INSTITUTO TECNOLÓGICO DE MÉRIDA División de Estudios de Postgrado e Investigación
Cuarto Informe Condiciones para la producción de etanol carburante a partir de los desechos sólidos de la sábila sacarificados Alumna: Br. Lilia Pérez Oyosa No. de Beca 032007 105 A Director: M. en C. Gerardo Rivera Muñoz
Octubre de 2008
INTRODUCCIÓN: El cultivo de la sábila en el estado de Yucatán cobró importancia recientemente como una alternativa para la diversificación de la zona henequera, ya que se adapta perfectamente a las condiciones de suelo que predominan en ella. Además de que su costo de producción es muy bajo y tiene una fuerte demanda en el mercado internacional. Sin embargo en los últimos años se han presentado serios problemas de comercialización local, primero por la dependencia de un solo comprador y después por el cierre de la industria que acopiaba la producción de hojas de sábila. La carencia de industrias o de opciones de locales de comercialización ha repercutido en el abandono de las plantaciones y en el quebranto de una importante alternativa productiva para la zona henequenera del estado. Aunado a todo esto el procesamiento de la sábila ha estado circunscrito a la producción de gel 1:1 cuya obtención es sumamente sencilla y de baja inversión o como gel concentrado 1:20 y 1:40 y el gel liofilizado (1:200) sin embargo participar en el mercado de estas tres últimas opciones requiere de una fuerte inversión, calculada en un millón de dólares en el año 2002. Otra alternativa es la diversificación de las opciones de industrialización de las hojas de sábila, para ello es necesario ampliar la gama de productos susceptibles de ser obtenidos de las hojas de sábila, con la idea de encontrar e ncontrar alternativas de alta demanda y valor agregado atractivo. En este proyecto se plantea la posibilidad de obtener etanol como un producto paralelo al gel de sábila, usando los subproductos y desechos que se generan durante el proceso de obtención del mismo. Nuestro grupo de trabajo ha venido colaborando con varias asociaciones de productores de sábila del estado de Yucatán y pretende aportar nuevas opciones para la industrialización de la sábila a través del establecimiento de las bases para una eventual utilización de los desechos sólidos de la sábila, en la producción de azúcares fermentables y la conversión de los mismos en etanol para su uso como combustible. ANTECEDENTES: Los desechos sólidos de la sábila están compuestos por polisacáridos como la celulosa, pectina y hemicelulosas, Figura 1, cuyos monómeros son azúcares. Por ello es factible pensar en la posibilidad sacarificarlos por vía química, Tabla I. O por vía enzimática, Tabla II, para producir hidrolizados ricos en azúcares fermentables. Mismos que pueden ser usados en la producción de etanol, mediante una fermentación alcohólica, Tabla III. Sin embargo no se encontraron reportes en los que esta opción sea analizada. Cabe destacar que la producción de etanol a partir de subproductos y desechos agroindustriales ya ha sido valorada, Tabla III. En este sentido destacan los estudios realizados en Colombia en los que se produjo etanol a partir de la cáscara de plátano y almidón de yuca (Monsalve 2006). Los realizados por el grupo de Saha (2006) en los que se usó paja de trigo para la producción de etanol previa sacarificación enzimática. El grupo de Kemppainen (2005) usó desechos de madera de álamo y papel periódico para producir azúcares fermentables que posteriormente usaron para la producción de etanol. Wingren en suiza ha realizado estudios en torno a la producción de etanol usando maderas suaves pretratadas con vapor y ha hecho la evaluación económica (Wingreem, 2004); el mismo grupo evaluó el efecto del lavado de las maderas tratadas, sobre el rendimiento de etanol
INTRODUCCIÓN: El cultivo de la sábila en el estado de Yucatán cobró importancia recientemente como una alternativa para la diversificación de la zona henequera, ya que se adapta perfectamente a las condiciones de suelo que predominan en ella. Además de que su costo de producción es muy bajo y tiene una fuerte demanda en el mercado internacional. Sin embargo en los últimos años se han presentado serios problemas de comercialización local, primero por la dependencia de un solo comprador y después por el cierre de la industria que acopiaba la producción de hojas de sábila. La carencia de industrias o de opciones de locales de comercialización ha repercutido en el abandono de las plantaciones y en el quebranto de una importante alternativa productiva para la zona henequenera del estado. Aunado a todo esto el procesamiento de la sábila ha estado circunscrito a la producción de gel 1:1 cuya obtención es sumamente sencilla y de baja inversión o como gel concentrado 1:20 y 1:40 y el gel liofilizado (1:200) sin embargo participar en el mercado de estas tres últimas opciones requiere de una fuerte inversión, calculada en un millón de dólares en el año 2002. Otra alternativa es la diversificación de las opciones de industrialización de las hojas de sábila, para ello es necesario ampliar la gama de productos susceptibles de ser obtenidos de las hojas de sábila, con la idea de encontrar e ncontrar alternativas de alta demanda y valor agregado atractivo. En este proyecto se plantea la posibilidad de obtener etanol como un producto paralelo al gel de sábila, usando los subproductos y desechos que se generan durante el proceso de obtención del mismo. Nuestro grupo de trabajo ha venido colaborando con varias asociaciones de productores de sábila del estado de Yucatán y pretende aportar nuevas opciones para la industrialización de la sábila a través del establecimiento de las bases para una eventual utilización de los desechos sólidos de la sábila, en la producción de azúcares fermentables y la conversión de los mismos en etanol para su uso como combustible. ANTECEDENTES: Los desechos sólidos de la sábila están compuestos por polisacáridos como la celulosa, pectina y hemicelulosas, Figura 1, cuyos monómeros son azúcares. Por ello es factible pensar en la posibilidad sacarificarlos por vía química, Tabla I. O por vía enzimática, Tabla II, para producir hidrolizados ricos en azúcares fermentables. Mismos que pueden ser usados en la producción de etanol, mediante una fermentación alcohólica, Tabla III. Sin embargo no se encontraron reportes en los que esta opción sea analizada. Cabe destacar que la producción de etanol a partir de subproductos y desechos agroindustriales ya ha sido valorada, Tabla III. En este sentido destacan los estudios realizados en Colombia en los que se produjo etanol a partir de la cáscara de plátano y almidón de yuca (Monsalve 2006). Los realizados por el grupo de Saha (2006) en los que se usó paja de trigo para la producción de etanol previa sacarificación enzimática. El grupo de Kemppainen (2005) usó desechos de madera de álamo y papel periódico para producir azúcares fermentables que posteriormente usaron para la producción de etanol. Wingren en suiza ha realizado estudios en torno a la producción de etanol usando maderas suaves pretratadas con vapor y ha hecho la evaluación económica (Wingreem, 2004); el mismo grupo evaluó el efecto del lavado de las maderas tratadas, sobre el rendimiento de etanol
Söderström (2004). Belkacemi en la Universidad Laval en Canadá ha trabajado en la producción de etanol a partir de desechos agrícolas fraccionados con vapor de agua, (Belkacemi 1997; Belkacemi 2002). Taylor y colaboradores (2000) desarrollaron un proceso para la producción fermentativa de etanol carburante. Doran en 1993 desarrolló un proceso para la producción de etanol usando celulosa cristalina como sustrato de fermentación y como microorganismo productor Klepsiella oxytoca conteniendo los genes de Zymomonas mobilis. Es evidente que existe interés a nivel mundial en usar productos, subproductos y desechos agrícolas, diferentes del almidón de maíz o de la azúcar de caña en la producción de etanol. En este sentido el uso de los residuos agrícolas generados en la Península de Yucatán y en especial los generados en el estado de Yucatán por la industria sabilera adquieren singular importancia.
Aloe barbadensis
Agua 99.5%
Sólidos 0.1%
Moléculas de alto peso molecular 0.1 Polisacáridos: Quinonas Azúcares reductores Proteínas Polisacáridos de varios tipos químicos
Moléculas de bajo peso molecular 0.4% Cationes + ++ + ++ K Ca Na Mg Aniones Cl Lactato Oxalato Azúcares Glucosa Manosa Sales Grasas Aminoácidos Polisacáridos: mananos, dextranas ramificadas y pectinas
Figura 1) Composición de la sábila
TABLA I SISTEMAS DE SACARIFI CACIÓN QUÍMI CA DE DESECHOS AGROIN DUSTRIA LES Desechos usados Residuos forestales de Eucalipto Cascarilla de cebada Cáscara de banano Almidón de yuca
PRI MER ETAPA Reactivo Concentración usado H2SO4 72 %
H2SO4 diluido H2SO4 diluido H2SO4
Temperatura 30º C
Tiempo reacción 60 min
1%
Relación Sustrato/ Químico 300mg muestra/3.0 ml H2SO4 500g muestra/5000ml H2SO4 100g muestra/50ml H2SO4 40-50 ml/500g muestra
5% 20 %
SEGUNDA ETAPA Dilución Temperatura de final hidrólisis 3.0% 125ºC en autoclave
90 g/l
REFERENCIA Tiempo de hidrólisis 60 min
Canettieri, 2007
80 a 180º C
0 a 330 min
Aguilar, 2004
125º C en autoclave
15 min
Baño María a 94º C, 395 rpm
6 hrs
Monsalve, 2006 Monsalve, 2006
TABLA II SISTEMAS DE SACARI FI CACIÓN ENZIMÁ TI CA DE DESECHOS AGROI NDUSTRI ALES
Rastrojo de maíz Cáscara de almendra
PRETRATAMI ENTO Reactivo Concentración usado Solución 0-4.3 % acuosa de H2O2 ajustada a pH 11.5 con NaOH H2SO4 1.4 % diluído H2SO4 2.2 g acido/kg diluído mezcla
Madera de pino
H2SO4 diluído
0.0- 4.5 g acido/ kg de mezcla
176 a 231º C
Rastrojo de maíz
H2SO4 diluído
0.03-0.06 g acido/ g biomasa
180 a 200º C
Desechos usados Paja de Trigo
Condiciones de reacción 25 a 35 º C, 250 rpm
Tiempo reacción 3 a 24 horas
Relación Sustrato/ Químico 8.6% w/v
190º C
8 min
180 a 215º C
0.9-1.1 min
14% w/v
1.0-5.5 min
7% w/w
1 min
25-35% w/w
HIDRÓLI SIS ENZIMÁTICA Enzima usada Condiciones de reacción CMCasa 45º C, 100 Β-glucosidasa rpm, pH 5.0 Xilanasa B-Xilosidasa L-Arabinofuranosidasa CPN celulasa 45º C, 130 rpm, pH 4.8 Complejo 50º C, 200 Celulasa de rpm, pH 4.8
REFERENCIA Tiempo de hidrólisis 72 a 120 hrs
Saha, 2006
168 hrs
Kadam, 2004
48 hrs
Martinez, 1997
48 hrs
Martinez, 1997
Aspergillus niger
Complejo Celulasa
de
Aspergillus niger
50º C, 200 rpm, pH 4.8
TABLA II SISTEMAS DE SACARI FI CACIÓN ENZIMÁ TI CA DE DESECHOS AGROI NDUSTRI ALES
Rastrojo de maíz Cáscara de almendra
PRETRATAMI ENTO Reactivo Concentración usado Solución 0-4.3 % acuosa de H2O2 ajustada a pH 11.5 con NaOH H2SO4 1.4 % diluído H2SO4 2.2 g acido/kg diluído mezcla
Madera de pino
H2SO4 diluído
0.0- 4.5 g acido/ kg de mezcla
176 a 231º C
Rastrojo de maíz
H2SO4 diluído
0.03-0.06 g acido/ g biomasa
180 a 200º C
Desechos usados Paja de Trigo
Condiciones de reacción 25 a 35 º C, 250 rpm
Tiempo reacción 3 a 24 horas
Relación Sustrato/ Químico 8.6% w/v
190º C
8 min
180 a 215º C
0.9-1.1 min
14% w/v
1.0-5.5 min
7% w/w
1 min
25-35% w/w
HIDRÓLI SIS ENZIMÁTICA Enzima usada Condiciones de reacción CMCasa 45º C, 100 Β-glucosidasa rpm, pH 5.0 Xilanasa B-Xilosidasa L-Arabinofuranosidasa CPN celulasa 45º C, 130 rpm, pH 4.8 Complejo 50º C, 200 Celulasa de rpm, pH 4.8
REFERENCIA Tiempo de hidrólisis 72 a 120 hrs
Saha, 2006
168 hrs
Kadam, 2004
48 hrs
Martinez, 1997
48 hrs
Martinez, 1997
Aspergillus niger
Complejo Celulasa
de
50º C, 200 rpm, pH 4.8
Aspergillus niger
TABLA II I SISTEMAS P ARA LA P RODUCCIÓN DE ETANOL USANDO COMO FUENTES DE CARBONO SUBP RODUCTOS O DESECHOS AGROI NDUSTRI ALES Sustrato usados Hidrolizado enzimático de Paja de Trigo adicionado con 10g de triptona y 5.0 g de extracto de levadura por litro Hidrolizado enzimático de Paja de Trigo adicionado con 10g de triptona y 5.0 g de extracto de levadura por litro Hidrolizados de cáscara de banano y almidón de yuca
Hidrolizados de cáscara de banano y almidón de yuca
Microorganismo usado Escherichia Coli recombinante FBR5
Cultivo de células en medio Luria incubado a 37º C durante 24 horas a 100 rpm
Escherichia Coli recombinante FBR5
Cultivo de células en medio Luria incubado a 37º C durante 24 horas a 100 rpm
Zymomona mobilis CP4
La conc. de azúcares reductores para el jarabe de yuca se ajustó a 20, 40 y 60 g/l y para el jarabe de cáscara de banano a 20 g/l en el medio complementado con KH2PO4, (NH4)2SO4, extracto de levadura y MgSO4·7H2O durante 72 horas La conc. de azúcares reductores para el jarabe de yuca se ajustó a 90 g/l y para el jarabe de cáscara de banano a 20 g/l en el medio complementado con KH2PO4, (NH4)2SO4, extracto de levadura y MgSO4·7H2O durante 5 horas
Saccharomyces cerevisiae NRRL Y-2034
Características del inóculo
Relación de inóculo 5.0%
Condiciones de reacción Matracez de 500 ml con volumen de operación de 350 ml, en semi-anaerobiosis (SHF)
5.0%
pH
Agitación
Referencia
6.5
Temperatu ra 37º C
130 rpm
Saha, 2006
Fermentador de dos litros volumen de operación de 1.5 L en semi-anaerobiosis (SSF)
6.0
37º C
150 rpm
Saha, 2006
Erlenmeyers de 250 ml con volumen de operación de 50 ml, en anaerobiosis
6.6
30º C
200 rpm
Monsalve, 2006
Erlenmeyers de 250 ml con volumen de operación de 50 ml, en anaerobiosis
4
30º C
200 rpm
Monsalve, 2006
TABLA II I SISTEMAS P ARA LA P RODUCCIÓN DE ETANOL USANDO COMO FUENTES DE CARBONO SUBP RODUCTOS O DESECHOS AGROI NDUSTRI ALES Sustrato usados Hidrolizado enzimático de Paja de Trigo adicionado con 10g de triptona y 5.0 g de extracto de levadura por litro Hidrolizado enzimático de Paja de Trigo adicionado con 10g de triptona y 5.0 g de extracto de levadura por litro Hidrolizados de cáscara de banano y almidón de yuca
Hidrolizados de cáscara de banano y almidón de yuca
Microorganismo usado Escherichia Coli recombinante FBR5
Cultivo de células en medio Luria incubado a 37º C durante 24 horas a 100 rpm
Escherichia Coli recombinante FBR5
Cultivo de células en medio Luria incubado a 37º C durante 24 horas a 100 rpm
Zymomona mobilis CP4
La conc. de azúcares reductores para el jarabe de yuca se ajustó a 20, 40 y 60 g/l y para el jarabe de cáscara de banano a 20 g/l en el medio complementado con KH2PO4, (NH4)2SO4, extracto de levadura y MgSO4·7H2O durante 72 horas La conc. de azúcares reductores para el jarabe de yuca se ajustó a 90 g/l y para el jarabe de cáscara de banano a 20 g/l en el medio complementado con KH2PO4, (NH4)2SO4, extracto de levadura y MgSO4·7H2O durante 5 horas
Saccharomyces cerevisiae NRRL Y-2034
Características del inóculo
Relación de inóculo 5.0%
Condiciones de reacción Matracez de 500 ml con volumen de operación de 350 ml, en semi-anaerobiosis (SHF)
5.0%
pH
Agitación
Referencia
6.5
Temperatu ra 37º C
130 rpm
Saha, 2006
Fermentador de dos litros volumen de operación de 1.5 L en semi-anaerobiosis (SSF)
6.0
37º C
150 rpm
Saha, 2006
Erlenmeyers de 250 ml con volumen de operación de 50 ml, en anaerobiosis
6.6
30º C
200 rpm
Monsalve, 2006
Erlenmeyers de 250 ml con volumen de operación de 50 ml, en anaerobiosis
4
30º C
200 rpm
Monsalve, 2006
La próxima generación de etanol combustible Todavía hay que superar algunos obstáculos antes de que se haya desarrollado un proceso totalmente comercial y hasta ahora la biomasa sólo se ha convertido en etanol en unas cuantas plantas piloto. Sin embargo, esto podría constituir los humildes albores de un enorme sector industrial nuevo que podría crecer e incluso superar la existente industria de etanol combustible de primera generación. El término “primera generación” describe la conversión de cosechas de azúcar y cereales con alto contenido en almidón, p.ej. el maíz, mientras que “segunda generación” se refiere a la conversión de lignocelulosa, mejor conocida como biomasa, un sustrato muy abundante que existe en todo el mundo. Antes, el alto costo de las enzimas para convertir la lignocelulosa en azúcar se consideraba uno de los principales obstáculos a la comercialización, pero los costos se han reducido. En el 2001, el Ministerio de Energía de EE.UU. concedió un contrato de investigación de tres años a Novozymes de un valor de 14.8 millones de dólares, con el fin de reducir diez veces el costo de las enzimas. En el 2004, al terminar esta investigación financiada por el gobierno, el costo se había reducido al nivel objetivo. “El costo de las enzimas ya no es la barrera económica dominante en la producción de etanol a partir de biomasa” comenta Joel Cherry, Director, Biotecnología/Bioenergía, que dirigió el proyecto de investigación en el centro de investigación de Novozymes en Davis, California, donde el trabajo de investigación continúa bajo su dirección. Él prevé que se desarrollarán enzimas todavía más eficientes y que el proceso será optimizado junto con colaboradores de Novozymes. “La conversión de biomasa en etanol todavía no es un proceso industrial comercial, pero es probable que se convierta en una oportunidad muy interesante para
La próxima generación de etanol combustible Todavía hay que superar algunos obstáculos antes de que se haya desarrollado un proceso totalmente comercial y hasta ahora la biomasa sólo se ha convertido en etanol en unas cuantas plantas piloto. Sin embargo, esto podría constituir los humildes albores de un enorme sector industrial nuevo que podría crecer e incluso superar la existente industria de etanol combustible de primera generación. El término “primera generación” describe la conversión de cosechas de azúcar y cereales con alto contenido en almidón, p.ej. el maíz, mientras que “segunda generación” se refiere a la conversión de lignocelulosa, mejor conocida como biomasa, un sustrato muy abundante que existe en todo el mundo. Antes, el alto costo de las enzimas para convertir la lignocelulosa en azúcar se consideraba uno de los principales obstáculos a la comercialización, pero los costos se han reducido. En el 2001, el Ministerio de Energía de EE.UU. concedió un contrato de investigación de tres años a Novozymes de un valor de 14.8 millones de dólares, con el fin de reducir diez veces el costo de las enzimas. En el 2004, al terminar esta investigación financiada por el gobierno, el costo se había reducido al nivel objetivo. “El costo de las enzimas ya no es la barrera económica dominante en la producción de etanol a partir de biomasa” comenta Joel Cherry, Director, Biotecnología/Bioenergía, que dirigió el proyecto de investigación en el centro de investigación de Novozymes en Davis, California, donde el trabajo de investigación continúa bajo su dirección. Él prevé que se desarrollarán enzimas todavía más eficientes y que el proceso será optimizado junto con colaboradores de Novozymes. “La conversión de biomasa en etanol todavía no es un proceso industrial comercial, pero es probable que se convierta en una oportunidad muy interesante para Novozymes en el futuro” prevé Emmanuel Petiot, Gerente de Desarrollo de Negocios Global de Novozymes para aplicaciones de biomasa. “Estamos viendo el principio de una industria nueva. Creemos que tardará todavía cuatro o cinco años desarrollar y comercializar las enzimas para este campo nuevo”. Aunque no haya empezado la venta comercial de las enzimas, la conversión de la biomasa en etanol ya está recibiendo la atención plena de Novozymes que está intensificando significativamente los esfuerzos de I+D, comercialización y otras áreas. De hecho, la búsqueda de celulasas y hemicelulasas de alto desempeño representa una movilización global de los recursos de investigación y pericia de Novozymes en este campo. Novozymes también participa activamente en conferencias clave sobre el tema y está solicitando más financiación estatal para acelerar el desarrollo a nivel global. La investigación de biomasa se lleva a cabo en los laboratorios de Novozymes en todo el mundo, mientras que la comercialización de la biomasa tiene su sede en Novozymes Norteamérica y está dirigida por Emmanuel Petiot. Novozymes tiene una larga historia de colaboraciones mutuamente beneficiosas. Las colaboraciones que Novozymes inicia son signos visibles de sus esfuerzos de investigación. La implementación y afinación de los procesos enzimáticos de Novozymes por medio de asociaciones con colaboradores industriales que llevan la tecnología a la fase de ensayo en planta piloto, constituyen el enfoque actual de la I+D de la biomasa. En junio del 2006, p.ej. Novozymes firmó un acuerdo de investigación de tres años con China Resources Alcohol Corporation (CRAC) sobre el desarrollo de biomasa para combustible biológico en China. CRAC es un área de negocio dentro de China National Cereals Oils & Foodstuffs Corporation (COFCO) que cuenta con tecnologías interesantes para la producción de combustible biológico. CRAC ha instalado una
planta piloto para la producción de etanol a partir de hojas y troncos de maíz en Zhaodong, provincia de Heilongjiang. A largo plazo, China espera convertirse en un importante mercado para el combustible biológico. El consumo de combustible ha crecido considerablemente durante los años recientes a medida que ha aumentado el número de vehículos del país y esto ha llamado la atención a la energía sustentable, especialmente el combustible biológico. Se reconoce generalmente que la producción de etanol de primera generación, basada en cosechas alimentarias, no crecerá mucho en China en los años venideros, porque China importa en gran parte maíz y otros cereales para uso alimentario. Contrariamente, China espera concentrarse en el desarrollo de cosechas no alimentarias como mandioca y sorgo dulce y en la producción de etanol combustible de segunda generación a partir de biomasa. En EE.UU.,, Novozymes acaba de firmar un contrato de colaboración con Broin con el fin de tomar el próximo paso para comercializar etanol rentable producido a partir de hojas y troncos de maíz. Esta colaboración es una extensión de la estrecha colaboración que ya existe entre las dos empresas. Es una oportunidad para que Novozymes pueda aprovechar su extraordinaria plataforma biotecnológica y para que Broin pueda alcanzar una comercialización rápida. Éstos son sólo dos ejemplos de lo que se está haciendo para situar el etanol basado en biomasa en la arena comercial. La producción de etanol a partir de biomasa puede dividirse en fases tal como se desprende del diagrama. Para que la comercialización tenga éxito, es necesario observar todas estas fases de una forma holística porque están unidas por una interacción compleja. Las fibras lignocelulósicas se componen de tres fracciones principales: celulosa, hemicelulosa y lignina. Las enzimas atacan la cadena polimérica de azúcar de las fracciones de celulosa y hemicelulosa, liberando azúcares monoméricos para la fermentación. Se necesita un pretratamiento para abrir las fibras y hacer que el sustrato lignocelulósico sea accesible para la acción enzimática. Evidentemente, las enzimas tienen que corresponder al sustrato. Si se utiliza un pretratamiento con ácido diluido, se degrada la mayor parte de la hemicelulosa y no se necesita una hemicelulasa. Sin embargo, si se utiliza un pretratamiento alcalino o neutro, todavía es necesario hidrolizar la hemicelulosa y se necesitan hemicelulasas. Para los investigadores o las empresas que desean ensayar enzimas en el laboratorio, el Biomass Kit de Novozymes contiene pequeñas muestras de enzimas. En la fase de fermentación se presenta otro reto ya que los azúcares del 5-carbono (C5) producidos por la degradación de la hemicelulosa, no son fermentados por la levadura utilizada actualmente. Los investigadores están desarrollando organismos capaces de aprovechar eficientemente estos azúcares para incrementar los rendimientos de etanol y, por consiguiente, aumentar todavía más la rentabilidad de todo el proceso. La recolección de materias primas es un desafío logístico. A menudo, las hojas y troncos de maíz, que han constituido el enfoque de la mayor parte de la investigación en EE.UU. y China, no se recolectan, sino que se dejan descomponer en los campos. Hay que establecer sistemas de recolección. Por eso, los ensayos con biomasa a menudo se basan en los que se llama “materia interna”, es decir residuos o subproductos existentes de las plantas de etanol de primera generación. Las fibras de maíz residuales del procesado de almidón de maíz y bagazo del procesado de caña de azúcar son ejemplos de materias primas lignocelulósicas
disponibles para la conversión. También pueden utilizarse astillas y pedazos de madera. La biomasa representa una materia prima renovable para la producción de combustible biológico como una alternativa a la gasolina. Con los crecientes precios del petróleo y los fuertes incentivos estatales, la producción de etanol a partir de biomasa es cada día más viable. A medida que crece la conciencia sobre el calentamiento global, los combustibles biológicos podrían tener un futuro prometedor. Ya que tanto los factores políticos, económicos y medioambientales favorecen los combustibles biológicos, existe ahora una fuerte voluntad en ciertos países para desarrollar la conversión de biomasa en etanol. Novozymes está involucrado en un esfuerzo de investigación sin precedentes destinado a buscar las celulasas y hemicelulasas necesarias para que tenga éxito la industria de etanol combustible de segunda generación. FASES DEL PROCESO DE CONVERSIÓN Recolección y entrega de la materia prima
Preprocesado
Pretratamiento
Celulasas
Microorganismo que utiliza hexosa y pentosa
Hidrólisis enzimática de la celulosa
Fermentación de mezcla de azúcares de la biomasa
Etanol u otro producto de fermentación
JUSTIFICACIÓN: El cultivo de la Sábila en el estado de Yucatán se estableció inicialmente para suministrar la materia prima a Estados Unidos y después se promovió el cultivo como respuesta a la crisis henequenera (Chel, 2005). Y su auge se dio por la capacidad del cultivo para adaptarse a las condiciones edafológicas del suelo de Yucatán, sin embargo es importante la búsqueda de alternativas o estrategias que permitan la comercialización rentable de este recurso natural. La carencia de industrias o de opciones de locales de comercialización ha repercutido en el abandono de las plantaciones y en el quebranto de una importante alternativa productiva para la zona henequenera del estado. Aunado a todo esto el procesamiento de la sábila a estado circunscrito a la producción de gel 1:1 cuya obtención es sumamente sencilla y de baja inversión o como gel concentrado 1:20 y 1:40 y el gel liofilizado (1:200) sin embargo participar en el mercado de estas tres ultimas opciones requiere de una fuerte inversión, calculada en un millón de dólares en el año 2002. Otra alternativa es la diversificación de las opciones de industrialización de las hojas de sábila, para ello es necesario ampliar la gama de productos susceptibles de ser obtenidos de las hojas de sábila, con la idea de encontrar alternativas de alta demanda y valor agregado atractivo. En este proyecto se plantea la posibilidad de obtener varios productos alternos al gel de sábila, usando los subproductos y desechos que se generan durante el proceso de obtención del gel de sábila. Nuestro grupo pretende aportar nuevas opciones para la industrialización de la sábila a través del establecimiento de las bases para: La eventual utilización de los desechos sólidos de la sábila, en la producción de azúcares fermentables y la conversión de los mismos en etanol para su uso como combustible. Finalmente poder establecer un proceso industrial en el que se logren productos homogéneos y con ello garantizar una calidad homogénea de los productos obtenidos. HIPÓTESIS: Dado que los desechos sólidos de la sábila contienen polímeros estructurales cuyos monómeros son azucares y dado que es posible mediante un proceso de sacarificación química o enzimática producir azúcares fermentables. Es de esperarse que estos puedan ser transformados a etanol mediante una fermentación alcohólica OBJETIVO GENERAL: Establecer las condiciones para la producción de etanol a partir de los desechos sólidos de la sábila sacarificados OBJETIV OS ESPECÍFI COS: 1. Establecimiento de las condiciones para recuperar aloína de los desechos sólidos generados durante la recuperación del gel de sábila.
2. Establecer las condiciones de sacarificación química de los desechos sólidos generados durante la recuperación del gel de sábila. 3. Establecer las condiciones de fermentación para la producción de etanol carburante usando como fuente de carbono los desechos sólidos de la sábila, sacarificados.
MATERIAL Y M ÉTODOS: Materia prima: Para el desarrollo de este trabajo se utilizaron pencas de sábila Aloe barbadensis Miller obtenidas de plantas cultivadas bajo diferentes condiciones de densidad de población en suelos mecanizados del campo experimental del Centro de Investigación Regional del Sureste del INIFAP, ubicado en Uxmal, Yucatán. Y de la plantación tradicional en suelo pedregoso del Sr. Evelio Salazar Seba ubicada en Umán, Yucatán. Obtención de los desechos sólidos: Este material fue procesado en el laboratorio de Tecnología enzimática y microbiana de la División de Estudios de Posgrado e Investigación, el procedimiento consistió en el lavado de las pencas con una posterior sanitización. Posteriormente se procedió a cortar el ápice y la base. Se les retiraron las espinas y el envés. Se retiró el gel y los residuos fueron picados en tiras de aproximadamente 2 cm de ancho. Secado de los residuos Sólidos: Los residuos sólidos picados fueron secados en un horno a 50ºC por 96 horas. Molienda de los residuos sólidos secos Los residuos sólidos ya secos fueron molidos en una licuadora industrial durante 30 segundos, 1 minuto y 5 minutos, cada muestra fue de 150 gr, todas por duplicado. Determinación del perfil Granulométrico Los residuos ya secos fueron tamizados con las siguientes mallas 10, 20, 30, 40, 50 y fracción de finos. Hidrólisis química de los residuos: Los residuos secos y molidos se hidrolizaron mediante la adición de H2SO4 al 10, 20 y 30%. En tubos de ensayo se colocaron 3 gr. de muestra por cada tiempo de molienda (30 segundos, 1minuto y 5 minutos) y una muestra control sin moler y se les adicionó 15 ml de ácido al 10%, se agita por completo; se hizo la misma metodología para las concentraciones de ácido al 20 y al 30%. Posteriormente los tubos con la muestra y el ácido se metieron a la autoclave a 125ºC durante 15 min. Transcurrido ese tiempo, se dejaron enfriar los tubos y se les agregó 15ml de agua, se pasó la mezcla a matraces y se les agregó 20ml más de agua, llevando el volumen a 50ml. Posteriormente se tomó una alícuota de estos matraces; éstas alícuotas se centrifugaron a 1500g por 10min. Se recuperó el sobrenadante y se le determinó la concentración de azúcares reductores por el método de DNS tomando .1ml como tamaño de alícuota. Hidrólisis quím ica, ajustando pH: Los residuos secos y molidos se hidrolizaron mediante la adición de H2SO4 al 10, 20 y 30%. En tubos de ensayo se colocaron 3 gr. de muestra por cada tiempo de molienda (30 segundos, 1minuto y 5 minutos) y una muestra control sin moler y se les adicionó 15 ml de ácido al 10%, se agita por completo; se hizo la misma
metodología para las concentraciones de ácido al 20 y al 30%. Posteriormente los tubos con la muestra y el ácido se metieron a la autoclave a 125ºC durante 15 min. Transcurrido ese tiempo, se dejaron enfriar los tubos y se les agregó NaOH 6N, para neutralizar las muestras hidrolizadas con 10% de ácido se utilizaron 8ml de NaOH y se llevó a 50 ml con agua, para las muestras con 20% de ácido se utilizaron 16 ml de NaOH y finalmente para las muestras con 30% de ácido se utilizaron 25 ml de NaOH y se llevaron a 50 ml de volumen con agua pasando las muestras a matraces. Posteriormente se tomó una alícuota de estos matraces; éstas alícuotas se centrifugaron a 1500g por 10min. Se recuperó el sobrenadante y se le determinó la concentración de azúcares reductores por el método de DNS tomando .2ml como tamaño de alícuota. Hidrólisis enzimática de los residuos: Se llevó a cabo la hidrólisis enzimática de los residuos secos y molidos utilizando la enzima “Pectinex AR”. Se hizo un diseño factorial 3 3, tomando como variables: temperatura, concentración de enzima y tiempos de molienda. El diseño factorial que se realizó fue el siguiente: Pectinex AR 35ºC 40ºC 45ºC 2.0 ml 4.0 ml 6.0 ml 2.0 ml 4.0 ml 6.0 ml 2.0 ml 4.0 ml 6.0 ml A B C A B C A B C A B C A B C A B C A B C A B C A B C En donde: En la primera línea se indica la temperatura de trabajo En la segunda línea los mililitros de enzima que se usaran. En la tercera línea se maneja las muestras de desecho con diferentes tiempos de molienda, la nomenclatura usada es la siguiente: A= 30 segundos de molienda B= 1 minuto de molienda C= 5 minutos de molienda Se utilizó como control una muestra sin moler. Se colocaron 3 gramos de muestra y se le añadió 28, 26 y 24ml de agua según fue el caso, se pusieron a preincubar a la temperatura de ensayo, una vez alcanzada la temperatura requerida se añadió la enzima alcanzando los 30ml de solución y se dejó reaccionar durante 30 minutos; transcurrido este tiempo, la reacción se detuvo haciendo pasar los tubos a un recipiente conteniendo agua con hielo. El sistema se llevó a 50ml en pequeños matraces añadiendo 20ml de agua, se tomó una alícuota de esta mezcla y se centrifugó a 1500g durante 10min. Se recuperó el sobrenadante y se le determinó la concentración de azúcares reductores por el método de DNS tomando .1ml como tamaño de alícuota.
Montaje de técnica para determinación de azucares reductores (DNS): Para la determinación de azúcares fermentables producto de la hidrólisis de los desechos sólidos de la sábila, se seguirá el método reportado por Miller (1953). Para la elaboración de una curva estándar de glucosa se seguirá la siguiente metodología
Glucosa Solución g /ml stock (ml)
Agua (ml)
REACTIVOS
Tubo
1) Solución de glucosa en agua a concentraciones entre 0 y 1000 g /ml
0
0
0.0
1.5
1
100
0.1
1.4
2) Reactivo de DNS
2
200
0.2
1.3
3
300
0.3
1.2
4
400
0.4
1.1
5
500
0.5
1.0
6
600
0.6
0.9
7
700
0.7
0.8
8
800
0.8
0.7
9
900
0.9
0.6
10
1000
1.0
0.5
PROCEDIMIENTO Se preparan 10 tubos de ensayo como se indica en las columnas y se agregan 3.0 ml de reactivo DNS a cada tubo, se lleva a ebullición en baño de maría por 5 minutos. Se deja enfriar el sistema a temperatura ambiente y se completa a 20 ml con agua destilada. Se lee la densidad óptica a 550 nm. La curva final resulta del promedio de mínimo 3 curvas.
PREPARACIÓN DE LA SOLUCIÓN STOCK DE GLUCOSA 1g 1 x 106 g 1 x 10-3 g 1000 g →
←
1 x 10-3 g 1 ml g a pesar volumen a preparar →
←
Determinación de la proteína extracelular Para la determinación de azúcares de la producción de proteína extracelular en los sistemas de fermentación se seguirá el método reportado por Lowry(1953). Para la elaboración de una curva estándar de Albúmina sérica bovina se seguirá la siguiente metodología. CURVA ESTÁNDAR DE ALBUMI NA SERICA BOVINA O CASEINA
REACTIVOS
Tub o
Proteína µg/ml
1. Solución de ASB de 500 µg/ml. 2. Reactivos de Lowry: Sulfato de Cu Reactivo A: pentahidratado al 1% en agua. Reactivo B: Tartrato de Na y K al 2%. Reactivo C: Carbonato de Na al 2% en NaOH 0.1M. Reactivo D: 1 vol de A + 1 vol B. Reactivo E: 1 vol de D + 50 vol de C. Reactivo de Folin-Ciocalteu diluido 1:1 con agua.
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500
Solución stock (ml) 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0
0.0* 0.3 0.6 0.9 1.2 1.5 1.8 2.1 2.4 2.7 3.0
Agua (ml) 1.0 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0.0
3.0 2.7 2.4 2.1 1.8 1.5 1.2 0.9 0.6 0.3 0.0
PROCEDIMIENTO A cada tubo preparado se añaden 5 ml de reactivo E y se agita. Se deja reposar durante 10 minutos, se agregan 0.5 ml de reactivo Folin 1:1 en agua y se agita. Se deja reposar durante 30 minutos y se lee la absorbancia a 590 nm. La curva final resulta del promedio de mínimo tres curvas. * Volúmenes utilizados para la curva estándar a 280 nm.
PREPARACIÓN DE LA SOLUCIÓN STOCK DE ASB Y CASEÍNA 1g 1 x 106 g 5 x 10-4 g 500 g →
←
Resultados
5 x 10-4 g 1 ml g a pesar volumen a preparar →
←
Curvas Estándar de Glucosa En la siguiente tabla y grafica se representan los resultados de cada una de las curvas de los datos obtenidos de la lectura de la densidad óptica promedio de la solución de Glucosa.
Glucosa 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000
D.O. 1 0,0145 0,0755 0,1425 0,214 0,2845 0,3475 0,4125 0,483 0,539 0,6165
D.O. 2
D.O. 3
0,0175 0,079 0,144 0,206 0,274 0,34 0,415 0,4675 0,5345 0,5985
D.O 4
0,0065 0,047 0,108 0,171 0,2355 0,3 0,364 0,4275 0,485 0,5565
D.O 5
0,027 0,092 0,1665 0,2345 0,3155 0,3635 0,44 0,527 0,559 0,67
0,0245 0,104 0,1735 0,249 0,3165 0,3915 0,4625 0,535 0,616 0,6925
D.O 6 0,034 0,108 0,182 0,256 0,327 0,3965 0,472 0,539 0,6215 0,7065
Curvas Esta ndar de Glucosa
CURVA ESTÁNDAR DE ALBUMIN A SERICA BOVIN A O
0,8 0,7 0,6
D.O. 1
a c i t 0,5 p O d 0,4 a d i s 0,3 n e D
D.O. 2 D.O. 3 D.O 4 D.O 5 D.O 6
0,2
CASEINA
0,1 0 0
200
400
600
Glucosa
Gráfica 1) Curva Estándar de Glucosa
800
1000
1200
Curva Estándar De Caseína En la siguiente tabla y grafica se representan los resultados de cada una de las curvas de los datos obtenidos de la lectura de la densidad óptica promedio de la solución de caseína.
Caseína 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500
D.O. 1 0,060 0,108 0,166 0,186 0,226 0,273 0,319 0,357 0,411 0,463
D.O. 2 0,0675 0,134 0,204 0,271 0,3445 0,413 0,494 0,549 0,63 0,702
D.O. 3 0,047 0,102 0,137 0,183 0,231 0,273 0,3335 0,36 0,404 0,4525
D.O. 4
D.O. 5
0,044 0,09 0,1375 0,1885 0,2345 0,272 0,3175 0,364 0,411 0,4655
D.O. 6
0,0595 0,1325 0,1705 0,215 0,2535 0,306 0,3605 0,397 0,4385 0,476
0,0675 0,112 0,1585 0,2095 0,2505 0,313 0,354 0,39 0,435 0,47
Curvas Estandar de Caseína 0,800 0,700 D.O. 1
a 0,600 c i t 0,500 p O d 0,400 a d i s 0,300 n e D 0,200
D.O. 2 D.O. 3 D.O. 4 D.O. 5 D.O. 6
0,100 0,000 0
100
200
300
400
500
600
Caseína
Gráfica 2) Curva Estándar de Caseína
Contenido de humedad de los residuos sólidos. Hasta el momento se han procesado 15.8 kg de residuos sólidos de la sábila integrados por el as, el envés, 5 cm del ápice y las espinas de la penca. Este material tiene un 89.58 % de humedad y un 10.41% de sólidos. Por lo que contamos con un lote de 1.57 kg de material que será usado para el desarrollo de este proyecto. Perfil Granulométrico. En la figura 2, se muestra el efecto del tiempo de molienda sobre el perfil granulométrico de las muestras, y como puede observarse conforme se incrementa el tiempo de molienda la fracción de sólidos finos se va incrementando, esto puede ser importante para facilitar el proceso de hidrólisis tanto química como enzimática
o en su caso para definir que perfil granulométrico es el más adecuado para realizar las fermentaciones en estado sólido. Perfil Granulométrico 70 60 50 40 30
Prom
20 10 0 10
20
30
40
50
Finos
Malla
Perfil Granulométrico 70 60 50 Prom
40 30 20 10 0 10
20
30
40
Malla
50
Finos
Perfil Granulométrico 70 60 50 40 30
Prom
20 10 0 10
20
30
40
50
Finos
Malla
Figura 2) Efecto del tiempo de molienda sobre el perfil granulométrico de las muestras
Metodologías para la Recuperación de Aloína. Para seleccionar la técnica que se usara para la recuperación de la aloína se realizo un análisis de la marchas reportadas con este fin, y se selecciono la más sencilla de realizar, Opción 1
Opcion 1 Extracto de aloe
Disolver en agua
Filtrar
Acidificar el filtrado con Ac. Sulfúrico para precipitar resinas
Filtrar
Resina
Neutralizar el filtrado con hidróxido de amonio
Precipitar la aloína cruda en etanol al 50%
El estándar se disuelve en etanol al 50%
TLC, HPLC
Filtrar 0.45 µ
Referencia: Elamthuruthy, A.T.; Shah, C.R.; Khan, T.A.; Tatke, P.A.; Gabhe, S.Y.; Standardization of marketed Kumariasava-an Ayurvedic Aloe vera product; Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis; 2005; 37, 937-941
Opción 2 Alícuota de 0.5 g de acíbar
Etanol (10 ml)
Sonicar por 1h a 50ºC
Centrifugar suspensión obtenida a 3000g por 10 min
Estándar disolver en etanol
Sobrenadante se usa para HPLC
Filtrar en membrana de 0.45 m antes de inyectar
Condiciones HP LC Columna: NOVA-PAK C 18 4m (150 x 3.9 mm Di) Fase Móvil: Metanol 25-30% (gradiente lineal, 5 min) Metanol 30-35% (gradiente lineal, 10 min) Metanol 35-70% (gradiente lineal, 35 min) Metanol 70% (isocrático, 10 min) Velocidad de flujo: 0,7 ml/min Temperatura: ambiente Longitud de onda: 293 nm Referencia: Park, M.K., Park, J.H., Na Young Kim, Yong Geun Shin, Yong Seok Choi, Jin Gyun Lee, Kyeong Ho Kim; Seung Ki Lee; Analysis of 13 phenolic compound in Aloe species by high performance liquid chromatography; Phytochemical Analysis; 1998; 9, 186-191
Opción 3
Preparación de la muestra (HPLC) Alícuotas de 300 mg de muestra en olvo Disolver en 100 ml de metanolagua (1:1) en agitación por 15 min
Filtrar una alícuota de solución en filtro de acetato
de celulosa Muestras Estándar
Precisión
Aloinosidos A y B se obtienen de la planta por medio de TLC
Soluciones de 100 mg de aloina A/B en 100 ml de matnol-agua (1:1)
TLC; sistema solvente:
Cromatografía (5 veces
acetato de etilo-metanol-agua (100:17:13)
Referencia: Rauwald, Hans W.; Beil, Anette; High-performance liquid chromatographic separation and determination of diastereomeric anthrone-Cglucosyls in Cape aloes; Journal of Chromatography, 1993; 639, 359-362
Opción 4
Preparación de muestra (HPLC) Muestra Aloe 50 mg
Disolver en etanol al 40%
Preparación de muestra (GC) Pesar 5 g de aloe en polvo en un frasco de 100 ml
Sellar con septum de aluminio-caucho
Sonicar por 10 min Añadir 0.02 l de
propionato de etilo Filtrar en membrana 0.22 m PTFE Calentar a 105 ºC por 30 min
Realizar headspace por 150 s con helio a una razón de 8 ml/min
Referencia: Saccú, Debora; Bogoni, Paolo; Procida, Giuseppe; Aloe Exudate: Characterization by Reversed Phase HPLC and Headspace GC-MS; J. Agric. Food Chem. 2001, 49, 4526-4530
Opción 5
Método de extracción Liquidos diluciones 1:10 y 1:100 Gel diluciones 1:10 y 1:100 Solidos 0.2 g con 2 ml de metanol Por sonicación 1 ml de solución
Remover
Evaporar
Residuo disolver en 1 ml de a ua
Preparación de la muestra 1 ml de la muestra 1:10 Adicionar 1 µg de crisofanol como estándar inicial Mas 0.5 ml de alcohol reactivo mas 1 ml de NaCl saturado
La mezcla extraida mas 3 ml
La capa de encima remover y mezcla con el 1er. extracto
Los extractos combinados fueron evaporados y secados
etilacetato/metanol (9:1)
La capa se traslada a un tubo de ensayo
El residuos disolver en un volumen peq.
Transferir a un GC La capa liquida extraida con 1 ml de
etilacetato/metano
(9:1)
El metanol fue eva orado
Referencia: ElSohly, Mahmoud A; Gul, Waseem; Murphy, Timothy P.; Analysis of the anthraquinones aloe-emodin and aloin by gas chromatography/mass spectrometry; International Immunopharmacology; 2004; 4, 1739-1744
Hidrólisis Química. En la gráfica 3, se muestra el efecto que tiene la hidrólisis química sobre la producción de azúcares reductores a partir de los residuos de sábila, como se observa, las condiciones a las que se obtienen una mayor concentración de azúcares reductores es cuando se utilizan concentraciones bajas de ácido, en este caso al 10% y usando las muestras control (sin moler) y las que fueron molidas durante 5 min. (Los datos de la gráfica están contenidos en el anexo 2) Efecto de las cond iciones de hidrólisis química sobre la produ cción de azúcares reductores (Glucosa) a partir de los residuos sólidos de sábila 180000
l m / 160000 g a 140000 s o c 120000 u l G100000 e d 80000 n ó i c 60000 a r t n 40000 e c n 20000 o C
0
10%
20%
30%
10%
Sin moler
20%
30%
10%
5 min
20%
30%
10%
1 min
20%
30%
30 seg
Concentración H2SO4 Tiempo de molienda
Condición de sacarificación
Gráfica 3) Efecto de la hidrólisis química sobre la determinación de azúcares reductores.
En la gráfica 4, se puede observar el efecto del pH sobre la determinación de los azúcares reductores, se observa una disminución en la cuantificación de estos con altas concentraciones de ácido (20 y 30%), esto es debido a que el sistema para la determinación de azúcares reductores por el método de DNS es básico y al momento de llevarse a cabo la reacción el sistema se acidifica y se forma sulfato de sodio, lo cual altera la determinación de azúcares. Efecto del pH sobre la determinación de az úcares reductores por el método de DN S 180000
14
160000
12
a s o 140000 c u l 120000 G e l d 100000 m n / ó g i 80000 c a r t 60000 n e c 40000 n o C
10 8 6
H p
Glucosa pH
4 2
20000 0
0 10%
20% .1 ml
30%
10%
20%
30%
10%
.5 ml
20%
30%
1 ml
Condición de sacarificación
Gráfica 4) Efecto del pH sobre la determinación de azúcares reductores de la hidrólisis química
Hidrólisis Química. (Ajuste de pH posterior a la hidrólisis) Se llevó a cabo la hidrólisis química con H 2 SO 4 con las mismas concentraciones que en el experimento anterior, esta vez ajustando el pH con NaOH, para evaluar el efecto del pH sobre la determinación de azúcares reductores. El ajuste de pH se realizó con el propósito de que el sistema de determinación de azúcares reductores por el método de DNS no se acidificara. Se esperaba que se obtuvieran mayores concentraciones de azúcares reductores al ajustar el pH de las muestras antes de hacer la determinación, como se puede observar esto no fue así, las concentraciones fueron menores que en la hidrólisis donde no se ajusto el pH, pero se encontró que en la mayoría de las muestras que se habían hidrolizado con 20% de ácido un aumento en la concentración de glucosa. En el caso de las muestras hidrolizadas con 30% de ácido la concentración sigue siendo baja, esto podría ser debido a que con esa concentración de ácido las muestras se carbonizan lo que hace que la determinación de azúcares se vea alterada. Efecto de las condiciones de hidrólisis química (ajustando pH) sobre la producción de az úcares reductores a partir de los residuos sólidos de sábila l m120000 / g a 100000 s o c u 80000 l G e d 60000 n ó i c 40000 a r t n e 20000 c n o 0 C
Glucosa
10% 20% 30% 10% 20% 30% 10% 20% 30% 10% 20% 30% Sin moler
5 min
1 min
30 seg
Concentración H2SO4 Tiempo de molienda
Condición de sacarificación
Gráfica 5) Efecto de la hidrólisis química sobre la determinación de azúcares reductores, ajustando pH
Hidrólisis Enzimática. A continuación se presentan los resultados del diseño factorial de la sacarificación enzimática. En la gráficas 6, 7 y 8 se puede observar la concentración de azúcares reductores contra la concentración de enzima y el tiempo de molienda de la muestra, se nota un aumento en la producción de azúcares cuando se incrementa la concentración de enzima y cuando se tienen las muestras más molidas. Efecto de la hidrólisis enzimática sobre la determinación de az ucares reductores a partir de los residuos d e sábila l m120000 / g a 100000 s o c u 80000 l G e d 60000 n ó i 40000 c a r t n 20000 e c n o 0 C
1 ml
2 ml
3 ml
1 ml
Sin moler
2 ml
3 ml
1 ml
30 seg
2 ml
3 ml
1 ml
1 min
2 ml
3 ml
5 min
Condición de hidrólisis
Gráfica 6) Hidrólisis Enzimática a 35ºC Efecto de la hidrolisis enzimatica sobre la determinacion de azucares reductores a partir de los residuos de sabila l m140000 / g m a 120000 s o 100000 c u l G 80000 e d n 60000 o i c 40000 a r t n 20000 e c n 0 o C
1 ml
2 ml Sin moler
3 ml
1 ml
2 ml 30 seg
3 ml
1 ml
2 ml 1 min
Condicion de sacarifiacion
Gráfica 7) Hidrólisis Enzimática a 40ºC
3 ml
1 ml
2 ml 5 min
3 ml
Efecto de la hidrólisis enzimática sobre la determinación de azúcares reductores a partir de los residuos sólidos de sábila 140000 a s o 120000 c u l 100000 g e d l 80000 m n / o i g c m 60000 a r t 40000 n e c 20000 n o C 0
Glucosa
Concentración
1 ml 2 ml 3 ml 1 ml 2 ml 3 ml 1 ml 2 ml 3 ml 1 ml 2 ml 3 ml de enzima Sin moler
30 seg
1 min
Condicion de sacarificacion
5 min
Tiempo de molienda
Gráfica 8) Hidrólisis Enzimática a 45ºC Se observó también que la mayor producción de azúcares se obtuvo cuando la temperatura a la cual se llevó la reacción fue de 40ºC, mientras que en 35 y 45º disminuye la concentración, debido que la mayor actividad de la enzima se da aproximadamente a 40ºC.
Anexos
Anexo I Datos del Perfil granulométrico de las muestras de la cutícula de sábila molidas durante diferentes intervalos de tiempo.
Para 30 segundos Malla
Fracción 1
Fracción 2
Prom
10 20 30 40 50 Finos
43.7 67.15 17.5 6.2 3.1 10.7
26 70 21.4 7.5 4.9 13.4
34.85 68.575 19.45 6.85 4 12.05
Para 1 minuto Malla 10 20 30 40 50 Finos
Fracción 1
Fracción 2
Prom
15.9 64.4 26.7 10.55 6.8 25.2
12.1 69.8 26.7 10.8 6.1 21.8
14 67.1 26.7 10.675 6.45 23.5
Para 5 minuto Malla 10 20 30 40 50 Finos
Fracción 1 Fracción 2 0.3 16.2 33.5 23.8 13.1 58.2
0 6.5 24.4 29.4 15.2 72.1
Prom 0.15 11.35 28.95 26.6 14.15 65.15
Anexo 2 Datos obtenidos de la hidrólisis química, con diferentes tiempos de molienda y concentración de ácido. Glucosa Promedio g/ml
Muestra Sin moler
5 min
1 min
30 seg
10% 20% 30% 10% 20% 30% 10% 20% 30% 10% 20% 30%
158732,14 65785,71 6803,57 149678,57 65678,57 1125,00 133071,43 55821,43 1982,14 129321,43 69857,14 589,29
Efecto del pH en la determinación de azúcares reductores de la hidrólisis química, utilizando alícuotas de .1, .5 y 1ml de hidrolizado de la muestra molida por 5 minutos. Concentración pH H2SO4 promedio .1 ml
.5 ml
1 ml
10% 20% 30% 10% 20% 30% 10% 20% 30%
11,53 11,01 10,07 7,61 4,83 4,75 4,76 4,38 3,47
Anexo 3 Datos obtenidos de la hidrólisis química, con diferentes tiempos de molienda y concentración de ácido y ajustando el pH posterior hidrólisis. Glucosa Prom
Muestra Sin moler
5 min
1 min
30 seg
10% 20% 30% 10% 20% 30% 10% 20% 30% 10% 20% 30%
46741,07 86049,11 18750,00 113370,54 99843,75 48013,39 57924,11 88459,82 20424,11 39508,93 73727,68 28392,86
Anexo 4 Datos del diseño factorial para la hidrólisis enzimática Hidrólisis enzimática realizada a 35ºC Glucosa Promedio Muestra g/ml Sin moler
30 seg
1 min
5 min
1 ml 2 ml 3 ml 1 ml 2 ml 3 ml 1 ml 2 ml 3 ml 1 ml 2 ml 3 ml
38303,57 34928,57 44732,14 28714,29 39750,00 44785,71 62357,14 85125,00 99428,57 74410,71 84321,43 111428,57
Hidrólisis enzimática realizada a 40ºC Glucosa Promedio Muestra g/ml Sin moler
30 seg
1 min
5 min
1 ml 2 ml 3 ml 1 ml 2 ml 3 ml 1 ml 2 ml 3 ml 1 ml 2 ml 3 ml
29732,14 23410,71 44142,86 38196,43 43017,86 56732,14 85178,57 92946,43 129589,29 99750,00 105053,57 125732,14
Hidrólisis enzimática realizada a 45ºC Glucosa Promedio Muestra g/ml Sin moler
30 seg
1 min
5 min
1 ml 2 ml 3 ml 1 ml 2 ml 3 ml 1 ml 2 ml 3 ml 1 ml 2 ml 3 ml
32410,71 40875,00 24321,43 45482,14 54267,86 58339,29 87910,71 103767,86 115500,00 102000,00 109285,71 107785,71
CRONOGRAMA DE ACTIVI DADES Mes Actividad 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Revisión bibliográfica x x x x x x x x x x x x 1. Establecimiento de las condiciones para recuperar aloína de los desechos sólidos generados durante la recuperación del gel de sábila. 1.1 Efecto del tamaño de partícula en el rendimiento de aloína. x x x 1.2 Efecto de la concentración y tipo de reactivo usado para la extracción de la Aloína. x x x 1.3 Efecto de la temperatura sobre la velocidad extracción de la aloína. x x x 2. Establecer las condiciones de sacarificación química de los desechos sólidos generados durante la recuperación del gel de sábila. 2.1 Efecto del tamaño de partícula en el velocidad de sacarificación x x x 2.2 Efecto de la concentración y tipo de reactivo usado para la sacarificación x x x 2.3 Efecto de la temperatura sobre la velocidad de sacarificación x x x 3. Establecer las condiciones de fermentación para la producción de etanol carburante usando como fuente de carbono los desechos sólidos de la sábila, sacarificados. 3.1 Efecto de la concentración de azúcares reductores sobre le velocidad de producción y x x x el rendimiento de etanol. 3.2 Efecto del pH sobre la velocidad de producción y rendimiento de etanol. x x x 3.3 Efecto de la temperatura sobre la velocidad de producción y rendimiento de etanol. x x x Análisis discusión de datos x x x x x x x x x Redacción del documento de tesis x x x
REFERENCIAS: Saha, Badal C.; Cotta, Michael A. Ethanol Production from Alkaline Peroxide Pretrated Enzymatically Saccharified Wheat Straw. Biotechnol. Prog. 2006, 22, 449-453. Kemppainen, Amber J.; Shonnard, David R. Comparative Life-Cycle Assessments for Biomasa-to-Ethanol Production from Different Regional Feedstocks. Biotechnol. Prog. 2005, 21, 1075-1084. Kadam, Kiran L.; Rydholm, Eric C.; McMillan, James D. Development and Validation of a Kinetic Model for Enzymatic Saccharification of Lignocellulosic Biomasa. Biotechnol. Prog. 2004, 20, 698-705. Martínez, José Miguel; Reguant, Jordi; Montero, Miguel Ángel; Montané, Daniel; Salvadó, Joan; Farriol, Xavier. Hydrolytic Pretreatment of Softwood and Almond Shells. Degree of Polymerization and Enzymatic Digestibility of the Cellulose Fraction. Ind. Eng. Chem. Res. 1997, 36, 688-696. Ishizawa, Claudia I.; Davis, Mark F.; Schell, Daniel F.; Jonson, David K. Porosity and Its Effect on the Digestibility of Dilute Sulfuric Acid Pretreated Corn Stover. J. Agric. Food Chem. 2007, 55, 2575-2581. Canettieri, Eliana V.; Rocha, George J. M.; Carvalho, Joâo A.; Silva Joâo B. A. Evaluation of the Kinetics of Xylose Formation from Dilute Sulfuric Acid Hydrolysis of Forest Residues of Eucalyptus grandis. Ind. Eng. Chem. Res. 2007, 46, 19381944. Pelley, R. P.; Wang, Y.-T.; Waller, T. A. Current Status of Quality Control of Aloe
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