Isolasi RNA RNA, terutama mRNA merupakan materi genetik yang mengkode suatu protein. Jumlah populasi mRNA akan lebih banyak dibanding dengan DNA. mRNA eukariot dapat dipisahkan dari DNA dengan menggunakan oligonukleotida dT. Atau RNA total juga dapat di isolasi dari sel dengan menambahkan enzim DNase yang berfungsi untuk mendegradasi DNA Ekstraksi DNA dari organisme eukaryote (manusia, hewan dan tumbuhan) dilakukan melalui proses penghancuran dinding sel (lysis of cell walls), penghilangan protein dan RNA (cell digestion) dan pengendapan DNA (precipitation of DNA) dan pemanenan. Berbagai teknik ekstraksi DNA telah dikembangkan dari prinsip dasar tersebut, sehingga saat ini muncul berbagai teknik ekstraksi dan purifikasi DNA. Prinsip dasar ekstraksi DNA adalah serangkaian proses untuk memisahkan DNA dari komponen-komponen sel lainnya. Hasil ekstraksi tersebut merupakan tahapan penting untuk langkah berikutnya. Oleh sebab itu dalam pelaksanaannya harus dilakukan dengan baik dan bebas kontaminasi. Secara kimiawi penghancuran sel dilakukan dengan memanfaatkan senyawa kimia seperti EDTA (ethyllenediamine tetraacetic), dan SDS (Sodium Dodecyl Sulfate). EDTA berfungsi sebagai perusak sel dengan cara mengikat ion magnesium (ion ini berfungsi untuk mempertahankan integritas sel maupun mempertahankan aktivitas enzim nuclease yang merusak asam nukleat). SDS merupakan sejenis deterjen yang berfungsi merusak membrane sel. Enzim proteinase K dapat digunakan untuk menghancurkan protein. Kotoran akibat lisis sel dipisahkan dengan cara sentrifugasi. Kemudian molekul nuleotida (DNA dan RNA) yang telah dipisahkan dibersihkan dari protein yang masih ada dengan menggunakan phenol. Dalam proses ini sebagian kecil RNA juga dapat dibersihkan. Sedangkan choloform digunakan untuk membersihkan sisa-sisa protein dan polisakarida dari larutan. Enzim RNAase digunakan untuk menghancurkan RNA sehingga DNA dapat diisolasi secara utuh. Pemurnian atau purifikasi DNA dapat dilakukan dengan mencampur larutan DNA tersebut dengan NaCl yang berfungsi memekatkan, memisahkan DNA dari larutan, dan mengendapkan DNA sewaktu dicampur dengan ethanol. Proses sentrifugasi dengan kecepatan tinggi akan mengendapkan tepung berwarna putih (DNA) dan menempel di dasar tabung ependorf. Pada manusia, hanya sel darah putih yang mempunyai inti dan mengandung DNA. Agar lebih efisien, isolasi DNA dilakukan hanya terhadap sel darah putih. Oleh sebab itu sampel darah total (whole blood) yang masih segar langsung dipisahkan menjadi serum, sel darah merah dan sel darah putih (dilapisan buffy coat) dengan teknik sentrifugasi. Setelah disentrifugasi, sampel darah total akan terbagi menjadi tiga lapisan, yaitu lapisan paling atas merupakan serum, lapisan tengah berwarna putih tipis adalah sel darah putih (buffy coat) dan lapisan bawah adalah sel darah merah. Lapisan kedua yang merupakan sel darah putih diambil dengan klinipette. Sintesis rna dlm sel
Enzim yang diperlukan dalam transkripsi DNA menjadi RNA adalah RNA polymerase. Reaksi enzimatik tersebut menghasilkan polimerase RNA dan ribonukleotida. Sekuen nukleotida pada DNA merupakan templat atau cetakan untuk membuat sekuen nukleotida pada RNA. RNA polimerase ada yang tidak membutuhkan templat atau cetakan seperti poli (A) polimerase yang penting dalam ekspresi gen. Penambahan nukleotida pada saat sintesis RNA mengikuti aturan pasangan basa: A berpasangan dengan U; G berpasangan dengan C. Setiap penambahan satu
nukleotida, ß- d an γ-fosfat dihilangkan dari nukleotida yang baru datang, dan gugus hidroksil dihilangkan dari ujung 3-karbon pada nukleotida, sama seperti polimerisasi DNA. RNA polimerase merupakan komponen pusat dari kompleks inisiasi transkripsi. Setiap kali suatu gen di transkrip, suatu kompleks baru digabungkan segera pada daerah upstream dari gen. Kompleks inisiasi disusun pada posisi yang sesuai dan tidak pada sembarang tempat di genom karena lokasi target ditandai dengan sekuen nukleotida khusus yang disebut promotor yang hanya terdapat di daerah upstream dari gen. Promotor bakteria dapat langsung dikenali oleh enzim RNA polimerase, tetapi pada eukariot dan archaea suatu protein intermediet yang mengikat ke DNA diperlukan dan membentuk platform tempat RNA polimerase mengikat. Pemrosesan prekursor RNA Kebanyakan RNA, terutama pada eukariot, awalnya disintesis sebagai prekursor atau premRNA yang harus diproses sebelum bisa menjalankan fungsinya. Berikut ini adalah garis besar pemrosesan pre-RNA. Modifikasi akhir terjadi selama sintesis mRNA eukariot dan archaea yang umumnya dengan penambahan nukleotida pada ujung 5′ yang disebut cap dan ekor poli A pada ujung 3′. Keduanya terlibat dalam penggabungan kompleks inisiasi translasi dari mRNA ini. Splicing adalah penghilangan intron dari prekursor RNA. Banyak gen-gen pengkode protein pada eukariot mengandung intron dan intron ini dikopi saat gen di transkrip. Intron dihilangkan dari pre-mRNA dengan reaksi pemotongan dan penggabungan. Pre-mRNA yang tidak mengalami penghilangan intron membentuk fraksi RNA nuklear yang disebut heterogenous nuclear RNA (hnRNA). Beberapa pre-rRNA dan pre-tRNA eukariot juga mengandung intron, sama seperti transkrip pada archaea, tetapi hal tersebut jarang terdapat pada bakteri. Pemotongan merupakan peristiwa yang penting dalam pemrosesan rRNA dan tRNA. Kebanyakan diantaranya awalnya disintesis dari unit transkripsi yang mengkhususkan diri pada lebih dari satu molekul. Oleh karena itu, pre-rRNA dan pre-tRNA harus dipotong kecil-kecil untuk menghasilkan RNA yang matang. Tipe pemrosesan ini terdapat baik pada prokariot maupun eukariot. Modifikasi kimia dilakukan pada rRNA, tRNA, dan mRNA. rRNA dan tRNA pada semua organisme dimodifikasi dengan penambahan gugus kimia baru yang ditambahkan ke nukleotida tertentu dalam setiap RNA. Modifikasi kimia mRNA disebut RNA-editing, seperti yang terlihat pada bermacam-macam eukariot. Pemrosesan mRNA emmpunyai pengaruh yang penting pada komposisi transkriptom. RNA editing, sebagai contoh, dapat menghasilkan suatu pre-mRNA tunggal yang diubah menjadi dua mRNA berbeda yang mengkode protein yang sangat berbeda. Peristiwa itu nampaknya tidak umum, tetapi splicing alternatif, dimana satu pre-mRNA menghasilkan dua atau lebih mRNA dengan cara penggabungan exon dengan kombinasi yang berbeda sangat umum terjadi. Dengan mekanisme ini, jumlah gen yang sedikit bisa menghasilkan protein yang lebih banyak.
Bab I Ekstraksi Asam Nukleat
A. Pendahuluan
Tujuan dari ekstraksi atau isolasi Asam nukleat adalah memisahkan asam nukleat dari komponen sel lainnya, sehingga dapat dianalisis dan dimodifikasi dengan teknik biologi molekuler lainnya. Jika akan mengisolasi dari jaringan dan organ langkah pertama yang dilakukan adalah homogenisasi jaringan, untuk meningkatkan jumlah sel yang akan dilisiskan. Langkah selanjutnya adalah permeabilisasi jaringan dengan detergen non-ionik, sehingga tidak mengikat asam nukleat, (Tween, SDS,nonidhet, laureth, dan triton). Kemudian lisiskan sel untuk mengeluarkan asam nukleat d engan buffer hipotonik. Langkah selanjutnya adalah degradasi dan presipitasi protein (pemanasan, enzim proteinase, dan garam chaotropic). Asam nukleat dapat dipresipitasi untuk dikonsentrasikan ke dalam v olume yang lebih kecil. Presipitat yang dapat digunakan PEG,isopropanol,ethanol,alkohol (FENOL TIDAK BISA). Kemudian masuk tahap pencucian dan solubilisasi asam nukleat. Metode ekstraksi/isolasi asam nukleat dengan fenol/isoamilalkohol,khlrofom. Lap.air berisi asam nukleat, lap. Antara air dan fenol (protein penghambat dan polimer seperti karbohidrat), lap. Anatara isoamilalkohol dan khlorofom berisi lemak. Lakukan pencucian dengan alkohol 70% kemudian alkohol 100%. Buang sisa fenol dan garam. Limbah fenol/isoamilalkohol/khlorofom adalah toksik.
B. Ekstraksi DNA dan C. Ekstraksi RNA
Metode melisiskan sel tetapi tidak memfragmentasi DNA. Pakai EDTA → mengikat ion Mg (Kofaktor DNase). Jika ada dinding sel, lisiskan pake enzim (lisozim→bakteri, litikase→jamur) Selanjutnya membran sel sebaiknya disolubilisasi dengan detergen. Jika proses disrupsi 0 fisik dibutuhkan lakukan pada suhu 4 C, atau pada larutan yang telah di autoclave (autoclave→menonaktifkan DNase). Guanidine (HCl) atau SCN (thiosianat) dan proteinase K untuk melisiskan sel dan menonaktifkan Dnase dan Rnase. Urea dan triton X100 untuk mendenaturasi protein k omponen sel. Setelah asam nukleat lepas dari sel, RNA dihilangkan dengan Rnase (RNA stabil thdp pemanasan→renaturisasi ketika pendinginan). Agen chaotropic → GuSCN,NaI,LiCl →menghancurkan kapsul lemak dan merusak integritas sel, denaturasi protein, dan menginaktivasi nuklease. Konsentrasi tinggi garam chaotropic + pH asam→ meningkatkan absorbsi asam nukleat pada matriks silika, sdgkan lemak dan protein kontaminan tidak terikat krn afinitasx moderat. Konsentrasi garam rendah+pH tinggi→melepaskan asam nukleat dari matriks silika. Matrik silika→komersil→dlam bentuk seperti filter ( spin column), gel ( glassmilk, silika gel ), suspensi (celite,plain-coarse silicate), partikel berselubung magnetik ( Dynabeads). CsCl dng density gradient centrifugation→isolat DNA dengan kemurnian tinggi. Elektroforesis gel agarose atau spektophotometer UV→mengetahui integritas DNA.
DNA untai ganda (+) koefisien absorpsi 0,027, DNA untai tunggal (+) 0,02, dan RNA 0,025 µg/ml/cm pada panjang gelombang 260nm. Rasio absorpsi 260/280 nm. Kontaminasi protein→>280nm. Sampel DNA murni (+) rasio 260/280nm→1,8-1,9 Sampel RNA murni (+) 1,9-2,0 <1,8→ketidakmurnian signifikan pada sampel. Kalibrasi terlebih dahulu dengan blank→pelarut yang digunakan untuk melarutkan asam nukleat yang diperiksa. Metode ekstraksi RNA mirip dengan DNA, ttp RNA lebh pendek , dan lebih sulit rusak→disrupsi sel dapat dilakukan lebih agresif. RNA mudah didigesti dengan Rnase. Proses deproteinisasi>agresif→RNA sering berikatan dengan protein. Penambahan DNase→hilangkan DNA. Presipitasi RNA dng→etanol. GuSCN→reagen yang sering digunakan krn merupakan inhibitor kuat Rnase. RNase relatif stabil thdp denaturasi dng pemanasan dan ekstraksi fenol. Aktivitas nuklease selama proses ekstraksi dpt dihambat dengan: o o Suhu dibawah suhu optimum nuklease 37 C (msl 4 C) o Inaktivasi nuklease pada larutan sisa dan permukaan gelas dng DEPC o Penghilangan ion2 kofaktor dng chelating agent. o Inaktivasi atau penghambatan dng fenol atau garam guanidium. o Untuk mengisolasi mRNA yang hanya 2-5% dari RNA total, digunakan oligo(dT)selulosa yang akan mengikat poly-A pada mRNA pada konsentrasi garam tinggi. RNA lain yang tidak berikatan dicuci, dan mRNA dilepaskan dari oligo(dT)-selulosa pada konsentrasi garam rendah. o o DNA dapat disimpan dalam bentuk aliquot dalam -20 C atau -70 C untuk menghindari kerusakan akibat freeze-thawing. o Penyimpanan DNA pada 4 C→beberapa bulan saja. DNA dilarutkan dalam air→kualitas memburuk (DNA bersifat asam lemah dalam air, untuk mengatasinya dilarutkan dalam buffer TE (tris-EDTA). o Penggunaan waktu lama dalam nitrogen cair -196 C.
BAB II PCR A. Prinsip dasar PCR
Perlu DNA (sebagai cetakan), primer (oligonukleotida yang akan mengkomplementari sekuens DNA), dNTPs (blok pembangun asam n ukleat), dan enzim polimerase DNA. DNA untuk PCR jk tidak murni→masalah reproduksibilitasnya. DNA harus bebas dari nuklease, endo-ekso proteinase, dan DNA binding protein. Untuk RNA→ubah dulu jadi DNA komplemennya. Reverse transkiption PCR (RT-PCR).
Primer (sangat menentukan keberhasilan PCR)→baik efektif dan efisien. Yng gratis MEDUSA, Primer3, PrimerQuest,dll. Primer yang baik: Panjang primer 18-30 nukleotida (kecuali utk tujuan tertentu) o Sekuensx tidak mengandung komplementari internal o Dalam sepasang primer tidak ada yang berkomplementari o Tidak ada struktur sekunder. o GC:AT→seimbang. o Pilih daerah yang stabil untuk diamplifikasi o o Perbedaan suhu annealing sepasang primer jangan lebih dari 5 C. o dNTPs sebagai pembangun komplek asam nukleat terdiri dari dATPs,dGTPs, dCTPs,dan dTTPs. Enzim DNA polimerase→ memiliki aktivitas proofreading mislx, yang melakukan proofreading dari 5’-3’→TTH94, tfl, AmpliTaq. Bufer reaksi PCR (1) co-solvent→menstabilisasi enzim dan atau DNA melting temperature (TM), (2) ion Mg→kofaktor aktivitas polimerase DNA thermostabil, (3) ion 4+ + + monovalen→NH , K , dan Na → menstimulasi kerja DNA polimerase, melindungi muatan negatif pada gugus posfat DNA sehingga primer akan menempel. Reaksi PCR: Denaturasi (melting)→memisahkan double strand DNA jadi single strand (dengan o pemanasan) Annealing (hibridisasi)→melekatnya primer pada strand DNA o Elongasi→proses amplifikasi oleh primer dari 5’-3’ o Tahapan PCR: (1) tahap awal, (2) eksponen sial, (3) Plateau. Visualisasi produk PCR→ mengecat DNA untai ganda dengan dari ion perak dan pewarna kimia yang mampu berinterkalasi diantara untai ganda DNA, mengecat primer atau dNTPs dengan flouresen atau hapten sebelum amplifikasi PCR. Positif palsu→ primer tidak cukup selektif, suhu annealing primer terlalu rendah, terlalu banyak siklus PCR. Ruangan bertekanan tinggi (agar tidak ada kontaminan dari luar yang masuk)→ berhubungan denga persiapan PCR (pengolahan spesimen, persiapan reaksi PCR, dan sintesis primer). Ruangan bertekanan rendah (mencegah keluarnya aerosol yang terkontaminasi poduk PCR ke luar ruangan)→tahapan thermocycling PCR, elektroforesis gel. Untuk langkah pencegahan kontaminasi→spesimen klinis, reaksi PCR, primer, dan asam nukleat disentrifugasi dahulu sebelum dibuka→mengurangi kontaminasi aerosol ktk tutup dibuka. Permukaan meja dibersihkan dengan 1 N HCl secara teratur atau menggunakan sinar UV atau radiasi sinar gamma selama satu malam→menghancurkan kontaminasi a erosol. Pembagian ruang laboratorium PCR: Ruangan bersih→pembuatan reaksi PCR (hanya bufer dan enzim untuk reaksi o PCR dan primerdan alat penunjangnya), spesimen, asam nukleat, produk PCR, plasmid, dan semua alt yang berhubungan dengan yang td disebutkan tidak boleh ada. Ruangan penerimaan sampel dan atau isolassi asam nukleat→plasmid dan produk o PCR tidak boleh ada (ruangan bersih ke-2)
o
o
Ruangan PCR→tempat alat PCR berada, tidak ada manipulasi apapun thdp sampel PCR. Ruangan paska PCR→dilakukan analisis produk PCR, elektroforesis gel (resiko kontaminasi aerosol dan atau debu tinggi). BAB III Elektroforesis gel
Adalah perpidahan molekul sebagai respon terhadap medan listrik. Dipengaruhi oleh: kekuatan medan listrik, muatan listrik, ukuran dan bentuk molekul, kekuatan ionik, viskositas, dan suhu medium yang digunakan oleh molekul tesbt utk berpindah. Medium yang digunakan: agarose dan poliakrilamid. Agarose→memisahkan molekul berukuran >100bp Akrilamid→memisahkan fragmen DNA pendek <100bp. DNA bermuatan negatif→bergerak dari katoda (-) ke anoda (+) Jenis bufer yang digunakan berpengaruh thdp resolusi pergerakan DNA Bufer TAE (tris-Acetate-EDTA)→baik utk fragmen DNA>4kb TBE (tris-borate-EDTA)→baik utk fragmen DNA 0,1-3kb. Untuk DNA biasanya agarose horizontal Elektroforesis protein biasanya menggunakan poliakrilamid (akrilamid dan bisakrilamid), konsentrasi total akrilamid mempengaruhi pergerakan. Metode SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulphate Polyacrylamid Gel Elektr ophoresis)→ memisahkan molekul protein berdasarkan berat molekul Metode IEF (Isoelectric Focusing)→memisahkan molekul protein berdasarkan isoelektriknya. Gel protein dibuat terdenaturasi oleh SDS (sodium dodec yl sulphate)→yang menyebabkan protein terdenaturasi oleh panas. SDS berikatan hidrofobik dengan protein sesuai ukuran proteinnya. Adanya muatan alami dari SDS membuat protein bermigrasi. Visualisasi DNA→flourescent intercalacting dye EtBr (warna merah atau orange flouresen ketika diiluminasi dengan UV), SYBRGreen atau Gelstar. Untuk protein→Coomassie brilliant blue atau teknik pengecata perak DNA maker→Campuran fragmen DNA yang telah diketahui massa molekulnya Untuk Protein→campuran protein murni yang telah diketahui massa molekulnya
BAB V Pengenalan enzim restriksi
Enzim yang digunakan bakteri untuk melindungi diri dari infeksi DNA asing Enzim EcoR1→memotong sekuens 5’-G_AATTC-3’ Untuk melindung DNA dalam selnya, bakteri menghasilkan enzim metilase yang memetilase basa A kedua dalam urutan sekuens tersebut (GAATTC)
Enzim endonuklease restriksi akan mendigest pada atau didekat segmen yang dikenali/ dimetilase oleh enzim metilase. Enzim endonuklease restriksi tidak akan mendigest pada sekuens yang telah dimetilase oleh enzim metilase. Enzim metilase dan endonuklease restriksi berperan dalam sistem imun bakteri. Kegunaan enzim endonuklease restriksi tergantung pada spesifitas dan frekuensi terjadinya pengenalan tempat pada sampel DNA. Alu1 spesifitasnya 4 nukleotida→A_GTC Not1 spesifitasnya 8 nukleotida→GC_GGCCGC Penggunaan enzim endonuklease restriksi→RFLP (Restriction Fragment Long Polymorphisms) sidik jari DNA, Kloning. Hidrolisis endonuklease adalah reksi spontan, tidak membutuhkan ATP. Yang paling menentukan dari aktivitas enzim en donuklease restriksi adalah konsentrasi ionik dalam bufer NaCl→low (20mM), medium (100mM), high (250mM)
6 Faktor Penting dalam Reverse Transcriptase PCR Thursday, March 25th, 2010 | 4 Comments Posted by yepyhardi RT PCR alias Reverse Transcriptase PCR adalah teknik yang digunakan untuk membuat cDNA (complementary DNA) dengan RNA sebagai template-nya. Proses ini adalah kebalikan dari transkripsi DNA menjadi RNA yang umum terjadi pada makhluk hidup, sehingga dinamakan reverse transcription (transkripsi terbalik). Di alam proses ini hanya terjadi pada virus-virus tertentu ketika menyusupkan materi genetiknya yang berupa RNA ke dalam genom ‘korbannya’. (Lihat kembali mengenai ‘Central Dogma in Molecular Biology‘).
HIV, salah satu virus yang memiliki enzim Reverse Transcriptase | Image from www.vircolab.com Catatan: Jangan keliru dengan istilah realtime PCR yang juga sering disingkat RT PCR. Yang kita bahas di sini adalah Reverse Transcriptase PCR. Untuk membedakan biasanya istilah realtime PCR diganti dengan quantitative PCR (qPCR). Di laboratorium, RT PCR umumnya dilakukan untuk menganalisa tingkat ekspresi genetik. Karena ekspresi setiap gen berbeda-beda, maka proses RT PCR harus dilakukan secara efisien dan tidak boleh melewatkan RNA dari gen yang tergolong ‘low copy’ dan sulit. Berikut ini adalah beberapa tips yang mungkin dapat membantu: Pemilihan primer RT
Ada 3 pilihan primer, oligo dT, random primer atau primer spesifik gen. Banyak orang menggunakan oligo dT karena mereka bisa mendapatkan salinan cDNA lengkap dari full mRNA. Akan tetapi, jika mRNA-nya panjang (>4 kb) atau tidak memiliki ekor poly A (mRNA prokar yota), maka pilihannya adalah random primer. Dengan random primer, ujung 5′ gen-gen yang panjang dapat ditranskripsi balik, tetapi cDNA yang diperoleh mungkin tidak full dari seluruh gen. Biasanya digunakan random primer 6-mers, tetapi 8 atau 9-mers dapat meningkatkan ukuran cDNA karena primernya akan terhibridisasi lebih jarang. Untuk aplikasi qPCR (quantitative PCR) gen-gen eukaryota, hasil terbaik bisa diperoleh dengan menggunakan kombinasi random primer panjang dan oligo dT.
Pilihan ketiga adalah primer spesifik gen yang dapat meningkatkan sensitivitas dengan mengarahkan seluruh aktifitas enzim RT untuk mentranskripsi balik hanya RNA tertentu saja. Jika yang kita lakukan adalah one-step RT PCR, primer spesifik gen digunakan karena primer RT juga nantinya digunakan sebagai primer reverse pada reaksi PCR-nya. Struktur Sekunder RNA
Struktur sekunder ini bisa jadi masalah dalam transkripsi balik RNA secara utuh. Ibarat menemui jalan buntu, enzim RT dapat berhenti ketika menemui struktur sekunder pada RNA-nya. Sulit memang memprediksi apakah RNA kita akan memiliki struktur sekunder, tapi biasanya kandungan GC yang tinggi bisa kita jadikan indikator bahwa RNA akan sulit untuk memisah dan mungkin tidak akan benar-benar menjadi utas tunggal sebelum reaksi. Untuk mengatasinya, bisa dengan melakukan denaturasi dulu pada suhu 65C selama 5 menit sebelum reaksi RT agar RNAnya dalam keadaan rileks. Pendekatan lainnya adalah dengan menggunakan enzim RT yang dapat bekerja pada suhu yang lebih tinggi dari RT standar. Ada juga enzim RT yang mampu menembus struktur sekunder RNA meski dilakukan pada suhu RT standar. Menyingkirkan gDNA
Kontaminasi DNA genom (gDNA) pada RNA merupakan salah satu penyebab terjadinya false positif saat reaksi PCR nantinya. Ada beberapa cara untuk menyingkirkan gDNA, misalnya pemberian DNase selama proses atau setelah isolasi RNA. Jika sample RNA diisolasi dari sel eukaryota, maka cara terbaik menghindari kontaminasi gDNA ketika PCR adalah dengan mendesain primer yang menyeberangi intron atau batas intron-exon. Seperti kita tahu bahwa mRNA pada eukaryota merupakan hasil transkripsi dari exon pada gDNA tanpa diseling-selingi lagi oleh intron-intron. Dengan cara ini tidak akan terjadi amplifikasi terhadap gDNA (atau setidaknya akan memiliki produk PCR yang berbeda ukurannya). Satu hal yang harus diwaspadai adalah pseudogene, yaitu salinan dari mRNA hasil splicing yang diinsersikan ke dalam genom. Primer yang didesain hanya untuk mRNA tadi tetap akan mengamplifikasi pseudogene ini. Untuk mRNA prokaryota masalah tidak akan selesai dengan primer yang didesain menyeberangi intron karena gDNA prokaryota tidak memiliki intron, sehingga penyingkiran gDNA ini amat krusial untuk keakuratan pengukuran ekspresi gen. Satu-satunya pilihan adalah reaksi enzimatik selama proses isolasi mRNA seperti yang diuraikan di atas. Harus dipastikan pula bahwa gDNA benar-benar tidak mengganggu amplifikasi, misalnya dengan buffer-buffer tertentu penghilang sisa-sisa DNA atau dengan mengamplifikasi (PCR) langsung RNA hasil isolasi tanpa melalui proses RT PCR. Jika amplifikasi PCR tetap terjadi berarti gDNA masih bercokol di situ. Memeriksa RNA Integrity
Kualitas RNA amat berpengaruh terhadap hasil sintesa cDNA. Variasi kua litas RNA dari batchke-batch dapat menyebabkan hasil yang tidak konsisten. Sebelum melakukan reaksi RT PCR, kita harus memeriksa kualitas band rRNA dengan melarikannya pada gel agarose dan memeriksanya secara visual. RNA eukaryota yang masih utuh (intact) ditunjukkan dengan adanya dua band rRNA 28s dan 18s yang jelas dengan intensitas pita 28s (lebih besar) kira-kira 2 kali intensitas pita 18s (lebih kecil). Jika intensitasnya sama pun masih bisa dianggap bagus. Jangan gunakan RNA yang memiliki smear tebal di sekitar pita rRNA apalagi pada ba gian bawah untuk reaksi RT PCR. Karena jika demikian sample RNA tersebut telah terdegradasi. Cara yang lebih akurat dan hemat sample adalah menggunakan Agilent BioAnalyzer untuk menentukan kualitas RNA secara lebih akurat. Selain menampilkan visualisasi pita-pita RNA dalam bentuk grafik, juga dapat menghitung RNA Integrity Number (RIN) secara kuantitatif. Skor RIN sempurna adalah 10, RIN 8 tetap OK, dan jika sudah di bawah 7 maka artinya sample RNA kita sudah terdegradasi dan akan menyebabkan hasil yang tidak konsisten. Cara ini memang lebih mahal tetapi hasil yang diberikan sangat akurat, terlebih jika sample RNA akan digunakan untuk analisa ekspresi seperti microarrays. Pengukuran Kuantitas RNA
Selain keutuhan RNA, kuantitas hasil isolasi RNA pun penting untuk diketahui. Akurasi hasil pengukuran dapat dipengaruhi beberapa faktor seperti akurasi instrumen yang digunakan, kontaminasi DNA, garam-garam, dan juga tingkat degradasi RNA. Untuk pengukuran kuantitas RNA, spektrofotometer Nanodrop adalah alat yang digemari karena kemudahan dan akurasinya, disamping itu jumlah sampel yang diperlukan hanya 1 uL saja sehingga sangat menghemat sampel RNA yang sangat berharga untuk penelitian selanjutnya. Kelemahan instrumen spektrofotometer UV untuk pengukuran RNA adalah bahwa DNA genom dan garam-garam yang mengkontaminasi akan terukur juga absorbansinya bersama dengan RNA sehingga akan menyebabkan false positive. Untuk itu dikembangkan suatu teknik pewarnaan spesifik RNA menggunakan Ribogreen, jadi yang diukur absorbansinya adalah Ribogreen yang terikat pada RNA sehingga hasil pengukuran akan lebih akurat. One Step RT-PCR atau Two Step RT-PCR ?
Pada one step RT-PCR, reaksi transkripsi balik untuk mengkonversi RNA menjadi c DNA dan reaksi PCR untuk mengamplifikasi gen tertentu yang ingin k ita ketahui ekspresinya dilakukan dalam satu rangkaian reaksi dan dalam satu tabung reaksi yang sama. Sedangkan pada two step RT-PCR, reaksi transkripsi balik dan reaksi PCR dilakukan secara te rpisah dan melibatkan beberapa tabung reaksi. Masing-masing cara memiliki keunggulan dan kelemahan, dan pilihannya amat bergantung pada penelitian yang kita lakukan. Dengan one step RT-PCR, tidak ada proses transfer sample sehingga mengurangi sumber kontaminasi, dan karena digunakan primer spesifik untuk RT-PCR dan PCR, maka sensitifitasnya bisa lebih baik. Dengan two step RT-PCR, RNA dapat dikonversi menjadi cDNA dalam jumlah besar sekaligus, baru kemudian dialiquot untuk digunakan pada
analisis beberapa gen berbeda. Ini dapat mengurangi variasi ketika membandingkan ekspresi beberapa gen dari sumber yang sama. Pilihan primer pun beragam, bisa oligo dT, random primer atau primer spesifik gen. Jadi, pilihannya bergantung keb utuhan riset kita. Karena banyak faktor yang mempengaruhi kesuksesannya, maka alangkah baiknya kita merancang metode RT-PCR ini dengan lebih baik, dan kondisi yang optimum bisa saja bervariasi dari satu penelitian ke penelitian lainnya. Dan begitu kondisi yang optimum sudah diperoleh, maka metode tersebut dapat digunakan secara konsisten.
