LAPORAN PRAKTIKUM KEGIATAN III ISOLASI PIGMEN TANAMAN DENGAN KROMATOGRAFI KOLOM
Dosen Pengampu: Fitria Susilowati, S.Pd., M.Sc.
Disusun oleh: Aisyah Rulina Safitri NIM: 36.2015.7.1.2275
PROGRAM STUDI FARMASI FAKULTAS ILMU KESEHATAN UNIVERSITAS DARUSSALAM GONTOR NGAWI 2017
I.
TUJUAN 1. Mengetahui pengertian kromatografi kolom 2. Melakukan isolasi pigemen tanaman dengan kromatografi kolom 3. Mengetahui kandungan pigmen dalam kangkung II. DASAR TEORI Kromatografi kolom merupakan suatu metode pemisahan fisik, dimana komponen-komponennya dipisahkan dan didistribusikan diantara 2 fase, salah satu fase tersebut adalah suatu lapisan stationer dengan permukaan yang luas, yang lainnya sebagai fluida yang mengalir lembut disepanjang landasan stationer. Pase stationer bisa berupa padat maupun cairan, sedangkan fase gerak bisa berupa cairan atau gas (Day dan Underwood, 1986). Kromatografi kolom adsorbsi merupakan salah satu contoh dari kromatografi cair-padat yang termasuk teknik tertua yang dioperasikan berdasarkan retensi terlarut pada permukaan adsorben. Pada kromatografi adsorbsi, fase stationernya terdiri atas zar padat dan fase geraknya terdiri dari zar gas atau cair. Yang temasuk dalam kromatografi cair-padat adalah kromatografi kolom adsorbsi, kromatografi gas, dan kromatografi lapis tipis (Gandjar dan Rohman, 2007). Pada kromatografi kolom, campuran yang akan dipisahkan diletakkan pada bagian atas kolom penjerat yang berada dalam tabung kaca, tabung logam, atau tabung plastik. Kolom kromatografi tabung untuk pengaliran karena gaya tarik bumi (gravitasi) atau sistem bertekanan rendah biasanya terbuat dari kaca ynag dilengkapi dengan keran jenis tertentu oada bagian bawahnya untuk mengatur aliran pelarut (Gritter, 1991). Klasifikasi kromatografi kolom berdasarkan interaksi komponen dengan adsorben adalah: 1. Kromatografi adsorbsia: komponen yang dipisahkan secara selektif teradsorbsi pada permukaan adsorben yang dipakai untuk isian kolom. 2. Kromatografi partisi: komponen mengalami partisi antara kapisan cairan tipis ada penyangga padat dan eluen. 3. Kromatografi pertukaran ion: komponen yang dipisahkan berbentuk ion. 4. Kromatografi filtrasi gel: pemisahan berdasarkan ukuran komponen yang dipisahkan.
Pengemasan kolom dapat dilakukan dengan cara basah atau cara kering. Cara basah lebih mudah untuk memperoleh packing yng memberikan pemisahan yang baik. Sedangkan cara kering umumnya dilakukan untuk alumina. Dalam cara basah, fase diam dicampur terlebih dahulu dengan pelarut sebelum dimasukkan ke tabung kolom. Sedangkan cara kering fase diam dimasukkan terlebih dahulu kedalam kolom, baru dialiri fase gerak (Basset, 1994). Kromatografi kolom memiliki peranan yang sangat luas dalam berbagai bidang, misalnya dalam penentuan kualitatif atau kuantitatif suatu senyawa. Metode ini juga diaplikasikan dalam pemisahan molekul-molekul penting seperti asam nukleat, karbohidrat, lemak, vitamin, dan molekul penting lainnya. Selain itu juga bisa digunakan untuk infestigasi suatu senyawa berbahaya dalam pasien atau korban. Kromatografi kolom memiliki kelebihan dan kekurangan. Kelebihannya adalah dapat digunakan untuk analisis dan aplikasi preparatif, menentukan jumlah komponen campuran, dan untuk memisahkan dan purifikasi. Selain itu metode ini hanya membutuhkan alat dan bahan yang mudah didapat dan murah, hanya membutuhkan waktu yang singkat, dan udah pelaksanaannya. Kekurangnnya adalah membutuhkan kemampuan dalam teknik dan manual untuk menyiapkan kolom yang sasuai dengan sampel, dan juga kurang akurat dalam penetapan kuantitaitf komponen dalam senyawa (Gritter, 1991). Kangkung (Ipomoea aquatica) merupakan semak yang kadang-kadang berumur 1 tahun atau menahun. Batangnya menjalar diatas tanah basah atau terapung. Tangkai daun tebal 3-20 cm, helaian daun sangat berbeda dalam bentuk dan ukuran, bulat telur, segitiga, memanjang, bentuk garis/lanset, gundul, rata/bergerigi, hidup ditanam atau liar, tempat lembab, berawa, genangan, parit, sawah, pinggir jalan (Steenis, 1947). Tanaman
memiliki
pigmen
yang
digunakan
untuk
membantu
kelangsungan hidupnya, macam-macam pigemen dalam tanaman adalah:
1. Klorofil: merupakan pigmen fotosintesis yang terdapat pada sebagian besar tumbuhan. Dibagi menjadi klorofil a yang mengandung warna hijau, dan klorofil b yang mengandung warna biru. 2. Karotenoid: merupakan pigmen penyebab warna merah, orange, dan kuning pada sayuran. 3. Antosianin: pembei warna merah, merah muda, ungu, dan biru. 4. Xantofil: pigmen berwarna kuning III.
ALAT DAN BAHAN A. ALAT 1. Gelas ukur 10 ml 2. Gelas ukur 20ml 3. Gelas beaker 120 ml 4. Corong 5. Pipet tetes plastik 6. Pipet tetes kapiler 7. Kolom 8. Klem dan statif 9. Tube 10. Spatula
: 2 buah : 2 buah : 1 buah : 1 buah : 2 buah : 1 buah : 1 buah : 1 buah : 12 buah : 2 buah
B. BAHAN 1. Silica gel 2. Daun kangkung 3. Solven PA (Pro Analysis) 4. Anhidrat 5. Kertas saring 6. Alumunium foil
: 3 gr : 7 lembar : aseton, n-heksana, metanol : secukupnya : secukupnya : secukupnya
IV. PROSEDUR KERJA A. PENYIAPAN KOLOM DAN FASE DIAM Menimbang silica gel 3 gram dalam keadaan kering
Menambahkan n-heksana secukupnya dan diaduk hingga membentuk slurry
Memasukkan kapas ke pangkal kolom
Memasukkan slurry secara perlahan dan menyiram sisa slurry di dinding kolom dengan n-heksana
Mengurangi n-heksana hingga 1 cm diatas permukaan silica, meratakan silica dengan menepuk kolom perlahan hingga packing kolom baik dan rapat
B. EKSTRAKSI DAUN KANGKUNG Menghaluskan 7 lembar daun kangkung dengan lumpang alu dan menambahkan kurang lebih 5ml aseton, mengaduknya hingga homogen
Menyiapkan kolom dan melapisinya dengan kertas saring dan membasahinya dengan aseton
Memasukkan anhidrat secukupnya di pangkal corong
Menyaring kangkung yang telah halus dan filtratnya dimasukkan dalam tube dan ditutup dengan alumunium foil
C. ELUSI DENGAN KROMATOGRAFI KOLOM
Menyiapkan 5 macam palarut, (1) 5ml n-heksana, (2) 5ml n-heksana : aseton 7:3, (3) 5ml aseton, (4) 5ml aseton : metanol 8:2, (5) 5ml metanol
Memasukkan larutan sampel (2,9 ml) secara perlahan-lahan dengan pipet
Memasukkan eluen sesuai urutan non-polar ke polar secara perlahan
Menampung eluet sesuai warna ke botol-botol vial
V.
DATA PENGAMATAN Fraksi 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
VI.
Warna Bening Kuning jernih segar Kuning jernih pucat Jernih kecoklatan Coklat Coklat muda Kuning kehijauan Hijau muda Hijau bening Jernih kehijauan Bening
PEMBAHASAN Kromatografi kolom merupakan metode tertua yang digunakan untuk
pemisahan komponen dari suatu senyawa. Metode ini banyak digunakan dalam berbagai bidang, contohnya dalam bidang klinis. Metode ini bisa dibunakan untuk menganalisis komponen suatu senyawa berdasarkan kualitatif ataupun kuantitatif. Metode kromatografi kolom banyak menjadi pilihan karena banyak kelebihannya dari pada metode lain. Kelebihannya adalah dapar digunakan untuk analisis dan aplikasi preparatif, menentukan jumlah komponen dalam senyawa, dan untuk pemisahan dan purivikasi. Selain itu pelaksanaannya murah dan mudah didapatkan sedangkan kekurangannya adalah bentuk kemampuan dan keahlian khusus untuk membuat kolom yang sesuai dengan sampel, dan juga kurang akurat dalam penetapan kuantitatif komponen. Prosedur awal dari metode ini adalah penyiapann kolom dan fase diam. Fase diam yang digunakan praktikan dalam praktikum ini adalah silica gel. Alasan
pemilihan silica gel karena memiliki tekstur dan struktur yang lebih kompak dan teratur. Saat memadat, silica gel akan berbentuk tetrahedral raksasa sehingga ikatannya kuat dan rapat, sehingga proses pemisahan menjadi optimal. Silica gel dapat membentuk ikatan hidrogen dipermukaannya, karena terikat gugus hidroksil. Oleh karenanya, silica bersifat polar. Jika fase gerak non polar, komponen-komponen yang bersifat polar akan terikat dan tertahan dalam fase diam. Komponen yang tidak polar akan keluar bersama fase gerak lebih cepat. Metode pembuatan fase diam dalam praktikum ini adalah metode basah. Silica gel ditimbang
gram dan dilarutkan dengan n-heksana. Setelah itu
dimasukkan perlahan ke dalam kolom melewati dinding kolom, alasan melewati dinding kolom adalah agar gelembung udara tidak terjebak ditengah-tengah silica, jika ada gelembung udara akan mengurangi kesuksesan proses pemisahan. Setelah itu dinding kolom disirami n-heksana hingga tidak tersisa silica di dinding kolom. Jika n-heksana berlebih, keran dibuka dan n-heksana dialirkan keluar hingga 1 ml diatas permukaan silica. Ini bertujuan agar fase diam tidak mengaring dan pecah. Untuk meratakan susunan silica, kolom ditepuk-tepuk perlahan hingga teksturnya menjadi rapat dan padat. Setelah siap, kolom ditutup dengan alumunium foil untuk mengurangi penguapan dari n-heksana. Prosedur selanjutnya adalah ekstraksi daun kangkung. 7 Lembar daun kangkung dihaluskan dengan lumpang alu hingga halus. Setelah itu ditambahkan kurang lebih 5 ml aseton, ini bertujuan untuk melarutkan komponen-komponen yang ada dalam kangkung. Dipilih aseton karena aseto erupakan salah satu pelarut yang bersifat netral, sehingga bisa melarutkan senyawa polar dan non polar. Setelah tercampur, menyiapkan corong yang telah dilapisi kertas saring. Kertas saring dibasahi aseton dan dimasukkan anhidrat di pangkal corong. Anhidrat ini berguna untuk menyerap air, sehingga ketika residu disaring akan menghasilkan sampel yang pekat dengan kadar air yang sedikit. Selanjutnya adalah persiapan elusi. Sebelum dilakukan elusi, terlebih dahulu disiapkan fase gerak. Fase gerak yang digunkan ada 5 macam, yaitu:
1. 2. 3. 4. 5.
5 ml n-heksana 5 ml n-heksana : aseton (7:3) 5 ml aseton 5 ml aseton : metanol (8:2) 5 ml etanol
Fase gerak ini berurutan dari non polar ke polar. Alasan digunakan campuran 2 pelarut karena agar mudah diatur sedemikian rupa sehingga pemisahan dapat terjadi secara optimal. Setelah tersedia, eluen ditutup rapat agar tidak terjadi penguapan. Tahap selanjutnya adalah penuangan sampel pada kolom. Penuangan ini harus dilakukan secara lembut dan perlahan agar tidak merusak susunan silica dalam kolom. Jika terlalu keras dalam penuangan, silica akan retak dan kolom dikatakan rusak. Jika terjadi keretekan, bisa ditanggulangi dengan pembalutan kolom dengan kertas tisu yang telah dibasahi dengan aseton atau alkohol. Sehu rendah dari alkoholdan aseton akan menyatukan kembali retakan dalam silica, sehingga menjadi pada dan rapat kembali. Tahap terpenting adalah proses elusi. Eluen dimasukkan perlaha dengan pipet tetes kapiler melalui dinding kolom. Disamping pemasukan eluen, keran kolom dibuka dan tetesannya diatur sedemikian rupa agar tidak terlau pelan atau cepat. Eluen yang ada di kolom harus selalu diamati agar tingginya tidak meyerupai permukaan silica, ini bertujaun agar silica tidak kering dan retak. Eluet yang keluar dimasukkan dalam botol-botol vial berdasarkan warnya. Jika terbagi berdasarkan warna, eluet bisa dianalisis atau dimonitoring kembali menggunakan KLT. Penuangan eluen dilakukan secara berurutan mulai dari non polar hingga polar. Komponen yang bersifat polar akan terikat dengan permukaan silica sehingga akan tertahan sementara. Sedangkan komponen yang bersifat non-polar akan terbawa dengan eluen non-polar keluar kolom. Saar eluen polar kasuk, komponen polar aan terlepas dari silica dan ikut keluar bersama eluen. Jika penuangan eluen dilakukan secara terbalik (polar – non-polar), eluen akan berinteraksi dengan silica, akhirnya proses pemisahan menjadi tidak optimal. Dan dari jenis fase diam dan fase gerak tersebut, kromatografi kolom ini dapat
digolongkan menjadi kromatografi fase normal. Ini dikarenakan fase diam yang digunakan bersifat polar, dan fase geraknya bersifat non-polar ke polar. Fraksi-fraksi yang didapatkan dari kromatografi kolom iniada dalam berbagai warna. Warna yang ada secara berurutan adalah kuning, coklat, kuning kehijauan, dan hijau. Fraksi awal berwarna kuning mengartikan adanya senyawa karotenoid. Setelah itu warna coklat yang mengartikan adanya senyawa antosianin. Fraksi selanjutnya berwarna kuning kehijauan yang mengartikan senyawa xantofil. Praktikan menyipulkan bahwa fraksi kuning kedua adalah xantofil karena xantofil merupakan senyawa agak polar yang biasanya muncul bersama klorofil. Fraksi selanjutnya adalah pigmen hijau yang mengartikan adanya klorofil. Fraksi berwarna hijau hasil pemisahan ini didapatkan hanya sedikit karena kandungan klorofil dalam kangkung tersebar pada seluruh badan tanaman, didaun dan dibatang. Berbeda dengan bayam yang kebanyakan klorofilnya berada di daun, sehingga fraksi yang didapatkan lebih banyak berwarna hijau. Dan dibanding dengan fraksi kelompok 4, kebanyakan berwarna hijau. Ini disebabkan karena sampel yanag mereka gunakan adalah daun kangkung muda,
yang disana
terdapat banyak
sekali kandungan
klorofil
untuk
berfotosintesis. Sedangkan praktikan menggunakan daun kangkung besar dan tua yang kandungan klorofilnya mulai berkurang.
VII.
KESIMPULAN Kromatografi kolom merupakan suatu metode pamisahan fisik dimana
komponen-komponennya dipisahkan dan didistribusikan diantara 2 fase. Fase diamnya berupa zat padat dan fase geraknya berupa zat cair atau gas. Cara mengisolasi pigmen tanaman dengan kromatografi kolom adalah dengan menyiapkan kolom dan fase diam, mengekstraks sampel, lalu dielusikan dengan kromatografi kolom.
Kandungan pigmen dalam kangkung adalah kuning (karotenoid), coklat (antosianin), kuning kehijauan (xantofil), dan hijau (klorofil).
VIII.
DAFTAR PUSTAKA
Basset, J, 1994, Buku Ajar Vogel Kimia Analisis Kuantitatif Organik, Penerbit Buku Kedokteran EGC, Jakarta. Day, R.A. Dan Underwood, A.L., 1986, Analisis Kimia Kuantitatif, Penerbit Erlangga, Jakarta. Gholib, Ibnu Gandjar Dan Rohman, Abdul, 2007, Kimia Farmasi Analisis, Pustaka Pelajar, Yogyakarta. Gritter, R.J., 1991, Pengantar Kromatografi, ITB, Bandung. Khopkar, S.M., 2000, Konsep Dasar Kimia Analitik, UI-Press, Jakarta. Steenis, C.G.G.J. Van, 1947, Flora, PT.Balai Pustaka Persero, Jakarta Timur.
