Versi terjemahan dari Flow cytometry cell cycle analysis using Propidium iodide DNA staining.docx Cytome Cyto metr tr y anali sis sik sik lu s sel ali r an menggunakan menggunakan i od odida ida pr op opidi idi um pewarn pe warn aa aan n D NA Pengantar Analisis siklus sel dengan kuantisasi kandungan DNA adalah salah satu aplikasi paling awal aliran cytometry.
DNA
mamalia, ragi, tanaman atau sel-sel bakteri dapat diwarnai oleh berbagai pewarna mengikat DNA. Premis dengan pewarna ini adalah bahwa mereka stoikiometri yaitu mereka mengikat secara proporsional dengan jumlah yang hadir DNA dalam sel. Dengan cara ini sel-sel yang berada dalam fase S akan memiliki DNA lebih dari sel-sel di G1.
Mereka akan mengambil
proporsional proporsion al lebih pewarna dan akan berpendar lebih terang sampai mereka telah dua kali lipat kandung kandungan an DNA mereka. Sel-sel di G2 akan sekitar dua kali seterang sel di G1.
Pewarna DNA-binding termasuk propidium termasuk propidium iodida (PI) (ab14083 (ab14083)) , 7-aminoactinomycin-D (7-AAD), Hoechst 33342 dan 33258, TO-PRO-3, 4'6'-diamidino-2-phenylindole (DAPI), dan DRAQ5 ™ (ab108410) dan DRAQ7 ™ (ab109202) . Dalam kebanyakan kasus, sel-sel harus diperbaiki atau dipermeabilisasi untuk memungkinkan masuknya pewarna yang dinyatakan aktif dipompa keluar oleh sel-sel hidup. Untuk fiksasi, fiksasi dalam alkohol atau aldehida biasanya digunakan.
Alkohol
adalah fiksatif dehidrasi yang juga permeabilizes. Hal ini akan memungkinkan akses yang mudah dari pewarna untuk DNA dan memberikan profil yang baik (rendah koefisien variasi, CV). dengan protein fluorescent dan beberapa penanda permukaan. aldehida (silang) fiksatif, biasanya paraformaldehyde lebih tepat.
Kerugiannya adalah bahwa hal itu sering tidak sesuai Jika ini perlu diperiksa secara bersamaan, penggunaan Hal ini dapat menyebabkan profil kualitas rendah (CV
tinggi) namun akan memungkinkan deteksi simultan fluorochromes lainnya. Dengan sel tetap, sampel dapat terakumulasi, bernoda dan dianalisis pada akhir percobaan. beberapa
minggu
di
4
o
C.
Sel-sel
tetap
aldehida
yang
stabil
Sel Alkohol tetap stabil selama
selama
2
sampai
3
hari.
Sebuah metode alternatif untuk memungkinkan pewarna DNA ke dalam sel adalah untuk permeabilize mereka dengan deterjen.
Hal ini dapat Triton X-100 (0,1%) atau NP40 (0,1%).
Saponin bukan permeabilizing reagen yang
direkomendasikan untuk analisis DNA karena tidak permeabilize membran nuklir dengan baik. dapat
disimpan
selama
yang
tetap
dan
harus
diproses
Sel dipermeabilisasi tidak
dalam
beberapa
jam.
Hal ini juga biasanya diperlukan untuk menggabungkan fiksasi (paraformaldehyde) dan permeabilization (Triton X-100) untuk pewarnaan intraseluler.
Metode lain juga tersedia, misalnya penggunaan buffer sitrat (dalam kombinasi dengan
deterjen), meskipun ini tidak begitu luas.
Ada juga beberapa pewarna yang akan memasuki sel hidup dan kuantitatif
mengikat DNA, ini termasuk Hoechst 33342, DRAQ5 ™ (ab108410) dan pewarna DyeCycle. Metode yang digunakan akan tergantung pada eksperimen dan informasi yang diperlukan. digunakan untuk label konten DNA.
Reagen
Dalam protokol ini, PI
70% Etanol
Propidium iodida (larutan stok 50 μ g / ml)
Ribonuklease I (stock 100 mg / ml)
Metode 1.
Panen sel dengan cara yang tepat dan mencuci di PBS.
2.
Perbaiki dalam etanol 70% dingin.
Tambahkan menjatuhkan bijaksana untuk pelet sementara
vortexing. Ini harus memastikan fiksasi semua sel dan meminimalkan menggumpal. 3.
Perbaiki selama 30 menit pada 4 o C.
4.
Cuci 2 X di PBS.
Berputar pada 850g dalam mesin pemisah dan berhati-hati untuk menghindari
hilangnya sel ketika membuang supernatan terutama setelah lepas dari etanol. 5.
Perlakukan sel dengan ribonuklease. Tambahkan 50 μ l dari 100 μ g / ml kaus kaki dari RNase. Ini
akan memastikan hanya DNA, RNA tidak, ternoda. 6.
Tambahkan 200 μ l PI (dari 50 μ g / ml larutan stok).
Analisis hasil 1.
Mengukur pencar maju (FS) dan samping pencar (SS) untuk mengidentifikasi sel tunggal.
2.
Pengolahan Pulse digunakan untuk mengecualikan doublet sel dari analisis.
Hal ini dapat dicapai baik
dengan menggunakan pulsa daerah vs lebar pulsa atau pulsa daerah vs tinggi pulsa tergantung pada jenis cytometer. 3.
PI memiliki emisi maksimum 605 nm sehingga dapat diukur dengan filter bandpass yang cocok.
Hasil yang diharapkan Sementara
menjalankan
Depan
dan
cytometer sisi
tersebut, menyebar
plot
berikut
untuk
harus
mengidentifikasi
ditampilkan: sel-sel
Analisis bentuk pulsa untuk mengidentifikasi gumpalan dan doublet (ini bisa menjadi kawasan pulsa vs lebar pulsa atau pulsa
daerah
vs
tinggi
pulsa
tergantung
pada
cytometer)
Maju pencar vs sinyal PI, PI histogram.
Untuk analisis, gerbang pertama pada populasi sel tunggal dengan menggunakan lebar pulsa vs daerah pulsa.
Lalu oleskan
gerbang ini dengan plot pencar dan gerbang keluar kotoran jelas. Kombinasikan gerbang dan berlaku untuk histogram petak PI.
Ada dua cara untuk quantitate persentase sel dalam setiap fase siklus sel:
1.
Dengan menggunakan spidol ditetapkan dalam program analisis.
2.
Dengan menggunakan algoritma yang akan mencoba mencocokkan kurva Gaussian untuk setiap fase.
Ini tersedia dengan beberapa perangkat lunak cytometry aliran dan lebih objektif daripada menetapkan penanda oleh mata.
Pemecahan Masalah dan tips 1.
Sel harus dijaga terkonsentrasi mungkin untuk memungkinkan sampel perbedaan tekanan terendah
untuk digunakan. Ini akan memastikan bahwa aliran sampel inti sesempit mungkin dan memberikan CV yang optimal. CV, atau koefisien variasi, adalah ukuran penyebaran data dan didefinisikan sebagai standar deviasi (sd) dibagi dengan rata-rata (m) dinyatakan sebagai persentase (sd / m X 100). 2.
Etanol 70% tidak boleh dilakukan dengan PBS sebagai penyebab protein ini curah hujan pada fiksasi.
Gunakan 70 bagian etanol mutlak untuk 30 bagian air suling. 3.
Analisis DNA parameter tunggal tidak akan menghasilkan informasi kinetik, juga tidak akan mampu
membedakan antara sel-sel dalam sangat awal atau akhir fase S dari sel-sel di G1 dan G2 fase masing-masing. Kita juga tidak bisa membedakan antara G2 dan fase mitosis sel.
Untuk informasi ini, (BrdU) teknik
bromodeoxyuridine harus digunakan atau Anda dapat menggabungkan analisis DNA dengan siklus sel fasespesifik penanda (misalnya phospho H3 untuk mitosis).
