producen en ellos sean tan peligrosas? La mayoría de protooncogenes codifican com ponentes de mecanismos que regulan el com porta miento social de las células en el cuerpo -e n particular los mecanismos median te los que señales de células vecinas empujan a la célula a dividirse, a diferenciarse o a morir. De hecho, muchos de los componentes de las vías de se ñalización celular se identificaron a través de la búsqueda de oncogenes, y de hecho una lista completa de productos de proto-oncogenes incluye ejemplos de prácticam ente todos los tipos de moléculas que participan en la señalización ce lular -proteínas secretadas, receptores transmembrana, proteínas de unión a GTP, proteína quinasas, proteínas de regulación génica, etc, como resume la Fi gura 24-26 y se trata en detalle en el Capítulo 15. Todas estas moléculas normal mente realizan su función en complejas cadenas de transmisión de señales de producción de más células, cuando éstas se necesitan. Sin embargo, pueden al terarse debido a mutaciones y transmitir señales incluso cuando no son necesa rias más células. El proto-oncogén erbB, por ejemplo, codifica el receptor del factor de crecim iento epidérmico (EGF); cuando el factor EGF se une al dominio extracelular del receptor, el dominio intracelular genera una señal de estimula ción en el interior de la célula. Una mutación en c -erbB puede convertirlo en un oncogén por eliminación del dominio extracelular de unión a EGF de tal modo que la señal de estimulación intracelular se produce constantem ente, incluso en ausencia de EGF. De un modo similar una mutación puntual en un lugar apro piado del gen ras puede generar una proteína Ras incapaz de hidrolizar el GTP que lleva unido, persistiendo anormalmente en su estado activado y transm i tiendo así una señal intracelular de proliferación incluso cuando no debería. Existen innumerables ejemplos de este tipo. Los tipos básicos de accidente genético que convierten a una proto-oncogén en un oncogén se resumen en la Figura 24-27. El gen puede ser alterado por una mutación puntual, una deleción, a través de una translocación cromosómica, o por inserción de un elemento genético móvil, como un DNA retrovírico. El cambio puede darse en la zona de codificación de la proteína, de tal forma que se genera un producto hiperactivo, o puede ocurrir en zonas de control adya centes, de forma que el gen simplemente se sobrexpresa. Alternativamente el gen también puede sobrexpresarse debido a una elevada amplificación del nú mero de copias a través de errores en el proceso de replicación cromosómica (el
Genética molecular del cáncer
PDGF [sis] EGF M-CSF factores de crecim iento
Figura 24-26 Actividades y localizaciones celulares de los productos de las principales clases de proto-oncogenes. Entre corchetes se indican algunos de los protooncogenes más representativos de cada clase.
1371
DELECIÓN O MUTACIÓN PUNTUAL EN LA SECUENCIA CODIFICANTE
REORDENAMIENTO DEL CROMOSOMA
AMPLIFICACIÓN GÈNICA
DNA ■
DNA
I
RNA
l RNA
proteína hiperactiva sintetizada en cantidades norm ales
proteína norm al producida en cantidades superiores a las norm ales
la cercanía de un activador la fusión a un gen que se potente hace que la proteína transcribe activam ente hace norm al se sintetice en que la proteína de fusión se cantidades superiores sintetice en cantidades superiores a las norm ales a las norm ales; tam bién puede ocurrir que la proteína de fusión sea hiperactiva
m ecanism o será comentado posteriormente -véase Figura 24-34). Cada gen en particular y cada respuesta a carcinógenos particulares presenta tipos caracte rísticos de anomalías. Por ejemplo, el 90% de tumores de piel provocados en ra tones por el iniciador tumoral dimetilbenzo[a]antraceno (DMBA) tienen un cam bio de una A por una T exactam ente en el mismo lugar que un gen ras mutado; probablem ente de todas las mutaciones causadas por DMBA, sólo la que se produce en este lugar activa de forma eficiente las células de la piel para formar un tumor. Por otro lado, frecuentem ente se sobrexpresan o amplifican algunos miembros de la familia del gen myc. La proteína Myc normalmente actúa en el núcleo com o señal de proliferación celular, como se com enta en el Capítulo 17; cantidades excesivas de Myc provocan la entrada de la célula en el ciclo de divi sión celular en circunstancias en las que una célula normal se detendría.
Las acciones de los oncogenes pueden ensayarse individualmente o combinadas entre sí en ratones transgénicos23 El concepto de un oncogén es paradójico. Como se ha argumentado amplia mente en la primera parte de este capítulo, una sola mutación no es suficiente para producir un cáncer. Sin embargo, se define a un oncogén como un gen de actuación dominante, y típicam ente se ensaya por su capacidad para causar, por sí mismo, transformación neoplásica de células en cultivo. Esta contradicción aparente refleja el abismo entre los modelos simplificados de cáncer estudiados más ampliamente por los biólogos moleculares y la complejidad de la enferme dad humana real. El ensayo estándar para la identificación de oncogenes no prueba sus efectos en células somáticas humanas normales sino en una línea ce lular 3T3 derivada de ratón; y las células 3T3 en cultivo han sufrido ya m utacio nes que las hacen anorm alm ente fáciles de ser transformadas por un solo cam bio genético adicional. Además, com o hemos advertido anteriormente, tanto el período de vida más corto como el menor número de células hace que los rato nes corran un riesgo intrínseco menor de padecer cáncer que los seres huma nos, de forma que sus células pueden estar menos protegidas que las células hu manas contra las consecuencias de mutaciones cancerígenas. Sin embargo, incluso en las células de ratón, generalmente un solo oncogén no es suficiente para convertir una célula normal en cancerosa. Este hecho se puede poner de manifiesto de un modo impresionante en estudios con ratones transgénicos. Un oncogén en forma de fragmento de DNA, derivado de un virus o de una célula tumoral, se puede unir a una secuencia de DNA promotora que se considere adecuada y luego se puede inyectar en el núcleo de un huevo de ra tón. A menudo, esta molécula de DNA recom binante pasará a estar integrada dentro de un crom osom a de ratón, produciendo la generación 'de una cepa de
1372
Capítulo 24 : Cáncer
Figura 24-27 Tres caminos por los que un proto-oncogén puede ser transformado en oncogén. Un cuarto mecanismo (no se muestra en la figura) implica la recom binación entre el DNA retrovírico y un proto-oncogén (véase Figura 24-24). Esto tiene efectos similares a los de un reordenamiento del cromosoma, poniendo al protooncogén bajo el control de un activador vírico y/o fusionándolo a un gen vírico que se transcribe activamente.
ratones transgénicos que llevan el oncogén en todas sus células. El oncogén in troducido de esta forma puede expresarse en muchos tejidos o sólo en unos cuantos tejidos especiales, de acuerdo con la especificidad tisular del promotor asociado. Típicamente, en ratones dotados mediante este sistema con un onco gén myc o ras, algunos de los tejidos que expresan el oncogén crecen exagerada mente; con el paso del tiempo, de vez en cuando algunas células sufren cambios adicionales y dan lugar a cánceres. Sin embargo, la gran mayoría de las células que expresan el oncogén myc o ras en el ratón transgénico no originan cán ce res, lo cual demuestra que el oncogén por sí solo no es suficiente para causar una transformación neoplásica. De todas maneras, desde el punto de vista del animal completo el oncogén heredado constituye una seria amenaza porque aumenta el riesgo de desarrollar cáncer. Los oncogenes heredados pueden ac tuar de forma similar en humanos, aunque es un fenómeno poco frecuente. En un ejemplo bien documentado, una forma mutante del proto-oncogén ret con fiere una predisposición hereditaria para ciertos tumores de tiroides y glándulas adrenales (un síndrome conocido como neoplasia endocrina múltiple de tipo 2A, [MEN2A, de Multiple Endocrine Neoplasia]). El análisis experimental de la acción de los oncogenes ha avanzado cruzan do una pareja de ratones transgénicos -u n o portador de un oncogén myc, y el otro portador de un oncogén ras- para obtener una progenie que contenga am bos oncogenes a la vez. Estas crías desarrollan cánceres con una frecuencia mu cho mayor que cualquiera de las dos cepas paternas (Figura 24-28), pero de nue vo los cánceres se originan como tumores aislados esparcidos entre células no cancerosas. Así, incluso expresándose dos oncogenes, las células han de sufrir cambios adicionales, generados al azar, para convertirse en cancerosas. La acción sinèrgica de dos o más oncogenes específicos para generar células cancerígenas se conoce como colaboración oncogénica, y puede ponerse de m a nifiesto tanto in vitro como in vivo. Si un fibroblasto de embrión de rata normal es transfectado únicamente con un oncogén ras o ùnicamente con un oncogén myc, continúa comportándose normalmente. Si el fibroblasto es transfectado con ambos oncogenes a la vez, se transforman. Distintos tipos celulares requie ren diferentes com binaciones de oncogenes para transformarse. Por ejemplo, el cáncer derivado de linfocitos, conocido como linfoma de células B, parece de pender de la colaboración entre los genes myc y bcl-2 (aparecen en el Capítulo 21, en relación a la muerte celular programada). Si sólo se sobrexpresa myc, las células son conducidas a través del ciclo de división celular de forma inapropia da, pero no se generan células cancerígenas porque la progenie de estas divisio nes anormales forzadas está programada para morir. Sin embargo, si bcl-2 se ex presa al mismo tiempo, la progenie sobrevive y prolifera: bcl-2 actúa como un oncogén porque la proteína Bcl-2 inhibe la muerte celular programada. Este fenómeno refleja el carácter del mecanismo de seguridad de la red com pleja que controla y regula la proliferación celular y la supervivencia. Parece que múltiples mecanismos de control actúan en paralelo de forma que el error de un solo com ponente no es suficiente para causar el desastre. De todas formas en este sistema de control, los proto-oncogenes sólo representan la mitad de la historia. No son menos importantes los genes supresores de tumores que actúan como contrapeso de ellos. Como veremos, deleciones y perturbaciones en los genes supresores de tumores juegan un importante papel en el cáncer humano como ocurre con las mutaciones de proto-oncogenes a oncogenes.
La pérdida de una copia de un gen supresor de tumores puede generar una predisposición hereditaria al cáncer24,25 Dada una célula cancerosa, es más difícil localizar la ausencia de un gen normal que descubrir la presencia anormal de otro gen: no puede tomarse el DNA y rea lizarse un ensayo de transformación para identificar algo que simplemente no está. Los conocim ientos sobre los genes supresores de tumores han sido mucho más difíciles de adquirir que en el caso de los proto-oncogenes.
Genética molecular del cáncer
< 1)
o 100 E
c
5 50 (D a
0 0
100 edad en días
200
Figura 24-28 Colaboración entre oncogenes en ratones transgénicos. Las gráficas muestran la incidencia de tumores en tres tipos de ratones transgénicos, uno portador de un oncogén myc, otro del oncogén ras, y un tercero portador de ambos oncogenes. Para estos experimentos se construyeron dos líneas de ratones transgénicos. Una de ellas lleva insertada una copia de un oncogén creado fusionando el proto-oncogén m yc con el promotor/estimulador del virus del tumor mamario de ratón (que así produce la sobreexpresión de myc en determinados tejidos com o la glándula mamaria). La otra línea lleva insertada una copia del oncogén v-Hras bajo control del mismo promotor/estimulador. Los ratones de ambas cepas desarrollan tumores mucho más frecuentem ente de lo normal, a menudo en la glándula mamaria o en las glándulas salivales. Por cruzamiento de las dos cepas se obtuvieron ratones que contenían ambos oncogenes a la vez. Estos híbridos desarrollan tumores con mucha mayor frecuencia todavía, muy superior a la suma de las frecuencias para los dos oncogenes por separado. Sin embargo, los tumores se producen sólo después de un lapso de tiempo, y sólo en una pequeña proporción de las células de los tejidos donde se expresan ambos genes: aparentemente, para que se desarrolle un proceso canceroso es necesario que, además de la presencia de los dos oncogenes, ocurran algunos cambios accidentales adicionales. (Según E. Sinn, et al., Cell 49:465-475, 1987. © Cell Press.)
1373
La dificultad estriba en que la pérdida de un solo gen supresor de tumores -incluso la pérdida de ambas copias del gen- normalmente no es suficiente por sí misma para causar cáncer; esto hace difícil incriminar mutaciones específicas. Hemos visto que al intentar localizar oncogenes nos encontramos con el mismo problema, y que puede solucionarse mediante ensayos en los que se utilizan lí neas celulares que normalmente son fáciles de transformar con un único gen mutado. Sin embargo, en el estudio de genes supresores de tumores la clave provino de un tipo de cáncer humano poco común, el retinoblastoma, que apa rece a partir de células del cuerpo que están transformadas por un número ex traordinariamente pequeño de mutaciones. El retinoblastom a aparece en la infancia; los tumores se desarrollan en célu las precursoras neuronales en la retina inmadura. Aproximadamente uno de cada 20 000 niños se encuentra afectado. Existen dos formas de la enfermedad, una hereditaria y otra no hereditaria. En la forma hereditaria aparecen múltiples tumores, norm alm ente de forma independiente, afectando ambos ojos; en la no hereditaria sólo queda afectado un ojo y por un solo tumor. En algunos enfer mos afectados de retinoblastom a hereditario se ha observado un cariotipo visi blem ente anormal, con una deleción en una banda específica del cromosoma 13; deleciones de este mismo locus tam bién se han encontrado en células tumorales de pacientes con la forma no hereditaria de la enfermedad. Esto sugiere que el cáncer podría estar causado no por la adquisición de un oncogén sii io por la pérdida de un gen supresor de tumores. Concretamente, si todas la células de los pacientes con la enfermedad hereditaria carecen de una de las dos copias de un gen supresor de tumores, estas células estarán predispuestas a transfor marse en cancerosas: una sola m utación somática que elimine la copia correcta del gen que se conserva en una célula del millón o más de células que crecen en la retina, será suficiente para iniciar un cáncer. El gen cuya pérdida parece ser crítica para el desarrollo del cáncer se denomina el gen retinoblastoma, o gen Rb. En niños sin la predisposición hereditaria, el retinoblastoma es muy poco frecuente porque requiere de la coincidencia de dos mutaciones somáticas en una sola célula de la retina para destruir ambas copias del gen Rb (Figura 24-29). Usando la localización conocida de la deleción crom osómica asociada al re tinoblastom a fue posible clonar y secuenciar el gen Rb y así analizar en detalle defectos genéticos en pacientes individuales. Como se predijo, en los enfermos de la forma hereditaria de la enfermedad se presenta una deleción o una muta ción de pérdida de función del gen Rb en todas las células del cuerpo. Las células
INDIVIDUO SANO NORMAL
RETINOBLASTOMA HEREDITARIO gen Rb mutante heredado
Figura 24-29 Mecanismos genéticos del retinoblastoma. En la forma hereditaria, todas las células del cuerpo carecen de una de las dos copias funcionales normales de un gen supresor de tumores, y en aquellas células en las que la otra copia se pierde o se inactiva debido a una mutación somática, se producen tumores. En la forma no hereditaria, todas las células contienen inicialmente dos copias funcionales del gen, y el tumor surge porque se pierden o inactivan ambas copias a través de la coincidencia de dos mutaciones somáticas en una célula.
RETINOBLASTOMA NO HEREDITARIO ocasionalm ente una célula inactiva uno de sus dos genes Rb correctos
)(
A ocasionalm ente una célula inactiva uno de sus dos genes Rb correctos
ocasionalm ente una célula inactiva su única copia correcta del gen Rb proliferación celular excesiva que da lugar a un retinoblastom a
la segunda copia de Rb se inactiva en la m ism a célula muy^, raramente proliferación celular excesiva que da lugar a un retinoblastom a
RESULTA DO : SIN T U M O R
13 7 4
Capítulo 24 : Cáncer
RESULTADO : LA M A YO R PARTE DE LOS IN D IV ID U O S QUE PRESENTAN EL GEN H EREDADO DESARROLLAN T U M O R
RESULTADO : SÓLO U N A DE CAD A 30 000 PER SON AS N O R M A LES DESARROLLA T U M O R
CELULA SANA CON UNA SOLA COPIA NORMAL DEL GEN m utación en el locus Rb en el crom osom a m aterno'
Rb
gen Rb norm al en el crom osom a paterno
FORMAS POSIBLES DE ELIMINACION DEL GEN Rb NORMAL >■ ■< v.v
sin desunión (pérdida de crom osom a)
sin desunión y
duplicación
recom binación m itótica
conversion gènica
deleción
m utación puntual
no cancerosas son defectuosas en una sola de las copias del gen, mientras que las cancerosas son defectuosas en ambas copias. En contraste, en pacientes que padecen la forma no hereditaria de la enfermedad, las células no cancerosas no muestran ningún defecto en ninguna de las copias de Rb, mientras que las can cerosas sí son defectuosas de ambas copias. Muchas com binaciones diferentes de accidentes genéticos pueden elimi nar o inutilizar ambas copias de un gen. La primera copia podría, por ejemplo, perderse en una deleción a gran escala del crom osoma o inactivarse por una mutación puntual; la segunda copia podría perderse de una manera similar o por recom binación m itótica (se explica en la Figura 21-73) o por conversión génica (véase Figura 6- 66). El abanico de posibilidades está resumido en la Figura 24-30. Puede verse que la mayoría de estas posibilidades son tales que la segun da copia del gen, y normalmente también las regiones flanqueantes en el cro mosoma, son delecionadas totalmente o reemplazadas por una copia de la re gión correspondiente del primer cromosoma en defecto; en otras palabras, se pierde la com binación heterozigota normal de los alelos materno y paterno de los genes en esta región cromosómica. De hecho, cuando se analizan las células tumorales de muchos pacientes de retinoblastoma distintos, se observa una pér dida de heterozigosis en la región del gen Rb en aproximadamente el 70% de los casos. Como veremos más adelante, la pérdida de heterozigosis en las células de un tumor sienta las bases de un método general por el cual pueden ser identifi cados y clonados los genes supresores de tumores.
Figura 24-30 Seis caminos por los cuales se puede perder la copia correcta conservada de un gen supresor de tumores. Una célula defectuosa en una sola de sus dos copias de un gen supresor de tumores se comporta como una célula normal sana; los diagramas muestran cómo podría perderse la función de la otra copia del gen, haciéndose así propicia a desarrollar cáncer. Para analizar el DNA del tumor se pueden utilizar sondas de DNA clonado en conjunción con la determinación de polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción (véase Capítulo 7); así se puede descubrir qué tipo de suceso ha ocurrido en un paciente dado. Nótese que la mayoría de los mecanismos dan lugar a una célula que carece totalmente ya sea de la copia materna o de la paterna de un gen supresor de tumores, junto con regiones cromosómicas adyacentes. Esto se refleja en una pérdida de heterozigosis en las zonas vecinas al defecto genético. La pérdida de heterozigosis en un lugar específico del genoma es una característica distintiva de un cáncer dependiente de la pérdida de función de un gen supresor de tumores. (Según W.K. Cavenee et al., Nature 305: 779-784, 1983. © 1983 Macmillan Magazines Ltd.)
La pérdida del gen supresor de tumores de retinoblastom a interviene en muchos cánceres distintos25,26 Dada la secuencia del gen Rb, es posible determinar su presencia en células de tumores distintos de los tumores del retinoblastoma. Parece que es frecuente que el gen esté inactivado en varios tipos comunes de cáncer, como los carcino mas de pulmón, de mama y de vejiga. Estos cánceres más comunes se generan por una serie más com pleja de cambios genéticos que los del retinoblastoma y aparecen más tarde en la vida y en otros tejidos del cuerpo. Pero en todos ellos parece que la pérdida de Rb es un paso importante en la progresión hacia la m a lignidad. Así, aunque el retinoblastoma es poco común, los cánceres en los que está implicado el gen Rb no lo son. Como se com enta en el Capítulo 17, Rb se expresa normalmente en casi to das las células del cuerpo, y parece que su producto actúa como uno de los prin cipales frenos del progreso a través del ciclo de división celular. La acción de fre no normalmente está regulada por fosforilación. La proteína Rb puede hallarse fosforilada y no fosforilada en cada ciclo de división celular, y en células que se ha retirado del ciclo se mantiene desfosforilada. Mientras está desfosforilada, Rb
Genética molecular del cáncer
1375
Tabla 24-6 Virus asociados con cánceres humanos Virus
Tumores asociados
Areas de alta incidencia
verrugas (benignas) carcinoma de cuello uterino
mundial mundial
cáncer de hígado (carcinoma hepatocelular)
Sudeste de Asia; África tropical
linfoma de Burkitt (cáncer de los linfocitos B)
Oeste de África; Nueva Guinea Papua Sur de China; Groenlandia (esquimales)
Virus de DNA Familia de los papovavirus Virus de los papilomas (muchas cepas distintas) Familia de los hepadnavirus Virus de la hepatitis B Familia de los herpesvirus Virus de Epstein-Barr
carcinoma de nasofaringe
Virus de RNA Familia de los retrovirus Virus tipo I de la leucemia leucemia de las células T de células T (HTLV-I) de adultos/linfoma Virus de la inmunodeficiencia sarcoma de Kaposi [cáncer de humana (HIV-1, el virus las células endoteliales de del SIDA) los capilares sanguíneos o linfáticos (?)]
Japón (Kyushu); Antillas África Central
Para todos los virus indicados, el número de personas infectadas es mucho mayor que el núme ro de personas que desarrollan cáncer: los virus han de actuar en conjunción con otros factores. Además, probablemente algunos de los virus contribuyen a la formación de un cáncer sólo de forma indirecta; por ejemplo, el HIV-1, destruyendo las defensas inmunes mediadas por célu las, puede permitir que las células endoteliales transformadas por algún otro agente no sean destruidas por el sistema inmunitario sino que medren como un tumor.
se une fuertemente a ciertas proteínas reguladoras de genes y así evita que actúen en el núcleo favoreciendo la replicación del DNA. La pérdida del gen deja a la cé lula libre de esta restricción. La interpretación molecular de la actuación de Rb permite avanzar otro paso en la comprensión del cáncer, ya que aporta luz sobre otra forma por la que se puede desencadenar el cáncer -p or virus de DNA. Antes de explicar cómo ocurre, hem os de detenernos y examinar el papel que tienen los virus en la cau salidad del cáncer humano.
Los virus de DNA tum orales activan la m aquinaria de replicación del DNA de la célula como parte de su estrategia para sobrevivir16 Se cree que aproximadamente un 15% de los cánceres humanos en todo el mun do se desarrollan por mecanism os en que participan virus. Como muestra la Ta bla 24-6, en humanos los principales culpables no son los retrovirus sino los vi rus de DNA. La evidencia de su participación proviene, en parte, de la detección de virus en pacientes de cáncer y en parte de la epidemiología. El cáncer de híga do, por ejemplo, es común en algunas partes del mundo (África y sudeste de Asia) donde las infecciones víricas de hepatitis B son comunes; en estas regiones el cáncer de hígado se da casi exclusivamente en personas que muestran signos de infección crónica de hepatitis B. El papel preciso de un virus asociado al cáncer es, a menudo, difícil de des cifrar porque existe un desfase de muchos años desde la infección vírica inicial
137 6
Capítulo 24 : Cáncer
hasta el desarrollo del cáncer. Además, el virus sólo es responsable de una de las etapas en la progresión hacia el cáncer; también participan otros factores am bientales y accidentes genéticos. Parece que en algunos cánceres los virus ejer cen acciones promotoras directas; por ejemplo, es posible que el virus de la he patitis B favorezca el desarrollo del cáncer de hígado al causar un daño que provoca la división celular en el hígado. Sin embargo, en algunos otros cánceres humanos los virus contribuyen directamente a causar una transformación neoplásica de las células que infectan. Estudios en cultivos celulares in vitro m ues tran cómo puede ocurrir esto. Si una célula tiene que ser transformada de forma estable por un virus, ha de establecerse una asociación parasitaria estable: el virus no ha de matar la cé lula, y la célula ha de retener los genes víricos de una generación a otra -n orm al mente integrando estos genes en uno o más de sus propios cromosomas, y a ve ces manteniéndolos como un plásmido extracromosómico que se replica al mismo tiempo que los cromosomas. Esto vale tanto para virus de DNA como para retrovirus, pero las dos clases de virus difieren fundamentalmente en la na turaleza de los genes víricos que causan la transformación neoplásica. Como se explica en el Capítulo 6, normalmente un virus de DNA tumoral en estado natural se propaga por un proceso que no depende de la generación de cáncer. Por ejemplo, un virus SV40 (Figura 24-31) produce una proteína vírica que activa rápidamente la maquinaria de replicación del DNA de la célula hués ped. Entonces el virus utiliza las proteínas del huésped para replicar y transcribir su propio genoma; la infección continúa hasta que el huésped muere, liberando una gran cantidad de nuevas partículas víricas infecciosas. Menos frecuente mente, sin embargo, el DNA vírico no se replica sino que se incorpora de forma estable en el cromosoma de la célula huésped. Si el gen vírico que activa la m a quinaria de replicación de la célula huésped se transcribe, este gen puede actuar como un oncogén, causando una transformación cancerosa. A diferencia de los oncogenes retrovíricos comentados anteriormente, este oncogén es una parte esencial del genoma vírico y no tiene un homólogo en la célula huésped normal.
Los virus de DNA tum orales activan la m aquinaria de replicación de la célula bloqueando la acción de los genes clave supresores de tum ores16,27 Los virus de DNA son un grupo diverso, pero en general, los principios que aca bamos de describir son válidos para la mayoría de los virus de DNA que están
proteínas víricas requeridas para la replicación controlada del virus •* crom osom a huésped
INTEGRACION ACCIDENTAL DE UN FR AG ME NTO DE DNA VÍRICO EN EL C R O M O S O M A HUÉ SP ED
producción desequilibrada de las proteínas víricas de replicación gen integrado codificante de una proteína vírica de replicación
i crom osom a del ! papilom avirus
•$
7\
/ñ \
<0
CRECIMIENTO BENIGNO O VE RR U GA
Genética molecular del cáncer
T U M O R MALIGNO
Figura 24-31 El virus SV40. La estructura de la cápside de este virus de DNA que infecta monos, ampliamente estudiado, ha sido determinada por difracción de rayos X. (Cortesía de Robert Grant, Stephen Crainic y James M. Hogle.)
Figura 24-32 Mecanismo por el cual ciertos papilomavirus se cree que desencadenan el cáncer del cuello de útero. Los papilomavirus tienen cromosomas de DNA circulares de doble cadena de aproximadamente 8000 pares de nucleótidos. En una verruga u otra infección benigna, estos cromosomas se mantienen, de forma estable, en las células basales del epitelio, como plásmidos cuya replicación está controlada para mantenerse en el mismo estadio que los cromosomas de la célula huésped [izquierda). Accidentes poco frecuentes pueden causar la integración de un fragmento del plásmido en el cromosoma del huésped, alterando el entorno de los genes víricos y desorganizando el control de su expresión. La producción descontrolada consiguiente de proteínas de replicación víricas -en particular los productos de los genes víricos E6 y E7- tiende a conducir a la célula huésped a la fase S, facilitando de este modo la génesis de un cáncer
[derecha). 1377
la p r o t e in a R b s e c u e s t r a u n f a c t o r d e p r o lif e r a c ió n
factor de proliferación celular inactivo (proteína reguladora de gen)
¡a p r o t e m a v ír ic a s e c u e stra Rb y p53
factor de proliferación celular activo .M1/ / transcripción génica
DNA p 5 3 a c t iv a e! f r e n o d e s e g u r id a d d e la p r o lif e r a c ió n c e lu la r
PROLIFERACIÓN CELULAR BLOQUEADA
PROLIFERACION CELULAR ACTIVADA POR EL DNA DEL VIRUS
implicados en la génesis de cánceres. Los papilomavirus, por ejemplo, son la causa de la verrugas en los seres humanos y también están implicados en carci nomas del cuello uterino. Son parientes lejanos de la familia de poliomavirus que incluye a SV40, y el cáncer que causan en humanos requiere que algunos ge nes de replicación del virus se integren en el cromosoma huésped, como se ilus tra en la Figura 24-32. Como ocurre con SV40, los papilomavirus tienen que ser capaces de contro lar la maquinaria de síntesis de DNA de la célula huésped, y los genes víricos que tienen esta función pueden actuar com o oncogenes. Se denominan genes E6 y E7 del papilomavirus, y sus productos proteicos son funcionalmente equivalen tes a una proteína de doble función denominada antígeno T grande, codificada por el correspondiente oncogén vírico del genoma de SV40. El mecanismo de ac ción es aparentem ente simple: estas proteínas víricas se unen a los productos proteicos de dos genes clave supresores de tumores de la célula huésped deján dolos fuera de acción y permitiendo por lo tanto a la célula replicar su DNA y di vidirse (Figura 24-33). Una de estas proteínas del huésped es Rb: uniéndose a ella, la proteína vírica (E7 o T grande) evita que se una a sus ligandos normales de la célula. El otro gen supresor de tumores que las proteínas víricas inactivan se deno mina p53 (por su masa molecular de 53 kilodaltons). Como Rb participa en el desarrollo de muchos tipos de cánceres, no sólo de los que son dependientes de virus.
Mutaciones en el gen p53 inhabilitan el freno de emergencia de la proliferación celular y conducen a una inestabilidad genética13,14,28 Las personas que heredan de sus padres una sola copia funcional del gen p53, como aquellas que heredan una sola copia funcional de Rb, están predispuestas a padecer cáncer. Son propensas a desarrollar varios tumores independientes en una amplia variedad de tejidos a una edad relativamente temprana -típ icam en te de adultos jóvenes. Esta predisposición familiar se denomina síndrome de LiFraumeni; como el retinoblastoma, es poco corriente. Las células tumorales de pacientes de Li-Fraumeni tienen defectuosas ambas copias de p53, mientras que las células no tumorales sólo tienen defectuosa una de ellas. Estas características son típicas de un gen supresor de tumores y, confir mando esta función de p53, se sabe que aumentando artificialmente en cultivos celulares ordinarios los niveles de la proteína p53 normal, se detiene la prolifera ción de las células. La proteína p53 se une al DNA y ejerce su efecto, al menos en parte, induciendo la transcripción de otro gen regulador. El producto de este gen, una proteína de 21 kilodaltons, se une a complejos de ciclina Gj con proteí na Cdk2, la cual norm alm ente conduce la célula más allá del punto de control G, del ciclo celular, com o se com enta en el Capítulo 17. La pro teína de 21 kilodal tons bloquea la actividad quinasa de estos complejos, evitando así la progresión de la célula en la fase S y la replicación de su DNA. A diferencia de lo que ocurre con Rb, en condiciones normales en la mayo ría de la células del cuerpo se encuentra muy poca cantidad de proteína p53. De
1 37 8
Capítulo 24 : Cáncer
Figura 24-33 Activación de la proliferación celular por el virus tumoral de DNA SV40. SV40 utiliza una sola proteína de doble función, denominada antígeno T grande, que secuestra tanto a Rb como a p53; otros virus tumorales de DNA relacionados utilizan dos proteínas víricas individuales (E6 y E7 en el caso de papilomavirus) para el mismo propósito.
hecho p53 no es necesaria para el desarrollo normal: ratones transgénicos en los que se han inactivado ambas copias del gen aparecen normales en todos los as pectos excepto en uno -norm alm ente desarrollan cáncer a la edad de 3 meses. Estas observaciones sugieren que p53 podría realizar una función necesaria sólo ocasionalm ente o en circunstancias especiales. Evidencias complementarias apoyan esta idea. Cuando se exponen células normales a luz ultravioleta o radia ción gamma, reaccionan aumentando la concentración de proteína p53 (redu ciendo la velocidad, normalmente rápida, de degradación de la molécula). El alto nivel de p53 resultante bloquea la proliferación celular: las células no pue den progresar en la fase S del ciclo celular y se retrasan en la fase Gj o mueren por apoptosis. Las células que carecen del gen p53 no muestran esta respuesta: continúan dividiéndose, precipitándose en la replicación del DNA sin detenerse en la reparación de roturas ni de otras lesiones causadas por la radiación dañina. Como resultado de ello, mueren, o lo que es peor, sobreviven y proliferan pero con un genoma en mal estado. Así una consecuencia habitual es que los crom o somas se fragmenten y se reúnan, generando un cariotipo altamente inestable. Esto puede conducir a duplicaciones génicas y, en los siguientes ciclos de divi sión celular, a amplificaciones génicas como las descritas anteriormente para m drl y myc en células tumorales (Figura 24-34). Parece, por lo tanto, que la función normal -o como mínimo una función norm al- de p53 es capacitar a las células para reparar con éxito el DNA dañado. Es posible que p53 pueda actuar también como freno de la proliferación celular en otras circunstancias de estrés. De hecho, muchas células cancerosas contie nen grandes cantidades de p53 (de mutante inactiva); lo cual sugiere que los otros accidentes genéticos que generan el cáncer son suficientes para estimular a p53 para que entre en juego. La pérdida o inactivación de p53 puede ser, por lo tanto, doblemente peligrosa en relación con el cáncer -prim ero, debido a la eli minación de un bloqueo hacia la proliferación de las células que han sufrido mutaciones carcinogénicas, y segundo por permitir otras mutaciones carcinogénicas que se generarán cuando estas células se dividan. Las mutaciones en el gen p53 son las lesiones más comunes en el cáncer humano; está presente en más del 50% de los casos de esta enfermedad.
Los cánceres colon-rectales se desarrollan lentam ente, a través de una sucesión de cambios estructurales visibles29,30 En la primera parte de este capítulo hemos visto que la mayor parte de cánceres se desarrollan lentamente a partir de una sola célula alterada, progresando desde tumores benignos a malignos por la acumulación de media docena de accidentes genéticos independientes. En la segunda parte del capítulo hemos discutido al gunos de estos accidentes en términos moleculares. Ahora consideraremos de qué forma encajan los principios generales y los fragmentos de la explicación ge-
Figura 24-34 Mecanismo por el cual la replicación del DNA dañado puede conducir a anomalías cromosdmicas y amplificación génica. El esquema muestra un de los diversos mecanism os posibles. El proceso empieza con el daño accidental del DNA en una célula que carece de proteína p53 funcional. En lugar de detenerse en el punto de control dependiente de p53 de la fase G, del ciclo de división celular, com o haría una célula normal con el DNA dañado hasta que su DNA estuviera reparado, la célula defectiva en p53 entra en la fase S con las consecuencias que se muestran. Cuando se ha generado un cromosom a que contiene una duplicación y carece de telómero, rondas de replicación repetidas, fusión de cromátidas, y roturas desiguales pueden increm entar todavía más el número de copias de la región duplicada. Por lo tanto, la selección a favor de las células con un número incrementado de copias de un gen en la región afectada del cromosom a dará lugar a mutantes en las cuales el gen se amplifica hasta un elevado número de copias. Las copias múltiples pueden ser visibles finalmente com o una región teñida hom ogéneam ente en el cromosoma, o pueden -tan to a través de un acontecim iento de recom binación com o mediante una rotura no reparada de una hebra de DNA- delecionarse de su locus original y aparecer como cromosom as dobles diminutos individuales (véase Figura 24-20).
»—telóm ero Q - centròm ero —gen A rotura en - una hebra J—telóm ero
1
la célula entra en la fase S y replica su DNA a pesar de que la rotura de la hebra no ha sido reparada
Genética molecular del cáncer
O
fragm ento de crom osom a separado
una célula hija hereda el crom osom a que carece de telóm ero
lU la célula entra en la fase S y replica su DNA
l
los extrem os de las crom átidas hermanas que carecen de telóm eros se fusionan
las crom átidas hermanas fusionadas se separan en la m itosis generando un nuevo punto de rotura
una célula hija hereda un crom osom a con genes duplicados pero que tam bién carecen de telóm ero
1379
Figura 24-35 Sección transversal de un pólipo adenomatoso del colon. El pólipo sobresale en el lumen del colon. El resto de la pared del colon está cubierta con epitelio de colon normal, formando glándulas típicas cortas; en el pólipo el epitelio aparece algo anormal, formando glándulas más largas. (Cortesía de Anne Campbell.)
nética, proporcionando una relación coherente del desarrollo de uno de los cán ceres humanos más comunes. Como ejemplo tomamos el cáncer colon-rectal, porque en este caso los pasos de la progresión tumoral se han podido seguir in vivo, a través de una serie de cambios estructurales que pueden ser relatados como acontecim ientos moleculares específicos. Los cánceres colon-rectales se generan en el epitelio lindante del colon y del recto (el tramo final del intestino). Son comunes, ya que actualmente causan unas 50 000 muertes cada año en los Estados Unidos y representan el 11% del total de muertes por cáncer. Como la mayoría de cánceres, normalmente no son diagnosticados hasta una edad tardía (el 90% después de los 55 años). Sin em bargo, un examen rutinario en adultos normales mediante un colonoscopio (un aparato de fibra óptica que permite observar el interior del colon y del recto) a menudo revela un tumor benigno del epitelio intestinal, de pequeñas dimensio nes, o adenoma, que forma una masa protuberante del tejido denominada póli po (Figura 24-35). Se cree que estos pólipos adenomatosos son los precursores de una gran proporción de los cánceres colon-rectales. Debido a que normal mente la progresión de la enfermedad es muy lenta, existe un período típico de 10-35 años en el cual el tumor de crecim iento lento ya es detectable pero aún no se ha convertido en maligno. Por ello, cuando la gente se somete a un reconoci miento mediante colonoscopio, hacia los 50 años, y se extraen los pólipos -e l procedimiento quirúrgico es rápido y sencillo- la incidencia de cáncer colonrectal disminuye mucho -d e acuerdo con algunos estudios, menos de la cuarta parte de lo que ocurriría en caso contrario. El cáncer de colon proporciona un ejemplo claro del fenómeno de la pro gresión tumoral descrito previamente. En los pólipos menores de 1 cm de diá metro, las células y los detalles locales de su disposición en el epitelio aparecen casi normales. Cuanto mayor es el pólipo, mayor es la probabilidad de que con tenga células con apariencia anorm alm ente indiferenciada y formando estruc turas organizadas de forma anormal. En algunos casos en un mismo pólipo pueden distinguirse dos o más sectores y las células de un sector parecen relati vamente normales mientras que las del otro parecen realmente cancerosas, como si hubieran aparecido como un subclon mutante del colon original de cé lulas adenomatosas. En estadios posteriores de la enfermedad, las células tumorales resultan invasivas, primero se separan de la lámina basal epitelial, luego se extienden por la capa muscular que rodea el intestino y finalmente forman m e tástasis hacia los nodulos linfáticos, el hígado, el pulmón y otros tejidos.
138 0
Capítulo 2 4 : Cáncer
Las m utaciones que conducen al cáncer colon-rectal pueden ser identificadas examinando las células cancerosas y estudiando las familias propensas a desarrollar cáncer29,31 ¿Cuáles son las mutaciones que se acumulan con el tiempo para producir este tipo de cáncer? Una aproximación para responder a esta pregunta consiste en utilizar sondas de DNA de proto-oncogenes conocidos y de genes supresores de tumores para determinar si alguno de ellos han sufrido una mutación. Por este medio se ha visto que el 75% de cánceres colon-rectales tienen mutaciones de inactivación en el gen supresor de tumores p53 ; el 50% tienen mutaciones pun tuales en el proto-oncogén ras (normalmente una mutación específica de acti vación, en el codón 12 del gen K-ras); un pequeño porcentaje tienen amplificado el número de copias del proto-oncogén myc; y otro pequeño porcentaje tiene mutaciones en otros proto-oncogenes conocidos (véase Tabla 24-7). Otra aproximación consiste en localizar el defecto genético en aquellas fa milias poco frecuentes que muestran una predisposición hereditaria al cáncer colon-rectal. El principal de estos síndromes de cáncer hereditario es la condi ción conocida como poliposis coli adenomatosa fam iliar (APC, de Adenomatous Polyposis Coli), en la cual a lo largo del colon se desarrollan cientos de miles de pólipos. Aparecen en una fase temprana de la edad adulta, y si no son extirpa dos, es casi inevitable que uno o más de ellos progrese hasta convertirse en m a ligno; desde la primera detección de pólipos hasta el diagnóstico de cáncer transcurren unos doce años. Un indicio de la enfermedad puede ser una deleción o una inactivación de un gen específico -e l gen APC situado en el brazo lar go del cromosoma 5. Los individuos que padecen el síndrome APC tienen muta ciones inactivadoras o deleciones del gen APC en todas las células del cuerpo. De los pacientes de cáncer colon-rectal que no padecen el síndrome APC, más del 65% tienen mutaciones similares en las células cancerosas pero no en los otros tejidos. Por lo tanto, de manera similar a lo que hemos comentado para el retinoblastoma, las mutaciones de APC han sido identificadas como uno de los ingredientes centrales del cáncer colon-rectal. La función normal de la proteína APC no se conoce, pero se ha visto que se une a catenina (3 (véase Capítulo 19), lo cual sugiere que podría estar implicada en algún mecanismo de control rela cionado con los lugares de anclaje del citoesqueleto a las uniones célula-célula.
Tabla 24-7 Algunas anomalías genéticas detectadas en células de cáncer colon-rectal Gen
Cromosoma
K-ras neu myc APC (poliposis coli adenomatosa) DCC (delecionado en carcinoma de colon) p53 HNPCC (cáncer colon-rectal hereditario no polipoide)
Tumores con mutaciones (%) Clase
12
-50
17
8
2 2
5
>70
18
>70
17
>70
2
-15
oncogén oncogén oncogén supresor de tumores supresor de tumores supresor de tumores supresor de tumores
Fuente: Modificado de J.L. Marx, Science 260:751-752,1992.
Genética molecular del cáncer
1381
Deleciones genéticas en las células cancerosas colon-rectales revelan lugares de pérdida de genes supresores de tum ores29,32 Otro enfoque en la investigación ha conducido también al descubrimiento de otros genes supresores de tumores. Como hemos indicado anteriormente, la pérdida de ambas copias de un gen supresor de tumores a menudo comporta una pérdida de heterozigosis en la región crom osóm ica en la que reside el gen: en lugar de distintas variantes materna y paterna sólo existe una versión de la se cuencia crom osóm ica y algunas veces ninguna. Como en las poblaciones huma nas existe una gran variabilidad genética, en muchos individuos es posible en contrar varias diferencias de secuencia entre las copias materna y paterna de cualquier crom osom a dado y diseñar sondas genéticas que detecten estas dife rencias. Usando estas sondas se puede analizar sistemáticamente el genoma de células de un tumor y buscar la pérdida de heterozigosis que es detectable en las células normales del individuo. Si la pérdida de heterozigosis se detecta repeti damente en el mismo lugar crom osóm ico en muchos tumores derivados de ma nera independiente, disponemos de un indicio muy fuerte de que este lugar nor malmente hospeda un gen supresor de tumores cuya pérdida es un instrumento para generar tumores. Un análisis sistemático de este tipo en un gran número de cánceres colonrectales revela distintos lugares en los que la pérdida de heterozigosis es tan co mún que sugiere la presencia de un gen supresor de tumores. El lugar del gen APC está entre ellos, al igual que el gen p53; otro lugar que muestra pérdida de heterozigosis en más del 70% de tumores está ocupado por un gen llamado DCC [delecionado en carcinoma de colon). Este gen, que fue descubierto a través de este sistem a de análisis, codifica la que parece ser una proteína transm em bra na cuyo dominio extracelular es similar al de la molécula de adhesión celular N-CAM, lo cual sugiere que podría estar implicada en la adhesión célula-célula o célula-m atriz o en la recepción de señales desde el entorno celular. La Tabla 24-7 proporciona un resumen de los principales proto-oncogenes y genes supre sores de tumores implicados en el cáncer colon-rectal.
Las etapas de la progresión tumoral pueden correlacionarse con determinadas m utaciones29,33 ¿En qué secuencia ocurren estas mutaciones y cómo contribuye cada una de ellas al com portam iento desordenado de la célula cancerosa? Las mutaciones que inactivan el gen APC parecen ser la primeras, o al menos, corresponden a una etapa muy temprana. Pueden ser ya detectadas en pequeños pólipos benig nos con la misma frecuencia elevada que en los tumores malignos de mayor ta maño. Su efecto parece ser simplemente el de incrementar la velocidad de proli feración de la célula en relación a la velocidad de pérdida de células, sin afectar la forma en que las células se diferencian o los detalles del patrón histológico que forman. Las mutaciones que activan el oncogén ras ocurren un poco más tarde; son raras en los pólipos pequeños pero son comunes en los mayores que muestran distorsiones en la diferenciación celular y en el patrón histológico. Cuando se hacen crecer en cultivo estas células malignas del carcinoma colonrectal que contienen estas mutaciones de ras, muestran las características co munes de células transformadas, com o la habilidad de proliferar sin anclaje al substrato; si su gen ras activado es eliminado las células revierten a no transfor madas y reducen su velocidad de proliferación. Las mutaciones en DCC y en p53 se producen más tarde. Son raras en póli pos pero com unes en tumores malignos que se desarrollan de ellos. La pérdida de p53 parece liberar a las células mutantes de sus últimas inhibiciones; si se transfecta p53 normal en las células de carcinoma colon-rectal, se suprime su proliferación. De acuerdo con una teoría, las mutaciones oncogénicas de ras, como el daño genético inducido por radiación, activan un freno de emergencia de la proliferación que depende de la proteína p53; para que las células puedan
1 38 2
Capítulo 2 4 : Cáncer
crom osom a alteración gen
5q
12p
18q
17p
p é r d id a
a c t iv a c ió n
p é r d id a
p é r d id a
APC
K-ras
DCC
p53 otras m utaciones
epitelio norm al
—►
epitelio hiperproliferativo
adenoma tem prano
— ► adenom a interm edio
^ adenoma tardío
crecer hasta un cáncer totalmente establecido ha de ocurrir que este freno sea inutilizado por una mutación en p53. Parece que la pérdida de la función p53 permite a las células no sólo dividirse sino también acumular más mutaciones a una velocidad rápida, progresando a través del ciclo celular cuando no están preparadas para hacerlo. Debido a que estas mutaciones posteriores ocurren rá pidamente, probablemente no son acontecim ientos limitantes en la incidencia del cáncer (véase Figura 24-8), pero deben tener consecuencias funcionales. Por este camino se llega finalmente al tumor maligno, con diversas y variadas abe rraciones genéticas y su habilidad para sobrevivir adaptándose frente al ataque terapéutico (Figura 24-36). A pesar de que las mutaciones en APC, ras, DCC y p53 pueden ser pasos li mitantes cruciales en una gran proporción de cánceres colon-rectales, estas mu taciones no siempre ocurren en la misma secuencia, y no son la única ruta de la enfermedad. Por ejemplo, en aproximadamente un 15% de los casos parece que el desarrollo del cáncer colon-rectal se desencadena desde el principio mediante otro tipo de mutación que aumenta la mutabilidad de la célula disminuyendo la fidelidad de replicación de determinadas clases de secuencias de DNA repetitivo (como repeticiones de dinucleótidos del tipo CACACA...) que están distribuidas a lo largo del genoma. Individuos que heredan esta mutación que promociona las mutaciones tienden a desarrollar cánceres colon-rectales (y de otros tipos) en una edad temprana; esta condición se conoce como cáncer colon-rectal heredi tario no polipoide o HNPCC (de Hereditary Non-Polyposis Colorectal Cancer). El gen HNPCC tiene una historia de evolución muy antigua: existe un gen hom ólo go al humano en bacterias y levaduras denominado mutS que es necesario para reparar regiones del DNA donde se producen desapareamientos de la secuencia de nucleótidos de las dos cadenas de la doble hélice (véase Figura 6-50). Está cla ro que estos mecanism os de reparación son de una importancia fundamental en todos los organismos vivos. Las células tumorales con mutaciones HNPCC nor m almente no muestran la enorme inestabilidad cromosómica asociada a las mutaciones p53 : han encontrado otra ruta más sutil hacia la acumulación rápida de las mutaciones requeridas para el cáncer. Otros tipos de cánceres que han sido analizados genéticamente muestran a menudo una variedad de lesiones genéticas y de diferencias entre un caso y otro de la enfermedad, incluso más amplias que las descritas aquí. Por ejemplo, en la forma de cáncer de pulmón conocida como cáncer de las células pequeñas del pulmón, se encuentran mutaciones no sólo en ras, p53 y APC sino tam bién en Rb, en miembros de la familia myc (en la forma de amplificación del número de copias del gen myc), y en al menos otros cinco proto-oncogenes conocidos y ge nes supresores de tumor. En pacientes distintos se han encontrado com binacio nes diferentes de mutaciones, que corresponden a cánceres que reaccionan de forma distinta al tratamiento.
—►
L
Figura 24-36 Secuencia típica de los cambios genéticos que marcan el desarrollo de un carcinoma colonrectal. Nótese que generalmente la pérdida de APC, DCC o p53 requiere dos mutaciones para que se eliminen ambas copias del gen. De este modo, los cambios mostrados aquí corresponden a un total de siete mutaciones. (Según E.R. Fearon y B. Vogelstein, Cell 61:759-767,1990.)
Cada caso de cáncer se caracteriza por su propia sucesión de lesiones genéticas Todo el progreso médico depende de un diagnóstico acertado. Si no se puede identificar correctam ente una enfermedad, no se pueden descubrir sus causas,
Genética molecular del cáncer
1383
predecir su resultado, seleccionar un tratamiento adecuado para un paciente dado, o realizar pruebas en una población de pacientes para juzgar si un trata miento propuesto es efectivo. Como acabamos de ver, la calificación tradicional de cánceres es simplista: una sola de la categorías convencionales aparece como una colección de trastornos heterogéneos después de un escrutinio detenido, con algunos acontecim ientos en común pero cada uno caracterizado por su pro pia sucesión de trastornos genéticos (Figura 24-37). La biología molecular está empezando a proporcionar herramientas para determinar con precisión qué ge nes son amplificados, cuáles están delecionados, y cuáles están mutados en las células tumorales de un paciente dado. Esta información podría ser tan impor tante para el tratamiento y prevención del cáncer como lo es la identificación de microorganismos en pacientes con enfermedades infecciosas. El descubrimiento de oncogenes y, más recientemente, de genes supresores de tumores ha marcado el fin de una era de tanteo en la oscuridad de los indi cios de las bases bioquímicas del cáncer. Ha sido alentador encontrar que, des pués de todo, existen algunos principios generales y que las distintas formas de cáncer comparten algunas anomalías genéticas clave. De todos modos aún esta mos lejos de entender com pletamente los cánceres humanos comunes. Conoce mos las secuencias de DNA de muchos oncogenes y proto-oncogenes y de diver sos genes supresores de tumores cruciales, pero sólo conocem os las funciones fisiológicas de algunos de ellos. Para poder diseñar tratamientos racionales y efi caces necesitam os conocer m ejor cómo interaccionan estas y otras moléculas para gobernar el com portam iento de las célula individuales, hemos de entender mejor la sociología de las células en los tejidos y hemos de comprender m ejor la población genética de la célula que gobierna la génesis de las células cancerosas a través de la m utación y de la selección natural. Retrocediendo en la historia de la biología celular, podemos sentirnos opti mistas. El deseo de entender qué es lo que guía la investigación básica revelará se guramente nuevos caminos hacia nuestras metas humanitarias, no sólo en rela ción al cáncer sino también en áreas más amplias que apenas podemos prever.
Resumen
Dos clases de genes son críticos en la génesis del cáncer -genes supresores de tumo res y proto-oncogenes. Las mutaciones de pérdida defunción en genes supresores de tumores relevan a las células de las inhibiciones que normalmente mantienen con trolado su número; las mutaciones de ganancia de función en proto-oncogenes estimulan a las células a incrementar su número cuando no deberían hacerlo. Estas últimas mutaciones tienen un efecto dominante, y los genes mutados, conocidos como oncogenes, pueden identificarse por su habilidad en transformar el compor tamiento de las células en las cuales son introducidos. Muchos oncogenes han sido localizados por su presencia en retrovirus transformantes, los cuales pueden tomar estas versiones modificadas y peligrosas de genes en unas células huésped e introdu cirlos en otras células huésped. Una gran proporción de proto-oncogenes codifican componentes de las rutas por las cuales las señales externas estimulan a las células a dividirse. Normalmente las mutaciones en genes supresores de tumores son recesivas en su efecto sobre una célula individual: no se produce pérdida del control hasta que ambas copias del gen se hallan inactivadas. Sin embargo, las personas que heredan una copia defectuosa y otra funcional del gen están a menudo fuertemente predis puestas al cáncer, ya que una sola mutación somática es suficiente, junto con la mutación heredada, para generar una célula que carezca totalmente de la función del gen supresor de tumores. Los cánceres que se dan de este modo en familias son raros, pero proporcionan un medio para identificar genes supresores de tumores cuya pérdida es característica en muchos cánceres comunes. Los virus de DNA como papilomavirus y SV40 pueden promover el desarrollo del cáncer secuestrando los productos de genes supresores de tumores -en particular de la proteína Retinoblas toma, que regula la progresión en el ciclo celular en circunstancias normales, y de 1 38 4
Capítulo 2 4 : Cáncer
TUMOR 1
TUMOR 2
Figura 24-37 Cada tumor generalmente contendrá un juego de lesiones genéticas distintas. En este diagrama esquemático, W, X, Y y Z denotan alteraciones en genes supresores de tumor u oncogenes aún no descubiertos. Los tumores que aparecen en distintos tejidos son, generalmente, más diferentes en sus anomalías genéticas que los tumores de origen similar.
la proteína p53, que se cree que actúa como freno de emergencia en la división celu lar de células que han sufrido un daño genético. Las etapas de la progresión tumoral pueden correlacionarse con mutaciones que activan oncogenes específicos e inactivan genes supresores de tumores. La pér dida de la función de p53, por ejemplo, es un acontecimiento tardío común y puede ser el responsable de la inestabilidad genética de muchos cánceres establecidos que forman metástasis. Combinaciones diferentes de mutaciones se han encontrado en diferentes formas de cáncer e incluso en pacientes que normalmente sufren la mis ma forma de la enfermedad. De todos modos, repetidamente se encuentran muchos de los mismos tipos de lesiones genéticas, lo cual sugiere que sólo existe un número limitado de caminos por los cuales nuestras defensas contra el cáncer pueden ser superadas.
Bibliograffa General Brugge, J.; Curran, T.; Harlow, E.; McCormick, F., eds. Ori gins of Human Cancer. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1991. Cairns, J. Cancer: Science and Society. San Francisco: W.H. Freeman, 1978. Cancer Biology: Readings from Scientific American. New York: W.H. Freeman, 1986. De Vita, V.T.; Heilman, S.; Rosenberg, S.A., eds. Cancer: Principles and Practice of Oncology, 4th ed. Philadelp hia: Lippincott, 1993. Franks, L.M.; Teich, N.M., eds. Introduction to the Cellular and Molecular Biology of Cancer, 2nd ed. Oxford, UK: Oxford University Press, 1991. Varmus, H.; Weinberg, R.A. Genes and the Biology of Can cer. New York: Scientific American Library, 1993. Citas 1. Cairns, J. Mutation selection and the natural history of cancer. Nature 255:197-200, 1975. Nowell, P.C. The clonal evolution of tumor cell popula tions. Science 194:23-28, 1976. 2. Doll, R.; Peto, R. Epidemiology of cancer. In Oxford Textbook of Medicine (D.J. Weatherall, I.G.G. Ledingham, D.A. Warrell, eds.), 2nd ed., pp. 4.95-4.123. Ox ford, UK: Oxford University Press, 1987. McGee, J.O’D.; Isaacson, P.G.; Wright, N.A., eds. Oxford Textbook of Pathology, Vol. 1, pp. 569-717. Oxford, UK: Oxford University Press, 1992. Parkin, D.M.; Laara, E.; Muir, C.S. Estimates of the worldwide frequency of sixteen major cancers in 1980. Int.J. Cancer 41:184-197, 1988. Robbins, S.L.; Cotran, R.S.; Kumar, V. Pathologic Basis of Disease, 4th ed., pp. 239-305. Philadelphia: Saun ders, 1989. 3. Fearon, E.R.; Hamilton, S.R.; Vogelstein, B. Clonal analy sis of human colorectal tumors. Science 238:193-197, 1987. Fialkow, P.J. Clonal origin of human tumors. Biochim. Biophys. Acta 458:283-321, 1976. Groffen, J.J., et al. Philadelphia chromosomal break point are clustered within a limited region, bcr, on chromosome 22. Cell 36:93-99, 1984.
Bibliografía
Nowell, P.C.; Hungerford, D.A. A minute chromosome in human granulocytic leukemia. Science 132:1497, 1960. 4. Ames, B.; Durston, W.E.; Yamasaki, E.; Lee, F.D. Carci nogens are mutagens: a simple test system combi ning liver homogenates for activation and bacteria for detection. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 70:22812285, 1973. Ashby, J.; Tennant, R.W. Chemical structure, Salmonella mutagenicity and extent of carcinogenicity as indica tors of genotoxic carcinogensis among 222 chemicals tested in rodents by the U.S. NCI/NTP. Mutation Res. 204:17-115, 1988. Case, R.M.P. Tumours of the urinary tract as an occupa tional disease in several industries. Ann. R. Coll. Surg. Engl. 39:213-235, 1966. Doll, R. Strategy for detection of cancer hazards to man. Nature 265:589-597, 1977. Hamden, D.G. Carcinogenesis. In Oxford Textbook of Pathology (J.O’D. McGee, P.G. Isaacson, N.A. Wright, eds.), Vol. 1, pp. 633-671. Oxford, UK: Oxford Univer sity Press, 1992. 5. Armitage, P.; Doll, R. The age distribution of cancer and a multi-stage theory of carcinogenesis. Br. J. Cancer 8:1-12, 1954. Peto, R. Cancer epidemiology, multistage models, and short-term mutagenicity tests. In Origins of Human Cancer (H.H. Hiatt, J.D. Watson, J.A. Winsten, eds.), pp. 1403-1428. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory, 1977. Vogelstein, B.; Kinzler, K.W. he mulistep nature of can cer. Trends Genet. 9:138-141, 1993.
6. Cairns, J. Cancer: Science and Society, pp. 144-156. San Francisco: W.H. Freeman, 1978. Campion, M.J.; McCance, D.J.; Cuzick, J.; Singer, A. Pro gressive potential of mild cervical atypia: prospecti ve, cytological, colposcopic, and virological study. Lancet 2:237-240, 1986. Farber, E.; Cameron, C. The sequential analysis of can cer development. Adv. Cancer Res. 31:125-225,1980. Foulds, L. The natural history of cancer. J. Chronic Dis. 8:2-37, 1958. Mclndoe, W.A.; McLean, M.R.; Jones, R.W.; Mullins, P.R. The invasive potential of carcinoma in situ of the cer vix. Obstet. Gynecol. 64:451-464, 1984.
1385
7. Ames, B.N.; Gold, L.S. Too many rodent carcinogens: mitogenesis increases mutagenesis. Science 249:970971.1990. Schnipper, L.E. Clinical implications of tumor-cell het erogeneity. N. Engl. J. Med. 314:1423-1431,1986. 8. Berenblum, I. A speculative review: the probable nature of promoting action and its significance in the un derstanding of the mechanism of carciongenesis. Cancer Res. 14:471-477,1954. Berenblum, I.; Shubik, P. The role of croton oil applica tions associated with a single painting of a carcino gen in tumour induction in the mouse’s skin. Br. J. Cancer 1:379-383,1947. Leder, A.; Kuo, A; Cardiff, R.D.; Sinn, E.; Leder, P. v-Ha-ras transgene abrogates the initiation step in mouse skin tumorigenesis: effects of phorbol esters and retinoic acid. Proc. Nad. Acad. Sci. USA 87:9178-9182,1990. Reddy, A.L.; Fialkow, P J. Influence of dose of initiator on two-stage skin carcinogenesis in BALB/c mice with cellular mosaicism. Carcinogenesis 9:751-754, 1988. 9. Cairns, J. The treatment of diseases and the war against cancer. Sci. Am. 253(5):51-59,1985. Cohen, LA. Diet and cancer. Sci. Am. 257(5):42-48,1987. Doll, R.; Peto, R. The causes of cancer: quantitative esti mates of avoidable risks of cancer in the United Sta tes today./. Natl. Cancer Inst. 66:1191-1308,1981. Enstrom, J.E. Cancer and mortality among active Mor mons. Cancer 42:1943-1951,1978. Henderson, B.E.; Ross, R.K.; Pike, M.C. Hormonal chemoprevention of cancer in women. Science 259:633639,1993. 10. Boon, R. Teaching the immune system to fight cancer. Sci. Am. 266(3):82-89,1993. Fentiman, I.S. The local treatment of cancer. In Intro duction to the Cellular and Molecular Biology of Cancer (L.M. Franks, N.M. Teich, eds.), 2nd ed., pp. 434-450. Oxford, UK: Oxford University Press, 1991. Malpas, J. Chemotherapy. In Introduction to the Cellu lar and Molecular Biology of Cancer (L.M. Franks, N.M. Teich, eds.), 2nd ed., pp. 451-467. Oxford, UK: Oxford University Press, 1991. Pastan, I.; FitzGerald, D. Recombinant toxins for cancer treatment. Science 254:1173-1177,1991. Wawrzynczak, E.J.; Thorpe, P.E. Monoclonal antibodies and therapy. In Introduction to the Cellular and Mo lecular Biology of Cancer (L.M. Franks, N.M. Teich, eds.), 2nd ed., pp. 468-509. Oxford, UK: Oxford Uni versity Press, 1991. 11. Sachs, L. Growth, differentiation, and the reversal of ma lignancy. Sci. Am. 254(l):40-47, 1986. Sawyers, C.L.; Denny, C.T.; Witte, O.N. Leukemia and the disruption of normal hematopoiesis. Cell 64:337350.1991. 12. Fidler, I.; Hart, I. Biological diversity in metastatic neo plasms: origins and implications. Science 217:9981003, 1982. Frixen, U.H., et al. E-cadherin-mediated cell-cell adhe sion prevents invasiveness of human carcinoma cells./. Cell Biol. 113:173-185, 1991. Stetler-Stevenson, W.G.; Aznavoorian, S.; Liotta, L.A. Tumor cell interactions with the extracellular matrix during invasion and metastasis. Annu. Rev. Cell Biol. 9:541-574, 1993.
1386
Capitulo 2 4 : C&ncer
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
Takeichi, M. Cadherins in cancer: implications for inva sion and metastasis. Curr. Opin. Cell Biol. 5:806-811, 1993. Barnes, D.E.; Lindahl, T.; Sedgwick, B. DNA repair. Curr. Opin. Cell Biol. 5:424-433,1993. Hanawalt, P.; Sarasin, A. Cancer-prone hereditary dise ases with DNA processing abnormalities. Trends Ge net. 2:124-129,1986. Kastan, M.B., et al. A mammalian cell cycle checkpoint pathway utilizing p53 and GADD45 is defective in ataxia-telangiectasia. Cell 71:587-597, 1992. Solomon, E.; Borrow, J.; Goddard, A.D. Chromosome aberrations and cancers. Science 254:1153-1160,1991. Gerlach, J.H., et al. Homology between P-glycoprotein and a bacterial haemolysin transport protein sug gests a model for multidrug resistance. Nature 324:485-489, 1986. Ma, C.; Martin, S.; Trask, B.; Hamlin, J.L. Sister chroma tid fusion initiates amplification of the dihydrofolate reductase gene in Chinese hamster cells. Genes Dev. 7:605-620,1993. Roninson, I.B.; Abelson, H.T.; Housman, D.E.; Howell, N.; Varshavsky, A. Amplification of specific DNA se quences correlates with multi-drug resistance in Chi nese hamster cells. Nature 309:626-628,1984. Smith, K.A.; Stark, M.B.; Gorman, P.A.; Stark, G.R. Fu sions near telomeres occur early in the amplification of CAD genes in Syrian hamster cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5427-5431, 1992. Wong, A.J., et al. Gene amplification of c -myc and Nmyc in small cell carcinoma of the lung. Science 233:461-464,1986. Bishop, J.M. Molecular themes in oncogenesis. Cell 64:235-248,1991. Brugge, J.; Curran, T.; Harlow, E.; McCormick, F., eds. Origins of Human Cancer. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory, 1991. Harris, H. The genetic analysis of malignancy. /. Cell Sci. 4(Suppl.):431-444, 1986. Varmus, H.; Weinberg, R.A. Genes and the Biology of Cancer. New York: Scientific American Library, 1993. Wyke, J.A. Viruses and Cancer. In Introduction to the Cellular and Molecular Biology of Cancer (L.M. Franks, N.M. Teich, eds.), 2nd ed., pp. 203-229. Ox ford, UK: Oxford University Press, 1991. zur Hausen, H. Viruses in human cancers. Science 254:1167-1173, 1991. Cooper, G.M. Oncogenes. Boston: Jones and Bartlett, 1990. Kahn, P.; Graf, T., eds. Oncogenes and Growth Control. Berlin: Springer, 1986. Watson, J.D.; Hopkins, N.H.; Roberts, J.W.; Weiner, A.M. Molecular Biology of the Gene, 4th ed., pp. 961-1096. Menlo Park, CA: Benjamin-Cummings, 1987. Martin, G.S. Rous sarcoma virus: a function required for the maintenance of the transformed state. Nature 227:1021-1023, 1970. Temin, H.M.; Rubin, H. Characteristics of an assay for Rous sarcoma virus and Rous sarcoma cells in tissue culture. Virology 6:669-688, 1958. Bishop, J.M. Viral oncogenes. Cell 42:23-38,1985. Bishop, J.M. Oncogenes. Sci. Am. 246(3):80-92, 1982. Jove, R.; Hanafusa, H. Cell transformation by the viral src oncogene. Annu. Rev. Cell Biol. 3:31-56,1987.
Swanstrom, R.; Parker, R.C.; Varmus, H.E.; Bishop, J.M. Transduction of a cellular oncogene-the genesis of Rous sarcoma virus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2519-2523, 1983. 20. Rijsewijk, F., et al. The Drosophila homolog of the mou se mammary oncogene int-1 is identical to the seg ment polarity gene wingless. Cell 50:649-657,1987. Varmus, H.E. The molecular genetics of cellular oncoge nes. Annu. Rev. Genet. 18:553-612,1984. 21. Croce, C.M.; Klein, G. Chromosome translocations and human cancer. Sci. Am. 252(3):44-50, 1985. Weinberg, R.A. A molecular basis of cancer. Sci. Am. 249(5):126-142, 1983. 22. Cantley, L.C., et al. Oncogenes and signal transduction. Cell 64:281-302, 1991. Downward, J., et al. Close similarity of epidermal growth factor receptor and \-erb-B oncogene protein sequen ces. Nature 307:521-527,1984. Hunter, T. The proteins of oncogenes. Sci. Am. 251(2):70-79, 1984. Quintanilla, M.; Brown, K.; Ramsden, M.; Balmain, A. Carcinogen-specific mutation and amplification of Ha-ras during mouse skin carcinogenesis. Nature 322:78-80, 1986. 23. Adams, J.M.; Cory, S. Transgenic models of tumor deve lopment. Science 254:1161-1167, 1991. Bissonnette, R.P.; Echeverri, F.; Mahboubi, A.; Green, D.R. Apoptotic cell death induced by c -myc is inhib ited by bcl- 2. Nature 359:552-554,1992. Fanidi, A.; Harrington, E.A.; Evan, G.I. Cooperative inter actions between c -myc and bcl-2 proto-oncogenes. Nature 359:554-556,1992. Hunter, T. Cooperation between oncogenes. Cell 64:249-270, 1991. Mulligan, L.M., et al. Germ-line mutations of the RET proto-ongoene in multiple endocrine neoplasia type 2A. Nature 363:458-460,1993. 24. Haber, D.A.; Housman, D.E. Rate-limiting steps: the ge netics of pediatric cancers. Cell 64:5-8,1991. Knudson, A.G. Hereditary cancer, oncogenes, and an tioncogenes. Cancer Res. 45:1437-1443,1985. Weinberg, R A Tumor supressor genes. Science 254:11381146,1991. 25. Hansen, M.F.; Cavenee, W.K. Retinoblastoma gene and cell growth control. Trends Genet. 4:125-129,1988. Weinberg, R.A. The retinoblastoma gene and cell growth control. Trends Biochem. Sci. 15:199-202,1990. Weinberg, R.A. Finding the anti-oncogene. Sci. Am. 259(3):34-41, 1988. 26. Harbour, J.W., et al. Abnormalities in structure and expres sion of the human retinoblastoma gene in SCLC. Scien ce 241:353-357,1988. (SCLC = small-cell lung cancer.) Hollingsworth, R.E.J.; Hensey, C.E.; Lee, W.-H. Retino blastoma protein and the cell cycle. Curr. Opin. Ge net. Devel. 3:55-62,1993. Lee, E.Y.-H.P., et al. Inactivation of the retinobalstoma suceptibility gene in human breast cancers. Science 241:218-221,1988. 27. Gissman, L. Papillomarivuses and human oncogenesis. Curr. Opin. Genet. Devel. 2:97-102, 1992. Lazo, P.A. Human papillomaviruses in oncogenesis. Bioessays 9:158-162,1988.
Bibliografía
Steinberg, B.M.; Brandsma, J.L.; Taichman, L.B. Cancer Cells 5 / Papillomaviruses. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory, 1987. 28. El-Deiry, W.S.; et al. WAF1, a potential mediator of p53 tumor suppression. Cell 75:817-825,1993. Harper, J.W. et al. The p21 CDK-interacting protein Cipl is a potent inhibitor of G, cyclin-dependent ki nases. Cell 75:805-816, 1993. Hartwell, L. Defects in a cell cycle checkpoint may be responsible for the genomic instability of cancer cells. Cell 71:543-546,1992. Lane, D.P. Worrying about p53. Curr. Biol. 2:581-583,1992. Livingstone, L.R., et al. Altered cell cycle arrest and gene amplification potential accompany loss of wild-type p53. Cell 70:923-935,1992. Perry, M.E.; Levine, A.J. Tumor suppressor p53 and the cell cycle. Curr. Opin. Genet. Devel. 3:50-54,1993. Yin, Y.; Tainsky, M A ; Bischoff, F.Z.; Strong, L.C.; Wahl, G.M. Wild-type p53 restores cell cycle control and in hibits gene amplification in cells with mutant p53 alleles. Cell 70:937-948, 1992. 29. Fearon, E.R.; Vogelstein, B. A genetic model for colorec tal tumorigenesis. Cell 61:759-767,1990. 30. Atkin, W.S.; Cuzick, J.; Northover, J.M A ; Whynes, D.K. Prevention of colorectal cancer by once-only sigmoid oscopy. Lancet 341:736-740, 1993. 31. Nishisho, I., et al. Mutations of chromosome 5q21 genes in FAP and colorectal cancer patients. Science 253:665669,1991. Rubinfeld, B.; et al. Association of the APC gene product with (3-catenin. Science 262:1731-1734,1993. Su, L.-K., Vogelstein, B.; Kinzler, K. Association of the APC tumor suppressor protein with catenins. Science 262:1734-1737, 1993. 32. Fearon, E.R., et al. Identification of a chromosome 18q gene that is altered in colorectal cancers. Science 247:49-56,1990. (DDC gene.) Vogelstein, B., et al. Allelotype of colorectal carcinomas. Science 244:207-211,1989. 33. Aaltonen, L.A., et al. Clues to the pathogenesis of familial colorectal cancer. Science 260:812-816,1993. Baker, S.J.; Markowitz, S.; Fearon, E.R.; Willson, J.K.V.; Vo gelstein, B. Suppression of human colorectal carcinoma cell growth by wild-type p53. Science 249:912-915,1990. Fishel, R.; et al. The human mutator gene homolog MSH2 and its association with hereditary nonpolypo sis colon cancer. Cell 75:1027-1038,1993. Leach, F.S.; et al. Mutations of mutS homolog in hereditary nonpolyposis colon cancer. Cell 75:1215-1235,1993. Minna, J.D., et al. Molecular genetic analysis reveals chro mosomal deletion, gene amplification, and autocrine growth factor production in the pathogenesis of hu man lung cancer. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51:843-853, 1986. Powell, S.M., et al. APC mutations occur early during colorectal tumorigenesis. Nature 359:235-237,1992. Shirasawa, S.; Furuse, M.; Yokoyama, M.; Sasazuki, T. Altered growth of human colon cancer cell lines dis rupted at activated Ki-ras. Science 260:85-88, 1993.
1387
Glosario veces se denomina globular o actina G; la forma polimè rica es filamentosa o actina F.
aceptor de electrones
electrón acceptor
Átomo o molécula que toma fácilmente electrones, re duciéndose.
acetil CoA
acetyl CoA
Pequeña molécula soluble en agua que transporta gru pos acetilo en las células. Consta de un grupo acetilo unido al coenzima A (CoA) por un enlace tioéster fácil mente hidrolizable. ( Véase Figura 2-20.)
acetilcolina
acetilcholine
acetilo
acetyl
Secuencia de DNA reguladora a la que se unen proteínas reguladoras de genes afectando la velocidad de trans cripción de un gen estructural que puede estar a miles de pares de bases de distancia
acuoso
aqueous
adaptación
adaptation
Ajuste de la sensibilidad tras estimulación repetida. Se trata del mecanismo que permite a una neurona, a un fotorreceptor o a una bacteria, reaccionar frente a pe queños cambios a pesar de que los valores basales sean elevados.
adenil ciclasa
adenylyl cyclase (adenilate ciclase)
# —c C(J
ácido desoxirribonucleico
deoxyribonucleic acid Véase DNA.
ácido graso
fattyacid
Compuesto como el ácido palmítico que tiene un ácido carboxílico unido a una cadena de carbohidrato. Se uti liza como fuente de energía en el metabolismo y como punto de partida para la síntesis de fosfolípidos. (Véase Panel 2-4, págs. 56-57.)
ácido nucleico
nucleicacid
RNA o DNA; cadena de nucleótidos unidos entre sí por enlaces fosfodiéster.
ácido ribonucleico de transferencia
transfer ribonucleic acid Véase tRNA.
acoplamiento quimiosmótico
chemiosmotic coupling
Mecanismo en el que un gradiente de iones hidrógeno (un gradiente de pH) a través de una membrana es utili zado para impulsar un proceso que requiere energía como la producción de ATP o la rotación del flagelo de una bacteria. acrosoma
acrosome
Región del extremo de la cabeza del espermatozoide que contiene una vesícula llena de enzimas hidrolíticas utilizadas para digerir la capa que rodea el oocito.
actina
actine
enhancer
Perteneciente al agua, como en una solución acuosa.
Neurotransmisor que actúa en sinapsis químicas colinérgicas, encontrado tanto en el cerebro como en el sis tema nervioso periférico. Es el neurotransmisor de las uniones neuromusculares de los vertebrados. (Véase Fi gura 15-9.)
Grupo químico derivado del ácido acé tico. Los grupos acetilo son importantes en el metabolismo y a menudo se agregan como modificaciones covalentes de proteínas.
activador
Abundante proteína que forma los filamentos de actina en todas las células eucariotas. La forma monomérica a
Enzima unida a membrana que cataliza la formación de AMP cíclico a partir de ATP. Componente importante de algunos procesos de señalización intracelular.
adipocito
adipocyte Célula adiposa. ADP (adenosina 5’-difosfato)
ADP (adenosine 5’-diphosphate) Nucleótido producido por la hidrólisis del fosfato termi nal del ATP. Regenera ATP cuando es fosforilado me diante un proceso generador de energía como la fosfori lación oxidativa. (Véase Figura 2-18.) adrenalina (epinefrina)
adrenaline (epinephrine)
Hormona liberada por las células cromafines (de la glándula adrenal) y por algunas neuronas en respuesta al estrés. Produce respuestas de “lucha o huida”, inclu yendo un incremento de la frecuencia cardíaca y de los niveles sanguíneos de azúcar.
aeróbico
aerobic
Describe un proceso que requiere, u ocurre, en presen cia de oxígeno gaseoso (0 2). alcaloide
alcaloid
Pequeño pero complejo metabolito con nitrógeno pro ducido por los vegetales como defensa contra los herbí voros. Como ejemplos, la cafeína, la morfina y la colchicina.
alcano (alifático)
alkane (aliphatic) Compuesto de carbono e hidrógeno, que únicamente tiene enlaces covalentes sencillos. Como ejempío, el etano (CH3—CH3).
^ ^ H— c — c — H | |
G -l
grupo carboxilo, a través de un enlace éster débil, a un grupo hidroxilo de un tRNA
alcohol
alcohol Molécula orgánica polar que contiene un hidroxilo fun cional (—OH) unido a un átomo de carbono que no se halla en un anillo aromático. Como ejemplo, el alcohol etílico. c h ,— c h 2— o h
Amoeba proteus
Especie de ameba gigante de agua fría ampliamente uti lizada en estudios de locomoción celular.
AMP (adenosina 5’ monofosfato)
AMP (adenosine 5’-monophosphate)
aldehido
aldehide
Compuesto orgánico que contiene el grupo —C H =0. Un ejemplo es el gliceraldehído. Puede oxidarse a ácido o reducirse a alcohol.
Uno de los cuatro nucleótidos de una molécula de RNA. Al AMP se le pueden añadir dos fosfatos, obteniéndose ATP. (Véase Figura 2-30.) AMP cíclico (cAMP)
cyclicAMP (cAMP)
alelo
alíele
Una de entre varias formas alternativas de un gen. En una célula diploide cada gen tendrá dos alelos, cada uno de los cuales ocupa la misma posición (locus) en cromo somas homólogos.
alga
alga
Nucleótido que se genera a partir del ATP a través de la adenilato ciclasa en respuesta a la estimulación hormo nal de receptores de la superficie celular. El cAMP actúa como molécula señal activando la quinasa A; se hidroliza a AMP mediante la fosfodiesterasa. anabolismo
Término informal utilizado para describir una gran va riedad de organismos fotosintéticos, tanto unicelulares como pluricelulares. Como ejemplo pueden citarse Ni-
tella, Volvoxy Fucus.
anabolism
Sistema celular de reacciones biosintéticas por el cual se construyen grandes moléculas a partir de moléculas más pequeñas.
anaeróbico
starch
anaerobio
alqueno
anafase
almidón Polisacárido compuesto exclusivamente por unidades de glucosa; utilizado por las células vegetales como al macén de energía.
alkene
Compuesto de carbono e hidróge no con uno o más dobles enlaces carbono-carbono. Como ejemplo el etileno.
anaphase H H
\ /
/ C=
C
\
H l-l
Northern blotting
(1) Eucariota unicelular generalmente de vida libre que repta cambiando de forma. (2) Más estrictamente, géne ro particular de protozoos que se desplaza con un movi miento característico, denominado ameboide y que se debe a la emisión de pseudópodos.
amida
amide
Q NH;
amino terminal (N terminal)
Final de una cadena polipeptídica que tiene libre el gru po a amino. aminoácido
amino acid
Molécula orgánica que contiene un grupo amino y un grupo carboxilo. Los que constituyen los bloques es tructurales de las proteínas son aminoácidos alfa, ya que el grupo carboxilo y el grupo amino se hallan so bre el mismo átomo de carbono. (Véase Panel 2-5, págs. 58-59.)
aminoacil tRNA
Forma activada de un aminoácido, utilizada en la sínte sis de proteínas. Consta de un aminoácido unido por su
G-2
Glosario
Técnica en la que fragmentos de RNA separados por electroforesis son inmovilizados sobre una lámina de papel; entonces, uno de los fragmentos es detectado es pecíficamente con una sonda marcada.
análisis del linaje
lineage analysis
Rastreo de los antepasados de una célula en un embrión en desarrollo.
antipático
(^
omino terminus (N terminus)
amino acyl tRNA
Fase de la mitosis durante el cual los dos conjuntos de cromosomas se separan uno del otro. Compuesta de anafase A (los cromosomas se desplazan hacia los polos del huso) y anafase B (los polos del huso se separan). análisis de tipo Northern
ameba
amoeba
Molécula que contiene un grupo carbonilo unido a una amina. Los aminoácidos adyacentes en la cadena de una proteína se hallan unidos mediante grupos amida.
Describe una célula, un organismo o un proceso meta bolico que actúa en ausencia de aire, o de forma más precisa, en ausencia de oxígeno molecular.
amphipathic Que tiene dos regiones, una hidrofóbica y otra hidrofílica, como una molécula de fosfolípido o de detergente. Angstrom (A) Unidad de longitud utilizada para medir átomos y molé culas. Es igual a 10~10metros, o 0,1 nanómetros (nm). anterior
anterior
Situado hacia el extremo de cabeza del cuerpo.
antibiótico
antibiotic
Substancia, como la penicilina o la estreptomicina, tóxi ca para los microorganismos. Habitualmente, produci do por un microorganismo o una planta determinados.
anticodón
anticodon
Secuencia de tres nucleótidos de una molécula de RNA de transferencia, complementaria a la secuencia de tres
nucleótidos del codón de una molécula de RNA mensa jero; el anticodón está asociado a un aminoácido deter minado, que está unido covalentemente a la molécula de RNA de transferencia. anticuerpo (inmunoglobulina)
antibody (immunoglobulin)
Proteína producida por los linfocitos B en respuesta a una molécula extraña o a un organismo invasor. A menudo se une muy fuertemente a la molécula extraña o a la célula, inactivándolas o marcándolas para su destrucción me diante fagocitosis o lisis inducida por complemento.
anticuerpo monoclonal
monoclonal antibody
Anticuerpo segregado por un clon de hibridoma. Dado que cada uno de estos clones deriva de una sola célula B, todas las moléculas de anticuerpo que sintetiza el clon son idénticas entre sí.
antígeno
antigen
Molécula que provoca una respuesta inmune.
antiporte
ATP sintasa
ATPsynthase Complejo enzimàtico situado en la membrana interna de la mitocondria y en la membrana tilacoidal del cloro plasto, que cataliza la formación de ATP a partir de ADP y fosfato inorgánico durante, respectivamente, la fosfo rilación oxidativa y la fotosíntesis. También se halla pre sente en la membrana plasmática de las bacterias. ATPasa
ATPase
Una de la extensa clase de enzimas que cataliza un pro ceso que implica la hidrólisis de ATP.
ATPasa Na+-K+
Na+-K+ATPase
Véase bomba de sodio.
autoanticuerpo
autoantibody
Anticuerpo que reacciona con una molécula del animal que ha producido el anticuerpo. Puede causar enferme dades autoinmunes.
autocatálisis
antiport
autocatalysis
apical
autoradiography (radioautography)
Proteína de membrana que transporta dos iones o pe queñas moléculas diferentes a través de una membrana en direcciones opuestas, simultánea o secuencialmente.
apical
Describe el extremo de una célula, de una estructura o de un órgano. La superficie apical de una célula epitelial es la superficie libre opuesta a la superficie basal. La su perficie basal se halla sobre la lámina basal que separa el epitelio de otro tejido.
Aplysia (liebre marina)
Molusco marino ampliamente utilizado en el estudio de los mecanismos del aprendizaje.
apoptosis
apoptosis
Muerte celular programada.
aromático
aromatic
Se refiere a una molécula que contiene átomos de car bono dispuestos en un anillo y unidos entre sí mediante enlaces alternos sencillos y dobles. A menudo, molécula relacionada con el benceno.
áster
áster
Sistema de microtúbulos dispuestos radialmente, como una estrella, que emana de un centrosoma o del polo de un huso mitótico.
astrocito
astrocyte
Categoría de célula glial del sistema nervioso central que típicamente posee largas prolongaciones radiales. Pro porciona soporte estructural a las células nerviosas y ayu da a controlar su ambiente extracelular químico e iónico.
ATP (adenosina 5’ trifosfato)
ATP (adenosine 5’-triphosphate)
Nucleósido trifosfato compuesto de adenina, ribosa y tres grupos fosfato, que es el principal transportador de energía química en las células. El grupo fosfato terminal es altamente reactivo en el sentido de que su hidrólisis, o transferencia a otra molécula, se produce liberando una gran cantidad de energía libre. (Véase Figura 2-18.)
Glosario
Reacción catalizada por uno de los productos de la reac ción, generándose un efecto de retroalimentación posi tiva (autoamplificación) sobre la velocidad de reacción.
autorradiografía (radioautografía)
Técnica por la cual un objeto radiactivo produce una imagen de sí mismo sobre una película fotográfica. La imagen se denomina autorradiografía o autorradiograma.
autosoma
autosome
Cualquier cromosoma que no sea uno sexual.
auxina
auxin
Tipo de hormona vegetal. axón
axon
Larga prolongación de una célula nerviosa capaz de conducir con rapidez impulsos nerviosos a largas dis tancias, proporcionando señales a otras células.
axonema
axoneme
Conjunto de microtúbulos y de proteínas asociadas que forman el eje de un cilio o de un flagelo de una célula eucariota, y que es el responsable de sus movimientos.
axoplasma
axoplasm
Citoplasma del axón de una célula nerviosa, especial mente tras su cono de emergencia.
bacteria
bacterium (plural bacteria) Nombre común de cualquier miembro del heterogéneo grupo de organismos procariotas. La mayoría de ellas son unicelulares, pero también existen formas pluricelulares. bacteriófago (fago)
bacteriophage (phage) Cualquier virus que infecte bacterias. Fueron los prime ros organismos utilizados para el estudio de la genética molecular y actualmente son ampliamente utilizados como vectores clónicos. (Del griego phagein, comer.)
G-3
bacteriófago lambda (bacteriófago >0
lambda bacteriophage (k bacteriophage)
Virus que infecta E. coli; ampliamente utilizado como vector de clonaje de DNA.
bacteriorrodopsina
bacteriorhodopsin
Pigmento proteico que se encuentra en la membrana plasmática de una bacteria resistente a la sal, Halobacterium halobium ; bombea protones hacia el exterior de la célula en respuesta a la luz.
basal
basal Situado cerca de la base. La superficie o cara basal de una célula es la opuesta a la superficie o cara apical.
base
base
Molécula (que habitualmente contiene nitrógeno) que acepta un protón en solución. A menudo se utiliza refe rido a las purinas y las pirimidinas del DNA o del RNA.
Proteina transmembrana que dirige el transporte activo de iones y de pequeñas moléculas a través de la bicapa lipídica. bomba de sodio (ATPasa Na+-K+)
sodium pump (Na*-K* ATPase)
Proteína transportadora transmembrana que se halla en la membrana plasmática de la mayoría de las células animales que bombean Na+hacia el exterior de la célula y K+hacia el interior utilizando la energía derivada de la hidrólisis del ATP.
borde en cepillo
brush border
Densa cubierta de microvilli localizada en la superficie apical de las células epiteliales del intestino y del riñón; los microvilli ayudan a la absorción incrementando la superficie de la célula.
C terminal
básico
C terminus
basic
Que tiene las propiedades de una base. basófilo
basophil
(1) Células de la serie blanca de la sangre que liberan histamina en una respuesta inflamatoria. Estrechamen te relacionadas con los mastocitos. (2) Se dice de aque llas estructuras celulares que tienen afinidad por los co lorantes básicos. El núcleo celular es basófilo.
benceno
benzene
Compuesto formado por un anillo de seis átomos de carbono y que contie ne tres dobles enlaces. Forma parte de muchas moléculas biológicas.
bicapa lipídica
lipid bilayer
Fina capa bimolecular formada fundamentalmente por moléculas de fosfolípido, que constituyen la base es tructural de todas las membranas celulares. Las dos lá minas de moléculas lipídicas están empaquetadas con sus colas hidrofóbicas hacia el interior y sus cabezas hidrofílicas hacia el exterior, expuestas al agua. biosfera
biosphere El mundo de los organismos vivos.
biotina
biotin
Compuesto de bajo peso molecular, que actúa de coen zima. Técnicamente, es fácilmente utilizable como mar ca covalente de proteínas, permitiendo detectarlas me diante la proteína del huevo, avidina, la cual se une muy fuertemente a la biotina. (Véase Figura 2-32). blastómero
blastomere
Cada una de las células formada por la división de un huevo fecundado.
blástula
blastula
Estadio temprano de un embrión animal, que habitual mente está formado por una esfera hueca de células, an tes de que empiece la gastrulación.
G-4
bomba
pump
Glosario
Véase carboxilo terminal.
cadena ligera
light chain
Uno de los polipéptidos más pequeños de una proteína formada por varias subunidades, como la miosina o una inmunoglobulina. cadena (o hebra) retrasada
lagging strand
Una de las dos cadenas de DNA acabadas de sintetizar que se hallan en la horquilla de replicación. La hebra re trasada se sintetiza de forma discontinua y los fragmen tos se unen después entre sí de forma covalente. cadherina
cadherin
Miembro de una familia de proteínas que median la ad hesión célula-célula dependiente de Ca2+ en los tejidos animales. caja horneó tica
homeobox
Corta secuencia de DNA (180 pares de bases de longi tud), muy conservada, que codifica un motivo de unión a DNA famoso por estar presente en los genes que parti cipan en la orquestación del desarrollo de un amplio abanico de organismos.
caja TATA
TATA box
Secuencia consenso de la región promotora de muchos genes eucariotas que une un factor general de transcrip ción, especificando así la posición en la que se inicia la transcripción. calmodulina
calmodulin
Proteína ubicua, de unión al Ca2+, que se une a otras proteínas de forma dependiente de las concentraciones intracelulares de Ca2+. Su unión modifica la actividad de muchas enzimas diana y de proteínas de transporte a través de membranas.
caloría
calorie
Unidad de calor. Una caloría (“c” minúscula) es el calor necesario para incrementar 1°C la temperatura de un gramo de agua. Una kilocaloría es la unidad utilizada para describir el contenido energético de los alimentos.
CAM
Véase molécula de adhesión celular. cAMP Véase AMP cíclico. canal de membrana
membrane channel
Complejo proteico transmembrana que permite a los iones inorgánicos o a otras moléculas pequeñas difundir pasivamente a través de la bicapa lipídica.
canal iónico
ion channel
Complejo proteico transmembrana que forma un canal lleno de agua a través de la bicapa lipídica, a través del cual determinados iones inorgánicos pueden difundir a favor de su gradiente electroquímico. canal liberador de Ca2+
Ca2*-release channel
Canal iónico de la membrana del retículo endoplasmático y del retículo sarcoplasmático (en las fibras muscula res) que, cuando es activado, libera Ca2+al citosol. CAP (proteína activadora de genes por catabolito)
CAP (catabolite gene activator protein)
Proteína reguladora de genes en procariotas que, en ausencia de glucosa, activa genes responsables de la de gradación de fuentes alternativas de carbono.
cápside
capsid
Proteína de cubierta de un virus, formada por el autoensamblaje de una o más subunidades proteicas formando una estructura geométrica regular.
carbohidrato
carbohydrate Término general utilizado para denominar a los azúca res y compuestos relacionados que contienen carbono, hidrógeno y oxígeno, habitualmente con la fórmula em pírica (CH20)„. carboxilo terminal (C terminal)
carboxyl terminus (C terminus)
Final de una cadena polipeptídica que contiene un gru po carboxilo a libre. carcinógeno
carcinogen
Agente, como un producto químico o una forma de ra diación, que causa cáncer.
carcinoma
carcinoma
Cáncer de células epiteliales; la forma más común de cáncer en humanos.
cariotipo
karyotype
Juego completo de cromosomas de una célula ordena dos en función de su tamaño, forma y número.
cartílago
cartilage Modalidad de tejido conjuntivo compuesto por células (condrocitos) englobadas en una matriz rica en coláge na de tipo II y en condroitín sulfato. catabolismo
catabolism
Término general utilizado para reacciones celulares ca talizadas por enzimas mediante las cuales moléculas complejas son degradadas a moléculas más sencillas,
Glosario
con liberación de energía. Habitualmente, los interme diarios de estas reacciones se denominan catabolitos. catalizador
catalyst
Substancia que acelera una reacción química sin que ella sufra ningún cambio. Las enzimas son catalizadores proteicos. cDNA
Véase DNA complementario. célula blanca de la sangre (leucocito)
white blood cell (leucocyte)
Célula nucleada de la sangre, que no contiene hemoglo bina; incluye linfocitos, neutrófilos, eosinófilos, basófilos y monocitos.
célula cromafín
chromaffin cell
Célula que almacena adrenalina en vesículas de secre ción y la segrega en momentos de estrés, cuando es esti mulada por el sistema nervioso. célula de Schwann
Schwann cell
Célula glial responsable de la formación de la vaina de mielina en el sistema nervioso periférico. célula de Sertoli
Sertoli cell
Célula con función esquelética y nutricional que se halla en los túbulos seminíferos de los testículos, en contacto con las células de la línea germinal.
célula endocrina
endocrine cell
Célula animal especializada que segrega una hormona a la sangre; habitualmente forma parte de una glándula, como la tiroides o la hipófisis.
célula folicular
follicle cell
Uno de los tipos celulares que generalmente rodean un oocito.
célula germinal
germ cell
Célula precursora que produce los gametos. célula glial
glial cell
Célula de soporte del sistema nervioso, incluyendo los oligodendrocitos y los astrocitos del sistema nervioso central de los vertebrados, y las células de Schwann en el sistema nervioso periférico.
célula HeLa
HeLa cell
Línea de células epiteliales humanas que crece vigorosa mente en cultivo. Derivada de un carcinoma cervical humano.
célula madre
stem cell
Célula relativamente indiferenciada que puede conti nuar dividiéndose indefinidamente, produciendo célu las hijas que pueden sufrir una diferenciación terminal y dar lugar a tipos celulares determinados. célula nodriza
nurse cell
Célula que está asociada a un oocito en ocasiones me diante puentes citoplasmáticos, proporcionándole macromoléculas para su crecimiento. También se denomi na célula folicular.
G-5
célula pilosa
hair celi
Célula epitelial sensorial especializada del oído, con ha ces de microvilli gigantes (estereocilios) que sobresalen de su superficie apical. Las vibraciones sonoras hacen vibrar los estereocilios, evocando un cambio eléctrico en la célula pilosa, la cual actúa así como un detector de sonido. célula roja de la sangre
red blood celi
Véase eritrocito.
célula somática
somaticcell
Cualquier célula de una planta o de un animal, que no sea una célula germinal o un precursor de célula germi nal. (Del griego soma, cuerpo.)
sión celular eucariota. Las ciclinas activan proteína quinasas cruciales (denominadas proteína quinasas depen dientes de ciclina), colaborando así en el control de la progresión desde un estadio del ciclo celular al siguiente. ciclo celular
celi cycle
Ciclo reproductor de la célula: secuencia ordenada de acontecimientos mediante los cuales la célula duplica su contenido y se divide en dos.
ciclo del ácido cítrico (TCA, ciclo de los ácidos tricarboxílicos, ciclo de Krebs)
citric acid cycle (TCA, tricarboxilic acid cycle, Krebs cycle)
Ruta metabòlica central que se encuentra en todos los organismos aeróbicos. Oxida grupos acetilo derivados de moléculas alimenticias hasta C 0 2y HzO. En las célu las eucariotas se produce en las mitocondrias.
cytotoxic T celi
ciclo de Calvin (ciclo de Calvin-Benson)
celulosa
ciclo de Krebs
célula T citotóxica Tipo de linfocito T responsable de matar las células in fectadas.
cellulose Polisacárido estructural formado por largas cadenas de unidades de glucosa unidas entre sí mediante enlaces covalentes. Proporciona fuerza tensora a las paredes de las células vegetales. centriolo
centriole
Formación microtubular cilindrica y corta, ultraestructuralmente muy similar a la del corpúsculo basal. Habi tualmente las células animales tienen un par de centríolos en el área central del centrosoma.
centro organizador de microtúbulos (MTOC)
microtubule organizing center (MTOC)
Región de la célula, como un centrosoma o un corpús culo basal, a partir de la cual crecen los microtúbulos. centròmero
centromere
Región de un cromosoma mitótico que mantiene unidas entre sí las cromátidas hermanas; también, el lugar del DNA en el que el cinetocoro forma y captura microtúbu los del huso cromático. centrosoma (centro celular)
centrosome (celi center)
Área central de las células animales organizadora pri maria de los microtúbulos y que actúa como polo del huso mitótico durante la mitosis. En la mayoría de las células animales contiene un par de centríolos.
cetona
ketone
Molécula orgánica que contiene un grupo carboxilo uni do a dos grupos alquilo.
chaperona (chaperona molecular)
chaperone (molecular chaperone)
Proteína que ayuda a otras proteínas a superar plegamientos incorrectos que producen estados inactivos o de agregación.
Chlamydomonas
Alga verde unicelular con dos flagelos. ciclina
Vía metabòlica principal mediante la cual el C 0 2 es fija do durante la fotosíntesis.
Krebs cycle
Véase ciclo del ácido cítrico.
ciclo del nitrógeno
nitrogen cycle
Circulación natural del nitrógeno entre moléculas orgá nicas y organismos vivos, y moléculas inorgánicas y el suelo.
cilio
cilium (plural cilia) Extensión filiforme de una célula que contiene microtú bulos en su parte central y que es capaz de realizar mo vimientos repetidos de batido. Los cilios se encuentran en la superficie de muchas células eucariotas y son los responsables de los desplazamientos de muchos orga nismos unicelulares. cinetocoro
kinetochore
Compleja estructura formada por proteínas en un cro mosoma mitótico, a la que se unen los microtúbulos y que desempeña un papel activo en el desplazamiento de los cromosomas hacia el polo. El cinetocoro forma parte de la zona del cromosoma conocida como centrò mero.
cinturón de adhesión
adhesión belt (zonula adherens)
Adhesiones semejantes a un cinturón que circundan el extremo apical de una célula epitelial, uniéndolo al de la célula adyacente. A lo largo de la superficie citoplasmà tica del cinturón de adhesión corre un haz contráctil de filamentos de actina.
cisterna
cisterna (plural cistemae)
Compartimiento aplanado, delimitado por una mem brana que forma parte del complejo de Golgi.
citocinesis
cytokinesis
División en dos del citoplasma de una célula animal o vegetal, lo cual es diferente que la división de su núcleo (que es la mitosis).
citocromo
cyclin
cytochrome
Proteína que periódicamente aumenta y disminuye de concentración, de forma coordinada con el ciclo de divi
G-6
Calvin cycle (Calvin-Benson cycle)
Glosario
Proteína coloreada, con hemo, que transfiere electrones durante la respiración celular y la fotosíntesis.
citoesqu eleto
cytoskeleton
Sistem a de filamentos proteicos del citoplasm a de las células eucariotas que proporciona a la célula form a y capacidad de realizar movim ientos dirigidos. Sus co m ponentes m ás abundante son los filamentos de actina, los m icrotúbulos y los filamentos intermedios. cito p lasm a
cytoplasm
Contenido de una célula que se halla delimitado por la m em brana plasm ática pero, en el caso de las células eu cariotas, exteriorm ente al núcleo. cito q u eratin a
cytokeratin
M iem bro de una familia de proteínas de filamentos in term edios características de células epiteliales. citoq u in a
cytokine
Proteína o péptido señal extracelular que actúan com o m ediadores locales en la com unicación célula-célula. citoqu in in a
cytoícinin
Miembro de una familia de pequeñas moléculas que re gulan el crecim iento y el desarrollo de las células vege tales. citosol
cytosol Contenido del principal com partim iento del citoplasm a, excluyendo los orgánulos rodeados de m em brana com o el retículo endoplasm ático y las mitocondrias. Se definió originalm ente de una forma operativa com o la fracción celular que queda después de eliminar las m em branas, los com ponentes del citoesqueleto y otros orgánulos, m ediante centrifugación a baja velocidad. clatrin a
clathrin Proteína que se ensam bla form ando una caja poliédrica en la cara citoplasm ática de una m em brana, formando una depresión revestida de clatrina, que gem a form an do una vesícula revestida de clatrina. clon
clone Población de células o de organism os form ada por divi siones (asexuales) repetidas a partir de una célula u or ganism o com ún. También se utiliza com o verbo: “clo nar un gen” significa producir m uchas copias de un gen m ediante ciclos repetidos de replicación. clorofila
chlorophyll Pigm ento vegetal que absorbe luz y que desem peña un papel central en la fotosíntesis. cloroplasto
chloroplast Orgánulo especializado de las algas verdes y de las plan tas, delimitado por una doble m em brana, que contiene clorofila y que lleva a cabo la fotosíntesis. Se trata de una form a especializada de un plasto. código genético
genetic code
Juego de reglas que especifican la correspondencia en tre tripletes de nucleótidos (codones) del DNA o del RNA y am inoácidos de las proteínas.
Glosario
cod ón
codon
Secuencia de tres nucleótidos de una m olécula de DNA o de RNA m ensajero, que representa la instrucción de incorporar un determ inado am inoácido en una cadena polipeptídica en crecim iento. co en zim a
coenzyme
Pequeña m olécula estrecham ente asociada con una en zim a y que participa en la reacción que cataliza dicha enzim a, a m enudo form ando un enlace covalente tran sitorio con el substrato. Com o ejem plos, la biotina, el NAD+y el coenzim a A. co en zim a A
coenzyme A
Pequeña m olécula utilizada en la transferencia enzim à tica de grupos acilo en la célula. ( acetil CoA y Figura 2-20.)
Véase también
co fa cto r
cofactor Ion inorgánico o coenzim a necesarios para la actividad de una enzima. colágen a
collagen
Proteina fibrosa rica en glicina y en prolina, que es el com p on ente m ayoritario de la matriz extracelular y del tejido conjuntivo. Existe en m uchas formas: el tipo I, el m ás com ún, se encuentra en la piel, los tendones y el hueso; el tipo II se encuentra en los cartílagos; el tipo IV se presenta en la lám ina basal. colesterol
cholesterol M olécula lipidica con una estructura esteroidal de cu a tro anillos característica, que es un com p on ente im por tante de la m em brana plasm ática de las células an im a les. Figura 10-8.)
{Véase
co lo ra n te fluorescente
fluorescent dye
M olécula que absorbe luz a una determ inada longitud de onda y responde em itiendo luz a otra longitud de onda; la luz emitida tiene una longitud de onda m ás lar ga (y por tanto, m enor energía) que la luz absorbida. co m b in ato rio
combinatorial Describe cualquier proceso que está gobernado por una com binación específica de factores (y no por un solo factor) de form a que diferentes com binaciones de ellos producen efectos distintos. com plejo
complex
Ensam blaje de moléculas que se m antienen unidas en tre sí m ediante enlaces no covalentes. La m ayoría de funciones celulares están desarrolladas por complejos proteicos. com plejo de Golgi
Golgi apparatus
Com partim iento de la célula eucariota, form ado por el conjunto de dictiosom as, en el que las proteínas y los lípidos sintetizados en el retículo endoplasm ático son modificados y alm acenados. com p lejo m ay o r de histocom patibilidad
major histocompatibility complex Véase MHC.
G-7
com p lejo n itro gen asa
constitutivo
nitrogenase com plex
constitutive
Complejo de enzim as en bacterias fijadoras de nitróge no, que cataliza la reducción del nitrógeno atm osférico N2 a am onio. com p lejo sin ap ton ém ico
co n ta cto focal (p laca de adhesión)
synaptonem al com plex Estructura que m antiene unidos los crom osom as aparea dos durante la profase I de la meiosis y facilita la recom bi nación genética. com p lem en to
com plem ent Sistem a de proteínas séricas activado por com plejos antígeno-anticuerpo o por m icroorganism os. Colabora en la elim inación de m icroorganism os patógenos cau san do directam ente su lisis o facilitando su fagocitosis. com p u esto en jaulado
caged com pound M olécula orgánica diseñada para cam biar a forma acti va cuando es irradiada con luz de una determ inada lon gitud de onda. Como ejemplo, el ATP enjaulado. co n cen tració n crítica
critical concentration C oncentración de una proteína no ensam blada, com o la actina o la tubulina, que está en equilibrio con la forma ensam blada de la proteína. Panel 16-1, págs. 882883).
(Véase
con exón
connexon Poro lleno de agua en la m em brana plasm ática, form a do por un anillo de seis subunidades proteicas. Parte de una unión com unicante (o de tipo gap): los conexones de dos células adyacentes se unen form ando un canal continuo entre am bas células.
Localización espacial de los átom os de una molécula -p o r ejem plo, la form a precisa de una proteína o de otra m acrom olécula, en tres dim ensiones.
cooperativity Fenóm eno m ediante el cual la unión de una m olécula de ligando a una m olécula diana favorece (cooperativi dad positiva) o dificulta (cooperatividad negativa) la unión de sucesivas moléculas del ligando. Se produce cooperatividad positiva en el ensam blaje de grandes com plejos, así com o en enzimas y receptores formados por m uchas subunidades alostéricas, en cuyo caso hace que la respuesta a los ligandos sea m ás abrupta. Figura 15-45.)
(Véase
có rte x celu lar
cell cortex Franja de citoplasm a adosada a la cara interna de la m em brana plasm ática. En las células animales es una capa rica en actina, responsable de los movim ientos de la superficie celular. cósm ido
cosmid Vector de clonaje utilizado para transportar grandes segm entos de DNA hacia o desde una célula; derivado del bacteriófago lambda.
Proceso de transporte a través de m em brana en el cual la transferencia de una m olécula depende de la transfe rencia sim ultánea o secuencial de otra molécula.
leucine zipper
growth cone Punta móvil m igrante de un axón o de una dendrita en crecim iento de una fibra nerviosa. co n stan te de asociació n (Ka)
association constant Medida de la asociación de un com plejo. Para el equili brio de la unión A + B ^ AB, la constante de asociación viene dada por la relación [AB] / [A] [B], y es tanto m ayor cuanto m ás fuerte es la unión entre A y B. co n stan te de disociación.)
(Véase tam
Motivo estructural encontrado en m uchas proteínas que se unen a DNA, en el que dos hélices de proteínas di ferentes se unen entre sí com o una hélice superenrollada dando lugar a un dímero proteico.
a
cre sta
crista (plural cristae) (1) Cada uno de los pliegues de la m em brana m itocondrial interna. (2) Estructura sensorial del interior del oído. c re sta neural
co n stan te de d isociación (K J
neural crest
dissociation constant Medida de la tendencia de un com plejo a disociarse. Para el equilibrio de unión A + B ^ AB, la constante de disociación viene dada por [A][B] / [AB], y es tanto m enor cuanto m ayor es la unión entre A y B. co n stan te de asociación.)
[Véase también
co n stan te de equilibrio (K)
equilibrium constant Relación entre las constantes hacia adelante y hacia atrás de una reacción; es igual a la con stan te de asocia ción. Figura 3-9.)
Glosario
cooperatividad
cre m a lle ra de leu cin a
con o de crecim ien to
G-8
Pequeña región de la superficie de un fibroblasto o de otra célula, que se halla anclada a la matriz extracelular. La unión se produce mediante proteínas transm em brana com o las integrinas, que están unidas, a través de otras proteínas, a los filamentos de actina del citoplasma.
co-transport (coupled transport)
conformation
{Véase
focal contact (adhesión plaque)
co tra n sp o rte (tran sp o rte acoplado)
con fo rm ació n
bién
Producido en cantidades constantes; contrario a regula do. La secreción constitutiva, por ejemplo, se produce de forma continua sin necesidad de ningún estímulo ex terno.
Grupo de células em brionarias derivadas de la raíz del túbulo neural que migran hacia diferentes localizacio nes y dan lugar a varios tipos de células adultas, com o células nerviosas en los ganglios periféricos, células cromafines, m elanocitos y células de Schwann. cristalografía de rayos X
x-ray crystallography Técnica para determ inar la distribución tridimensional de los átom os de una molécula en base al patrón de di fracción de los rayos X que atraviesan un cristal de la molécula.
cro m átid a
chromatide Una copia de un crom osom a form ada por replicación de DNA, aún unida a la otra copia por el centróm ero. cro m átid a h erm a n a
sister chromatide
Véase cro m átid a. cro m atin a
chromatin Complejo de DNA, histonas y proteínas no histonas que se halla en al núcleo de las células eucariotas. Material del que están formados los crom osom as. cro m ato g rafía
chromatography T écnica bioquím ica en la que unas substancias m ezcla das se separan en función de su carga, su tam año o al guna otra propiedad, al repartirse entre una fase móvil y una fase estacionaria. cro m o so m a
chromosome Estructura com puesta por una m olécula muy larga de DNA y por proteínas asociadas, que contiene parte (o toda) la inform ación hereditaria de un organism o. Espe cialm ente evidente en células animales y vegetales en mitosis o meiosis, cuando cada crom osom a se condensa en un filamento com p acto y fácil de visualizar. cro m o so m a h om ólogo
homologous chromosome Una de las dos copias de un determ inado crom osom a de una célula diploide, derivando cada copia de cada uno de los padres.
cro m o so m a sexual
sex chromosome
C rom osom a que puede estar presente o no, o presente en un núm ero variable de copias de acuerdo con el sexo del individuo; en los mam íferos, los crom osom as X e Y. cu erp o basal
basalbody
Form ación corta y cilindrica de m icrotúbulos y proteí nas asociadas encontrada en la base de un cilio o de un flagelo de una célula eucariota. Actúa com o lugar de nucleación para el crecim iento del axonem a. Estructural m ente m uy similar a un centríolo.
d ad or de electro n es
electrón donor
M olécula que fácilm ente libera un electrón, oxidándose. dalton
dalton Unidad de m asa m olecular. Es aproxim adam ente igual a la m asa de un átom o de hidrógeno (1,66 x 10~24 g). dedo de zinc
zincfinger
Motivo estructural encontrado en m uchas proteínas que se unen al DNA; com puestos por un asa de cadena polipeptídica unida a un átom o de zinc. degenerado
degenerate
No se trata de un juicio moral sino de un adjetivo que describe múltiples estados que realizan aproxim ada m ente la m ism a función. Por ejemplo, diferentes co m binaciones de tres bases nucleotídicas (codones) que codifican el mismo aminoácido.
Glosario
d end rita
dendrite
Expansión de una célula nerviosa, típicam ente ram ifica da y relativam ente corta, que recibe im pulsos p roced en tes de otras células nerviosas. d epresión revestida
coated pit
Invaginación de la m em brana plasm ática que en su su perficie citoplasm ática está asociada con una lám ina de proteína. Se libera form ando una vesícula revestida du rante el proceso de endocitosis. desarrollo
development Sucesión de cam bios que tienen lugar en un organism o, a partir de la fecundación, y que dan lugar a un indivi duo adulto. d esm o so m a
desmosome
Unión célula-célula especializada, habitualm ente for m ada entre dos células epiteliales, y que se caracteriza por presentar densas placas de proteína en las que se in sertan filamentos interm edios de las células que se h a llan contiguas. d esn atu ralización
denaturation
Cambio notable de conform ación de una proteína o de un ácido nucleico causado por calentam iento o por ex posición a agentes químicos y que generalm ente conlle va la pérdida de la función biológica. d etergen te
detergent
Tipo de m olécula anfipática pequeña que tiende a coalescer en el agua, con sus colas hidrofóbicas escondidas y sus cabezas hidrofóbicas expuestas; am pliam ente uti lizada para solubilizar proteínas de m em brana. d eterm in ación
determination
Com prom iso de una célula de un em brión en una etapa especializada particular del desarrollo; refleja un cam bio en el carácter interno de la célula. d eterm in an te antigén ico (epítopo)
antigenic determinant (epitope)
Región específica de una m olécula de antígeno que se une a un anticuerpo o a un recep tor de célula T. diacilglicerol
diacylglycerol Lípido com puesto por dos cadenas de ácido graso uni das a una m olécula de glicerol. Se produce, por ejemplo, por la rotura de fosfolípidos de inositol en respuesta a señales extracelulares y en este caso actú a com o m olé cula señal colaborando en la activación de la proteína quinasa C.
Dictyostelium discoideum
Moho unicelular am pliam ente utilizado para el estudio de la locom oción celular, de la quimiotaxis y de la dife renciación. diferenciación
differentiation Proceso por el cual una célula sufre un cam bio hacia un tipo celular claram ente especializado. difusión
diffusion Desplazam iento neto de las m oléculas hacia zonas de
G-9
m enor con centración , debido a movim ientos térm icos aleatorios.
DNA superenrollado
supercoiled DNA
Región del DNA en la que la doble hélice está enrollada sobre sí m ism a. Figura 9-55.)
(Véase
d ineína
dynein
M iem bro de una familia de grandes proteínas m otoras que presentan a lo largo de sus microtúbulos m ovim ien tos dependientes de ATP. En el axonem a ciliar, la dineí na form a los brazos laterales que h acen que los dobletes de m icrotúbulos adyacentes se deslicen uno sobre otro. diploide
diploid
Que contiene dos juegos de crom osom as hom ólogos y, por lo tanto, dos copias de cada gen o locus genético. disacárido
disaccharide Molécula de carbohidrato form ada por dos unidades de m onosacárido unidas entre sí por un enlace covalente.
d om in an te
dominant
Se refiere al m iem bro de un par de alelos que es expre sado en el fenotipo de un organism o, m ientras que el otro alelo no es expresado, a pesar de que am bos alelos se hallan presentes. También se refiere al fenotipo ex presado por un alelo dom inante. El opuesto a dom inan te es recesivo. dom inio
domain
Porción de una proteína que tiene una estructura tercia ria por sí m isma. En proteínas grandes cada dominio está conectado a los otros dominios m ediante cortas y flexibles regiones de polipéptido.
disco Z (línea Z) Z Región aplanada de un sarcóm ero m uscular a la que se unen los extrem os m ás de los filamentos de actina. En las m icrografías se observa com o una línea negra trans versal.
dom inio sem ejan te a u n a inm unoglobulina (Ig-like)
división celu lar
dorsal
disc (Z line)
celi división
Partición de una célula en dos células hijas. En las célu las eucariotas com prende la división del núcleo (mitosis) estrecham ente relacionada con la división del cito plasm a (citocinesis). DNA (ácido desoxirrib onu cleico)
DNA (desoxyribonucleic acid)
Polinucleótido form ado por la unión covalente entre unidades de desoxirribonucleótidos; actú a com o el transportador de la inform ación genética. DNA co m p lem en ta rio (cDNA)
complementary DNA (cDNA)
M olécula de DNA sintetizada com o una copia de un mRNA, y que por lo tanto carece de los intrones que se hallan presentes en el DNA genóm ico. Se utiliza para determ inar la secuencia de am inoácidos de una protei na m ediante la secu en ciación del DNA, o para sintetizar una proteína en grandes cantidades m ediante clonaje seguido de su expresión. DNA gen óm ico
genomicDNA
DNA que constituye el genom a de una célula o un orga nism o. A m enudo se utiliza en contraposición a cDNA (DNA preparado por transcripción inversa a partir de RNA m ensajeros). DNA reco m b in an te
recombinant DNA
Cualquier m olécula de DNA form ada por la unión de segm entos de DNA procedentes de diferentes fuentes. Los DNA recom binantes son am pliam ente utilizados en el clonaje de genes, en la m odificación genética de orga nism os y en biología m olecular en general. DNA satélite
satellite DNA Regiones de DNA de secuencia m uy repetitiva, de un crom osom a eucariota, habitualm ente identificables por su com posición de nucleótidos poco habitual. El DNA satélite no se transcribe y su función todavía no es co n o cida.
G -10
Glosario
immunoglobulin like (Ig-like) domain
Dominio proteico característico de unos 100 residuos de am inoácido que se encuentra en m oléculas de anticuer po y en m uchas otras proteínas, las cuales form an la superfamilia de las Ig.
dorsal Relativo a la parte posterior del animal; tam bién la su perficie superior de una hoja, un ala, etc.
Drosophila melanogaster
Especies de una pequeña m osca, habitualm ente d eno m inada m osca de la fruta o del vinagre, am pliam ente utilizada en estudios genéticos del desarrollo.
e cu ació n de N em st
Nemst equation
Expresión cuantitativa que relaciona las con cen tracio nes en el equilibrio de un ion a cad a lado de una m em brana perm eable con la diferencia de voltaje a través de dicha m em brana. Panel 11-2, pág. 562.)
{Véase
elem ento transponible
transposable element
Segmento de DNA que puede desplazarse desde una p o sición del genom a a otra. em briogénesis
embryogenesis Desarrollo de un em brión a partir de un huevo fecunda do, o zigoto. endocitosis
endocytosis Captación de m aterial al interior de una célula m ediante una invaginación de la m em brana plasm ática e internalización en forma de vesícula rodeada de m em brana. pinocitosis y fagocitosis.)
(Véanse también
en d osom a
endósame
Orgánulo de las células anim ales delimitado por una sola m em brana, que transporta m aterial que se acab a de incorporar por endocitosis. La m ayor parte del m ate rial es transferido a los lisosomas para su degradación. endotelio
endothelium Capa de células m uy aplanadas (células endoteliales) que limitan todos los vasos sanguíneos. Regula el inter
cam bio entre la sangre y los tejidos que rodean el vaso. N orm alm ente está rodeada por la lám ina basal. en ergía de activación
enlace, generando una distribución polarizada de la ca r ga eléctrica. en lace tio éster
activation energy
thioester bond
Energía extra que pueden presentar algunos átom os o m oléculas adem ás de su energía basal para poder sufrir una reacción quím ica particular. Figura 2-15.)
Enlace de alta energía form ado por una reacción de condensación entre un grupo ácido (acilo) y un grupo tiol (— SH); se presenta, por ejemplo, en el acetil CoA y en m uchos com plejos en zim a-substrato.
(Véase
en ergía de en lace
bond energy
Fuerza de la unión quím ica entre dos átom os, m edida por la energía en kilocalorías o kilojulios necesaria para rom perla.
en trecru zam ien to
Crossing over
Proceso m ediante el cual dos crom osom as hom ólogos se rom pen en puntos correspondientes y se vuelven a unir cam biados, produciendo dos crom osom as recom binantes. (Véase Figura 6-56.)
en erg ía libre (G)
free energy
Energía que puede extraerse de un sistem a para im pul sar reacciones. Tiene en cuenta cam bios tanto en en er gía com o en entropía. en lace covalen te
covalentbond
en tro p ía
entropy
Cantidad term odinám ica que mide el grado de desor den de un sistema; cuanto m ayor es el desorden m ayor es la entropía.
Unión quím ica estable entre dos átom os, producida al com partir estos átom os uno o m ás pares de electrones.
en v o ltu ra n u clear
en lace de a lta en erg ía
nuclear envelope
high-energy bond
Enlace covalente cuya hidrólisis en las condiciones exis tentes en la célula viva libera una cantidad de energía li bre extraordinariam ente elevada. Un grupo unido a una m olécula por un enlace de alta energía es fácilmente transferido de una a otra molécula. Como ejemplos se pueden citar los enlaces fosfodiéster del ATP y el enlace tioéster del acetil Coa. en lace disulfuro (— S— S— )
disulfide bond
Doble m em brana que delimita el núcleo celular. Está form ada por una m em brana interna y otra externa, con num erosas perforaciones o poros nucleares. en zim a
enzyme Proteína (o RNA) que cataliza una reacción quím ica d e term inada. en zim a de re stricció n (n u cleasa de restricció n )
Unión covalente form ada entre dos grupos sulfhidrilo de dos cisteínas. Sistema habitual de unir dos proteínas o diferentes zonas de la m ism a proteína en el espacio extracelular.
restriction enzyme (restriction nuclease)
M iembro de una gran familia de nucleasas que puede rom per una m olécula de DNA en cualquier lugar en el que se presente una determ inada co rta secuencia de nucleótidos. Se usa am pliam ente en tecnología del DNA recom binante.
en lace fosfodiéster
phosphodiester bond Enlace químico covalente formado cuando dos grupos hidroxilo se unen m ediante enlaces éster al mism o gru po fosfato, com o dos nucleótidos adyacentes en el DNA o el RNA. Figura 2-10.)
(Véase
en lace iónico
ionic bond
Unión entre dos átom os, uno de ellos con carga positiva y el otro con carga negativa. Un tipo de enlace no cova lente. en lace no covalen te
noncovalent bond
Enlace químico en el cual, a diferencia del enlace cova lente, no se com parten electores. Los enlaces no covalentes son relativam ente débiles, pero cuando se produ cen varios de ellos entre dos moléculas sum an sus fuerzas dando lugar a fuertes interacciones altam ente específicas. en lace peptídico
peptide bond
Enlace químico entre el grupo carboxilo de un am ino ácido y el grupo am ino de otro am inoácido -u n a forma especial de un enlace amida. Figura 2-7.)
(Véase
en lace p olar
polar bond
Enlace covalente en el que los electrones son atraídos m ás fuertem ente a uno de los dos átom os que form an el
Glosario
en zim a p ro teo lítica
proteolytic enzyme Véase p ro teasa. ep im erización
epimerization
R eacción que altera la distribución espacial alrededor de un átom o, com o en una m olécula de azúcar. epinefrina
epinephrine Véase ad ren alin a.
epitelio
epithelium Capa celular coherente form ada por uno o m ás estratos de células y que recubre una superficie exterior o limita una cavidad.
epítopo
epitope Véase d eterm in an te an tigénico.
ER
Véase retícu lo en dop lasm ático.
eritro cito (célula ro ja de la sangre)
erythrocyte (red blood cell)
Pequeña célula de la sangre de los vertebrados, que co n tiene hemoglobina y que transporta oxígeno y dióxido de carbono a y desde los tejidos. (Del griego rojo.)
eruthros,
G- l l
Escherichia coli (E. coli)
exocitosis
Bacteria sem ejante a una varilla, que norm alm ente se halla en el colon de los hum anos y de otros animales; es am pliam ente utilizada en la investigación biom édica. estad o de tran sició n
transition state
Estructura que se form a de m anera transitoria en el cu r so de una reacción quím ica y que es el intermediario que tiene la m ayor energía libre de todos los de la re a c ción; etapa limitante de la reacción. éster
ester
M olécula form ada por la reacción de condensación de un grupo alcohol y un grupo ácido. La m ayoría de gru pos fosfato son ásteres. ( Véase Panel 2-2, págs. 52-53.)
exocytosis Proceso por el cual son segregadas la mayoría de las m o léculas en una célula eucariota. Estas moléculas están em paquetadas en vesículas que se fusionan con la m em brana plasmática, liberando su contenido al exterior. exón
exon
Segmento de un gen eucariota formado por DNA que codifica secuencias de nucleótidos en el mRNA; un exón puede codificar am inoácidos en una proteína. Habitual m ente está adyacente a una secuencia de DNA no codi ficante, denom inada intrón. exp resión
expression Producción de un fenotipo observable por un gen - h a bitualm ente por la síntesis de una proteína.
estereocilio
stereocilium Microvilli grande y rígido encontrado en organizaciones en “tubos de órgano pipa” de la superficie apical de las células pilosas del oído. Un estereocilio no contiene m i crotúbulos sino un haz de filamentos de actina, por lo que propiam ente no es un cilio. esteroid e
extrem o m ás
plus end
Extrem o de un m icrotúbulo o de un filamento de actina en el que la adición de m onóm eros se produce m ás rá pidam ente; el extrem o en “crecim iento rápido” de un microtúbulo o de un filamento de actina. El extrem o m ás de un filamento de actina. Panel 16-1, págs. 882-883.)
(Véase
steroid
M olécula hidrofóbica relacionada con el colesterol. M u chas horm onas im portantes, com o los estrógenos y la testosterona, son esteroides. estro m a
stroma
(1) Tejido conjuntivo en el que se halla em bebida una glándula u otro epitelio. (2) El gran espacio interior de un cloroplasto, que contiene enzim as que catalizan la incorporación de C 0 2 a azúcares.
extrem o m enos
minus end
Extrem o de un m icrotúbulo o de un filamento de actina en el que la adición de m onóm eros se produce m ás len tam ente; el extrem o de “crecim iento len to” del m icrotú bulo o del filamento de actina. El extrem o m enos de un filamento de actina tam bién se con oce com o el extrem o en punta. Panel 16-1, págs. 824-825.)
(Véase
e stru ctu ra cu a te rn a ria
quatemary structure
Relación tridimensional entre las diferentes cadenas polipeptídicas de un com plejo proteico. e stru ctu ra p rim aria
primary structure
Secuencia de unidades de un polím ero lineal, com o la secuencia de am inoácidos de una proteína. e stru ctu ra secu n d aria
secondary structure
?
Patrón de plegam iento local y regular d una m olécula polim èrica; en proteínas, las hélices a y las lám inas X. e stru ctu ra terciaria
tertiary structure
Form a tridim ensional com pleja de una m acrom olécula, especialm ente de una proteína. etil (— CH2— CH3)
ethyl
Grupo quím ico hidrofóbico derivado a partir del etano
(CH3CH3). eu ca rio ta
eucaryote (eukaryote) Organismo vivo com puesto de una o m ás células cuyo núcleo está diferenciado en el citoplasm a. Incluye todas las formas de vida excepto los virus y las bacterias (pro cariotas). eu cro m atin a
euchromatin Región de un crom osom a en interfase que se tiñe difu sam ente; la crom atin a “n orm al” es lo opuesto a la heterocrom atin a m ás condensada.
G -12
Glosario
facto r de crecim ien to
growth factor
Molécula polipeptídica extracelular señal que estimula una célula a crecer o a proliferar. Como ejemplos pueden citarse el factor de crecim iento epidérmico (EGF, de Epi dem ial Growth Factor) y el factor de crecim iento deriva do de las plaquetas (PDGF, de Platelet-Derived Growth Factor). La mayoría de factores de crecim iento ejercen otras acciones adem ás de inducir el crecim iento o la di ferenciación celulares. facto r de elongación
elongation factor
Proteína necesaria para la adición de am inoácidos a c a denas polipeptídicas en crecim iento en los ribosom as. facto r de iniciación
initiation factor
Proteína que estimula la asociación adecuada de riboso m as y mRNA necesaria para que se inicie la síntesis de proteínas. fa cto r de tran scrip ció n
transcriptionfactor
Término aplicado de forma laxa a cualquier proteína n e cesaria para iniciar o regular la transcripción en eucariotas. Incluye tanto proteínas reguladoras de genes com o factores generales de transcripción. Figura 9-34.)
(Véase
fa cto r de tran scrip ció n general
general transcripción factor
Cualquiera de las proteínas cuyo ensamblaje alrededor de la caja TATA es necesario para la iniciación de la transcripción de la m ayoría de los genes de eucariotas.
facto r p ro m o to r de la fase M
cares átom os de carbono a partir del dióxido de carbono atm osférico. Segunda etapa de la fotosíntesis.
M-phase-promotingfactor Véase M PF.
fijación del n itrógeno
nitrogen flxation
fago
phage Véase bacteriófago.
Procesos bioquímicos desarrollados por determ inadas bacterias que reducen el nitrógeno atm osférico (N2) a am onio y, por lo tanto, a varios m etabolitos que con tie nen nitrógeno.
fagocito
phagocyte Término general que se aplica a una célula fagocítica -e s decir, una célula com o un m acròfago o un neutrófilo que está especializada en cap tar partículas y m icroorga nismos m ediante fagocitosis. fagocitosis
phagocytosis Proceso por el cual un m aterial particulado es endocitado (“com ido”) por una célula. Es destacable en células carnívoras, com o y en m acrófagos y neutrófílos de vertebrados. (Del griego com er.)
Amoeba proteus,
phagein,
fase G0
G0phase “Fase G -cero”, (de Gap “zero” phase). Fase de descanso del ciclo de división celular eucariota, que se produce debido a un estado de quiescencia en la fase G,; a m en u do se observa en células diferenciadas.
fase G,
G, phase Fase 1 (de Gap 1 phase) del ciclo de división celular, que va desde el final de la citocinesis hasta el inicio de la sín tesis de DNA.
fase G2
G2phase Fase 2 (de Gap 2 phase) del ciclo de división celular, entre el final de la síntesis del DNA y el principio de la mitosis.
faseM
M phase Período del ciclo de la célula eucariota durante el cual se dividen el núcleo y el citoplasm a. faseS
S phase Período del ciclo celular de una célula eucariota en el que se sintetiza DNA. fecu n dación
fertilization
Fusión de un gam eto m acho con un gam eto hem bra (am bos haploides) form ando un zigoto diploide que se desarrollará form ando un nuevo individuo. fenotipo
phenotipe C arácter observable de una célula o de un organism o.
fijador
fixative Reactivo químico com o el formaldehído o el tetróxido de osmio, utilizado para preservar las células para su es tudio m icroscópico. Se dice que las m uestras tratadas con estos reactivos están “fijadas”, y el proceso se d eno mina “fijación”. filam ento de a ctin a (m icrofilam ento)
actin filament (microfilament)
Filam ento proteico helicoidal form ado por la polim eri zación de moléculas globulares de actina. Principal constituyente del citoesqueleto de todas las células eucariotas y parte del aparato contráctil del m úsculo es quelético. filam ento in term ed io
intermediate filament Filam ento proteico (de unos 10 nm de diám etro) que form a redes en las células animales. Uno de los tres ti pos m ás im portantes de filamentos del citoesqueleto.
filogenia
phytogeny Historia evolutiva de un organism o o de un grupo de o r ganismos, a m enudo presentada com o un árbol filogénico. flagelo
flagellum (plural flagella) Evaginació alargada, sem ejante a un látigo, cuyas ondu laciones empujan la célula por un medio fluido. Los fla gelos de células eucariotas son versiones largas de los cilios; los flagelos bacterianos son com pletam ente dife rentes, m ás pequeños y de constitución m ás sencilla. fluoresceín a
fluorescein
Colorante fluorescente (fluorocromo) que em ite luz fluorescente de color verde cuando es iluminado con luz azul o ultravioleta. fosfatasa
phosphatase Véase fosfoproteín a fosfatasa. fosfatidilinositol
phosphatidylinositol Un fosfolípido de inositol.
fibra n erviosa
nerve celi Véase n eu ro n a.
fosfoinosítido
fibroblasto
phospholipid
flbroblast
Tipo celular com ún que se presenta en el tejido conjun tivo. Secreta una matriz extracelular rica en colágena y en otras m acrom oléculas de m atriz extracelular. Migra y prolifera fácilm ente en tejidos dañados y en cultivos de tejido. fijación del carb on o
carbón flxation
Proceso por el cual las plantas verdes incorporan a azú
Glosario
(Véase Figura 15-29.)
phosphoinositide Véase fosfolípidos de inositol. fosfolípido
C ategoría principal de moléculas lipídicas utilizadas para construir m em branas biológicas. Generalm ente es tán com puestos por dos ácidos grasos unidos a través de un glicerol fosfato a uno o varios grupos polares. fosfolípidos de inositol (fosfoinositoles)
inositol phospholipids (phosphoinositides) C om puesto de una familia de lípidos form ada por deri vados fosforilados del inositol. A pesar de que son co m
G-13
ponentes m inoritarios de la m em brana plasm ática, son im portantes en la transducción de señales en las células eucariotas. Figura 15-29.)
{Véase
gástru la
gastrula Estadio m uy tem prano del desarrollo em brionario de un animal en el que las células se han invaginado form ando el rudim ento de la cavidad del estóm ago. (Del griego vientre, estóm ago.)
fosfoproteín a fosfatasa
phosphoprotein phosphatase Enzim a que elimina un grupo fosfato de una proteína, m ediante hidrólisis. fosforilación
phosphorylation
gaster,
gen con stitutivo o dom éstico
housekeeping gene
Gen que determ ina una función necesaria en todos los tipos celulares de un organism o, independientem ente de lo especializada que sea esta función.
R eacción m ediante la cual un grupo fosfato queda uni do covalentem ente a otra molécula. fosforilación oxid ativa
oxidative phosphorylation Proceso producido en bacterias y m itocondrias m edian te el cual la form ación de ATP está im pulsada por la transferencia de electrones desde moléculas alim enti cias hasta el oxígeno m olecular. Supone la generación interm edia de un gradiente de pH a través de la m em b rana y el acom plam iento quim iosm ótico.
gen cd c
Gen que controla una etapa o conjunto de etapas espe cíficas del ciclo celular. Originalmente se identificaron en levaduras. gen
gene Región del DNA que controla una característica heredi taria discreta, habitualm ente correspondiente a una sola proteina o un solo RNA. Esta definición ab arca la unidad funcional com pleta, incluyendo las secuencias codificantes de DNA, las secuencias de DNA regulado ras, no codificantes, y los intrones.
fotón
photon Partícula elem ental de luz y de otras radiaciones electro m agnéticas. fotosíntesis
photosynthesis Proceso por el cual los vegetales y algunas bacterias uti lizan la energía solar p ara im pulsar la síntesis de m olé culas orgánicas a partir de dióxido de carb on o y agua.
gen estru ctu ral
structural gene
Región de DNA que codifica una proteína o una m olé cula de RNA que form a parte de una estructura o que tiene una función enzim àtica; opuesto a las regiones del DNA que regulan la expresión de genes.
frag m en tos de Okazaki
Okazakifragmente
Cortas secuencias de DNA producidas sobre la hebra re trasada durante la replicación del DNA, descubiertas por Okazaki. Son rápidam ente unidas por una DNA ligasa form ando una hebra continua de DNA. fusión celu lar
cellfusión
Proceso m ediante el cual las m em branas plasm áticas de dos células se rom pen en el punto de co n tacto entre ellas, perm itiendo que los dos citoplasm as se m ezclen.
GAG (glucosam in oglu cano)
GAG (glycosaminoglycan)
Polisacárido largo, lineal y m uy cargado eléctricam ente, com puesto de pares de azúcares repetidos, uno de los cuales siem pre es un am ino azúcar. Se en cuen tra princi palm ente unido de form a covalente a un núcleo protei co en proteoglucanos de la m atriz extracelular. Como ejem plos, el condroitín sulfato, el ácido hialurónico y la heparina. gam eto
gamete
src gene Nom bre del prim er oncogén retrovírico descubierto {vsrc) y de su proto-oncogén precursor {c-src). El producto
gen src
de estos genes es una proteína quinasa asociada a m em brana que fosforila m uchas proteínas diana sobre resi duos de tirosina. (De el tipo de cán cer que cau sa el virus ; se pronuncia “sarc”.)
src
sarcoma,
gen om a
genome
La totalidad de la inform ación genética de una célula o de un organism o; el DNA que transporta esta inform a ción. genotipo
genotype Constitución genética de una célula individual o un o r ganismo. gigaPrefijo que denota IO9. (Del griego
gigas, gigante.)
glicerol
Célula haploide especializada, tanto un esperm atozoide com o un oocito, cuya función es la reproducción sexual. ganglio
ganglion (plural ganglia) Agrupación de células nerviosas asociadas con células gliales, localizadas fuera del sistem a nervioso central. gangliósido
ganglioside
Cualquier glucolípido que tenga uno o m ás residuos de ácido siálico en su estructura. Se encuentra en la m em brana plasm ática de las células eucariotas, especialm en te abundante en las fibras nerviosas.
G -14
cdc (gen de ciclo de división celular) gene (cell-division-cycle gene)
Glosario
glycerol Pequeña m olécula orgánica p a riente de m uchas otras moléculas pequeñas de la célula, com o los fosfolípidos.
CI l ,O H CHOH C H 2O H
glucocáliz (cu b ierta celular)
glycocalyx (celi coat)
Capa rica en carbohidratos que forma la cubierta exterior de cualquier célula eucariota. Com puesta de oligosacáridos unidos a glucolípidos y glucoproteínas intrínsecos de la m em brana plasmática, así com o a glucoproteínas y proteoglucanos secretados y reabsorbidos en la superficie celular.
grupo acilo
glucógeno
acyl group
glycogen
Polisacárido com puesto exclusivam ente por unidades de glucosa, utilizado para alm acenar energía en las célu las animales. Form a grandes granos, especialm ente en las células del hígado y tam bién del músculo.
grupo alquilo
alkyl group
glucolípido
glycolipid
M olécula lipídica de m em brana form ada por una corta cad ena de carbohidrato unida a una cola hidrofóbica. glucolisis
glycolysis Vía m etabólica ubicua que se produce en el citosol, m e diante la cual los azúcares son degradados de form a in com pleta y se produce ATP. (Literalmente, “rotura de los azú cares”.) g lu cop roteín a
glycoprotein
Cualquier proteína con una o m ás cadenas de oligosacárido, unidas a ella covalentem ente. Incluye la m ayoría de las proteínas secretadas y la m ayoría de proteínas ex puestas en la superficie exterior de la m em brana plas m ática. glu cosa
glucose
Térm ino general para un grupo de átom os de carbono e hidrógeno, unidos covalentem ente entre sí, com o el grupo metilo (— CH3) o el grupo etilo (— CH2— CH3); es tos grupos pueden form arse por la elim inación de un átom o de hidrógeno de un alcano. grupo am ino
aminógroup
Grupo funcional ligeramente básico derivado del am o níaco (NH3) en el que uno o m ás átom os de hidrógeno se hallan reem plazados por otro átom o. En solución acu osa puede acep tar un protón, presentando entonces una carga positiva. grupo carb on ilo
carbonyl group
Par de átom os que consisten en un átom o de carbono unido a un átom o de oxígeno m ediante un doble enlace ( C = 0 ). grupo carb oxilo
Azúcar de seis carbonos que juega un papel principal en el m etabolism o de las células vivas. Se alm acena com o polím ero en form a de glucógeno en las células an im a les, y de alm idón en las células vegetales. Panel 2-3, págs. 54-55.)
(Véase
glu cosam inoglucan o
glycosaminoglycan Véase GAG. g lu tar aldehido
glutaraldehyde Pequeña m olécula reactiva con dos grupos aldehido, que a m enudo se utiliza com o fijador de entrecruzamiento. grad ien te electroq uím ico
electrochemical gradient
Fuerza im pulsora que hace que un ion se desplace a tra vés de una m em brana debido a la com binación de in fluencias de una diferencia de su concentración y de su carga eléctrica a cad a lado de la m em brana. g ran a
grana (singular granum) Discos m em branosos apilados (tilacoides) de los cloroplastos que contienen clorofila; en ellos se producen las reacciones de la fotosíntesis que atrapan energía lum i nosa. gran u locito
granulocyte Categoría de células sanguíneas de la serie blanca que se caracterizan por presentar gránulos citoplasm áticos aparentes. Se clasifican en neutrófilos, basófilos y eosinófilos. gru p o (grupo funcional)
group (functional group) Conjunto de átom os unidos covalentem ente entre sí, com o un grupo hidroxilo (— OH) o un grupo amino (— NH2), cuyo com portam iento químico está bien c a racterizado.
Glosario
o
Grupo funcional derivado de un ácido carboxílico. (R representa un grupo al quilo, com o por ejemplo un metilo.)
carboxyl group
Átomo de carbono unido a un átom o de oxígeno m ediante un doble enlace, y a un grupo hidroxilo. Las m oléculas que contienen un grupo carboxilo son ácidos (carboxílicos) débiles.
—c
GTP (guanosina 5 ’ trifosfato)
GTP (guanosine 5’-triphosphate) Principal nucleósido trifosfato utilizado en la síntesis de RNA y en algunas reacciones de transferencia de en er gía. Juega un papel especial en el ensam blaje de los microtúbulos, en la síntesis de proteínas y en la señaliza ción celular.
haploide
haploid
Que tiene un solo juego de crom osom as, com o una c é lula esperm ática. Se distingue de diploide (que tiene dos juegos de crom osom as). h e b ra o ca d e n a co n d u cto ra
leadingstrand
Una de las dos cadenas de DNA recién sintetizadas que se hallan en la horquilla de replicación. La hebra conductora se sintetiza de forma continua en dirección 5 ’ a 3 ’. hélice alfa (hélice a)
alpha helix (a helix) Motivo estructural com ún de proteínas en el que una secuencia lineal de am inoácidos se pliega form ando una hélice dextrógira estabilizada por enlaces de hidrógeno entre átom os del esqueleto de la propia cadena. h élice a a
helix Véase hélice alfa.
h em id esm osom a
hemidesmosome
Unión celular especializada entre una célula epitelial y la m em brana basal subyacente.
G -15
h em o
hidrólisis (hidrolítico)
heme
hydrolysis (hydrolytic)
M olécula orgánica cíclica que contiene un átom o de hierro, que en el caso de la hem oglobina transporta oxí geno y en el de los citocrom os transporta electrones. h em oglob in a
hidroxilo (— OH)
hemoglobine
hydroxyl
Proteína m ayoritaria de los eritrocitos que en los pulm o nes se asocia a 0 2 m ediante un grupo hem o que lleva unido. h em opoyesis (hem atopoyesis)
hemopoiesis (hematopoiesis)
Generación de las células de la sangre, principalm ente en la m édula ósea roja. h etero cario n te
heterocaryon
Grupo químico formado por un átom o de hidrógeno unido a uno de oxígeno, com o en un alcohol. hip ertón ico
hypertonic
Describe cualquier medio cuya con centración de solu tos es suficientem ente elevada para h acer que salga agua de una célula debido a osmosis. (Del griego superior.)
huper,
hip otón ico
Célula con dos o m ás núcleos producida por la fusión de dos o m ás células diferentes.
hypotonic
Cualquier medio cuya concentración de solutos es sufi cientem ente baja para hacer que entre agua en una c é lula debido a osmosis. (Del griego inferior.)
hupo,
h e te ro cro m a tin a
heterochromatin
Región de un crom osom a que durante la interfase p er m an ece extraordinariam ente condensada e inactiva transcripcionalm ente. h eterod ím ero
heterodimer
Complejo proteico form ado por dos cadenas polipeptídicas diferentes.
h istam in a
histamine
Pequeña m olécula derivada del am inoácido histidina, li berada por los m astocitos y por los granulocitos basófilos en las reacciones alérgicas. Causa irritación, dilata ción de los vasos sanguíneos y con tracción del m úsculo liso. h isto n a
histone
h eterozigoto
heterozygote
Célula diploide o individuo que tiene dos alelos diferen tes de un determ inado gen. h ib rid ación
hybridization
M olécula de un grupo de abundantes pequeñas proteí nas, rica en arginina y lisina y asociada con el DNA en los crom osom as eucariotas. h om eod om in io
Proceso m ediante el cual dos cadenas com plem entarias de ácido nucleico form an una doble hélice durante un período de unión; poderosa técn ica para d etectar se cuencias de nucleótidos determ inadas.
in situ hybridization in situ
h ib rid ación
T écnica m ediante la cual se utiliza una sonda de DNA o RNA de una sola cad ena para localizar un gen o una m o lécula de mRNA en una célula o un tejido. hibridación.)
(Véase tam
bién
Rotura de un enlace covalente en la que se adiciona agua, de form a que a uno efe los productos de la rotura se añade un — H y al otro un — OH.
h ib rid om a
hybridoma Línea celular utilizada en la producción de anticuerpos m onoclonales; obtenida por fusión de linfocitos B pro ductores de anticuerpos con células de una línea tumoral.
h id ro carb u ro
hydrocarbon
C om puesto que está formado únicam ente por carbono e hidrógeno. hidrofílico
hydrophilic M olécula polar o parte polar de una m olécula que forma suficientes enlaces de interacción con el agua para di solverse en ella. (Literalm ente “que le gusta el agua”)
homeodomain
Motivo de unión a DNA, de 60 am inoácidos, codificado por un hom eobox. h om ología
homology
Similitud estructural de un órgano o m olécula que refle ja un origen evolutivo com ún. Específicam ente, simili tud en secuencias de proteínas o ácidos nucleicos. C on trasta con la analogía -sim ilitud que no refleja un origen evolutivo com ún. h om ozigoto
homozygote Célula u organism o diploides que tienen dos alelos idénticos de un determ inado gen.
horquilla de rep licación
replicationfork
Región en form a de Y de una m olécula de DNA en repli cación, en la que se están form ando y separando entre sí dos hebras hijas. h uso m itótico
mitotic spindle Disposición de m icrotúbulos y moléculas asociadas que se forma entre los polos opuestos de una célula eu cario ta durante la mitosis y actú a desplazando los crom oso m as duplicados, separándolos entre sí.
h idrofóbico (lipofílico)
hydrophobic (lipophilic) M olécula no polar o parte no polar de una m olécula que no form a interacciones favorables con el agua, por lo que no se disuelve en ella. (Literalmente “que detesta el agu a”.)
G -16
Glosario
in vitro Término utilizado en bioquím ica para escribir un p roce so que tiene lugar en un extracto aislado libre de células. También utilizado en biología celular para referirse a c é
{in vitro), com o opuesto a ce{in vivo).
lulas que crecen en cultivo lulas que crecen en un organism o
in vivo
En una célula o en un organism o intactos índice m itótico
mitotic index
Porcentaje de células de una población que en un m o m ento dado están en mitosis. ind ucción (em briònica)
induction (embryonic)
Cambio en las características de desarrollo de un tejido debido a interacciones con otros tejidos. in form ación posicional
positional information
Inform ación aportada o que presentan las células de acuerdo con su posición en un organism o pluricelular. El registro interno de la célula de su inform ación posi cional se denom ina su valor posicional. Inicio
Start
Im portante punto de control del ciclo celular eucariota. Atravesar el punto de inicio conduce a la célula a entrar en la fase S. in m o rtal ización
immortalization Producción de una línea celular capaz de dividirse un núm ero ilimitado de veces. Puede ser el resultado de transform aciones químicas o víricas o de fusión con c é lulas de una línea tumoral.
in m unidad m ed iad a p o r células
cell-mediated immunity
Respuestas inm unes m ediadas por linfocitos T. in m unoglobulina (Ig)
immunoglobulin (Ig)
M olécula de anticuerpo. Los vertebrados superiores tie nen cinco clases de inmunoglobulinas -IgA, IgD, IgE, IgG e IgM - cad a una de las cuales tiene funciones dife rentes en la respuesta inmune. inositol
inositol M olécula cíclica con seis grupos hidroxilo, que form a el grupo hidrofóbico de cabeza de los fosfolípidos de inosi tol.
in satu rad o
unsaturated Describe una m olécula que contiene uno o m ás dobles o triples enlaces carbono-carbono, com o el isopreno o el benceno.
insulina
insulin
H orm ona polipeptídica segregada por las células a del páncreas que, entre otras cosas, colabora en la regula ción del m etabolism o de la glucosa en los animales. in tegrin a
integrin
M iembro de una gran familia de proteínas transm em brana que participan en la adhesión de las células a la m atriz extracelular. in terfase
interphase Largo período del ciclo celular com prendido entre una mitosis y la siguiente. Incluye las fases G1( S y G2.
Glosario
in terleu cin a
interleukin
Péptido o proteína segregada que principalm ente media interacciones locales entre células sanguíneas de la serie blanca (leucocitos). in trón
intron Región no codificante de un gen eucariota que se trans cribe a m olécula de RNA pero que después es eliminada por la m aduración del RNA, al producirse la m olécula de mRNA.
ionóforo
ionophore Pequeña molécula hidrofóbica que se disuelve en la bicapa lipídica e increm enta su permeabilidad a determ i nados iones inorgánicos.
IP 3 (inositol trisfosfato)
IP3 (inositol trisphosphate) Pequeña molécula hidrosoluble producida por la rotura del fosfolípido de inositol PIP2 en respuesta a señales extracelulares; provoca la liberación de Ca2+ desde el retí culo endoplasm ático. (Véase Figura 15-30.) isoform as
isoforms
Múltiples formas de la m ism a proteína que difieren en alguna parte de su secuencia de am inoácidos. Pueden estar producidas por genes diferentes o por m aduración alternativa de transcritos de RNA que provengan de un mismo gen. isóm eros
isomers
M oléculas form adas por los m ism os átom os y con las m ism as uniones químicas pero que tienen diferentes conform aciones tridimensionales. isopreno
isoprene
Pequeño com puesto hidrocarbonado de cinco átom os de carbono. Da lugar a los isoprenoides.
(■H, n/: = c — (;h =
ch
,
isoprenoide (poliisoprenoide)
isoprenoid (polyisoprenoid)
Miembro de una gran familia de m oléculas lipídicas cuyo esqueleto carbonado está basado en varias unida des de isopreno. Com o ejemplos, el ácido retinoico y el colesterol. isótopo
isotope
Una de entre varias formas de un átom o, con las m ism as propiedades químicas pero diferente peso atóm ico. Pueden ser estables o radiactivos. isótopo radiactivo
radioactive isotope Form a de un átom o cuyo núcleo es inestable y que em i te radiación cuando se transform a en un átom o m ás es table.
joule
joule Unidad estándar de energía del sistem a m étrico d eci mal. Un joule es la energía liberada en un segundo por una fuente de energía de un vatio de potencia. Aproxi m adam ente igual a 0,24 calorías.
G -17
kilo-
mica) o copias en DNA de las moléculas de mRNA pro ducidas por una célula (librería o biblioteca de cDNA).
kiloPrefijo que indica 103. k ilocaloría (kcal)
kilocalorie (kcal) Unidad de energía calorífica igual a 1000 calorías. A m e nudo se utiliza para expresar el contenido energético de las m oléculas alim enticias: la fuerza de los enlaces, por ejem plo, se m iden en kcal/m ol. Una unidad alternativa es el kilojoule, que es igual a 0,24 kcal.
kilojoule
kilojoule Unidad estándar de energía igual a 1000 joules o a 0,24 calorías.
lám in a basal
basal lamina (plural basal laminae) Fina capa de m atriz extracelular que separa las láminas epiteliales y m uchos tipos de células, com o las fibras m usculares o las células adiposas, del tejido conjuntivo. A veces se denom ina, incorrectam ente, m em brana basal.
lám in a de m ielin a
myelin sheath
Cubierta aislante de los axones de determ inadas neuro nas de los vertebrados form ada por un crecim iento des orbitado de la m em brana celular de una célula aco m p a ñante. Producida por oligodendrocitos en el sistem a nervioso central y por las células de Schwann en el siste m a nervioso periférico. lám in a n u clear
nuclear lamina Lám ina fibrosa que se halla sobre la superficie interna de la m em brana nuclear interna, form ada por una red de filamentos interm edios de lám inas nucleares. lám in as
lamins
Proteínas de filamento interm edio que form an la m atriz fibrosa (lámina nuclear) de la superficie interna de la envoltura nuclear. lam in in a
laminin
Proteína de la matriz extracelular que se halla en la lá m ina basal. lectin a
lectin
Proteína que se une fuertem ente a un azúcar específico. M uchas lectinas derivan de semillas vegetales y a m en u do se utilizan com o reactivos de afinidad para purificar glucoproteínas o para detectarlas sobre la superficie de las células. leu co cito
leucocyte Véase célu la b lan ca de la san gre.
levad u ra
yeast
Térm ino com ún utilizado para denom inar diversas fa milias de hongos unicelulares. Incluye especies utiliza das para ferm entar la cerveza y para h acer pan, así com o especies patógenas (que causan enferm edades). librería (o biblioteca) de DNA
DNA library
Colección de m oléculas de DNA clonadas, que repre sentan un genom a com pleto (librería o biblioteca genó-
G -18
Glosario
ligando
ligand
Cualquier m olécula que se une a un lugar específico de una proteína o de otra m olécula. (Del latín ligar, unir.)
ligare,
ligasa
ligase Enzim a que une (liga) entre sí dos moléculas a través de un proceso dependiente de energía. Por ejemplo, la DNA ligasa une entre sí dos moléculas de DNA a través de un enlace fosfodiéster.
línea celu lar
cell line
Población de células de origen animal o vegetal cap aces de dividirse indefinidamente en cultivo. línea germ in al
germ line
Linaje de células germinales (que contribuyen a la for m ación de una nueva generación de organism os), en contraposición a células som áticas (que form an el cu er po y no participan en la procreación). linfa
lymph Fluido incoloro derivado de la sangre por filtración a través de las paredes de los capilares. Transporta los linfocitos a través de un sistema especial de ductos y vesí culas -lo s vasos linfáticos.
linfocito
lymphocyte Célula sanguínea de la serie blanca que produce una respuesta inm une cuando es activada por una m olécula extraña (un antígeno). Los linfocitos T se desarrollan en el timo y son los responsables de la inmunidad m ediada por células. Los linfocitos B se desarrollan en la m édula ósea de los m am íferos y son los responsables de la p ro ducción de los anticuerpos circulantes.
linfocito B (célula B)
B lymphocyte (B cell) Tipo de linfocito que sintetiza anticuerpos. linfocito T (célula T)
T lymphocyte (T cell) Tipo de linfocito responsable de la inmunidad m ediada por células; incluye tanto las células T citotóxicas com o las células T colaboradoras.
lipasa
lipase Enzima que cataliza la hidrólisis de un lípido; general m ente separa los ácidos grasos del glicerol en un triacilglicérido o un fosfolípido.
lípido
lipid
M olécula orgánica insoluble en agua pero soluble fácil m ente en solventes orgánicos no polares. Los de una clase determ inada, los fosfolípidos, constituyen la base estructural de las m em branas biológicas. lipofílico
lipophilic Véase hidrofóbico.
liposom a
liposome
Vesícula form ada por una bicapa artificial de fosfolípi-
dos, generada a partir de una suspensión acuosa de m o léculas de fosfolípido. lisis
lysis Rotura de la m em brana plasm ática de una célula, que conduce a la liberación del citoplasm a y a la m uerte de la célula.
lisogenia
lysogeny
Estado de una bacteria en el que transporta, integrado en su genom a, el DNA de un virus inactivo. El virus p ue de ser activado posteriorm ente para replicarse y lisar la célula. lisosom a
lysosome Orgánulo vesicular de las células eucariotas que con tie ne enzim as digestivas, las cuales son m ás activas al pH ácido al que se halla el lumen de los lisosomas.
lo com oción am eboide
amoeboid locomotion Form a característica de locom oción celular tipificada por Amoeba proteus. Asociada con la emisión de pseudópodos y con corrientes citoplasm áticas. lo com oción celu lar (m igración celular)
cell locomotion (cell migration)
D esplazam iento activo de una célula desde una locali zación a otra, particularm ente la migración de una célu la sobre una superficie. locus
locus
MAP (microtubule-associated protein)
Cualquier proteína que se une a m icrotúbulos y modifi ca sus propiedades. Se han encontrado m uchos tipos di ferentes de MAP, incluyendo proteínas estructurales com o MAP-2, y proteínas m otor com o la dineína. MAP quinasa (p ro teín a q uinasa activ ad a p o r m itógeno)
MAP kinase (mitogen-activated protein kinase)
Proteína quinasa que desem peña un papel crucial en la transm isión de señales desde la m em brana plasm ática al núcleo. Es activada por un amplio abanico de señales inductoras de diferenciación o de proliferación. m a p a de restricció n
restriction map
R epresentación en form a de diagram a de una molécula de DNA en la que se indican los lugares de rotura por varias enzim as de restricción. m a p a peptídico
peptide map
Patrón bidimensional (sobre papel o gel) característico form ado por la separación de la m ezcla de péptidos pro ducidos por la digestión parcial de una proteína. m a rc a
label
Grupo químico o átom o radiactivo añadido a una m olé cula para poder seguir su rastro a través de una reacción bioquímica o para poderla localizar en el espacio. m a rc a r
label
Añadir una m arca a una célula o a una molécula.
En genética, la posición de un gen en un crom osom a. Los diferentes alelos del mismo gen ocupan el mismo locus. (Del latín lugar.)
locus,
lu gar activo
active site
Región de la superficie de una enzim a a la que se une una m olécula de substrato, sufriendo entonces la re a c ción catalizada por la enzima. luz, lum en
lumen
Cavidad limitada por una lám ina epitelial (en un tejido) o por una m em brana (en una célula).
m acrò fag o
macrophage Célula sanguínea de la serie blanca, especializada en la cap tación de m aterial particulado m ediante fagocitosis.
m acro m o lécu la
macromolecule
Molécula, com o una proteína, un ácido nucleico o u n p o lisacárido, cuya m asa molecular es m ayor de varios cen tenares de daltons. (Macro del griego makros, grande.) m ad u ració n del RNA
RNA splicing
Proceso nuclear en el que se eliminan las secuencias intrón de una m olécula de RNA, dando lugar a una m olé cula de RNA m ensajero. m aligno
malignant Describe tum ores y células tum orales que son invasivos y /o son capaces de producir m etástasis; un tum or m a ligno es un cáncer.
Glosario
MAP (p ro teín a aso ciad a a m icrotú b ulos)
m a sa m o lecu lar relativa
relative molecular mass
M asa de una m olécula expresada com o múltiplo de la m asa de un átom o de hidrógeno. m asto cito s
mastcells
Célula tisular am pliam ente distribuida, que libera histamina com o parte de una respuesta inflamatoria. Estre cham ente relacionada con los basófilos de la sangre. m atriz e x tracelu lar (ECM)
extracellular matrix (ECM) Compleja red de polisacáridos (com o glucosam inoglucanos y celulosa) y de proteínas (com o colágena) secretada por las células. Actúa com o elem ento estructural en los tejidos y tam bién influyen en su desarrollo y su fisiología. m ed ia lu n a gris
gray crescent
Banda de pigm entación suave que ap arece en el huevo de algunos anfibios en el lugar opuesto al que ha en tra do el esperm atozoide en la fecundación. Está causada por la rotación del córtex del huevo y de los gránulos de pigm ento asociados. M arca el futuro lugar dorsal. m ega-
mega-
Prefijo que denota 106. (Del griego megas, enorm e, p o deroso.)
m eiosis
meiosis
Tipo especial de división celular por el cual se producen los óvulos y los esperm atozoides, con una reducción de la cantidad de m aterial genético. Com prende dos divi siones nucleares sucesivas con una sola ronda de replicación del DNA, lo cual produce cu atro células hijas ha-
G-19
ploides a partir de una célula diploide inicial. (Del griego disminución.)
meiosis,
m elan ocito
m icrofílam en to
melanocyte Célula que sintetiza el pigm ento negro melanina, res ponsable de la pigm entación de la piel y del pelo.
membrane
Doble cap a de m oléculas lipídicas y proteínas asociadas que delimita todas las células y, en las células eucariotas, tam bién delimita m uchos orgánulos y com p arti m ientos celulares.
m icrograffa
Fotografía de una imagen obtenida a través de un m i croscopio. Puede ser una micrografía óptica o una micrografía electrónica (electronmicrografía) dependiendo del tipo de m icroscopio utilizado. m icroin yección
microinjection
m em b ran a in tern a
internal membrana M em brana de la célula eucariota que no es la m em b ra na plasm ática. Com o ejemplos, las m em branas del retí culo endoplasm ático y del com plejo de Golgi.
m em b ran a p lasm ática
plasma membrane
M em brana que delim ita una célula viva. m eristem o
meristem
Inyección de m oléculas en el interior de una célula utili zando un m icroelectrodo. m icró n (pm o m icro m etro )
micron (fim o micrometer)
Unidad de medida a menudo aplicada a células o a or gánulos biológicos. Es igual a 10-6 m etros, o I0 4 cen tí m etros. m icrotú b ulo
Grupo de células en división cuyos productos dan lugar a tejidos y órganos de una planta en crecim iento. Ejem plos clave son el m eristem o apical de la raíz y los meristem os apicales de las yem as.
microtubule
Estructura cilindrica alargada com puesta por la proteína tubulina. Es uno de los tres principales tipos de elem en tos del citoesqueleto.
(plural m icrovilli) microvillus (plural microvilli)
m icrovillus
m esén q u im a
mesenchyme
Tejido conjuntivo indiferenciado de los animales, for m ado por células englobadas en una tenue matriz extracelular. m etabolism o
metabolism
Suma total de los procesos químicos que tienen lugar en las células vivas. m etafase
metaphase
Finas proyecciones digitiformes que em ergen de la m em brana de una célula animal. Contienen un haz de filamentos de actina y son particularm ente abundantes en la superficie de absorción de las células epiteliales del intestino (enterocitos). m ili-
milliPrefijo que denota 10 3.
m ioblasto
Estadio de la mitosis en el que los crom osom as se hallan fuertem ente unidos al huso m itótico, situados en su ecuador, pero todavía no se han disgregado hacia los polos opuestos.
myoblast
Célula m ononucleada e indiferenciada precursora de una fibra muscular. Una célula del músculo esquelético está formada por la función de varios mioblastos. m iofibrilla
m etástasis
myofibril
metastatis
Difusión del cán cer desde el lugar donde se ha originado a otros lugares del cuerpo. m etil (— CH3)
methyl
Grupo quím ico hidrofóbico derivado del m etano (CH4). MHC (com plejo m ay o r de histocom patibilidad)
MHC (major histocompatibility complex)
Complejo de genes de vertebrados que codifican una gran familia de proteínas de superficie celular las cuales se unen a fragm entos proteicos o a proteínas extrañas (no propias) presentándolas a los linfocitos T para indu cir así una respuesta inm une. Figura 23-45.)
(Véase
m icro-
micro-
Prefijo que denota 10~6. m icro electro d o (o m icrop ip eta)
microelectrode (o micropipette)
Porción de tubo de vidrio muy fino estirado hasta co n seguir una punta m ucho m ás fina todavía; se utiliza para
Glosario
microfilament Véase filam ento de actin a.
micrograph
m em b ran a
G -20
penetrar en una célula y estudiar su fisiología o inyectar corriente eléctrica o moléculas.
Haz largo y organizado de actina, m iosina y otras proteí nas, situado en el citoplasm a de las fibras m usculares y que se con trae m ediante un m ecanism o de desliza m iento de filamentos. m iosin a
myosin
Tipo de proteína m otora que utiliza ATP para dirigir desplazam ientos a lo largo de filamentos de actina. La miosina II es una proteína muy grande que form a los filamentos gruesos del m úsculo esquelético que se des lizan sobre los filamentos de actina durante la co n trac ción. La miosina I es menor, está distribuida m ás am pliam ente y no se ensam bla form ando filamentos; a m enudo se halla unida a m em brana. m ito co n d ria
mitochondrion (plural mitochondria) Orgánulo rodeado de una doble m em brana, de tam año aproxim adam ente igual al de una bacteria, que desarro lla la fosforilación oxidativa y produce la m ayoría del ATP de las células eucariotas.
m itógeno
mitogen
Substancias extracelulares, com o los factores de creci miento, que estimulan la proliferación celular. m itosis
mitosis
División del núcleo de una célula eucariota, con la co n densación del DNA en crom osom as visibles. (Del griego hilo, filamento; se refiere a la apariencia sem ejan te a un filamento de los crom osom as condensados.)
mitos,
m od ificación p o st-trad u ccio n al
posttranslational Information
Cambio, catalizado por enzimas, que sufre una proteína tras ser sintetizada. Como ejemplos, la rotura, la glucosilación, la fosforilación, la metilación y la prenilación. m ódulo
module
En una proteína o ácido nucleico, una unidad de estruc tura o de función; se utiliza en una gran variedad de contextos diferentes. m ol
mole M gram os de una substancia, siendo M su m asa m ole cular relativa (peso m olecular); son 6 x 1023 moléculas de la substancia.
m olécu la
molecule
Grupo de átom os unidos entre sí m ediante enlaces covalentes. m olécu la ap olar
apolar molecule Véase m olécu la no p olar. m olécu la de adhesión celu lar (CAM)
cell-adhesion molecule (CAM)
Proteína de la superficie de una célula animal que m e dia la unión célula-célula. m o lécu la no p o lar (m olécu la apolar)
nonpolar molecule (apolar molecule) M olécula que no tiene una acum ulación asim étrica de cargas positivas o negativas; tales m oléculas general m ente son insolubles en agua. m olécu la p olar
polar molecule
M olécula en la que existe una distribución polarizada de las cargas positivas y negativas debido a una distribu ción desigual de los electrones. Las m oléculas polares suelen ser solubles en agua. m olécu la satu rad a
saturated molecule Molécula que solam ente tiene enlaces sencillos carb o no-carbono. m olécula señal
signal molecule Molécula extracelular o intracelular que coordina la res puesta de una célula al com portam iento de otras células u objetos del entorno. m on ó m ero
monomer
Pequeña unidad m olecular básica que puede unirse a otras del m ismo tipo form ando una gran molécula (un polímero).
Glosario
m o n o sacárid o
monosaccha ride Azúcar sencillo de fórmula general (CH20 )„, siendo entre 3 y 7.
n
m osaico
mosaic
En genética, organism o com puesto por una mezcla de células de genotipos diferentes. m otivo
m otif
Elem ento de patrón estructural que se repite en m uchos contextos; concretam ente, pequeño dominio estructu ral que se presenta en una gran variedad de proteínas. M PF (facto r p ro m o to r de la fase M)
MPF (M-phase-promotingfactor)
Complejo proteico que contiene una ciclina y una pro teína quinasa y que em puja a una célula a entrar en la fase M. (Originalmente se denom inó factor p rom otor de la m aduración.) mRNA (RNA m en sajero)
mRNA (messenger RNA)
M olécula de RNA que determ ina la secuencia de am ino ácidos de una proteína. Se produce por m aduración del RNA (en eucariotas) a partir de una gran m olécula de RNA sintetizada por la RNA polim erasa com o una copia com plem entaria de una zona de DNA. Es traducida a proteína a través de un proceso catalizado por ribosomas. MTOC
Véase ce n tro organ izad or de m icrotú b ulos.
m ú scu lo card íaco
cardiac m úsele
Tipo especializado de m úsculo estriado que forma el c o razón, que consiste en fibras m usculares cardíacas uni das entre sí m ediante uniones celulares. m ú scu lo estriad o
striated muscle
M úsculo com puesto de miofibrillas estriadas transver salm ente. Los ejem plos mejor conocidos son los m ú scu los esquelético y cardíaco de los vertebrados. m ú sculo liso
smooth muscle Tipo de m úsculo encontrado en las paredes de las arte rias y del intestino y otras visceras, y en algunas otras lo calizaciones del cuerpo de los vertebrados. C om puesto de largas fibras m ononucleadas, en form a de huso. Se denom ina “liso” debido a que no presenta las estrías ge neradas por la presencia de los sarcóm eros de los m ús culos esquelético y cardíaco. m u tació n
mutation
Cambio heredable de la secuencia de nucleótidos de un crom osom a. m u tació n d o m in an te negativa
dominant negative mutation
M utación que afecta de form a dom inante el fenotipo, m ediante una proteína o una m olécula de RNA defec tuosas que interfieren en la función norm al del p rod uc to génico de la m ism a célula. m u tació n h o m e ó tica
homeotic mutation
M utación que hace que unas células localizadas en una región del cuerpo se com porten com o si estuvieran si-
G-21
tuadas en otra región, generando una alteración grotes ca del plan corporal. m u tació n pun tu al
point mutation
n ico tin a ad enina dinucleótido fosfato
nicotine adenine dinucleotide phosphate Véase NADP+. Nitella Alga verde con células plurinucleadas gigantes. Utiliza da en estudios de fisiología vegetal y de corrientes citoplasm áticas dependientes de actina.
Cambio de un solo nucleótido en el DNA, especialm ente en una región del DNA que codifica proteína. m u tan te sensible a la te m p e ra tu ra (ts)
temperature sensitive (ts) mutant
Organismo o célula que contiene una proteína (o una m olécula de RNA) alterada genéticam ente que actúa norm alm ente a una tem peratura pero que es anorm al a otra tem peratura (que habitualm ente es elevada).
N term in al
N terminus Véase am in o term in al. NAD+ (n icotin a ad en in a dinucleótido)
NAD+ (nicotine adenine dinucleotide)
C oenzim a que participa en una reacción de oxidación aceptando un ion hidruro (H ) de la m olécula dadora. El NADH form ado es un im portante transportador de elec trones para la fosforilación oxidativa. NADP+ (n ico tin a ad en in a d in ucleótido fosfato)
NADP+ (nicotine adenine dinucleotide phosphate) Coenzim a estrecham ente relacionado con el NAD+ que se utiliza am pliam ente en procesos de biosíntesis, no en procesos catabólicos. n an o-
nanoPrefíjo que denota 1 0 9.
n an ó m etro (nm )
nanometer (nm)
Unidad de longitud habitualm ente utilizada para medir m oléculas y orgánulos celulares. 1 nm = 10_3^m = 10 9m. n eu rita
nm
Véase n an ó m etro .
NMR (reso n an cia m ag n ética nuclear)
NMR (nuclear magnetic resonance)
Absorción resonante de radiación electrom agnética a una frecuencia determ inada por núcleos atóm icos en un cam po m agnético, debida a cam bios en la orienta ción de sus m om entos de dipolo m agnético. El espectro NMR proporciona inform ación acerca del am biente químico del núcleo atóm ico. El NMR bidimensional se utiliza am pliam ente para determ inar la estructura tridi m ensional de pequeñas proteínas. n ucleación
nucleation
Estado crítico en el proceso de ensamblaje de un polí mero, en el cual un pequeño grupo de m onóm eros se agregan de acuerdo con una disposición correcta ini ciando una rápida polim erización; de form a m ás gene ral, etapa limitante del proceso de ensamblaje. núcleo
nucleus Prom inente orgánulo delimitado por una doble m em brana, propio de la célula eucariota. Contiene el DNA organizado en crom osom as.
nucléolo
nucleolus Estructura del núcleo en la que se transcribe el RNA ribosóm ico y se ensam blan las subunidades ribosóm icas. nucleósido
neurite
Larga evaginación que crece a partir de una célula ner viosa en cultivo. Térm ino genérico que no especifica si la evaginación es un axón o una dendrita, aunque habi tualm ente es sinónim o de axón. n eu rofilam en to
neurofilament
Filam ento intermedio encontrado en las fibras nerviosas. n eu ro n a (fibra nerviosa)
neuron (nerve cell)
Célula con largas prolongaciones especializadas en reci bir, conducir y transm itir señales en el sistem a nervioso. n europép tido
neuropeptide
Péptido que actú a com o m olécula señal, secretado por neuronas tanto en una sinapsis com o en otro lugar. n eu ro tran sm iso r
neurotransmitter Pequeña m olécula señal sintetizada por la fibra nerviosa presináptica y segregada en una sinapsis quím ica para propagar la señal a la fibra postsináptica. Com o ejem plos pueden citarse la acetilcolina, el glutam ato, el GABA, la glicina y m uchos neuropéptidos. n ico tin a ad en in a dinucleótido
nicotine adenine dinucleotide Véase NAD+. G -22
nm
Glosario
nucleoside
Com puesto formado por una base púrica o pirimidínica unida a un azúcar ribosa o desoxirribosa. Panel 2-6, págs. 60-61.)
{Véase
n u cleosom a
nucleosome
Unidad estructural de los crom osom as eucariotas, sem e jante a una cuenta de collar, com puesta de una corta c a dena de DNA enrollado alrededor de un núcleo de p ro teínas histona; subunidad fundamental de la crom atina. n ucleótido
nucleotide
Nucleósido con uno o m ás grupos fosfato unidos al azú car m ediante enlaces éster. El DNA y el RNA son polím e ros de nucleótidos.
oligodendrocito
oligodendrocite
Tipo de célula glial del sistem a nervioso central de los vertebrados que forma una vaina de mielina alrededor de los axones neuronales. oligóm ero
oligomer
Corto polímero formado (en una célula) por am inoáci dos (oligopéptido), azúcares (oligosacárido) o nucleótidos (oligonucleótidos). (Del griego poco, pequeño.)
oligos,
on cogén
p atógen o
oncogene
pathogen (pathogenic)
Gen de una gran colección de genes que pueden contri buir a que una célula se transform e en cancerosa. Típi cam ente, un m utante de un gen norm al (proto-oncogén) que participa en el control del crecim iento o de la división celulares.
Organismo u otro agente que causa enferm edad. p a tró n de d ifracción
diffraction pattem
Patrón producido por la interferencia de las ondas de la radiación transm itida o dispersada por diferentes zonas de un objeto.
oo cito
oocyte Célula germ inal fem enina. H abitualm ente es una célula m uy volum inosa y carente de m ovim iento.
p a u ta de le ctu ra
readingframe
Fase en que son leídos los nucleótidos en grupos de tres, codificando una proteína; una m olécula de mRNA pue de ser leída siguiendo tres pautas de lectura diferentes. Figura 3-17.)
oogénesis
oogenesis
[Véase
Form ación, crecim iento y m aduración de los oocitos en el ovario.
PCR (reacció n en ca d e n a de la polim erasa)
PCR (polymerase chain reaction)
op erad o r
operator
Técnica que perm ite amplificar determ inadas regiones de DNA, m ediante múltiples ciclos de polim erización de DNA, cada uno de los cuales es seguido por un breve tratam iento de increm ento de tem peratura para separar las cadenas com plem entarias.
Corta región de DNA de un crom osom a bacteriano que controla la transcripción de un gen adyacente. o p erón
operon
En un crom osom a bacteriano, grupo de genes contiguos que se transcriben en una sola molécula de mRNA.
péptido señal
signal peptide
O rganizador
Corta secuencia de am inoácidos que determ ina la loca lización final de una proteína en la célula. Un ejemplo lo constituye la secuencia N terminal de unos 20 am ino ácidos que dirige las proteínas nacientes de secreción o transm em brana hacia el retículo endoplasm ático.
Organizer Véase O rganizador de Spem ann.
O rganizador de Spem ann
Spemann’s Organizer
Tejido especializado de la punta dorsal del blastoporo de un em brión de anfibio; fuente de señales que ayudan en la form ación orquestada del eje corporal em briona rio. (Por H. Spem ann y H. Mangold, codescubridores.)
p ero xiso m a
peroxisome
Pequeño orgánulo celular delimitado por una única m em brana, que utiliza oxígeno m olecular para oxidar moléculas orgánicas. Contiene algunas enzimas que p ro ducen peróxido de hidrógeno (H20 2) y otras que lo de gradan.
organ izad or n u cleo lar
nucleolar organizer
Región de un crom osom a que contiene un grupo de ge nes de RNA ribosóm ico que dan lugar al nucléolo. ósm osis
osmosis
D esplazam iento neto de m oléculas de agua a través de una m em brana sem iperm eable, dirigido por la diferen cia de con cen tració n de un soluto a cad a lado de ella. La m em brana debe ser perm eable al agua pero no al soluto. oxid ación (verbo oxidar)
oxidation (oxidize)
Pérdida de densidad de electrones de un átom o, com o ocurre cuando a una m olécula se añade un oxígeno o se elimina un hidrógeno. Opuesto a la reducción. Figura 2-14.)
[Véase
peso m o lecu lar
molecular weight N um éricam ente, igual a la m asa m olecular relativa de una molécula, expresada en daltons.
pH
pH Medida com ún de la acidez de una solución: “p ” se re fiere a la potencia de 10, y “H ” al hidrógeno. Se define com o el logaritmo negativo de la con centración de iones hidrógeno en m oles por litro (M). Así, pH 3 (10~3 M de H+) es ácido y pH 9 (10 9 M de H+) es alcalino. pinocitosis
pinocytosis Tipo de endocitosis en la que son captados materiales solubles del medio y son incorporados a vesículas para su digestión. Literalmente, “bebida celular”.
p ar de bases
base pair
Dos nucleótidos de una m olécula de RNA o de DNA, apareados m ediante enlaces de hidrógeno -p o r ejemplo G con C y A con T o con U. p ared celu lar
cell wall
Matriz extracelular m ecánicam ente resistente deposita da por un célula en el exterior de su m em brana plasm á tica. Es prom inente en la m ayoría de plantas, bacterias, algas y hongos. No se presenta en la m ayoría de las célu las animales.
Glosario
pirim idina
pyrimidine Una de las dos categorías de com puestos con anillos con nitrógeno que se encuentran en el DNA y en el RNA. Ejemplo, la citosina. Panel 2-6, págs. 60-61).
[Véase
p la ca celu lar (fragm oplasto)
cell píate
Estructura aplanada limitada por la m em brana que se for m a por la fusión de vesículas en el citoplasma de una célu la vegetal en división, y que es la precursora de una nueva pared celular.
G-23
p laca de adhesión
adhesión plaque
Véase co n ta cto focal. p laca m etafásica
metaphase píate
Plano im aginario que form a un ángulo recto con el huso m itótico y es equidistante de am bos polos; plano en el que se sitúan los crom osom as en la metafase. p laq ueta
platelet
Fragm ento celular, sin núcleo, que se produce en la m é dula ósea por rotura de un m egacariocito y que se halla en grandes cantidades en el plasm a sanguíneo. Colabo ra en el inicio de la coagulación de la sangre cuando un vaso sanguíneo es dañado. plásm ido
plasmid
Pequeña m olécula de DNA circular que se replica de for m a independiente del genom a. Am pliamente utilizada com o vector en clonaje de DNA. plasm od esm o
plasmodesma (plural plasmodesmata) Unión com u n ican te célula-célula en vegetales, m edian te la cual un canal de citoplasm a limitado por m em bra na plasm ática co n ecta dos células adyacentes a través de un pequeño poro (o puntuación) presente en las p a redes celulares de am bas células. plasto
nuclear pore
Canal que atraviesa la envoltura nuclear perm itiendo a determ inadas moléculas desplazarse desde el núcleo al citoplasm a y viceversa. p o sterio r
posterior
Situado hacia el extrem o de la cola del cuerpo. poten cial de acción
action potential
Excitación rápida, transitoria y autopropagante, de la m em brana plasm ática de una célula com o una neurona o una fibra m uscular. Los potenciales de acción, o im pulsos nerviosos, perm iten la señalización a largas dis tancias en el sistema nervioso. p oten cial de m e m b ra n a
membrane potential
Diferencia de voltaje a través de una m em brana debido a un ligero exceso de iones positivos en un lado y de io nes negativos en el otro lado. Un potencial de m em bra na típico de una m em brana plasm ática de una célula es de -6 0 mV (negativo en el interior respecto al fluido cir cundante). pren ilación
prenylation Unión covalente de un grupo lipídico isoprenoide a una proteína. p resión o sm ó tica
plastid Orgánulo citoplasm ático propio de células vegetales, ro deado por una doble m em brana, que sintetiza su propio DNA y que a m enudo está pigm entado. Los cloroplastos son una m odalidad de plastos. p olím ero
polymer
M olécula grande generada por la form ación de series de enlaces covalentes que unen m uchas subunidades idén ticas o sim ilares entre sí (m onóm eros). polipéptido
polypeptide Polím ero lineal com puesto por múltiples am inoácidos. Las proteínas son polipéptidos de gran tam año, y am bos térm inos pueden utilizarse de form a indiferente. poliploide
polyploid
Describe una célula o un organism o que contiene m ás de dos juegos de crom osom as homólogos. p olirrib oso m a (polisom a)
polyribosome (polysome)
M olécula de mRNA a la que se han unido varios ribosom as, los cuales están realizando síntesis de proteínas. polisacárid o
polysaccharide Polím ero lineal o ram ificado de m onosacáridos. Ejem plos, el glucógeno, el ácido hialurónico y la celulosa. polo an im al
animal pole En huevos con yem a, el extrem o libre de vitelo que se divide m ás rápidam ente que el polo vegetativo. polo vegetativo
vegetal pole
Extrem o en el que se localiza la m ayoría de la yem a en un huevo de animal. El extrem o opuesto al polo animal.
G -24
p oro n u clear
Glosario
osmotic pressure
Presión que será ejercida sobre el lado de elevada co n centración de soluto de una m em brana sem iperm eable para impedir el flujo de agua a través de la m em brana debido a osmosis. p ro ca rio ta
procaryote (prokaryote) Organismo constituido por células sencillas que carecen de un núcleo diferenciado: una bacteria o una cianobacteria. profase
prophase Prim era etapa de la mitosis durante la cual los crom oso m as están condensados pero todavía no se hallan uni dos al huso m itótico. p ro m o to r
promoter
Secuencia nucleotídica de un DNA por la que la RNA polim erasa inicia la transcripción. p ro te a sa (p rotein asa, en zim a proteolítica)
protease (proteinase, proteolytic enzyme)
Enzim a com o la tripsina, que degrada proteínas hidrolizando algunos de sus enlaces peptídicos. p ro teín a
protein
Principal constituyente m acrom olecular de las células. Polímero lineal de am inoácidos unidos entre sí m edian te enlaces peptídicos, siguiendo una secuencia determ i nada. p ro teín a activ ad o ra de GTPasa (GAP)
GTPase-activating protein (GAP)
Proteína que se une a una proteína de unión a Ras, o a una proteína relacionada con ella, inactivándola m e diante la estim ulación de su actividad GTPasa, la cual hidroliza el GTP que tiene unido form ando GDP.
p ro tein a alostérica
allosteric protein
Proteina que cam bia de una conform ación a otra cuando se une a otra m olécula o cuando es modificada covalen tem ente. El cam bio de conform ación altera la actividad de la proteína y puede form ar la base del movimiento di rigido. p ro teín a Cdk
Cdk protein Véase p ro teín a quinasa d ependiente de ciclina.
p ro teín a de estrés p o r ca lo r (de resp u esta al estrés)
heat shock protein (stress-response protein)
Proteína sintetizada en respuesta a una tem peratura elevada u otro tratam iento estresante; habitualm ente ayuda a que la célula sobreviva el estrés. p ro teín a de unión a la a ctin a
actin-biding protein
Proteína que en las células se asocia tanto con m on óm e ros de actina com o con filamentos de actina, m odifican do sus propiedades. Como ejemplos, pueden citarse la miosina, la actinina a y la profilina. p ro teín a fosfatasa
protein phosphatase Véase fosfoproteín a fosfatasa. p ro tein a G
G protein
C om ponente de una gran familia de proteínas heterotrim éricas de unión a GTP que son im portantes interm e diarios en procesos de señalización celular. Habitual m ente son activadas por la unión de una horm ona u otro ligando señal a una proteína receptora transm em brana que atraviesa la m em brana siete veces. p ro teín a globular
globular protein
Cualquier proteína cuya forma sea aproxim adam ente esférica; con trasta con las proteínas fibrosas, muy alar gadas, com o la colágena. p ro teín a lib erad ora del n ucleótido de gu anina (GNRP)
guanine nucleotide releasing protein (GNRP)
Proteína que se une a una proteína de unión a Ras o a una proteína relacionada con ella, activándola m ediante la estim ulación de la liberación del GDP que tiene uni do, y de la unión de GTP en su lugar. p ro teín a m o to ra
motor protein
Proteína que utiliza energía derivada de la hidrólisis de nucleósidos trifosfato para autopropulsarse a lo largo de un filamento o de una molécula polimèrica. p ro tein a quinasa
protein kinase
Enzima que transfiere el fosfato terminal del ATP a un aminoácido determ inado de una proteína diana. p ro teín a quinasa d ependiente de ciclin a (p roteín a Cdk)
cyclin-dependent protein kinase (Cdk protein)
Proteína quinasa que debe com plejarse con una ciclina para ser activa; se cree que diferentes complejos Cdk-ciclina desencadenan diferentes etapas del ciclo de divi sión celular, fosforilando proteínas diana específicas. p ro teín a Ras
Ras protein
M iembro de una gran familia de proteínas que unen GTP que colabora en la transm isión de señales desde re ceptores de la superficie celular hasta el núcleo. Se de
Glosario
ras,
nom ina así por el gen identificado por prim era vez en virus que causan sarcom as en rata. p ro teín a reg u lad o ra de genes
gene regulatory proteins
Nom bre genérico para cualquier proteína que se una a una secuencia determ inada de DNA y altere la expresión de un gen. p ro teín a tra n sp o rta d o ra
carrier protein
Proteína de m em brana que se une a un soluto y lo tran s porta a través de la m em brana, sufriendo una serie de cam bios conform acionales. p ro tein asa
proteinase Véase p ro teasa. proteoglu can o
proteoglycan
M olécula form ada por una o m ás cadenas de glucosam inoglucano (GAG) unidas a un núcleo proteico. proteolisis
proteolysis Degradación de una proteína, habitualm ente por hidró lisis en uno o m ás de sus enlaces peptídicos. p ro teo so m a
proteasome
Gran com plejo proteico del citosol que es responsable de la degradación de las proteínas que están m arcadas, m ediante ubiquitinación u otros sistemas, para ser des truidas. p ro to -o n co g én
proto-oncogen
Gen normal, habitualm ente relacionado con la regula ción de la proliferación celular, que m ediante m utación puede ser transform ado en un oncogén prom otor de cáncer. protozoo
protozoa
Organismo eucariota unicelular móvil, generalm ente no fotosintético y de vida libre. Cabe destacar o que se alim entan de otros m icroorganism os. Un gran núm ero de protozoos son parásitos.
Amoeba,
Paramecium
pseudópodo
pseudopodium (plural pseudopodia) Larga evaginación de la superficie celular form ada por las células am eboides que les perm ite la locom oción. De forma m ás general, cualquier evaginación dinám ica rica en actina de la superficie de una célula animal. p un to de co n tro l
checkpoint
Punto del ciclo de división de las células eucariotas en el cual el progreso a través del ciclo se puede detener hasta que se den las condiciones adecuadas para que la célula progrese hasta el estado siguiente. p un to isoeléctrico
isoelectric point
pH al que una molécula cargada en solución no presen ta carga eléctrica neta, y por lo tanto, no se desplaza en un cam po eléctrico. p urin a
purine
Una de las dos categorías de com puestos con anillos con nitrógeno que se encuentran en el DNA y en el RNA. Ejemplos, la adenina y la guanina. Panel 2-6, págs. 60-61).
(Véase
G -25
q uelato
chelate
Se com bina de form a reversible, norm alm ente con una gran afinidad, con un ion m etálico com o Fe, Ca o Mg. q u eratin a (citoq ueratin a)
keratin (cytokeratin)
Miembro de las proteínas que form an filamentos inter medios de queratina, principalm ente en las células epi teliales. Algunas queratinas especializadas se en cu en tran en el pelo, en las uñas y en las plumas. q uim iotaxis
chemotaxis
Respuesta móvil de una célula o de un organism o que le lleva hacia un com puesto químico difusible o le hace huir de él. q u in asa A (p ro teín a qu in asa depen d ien te de AMP cíclico)
A-kinase (cyclic AMP-dependent protein kinase)
Enzim a que fosforila proteínas diana en respuesta a un increm ento de los niveles intracelulares de AMP cíclico. Fue identificada por prim era vez en el m úsculo esquelé tico com o parte de la vía de regulación de la degrada ción de glucógeno en respuesta a la adrenalina. q uinasa C
C-kinase
Proteína quinasa dependiente de Ca2+ que, cuando es activada por diacilglicerol y por un increm ento de las con centracion es de Ca2+, fosforila proteínas diana en re siduos determ inados de serina y treonina. quinesina
kinesin
Tipo de proteína m otora que utiliza la energía de hidró lisis de ATP para desplazarse por un m icrotúbulo.
señal eléctrica. Se trata del ejemplo mejor conocido de canal iónico regulado por ligando. A veces denom inado receptor de la acetilcolina, para diferenciarlo del receptor que es un recep tor de la su perficie celular relacionado con proteína G.
nicotínico muscarínico,
recesivo
recessive Se refiere al m iem bro de un par de alelos que no se ex presa en el fenotipo de un organism o cuando se halla presente el alelo dom inante. Tam bién hace referencia al fenotipo de un individuo que únicam ente tiene alelos recesivos.
reco m b in ació n
recombination
Proceso en el que los crom osom as o las m oléculas de DNA se rom pen y los fragm entos se vuelven a soldar pero siguiendo com binaciones nuevas. Puede ocurrir en la célula viva -p o r ejemplo por entrecruzam iento duran te la m eiosis- o en el tubo de ensayo utilizando DNA pu rificado y enzim as que rom pen y unen cadenas de DNA. red u cció n (verbo reducir) (verbo Adición de densidad electrónica a un átom o, com o o cu rre durante la adición de hidrógeno o la elim inación de oxígeno de una molécula. Lo opuesto de la oxidación. Figura 2-14.)
reduction
reduce)
[Véase
registro de zo n a
patch-clamp recording T écnica electrofisiológica en la cual la fina punta de un electrodo se sella sobre una zona de una m em brana c e lular, siendo así posible m edir el flujo de corriente a tra vés de los canales iónicos individuales de la zona. rep reso r
repressor Proteína que se une específicam ente a una región del DNA impidiendo la transcripción de un gen adyacente.
rad io au to grafía
radioautography Véase au torrad io g rafía. reacció n
reaction
En quím ica, cualquier proceso en el que cam bia la dis tribución de átom os en m oléculas. reacció n acop lad a
coupled reaction
Par de reacciones quím icas relacionadas en las que la energía liberada por una de ellas impulsa la otra. reacció n en cad en a de la p o lim erasa
polymerase chain reaction Véase PCR. re ce p to r
receptor
Proteína que une de form a específica moléculas señal extracelulares (ligandos) iniciando una respuesta en la célula. Los receptores de superficie celular, com o el re cep tor de la acetilcolina y el recep tor de insulina, están localizados en la m em brana plasm ática, con su lugar de unión al ligando expuesto al m edio extracelular. Los re ceptores intracelulares, com o los receptores de h o rm o nas esteroideas, unen ligandos que difunden al interior de la célula a través de la m em brana plasm ática. re ce p to r de acetilco lin a
acetilcholine receptor
Canal iónico que se abre en respuesta a la unión de a ce tilcolina, transduciendo así una señal quím ica en una
G -26
Glosario
RER
RER
Véase retícu lo en dop lasm ático rugoso.
residuo
residue
Térm ino general que indica la unidad de un polím ero. Porción de un azúcar, un am inoácido o un nucleótido que forma parte de un polímero. reso n an cia m ag n ética n u clear
nuclear magnetic resonance Véase NMR.
resp iració n
respiration
Término general de cualquier proceso celular en el que la cap tación de m oléculas de 0 2 esté acoplada a la pro ducción de C 0 2. resp u esta in flam atoria
inflammatory response Respuesta local de un tejido a una agresión o a una in fección. Causada por la invasión de células sanguíneas de la serie blanca, que liberan varios m ediadores locales com o la histam ina. resp u esta in m u n e
immune response
Respuesta del sistem a inmune de una vertebrado cu an do una substancia o un m icroorganism o extraños en tran en el cuerpo.
retícu lo en dop lasm ático (ER)
endoplasmic reticulum (ER)
Com partim iento laberíntico delimitado por una m em brana, localizado en el citoplasm a de las células eu ca riotas, donde se sintetizan lípidos y proteínas unidas a m em brana.
pan en la síntesis de proteínas. A m enudo se diferencian por su coeficiente de sedim entación, com o rRNA 28S o rRNA 5S. rRNA
rRNA Véase RNA ribosóm ico.
retícu lo en d op lasm ático liso (SER)
smooth endoplasmic reticulum (SER) Región del retículo endoplasm ático no asociada a ribosom as; participa en la síntesis de lípidos. retícu lo en d op lasm ático rugoso (RER)
rough endoplasmic reticulum (RER)
Región del retículo endoplasm ático asociada con ribosom as; participa en la síntesis de proteínas de secreción y de proteínas asociadas a m em brana. retícu lo sarco p lasm ático
sarcoplasmic reticulum
Red de m em branas internas situadas en el citoplasm a de una fibra muscular, que contienen elevadas co n cen traciones de Ca2+ secuestrado, el cual es liberado al citosol com o resultado de la excitación del m úsculo. Corres ponde a una modalidad de retículo endoplasm ático liso.
Saccharomyces Género de levaduras que se reproducen asexualm ente por gem ación o sexualm ente por conjugación. E con ó m icam ente im portante en cervecería y panadería, y am pliam ente utilizadas en ingeniería genética y com o m o delo de organism o sencillo en el estudio de la biología celular de los eucariotas.
Salmonella
Género de bacteria aeróbica, móvil y con form a de vari lla. Incluye especies que causan envenenam iento de ali m entos. sa rco m a
sarcoma Cáncer del tejido conjuntivo. sa rcó m e ro
retroviru s
sarcomere
retrovirus
Virus con RNA que se replica en una célula sintetizando prim ero una doble cad ena de DNA intermedia. RGD
RGD Secuencia de los am inoácidos arginina-glicina-aspartato (RGD en la nom enclatura de una sola letra de los am i noácidos) que se presenta en la fibronectina y en otras proteínas de matriz extracelular y que es reconocida por algunas integrinas que se unen a estas proteínas.
Unidad repetitiva de una miofibrilla de una fibra m us cular. Form ada por la disposición de filamentos super puestos finos (miosina) y gruesos (actina) entre dos dis cos Z adyacentes. secu en cia co m p le m e n ta ria de nucleótid os
complementary nucleotide sequence
Se dice que dos secuencias de ácidos nucleicos son co m plementarias si una con otra pueden form ar una doble hélice m ediante un apaream iento de bases perfecto. secu en cia con senso
rib on u cleasa
consensus sequence
ribonuclease
Form a m ás típica o prom edio de una secuencia que se reproduce con pequeñas variaciones en un grupo de moléculas de DNA, de RNA o de proteínas, relacionadas entre sí.
Enzima que co rta una m olécula de RNA hidrolizando uno o m ás de sus enlaces fosfodiéster. rib o som a
ribosome
Partícula com puesta de rRNA ribosóm icos y de proteí nas ribosóm icas, que se asocian con los RNA m ensaje ros y catalizan la síntesis de proteínas. RNA (ácido ribonucleico)
RNA (ribonucleic acid)
Polím ero form ado a partir de m onóm eros ribonucleótidos unidos entre sí por enlaces covalentes. RNA an tisen tido
secu en cia p alin d ró m ica
palindromic sequence
Secuencia de nucleótidos que es idéntica a su cadena . com plem entaria cuando cad a una es leída en la m ism a dirección quím ica -p o r ejem - 5 x x x x g a t c x x x x r pío, GATC. i' X X X X C T A G X X X X 5' secu en ciació n de DNA
DNA sequencing
Determ inación del orden de nucleótidos de una m olé cula de DNA. Figuras 7-7 y 7-8.)
antisense RNA
RNA com plem entario de un transcrito determ inado de RNA de un gen, que puede hibridar con el RNA determ i nado y bloquear su función.
(Véanse
segm en tación
cleavage
(1) División física de una célula en dos. (2) Tipo esp ecia lizado de división celular observado en m uchos em brio nes tem pranos por la cual una gran célula se divide en m uchas pequeñas sin que haya habido crecim iento.
RNA m en sajero
messenger RNA Véase mRNA.
segundo m en sajero
RNA p olim erasa
second messenger
RNA polymerase Enzima que cataliza la síntesis de una molécula de RNA sobre un patrón de DNA, a partir de precursores nucleó sido trifosfatos. Figura 6-5.)
Pequeña m olécula form ada o liberada a la circulación en respuesta a una señal extracelular, que participa en la transm isión de la señal al interior de la célula. Ejemplos, el cAMP, el IP3 y el Ca2+.
(Véase
RNA rib osó m ico (rRNA)
ribosomalRNA (rRNA)
Cualquiera de las moléculas específicas de RNA que for m an parte de la estructura de un ribosom a y que partici
Glosario
SER
SER
Véanse retículo endoplasmático liso. G-27
serin a/treo n in a q uinasa
substrato
serine/threonine kinase
substratum, substrate
Proteína quinasa que fosforila serinas o treoninas de sus proteínas diana.
(1) Superficie sólida a la que se adhiere una célula. (2) M olécula sobre la que actúa una enzima. subunidad
sim biosis
subunit
symbiosis Asociación íntim a entre dos organism os de especies di ferentes, de la cual am bos obtienen a largo plazo una ventaja selectiva. sim p orte
symport
Form a de cotransporte en el que una proteína transpor tadora transporta dos tipos de soluto a través de una m em brana en la m ism a dirección. co tran sp orte.)
Com ponente de un complejo m ulticom ponente -p . ej., una proteína com ponente de un com plejo proteico. sulfhidrilo (tiol, — SH)
sulfhydryl (thiol, — SH) Grupo químico que contiene azufre e hidrógeno, que se halla en el am inoácido cisteína y en otras moléculas. Dos grupos sulfhidrilo pueden unirse entre sí (reducir se) form ando un enlace disulfuro.
(Véase también
sinapsis
synapse
Unión com u n ican te célula-célula que perm ite el paso de señales desde una fibra nerviosa a otra célula. En una sinapsis quím ica la señal es transportada por un neurotransm isor difusible; en una sinapsis eléctrica se produ ce una conexión entre el citoplasm a de am bas células a través de uniones de tipo gap.
su perenrollam ien to
coiled-coil
Estructura proteica sem ejante a un cilindro, especial m ente estable, form ada por dos hélices enrolladas una alrededor de la otra.
a
tejido conjuntivo
connective tissue
Cualquier tejido de soporte que se halla entre otros tejidos y que está formado por células englobadas en una relati vamente abundante cantidad de matriz extracelular. Entre ellos, el hueso, el cartílago y el tejido conjuntivo laxo.
sincitio
syncytium Masa de citoplasm a que contiene m uchos núcleos rodea da por una sola m em brana plasmática. Típicamente es el resultado de la fusión de células o de series de ciclos de división incompletas en las que el núcleo se divide pero la célula no.
telofase
telophase Estadio final de la mitosis en el que los dos juegos de crom osom as, ya separados, se descondensan y em pie zan a ser delimitados por la envoltura nuclear.
sistem a in m u n e
immune system
Población de linfocitos y de otras células sanguíneas de la serie blanca de los vertebrados, que defienden el or ganism o con tra la infección
telóm ero
telomere
Final de un crom osom a, asociado a una secuencia ca racterística de DNA que se replica de una forma espe cial. C ontrarresta la tendencia del crom osom a a acortar se en cada ciclo de replicación. (Del griego final.)
sistem a n ervioso ce n tra l (SNC)
central nervous system (CNS)
Principal órgano procesador de inform ación del sistema nervioso. En los vertebrados está formado por el encéfa lo y la m édula espinal.
Tetrahymena
Género de protozoos ciliados utilizado en estudios de axonem as ciliares, autom aduración del RNA y repro ducción del telóm ero.
soluto
solute
Cualquier m olécula que está disuelta en un líquido. Al líquido se le denom ina solvente.
tetróxid o de osm io
osmium tetroxide
Com puesto inorgánico ( 0 s 0 4) utilizado habitualm ente com o fijador en el estudio de las células con el m icros copio electrónico.
so m a celu lar
cell body
Parte principal de una célula nerviosa, que contiene el núcleo y la m ayoría de los orgánulos celulares. Las otras partes de la célula nerviosa son el axón y las dendritas.
tilacoide
thylakoid Vesícula aplanada que se halla en un cloroplasto, que contiene pigm entos y en la que se llevan a cabo las reac ciones de captación de la luz de la fotosíntesis. Los m on tones de tilacoides forman el grana de los cloroplastos.
som ito
somite
Uno de una serie de bloques pares de m esoderm o, que se form an m uy precozm ente durante el desarrollo em brionario y se hallan a cada lado de la notocorda de un em brión de vertebrado. Dan lugar a la colum na verte bral; cad a som ito produce la m usculatura de un seg m ento vertebral y del tejido conjuntivo asociado, inclu yendo el que form a la vértebra a la que se halla unida la m usculatura. son da
probe
tiol
thiol Véase sulfhidrilo.
tipo salvaje o silvestre
wild type
Norm alm ente, form a no m utante de un organism o; la form a encontrada en la naturaleza. tiro sin a quinasa
Fragm ento definido de RNA o de DNA, m arcado radiacti va o quím icam ente, utilizado para localizar determinadas secuencias de ácidos nucleicos m ediante hibridación.
G -28
telos,
Glosario
tyrosine kinase
Enzima que transfiere el fosfato term inal del ATP a un residuo determ inado de tirosina de su proteína diana.
to p o iso m erasa (DNA top oisom erasa)
topoisomerase (DNA topoisomerase)
Enzima que hace de forma reversible cortes en una m o lécula de DNA facilitando la eliminación de nudos o de vueltas excesivam ente enrolladas. trad u cció n (trad u cció n del RNA)
translation (RNA translation)
Proceso por el cual la secuencia de nucleótidos de una m olécula de RNA m ensajero dirige la incorporación de am inoácidos a una proteína; ocurre en un ribosom a. tran scrip ció n (tran scrip ció n del DNA)
transcription (DNA transcription)
Copia de una hebra del DNA a una secu en cia com p le m en taria de RNA, m ediante la enzim a RNA polim erasa. tran scrip ció n del DNA
DNA transcription
Véase tran scrip ció n . tran scrip tasa inversa
reverse transcriptase
Enzim a presente en los retrovirus que sintetiza una c o pia de doble cadena de DNA a partir de una molécula de RNA de cadena simple. tran scrito
transcript RNA producto de una transcripción de DNA.
tran sd u cción de señal
signal transduction
Substitución de una señal por su conversión desde una form a de señal quím ica a otra. En biología celular, p ro ceso por el que una célula convierte una señal extracelu lar en una respuesta. tran sfección
transfection
Introducción de una m olécula de DNA extraña en una célula eucariota; habitualm ente se produce la expresión de uno o m ás genes del DNA acabado de introducir. tran sferen cia de tipo blot
blotting
Técnica bioquím ica en la que unas m acrom oléculas se paradas sobre un gel de agarosa o de poliacrilamida son transferidas a una lám ina de papel, quedando así inm o vilizadas para posteriores análisis. tran sferen cia de tipo S outhern
Southern blotting
Técnica m ediante la cual fragm entos de DNA, separados por electroforesis, son inmovilizados sobre una lámina de papel; entonces, se detectan específicam ente las m o léculas de interés utilizando una sonda constituida por un ácido nucleico m arcado. (Por E.M. Southern, el in ventor de la técnica.) tran sferen cia de tipo W estern
Western blotting
Técnica m ediante la cual diversas proteínas separadas e inmovilizadas sobre una lám ina de papel, son analiza das, habitualm ente m ediante un anticuerpo m arcado. tran sform ación
transformation
Alteración heredable de las propiedades de una célula eucariota. En el caso de células animales en cultivo, h a bitualmente se refiere a la adquisición o pérdida de pro piedades tras el tratam iento con un virus o un carcinó geno.
Glosario
tran sgén ico
transgenic
Describe una planta o un animal que ha incorporado de forma estable uno o m ás genes de otra célula u organis m o, y que puede transmitirlos a generaciones sucesivas. tra n sp o rta d o r de electro n es
electrón carrier
Molécula, com o el citocrom o c, que transfiere un elec trón desde una m olécula dadora a otra aceptora de elec trones. tran sp o rtad o res ABC
ABC transporters
M iembros de una gran superfamilia de proteínas trans portadoras que hidrolizan ATP y transfieren a través de la m em brana gran variedad de pequeñas m oléculas. tra n sp o rte activo
active transport
Desplazamiento de una molécula a través de una m em brana o de otra barrera impulsado por una forma de ener gía diferente de la alm acenada en el gradiente de con centración o gradiente electroquímico de la molécula transportada. tra n sp o rte axón ico
axonal transport
Transporte dirigido de orgánulos y m oléculas a lo largo de un axón de una célula nerviosa; puede ser anterógrado (desde el cuerpo celular) o retrógrado (hacia el cu er po celular). tra n sp o rte de electro n es
electrón transport
Desplazam iento de electrones desde estados de elevada energía hasta otros de baja energía, a lo largo de series de moléculas transportadoras de electrones, com o en la fosforilación oxidativa y en la fotosíntesis. tra n sp o rte de m em b ran a
membrane transport
Desplazam iento de m oléculas por una m em brana, m e diado por una proteína de transporte de m em brana. tra z a d o r
tracer
M olécula o átom o que ha sido m arcado quím ica o ra diactivam ente con la finalidad de poderlo seguir a través de un proceso bioquímico o de localizarlo fácilm ente en una célula o en un tejido. tríacilglicérido
triacylglyceride Ester del glicerol con ácidos grasos. Principal constitu yente de las gotas de grasa de los tejidos animales (en los que los ácidos grasos son saturados) y de los aceites vegetales (en los que la m ayoría de los ácidos grasos son insaturados).
tRNA (ácido ribon u cleico de tran sferen cia)
tRNA (transfer ribonucleic acid)
Conjunto de pequeñas m oléculas de RNA utilizadas en la síntesis de proteínas com o interfase (adaptadores) entre el mRNA y los am inoácidos. Cada tipo de m olécu la de tRNA está unida covalentem ente a un aminoácido determ inado.
ubiquitina
ubiquitin
Proteína pequeña y altam ente conservada, presente en todas las células eucariotas que se une covalentem ente
G-29
a las Usinas de otras proteínas. La unión de una cadena de ubiquitinas m arca a la proteína para ser degradada por proteolisis intracelular en un proteosom a. unión, co n exión
linkage
(1) Efecto m utuo de la unión de un ligando sobre la unión de otro ligando, lo cual es la característica central del com portam iento de todas las proteínas que presen tan cooperatividad. (2) H erencia conjunta de dos loci genéticos que se hallan cercan os entre sí en el mismo crom osom a; cuanto m ayor es la conexión m enor es la frecuencia de recom binación entre am bos loci. u nión ad h eren te
adherens junction Unión intercelular en la que la cara citoplasm ática de la m em brana plasm ática se une a filamentos de actina. Como ejemplos, los cinturones de adhesión que unen en tre sí células epiteliales adyacentes y los contactos focales de la superficie inferior de los fibroblastos cultivados. u nión celu lar
cell junction
Región especializada de conexión entre dos células o entre una célula y la m atriz extracelular. u nión co m u n ican te o de tipo gap
gapjunction
Unión que com u n ica dos células y que perm ite que iones y pequeñas m oléculas pasen del citoplasm a de una de ellas al de la otra.
DNA a una célula receptora con la intención de clonar un gen. v ecto r de exp resión
expression vector
Un virus o un plásmido que transporta una secuencia de DNA al interior de una célula huésped y allí dirige la sín tesis de una proteína determ inada. ven tral
ventral Situado bajo la superficie del vientre de un animal.
vesícula
vesicle
Orgánulo pequeño, esférico y rodeado de m em brana del citoplasm a de una célula eucariota. vesícula de secreción
secretory vesicle
Orgánulo rodeado de m em brana en el que se alm ace nan las m oléculas destinadas a ser segregadas. A veces se denom inan gránulos de secreción debido a que sus contenidos teñidos hacen que el orgánulo sea visible com o un pequeño objeto sólido. vesícula revestida
coated vesicle
Vesícula diminuta form ada por el pellizcam iento de re giones recubiertas de la m em brana. Algunos revesti m ientos son de clatrina m ientras que otros son de otras proteínas. virus
virus
u nión e stre ch a o e s ta n ca
tight junction
Unión célula-célula que sella entre sí células epiteliales adyacentes, impidiendo el paso de la m ayoría de m olé culas disueltas desde un lado de la lám ina epitelial hasta el otro.
AG)
Partícula form ada por ácido nucleico (RNA o DNA) en el interior de una cubierta proteica que es capaz de repli carse en el interior de una célula huésped y de disem i narse de una célula a otra. A m enudo son causa de en fermedades.
variación de en ergía libre (
free energy change (AG)
Cambio de la energía libre durante una reacción: la energía libre de los productos m enos la de los substra tos. Un valor muy negativo de AG indica que la reacción tiene una gran tendencia a producirse. Panel 141, págs. 714-715.)
(Véase
v ecto r
vector
En biología celular, un agente (un virus o un plásmido) utilizado para transm itir m aterial genético a una célula o a un organism o. v e cto r de clonaje.)
(Véase también
v e cto r de clon aje
cloning vector
Elem ento genético, habitualm ente un bacteriófago o un plásmido, utilizado para transportar un fragm ento de
G -30
Glosario
M áxim a velocidad de una reacción enzim àtica, cuando el substrato se halla a niveles de saturación.
Xenopus laevis (sapo de Suráfrica) Especies de rana (no de sapo) utilizadas frecuentem ente en estudios de desarrollo tem prano de vertebrados.
zigoto
zygote Célula diploide originada por la fusión de un gam eto masculino y un gam eto fem enino. Óvulo fecundado.
zonula adherens Véase cin tu ró n de adhesión.
índice alfabético Los números en negrita se refieren a las páginas donde el tema se trata con mayor profundi dad; los que van seguidos de una F remiten a figuras, y los que llevan FF a varias figuras si tuadas en la misma página o en páginas consecutivas; las cifras que preceden a una T remi ten a una tabla, y las que llevan FT o TF, a una tabla y una figura que van seguidas, ya sea en la misma página, ya en páginas consecutivas.
Aborto de genes fuera de combate, 1134 unión, 64 Ac-Ds, elementos, 419T Acción potencial, 564 Acelerante retroalimentación positiva, 811F Acetato de tetradecanoilforbol, 1355 Acetil CoA, 48, 69, 71F, 74, 75, 80, 84F, 616, 702F, 703 y sigs. CoA oxidación, 705 N-Acetil-D-galactosamina, 1045F Acetilación, 235 Acetilasas AT-terminales, 235 Acetilcolina, 573-575, 577, 675, 777F, 786, 797T canales catiónicos regulados, 583T neuronas sensibles, 576 receptores, 574F, 810 receptores muscarínicos, 804 receptores nicotínicos, 804 Acetilcolinesterasa, 574 /V-Acetilgalactosamina, 649,1043 N-Acetilglucosamina, 604F, 630, 646, 647F, 649, 1043,1045F transferasa I, 648F /V-Acetilglucosamina-galactosa-ácido siálico, 647F Acetilo, grupos, 74F Ácido(s) abscísico, 1194 N- acetil neuramínico, 516F y-aminobutírico, véase GABA araquidónico, 775 ascòrbico, 1051 aspártico, 76,139, 529F carboxílico, 47F, 48, 71 carboxilo, 181F cítrico, 74, 76, 705 cítrico, ciclo, 73F, 74, 84F, 90, 702, 705 y sigs. clorhídrico, 1228 desoxirribonucleico, 62F, 103, véase también DNA etilendiamíntetraacético, 166 fórmico, 614, 745 fórmico, oxidación, 746F fosfatídico, 633 giberélico, 1078,1191,1192F n-glucurónico, 1045 glutámico, 48F, 111F, 139 grasos, 37,45, 47, 69, 702, 772 grasos, cadenas alquilo, 615 grasos, ciclo de oxidación, 704F grasos, porcentaje del peso celular, 45T rasos y cloroplastos, 743 ialurónico, 1043,1047,1076 hialurónico, estructura, 1044F láctico, 17, 90, 705 mirístico, 519F nucleicos, 62, 102-115 nucleicos, hibridación, 313,322,323F nucleicos, porcentaje del peso celular, 45T orgánicos como dadores de electrones, 747 palmítico, 47F, 519F pirúvico, 71 policitidílico, 6 poliguanílico, 6 polisiálico, 1038 ribonucleico, 5, 62,109, véase también RNA siálico, 516F, 647, 648F tricarboxílicos, ciclo, 73, 705 y sigs. Acil coenzima A, 633F graso CoA, 703 graso CoA deshidrogenasa, 704F y sigs. transferasas, 633 Aconitasa, 496 Acopladas, reacciones, 63, 67 Acoplamiento celular, 1026 de las reacciones químicas, 68F
factor, 772 quimiosmótico, 697F, 707,708T reversible elementos, 719 ACTH, 789T Actina, 25F, 36, 359, 474, 852, 978, 1258 concentración crítica, 881 contacto focal, 964 control de polimerización, 885 córtex, 849, 851 de córtex de eritrocito, 895 estructura, 881F fase lag, 881 filamentos, 131F, 843, 844, 858, 880, 965F, 1072T G, 880 globular, 880 haces contráctiles, 895 haces paralelos, 895 hidrólisis de nucleósidos trifosfato, 884 microvilli, 902 movimiento retrógrado, 889 polaridad, 880 polimerización in vitro, 880 polimerización local, 889 propiedades mecánicas, 859F proteínas de entrecruzamiento de los filamentos, 896 proteínas de unión, 894, 905F redes parecidas a geles, 895 tinción negativa, 164F trampa de ADP, 884F velocidad de nucleación, 881 y ATP, 884 y córtex celular, 890 y drogas estabilizadoras, 885 y fragmoplasto, 1009 y membrana plasmática, 850F y segmentación, 1003 y uniones adherentes, 1022 a-Actinina, 896, 897F, 902,905F, 1023,1024,1069 localización, 917F Actinomicina D, 256T Activación del complemento, 1299F del complemento, vía alternativa, 1299 del complemento vía clásica, 1299 gènica, 1137, gènica a distancia, 451F Activadas, células, 1289 Activador, 422,451 acídico, 454 Bicoid, 457FF del.plasminógeno de tipo uroquinasa, 1066 Hunchback, 457FF transcripcional, 447 transcripcional CAP, 448 Actividad del MPF y fosforilación, 948 eliminación de sinapsis dependiente, 1209 enzimàtica, 86 genómica heredable, 481 MPF, 948F proteica control, 431 proteína tirosina quinasa específica, 813 Ras regulación, 817F Activina, 823,959T, 1128F, 1130 Acumulo lisosomal, enfermedades, 659 Adaptación, 581,825 celular lenta, 825 Adaptina, 685 y proteínas transmembrana, 684 Adenil ciclasa, 788, 791,804 ciclasa, activación, 787, 790F, 808F ciclasa, inhibición, 791,808F ciclasa, tipos, 789F Adenina, 6,49, 62, 103 desaminación espontánea, 267F nicotinamida dinucleótido, 74, véase también ADP
Adenocarcinomas, 1347 Adenoma, 1346F, 1347 intestinal, 1380 S-Adenosil metionina, 262F Adenosín trifosfato, 15, véase también ATP trifosfato estructura, 49F Adenosina 5’-monofosfato, 788 Adenovirus, 296F, 398, 484 ADF, 887 Adherente unión, 1018T, 1022 Adhesión, 906 banda de, 1018T, 1022,1035 célula-célula, 537,1122 celular, 1017 celular, familias de moléculas, 1072T, 1121 celular, velocidad, 1034F celular y calcio, 1033 cinturones, 902 intercelular, 1032 intercelular independiente de calcio, 1037 intercelular moléculas, 1037 placas, 902, 1024 selectiva célula-célula, 1033,1121 Adición gènica, 349F, 350 Adipocitos, 431, 703, 1263, 1273 del tejido adiposo marrón, 728 desarrollo, 1265F y moléculas señal, 1265 ADP, 68F, 69, 74 conversión, 711 ribosa, 791 ribosilación, 791 transporte mitocondrial, 711 Adrenalina, 786, 789FT, 791, 792, 803 Aecuorina, 195F Aeróbico metabolismo, 705 Afidicolina, 952, 980 Afinidad constante, 101,1298 de un anticuerpo, 1298 maduración, 1298,1311 Aflatoxina, 1358 B„1350F Agarosa, 177F, 317 Agentes cancerígenos, 1350 cancerígenos, activación metabòlica, 1350F cancerígenos, período de incubación, 1352 cancerígenos, y retraso de la aparición, 1352F desacoplantes, 727, 728 Agrecano, 1046F, 1047, 1049T agregado, 1047F Agregación plaquetaria, 797T Agregados enzimáticos, 90 moleculares, 122 Agrina, 1064 Agrobacterias, 354F Agrupamiento, 532 Agua, 44 carácter polar, 44 enlaces de hidrógeno, 44 porcentaje del peso celular, 45T resorción, 789T tensión superficial, 44 Ala de pollo, desarrollo, 1139 Alanina, 48F Albúmina, 324,417 número de intrones, 365T tamaño del gen, 365T tamaño del mRNA, 365T Alcaloide del azafrán silvestre, 861 Alcohol oxidación biológica, 709F Alcohólicos crónicos, 1231 Aldehido, 709F activo, 150 grupos, 46 Alélica, exclusión, 1311 Alelos, 281, 1085 Alérgicas, reacciones, 674, 1296
1-1
Alfa actinas, 880 Algas genomas mitocondriales, 753 verdes, 28, 29FF verdes unicelulares, 28 Alineamiento cromosómico, 1092F Almidón, 47, 736 Alostería, 210 Alquitrán, 1355 Alta energía estado, 102 Alteración del DNA, eliminación, 263 tándem de DNA, 414 Alvéolos mamarios, 1243 Alzheimer, enfermedad, 1207 cc-Amanitina, 393 Ambigüedad de intrón, 485 Amebas, 26F, 891 gigantes movimiento, 907 pinocitosis, 663 Ameloblastos, 1273 Ames, ensayo de, 1351F Amilasa, secreción, 797T Amiloplastos, 731F Amino, grupos, 45 Aminoácidos absorción, 1021 acetilo, 74F activación, 243F adenilados, 243F carga de las cadenas, 49F desestabilizantes, 234 desestabilizantes primarios, 235 desestabilizantes secundarios, 235 desestabilizantes terciarios, 235 enlaces de hidrógeno, 117F enlaces no covalentes débiles, 117 esenciales, 76, 77F formación de polímeros, 4 i., 188T N-terminales, 234 N-terminales desestabilizantes, 235 número, 116 oxidados, 233 porcentaje del peso celular, 45T secuenciadores, 184 selenocisteína, 498 síntesis en los seres vivos, 45F y cloroplasto, 743 y tRNA, 243 Aminoacil-tRNA, 220, 243F, 244, 249-251 estructura del enlace, 244F lugar de unión, 247 sintetasa, 243F, 244, 245F, 257 Aminopeptidasa, 251 Amortiguadores, 183T AMP, 37F, 243F cíclico, 62, 197, 787FF, 791 cíclico, canales catiónicos regulados, 805 cíclico, como mediador intracelular, 787 cíclico, degradación, 788F cíclico, elementos respuesta, 792 cíclico, fosfodiesterasas, 788 cíclico, fosforilación de proteínas mediada por, 792 cíclico, fosforilación dependiente, 558 cíclico, niveles intracelulares, 787 cíclico, proteína quinasas dependientes, 791, 792F cíclico, quinasa dependiente, 215F cíclico, síntesis, 788F cíclico y calcio, 803 cíclico y Dictyostelium, 891, 892F cíclico y quinasa A, 793F Amplificación del DNA, 414 génica, 1379F por PCR, 341F Ampollas cutáneas y queratina, 859F Anabolismo, 77 Anaeróbicas fermentaciones, 71 Anafase, 984, 995 11, 1093,1097 A, 996 B, 996 Blí!, fuerzas, 998 microtúbulos cinetocóricos, 995F retraso, 996 tardía, 981F y sigs. temprana, 981F y sigs. Análisis de retraso en gel, 443,444F genético, 313 Anclaje de glucosilfosfatidilinositol, 632F farnesil, 519F miristil, 519F unión, 1018, 1021, 1022F, 1026T Andamio nuclear, 412 Anemia, 1255 de Fanconi, 1362 falciforme, 184,328
1-2
índice alfabético
Anémonas de mar, 32 Anergia clonal, 1290,1337 Anfibios, desarrollo embrionario, 35F polaridad del huevo, 1112 Antipáticas moléculas, 510 Angina de pecho, 779 Angiogénesis, 1233F control, 1234 y crecimiento tumoral, 1234 Anilina, colorantes de, 148T Anillo contráctil, 900,977,978, 1001F, 1004 de nicotinamida, 73F de subunidades proteicas, 130F deslizante y DNA, 274F Animales hibernantes, 729 matriz extracelular, 1041 pluricelulares controles de la división, 955 superiores, 34 tamaño del DNA mitocondrial, 753T transgénicos, 291, 292F, 351, 467T Aniones, transportador de, 527 Anisomicina, 256T ANP.812 Anquirina, 525 membrana, 894 Ansiedad, 576 Antena, complejo, 738 Anteras, 1196 Anteroposterior eje, 1112 Antibióticos, 255,256T Anticodón, 112,242,245 Anticuerpo(s), 189, 197, 230, 335, 417F, 1279, 1292F, 1294F, 1339 afinidad, 1298 anti-BrdU, 386,928 anti-cadherina, 1035 anti-epítopos, 349 anti-insulina, 199F anti-miosina-II, 195 anti-NGF, 1206 anti-Ras, 816 anti-SRBC, 1292 anti-tubulina, 864 cadenas ligeras, 1293,1296 cadenas pesadas, 1293 y sigs. catalíticos, 139F clases secundarias, 1313 como enzimas, 139 como sonda, 336 como sondas para la detección de moléculas, 197,198 contra MAP-2, 870 contra tau, 870 de cDNA, 319 de la leche, 668 dominios, 1303 estructura fina, 1302 Fab,1294F fagocitosis activada, 1295F generación de la diversidad, 1307 genes, 1307 humanos propiedades, 12971' inyección en una célula, 195 ligado a la membrana, 1312 lugares de unión al antígeno, 1292 monoclonales, 199-201 monoclonales homogéneos, 200F partículas recubiertas, 662 plegamiento de cadenas, 1303 producción, 1243 propiedades funcionales, 1291 región bisagra, 1292,1293F región constante, 1302 región variable, 1302 regiones hipervariables, 1303F repertorio preinmunitario, 1307 respuesta afinada, 1310 respuesta primaria, 1288F, 1295 respuesta secundaria, 1288F segmentos génicos, 1308 unión específica, 166 y colorantes fluorescentes, 153 y complemento, 1298 y ferritina, 158T Antigénico determinante, 1297 Antígeno, 177F, 198, 534, 775F, 1229F, 1252, 1279 y sigs. bivalente, 1292 celular, 148T células presentadoras, 1287F, 1327, 1328 estimulación, 489F H -2 ,1317 hipermutación somática dirigida, 1310 HLA, 1317 independiente de células T, 1332 multivalente, 1297, 1298F
propio falta de respuesta, 1289 proteico extracelular procesamiento, 1328F receptor específico, 1285 T, 602 T del SV40, 383, 602F T grande, 1378F unión, 1292 unión al anticuerpo, 1297F vírico, 1323F Antígeno-anticuerpo complejo, 1306F Antisuero, 199 ordinario, 200 Antocianos, 655 AP endonucleasa, 263-265F Aparato de translocación, 624 de translocación, poro acuoso, 624 mitótico, evolución, 1009 Apareamiento, 471 codón-anticodón, 242, 255 complementario de bases, 6, 106 complementario de nucleótidos, 6 de bases, 62,268 de bases, balanceo, 246 de bases, reconocimiento, 434F de cromosomas homólogos, 1087 de cromosomas sexuales, 1093 meiótico cromosómico, 1089 APC, 1381 Apéndice, 1280 Apertura numérica, 149,150F Apolipoproteínas B, 492 Apoptosis, 1152, 1153F, 1257, 1326 muerte celular, 1257F Aprendizaje e hipocampo, 583 memoria, 582 Arabidopsis, 339 flor, 1196F mutaciones homeóticas, 1197F mutantes, 1196F plántula, 1190F producción de mutantes, 1195F thaliana, 355,1194,1195F thaliana, embriogénesis, 1188F Arcos branquiales, 1183 ARF, 686 y revestimiento de coatómero, 686 Arginil-tRNA-proteínas, transferasa, 235 Arginina, 235 en medios de cultivo, 169T Arquebacterias, 14,22F Arrestina p, 826 ARS, 382 Arterias, 1232 corte transversal, 1231F Asa regiones, 124, 125F Asexual reproducción, 1083 Asimetría lipídica, 515 Asparagina, 630, 631F Aspartato, 212, 235 transcarbamilasa, estado relajado (R), 214 transcarbamilasa, estado tenso (T), 214 transcarbamilasa, interruptor, 213F transcarbamilasa, subunidades catalíticas, 212 transcarbamilasa, transición alostérica, 212 transcarbamilasa, transición R-T, 213F Aspártico, ácido, 76,139, 529F Aspergillus flavas oryzae, 1350F genoma mitocondrial, 759 Áster, 864,980 microtubular posición, 1002F Astral, fuerza de exclusión, 992 microtúbulo, 986 Astrocitos cultivados, filamentos gliales, 856F del sistema nervioso central, 856 Ataque de membrana complejo, 1300F Ataxia telangiectasia, 1362 Atenuación y transcripción, 484 Aterosclerosis, 665 Ateroscleróticas placas, 664 Atmósfera prebiótica, 4 terrestre, composición, 17 Átomos de hidrógeno disociación, 75 movimiento, 101 radiactivos detección, 189 ATP, 15, 36, 47, 62, 64, 67, 218, 220F, 735, 740, 743 cassette de unión, 556 como transportador de energía, 68F conversión, 711 estructura, 49F formación, 66, 75 fosfato terminal, 68 grupo transferido, 81 hidrólisis, 67, 68, 78, 79F, 81F, 141, 222F, 713 producción, 697, 710 producción en el cloroplasto, 733, 742 producción por fermentación, 744
proteínas que hidrolizan, 221 radiactivo, 192F sintasa, 76, 224, 553, 612, 697, 707, 711,717, 718F, 727-729, 742F sintasa del cloroplasto, 733 sintasa, funcionamiento reversible, 119 sintasa, mecanismo acoplador reversible, 719F sintasa, purificación, 717 sintasa y flujo de protones, 718F síntesis, 553 y actina, 884 y biosíntesis, 78 y enzimas, 141 y hexoquinasa, 209 y miosina, 223F y oxidación, 66 y oxígeno, 70 ATPasa, 548, 557T, 624 de calcio, 553 de eliminación de la cubierta, 684 de hidrógeno vacuolar, 666 de resistencia a múltiples drogas, 557T de sodio-potasa, 550F, 551 de sodio-potasio, 223, 523F, 549F, 561, 729, 895 de transporte de cationes, 557T dependiente de hidrógeno, 554 DNA dependiente, 286 estrecha, 555F transportadora de eucariotas, 555 transportadora de membrana, 555 ATPasaF0F,, 718 ATPasaF,, 718 Atracciones de van der Waals, 94, 95T AUG de iniciación, codón, 252 Autoanticuerpos de la escleroderma, 990 Autocatalítico, sistema, 5 Autocorrección del DNA, 271 Autocrina memoria, 1138 Autoensamblaje de proteínas, 133 Autofagia, 656 Autofagocitosis, 620 Autofagolisosoma, 657F Autofagosoma, 656 Autofosforilación, 803, 814 Autoinmunitaria, enfermedad, 1279, 1290 Automaduración, 403, 759 por corte y empalme, 8 Autorradiografía, 182,189-191F Autosoma, 477,1086 Autotolerancia, aprendizaje, 1290 inmunológica, 1336 Auxina, 1193 transporte, 1194 Avidez de la unión de un anticuerpo, 1298 Axila foliar, 1193 Axón,564, 581 de la retina, 1207 de la retina selectividad, 1208F de lados opuestos, 1207 desarrollo, 1199 formación en cultivo, 1204F mielinizado, 569F potencial de acción, 566F Axonemas estructura, 875 flexión, 876F Azida, 725 Azúcares, 4, 37,46, 69,176 y sigs. de cadena abierta, 46 de las glucoproteínas, orientación, 651F fosfato, 15, 106 metabolismo, 699 nucleótidos ADP-glucosa, 736 nucleótidos UDP-glucosa, 736 porcentaje del peso celular, 45T simples, 45 transportadores, 557T Azufre, 16 ciclo, 65 metabolismo, 76 oxidación, 65 Azul de Coomassie, 151,180
b-c, complejo, 722 B-DNA, 435F Babosa del moho del cieno, 891F Bacteriana, infección, 1298 Bacterianos, genomas, 387 Bacterias, 12-14, 37, 63,148T actuales, transporte de electrones, 747F ahorro energético, 729 alimentación, 14 anaeróbicas, 729, 744, 749
índice alfabético
anaeróbicas estrictas, 729 anaeróbicas, muerte, 748 ATP sintasa, 720 ATPasa de transporte, 556 cambios de fase, 469, 470 capacidad de multiplicación, 13 codones de iniciación, 252 composición, 94T concentraciones de atrayentes, 829 corrección de errores, 277 doble membrana, 556F enjambre, 28 evolución, 771 fisión binaria, 13 fotosintéticas, 593, 746 genomas, 755 jam negativas, 556F isogénicas, 301 membranas especializadas, 592F mRNA, 492 natación, 829 nichos ecológicos, 13 oxidación aeróbica, 17 patógenas y actina, 889 proteínas transportadoras, 548 púrpura, 740F púrpura fotosintéticas, 749, 764 púrpura, fotosistema derivado, 748 quimiotaxis, 827, 828F relaciones familiares, 13F síntesis proteica, 255 translocación de proteínas, 625F transporte impulsado por protones, 729F verdes del azufre, fotosíntesis, 747F verdes, fotosistema derivado, 748 zonas, 593 Bacteriófago, 5, 49,66,103, 293F, 294 lambda, 135F, 290, 291F, 339,432 lambda, proteínas ero, 438F lambda, tipo de crecimiento, 473F M13, 296F, 297 Mu, 292 R17,296F T4, 294, 296F, 296F T4, cromosoma, 297F temperado, 301 Bacteriorrodopsina, 520F, 528F, 529, 534, 553, 727F bombeo de hidrógeno, 726 como bomba de protones, 528 estructura tridimensional, 529F Balanceo, 246 BamHl, 363F Bandas 3, 524 A del músculo, 909F de adhesión, 1018T, 1022,1035 de cromosomas mitóticos, 380 de expresión de ftz, 1167F eve, 1169F ftz, 1168, 1169F G, 380, 386 germinales extendidas, 1155F I del músculo, 909F M del músculo, 909F R, 380,386 ricas en A-T, 386, 387 ricas en G-C, 386,387 Z del músculo, 913 Barajado de dominios, 129F cíe exones, 421, 422F Barril (i, 521 Bases, 49 apareamiento, 62, 268 pirimidínicas, 76,106 púricas, 76,106 Basófilos, 1273,1296 Bastón, 806F, 1225, 1226F respuesta a la luz, 807F Bazo, 1280, 1283 formación de colonias, 1249F BDNF, 959T Benzopireno, 265, 1355 Beta actinas, 880 Betaglicano, 1048,1049T BFC-E,1252 Bicapa, 511 lipídica, 48, 132.359F, 510 lipídica, asimetría, 514 lipídica, biosíntesis, 634F lipídica, composición, 513 lipídica de membrana ensamblaje, 633 lipídica, fluidez, 513 lipídica, hidrofobicidad, 541 lipídica libre de proteínas, impermeabilidad, 542 lipídica sintética, 511, 512F, 543F lipídica sintética, permeabilidad relativa, 542F
f
Bicarbonato, 82F Bicoid, proteínas reguladoras, 436T Biológica, diversidad, 423 Biosíntesis, creación de orden, 77 y ATP, 78 y poder reductor, 82 Biotina, 80, 82F, 137 en medios de cultivo, 169T grupo transferido, 81 BiP, 630 proteínas, 645 Bipartición simple renovación, 1227 Blastocele, 1114 Blastocisto, 1132 Blastodermo celular, 1156 sincitial, 1155F, 1156 y segmentos de Drosophila, 1156F Blastómeros, 1035,1113 cohesión, 1127 de Xenopus diferencias, 1126 vegetativos dorsales, 1128, 1129 vegetativos ventrales, 1129 Blastoporo, 1115 labio dorsal, 1116,1117F Blástula, 1114F de Xenopus, 1131 estructura, 1114 Bloom, síndrome de, 264F, 1362 Bloqueo de la re-replicación, 388F, 941,942F primario de poliespermia, 1105 secundario de poliespermia, 1105 BMP, 959T, 1264 Bola y cadena modelo, 572F Bolsa de Fabricio, 1281, 1282 Bomba de calcio, 551, 684, 795 de hidrógeno, 679F, 697 de iones, 36 de péptidos, 557T de protones, 528, 697 de sodio-potasa, 548 de sodio-potasio paro, 561 electrogénica, 550 iónica, 523F Bombeo de hidrógeno, 725 de hidrógeno y cadenas respiratorias, 720 de protones, 727F Botella, células, 1117 BPTI, 124 estructura tridimensional, 123F BPTL, 122 BrDU, 928 Brefeldina y proteínas de Golgi, 645,646F Bromodeoxiuridina, 928 Bromuro de cianógeno, 183,184T de etidio, 318 Brote, 1188 ápice, 1193F Bsl, elementos, 419T Bucle de DNA en Escherichia coli, 461 de retroalimentación, 474F de retroalimentación positiva, 473, 474 Bulbo olfativo, 1199F Bungarotoxina, 574 Bunyavirus, 301 Burbuja de replicación, 277,383 Burkitt, linfoma de, 1376T
Cl, estructura, 1300F C3, estructura, 1299 C3a, estructura, 1300 C3b, estructura, 1300 Cabello, difracción de rayos X, 119 Cabezas de miosina, 912, 914F de miosina, desplazamiento, 913 de miosina muscular, 914F del espermatozoide, 1100 Cadenas a de las proteínas G, 788 P de la hemoglobina, 416 P de las proteínas G, 789 alquilo ae ácidos grasos, 615 cebadoras, 264F, 271 conductoras, 270 de glucosaminoglucano, 649 de poli-A, 396 de transporte electrónico, 75, 698, 723F hidrocarbonadas, 513F invariables, 1327 1,1295 laterales proteicas interacciones, 136 ligeras, 1293 y sigs. ligeras d, 1296,1312 ligeras de anticuerpos, 1311
1-3
ligeras k, 1296,1309F, 1312 ligeras reguladoras, 223F patrón, 264F pesadas, 1293ysigs. pesadas en el ratón, segmentos génicos, 1309F poli-A, 488 polipeptídicas, asa extendida, 231 polipeptídicas, elongación, 247 polipeptídicas, gráficos de hidropatía, 520F polipeptídicas, hélice a, 520F, 521 polipeptídicas, posibles, 125 polipeptídicas translocadas, ensamblaje, 629 polipeptídicas translocadas, plegamiento, 629 polipeptídicas y BiP, 630 polipeptídicas y membrana del retículo endoplasmático, 624 respiratorias, 702, 705, 707F, 717 respiratorias, energía almacenada, 710 respiratorias mitocondriales, 729, 750 respiratorias mitocondriales de la membrana, 707FT respiratorias, transportadores electrónicos, 709, 720 respiratorias y bombeo de hidrógeno, 720 respiratorias y potencial redox, 726F retrasadas, 270,272F, 391F transportadoras de electrones tipos, 750F Cadherina, 1022, 1034,1035F, 1041,1072T dependiente de calcio, 1205 desmosomal, 1072T E, 1035, 1036, 1360 en células adyacentes, 1026T N , 1035 P, 1035 y calcio, 1035 Caenorhabditis elegans, 337, 339 elegans, análisis de linaje, 1144 elegans, autofecundación, 1144 elegans, células de la línea germinal, 1145 elegans, desarrollo invariable, 1144 elegans, fenotipo multivulva, 1147 elegans, fenotipo sin vulva, 1147 elegans, genes de la vulva, 1147 elegans, genética del desarrollo, 1143 elegans, inducción de la vulva, 1151F elegans, microtúbulos, 861 elegans, progenie homozigótica, 1144 Cafeína, 952, 953F Caja TATA, 453F Calcineurina y calcio, 793 Calcio, 776 activación por láser, 197 adhesión intercelular independiente, 1037 canales de liberación, 915 como mediador intracelular, 787 como mensajero intracelular ubicuo, 795 como señal intracelular, 794 concentraciones extracelulares, 551 entrada en el citosol, 796F libre, concentración, 195F libre en el citosol, 546, 795F metabolismo, 780 oscilaciones, 799 secuestro del citosol, 620 transporte mitocondrial, 711 y adhesión celular, 1033 yAMP cíclico, 803 y calcineurina, 793 y concentración muscular, 916 y gelsolina, 897 y músculo liso, 919F ypectinas, 1075 y pérdida de la cubierta, 684 y queratinocitos, 1241 y reacción acrosómica, 1104 y reacción cortical del oocito, 1105 y uniones gap, 1029F Calcio-calmoduíina, 811 Callo, 355 Calmodulina, 789F, 801,810 activación alostérica, 802 como receptor intracelular de calcio, 801 Calor, 75 máquinas generadoras, 728 y desorden, 63 CAM, 1034 CaM quinasa II, 811 Cambio de clase recombinación, 1314 de clase y reordenación del DNA, 1314F de proteínas isoformas, 1261 epigenético heredable, 1349 Caminar por el cromosoma, 337, 338, 339 cAMP como mediador intracelular, 787 Canales catiónicos regulados por acetilcolina, 583T catiónicos regulados por AMP cíclico, 805 catiónicos regulados por glutamato, 583T
1-4
índice alfabético
catiónicos regulados por serotonina, 583T catiónicos regulados por transmisor, 574 catiónicos regulados por voltaje, 570, 571,576, 583T de calcio, 674,811 de calcio, activación, 808F de calcio, inhibición, 808F de calcio regulados por voltaje, 570, 581, 582 de cloro, 558 de cloro apertura, 573 de cloro regulados por GABA, 583T de cloro regulados por glicina, 583T de fuga de potasio, 560, 561 de gramicidina, 546F de liberación de calcio, 577, 915 de potasio, 571F, 791 de potasio, activación, 808F de potasio, activados por calcio, 581 de potasio, activados retardados, 580 de potasio, regulados por voltaje, 567,583T de potasio retardados, 567, 581 de potasio tempranos, 580,581 de sodio, 577, 806 de sodio, ley del todo o nada, 567 de sodio regulados por voltaje, 564F, 565, 570, 583T formadores, 545 inactivación, 571 inactivación automática, 565 iónicos, 22, 36, 175T, 193, 558, 559, 782 iónicos, familias, 583T iónicos regulados, 560F, 577 iónicos regulados por nucleótidos, 805 iónicos regulados por transmisor, 572, 57 5, 576, 583T, 782 iónicos regulados por voltaje, 565 iónicos selectividad, 193F, 559 iónicos y proteínas G triméricas, 804 liberadores de calcio, 798 liberadores de calcio sensibles a IP3, 797 proteicos, 193 proteínas, 541, 558 receptores asociados, 782 receptores de NMDA, 582 regulados mecánicamente, 560 regulados por ion, 560 regulados por ligando, 560 regulados por nucleótido, 560 regulados por transmisor, 560 regulados por voltaje, 560,573 y calcio, 492 y desfosforilación, 560 y fosforilación, 560 Canalículos hepáticos, 1229 Cáncer, 303, 329, 352, 414, 422, 557, 771, 822, 862, 953, 963,970, véase también Carcinoma causas ambientales, 1356 curación, 1358 de cavidad oral, incidencias, 1357T de cavidad oral y faringe, 1347T de células del sistema nerviosos, 1347 de colon, 1352F de colon, incidencia, 1357T de colon y recto, 1347T, 1353,1379 de colon y recto hereditario no polipoide, 1383 de colon y recto, mutación, 1381 de cuello uterino, 1347T, 1353,1359, 1377F de cuello uterino, desarrollo, 1353F de cuello uterino, incidencia, 1357T de endometrio, 1347T de esófago, incidencia, 1357T de estómago, 1347T de estómago, incidencia, 1357T de hígado, 1350F, 1376T, 1377 de hígado, incidencia, 1357T de hígado y sistema biliar, 1347T de la infancia, 1358 de labio, incidencias, 1357T de laringe, incidencia, 1357T de los linfocitos B, 1376T de mama, 1347T de mama, incidencia, 1357T de mama y hormonas reproductoras, 1358 de mama y parto, 1358F de órganos digestivos, 1347T de órgaños urinarios, 1347T de ovario, 1347T de ovario, incidencia, 1357T de páncreas, 1347T de páncreas, incidencia, 1357T de piel, 266,855,1347T, 1355,1362 de próstata, 1347T de próstata, incidencia, 1357T de pulmón, 1347T, 1352 de pulmón, incidencia, 1357T de recto, incidencia, 1357T
de riñón, incidencia, 1357T de testículo incidencias, 1357T de tracto reproductor, 1347T de útero, 1347T de útero, incidencia, 1357T de vejiga, 1347T de vejiga incidencia, 1357T del sistema respiratorio, 1347T evolución, 1352 factores estimulantes, 1355 familias propensas, 1381 genética molecular, 1365 humano, virus asociados, 1376T microevolución, 1345 nasofaríngeo incidencia, 1357T número de mutaciones, 1350 predisposición hereditaria, 1373 tipos, 1347T trasplantable, 1134 y cambio epigenético, 1349 y edad, 1351, 1352F y genes de control de la proliferación, 966F y poblaciones de emigrantes, 1357 y proteínas víricas, 301 y secuencias de DNA de una célula, 1349 y selección natural, 260 y tipo celular, 1346 Cancerígenos químicos, 1349 CAP, 130F, 435F, 436T-448, 449F y ligando, 136F Capa epitelial, evolución, 32 epitelial, función, 32 germinal, 1118 pigmentada de la retina, 1221 pluricelular, 32 Capacidad de división herencia, 970F mutagénica, 1351F Capacitación, 1104 Caperuza 5,395,397,492,493 agrupamiento, 532F formación, 532F Capilares, 1232 factor de crecimiento, 1234 formación in vitro, 1234F lesión, 1234F proliferación, 1233 sección transversal, 1232F Capping, 532 Cápsides, 132,294, 295F proteínas, 498 Capucha 5,252 Caracteres biológicos herencia, 102 Caras de fractura, 528 /V- Carbamilaspartato, 212 Carbamilfosfato, 212 Carbohidratos, metabolismo, 1229 síntesis, 698 Carbono, ciclo, 64F ciclo de fijación, 735 compuestos, 43 dióxido, 65 electrones, 44 enlaces covalentes, 44 fijación, 64, 734 monóxido de, 779 Carboxilo, grupo, 45, 82F transferencia, 82F Carboximetilcelulosa, 177F Carcinogénesis y mutagénesis, 1349 Carcinoma, 855,1346,1347T, 1368T, véase también Cáncer cervical, 1353F cervical humano, 171T colon-rectal secuencia, 1383F de células basales, 1348 de cuello uterino, 1376T de nasofaringe, 1376T de Paget, 1363F de próstata, 1346F hepatocelular, 1376T Cardíacas, células, 1221 Cardiolipina, 700, 762 Cariocarcinoma, 1358 Cariotipo, 380 humano, bandas de cromosomas, 381F Carotenoides, 738 Carpelos, 1196 Carriers, 543 Cartílago, 1119,1264 crecimiento, 1266F Cascada catalítica de mediadores intracelulares, 807 catalítica inducida por la luz amplificada, 808F catalítica inducida por ligando, 809F de fosforilación, 784 de fosforilación en serinas/treoninas, 818-820F
de señales intracelulares y factor de crecimiento, 967 del complemento, 1301 proteolítica, 1299 Casquete de GTP de microtúbulos, 868 Cassettes de unión al ATP, 556 génicas, 470 mecanismo, 472 silenciosas, 472 Catabolismo, 73F, 77 etapas, 70F oxidativo, 73 y biosíntesis, 86 Catalasa, 101, 614 número de intrones, 365T tamaño del gen, 365T tamaño del mRNA, 365T Catálisis àcida, 140F básica, 140F enzimàtica, 67F, 137 Catalizador, 66 autogeneración, 5 biológico, 44 primitivo, 81 Catecolaminas, 803 Catenina, 1023, 1036 P, 1381 Caucho,122 Caveolina, 680F CD4, correceptor, 1322 CD8, correceptor, 1322 CDC2 gen, 954T cdc2 gen, 954T Cdc2 subunidades, 937F CDC9 gen, 954T cdc 10 gen, 954T cdc 13 gen, 954T cdc 17 gen, 954T cdc25 gen, 954T CDC28 gen, 954T Cdk, 217F activación, 218F estructura tridimensional, 217F, 218 y ciclinas, 932F cDNA, 333F, 334, 343 clon, 319, 334F librería, 335 síntesis, 333F Cebadores de RNA, 272 de RNA, síntesis, 272F Celentéreos, 32 Celenterón, 32 Celular 3T3, línea, 965F adhesión, 1017 córtex, 849 determinación, 476 diferenciación, 429,476, 1136 entorno, 1221 memoria, 469,476,1135 poder reductor, 746 teoría, 147,148T unión, 1017,1018 Celular-I enfermedad, 660 Célula(s), 15 p del páncreas, 672F P desarrollo, 1282F 3T3, 1372 3T3 de ratón, 1265,1369 3T3 y células adiposas, 1265 acinares, 1272 activadas, 1289 adiposas, 1265 adiposas y células 3T3,1265 aisladas, 166 análisis termodinàmico, 63 ancestrales comunes, 3 animales en cultivo, anclaje, 964 animales, migración, 906 animales, número, 107 animales, potencial de membrana, 560 animales, tamaño, 147 asesinas, 1245,1273 asesinas, concentración, 1246T asesinas, función, 1246T autodestrucción, 776 B, 1281,1321 B, activación por células T, 1332 B activadas, 1292 B, cambio de anticuerpo producido, 1313 B, cambio de clase, 1313 B con memoria, 1291 B, concentración, 1246T B, desarrollo, 1307,1311F B, función, 1246T B, monoespecificidad, 1311 B, receptores, 1291
índice alfabético
B, receptores del antígeno, 1329F B, señales de activación, 1333F B virgen, 1295,1313 B y células T colaboradoras, 1331 B y DNA, 1308F bacterianas, 1F basales, 1240 basales de la epidermis, 1272 basales del epitelio olfativo, 1237 basales del lecho ungueal, 1272 basales, integrinas, 1241 basales, mitosis, 1239 basales, regulación de la proliferación, 1241 caliciformes del intestino delgado, 644F cancerosas, 169 cancerosas, amplificación génica, 1364F cancerosas, núcleo, 1363F cardíacas, 1221,1258 cartilaginosas, 1264 cebadas, 674, 1273 ciliadas, 1273 ciliadas del conducto auditivo externo, 1222 ciliadas del oído, 1223F clasificador, 167F cohesión, 32 con memoria en el centro activado, 1311 contráctiles, 1273 control del tamaño, 945 cooperación, 29 crecimiento discreto, 929 cultivadas con genes humanos, 171T cultivadas de roedores, 957 de almacenamiento, 1273 de anclaje, 1146 de anclaje, expresión de lin-3,1150F de anclaje, posición, 1147 de Boettcher, 1273 de Clara, 1272 de Claudius, 1273 de conducción binocular, 1211 de Golgi, 643F de Hensen, 1274 de Kupffer, 1229F, 1231 de la sangre, 1273 de Langerhans, 1238F, 1273 de las extremidades, valores posicionales, 1140 de las uñas de manos y pies, 1272 de levadura en crecimiento, 2F de Leydig, 619F de los epitelios de barrera estratificada, 1272 de mamífero, P oxidación, 615 de mamífero, composición, 94T de mamífero en cultivo, 957F de mamífero, fosfolípidos, 515F de mamífero, genes del ciclo celular, 956 de mamífero, punto de control G,, 960 de mamífero, regulación del crecimiento, 957 de mamífero y factor de crecimiento, 957 de memoria, 1289 de Merkel, 1238F de organismos pluricelulares, cooperación, 1346 de Paneth, 1272 de Purkinje, 195F de Schwann, 36,567,569F, 972,1060, 1119, 1206F, 1219, 1274 de secreción de hormonas, 1272 de secreción de matriz extracelular, 1273 de Sertoli, 1274 de somitos, especialización, 1136 de sostén, 1274 de tejido básico vegetal, 1188 de tejido vascular vegetal, 1188 de vertebrados división, 479 definición, 3 del cristalino, 1222, 1274 del cuerpo humano adulto, 1271 del embrión animal temprano, clasificación, 1121F
del embrión animal temprano, totipotencia, 1133 del embrión, uniones gap, 1028 del estroma, 1312 del mesófilo, 736 del sistema inmunitario, 1273 del tejido conjuntivo, 1222,1262 dendríticas con interdigitaciones, 1287F, 1328 dendríticas foliculares, 1287F desnutrición, 960 determinadas, 1136,1137 diana, 772, 851, 1315 diana, adaptación, 825 diana, autodestrucción, 1325 diana y células T citotóxicas, 1326F diferenciadas, 1219 diferenciadas memoria, 1221
diferenciadas terminales, 1250 diploides, 1083,1084F división, 977 división asimétrica, 1002 efectoras, 1282 eléctricas, 572 en botella, 1117 en cultivo, 168F en fase M, huso mitótico, 986 en medios de cultivo, 1221 en mitosis y células en interfase, 936F endocrinas, 774 endoteliales, 536,537F, 779,856,1219,1232, 1233, 1253T, 1273 endoteliales, bipartición, 1232 endoteliales de los vasos sanguíneos, 1068, 1231 epidérmicas, 1221,1253T epidérmicas en diferenciación, 1239 epidérmicas, índice de mantenimiento, 1241 epidérmicas, índice de producción, 1241 epidérmicas, origen, 1181 epidérmicas vegetales, 1188 epiteliales, 168,533F epiteliales, compartimientos endosomales, 669 epiteliales de absorción intestinal, 1273 epiteliales de cavidades internas, 1273 epiteliales de secreción exocrina, 1272 epiteliales del intestino, división, 960 epiteliales, filamentos de queratina, 854 epiteliales, membrana plasmática, 516 epiteliales polarizadas, endocitosis, 669 epiteliales, queratina, 855 epiteliales, queratinizadas, 1271, 1272 eritroblásticas, 465,466 errores, 102 ES, 353, 1134F escamosas, 1273 escamosas queratinizadas, 1240 especialización, 29, 469 especificadas regionalmente, 1139 espinosas, 1238F, 1239 estado de no-crecimiento, 960 estado de reposo G0, 960 eucariotas, 12 eucariotas ancestrales, 21 eucariotas anaeróbicas y mitocondrias, 23 eucariotas, área de membrana, 593 eucariotas, compartimientos, 593F eucariotas, evolución, 843 eucariotas, orgánulos, 20 eucariotas, origen simbiótico, 20 eucariotas, proteína fosfatasas, 215 eucariotas, proteína quinasas, 215 eucariotas, proteínas Rab, 688 eucariotas, señalización, 220F eucariotas sin mitocondrias, 21 eucariotas, transición alostérica, 214 eucariotas y miosina, 898 evolución, 3-41 fagocíticas, 661,1244, 1295 foliculares, 1095, 1099 foliculares del ovario, 1098 formadoras de colonias, 1249 formadoras de colonias de eritrocitos, 1252 formadoras rápidas de eritrocitos, 1252 fotorreceptoras de la retina, 1224 fraccionamiento, 172-187 G0, 962 ganglionares de la retina, 1224 generación de orden, 63 germinales, 1083, 1084, 1255, 1274 germinales, estabilidad, 260 germinales primordiales, 1094, 1162 gliales, 567,858, 1201, 1274 gliales radiales, 1201F, 1202F ranulares, 1238F aploides, 1083, 1084F hematopoyéticas, 1247 hematopoyéticas, comportamiento, 1255 hepáticas, 90, 591T, 592F, 1221 hepáticas, cultivo, 171T hepáticas, división, 960 hepáticas e hidrocortisona, 1222 hepáticas, mitocondrias, 700 hepáticas, oscilación de calcio, 799F hepáticas, pérdida, 1230 hepáticas, proliferación, 1230 híbridas, 170 híbridas, producción, 170F hijas distintas, 1005 hijas epidérmicas destino, 1240 imagínales, 1175 intestinales, 547 L, 1036 liberación de calor, 63
1-5
madre, 1227,1236 madre de la musculatura esquelética, 1262 madre de teratocarcinoma, 1134F madre, definición, 1237F madre, determinación, 1237 madre, diferenciación, 1237 madre, división, 1237 madre embrionarias, 353, 1134 madre embrionarias y señales del entorno, 1133 madre epidérmicas, 1237,1238, 1240 madre hematopoyéticas, 1243, 1247, 1253T madre hematopoyéticas pluripotenciales, 1282 madre hematopoyéticas y factor Steel, 1255 madre inmortales, 1240F madre pluripotenciales, 1243,1249-1251F madre, propiedades, 1237 madre sensoriales del ala del disco imaginal, 1180F membrana, 509F memoria, 387 mesenquimáticas, 1263 mieloides, 1245 migratorias, 850F migratorias en tejidos del embrión, 1122 migratorias, interacciones, 1123 mioepiteliales, 917, 1242F, 1258, 1259,1273 modulación del estado diferenciado, 1221 mononucleadas por segmentación citoplasmática, 1001 mucosas, 1272 muerte ordenada en el desarrollo, 1152 musculares, 36, 1120 musculares cardíacas, 1224,1258, 1259 musculares clases, 1259F musculares esqueléticas, 1258,1259 musculares esqueléticas plurinucleadas, 1260 musculares lisas, 1259 mutantes, condición permisiva, 946 mutantes, condición restrictiva, 946 mutantes condicionales, 946 mutantes y cáncer, 1350 nerviosas, 33,36F, 168, 548, 563, 774F, 1219, 1224 nerviosas, canales iónicos, 542, 560 nerviosas, compartimentación, 871F nerviosas, conexiones, 1199F nerviosas, diferenciación, 871 nerviosas e iones orgánicos, 33 nerviosas, evolución, 33 nerviosas, permanencia, 1222 nerviosas, polarización, 677 nerviosas, regeneración de axones, 1224 nerviosas tumorales, cultivo, 171T nerviosas y citocalasina, 885F neurales madre, 1201 neurales, moléculas de adhesión, 1037 NIH 3T3, 1369 NK, 1245, 1251F NK, concentración, 1246T NK, función, 1246T no permisivas, 301 no polarizadas, transporte vesicular, 685F nodriza, 1098, 1274 olfativas, 1120 oocitos, reservas nutrivitas, 1094 permanentes, 1222 permisivas, 301 pigmentarias, 1221, 1255,1274 pigmentarias de la retina, 1221 pigmentarias de peces, 847F plasmáticas, 1283 pluripotenciales, 1237 polares, 1156 polarizadas, 675, 677F poliploides, 373 postsinápticas, 572 postsinápticas excitabilidad, 782 postsinápticas y cambios a largo plazo, 583 pre-B, 1294 precursoras de músculo, 1137 precursoras sanguíneas, 1122 presentadoras de antígeno, 1286, 1287F, 1292, 1327, 1328 presinápticas, 572 procariotas, 12-14 progenitoras de granulocitos y macrófagos, 1253 progenitoras determinadas, 1250, 1251F progenitoras GM, 1253, 1253T proneurales, 1180 PtK, 936F PtK cinetocoros, 989F PtK2, 852F quiescentes G0, 962 reacciones inmunitarias mediadas por, 1315
-6
índice alfabético
renales, 547, 555,1253T sanguíneas, 1221, 1236, 1244F, 1246T, 1273 sanguíneas de la línea blanca, 856 sanguíneas, diferenciación, 1250 sanguíneas, formación, 1243 sanguíneas y médula ósea, 1246 satélite, 1261F, 1262 satélite musculares, 1237 secretoras de colágena, 1054 secretoras de insulina, 199F secretoras de la piel, 1242 secretoras del páncreas, 1118 secretoras esteroideas, 619F senescencia, 969 sensoriales madre, 1179 separación, 166 serosas, 1272,1273 sinoviales, 1273 sistema libre de, 174 somáticas, 1084, 1162 somáticas especialización, 36 somáticas estabilidad, 260 superiores compartimentación, 589 T, 1281 y sigs. T, activación, 1326 T, antígeno independiente, 1332 T autorreactivas, 1336 T, cadenas a, 1315 T, cadenas p, 1315 T citotóxicas, 1282, 1315, 1316, 1320, 1323, 1324, 1332 T citotóxicas, polarización, 851F T citotóxicas y células diana, 1326F T citotóxicas y proteínas víricas, 1325F T citotóxicas y virus de la gripe, 1324 T colaboradoras, 1282,1291,1313, 1315, 1316, 1326 T colaboradoras, activación, 1329, 1330F T colaboradoras, proliferación, 1331 T colaboradoras, señales de activación, 1333F T colaboradoras y células B, 1331 T colaboradoras y proteínas antigénicas, 1327 T, concentración, 1246T T, correceptores, 1322 T, desarrollo, 1282F T en desarrollo, eliminación, 1336 T, estimulación, 1331F T, función, 1246T T, hipermutación somática, 1315 T, leucemia, 1376T T, receptor heterodímero, 1315F T, receptores, 1315, 1329 T, receptores accesorios, 1322 T, receptores del antígeno, 1329F T, selección del repertorio, 1335 T transgénicas, 1336 T transgénicas, maduración, 1336 tectales, 1208 T h1, 1316, 1333 T,,2, 1316, 1333 tolerantes, 1330 totipotentes, 1094 transfectadas, 332,333 transformadas, 1366,1367 transmisión, 771 tumorales, 171T túnico-vasculares, 736, 737 unipotenciales, 1237 vecinas y factores de crecimiento, 963 vegetales, citocinesis, 1007F vegetales, división asimétrica, 1003 vegetales en división, 1007F vegetales, fases de desarrollo, 1190 vegetales, mitosis, 984F vegetales, presión de turgencia, 654 vegetales, red cortical de microtúbulos, 1077F vegetales superiores, citocinesis, 1008F vegetales superiores, mitosis, 1008F vegetales, tamaño, 655F vegetales, telofase, 1007F zimógenas, 1272 Células-células, uniones, 1018 uniones adherentes, 1023,1026T Células-matriz, uniones adherentes, 1023,1026T Celulosa, 47, 1074 fibrillas, 1191 microfibrillas, 1074 orientación y microtúbulos, 1191 sintasa, 1076, 1078 Cementoblastos, 1273 Centrifugación, 166 en gradiente de densidad, 175T en solución salina, 173 Centríolos, 846F, 874, 877, 979 duplicación, 878 hijos, 878
replicación, 878F, 979F Centro celular, 643 de hierro-azufre, 721 de hierro-azufre, estructura, 722F de inactivación, 478 de reacción fotoquímico, 738, 739 de reacción fotosintético bacteriano, 531 embrionario de señales, 1117 fibrilar, 409 germinal, 1311 germinativo de los folículos linfoides, 1287F organizador de microtúbulos, 866F, 978 Centrómeros, 361,362F, 378, 988F, 988 Centrosoma, 592, 643, 844, 845, 864, 980F con microtúbulos, 846F duplicación, 929,978 matriz, 865, 866F reorientación, 851 y nucleación de microtúbulos, 864 Ceramida, 634 Ceras de inclusión, 151 Cerebro, 1200 y ojo conexión, 1207F a-Cetoglutarato, 75 Cetona grupos, 46 CFC, 1249, 1251F CFC-F,1252 CFU, 1249 Chaperona hsp70, 610 molecular, 227,228F Chaperoninas, 610, 618 Chatarra genética, 400 Chlamydomonas, 28 flagelos, 876 genoma mitocondrial, 758 tamaño del DNA de cloroplastos, 753T tamaño del DNA mitocondrial, 753T Chondromyces crocatus, 29F Choque térmico, 493 Cianobacterias, 16,22F, 29, 73, 730, 748 fijación de nitrógeno, 16, 17 y cloroplastos, 22 Cianuro, 725 de hidrógeno, 4 Ciclinas, 217, 218 A, 957 acumulación, 937 B, 939, 948 Cdc2,948 concentración celular, 957 destrucción, 937 E, 957 G, 932, 1378 G„ 939, 950, 954T, 962 G[ y control del inicio, 951 G, y proteínas Cdc2, 949 mitóticas, 932, 937, 940, 948, 954T proteolisis, 977 proteolisis dirigida, 218 y Cdk, 932F y embriones tempranos, 938F y gen cdc, 948F y proteínas Cdk, 957F, 968 Ciclo celular, controles por retroalimentación, 952, 954, 955F celular de embriones tempranos, 928F, 933 celular dependendiente de señales inhibidoras, 954 celular, duración, 926 celular en la fase M, 493 celular, factor de retraso, 931 celular, puntos de control, 944 celular, puntos de control de tamaño, 944 celular, sistema de control, 940, 943 celular, sistema de control central, 929, 930 celular típico, 927 celular y deprivación de suero, 962F de división, 925 de división, genes, 946 de división mutaciones, 945 de eIF-2,494F de Krebs, 73, 705 y sigs. de la urea, 762 de los ácidos tricarboxílicos, 73, 705 y sigs. de oxidación de los ácidos, 704F del ácido cítrico, 73F, 74, 84F, 90, 702, 705 y sigs. del carbono, 64F del centrosoma, 979F del glioxilato, 616 del nitrógeno, 76 endocítico-exocítico, 663 Q, 727 sincronismo, 874 vital sexual, 1084F Cicloheximida, 256T, 962
Ciclooxigenasa, 775F Ciliados, 25, 26FF Cilios, 874 batido, 875F, 879F brazada, 875F crecimiento, 877 movimientos, 874 movimientos de recuperación, 875F primarios, 879 y flagelos, 25 Cin4, elementos, 419T Cinética enzimàtica, 138F Cinetocóricos microtúbulos, 986 Cinetocoro, 988F, 990 y cromátidas hijas, 992 Cinturones de adhesión, 902 Cirrosis, 1231 Cirugía y cáncer, 1358 Cisteína, 118F en medios de cultivo, 169T residuos, 630 Cisternas de Golgi, 590, 643 de Golgi, compartimientos de procesamiento, 647 Cistina, piedras de, 543 Cistinuria, 543 Citidín bisfosfocolina, 633F Citocalasina, 1070,1265 D ,1005 y células nerviosas, 885F Citocinesis, 926, 926F, 930F, 977, 978, 1001, 1005F de células vegetales, 1007FF Citocromo, 137, 720, 739 aa3, 722 brl(i2 dominios, 125F c, 721, 725 c, estructura, 7 2 1F c, evolución, 259F , 260T c, genes, 319 c humano, 261 oxidasa, 608F, 723, 725, 749, 762 oxidasa complejo, 722 oxidasa reacción del oxígeno, 724F P-450 oxidasas, 1350 Citoesqueleto, 25, 36, 197, 359, 524, 843 célula T citotóxica, 851F conexiones, 1021 de Dictyostelium, 891 de espectrina, 526F de los microvilli, 903 e integrinas, 1069 en fase M, 978F funciones, 851 naturaleza, 844 tipos de filamentos proteicos, 845F y adhesión celular, 1040F y membrana, 894 y plano de división, 1007 Citofluorímetro de flujo separador, 929F Citoplasma, 20, 590 Citoplasmàtica corriente, 897 memoria, 1138 Citopoyetinas, 1252 Citoqueratinas, 855 Citoquímica fluorescente análoga, 195, 196F Citoquinas, 820,1253T, 1283, 1316 Citoquininas, 1194 Citosín trifosfato, 212 Citosina, 6,49,62, 103 desaminación espontánea, 267F Citosol, 24, 590F, 591T concentración de hierro libre, 494F degradación de proteínas, 232 Cítrico ácido, 74, 76, 705 Clases secundarias de anticuerpos, 1313 Clasificador celular activado por fluorescencia, 166 de células, 167F Clatrina, 665, 680 depresión revestida, 663 vesículas revestidas, 663 CLB 1,2,3,4 gen, 954T CLN 1,2,3 gen, 954T Clon de cDNA, 334F, 444 de células, 171T de células mutantes marcadas genéticamente, 1177F de células T, 1331 de DNA genómico, 326, 333 genómico, 334F hibridómico, 200 Clonaje celular, 170 de cdc2,947 de DNA, 314-316 331 de DNA en una bacteria, 332F de expresión, 786 de homología, 786
índice alfabético
posicional, 339F, 340 posicional de DNA, 340 seriado de DNA, 343F Cloranfenicol, 256T, 752 acetil transferasa, 346F Cloro, oxidación, 65 reducción, 65 Clorofila, 16, 733, 737 estructura, 737F excitación, 738F y dador fuerte de electrones, 739 Cloroplastos, 20F-22, 175T, 590, 697, 730, 732F, 734F ácido graso, 762 biosíntesis, 751 biosíntesis de proteínas, 752F como simbiontes, 22 compartimientos, 607F de hepáticas, genomas, 756F división, 752 DNA, 698, 753T, 754 estomas, 733 evolución, 749F, 762 genomas, 319, 751, 755 glucolípidos, 762 matriz, 613 membrana tilacoidal, 553 membranas internas, 517, 743 origen, 594F paterno masculino, 761 péptidos señal amino terminales, 613 proceso biosintético, 743 producción de ATP, 742 proteínas específicas de tejido, 762 reacciones, 733 RNA, 252 síntesis proteica, 755 transporte de proteínas, 607,612 y ácido graso, 743, 762 y aminoácidos, 743 y cianobacterias, 22 Cloroquina, resistencia, 557T Cloruro de cesio, 175T CM-celulosa, 177F CMP-N-ácido acetilneuramínico, 648F Coágulo linfático, 171T sanguíneo, 1071 Coatómero, 685 Codificación del PSP principal, 580F Código de reconocimiento del DNA, 434F genético, 10, 36, 111F, 174, 175T, 185, 244, 246F, 361 genético, degeneración, 111, 245, 246 genético universal mitocondrial, 757T Codón, 111,242, 245, 361 AUG, 492 AUG de iniciación, 252,257 de iniciación, 250-252 de iniciación en bacterias, 252 de terminación, 245,246,249, 319,321F Codón-anticodón, apareamiento, 242, 255 Coeficiente de sedimentación, 173 Coensamblaje a lo largo de un núcleo, 134F Coenzimas, 80,136,137F, 721 A grupo transferido, 81 origen, 81 Cofia radicular, 1191F Co-heredabilidad, 327 Coiled-coil, 132 Cola del espermatozoide, 1100 del espermatozoide, fibra densa externa, 1100 del espermatozoide, porción media, 1100 hidrocarbonada, 513 poli-A, 396, 397, 495, 496F poli-A, control de longitud, 497F transmembrana carboxilo terminal, 632 Colaboración oncogénica, 1373 Colágena, 120,128,134,166,168,417, 1042, 1048, 1065, 1263 asociada a fibrillas, 1050 cadenas a, 1049 estructura molecular, 1049 evolución, 513 fibrilar, 1050 formadora de redes, 1050 mutaciones, 1052 organización, 1051 secreción, 1051 solapamiento molecular, 1053F tipo I, 1265 tipo II, 1264 tipo IV, 1060 tipo IV red laminar, 1059, 1060F tipo VII, 1062 tipo IX, 1054, 1054F tipo XII, 1054
tipos, 1050T unión específica, 166 y elastina, comparación, 121F Colagenasa, 166, 1065 de tipo IV, 1361 Colcemida, 861, 864 y microtúbulos, 865F Colchicina, 861, 885, 996 estructura química, 863F y microtúbulos, 994 y tubulina, 994 Cólera, 148T, 791 diarrea debilitante, 517 Colesterol, 84F, 780 en bicapa lipidica, 514F en sangre niveles, 665 estructura, 513F formación, 82F importación celular, 664 libre, 665 y endocitosis mediada por receptor, 664 Colina, 48 axónica, 580 en medios de cultivo, 169T Colon, pólipo adenomatoso, 1380F Colon-rectal, cáncer, 1379 Colonias bacterianas con clon de cDNA, 336F celulares, 28 de algas verdes, 29 Colorantes de anilina, 148T fluorescentes, 148T, 152F fluorescentes y anticuerpos, 153 orgánicos selectivos, 151 Columna cromatogràfica de almidón, 183T de afinidad, 178,178F, 198 de filtración en gel, 177, 178F de HPLC, 179 de intercambio iónico, 177 hidrofóbicas, 177 Combinatorio, control, 441 Combustión oxidación biológica, 708F Compactación, 1035 Comparaciones de secuencias de DNA, 15 Compartimentación, 142F primitiva, 10 Compartimientos, 1179 axonales, 871 cis de Golgi, 647 de Drosophila, 1178F de la ruta biosintética-secretora, 642 dentríticos, 871 diversidad, 678 endosomales, 665 intracelulares, 589 intracelulares, volumen, 59IT marcadores, 678 mediales de Golgi, 647, 659F nucleares, 599 trans de Golgi, 647 ventaja evolutiva, 10F y energía libre, 678 Complejo Pa, 791 abierto, 392 achaete-scute, 1180, 1181 antena, 738 Antennapedia, 1175F Antennapedia bithorax, 1173 Antennapedia genes selectores homeóticos, 1171 b-c,, 722, 727, 750 b -í, 740, 741F, 742 bithorax, 1175F bithorax, genes selectores homeóticos, 1171 calcio-calmodulina, 919 calcio-calmodulina, estructura, 802F CD3, 1329 de ataque de membrana, 1299, 1300F de Golgi, 24F, 148T, 516, 521, 590F, 643F de Golgi, compartimentación, 650F de Golgi, compartimientos ordenados, 643 de Golgi, polarización, 644F, 649F de Golgi, vía de retorno, 646F de Golgi y microtúbulos, 849F de Golgi y oligosacáridos, 646 de Golgi y proteoglucanos, 649 de la citocromo oxidasa, 722 de la succinato deshidrogenasa, 706F de piruvato deshidrogenasa, 705F de poro nuclear, 594F de señalización en la membrana plasmática, 1329 de unión, 1029 enzimàtico, 130 enzimàtico respiratorio, 708, 709, 722 enzimàtico respiratorio, paso de electrones, 723F
I-
enzimàtico respiratorio y potencial redox, 725 extra sex combs, 1175F gènico H-2,1318F gènico HLA, 1318F HOM, 1171, 1172 HOM de insecto, 1182F, 1183F FlOM, localizaciones cromosómicas, 1173F HOM, patrones de expresión, 1173F Hox de mamífero, 1182F, 1183F HoxA,1183F HoxA, expresión, 1185 HoxB, 1183 HoxC, 1183 HoxD, 1183 HoxD, expresión, 1185 interruptor genético, 456 MHCde clasell, 1318F mitocondrial ATP, 708T multienzimático, 141, 142 NADH deshidrogenasa, 722 peptídico MHC, 1322 principal de histocompatibilidad, 1316, 1317 proteico, 122,127 ribosoma-SRP, 623 sinaptonémico, 287,1089-1091F Complementariedad, regiones determinantes, 1303F Complemento, 1280 activación, 1299F cascada, 1301 componente temprano, 1299 componente tardío, 1299 fijación, 126 reconocimiento, 662 sistema, 1295 y anticuerpos, 1298 Componente tardío del complemento, 1299 temprano del complemento, 1299 Comunicación célula-célula, 33 unión, 1018 Conalbúmina, 809F Concentración de calcio y concentración muscular, 915 gradiente, 544 iónica, cambios, 193 iónica, diferencias, 541 molecular, ajuste, 777 muscular, 175 muscular y calcio, 916 Condensación, 78 cromosómica, 977 de la cromatina, heredabilidad, 478 Condiciones prebióticas, 4-12 Condroblastos, 1042, 1273 Condrocitos, 1262, 1264, 1269 y fibroblastos, 1222 Condroclastos, 1273 Condrodisplasias, 1052 Condroitín sulfato, 1043, 1123 sulfato+keratán sulfato, 1049T sulfatos, 1045 Condroma, 1347 Condrosarcoma, 1347 Conducción saltatoria, 567 Conducto biliar, 1229F torácico, 1286 Conexinas, 1027 isotipos, 1027 Conexión, 210, 232 citoesqueleto, 1021 de uniones de tipo gap, 1027 sináptica, definición de patrones, 1209 sináptica, período crítico, 1211 sináptica y experiencia, 1210 Conformaciones proteínicas, 117 Congelación, grabado por, 162 rápida, 151 Conjugación de levaduras, 943 Cono, 806, 1225 axónico, 580, 1203 de crecimiento e integrinas, 1205 decrecimiento neuraJ, 1203, 1204F de crecimiento neural desplazamiento, 1205 de crecimiento y cadherina N, 1205 de crecimiento y N-CAM, 1205 Consenso, secuencias, 240, 400F Constante de afinidad, 100F, 101,1298 de asociación, 100F de disociación, 100F de equilibrio, 100, 101 de equilibrio, energía libre, 101T Contacto focal, 893, 896, 964, 965F, 1018T, 1024, 1069 focal e integrinas, 903F focal y fibras de estrés, 901F focal y filamentos de actina, 902
1-8
índice alfabético
no adhesivo, 1040 Contador de centelleo, 189 Geiger, 189 Contracción, 36 muscular, 25,578, 797T, 908,910,911F muscular filamentos deslizantes, 158T muscular y concentración de calcio, 915 Contracepción, 1107 Contrarreceptores, 1068 Control combinatorio, 441 combinatorio y desarrollo, 475F de la actividad proteica, 431 de la degradación de los mRNA, 431 de transporte de RNA, 431 del anclaje, 965 del ciclo celular y proteína quinasa, 931 del ciclo de división celular, 925 del inicio y ciclinas G,, 951 del locus, región, 466 del procesamiento del RNA, 431 gènico, 429 gènico combinatorio, 472,476 gènico fibra muscular, 1138F negativo, 447 por retroalimentación, 86 positivo, 447 post-traduccional controlado por hierro, 496F post-transcripcional, 484F, 499 respiratorio, 728 traduccional, 431,486 traduccional negativo, 494 transcripcional, 431,486 Conversión gènica, 268, 287,288, 415, 419, 470 gènica y recombinación general, 289F Corazón hormonas, 789T músculo, 918, véase también Músculo cardíaco Corion, 1095 Córnea del ojo, angiogénesis, 1233 Corpúsculo basai, 877F de Barr, 477 polar, 1097 polar del huso, 865, 893,946F Corrección cinética de pruebas, 255F de errores, 288, 290F de errores de apareamiento, 277 de galeradas, 254,271F, 276 exonucleasa 3 a 5,271 Correceptores, 1048 CD28, 1339 CD4, 1322F, 1337, 1339 CD8, 1322F, 1337, 1339 de unión a MHC, 1322 Corrientes citoplasmáticas, 897 Corte y empalme, 113 y empalme, maduración por, 110 Córtex celular, 849 citoplasmàtico del huevo, giro, 1112 de actina, 849, 851, 891, 907F de eritrocito actina, 895 Corteza adrenal, hormonas, 789T celular, comportamiento, 904 cerebral, disposición de neuronas, 1202 Cortical red, 1077 Corticoesteroides, 775F Cortisol, 775F, 780 secreción, 789T Cotilédones, 1188 Cotransporte aniónico, 527 CRE, 793 Creatina fosfoquinasa, 474 Crecimiento celular interfase, 944 celular y división celular, 959 del oocito, 934 derivado de las plaquetas, 958 factor de, 495F, 782,956, 958 neuronal, factor, 960 tumoral y angiogénesis, 1234 vegetal, reguladores, 1194 Cremallera de leucina, 441F Cresta genital, 1094 mitocondrial, 702 neural, 1119, 1123F, 1200 neural, migración de células, 1032,1123F Criofractura, 158T, 163F, 527 Crioprotector, 162 Criostato, 151 Cripta intestinal, 961F, 1236 Crisálidas, 1155 Cristales de hidroxiapatita, 1265, 1266 proteicos, 185 Cristalinas, 1223 Cristalino, 1223 células del centro, 1223 crecimiento, 1223, 1224F maduro, 1224F Cristalización de proteínas, 185
Cristalografía de rayos X, 185, 186F de rayos X, historia, 188T electrónica, 529 Cromátidas, 981F y sigs. hermanas, 378, 988, 1087, 1091,1093 hermanas, separación, 995-997F hijas y cinetocoros, 992 homólogas no hermanas, entrecruzamiento, 1088 intercambios, 1090 Cromatina, 280,366, 394F activa, 377 activa e histonas, 377 activa, formación, 466 condensada, 376, 378, 380, 412F, 478 cristalización, 477 de 30 nm, 370F descondensada, 371 digestión, 376F empaquetamiento, 379F, 464 estructura, 462 gránulo, 394 inactiva, 463 interfásica, 373 muy condensada en la fase S, 386 y lámina nuclear, 604 Cromatografía, 176, 178F de afinidad, 177F, 178 de afinidad de DNA, 444, 445F de filtración, 177 de filtración en gel, 177F de intercambio iónico, 177F de partición, 176,183T en capa fina, 176 en columna, 176F, 177, 183T hidrofóbica, 177 historia, 183T líquida de alta resolución, 179 sobre papel, 176F, 183T tipos de matriz, 177F Cromómeros, 371, 372F Cromosoma(s), 27, 148T, 361 11,170 9 y 22 translocación, 1348F artificiales, 363 artificiales de levadura, 363F artificiales en células de levadura, 339 caminar por los, 337,338, 339 circulares, 362 de levadura, 989 de mamíferos, 386 de oocitos, 371 división, 1010F estructura, 373F estructura bivalente, 1087 estructura global, 371 eucariotas, origen de replicación, 384 eucariotas, replicación, 384 Filadelfia, 1348 homólogos, 1087,1089F humanos, 371, 385 humanos en mitosis, 380 humanos patrón de bandas, 380F mareaje selectivo, 412F metafásicos, 378F mitóticos, 378,378F mitóticos, dominios estructurales, 380 orientación polarizada, 411F plumulados, 371 plumulados de oocitos, 372F plumulados, estructura, 372F politénicos, 373, 374, 411F politénicos, bandas, 374 politénicos, bucles, 376 politénicos de Drosophila, 373FF politénicos, dominios de cromatina, 374 politénicos gigantes, 388F politénicos, síntesis de RNA, 375F replicación, 382 rondas de replicación, 942 sexuales, 361, 476, 1086, 1093 sexuales, apareamiento, 1093 unión al huso, 992 víricos, 296,301 X heterocromatina, 477 X inactivados, 386,476, 478, 1138, 1349F Cromosómica, segregación, 1091 separación, 1092F Cromosómico, alineamiento, 1092F Crossing-over, véase Entrecruzamiento Cruce por células tumorales, 1362F CSF, 959T, 1252, 1253 tipos, 1253 CTP, 214 Cuaternaria, estructura, 124F Cubierta ATPasa de eliminación, 684
celular, 517, 535, 536F de clatrina, ensamblaje, 681F de clatrina, estructura, 681F oocitaria, 1095 pelúcida, 1104 vitelina, 1095F Cuello uterino carcinomas, 1376TF Cuerpo de vertebrados, plano estructural, 1124 ejes, 1112 fructífero, 29F fructífero de Dictyostelium discoideum, 891F humano, número de mutaciones, 1350, 1351 medio, 1004 multivesicular, 668F neuronal, 563 residual, 662 Cultivo celular, 166-172 de callos, 355 de tejidos historia, 171T medios, 168, 169T, 171T placa, 167 primario, 168 secundario, 168 vida limitada, 169 Curare, 576 Cyanophora paradoxa, 22 F
D Decodificación del mRNA, 246F Decorina, 1046F, 1049T Dedos de zinc, 439 de zinc, proteínas, 440F Deficiencia de adhesión leucocitaria, 1068 Deformación, 95 del DNA, 435F Degradación de la ciclina y mitosis, 939 del RNA, 496F proteica dependiente de ubiquitina, 234F proteolítica y ensamblaje, 134 Deleción, 414 clonal, 1290, 1337 Delecionado en carcinoma de colon, 1382 Dendritas, 564, 581, 1199 cono de crecimiento, 1203 desarrollo, 1199 formación en cultivo, 1204F Densidad de flotación, 173 gradiente, 173 inhibición de la división celular dependiente de la, 963 Dependencia de anclaje, 964 Depresión, 576, 680 revestida de clatrina, 663, 665,680F revestida y pinocitosis, 662 Dermatán sulfato, 1043F, 1049T Dermis, 1119 Desacoplantes naturales, 728 Desaminación, 261F Desarrollo celular, 775 de Drosophila, 1155F del ratón, 1132 embrionario vegetal, detención, 1188 embrionario y expresión génica, 330 genes controladores, 1143 mecanismos celulares, 1111 neural, 1199 neural fases, 1200F regulador, 1126 ritmo, 1152 temprano de los mamíferos regulación, 1133 vegetal, 1187 y control combinatorio, 475F y mediación del DNA, 480 Descamación de la piel, 1240 Descondensación, 465 Desdiferenciación, 430F Desensibilización, 825 celular, 825 heteróloga, 827 homóloga, 827 Deshidratación, 78, 79F, 84 por congelación, 162 Deshidrogenaciones, 66 Deshidrogenasa, complejo de la succinato, 706F complejo NADH, 722 piruvato, 705F Desinapsis cromosómica, 1090F Desmina, 859,1024 filamentos, 857 Desmoplaquinas, 1025F Desmosomas, 857,1018T, 1022,1024 Desmotúbulos, 1031 Desnaturalización del DNA, 322
índice alfabético
Desorden del universo, 63 y calor, 63 Desoxi ATP, 320F Desoxirribonucleasas, 367 1,369 Desoxirribonucleico ácido, 62F, 103, véase también DNA Desoxirribonucleósidos trifosfato, 107 Desoxirribonucleótidos, 103,107F, 952 Desoxirribosa, 49, 76,109, 262 Desplazamientos de cabezas de miosina, 913,914F morfogénicos, 1113F Despolarización auto-amplificante, 566 de membranas, 565 Despolimerización de los microtúbulos, 851 Despurinación, 261F-263 Destoxificación reacciones, 619 Detergentes, 521 estructura, 522F micela, 521F y proteínas de membrana, 521, 523F Determinación celular, 476,1135, 1137 celular, momento, 1136 Determinantes antigénicos, 1286, 1297, 1298F antigénicos idénticos, 1298F inmunodominantes, 1286 localizados, 1126 Dextrano, 177F DHFR, 1363 Diacilglicerol, 798F, 799, 801F y proteina quinasa C, 799 Diacinesis, 1090 Diafragma de apertura controlada, 604 Diagnóstico prenatal, 327, 328 Dianas de restricción, 316F Diarrea debilitante del cólera, 517 Dictiosomas, 647 de Golgi, 643 de Golgi, cara cis, 644 de Golgi, cara trans, 644 interconexión, 649 Dictyostelium, 907 discoideum, 891F discoideum, quimiotaxis, 892F Didesoxi ATP, 320F Didinium, 27F Dietilaminoetilcelulosa, 177F Diferenciación celular, 34, 429, 476,1136,1137, 1219 celular y crecimiento canceroso, 1359 Difracción de rayos X, 119,185, 186F, 188T efectos ópticos, 149 microscópica, 148T Difusión, 99 cinética mediada por transportador, 547F cinética simple, 547F facilitada, 543, 548F lateral, 531 limitación, 100 rotacional, 531 Digestión, 69 intracelular, 652 Dihidrofolato reductasa, 1363 Dihidrolipoil deshidrogenasa, 705F Dihidroxiacetona fosfato, 418 Dímeros de pirimidina, 265, 266 de proteína hélice-bucle-hélice, 442F de timina, 262 H2A-H2B, 463F modelo de cinta, 130F simétricos, 130 Dimetilbenzeno antraceno, 1355, 1372 Dineína ciliar, 872, 876, 877F citoplasmàtica, 872, 876 y microtúbulos, 871 Dinitrofenol, grupos, 1286F Dinoflagelados, 26F cinetocoros, 1009 mitosis, 1009 Dinucleótidos, 73F Dióxido de carbono, 65 de carbono, conversión en carbohidratos, 733 de carbono, fijación, 735 de carbono, fijado por bacterias, 16,17 Diploides células, 1083 organismos, 361 Diplomonados, 21F Diploteno, 1090 Dirección, marcadores moleculares, 1172 Direccionamiento gènico, 353 dis2, gen, 954T DIS2 SI, gen, 954T Disacáridos, 46,47F Discos imagínales control, 1176 imagínales de Drosophila, 1175F imagínales, determinación de las células, 1176F
imagínales, señales morfogénicas, 1179 imagínales y genes selectores homeóticos, 1176 intercalares del músculo, 918 Z del músculo, 909F, 910,913, 917,918 Disgénesis híbrida, 423 Disociación, reacción de, 100F Displasia benigna del cuello uterino, 1359 uterina, 1354 Distrofia muscular, 340, 1262, 1265 Distrofina, 917 número de intrones, 365T tamaño del gen, 365T tamaño del mRNA, 365T Diversidad, 3 biológica, 423 celular, 1131 Diversificación combinatoria, 1309 de empalme, 1310 División celular, 925,977 celular, anclaje, 965F celular, asimétrica, 1002 celular, etapas, 926F celular, patrones reguladores, 971 celular, regulación, 959 célular vegetal, 1007F celular vegetal, orientación, 1190 celular y crecimiento celular, 959 citoplasmàtica, 977 meiótica 1,1087F, 1089F, 1097 meiótica I, separación de cromosomas, 1091 meiótica II, 1087, 1091,1102 meiótica II y mitosis, 1093 mitocondrial, 752FF nuclear, 977 DMBA, 1355, 1372 DNA altamente repetido, 420 amplificación, 414 amplificación de secuencias, 332F anillo deslizante, 274F apertura, 273 artificial, 349 bucles estrechos, 368 cantidad, 23,364F centromérico, 989 circular, 298 circular de cloroplastos, 753 circular de mitocondrias, 753 clonaje, 314-316,331 clonaje posicional, 340 clonaje seriado, 343F código de reconocimiento, 434F como material hereditario, 11,12 como patrón, 268 complementario, 334 con extremos cohesivos, 315F conservado, búsqueda, 339F contenido, 929F cromatografía de afinidad, 444 cromosomico, empaquetamiento, 361 cromosómico no codificante, 363 dañado replicación, 1379F dañado y retraso de la mitosis, 953 de cloroplastos, 22,23, 753T, 754 de cloroplastos, transcripción, 755 de desecho, 763 de genes mutantes, diferencias, 339F de mitocondrias, 753T, 754 de primates, mapa de restricción, 316F deformación, 435F desenrollamiento, 240F desnaturalización, 322 difracción de rayos X, 188T doble hélice, 12, 188T, 433F e histonas, 367,389 egoísta, 421 empaquetamiento, 27,374 en células primitivas, 11 enrollamiento, 240F enzimas de reparación, 265 espaciador, 368,405, 414 estructura, 103 exceso, 363 fluctuaciones térmicas, 261 footprinting, 322 véase Huellas del DNA fragmentación, 314 fragmentos, 315 fragmentos, secuenciación, 319F genómico solapado, 338F girasa, 468 glucosilasa, 264,265F, 267 hebras, 106 helicasa, 222,265, 273, 345F, 383 helicasa actividad, 273F hélice-giro-hélice, 437F hibridación, 284F hibridación in vitro, 284
1-9
horquilla de replicación, 269 huellas, 318, 320, 321F, 322 humano, 267 humano mapa de restricción, 316F ingeniería, 342 inhibidor de la unión, 1138F insertos, 333,339 interacciones con proteínas, 436 inversiones en bacterias, 470F librerías, 171 ligasa, 263FF, 263, 270, 271, 343, 954T ligasa reacción catalizada, 264F marcadores químicos, 318 mareaje radiactivo, 318F metilación, 481F mitocondrial, 23, 753F, 754T mitocondrial de mamíferos, 754 monocatenario y mutación, 268 muescas, 277 no codificante, 419 nuclear, replicación, 927 número de copias, 322F oligonuclcótidos, 328,347 patrón de metilación, 479 plásmidos, 499 plegado, 28F polimerasa, 107, 263F, 263, 264F, 265F, 269, 271,276, 298, 383,952 polimerasa, inhibición, 952 polimerasa alfa, 384 polimerasa de Escherichia coli, 264F, 393 polimerasa delta, 384 polimerasa móvil, 273 priinasa, 278,383 proteínas de unión, 368 purificación de secuencias, 332F recombinante, 313,331, 571 recombinante, formación, 332F recombinante, tecnología, 347, 544 relaciones evolutivas, 15, 16 renaturalización, 284,322 reorganizaciones, 469 reparación, 237, 257, 258, 262FF, 265F, 1351 repetidos intercalados, 420 replicación, 107, 175, 237, 257, 268, 387, 479F, 930F,1087 replicación semiconservativa, 108F replicado incompletamente, 953F rotura específica, 313 satélite, 420F satélite, evolución, 420 satélite, función, 420 secuenciación, 313, 314 secuencias conservadas, 366 secuencias de nucleótidos y evolución, 15 secuencias reguladoras, 345 secuencias teloméricas, 970 separación, 314 sinapsis, 285,286F síntesis, 81F, 107F síntesis in vitro, 319 sintético, 327 sondas, 185, 318, 322F, 323 surco mayor, 436F tándem, 415F tensión superhelicoidal, 467,468F tinción, 318 topoisomerasa 1eucariota, 279F topoisomerasa II, 280F, 468 topoisomerasas, 278 transcripción, 27, 109, 175,238, 257,391,392F, 393 transcripción in vitro, 343 transducción, 307 transferencia de información, 110F tumoral, virus, 1377 virus, 1376T y células B, 1308F y proteínas reguladoras, 442 y vectores de expresión, 337 DNasa I, 369, 376F, 465, 466 DNasas, 324, 367 DNP, 1286F Doble enlace cis, 513F hélice de DNA, 103F hélice, proteínas desestabilizadoras, 285 hélice, reparación, 266 Dodecil sulfato, 183T sulfato sódico, 179F, 521, 522F Dolicol, 630 Dolor percepción, 827F Dominios amino terminales, 854 apicales, 1019 basolaterales, 1019 de activación, 454 de las inmunoglobulinas, 1304F
I -10
índice alfabético
de unión al DNA, 454 desplazamiento, 208 kringle, 129F lectinas, 537 proteicos, 122 proteicos enlaces de hidrógeno, 124 proteicos estructura, 124 SH2, 230F, 231,815,818 Dopamina, 803 Dorsoventral, eje, 1112 Dotación de enzimas, 15 Down, síndrome de, 1088 Droga(s) anticancerosas, 1358 anticancerosas y capacidad de mutación, 1363 antiinflamatorias no esteroideas, 775F antimalárica cloroquina, 557 antimitóticas, 861 antimitóticas y microtúbulos, 861 citotóxicas, 557 psicoactivas, 575, 576 que polimerizan microtúbulos, 849, 850 resistencia, 555 resistencia múltiple, 1363 Drosophila, 339 blastodermo, 1157,1169F compartimientos, 1178F desarrollo, 1155F desarrollo, sincitio, 1156 determinación del sexo, 485, 487F discos imagínales, 1174,1175 eje dorsoventral, 1160 elementos, 419T elementos E, 419T elementos P, 419T embrión, 153F estado proneural, 1180 estructura, 1155 gastrulación, 1157 genes de control del desarrollo, 1182 genes de segmentación, 1165 gradiente de concentración de señales, 1167F mapa destino, 115F7 mapa geométrico, 1158 patrón fundamental de unidades de repetición, 1155 polaridad anteroposterior, 1163F regiones de control no codificantes, 1174 segmentos corporales, 1155F sistemas de genes de polaridad, 1158F tipos de segmentación mutantes, 1165F y genética, 1154 Duplicación específica de lugar, 421
Ecdisona, 375, 780 EcoRl, 363F Ectodermo, 32, 33, 1115,1119 neurogénico, 1157 Ecuación de Nernst, 561 Edición del RNA, 490,491F EDTA, 166 EF-1, 255F EF-Tu,255F hidrólisis de GTP, 221F Efectoras células, 1282 Efectos de borde, 149F de posición, 464, 478 maternos genes, 1159 ópticos de difracción, 149 EGF, 667, 813, 958, 959T, 1150, 1241 EGTA, 583, 1106 Ehlers-Danlos síndrome, 1052 Eicosanoides, síntesis, 775F eIF-2, 251,254 fosforilación, 493, 494 función, 493 proteínas, 493 Eje del cuerpo, 1112 dorsoventral de Drosophila, 1160 raíz-brote, 1188 Ejercicio, 90 violento, 87 Elastasa, 126 Elastina, 120, 122, 1042, 1055 estiramiento, 1056F y colágena comparación, 121F Eléctrica, excitabilidad, 563 Electrodenso, material, 157 Electrodos intracelulares, 191 Electroforesis, 179, 183T bidimensional en gel de poliacrilamida, 181, 182F en agarosa, 317
en gel, 324 en gel de campo pulsante, 317 en gel de DNA, 317F en gel de poliacrilamida, 183T en gel de poliacrilamida con SDS, 179, 180FF, 183T, 521,524 historia, 183T Electrones, 65 cadenas de transporte, 698 del NADH y formación de ATP, 716 flujo inverso, 728 fuentes, 16 longitud de onda, 157 transferencia, 16, 697, 725 transferencia al oxígeno, 75, 698, 708 transportadores, 698 Electrónica, cadena de transporte, 75 Electroquímico, gradiente, 544 Elementos Ac-Ds, 419T Bsl, 419T Cin4, 419T, 423 de acoplamiento reversible, 719 de Drosophila, 419T de respuesta al hierro, 495 even-skipped, 456F F de Drosophila, 423 L1 de humanos, 419T P, 353 P de Drosophila, 419T respuesta al AMP cíclico, 792 Tam3, 419T THE-1, 419T Tn3 e IS1, 419T transicionales, 619, 644 transponibles, 293, 305,306F, 419T, 421 transponibles humanos, 423 transponibles, inserción, 421F transponibles Ll, 423 transponibles y regulación génica, 422 Ty, 419T Tyl de levaduras, 305 Eliminación de bases, reparación, 263 de nucleótidos, reparación, 264 de sinapsis dependiente de actividad, 1209 de sinapsis, patrón de excitación, 1210F ELISA, 199 Elongación de cadena, 239F factor, 255F, 392, 393 Embriogénesis, 1107 Embriones animales, señales posicionales, 1139 animales tempranos, diversificación, 1125 bombeo de sodio, 1114 de anfibio, 1120F de pollo, desarrollo, 1139F dorsalización, 1158 tempranos, 35 tempranos, cadherinas, 1121F tempranos, ciclo celular, 928F tempranos y ciclinas, 938F tempranos y MPF, 933, 938F ventralización, 1158 Empalme, diversificación, 1310 Empaquetamiento celular, 1119 celular cambios, 1117 del DNA, 374 del DNA de orden superior, 462 Encefalinas, 673, 827F Encéfalo, 1119 Endo-H,648F Endocitosis, 24, 594, 641, 656, 661 de la fase fluida, 663 de LDL mediada por receptor, 667F mediada por receptor, 658, 664, 665 mediada por receptor y colesterol, 664 péptido señal, 685F señal, 685 Endodermo, 32,33, 1115, 1118 Endoglucosidasa altamente específica, 648F Endorfinas, 827F Endosimbiótica, hipótesis, 762, 763 Endosomas, 590F, 591T, 653, 661 pll, 653F tardíos, 656, 666 tardíos y lisosomas, 666F tempranos, 642F, 656, 666 tempranos, proteínas recuperadas, 666 tempranos y tardíos, relación, 668 y virus, 299 Endoteliales, células, 1219, 1232, 1233 Energía, ahorro en bacterias, 729 ATP como transportador de, 68F celular obtención, 69 de activación, 66F de activación y enzimas, 139F de enlace fosfato, 736 de oxidación, 708F
de oxidación conversión en ATP, 706 de oxidación y energía de enlace, 716 libre, 77,712 libre, constantes de equilibrio, 101T libre de una reacción, 77 libre estándar, 712 libre, variación, 713F obtención, 65 orgánulos transformadores, 697 por resonancia, transferencia, 737 Enfermedad(es) autoinmunitaria, 1279,1290 celular-I, 660 de acúmulo lisosomal, 659 deAlzheimer, 1207 deGlanzmann, 1069 de Hurler, 659, 660 de las motoneuronas, 1207 de Lou Gehrig, 1207 genética, 327 genéticas humanas, 327,340 hereditaria, 543 hereditarias humanas, 267 inflamatoria, 775F mental, 576 susceptibilidad individual, 329 Enfoque isoeléctrico, 181 Enlace amida, hidrólisis, 139 carbono-carbono, 82 covalente, 8, 44,94, 951' covalente, estabilidad, 44 de alta energía, 68 de hidrógeno, 94, 95T de hidrógeno base-base, 81 de hidrógeno, competencia, 136F disulfuro, formación, 118F fosfato, energía, 736 fosfodiéster, 5, 263 N-glucosídico, 262 iónico, 94,95T no covalente, 94, 95F peptídico, 5, 48F, 78, 98F, 242, 245F peptídico rotura, 184T S—S, 118 tioéster, 80 Ensamblaje de una librería de clones ordenados, 339F tipo pie de rey, 134F Ensayo de Ames, 1351F Entactinas, 1060, 1062 Entorno celular, 1221 Entrada mitótica, 945 Entrecruzamiento, 281, 283 cromosómico, 1089, 1097 de cromátidas homologas no hermanas, 1088 del DNA, 287F desigual, 414F, 415 genético y marcador RFI.P, 328F proteínas, 895 Entropía, 712 Envoltura nuclear, 359, 360F, 413F, 599, 600 nuclear, neoformación, 605F nuclear, rotura, 605F nuclear y mitosis, 604 nuclear y telofase, 999 Enzimas, 7, 44, 65,66, 69, 86, 233 activación, 89 actividad, 86 agregados simétricos, 212 alostéricas, 211F Cdk, 217 de destoxificación, 620 de HIV-1,303F de las células diana, 779 de recombinación específica, 292F de reparación del DNA, 265,266 digestivas, 676 dotación de, 15 EcoRI, 314F enlace covalente, 141F enlaces covalentes intermedios, 140 especificidad, 102 extremo N, 234 generadores de cadenas cebadoras de RNA, 272 hidrolíticas, 672 Hind III, 314F Hpal, 314F Hpall, 480 inhibición, 89 liberadoras del nucleótido de guanina, 494F ligadas a membrana, 553 lisosomales, clasificación, 657 modelos de espacio lleno, 138F proteolitícas, 166,183 Pst I, 314F RecBCD, 282F receptores asociados, 783
índice alfabético
retroalimentación negativa, 212 secreción, 1228 secuencia de aminoácidos y evolución, 15 subunidades idénticas, 212 transposasa del elemento, 353 uniformidad, 37 velocidad de reacción, 101 y ATP, 141 y balance energético, 140 y energía de activación, 139F y enlaces covalentes, 139 y estados de transición, 138 y evolución de las reacciones metabòlica, 14, 15 Enzimàtica, catálisis, 67F cinética, 138F Enzimologia, 175T Eosina, 151F Eosinófilos, 1273, 1296 factores del desarrollo, 1254 Epidérmicas, células, 1221 Epidérmico, factor de crecimiento, 958 Epidermis, 1220F, 1236, 1239 células madre, 1236 de insecto, valores posicionales, 1141 de mamífero, 1238F de peces, 850F grosor, 1241 renovación, 1236 uniones de anclaje, 1022 Epidermolisis bullosa simple, 858 Epididimo, 1102 Epinefrina, veáse Adrenalina Epitelio, 32 curvatura, 1119F intestina] mamíferos, 1019 intestinal, división, 961F intestinal, migración, 961F intestinal, red terminal, 904F olfativo, 1237F pigmentario, 1221F Epítopos, 349, 1286 mareaje, 349 F.pstein-Barr, virus de, 1376T Equilibrio, 100F constante, 100, 101 de sedimentación, 173 F.R, véase Retículo endoplasmático Eritroblastos, 1252F Eritrocitos, 37,459,1244, 1273, véase también Glóbulos rojos actina del córtex, 895 concentración, 1246T fantasmas, 522 función, 1246T humanos, 523F humanos, espectrina, 525F humanos, osmolaridad, 551F membrana, 524 muerte, 1252 proteínas de membrana, 535 viejos, 1231 viejos, fagocitosis, 661 Eritroleucemia, 1368T Eritromicina, 256T, 752, 755 Eritropoyetina, 958, 959T, 1252 células diana, 1253T células productoras, 1253T receptores, 1253T tamaño, 1253T Erizo de mar, gastrulación, 1115F ERK, 819 Errores de apareamiento, corrección, 277 de replicación, 289 de síntesis de proteínas, 254 Escamas epiteliales, 1239F Escherichia coli, 13F, 16F, 214 coli composición, 94T coli flagelos, 829F Escleroderma, 990 Esclerosis múltiple, 567 Esfera proteica, 132 Esfingomielina, 514, 515,634 en membraba celular, 514T Esfingosina, 634 Esófago, 1118 Espacio de las vesículas del retículo endoplasmático, 617 extracelular, 1041 intermembranoso mitocondrial, 611, 700 perinuclear, 599 periplasmático, 556F tilacoidal, 607, 732F, 733 Especialización celular, 37 Especifidad neuronal, 1207 Espectrina, 524, 897F de eritrocito humano, 525F
dímeros de, 526F membrana, 894 y anemia, 525 Espectro ESR, 512 Espectroscopia de resonancia magnética nuclear, 186, 187F Espejo dicroico, 157 Espermátidas, 1102 Espermatocitos, 1274 maduros, 1101F primarios, 1101F secundarios, 1101F, 1102 Espermatogénesis, 1100, 1101F Espermatogonias, 1101F, 1237, 1274 y sincitio, 1102 F.spermatozoide(s), 102, 534, 874,1084, 1085F, 1086, 1094, 1099 bloqueo de las re-replicaciones, 942 capacidad de fecundación, 1104 cilios, 874 como transportador de DNA, 1099 humanos, 1100F mitocondrias, 700F producción continua, 1100 puentes citoplasmáticos, 1103 punto de entrada, 1113 unión de pronúcleos, 1108F y centríolo del zigoto, 1107 Espín, 186 Espinosas, células, 1238F Espliceosomas, 400F-403 Esporas, 29F, 37 Esqueleto como armazón rígido, 1270 Esquema Z, 741F Esquizofrenia, 576 Estabilidad del RNA, 495F genética, 258 Establecimiento, metilasa de, 480 Estado de energía y temperatura, 102 de expresión herencia, 479F de profago, 473 de transición y enzimas, 138 diferenciado, mantenimiento, 1219 lítico, 473 Estambres, 1196 Estanca, unión, 1019, 1021F, 1114 Estereocilios, 1223F Esteres de forbol, 801, 1355 Esteroides, 772 Estimulador del virus del tumor mamario, 1373F Estómago, 1118 Estornudos, 674 Estradiol, respuesta del oviducto, 809F Estreptomicina, 256T, 755 en medios de cultivo, 169T Estrés, 90 calorífico, proteínas activadas, 780F fibras de, 893, 900, 1069 Estrógenos y cáncer de mama, 1359 Estroma del cloroplasto, 733 Estructura celular, autoensamblaje, 132 cuaternaria, 124F extraembrionaria, 1132 primaria, 122, 124F secundaria, 122, 124F terciaria, 124F Etanol, 542, 705 Etanolamina, 48 Etilendiamín tetraacético, ácido, 166 Etileno, 1078, 1191, 1192F, 1194 N-Etilmaleimida, 689F Etioplastos, 731 Eubacterias, 14, 22F Eucariotas, control génico, 471 control génico combinatorio, 475 corrección de errores, 277 expresión génica, 432F genes de actina, 880 /V-glucosilación, 651 origen, 22F proteínas reguladoras, 455F, 460F proteínas represoras, 455F recambio proteico selectivo, 232 regulación de la transcripción, 449 replicación del DNA, 280 RNA, 252 superiores, maduración del RNA, 402 y procariotas, 23T Eucromatina, 378,478 Euglena, 16F Euglenoides, 26F Evolución, 3 celular, 3-41 celular, lagunas, 3 de la síntesis proteica, 257 proteica y maduración del RNA, 402
1-11
y oxígeno atmosférico, 17FF y programas básicos de desarrollo, 34 y red de señalización celular, 835 y secuencias de DNA, 15,16 y subunidad ribosómica pequeña, 16F y variación al azar, 3 Evolutivo, árbol, 40F Excitabilidad de las membranas, 541 eléctrica, 563 Exclusión alélica, 1311 Exocitosis, 24, 641, 663, 670, 1095 como respuesta localizada, 674F de vesículas secretoras, 672F liberación del producto, 673 regulada, 674 Exones, 110F, 229, 335, 365, 398, 399F barajado, 421,422F recombinación genética, 111,417 Expansión celular vegetal, 1191F clonal, 1289 Experimentos de condiciones prebióticas, 4FF de trasplante, 1136 in vitro, 167 in vivo, 167 Explantes, 168 Explosiones de transposición, 423 Exportadores de feromonas, 557T Expresión clonaje, 786 de eve regulación, 458 de un gen, 346F de un gen central, 323 gènica, 37,346F, 495 gènica cambios hereditarios, 469,473 gènica control, 429, 462 gènica efectos de posición, 465F gènica en plantas, 355 gènica heredable, 476 gènica proteínas reguladoras, 241 gènica regulación, 431 gènica y desarrollo embrionario, 330 gènica y evolución, 261 vectores de, 344 Extensión convergente, 1117, 1118F Extracelular, matriz, 1017,1021 Extracto, 172 de embrión de pollo, 168 de levadura, 175T Extraembrionaria, estructura, 1132 Extragénicas, mutaciones supresoras, 1147 Extremo carboxilo terminal, 244 cohesivo, 315
Fabricio, bolsa de, 1281, 1282 Factor VIII número de intrones, 365T VIII tamaño del gen, 365T VIII tamaño del mRNA, 365T de acoplamiento, 772 de células madre, células diana, 1253T de células madre, células productoras, 1253T de células madre, receptores, 1253T de células madre, tamaño, 1253T de crecimiento, 168, 495F, 782, 809, 956, 958, 969 de crecimiento, combinación, 958 de crecimiento de fibroblastos, 813,958, 859T, 1048, 1128F, 1235, 1260, 1046 de crecimiento de hepatocitos, 813, 1230 de crecimiento de transformación a, 959T de crecimiento de transformación p, 959T de crecimiento derivado de plaquetas, 813, 814F,959T, 1235 de crecimiento epidérmico, 129F, 667, 813, 958, 959T, 1150, 1241, 1371 de crecimiento específico en medios de cultivo, 169T decrecimiento nervioso, 171T, 1206 de crecimiento neuronal, 813, 959T, 960 de crecimiento semejante a la insulina, 959T de crecimiento semejante a la insulina II, 481, 959T de crecimiento transformante P, 1047 de crecimiento vascular endotelial, 813, 1235 de crecimiento Wnt-1, 353F de crecimiento y cascadas de señales intracelulares, 967 de crecimiento y células de mamífero, 957 de crecimiento y células vecinas, 963 de crecimiento y proteínas Myc, 967F de crecimiento-1 para insulina, 813 de dispersión, 1230 de elongación, 255F, 392, 393 de iniciación, 249, 254
1-12
índice alfabético
de iniciación 2 de eucariotas, 251 de iniciación, fosforilación, 493 de liberación, 249 de transcripción, 462 despolimerizador de la actina, 887 estimulador de colonias, 813,1252 estimulador de colonias hematopoyéticas, 959T estimulador de la formación de colonias, 813 general de transcripción, 450 general de transcripción, proteínas activas, 453 general de transcripción TFIID, 453F inhibidor de leucemia, 1134 liberador de hormona del crecimiento, 823 neurotrófico, 1205, 1206 neurotrófico derivado del cerebro, 959T permisivo, 388F promotor de la fase M, 932 promotor de la maduración, 935 Steel, 1124, 1255 Steel y células madre hematopoyéticas, 1255 Wnt, 1128F Factor-|3 transformante del crecimiento, 823 Factor-1 de ensamblaje de peroxisomas, 616 FAD, 75 FADH2, 75, 704F, 705 Fagocíticas células, 1295 Fagocitosis, 24,656, 661 activada por anticuerpos, 1295F Fagolisosoma, 657F Fagosomas, 656, 661,1244 diámetro, 662 y lisosomas, 662 Faloidinas, 885, 888F Familia(s) Cdk, 969 de genes, 414 de genes de la globina, 415 de proteínas transportadoras, 557T génica, 329 hsp70, 610 Janus, 820,821 MADS, 1197 MyoD, 1137, 1138F Rab,816 Src, 820, 821 Src tirosina quinasa, 821 TGF-P, 1161 Fanconi, anemia de, 1362 Fanerógamas, desarrollo, 1189F Fantasmas de eritrocito, 522, 525, 549 de eritrocito no soldado, 524F de eritrocito soldado, 523, 524F Faringe, 1118 Fasciclina II, 1038 Fascículos de fibras nerviosas, 1205 Fase diploide, 1084 embrionaria, 35 fluida endocitosis, 663 G0, 927 y sigs. G,, 927 y sigs. G2, 1097 G2del primer ciclo de división meiótica, 934 haploide, 1084 luminosa reacción, 733 M, 361, 387, 926 y sigs., 977, 988, 1087 M, dinámica de microtúbulos, 986F M, estadios, 980 y sigs. M, evolución, 1009 M, síntesis de proteínas, 929 M y orgánulos citoplasmáticos, 984 mitótica, véase Fase M oscura reacciones, 734 S, 382, 385, 388, 928F, 1087, 1093 S,, 927 y sigs. Fecundación, 1083, 1086, 1094,1103 del huevo, 934 electronmicrografía, 1104F externa, 1104 in vitro, 1104 interna, 1104 por un solo espermatozoide, 1105 y fusión de membranas, 691 Feedback, 86 negativo, 87F Fenciclidina, 582 Fenilalanina, 242F en medios de cultivo, 169T tRNA cruce en trébol, 112F Fenobarbital, 620, 1230 Fenotipo wee, 947F Fermentación, 744, 745F anaeróbica, 71 Feromonas de apareamiento, 951 exportadores, 557T Ferritina, 199F, 496F FGF, 813, 814, 959T, 1046, 1128F, 1260, 1262
Fibras de colágena, 1050 de estrés, 893, 895, 899,900, 1069 de estrés y contactos focales, 901F de estrés y filamentos de actina, 905 del cristalino, 1223 elásticas, 1055 elásticas, red, 1056F musculares, 90F, 910,1060,1259,1261 musculares blancas, 1261F musculares de las extremidades, 1122F musculares del corazón, 1222 musculares, diferenciación in vitro, 474 musculares esqueléticas, división, 960 musculares estriadas, 1237 musculares lentas, 1261F musculares lisas, 1258,1263 musculares rápidas, 1261F musculares rojas, 1261F Fibrilina, 1057 Fibrillas de anclaje, 1062 de celulosa, 1191 de colágena, 1050 de colágena, enlaces covalentes, 1053F de colágena, formación, 1052F Fibrina, 259 Fibrinógeno, 259 Fibrinopéptidos, 259 evolución, 259F, 260T Fibroblastos, 168,474F, 475,856, 1054,1135,1219, 1231, 1253T, 1262, 1263F, 1264 borde frontal de avance, 887F caveolas, 680F ciclos de división, 970 factor de crecimiento, 1235 humanos en cultivo, 171T humanos, nucléolos, 409F matriz extracelular, 1042F pinocitosis, 663 regeneración, 972 transformaciones, 1262 versatilidad, 1263 y colágena, 1050F, 1055 y condrocitos, 1222 y señales de la matriz extracelular, 1263 Fibroína, 110 Fibronectina, 965, 1042,1043, 1057, 1063, 1065, 1122, 1123, 1241 e integrasas, 1068 estructura, 1057F maduración alternativa del RNA, 1058 plasmática, 1058 tipo III, 1059 y filamentos de actina, 1070F Fibrosarcoma, 1368T Fibrosis quística, 340, 555, 558 Fijación, 150 de carbono, 64 del carbono reacción inicial, 734F del nitrógeno, 76 Fijadores químicos, 159F Filagrina, 1238F Filamento(s) de actina, 25, 131F, 858, 880, 965F, 1026T,1072T,1119F de actina, fragmentación, 897 de actina y contactos focales, 902 de actina y fibras de estrés, 905 de actina y fibronectina, 1070F de actina y microtúbulos, 850 de desmina, 857 de fibronectina, 1058 de queratina, 854,855, 857F de vimentina, 854 delgados del músculo, 910 evolución, 844 gliales en astrocitos cultivados, 856F grueso de miosina, 912F intermedios, 852, 1025F, 1026T, 1072T intermedios, ensamblaje, 854F, 1024 intermedios, estructura, 853 intermedios, monómeros proteicos, 853F intermedios neuronales, 855T intermedios y estabilidad mecánica, 858 modelo de deslizamiento, 911 proteicos, 130 relacionados con la vimentina, 854 Filamina, 896,898, 905F Filopodios, 887, 895, 903, 1204 Filtro selectivo de iones, 559F Fimbrina, 896 Fitocromos, 1195 Flagelina, 470, 829 Flagelo, 360 bacteriano, 828 bacteriano, motor, 828F bacteriano, rotación, 697 batido, 875F
crecimiento, 877 de Escherichia coli, 829F disposición de microtúbulos, 875, 875F longitud, 878F Flavín adenín dinucleótido, 75 Flavivirus, 301 Flip-flop, 473,512, 531 Flipasa, 634, 635F Flor genes selectores homeóticos, 1198F Flotación densidad, 173 Fluctuaciones térmicas y DNA, 261 Flujo inverso de electrones, 728 Fluoresceína, 152F, 153, 199F empaquetada unida a tubulina, 198F Fluorescencia, 167F clasificador celular activo, 166 después de fotoblanqueamiento, 533 Fluorocromos, 198 Focal, contacto, 1018T, 1024 Fodrina, 895 Folato en medios de cultivo, 169T Foliculares, células, 1099 Folículos linfoides, 1287F Forbol, ásteres de, 801, 1355 Formación de caperuza, 532 Formadores de canal, 545 Formaldehído, 4,150, 614 N-Formilmetionina, 115F, 755, 891 Fosfatasa, 653 ácida, 649F alcalina, 199F jroteínas inhibidoras, 794 atidilcolina, 511F, 514,633, 635F, 762 en membraba celular, 514T síntesis, 633F Fosfatidiletanolamina, 514, 515, 762 en membraba celular, 514T síntesis, 633 Fosfatidilinositol, 518, 796, 1355 3’-quinasa, 815 síntesis, 633 Fosfatidilserina, 514, 515, 634, 800, 1257 descarboxilación, 762 en membraba celular, 514T síntesis, 633 Fosfatos, adición, 218 cálcicos, 1265 eliminación, 218 terminales del ATP, 68 3’-Fosfoadenosina-5’-fosfosulfato, 650 Fosfocelulosa, 177F Fosfodiesterasa, 265F, 788, 804 de AMP cíclico, 788 de GMP cíclico, 806, 807 Fosfofructoquinasa, 89 3-Fosfoglicerato, 734F, 735, 737 Fosfoglicolato, 734F Fosfoinosítidos, 796 Fosfolipasa, 653 C, 794 C específica de fosfoinositoles, 797 C-P, 796, 797, 798F, 801F, 808F C-p activación, 808F C-a, 815,1329 Fosfolípidos, 48 colas, 510 con colina, 634 de células de mamíferos, 515F de inositol, 514, 515, 796, 801F, 808 de inositol, vía, 1072 doble enlace, 511F estructura, 510 movilidad, 512F proteínas de intercambio, 634, 635F transferencia entre membranas, 635F translocadores, 634 y glóbulos rojos humanos, 515F y mitocondrias, 634 y peroxisomas, 634 zonas, 511F Fosfoproteínas fosfatasa, 810 Fosforilación, 230F a nivel de substrato, 705, 707 cascada, 784 de proteínas, 214, 216F, 977 de proteínas mediada por AMP cíclico, 792 de proteínas y MPF, 940 de residuos de serina, 854 dependiente de AMP cíclico, 558 factor de iniciación, 493 no cíclica, 740, 741F oxidativa, 73F, 75, 702, 706, 707F, 710, 711F oxidativa, evolución, 746F oxidativa, fotosíntesis, 590 Fosforilasa quinasa, 792,802, 804F, 810 Fósforo, ciclo del, 65
Í
índice alfabético
Fosfotirosinas, 784 Fosfotransferasa, 659 Fósiles, 4 Fotofosforilación cíclica, 742 Fotoquímico, centro de reacción, 738, 739 Fotorreceptores, 818F, 1225 adaptación, 806 como células permanentes, 1225 de la retina, 1224 en forma de bastón, 806 en forma de cono, 806 R7, 817, 818 Fotorrespiración, 615,736 Fotosíntesis, 16,17, 63,730, 734F fase luminosa, 64 fase oscura, 64 fases, 64F flujo de electrones, 741F y potencial redox, 741F Fotosintéticos, organismos, 730 Fotosistema, 698 I,740, 741F, 748 II, 740F, 748 antena, 738F centro de reacción, 738F derivado de las bacterias púrpura, 748 derivado de las bacterias verdes, 748 Fraccionamiento de células, 172-187 Fractura, 162 caras, 528 mesenquimática, 1263 ósea, 1270F ósea reparación, 1264 Fragmentación del DNA, 314 Fragmentadoras, proteínas, 897 Fragmentos cebadores, 272 de DNA, 315 de DNA, secuenciación, 319F de DNA, unión, 343 de restricción, 315 de restricción, polimorfismo de longitud, 326 F(ab’), 1293 Fab, 1293 Fe, 1293 mapas, 315 Fragmoplasto, 1006 crecimiento, 1009 Franja 2 de eve, 457F preprofase, 1007 Frecuencia cardíaca, 789T de iniciación, 395 de mutación, cálculo, 258, 259 Fructosa 6-fosfato, 89, 736 bisfosfatasa, 89 Fuerza astral de exclusión, 992, 993 protón-motriz, 710, 719F, 729F Función de las proteínas e ingeniería genética, 349F Fura-2, indicador, 194 Fusión celular, 388, 593F de vesículas, 642 espermatozoide-oocito, 1106 génica, 348 nucleolar, 410F
G-CSF células diana, 1253T células productoras, 1253T receptores, 1253T tamaño, 1253T GABA, 573, 575, 675 canales de cloro regulados, 583T GAG, 1042 estructura, 1043F organización en la matriz extracelular, 1047 GAL4, 436T Galactocerebrósidos, 516F Galactosa, 648F P-Galactosidasa, 346F, 453F, 490F, 1183F Galactosil transferasa, 1104 Galeradas, corrección, 254, 276 Gametos, 1084, 1093 Gamma actinas, 880 Ganglios, 1033F nerviosos y N-CAM, 1038 sensoriales, 1119 simpáticos, 1119 Gangliósidos, 516 GM1,517 GAP, 219, 686,815,817 Gap 1,382 2,382 uniones, 558, 1018T, 1026, 1027F, 1028F, 1114
Gastrina, 1228 Gástrula tardía, 1137 Gastrulación, 1112, 1114,1117F, 1133,1136 en erizo de mar, 1115F enXenopus, 1115,1116F y labio dorsal del blastoporo, 1116 GATA-1,436T GCN4, 436T GDP, 219 Gel(es) de agarosa, 318 de campo pulsante, 318 de poliacrilamida, 179,180,183T, 317,318 de poliacrilamida-SDS, 182 de polisacáridos, 1043 formados por proteínas, 896 Gelificación, 897 Gelsolina, 897,898 y calcio, 897 Gemación, 2F, 593F, 1083F de vesículas, 642 Gen(es), 102,364,452 achaete, 1180 activación, 37 activados por ligando, 779 ADE2,464 altamente fragmentados y proteínas, 417 AP-1,820 APC, 1381T-1383 apétala2 ,1198F apetala3, 1198F be1-2,1257, 1373 bicoid, 1158F, 1164F, 1165, 1167,1173 boss, 818 bride-of-sevenless, 817 c-kit, 1255 c-src, 1367 cactus, 1161 cascada de cambios, 488F ede, 945, 950 ede mutantes, 947 ede y ciclinas, 948F cdc2, 947, 950 cdcU, 947 cdc25,947 CDC28, 950 cdk, 957F cdk2, 956 ced-3,1153 ced-4,1153 ced-9,1153 celulares, 1143 ChoxA, 1185F ChoxD, 1185F controladores del desarrollo, 1143 CREB, 804 DCC, 1382 de anticuerpos, 1307 de antiproliferación, 966,968 de bandas, 375 de ciclina G, deleción, 950 de clase c, 1198F de control del desarrollo, 1145 de Drosophila grupos anteriores, 1158 de Drosophila homólogos en vertebrados, 1182 de Drosophila inactivación, 478 de efecto materno, 1159,1162 de efecto zigoto, 1165 de fibronectina, 1058 de funciones imprevistas, 340 de globinas, 334 de globinas de mamífero, 465 de nistonas, 369F de interbandas, 375 de interés final, 338 de la actina, 880 de la albúmina de ratón, 325 de la conexina, 1027 de la fasciclina II, 1038 de la a-globina, 398 de la p-globina, 106, 465 de la P-globina humana, 459F, 466F de la B-globina, región transcrita, 399F de la hemoglobina, 116,416 de la inhibición lateral, 1181 de la insulina, 170, 418 de la ovoalbúmina, 398 de la ovoalbúmina de gallina, 402F de la polaridad de segmento, 1169 de la respuesta inmunitaria, 1338 de levadura, inactivación, 478 de mamífero, 355 de mantenimiento, 482 de miogenina, 475 de orgánulos, intrones, 758, 759 de polaridad de segmento, 1166 de polaridad del huevo, 1158, 1159, 1169
1-13
de polaridad del segmento y compartimentación, 1178 de proliferación, 966 de quinasa dependiente de ciclina, 956 de regla par, 1165,1168-1170 de regla par y segmentos de blastodermo, 1168F de respuesta primaria, 781F de respuesta rápida, 967,968 de respuesta retardada, 967,968 de RNA 7SL, 423 de rRNA 5S, 369 de segmentación, 1165,1168 de segmentación expresión, 1166 de vertebrados NF-kB, 1160 decapentaplégico, 1161 defectivos Igf-2,482 definición, 487 deformed, 1174 del ciclo de división, 954T del complejo bithorax supresión, 1172F del grupo Polycomb, 1174 delta, 1181 desactivación, 37 dorsales, 1160 doublesex, 487FF dpp, 1161,1179 dsx, 487FF £6, 1378 £7, 1378 en tándem, 414F engrailed, 461F, 1168F, 1169,1178,1184 engrailed expresión, 1170F esenciales, 364 específicos de tejidos, 483 etapas de activación, 466F eucariotas, intrones, 398F eucariotas, proteínas reguladoras, 455F eve, 459 eve, controles combinatorios, 457 even-skipped, 1164F, 1173 expresión, 323,1125 extra sex combs, 1175F fos, 819,969 fragmentados, 418F ftz, 352F, 1169F gap, 498,1165-1167 gap hunchback, 1166F, 1167 gap Krüppel, 1166F -1168 homólogos, familias, 37 Hox de ratón, dominios de expresión, 1183F Hox, regulación, 1186 Hox y extremidades de los vertebrados, 1185 Hox y valores posicionales de vertebrado, 1184 humanos bcl-2, 1153 humanos, tamaño, 365T hunchback, 1168,1173 Igf-2 maternos, mareaje, 482 inactivación, 481F Ir, 1338 K-ras, 1381,1381T kit, mutaciones, 1124F Krüppel, 1165,1168 labiales, 1182F lac de Escherichia coli, 453F lacZ, 449F, 1180F let-23,1147,1150 let-60,1147 leyes, 148T ligados, 327 lin-3,1147,1150 /í'n-14, 1151, 1152 /m-14, mutaciones, 1151F lin-45,1147, 1150 marcadores, 345,453F maternos de los orgánulos, 760 maternos, marcados, 482 MHC de clase 1,1317 miogénicos, 1260 miogenina, 1137,1138F mitocondriales en levadura, 760F mitocondriales evolución, 758 mitocondriales herencia no mendeliana, 759 mutadores, 276 mutantes, detección, 328 mutantes, identificación, 339 mutS, 1383 myc, 967F-969, 1372, 1373, 1381T, 1383 myoD, 474F MyoD, 1138F nanos, 1158F neo, 353F neurogénicos, 1181 neurogénicos delta, 1181F neurogénicos notch, 1181 nucleares en levadura, 760F
1-14
índice alfabético
número, 41 número de nucleótidos, 364 organización, 365F oskar, 1163 p53,953,1350F, 1378, 1379, 1382, 1383 p53, mutaciones, 1378 partidos, 487 piscillata, 1197F pol, 498 polares dorsoventrales del huevo, 1158 purificación, 314 raf, 1150 rag-1,1310,1312,1315 rag-2,1310,1312,1315 ras, 816,818,1150,1370,1371,1383 Rb, 969, 1374, 1375 recA, 285 rediseñados, 347 regiones de control, 452,453F represores, 266 retinoblastoma, 968 RNA 7SL, 424F rRNA, 405 rRNA transcripción, 406F scute, 1180 selectores homeóticos, 438,1166,1171,1174, 1176 selectores homeóticos, mutaciones, 1177 selectores homeóticos, regiones de control, 1172 selectores homeóticos y compartimientos, 1178 selectores homeóticos y discos imagínales, 1176 selectores homeóticos y flor, 1195 sem-5, 816,1147,1150 sev, 817 sex-lethal, 487F silenciamiento, 464 src, 1367 src vírico, 1367 Steel, 1255 supresoresde tumores, 966,1365, 1373, 1377, 1378,1382 supresores de tumores de retinoblastomas, 1375 supresores de tumores, pérdida, 1375F Sxl, 488F tempranos inmediatos, 819 tk, 353F Toll, 1160 torso, 1158F tra, 488F transferidos, expresión, 467T transformer, 487F twist, 1161 ultrabithorax, 1178 weel, 947 white, 465F
wingless, 1170,1179,1184 Wnt-l, 1369F y RNA, 364 Genética, estabilidad, 258 inestabilidad, 1378 inversa, 347 microbiana, 313 molecular, 943 molecular del cáncer, 1365 y Drosophila, 1154 Genético, código degenerado, 245 interruptor, 435 Génica, amplificación, 1379F conversión, 470 expresión, 346F, 495 familia, 329 Génico, control, 429 Genoma(s), 339, 361 ajuste, 413 bacterianos, 387 con secuencias repetidas, 290F de mamíferos, 387 de vertebrados, tamaño, 1184 durante el desarrollo, 1125 evolución, 421 HIV, 305F humanos, 327,339, 361 humanos, secuenciación, 319 humanos, tamaño, 364F mareaje, 481,482 mitocondriales humanos, 756F mitocondriales, tamaño, 754 mitocondriales vegetales, tamaño, 758 nucleares evolución, 413 nucleares organización, 413 replicación única, 388 víricos, 294, 296
Genómica, librería, 335 Genómico, clon, 334F Genoteca, 332 Germinación de plántulas, 1190F Germinales células, 1084 líneas, 1084 GHF, 823 Giardia, 16F, 21F evolución, 763F Giberelinas, 1194 Giemsa, método, 380F Glándula(s) adrenales, 1373 cinéticas de población, 1242 hipófisis, 823 mamarias, 1242F mamarias en reposo, 1242 salivales, 1118 sudoríparas, queratina, 855 suprarrenales, 792 tiroides, hormonas, 789T Glanzmann, enfermedad de, 1069 GlcNAc-fosfotransferasa, 660F GlcNAc-fosfotransferasa, defectos, 659 Gliales, células, 567,1201 Gliceraldehído-3-fosfato, 418, 735, 736, 743 deshidrogenasa, 72F, 128F Glicerol, 48, 69, 87, 542, 703 3-fosfato, 633F Glicina, 76,242, 573,575,1055 canales de cloro regulados, 583T Gliomas, 1347T Glioxilato, ciclo del, 616 Glioxisomas, 615F, 616 Globina, activación global, 466 de cadena única, 416 evolución, 417F familia de genes, 415 primitiva, 416 P-Globina, 417F número de intrones, 365T tamaño del gen, 365T tamaño del mRNA, 365T transcrito primario, 403F Glóbulos blancos, 671, 907,1244,1245F, véase también Leucocitos blancos, concentración, 1246T blancos, fagocitosis, 661 blancos, función, 1246T blancos, migración, 1247F blancos, tipos, 1244 blancos y diseminación por el cuerpo, 1360 fundidos, 227 fundidos, estructura, 227F rojos, 1244,1255, véase también Eritrocitos rojos, concentración, 1246T rojos, desarrollo, 1252F, 1253F rojos, electronmicrografía de criofractura, 527F rojos, función, 1246T rojos, glucoforina, 526 rojos, lesiones de la membrana, 1301F Glucagón,789T Glucocáliz, 517, 535FF Glucocorticoides, 431 receptor de, 606F Glucoesfingolípidos, 634 Glucoforina, 520F, 524F-526,528 destino, 528F Glucógeno, 47, 703 degradación, 789T, 793F, 797T fosforilasa, 704F, 792 gránulos, 704F metabolismo, 792, 794 sintasa, 704F, 792 Glucolípidos, 47, 513, 515F, 516, 634, 676 de superficie, 516 en membrana celular, 514T funciones, 516 neutros, 516F Glucolisis, 15, 70, 72F, 74, 84F, 87FF, 208F, 704 anaeróbica, 17, 699 Gluconeogénesis, 87, 88F Glucoproteínas, 47, 550, 630, 670 cadenas hidrocarbonadas, 187 de la matriz y migración celular, 1059 homologas de adhesión célula-célula, 1121 transmembrana, 1022 transmembrana de unión, 1022 Glucosa, 46, 70, 542 1-fosfato, 704, 736, 792 6-fosfato, 208F degradación, 90F degradación anaeróbica, 15 en medios de cultivo, 169T estructura, 46F hepática, 87 metabolismo oxidativo, 90
oxidación, 46 transportador unidireccional, 557T transportadores pasivos, 557T y hexoquinasa, 209F D-Glucosa, 47F u-Glucosamina, 1045F Glucosaminoglucanos, 1042, 1043 azúcar incorporado, 649 cadenas, 649 estructura, 1043F Glucosidasas, 653 Glucosilación, 649 objetivo, 650 proteica, 630 Glucosilfosfatidilinositol, 518, 535, 676, 1048 anclaje, 632F Glucosiltransferasas, 649, 1045 Glutamato, 235, 573, 575, 582, 583, 675, 1211 canales catiónicos regulados, 583T Glutámico, ácido, 111F, 139 Glutamina, 76, 79 en medios de cultivo, 169T Glutaraldehído, 150,158T, 159 GM, 1253 GM-CSF, células diana, 1253T células productoras, 1253T receptores, 1253T tamaño, 1253T GMP cíclico, 779, 805 cíclico proteínas quinasa dependientes, 812 GNRP, 219, 686,817 Gónadas, 1134 Gonium, 28 GPI, 518, 632,676, 1048 Grabado por congelación, 162 Gradiente centrifugación, 175T de calcio, 551 de concentración, 544 de densidad, 173 de H* y membrana, 76F de hidrógeno, 727 de la proteína bicoide, 490 de morfógeno, 1130F de pl l de la membrana mitocondrial interna, 710 de potasio, 560 de sacarosa, 173 de sodio, 553 electroquímico, 544 electroquímico de protones, 76,697, 707, 710,711,742 electroquímico transporte activo, 712F iónico y transporte activo, 553 morfogénico, 1129 morfogénico anterior, 1163 Gramicidina A, 546 Grana, 20F Granulares células, 1238F Granulocitos, 1244 basófilos, 1244 células diana, 1253T células productoras, 1253T concentración, 1246T CSF, células diana, 1253T CSF, células productoras, 1253T CSF, receptores, 1253T CSF, tañamo, 1253T eosinófilos, 1244 función, 1246T neutrófilos, 1244 receptores, 1253T tamaño, 1253T Gránulos corticales, 1095 de cromatina, 394 de membrana de revestimiento, 1238F de secreción, 671 P, 1006 polares, 1162 unidos a microtúbulos, 846 Grasa, gotas, 703FF Gripe, virus de la, 296F groEl, proteínas, 228F Grupos acetilo, oxidación, 74 aldehido, 46 amino, 45 anteriores de genes de Drosophila, 1158 carboxilo, 45, 82F cetona, 46 de espín electrónico, 512 dinitrofenol, 1286F farnesil, 519F fosfato adición, 783 fosfato y proteínas, 215F geranilgeranil, 519F hemo, 137, 720 hemo unidos, estructura, 721F
índice alfabético
hidroxilo, 45 metilo, 45 Polycomb, 1175F posteriores de genes de Drosophila, 1159 prenil, 518, 519F GTP, 197, 219, 220F, 248 hidrólisis, 218, 220, 221, 867, 868F proteínas de unión, 686, 782 unión, 218 y despolimerización, 860 y polimerización, 860 GTPasa, 218, 219, 576, 801 monomérica, 219, 868, 786, 787, 884 monomérica superfamilia Ras, 816 Rae, 893 RHho, 893 Guanilato ciclasa, 779,806 Guanina, 6,49, 62,103 desaminación espontánea, 267F
Haces contráctiles, 900F contráctiles de actina, 1002F formados por proteínas, 896 Halobacterium, 16F, 593 Hambre, 90 Haploides, células, 1083 Hebra de sellado, 1020F ligera, 758 patrón, 106 pesada, 758 Hélice 98F. 99 a, í 19, 120, 124, 131F, 188T, 227, 437, 518F, 526, 528, 627 a transmembrana, 545,547 a, unión, 231F de DNA desenrollamiento, 273 de DNA muy curvada, 435F de reconocimiento, 437,437F de subunidades proteicas, 130F dextrógira, 99F DNA, leído por proteínas, 433 interruptor, 220,221F levógira, 99F proteínas desestabilizadoras, 273 superenrollada, 120,131F, 231F Heliozoos, 26F Hematopoyesis, 1247,1251F factores de regulación, 1251 Hematoxilina, 151F Hemicelulosa, 1074,1075 Hemidesmosomas, 857,1018T, 1022,1024,1025 Hemo, grupo, 137, 720 Hemoglobina, 106F, 137, 188T, 344, 402, 405, 415, 416, 1252 cadena (i, 328 cadenas, 416 de primates, 316F evolución, 259F, 260T, 316F, 416 enes, 116,319 umana, 261 peso molecular, 175T Hendidura postsináptica, 572 sináptica, 774 Hepadnavirus, 1376T Heparán sulfato, 1043,1045F, 1046,1049T, 1060, 1062 Heparina, 1043 Hepáticas células, 1221 Hepatitis B, 1377 B, virus, 1376T B y cáncer hepático, 1376 Hepatocelulares, carcinomas, 1376T Hepatocitos, 1273 factor de crecimiento, 1230 Heredabilidad independiente, 327 Herencia citoplasmàtica, 759, 760F materna, 761 mendeliana, 760F mitocondrial biparental, 761 mitocondrial uniparental, 761 no mendeliana, 759, 760F y estructura del DNA, 106 Herpes, 294 Herpesvirus, 1376T Heterocariontes, 170, 171T, 531 Heterocromatina, 377F, 378,386,464 transcripcionalmente activa, 378 Heterodimerización, 442 de proteínas con cremalleras de leucina, 442F Heterodímeros de proteínas reguladoras, 455 Heterodúplex, unión, 282F
Heterofflicas, uniones, 1036 Heterozigosis, pérdida, 1375F Heximida, 752 Hexoquinasa, 210,211,884F conformación, 208F reacción, 208F y ATP, 209 y glucosa, 209F HGF, 813 Hialadherinas, 1045 Hialocitos, 1273 Hialuronano, 1044 Hialuronato, 1044 Hialuronidasa, 1045, 1104 Hibernantes, animales, 729 Hibridación de ácidos nucleicos, 313,322,323F del DNA, 284F in situ, 330F, 336 poco rigurosa, 329 rigurosa, 329F sobre filtro, 325F substractiva, 335F Híbridas, células, 170 Hibridomas, 200,1302 de células T, 1331 línea celular, 199 preparación, 200F Hidrocortisona y células hepáticas, 1222 Hidrogenaciones, 66 Hidrógeno átomo, 709 bombeo, 725 enlace, 94 Hidrolasas ácidas, 653 lisosomales, 657,1244,1245 lisosomales, clasificación, 658 lisosomales, reconocimiento, 660F lisosomales, transporte, 658F lisosomales y M6P, 659 Hidrólisis, 78 de ATP, 67, 68, 78, 79F, 81F, 141, 222F, 549 de ATP, ruta alternativa, 80F de GTP, 218, 220, 221, 867, 868F de GTP y EF-Tu, 221F de PIP,, 798F del enlace amida, 139 del pirofosfato, 79 HidroxUisina, 1055 residuos, 1051F Hidroxilo, grupos, 45 5-Hidroximetu-C, 297 Hidroxiprolina, 1055,1075 residuos, 1051F Hidroxiurea, 952,953F Hidruro del NADPH, 82 Hierro, elementos de respuesta, 495 oxidación, 65 Hierro-azufre, proteínas, 721 Hígado, 1118 cáncer de, 1376T, 1377 estructura, 1229F fetal, 1281,1282 funciones, 1227 hormonas, 789T Hijo-de-semzfess, 818 Hipermastiginos, mitosis, 1010 Hipermutación somática, 1311 somática dirigida por el antígeno, 1310 Hipervariables, regiones, 1303 Hipocampo, 582 potenciación a largo plazo, 582 y aprendizaje, 583 Hipodermis, 1220F Hipótesis de la señal, 622 endosimbiótica, 762,763 quimiosmótica, 707 señal original, 622F una banda de gen, 376 Hipoxantina, 267 Histamina, 671F, 674,1296 secreción, 797T, 1297F Histidina en medios de cultivo, 169T Histocompatibilidad, complejo principal, 1316 moléculas de, 1317 Histonas, 27, 28F, 280, 366, 369, 399, 414, 462, 495F, 497, 599, 952 de nueva síntesis, 389 H l, 367, 370, 377, 940, 1000 H l, fosforilación, 978 H2A, 366, 377 H2B, 366, 377 H3, 366 H4, 366 H4, evolución, 260T H4, secuencia de aminoácidos, 366F nucleosómicas, 366 octámeros, 367, 368F
1-15
paternas, 389 síntesis, 929 transporte, 602 y cromatina activa, 377 y DNA, 367,389 y fase S, 389 HIV.304,484,1322, 1327 genoma, 305F HIV-1,1376T enzimas, 303F HLH, 442 HMG 14,377 HMG 17,377 HNPCC, 1383 síndrome, 1362 hnRNA, 395, 397 nuclear, 397T transcritos, 398 y mRNA, 398 hnRNP, 404 partículas, 398 Hoescht 33258, 380F Hojas de planta C3, 737F de planta C4, 737F formación, 1192 'erminales, 1115 iday, unión, 287 Hombre, fusión de dos cromosomas, 381 genoma mitocondrial, 756F Homeodominios, 438F comparación, 127F de unión al DNA, 1172 familia, 127 Homofílicas uniones, 1036 Homogenado, 172 Homología, clonaje, 786 Hongos, genes mitocondriales, 759 meiosis, 288 septum, 1009 tamaño del DNA mitocondrial, 753T Hormona(s), 774,786,789T adrenocorticotropa, 789T concentración, 774 del crecimiento, 1265 del crecimiento humanas, 821F eritropoyetina, 1252 esteroideas, 779, 780,808,958 esteroideas, duración de la respuesta, 781 esteroideas, receptores, 185 esteroideas, síntesis, 619 esteroideas, superfamilia de receptores, 780 estimuladoras de la tiroides, 789T luteinizantes, 789T peptídicas, 1228 polipeptídicas, 672 proteicas, 782 reproductoras y cáncer, 1358 sexuales, 780 solubles en agua, 781 tiroideas, 779, 780, 789T tiroideas, duración de la respuesta, 781 vegetales, 1194 y AMP cíclico, 789T Horquilla beta, motivo, 123F de replicación, 273,276F, 382,383,387 de replicación del DNA, 269,270F de replicación en la fase S, 385F de replicación en mamíferos, 384F de replicación, iniciación, 277 de replicación, proteínas, 275F de replicación, velocidad, 385 Hoxa-1, 1182F Hoxb-1, 1182F Hoxd-1, 1182F Hpall metilasa, 479 HPLC, 179 hsp BIP, 228 hsp60 de mitocondrias, 228 proteínas, 227,228F hsp70 citosólica, 611F de mitocondrias, 228 proteínas, 227, 228F Hsp90, 780F HTLV-I, 1376T Huellas dactilares, 184 del DNA, 318, 320-322 genéticas, 342F Hueso, 1119 carga que debe soportar, 1268 compacto, 1268F crecimiento por aposición, 1266 hormonas, 789T largo, 1268F largo desarrollo, 1269F largo remodelado, 1270F remodelación, 1265
f
1-16
índice alfabético
resorción, 789T Huevo, activación, 935F asimetrías, 1113F de Drosophila gradiente dorsoventral, 1160 de ratón, 1131 de Xenopus, asimetrías, 1127,1128 de Xenopus, división, 937F fecundado, síntesis de proteínas, 938 genes de polaridad, 1158 maduración, 935F maduro de Xenopus, 934F polaridad, 1112 segmentación, 934F, 1112,1113 Humo del tabaco, 1355,1358 Hurler, enfermedad de, 659,660 Huso, corpúsculo polar, 893 cromosomas y unión, 992 metafásico, 987F metafásico, dinámica de microtúbulos, 993 mitótico, 25, 861, 926, 977, 978, 980, 985F, 987F mitótico bipolar, 987F mitótico, cambio de posición, 1002 mitótico, metafase, 994F mitótico y segmentación citoplasmática, 1001 repelencia de cromosomas, 991 Hydra, alimentación, 33F natación, 33F organización corporal, 32F
ICAM, 1037 1CAM-1, 1330 Ig secuencias de DNA, 1304F IgA, 1296,1313 propiedades, 1297T transporte a través de una célula epitelial, 1296F IgC, 1295 IgD, 1295, 1313 propiedades, 1297T síntesis, 1313F IgE, 1296,1313, 1333 función, 1297F propiedades, 1297T IGF-1,814, 959T, 1265 IGF-2, 481, 959T IgG, estructura plegada, 1305F propiedades, 1297T IgM, 1294, 1312, 1313 estructura, 1295F propiedades, 1297T síntesis, 1313F IL -1 ,1329 acción, 1334T diana, 1334T peso molecular, 1334T IL-2,821, 1333 acción, 1334T diana, 1334T peso molecular, 1334T * 1L-3, 959T, 1252, 1255 acción, 1334T células productoras, 1253T diana, 1253T, 1334T peso molecular, 1334T receptores, 1253T tamaño, 1253T IL -4 ,1333 acción, 1334T diana, 1334T peso molecular, 1334T IL -5 ,1333 acción, 1334T diana, 1334T peso molecular, 1334T II.-6 acción, 1334T diana, 1334T peso molecular, 1334T Imágenes, intensificación, 155 procesamiento, 154 procesamiento electrónico, 155F tridimensionales, 161 Imago, 1155 desarrollo, 1174 Immunoblotting, 182F Importación a los peroxisomas, 597T, 616 mitocondrias, 597T núcleo, 597T retículo endoplasmático, 597T Impulso nervioso, 564 Inactivación, centro de, 478 de genes de Drosophila, 478 de genes de levadura, 478
del canal, 571 del cromosoma X, 477F, 1138 génica selectiva, 353F Inclusión, 150 Incrementadores, 422, 451 Indicadores emisores de luz, 193 fluorescentes, 193, 195F fluorescentes de calcio, 194F luminiscentes, 193 índice de hidropatía, 520F de mareaje, 928 mitótico, 928 Inducción de la vulva, 1146F mesodérmica, 1127F, 1128 mesodérmica, señales, 1128F secuencial, 1127F Inductor de tumores, 169 Infarto de miocardio, 664,665 Infección bacteriana, 1247, 1298 lítica, 301 por protozoos, 1247 y complemento, 1298 Influencia temporal, diferenciación, 1131F Información genética, 237 posicional, 1139 Ingeniería de DNA, 342 genética, 313, 314, 316,328 Inhibición de la división celular dependiente de la densidad, 963 lateral, 823, 824,1180F lateral dependiente de Notch, 1181 lateral, inactivación, 1181F lateral y tipos de células diferenciados, 1180 por retroalimentación, 87F Inhibidor competitivo, 547 de la síntesis de proteínas, 256T de la síntesis de RNA, 256T de la tripsina pancreática básica, 122 de la unión a DNA, 1138F tisularde metaloproteasas, 1066 Iniciación, codón de, 250, 251 de la horquilla de replicación, 277 factor de, 249,254 frecuencias, 395 Iniciador tumoral, 1355F Inicio de la traducción del mRNA, 492 de síntesis de RNA, 240F de transferencia de señal, 626 quinasa, 950 superación, 950 y levadura de fisión, 950F Injerto, rechazo, 1317 Inmune, respuesta, 851 Inmunidad, base celular, 1280 de los recién nacidos, 1282 especificidad, 1279 Inmunitarias, moléculas de reconocimiento, 1339 Inmunitario, sistema, 1270 y sigs. Inmunocitoquímica indirecta, 199F Inmunoensayos unido a una enzima, 199 Inmunofluorescencia, 198F Inmunoglobulinas, 230,344,417F 1037,1280, 1291 y sigs. bucles hipervariables, 1305 cadenas, 1302F dominios, 125F, 1304, 1304F lámina p, 119F, 1305 plegamiento, 1305 proteínas de membrana, 1340F región C, 1308 región V, 1308 superfamilia, 1305 Inmunolocalización en microscopía electrónica, 199F Inmunología, 1279 Inmunológica adquirida, tolerancia, 1289, 1290 autotolerancia, 1336 memoria, 1288 natural, tolerancia, 1290 tolerancia, 1290F Inositol, fosfolípidos de, 514, 796, 801F trifosfato, 197, 796-798F Insectos, regiones del cuerpo, 1184F y mamíferos, comparación del desarrollo, 1183 Inserción y mutagénesis, 1369F Inserto de DNA, 333, 339 Insomnio, 576 Insulina, 134, 959T bovina secuencia, 183T en medios de cultivo, 169T genes, 319,418 número de intrones, 365T puentes disulfuro, 135F secuencia, 108, 109F tamaño del gen, 365T tamaño del mRNA, 365T
Insulina-2, factor de crecimiento similar, 481 Integración de señales, 785F neuronal, 580 Integrasa, 293F, 473 de retrovirus, 498F lambda, 290, 291F y fibronectina, 1068 ylamininas, 1068 Integrinas, 537, 823, 902, 1024, 1033, 1036, 1041, 1067, 1069, 1072T, 1107, 1205, 1287 P2, 1068 Pj, 1068, 1070 afinidad por el ligando, 1067 como heterodímeros transmembrana, 1068 de las células sanguíneas, 1072T regulación de la actividad, 1070,1071F y cascadas de señalización intracelular, 1071 y cationes divalentes, 1068 y citoesqueleto, 1069 y comunicación celular, 1069 y contactos focales, 903F Intensificación de imágenes, 155 Interacciones antígeno-anticuerpo, 1293F, 1297 de corto alcance célula-célula, 1130F DNA-proteína, especificidad, 440 inductivas, 1127 proteína-proteína, 232 Intercalación, principio, 1142 y valores posicionales, 1140 Intercambiador calcio-sodio, 795 de aniones, 557T de cloro-HC03, 554 de cloro-HCOj impulsado por sodio, 554 de sodio-hidrógeno, 554 Intercambio cruzado de cadenas, 287 rotatorio, 994 rotatorio de actina, 884 Intercelular adhesión, 1032 moléculas de adhesión, 1034 unión adherente, 1022 Interfase, 361, 926ysigs., 981F replicación del DNA, 940 Interferón, genes, 319 Interferón-a, 1325, 1333 acción, 1334T diana, 1334T peso molecular, 1334T Interleuquina, 1283,1316,1333 Interleuquina-1, 656,1329 Interleuquina-2,821,959T, 1331 Interleuquina-3, 959T, 1252 células diana, 1253T células productoras, 1253T receptores, 1253T tamaño, 1253T Interleuquina-4, 1333 Intermediario azúcar-nucleótido, 632 de alta energía, 79 globular fundido, 226 Intermedios, filamentos, 843,844,1072T tetraédricos, 139F Interneuronas retinianas, 1225 Internudos, 1192 Interruptor genético, 435, 473 genético, evolución, 461 genético, funcionamiento, 445 regulador de tipo, 473F Intestinales, paredes, 1017F Intestino, 1118 de Caenorhabtidis elegans linaje celular, 1145F delgado, banda de adhesión, 1023F delgado, células calciformes, 644F delgado, células epiteliales, 1020F delgado, desmosomas, 1025F delgado, hemidesmosomas, 1025F fagocitosis, 661 primitivo, 1114 revestimiento epitelial, 1228F Intracelular, proteínas de adhesión, 1022 Intrones, 110F, 335,365,417,419, 759 actividad catalítica, 113 ambigüedad, 485 antigüedad, 417 automadurativos de Tetrahymena, 115 de automaduración, 404F del grupo I, 403, 404F del grupo II, 403,404F, 405 extremos, 115F número, 365T opcionales, 759 pérdida, 418 tamaño, 400 triosafosfato isomerasa, 418 Intrónicas, secuencias, 395 Inversiones, 414
índice alfabético
de DNA en bacterias, 470F Involución mamaria, 1243 Involucrina, 1239, 1241 Iones de calcio, 590 hidruro, 75, 80,709 inorgánicos, porcentaje del peso celular, 45T inorgánicos, transporte mitocondrial, 710 y potencial de membrana, 563F Ionóforo A23187, 546 de calcio, 801 de hidrógeno, 727 y permeabilidad de membranas, 545 Ionomicina, 801 Iontoforesis, 196F IP3, 797 IRS-1, 814 Islas CG, 483 de maduración, 405F ricas en CG de mamíferos, 482 Isoeléctrico punto, 181 Isoelectroenfoque, 181F, 182FF Isoenzimas, 87F Isoformas, 545 proteicas, 487 Isoleucina en medios de cultivo, 169T inhibición por retroalimentación, 87F Isomerización de cadenas cruzadas, 287 de entrecruzamiento de cadenas, 288F Isotipos de conexina, 1027 Isótopos, 189
K Kanamicina, resistencia a la, 354F Kaposi, sarcoma de, 1376T Krebs, ciclo de, 73, 705 y sigs. Krüppel, 436T Kupffer, células de, 1229F, 1231
Labio dorsal, 1115 Láctico, ácido, 90 deshidrogenasa, dominios, 125F Lactosa, metabolismo, 37 Lambda, proteínas represoras, 473 Lamelipodios, 849, 850F, 887, 1204 dinámica, 888F Lámina a, modelo espacial, 121F p, 119, 124, 188T, 227, 229F, 230, 437 p antiparalela, 119 P cerrada, 530 P, modelo espacial, 121F P paralela, 120 P, reconocimiento del DNA, 440 basal, 1025,1032F, 1042,1059,1232 basal como barrera selectiva, 1063 basal, estructura, 1060,1063F basal, funciones, 1062 basal, organización, 1061F basal y receptor de acetilcolina, 1064 basal y regeneración de tejidos, 1063 basal y unión neuromuscular, 1065F celular, 1020F densa, 1061 epitelial, invaginación, 1023F fibrorreticular, 1061 lúcida, 1061 media, 1075 nuclear, 359F, 594F, 599, 604F, 852, 855T, 857, 858F, 1000 nuclear, despolimerización, 605 nuclear y cromatina, 604 proteica, 132 rara, 1061 Laminina, 168, 857, 940, 965, 1042, 1043, 1060, 1062, 1065, 1122, 1205, 1234, 1316 e integrasas, 1068 estructura, 1062F fosforilación, 605F mutante, 940 nuclear, 604 residuos de serina, 858 Langerhans, células de, 1238F, 1328 Larva, 1155 Latencia vírica, 301 Lck quinasa, 1329 LCR, 466 LDL, 664F Leche, producción, 1242 Lecitina, 633 Lectinas, 535, 1037,1257
de superficie celular, 1287 Lectura pautas, 111,249 traduccional pauta, 498F Leptoteno, 1090 Leucemia, 1347T, 1352,1358 de las células pre-B, 1368T de las células T, 1376T fase crónica temprana, 1353 mielógena crónica, 1370 mielógena crónica, origen genético, 1348F virus tipo 1,1376T y diferenciación celular, 1360 Leucina, cremallera de, 441F en medios de cultivo, 169T motivo cremallera, 440 Leucocitos, 1244, véase también Glóbulos blancos basófilos, concentración, 1246T basófilos, función, 1246T concentración, 1246T eosinófilos, concentración, 1246T eosinófilos, función, 1246T función, 1246T monocitos, concentración, 1246T monocitos, función, 1246T neutrófilos, concentración, 1246T neutrófilos, función, 1246T polimorfonucleares, 1244 I^eucoplastos, 731 Leucotrienos, 775F Levadura, 943 cambio de forma, 945 ciclo de Cdc2, 951F clonaje, 943 con plásmido bacteriano, 382 cromosomas, 319,361 de fisión, 943,945 de fisión, ciclo vital, 944F de fisión e Inicio, 950F de fisión mutante, 947F de fisión, tamaño, 948 de gemación, 945,950 de gemación y ciclina G,, 943 de mitocondrias, 761F deficiente en profilina, 886 genes de fisión, 954T genes de gemación, 954T mutantes diminutos, 761 polarización morfológica, 893F proteína reguladora, 470 tipo celular, 471F tipo de apareamiento, 472F topoisomerasa II, 280 transportador ABC, 557 Leydig, células de, 619F Leyes deAbbé, 148T LFA-1, 1068, 1072T LFI, 789T Li-Fraumeni, 1378 Librería de cDNA, 334,335, 337 de cDNA y mRNA, 335 de DNA, 171 de DNA, detección de clones, 335 de DNA genómico, 333 de DNA genómico humano, 363 de DNA, vectores víricos, 332 genómica, 335,335 genómica de clones ordenados, 339 Libres de células, sistemas, 175T Librium, 576 LIF, 1134 Ligamiento, estudio, 338 genético, 327 Ligando, 135, 207, 773 acoplamiento, 210 CD40,1332 genes activados, 779 inhibidor, 212F inhibidor, cinética, 211F y moléculas de agua, 136 y proteínas, 208 Ligasa, 952 Límites de resolución, 149 Líneas celulares, 957 celulares de hibridomas, 199 celulares eucariotas, 169T celulares HeLa, 171T celulares L, 17 IT celulares transformadas, 169 de células T, 1331 germinales, 1084 M del músculo, 909F Z del músculo, 910 Linfocito(s), 820, 1220, 1244, 1245, 1280, 1283F B, 199, 200, 335F, 489F, 1245, 1273, 1281 y sigs. B, cáncer, 1376T
1-17
concentración, 1246T función, 1246T maduración, 1288 migración, 1287,1288F no deseables, 1153 receptores de superficie, 1285 recirculación, 1286 T, 335,335F, 1071, 1251F, 1253T, 1273 T citotóxicos, 558 T colaboradores, 304 tamaño, 960F y marcadores de superficie celular, 1283 Linfoma, 1347T de Burkitt, 1370, 1376T de Hodgkin, 1358 Linfoquinas, 1283,1316 Unkage, 232 Lipasas, 653 Lípidos de membranas, 510 degradación, 69 en dominios de membrana, 534 flip-flop, 633 importación a mitocondrias, 762 micela, 511F transportadores dolicol, 631F Upoamida reductasa transacetilasa, 705F Lipocitos, 1273 Lipoproteínas de baja densidad, 664F Liposomas, 512F Lipoxigenasa, 775F Lisina, 1053F en medios de cultivo, 169T inhibición por retroalimentación, 87F Usosomas, 24, 175T, 347, 590F, 591T, 594, 641, 1244 bomba de hidrógeno, 653F morfología, 654F pH ácido, 653F transporte, 656 transporte a la red del trans Golgi, 652 y endosomas tardíos, 666F y fagosomas, 662 y membrana plasmática, 668F Lisozima, 188T, 344 Listeria monocytogenes, 890F monocytogenes y actina, 889 Localizadores de receptores, 1287 Loci genéticos, 1085 MHC, 1323F MHC de clase II, 1318F Locomoción celular, 888,907 Locus del tipo de apareamiento, 471 MAT, 472F Lou Gehrig, enfermedad de, 1207 LTP, 582 Lugar A del ribosoma, 251 aceptor, 400 activo, 211 dador, 400 de corte 3’, 400 de corte 5’, 400 de entrada del ribosoma interno, 493 de unión a un ligando evolución, 128F de unión al antígeno de anticuerpos, 1292 de unión aminoacil-tRNA, 247 de unión peptidil-tRNA, 247 hipersensible a nucleasas, 369 P, 247,248 P del ribosoma, 251 regulador, 211 Lumen del retículo endoplasmático, 594F, 617 Lupus eritomatoso sistèmico, 399 Luz y desarrollo de la flor, 1195
M M-CSF, 813 células diana, 1253T células productoras, 1253T receptores, 1253T tamaño, 1253T M6P, 657 e hidrolasas lisosomales, 659 Mac-1,1068,1072T Macrófagos, 656, 661,662F, 1219, 1244, 1253T, 1273, 1321 CSF, células diana, 1253T CSF, células productoras, 1253T CSF, receptores, 1253T CSF, tamaño, 1253T hepáticos, 1231 producción, 1253 Macromoléculas, 45 a alta resolución, 163
1-18
índice alfabético
enlaces débiles, 94 porcentaje del peso celular, 45T poros nucleares, 603 respuesta inmunitaria, 1279 síntesis, 83F Maduración alternativa del RNA, 484,485F control, 486F de la afinidad, 1298,1311 del RNA, 360, 400F, 403 del RNA por corte y empalme, 241, 398 factor promotor, 935 islas, 405F oocitaria, 1097 por corte y empalme, 110,175, 324, 401F trans del RNA, 490 Magnetización intrínseca, 186 Malaria, 557,1339 Mamarias, glándulas, 1242F Mamíferos, 350 complejos de HOM, 1183 cromosomas, 386 desarrollo embrionario, 35F desarrollo temprano, 1131 genes de globina, 465 enomas, 387 orquilla de replicación, 384F islas ricas en CG, 482 mitosis, 981F regiones de control, 458 Mañosa, 648F 6-fosfato, 657, 659F 6-fosfato, adición a glucoproteínas, 659 6-fosfato, síntesis, 659F Manosidasa, 648F Mantenimiento genes, 482 MAP, 819, 870, 871 tipos, 870 y regiones especializadas del citoplasma, 870 MAP-2, 871 MAP-quinasa, 818 MAP-quinasa-quinasa, 819 MAP-quinasa-quinasa-quinasa, 820F Mapa corporal, forma, 1111 cromosómico, 337 de alta resolución de distribución de RFLP, 327 de destino, 1116 de restricción, 315,316F, 325, 326 físico, 326 genético de ligamiento, 326 geométrico de Drosophila, 1158 neuronal, 1207 peptídico, 183, 183F retinotectal, eliminación de sinapsis, 1209F Mapaje genético, 339F Máquina de replicación, 275 proteica, 225 Maquinaria de fusión de membrana, 689 Marca de espín, 512 Marcadores, 1283 de superficie celular y linfocitos, 1283 en el cruzamiento, 326 moleculares de dirección, 1172 proteicos de orgánulo, 687 químicos de DNA, 318 RFLP y entrecruzamiento genético, 328F Mareaje de células con anticuerpos, 166 de epítopos, 349 del genoma, 481,482 índice de, 928 radiosiotópico, 190 vectorial, 524 Mares primitivos, hierro ferroso, 748 Marfan, síndrome de, 1057 Masa celular interna, 1133 Masaje proteico, 228 Mastocitos, 1246,1296, 1297F MAT, 471 a,, 436T Material genético, empaquetamiento, 26 genético, pérdida, 37 pericentriolar, 865 Matriz del centrosoma, 865, 866F, 978 extracelular, 32, 1017,1021,1041,1055F, 1219 extracelular, degradación, 1065 extracelular, macromoléculas, 1064F extracelular, orientación, 1042 extracelular, producción, 1042 mitocondrial, 700 nuclear, 412 y células del tejido conjuntivo, 1264 MCP, 830 MDR, 557 mdrl, 1363 Mecanismo autocrino, 1331 cassette, 472 Media blástula, transición, 1114
luna gris, 1113,1115 Mediadores intracelulares, 776, 787 locales, 773 Medio de cultivo, 168,169T, 171T HAT, 171T libre de suero definido químicamente, 168 Mediolateral, eje, 1112 Médula espinal, 1119, 1200 espinal, cono de crecimiento, 1203F espinal, motoneuronas, 578F ósea, 1247, 1248F, 1281F, 1282 ósea, metástasis, 1346F ósea y células sanguíneas, 1246 ósea y respuesta inflamatoria, 1247 Medusas, 32 Megacariocitos, 1244,1248F, 1249,1273 concentración, 1246T factores del desarrollo, 1254 función, 1246T Meiosis, 281, 287, 1083, 1086 I división, 1087F, 1089F II división, 1087 duración de las etapas, 1093F metafase I, 1091 y mitosis, 1088 Melanocitos, 1220, 1274, 1238F Melanoma, 1348 maligno, 1347T Membranas, 130 basales, 1061 basales y migración celular, 1064 basales y sinapsis, 1063 biológicas funciones, 509 celulares, 47, 509F, 591T celulares, carbohidratos, 650 celulares, composición, 514T celulares de eritrocito, banda 3, 527 de eritrocito, 524 de las vesículas secretoras, 59IT de los lisosomas, 59IT de los peroxisomas, 59IT del complejo de Golgi, 59IT del endosoma, 59IT del retículo endoplasmático, 1324 del retículo endoplasmático liso, 591T del retículo endoplasmático poro acuoso, 625F del retículo endoplasmático rugoso, 59IT del retículo endoplasmático y lisosomas, 668F del tectum posterior, 1208 endoplasmáticas y lisosomas, 668F enzimas ligadas, 553 excitabilidad, 541 excreción, 541 externas de bacterias, 530 externas mitocondriales, 700 externas, origen, 10 formación, 11F función de barrera, 541 fusión, 691F internas, 24 internas de las células eucariotas, 23 internas mitocondriales, 700 intracelulares, 142 lípidos, 510 mitocondriales internas, 706, 708T, 743 mitocondriales internas, fosfolípidos, 710 mitocondriales internas, gradientes de pH, 710 mitocondriales internas, proteínas, 710 mitocondriales, puntos de contacto, 609 mitocondriales, transportadores electrónicos, 709 multipaso, 527 negras, 512F nucleares, 591T, 1000 nucleares externas, 599 nucleares internas, 599 plasmáticas, 11,36, 509, 59IT plasmáticas bacterianas y proteínas, 625F plasmáticas, caveolas, 680F plasmáticas, complejo de señalización, 1329 plasmáticas, dominios, 534F polaridad, 595F postsinápticas, 582, 773 potencial, 560 potencial de reposo, 561 propiedades eléctricas, 558 proteínas, 517 proteínas alostéricas unidas, 223 proteínas periféricas, 519 púrpura, 593 púrpura de Halobacterium, 534 repolarización, 581 tilacoidales, 607, 732F, 733 tilacoidales transporte de proteínas, 612 transporte, 542 transporte de iones inorgánicos, 541
transporte de moléculas, 541 y citoesqueleto, 894 y concentraciones iónicas, 542T y gradiente de H*, 76F y primera célula, 10,11 Memoria autocrina, 1138 celular, 34, 387, 469, 474F, 476, 777, 1135, 1220, 1289 citoplasmàtica, 1138 inmunitaria, fundamentos celulares, 1289F inmunológica, 1288 nuclear, 1138 Mensajeros intracelulares, 787 Mercaptoetanol, 179 Meristemos, 1073,1190 apicales, 355, 1190, 1191F, 1192 Merkel, células de, 1238F Mesénquima, 1115, 1118 Mesodérmica, inducción, 1127F Mesodermo, 1115, 1118 fragmentación, 1120 Mesófiío, células del, 736 Mesosomas, 594F Metabólicas, reacciones, evolución, 14,15 Metabolismo, 74 aeróbico, 705,706 árbol filogenètico, 15 celular velocidad, 141 de los carbohidratos, 1229 del calcio, 780 del glucógeno, 792, 794 energético mitocondrial, 707F intermediario celular, 590 lipidico, 24F oxidativo de la glucosa, 90 oxidativo y mitocondrias, 21 y transiciones alostéricas, 210 Metabolitos de la digestión, 641 transporte mitocondrial, 710 Metafase, 926,981F, 984,992 I , 1091,1093 II, 1093 microtúbulos cinetocóricos, 995F Metalización de muestras, 158T Metaloproteasas, 1065 Metástasis, 1346F capacidad de formar, 1361,1362F etapas, 1361F y lámina basal, 1360 Metilación del DNA, 481F del DNA, herencia de patrones, 480F del DNA, patrón, 479 del DNA y desarrollo, 480 en células de vertebrados, 479 Metilasa de establecimiento, 480 de mantenimiento, 479 5-Metilcitosina, 479F Metilguanosina, 252 Metilo, grupos, 45 Metiltransferasa, 832 Metionina, 246, 251 en medios de cultivo, 169T inhibición por retroalimentación, 87F N-terminal, 235 S, 938 Metotrexato, 1363 MHC, 1316, 1317 loci polimórficos, 1317 mimetismo, 1339F restricción, 1323 Miastenia gravis, 1290 Micelas, 511 de lípidos, 511F Micoplasmas, l i , 364F Microcuerpos, 591 Microelectrodos intracelulares, 191 ion-selectivos, 193F Microespinas, 849, 887,895,903, 1204 celulares, 850F Microfibrillas, 1056 de celulosa, 1074 de celulosa, orientación, 1076F, 1078F de celulosa y crecimiento celular, 1076 c^-Microglobulina, 1317,1318 Microinyección, 195,197 Microorganismos, fagocitosis, 661 Micropipetas, 192 para registro zonal, 193F Microscopia convencional y confocal, comparación, 156F crioelectrónica, 163,164 de campo claro, 154F de campo oscuro, 154F de células vivas, 154 de contraste de fases, 154F de contraste de fases interferencia!, 154F
índice alfabético
de fluorescencia, 153F de interferencia asistida por ordenador, 155 de Nomarski, 155F de objetos tridimensionales, 155 electrónica de barrido, 161F electrónica de criofractura, 162,163F electrónica de grabado por congelación, 162 electrónica, muestras al vacío, 159 óptica, 147 óptica de contraste vídeo-amplificada, 148T Microscopio compuesto, 148T contraste de fases interferencia!, 153F de barrido confocal, 155,157F de barrido confocal de fluorescencia, 156F de contraste de fases, 148T, 153 de contraste interferencial, 148T de fluorescencia, 152F, 194 de rastreo confocal, 148T electrónico, 148,155F, 157 electrónico de barrido, características, 159F electrónico de transmisión, 157,162 electrónico de transmisión, características, 159F electrónico, historia, 158T electrónico, límite de resolución, 157F electrónico, preparación de muestras, 159 óptico, características, 159F óptico, contraste, 153F óptico, resolución, 149 óptico, tipos, 154F Microsomas, 172,620 aislamiento, 621F centrifugación en equilibrio, 621 rugosos, 620 Microsporidios, 16F, 21 evolución, 763F Micrótomo, 150F Microtúbulos, 25, 26, 28F, 175, 359, 646F, 843,844, 858,860, 861F, 1119F acortamiento, 846F adición de subunidades, 991F alargamiento, 862 astrales, 986,999 captura de cinetocoros, 990F casquete de GTP, 868 centro organizador, 866F, 978 cinetocóricos, 986,988F cinetocóricos, desensamblaje, 996 cinetocóricos, extremos más, 991 clases, 985F crecimiento, 846F, 865F decoración con ganchos, 864F deslizamiento, 876F despolimerización, 849,851, 862,997 dinámica, 844 dirección de desplazamiento, 872 distribución interfásica, 865F estabilización selectiva, 987F estructura, 860 extremo más, 864 extremo menos, 864 extremos, 863 flujo, 198F inestabilidad dinámica, 867F interfásicos, 986 labilidad, 861 maduración, 869 mitocondrias, 699F nucleación, 862 orientación cortical, 1078F orientación en las células, 864F polares, 979F, 986, 987, 1004 polaridad, 844 polimerización, 862 proteínas asociadas, 870F proteínas motoras, 848F, 872 recambio, 866 solapados, deslizamiento, 998F solapamiento, 987 ubicación, 846 velocidad de desplazamiento, 872 y centro de la célula, 847F, 848 y colchicina, 994 y filamentos de actina, 850 y morfogénesis celular, 868 y orientación de la celulosa, 1191 y paredes celulares, 1076 y polarización celular, 869F y ribosomas, 871 Microvilli, 904F y actina, 902 Mielina, fabricación, 858 vaina, 36 Mielinización, 567, 569F Mieloma múltiple, 1302 proteínas, 1302
Migración celular y glucoproteínas de la matriz, 1059 celular y membrana basal, 1064 de cadenas, 286,286F de la bifurcación, 286 Mioblastos, 474,1260 diferenciación, 1260 en el adulto, 1261 fusión, 1260F Miocardio, infarto de, 664 Miofibrillas, 175T, 901,910 del músculo esquelético, 909F elasticidad, 916 Miogenina, 475,476,1137 Mioglobina, 405 de cachalote, 188T hélice a, 120F Miosina, 162F, 224F, 474, 848, 852, 898, 1258 cambio de conformación, 223F dominio cabeza, 223F estructura, 222,223F extremo barbado, 912 extremo puntiagudo, 911 filamentos gruesos, 912F fosforilación de la cadena ligera, 918 quinasa de la cadena ligera, 802,919 y ATP, 223F y células eucariotas, 898 y segmentación, 1003 Miosina-I, 899F, 904F, 906 en una ameba, 908F funciones, 900F Miosina-II, 899F, 919,978 en una ameba, 908F ensamblaje controlado, 901F estudios genéticos, 908 funciones, 900F Mitocondrial, DNA, 754T interna, membrana, 706 proteína precursora, 607 Mitocondrias, 20F, 21, 36, 69, 75, 148T, 173, 590F, 59 IT, 594 697,699 apareamiento codón-anticodón, 757 biosíntesis, 751 biosíntesis de proteínas, 752F código genético alterado, 757 código genético mitocondrial, 757 código genético y evolución, 757 codón AGG, 757 compartimientos, 607F, 700 de animales, sistema genético, 757 de levadura, 761F del tejido adiposo marrón, 728 desplazamiento, 699 división, 752FF DNA, 5, 698, 753T, 754 errores por nucleótido, 758 espacio de la matriz, 607 espacio intermembrana, 607 evolución, 749F, 762, 764 fraccionadas, 700F genomas, 751 gradiente electroquímico, 608 importación, 597T importación de lípidos, 762 importación de proteínas, 608F membrana externa, 607 membrana interna, 517, 607 membranas, 700 metabolismo energético, 707 microtúbulos, 699F organización, 701F origen, 594F, 763F péptido señal, 608F plasticidad, 698F proteínas específicas de tejido, 762 RNA, 252 secuencias codificantes, 757 secuencias de DNA reguladoras, 757 señal de stop, 757 transporte de proteínas, 607 y células eucariotas anaeróbicas, 23 y fosfolípidos, 634 y metabolismo oxidativo, 21 y proteínas desplegadas, 610F y relación ATP-ADP, 711 Mitosis, 28F, 926F, 930F, 977, 978, 985, 1091 de células vegetales, 984F, 1008F de mamífero, 981F separación de cromosomas, 1091 suicida, 940 y bloqueo de las re-replicaciones, 941 y conversión génica, 288 y degradación de la ciclina, 939 y envoltura nuclear, 604 ymeiosis, 1088
1-19
y MPF, 935 y nucléolo, 409 y regulador citoplasmàtico, 935 Mitótica, segregación, 760 Mitótico, índice, 928 Mixobacterias, 28,29F MMTV, 1369F Moco, secreción, 676 Modelaje de la ramificación de la planta, 1193 Modificaciones post-transcripcionales, 243 Módulos de la planta, 1192 e interacciones proteina-proteina, 230 en línea, 230 enchufe, 230 kringle, 230 proteicos, 129F, 229F Mono del cieno, 907 Molde complementario, 6F Moléculas 1 de adhesión intercelular, 1330 antipáticas, 10,11 510 autorreplicantes y selección natural, 7,8 biológicas actuales, 4 cargadas y bicapas lipídicas, 543 catalíticas originarias, 5 celulares, cuantificación, 189-201 de adhesión célula-célula homofílicas, 1205 de adhesión celular, 1121 de adhesión de las células neurales, 1037 de adhesión intercelular, 1034,1037 de adhesión intercelular neural Ll, 1038 de DNA recombinantes, 315 de histocompatibilidad, 1317 de reconocimiento inmunitario, 1339 de RNA, selección, 10 de superficie celular, 1038 empaquetadas, 197F empaquetadas fluorescentes, 197 fluorescentes, 155 intracelulares y velocidad de recambio, 778 introducción en la célula, 194 marcadas radioisotópicamente, 192F MHC, 1316, 1335 MHC, clases, 1317 MHC de clase 1,1316,1324 MHC de clase 1, distribución celular, 1321T MHC de clase I, dominios, 1321T MHC de clase I, estructura, 132 IT MHC de clase I, funciones, 1321 MHC de clase I, loci genéticos, 132IT MHC de clase I, surco de unión, 1320F MHC de clase II, 1316,1318,1321F, 1327 MHC de clase II, distribución celular, 132IT MHC de clase II, dominios, 1321T MHC de clase II, estructura, 1320,1321T MHC de clase II, funciones, 1321 MHC de clase II, loci genéticos, 132IT MHC formas alélicas, 1338 MHC y células T, 1321F movimiento, 101 orgánicas, degradación, 66 orgánicas, origen, 4 orgánicas pequeñas, 45 orgánicas síntesis en los seres vivos, 45F pequeñas no polares, 542 polares no cargadas, 542 radiactivas, 190 repelentes del tectum, 1207 señal, combinaciones, 776 señal extracelulares, 772 señal hidrofóbicas, 779 señal intracelulares, 197 señal pequeñas, 779 señal y adipocitos, 1265 señalización y proteoglucanos, 1046 señalizadoras B7,1329 vida media, 777 Momento del nacimiento, 1202 Monocapa celular rasgada división celular, 963F confluente, 963,964F externa, 534 Monocitos, 1244, 1267, 1273 Monofosfato de adenosina, véase AMP Monosacáridos, 46 absorción, 1021 Monóxido de carbono, 772, 779 Morfina, adictos, 827 estructura, 827F síndrome de abstinencia, 827 tolerancia, 827 Morfogénesis, 355 vegetal, 1191F Morfógeno, 1130 gradiente, 1129,1130F Mórula, 1132 Mosaico, 1126 Mosca del vinagre, 350
,
1-20
índice alfabético
mutante sevenless, 817 transgénica, 352F, 353 Motivo, 124 p-a-p, 124, 125F cremallera de leucina, 440 en horquilla p, 123F, 124 estructural de unión a DNA, 432 hélice-bucte-hélice, 442 hélice-giro-hélice, 437,442,473F proteico habitual, 125F Motoneuronas de la médula espinal, 578F enfermedad, 1207 Motor del flagelo y receptores quimiotácticos, 832 proteico, 222 Movimiento al azar, 63,99F browniano, 848 ciliar, 175T fibrilar y unión gap, 1028 morfogénico, 1111,1121 retrógrado de la actina, 889 saltatorio, 848 térmico, 99 MPF, 932,942, 950 activación, 937, 939, 948 autocatalítico, 939 de animales, 947 de levadura, 947 ensamblaje, 933 ensayo, 935F inactivación, 937,953, 977 oscilaciones de actividad, 936 subunidad de Cdk, 939 subunidades, 937F y embriones tempranos, 933,938F y fosforilaciones, 940 y mitosis, 935 y procesos subordinados de la mitosis, 939 y quinasa de inicio, 950F MRF4, 1137 mRNA, 12,109,110F, 237,242,344,484, véase también RNA mensajero búsqueda, 339F celular, abundancia, 395T citoplasmático, 397T control de la degradación, 431 de bacterias, 492 de bicoid, 1164 de ciclina, 939 decodificación, 246F degradación selectiva, 496 del polo anterior, 1163 distintos de una célula, 431 dorsal, 1160 en animales transgénicos, 467T estabilidad, 497 eucariota, 252F eucariota, capucha, 251F, 252 exportación, 599 inicio de la traducción, 492 lectura, 111 monocistrónico, 253 policistrónico, 253 precursores, 395 procariota, 252F región 5’ líder, 494 tamaño, 365T traducción, 111,497F transporte al citoplasma, 404 variaciones de estabilidad, 495 y hnRNA, 398 y librería de cDNA, 335 y microtúbulos, 871 y poros nucleares, 404F MTOC, 978 Mudas de insectos, 1141 Muerte celular por apoptosis, 1257F celular programada, 776,925,1152,1256,1326 Muesca de DNA y recombinación, 283 Multipaso de membrana, 629F Multivalentes, ligandos, 532 Muscular, célula, 1120 reparación, 1262 Músculo, 908 cardíaco, 777, 779,909,917 cardíaco, células, 1224 cardíaco, estructura, 918F cardíaco, grasa, 703 cardíaco, mitocondrias, 700F cardíaco, uniones de anclaje, 1021,1022 células precursoras, 1137 de vuelo, 910F, 911F esquelético, 777,909F, 1121 esquelético, células, 1259 esquelético, cultivo, 171T esquelético embrionario, 168 esquelético, génesis, 1258
esquelético, modulación, 1258 esquelético, regeneración, 1258 filamentos finos, 134 hormonas, 789T liso, 775, 909,917,918 liso, contracción, 919F liso uterino, 775F liso y calcio, 919F ordenación de filamentos proteicos, 164F Muslo de pollo, desarrollo, 1139 Mutación(es), 108,258, 326,1085 aleatoria, 35 antenappedia, 1171 aumentadora de la frecuencia de mutación, 1361 bithorax, 1171 compatible con el desarrollo, 35 de células germinales, 260 de células somáticas, 260 de efecto materno, 1159 del cáncer colon-rectal, 1381 dominante en diploides, 350 dominante negativa, 350, 351 heterocrónica, 1151 homeótica, 1171,1171F humana, 347 perjudicial, 260 raaS, 953 recesiva de efecto materno, 1159F SEC, 688 silenciosa, 108 supresoras extragénicas, 1147 velocidad, 1355 ventajosa, 108 wee, 945 y selección natural, 259 Mutagénesis específica de lugar, 545 por inserción, 1369F Mutágenos, 346 Mutantes a medida, 347 agamous, 1196 apétala2,1196 apetala3,1196 cdc, 946 cdc2D, 947F cdc25, 947F de regla par fushi tarazu, 1165 de regla par hairy, 1166 diminutos citoplasmáticos, 761 ftz, 1167F, 1168 gooseberry, 1166 Krüppel, 1168 Zm-14,1152 sensibles a la temperatura, 946 7,482 weel, 947F y función génica, 345,346 Myfe, 475, 1137 MyoD, 475, 476, 1137 myoD, 1138F
N-CAM, 1037F, 1038, 1121, 1205, 1382 glucosilación, 1037 mRNA, 1037 y ácido siálico, 1037 y ganglios nerviosos, 1038 NAD, 71, 72FF, 698 formación, 709 NADH, 47, 71, 73F-75, 80, 698, 704F, 705, 743 deshidrogenasa, 747 deshidrogenasa, complejo, 722 grupo transferido, 81 pérdida del ion hidruro, 709 síntesis, 82 transferencia de electrones, 708 transporte del ion hidruro, 709 NADPH, 64, 82F, 698, 735, 740, 742 estructura, 83F grupo transferido, 81 producción en el cloroplasto, 733 2-Naftilamina, 1350 NANA, 516F Nasofaringe, carcinoma de, 1376T Nebulina, 917 localización, 917F Necrosis celular, 1257 Neisseria gonorrhoeae, 470 NEM, 689F Nemátodos, comportamiento celular, 1143 Neoplasia endocrina múltiple de tipo 2A, 1373 Neoplásica, transformación, 302 Neoplasma, 1346
Nernst, ecuación de, 561 Nervios periféricos, 1119 Nerviosas, células, 1219,1224 Nervioso, impulso, 564 Neuritas, 1204 Neurofibromina, 817F Neurofilamentos, 854, 856 Neuronal, especificidad, 1207 integración, 580 Neuronas, 563, 564F análisis por ordenador, 834 autónomas, 1274 cantidad, 1153 conexiones, 1201,1202 de conducción binocular, 1211 de los vertebrados, 576 dependientes de NGF, 1206 disposición de capas, 1203F división, 960 fase de muerte celular, 1206 inmaduras, 1201F inmaduras, migración, 1202F migración en ratones mutantes, 1203 nacimiento, 1201 número, 1206 olfativas, receptores, 805F periféricas, 1274 potencial postsináptico, 578 sensibles a acetilcolina, 576 sensoriales, 1206,1274 sensoriales del olfato, 808F simpáticas, 1206 tamaño, 960F típicas de vertebrados, 1199F valores posicionales, 1207 Neuropéptidos, 573,672 Neurospora, genoma mitocondrial, 759 Neurotransmisores, 572, 575, 675, 773, 782, 786 concentración, 774 excitadores, 573 inhibidores, 573 peptídicos, 673 Neurotrofina, 1206 Neurotrofina-3, 959T Neurotrofina-4, 959T Neurulación, 1112, 1119,1133 Neutrófilos, 536, 656, 661, 1253T, 1273 fagocitosis, 662F muerte programada, 1257 producción, 1253 quimiotaxis, 891 NGF, 171T, 813, 959T, 960, 1206 y neuritas, 1206F Nicotinamida, 82 adenina, 73F en medios de cultivo, 169T Nitrato de plata, 148T Nitrocelulosa, papel de, 182 Nitrógeno, ciclo, 65, 76 fijación, 76 fijado por bacterias, 16,17 metabolismo, 76 molecular, 76 Nitroglicerina, 779 Nivel genético fundamental, 35 NMDA, receptores, 1211 NMR bidimensional, 187,188T espectroscopia, 187F No-disyunción, 1087, 1091 Nódulos de Ranvier, 567 de recombinación, 1090 linfáticos, 1280,1283 linfáticos humanos, 1287F Noradrenalina, 803 Notocorda, 1118 NSF, 689F NT-3, 959T NT-4, 959T Nucleación de la hélice, 284 Nuclear, memoria, 1138 trasplante, 1125 Nucleasas, 367, 653 de reparación del DNA, 263 de restricción, 313,314F, 315, 332, 332F, 363F de restricción Hpall, 479 lugares hipersensibles, 369 micrococales, 367 Nucleicos, ácidos, 62,102-115 Núcleo (s), 173, 590F, 591T celular, 20F, 148T celular, estructuras, 1000 denso, vesículas, 671 embrionario en división rápida, 387 envoltura, 413F importación, 597T importación específica de proteínas, 603F
índice alfabético
interfásico cromosomas, 410 orden,411 origen, 594F transporte de moléculas, 599 Nucleocápside, 298 Nucleolar, fusión, 410F Nucleolina, 407 Nucléolo, 405, 407 organización, 408 tamaño, 409 y ciclo celular, 410F y mitosis, 409 y síntesis de ribosomas, 408F Nucleoplasmina, 603F Nucleoporinas, 604F Nucleósido(s) difosfatasa, 649F trifosfato, 81F, 83F,' 224 Nucleosomas, 280, 368F, 389, 462, 463 apertura, 390F curvatura del DNA, 369 desplazamiento, 464F empaquetamiento, 370,371F, 378 empaquetamiento del DNA, 940 histonas H l, 369 observados, 367F posición, 368 regiones libres, 370F Nucleótidos, 4,37, 45,49, 76 5-metilC, 480,481 apareamiento complementario de, 6 C metilados, 267 canales iónicos regulados, 805 como transportadores de energía, 62 desaminación, 267 difosfatasa, 160F enlace, 6FF esenciales, 76 formación de polímeros, 4 G metilados, 395 número, 107 plegamiento de la cadena, 7 porcentaje del peso celular, 45T reparación por eliminación, 264 secuencias, 37, 433 secuencias específicas, 315 unión, 62, 103 y variedad biológica, 107 Nudos, 1192 Nuevas proteínas, 417 proteínas, recombinación, 127 Número atómico y microscopio electrónico, 159 de recambio, 138 haploide de cromosomas, 1089 Nutrientes, absorción, 1228
Oclusión, unión de, 1018 Oct-1,436T Octámeros de histonas, 367, 368F Odontoblastos, 1273 Odorantes, 805 Oído, células ciliadas, 1223F Ojo de vertebrados, desarrollo, 1221F tapado y conexiones sinápticas, 1211 y cerebro, conexión, 1207F Okazaki, fragmentos de, 272,276,280 Olfativos, receptores, 805 Oligodendrocitos, 567 Oligonucleótidos antisentido específicos, 871 de DNA, 328,347 sintéticos, 328, 348F sintetizadores automáticos, 343 sondas sintéticas, 337F Oligosacáridos, 46,517 complejos, 646, 647 complejos, síntesis, 648F estructura tridimensional, 651F procesamiento, 648F ricos en mañosa, 646, 647F rutas de procesamiento, 647 transferasa de, 630 unidos a asparagina, 630, 647F y complejo de Golgi, 646 N-Oligosacáridos, 630, 632, 646, 649 O-Oligosacáridos, 632,651F Oligosacaril transferasa, 631F Omatidios, 817FF Oncogenes, 304, 352, 422, 822, 966, 1365,1368T abl, 1368T bel-2 , 1369F concepto, 1372 erbB, 822,1368T fes, 1368T
fgf-3, 1369F fms, 1368T fos, 1368T H-ras, 1368T identificación, 1372 iní-1,1369F int-2, 1369F int-3, 1369F jun, 1368T K-ras, 1368T kit, 1368T L-myc, 1369F Ick, 1369F myc, 1368T, 1373F N-myc, 1369F N-ras, 1369F n e u ,1369F Notch-1 ,1369F raf, 1368T RARa, 1369F ras, 822, 1373F, 1382 reí, 1368T ret, 1369F sis, 822, 1368T src, 1368T supresores de tumores, 1373 trk, 1369F v-H-ras, 1373F v-src, 822, 1367, 1368F Wnt-1, 1369F y ratones transgénicos, 1372, 1373F y retrovirus, 1367 Oncogénica, colaboración, 1373 Ondas luminosas, interferencias, 149F Oocitarias, cubiertas, 1095 Oocitos, 1085F, 1086, 1094, 1274 crecimiento, 934,1097 de Drosophila, 1098F etapas del desarrollo, 1095 fecundados de mamífero, 351 hormonas, 934 huso meiótico, 865 meiosis, 934 primarios, 1096F-1098F reacción cortical, 1105, 1106F secundarios, 1096F Oogénesis, 1096 etapas, 1096F Oogonias, 1096F, 1274 Operador, 446 Operón de triptófano, 447F lac, 448, 449F trp, 448 Opiáceos endógenos, 827F Opsina, 806 Óptica, descubrimientos, 148T electrónica, 158T Orden biológico, 62-69 creación y biosíntesis, 77 Organismos diploides, 361 fotosintéticos, 63,64, 730 no fotosintetizadores, 64 pluricelulares, 27-41 pluricelulares, evolución, 771 pluricelulares, ventaja selectiva, 28 transgénicos, 338,347 unicelulares, capacidad de adaptación, 28 Organizador, 1117,1118,1129 de Spemann, 1117,1128, 1131 Organizadora nuclear, región, 407 Órganos, 1017 eléctricos, 574 linfoides, 1280ysigs. linfoides centrales, 1283 linfoides humanos, 1281F linfoides periféricos, 1283 linfoides primarios, 1282, 1283 linfoides secundarios, 1281F-1283 sensoriales, 1120 Orgánulos, 589 cambios de ubicación, 849 cantidad de DNA, 754T citoplasmáticos y fase M, 984 de eucariotas, 20, 698 evolución, 592, 698 genes maternos, 760 información epigenética, 599 marcadores proteicos, 687 número en la célula, 753 origen, 594F replicación del DNA, 752 síntesis de novo, 597 tamaño del genoma, 753T transformadores de energía, 697 y red microtubular, 848 Orientación de vía, 1033
I-
Rabí, 410, 411F Origen de replicación, 277,297, 361, 362F, 382, 387F, 388 de replicación, activación, 387 de replicación de cromosomas eucariotas, 384 de replicación del DNA, 362 monoclonal del cáncer, 1348, 1349F Oro coloidal, 199F coloidal y poros nucleares, 603F Oscilaciones de calcio, 799 Osmio, tetróxido de, 159 Osmolaridad, 551F Ósmosis, 551F Osteoblastos, 1042, 1266, 1267F, 1273 Osteocitos, 1262, 1266 Osteoclastos, 1254, 1266, 1267F, 1273 erosión del cartílago, 1269 Osteogénesis imperfecta, 1052 Osteoide, 1266 Osteopetrosis, 1254 Osteosarcoma, 1368T Ouabaína, 549F Ovario, células foliculares, 1098 hormonas, 789T Ovoalbúmina, 809F Óvulos, 102 maduros, 1096F, 1097 tamaño, 1094F, 1095F Ovum, 1097 Oxalacetato, 74, 705 Oxidación, 65F P, 615 aeróbica, 17 biológica, combustión, 708F biológica de un alcohol, 709F de moléculas biológicas, 65 del ácido fórmico, 746F energía, 708F espontánea,262F mitocondrial, 702 y ATP, 66 Oxidativa, fosforilación, 706 reacción, 614 Óxido férrico, 748 nítrico, 772, 779 Oxígeno atmosférico, 748 atmosférico y evolución, 17FF libre en condiciones prebióticas, 4 molecular, transferencia de electrones, 75 niveles atmosféricos, 748F oxidación, 65 reactividad, 17 reducción, 723 y ATP, 70
pl20Bap, 817F p53 proteínas, 1379F Pájaros, desarrollo embrionario, 35F Paladio, 965F Páncreas, 1118 células p, 672F renovación, 1227 Pantotenato en medios de cultivo, 169T Papaína, 1293 Papilomas, 1376T número de células, 1356 Papilomavirus, 1377F, 1378 Papovavirus, 302, 1376T PAPS, 650 Paquiteno, 1090 Par bivalente, 1089 Paracórtex linfoides, 1287F Paramecium, 26, 27F Parathormona, 789T Parecelular transporte, 1021 Paredes celulares, 13, 32, 1006, 1030 celulares de vegetales, 1073 celulares, estructura, 1074 celulares, fuerzas de tensión, 1074 celulares primarias, 1073, 1075F celulares primarias, orientación de micro fibrillas, 1076F celulares secundarias, 1074 celulares semirrígidas, 551 celulares vegetales, 1187 celulares y microtúbulos, 1076 composición, 1073 intestinales, 1017F Pares conjugados ácido-base, 725 de bases de Watson y Crick, 106 de cromosomas diminutos, 1363 redox conjugados, 725
1-22
índice alfabético
Partenogénesis, 1094 Partículas de reconocimiento de señal, 623 grandes fagocitosis, 661 hnRNP, 398 intramembrana, 162 Parto, 775F Paso único, proteínas transmembrana, 626 Pata de cucaracha, valores posicionales, 1140F Patching, 532 Patrón complementario, 6F de difracción de rayos X, 185 de metilación del DNA, 479 de RNA, 325 polinucleótidos como, 6FF Pautas de lectura, 111,249 de lectura traduccional, 498F PCR, 340, 343 amplificación, 341F en medicina forense, 342F PDGF, 813, 814F, 822, 958, 959T, 1235 concentración, 964 receptores, 814 y proteínas señal, 815F Peces eléctricos, 574 epidermis, 850F Pectinas, 1074, 1075 y calcio, 1075 Pelomyxa palustris, 21 Pelos, 859 Pénfigo, 1024 Penicilina en medios de cultivo, 169T Pepsina, 188T Peptidasa de señal, 596, 608, 610F Peptidil transferasa, 115F, 247, 249,257 transferasa, actividad, 115 Peptidil-tRNA, 244, 245F, 248-250 lugar de unión, 247 Péptido(s), bomba, 557T de incicio de transferencia, 627 de paro de transferencia, 626 N-formilados, 891 internos de inicio de transferencia, 627 líderes amino terminales, 622 natriuréticos atriales, 812 señal amino terminal, 597, 609F, 610F señal amino terminal de retículo endoplasmático, 627F señal, cortado, 627F señal de retículo endoplasmático eliminación, 625 señal, descubrimiento, 622 señal, dirección de ribosomas, 624F señal hidrofóbico del tilacoide, 613 señal para el retículo endoplasmático, 618 señal, secuencias, 597T señal y cloroplastos, 612 señal y ribosomas, 622F señal y SRP, 623 transportadores, 1324F Pequeñas proteínas SH adaptadoras, 816 Pérdida de heterozigosis, 1375F de inhibición por contacto, 1367F Perforina, 1326 Pericentriolar material, 865 Período de semidesintegración, 189T Perlecanos, 1046, 1049T, 1062 Permanentes células, 1222 Permeabilidad coeficientes, 543F selectiva, 590F Permeasas, 543 Peroxidasa, 199F de rábano,199F Peroxisomas, 24, 175T, 590F, 59IT, 594, 614 ensamblaje, 616 evolución, 614 importación, 597T importación de proteínas, 616 replicación, 761 secuencia señal, 616 tipos, 615F vacíos, 616 vegetales, 615 y fosfolípidos, 634 Pétalos, 1196 Pez, desarrollo embrionario, 35F pH citosólico, 554 isoeléctrico, 181F y proteínas, 554 y transporte, 554 y unionesgap,1029F y vesículas, 679F Pll-30 proteínas, 1107F pHmetro, 192 Pl, 796 Pl-bisfosfato, 796 Pl-fosfato, 796
PI3-quinasa, 815 Piedras de cistina, 543 Piel de mamífero, 1220F mutante, 859F Pinocitosis, 661 velocidad, 663 y depresiones revestidas, 662 PIP, 796 PIP,, 796 hidrólisis, 798F Piridoxal en medios de cultivo, 169T Pirimidinas, 4, 49, 731 dímeros, 265, 266 Pirofosfato, 79, 239F hidrólisis del, 79 Piruvato, 69, 70, 702, 707F carboxilasa, 82F descarboxilasa, 705F deshidrogenasa, complejo, 705F Piruvato-deshidrogenasa, estructura, 89F Placas ateroscleróticas, 664 básicas del tubo neural, 1205 celulares, 1006 celulares precoces, 1006 de adhesión, 902, 1024 de cultivo, 167 desmosómicas, 1025 hemolíticas, prueba, 1292 metafásicas, 985 metafásicas, alineación de cromosomas, 993F metafásicas, fuerzas, 993 metafásicas, fuerzas bipolares, 992 Placenta, 1131, 1132 Placoglobinas, 1023, 1025F Plantas, 63 C3, 737 C4, 737 desarrollo, 1187 diferenciación celular, 1190 división celular, 1190 elongación celular orientada, 1190 embriogénesis, U88F estrategia oportunista, 1187 fijación del carbono, 736 genes mitocondriales, 759 genes selectores homeóticos, 1197 modelaje de la ramificación, 1193 modelaje repetitivo, 1192F módulos estándar, 1187 módulos repetitivos, 1190 mutantes, 1194 proteínas reguladoras de genes, 1197 señales hormonales, 1193 superiores, citocinesis, 1006 superiores, genoma del cloroplasto, 755 superiores, tamaño del DNA de cloroplasto, 753T superiores, tamaño del DNA mitocondrial, 753T tamaño del genoma mitocondrial, 758 transgénicas, 354F Plaquetas, 958F, 1070, 1244, 1246, 1249 agregación, 775 concentración, 1246T crecimiento derivado, 958 factor de crecimiento derivado, 1235 función, 1246T vitelinas, 1095 Plasma germinal, 1162 Plásmidos, 293, 301, 306, 362 de DNA, 499 número, 499F Plasminógeno, 1066 Plasmodesmos, 32, 1018T, 1030F, 1031F Plasmodium falciparum, 557 Plástico, 166 Plastidios, 731 diversidad, 731F Plastoquinona, 741F Plastos, 594, 697 Platino, réplica, 162 sombreado, 162F PLC-y, 815 Plegamiento de las inmunoglobulinas, 1305 proteico, 117, 226 proteico tridimensional, 597 Ploidía y número de células, 971F Pluricelulares, organismos, 27-41 Pluricelularidad, 28 Pneumocitos, 1272, 1273 Poder de resolución, 148F reductor, 736 reductor celular, 746 reductor y biosíntesis, 82 reductor y luz solar, 16 Podocitos, 1273
pol3, gen, 954T Polares, microtúbulos, 986 Polaridad de segmento genes, 1166 del embrión de anfibio, 1112 del huevo, 1112 del huevo, sistema de gradiente, 1162F Polarización celular en levaduras, 893 celular y microtúbulos, 869F Polen, 157F, 1196 Poli A, 252 A adición, 486 C, 6
G, 6 Poli-iV-acetilglucosamina, 1044 Poliadenilación, señal de, 396F Poliespermia, 1105 Polietilenglicol, 170 Polimerasa de Drosophila, 392FF de Uscherichia coli, 392FF de poli-A, 396 Polimerización, 844 de la actina, 881 local de actina, 889 por la cabeza, 84,270 por la cola, 84 sobre un patrón catálisis, 7 velocidad, 268 Polímeros, 4 biológicos síntesis, 84 crecimiento, 84F Polimorfismo, 326 de longitud de los fragmentos de restricción, 326 MHC, 1338 Polinucleótidos, 5, 84 a polipéptidos, flujo de información, 8, 10 adición de monómeros, 84 autogeneración, 6 como patrón, 6FF errores de copia, 7 estructura plegada tridimensional, 7 formación, 5F quinasa, 318F síntesis, 80, 81F Poliomavirus, 296F, 1378 Poliovirus, 295F Polipéptidos, 5 ,48F como catalizadores, 6 formación, 5F limitaciones estéricas, 98F Poliploides, células, 373 Pólipo adenomatoso, 1380 adenomatoso de colon, 1380F Poliposis coliadenomatosa, 1381T coliadenomatosa familiar, 1381 Poliproteínas, 673 Polirribosomas, 113F, 253FF, 618 Polisacáridos, 46, 84 adición de monómeros, 84 con puentes cruzados, 177F degradación, 69 esferas, 166 porcentaje del peso celular, 45T Polisomas, 253 Politénicos, cromosomas, 374 Polivirus, 296F, 297 Polo animal, 1112 vegetativo, 1112 Polvo de ángel, 582 Porfirina, 720 Porinas, 521, 530, 556F, 559, 608, 700 estructura tridimensional, 530F Poros de un translocador proteico, 624 nucleares, 594, 600, 601F, 1000 nucleares, importación dirigida por señal, 603F nucleares, macromoléculas, 603 nucleares, oro coloidal, 603F nucleares y transporte activo, 604F nucleares y transporte de histonas, 602 Posición, efecto de, 464 efectos, 478 Posicionales valores, 1139 Post-transcripcional, control, 484 Potasio, canales de, 571F, 791 Potenciación a largo plazo, 582, 583F a largo plazo en el hipocampo, 582 Potencial de acción, 564-567, 577, 810 de equilibrio del sodio, 565 de membrana, 544, 560 de reposo de la membrana, 561 postsináptico, 578 postsináptico excitador, 578 postsináptico inhibidor, 578 postsináptico principal, 579 redox, 725 redox y cadena respiratoria, 726F
índice alfabético
redox y fotosíntesis, 741F Poxvirus, 296F Pre-B células, 1294 Precursor de RNA 45S, 406F del oligosacárido unido a lípido, síntesis, 631F radiactivo del DNA, 191F Preinmunitario de anticuerpos, repertorio, 1307 Prenil, grupo, 518 Prenilación, 519F Preproproteínas, 673 Presentadoras de antígeno células, 1328 Presión de turgencia, 655, 1074 Prevacuolas vegetales, presión de turgencia, 654 Primaria, estructura, 122, 124F Primasa, 275 Primera célula, membranas, 10, 11 Primordios de meristemo, 1192 foliares, 1192 Primosomas, 275, 278F Principio de intercalación, 1142 Procadenas a, 1051 Procariotas, estructura, 13F evolución a eucariotas, 12-27 tamaños, 13F transcripción, 448F y eucariotas, 22F, 23T Procesamiento de imágenes, 154 del RNA, 27, 397 Procesos subordinados, 930 Procolágena, 1051 degradación, 1051 fibrilar, 1054 Producción de la forma segregada del anticuerpo, 1312 Productos génicos interactivos, 37 Profase, 984 y sigs. I, 1093 II, 1093 meiótica, 934 meiótica 1,1089F, 1090F temprana, 981F y sigs. Profilina, 886,892 Progesterona, secreción, 789T Programa de desarrollo, detención, 1134 Progresión tumoral, 1351 tumoral, etapas, 1382 Proinsulina, 135F Prolactina, 821 Proliferación celular, genes de control y cáncer, 966F celular, mecanismo homeostático, 1230 celular, regulación, 1256 celular, señales estimuladoras, 967F Prolina, 1049, 1055 transportador unidireccional, 557T Prometafase, 981F, 984,990 Promotor, 239, 452 del virus del tumor mamario, 1373F integración, 458F tumoral, 1355F, 1356 tumoral, efecto, 1356F Promotoras, secuencias, 392 Pronúcleos fusión, 1107 Propéptidos, 1051 Proplastidios, 731F Prostaciclihas, 775F Prostaglandinas, 775F Protaminas, 1100 Proteasas, 653, 1104, 1235 intermembrana, 612 V8,184T Proteína(s), 5, 48, 84, 360, 871 a, 790F (x2, 126, 471 a, de la levadura, 127F abundantes, secuenciación, 344 activadas por catabolito, 435F activadas por estrés calorífico, 780F activadoras de catabolito, 124F activadoras de gen por catabolito, 1, 129FF, 136F activadoras de GTPasa, 219, 686, 815, 816, 817 activadoras génicas, 447, 453 activadoras génicas gal4, 453F activadoras génicas GAL4, 454F adhesivas, 1057 adición de monómeros, 84 agregados simétricos, 212 alostéricas, 210 alostéricas andadoras, 222F alostéricas como interruptores, 210 alostéricas, motor, 222F alostéricas unidas a membrana, 223 ancestrales, 129 angreladas de Drosophila, 127 antigénicas y células T colaboradoras, 1327
AP-1, 820 ARF-GTP, 687F asignación de funciones, 129 asociadas a enzimas, 782 asociadas a microtúbulos, 870 B7, 1330F banda 3, 527, 548 banda 3, destino, 528F banda 3 en eritrocitos, 557T banda 4,1, 525, 526F base de datos, 129 Bcl-2,1373 Bicoid, 1165 Bicoid, gradiente, 1164F biosintetizadas, tráfico, 641F BiP, 645 Blk, 821 Boss, 819F cactus, 1161 cadenas laterales, 117 carboxilo terminal, 486 CD3, funciones, 1330T CD3, peso molecular, 1330T CD4, 304, 1284, 1322 CD4, funciones, 1330T CD4, peso molecular, 1330T CD8, 1284, 1322 CD8, funciones, 1330T CD8, peso molecular, 1330T CD28, 1329 CD28, funciones, 1330T CD28, peso molecular, 1330T CD45, 822 cdc2, 956 Cdc2,962 Cdc2 y ciclinas G,, 949 Cdcl3, 948 Cdc25, 948, 949 Cdk, 219, 963, 969 Cdk y ciclinas, 957F, 968 Cdk2, 957, 1378 Ced-3, 1153 Ced-4, 1153 centrales, 1045 chaperonas, 630 CheW, 830, 831 CheY, 830, 831 CheZ, 830, 831 el, 473 citoesqueleto, 180 citosólicas, transporte a lisosomas, 656 clasificación, 589 clasificación en el trans Golgi, 671F como catalizadores, 135-142 como máquinas, 207 como motor, 224F como un microchip, 216 con cremallera de leucina, 442 con cremalleras de leucina heterodimerizadas, 442F con dedos de zinc, 439F, 440F con dominios SI I2, 815 con funciones relacionadas, 329 con ligandos, 209 conformación, 208 conformación cerrada, 210F conformación de menor energía, 227 conformación globular, 117F ero, 473 ero del bacteriófago lambda, 438F cromosómicas no-histonas, 366 de adhesión intracelular, 1022, 1025F de anclaje, 902 de canal, 541, 543, 544F, 558 de canal, clases, 576F de clase 1,1318F de doble paso, 627 de doble paso con una secuencia señal interna, 629F de Drosophila Noth, 823 de elevada movilidad, 377 de entrecruzamiento, 895 de entrecruzamiento de los filamentos, 896 de envoltura, 298,300 de estrés por calor, 226-228 de filamentos intermedios, 853 de fusión, 348,349 de fusión Gag-Pol, 498F de fusión, genes, 691 de fusión transmembrana, 1106 de Golgi y brefeldina A, 645, 646F de hierro-azufre, 721 de homeodominios, 438 de iniciación, 278F de intercambio de fosfolípidos, 634 de la cápside, 299,498
1-23
de la superficie celular, 117 de los neurofilamentos, 856 de mamífero, 261 de mamífero Bcl-2, 1153 de matriz extracelular, 1026T de membrana, 180, 185, 517, 628 de membrana, difusión, 531 de membrana en gel de poliacrilamida, 524F de membrana en un bastón, renovación, 1227F de membrana, estructura, 158T de membrana, lado citoplasmático, 522 de membrana lisosomal, 653 de membrana, movilidad restringida, 535F de membrana, orientación, 524 de membrana plasmática, 676 de membrana plasmática, clasificación, 677F de membrana plasmática, velocidad de difusión, 533F de membrana, purificación, 521 de membrana, solubilización, 521, 522F de membrana y detergentes, 523F de morfogénesis del hueso, 823 de paso múltiple, 518F de paso único, 518F de quimiotaxis aceptoras de metilos, 830 de regulación génica, 432, 433, 435 de regulación génica regulada, 459 de resistencia a múltiples drogas, 557 de secreción, 672 de secreción y retículo endoplasmático, 622 de transferencia de fosfolípidos, 634 de transporte, 544F de transporte a través de membrana, 543 de transporte, especificidad, 543 de transporte impulsado por sodio, 554 de unión, 630 de unión a carbohidratos de superficie, 1037 de unión a CHE, 793 de unión a DNA de una sola cadena, 273 de unión a GTP, 1371 de unión a GTP monoméricas, 686 de unión a GTP triméricas, 686 de unión a la actina, 894, 905F, 906F de unión a la actina, estructura, 897F de unión al calcio, 904F de unión al DNA, 368 de unión al DNA, ensayo, 443 de unión al monómero de actina, 886F de unión de GTP, 686 de unión transmembrana, 1026T decapentaplégicas, 959T degradación, 69 del axonema, 878 del complemento C5, 1290 del mieloma, 1302 del vitelo, 1098 descondensadoras de cromatina, 467 desembarcadero, 623 desestabilizadoras de la doble hélice, 285 desestabilizadoras de la hélice, 273 desnaturalización, 117,233 desplazamiento entre compartimientos, 594 desplegadas y mitocondrias, 610F destino celular, 596 dímeros proteicos, 130F dímeros simétricos, 130F disulfuro isomerasa, 629, 630 dnaA, 278F dnaB, 278F dominio, 519 dominio citoplasmático, 519 Dorsal, gradiente, 1161F Dpp, 1162 Drk, 818 EF-Tu, 220, 221, 224F EF-Tu, transición alostérica, 219 efecto dominante negativo, 351F eIF-2, 493 elongación, 249 en dominios de membrana, 534 enlaces de hidrógeno, 118F enlaces disulfuro, 118 ensamblaje, 226 env, 1368F errores de síntesis, 254 escasa producción, 344 esenciales, 260 esenciales, número, 364 específicas del axón, 1203 estructura, 116-142 estructura multidominio, 128 estructura y propiedades químicas, 135 evolución de la síntesis, 257 expresión, 474 ferritinas, 495 Fgr, 821
1-24
índice alfabético
fibrosas, polímeros, 853 filamentos intermedios, 855T formas, 116, 122F Fos, 822 fosfatasa, 214, 216, 218, 771 fosfatasa I, 793, 940, 954T fosfatasa I y AMP cíclico, 794 fosfatasa IIA, 793 fosfatasa IIB, 793 fosfatasa 11C, 793 fosforilación, 214, 216F, 977 fosforilación y MPF, 940 fragmentadoras, 897 frecuencia de mutación, 259 Fyn, 821, 1329 G, 686, 790F G, activación, 786 G, cadenas polipeptídicas, 788 G estimuladoras, 787, 788 G heterotriméricas, 884, 892 G inhibidoras, 791 G, receptores asociados, 782 G triméricas, 786 G triméricas, desensamblaje, 788 G triméricas, familias, 808F G triméricas inhibidoras, 791 G triméricas y canales iónicos, 804 Gag, 498F GCN4, 494 génicas bicoides, 490 glial acídica fibrilar, 856 globulares, unión, 127 glucosilación, 630 glucosilación en el retículo endoplasmático, 631F Gq, 797 groEl, 228F hacia peroxisomas, importación, 616 Hck, 821 hélice-giro-hélice, 437F, 438 hidrólisis, 183 HLH, 442 11L11 truncadas, regulación, 443F HMW, 870 hsp60, 227, 228F hsp70, 227, 228F, 630 hsp90, 606F huella dactilar, 183F Hunchback, 1166F I-kB, 1161 importación cotraduccional, 617 importación específica al núcleo, 603F inactivas, 127 inhibidoras de fosfatasas, 794 inhibidoras de la tripsina pancreática, 123F inhibidoras de síntesis, 255 iniciación de la síntesis, 493F iniciadoras, 277, 388F integradoras, 784 integrales de membrana, 519 intercambiadoras de fosfolípidos, 635F interfases de unión, 231 intracelulares, 771 isoformas, 487 JAK, 821 Jun, 820, 822 Kit, 1123, 1124 Krüppelk, 1166F Lck, 1322 Let-23, 1150 Let-60, 1151 LFA-1 asociadas a la función linfocitaria, 1330 LFA-1, funciones, 1330T LFA-1, peso molecular, 1330T liberadoras de nucleótidos de guanina, 219, 686, 687F, 817 Lin-3, 959T, 1150 Lin-45, 1151 longitud, 125 lugar de unión, 135 luminiscentes, 195F Lyn,821 mal plegadas, 233 marcadoras, 346F MHC, 1317, 1320, 1323F, 1339 MHC, aminoácidos polimórficos, 1320 MHC de clase 1, 1318F, 1321F MHC de clase I, estructura, 1319F MHC de clase II, 1318F, 1327 MHC, lugar de unión al antígeno, 1319 MHC, polimorfismo, 1338 MHC y presentación del antígeno, 1338 miogénicas, 475,1137 mitocondriales hsp60, 611 mitocondriales hsp70, 611 mitocondriales, importación, 609
mitocondriales, origen, 764F monoméricas que unen GTP, 786 morfogénicas del hueso, 959T, 1264 motor de microtúbulos, 999F motoras, 848F muerte, 226 MutL, 276F MutS, 276F Myc, 967F, 1372 MyoD, expresión en fibroblastos, 474F nacimiento, 226 NF-li, 856 NF-L, 856 NF-M, 856 niveles de organización estructural, 122,124F NtrC, 451F nucleares, 603 nucleares de proteoglucanos, 649 nucleares, transporte activo, 603 nuevas, 125, 417 número, 431 p53, 953, 1362, 1378, 1379F periféricas de membrana, 519 periplasmáticas que se unen a substratos, 556F PH-30, 1107F plegamiento, 119, 226F plegamiento espontáneo, 117 pol, 1368F Polycomb, 1174, 1175F porcentaje del peso celular, 45T post-traduccional, 617 precursoras mitocondriales, 607 purificación, 178F purificadas, renaturalización, 522 que forman geles, 896 que forman naces, 896 que hidrolizan ATP, 221 que patrullan el DNA, 468F que unen GTP, 218 quinasa, 214, 215F, 218, 224F, 231, 460, 771, 783, 784F quinasa activadas por mitógenos, 819 quinasa, árbol evolutivo, 215, 216F quinasa C, 515, 798F, 800, 1355 quinasa C, número de intrones, 365T quinasa C, tamaño del gen, 365T quinasa C, tamaño del mRNA, 365 T quinasa C y diacilglicerol, 799 quinasa Cdk, 216 quinasa dependientes de calcio/calmodulina, 802 quinasa dependientes de ciclina, 217, 932 quinasa dependientes de GMP cíclico, 812 quinasa dependientes de AMP cíclico, 791, 792F quinasa, estructura tridimensional, 215F quinasa Src específicas de tirosina, 1322 quinasa y control del ciclo celular, 931 quinasa y genes cdc2, 947 Rab, función, 688F Rab, localización, 689T Rab y unión de vesículas, 688 Rab-GTP, 688F Rae, 816, 893 Raf, 822 Ras, 218, 219,816, 822 Ras, estructura, 219F Rb, 968F, 1378 Rb desfosforilada, 969 Rb, fosforilación, 969F RecA, 285, 286F, 288 RecA de Escherichia coli, 266 RecA, estructura, 285F RecBCD, 282F, 284 receptoras, 777F receptoras celulares, 777 receptoras de la superficie celular, 771, 782 receptoras intracelulares, 440, 771 receptoras quimiotácticas del aspartato, 830F receptores asociados, 786 receptores relacionados, 796 reguladoras, 436T reguladoras bacterianas, 449F reguladoras combinación, 475 reguladoras de eve, 458F reguladoras de genes, 1179 reguladoras de la actividad génica, 109 reguladoras de la expresión génica, 241 reguladoras, distribución, 456F reguladoras que unen GTP, 782 reguladoras Tra, 488F reguladoras transmembrana de la fibrosis quística, 557T reguladoras y DNA, 442 relacionadas con la vimentina, 855T, 856 representaciones, 122
represoras bacterianas met, 441F represoras de la traducción, 494 represoras del triptófano, 447F represoras eucariotas acción, 455F represoras génicas, 447, 454 represoras lambda, 473 residentes del retículo endoplasmático, 629, 644, 645F residuos polares, 117 retinoblastoma, 968F Rho, 816, 905 ribosómicas, 599 ruta por defecto, 595F Sec4, 688 secretadas, 1371 secuencia de aminoácidos, 108, 313 Sem-5,1151 señal y PDGF, 815F separación, 176 y sigs. séricas, electroforesis, 183T serina/treonina fosfatasas, 793 serina/treonina quinasa, 799, 954T Sev, 818, 824 SH adaptadoras, 817 síntesis, 24F, 237, 360F, 929 SNARE, 687F solubles en agua, 617 solubles, translocación, 626F Src, 821,822 SSB, 284, 285 superenrolladas, 131 Sxl funcionales, 488F tamaños, 93F, 122F tau, 870 TCP-1, 228F Thy-1, 1284, 1340 tirosina fosfatasa, 821, 954T tirosina quinasa, 954T tirosina quinasas no receptoras, 815, 821 Toll, 1160 tráfico, 595F transductor de información, 224F translocación, 175T translocación post-traduccional, 623 transmembrana, 188T, 518, 617 transmembrana CD40, 1332 transmembrana de multipaso, 520, 548,627 transmembrana de paso único, 520, 521F, 626 transmembrana de un solo paso y retículo endoplasmático, 628F transmembrana, hélice a, 519 transmembrana, orientación, 651F transmembrana y adaptinas, 684 transportadoras, 541, 543, 544F, 1019 transportadoras, cambio de conformación, 548F transportadoras de bacterias, 548 transportadoras, distribución asimétrica, 555 transportadoras, familias, 557T transportadoras intestinales, 555F triméricas que unen GTP, 786 Tyk2, 821 unidas a GPI, 676 unidas al DNA, interacción, 452F unión, 231F unión de superficies rígidas, 231 unión extracelular, 1026T unión todo o nada, 231F velocidad de evolución, 259,259F velocidad de síntesis, 254 versatilidad, 120 Vgl, 959T, 1129 vida media, 234 víricas de fusión de membrana, 690 víricas y células T citotóxicas, 1325F Weel, 949 y genes altamente fragmentados, 417 y grupo fosfato, 215F y ligando, 208 y membrana lipídica, 518F y pH, 554 y tipos celulares, 430 Yes, 821 zonas móviles, 207 Proteínas-carbohidrato, reconocimiento, 536 Proteinasas 3-fosfato, 70-72F Proteínicas, conformaciones, 117 Proteoglucanos, 535, 649, 670, 671F, 1042, 1043, 1045,1046F de superficie celular, 1048 funciones, 1049T integrales de membrana, 535, 536F localización, 1049T peso molecular, 1049T tipo de cadenas, 1049T transmembrana, 1072T
índice alfabético
y complejo de Golgi, 649 y moléculas, señalización, 1046 yproteasas, 1047 Proteolisis de complejo proteico, 232F dependiente de ubiquitina, 232, 233 selectiva, 231 Proteosomas, 232, 233F, 1324 Protistas, 16F, 25 grupo, 26F Proto-oncogenes, 422, 822, 966, 1365 abl, 1370, 1370F bel- 2,1153 c-erbB, 1371 celulares c-src, 1368F conversión, 1370 del huésped y retrovirus, 1369 disfunciones, 1369 erbB, 1371 fos, 967 jun, 967 myc, 967, 1363, 1364F, 1370, 1381 ras, 1381 ret, 1373 transformación en oncogenes, 1372F trk, 1207 Protofilamentos, 861F Protones, 65 bomba, 528, 727F captación, 710 gradiente electroquímico, 76, 697, 707, 710, 711, 719F, 742 transporte mitocondrial, 711 y ATP sintasa, 718F Protozoos, 27F ciliados, 16F, 113 ciliados, herencia cortical, 879F cilios, 874 descubrimiento, 148T estructura, 25 genomas mitocondriales, 753 mitocondrias, 764 tamaño del DNA mitocondrial, 753T Protrusión, 906 Provirus, 301 Prueba de la placa hemolítica, 1292 Prurito, 674 Pseudogenes, 416 Pseudópodos, 662, 887 Psoriasis, 1241 Puentes cruzados, 911 Puffs cromosómicos, 374, 375FF Pulmones, 1118 Pulso y caza, experimento, 190FF Punto de control G, 945 de control G,, 931,961,962,965, 968 de control G, y suero, 961 de control G¿, 950 de control, inicio, 931, 945, 949 de rotura del transcrito de RNA, 486 isoeléctrico, 181, 183T Pupa, 1155 Purinas, 4, 49, 731 Purkinje, células de, 195F Puromicina, 256T, 625F
Queratán sulfato, 1043 Qucratina, 855T, 1024, 1239 acida, 855 de la piel, 119 dura, 855 filamentos, 854,855, 857F mutante, 858 neutra/básica, 855 síntesis, 1239 tipos, 1240 a-Queratina, 855 P-Queratina, 855 Queratinocitos, 850, 1033, 1135, 1239, 1240 basales, 1240 de la epidermis, 1272 de las uñas de manos y pies, 1272 y calcio, 1241 Queratohialina, 1238F Quetas mecanosensoriales, 1179F sensitivas distribución, 1179 Quiasmas, 1089, 1091 Química celular, 43 orgánica, 44 Quimiosmosis, 729 Quimiosmótica, hipótesis, 707 Quimiosmótico, acoplamiento, 697F Quimiotaxis, 888, 891, 1033, 1123
bacteriana, 827, 828F bacteriana y metilación del receptor, 831 bacteriana y receptores transmembrana, 830 Quimotripsina, 126, 129F, 184T tríada catalítica, 137F Quin-2, 194 Quinasa, 819, 819 A, 791, 792F, 793,804,810 A, activación alostérica, 802 A y AMP cíclico, 793F (3adrenérgica, 826 C, 800, 801F, 820F C cerebral, 800 C y transcripción génica, 800F CaM, 802, 804 CaM 11, 802 CaM II activación, 803F Cdc2, 940, 951 de Inicio, 950 de Inicio y MPF, 950F de Inicio y replicación del DNA, 952 de la cadena ligera de la miosina, 802, 919 dependiente de AMP cíclico, 215F dependiente de ciclina, 937 M015, 948 multifuncional calcio calmodulina, 802 PHC, 800 regulada por señales extracelulares, 819 Weel, 948F Quinesinas, 848, 849, 872 axonales, 873 de entrecruzamiento contiguo, 999F Ncd, 873 y microtúbulos, 871 Quinona, 721, 722F, 727, 739 intercambiable, 740F libremente móvil, 740F Quitina, 1044
RAD9, gen, 954T Radiaciones ionizantes, 1349 ultravioleta, 4, 266 Radio de van der Waals, 123F Radiofrecuencia, pulsos, 186 Radioisótopos, 189, 189T naturales, 189 y mareaje de moléculas, 190 Radioterapia local y cáncer, 1358 Raíz en crecimiento, 1191F Ranvier, nodulos de, 567 Rastro de memoria, retroalimentación positiva, 1174 Ratón, desarrollo, 1132F quimérico, 1133F, 1134F reeler, 1203F, 1207 transgénico, 352FF, 466, 482 transgénico y cáncer, 1351 transgénico y oncogenes, 1372, 1373F Rayos, 76 a, 189 catódicos, 188T X, 185 X, cristalografía, 186F X, difracción, 185, 186F X y cáncer, 1349 Re-replicación, bloqueo, 388F, 941, 942F Reacción(es) acopladas, 63, 67 acrosómicas, 1100, 1104, 1105F alérgicas, 1296 catabólicas, 67 compartimentación, 89 de destoxificación, 619 de fijación de carbono, 734 de la fase luminosa, 733 de la fase oscura, 734 de peroxidación, 614 de trasplante, 1317 en cadena de la polimerasa, 340, 343 energéticamente desfavorables, 68, 78 energéticamente favorables, 78 espontáneas, 78 fotosintética de electrones, 733 fotosintéticas, estructura, 531F glucolíticas, 88F inmunitarias mediadas por células, 1315 limitadas por difusión, 142 metabólicas, evolución, 14, 15 oxidativas, 614 punto de equilibrio, 101 químicas espontáneas, 77 químicas, punto de equilibrio, 140 velocidad, 86
1-25
Recambio, número de, 138 proteico selectivo, eucariotas, 232 Receptores, 772 a, adrenérgicos, 791 P2adrenérgicos, 791, 826F asociados a canales, 782 asociados a enzimas, 783, 812 asociados a proteínas, 786 asociados a proteínas G, 782 asociados a tirosina quinasas, 812 asociados a tirosina quinasas actividad, 820 basales de unión, 1064 buscadores, 1287 célula-matriz, 1024 citoquinas, 1254 de acetilcolina, 474, 574FF, 810 de acetilcolina y lámina basal, 1064 de adrenalina, 786F de carga, 684F de células T, 1329 de factores de crecimiento, 813 de glucocorticoides, 606F de insulina, 814 de la matriz, 1067 de la superficie celular, 772F de las células B, 1291 de las células T, 1339 de LDL defectuosos, 665 de LDL, rutas, 667 de linfocitos, 821 de mañosa 6-fosfato, 658 de PDGF, 814 de reguladores de crecimiento, 1194 de rianodina, 798 de SRP, 623 de superficie celular, 783 de superficie, clases, 783F de tirosina quinasa, 1150 endocitosis mediada, 664 específicos de antígenos, 1285 Fe 1295 1339 GM-CSF, subunidades, 1254F guanilato ciclasa, 812, 813 humanos de LDL, 664F IL-2, 821 1L-2, ensamblaje, 821F IL-3, subunidades, 1254F intracelulares, 772F LDL, 664F LDL, número de intrones, 365T LDL, tamaño del gen, 365T LDL, tamaño del mRNA, 365T localizadores, 1287 M6P, 657 moléculas de superficie celular, 1039 muscarínicos de acetilcolina, 804 mutantes, 664F nicotínicos de acetilcolina, 804 NMDA, 582,583, 1211 NMDA y aprendizaje, 583 número, 825 olfativos, 805 para el virus del SIDA, 1322 proteicos intracelulares, 781F quimiotácticos, 830, 831F quimiotácticos, activación secuencial, 832F quimiotácticos, adaptación, 832F quimiotácticos y motor del flagelo, 832 relacionados con enzimas, 573 relacionados con proteínas G, 573 serina/treonina quinasa, 812, 823 tirosina fosfatasa, 812 tirosina quinasa, 798F, 812, 813, 817, 819F, 822, 1253T transmembrana, 1371 transmembrana endocitados, 667F transmembrana Notch, 823 transmembrana y quimiotaxis bacteriana, 830 unidos a proteínas G, 797T Receptores-anticuerpos complejos, 668 Rechazo del injerto, 1317 Reciclaje de membrana, 658 Recién nacidos, inmunidad, 1282 Recodificación, señal de, 498 traduccional, 498 Recombinación conservativa específica de lugar, 291 de exones, 417 del cambio de clase, 1314 desigual, 415F específica de lugar, 281 general, 281F, 282, 283F, 290F general y conversión génica, 289F genética, 237, 281,413,1083 genética entre exones, 111 genética específica de lugar, 289
1-26
índice alfabético
genética general, 287,1089 genética promiscua, 288 nomóloga, 349,353F iniciación, 282F mitótica, 1177F mitótica inducida por rayos X, 1176 nódulos, 1090 transposicional específica de lugar, 291,293F V(D)J, 1312 Recombinantes, moléculas de DNA, 315 Reconocimiento, hélice de, 437 inmunitario, moléculas, 1339 mediante hélice a, 440 molecular, 93,99,101 Recoverina, 806 Red cortical, 1077 de espectrina, 526 de señalización, 836F de señalización celular y evolución, 835 del cis Golgi, 644, 645F del trans Golgi, 644, 657 del trans Golgi y superficie celular, 670 microtubular, 845 microtubular, ubicación, 846 neuronal, 833 neuronal, entrenamiento, 834, 836 neuronal, pesos de conexión, 834 Redox conjugado, par, 725 potencial, 725 Reducción, 65F del oxígeno, 723 Reductor, poder, 736 Reeler, mutante, 1203F Reemplazamiento génico, 349F, 350 Regeneración intercalada, 1141F, 1142 y crecimiento coordinado, 1231 Región(es) 3’ no traducida, 490 5’ líder mRNA, 494 asociada al andamio, 412 CH, 1312,1313 cromosómicas MHC, 1324 de armazón, 1303 de control del gen, 452 de control del locus, 466 determinante de la complementariedad, 1303F diversidad, 1310 dominio de control sobre la actividad génica, 467F en asa, 124, 125F heterodúplex, 283 hipervariables, 1303 libre de nucleosomas, 463 MAR, 412 reguladora de eve, 457F revestidas, 679 SAR, 412 señal, 596F V de inmunoglobulinas, segmentos génicos, 1308 V, ensamblaje de secuencias codificantes, 1312 VH, 1310-1313 VL, 1311 Registro zonal, 193, 567, 570F zonal, configuraciones estándar, 194F zonal, micropipetas, 193F Regla AT-terminal, 234,235 Regulación génica, 422 génica, proteínas, 435 génica y elementos transponibles, 422 por disminución, 668 por disminución del número de receptores, 826 por retroalimentación, 86 por retroinhibición, 211 Regulador citoplasmático y mitosis, 935 de tipo interruptor, 473F del crecimiento, 355 del crecimiento vegetal, 1194, 1194F secuencias, 452 Rejilla para cortes ultrafinos, 159F Reloj intracelular, 1131 Renaturalización del DNA, 284,322 Renovación celular velocidad, 1227 del revestimiento del intestino, 1236F por bipartición simple, 1227 tisular, 1270 Reordenación del DNA y cambio de clase, 1314F Reorganizaciones del DNA, 469 Reovirus, 296F Reparación del DNA, 237, 257, 258, 262FF, 265F, 1351 muscular, 1262 por eliminación de bases, 263, 265F por eliminación de nucleótidos, 264, 265F Repertorio preinmunitario de anticuerpos, 1307 Repetición de fibronectina tipo III, 1057 en heptada, 853
Réplica de platino, 162 metalizada, 162F Replicación, burbuja de, 383 del cromosoma eucariota, 384 del DNA, 107, 175, 237, 257, 268, 387, 479F, 930F, 1087 del DNA, corrección de galeradas, 270 del DNA, correctores, 108 del DNA, errores, 108 del DNA, horquilla, 270F del DNA, modelo incorrecto, 269F del DNA nuclear, 927 del DNA y quinasa de inicio, 952 del extremo, 362 del virus de simio SV40, 383 en mamíferos, horquilla, 384F horquilla, 273, 275, 276F, 382, 383, 387 iniciación, 383F máquina de, 275 no simultánea, 385,386F orígenes, 277, 361,382, 387F, 388 semiconservativa del DNA, 108F todo o nada, 387 unidad, 385 velocidad, 384 Replicasas, 297 Repolarización de la membrana, 581 Represión de la sinapsis, 1210 Represor de triptófano, 446,448, 469 Giant, 457F, 458F Krüppel, 457F, 458F lac, 433,436T lambda, 432, 433, 436T met, 441F transcripcional, 447 Reproducción asexual, 1083 sexual, 1083,1085 sexual en fanerógamas, 1188 Reptiles, desarrollo embrionario, 35F Rescate genético, 352F Reservas energéticas, 703 nutritivas en oocitos, 1094 Residuos de aminoácidos polares, 136 de serina, fosforilación, 854 GlcNAc, 659F tirosina fosforilados, 815 Resinas de inclusión, 151 Epon,158T epoxi Araldite, 158T intercambiadoras de iones, 183T Resistencia múltiple a las drogas, 1363 Resolución, límites, 149 máxima, 165 poder, 148F, 157 Resonancia magnética nuclear de proteínas, 119 magnética nuclear, espectroscopia, 186 Resorción ósea, 1267 Respiración, 17 celular, 73 celular eficacia, 716 Respiratorias, cadenas, 705 Respiratorio, complejo enzimàtico, 708 Respuesta al shock térmico, 266 inflamatoria, 1246, 1247F inmunitaria, genes, 1338 inmunitaria mediada por células, 1280 inmunitaria secundaria, 1295 monoclonal, 1286 oligoclonal, 1286 policlonal, 1286 por anticuerpos, 1280 primaria, 781 primaria de anticuerpos, 1295 rápida, genes, 967,968 retardada, genes, 967, 968 secundaria, 781 SOS, 266 Restricción, mapas de, 315, 316F MHC, 1323, 1335 Retículo endoplasmático, 24F, 232, 515, 590F, 617 endoplasmático, células especializadas, 618 endoplasmático, centrifugación, 620 endoplasmático, importación, 597T endoplasmático liso, 618 endoplasmático, membranas, 1324 endoplasmático, origen, 594F endoplasmático, proteínas residentes, 629 endoplasmático, ribosomas adheridos, 617 endoplasmático rugoso, 618 endoplasmático, señal de retención, 629, 645 endoplasmático translocador, 634 endoplasmático, túbulos membranosos, 848 endoplasmático y calcio, 620 endoplasmático y hormonas esteroides, 619 endoplasmático y rodopsina, 629F sarcoplasmático, 551, 578, 620, 811, 915F
y microtúbulos, 849F Reticulocitos, 1252F Reticuloendoteliosis, 1368T Retina, 806,1120, 1200 desarrollo, 1221F estructura, 1225F nasal, 1208 neural, 1221F, 1224 temporal, 1208 Retinal, 528 11 -cis, 806 Retinoblastomas, 1347T, 1374 genes supresores de tumores, 1375 mecanismos genéticos, 1374F Retinoides, 772, 779-781 Retroalimentación bucle, 474F inhibición, 87F negativa, 86, 87F negativa en enzimología, 210 positiva, 810 positiva en enzimología, 211 regulación, 86 Retroinhibición regulación por, 211 Retrotransposones, 305 Retrovirus, 302, 303-305, 419T, 1366, 1376T ciclo vital, 303F como vectores para los oncogenes, 1365 integrasa, 498F y oncogenes, 1367 y proto-oncogenes del huésped, 1369 Revestimiento de clatrina y ensamblaje, 680 de coatómero y ARF, 686 del intestino, renovación, 1236F epitelial del intestino delgado, 1227 RFLP, 326, 338, 339F y transferencia Southern, 327F Rianodina, receptores, 798 Riboflavina en medios de cultivo, 169T Ribonucleico, ácido, véase RNA Ribonucleoproteínas nucleares pequeñas, 399 Ribonucleósido trifosfatos, 239, 239F Ribosa, 49, 62,76, 109 Ribosomas, 10, 112, 130, 164, 173, 234, 237, 246, 405, 593, 621F bacterianos, 253 bacterianos, autoensamblaje, 133 bacterianos, estructura, 251F catálisis, 115 de Escherichia coli, 755 de procariotas, 246 desplazamiento de pauta, 488 desplazamiento sobre el mRNA, 247F diámetro, 601 eficiencia, 113 eucarióticos, 248F internos lugares de entrada, 493 libres, 618, 619F procarióticos, 248F reensamblaje, 133 síntesis, 407 unidos a membrana, 618, 619F y evolución, 16F y lectura de RNA, 112, 113F y microtúbulos, 871 y RNA unión, 248F Ribosómico, RNA, véase rRNA Ribozima, 8 Ribulosa 1,5-bisfosfato, 734, 735 bisfosfato carboxilasa, 186F, 734F-736 Rifamicina, 256T Riñón, hormonas, 789T yANP, 812 RNA, 5, 49,62, 109 antisentido, 350F, 351, 499F, 908 automadurativo, 114F autorreplicante, 9F bacteriano, síntesis, 239 cantidades en mamíferos, 397T catalíticos, 12, 115, 393 cebadores, 272 ciclos de selección, 8 como adaptador, 9 como catalizador, 8, 113 como código, 9 control de transporte, 431 control del procesamiento, 431 de eucariotas, corte y empalme, 110 de transferencia, 109,112, 237, 238, 242,393, 397, 405 de transferencia como adaptador, 242 degradación, 496F edición, 490,491F estabilidad, 495F guía, 491 heterogéneo nuclear, 395 localización, 489
índice alfabético
localización en los tejidos, 331F longitud, 394 maduración, 360, 400F, 401F, 403 maduración alternativa, 484,485F, 486FF, 487 maduración por corte y empalme, 241, 398,484 maduración trans, 490 mensajero, 12, 109, 110F, 237, véase también mRNA mitocondrial, origen, 764F plegamiento, 81 polimerasa, 238, 239F, 269, 271, 391, 392, 461 polimerasa I, 393, 406, 451 polimerasa 11, 393, 394, 395FF, 397, 398, 450F, 497 polimerasa III, 393, 407, 451 polimerasa bacteriana, 240, 241 polimerasa de Escherichia coli, 755 polimerasa de subunidad p, 392F polimerasa de una sola cadena, 241 polimerasa eucariota, 241, 393, 394 polimerasa intercambio de subunidades, 392 polimerasa, orientación, 241F polimerasa, origen, 392F polimerasa, subunidades intercambiables, 460F polimerasa vírica, 344F polimerasa y nucleosomas, 463F polimerasa y transcripción génica, 460 primasa, 272 procesamiento, 27,391, 397 producción, 343 propiedades catalíticas, 7 punto de segmentación, 489F reacciones catalizadas, 499 replicación, 6F ribosómico, 10, 12, 115, 246, 393,397, véase también rRNA ribosómico desproteinizado, 115F ribosómico 5S, 393 secuencia, 313 síntesis, 81F, 237,238F, 391, 392F splicing, 110 terminación temprana, 484 traducción, 27 transcritos primarios, 365,396,402F, 488 velocidad de crecimiento, 394 virus, 1376T y genes, 364 y ribosomas unión, 248F y síntesis de proteínas, 109 y síntesis primordial de proteínas, 10 y unión de aminoácidos, 9 RNasas, 324 Rodamina, 153,199F Rodopsina, 529, 786, 806, 826 y retículo endoplasmático, 629F Rojo de rutenio, 535 fenol en medios de cultivo, 169T Rombómeros, 1183 Rotación cortical, 1127 Rotura específica del DNA, 313 rRNA, 109, 113, 115,238, 246,405, véase también RNA ribosómico 5,8S, 406 5S, 407, 414 18S, 406 28S, 406 45S, 406, 407 citoplasmático, 397T de bacteriófago, 403 de cloroplastos, 403 de Tetrahymena, 403 en la subunidad rRNA 16S de E. coli, 247F genes mitocondriales, 403 nuclear, precursores, 397T Ruta basurero, 658 de secreción constitutiva, 670, 671F de secreción, proteólisis, 673 de secreción regulada, 670, 671F por defecto, 670, 671F Rutenio, rojo de, 535
Sacarosa, 736 gradiente de, 173 Saccharomyces cerevisiae, 339, 362, 943 cerevisiae, acoplamiento, 772 cerevisiae, ciclo vital, 944F cerevisiae, tipos celulares, 471 cerevisiae, genoma mitocondrial, 758 Saco amniotico, 1132 vitelino, 1133 Sal de plata, 180 Salmonella, cambio de expresión génica, 470
quimiotaxis, 828F Sangre, coagulación, 126 Sarcoma, 1346, 1347T, 1366, 1368T de Kaposi, 304,1376T de Rous, virus, 1366, 1368F Sarcómero, 909F, 910 línea media, 913F Satélites musculares, células, 1237 Schizosaccharomyces pombe, 943 pombe, ciclo vital, 944F Schwann, células de, 36, 567, 569F, 1119, 1206F, 1219 SDA, 1327 SDS, 521 SDS-PAGE, 179, 180F, 182 Secciones de un tejido, 150F ópticas, 155 por congelación, 151 seriadas, 161F ultrafinas, 159 ultrafinas con osmio, 160F Secreción, 594 constitutiva, ruta, 670 gránulos de, 671 regulada, ruta, 670 Secuenciación de DNA, 313, 314 de DNA, método enzimàtico, 320F de DNA, método químico, 319F de fragmentos de DNA, 319F Secuenciadores de aminoácidos, 184 Secuencial, inducción, 1127F Secuencias 3’ no traducidas, 399F AAUAAA, 396 Alu, 423 Alu humanas, 424F Asn-X-Ser, 630F C8, 1313 CM, 1313 CCGG, 479, 480 CG, 267 CG deficiencias, 483 CG metiladas, 483 codificantes continuas, 334 consenso, 240,400F de aminoácidos, máquinas automatizadas, 184 de DNA, 320F de DNA de proteínas, 321F de DNA de una células y cáncer, 1349 de DNA reguladoras, 345 de inicio de translocación, 628F de la insulina, 108, 109F de nucleótidos, 37, 245 de nucleótidos determinadas, 323 de replicación autónoma, 382, 383F de YSPTSPS, 450F GATA-1, 459F • GATC no metiladas, 276F, 277 génicas de la vulva, 1150F GGGTTA, 390, 391F GGGTTG, 391F homeobox, 1172 intrónicas, 395 intrónicas con automaduración, 403 intrónicas, eliminación, 400,401 intrónicas purificadas, 114F KFERQ, 656 leader 5', 399F nucleotídicas de curvatura, 434 nucleotídicas específicas, 315 palindrómicas, 314F promotoras, 392 promotoras del DNA, 238F reguladoras, 365,452 repetidas ricas en G, 391F RGD, 1058 Shine-Dalgarno, 492 tándem, 414 TATA, 450 TG, 267 VNTR, 342F Secundaria, estructura, 122, 124F Seda, 110 difracción de rayos X, 119 Sedimentación coeficiente, 173 equilibrio, 173 velocidad de, 173, 174F Segmentación del huevo, 1112, 1113 del plasma, 1001 etapas, 1113F genes, 1165 plano de, 1002F y actina, 1003 ymiosina, 1003 Segmentos corporales de Drosophila, 1155F D ,1312 de diversidad, 1309
1-27
Recambio, número de, 138 proteico selectivo, eucariotas, 232 Receptores, 772 adrenérgicos, 791 p2adrenérgicos, 791, 826F asociados a canales, 782 asociados a enzimas, 783, 812 asociados a proteínas, 786 asociados a proteínas G, 782 asociados a tirosina quinasas, 812 asociados a tirosina quinasas actividad, 820 basales de unión, 1064 buscadores, 1287 célula-matriz, 1024 citoquinas, 1254 de acetilcolina, 474, 574FF, 810 de acetilcolina y lámina basal, 1064 de adrenalina, 786F de carga, 684F de células T, 1329 de factores de crecimiento, 813 de glucocorticoides, 606F de insulina, 814 de la matriz, 1067 de la superficie celular, 772F de las células B, 1291 de las células T, 1339 de LDL defectuosos, 665 de LDL, rutas, 667 de linfocitos, 821 de mañosa 6-fosfato, 658 de PDGF, 814 de reguladores de crecimiento, 1194 de rianodina, 798 de SRP, 623 de superficie celular, 783 de superficie, clases, 783F de tirosina quinasa, 1150 endocitosis mediada, 664 específicos de antígenos, 1285 Fe, 1295, 1339 GM-CSF, subunidades, 1254F uanilato ciclasa, 812, 813 umanos de LDL, 664F IL-2, 821 IL-2, ensamblaje, 821F 1L-3, subunidades, 1254F intracelulares, 772F LDL, 664F LDL, número de intrones, 365T LDL, tamaño del gen, 365T LDL, tamaño del mRNA, 365T localizadores, 1287 M6P, 657 moléculas de superficie celular, 1039 muscarínicos de acetilcolina, 804 mutantes, 664F nicotínicos de acetilcolina, 804 NMDA, 582,583, 1211 NMDA y aprendizaje, 583 número, 825 olfativos, 805 para el virus del SIDA, 1322 proteicos intracelulares, 781F quimiotácticos, 830, 831F quimiotácticos, activación secuencial, 832F quimiotácticos, adaptación, 832F quimiotácticos y motor del flagelo, 832 relacionados con enzimas, 573 relacionados con proteínas G, 573 serina/treonina quinasa, 812, 823 tirosina fosfatasa, 812 tirosina quinasa, 798F, 812,813,817, 819F, 822, 1253T transmembrana, 1371 transmembrana endocitados, 667F transmembrana Notch, 823 transmembrana y quimiotaxis bacteriana, 830 unidos a proteínas G, 797T Receptores-anticuerpos complejos, 668 Rechazo del injerto, 1317 Reciclaje de membrana, 658 Recién nacidos, inmunidad, 1282 Recodificación, señal de, 498 traduccional, 498 Recombinación conservativa específica de lugar, 291 de exones, 417 del cambio de clase, 1314 desigual, 415F específica de lugar, 281 general, 281F, 282,283F, 290F general y conversión génica, 289F genética, 237, 281, 413, 1083 genética entre exones, 111 genética específica de lugar, 289
1-26
índice alfabético
genética general, 287, 1089 enética promiscua, 288 omòloga, 349,353F iniciación, 282F mitótica, 1177F mitótica inducida por rayos X, 1176 nodulos, 1090 transposicional específica de lugar, 291, 293F V(D)J, 1312 Recombinantes, moléculas de DNA, 315 Reconocimiento, hélice de, 437 inmunitario, moléculas, 1339 mediante hélice a, 440 molecular, 93, 99, 101 Recoverina, 806 Red cortical, 1077 de espectrina, 526 de señalización, 836F de señalización celular y evolución, 835 del cis Golgi, 644, 645F del trans Golgi, 644, 657 del trans Golgi y superficie celular, 670 microtubular, 845 microtubular, ubicación, 846 neuronal, 833 neuronal, entrenamiento, 834, 836 neuronal, pesos de conexión, 834 Redox conjugado, par, 725 potencial, 725 Reducción, 65F del oxígeno, 723 Reductor, poder, 736 Reeler, mutante, 1203F Reemplazamiento gènico, 349F, 350 Regeneración intercalada, 1141F, 1142 y crecimiento coordinado, 1231 Región (es) 3’ no traducida, 490 5’ líder mRNA, 494 asociada al andamio, 412 CH, 1312, 1313 cromosómicas MIIC, 1324 de armazón, 1303 de control del gen, 452 de control del locus, 466 determinante de la complementariedad, 1303F diversidad, 1310 dominio de control sobre la actividad génica, 467F en asa, 124, 125F heterodúplex, 283 hipervariables, 1303 libre de nucleosomas, 463 MAR, 412 reguladora de eve, 457F revestidas, 679 SAR.412 señal, 596F V de inmunoglobulinas, segmentos génicos, 1308 V, ensamblaje de secuencias codificantes, 1312 VII, 1310-1313 VI., 1311 Registro zonal, 193, 567, 570F zonal, configuraciones estándar, 194F zonal, micropipetas, 193F Regla N-terminal, 234, 235 Regulación gènica, 422 génica, proteínas, 435 génica y elementos transponibles, 422 por disminución, 668 por disminución del número de receptores, 826 por retroalimentación, 86 por retroinhibición, 211 Regulador citoplasmàtico y mitosis, 935 de tipo interruptor, 473F del crecimiento, 355 del crecimiento vegetal, 1194, 1194F secuencias, 452 Rejilla para cortes ultrafinos, 159F Reloj intracelular, 1131 Renaturalización del DNA, 284,322 Renovación celular velocidad, 1227 del revestimiento del intestino, 1236F por bipartición simple, 1227 tisular, 1270 Reordenación del DNA y cambio de clase, 1314F Reorganizaciones del DNA, 469 Reovirus, 296F Reparación del DNA, 237, 257, 258, 262FF, 265F, 1351 muscular, 1262 por eliminación de bases, 263, 265F por eliminación de nucleótidos, 264, 265F Repertorio preinmunitario de anticuerpos, 1307 Repetición de fibronectina tipo III, 1057 en heptada, 853
Réplica de platino, 162 metalizada, 162F Replicación, burbuja de, 383 del cromosoma eucariota, 384 del DNA, 107, 175, 237, 257, 268, 387, 479F, 930F, 1087 del DNA, corrección de galeradas, 270 del DNA, correctores, 108 del DNA, errores, 108 del DNA, horquilla, 270F del DNA, modelo incorrecto, 269F del DNA nuclear, 927 del DNA y quinasa de inicio, 952 del extremo, 362 del virus de simio SV40, 383 en mamíferos, horquilla, 384F horquilla, 273, 275, 276F, 382, 383, 387 iniciación, 383F máquina de, 275 no simultánea, 385, 386F orígenes, 277, 361, 382, 387F, 388 semiconservativa del DNA, 108F todo o nada, 387 unidad, 385 velocidad, 384 Replicasas, 297 Repolarización de la membrana, 581 Represión de la sinapsis, 1210 Represor de triptófano, 446,448, 469 Giant, 457F, 458F Krüppel, 457F, 458F lac, 433, 436T lambda, 432,433, 436T met, 441F transcripcional, 447 Reproducción asexual, 1083 sexual, 1083, 1085 sexual en fanerógamas, 1188 Reptiles, desarrollo embrionario, 35F Rescate genético, 352F Reservas energéticas, 703 nutritivas en oocitos, 1094 Residuos de aminoácidos polares, 136 de serina, fosforilación, 854 GlcNAc, 659F tirosina fosforilados, 815 Resinas de inclusión, 151 Epon, 158T epoxi Araldite, 158T intercambiadoras de iones, 183T Resistencia múltiple a las drogas, 1363 Resolución, límites, 149 máxima, 165 poder, 148F, 157 Resonancia magnética nuclear de proteínas, 119 magnética nuclear, espectroscopia, 186 Resorción ósea, 1267 Respiración, 17 celular, 73 celular eficacia, 716 Respiratorias, cadenas, 705 Respiratorio, complejo enzimàtico, 708 Respuesta al shock térmico, 266 inflamatoria, 1246, 1247F inmunitaria, genes, 1338 inmunitaria mediada por células, 1280 inmunitaria secundaria, 1295 monoclonal, 1286 oligoclonal, 1286 policlonal, 1286 por anticuerpos, 1280 primaria, 781 primaria de anticuerpos, 1295 rápida, genes, 967, 968 retardada, genes, 967, 968 secundaria, 781 SOS, 266 Restricción, mapas de, 315, 316F MHC, 1323, 1335 Retículo endoplasmático, 24F, 232, 515, 590F, 617 endoplasmático, células especializadas, 618 endoplasmático, centrifugación, 620 endoplasmático, importación, 597T endoplasmático liso, 618 endoplasmático, membranas, 1324 endoplasmático, origen, 594F endoplasmático, proteínas residentes, 629 endoplasmático, ribosomas adheridos, 617 endoplasmático rugoso, 618 endoplasmático, señal de retención, 629, 645 endoplasmático translocador, 634 endoplasmático, túbulos membranosos, 848 endoplasmático y calcio, 620 endoplasmático y hormonas esteroides, 619 endoplasmático y rodopsina, 629F sarcoplasmático, 551, 578, 620, 811,915F
FRAP, 533F Pap smear, 1354F Papanicolaou, 1354F Tecnología del DNA recombinante, 313, 347 Tectales, células, 1208 Tectum, moléculas repelentes, 1207 óptico del cerebro intermedio, 1207 orientación anteroposterior, 1209 posterior, 1208 Tejido, 1017 adiposo, 703 adiposo hormonas, 789T adiposo marrón, mitocondrias, 728 adulto, respuesta a las señales, 777 cartilaginoso, 1119 con actividad eléctrica y uniones gap, 1028 conjuntivo, 120, 990, 1017, 1041, 1042F, 1054, 1119, 1121, 1262F, 1263 conservación y forma, 1220 constituyente, 1220, 1221 convergente, 1118F de muslo de pollo, 1140F diana, 789T embrionario, disociación, 1033 epitelial, 1017 epitelial, uniones de anclaje, 1021F fibroso, 1119 enes específicos, 483 ematopoyético, 1282 óseo, 1119 renovación, 1270 secciones, 150F Telangiectasia, ataxia, 1362 Telofase, 981F y sigs. II, 1093 de célula vegetal, 1007F tardía, 981Fysigs. y envoltura nuclear, 999 Telomerasa, 362, 389,390, 970 Telómeros, 361, 362F, 389, 464, 970 replicación, 391F Temperatura, mutantes sensibles a la, 946 y estado de energía, 102 Tenascina, 1059 Tensión superhelicoidal, 468 superhelicoidal del DNA, 467, 468F Teoría celular, 147, 148T cromosómica, 1086 déla selección clonal, 1284F, 1288, 1291 neuronal, 168 Teratocarcinomas, 1134, 1349 Teratoma, 1134 Terciaria estructura, 124F Terminación, codón de, 245, 246 de síntesis de RNA, 240F señal, 240 Termodinámica, segunda ley, 63,69, 712 Test de hidropatía, 521 Testículo de mamífero, 1102F Tetraciclina, 256T, 752, 755 Tetrahymena, 113, 115,391F intrón automadurativo, 115 Tetrametilrodamina, 152F 1,3,5-Tetraquisfosfato, 798 Tetrasacáridos de unión, 1045 Tetróxido de osmio, 159 TFIID, 450 TGF-a, 959T TGF-p,’ 823, 959T, 1047, 1128F, 1264 THE-1, elementos, 419T Tiamina en medios de cultivo, 169T pirofosfato, 137 Tierra primitiva, condiciones, 4FF Tilacoidal, espacio, 607, 733 membrana, 607, 732F, 733 Tilacoides, 612, 733 criofractura, 163F gradiente electroquímico, 612 Timidina 3H, 191, 270, 384, 928, 965F 5-bromodeoxiuridina, 386 Timina, 49, 62, 103, 109 dímero, 262 Timo, 1280, 1281F, 1315, 1335 selección negativa, 1336, 1337F selección positiva, 1335, 1337F Timosina, 886 TIMP, 1066 Tinción celular, 148T del DNA, 318 negativa, 158T, 163,164 selectiva, 151 Tioéter, 519F Tipos celulares, control, 471F celulares de los vertebrados, 36 celulares, DNA, 429 celulares especializados, 469
índice alfabético
celulares y proteínas, 430 Tiroglobulina, número de intrones, 365T tamaño del gen, 365T tamaño del mRNA, 365T Tirosina, 780 aminotransferasa, 431 autofosforilación, 814 en medios de cultivo, 169T hidroxilasa, 803 quinasa, 784, 813, 902 quinasa, familias de receptores, 813F quinasa Lek, 822 quinasas similares a Src, 1329 quinasas transmembrana, 1254 residuos, 650 Titina, 917 localización, 917F TMV, véase Virus del mosaico del tabaco estructura, 134F Tn3 e IS1 elementos, 419T Todo-fram- retinal, 806 Tolerancia inmunológica, 1290F inmunológica adquirida, 1289, 1290 inmunológica natural, 1290 Tonicidad, 551F Topoisomerasa, 952 Toxina(s), 576 bacterianas, 1280 colérica, 517, 791 colérica, activación, 808F pertúsica, 791 pertúsica, activación, 808F TPA, 1355 TPP, 137F carbono addico, 137F Tracción, 906 Tractos fibrosos, 1205 Traducción, 111,360, 618 continua y translocación, 624 del mRNA, 497F del RNA, 27 eucariota, 492 in vitro, 174,175 procariota, 492 proteínas represoras, 494 Traduccional, control, 431 negativo control, 494 recodificación, 498 Tráfico proteico, 595F Trancrito primario de RNA, 402F Transcitosis, 667, 668, 1296 Transcripción, 360 atenuación, 484 de DNA in vitro, 343 del DNA, 27, 109, 175, 238, 257, 391, 392F del DNA, activación, 463 dirección, 241F ensamblaje de factores, 450F factor general, 450 gènica, 422, 779,1113 gènica y RNA polimerasa, 460 impedida, 463 unidad de, 392 Transcripcional, control, 431 Transcriptasa inversa, 303, 304, 333F, 419T, 498F inversa de retrovirus, 334 Transcritos de RNA, 109 de RNA, punto de rotura, 486 hnRNA, 398 primarios, 110, 395 primarios de RNA, 365, 396, 396F, 488 Transducción del DNA, 307 energética, 517 Transducina, 806, 807 Transductores sensoriales, 1274 Transfectadas, células, 332 Transferasa de oligosacáridos, 630 Transferencia CCA, 112 de electrones, 725 de energía por resonancia, 737 de tipo Western, 182F direccional y vesículas revestidas, 680 Northern, 324,325F RNA de, véase tRNA señal de inicio, 626, 627 señales de paso, 627 Southern, 324, 325, 328 Southern y RFLP, 327F Transferrina, 168, 496F, 667 en medios de cultivo, 169T libre de hierro, 667 Transformación con virus, 169 genética, 347 neoplásica, 302 vírica, 171T Transgenes, 352
Transgénicos, animales, 351 organismos, 338 ratones, 482 Transición alostérica, 210, 211 alostérica acoplada energéticamente, 224 alostérica cooperativa, 212F alostérica y metabolismo, 210 cooperativa de todo o nada, 212 de fase, 513 de la media blástula, 1114 del ciclo celular, 932 R-T, 213F Translocación, 414,464 de proteínas, 175T génica accidental, 415 post-traduccional, ruta, 624 secuencias de inicio, 628F y membrana del retículo endoplasmático, 623 y traducción continua, 624 Translocadores de fosfolípidos, 512, 634 proteicos, 595 Transmembrana de multipaso, proteínas, 520 de paso único, proteínas, 520 Transmisión neuromuscular, 577 Transponibles elementos, 305, 306F, 421 Transportadores, 543 ABC, 555, 557TF ABC codificados por MHC, 1324 ABC de la membrana del retículo endoplasmático, 558 acoplados, 547 antiporte, 548 constantes de unión al soluto, 547 de aniones, 527 de azúcares, 557T de electrones, 698 de electrones de la cadena respiratoria, 720 de hidrógeno, 728 de intercambio, 548 de intercambio de cationes/aniones, 557T electrónicos de la membrana mitocondrial, 709 formadores, 545 iónicos móviles, 545F móviles, 545 proteínas, 541 sencillos, 547 unidireccionales de sodio-HC03, 554 unidireccionales impulsados por sodio, 557T uniportes, 547 Transporte activo, 541, 543, 544, 547 activo primario, 553 activo secundario, 553 activo y gradiente electroquímico, 712F activo y gradiente iónico, 553 activo y poros nucleares, 604F antiporte, 547 de electrones, cadenas, 698 de electrones, evolución, 744 de hidrógeno, 590 de intercambio, 547 de membrana, familias de proteínas, 545 de RNA, regulación, 488 de vesículas, 593 de vesículas, dirección, 687 del retículo endoplasmático al complejo, 642 direccional selectivo, 679 electrónico, cadena, 75 iónico, hidrólisis de ATP, 549 mediado por transportadores, 547F nuclear, regulación, 605 paracelular, 1021 pasivo, 543, 544F, 547 regulado, 595 simporte, 547 transcelular, 555 transcelular de glucosa, 555F transcelular y uniones estancas, 1019F transmembrana, 595 unidireccional, 547, 553 unidireccional con sodio, 547 velocidad máxima, 547 vesicular, 595, 641, 686, 873F vesicular, mecanismos moleculares, 678 vesicular unidireccional y energía, 679F y pH, 554 Transposasa, 305, 419T, 421,422 Transposición, 305 explosiones, 423 Tráquea, 1118 Trasplante, experimentos, 1136 nuclear, 1125, 1126F reacciones, 1317 Treonina, 182F, 215F en medios de cultivo, 169T inhibición por retroalimentación, 87F Triacilglicéridos, 47, 48, 703, 788
1-29
degradación, 789T Trifosfato de adenina, 62 Triglicéridos, 703 Triosafosfato isomerasa, 417, 418F Tripanosomas, 16F mitocondrias, 491F proteínas unidas a GPI, 632 Triplete de nucleótidos, 111 Tripsina, 126, 166, 183, 184T, 344 Triptófano, 45F, 246 en medios de cultivo, 169T represor, 446, 469 síntesis, 446F Trisquelion, 680, 681F, 684F Tritón, 521 X-100, 522F, 522 tRNA, 109, 111,112, 220, 237, 238, 242, 246, 397T anticodón, 245F en hoja de trébol, 242F estructura plegada, 242F estructura tridimensional, 188T iniciador, 250 nucleótidos, 243F plegamiento, 112 reconocimiento, 244F y aminoácido, 243 Trofoectodermo, 1133 Trombina, 797T Trombospondina, 1257 Tromboxanos, 775F Tropomiosinas, 474, 526F, 853, 905, 916 Troponina, 474, 916F C, 801,916 T, 916 TSH, 789T Tuberculosis, 148T Tubo neural, 1119, 1120F, 1200, 1201 neural, formación, 1119F, 1201F neural, placa básica, 1205 proteico, 132 Tubulina, 195, 843, 860, 986F a, 860,861 a/p, 865 P, 860, 861, 866F y, 865, 866F acetilación, 869 adición al microtúbulo, 991 adición de moléculas, 845 concentración crítica, 862, 863F destirosinación, 869 marcada con fluoresceína empaquetada, 197 modificación post-traduccional, 869 propiedades mecánicas, 859F pura, polimerización, 863F vida media, 866 y colchicina, 994 Túbulos, 915F del retículo endoplasmático, 592 membranosos del retículo endoplasmático, 848 seminíferos, 1101, 1102F transversales, 915 Tumor benigno, 1346 de glándulas, 1373 de mama, crecimiento, 1348F de retinoblastoma, genes supresores, 1375 de tiroides, 1373 genes supresores, 966, 1365, 1377 glandular benigno, 1346F glandular maligno, 1346F inducción, 17 IT maligno, 1346 p53, 1381 progresión, 1354 secundario, 1361 selección natural, 1354 y mutación, 1354 y vasos sanguíneos, 1359 Tumoral, progresión, 1351 Túnico-vasculares, células, 736,737F Turgencia, 1191 presión, 655, 1074 Ty, elementos, 419T
U-PA, 1066 Ubiquinona, 725, 741F Ubiquitina, 232F, 233, 1324 degradación proteica dependiente de, 234F estructura tridimensional, 233F UDP-galactosa, 648F UDP-GlcNAc, 660F UDP-N-acetilglucosamina, 648F Ultracentrífuga, 173
1-30
índice alfabético
analítica, 175T historia, 175T preparativa, 172F Ultracentrifugación, 172 Ultramicrótomo, 159 Umbral de estimulación sináptica, 580 Uñas, 859 Unidad de homología, 1339 de replicación, 385 de replicación tardía, 386 de transcripción, 392 formadorade colonias, 1249 Unión(es), 1063 a MHC correceptores, 1322 adherentes, 902, 1018T, 1022 adherentes célula-célula, 1022, 1026T adherentes célula-matriz, 1023, 1026T adherentes y actina, 1022 al antígeno, 1292 antígeno al anticuerpo, 1297F célula-célula, 1018 célula-célula dependiente de calcio, 1035 célula-matriz, 1018T celulares, 33, 1017, 1018 competitivas, 211F complejo, 1029 comunicantes, 558, 576, 776F de anclaje, 1018, 1021, 1022F, 1026T de comunicación, 1018 de fragmentos de DNA, 343 de Holliday, 287 de las vesículas, especificidad, 688 de oclusión, 1018 de tetrasacáridos, 1045 estancas, 533F, 534, 555F, 675,1019, 1020FF, 1114 estrechas, véase Uniones estancas gap, 776, 1018T, 1026, 1027FF, 1099, 1114 gap, diámetro, 1027 gap, permeabilidad, 1029 gap y calcio, 1029F gap y pH, 1029F GTP.218 heterodúplex, 282F, 283, 288 heterofílicas, 1036 homofílicas, 1036 neuromusculares, 36 neuromusculares y lámina basal, 1063,1065F proteínas de, 558 septadas, 1018T, 1022,1024 solapadas, 283 V-J, 1309F ydesmosomas, 1026T y glucoproteínas transmembrana, 1022 y hemidesmosomas, 1026T Uracil DNA glucosilasa, 264, 267 Uracilo, 6, 49, 109, 262 DNA glucosilasa, 482 Urato oxidasa, 614 Urea, ciclo, 762 Ureasa, 188T Uridina3H, 191, 398 Útero, 775F carcinoma in situ, 1354 UTR, 490, 496F y localización de mRNA, 490F UTR3’, 495F, 496
v-SNARF, 687FF Vacuolas, 24 contráctiles, 551 presión osmótica, 654 vegetales, 654, 655F Vaina de mielina, 36, 517, 567, 569F Valina, 111F en medios de cultivo, 169T Valinomicina, 546 Valium, 576 Valor posicional, 1135,1139 posicional e intercalación, 1140 s, 173 Van der Waals atracciones, 94, 95T Variación al azar y evolución, 3 de energía libre, 713F de energía libre estándar, 712 y sigs. estabilidad del mRNA, 495 Variegación, 761 por efecto de posición, 478F Vasopresina, 789T, 797T, 799F Vector(es), 343 de clonaje, 331 de expresión, 344
de expresión plasmídico, 345F de expresión y DNA, 337 plasmídicos, 332 víricos, librería de DNA, 332 YAC, 363F Vegetales, paredes celulares, 1073 VEGF, 813, 1235 Vellosidades intestinales, 1236 Velocidad de movimiento molecular, 101 de mutación, 1355 de replicación, 384 de sedimentación, 173, 174F de transporte máxima, 547 Venas, 1232 Vénulas postcapilares de endotelio grande, 1287F Verde de malaquita negro Sudán, 151 Verificación de lectura, 271F Verrugas, 1376T Vertebrados, desarrollo, 1220F especialización, 36 inducción de la mitosis, 956 intrones, 401 obtención del nitrógeno, 76 regiones del cuerpo, 1184F Vértebras, 1121 Verticilos florales, 1196 Vesícula(s) acrosómicas, 1100 citoplasmáticas, 24 de Golgi, 59IT, 643 de membrana, 196 de núcleo denso, 671 de secreción, reciclaje de membranas, 674 de secreción, señal para el vaciado, 673 de secreción y proteólisis, 672 de transporte, 593, 595, 641 del cristalino, 1223 del retículo endosplasmático liso, 59IT del retículo endosplasmático rugoso, 59IT fusión, 689 pinocíticas revestidas de clatrina, 684 revestidas, 679 revestidas de clatrina, 663, 671F, 679F revestidas de coatómero, 679F, 685 revestidas de coatómero, formación, 687F revestidas, tipo, 679 revestidas y transferencia direccional, 680 secretora, gemación, 671 secretora, origen, 671,672F secretoras y microtúbulos, 871 sinápticas, 572 sinápticas, formación, 676F sinápticas y endosomas, 675 y pH, 679F Vía biosintética secretora, 641 biosintética-secretora, compartimientos, 642F endocítica, 641 endocítica, compartimientos, 642F metabólica, activación, 211 por defecto, 642 secretora, 641 Vibraciones ultrasónicas, 172 Vida, formas más simples, 3 Viento polar, 992F VIH, véase Virus de la inmunodeficiencia humana Villina, 903 Vimentina, 843, 856 filamentos, 854 filamentos relacionados, 854 propiedades mecánicas, 859F Vinblastina, 862 Vincristina, 862 Vinculina, 902, 1023, 1072T localización, 1024F Viroides, 307 de plantas RNA, 115 Viruela, 294 Virus, 130, 164, 293, 1280, 1321, 1349 auxiliar, 1368F bacteriano SPOl, 460F bacterianos, colas, 134 cápside proteica, 294 ciclo vital, 294F cubierta, 132 1301 de DNA, 1376T de DNA, replicación, 297 de DNA tumorales, 302, 1376, 1377 de Epstein-Barr, 319,1376T de la estomatitis vesicular, 297, 300 de la gripe, 296F, 297 de la gripe, proteínas de fusión, 691 de la hepatitis B, 1376T de la inmunodeficiencia humana, 304, 1327, 1376T de RNA, 1376T de RNA de cadena negativa, 297 de RNA de cadena positiva, 297
de RNA, replicación, 297 de RNA tumorales, 302,304 de simio SV40,295FF, 369, 383, 1377FF de tumor mamario de ratón, 1369F del herpes, 294,296F, 300,301 del mosaico del tabaco, 133,188T, 296,296F del mosaico del tabaco, autoensamblaje, 133 del mosaico del tabaco, estructura, 134F del sarcoma de Rous, 171T, 1366,1368F del sarcoma de Rous, transformación celular, 1367F del SIDA, 303F, 304 del tomate achaparrado, 133F, 295F endocitosis, 690F envoltura membranosa, 294 envolturas, 296F esférico estructura, 133F evolución, 306 latencia, 301 microscopía electrónica, 165F necrosante satélite del tabaco, 295F recubiertos, 294 recubiertos, gemación, 300 Semliki forest, 295F, 300 Semliki forest, ciclo vital, 299F Semliki forest, estructura, 298F tipo I de la leucemia, 1376T tumorales, cultivo celular transformado, 1366T vegetal, 175T
índice alfabético
laevis, gastrulación, 1115 laevis, desarrollo del huevo, 1112F Xeroderma pigmentosum, 266,1362
X de la patata, 296F y células T citotóxicas, 1323F y maquinaria intracelular, 298 y solapamiento de genes, 307 Visión, 806 en estéreo, 1211 Vitamina, 80 A, 780F C ,1051 D, 779-781 Vitelo, 1098, 1131 Voltaje, canales iónicos regulados por, 565,570 sensor, 571F, 572 Volumen celular, estabilidad, 550 Volvo)c, 29, 32
YAC, 339, 363F Yema de la extremidad de ios vertebrados, 1185F de la extremidad, valor posicional, 1185 del ala de pollo, 1140
W Watson y Crick, pares de bases, 106 Weel, gen, 954T Western blotting, 182F
Xenoinjertos, 1317 Xenopus laevis, 1112
Z, esquema, 741F Zellweger, síndrome de, 616 Zigoteno, 1090 Zigoto, 1084F, 1107,1188 centríolo, 1107 Zinc, dedos de, 439 Zona marginal, 1117 pelúcida, 1095, 1104, 1132 pelúcida de mamífero, 1104 registro, 567, 570F ZP1, 1104 ZP2,1104-1106F ZP3, 1104, 1105F, 1107
1-31