UNIVERSIDAD NACIONAL FEDERICO VILLARREAL Facultad de Ciencias Naturales y Matemáticas Escuela Profesional de Biología
PRACTICA Nº1 FRAGILIDAD OSMOTICA DEL ERITROCITO
Docente: Blga. Rossalyn Acuña Payano Estudiantes: Hidalgo Venegas, Carlos. Toribio Gamuzo, César. Vásquez Domínguez, Andrés. Grupo: Grupo “E” – Viernes 16:20 – 18:00
2013
FRAGILIDAD OSMÓTICA DEL ERITROCITO I.
INTRODUCCIÓN La osmosis es un tipo especial de transporte pasivo en el cual sólo las moléculas de agua son transportadas a través de la membrana. El movimiento de agua se realiza desde un punto en que hay mayor concentración a uno de menor para igualar concentraciones. De acuerdo al medio en que se encuentre una célula, la osmosis varía. La función de la osmosis es mantener hidratada a la membrana celular. Dicho proceso no requiere gasto de energía. En otras palabras, la osmosis es un fenómeno consistente en el paso del solvente de una disolución desde una zona de baja concentración de soluto a una de alta concentración de soluto, separadas por una membrana semipermeable. La membrana celular constituye una interfase entre el compartimento intra y extracelular que permite el libre recambio de moléculas de agua, estableciéndose un gradiente osmótico. La membrana celular de los eritrocitos es flexible, pero prácticamente carece de elasticidad, lo que significa que la célula se rompe si le entra agua hasta exceder un volumen crítico. Cuando la célula enfrenta un ambiente hipotónico se genera un movimiento neto de agua libre hacia su interior. Según el grado de hipotonicidad y la capacidad de la membrana para mantener su integridad, la célula se hincha y estalla permitiendo, en el caso de los eritrocitos, la salida de hemoglobina. Esta propiedad es utilizada en la prueba de la fragilidad osmótica eritrocitaria (FOE), que consiste en exponer alícuotas de eritrocitos a concentraciones decrecientes de NaCl, usualmente entre 0,85% y 0%, y luego cuantificar el grado de hemólisis en cada una de ellas. Por lo tanto, la FOE permite evaluar la resistencia y estabilidad de la membrana del eritrocito frente a un estrés osmótico. La ruptura de la membrana celular produce la salida del contenido de hemoglobina, por lo que se puede medir la ruptura de los eritrocitos midiendo y cuantificando la cantidad de hemoglobina liberada al medio mediante técnicas espectrofotométricas.
La fragilidad osmótica del eritrocito depende de características como la edad del eritrocito, su tamaño, forma y las demás condiciones propias de la estructura interna de la célula. Como se emplea una población de millones de células, la fragilidad osmótica sigue la distribución de una curva normal. El objetivo de esta práctica, es conocer la fragilidad osmótica de los eritrocitos frente a diferentes efectos físicos y químicos; como la temperatura y el pH; en concentraciones decrecientes de NaCl. II.
MARCO TEÓRICO Eritrocitos Los eritrocitos son células sanguíneas anucleadas que miden aproximadamente 8 μm de diámetro (así, unos 3000 eritrocitos en fila ocupan 2,5 cm de longitud) y tienen forma de disco bicóncavo. La membrana del eritrocito en un complejo de lípidos y proteínas (bicapa lipídica), el cual es importante para mantener la elasticidad celular y la permeabilidad selectiva. Los eritrocitos pueden deformarse, sin llegar a lesionarse para poder pasar por los más estrechos capilares. Este grado de deformidad o elasticidad influye en la rapidez del flujo sanguíneo por la microcirculación. Los eritrocitos son los elementos celulares más abundantes de la sangre. En el varón adulto existen alrededor de 5.500.000 por cc de sangre, y en las mujeres unos 4.800.000 por cc. Un eritrocito contiene 200 a 300 millones de moléculas de Hemoglobina (Hb). La Hb consiste en la combinación de una molécula proteica de globina, con cuatro moléculas de un compuesto pigmentado llamado grupo hemo. Cada molécula de hemo posee un átomo de hierro en su centro (Fe2+), por lo que, una molécula de Hb puede transportar hasta cuatro moléculas de oxígeno y formar oxihemoglobina por medio de una reacción reversible. La Hb también puede combinarse con dióxido de carbono para formar carboxihemoglobina, también por una reacción reversible. El CO2 se une a la porción globina de la molécula de Hb. En un varón adulto normal, 100 cc de sangre contienen 14 a 16 g de Hb; la sangre de una mujer contiene de 12 a 14 g de Hb por 100 cc. El proceso de formación de eritrocitos se denomina eritropoyesis. La vida promedio de un eritrocito circulante en el torrente circulatorio es de unos 120 días. Se fragmentan en los capilares y son fagocitados
por las células retículo-endoteliales de la cubierta de los vasos sanguíneos en hígado, bazo y médula ósea. En condiciones fisiológicas, los eritrocitos se encuentran en equilibrio osmótico con la sangre que los contiene (valor de osmolaridad del plasma sanguíneo: 290 ± 10 mOsm/L), por lo cual se dice que la sangre es una solución isosmótica e isotónica. Si la osmolaridad del plasma llega a disminuir significativamente (plasma hipotónico), el agua como líquido, entra al interior celular aumentando su volumen. Si por el contrario, la osmolaridad del plasma se incrementa, este se torna hipertónico y el agua sale del eritrocito ocurriendo una reducción del volumen celular. La forma y el volumen de los eritrocitos cambian cuando varía la cantidad de agua contenida en su interior, pudiendo tomar una forma estrellada o irregular al ocurrir pérdida de volumen (fenómeno de crenación) o bien aumentar su volumen hasta adquirir la forma de una esfera. Cuando la célula no puede resistir la carga de agua que recibe, la membrana se rompe (fenómeno de hemólisis) y se libera la hemoglobina la cual puede ser cuantificada por métodos espectrofotométricos. La hemólisis es un proceso que ocurre en una población mixta de células por lo que no ocurre en un solo punto y a la misma velocidad en todos los casos. Como el efecto final es un tanto difícil de apreciar experimentalmente, debido a que la hemólisis ocurre en forma que se hace asintótica al 100 % (curva aplanada), se prefiere analizar el tiempo de hemólisis al alcanzar el 50%. Membrana del Glóbulo Rojo La membrana del glóbulo rojo es la responsable de las propiedades mecánicas y de la mayoría de las funciones fisiológicas de la célula. Está formada por una bicapa lipídica plana, donde predominan en el 80 % los fosfolípidos y el colesterol y en menor medida los glicolípidos y aminofosfolípidos, distribuidos asimétricamente. De igual forma, se encuentran embebidas parcial o totalmente en ella las proteínas integrales de membrana, unidas fuertemente por enlaces apolares. Su libre desplazamiento a través de esta bicapa contribuye a mantener su fluidez. Las proteínas periféricas interactúan entre sí para formar una malla o enrejado que recubre la cara interior de la doble capa de fosfolípidos y son las responsables de la estabilidad y las propiedades viscoelásticas de la membrana. Entre estas proteínas se destacan la espectrina (Sp), la ankirina (banda 2.1, 2.2, 2.3 y 2.6), la banda 4.1, la banda 4.2, la banda 4.9, la aducina, la
tropomiosina y la banda 7. Otras proteínas periféricas se disponen hacia la cara exterior de la bicapa lipídica y ellas son fundamentalmente antígenos de grupo sanguíneo (fig.1).
Fig. 1. Estructura de la membrana eritrocitaria. La banda 3 representa el 25 % del total de las proteínas integrales. Está constituida por 2 dominios estructurales: el dominio citoplasmático, que es el encargado de la unión con las proteínas del esqueleto, y el sitio transmembranoso que mantiene el contacto con el medio extra e intracelular, proporcionando los canales responsables del transporte de iones bicarbonato (HCO3-) y cloruros (CI-). Además, posee un sitio de glicosilación capaz de unir antígenos para el grupo sanguíneo I/i e interviene activamente en la eliminación de eritrocitos envejecidos. Las glicoforinas son un grupo de proteínas integrales caracterizadas por su elevado contenido en ácido siálico. Las glicoforinas A,B,C y D son las más importantes y constituyen los sustratos antigénicos de los diferentes grupos sanguíneos. La glicoforina C contribuye a la estabilidad de la membrana gracias a su interacción con proteínas periféricas, además de participar en el intercambio iónico transmembranoso. La Sp es la proteína más abundante y además la principal responsable del mantenimiento del enrejado proteico. Está compuesta por 2 subunidades a y b enrolladas de forma antiparalela, las que se unen por sus extremos para formar tetrámeros. Estas 2 subunidades están constituidas por secuencias repetitivas de 106 aminoácidos, las que se enlazan para formar una triple hélice (fig.2).
Fig.2. Estructura del tetrámero de espectrina (Sp). Se observa la triple hélice de las unidades repetitivas, los sitios de autoasociación de la Sp y los sitios de nucleación donde comienza la interacción lateral entre las cadenas a y b de la Sp. La ankirina (ANK) está compuesta por 3 subunidades estructurales correspondientes a 3 dominios funcionalmente diferentes: regulador, de unión a la membrana y de unión a la Sp. Su contribución a la integridad de la membrana es decisiva, ya que constituye un importante punto de anclaje a la doble capa lipídica a través de la banda 3.1 La actina es una proteína organizada en forma de protofilamentos helicoidales estabilizados por la interacción con la Sp, la proteína 4.1 y la tropomiosina. Otra de las proteínas que integran el citoesqueleto es la proteína 4.1, cuya función fundamental es estabilizar la unión espectrina-actina y contribuir a fijar el esqueleto a la bicapa lipídica. El mantenimiento de la forma y estabilidad de la también responsabilidad de otras proteínas. Entre proteína 4.2, que actúa como modulador para interacción ankirina-banda 3. La banda 4.9, la tropomiosina, protegen la estabilidad de la actina.
membrana ellas está estabilizar aducina y
es la la la
III.
MATERIALES:
Tubos de ensayo. Rejilla. Estufa para Baño María. Termómetro. Micropipeta y Propipeta. Pipetas graduadas. Agua destilada. Solución salínica amortiguadora (fosfato salino) a pH 7,4 de NaCl al 1% Solución anticoagulante de ethylen diamine tetra-acético 0,1% Buffer a pH 5,6; 7,4 y 8,9. Muestra Biológica: Sangre de Caballo.
IV.
METODOLOGÍA:
Experimento Nº1: Fragilidad Osmótica Para cada muestra sanguínea realizar el siguiente esquema de evaluación: Reactivos Concentración de NaCl % Sol. Fosfato salino (NaCl 1%) pH 7,4 mL Agua destilada mL Sangre total con EDTA mL.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
0,00
0,10
0,35
0,45
0,5
0,55
0,6
0,7
0,85
0,00
0,1
0,35
0,45
0,5
0,55
0,6
0,7
0,85
1
0,9
0,65
0,55
0,5
0,45
0,4
0,3
0,15
0,01
0,01
0,01
0,01
0,01
0,01
0,01
0,01
0,01
Mezclar suavemente y dejar reposar a temperatura ambiente 30 minutos. Mezclar y centrifugar a 2000rpm/ 5 min. Leer en espectrofotómetro a 530 nm usando el tubo 9 como blanco (0% de hemólisis). Haga una gráfica de los valores de hemólisis en % contra la concentración de NaCl.
Experimento Nº2: Efecto de la temperatura sobre la fragilidad osmótica Reactivos Concentración de NaCl % Sol. Fosfato salino (NaCl 1%) pH 7,4 mL Agua destilada mL Sangre total con EDTA mL. Mezcla e incubar a Cº/30 min.
1
2
3
4
5
0,00
0,85
0,85
0,85
0,85
0,00
0,85
0,85
0,85
0,85
1
0,15
0,15
0,15
0,15
0,01
0,01
0,01
0,01
0,01
ambiente
Sobre hielo
ambiente
37º
45º
Mezclar y centrifugar a 2000rpm/ 5 min. Leer el sobrenadante en espectrofotómetro a 530 nm. Usar agua destilada como blanco. Expresar el resultado como el porcentaje de hemólisis a cada valor de temperatura de incubación. Se calcula utilizando el valor de la absorbancia del sobrenadante del tubo donde ocurre la máxima hemòlisis como el 100%.
Experimento N°3: Efecto del pH sobre la fragilidad osmótica Reactivos Concentración de NaCl % pH Sol. Fosfato salino (NaCl 1%) mL Agua destilada mL Sangre total con EDTA mL.
1
2
3
4
0,00
0,85
0,85
0,85
5,6
7,4
8,9
0,00
4,25
4,25
4,25
1
0,15
0,15
0,15
0,01
0,01
0,01
0,01
Mezclar suavemente y dejar reposar a temperatura ambiente 30 minutos. Mezclar y centrifugar a 2000rpm/ 5 min. Leer el sobrenadante en espectrofotómetro a 530 nm. Usar agua destilada como blanco. Expresar el resultado como el porcentaje de hemólisis a cada valor de pH. Se calcula utilizando el valor de absorbancia del sobrenadante, del tubo donde ocurre la máxima hemólisis como el 100%.
RESULTADOS Cálculos Experimento Nº1: Fragilidad Osmótica
TUBO
ABSORBANCIA
1 2 3 4 5 6 7 8
0.737 0.715 0.541 0.462 0.251 0.211 0.152 0.065
Concentracion NaCl 0 0.1 0.35 0.45 0.5 0.55 0.6 0.7
% Hemólisis 100 97.01 73.41 62.69 34.06 28.63 20.62 8.82
9 0 0.85 0 Tabla 1.- Lectura de las absorbancias en el espectrofotómetro a 530nm
Experimento Nº1: Fragilidad Osmótica 120 100 80
%hemolisis
V.
60 % Hemolisis
40 20 0 0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
Concentración de NaCl Cuadro 1.- Gráfico de la concentración de NaCl respecto al porcentaje de hemolisis obtenido
Experimento Nº2: Efecto de la temperatura sobre la fragilidad osmótica TUBO
ABSORBANCIA
1
0.56
2
0.482
3
0.588
4 5
0.661 0.595
Efecto de Tº Ambiente (sin Sol. Salina) Hielo Ambiente (con Sol. Salina) 37º 45º
% Hemólisis 84.72 72.92 88.96 100 90.02
Tabla 2.- Lectura de las absorbancias en el espectrofotómetro a 530nm con relación al efecto de temperatura y porcentaje de hemolisis.
Cuadro Nº 2: Experimento Nº 2: Efecto de la temperatura sobre la fragilidad osmótica; el porcentaje de hemólisis en relación al efecto de la temperatura.
Experimento N°3: Efecto del pH sobre la fragilidad osmótica TUBO 1 2 3 4
ABSORBANCIA 1 0.043 0.166 0.219
Efecto del pH 0 5.6 7.4 8.9
% Hemólisis ----------19.63 75.8 100
Tabla 3.- Lectura de las absorbancias en el espectrofotómetro a 530nm con relación al efecto del pH y porcentaje de hemolisis.
Cuadro Nº 3: Efecto del pH sobre la fragilidad osmótica; el % de hemólisis en relación al pH.
Cuestionario 1. ¿Una solución salina que es isotónica para eritrocitos es necesariamente isotónica para otro tipo de células? El paso del agua hacia dentro o fuera de las células es un proceso biológico de importancia. Si las concentraciones mol/L de solutos en ambos lados de la membrana celular son las mismas, la presión osmótica es igual y las soluciones son isotónicas sin que haya paso neto de líquido en ningún sentido. Por lo tanto una solución salina para eritrocitos o cualquier otra célula, es la misma. La concentración de solutos en la sangre es isotónica con una solución de 0,9% de cloruro de sodio. La concentración de cloruro de sodio 0,85< 0,9%, se llama solución salina normal o fisiológica o “suero fisiológico”. 2. ¿Cuáles son las causas de la hipernatremia? El exceso de sodio en la sangre puede ser ocasionado por ciertas condiciones. Las causas específicas de la hipernatremia incluyen:
Deshidratación o pérdida de fluidos corporales por vómitos prolongados, diarrea, sudoración o fiebre alta. Deshidratación por no beber la cantidad suficiente de agua. Fármacos tales como esteroides, regaliz y ciertos medicamentos para disminuir la presión sanguínea. Ciertas enfermedades endocrinológicas como diabetes (cuando la orina es muy frecuente) o aldosteronismo. Ingestión excesiva de sal. Hiperventilación (respiración demasiado rápida).
En todos los casos, la hipernatremia y por lo tanto la hipertonicidad plasmática, induce la salida de agua del espacio celular al extracelular, lo que produce disminución del volumen celular. La disminución del volumen neuronal se manifiesta clínicamente por síntomas neurológicos: letargia, reflejos hiperactivos, temblor muscular, convulsiones y coma. Con frecuencia, sobre todo en personas ancianas, se producen trombosis de los senos venosos craneales, y, al disminuir el tamaño del cerebro, hemorragias cerebrales por tracción de las
estructuras vasculares. La salida del agua celular al espacio extracelular tiende a preservar la volemia, por lo que al principio no son aparentes los síntomas y signos de hipovolemia, que pueden aparecer, hasta la situación de shock, en fases avanzadas. 3. ¿Cómo se comportaría el eritrocito en un estado de hipernatremia? Cuando sobreviene la hipernatremia, todas las células del organismo se reducen en tamaño, que es proporcional al grado de reducción del volumen celular; sin embargo, los mecanismos regulatorios internos permiten restaurar, en muchas células, su volumen casi normal. Los eritrocitos y las neuronas tienen esta habilidad para regular su volumen. Una vez que han pasado más de 48 horas de hipernatremia; es decir, el inicio de considerarse crónica, tendrá un volumen normal a expensas del contenido de solutos intracelular aumentado. En ese momento, rápidamente se restaura la osmolaridad que originará una “hinchazón” celular, lo que en la mayor parte de los órganos del cuerpo no tendrá mayor consecuencia; sin embargo, en el cerebro es devastadora, pues aparecen: edema cerebral, herniación y la muerte. De ahí la importancia del tratamiento cauteloso en la hipernatremia crónica.
VI.
CONCLUSIONES A menor concentración de NaCl se incrementa el porcentaje de hemolisis, debido a que ingresa agua al eritrocito liberando hemoglobina. La variación del porcentaje de hemolisis influye directamente con la lectura de las absorbancias. En un ambiente salino se produce mayor cantidad de hemolisis comparado con un ambiente normal. La temperatura del hielo obtiene la menor hemolisis debido a que conserva a los eritrocitos sin ningún cambio y por consiguiente no hay liberación de hemoglobina.
VII.
DISCUSIONES Para ésta evaluación tomamos en cuenta que los resultados obtenidos son de una especie de caballo sana y joven. Los efectos de temperatura, salinidad y pH frente a una muestra de sangre se ven influenciada de acuerdo a las condiciones inmunológicas del animal (Forchetti, 2006). Los márgenes de error para nuestros resultados se obtuvieron en las lecturas de las absorbancias, para i) la temperatura: sabemos que la temperatura fisiológica es 37ºC y el porcentaje de hemolisis debe ser mínimo o nulo; sin embargo en los resultados obtenidos no se coincide esta afirmación; ii) el pH: de la misma forma, sabemos que el pH fisiológico es 7,4 y su hemolisis debe ser mínima; pero nuestras lecturas nos indican lo distinto comparadas con lo normal (Chihuailaf, 2006).
VIII.
REFERENCIAS BILIOGRÁFICAS
Granados J, Fragilidad osmótica de los eritrocitos de carnero en relación con su uso en el laboratorio clínico, Hospital de San Juan de Dios, Costa Rica, 1993.
Hariharan S.: Nutrition of laboratory animals. LAIS Centre News 1984; 12: 2- 35.
Lovelock J, La hemolisis de células sanguíneas por congelación y descongelación, Instituto Nacional para la investigación médica, Londres – Inglaterra, 1953.
Zou CG, Haemolisis of human and sheep redblood cells in glycerol media: the effect of pH and the role of band 3. School of biological science. Inglaterra. 2000.
Forchetti, O.; Maffrand C.; Vissio C.; Boaglio C.; Cufré G.. Hipofosfatemia y fragilidad osmótica eritrocitica en cabras. Revista Electrónica de Veterinaria, Vol. VII, nº 01, Enero/2006
Chihuailaf R H . Variaciones de la Fragilidad Osmótica Eritrocitaria en Bovinos a Pastoreo sobre praderas con bajo contenido de Selinio y Suplementados o no con Selenio, Instituto de Ciencias Clínicas Veterinarias. Chile, 2006
http://scielo.sld.cu/scielo.php?pid=S08642892002000100001&script =sci_arttext
