TINCIÓN DEL FROTIS SANGUÍNEOS. El frotis sanguíneo una vez seco se somete a un proceso p roceso de fijación y posteriormente a una tinción mediante a un colorante adecuado. En la mayoría de los laboratorios los colorantes más empleados para la tinción hematológica se basan en el de Romanowsky constituido fundamentalmente fundamentalmente con la mezcla de eosina (ácida) y azul de metileno (básico). Además se ha incorporado el empleo de derivados por oxidación del azul de metileno que se conoce con el nombre de azures (A, B, C). Son los azures responsables de la coloración púrpura o roja de ciertas estructuras. Tanto la eosina como el azul de metileno son muy sensibles a las variaciones de pH de las diferentes estructuras celulares de forma que las que tienen carácter básico fijan la eosina mientras que las que poseen propiedades ácidas fijan principalmente el azul de metileno. Esto explica que las estructuras basófilas se tiñan de color azul mientras que los competente acidófilas adquieren un color rosado. Igualmente la diferente afinidad de ciertas granulaciones citoplasmáticas por dichos colorantes permite clasificar los leucocitos polimorfos nucleares en 3 grupos: A·- Granulocitos eosinófilos: en los que la granulación específica contiene sustancias de carácter básicos que fijan los colorantes ácidos y se tiñen de color rojo-naranja. B·- Granulacitos basófilos: en los que la granulación específica posee sustancias de carácter ácido que fijan los colorantes básicos y se tiñen de color azul oscuro. C·- Granulocitos neutrófilos: en los que la granulación específica posee compuestos de carácter neutros que fijan ambos colorantes simultáneamente. simultáneamente. Debido a ello se tiñen de un color pardo. Los azures (A, B, C) son los responsables de la coloración púrpura o roja de la cromatina de los leucocitos y de ciertas granulaciones citoplasmáticas que por ello se denominan azurófilos. Dentro del grupo de colorante tipo Romanowsky los más utilizados son el de Giemsa, Wright, MayGrünwald- Giemsa:
Tinción de May- Grünwald- Giemsa (panóptica): Es el resultado de combinar la tinción de Giemsa con la de May- Grünwald y se conoce como tinción panóptica. Esta tinción resulta de manera especial las granulaciones leucocitarias y mejora la coloración de los hematíes. de Giemsa, colorante de May- Grümwald (está constituido por una solución alcohólica de azul de metileno y eosina). • Material: frotis sanguíneo seco, colorante
• Método:
1·- Fijar el frotis en el porta sumergiéndolo en solución de M-G durante 2 o 3 min. 2·- Transferido a una dilución de May-Grünwald durante 2 o 3 minutos diluida en agua destilada o con pBs preparada extemporáneamente extemporáneamente y dejarla uno 2 o 3 minutos. 3·- Sin lavar sumergir el frotis en la solución de Giemsa prepara extemporáneamente durante 20 minutos. 4·- Lavar el frotis con abundante agua destilada y sumergirlo en tampón pBs de pH = 6.8 de unos 2 a 5 minutos.
5·- Secar el frotis al aire y una vez seco está listo para su observación al microscopio. • Resultados: esta preparación proporciona una amplia gama de colores. Los hematíes se tiñe n
de un color rosa pálido con una zona central más clara. La policromía se advierte con una tendencia de color azulado. La cromatina nuclear se tiñe de violeta oscuro dejando dibujadas las estructuras cromáticas que sirven para ver el grado de madurez de la célula. Las granulaciones de los eosinófilos son rojo-anaranjado casi amarillentas. La de los basófilos son violeta muy oscuro y la de los neutrófilos rojo-púrpura Los linfocitos tienen pequeños granos azurófilos de color rojo. Las plaquetas presentan una porción periférica azulado y gránulos centrales rojos. El citoplasma de los linfocitos es casi siempre azul y el de los monocitos presenta un color ligeramente azulado. CAUSAS DE ERROR EN LA TINCIÓN DEL FROTIS SANGUÍNEO. Una extensión de sangre bien teñida debe caracterizarse por una buena diferenciación de las estructuras subcelulares de los leucocitos una coloración rosada de los hematíes y la ausencia de los precipitados. Los defectos más frecuentes observados en los frotis sanguíneo son: 1·- Una coloración excesivamente azul que puede ser debida a: ~ Excesivamente grueso el frotis ~ Lavado insuficiente ~ Tiempo prolongado ~ Empleo de colorante excesivamente alcalino 2·- Una coloración excesivamente rosada: en este caso el colorante, el tampón o el agua de lavado tiene un carácter demasiado ácido. 3·- Presencia de precipitados. En general obedecen a una acción excesivamente prolongada del colorante May-Grünwald o del colorante fijador; otras veces pueden evitarse mediante la filtración del colorante antes de su empleo. 4·- Apreciación de artefactos morfológicos debido al anticoagulante 5·- Apreciación de artefactos debido a suciedad, deterioro o presencia de grasa en el porta. 6·- Hidratación de los hematíes.
