LC – MS/MS
Pendahuluan
Kromatografi cair merupakan dasar teknik pemisahan di Kromatografi bidang sains dan terkait dengan kimia. Kromat Kromatografi ografi cair dapat dengan aman memisahkan senya senyawa wa organik dengan rentang yang sangat sangat luas yaitu mulai dari metabolit obat dengan molekul kecil sampai peptida dan protein.
Detektor umum dari kromatogr kromatografi afi cair termasuk indeks refraksi, refrak si, elektrokimia, fluoresensi, dan ultraviolet-visible (UVVis). Beberapa dari detector tersebut memberikan data dua dimensi yaitu data yang menunjukkan me nunjukkan kekuatan kekuatan signal sebagai fungsi atas waktu
Pendahuluan
Kromatografi cair merupakan dasar teknik pemisahan di Kromatografi bidang sains dan terkait dengan kimia. Kromat Kromatografi ografi cair dapat dengan aman memisahkan senya senyawa wa organik dengan rentang yang sangat sangat luas yaitu mulai dari metabolit obat dengan molekul kecil sampai peptida dan protein.
Detektor umum dari kromatogr kromatografi afi cair termasuk indeks refraksi, refrak si, elektrokimia, fluoresensi, dan ultraviolet-visible (UVVis). Beberapa dari detector tersebut memberikan data dua dimensi yaitu data yang menunjukkan me nunjukkan kekuatan kekuatan signal sebagai fungsi atas waktu
Pendahuluan
Detektorfluorosensi dan diode-array UV-Vis menghasilkan Detektorfluorosensi data tiga dimensi yaitu tidak hanya kekuatan kekuatan signal namun data spectra dari masingmasing poin waktu.
Mass spectrometers juga menghasilkan data tiga dimensi. Selain kekuatan kekuatan signal juga menghasilkan data massa spektral yang dapat memberikan informasi berharga tentang struktur, berat molekul, identifikasi, jumlah, dan kemurnian sampel.
Pendahuluan Data spektral massa menambahkan spesifitas yang
meningkatkan kepercayaan dalam hasil dari analisis baik kualitatif dan kuantitatif. Untuk sebagian besar senyawa yang di analisis dengan spektrometer massa jauh lebih sensitif dan lebih spesifik daripada semua LC detektor lainnya. Hal ini dapat menganalisis senyawa yang tidak memiliki kromofor yang cocok. Hal ini juga dapat mengidentifikasi komponen dalam kromatografi dengan peak yang belum terselesaikan, mengurangi kebutuhan untuk kromatografi yang sempurna.
LC – MS/MS
Liquid Chromatography – Mass Spectroscopy adalah 2 alat yang digabungkan menjadi 1 , dimana berfungsi untuk memisahkan beberapa senyawa atau campuran senyawa berdasarkan polaritasnya ( prinsip kerja kromatografi), dimana setelah campuran senyawa tersebut terpisah, maka senyawa yang murni tersebut akan diidentifikasi berat molekulnya.
Liquid Chromatography – tandem Mass Spectrometry (LC – MS/MS) merupakan satu satunya teknik kromatografi cair dengan detektor spektrometer massa. Penggunaan LC – MS/MS untuk penelitian bioanalisis dimulai pada akhir 1980-an
Kelebihan Teknologi LC – MS/MS
Spesifitas. Hasil analisis yang khas dan spesifik diperoleh dari penggunaan spektrometer massa sebagai detektor.
Aplikasi yang luas, dengan sistem yang praktis. Berbeda dengan GC-MS sebagai spektrometer massa klasik, penerapan LC – MS/MS tidak terbatas untuk molekul volatil. Mampu mengukur analit yang sangat polar, selain itu persiapan sampel cukup sederhana tanpa adanya teknik derivatisasi.
Fleksibilitas. Pengujian yang berbeda dapat dikembangkan dengan tingkat fleksibilitas yang tinggi dan waktu yang singkat.
Kaya Informasi. Sejumlah data kuantitatif maupun kualitatif dapat diperoleh. Hal ini disebabkan seleksi ion yang sangat cepat dengan banyak parameter.
Instrument LC – MS/MS
Sejarah •
•
Pada tahu 1886, Eugen Glodskin mengamati sinar dalam gas tidak bermuatan pada tekanan rendah yang berpindah dari anoda dan melalui chanels dalam lubang katoda, berlawanan dengan arah muatan megatif sinar katoda. Goldstream menyebutnya dengan muatan positif sinar anoda. Wilhem wien menemukan bahwa medan listrik dan medan magnet yang kuat dapat membelokkan sinar canal. Pada tahun 1899, dibuatlah peralatan medan magnet dan medan listrik parallel yang dapat memisahkan sinar positif berdasarkan perbandingan muatan massa.
Sejarah •
•
•
Beberapa teknik modern dari mass-spectroscopy di teliti oleh Arthur Jeffrey Dempster dan F.W Aston pada tahun 1918 dan 1919. Pada awal 1940, Mass Spectroscopy pertama dirancang untuk penentuan komponen dalam campuran hidrokarbon kompleks dalam industri minyak, kemudian berkembang untuk penggunaan berbagai senyawa organic yang dihasilkan oleh industri kimia Pertengahan 1950. dirancang untuk penentuan unsur secara kualitatif dan kuantitatif bedasar mass to charge ratio (m/z) ion ion yang dihasilkan. Hal ini dimanfaatkan baik oleh industri elektronika maupun nuklir. Keduanya berdasar pada material yang sensitive untuk race kontaminan
Sejarah •
•
•
Awal 1960, Mass Spectroscopy digunakan untuk identifikasi dan analisis struktur molekul yang kompleks. Basisnya adalah pola fragmen ion masing masing dengan massa berbeda, yang terbentuk saat molekul besar terionisasi. Tahun 1989 nobel dalam bidang kimia diperoleh John Bennet Fenn untuk pengembangan electrospray ionization (ESI) Perkembangan terakhir, spektrometri massa digunakan secara luas sebagai detektor untuk kromatografi gas maupun cair
Mass Spectroscopy
Spektroskopi massa adalah cara analisis senyawa kimia dengan memecahkan molekulnya menjadi ion ion besar maupun kecil, dan dari pola pola ionisasi ini nantinya akan di didapat informasi mengenai molekul utuhnya.
Molekul yang masuk ke dalam spektrometer massa harus senyawa murni, bukan campuran, karena itu beberapa langkah pemisahan kimia sudah harus selesai dilakukan
Spektroskopi massa sering digabung dengan kromatografi, karena sampai saat ini pemisahan senyawa kimia dengan kromatografi sudah cukup sempurna sehingga analisis senyawa senyawa yang terpisah ini dapat dilakukan langsung.
Mass Spectroscopy
Spektroskopi massa memberikan informasi berdasarkan perbandingan massa/muatan (m/z). Sampel senyawa kimia yang dianalisis dalam jumlah relatif sangat kecil, yakni µg.
Senyawa kimia akan diubah fasa nya menjadi gas dan di pecah pecah menjadi ion ion dengan massa relative yang lebih rendah.
Pemecahan senyawa2 kimia ini dilakukan dengan menembak senyawa senyawa kimia tersebut dengan electron berenergi tinggi (sedikitnya 70eV setara dengan 1610kkal/mol atau 6720kJ/mol), ion ion ini akan bergerak dalam medan listrik dan medan magnet dengan kecepatan sesuai dengan massanya sebelum mencapai detektor, dari pola pola pecahan ion, struktur senyawa sampel dapat diprediksi
Instrument MS terbagi menjadi 3 bagian
Ion Souce mengubah molekul sampel dari fase gas menjadi ion ion
Mass Analyzer memilih ion ion berdasar massanya menggunakan medan elektromagnetik
Detektor Processing Ion signal mjd Mass Spectrum
LC – MS/MS
Spektrometer massa bekerja dengan molekul pengion yang kemudian akan memilah dan mengidentifikasi ion menurut massa, sesuai rasio fragmentasi mereka.
2 komponen kunci dalam proses ini adalah sumber ion (ion source) yang akan menghasilkan ion dan analisis massa (mass analyzer) yang menseleksi ion
Sistem LC – MS/MS umumnya menggunakan beberapa jenis ion source dan mass analyzer yang dapat disesuaikan dengan kepolaran senyawa yang akan di analisa.
Masing2 ion source dan mass analyzer memiliki kelebihan dan kekurangan sehingga harus disesuaikan dengan enis informasi yang dibutuhkan.
Prosedur Umum Mass- Spectroscopy
•
•
•
Sampel dimasukkan ke dalam instrument MS dan mengalami penguapan Komponen dari sampel diionisasi (dengan berbagai metode), sehingga menghasilkan partikel bermuatan (ion) Ion dipisahkan berdasarkan rasio massa/muatan (m/z) dalam analyzer oleh medan elektromagnetik
•
Ion ion di deteksi
•
Sinyal ion diproses menjadi spektra massa
Sumber Ion (Ion Source)
Selama beberapa tahun terakhir, banyak kemajuan pada LC – MS/MS dalam pengembangan sumber ion dan teknik untuk mengionisasi dan memisahkan ion molekul analit dari fase geraknya
Sebelumnya LC – MS/MS menggunakan sistem antarmuka yang kurang baik dalam memisahkan molekul fase gerak dari molekul analit. Molekul2 analit yang terionisasi dalam spektrometer massa berada dalam kondisi vakum, peristiwa semacam ini sering terjadi pada ionisasi elektron tradisional. Teknik ini hanya berhasil untuk jumlah senyawa yang sangat terbatas.
Sumber Ion (Ion Source)
Pengenalan teknik ionisasi tekanan atmosfer (atmospheric pressure ionization/API) sangat memperluas jumlah senyawa yang dapat dianalisis dengan LC –MS/MS. Pada teknik ionisasi tekanan atmosfer, molekul analit terionisasi terlebih dahulu pada tekanan atmosfer. Ion ion analit tersebut kemudian secara mekanis dan elektrostatis terpisah dari inti molekul.
Teknik ionisasi tekanan atmosfer antara lain : 1. ionisasi elektrospray (electrospray ionization/ESI) 2. ionisasi kimia tekanan atmosfer (APCI) 3. photoionisasi tekanan atmosfer (APPI)
Dalam setiap pengukuran, sifat analit dan kondisi pemisahan memiliki pengaruh kuat untuk memberikan hasil terbaik dalam teknik ionisasi pada elektrospray, APCI maupun APPI. Teknik yang paling efektif tidak selalu mudah untuk diprediksi
Aplikasi dari berbagai teknik ionisasi LC – MS/MS
1. Ionisasi Elektrospray / ESI Ionisasi elektrospray bergantung pada pelarut yang digunakan untuk memungkinkan analit mampu mengion dengan baik sebelum mencapai spektrometer massa. Eluen LC disemprotkan bersamaan dengan gas nebulizer ke dalam bidang elektrostatik pada tekanan atmosfer yang akan menyebabkan disosiasi lebih lanjut molekul analit.
Ionisasi Elektrospray / ESI
Pada saat yang bersamaan gas yang dipanaskan menyebabkan menguapnya pelarut sehingga tetesan analit menyusut, konsentrasi muatan dalam tetesan meningkat. Keadaan akan memaksa ion untuk bermuatan melebihi kekuatan kohesif atau ion dikeluarkan ke dalam fase gas. Ion ion yang tertarik akan melewati pipa kapiler pengambilan sampel yang selanjutnya akan diteruskan ke dalam analisis massa.
Elektrospray sangat berguna untuk menganalisis molekul besar seperti protein, peptida, dan oligonukleotida, namun dapat juga menganalisis molekul kecil seperti benzodiazepin.
2. Ionisasi Kimia Tekanan Atmosfer / APCI Dalam APCI, eluen LC disemprotkan melalui sebuah pemanas (umumnya bersuhu 250˚C – 400˚C ). Proses berlangsung pada tekanan atmosfer. Udara panas akan menguapkan cairan. Fase gas pelarut yang dihasilkan akan terionisasi oleh elektron dari jarum korona. Ion ion pelarut kemudian mntransfer muatan pada molekul analit melalui reaksi kimia (ionisasi kimia). Ion ion analit mlewati pipa kapiler pengambilan sampel yang dilanjutkan ke dalam analisis massa.
Ionisasi Kimia Tekanan Atmosfer / APCI
APCI berlaku untuk berbagai kutub dan molekul nonpolar. Karena melibatkan suhu tinggi, APCI kurang cocok dibandingkan dengan elektrospray untuk analisis biomolekul besar yang mungkin secara termal tidak stabil.
APCI lebih sering digunakan pada kromatografi fase normal dibandingkan dengan sumber ion elektrospray karena analit yang biasanya nonpolar.
3. Photoionisasi Tekanan Atmosfer / APPI APPI untuk LC – MS/MS merupakan teknik yang relatif baru. Penguap mengubah eluen LC menjadi fase gas. Sebuah lampu bermuatan menghasilkan foton dalam kisaran energi ionisasi yang kecil. Kisaran energi yang dipilih ialah energi yang mampu mengionisasi molekul analit sebanyak dan mampu mungkin meminimalkan ionisasi molekul pelarut. Ion ion yang dihasilkan akan melewati pipa kapiler pengambilan sampel ke dalam analisis massa.
Photoionisasi Tekanan Atmosfer / APPI Hampir semua senyawa yang biasa di analisis oleh APCI dapat dianalisis pula dengan APPI. Hal ini menunjukkan kemiripan di dalam dua aplikasi, yakni menganalisis senyawa yang sangat nonpolar dengan laju alir yang rendah ( < 100ml/menit) dimana senditifitas APCI terkadang berkurang
Analisis Massa (Mass Analyzer) Meskipun dalam teori semua jenis analisis massa dapat digunakan untuk LC – MS/MS, namun kenyataannya, ada 4 jenis analisis massa yang paling sering digunakan : 1. Quadrupole 2. Time of Flight 3. Perangkap Ion 4. Fourier Transform – Ion Cyclotron Resonance (FT – ICR) Masing masing memiliki kelebihan dan kekurangan tergantung pada persyaratan dari analisis yang akan digunakan
1. Quadruplo Sebuah analisis massa quadruplo terdir dari empat batang paralel diatur dalam persegi. Ion analit diarahkan ke bagian tengah persegi. Tegangan yang dialirkan pada batang menghasilkan bidang elektromagnetik. Bidang ini menentukan rasio massa ? Yang dapat melewati filter pada waktu tertentu. Quadruplo cenderung merupakan analisis massa yang paling sederhana dan paling murah.
Quadruplo Analisis Massa Quadruplo dapat ber operasi dengan 2 mode : 1. Memindai (scan) modus 2. Pemantauan ion terpilih ( selected ion monitoring/SIM) modus Dalam mode scan, analisis massa memantau berbagai rasio ? / ? . Dalam modus SIM, analisa massa hanya memantau beberapa rasio ? / ? . Modus SIM jauh lebih sensitif dibandingkan modus memindai tetapi memberikan informasi tentang fragmentasi ion yang lebih sedikit. Modus pindai biasanya digunakan untuk kuantisasi dan pemantauan senyawa target.
2. Time of Flight Pada analisis massa time of flight (TOF), Sebuah gaya elektromagnetik yang seragam diterapkan untuk semua ion pada waktu yang sama. Hal ini menyebabkan ion akan dipercepat menyusuri tabung penerbangan. Ion yang lebih ringan berjalan lebih cepat dan tiba pada detektor paling awal, sehingga rasio fragmentasi ? /? Ditentukan oleh waktu kedatangan mereka. Analisis massa ( TOF) memiliki kisaran massa yang luas dan sangat akurat pada pengukuran massa suatu senyawa.
3. Perangkap Ion Analisis massa perangkap ion massa terdiri dari elektroda melingkar cincin dua penutup di kdua ujungnya yang bersama sama membentuk sebuah ruang. Ion memasuki ruang dan terjebak oleh medan elektromagnetik. Bidang lain digunakan untuk mengeluarkan dengan selektif dari dalam perangkap. Perangkap ion memiliki kelebihan dapat melakukan beberapa tahapan pengukuran spektrometer massa tanpa analisis massa tambahan
4. Fourier transform-ion cyclotron resonance (FT-ICR) Analisis massa FT-ICR merupakan jenis lain dari analisis massa perangkap ion. Ion memasuki ruangan dan terjebak dalam lingkaran orbit oleh medan listrik dan medan magnet yang kuat. Ketika terjadi eksitasi oleh frekuensi radio (RF) pada medan listrik, ion menghasilkan arus yang bergantung pada waktu. Arus ini dikonversi oleh fourier menjadi frekuensi orbital dari ion yang sesuai dengan rasio muatan massa senyawa. Seperti perangkap ion, analisis massa FT-ICR dapat melakukan beberapa tahapan spektrometri massa tanpa analisis massa tambahan. FT-ICR juga memiliki rentang massa yang lebar dan resolusi massa yang sangat baik. FT-ICR merupakan analisis massa termahal diantara yang lain
Collision Induced Disosiasi/ CID
Teknik ionisasi tekanan atmosfer yang di bahas umumnya menghasilkan : 1. Molecular ions M+ or M– 2. Protonated molecules [M + H]+ 3. Simple adduct ions [M + Na]+ 4. Ions representing simple losses such as the loss of a water [M + H – H2O]+
Berat molekul yang di hasilkan memberikan informasi sangat berharga, tapi pelengkap informasi struktural sering dibutuhkan.
Cont’d
Dalam memperoleh informasi struktural, ion analit terfragmentasi karena molekul bertabrakan dengan netral yang dikenal sebagai disosiasi tabrakan induksi ( collision induced disosiasi/ CID) atau disosiasi tabrakan diaktifkan (collisionally activated dissociation/ CAD).
Tegangan diberikan kepada ion ion analit untuk menambah energi agar mampu melakukan tabrakan sehingga menciptakan fragmentasi lagi.
CID Pada Satu Tahap MS
CID yang paling sering dihubungkan dengan dua tahap spektrometer massa dimana terjadi pada setiap tahap penyaringan MS, tapi CID juga dapat dicapai dalam satu tahap spektrometer massa quadrupole atau TOF
Pada satu tahap spektrometer massa, CID terjadi dalam sumber ion dan dengan demikian kadang kadang disebut sumber CD ATAU in-source CID.
Analit (prekursor) ion yang dipercepat dan bertabrakan dengan molekul netral sisa untuk menghasilkan fragmen disebut ion produk
Cont’d
Keuntungan melakukan CID di satu tahap instrumen adalah kesederhanaan mereka dan biaya yang relatif rendah
Kelemahannya adalah semua ion akan terfragmentasi. Dalam proses ini tidak ada kesempatan untuk memilih ion prekursor secara spesifik sehingga tidak ada cara yang pasti untuk menentukan ion produk yang berasal dari ion prekursor
Spektrum yang dihasilkan mungkin termasuk puncak massa dari ion atau senyawa pengotor dan senyawa analit yang diinginkan.
Proses ini mungkin dapat diterima ketika menganalisis sampel yang relatif murni, tapi tidak memberikan hasil yang baik jika puncak kromatografi tidak memiliki intensitas yang baik
CID Pada Dua Tahap MS
Beberapa tahap MS atau disebut juga tandem MS, atau MS/MS adalah cara yang ampuh untuk mendapatkan informasi struktural
Dalam triple quadrupole, quadrupole pertama digunakan untuk memilih prekursor ion
CID mengambil tempat di tahap kedua dimana terjadi proses tabrakan
Pada tahap ketiga akan menghasilkan spektrum produk ion, pada proses ini terjadi seleksi ion dimana hanya ion produk yang memenuhi kuantitas dan kualitas senyawa target yang akan ditampilkan dalam spektrum
Cont’d
Pada awal kemunculan sistem LC-MS/MS banyak keterbatasan pada masalah dasar seperti jumlah eluen LC sehingga spektrometer massa dapat menerima dengan baik. Perubahan metode LC sangat diperlukan untuk menyesuaikan dengan detektor MS
Detektor
Unsur terakhir pada spektrometer massa adalah detektor
Detektor menghitung muatan yang terinduksi atau arus yang dihasilkan ketika ion dilewatkan atau mengenai suatu permukaan.
Dalam instrumen scanning, sinyal dihasilkan dalam detektor selama scanning, dimana scanning massa dan ion dihitung sebagai m/z.
Menurut tipenya, beberapa tipe elektron multiplier digunakan, seperti faraday cups dan detektor ion ke photon
Karena jumlah ion yang meninggalkan mass analyzer cukup kecil, maka sering digunakan Microchannels plate detector, detektor ini terdiri dari sepasang logam pada permukaan dengan mass analyzer atau daerah pemerangkap ion.
Hasil akhir dari spektrum massa berupa rangkaian puncak. Puncak pada ratio m/z yang sesuai untuk masing masing ion
LC – MS/MS •
•
•
Sistem modern LC-MS/MS lebih fleksibel. Spektrometer massa dapat menerima kecepatan alir eluen hingga 2ml/menit. Dengan sedikit modifikasi, instrumen yang sama juga dapat memberikan hasil yang baik pada aliran mikroliter dan nanoliter Sumber ion dengan ortogonal (off-axis) nebulizer lebih toleran dari nonvolatile buffer dan hanya memerlukan sedikit penyesuaian pada perbedaan komposisi pelarut dan kecepatan alir
