COPROCULTIVO Fundamento
La porción inferior del intestino tiene una flora bacteriana normal excesivamente amplia. Los microorganismos con mayor prevalencia son los anaerobios (Bacteroides, bacilos Gram positivos, Estreptococos), microorganismos entéricos gran negativos y Enterococcus fecalis. Cualquier intento por aislar bacterias patógenas de las heces implica la separación de las especies patógenas, usualmente a través del empleo de medios selectivos diferenciales y de cultivos enriquecidos. Las principales causas de trastornos gastrointestinales agudos incluyen a los virus, las toxinas (de: Estafilococos, Vibriones, Escherichia coli ), bacilos entéricos gran negativos invasores, los fermentadores lentos de la lactosa, la Shigella, la Salmonella y la Campilobacter. La importancia relativa de estos grupos tiene grandes discrepancias en las distintas partes del mundo. Las heces y los raspados rectales son los especímenes de que se dispone con mayor facilidad. Debe anotarse, en el examen macroscópico la presencia de sangre, moco o helmintos en la inspección inicial. Se suspenden los especímenes especímenes en un caldo selectivo como el Caldo de Tetrationato y se cultivan sobre medios ordinarios, así como en medios selectivos diferenciales, diferenciales, por ejemplo Agar EMB, Agar Agar McConkey, McConkey, Agar S-S, para para permitir la separación separación de los bacilos gran negativos que no fermentan la lactosa de otras bacterias entéricas comunes. Los frotis teñidos pueden revelar una prevalencia de leucocitos y de ciertos microorganismos anormales como Cándida o estafilococos, pero no pueden utilizarse para diferenciar las bacterias entéricas patógenas de las de la flora normal, por lo que deben realizarse otro tipo de pruebas para discriminar los tipos de bacterias presentes en la muestra como son las pruebas bioquímicas. Material
Agua destilada Gradilla Tubos de ensayo Asa de siembra desechable y normales Hisopo Papel de filtro Pipetas de vidrio Medios de cultivo Pinzas metálicas Alcohol Algodón graso Vaso de precipitado Mechero Bunsen Portaobjetos Cubreobjetos Microscopio Cubeta de tinción Pinzas de madera Frasco lavador
Reactivos:
Medios de cultivo para aislamiento:
Agar sangre Agar Mc Conkey Agar entérico Hektoen (HK)
Medios para pruebas bioquímicas:
Agar Christensen KIA
Colorantes para tinción de Gram: Lugol, cristal violeta, fucsina básica, alcohol Muestras:
Heces de adulto. Procedimiento
El procedimiento fue el siguiente: 1. Recogida de la muestra Preparación o indicaciones del paciente: Se debe seguir con el régimen habitual de comidas. A. Para niños/as Para bebés y niños pequeños que usan pañales: Se puede cubrir el pañal con un envoltorio plástico. Si se coloca correctamente el envoltorio plástico, separando las heces de la orina, se puede evitar que éstas se mezclen con el fin de obtener una muestra mejor. B. Para adultos Hay muchas maneras de recolectar las muestras. Se pueden recoger las heces con la ayuda de un envoltorio plástico que se coloca suelto sobre el inodoro y se sostiene en su lu gar con el asiento. Luego se coloca la muestra en un recipiente limpio. El equipo para recolección de la muestra trae una gasa especial que se usa para recogerla y luego se coloca la muestra en un recipiente limpio. 1.1.Condiciones para la toma de muestras Heces que no tengan más de media hora de obtenidas, o muestras tomadas directamente del recto con un hisopo de algodón. Cuando las siembras no se pueden efectuar de inmediato o la muestra demora en llegar al laboratorio, se aconseja emulsionar aproximadamente 1g de heces en 1º ml de un líquido conservador, o bien, depositar en éste el hisopo rectal.
Muestra de heces de 12 o 24 hrs. Se recogerán las heces en un frasco limpio con cierre hermético, no es necesaria la esterilidad. El análisis se hará en las 12 horas siguientes a la deposición, guardando la muestra en el frigorífico a 4-10º C. Si el análisis se pospone más de 24 horas se añadirá un volumen igual al de las heces de una solución acuosa al 5% de formol comercial. 1.2.Procesamiento de la muestra una vez llega al laboratorio.
Evitar contaminación por material no estéril. Uso de contenedores y medios de transporte apropiados. Etiquetar muestra adecuadamente. Temperatura de conservación: 4°C para evitar la proliferación bacteriana.
2. Examen macroscópico de la muestra Se comprueba su olor, consistencia, presencia de mucus, sangre, restos de alimentos sin digerir. 3. Examen y en fresco. Observación en el microscopio: lugol- fresco: En fresco: Colocamos una gota diluida en agua destila de la muestra en un portaobjetos y colocamos un cubre encima. Se realiza una dilución en un tubo de ensayo con una pequeña cantidad de heces recogida con la ayuda de un asa de siembra desechable y se le añade un poco de agua destilada, se agita un poco y se obtiene una gota de esta dilución. Dicha gota la colocamos en un portaobjetos y añadimos una gota de Lugol donde colocaremos un cubreobjetos encima para su posterior Observación al microscopio. Otro método de observación es realizando el mismo procedimiento, pero sustituyendo el Lugol por el negro sudan. Esta tinción está indicada para la observación de grasa. Prueba de parasitología: Este tipo de pruebas se realiza cuando se sospecha de la presencia en heces de parásitos. En nuestro caso, la prueba no es necesaria, ya que el paciente no presenta una sintomatología como diarrea aguda, gases intestinales excesivos, dolores cólicos, elevación de eosinófilos en sangre u otros síntomas. En el examen de parasitología se coloca un poco de muestra en el portaobjetos y se agrega una gota de Lugol. Con un bote de muestra colocar una gasa y añadir 50 ml de suero fisiológico para poder filtrar dicha muestra. Al liquido resultante del filtrado de le coloca en un tubo de centrifuga y se centrifuga 5 min. a 3000 r.p.m. se desecha el sobrenadante y obtenemos el sedimento que observaremos con una gota de Lugol añadida para poder observar mejor.
Realización de medios de cultivo y siembra
Siembra e inoculación de placas
Se procede a realizar la siembra, en estría múltiple, con la ayuda de un asa de siembra, tomando una pequeña cantidad de inóculo de las heces, previamente diluido en suero, teniendo en cuenta de trabajar en condiciones lo más asépticas posibles. Se tapa la placa y se mete en la estufa en un periodo de 24-48 horas. Examen morfológico del crecimiento de las colonias cultivadas macroscópicamente y al microscopio. Las características físicas de las colonias son de gran ayuda en la identificación. Cada microorganismo crece de manera diferente formando colonias de distinto color, forma, tamaño, textura, olor, brillo, etc. Existen colonias más o menos elevadas, con bordes enteros, estrellados, deflecados, y un largo etc. El tiempo de incubación necesario para que aparezcan las colonias también puede tener valor en la identificación. Las características de las colonias tampoco ofrecen un diagnóstico por si solas, pero dirigen los esfuerzos hacia un grupo más o menos amplio de microorganismos. Hay colonias muy características, casi exclusivas de determinadas bacterias. Es el caso de las especies de Proteus, que se extiende ampliamente por la placa formando un velo muy característico.
1. Examen microscópico Una vez transcurrido el tiempo necesario se procede a sacar el medio de cultivo, la placa de Petri y se obtiene una pequeña muestra con la ayuda del asa de siembra y se coloca en un porta previamente humedecido con una gota de agua destilada. Para poder fijar la muestra lo podremos realizar con calor, por lo que se pasa a realizarlo con el mechero y cuidando de no quemarnos lo haremos con la ayuda de una pinza de madera. A continuación, se procede a teñir la muestra. Tinción azul de metileno: El procedimiento es bastante sencillo. Primero se ha de fijar la muestra pasando el portaobjeto por el mechero varias veces. Luego se tiñe con el azul de metileno cubriéndola entera. Pasado 5 min. Se lava con agua destilada se deja secar y se procederá a observar en el microscopio con aceite de inmersión y en el objetivo de 100x. Esto nos permite comprobar la presencia o ausencia de leucocitos. Así:
Presencia de leucocitos: La infección ha cursado con inflamación intestinal. Se trata por tanto de microorganismos invasivos como Salmonella, Shigella. Ausencia de leucocitos: Significa que no ha habido inflamación por lo que la infección puede ser debida a virus (Rotavirus) o a bacterias productoras de toxinas (Vibrio cholerae).
Para realizar la tinción de Gram: Primero se realiza un frotis con la muestra en un portaobjetos.( Realizamos 3 frotis con tres colonias aisladas). Se fija la muestra en el mechero y se coloca después en la cubeta para proceder a teñirla. Se cubre la muestra con 1 minuto de cristal violeta, 1 min de Lugol, 30 seg y 1 min de fucsina básica, y se lava con agua destilada entre colorante y colorante además del alcohol y se deja secar. Esta tinción nos sirve para distinguir entre las bacterias Gram + y Gram – según sea la composición de su pared y apreciar visualmente su forma y organización. 2. Realización de pruebas bioquímicas
Prueba KIA: Sembramos en picadura dos tubos con el medio KIA e incubamos a 37ºC durante 18-24 horas. Observar. Con la prueba bioquímica del KIA hemos detectado la capacidad que tienen las enterobacteriáceas para metabolizar o no la glucosa y/o lactosa, producción de gas y de ácido sulfhídrico. B-GALACTOSIDASA: Nos indica si la bacteria en su metabolismo fermenta la lactosa. Esta prueba la realizaremos preparando una suspensión densa del microorganismo en un tubo donde añadiremos una gota de tolueno y mezclaremos para después añadir el disco de ONPG. Incubaremos a 37ºC y leemos antes de 24h el resultado. OXIDASA :Esta prueba nos indica si el microorganismo contiene la enzima citocromo oxidasa descartando que fuera un microorganismo anaerobio estricto pudiendo ser
aerobio o anaerobio facultativo. Se procede a impregnar una tira reactiva con una muestra de la colonia crecida en la placa de Agar Sangre y observar la reacción que produce cambiando de color. CATALASA: Para esta prueba se toma una colonia del microorganismo joven y se coloca sobre un portaobjetos donde añadiremos una gota de peróxido de hidrógeno observando si produce o no burbujas. UREASA: Esta prueba se realiza sembrando el microorganismo en medio Christensen en tubo inclinado por la superficie en zigzag. El resultado se observa después de una incubación a 37ºC con un cambio de color del indicador.
UROCULTIVO
El urocultivo es el cultivo de orina para diagnosticar infección sintomática del tracto urinario o infección asintomática (bacteriuria asintomática) en pacientes con riesgo de infección. Está basada en la presencia de un número significativo de bacterias (generalmente >100.000 bacterias/ml.) La piuria, junto con la bacteriuria, es un dato muy importante para el diagnóstico de infección del tracto urinario, ya que prácticamente está presente en todas las infecciones urinarias. Una excepción es la bacteriuria asintomática en la que la piuria puede estar ausente. Agentes etiológicos a investigar rutinariamente
Escherichia coli Klebsiella spp. Enterobacter spp. Serratia spp. Enterococus spp. Proteus spp. Pseudomonas spp. Acinetobacter spp. Candida spp. Staphylococus spp. Estreptococo grupo B (imprescindible en embarazadas)
Recogida de muestras
Para la recogida, transporte y manipulación de muestras podrán tenerse en cuenta los protocolos establecidos por la SEIMC. La correcta recogida y conservación de la orina para urocultivos es fundamental para que puedan obtenerse resultados fiables. Los puntos clave son: - Mujeres: Obtención de la orina después de separar los labios vaginales de manera que el chorro de orina no toque genitales externos. - Hombres: Retracción del prepucio de manera que el chorro de orina salga directamente.
Examen microscópico (recomendado)
El procedimiento elegido debe permitir:
Recuento de leucocitos al menos semicuantitativo Detección de células epiteliales (CE): su presencia indica muy probablemente contaminación de la muestra por contacto con genitales externos. Ante un resultado (urocultivo) positivo si se observa presencia de células epiteliales debe pedirse nueva muestra para confirmar.
Cultivo
Debe permitir el aislamiento y el recuento cuantitativo desde 1.000 ó 10.000 Unidades Formadoras de Colonias (UFC)/ml. de los uropatógenos más comunes: Se sembrará cuantitativamente, generalmente con asa calibrada de 1 ó 10 ml. en uno de los siguientes medios en placa:
Cled Agar cromogénico de orina o Agar sangre + agar MacConkey (Levine)
Incubar a 35-37° C en aerobiosis durante 24-48 horas. Lectura de cultivo en UFC/ml: - Menos de 1.000 ó 10.000 UFC, se informará: “Menos de 1.000 ó 10.000 UFC/ml”.
- De 10.000 a 100.000 UFC. - Un patógeno sin células epiteliales: informar microorganismo, número de colonias, antibiograma y valorar clínicamente - Dos patógenos: informar microorganismos, número de colonias y solicitar nueva muestra. - Más de dos patógenos: informar “Cultivo mixto, probable contaminación”. - > 100.000 ó más UFC: Uno o dos patógenos: informar identificación más antibiograma. Más de dos especies: informar “cultivo mixto, probable contaminación”.
Situaciones especiales
1. En embarazadas adicionar (sembrando con escobillón) medio de Granada o Agar sangre nalidíxico. El primero se incubará en anaerobiosis (o bajo un cubre) y el segundo en 5-7% CO2. Estreptococo grupo B en embarazadas, se informará en cualquier cantidad. 2. Orinas obtenidas por técnica invasiva (punción suprapúbica o por citoscopia): Sembrar siempre con asa calibrada o con pipeta estéril al menos 10 ml. Incluyendo una placa de agar sangre. Reincubar hasta 48 horas y tomar como significativo cualquier crecimiento a partir de 100 UFC /ml. La orina de punción suprapúbica es la muestra adecuada para investigación de Anaerobios o de mycoplasmas genitales. Si se considera procedente o se solicita por el clínico en una muestra adecuada estas muestras se trabajarán para detección de estos microorganismos y se informará el resultado. 3. En orinas obtenidas y conservadas con garantía de que se ha evitado la contaminación y en enfermos sintomáticos en que urocultivos previos no hayan ofrecido un número significativo de colonias se podrían estudiar microorganismos más exigentes y recuentos más bajos. Por ejemplo sembrando más cantidad de muestras (0,1 ml.) en agar sangre e incubando las placas 48 ó 72 horas. 4. Solicitud por el clínico de investigación de otros microorganismos. Si la muestra es correcta y la petición esta motivada se debe efectuar el procedimiento de trabajo adecuado a la solicitud. 5. Para el cultivo de se tendrá en cuenta lo establecido en el protocolo de la SEIMC de diagnóstico de Micobacterias. NO SE CULTIVARÁN NUNCA por no ser muestras adecuadas:
Catéteres de Foley. Orina de micción o de catéter para anaerobios. Orinas de más de 2 horas de su recogida sin conservación adecuada.
En caso de que no exista posibilidad de recibir las muestras de orina en el laboratorio con menos de dos horas desde el momento de la recogida y no se puedan refrigerar las muestras, se podrá optar entre uno de los siguientes procedimientos: a) Enviar la muestra con un conservante. b) Enviar la muestra ya sembrada por el sistema de laminocultivo o similar. En este último caso sería recomendable que el personal del centro de salud en el momento de la siembra introdujese una tira para detección de leucocitos/nitritos en la orina y anotase los datos correspondientes a los leucocitos en el vale de solicitud del cultivo. Método de despistaje automatizado: Los métodos automatizados de despistaje de infecciones urinarias tienen un excelente valor predictivo negativo por lo que si el número de muestras es elevado podrá ser un método alternativo a los métodos convencionales.
¿Qué es un medio de cultivo cromogénico? Un medio de cultivo cromogénico es un medio microbiológico adecuado para la incubación, diferenciación o selección de muchos microorganismos usando un sustrato cromogénico que da como resultado un color. Este color será característico de cada microorganismo siendo más fácil y precisa la diferenciación. ¿Cómo funciona un medio cromogénico? Los medios cromogénicos contienen nutrientes tales como peptonas, aminoácidos, extracto de levadura, minerales y vitaminas, además de inhibidores, gelificantes y sustrato cromogénico o cromógenos. Se ha comprobado que los sustratos cromogénicos son una herramienta potente en la identificación de microorganismos, debido a la detección de enzimas específicas producidas por los microorganismos en estudio. El principio de los medios cromogénicos son los sustratos cromogénicos como ONPG, X-Gal, o X-Glu junto con una selectividad específica del medio. Los microorganismos de estudio se caracterizan por tener sistemas de enzimas específicas que son responsables de la escisión del sustrato en el interior del cromógeno. Con el fin de separar el sustrato, la unión entre las dos partes del cromógeno se rompe por la enzima. De ese modo, los cromófobos son liberados y pueden ser detectados visualmente mediante la observación de un cambio de color en el medio. ¿Cuáles son sus ventajas? 1. Menor tiempo en dar resultado comparado con los métodos tradicionales tanto negativo como presunto positivo. Algunos medios confirman resultado en 24 horas. 2. Con solo medio se puede identificar más de un organismo. Si adquirimos cada medio específico para más de un organismo, el medio cromogénico es más barato. 3. La interpretación del resultado es visual sin la necesidad de habilidades especiales o de instrumentos. 4. Los medios cromogénicos eliminan la necesidad de análisis bioquímicos adicionales para la identificación del agente patógeno. 5. La virulencia de un determinado microorganismo se puede detectar simultáneamente con su diferenciación y selección. Las pruebas de coagulasa y fibrino-lisina también se puede llevar a cabo de forma simultánea en el medio. 6. Los medios cromogénicos se componen de nutrientes y hacen posible la supervivencia de los microorganismos dañados que están a punto de desaparecer.
