Laborator Microbiologie generala_2011-2012

LUCRARI LABORATOR MICROBIOLOGIE GENERALA

L.1.

Reguli de protecţ ie ie a muncii în laboratorul de microbiologie; Microscopul. Utilizarea microscopului

Studiul microbiologic al bacteriilor - Studiul bacteriilor prin colorare simpla

L.2.

Studiul microbiologic al bacteriilor - Studiul bacteriilor prin colorare diferenț iala iala

L.3.

Studiul microbiologic al drojdiilor (Saccharomyces, (Saccharomyces, Pichia, Torulopsis)

L.4.

L.5.

Studiul Kloeckera) Kloeckera)

L.6.

microbiologic

al

drojdiilor

(Candida, (Candida,

Rhodotorula,

Studiul microbiologic al mucegaiurilor (Mucor, (Mucor, Rhizopus)

Studiul microbiologic al mucegaiurilor ( Aspergillus Aspergillus oryzae, Aspergillus glaucus, Penicillium expansum)

L.7.

niger,

Studiul microbiologic al mucegaiurilor (Botrytis, (Botrytis, Geotrichum, Alternaria, Fusarium, Cladosporium)

L.8.

L.9.

Tehnici de izolare a culturilor pure

Tehnici indirecte (culturale) de evaluare a numărului de microorganisme - Tehnica clasic ă de numărare prin cultivare pe medii dense

L.10.

L.11.

Metoda directă de numărare a bacteriilor în preparate fixate şi colorate - Metoda Breed

L.12.

Metode directe de numărare - Numărarea cu citometre

L.13.

de

Influenţ a factorilor microorganismelor

mediu

asupra

dezvoltării

Facultatea Ş tiinţ tiinţ a şi Ingineria Alimentelor

REGULI DE PROTECŢIE A MUNCII ÎN LABORATORUL DE MICROBIOLOGIE Într-un laborator de microbiologie trebuie respectate anumite reguli de ordine interioar ă, după cum urmează: Este strict interzis accesul persoanelor str ăine în laborator; Intrarea în laborator şi participarea la lucr ările practice se va face numai dup ă audierea şi însuşirea regulilor de protecţie a muncii (dovedită prin semnătur ă pe un proces verbal); Intrarea în laboratorul de microbiologie necesit ă purtarea obligatorie a echipamentului de protecţie (halat cu mâneci lungi, m ănuşi sterile, etc.). Se recomandă ca echipamentul de protec ţ ie ie să fie păstrat separat de hainele utilizate în exterior;

Nu se mănâncă şi nu se fumează în laborator. Manipulările trebuiesc efectuate cu multa aten ţ ie, ie, chiar dac ă nu se lucrează cu microorganisme patogene. Culturile, preparatele microscopice umede, toate materialele care con ţ in in sau s-au aflat în contact cu microorganisme vii trebuie mânuite cu grija. În laboratorul de microbiologie, poate exista şi pericolul generat de utilizarea tensiunii înalte, a radia ţ iilor iilor ultraviolete şi a altor radia ţ ii. ii. Radia ţ iile iile ultraviolete (λ=250-270 nm) sunt folosite pentru sterilizarea aerului şi suprafeţ elor elor de lucru. iradierea se face timp de 15 min - 2 ore, în func ţ ie ie de dimensiunea înc ăperii şi gradul presupus de contaminare a aerului. În timpul func ţ ionarii ionarii lămpii, nu este permis accesul personalului în înc ăpere decât cu ochelari de protecţ ie ie şi pentru scurta durata, deoarece razele ultraviolete ataca retina, iar in doze mari pot produce arsuri ale epidermei; Rănile şi zgârieturile de pe mâini trebuie s ă fie complet protejate de pansamente rezistente la apa şi de mănuşi chirurgicale; Să se evite pe cât posibil atingerea p ărului, ţ inând inând cent ca nivelul de contaminare a acestuia este de aproximativ 1 milion/cm 2. Persoanele cu p ăr lung este necesar s ă-l strângă, pentru a evita accidentele, ţ inând inând seama ca de obicei se lucreaz ă în. apropierea becului de gaz; 1

Când o cultura este pipetat ă din greşeala pe bancul de lucru sau pe podea, nu va gr ăbiţ i să ştergeţ i locul respectiv, ci aplica ţ i peste suspensia respectiva o ăţ aţ i; soluţ ie ie dezinfectanta, a şteptaţ i aproximativ 20 minute şi abia apoi cur ăţ i; Laborator Microbiologie general ă|


Evacuarea rapidă a conţ inutului inutului pipetelor poate produce aerosoli. Aerosolii pot fi generaţ i şi la mânuirea firului sau ansei, şi la îndep ărtarea dopului de vata sau de cauciuc din eprubetele cu culturi şi la deşurubarea capacelor sticlelor cu culturi. În general, în munca din laboratorul de microbiologie se prefera mi şcările lente, negr ăbite; Utilizarea firului sau ansei necesit ă bune deprinderi la mânuirea acestora, pentru a se evita contaminarea aerului şi a zonei de lucru. Firul şi ansa trebuie s ă fie sterilizate înainte şi după utilizare, prin flambare la ro şu, în flac ăra unui bec ăştierea materialului aderent se Bunsen pe toata lungimea firului metalic. Împr ăş evita prin introducerea firului metalic în flac ăra, în mod gradat; Eprubetele cu culturi vor fi ţ inute inute întotdeauna în stativele pentru eprubete. Nu lăsaţ i niciodat ă eprubete sau pipete utilizate pe bancul de lucru. Placa Petri în care se număra microorganismele nu va fi privit ă ca fiind lipsita de risc, chiar dacă inocularea ei s-a f ăcut dintr-un aliment bun pentru consum; Dopul de vată de la capătul pipetei se afl ă acolo pentru a preveni contaminarea lichidului care trebuie pipetat şi pentru a preveni infectarea utilizatorului. Pipetele folosite nu se vor l ăsa nici o data pe bancul de lucru. Ele se vor introduce într-un recipient conţ inând inând soluţ ie ie dezinfectant ă (bicromat de potasiu 5%). Lamele şi lamelele se vor a şeza după utilizare în vase con ţ inând inând soluţ iiii dezinfectante, după ce în prealabil lamelele au fost separate de lame cu ajutorul unei pensete; Să se eticheteze corect culturile înainte de depozitarea lor la termostate sau în alte zone; ăţ a zona de lucru. Aceasta se va şterge cu o După terminarea lucrului se va cur ăţ soluţ ie ie dezinfectanta (cloramina 6.5-3%, formol sau fenol 3-5%, HgCI 2 0.1%). Mâinile se igienizeaz ă prin introducerea lor într-o substan ţă antiseptic ă pentru câteva minute, apoi se spal ă cu apă caldă si săpun.

2

Laborator Microbiologie general ă|

Facultatea Ş tiinţ a şi Ingineria Alimentelor

MICROSCOPUL. UTILIZAREA MICROSCOPULUI Microscopul este instrumentul cel mai utilizat şi cel mai important în laboratorul de microbiologie. Cu ajutorul microscopului optic se realizeaz ă studiul morfologic al microorganismelor (bacterii, drojdii şi mucegaiuri ) şi numărarea directă a acestora. Studiul virusurilor şi a ultrastructurilor celulare necesita utilizarea microscopului electronic. Reguli de utilizare a microscopului

Întotdeauna microscopul se transportă cu două mâini, o mână se aşează la baza, iar cu cealalt ă se prinde coloana sau stâlpul microscopului; Se aşează cu atenţ ie microscopul pe masa de lucru. În cazul unei mi şcări violente sau după un şoc acesta se poate deregla; Nu se înclină niciodată microscopul, chiar dacă există această posibilitate. Când se utilizează obiectivul de imersie, prin inclinare, uleiul de cedru se r ăspândeşte pe măsuţ a microscopului; Pentru cur ăţ are, întotdeauna se folose şte hârtie specială pentru cur ăţ area lentilelor. Dacă rezultatele nu sunt corespunzătoare prin utilizarea hârtiei, se poate folosi o cantitate mic ă de benzen. Nu se va utiliza alcoolul sau alt produs care-poate determina desprinderea lentilelor; Să se observe permanent diferenţ ele dintre obiectivele folosite pentru studiul preparatelor microscopice umede şi obiectivele de imersie (pentru studiul preparatelor microscopice colorate). Obiectivul de imersie este fragil, el trebuie utilizat cu foarte mult ă atenţ ie; De fiecare data când se utilizeaz ă microscopul este necesar să se cureţ e toate lentilele: ale obiectivului, ocularului şi condensatorului; Se aşează întotdeauna în centrul optic al microscopului obiectivul cel mai mic şi se coboar ă tubul cât este posibil; Se acoper ă microscopul după utilizare cu un sistem de protec ţ ie; 1

Nu se vor întreprinde niciodată reparaţ ii. Acest lucru se realizeaz ă de către echipele specializate.



Elementele microscopului

Microscopul se compune dintr-un stativ portant, un sistem optic, o m ăsuţă port-obiect şi un sistem de iluminare. Sistemul optic şi măsuţ a sunt mobile.

2

1 Oculare

7

2 Dispozitiv port-obiective

8

3 Obiective 4 Clema pentru fixarea preparatului 5 Măsuţă Şurub macrometric pentru prinderea 6

12 Lampa

imaginii

Şurub pentru deplasarea pe axa y Şurub micrometric pentru clarificarea

imaginii Şurub pentru deplasarea pe axa x 9 10 Buton de pornire oprire 11 Şurub de ajustare a luminozit ăţ ii



Ocularele

Curent se utilizează oculare care au puterea de mărire de x8, x10, x12. Obiectivele

Dispozitivul port-obiectiv permite selec ţ ionarea obiectivului dorit prin simpla rota ţ ie. Obiectivele utilizate în microbiologie sunt în general obiective acromatice şi dacă este posibil plan-acromatice. Gama obiectivelor necesare au puterea de m ărire de x10, x20, x40, iar obiectivele de imersie au puterea de m ărire de x90, x100. Măsuţa port-obiect

Măsuţ a port-obiect reprezintă un suport pentru lam ă. Deplasarea pe cele doua axe orizontale perpendiculare se realizează cu ajutorul unui şurub situat lateral. Sistemul de iluminare

Se compune dintr-o sursa de lumina şi un condensator. Condensatoarele curente sunt dotate cu o diafragma. Sistemul de iluminare este independent sau încorporat în microscop. Sistemul de deplasare a obiectivelor

Se realizează cu un şurub pentru mişcările rapide şi un alt şurub pentru reglare micrometrică. Distanta frontal ă, adică distanta între preparat şi obiectiv, depinde de puterea de mărire a obiectivului. Puterea de m ărire

Puterea de rezoluţ ie este capacitatea de separare a doua obiecte foarte apropiate. Puterea de mărire variază de la 100-1200 corespunzător sistemului oculare — obiectiv utilizat. Se calculeaz ă prin produsul dintre puterea de mărire a ocularului şi a obiectivului. Utilizarea microscopului

Cur ăţ area cu ajutorul unei hârtii speciale a elementelor optice ale microscopului; Reglarea luminozităţ ii; Fixarea preparatului pe măsuţă cu ajutorul unei cleme. Partea preparatului care interesează se aşează în centrul port-obiectului; 3

Obiectivul este selec ţ ionat: iniţ ial se fixează obiectivul cu puterea de m ărire cea mai mică (x10) pentru prinderea imaginii; Se coboar ă obiectivul la o distan ţă de 0.5-1 cm de preparat cu ajutorul şurubului Laborator Microbiologie general ă|


macrometric; Pentru studiu se schimba obiectivul cu un altul cu putere de m ărire superioar ă prin rotirea dispozitivului port obiective; După obţ inerea imaginii, se realizeaz ă clarificarea acesteia cu ajutorul şurubului micrometric; În cazul utilizării obiectivului de imersie, se depune o pic ătur ă de ulei de imersie în zona care interesează şi se imersează obiectivul în aceasta zonă; După utilizare, obiectivele de imersie trebuie sa fie cur ăţ ate cu benzen; Lamele examinate vor fi imediat îndep ărtate pentru a se evita contaminarea. Cauzele care duc la obţ inerea unor imagini necorespunz ătoare sunt:

Executarea unor preparate necorespunzătoare; Preparate care nu sunt centrate corespunz ător; Elemente optice murdare; Obiective şi oculare dereglate; Luminozitate reglată necorespunzător.

4



STUDIUL BACTERIILOR Definiţie Bacteriile sunt microorganisme monocelulare de tip procariot cu un cromozom unic, care se înmul ţ ţ esc esc asexuat prin sciziune binar ă binar ă. Răspândire în sol - concentra ţ ia ia de celule poate ajunge la valori de 10 7-109/g atât în straturile superficiale (bacterii aerobe), cât şi în straturile de profunzime (bacterii anaerobe). din sol, bacteriile s-au adaptat s ă tr ăiască în ape ape,, unde concentra ţ ia ia de celule 3 12 3 poate fi între 10/cm în apa de izvor, pân ă la valori de 10 /cm , de exemplu, în ape fecalo-menajere. existen ţ a în aer aer a a bacteriilor este temporar ă şi prin intermediul curen ţ ilor ilor de aer sunt r ăspândite la distan ţ e foarte mari. Din aer, sunt antrenate din nou în sol prin intermediul precipita ţ iilor iilor atmosferice. fac parte din microbiota naturala a plantelor şi animalelor Rol rol important în natur ă: în transformarea compu şilor macromoleculari în compuşi simpli, prin mineralizarea materiei organice nevii, contribuind astfel la realizarea natural ă a circuitului unor elemente de importan ţă vitală: carbon, azot, sulf, fosfor, fier ş.a. în industria alimentar ă - culturi starter al proceselor fermentative bacteriile lactice sunt folosite la fabricarea produselor lactate, a brânzeturilor, în industria panifica ţ iei, iei, la conservarea legumelor, m ăslinelor, furajelor verzi etc. bacteriile propionice sunt utilizate la fabricarea brânzeturilor tip schwaitzer bacteriile acetice la fermenta ţ ia ia alcoolului etilic – ob ţ inerea inerea industrial ă a oţ etului. etului. în biotehnologie se pot obţ ine: ine: enzime, proteine, aminoacizi, acid lactic, acid acetic, solven ţ i (acetonă, alcool izopropilic, alcool butilic); hormoni – insulina produs ă de un mutant de Escherichia coli ; îngr ăşă – Azotobacter ;; ăşăminte biologice – Azotobacter insecticide biologice – Bacillus thuringiensis thuringiensis;; antibiotice – Streptomyces sp. sp . vitamine – de ex. vitamina B12 – Propionibacterium shermani 1

Aspecte negative: în industria alimentar ă – bacterii agen ţ i de alterare a produselor alimentare (acrirea berii, vinului, putrefac ţ ia ia cărnii ş.a.); Laborator Microbiologie Laborator Microbiologie general ă|


bacterii patogene – ingerare alimente contaminate – toxiinfec ţ iiii alimentare; bacterii patogene – pot s ă paraziteze organismele vii dând îmboln ăviri grave (tuberculoza, febra tifoid ă, dizenteria, sifilis, bruceloza, antrax, ş.a.), bacterioze la plante. Caractere morfologice Bacteriile prezint ă forme celulare foarte diversificate, dintre care forme de baz ă, monocelulare, precum şi forme derivate ale acestora ce rezult ă în urma asocierii celulelor rezultate prin reproducere. Dintre formele de baz ă fac parte urm ătoarele (Anexa 2): - forma sferică – coccus → sfera este perfect ă (micrococi), ovalar ă (enterococi), lanceolat ă (pneumococi) şi reniformă (gonococi); Enterobacter) , cu - forma bacilar ă – cilindrică → drepte cu capete rotunjite (g. Enterobacter), capete retezate (g. Bacillus), Bacillus) , fusiforme, m ăciucate (g. Corynebacterium), Corynebacterium) , cu diametru variabil (g. Mycobacterium); Mycobacterium) ; - formele spiralate-elicoidale → specifice bacteriilor patogene forma vibrio forma spirillum → filamente rigide cu spire largi forma spirocheta → filamente flexibile cu mai multe spire; - formele filamentoase → specifice bacteriilor miceliene (actinomicete, chlamydobacterii etc.). Mediul de baz ă pentru cultivarea bacteriilor – bulionul de carne lichid sau solidificat cu agar (BCA). Prin reproducere pe mediu nutritiv solidificat ia na ştere o colonie alcătuită din biomasa de celule rezultate prin sciziune din celula unic ă: - colonii de tip S (smooth – neted lucios) - colonii de tip R (rough – rugos, aspru, zbârcit) - colonii de tip M – la bacterii produc ătoare de capsule, cu consisten ţă gelatinoas ă, mucoidă Coloniile de bacterii: pe medii solide culori de alb, alb-crem, galben-auriu, oranj-ro şu, albastru fluorescen ţă pe medii nutritive lichide pot da tulburare şi sediment – bacteriile anaerobe formeaz ă voal caracteristic, fragil, cutat, gelatinos – bacteriile aerobe.

2

Caractere fiziologice generale bacteriile se dezvolt ă într-un domeniu larg de temperatura → 10°C şi 90°C; în raport cu oxigenul majoritatea bacteriilor sunt aerobe (ex. bacterii acetice), care cresc în semiaerobioz ă (ex. bacterii lactice), dar un grup restrâns de bacterii sunt adaptate s ă crească în strictă anaerobioz ă (ex. genul Clostridium). Clostridium ). pH=1-11 → optim la valori acide pentru bacterii acidotolerante (bacterii acetice, lactice) sau la valori neutre pentru bacterii de putrefac ţ ie. ie. Laborator Microbiologie Laborator Microbiologie general ă|

Facultate Ş tiinţ tiinţ a şi In ineria Alime telor

TUDIUL BAC ERIILO

PRIN COLORARE SI PLĂ

Preparatele micro copice su nt de dou ă tipuri: A.

Preparat umede – pentru stu diul drojdii lor si a mu cegaiurilo ;

B.

Frotiuri ( reparate-uscate) – p ntru studi l bacteriil r.

Coloranţ iiii utiliza ţ i n studiul b acteriilor a u ca scop accentuar ea contras ul prepara telor (colora e simpl ă ) sau în sco pul identifi cării (colo r ările dife enţ iale). iale). Colorar a simpl ă rezint ă două etape: 1. 2.

bţ inerea inerea f otiurilor; olorarea s impl ă propriu-zis ă.

Etapele prelevării probelor p ntru reali area froti rilor sunt rezentate în figura 1 .

1

Fig ra 1. 1 . Etapele prelev rii probelo r L borator Micr borator Micr biologie gen eral ă|

Facultate Ş tiinţ a şi In ineria Alime telor

Obţ iner a frotiuril r presupu ne etalare a celulelo r de studi t, urmat ă de uscar , de fixare şi de colora e (Fig. 2)

F R O T I U

1. Sterilizare la

ă

2. dăugare apă diistilată 3. Sterilizare ansa 4. Prelevare pr bă 5. lasare probă p lamă

6. Etalare pro

ă

7. Uscare 8. Fixare 9. Răcire

Fig ura 2. Eta ele realiz rii frotiuluii Etalare este realizat ă por ind de la prelevar a probele , etapă i entică cu cea utilizat ă pentru pre paratele u ede în st re proasp ătă. Picătur de suspe nsie se et alează cu ajutorul fir ului metali c steril as fel încât s ă se obţ in ă o distribuţ ie foarte fin ă, omogen . Uscare se efectu ează deasupra flăcă ii unui bec de gaz pe ntru a se vita o înc lzire violent ă. Fixarea se realize ază trecând lama de 2-3 ori pri n flacăra se reali ează r ăcir ea.

ecului de gaz, dup ă care

Frotiul oate fi an lizat în co tinuare su b aceasta formă sau colorat. 2

L borator Micr biologie gen eral ă|


Se reali ează prin acoperire frotiurilor fixate cu c âteva pic ături de colo rant timp d e 30 sec – 2 min (A), d pă care s realizeaz spălarea (B) şi zvâ tarea prep aratelor (C ).

A

B

C

Exame ul microsc opic se efe ctueaz ă c obiectiv le de ime sie (x90, 100). Coloranţ ii utiliza ţ i f recvent su t: albastr de metile sau fucsi na. Etapele realiz ării color ării simple sunt p ezentate î n figura 3.

C O L O R A R E

1. Obţ iner e frotiu

2. Ad ăugare colorant (fucsină )

3. Menţ inere collorant 1 min.

4. Spălare colorant

S I M P L Ă

5. Zvântare preparat

6.. Adăugare ul ei de cedru

Fig ra. 3 Eta ele realiz ării color ării simple 3

L borator Micr biologie gen eral ă|

Bacteri i din I URT

Iaurturil e sunt fa ricate cu ajutorul l ptelui pas teurizat, i noculat cu dou ă ba terii termofil : 

Lact bacillus b lgaricus, gent de a idifiere şi romă;



Stre tococcus t ermophilu , formeaz aroma.

Există un sinergis între cel e dou ă bacterii; aces tea produ compuşi utili una p ntru cealalt ă (activitate peptidazic ă de c ătre prima bact erie, acid ormic prod us de cea de a doua).

1.

actobaci lus bulga icus

Sunt alungiţ i, ram po itivi, bacili nespor laţ i, imobili, ho mofermentativi, termofil i (tempera ura de dez voltare 45 C). Ferme tează glu oza, lacto za, fructo a şi câteod tă galact za cu pro ducere de acid lactic.

2.

treptoco cus ther ophilus

Sunt oci, Gra m pozitiv i, nespor ulaţ i, imobili, grupaţ i în perechi i câteoda ă în lanţ uri. Fermen tează lact oza, zahar oza, gluco a şi uneori galactoza cu formare de acid l ctic, temper tura maxi ma de cre tere 50-5 °C.

Laborator Micro iologie gen ral ă|

Bac erii d n SM NTÂ Ă treptoc occus c emoris

Smântâna acidă este f rmentată e Streptoc occus cre oris. Sunt coci (llanţ uri de coci), G+, nesporula ţ i, micro-a erofili, foa te exigen ţ i din punct e vedere nutriţ ional, cresc l tempera tura de 10°C, dar nu cres c la temper tura de 45 °C. Fermentează lactoza şi maltoza.


acter i din

ORŞ

actobac illus del rueckii

Sunt b cili alungiţ i, Gram pozitivi, n sporulaţ i, imobili, h omoferme tativi, ter ofili (temper atura de d zvoltare 4 °C). Lactobacillus delb ueckii fermentează lactoza.


Tema: STUDIUL BACTERIILOR PRIN COLORARE SIMPLĂ Scopul: Formarea deprinderilor de manipulare a ustensilelor şi aparaturii de laborator ;

Cunoaşterea şi utilizarea adecvată a noţiunilor necesare identificării bacteriilor Bacterii din IAURT

Bacterii din SMÂNTÂNĂ

Bacterii din BORŞ

NUME/PRENUME STUDENT

GRUPA Data

Cadrul didactic


STUDIUL B CTERIILOR P IN CO ORAR ( RAM)

DIFERENŢIA

Ă

Preparatele micro copice sunt de dou ă tipuri: A.

Prep rate ume e – pentr studiul dr ojdiilor si

mucegaiurilor;

B.

Froti ri (preparate-uscate) – pentru s udiul bact riilor.

Coloranţ ii utiliza ţ i n studiul b acteriilor au ca scop accentuar ea contras ul preparatelor (colora e simpl ă ) sau în scopul identifi cării (colo r ările dife enţ iale). Colorar a Gram permite divi area bact riilor în d uă grupe: GRAM P ZITIVE (G +) şi GRAM NEGATIVE (G-). Aceasta m toda se bazează e diferen ţ a structu ii şi compoziţ iei peretelui celular la cele două grupe de bacteriii. Bazele etodei au fost stabilite de bacteriologul danez Hans Christian Gr am, în anu l 1884. Colorar a GRAM rezintă d uă etape: 1. 2.

bţ inerea f otiurilor; olorarea RAM propriu-zisă.

Ob ţ iner a frotiuril r presupune etalarea celulelo r de studi t, urmat ă de uscar , de fixare şi de colora e

Frotiul scat şi fixat se aco er ă cu câteva picăt ri de viol t de gen ţ iană sau cristal violet, timp de 1 inut (A), poi se clăteşte cu a pă (B). Se acoper ă poi prepa ratul timp de câteva s cunde (3 sec) cu soluţ ie Lu gol (iod î iodura d e potasiu) care joaca rol de mordant (C);

1

A B C Frotiul ste supus ac ţ iunii a lcoolului e tilic - 96° (D). Dup ă sp ălarea reparatul i cu ap ă (E), acesta s acoper ă cu al doil a coloran t (fucsina bazică) ca re recolor az ă celulele bacteriilor Gram ne ative (F).



D E F Dup ă spălarea reparatul i cu ap ă (G) se realizează zvântarea (H) şi apoi studier a acestui cu obiect iv de 90x imersat în ulei de ce dru.

H - vor ave a culoare roz-roşi ; iar

În urma acestei etode de colorare acteriile bacteriile G+ se v or colora î n violet. Prezentarea schematic ă a c olor ării Gr am se reg ăse şte în igura 1. 1. Obţ i nere frotiu

C O L O R A

2. Ad ăugare col orant (v iolet d genţ iană sau cristal violet) Menţ i ere colorant 1 min. 3. dăugare Lugo l M nţ inere 30 sec .

R E

4.

pălare cu alco ol

D I

5. Spălare cu ap

F E R

6. Adăugare colorant (f ucsină ) Menţ i ere colorant 1 min.

E N

7.

pălare cu apă

Ţ I A

8. Zv ântare prepara t

L 2

Ă

9. Adăugare ulei de ce dru

Fig ra. 1 Etapele realiză rii color ării GRAM



NEXA E apele color ării GRAM

Dura a aplic re

Frotiu fixat, necolorat

-

-

Cristal violet

1’, apoi clătir cu apă

Col oranţ ii bazici rea cţ ionează cu gru pe încă cate neg ativ din p rete me brană şi citosol

Soluţ ie Lugol

1’, apoi clătir cu apă

Alcool etilic 96°

10-15’’, apoi clătir cu apă

Fucsină, colorant contrast

1’, apoi clătir cu apă, zvântare în aer cald, studiu cu obiec iv de 90x imersat în lei u de cedru

de

de

Re c ţ ii

Reactivi/ repa rat

Aspec t celule

Gram poziti e (G+)

Gram negative (G-)

Celule f ăr ă culoar şi dificil de viz alizat

Atât bacteriile Gram pozitive cât c ele Gram şi negati e sunt colorat e în violet închis. Iod ul are efect Ambel e grupe de mo dant şi mă eşte bacteriii r ămân ata şarea colorat e în violet închis. Sol enţ ii pal ă col rantul şi iodul din cel le. Color antul difuzează din celula bac teriilor ram poz itive mult mai lent dec ât în cazul celor Gra m neg tive, dat orită compoziţ iei chi ice şi grosimii per etelui celular Col orantul bazic se fixează de grupele înc rcate negati din am ele tipuri de cel le. La bact eriile Gra m pozitive sunt îns puţ ine grupe libere de cristal v iolet co parativ cu cele Gra m negative care sun t complet libe re

Bacter iile Gram pozitiv e r ămân colorat e în violet închis în timp ce bacteriiile Gram negati e devin incolor e şi dificil de obs ervat.

Celule le Gram pozitiv e r ămân colorat e în violet închis (culoarea colora tului primar ) în timp ce celulel e Gram devin colorate în roz sau roşu (culoa ea colora tului de contra st)

3


Bacill s su tilis

1.

aractere 

2.

f rmează pe Plate Cou t Agar, du ă 48h de c ultivare la 7°C, colonii alb-crem, plate şi neuniform . aractere



3.

acrosco ice (colo iale).

icroscopice

bacterii cu forma de astonaşe, G+, aerobe, mezofil caracterizaţ i prin aptitudinea de sp rulare.

în gener al mobile. Sunt

ăspândir şi rol 

sunt foarte r spândite î natur ă, în special în s ol şi pe pro usele veg tale.

L borator Micr biologie general ă|

acter ii din

Ţ ET

Acet bacter ceti

Sunt bacili, G-, nesporulaţ i, în g neral mo ili, aerobi. Sunt agenţ i de ferme tare acetică, care e ste de fap t o oxidar e incompl tă a etanolului. aracteristi ca principală este producerea d e acid ace ic pornind de la etan ol. Prin colorar ea Gram e e apar de culoare ro ie. Sunt bacteriii de conta inare a p oduselor a lcoolizate pe care le acidifică. Î industrie sunt utilizate pentru bţ inerea o ţ etului.


Tema:

STUDIUL MORFOLOGIC AL UNOR SPECII DE BACTERII PRIN COLORARE GRAM

Scopul:

Formarea

deprinderilor de manipulare a ustensilelor şi aparaturii de laborator; Cunoaşterea şi utilizarea adecvată a noţiunilor necesare identificării bacteriilor

Bacillus subtilis

Bacterii din OŢET


GRUPA Data

Cadrul didactic


STUDIUL DROJDIILOR Definiţie Drojdiile reprezint ă un grup taxonomic complex şi eterogen de microorganisme monocelulare de tip eucariot , care se înmul ţ esc prin înmugurire, ca formă general ă de reproducere şi în mod particular prin ascospori forma ţ i pe cale asexuat ă şi sexuat ă. Importanţă /rol

produc fermentarea glucidelor simple în anaerobioză cu formare de alcool etilic şi dioxid de carbon → fabricarea alcoolului, a vinului, berii şi pâinii. sunt utilizate ca surs ă de proteine în alimenta ţ ia umană, cu denumirea de SCP (single cell protein ) sau în alimenta ţ ia animalelor. din biomasa de drojdie se obţ in: - extracte folosite ca aditivi alimentari; - vitamine hidrosolubile: B1, B2, PP, ergosterol; - enzime: β - fructofuranozidaza şi β - galactozidaza; - prin hibridizări şi inginerie genetic ă, din mutan ţ i ai speciei Saccharomyces cerevisiae s-a obţ inut interferonul. Răspândire în sol, celulele de drojdie se întâlnesc în straturile superficiale pân ă la adâncimi de aproximativ 30 cm, în concentra ţ ii de 102- 2·105/g. din sol, prin ac ţ iunea unor factori (fizici, mecanici, biologici), microorganismele se pot afla temporar în aer şi să se r ăspândească la distanţ e mari; din sol şi aer drojdiile pot ajunge în ape şi unele specii pot fi întâlnite chiar la

adâncimi de 4000 m. in microbiota epifita a plantelor. Caractere morfologice generale

Exemple de genuri cu importanţă in industria alimentar ă: forma oval ă (elipsoidal ă ) – g. Saccharomyces; forma sferic ă – g. Torulopsis; forma apiculat ă (de l ămâie) – g. Kloeckera; forma cilindric ă – g. Candida; forma de sticl ă – g. Saccharomycodes.

Cultivarea celulelor de drojdie pe medii nutritive lichide: Fermentare anaeroba a zahărului

1



[1]. Tulburare mediu [2]. Producere spumă [3]. Depunere sediment [4]. Limpezirea supernatantului Cultivarea celulelor de drojdie pe medii nutritive solide sau solidificate (de exemplu: must de malţ cu agar) Înmugurire

succesiv ă

Coloniile de drojdii au aspect cremos lucioase sau mate alb-crem → drojdii din g. Rhodotorula colonii roşu-pastelat Colonia în secţiune poate avea: un profil lenticular, semicircular sau triunghiular perimetrul circular, umbonat, cu margini ondulate Caractere fiziologice generale ale drojdiilor O proprietate important ă a unor drojdii cu utiliz ări în industria alimentar ă este aceea de a fermenta în condiţ ii de anaerobioză glucide (hexoze, diglucie, triglucide) cu formare de alcool etilic şi dioxid de carbon şi produse secundare care dau aroma caracteristică

produselor fermentate. În condiţ ii de aerobioză, drojdiile asimilează glucidele transformându-le prin respiraţ ie la CO2 şi H2O, iar energia eliberată favorizează creşterea şi înmulţ irea celulelor. Celulele de drojdie, în func ţ ie de condiţ iile de cultivare şi vârstă pot prezenta activitate metabolică diferenţ iată concretizată prin trei stări în care se pot afla celulele şi anume: starea de metabioz ă (activ ă ), în care celulele au activitate metabolic ă maximă. În condiţ ii favorabile de cultur ă, celulele cresc, se reproduc şi acumulează intracelular substanţ e de rezervă glicogen şi trehaloză; starea de anabioz ă (latent ă ), celulele î şi menţ in caracteristicile vitale, dar nu se pot înmulţ i. Această stare apare când substanţ ele nutritive ale mediului sunt epuizate, iar celulele consumă din substanţ ele de rezervă intracelulare; starea de autoliz ă (moartea fiziologic ă ). Se produce o solubilizare a compuşilor intracelulari sub acţ iunea enzimelor proprii celulei. •

•

•

2


Sacc aromyces erevi iae

1.

aractere




După 3 zile de cultivare l 25°C, for mează pe MEA (Malt Extract gar), colonii de culoare alb-c em, conv xe, cu pe imetrul cir ular şi su rafaţ a luci asă, având diame rul de 1 - 2 mm. 2.

aractere

icroscopice



celul le au for a elipsoidală, globo să sau ellipsoidal al ungită şi ot fi di puse sing lar, in per chi sau la ţ uri;  se re roduc prin înmugurir , iar mugu rele poate fi alipit de c elula mam ă. 3.

ăspândir şi rol 

microflora epifită a fructelor dulci (strug uri, mere, ere, prune, gutui, coa ăze,

a rişe); 

este tilizată la:  fa ricarea spirtului;  la bţ inerea drojdiei com rimate;  în panificaţ ie;  la abricarea nor sortim nte de ber e.


Pichi me bran efaci ens

1.

aractere


form ază, pe must de malţ cu agar, colonii cu perimetrul slab lobat sau chiar n regulat, c aspect m t, rugos, d e culoare a lbă sau alb -cenuşie. 

2.

aractere

icroscopice

prezi tă celule alungite, cili drice, cu c apetele as uţ ite sau r tunjite dis use în lanţ ri sau as cia ţ ii, for ând pse domicelii rezultate p rin înmugu rire multip lar ă. Poate f orma 1- 4 scospori. 

3.

ăspândir şi rol  microflora produ elor veget le conserv te prin mu are;  se dezvolta pe li hide slab alcoolice ( 7 - 9 ° alcool) , producân oxidarea totală a alcoollului etilic; lterare a băuturilor lab alcooli zate (vin d e masa, ere),  este agent de păstrat in vase cu gol de aer.


orulo sis h lmii

1.

aractere


form ază pe must de malţ cu agar, d pă 3 zile e cultivate la 25°C, c lonii albe, circulate, co vexe, apla izate, cu s prafaţ a lu ioasă. 

2.

aractere

icroscopice



celul le sunt mi i, elipsoidale;



se re roduc prin înmugurir şi apar iz late sau a ociate;



form ază 1-4 ascospori,

u formă

ferică pâ ă la elips oidală şi

ereţ i

netezi. 3.

ăspândir şi rol 

drojdi a este pr zentă în

aramura î n fazele i cipiente d e ferment re a

mur ătu ilor; 

a fost izolată din băuturi r ă oritoare, d pe măsline verzi şi fr ucte citrice .


Tema: STUDIUL MICROBIOLOGIC AL DROJDIILOR Scopul: Cunoaşterea şi utilizarea adecvată a noţiunilor necesare identificării drojdiilor

Saccharomyces cerevisiae

Pichia membranaefaciens

Torulopsis holmii


GRUPA Data

Cadrul didactic

Cand da valida ( andi a my oder a)

1.

aractere


coloniile dezvolt te pe me iu solidific at prezintă un aspec mat, cutat, de culoare alb-cenuşi sau uneo i alb-crem. 

2.

aractere

icroscopice

celul le sunt de ormă elips idal - alun ită, cilindrică, cu extr mităţ ile rot njite sau sla ascuţ ite.  pot f orma pseudomiceliu, deoarece prin înmu urire multipolar ă, cellulele r ămân lipite. 

3.

ăspândir şi rol  face arte din microbiota epifită a fruct lor şi a un  în c zuri rare, se întâlneşte în m icrobiota cereali re;  este agent de alterare a vinurilor sllab alcooli defectul numit „flo rea vinului";  prod ce alter ări ale băutu ilor r ăcorit are şi a murare.

r legume; eminţ elor oleaginoase şi e, slab s lfitate, produce roduselor conservate prin


Rhodot rula lutini

1.

aractere


form ază pe MEA (Malt xtract Ag r), după zile de ultivare, c lonii convexe, cu perimetrul circul r, cu suprafaţ a lucioa ă sau asp ct mucos, de culoare roşu pastelat. 

2.

aractere

icroscopice

celul le au formă elipsoidal ă şi dimen siuni medii ; reproducerea are lo prin înmugur ire pe întreaga supraf ţă;  celul pot fi izolate sau a sociate pe rechi. Unelle tulpini p ot forma c elule alungite.. 

3.

ăspândir şi rol  este larg r ăspândită pe su rafaţ a fruc elor şi legumelor proa păt recoltate;  se întâlneşte în microbiota epifită a frunzelor şi tulpinilor, a boabel r de cereale, a măslinel r ;  poate produce r r alter ări ale fructelor i legumelo ;  poate produce alter ări al sucurilor insuficient pasteuriz te de mere şi căpşuni.


Kl ecke a api culat

1.

aractere


form ază pe MEA (Malt Extract Agar) upă 3 zile de cultivar la 25°C, colonii de culoare alb-cre , aproape semisferice , cu margin i circulare şi suprafaţ a lucioasă. 

2.

aractere

icroscopice

celul le au fie f orma elips idală, fie piculată, mono s u bipolari, are se găs sc singuri sau perech i. 

atorită mugurilor terminali,

3.

ăspândir şi rol  a fost izolată de pe căpşuni; afine, stru guri, must e struguri, sucuri de itrice şi siropuri de fructe  prod ce ferment ţ ia alcoolică a mustul i de strugu ri;  prod ce alterare smochine lor, tomatel or şi cireşelor.


Tema: STUDIUL MICROBIOLOGIC AL DROJDIILOR Scopul: Cunoaşterea şi utilizarea adecvată a noţ iunilor necesare identificării drojdiilor

Candida mycoderma

Rhodotorula glutinis

Kloeckera apiculata


GRUPA Data

Cadrul didactic


STUDIUL MUCEGAIURILOR Definiţie Mucegaiurile sunt microorganisme de tip eucariot , monocelulare sau pluricelulare, diferenţ iate din punct de vedere morfologic şi care se reproduc prin spori formaţ i numai pe cale asexuat ă sau pe cale mixt ă (asexuat ă şi sexuat ă ).

Răspândire

în sol, în special în stratul superficial al solului care le asigur ă condiţ ii de creştere şi supravieţ uire. din sol, sporii de mucegai sunt antrena ţ i pe calea aerului la distanţ e foarte mari. În aer, mucegaiurile sub form ă de spori sau hife vegetative pot supravieţ ui un timp îndelungat. în apă prezenţ a mucegaiurilor este ocazională sporii de mucegai se întâlnesc frecvent la suprafaţa plantelor , în tractul digestiv, în special la ierbivore. în microbiota plantelor, pe suprafa ţ a fructelor şi legumelor . la om şi animale mucegaiurile patogene produc un num ăr mai redus de îmbolnăviri, se dezvoltă pe piele, unghii, păr. Rol

1

rol important în natur ă: Prin activitatea lor de degradare a materiei organice vii, mucegaiurile participă la transformarea unor compuşi organici (celuloza, hemiceluloze, substanţ e pectice, amidon, lipide) la compu şi mai simpli şi sunt consideraţ i agenţi de putrezire . Mucegaiurile participă astfel la circuitul carbonului în natur ă şi îmbogăţ esc solul în substanţ e cu molecule mici care pot fi folosite de alte microorganisme sau de către plante. în industria alimentar ă, culturi fungice selecţ ionate se pot folosi la fabricarea brânzeturilor – tip Roqueforti, Camemberti sau la maturarea salamurilor crude. în biotehnologie se pot obţ ine compuşi deosebit de valoroşi: antibiotice: peniciline Penicillium chrysogenum , etc.; acizi organici (citric, lactic, gluconic, kojic, malic, fumaric); vitamine (B2, ergosterol – provitamina D2); enzime (amilaze, proteaze, lipaze, celulaze etc.). îmbogăţirea în proteine a f ăinurilor vegetale agenţi de depoluare a apelor reziduale obţinere SCP



Caractere morfologice

Mucegaiurile se r ăspândesc în natur ă sub formă de spori rezistenţi la uscăciune, formă în care se menţ in în stare viabilă ani de zile. Dacă un astfel de spor ajunge pe suprafa ţ a unui mediu favorabil pentru cre ştere, cu o cantitate suficient ă de apă liber ă care să-i permită absorbţ ia substanţ elor nutritive, în primul stadiu care poate să dureze 3-4 ore, are loc absorbţ ia apei şi activizarea sistemelor enzimatice, apoi are loc germinarea celulei sporale şi formarea tuburilor vegetative numite hife (lat. hypha) sau thal (thallus). Hifele cresc numai prin vârf şi deci au o cre ştere apicală după care se ramifică rezultând miceliul. Hifele se extind pe suprafa ţ a mediului, se diversific ă şi îndeplinesc anumite funcţ ii specializate. Hifele de extindere se pot dezvolta şi în profunzimea mediului realizând absorbţia nutrienţilor şi au rol de susţinere; Hifele de r ăspândire se pot dezvolta de-a lungul mediului sau aerian. La un anumit grad de dezvoltare a acestor hife vegetative se formeaz ă hifele reproducătoare, generatoare de spori, diferenţ iate în funcţ ie de gen şi specie. Totalitatea hifelor vegetative şi reproducătoare alcătuieşte miceliul.

Dezvoltarea mucegaiurilor are loc destul de rapid în condi ţ ii favorabile; astfel în interval de 2-3 zile pe mediu nutritiv se formeaz ă colonii vizibile, diferen ţ iate. În cazul mucegaiurilor inferioare coloniile se dezvoltă rapid, sunt extinse, cu tendinţ a de a ocupa tot spa ţ iul disponibil, au aspect pâslos şi culori, alb, bej, cenuşiu, brun. Mucegaiurile superioare caracterizate formează colonii cu o cre ştere radială limitată şi culori ce difer ă de la alb la galben, brun, verde, portocaliu, albastru, cu diferite nuan ţ e specifice în func ţ ie de gen şi specie. Caractere fiziologice generale sunt microorganisme aerobe deci necesită pentru creştere prezenţ a oxigenului din aer sau a oxigenului dizolvat în mediul lichid. Un num ăr limitat de specii sunt microaerofile şi pot produce muceg ăirea internă a untului şi a ou ălor. se dezvolta în limite largi de pH (15-9), valoare optim ă în domeniu acid 5.5-6. microorganisme mezofile cu temperaturi optime de cre ştere la 25°C, un num ăr restrâns sunt termofile - cele patogene au temperatura optimă la 37°C, iar altele sunt adaptate la temperaturi scăzute (0-3°C). Majoritatea sunt inactivate la temperaturi de 80°C; cei mai rezisten ţ i spori sunt distruşi la 88°C/10 minute. 2


Mucor muc edo

1.

aractere 

acrosco ice (colo iale)

colonii dense, pâsloase şi o culoare ce variază de la cenuşiu-argintiu până la

gălbui; 2.

aractere 

icroscopice

Spor ngioforii

→

lungi şi neramific aţ i, de obi cei perpendiculari pe hifa

vegetativă; Spor ngii sferici; for a cilindric , piriformă sau ovală;  Colu ela  Cola ul se o servă prin ruperea sa solubiliza rea membr nei sporangelui şi elibe area sporil r;  Spor ngiospori i oval-cil indrici, nete zi şi hialini. 

→

→

→

3.

ăspândir şi rol

se întâlneşte pe resturi veg tale şi dejecţ ii.  prod ce muceg irea cerealelor, pâinii, a produsellor lactate cide, a că nii şi preparatelor de ca ne. 

Laborator Micro iologie gen rală|

R izop s stol nife

1.

aractere 

2.

colonii extinse, c un miceli dens, pâslos şi culoa e cenuşie

aractere   


icroscopice

Stilo porangele sferic, e culoare rună - neagr ă la maturitate; Colu ela s misferică, u apofiza l argă; Spor ngiospori i eliberaţ i prin spar erea spor ngelui sunt de formă ovală, →

→

→

brun - î chis.

3.

ăspândir şi rol   

în natur ă, în sol i pe produse vegetale; alterarea fructelor şi legumelor depozitate; prod ce mucegăirea produselor alimentare şi poate elabora

icotoxine.


Tema: STUDIUL MICROBIOLOGIC AL MUCEGAIURILOR Scopul: Cunoaşterea mucegaiurilor

şi

utilizarea

adecvată

a

noţ iunilor

necesare

identificării

Mucor mucedo

Rhizopus stolonifer


GRUPA Data

Cadrul didactic

sper illus iger

1.

aractere


colonia se dezv ltă rapid, u un mice liu catifelat , de culoa e albă sau albgălbuie. Odată cu formarea conidiosporilor, colonia capătă un aspect gra ular şi cul area devine brun închis - negru;  rever ul coloniei poate fi in olor sau co lorat în gal ben-pal; m rginile colo niilor r ămân lbe sau sl b gălbui. 

2.

aractere

icroscopice

Coni ioforii se ezvolta de obicei dire t din subst at;  Vezi ula este m re, sferică sau globoa să;  Fiali ele se dezvolta radial pe întreag a suprafaţ a laterală a veziculei şi sunt dispuse în două rânduri: I. Fialidele primare sunt mai lungii decât cele secundare ; II. Fialidele secundare sunt mult ai scurte.  Fialosporii se d zvolta basipetal, în la ţ uri lungi, in fialidele secundare; au o formă sferică sau loboasă. 

3.

ăspândir şi rol

se în âlneşte în sol, materii vegetale n descom unere, mi roflora vegetală (tuberc li, r ădăcini, seminţ e, fr ucte, cereale) şi produsele lor de prelucrare, epozite, pi niţ e, săli de abricaţ ie.  tulpini selecţ ionate se folosesc industr ial pentru bţ inerea de acizi org anici: acid gluconic, galic, citric, fum ric, oxalic. 


Asperg llus oryzae

1.

aractere  

2.

   

3.

colonia are culoare gălbuie pre galben -orange, br un-oliv; rever ul coloniei este incolo .

aractere 


icroscopice

Coni ioforii sunt înalţ i cu p reţ i subţ iri şi aspect ru gos, sub v ziculă. Capul conidial ste sferic. Vezi ula este sf rică şi prezintă pe 2/3 din suprafa ţ a Fiali ele sunt uniseriate. U eori pot fi p rezente şi f ialide secu dare. Coni iosporii s nt elipsoid li, piriformi , sau globo i la maturitate

ăspândir şi rol

se poate izola din sol, de p resturi ve etale, sem inţ e, în special de ore (lat. oryzae - orez), malţ fructe, produse alime tare. 


A pergi llus gl aucus

1.

aractere  


colonia are culoare verde g lbui sau ve rde cenuşi ; rever ul coloniei este slab colorat în uanţ e gal en-verzui, brun - roş at la

margini. 2.

aractere

icroscopice

Coni ioforii su t netezi, incolori, cu vezicul , de formă ovală.  Capul conidial ste mare, feric sau o  Fiali ele se for ează dire t pe vezic vezicul se pot for a noi coni iofori scur ţi.  Fialosporii au forma elipsoidală sau pi 

3.

iametrul c re se lărg şte treptat spre al. lă, la part a superio r ă. Adese ri pe iformă.

ăspândir şi rol

este ăspândit în natura, fiin frecvent î tâlnit în soll.  Aspe gillus glau cus este agent de mucegăire al produselor alimentare conser ate prin u care (cereale, seminţ e oleagino ase, fructe uscate) s u cu adao s de zahăr ( ucuri, siro uri, fructe c onfiate).  a fost izolat de p pâine, lapte concentr at, unt. 


Pe icillium ex ansu

1.

aractere  

2.


colonia are culoare verde-al ăstrui, cu spect catif lat; rever ul este col rat în brun închis sau portocaliu- run.

aractere

icroscopice

 Coni ioforii  

3.

au ereţ i netezi. Prezi tă fialide f ie cu formă de fiolă, fie cu formă cilindrică. Formează conidii elipsoidal e, cu pereţ i netezi.

ăspândir şi rol

Peni illium expa sum este un mucega i psihrofil ( oate creşt la -6°C; creşte viguros la 0°C). Se dezvoltă optim la 2 °C. Temp ratura ma imă de de voltare es e de 35°C.  Este prezentat î mod frec ent pe m re şi pere la care produce putrezirea brună.  A fos izolat şi de pe căpşuni şi tomate.  Foarte r ăspândit pe aliment cum sunt carnea şi p odusele di carne.  Prod ce micotoxine de tipul patulinei şi citrininei. 



şi

utilizarea

adecvată

a

noţ iunilor

necesare

Aspergillus niger

Aspergillus oryzae

Aspergillus glaucus

Penicillium expansum

identificării


GRUPA Data Cadrul didactic

otry is cin rea

1.

aractere


form ază colonii extinse, floconoase. închis pe măsura f rmarii conidiilor.  rever ul este de culoare gri. 

2.

aractere

iceliul este iniţ ial alb, ar devine ri-gri

icroscopice

 Coni ioforii

se formeaz ă din hifele aeriene, u diferite lungimi, fi care purtând terminal u mănunchi de ramuri curte, avâ d capetele rotunjite.  Coni iile format pe aceste ramuri scu rte sunt eli soidale, ne tede şi lun i. 3.

ăspândir şi rol

Botry tis cinerea se dezvolta în domeni i de tempe raturi mini e de -2 - . 5°C, maxim de 28-35° şi optime la 22-25°C,, şi într-un i terval de p H de 2-8.  este un muceg i întâlnit î zonele t mperate, pe legume (roşii) şi f ructe (strugu i, mere, pe e, căpşuni ).  poate să produc putrezirea fructelor şi legumelor şi în condiţ ii de refriger re.  în to mnele îns rite produ e "botritiza rea nobila" cu obţ ine ea de vinuri de calitate superioara din boabel stafidite. 


Botrytis cinerea

Laborator Microbiologie

general ă|

Ge trich m ca didu

1.

aractere


miceliul are cul are alb-cr m, înălţ imi reduse şi textura a emănătoa e cu cea a drojdiilor. Pe MEA colo iile sunt e tinse, au c uloare albă, aspect pu lverulent.  rever s necolorat 

2.

aractere

icroscopice

Prezintă hife vegetative, ramificate dichotomi c, pe ca e se dez volta perpen icular hife reproduc toare, car nu se dife renţ iază de hifele veg tative.  Hifel reproducătoare se ragmentează la maturitate aproa pe în între ime, formân arthrosp ri hialini, cilindrici sau elipsoidali,, cu capete rotunjite.  Arth osporii au tendinţ a de aranjar în zig-z g, iar la aturitate evin sferici. 

3.

ăspândir şi rol

se dezvoltă la temperaturi optime de 2 5-30°C şi slab la emperaturi sub 10°C.  este agentul de contamina e al produ selor lacta drojdiei comprim te. Produ e putrezir a acr ă, î n special grapefr uit), în tim ul depozit rii acestor a. Produce râncezire alimentare.  este ontaminant frecvent al utilajelor in industri a fost denumit "mucegaiul utilajelor". 

axime de 5-38°C. Creşte e, al zemii de mur ăt ri, al a fructelo citrice (l mâi, untului şi a altor gr simi laptelui, motiv pentru care


Al erna ia alt rnat

1.

aractere oloniale 

miceliul este pu os, are ini ţ ial culoare alb murda r-gri, iar a oi devine



rever sul coloniei are culoar brun pân la negru.

run-

cenuşi .

2.

spect mi roscopic

prezi tă hife su ţ iri, septate.  form ază lanţ uri de conidii (cca., 10 c onidii), ram ificate nere gulat, la ca pătul unor c nidiofori f arte scur ţi care nu se pot di tinge. Co idiile prezi ntă 2-3 s pturi longitu inale, sunt piriforme şi dispuse c partea as uţ ita elong ata, spre c nidiofor. 

3.

ăspândir şi rol

se î tâlneşte î microflor cerealel r, seminţ lor oleagi oase pro spăt recoltate când pre enţ a lor poate fi consi derată dre t indice de prospeţ im ale acest ra. 


Fus rium gram near m

1.

aractere oloniale

Miceliul are aspect pâslos, dens, şi se extinde rapid în laca. Cul area este ro -cenuşiu pre auriu- run  Reversul este olorat în portocaliu- brun cu n uanţ e mai deschise spre margin . 

2.

spect mi roscopic 

În pr parat micr oscopic se pot obser a: conidiof ri simpli sau  macroconidii , ca e se for mează p ra ificaţ i, de obicei în mănunchi, fu siformi, cu 5 septuri. clamido pori, car -sunt mon o sau pluricelulari, de obicei glo boşi, for maţ i interc lar, de-a l ngul hifel r sau la ni velul macr conidiilor; sunt ne ezi sau ru oşi, hialini sau de cul oare brun al. 

3.

ăspândir şi rol

Se d zvolta optim la 24-26°C, la pH ,7-7,2. Este r ăspândit n natura şi este fitop atogen al gramineelo r (putrezir a în coroana la plante de grâu, p rumb).  Se p ate întâlni si pe plant e (mazăre,, cartofi, ba nane). icotoxine e tipul sci pene (zearalenone).  Poat elabora  


Clad ospor um h rbar m

1.

aractere oloniale  

2.

colonii catifelate, netede uş r ridate, d culoare ol iv. rever s de culoar brun oliv ână la ne ru-bleuma in (ca o pa ă de cerneală).

spect mi roscopic  

prezi tă hife su ţ iri, septate. Coni ioforii sunt ramific ţ i neregul at, ceea

e le con er ă un a pect

dendritic. form ază coni ii elipsoidale până la cilindri ce, cu ex tremităţ i uneori neregulate datorit cicatricilor mugurale. Conidiile s unt de obic ei neseptat e, dar cele mari pot pre enta 1-2 septuri trans ersale. 

3.

ăspândir şi rol

se poate dezvolta până la n aw de 0. 88 şi într-u n domeniu de temper atura cuprins între -1-0° şi 32°C.  este n contami ant frecvent al produ elor alime tare, este întâlnit pe ame şi prod se din car e, oua, legume proas ete, alune , cereale.  prod ce pete negre pe carn ea păstrat , în condi ţ ii de refriger are. 



şi

Botrytis cinerea

utilizarea

adecvată

a

noţ iunilor

necesare

identificării

Geotrichum candidum

Alternaria alternata Fusarium graminearum

Cladosporium herbar


GRUPA Data Cadrul didactic


TEHNICI DE IZOLARE A CULTURILOR PURE Tehnicile de izolare a microorganismelor, indiferent de natura lor, presupun opera ţ ii de prelevare a probelor biologice din medii naturale, inoculare în medii de cultur ă specifice şi, după cultivare în condiţ ii optime, izolarea şi studiul coloniilor izolate, repicare pentru obţ inerea de culturi pure. Prin cultur ă pur ă se în ţ elege biomasa de celule rezultate prin reproducere dintr-o singur ă celul ă aflat ă într-un mediu nutritiv steril cu volum limitat. Astfel, o cultur ă pur ă este format ă din celule apar ţ inând unei singure specii sau unei singure tulpini.

In funcţ ie de principiul realiz ării lor, metodele de izolare a culturilor pure pot fi clasificate în două grupe mari, şi anume: 

metode bazate pe principiul separ ării fizico-mecanice a celulelor;



metode biologice.

La rândul lor, fiecare din aceste două grupe cuprinde metode generale, care se preteaz ă a fi utilizate pentru izolarea majorit ăţ ii microorganismelor, sau metode de izolare specifice pentru un anumit grup sau un microorganism individual. Procedee fizice de izolare a culturilor pure Metoda Koch

Se bazează pe r ăspândirea microorganismelor recoltate din medii naturale într-un mediu nutritiv şi fixarea distanţ ată a celulelor în urma solidific ăm mediului cu formare prin multiplicare de colonii izolate între ele. Metoda este folosit ă în special pentru izolarea culturilor pure de drojdii. Mediul de r ăspândire este mustul de malţ cu gelatină, repartizat câte 20cm3 în 3 eprubete, fluidificat şi menţ inut la 35-40°C. Din proba aleas ă pentru izolare se recolteaz ă celulele cu ajutorul unei anse, care apoi este trecut ă succesiv în cele 3 eprubete. Dup ă inoculare şi uniformizare, con ţ inutul fiecărei eprubete se repartizează în câte o plac ă Petri, iar prin solidificarea mediului celulele care r ămân fixate în gel vor forma prin multiplicare colonii izolate. În funcţ ie de densitatea celulelor recoltate ini ţ ial, în placa a 2 a sau a 3 a pot exista colonii izolate (la o distan ţă de cca. 2 cm), iar dup ă studiul caracterelor microscopice ale coloniilor reprezentative se face repicarea în eprubete cu Malt Extract Agar, ob ţ inându-se culturi pure (fig. 1). 1



Fi . 1. Tehni a de izolar a culturilo r pure Metoda scarificat

În plăci etri sterile se repartizează mediul de cultur ă adecvat (BCA sau

MA) (fig. ).

Fig. 2 Repartiz are mediu de cultur ă decvat

2

Cu ajut rul firului etalic se recoltează celule din mediul na tural sau d in culturi ixte (fig. 3), apoi cu fir l încărcat cu celule e traseaz striuri dif erite pe suprafaţ a mediului solidificat, astfel în ât prin dru ul cât maii sinuos pa rcurs de fir (Fig.4), înt -o zonă a plăcii celulele să r ămână ataşate d mediu şi prin termostatare 48-72 h să s dezvolte şi să formeze colonii izol te.



Fig . 3 Recoltarea celulel r din cultu i mixte

Se reali ează apoi tudiul morf ologic al coloniilor repr ezentative şi culturile are interesează sunt repicate în epr ubete cu m diu steril, bţ inându-se astfel cul uri pure (fi . 5).

F ig. 4 Trasa e striuri p suprafaţ a unui mediu solidificat

3

Fig. 5 Obţ i ere de cul uri pure


Facultatea Ştiinţa şi Ingineria Alimentelor

TEHNICI INDIRECTE (CULTURALE) DE EVALUARE A

NUMĂRULUI DE MICROORGANISME Tehnica clasic ă de numărare prin cultivare pe

medii dense

Metoda culturala Koch

Metodologia de analiză presupune inoculare în masa mediului solidificat, când 1 cm3 din

fiecare diluţie se transferă cu câte o pipetă sterilă în plăci Petri sterile. Peste suspensia din fiecare placă se repartizează câte o eprubetă de mediu de cultură specific, cu agar (10-15 cm3), fluidificat şi temperat. Mediul se omogenizează cu suspensia din placă prin mişcări orizontale, circulare ale plăcii. După solidificarea mediului, prin termostatare în condiţii optime, se vor forma colonii atât la suprafaţa mediului cât şi în profunzimea acestuia.

1

Acest mod de cultivare este cel mai favorabil pentru microorganismele facultativ anaerobe, dar şi microorganismele aerobe le tolerează destul de bine. în cazul

microorganismelor anaerobe se recomandă cultivarea în dublu strat, adică după înglobarea celulelor în mediu şi solidificare, primul strat de mediu se acoperă cu încă un strat de mediu steril. Laborator Microbiologie generală|


Citire a

şi interpretarea rezultatelor

După termostatarea în condiţii optime, apariţia vizibilă a coloniilor va depinde de

particularităţile fiziologice ale microorganismelor cultivate şi de condiţiile de cultivare, de obicei după 48-72 h de cultivare. În funcţie de numărul de colonii evidenţiate în plăcile din care s-a făcut numărarea n, se va calcula numărul de microorganisme pe gram sau cm 3 probă de analiză, cu formula: 

∑     



N – numărul de celule/cm3(g) probă;

Σ n – suma numărului coloniilor din plăcile din care se face numărarea; x1 – numărul plăcilor din prima diluţie aleasa pentru numărare; x2 - numărul plăcilor din a doua diluţie aleasa pentru numărare; k – coeficientul de diluţie corespunzător primei diluţii aleasă pentru număr are; 0,1 – coeficient care egalează diluţiile. Atenţie!!! Numărarea se realizează din plăcile Petri în care s-au dezvoltat între 25 – 250 de colonii

În cazul în care numărul de colonii pe placă este mare, în imposibilitatea repetării analizei, pentru a înlesni numărarea fie se împarte placa în mai multe sectoare, se numără coloniile pe un sector şi, în final, se însumează coloniile pe întreaga placă, fie se delimitează pe reversul mediului o suprafaţă de 1 cm2, care conţine un număr mediu de microorganisme, se numără coloniile de pe această suprafaţă şi, în final, se raportează la total suprafaţă mediul din placă.

2

Laborator Microbiologie generală|

Tema: TEHNICI INDIRECTE MICROORGANISME

(CULTURALE)

DE

EVALUARE

A

NUM ĂRULUI

DE

Scopul: Cunoaşterea şi utilizarea adecvată a noţ iunilor necesare evaluării numărului de microorganisme

1. Completaţi schema de lucru pentru realizarea diluţiilor si inocularea probelor

2. Înregistraţi in tabelul de mai jos numărul de colonii/placă (in plăcile selectate pentru numărare) Diluţia

Proba

Nr. colonii/placă

1 2

3. Stabiliţi gradul de contaminare exprimat in unităţi formatoare de colonii (ufc) per gram sau ml produs: Proba 1 _______________ Proba 2 _______________

NUME/PRENUME STUDENT GRUPA Data

Cadrul didactic


METODA DIRECTĂ DE NUMĂRARE A BACTERIILOR ÎN PREPARATE FIXATE ŞI COLORATE METODA BREED

Celulele de bacterii aflate într- un volum cunoscut de lichid se repartizează pe o

suprafaţă limitată de frotiu, iar după fixare şi colorare simplă se stabileşte numărul de celule prin examen microscopic direct. 2

Pe o lamă de sticlă degresată se conturează cu markerul o suprafaţă S d de

2-6 cm (a).

a

b

c

d

Se inversează lama şi, central, cu ajutorul unei micropipete sterile, se plasează o picătură din suspensia de analizat cu un volum cunoscut V p, egal cu 0.02-0.05 cm3 (b). Imediat cu ajutorul firului se repartize ază cantitatea de probă cât mai uniform, pe întreaga suprafaţă conturată.

e

f

Se realizează uscarea în curent de aer cald (c, d), fixarea (de preferat cu soluţie de alcool 96%, timp de 20 min) (e), colorarea simplă (f), spălarea (g) şi uscarea. 1

Preparatul se studiază apoi la microscop, cu obiectiv de imersie, având grijă ca picătura de ulei de cedru să fie pusă în momentul în care se face numărarea. Se numără celulele de bacterii din mai multe câmpuri microsc opice (minimum 25; Σn=600-1000) aflate în diferite zone ale frotiului. După numărare; se Laborator Microbiologie generală |


calculează numărul mediu de celule pe câmp microscopic (x = numărul de câmpuri cercetate): ̅

∑ 

Pentru determinarea numărului de celule prezente într -un gram sau cm3 produs analizat este necesar să se cunoască: gradul de diluţie, volumul de suspensie folosit la obţinerea frotiului, mărimea suprafeţei delimitate pe care s -a realizat frotiul şi suprafaţa câmpului microscopic. Suprafaţa câmpului microscopic S c se determină cu ajutorul micrometrului obiectiv. Se înlocuieşte preparatul analizat cu lama micrometrului obiectiv şi, cu acelaşi obiectiv cu care s-a făcut numărarea, se măsoară diametrul câmpului d c cu ajutorul scării gradate (1 mm:100 diviziuni):     

unde: n d este numărul de diviziuni de pe scara micrometrului obiectiv care se cuprind exact în câmpul microscopic: 

   

 

Numărul de câmpuri microscopice posibil de studiat pe suprafaţa de frotiu delimitată - N c se calculează cu formula:  

 

Numărul de bacterii prezente într -un cm3 sau un g produs analizat se determină cu formula: ̅   





în care: k este coeficientul de diluţie.

2

Laborator Microbiologie generală |

Tema: METODA DIRECTĂ DE NUMĂRARE A BACTERIILOR ÎN

FIXATE ŞI COLORATE - METODA BREED

PREPARATE

Scopul: Cunoaşterea şi utilizarea adecvată a noţiunilor necesare evaluării numărului de microorganisme

1. Înregistraţi datele obţinute în tabelul de mai jos: Suprafaţa delimitată , cm2 Volumul suspensiei de analizat, cm3 Numărul mediu de celule pe câmp microscopic: x (numărul de câmpuri cercetate)

n (nr. celulele de

x (numărul de câmpuri cercetate)

bacterii)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

S d = V p =

 ̅

n (nr. celulele de bacterii)

13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25

∑

 ̅



Diametrul câmpului microscopic, mm

dc =

    

Suprafaţa câmpului microscopic , cm2





S c =



 



Numărul de câmpuri microscopice pe suprafaţa de frotiu delimitată

 

N c =

 

Numărul de bacterii prezente într -un ml sau un g

̅   



N=



NUME/PRENUME STUDENT GRUPA Data Cadrul didactic


METODE DIRECTE DE NUMĂRARE NUMĂRAREA CU CITOMETRE Celulele de drojdii şi sporii de mucegai se pot număra, prin examen microscopic direct, cu ajutorul citometrelor (camerelor de numărat) . Se cunosc mai multe tipuri de citometre: Thoma, Türk, Bürker, Rosenthal, Goreaev ş.a., construite pe acelaşi principiu.

Un citometru este o lamă de sticlă groasă, prevăzută cu trei platforme separate între ele prin rigole în sticlă. Platforma centrală este denivelată faţă de celelalte două cu o înălţime de 0,1- 0,2 mm (înscrisă pe fiecare cameră). Pe platforma centrală este gravată o reţea de linii perpendiculare, care delimitează o anumită suprafaţă divizată de către linii perpendiculare în microcelule de formă pătratică (pătrăţele elementare).

Diferenţierea dintre tipurile de citometre constă în mărimea variabilă a suprafeţei unui pătrăţel elementar, în cazul citometrului Thoma, suprafaţa de 1 mm2 este divizată de către linii în 400 de pătrăţele elementare cu (Fig. 1) latura de 1/20 mm.

Fig. 1 Profilul şi reţeaua citometrului Thoma 1

Pentru numărare se plasează o picătură din suspensia de celule de analizat pe platforma centrală, în dreptul suprafeţei delimitate. Peste suspensie se plasează o lamelă care se sprijină pe cele două platforme laterale şi astfel între lamelă şi citometru se creează o peliculă de lichid cu înălţime egală cu denivelarea platformei centrale (0,1 mm). Laborator Microbiologie generală |


Preparatul obţinut se studiază la microscop cu obiectiv cu grosisment x 40, când în câmpul microscopic poate fi vizualizat un grup de 16 pătrăţele elementare, din care se numără celulele a căror suprafaţă se află mai mult de jumătate în interiorul careului de 4x4 pătrăţele elementare. Se fac numărări de celule din mai multe câmpuri microscopice (∑n = 100) şi se calculează numărul mediu de celule pe un pătrăţel elementar.

Suprafaţa (S) de 1 mm2 este divizată de către linii în 400 de pătrăţele elementare cu latura de 1/20 mm. Suprafaţa pătrăţelului elementar este:  







Înălţimea platformei centrale:    

 



Volumul pătrăţelului elementar:      







 

 

 

  

    



Numărul mediu de celule pe un pătrăţel elementar: 

∑ 

Numărul de celule prezente într -un cm3 de suspensie de analizat se determină cu formula:         

în care: n - numărul mediu de celule pe un pătrăţel elementar; k - coeficient de diluţie.

În cazul bacteriilor, această metodă este greu de aplicat, atât din cauza dimensiunilor reduse ale celulelor cât şi a faptului că de multe ori ele prezintă mobilitate.

2

Laborator Microbiologie generală |

Tema:

METODE DIRECTE DE NUMĂRARE – NUMĂRAREA CU CITOMETRE

Scopul: Cunoaşterea şi utilizarea adecvată a noţiunilor necesare evaluării numărului de microorganisme

1. Analizaţi profilul şi reţeaua citometrului Thoma

2. Înregistraţi datele obţinute în tabelul de mai jos: Suprafaţa pătrăţelului elementar, mm 2  

 

S pe =



Înălţimea platformei centrale, mm 

 

h=



Volumul pătrăţelului elementar, cm 3

Vpe

    

Numărul mediu de celule pe un pătrăţel elementar: x (numărul de câmpuri x (numărul de câmpuri n (nr. cercetate) 1 2 3 4 5 ∑ ̅ 

celulele )

cercetate) 6 7 8 9 10

Numărul de celule prezente într -un cm3 de suspensie

n (nr.

 ̅

celulele )

N=



        

NUME/PRENUME STUDENT GRUPA Data Cadrul didactic


INFLUENŢA FACTORILOR DE MEDIU ASUPRA DEZVOLT ĂRII MICROORGANISMELOR

În procesul de nutriţ ie şi deci în cel de dezvoltare a microorganismelor, acestea sunt supuse influenţ elor unor factori de mediu care condi ţ ionează activitatea microbian ă determinând fie stimularea cre şterii şi reproducerii, fie inhibarea activit ăţ ii (inactivarea microorganismelor).

Procesele metabolice se desf ășoar ă în limite stricte de temperatura, specifice fiecărui microorganism. Factorul temperatur ă poate favoriza sau inhiba dezvoltarea microorganismelor, iar în anumite cazuri poate chiar determina moartea acestora. Modul de lucru

Pentru a testa influen ţ a temperaturii asupra dezvolt ării microorganismelor se folosesc două microorganisme test ( Bacillus subtilis şi Saccharomyces cerevisiae), sub formă de suspensie. Pentru fiecare microorganism luat în studiu, se iau câte trei pl ăci Petri sterile. Cu o pipet ă sterilă se introduc în fiecare plac ă, cate 1 cm3 suspensie. În fiecare plac ă Petri se toarn ă apoi cca. 15 cm 3 mediu de cultura (BCA – bulion de carne cu agar, pentru Bacillus subtilis şi MMA – must de mal ț cu agar, pentru Saccharomyces cerevisiae) fluidificat şi r ăcit la 45±5°C. Mediile se repartizeaz ă uniform în pl ăci prin rotirea acestora în plan orizontal, apoi sunt l ăsate în repaus până se produce solidificarea. Pe capacul pl ăcilor se noteaz ă numele probei, mediul utilizat şi apoi se termostateaz ă la temperaturi de 4, 25, 37°C, timp de 3 zile. Dup ă perioada de termostatare se va evalua cre șterea microorganismelor în fiecare plac ă şi se va nota nivelul de cre ștere, în tabelul din fisa de lucru.

1

Pentru a aprecia dezvoltarea microorganismelor sau activitatea enzimelor este necesar să se cunoască valoarea activit ății apei. Laborator Microbiologie general ă|


Disponibilitatea apei dintr-un mediu de cultur ă pentru transferul de substanțe şi reacțiile chimice este exprimat ă prin activitatea apei (a w). Acest parametru ia valori de la 0 la 1. Prezen ţ a substanțelor solubile în apa face ca activitatea apei pure s ă scadă sub valoarea 1. Cu cât concentra ția unei solu ții este mai mare, cu atât scăderea valorii activit ății apei este mai mare şi vice-versa, ceea ce poate crea un soc osmotic. Mod de lucru

Pentru a testa influen ţ a temperaturii asupra dezvolt ării microorganismelor se folosesc două microorganisme test, Bacillus subtilis şi Saccharomyces cerevisiae, sub formă de suspensie şi medii de cultura cu concentra ții diferite de sare (0%, 0.5%, 2% NaCl)/ diferite activit ăţ i ale aw. Pentru fiecare microorganism luat în studiu, se iau câte trei placi Petri sterile. Cu o pipet ă sterilă se introduc în fiecare plac ă, cate 1 cm3 suspensie. În fiecare plac ă Petri se toarn ă apoi cca. 15 cm3 mediu de cultura (BCA – bulion de carne cu agar pentru Bacillus subtilis şi MMA – must de mal ț cu agar pentru Saccharomyces cerevisiae) fluidificat şi r ăcit la 45±5°C. Mediile se repartizeaz ă uniform în placi prin rotirea acestora în plan orizontal, apoi sunt l ăsate în repaus până se produce solidificarea. Pe capacul pl ăcilor se notează numele probei, mediul utilizat, concentrația de sare şi apoi se termostateaz ă la temperatura de 25°C timp de 3-5 zile plăcile inoculate cu suspensie de Saccharomyces cerevisiae şi temperatura de 37°C, timp de 48 ore, pl ăcile inoculate cu suspensie de Bacillus subtilis . După perioada de termostatare se va evalua cre șterea microorganismelor în fiecare placă şi se va nota nivelul de cre ștere în tabelul din fisa de lucru.

2


Laborator Microbiologie generala_2011-2012

Recommend Documents