Faculté pluridisciplinaire de Nador Département de BCG
METHODES CHROMATHOGRAPHYQUES
ABDELHAKIM BAILAL
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I/ HISTORIQUE DE LA CHROMATOGRAPHIE 1903 - Séparation de pigments de la chlorophylle sous la forme d’anneaux colorés sur une colonne remplie de carbonate de calcium ( Tswett chimiste russe) 1930- où Edgar Lederer a purifié par la méthode de Tswett la lutéine du jaune d’œuf. 1938 - Chromatographie sur couche mince (Ismailov et Shraiber) 1940- Martin et Synge développent la pratique et la théorie de la chromatographie, ils obtiennent le prix Nobel en 1952 1952-mise au point de la Chromatographie en Phase Gazeuse ( CPG). 1968 - Chromatographie en phase liquide à haute performance HPLC (Giddings et Kirkland) Aujourd„hui- la chromatographie, à elle seule, représente plus de la moitié du chiffre
d’affaires de l’instrumentation d’analyse moléculaire (Plus de 20 milliards d'Euros par an).
II/PRINCIPES DE LA CHROMATOGRAPHIE 1- Définitions A - Chromatographie : Ensemble de méthodes qui assurent la séparation des constituants d’un mélange en utilisant deux phases non miscibles: les divers constituants sont entraînés d'une manière différentielle par une phase mobile (Φm) le long d'une phase stationnaire ( Φs). en fait, les solutés se partagent entre la
Φ s
et la Φ m ;
B- phase stationnaire(ϕs) Par définition immobile; choisie pour sa grande affinité pour les divers solutés; cependant, l’ affinité ne doit pas être trop importante: les solutés doivent pouvoir être détachés.
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La phase stationnaire la plus utilisée en chromatographie est le gel de silice. Il est constitué de micro sphères de diamètre sensiblement constant pouvant varier de 2 à 5 mm. Le diamètre doit être le même pour toutes les particules si on veut éviter la création de chemins préférentiels. Ces micro sphères sont obtenues par agglutination en présence d’un liant organique urée/formol de microparticules (appelées sol-gel) elles mêmes obtenues par polymérisation puis hydrolyse contrôlée du tétraéthoxysilane.
Remarque : Les gels de silice ne supportent pas des pH trop extrêmes. Il y a des risques de dissolution pour des pH trop acides ou trop basiques. on se limite donc à la gamme 2 < pH < 12. Des gels spéciaux existent pour une utilisation à pH extrêmes.
C- phase mobile(ϕm) = éluant si la ϕm est liq a) Influence de la polarité de la ϕm À l’exception de la chromatographie en phase gazeuse, la phase mobile, appelée également éluant, est un solvant ou un mélange de plusieurs solvants miscibles.
Le rôle de la ϕm est de déplacer les composés du mélange vers le haut de la plaque en CCM ou vers la sortie de la colonne en chromatographie sur colonne. - Dans la ϕm : Plus un composé est soluble dans la la ϕm , plus vite il se déplacera - Dans la ϕs : Plus un composé est soluble dans la ϕs liquide, moins vite il se déplacera. - La vitesse de déplacement des composés d’un mélange dépend de la polarité de l’éluant , de celle des composés à séparer et des adsorbants utilisés dans la ϕs .
b) Série éluotropique des solvants Éther de pétrole Cyclohexane Tétrachlorométhane Trichlorométhane Toluène Benzène Dichlorométhane Éther diéthylique
« pouvoir éluant » croissant
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Trichlorométhane Éthanoate d’éthyle Pyridine Propanone Propan-1-ol Éthanol Méthanol Eau Acide éthanoïque
c) Polarité des principaux groupements fonctionnels
d) Adsorbants utilisés en chromatographie Papier, cellulose Kieselguhr, terre de diatomées Amidon Sucres Talc Carbonate de sodium Oxyde de magnésium Gel de silice Alumine Charbon activé
Forces d’interactions croissantes avec les composés polaires
L’adsorption est un phénomène d'interface à la différence de l'absorption
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D- éluat Solution recueillit à la sortie de la colonne. E- élution Processus au cours duquel on sépare les phases. F- Chromatogramme: Diagramme montrant l’évolution du signal du détecteur (÷ à la concentration en soluté) en fonction du temps d’élution (plus rarement du volume d’élution).
L’analyse du chromatogramme permet une analyse :
-qualitative : identification / position du pic -quantitative : aire des pics
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Séparation des constituants d‟un mélange par chromatographie d‟élution sur colonne
2- principe -
Chaque soluté est soumis à : une force de rétention (exercée par la phase stationnaire) une force de mobilité ( due à la phase mobile). Les temps de rétention des composés sur la phase stationnaire doivent être différents pour que la séparation se fasse.
-
Les facteurs qui contrôlent la séparation sont surtout d'ordre thermodynamique: la rétention de l'échantillon sur la colonne est donc contrôlée thermodynamiquement.
a) La séparation idéale
b) La séparation réelle En pratique la séparation idéale n'est pas réalisable. Ainsi il se produit un élargissement des bandes en raison surtout des phénomènes de diffusion. Les facteurs qui contrôlent la diffusion
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sont surtout de nature cinétique et peuvent être considérés indépendamment des facteurs thermodynamiques qui influencent la rétention.
Séparation chromatographique réelle (non idéale)
III/ DIFFÉRENTS TYPES DE CHROMATOGRAPHIE 1-Classification suivant la nature des phases a) chromato en phase liq (CPL) ← ϕm=liq
ϕm=liq et ϕs=liq → (CLL) ϕm=liq et ϕs= solide → (CLS) ϕm=liq et ϕs= résine échangeuse d’ion → (IEC) ϕm=liq et ϕs= GEL
b) chromato en phase gazeuse ← ϕm=GAZ ϕm=gaz et ϕs=liq → (CGL) ϕm=gaz et ϕs= solide → (CGS)
c) chromatographie en phase supercritique (CPS) Dans laquelle la phase mobile est un gaz comprimé (à sa température et à sa pression critique) ou une phase liquide / vapeur de même densité (au-delà de la température critique, le gaz ne peut être liquéfié quelle que soit sa pression). Avec cette phase mobile, le plus souvent l’anhydride carbonique, la durée de l’analyse est de 5 à 10 fois plus courte qu’avec les phases mobiles liquides. De viscosité très faible, cette phase mobile permet un couplage facile avec des détecteurs comme le spectromètre de masse ou le détecteur par mesure de la diffusion de la lumière.
2-Classification selon le phénomène chromatographique : Elle dépend de la nature (et de la structure) de la ϕs utilisée. On distinguera donc :
a) la chromatographie d'adsorption 7
(LSC, GSC) (lorsque la phase stationnaire est un solide);
La séparation entre les molécules est fondée sur le processus répété d'adsorption et désorption par la
ϕs.
La phase stationnaire est très polaire (la phase mobile est alors généralement peu polaire), les substances sont alors élués en sens inverse de leur polarité propre. Les composants peu polaires ont une plus grande affinité pour la phase mobile et sont donc élués rapidement. Inversement les solutés polaires ont une plus grande affinité pour la phase stationnaire et sont élués lentement.
Principaux greffons utilisés en phase normale : Il s’agit de greffons comportant des fonctions de nature polaire :
- Amine NH2 - Nitrile : CN - Diols : CH2 – CHOH – CH2OH La ϕs peut être modifiée pour être apolaire : chromatographie d‟adsorption en phase inverse. La phase stationnaire est peu polaire ou apolaire (la phase mobile est alors généralement polaire), les substances sont alors élués dans le sens de leur polarité propre. Les composants polaires ont une plus grande affinité pour la phase mobile et sont donc élués rapidement. Inversement les solutés peu polaires ont une plus grande affinité pour la phase stationnaire et sont élués lentement.
Principaux greffons utilisés en phase inverse : Il s’agit de greffons comportant des fonctions de nature apolaire :
C2 : Diméthylsillyle : C8 : Octylsillyle C18 : Octadécylsillyle
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Par extension on pourrait y rattacher la chromatographie d'affinité, qui correspond à un cas où les propriétés d'adsorption de la phase stationnaire sont spécifiques vis-à-vis d'un (ou une famille de) composé(s).
la phase stationnaire est ici un substrat inerte sur lequel est greffé un “effecteur” qui présente une affinité pour un soluté de l‟échantillon à analyser (affinité enzyme-
substrat,ligand-récepteur, antigène-anticorps).
b) la chromatographie de partage
La séparation est fondée sur les différences de solubilité des molécules à séparer entre ϕm et ϕs liquide (phase qui imprègne ou qui est greffée sur un solide). Il s'agit alors de chromatographie liquide-liquide (CLL).
c) la chromatographie d'échange d'ions (IEC) 9
La ϕs est un solide à la surface duquel se trouvent des groupements ionisés : échangeur d'ions. Un soluté ionisé de charge opposée se trouvera d'autant plus retenu que sa charge (opposée à celle de la ϕs ) sera plus forte. C’est la loi de COULOMB qui régit ces échanges de forte énergie (40 à 80 kJ.mole-1) :
d) la chromatographie d'exclusion ou perméation de gel, ou tamisage moléculaire
(SEC) où la ϕs (poreuse) se comporte comme un tamis et sépare les composés en fonction de leur taille. les molécules à séparer qui sont trop volumineuses pour pénétrer dans les pores sont exclues de la phase stationnaire et sont éluées les premières.
3-Classifications selon les procédés utilisés : - Selon le conditionnement de la phase stationnaire, on distinguera : a) la chromatographie sur colonne b) la chromatographie sur papier c)la chromatographie sur couche mince - Selon les modalités de migration de la phase mobile, on distinguera a’) la chromatographie par développement (les constituants de l'échantillon restent sur la ϕs) b’) la chromatographie d'élution (les substances sont entraînées hors de la ϕs
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