TUJUAN
untuk mengetahui cara memisahkan (mengisolasi) DNA dari 2 jenis buah yang dijadikan sebagai sampel, serta untuk mengetahui keaktifan detergen dalam proses isolasi DNA pada sampel buah. DASAR TEORI
Isolasi DNA adalah proses pengeluaran DNA dari tempatnya berada (ekstraksi atau lisis) biasanya dilakukan dengan homogenasi homogenasi dan penambahan buffer ekstraksi atau buffer lisis untuk mencegah DNA rusak (u!ono, 2""#). $ada sel eukariotik termasuk tanaman dan he!an bagian terbesar dari DNA berada pada nukleus yaitu organel yang dipisahkan dari sitoplasma dengan membran. Nukleus terdiri dari %" & keseluruhan DNA seluler. 'isa DNA adalah adalah organel lain seperti seper ti mitokondria dan kloroplas. arena DNA terdapat pada nukleus, maka perlu adanya metode pelisisan sel sampai pemanenan sel. Dimana metode metode tersebut merupakan bagian dari metode isolasi DNA (lrod, 2""*). $emisahan DNA dari materi seluler lainnya merupakan hal yang signifikan dan mengharuskan penyallinan DNA menjadi +NA dan translasi +NA menjadi protein berlangsung dalam kompartemen( ruang ) yang yang berbeda yaitu secara berturutturut dalam nucleus dan sitoplasma ( lrod, 2""* ). -erdapat -erdapat organelorganel bermembran ganda di dalam sitoplasma, termasuk mitokondria baik pada tumbuhan maupun he!an. leh karena itu perlu dilakukan isolasi DNA pada tanaman dan he!an untuk mengetahui dan mempelajari DNA dari tanaman dan he!an tersebut. 'el eukariotik memiliki DNA lebih banyak, lengkap dengan komponenkomponen lain. DNA tanaman dan he!an tersimpan dalam nucleusyang terbungkus oleh membran. Isolasi DNA merupakan langkah yang tepat untuk mempelajari DNA. $rinsipnya ada dua, yaitu sentrifugasi dan presipitasi.'entrifugasi merupakan teknik untuk memisahkan campuran berdasarkan berat molekul komponennya. /olekul /olekul yang mempunyai berat molekul besar besar akan berada di bagian ba!ah tabung dan molekul ringan akan berada pada bagian atas tabung. 0asil sentrifugasi akan menunjukkan dua macam fraksi yang terpisah, yaitu
supernatan pada bagian atas dan pelet pada bagian ba!ah. $resipitasi merupakan langkah yang dilakukan untuk mengendapkan suatu komponen dari campuran (u!ono, 2""#). DNA pada makhluk hidup dapat diisolasi secara s ederhana. $engisolasian DNA secara sederhana dapat dilakukan dengan memecahkan dinding sel, membran plasma dan membran inti baik secara mekanik maupun secara kimia!i. Isolasi DNA merupakan suatu teknik yang digunakan untuk memperoleh DNA murni, yaitu tanpa protein dan +NA dari suatu sel dalam jaringan. $emecahan dinding sel secara mekanik dapat dilakukan dengan pemblenderan atau penggerus menggunakan mortar dan pistil. 'edangkan secara kimia!i dapat dilakukan dengan pemberian detergen. $enambahan sabun cair dan garam dapur adalah untuk melisiskan membran inti untuk mengeluarkan isi inti sel yang berisi DNA. Isolasi DNA dapat dilakukan melalui tahapantahapan antara lain1 preparasi ekstrak sel, pemurnian DNA dari ekstrsk sel dan presipitasi DNA. /eskipun isolasi DNA dapat dilakukan dengan berbagai cara, akan tetapi pada setiap jenis atau bagian tanaman dapat memberikan hasil yang berbeda, hal ini dikarenakan adanya senya!a polifenol dan polisakarida dalam konsentrasi tinggi yang dapat menghambat pemurnian DNA. ika isolasi DNA dilakukan dengan sample buah, maka kadar air pada masingmasing buah berbeda, dapat memberi hasil yang berbedabeda pula. 'emakin tinggi kadar air, maka sel yang terlarut di dalam ekstrak akan semakin sedikit, sehingga DNA yang terpretisipasi juga akan sedikit (amilah, 2""3). $enambahan deterjen dalam isolasi DNA dapat menyebabkan rusaknya membrane sel, melalui ikatan yang dibentuk melalui sisi hidrofobik deterjen dengan protein dan lemak pada membrane membentuk senya!a 4lipid proteindeterjen kompleks5. 'enya!a tersebut dapat terbentuk karena protein dan lipid memiliki ujung hidrofilik dan hidrofobik, demikian juga dengan deterjen, sehingga dapat membentuk suatu ikatan kimia (amilah, 2""3). $rinsip 6 prinsip dalam mengisolasi DNA (/uladno, 2""2) 1 7. melisis sel secara fisik, dengan cara penggerusan. 2. pemecahan dinding sel. 8. pemecahan membran sel. 9. pemisahan DNA dari bahan yang lain.
Dalam isolasi DNA, bahan yang kita gunakan biasanya berupa jaringan tumbuhan atau jaringan he!an, untuk itu langkah pertama yang harus kita lakukan adalah memecahkan jaringan menjadi selsel yang mandiri. $roses dilakukan secara mekanik atau fisik dengan menumbuk atau menggerus bahan yang akan kita gunakan dengan mortar atau blender. edua adalah memecahkan dinding sel dan membran sel lapisan pembungkus DNA. struktur utama pembentuk membran dan dinding sel adalah lemak, untuk itu kita gunakan deterjen dan garam dapur. edua bahan ini digunakan untuk melubangi dan merusak s el sehingga isi inti sel (DNA) bisa keluar (/uladno, 2""2). -ahap selanjutnya adalah pemisahan DNA dari bahan yang lain. $emisahan dilakukan dengan menggunakan ethanol:alkohol dingin berkonsentrasi %"%3&. thanol:Alkohol tidak melarutkan DNA dan berat jenis alkohol yang lebih ringan dari air membuat DNA naik dan melayanglayang di permukaan . ;-A< atau Cetyl trimethylammonium bromide merupakan sejenis deterjen yang dapat mendegradasi dinding sel, denaturasi protein, memisahkan karbohidrat, merusak membran sel dan melarutkan DNA. Apabila dinding sel terdegradasi maka semua isi sel dapat keluar termasuk DNA dan dilepaskan ke dalam buffer ekstraksi.Da lam proses isolasi DNA tanaman, penambahan senya!a pereduksi seperti merchaptoetanol dapat mencegah proses oksidasi senya!a fenolik sehingga menghambat akti=itas radikal bebas yang dihasilkan oleh oksidasi fenol terhadap asam nukleat. /erchaptoetanol juga berfungsi untuk meli ndungi +NA dari senya!a >uinon, disulphide, peroksida, poliphenoksidase, dan protein. $roses pemansan pertama bertujuan untuk melarutkan ;-A< dan mercaptoetanol. 'edangkan pemanasan yang kedua bertujuan untuk memdegradasi protein dan dinding sel. Klorofrom dan isoamilalkohol (;IAA) berfungsi untuk mengekstrak dan dan mengendapkan komponen polisakarida di dalam buffer ektraksi yang mengkontaminasi larutan DNA. $emberian isopropanol dan etanol dilakukan agar terjadi dehidrasi DNA sehingga terjadi presipitasi. 'etelah pemberian etanol, pellet yang dipeoleh dikeringanginkan. 0al ini bertujuan untuk mengeringkan pellet dari sisasisa buffer maupun etanol.-ahapan terakhir dari ektraksi ini adalah penambahan buffer -.
yang berukuran tebal dan dapat memisahkan DNA dari polisakarida karena adanya perbedaan karakteristik kelarutan (differensial of solubility). Disamping deperoleh fragmen DNA, dengan metode ;-A< juga akan diperoleh +NA dengan pita tipis yang terletak jauh berada di ba!ah pita DNA. eberadaan pita +NA tergantung bahan yang diekstraksi (lrod, 2""*). /etode ini tidak membutuhkan biaya yang lebih mahal dibandingkan dengan menggunakan kit. 'elain itu, kelebihan dari ektraksi ini adalah pita DNA yangdiproleh lebih tebal bila dibandinglan dengan ektraksi metode fenol dan tanpa fenol. Akan tetapi, dari hasil dengan metode ini masih terdapat pita smear dan DNA yang dihasilkan lebih sedikit daripada ektraksi dengan menggunakan kit. endala yang umum te rjadi dalam ekstraksi ;-A< adalah adanya inhibitor pada inang, rendahnya konsentrasi =ius dan pengaruh cara maupun lama !aktu penyimpanan. ALAT DAN BAHAN
Alat :
•
$ipet tetes
•
•
•
@elas ukur
•
-imbangan
•
-abung reaksi
•
ertas saring
Bahan :
•
•
•
•
Alkohol
•
A>uades *3&
•
A>uades dingin %&
•
@aram
CARA KERJA
7. uades, kemudian diblender hingga halus. 9. /asingmasing buah yang telah diblender dimasukkan kedalam 8 botol selai. 3. Dilarutkan 7 spatula detergen kedalam " ml a>uades, kemudian diaduk hingga larut. . -iga jenis larutan detergen kemudian dimasukkan kedalam masingmasing tabung reaksi yang berisi jus buah sebanyak 9 ml. *. Ditambahkan 7 spatula garam dapur kedalam masingmasing tabung reaksi, kemudian diaduk hingga larut. #. ;ampuran kemudian disaring sebanyak 2 kali dengan kertas saring. %. Balu ditambahkan alkohol % & sebanyak 3 ml kedalam masingmasing campuran. 7". Barutan kemudian dihomogenkan dengan menggunakan mesin =orteC. 77. Amati dan catat hasil !aktu dan tumpukan !arna putih yang terbentuk.
DATA
N o 7
enis
/elon I
enis Detergen •
•
•
2
/elon II
•
•
•
aktu
;rea m
•
;rea m
•
• •
"2179 ""18" "717#
ualitas
• • •
eterangan
E EEE EE
• •
•
• •
"#1"* 7"1"7 "#1"3
• • •
EEE E EE
• • •
apas
apas apas apas
ANALISIS DATA
$raktikum ini dilakukan untuk mengetahui pengaruh macam buah dan jenis deterjen terhadap kualitas DNA yang dihasilkan dalam proses isolasi. $erlakuan pertama menghaluskan buah melon menggunakan blender sampai halus dan ditambahkan a>uades *3& dan dituangkan pada botol selai. emudian ditambahkan tiga macam detergen yang berbeda yaitu cream, bubuk, dan cair. 'etelah ketiga jenis detergen ditambahkan dengan tiga botol selai yang berbeda dan ditambahkan garam, kemudian dipindahkan ke dalam tabung reaksi dan ditambahkan a>uades dingin %& dan didiamkan hingga terbentuk endapan putih. Dari hasil percobaan yang sudah dilakukan didapatkan pada melon I dengan detergen cream didapatkan !aktu "2179 dengan kualitas (E) dan terbentuk kapas. $ada detergen bubuk didapatkan !aktu ""18" dengan kualitas (EEE) dan terbentuk benang, serta pada detergen cair diperoleh !aktu "717# dengan kualitas (EE) dan adanya bentuk kapas didalam tabung reaksi.
emudian pada melon II yang dengan perlakuan sama pada tiga detergen yang berbeda didapatkan hasil dengan detergen cream didapatkan !aktu "#1"* dengan kualitas (EE E) dan adanya bentukan kapas pada tabung. $ada tabung reaksi selanjutnya dengan detergen bubuk diperoleh !aktu 7"1"7 dengan kualitas (E) dan adanya kapas pada dalam tabung, serta yang terakhir dengan tabung berisi detergen cair diperoleh !aktu "#1"3 dengan kualitas (EE) dan adanya bentukan kapas didalam tabung reaksi. $erbedaan dengan samanya jenis buah ini dapat disimpulkan sementara bah!a penggunaan detergen yang berbeda dalam percobaan dilakukan untuk mengetahui detergen dalam bentuk apa yang paling aktif dalam menghancurkan membran sel pada setiap sampel buah.'etelah dilakukan percobaan ternyata detergen bubuk menghasilkan DNA kasar yang lebih terlihat serta endapan putih yang lebih banyak.
PEMBAHASAN
•
$rinsip utama dalam isolasi DNA ada tiga yakni penghancuran (lisis), ektraksi atau pemisahan DNA dari bahan padat seperti selulosa dan protein, serta pemurnian DNA. 'elain itu ada 2 prinsip lagi dalam melakukan isolasi DNA, yaitu sentrifugasi dan presipitasi. $rinsip utama sentrifugasi adalah memisahkan substansi berdasarkan berat jenis molekul dengan cara memberikan gaya sentrifugal sehingga substansi yang lebih berat akan berada di dasar, sedangkan substansi yang lebih ringan akan terletak di atas. -eknik sentrifugasi tersebut dilakukan di dalam sebuah mesin yang bernama mesin sentrifugasi dengan kecepatan yang ber=ariasi. Dalam percobaan ini, kami melakukan isolasi DNA yang berasal dari 8 jenis buah yang memiliki kandungan air yang berbeda yaitu buah melon, buah jeruk dan buah semangka. /etode yang dilakukan dalam percobaan ini adalah penghancuran (lisis) serta ekstraksi. $erlakuan pertama yang diberikan pada buah melon yaitu mengupas serta memotongnya menajadi ukuran yang lebih kecil, hal ini dilakukan agar pada saat penghancuran buah mudah dihancurkan menjadi partikel 6 partikel yang lebih kecil dan menyaringnya dengan penyaring. -ahap selanjutnya yaitu menambahkan campuran det ergen yang sudah dilarutkan, hal ini bertujuan untuk merusak membran sel dari kedua buah
tersebut. $erusakan membran sel terjadi akibat adanya ikatan kimia yang terbentuk antara detergen dengan ?at?at yang ada pada buah. Detergen bisa menyebabkan kerusakan membran sel dengan mengemulsi lipid dan protein sel serta menyela interaksi polar yang menyatukan membran sel karena detergen mengandung disodium D-A dan lauryl sulfat yang memiliki fungsi yang sama dengan dodesil sulfat (amilah, 2""3). 'edangkan menurut /uladno (2""2), penambahan deterjen dalam isolasi DNA dapat dilakukan karena deterjen dapat menyebabkan rusaknya membran sel, melalui ikatan yang dibentuk melalui sisi hidrofobik deterjen dengan protein dan lemak pada membran membentuk senya!a 5lipid proteindeterjen kompleks5. 'enya!a tersebut dapat terbentuk karena protein dan lipid memiliki ujung hidrofilik dan hidrofobik, demikian juga dengan deterjen, sehingga dapat membentuk suatu ikatan kimia. 'etelah penambahan detergen tahap selanjutnya yaitu penambahana garam, tujuan dari penambahan garam adalah untuk memudahkan pemisahan benangbenang DNA dari campuran sehingga benangbenang tersebut akan mudah diamati. 0al ini terjadi karena NaE dalam garam dapat membentuk ikatan pada kutub negati=e dari ikatan fosfat DNA. -ahap selanjutnya yaitu penambahan a>uades dingin % &, penambahan ini bertujuan untuk mempermudah terjadinya presipitasi pada benangbenang DNA. A>uades dingin %& tersebut mampu memba!a asam nukleat yang terdapat dalam campuran naik ke permukaan, untuk kemudian diendapkan.'etelah ditambahkan ethanol larutan kemudian kembali dihomogenkan pada mesin =orteC. Dari percobaan isolasi DNA diperoleh hasil pada buah melon yaitu perubahan !arna yang terjadi yaitu pada buah melon pertama dengan jenis detergen cream, bubuk, cair dengan !aktu "2179, ""18", "717# dan diperoleh hasil bentukan kapas, benang, kapas. 'edangkan pada buah melon II dengan jenis detergen cream, bubuk, cair dengan !aktu "#1"*, 7"1"7, "#1"3 dan diperoleh bentukan kapas dalam tiga jenis detergen yang berbeda. $erbedaan kedua jenis melon ini diakibatkan oleh perbedaan susunan DNA yang terdapat pada buah. Dari percobaan pada kedua buah melon diperoleh DNA kasar atau benang 6 benang halus (supernatant) dalam jumlah yang sedikit serta endapan putih yang terlihat. Dari hasil yang didapatkan terlihat bah!a ada perbedaan pengaruh detergen !aktu dalam melepaskan DNA pada jenis buah tertentu, dimana tidak semua buah letal terhadap kandungan dari suatu detergen. 0al ini terjadi karena pada buah terdapat perbedaan pigmen yang masih berikatan dengan DNA, dimana pigmen ini memiliki ukuran atau kemampuan
yang berbeda dalam melepaskan diri dengan DNA pada setiap detergen, sehingga perbedaan !aktu terlepasnya DNA dari sel tersebut juga menunjukkan bah!a kemampuan setiap detergen dalam merusak membran sel tidak sama.
KESIMPULAN
Dari percobaan isolasi DNA yang telah dilakukan dapat diketahui metode atau cara bagaimana mengisolasi DNA dari buah yang dijadikan sebagai sampel. aitu melalu cara penghancuran (lisis), ekstraksi, serta pemurnian. $enggunaan detergen yang berbeda dalam percobaan dilakukan untuk mengetahui detergen dalam bentuk apa yang paling aktif dalam menghancurkan membran sel pada setiap sampel buah.'etelah dilakukan percobaan ternyata detergen bubuk menghasilkan DNA kasar yang lebih terlihat serta endapan putih yang lebih banyak. DAFTAR RUJUKAN
lrod, '., 2""*. Genetika Edisi Keempat . rlangga. akarta. amilah. 2""3. Pengaruh Berbagai acam Deter!en" Penambahan Garam dan Ekstrak #anas $Ananas Comusus% terhadap &asil 'solasi D#A Berbagai acam Buah sebagai Topik Praktikum ata Kuliah Genetika. 'kripsi tidak diterbitkan. /alang1 $rogram 'arjana
u!ono, -., 2""#. Biologi olekuler . rlangga. akarta.
