An A nalisaVitamin
DEFINISI
Senyawa organik yang tidak termasuk dalam protein, karbohidrat, lemak yang terdapat dalam jumlah jumlah kecil kecil dalam bahan makanan tapi sangat penting peranannya bagi tubuh Senyawa organik dengan berat molekul rendah yang dibutuhkan oleh manusia dan organisme hidup lainnya sebagai sumber nutrisi yang diperlukan dalam jumlah kecil untuk metabolisme normalnya. Manusia tidak dapat mensintesis sebagian besar itamin dan kebutuhan akan itamin diperoleh dari makanan dan suplemen. !ekurangan itamin de"isiensi
DEFINISI
Senyawa organik yang tidak termasuk dalam protein, karbohidrat, lemak yang terdapat dalam jumlah jumlah kecil kecil dalam bahan makanan tapi sangat penting peranannya bagi tubuh Senyawa organik dengan berat molekul rendah yang dibutuhkan oleh manusia dan organisme hidup lainnya sebagai sumber nutrisi yang diperlukan dalam jumlah kecil untuk metabolisme normalnya. Manusia tidak dapat mensintesis sebagian besar itamin dan kebutuhan akan itamin diperoleh dari makanan dan suplemen. !ekurangan itamin de"isiensi
#nalisa $itamin In"ormasi komposisi itamin makanan diperlukan untuk menentukan intake guna mengetahui kecukupan dan perbaikan status gi%i manusia. Metode pengujian yang reliable &dapat dipercaya'handal( dipercaya'handal( sangat diperlukan untuk menjamin akurasi food labeling
)ang *erlu diperhatikan #kurasi dan presisi Faktor ekonomis +umlah sampel'ketersediaan sampel Metode yang dapat diaplikasikan !ondisi seperti cahaya, oksigen, p dan panas supaya tidak merusak omogenisasi sampel
!estabilan $itamin $itamin
p - p- p/- 01 Sinar *anas 2SM
$it #
S
3
S
3
3
3
45
$it 6
3
S
3
3
3
3
755
8iotin
S
S
S
S
S
3
95
!aroten
S
3
S
3
3
3
:5
!olin
S
S
S
3
S
S
;
8<71
S
S
S
3
3
S
75
$it D
S
<
3
3
3
3
45
#s."olat
3
3
S
3
3
3
755
!estabilan $itamin $itamin
p -
p-
p/-
01
Sinar *anas 2SM
$it !
S
3
3
S
3
S
;
Niasin
S
S
S
S
S
S
-;
#s.*ant otenat
S
3
3
S
S
3
;5
# p<# ben%oat
S
S
S
3
S
S
;
8<9
S
S
S
S
3
3
45
8<1
S
S
3
3
3
3
-;
8<7
3
S
3
3
S
3
=5
$it E
S
S
S
S
3
3
;;
keterangan S > stabil 3 > tidak stabil SM > Susut akibat dimasak
Ekstraksi
!ecuali bioassay, analisa itamin sebagian besar melibatkan ekstraksi untuk memisahkan itamin dari matriks biologisnya Secara umum meliputi satu atau beberapa perlakuan seperti panas, asam, alkali, pelarut dan en%im. *rosedur ekstraksi spesi"ik untuk setiap itamin dan didisain untuk menstabilkan itamin. *rosedur ekstraksi dapat diaplikasikan untuk beberapa itamin. Misalnya untuk tiamin dan ribo"lain dan beberapa itamin larut lemak.
6ontoh
#sam askorbat ? ekstraksi dingin dengan asam meta"os"orat'asam asetat $. 87 dan 81 pemanasan dalam asam @ perlakuan en%im Niasin autoklaing dalam asam &Non cereal( atau dalam alkali &cereal( $itamin #, E dan D *elarut organik, sapono"ikasi, dan reekstraksi dengan pelarut organik. Antuk itamin<itamin yang tidak stabil &#, E, D(, perlu ditambahkan antioksidan untuk menghambat oksidasi
#nalisa $itamin 8ioassay manusia dan hewan Microbiological assay bakteri, yeast dan jamur *hysicochemical assay spektro"otometri, "luorometri, kromatogra"i, en%imatis, immunologi dan radiometri
8ioassay Sampai saat ini baru digunakan untuk itamin D dan 871 $itamin D Menggunakan Metode standard dari #0#6 yang dikenal dengan Metode Bine 3est yang didasarkan pada pengapuran tulang. !arena menggunakan pengapuran tulang hanya terbatas pada uji hewan coba saja tidak pada manusia
*rosedur 8ioassay $itamin D
*reparasi sampel #0#6 *eriode deplesi &*enghabisan( pemberian diet Cachitogenic selama 7=<1; hari. 3ikus yang digunakan berumur :5 hari dengan berat badan 44 g tetapi 95 g *engujian mulai hari terakhir deplesi sampai = atau 77 hari setelah deplesi. Selama pengujian, tikus terdeplesi diberi itamin D dengan jumlah diketahui &standard( dan tidak diketahui &sampel( +umlah itamin dalam sampel ditentukan oleh Bine 3est dari warna tulang tibia &tulang kering( proimal paling akhir atau tulang radius atau ulna distal paling akhir.
Mikrobiological assay 3erbatas pada itamin yang larut air Sangat sensiti" dan spesi"ik untuk tiap itamin Memakan waktu dan harus patuh pada prosedur analisa untuk hasil yang akurat
PRINSIP
*ertumbuhan mikroba sebanding dengan kebutuhan akan itamin. Microbiological assay menguji pertumbuhan mikroba dalam ekstrak sampel yang mengandung itamin dibandingkan dengan pertumbuhan mikroba dalam itamin dengan jumlah yang diketahui. 8akteri, yeast dan jamur digunakan sebagai organisme uji *ertumbuhan diukur dengan turbiditas &kekeruhan(, produksi asam, graimetri dan respirasi
Niasin
8akteri L.plantarum *reparasi stok kultur inokulasi freeze dried culture pada agar bacto
3ahap analisa
*reparasi sampel
*reparasi tabung pengujian
3imbang sampel &kira
*reparasi standar
Sama dengan cara preparasi tabung pengujian. Standar larutan yang mengandung 5,7 Gl'ml Niasin
Inokulasi dan inkubasi &:- 6, 79<7= jam(
3ambahkan 7 tetes inokulum ke masing
*engukuran #bsorbansi diukur pada panjang gelombang ;45< 995 nm
Folat
3erdiri dari tiga komponen yang terikat
Hugusan pteridina #sam para amino ben%oat #sam glutamat
Sedikit larut dalam air, mudah teroksidasi dalam asam dan cahaya dan hilang ketika pemasakan !arena instabil dan beragam bentuk menyulitkan dalam analisanya Antuk menghitung bioaailabilitas "olat dalam "orti"ikasi dan dalam makanan telah dibuat DFE &Dietary Folate Euialent(
8erdasarkan hasil penelitian dilaporkan bahwa
#sam "olat =;2 bioaailable Folat dalam makanan ;52 bioaailable #sam "olat dalam produk "orti"ikasi 7,- kali lebih bioaailable dibanding dengan "olat dalam makanan
Gg DFE > Gg "ood "olate @ &7.- Gg asam "olat(. *erhitungan Gg DFE untuk beberapa makanan memerlukan jumlah asam "olat sebagai bagian yang terpisah dari "olat makanan.
Saat ini, metode kromatogra"i cair sangat penting untuk memastikan jumlah asam "olat dan bentuk ragam "olat dalam makanan 8aru
Folat
*rinsip ?
Folat dalam sampel diekstraksi dalam bu""er pada suhu 755 6 &air mendidih(. asil esktraksi didigesti dengan α
)ang perlu diperhatikan
arus dilakukan upaya untuk melindungi "olat yang labil dari oksidasi dan degradasi "otokimia. *engurangan senyawa
PROSEDUR
*reparasi sampel
7,1<1 g sampel ditambahkan ;5 ml bu""er, dihomogenkan, dan didigesti &sampel tinggi lemak harus diekstrak dengan heksan dan semua sampel harus dihindarkan dari cahaya dan udara(
*emecahan trien%im
*anaskan sampel selama ; menit, dinginkan pada suhu ruang, digesti sampel dengan α
*reparasi kura standar dan tabung blanko
8uat = titik kura standard dengan menggunakan larutan "olat. 3ambahkan ; ml L.casei ke dalam masing
*engujian #sam "olat diuji berdasarkan pertumbuhan L.rhamnosus �#6(. 3abung sampel, kura standard, blanko inokulasi, blanko uninokulasi dan blangko en%im diautokla" pada suhu 717 6 selama ; menit, kemudian diinokulasi dengan 7 tetes inokulum L.rhamnosus per tabung. Setelah itu diinkubasi pada suhu :- 6 selama 15<14 jam, pertumbuhan mikroba dinyatakan dalam 2 transmitan pada ;;5 nm
!imiawi $itamin # $itamin E $itamin 6 $itamin 87 $itamin 81
$itamin #
Sensiti" terhadap cahaya &A$(, udara &beberapa prooksidan(, suhu tinggi dan kelembaban *erlu tahap
PRINSIP
Sampel disapono"ikasi, itamin # akan terekstrak ke dalam larutan organik dan terkonsentrasi. Semua trans
)ang perlu diperhatikan Semua pekerjaan harus dilakukan dalam cahaya dengan intesitas rendah arus menjaga terjadinya oksidasi retinol selama analisa Eaporasi larutan harus menyeluruh di bawah aliran nitrogen dan heksadekan ditambahkan untuk mencegah destruksi selama eaporasi
*rosedur
*reparasi Sampel
3rans"er sampel &makanan "ormula atau susu cair( ke dalam tabung digesti 755 ml, tambahkan 75 ml etanolik pirogallol &12 pirogallol dalam J;2 etanol( dan sabunkan dengan etanolik !0 &752 !0 dalam J52 etanol( pada suhu ruang selama 7= jam atau pada suhu -5 6 dengan menggunakan re"lu essel.
Ekstraksi
*ipet : ml sampel yang telah terdigesti ke dalam tabung sentri"us 7; ml dan tambahkan 1 ml air. Ekstrak dengan - ml heksan
*arameter !romatogra"i !olom 7; cm 4.; mm dipadati dengan : mm silika &#pe µm silika( Fase mobil Isokratik, heptane dan isopropanol &7<;2( Deteksi A$ , :45 nm Flow rate 7<1 ml'menit
*erhitungan Semua trans retinol &mg'ml( > &#t'#st Kt DF('$ !et ? #t > area puncak sampel #st> area puncak standar Kt > berat sampel $ > olume sampel DF > "aktor pengenceran
$itamin E
Dalam bentuk = komponen yang berbeda dalam makanan dan semuanya adalah 9< hidroksikroman Famili itamin E terdiri dari α<,β<,γ < dan δ< toko"erol 6irinya sebuah rantai cabang jenuh dari : unit isopren dan berikatan dengan tokotrienol tidak jenuh. 3ahan panas dan asam, karena bersi"at antioksidan maka $itamin E akan mudah teroksidasi terutama bila dalam minyak tengik, timah dan garam besi Mudah rusak oleh sinar A$
*rinsip
Antuk produk makanan umumnya sampel disabunkan dengan re"lu, diekstrak dengan heksan dan diinjeksi ke dalam "ase normal kolom *B6 yang disambungkan pada detektor "luoresensi Antuk Margarin dan Minyak nabati sampel dilarutkan dalam heksan, MgS0 4 ditambahkan untuk mengganti air kemudian di"ilter dan diuji dengan *B6 Antuk minyak dilarutkan dalam heksan dan diinjeksi secara langsung ke dalam kolom *B6
)ang perlu diperhatikan $itamin E adalah subyek oksidasi *enyabunan dilakukan dengan re"lu yang sudah ditambah antioksidan pirogallol dengan reaksi essel yang terlindung dari cahaya
*rosedur
*roduk makanan umum
3ambahkan 75 ml dari 9 2 &w'( pirogallol dalam etanol ke sampel , campur dan aliri dengan N . *anaskan pada suhu -5 6 selama 75 menit dengan sonikasi. 3ambahkan 1 ml 95 2 !0, campur dan aliri dengan N1. ancurkan selama :5 menit pada suhu -5 6. Sonikasi selama ; menit, dinginkan pada suhu ruang dan tambahkan Na6l dan air. Ekstrak dengan heksan &5,72 83( : kali. 3ambahkan 5,; g MgS04 dan campur. Filter dan encerkan sampai olume dengan heksan dan injeksi 15 µl. 1
Margarin dan minyak nabati
3ambahkan 45 ml heksan &5,72 83( ke dalam 75 g sampel dan campur. 3ambahkan : g MgS04 dan campur, biarkan ≥ 1 jam. Filter dan encerkan sampai olume dengan heksan. Injeksi 15 µl.
*arameter !romatogra"i !olom ibar C3, Bichrosorb Si95 ; µm, 1; cm4.9 mm Fase mobil 5,J2 isopropanol dalam heksan Flow 7 ml'menit Detektor<"luoresensi, E > 1J5 nm, Em > ::5 nm
$itamin 6
8erbentuk asam B
$itamin 6 Metode 3itrasi 1,9 dicloroindophenol *rinsip
B
mg asam askorbat'ml sampel > Standard &mg'ml( olume titrasi sampel &F*'berat sampel(
*rosedur
*reparasi sampel
*reparasi standard
3imbang dan ekstrak sampel dalam asam meta"os"orat
3itrasi
3itrasi sampel dan standard &: ulangan( dengan dikloroindophenol sampai berwarna merah muda sedikitnya 75 detik
Metode Mikro"lourometrik
*rinsip Metode ini mengukur asam askorbat dan asam dehidroaskorbat #sam askorbat dioksidasi membentuk asam dehiroaskorbat dan direaksikan dengan o< phenilenediamin membentuk komponen "luoresen uinoalin
*rosedur
*reparasi Sampel
Sama dengan metode titrasi, jumlahnya 755 ml untuk standard dan sampel, tambahkan 1 asam Norit, gojog dan saring
*reparasi blanko
3rans"er ; ml "iltrate ke dalam tabung olumetrik 755 ml yang mengandung ; ml :80:< Na0#c, biarkan selama 7; menit, kocok. 3rans"er 1 ml larutan ke dalam : tabung
*enentuan Sampel
*embentukan Luinoalin
3rans"er ; ml standard dan sampel ke dalam tabung olumetrik yang mengandung ;ml dari ;52 Na0#c trihidrid dan 1- ml air. Encerkan sampai olume dengan air kemudian trans"er 1 ml standard dan sampel ke dalam tabung "luoresen 3ambahkan 1 ml dari 15 2 larutan o< "enilenediamin
*engukuran
Akur "luoresen pada E > :;9 nm dan Em> 445 nm
3iamin &87(
*rinsip Ekstraksi dan hidrolisis en%imatis dari ester< ester tiamin "os"at dan pembersihan Metode ini didasarkan pada pengukuran "luoresensi dari bentuk oksidasi tiamin &tiokrom(
)ang *erlu diperhatikan 3iokrom sensiti" pada cahaya harus mengurangi cahaya pada semua prosedur 3iamin sensiti" panas terutama pada suasana basa tahap analisa dengan cara oksidasi tiamin harus dilakukan dengan cepat dan teliti berdasarkan prosedur yang ada
*rosedur
*reparasi Sampel
3imbang sampel yang mengandung 75<15 µg tiamin, tambahkan 6l, campur, autokla" selama 7; menit pada 717 6, atur p sampai 4,;<;,5 dengan 6l,
idrolisis En%im
3ambahkan larutan en%im dan inkubasi selama : hari pada suhu 4;<;5 6, dinginkan sampel atur p sampai :,;, encerkan sampai olume dengan air, campur dan saring. Barutan standard diperlakukan dengan en%im yang sama.
*embersihan Ekstrak sampel
Masukkan ekstrak sampel ke dalam kolom ion
*embentukan 3iokrom
!onersi tiamin ke tiokrom menggunakan !1Fe&6N(9, tambahkan isobutil alkohol, kocok, dan sentri"us.3uangkan "raksi isobutil alkohol ke dalam tabung baca "luoresen dan baca pada :9; nm'4:;nm. 8egitu juga standard dan buat kura standard untuk menghitung tiamin sampel
Cibola"in &81( Struktur mirip gula ribosa Barut air dan memberi warna "luoresens kuning kehijauan Mudah rusak oleh cahaya dan sinar A$ 3ahan panas, oksidator, asam namun sensiti" pada suasana basa
*rinsip Ektraksi, pembersihan dan kompensasi adanya substansi pengganggu Ditentukan dengan "luorometer
3itik !ritis !arena sensiti" pada A$ maka semua prosedur dilakukan pada ruang minim cahaya. #danya proses oksidasi permanganat perlu diperhatikan untuk hasil yang reliable
*rosedur
*reparasi Sampel
3imbang sampel homogen, tambahkan 5,7N 6l campur kemudian autokla" selama :5 menit pada suhu 717 6 dan dinginkan. Endapkan substansi pengganggu dengan mengatur p 9 dan segera diikuti pengaturan p 4,;, encerkan sampai olume dengan air dan saring
0ksidasi Materi pengganggu
3empatkan "iltrat ke dalam 4 tabung, 1 tabung tambahkan 7 ml air dan tambahkan 7 ml larutan standard &5,; µg'ml ribo"lain( ke dalam 1 tabung lainnya. Antuk tiap tabung &satu persatu( 3ambahkan 7 ml asam asetat glasial, diikuti 5,; ml !Mn0 4 : 2 biarkan selama 1 menit kemudian tambahkan 5,; ml 101 :2, kocok.
*engukuran Fluoresen *anjang gelombang 445 nm';9; nm *ertama baca ekstrak sampel yang mengandung air kemudian tambahkan 15 mg Na1S104 campur dan baca ulang, setelah itu baca standard
*erbandingan
Setiap metode mempunyai kelebihan dan kelemahan. *erlu memperhatikan "aktor<"aktor berikut dalam memilih metode
#kurasi dan presisi metode Antuk keperluan apa in"ormasi bioaailabilitas atau kandungan waktu dan alat *ersonel +enis bahan yang akan dianalisa +umlah sampel #turan'prosedur yang diguanakan
!euntungan dan !elemahan 8ioassay
!euntungan 3idak butuh preparasi sampel Mengurangi potensi perubahan senyawa yang tidak diinginkan selama preparasi
!elemahan
Memakan waktu 3erbatas pada hewan
Mikrobiologis dan cara kimia memerlukan ekstraksi 6ara kimia In"ormasi yang diperoleh hanya total itamin dalam makanan tidak sampai bioailabilitas itamin Mikrobiologis terbatas pada itamin yang larut air dan memakan waktu tetapi memerlukan sedikit sampel
6ara kimia dengan *B6 lebih disukai karena sederhana, akurat dan teliti. Namun yang terpenting ketika memilih metode analisa, setidaknya metode tersebut telah diujikan di laboratorium dan telah dipublikasikan oleh organisasi seperti #0#6 &#merican o" 0""icial #nalytical 6hemist(
