DETERMINACION DE PROTEINAS SEGUN LOWRY 1.
PRINCIPIO DEL METODO La cuantificación de la concentración de proteínas en la biomasa se realiza con el método colorimétrico de Lowry (Lowry et al., 1951) modificado por Peterson (1977). El principio del método se basa en que ciertos amonio ácidos como tirosina, triptófano y cisteína reaccionan en un medio-alcalino con ácido fosfotungsténico y ácido molíbdico del reactivo de Folin (color amarillo) para dar un complejo incoloro que se puede reducir mediante una reacción lenta con fenol en un complejo de coloración azul detectable por espectrofotometría entre 600 y 900 nm (con una absorbancia máxima a 740 nm). Esta coloración se refuerza por el acomplejamiento de sulfato de cobre con los enlaces peptídicos de las proteínas. La intensidad de la coloración obtenida depende del número y de la naturaleza de los residuos que constituyen la proteína presente en la muestra a analizar ya que a iguales concentraciones dos proteínas diferentes no desarrollan la misma intensidad de color. (Figura 1)
Figura 1. Esquema del proceso de obtención proteínas El método de Lowry (1951) es un método colorimétrico de valoración cuantitativa de las proteínas. A la muestra se añade un reactivo que forma un complejo coloreado con las proteínas, siendo la intensidad de color proporcional a la concentración de proteínas, según la Ley de Lambert-Beer.
Este método consta de dos etapas: 1) Los iones Cu2+, en medio alcalino, se unen a las proteínas formando complejos con los átomos de nitrógeno de los enlaces peptídicos. Estos complejos Cu2+-proteína tienen un color azul claro. Además, provocan el desdoblamiento de la estructura tridimensional de la proteína, exponiéndose los residuos fenólicos de tirosina que van a participar en la segunda etapa de la reacción. El Cu2+, se mantiene en solución alcalina en forma de su complejo con tartrato. 2) La reducción, también en medio básico, del reactivo de Folin-Ciocalteau, por los grupos fenólicos de los residuos de tirosina, presentes en la mayoría de las proteínas, actuando el cobre como catalizador. El principal constituyente del reactivo de Folin-Ciocalteau es el ácido fosfomolibdotúngstico, de color amarillo, que al ser reducido por los grupos fenólicos da lugar a un complejo de color azul intenso.
REACTIVOS A) (Solución A) Solución de Na2Co3 al 2% y tartrato de sodio y potacio al 0.02% en NaOH 0.1N. Na2Co3 (Carbonato de Sodio) 2g-------- 100mL 10g------- 500mL Tartrato de sodio y potacio 0.02g-----100mL 0.10g----- 500mL NaOH (Hidroxido de Sodio) 40g------ 1N 4.0----- 0.1N---- 1000mL 2.0g----------------- 500mL B) (Solución B) Solución de CuSO4 al 0.5% en agua destilada. CuSO4 (Sulfato de Cobre) 0.5g ------10mL 1.25-------250mL C) Solución cupro-alcalina, 50mL de la Solución A con 1mL de la Solución B. se prepara al momento de usarse D) Reactivo de folin-Ciocalteu diluido en una proporcion 1:1 en agua destilada E) Solucion estandar. Albumina bovina 0.3mg en 1mL de agua destilada CURVA ESTANDAR TUBO 0 1 2 3 4 5
ASB (µl) – [ ] --- ----50---0.015 100—0.03 150—0.045 200—0-06 250---0.075
H2O (µl) 250 200 150 100 50 ----
SOL. C (Ml) 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 *
*Mezclar e incubar 10min a T.A ** Mezclar e incubar 45 minutos aT.A
Leer a 550nm
SOL.D (µl) 100 100 100 100 100 100 **
Espectrofotometría: Los métodos espectrofotométricos se basan en la interacción materia-energía. La radiación EM interacciona con la materia produciendo algún efecto, se dice que materia absorbe energía. Se lleva la materia desde un estado fundamental a un estado excitado. Dependiendo de la cantidad de energía aplicada, la interacción ocurrirá a distintos niveles. Con ello se distinguen varios tipos de espectroscopia según sea el tipo de interacción con la REM:
Para el caso de la espectrofotometría UV-visible la interración ocurre a nivel de los e- de la capa de valencia existe un cambio en la distribución electrónica. Absorción UV-visble : Para que ocurra la absorción de una radiación UV-visible en moléculas orgánicas, se requiere que la energía absorbida corresponda al salto de un orbital poblado a uno desocupado. En el caso molecular, los niveles no son tan discretos por lo que existe una gamma de frecuencias posibles. Absorción y Emisión: Cuando se absorbe energía se pasa de un estado fundamental a un estado excitado. Este estado excitado vuelve a su estado basal luego de un cierto periodo de desfase, ocurriendo emisión de radiación (no siempre puede ocurrir, la energía se puede disiparse de otras formas). Este fenómeno da origen a otro tipo de espectroscopía como la espectroscopia de luminiscencia, fluorescencia.
Cada analito molecular tiene un máximo de absorción en la zona del UV-visible. Atendiendo a esta para cada sustancia y a la intensidad en que se absorbe la radiación se diseña un método para cuantificar la cantidad de sustancia .
La cubeta: Recipente de la muestra
Absorción de la Luz
Procedimiento experimental:
Una vez que se tiene la muestra, se obtiene una solución perfectamente disuelta y transparente que se coloca en la cubeta. En general se ocupan cubetas cuadradas de un cm de paso. Si la disolución es muy diluida, se ocupa una cubeta más ancha (mayor posibilidad de paso de luz y absorción). Se ocupan cubetas de cuarzo (no absorbe radiación visible ni UV) Los fenómenos ópticos (reflexión, dispersión) causan atenuación del haz que atraviesa la solución que se deben considerar en la medición. Para compensar estos efectos, se coloca una solución blanco que da cuenta de las perdidas anteriores. Esta se conoce como solución o cubeta de referencia.
Análisis Cuantitativo:
Para efectuar el análisis la radiación de la fuente luminosa debe ser monocrómatica . Se debe elegir máximo para obtener la máxima sensibilidad y minimizar los errores. El espectrofotómetro contiene un monocromador, que transforma la luz policromática en monocromática. Depende de la calidad de este, que tan buena es esta transformación.
Se debe establecer el rango de concentración donde la relación con la absorbancia es lineal. Depende de la absorbilidad de la sustancia. Solo debería usarse el rango lineal.
Existe un rango de absorbancia óptima para la medición (alrededor de 0.15-0.7). Esto debido a que en la zona de alta absorbancia se producen desviaciones como consecuencia de que la luz que logra pasar es casi nula y se confunde con el ruido de fondo. Este rango depende de la calidad del aparato, incluso hay algunos que llegan a valores de 3 en absorbancia, pero llevan implícito cierto error. Esto se conoce como desviaciones instrumentales.
También pueden ocurrir desviaciones químicas de la ley de Beer producto de que las especies que forman la muestra interactúan y se desvía de la linealidad. Esto ocurre a altas concentraciones. Para construir la curva de calibración se toman valores limite de concentración en los valores 0.15-0.7 de A y luego se toma un par de puntos más. Lo ideal es que la curva de calibración se construya en las mismas condiciones que la muestra (misma matriz). Cuando no procede esto, se puede eliminar el efecto de la matriz si se aplica el Método de Adición Estándar. Componentes de un Espectrofotómetro
1. 2. 3. 4.
Monocromador: Dispersa la luz y selecciona una longitud de onda Colimador: Selecciona de la franja de luz una determinada longitud de onda Detector: Transforma los fotones recibidos en una señal eléctrica. Fuentes radiante: Origen de luz (lamparas)
General mente se toman dos extremos: Blanco 100% de transmitancia Objeto opaco 0% de transmitancia Luego se toma el valor para la muestra.
Fuentes radiantes:
Lampara de Tungsteno no tiene una longitud de onda constante en su radiación, lo que obliga a calibrar el instrumento cada vez que se cambia la longitud de onda. Permite medir solo en el rango del espectro visible.
Lámpara de Deuterio También tiene intensidad variable en la longitud de onda lo que obliga a recalibrar el instrumento cada vez que se varia la longitud de onda. Sirve para medir en el rango UV.
