Efektivitas Virus SpltMNPV Terhadap Ulat Spo Spodopter a litur litur a (Ulat Grayak) SI BIOLOGI 2016
Devita Rahmadani, Anindia Ayu Fachrudiana, Luluk Lusiana Anjani, Ela Saidatul Abadiyha, Roberto Charles Nenotek Jurusan Biologi-FMIPA Universitas Negeri Surabaya
ABSTRACT Virologi adalah ilmu yang mempelajari tentang virus, mikroorganisme yang dapat membahayakan sebagai agen penyebab penyakit seperti influenza dan Human Immunodeficiency Virus (HIV). Virus adalah organisme terkecil yang berperan dalam penyebaran penyakit dengan menginfeksi sel dan mengakibatkan perubahan yang membahayakan sel sampai mematikan sel. Salah satu jenis virus yang membahayakan adalah Spodoptera litura Nuclear Polyhedrosis Virus (SINPV) berpotensi untuk mengendalikan S. litura (ulat grayak) karena efektivitas bioinsektisidanya sangat tinggi. Ulat grayak (Spodoptera litura Fabricus) merupakan salah satu hama penting bagi tanaman. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui keefektifan Spodoptera litura Nuclear Polyhedrosis Virus (SINPV) dalam menginfeksi ulat grayak (Spodoptera litura Fabricus) dengan perantara pakan buatan yang telah diinfeksi virus Spodoptera litura Nuclear Polyhedrosis Virus (SINPV) secara in vivo. Data yang diperoleh berupa a) memperbanyak virus dengan metode infeksi secara in vivo, b) pemurnian virus dilakukan dengan menghaluskan ulat grayak yang terinfeksi menggunakan mortal kemudian disaring untuk menghasilkan filtratnya lalu diamati di bawah mikrosokop dengan perbesaran 1000x c) perhitungan virus dengan menggunakan haemachytometer. Hasil dari penelitian ini adalah banyaknya ulat mati pada instar 3 sebanyak 6 ulat, instar 4 sebanyak 15 ulat dan instar 5 sebanyak 10 ulat. Jumlah semua virus yang telah diamati pada instar 3(1) sebanyak 18, instar 3(2) sebanyak 31, instar 3(3) sebanyak 18 dan jumlah K sebanyak 11,665 x 108 ; pada instar 4(1) sebanyak 12, instar 4(2) sebanyak 38, instar 4(3) sebanyak 45 dan jumlah K sebanyak 15,83 x 108 ; pada instar 5(1) sebanyak 55, instar 5(2) sebanyak 140, instar 5(3) sebanyak 23 dan jumlah K sebanyak 36,33 x 108 .
K ata ata kunci : virus SINPV, ulat grayak (Spodoptera litura Fabricus), pakan
PENDAHULUAN
Salah satu mikroba yang dikenal karena memiliki dampak negatif bagi keberlangsungan hidup manusia saat ini adalah virus. Menurut Ibrahim (2007), virus merupakan suatu unit tidak bersel yang sangat kecil dan merupakan garis batas antara yang hidup dan yang tidak hidup, serta berperilaku seperti organisme-organisme hidup ketika menginfeksi sel-sel. Virus dapat bertindak sebagai agen penyakit dan agen pewaris sifat. Sebagai agen penyakit, virus memasuki sel dan menyebabkan perubahan-perubahan yang membahayakan bagi sel, yang akhirnya dapat merusak atau bahkan menyebabkan kematian pada sel yang diinfeksinya. Sebagai agen pewaris sifat, virus memasuki sel dan tinggal di dalam sel tersebut secara permanen. Salah satu virus yang memberikan dampak negatif bagi kelangsungan hidup makhluk hidup adalah Spodoptera litura multiple nuclear polyhedrosis virus virus (SINPV) yang menyerang
oleh virus SINPV adalah ulat grayak (Spodoptera litura). Ulat grayak merupakan salah satu hama yang sering menyerang tanaman di bidang pertanian. Virus dapat menyerang manusia kerana virus membutuhkan inang atau substrat tertentu untuk agar dapat hidup dan menjadikan dirinya menjadi banyak. Oleh karena itu melalui penelitian ini kita dapat memperoleh gambaran tentang bagaimana suatu virus terbentuk dan bagaimana virus tersebut menyerang inang nya. Tujuan dilakukannya penelitian ini adalah untuk mengetahui bagaimana cara perbanyakan virus, mengetahui kematian ulat Spodoptera liptura yang disebabkan oleh virus, mengetahui cara pemurnian virus, mengetahui cara perhitungan virus dengan haemositometer, dan untuk mengetahui efektivitas virus terhadap ulat Spodoptera litura.
BAHAN DAN METODE Tempat dan Waktu
Penelitian dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi Jurusan Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Negeri Surabaya pada Bulan November 2017. Alat Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah botol kapsul, pinset, cawan petri, pipet tetes, sentrifuse, kain penyaring, mortal, alu, tabung reaksi, spet, cover glass. Bahan Bahan yang digunakan dalam penelitian adalah ulat grayak (Spodoptera liptura) instar 3, instar 4 dan instar 5 yang digunakan diperoleh dari BALITAS Malang, dan virus uji yang digunakan yaitu Spodoptera litura Nuclear Polyhedrosis Virus (SINPV ) , pakan buatan, akuades steril, alkohol, tepung kedelai, maizena, clindamicin, renouit, nipagia, striptomisin, quekeroat, natrium benzoat, vitamin c, kandistatin, formalin 4%. Pembuatan pakan buatan Semua bahan meliputi tepung kedelai 100 gr, maizena 50 gr, clindamicin, renouit, nipagia 1 gr, striptomisin 0,2 gr, quekeroat 2 gr, natrium benzioat 0,2 gr, vit c, kandistatin, dan formalin 4% dicampur menjadi satu dengan menggunakan blender sampai tercampur rata. Kemudian dituang kedalam nampan plastik dan dimasukkan kedalam kulkas. Memperbanyak Virus Menaruh ulat grayak kedalam botol kecil. Pakan buatan dicelupkan dalam suspensi virus. Ulat yang telah terkontaminasi virus dipelihara dan diberi makan pakan buatan sampai ulat mati. Ulat yang mati karena terinfeksi virus akan diam terlentang dengan tubuh yang lunak berwarna hitam kecoklatan. Ulat yang telah mati dipanen, secara hati-hati karena tubuhnya mudah hancur. Tubuh ulat dimasukkan kedalam tabung reaksi steril yang berisi akuades.
Pemurnian Virus Ulat yang telah mati terinfeksi virus dihaluskan dengan mortal, jika terlalu pekat ditambahkan akuades. Kemudian menyaring ulat yang telah dihaluskan sampai 3 kali penyaringan. Lalu dimasukkan kedalam tabung sentrifuse dan dimurnikan dengan memutarnya pada kecepatan 3500 rpm selama 15 menit. Membuang supernata dan ditambahkan akuades steril serta aduk sampai homogen. Di putar kembali dengan cetrifuse pada kecepatan 3500 rpm selama 15 menit sebanyak 2 kali. Penghitungan Virus Penghitungan virus dilakukan dengan menggunakan hemositometer. Membersihkan alat haemachytometer dengan tissue yang sudah diberi alkohol. Setelah itu haemachytometer ditutup dengan cover glass yang sudah dibersihkan. Mengambil larutan pengenceran virus dari tabung reaksi dengan menggunakan spet. Meneteskan larutan tadi pada alat haemachytometer. Amati dengan menggunakan mikroskop dan dihitung berapa jumlah sel dalam satu kotak.
Rumus penghitungan: Virus =
6 ,25
N = 80 T = rata-rata total D = faktor pengenceran
HASIL DAN PEMBAHASAN
Telah diperoleh hasil perhitungan virus dan pemurnian virus dari ulat grayak ( Spodoptera litura). Berikut adalah hasil instar mati ulat yang dimurnikan yang ada pada (Tabel 1) dan hasil perhitungan pengamatan jumlah virus pada (Tabel 2). Tabel1. Hasil Kematian Ulat Grayak
Instar 3
Instar 4
67
95
Instar 5
218
Dari ulat grayak (Spodoptera litura) instar 3 memiliki jumlah kematian sebanyak 67 ulat, sedangkan hasil dari instar 4 sebanyak 95 ulat dan dari instar 5
Tabel 2. Hasil Pengamatan Jumlah Virus Penyebab Mati
Pengulangan
Jumlah
Instar 3 Virus
I
18
(1,5cm-2,0cm)
II
31
III
18
Instar 4 Virus
I
12
(2,0cm-2,5cm)
II
38
III
45
Instar 5 Virus
I
55
(2,5cm-3,5cm)
II
140
III
23
Jumlah Total
Rata Total
Hasil Perhitungan
67
23,33
11,665 x 10 8
95
31,66
15,83 x 10 8
218
72,66
36,33 x 10 8
Instar 3 Virus (1,5cm-2,0cm) Pengulangan I
Instar 3 Virus (1,5cm-2,0cm) Pengulangan II
Instar 3 Virus (1,5cm-2,0cm) Pengulangan III
Instar 4 Virus (2,0cm-2,5cm) Pengulangan I
Instar 4 Virus (2,0cm-2,5cm) Pengulangan II
Instar 4 Virus (2,0cm-2,5cm) Pengulangan III
Instar 5 Virus (2,5cm-3,5cm) Pengulanagan I
Instar 5 Virus (2,5cm-3,5cm) Pengulanagan II
Instar 5 Virus (2,5cm-3,5cm) Pengulanagan III
Gambar. Hasil Pengamatan Jumlah Virus
Suspensi virus diambil dengan pipet 1 ml dan diletakkan pada objek glass haemocytometer, kemudian diamati dengan mikroskop. Pengamatan dilakukan tepat pada garis-garis yang nampak pada lapang pandang dengan garis membujur serta melintang membentuk kotak 5x5 dengan tiap kotaknya berisi 4x4 kotak. Kotak yang dihitung virusnya adalah kotak paling kiri atas, paling kanan atas, tengah, paling kiri bawah dan paling kanan bawah dan kotak pada tengah-tengah. Perhitungan virus dilakukan sebanyak tiga kali pengulangan dengan perbesaran mikroskop 100 x 10. Virus yang dilihat melalui mikroskop dengan perbesaran 100x, akan tampak bulat bercahaya. Sesungguhnya, yang terlihat adalah polyhedra dari virus tersebut yang berbentuk seperti kristal tidak beraturan (Tri Asri, 2016). Melalui perhitungan virus, maka akan diketahui penyebab kematian ulat.. Berikut merupakan data perhitungan terkait jumlah virus : Jumlah virus didapatkan dari perhitungan dengan rumus sebagai berikut: Rumus penghitungan: Virus =
6 ,25
N = 80 T = rata-rata total D = faktor pengenceran Dari hasil perhitungan jumlah virus, didapatkan hasil bahwa ulat Spodoptera liptura yang mati karena Spodoptera litura multiple nuclear polyhedrosis virus (SINPV) lebih banyak terdapat pada ulat yang berinstar 5, jika dibandingkan dengan ulat yang berinstar 3 dan instar 4. Hal ini menandakan bahwa ulat
Spodoptera liptura tidak mampu bertahan hidup pada instar ke lima saat terinfeksi virus. Spodoptera litura multiple nuclear polyhedrosis virus (SINPV) adalah salah satu jenis virus
patogen yang berperan sebagai agensia hayati dalam mengendalikan ulat grayak (Spodoptera litura), karena bersifat spesifik, selektif, efektif untuk hama-hama yang telah resisten terhadap insektisida dan aman terhadap lingkungan. Sebuah baculovirus awalnya terisolasi, beberapa Spodoptera litura nucleopolyhedrovirus (SINPV) telah terkontam melalui S. litura larva upto empat generasi untuk menentukan jumlah rata-rata tubuh oklusi (OBS) dipanen per larva dan keberhasilan mereka dalam hal infektivitas, makan penghentian dan kecepatan membunuh larva inang (Mudasir dkk, 2014). Ulat grayak diberi pakan buatan berupa komposisi-komposi tertentu yaitu, tepung kedelai 100 gr, maizena 50 gr, clindamicin+ renouit, nipagia 1gr, striptomisin 0,2 gr, guekergoat 2gr, Na Benzoat 0,2 gr, vitamin C, kondistatin dan formalin 4%. Setelah itu, memasukkan agar dan air tersebut ke dalam blender dan dicampur/ diblender. Hasil blender tersebut kemudian diletakkan pada nampan dan menunggunya hingga padat. Pakan yang telah siap digunakan dibagi menjadi dua bagian, bagian pertama dicelup dalam suspensi virus, sedangkan bagian lainnya menjadi pakan yang diberikan pada hari-hari selanjutnya. Pakan ulat buatan diberi bahan formalin dan dimasukkan kedalam kulkas penyimpanan guna menghindari penjamuran dan bakteri yang masuk. Pakan akan dicelupkan kedalam virus SINPV yang akan dimakan ulat grayak, sehingga ulat grayak akan terinfeksi virus. Setelah beberapa hari
bergantung lama matinya ulat, maka ulat yang mati disimpan dalam tabung reaksi aquades. Banyaknya ulat yang mati diinstar 5 sebanyak 218 ulat dan yang mati diinstar 4 sebanyak 95 ulat, sedangkan yang mati pada instar 3 sebanyak 67 ulat. Untuk menjaga sterilitas larutan virus sebelum virus dituang/diinfeksikan dalam medium S. litura. Larutan SINPV difiltrasi dengan kain penyaring. Selanjutnya hasil pemurnian virus diamati pada mikroskop. Mekanisme infeksi terbagi menjadi dua yaitu infeksi primer dan infeksi sekunder (Samsudin, 2011). Mekanisme infeksi primer terjadi jika larva memakan pakan alami yang sudah diberi virus laten dan dicerna sampai pada midgut larva. Calyx (polyhedron envelope) yang mengelilingi polyhedra (OBs) akan didegradasi oleh enzim proteinase, setelah itu membran pembungkus Occlusion Bodies (OBs) yang berupa protein polyhedrin akan didegradasi di dalam midgut serangga dalam suasana alkali sebelum mengeluarkan Occlussion Derivat Viruses (ODVs) (D’Amico dan Slavicek, 2012). Suasana alkali yang bagus untuk mendegradasi OBs berada di midgut larva (Rohrmann, 2011). Secara umum SlNPV mudah diperbanyak secara in vivo, yaitu dengan menginfeksi larva inang atau diambil dari larva yang telah terinfeksi SlNPV lalu dapat diaplikasikan kembali. Dengan didapatkannya isolat SlNPV yang lebih efektif, maka dapat meningkatkan peluang SlNPV untuk dikembangkan sebagai bioinsektisida, sehingga ketergantungan terhadap insektisida sintetik dapat dikurangi dan masalah serangan larva S. litura Fabricius dapat diatasi secara berkelanjutan (Laoh. dkk, 2003 dalam Riyanto, 2008). NPV menginfeksi inang melalui dua tahap. Pada tahap pertama NPV menyerang usus tengah, kemudian pada tahap selanjutnya organ tubuh (hoemocoel) serta organ-organ tubuh yang lain. Pada infeksi selanjutnya NPV juga menyerang sel darah, trakea, hipodermis dan sel lemak. Polyhedra Inclusion Body dalam tubuh larva yang terserang ukuranya bervariasi tergantung pada perkembangan stadium larva, tetapi pada beberapa jenis NPV sebagian polyhedra memiliki ukuran dan stadium pematangan yang hampir sama (Bedjo, 2006 ; Biogen Online, 2007 dalam Riyanto, 2008). Enzim proteinase banyak ditemukan pada saluran pencernaan larva dan pada polyhedra itu sendiri, sedangkan polyhedra yang
diperbanyak pada kultur sel kurang akan enzim proteinase (Rohrmann, 2011). Tahap selanjutnya, ODVs menembus membran peritrofik, ODVs membutuhkan enzim-enzim seperti enzim chitinase dan metalloprotease untuk menembus membran peritrofik karena dalam membran peritrofik tersusun atas lapisan khitin dan muchin. Occlusion Derivat Viruses (ODVs) melakukan fusi dengan membran plasma dan sel-sel epitel midgut yang merupakan target primer infeksi NPV, ketika sampai pada sel midgut ODVs akan mengeluarkan virion atau BVs (Rohrmann, 2011). Ciri-ciri larva S. litura yang terinfeksi virus laten pada tiap infeksi antara lain larva malas untuk makan dan bergerak, cenderung naik ke atas botol vial, larva mati dengan tubuh hitam mengkilap dan mengeluarkan cairan putih keruh. Jarak antara infeksi virus pertama pada ulat dengan kematian ulat tersebut adalah sekitar 12 hari. Ulat yang mati, dimasukkan ke dalam tabung reaksi kemudian diletakkan di dalam freezer. Hal tersebut berguna untuk menjaga ulat agar tidak mengalami kebusukan. Pemurnian virus dilakukan seminggu kemudian, jangka waktu tersebut adalah waktu kematian ulat secara keseluruhan.
KESIMPULAN
Berdasarkan hasil penelitian yang telah dilakukan dapat disimpulkan bahwa virus SPLtMNPV dapat mempengaruhi kelangsungan hidup ulat grayak. Efektifitas virus SPLtMNPV yang terdapat pada ulat grayak instar 3, 4 dan 5 tidak semua ulat terinfeksi virus melainkan terinfeksi virus+jamur, dan virus+bakteri. Ulat yang terinfeksi paling banyak pada ulat grayak instar 5 yang berbanding lurus dengan perhitungan. Adapun hasil perhitungan ulat grayak pada instar 5, yaitu sejumlah 36,33 x 108.
DAFTAR PUSTAKA
Riyanto. 2008. Potensi Agen Hayati Spodoptera Litura Nuclear Polyherosis Virus (SINPV ) untuk Pengendalian Spodoptera Litura Fabricus. http://eprints.unsri.ac.id/ 1087/1/Potensi_Agen_Hayati_SLNP_untuk _pengendalian__Spodoptera_ Litura.pdf.
Aditya, Lasinrang., dkk. 2014. Karakteristik dan Reproduksi Virus. Makasar: Universitas Islam Negeri Alauddin Makassar. Asri, Mahanani Tri., dkk. 2013. “Peningkatan Patogenesitas Virus Laten Hasil Isolasi dari Kultur Sel Midgut Larva Spodoptera litura terhadap Larva Spodoptera litura melalui Penginfeksian Berulang” dalam LenteraBio. Vol. 2 No. 1. Hlm 1-4. Asri, Mahanani Tri., dkk. 2009. “Pengembangan Metode Penginfeksian Spodoptera Litura Multiple Nucleopolyhedrosis Virus (Spltmnpv) Pada Sel Primer Epitel Usus Larva Spodoptera Litura” dalam jurnal Pengembangan Metode Penginfeksian. Hlm 1-6
