Tugas Kelompok BIOLOGI SEL MEKANISME PERBAIKAN DNA (DNAREPA REKOMBINASI DNA (DNARE
I R) dan
COMBI NAT I ON)
DOSEN MATA KULIAH : Dra. Arni Amir, MS
DI SUSUN OLEH : ( KELOMPOK 4 ) Eka Safitri Yanti
(1420332031)
Marisa Lia Anggraini
(1420332032)
Dewi Ayu Ningsih
(1420332033)
Tiyan Febriyani Lestari
(1420332034)
Murdayah
(1420332035)
Usna Maria Harahap
(1420332036)
Welly Handayani
(1420332037)
Nela Rahmawati
(1420332038)
Rahmatul Ulya
(1420332039)
Rika A
(1420332034)
i
ii
KATA PENGANTAR
Penulis mengucapkan syukur Alhamdulillah atas karunia Allah SWT, akhirnya tugas makalah mata kuliah Biologi Sel dengan judul
“
DNA
repair dan DNA Recombination
”
dapat diselesaikan tepat pada waktunya.
Materi tugas ini diambil dari berbagai sumber ilmiah. Tugas ini disusun terutama untuk memenuhi tugas mata kuliah Biologi Sel, dengan harapan dapat memperdalam wawasan keilmuan penulis sebagai mahasiswa Pascasarjana Ilmu Kebidanan tentang DNA
repair dan DNA Recombination.
Penulis mengucapkan terima kasih kepada dosen mata kuliah Biologi Sel, ibu Dra. Arni Amir, MS, yang telah memberi kesempatan dan bimbingan kepada penulis sehingga dapat menyelesaikan makalah ini.
Penulis menyadari bahwa makalah ini masih jauh dari sempurna, oleh karena itu penulis mengharapkan saran serta masukan yang bermanfaat dalam kesempurnaan makalah ini.
Padang, Februari 2015
Penulis
iii
DAFTAR ISI
HALAMAN JUDUL .................................................................................................................i KATA PENGANTAR.............................................................................................................iii DAFTAR ISI............................................................................................................................iv
BAB I PENDAHULUAN......................................................................................................... 1 A.
Latar Belakang ............................................................................................................................ 1
B.
Rumusan Masalah ....................................................................................................................... 3
C.
Tujuan ......................................................................................................................................... 3
BAB II PEMBAHASAN .......................................................................................................... 4 Mekanisme Perbaikan DNA (DNA Repair) ............................................................................... 4
A. 1.
Komponen yang Terlibat dalam Perbaikan DNA ................................................................... 5
2.
Mekanisme Perbaikan DNA ................................................................................................... 6
3. B.
Kegagalan Perbaikan DNA ................................................................................................... 17 DNA Rekombinan .................................................................................................................... 19
1. 2.
Fungsi Rekombinasi Genetik ................................................................................................ 19 Tipe Rekombinasi Genetik.................................................................................................... 19
BAB III PENUTUP ................................................................................................................ 40
DAFTAR PUSTAKA
iv
BAB I PENDAHULUAN
A. Latar Belakang
DNA merupakan bahan genetik yang harus diturunkan kepada generasi berikutnya. Terdiri dari tiga komponen utama, yaitu gugus fosfat, gula 5-karbon (deoksiribosa) dan basa nitrogen. DNA akan mengalami proses perbanyakan sebagai salah satu tahapan sangat penting dalam proses pertumbuhan sel. DNA sebagai materi genetik yang selalu mengalami berbagai reaksi kimia dan selalu melakukan copy DNA. Perubahan struktur DNA ini disebut mutasi DNA yang dapat terjadi pada saat proses replikasi DNA. Thomas Carell dan Eva Burckstummer di Ludwig Maximillan University of Munich, Jerman, telah membuat rantai-rantai DNA pendek yang mengandung lesi (cacat/luka). Carell menjelaskan bahwa ini adalah kunci untuk memahami reparasi DNA. Lesi-lesi yang terdapat pada DNA ini analog dengan lesi yang timbul apabila sinar UV mengenai DNA yang tersimpan dalam spora seperti spora bakteri Bacillus. Di alam, spora-spora ini bisa menjadi tidak aktif (dorman) selama bertahun-tahun, dengan menyimpan DNA, tetapi kemudian hidup kembali. Glen Burley, seorang ahli di bidang nanoteknologi DNA di Universitas Leicester, Inggris, mengatakan bahwa penelitian ini menarik karena menemukan sebuah metode untuk meneliti bagaimana spora bakteri mereparasi DNA yang rusak. "Mekanisme yang terlibat perlu segera diketahui karena proses kerusakan DNA pada spora berbeda dengan yang terjadi pada mamalia," kata dia. "Metode-metode ini kemungkinan akan membuka pemahaman yang lebih besar tentang bagaimana spora bisa bertahan hidup selama periode waktu yang lama dan pada kondisi-kondisi yang tidak cocok – misalnya pada sumber mata air panas atau dibawah keterpaparan sinar UV." Carell menjelaskan bahwa walaupun proses reparasi pada spora berbeda, tetapi fenomena pengenalan lesi oleh enzim bersifat umum. Enzim-enzim seperti ini juga bekerja dalam sel-sel kita, sehingga pemahaman yang lebih mendalam tentang kelompok enzim yang membingungkan ini diperlukan. Kegagalan-kegagalan reparasi DNA ini bertanggung jawab untuk terjadinya mutasi yang selanjutnya mengarah pada situasi seluler berbahaya yang bisa menghasilkan kanker. DNA sebagai materi genetic yang selalu mengalami berbagai reaksi kimia dan selalu melakukan kopi DNA. Perubahan struktur DNA ini disebut mutasi DNA yang 1
dapat terjadi pada saat proses replikasi DNA. Untuk menstabilkan hal tersebut maka DNA memiliki kemampuan untuk memperbaiki (repair) kesalahan yang terjadi pada dirinya sendiri. Jika mutasi DNA yang terjadi cukup banyak dan DNA tidak sempat untuk memperbaiki (repair) dirinya sendiri maka akan terjadi kelainan ekspresi genetic bahkan menyebabkan terjadinya penyakit genetik. Konsumsi makanan yang bergizi serta istirahat yang cukup memungkinkan tubuh untuk dapat melakukan repair DNA. DNA repair merupakan suatu mekanisme perbaikan DNA yang mengalami kerusakan / kesalahan yang diakibatkan oleh proses metabolisme yang tidak normal, radiasi dengan sinar UV, radiasi ion, radiasi dengan bahan kimia, atau karena adanya kesalahan dalam replikasi DNA. Mekanisme perbaikan yang terdapat ditingkat selular secara garis besar disesuaikan dengan jenis kerusakan yang tentu saja terkait erat dengan jenis factor penyebabnya. Sel-sel menggunakan mekanisme-mekanisme perbaikan DNA untuk memperbaiki kesalahan-kesalahan pada sekuens basa molekul DNA. Kesalahan dapat terjadi saat aktivitas selular normal, ataupun dinduksi. DNA merupakan sasaran untuk berbagai kerusakan: baik eksternal agent maupun secara spontan. Apabila ada kesalahan / kerusakan DNA, sel mempunyai dua pilihan : (1) Kesalahan tersebut diperbaiki dengan cara mengaktifkan DNA repair. Namun apabila kesalahan yang ada sudah tidak mampu lagi ditanggulangi, sel memutuskan untuk beralih ke pilihan kedua. (2) Apabila DNA tidak mampu diperbaiki lagi, akibat dari adanya kesalahan yang fatal maka akan dimatikan daripada hidup membawa pengaruh yang buruk bagi lingkungan sekelilingnya. Kemudian sel dengan DNA yang normal akan meneruskan perjalanan untuk melengkapi siklus yang tersisa yaitu S (sintesis) G2 (Gap 2) dan M (Mitosis). Rekombinasi DNA merupakan penyusunan kembali informasi genetic dalam dan antara molekul DNA yang meliputi berbagai macam proses yang terletak secara kolektif dibawah rekombinasi genetic. Pengertian tentang bagaimana penyususnan kembali DNA terjadi menemukan penggunaan praktis seperti metode baru yang diteliti para ilmuan untuk mengubah genom berbagai macam organisme. Rekombinasi DNA ( rDNA ) adalah suatu upaya meletakkan DNA dari suatu organisme kedalamDNA bakteri dengan menggabungkan dua atau lebih sekuens yang biasanya tidak akan terjadi bersama-sama melalui penyambungan gen. Dalam hal modifikasi genetik, itu diciptakan melalui pengenalan yang relevan DNA ke dalam DNA organisme yang ada seperti plasmid dan bakteri, untuk kode atau mengubahciri yang berbeda dengan tujuan tertentu seperti resistensi
antibiotik. Ini berbeda dari
2
rekombinasigenetika dalam hal itu tidak terjadi melalui dalam sel, tetapi di rekayasa. Sebuah protein rekombinan adalahsuatu protein yang dihasilkan dari DNA rekombinan.
B. Rumusan Masalah
Rumusan masalah dari makalah ini yaitu bagaimana proses terjadinya mekanisme perbaikan DNA (DNA repair) dan rekombinasi DNA (DNA recombination) ?
C. Tujuan
Tujuan dari penyusunan makalah ini yaitu mampu memahami dan menjelaskan mengenai proses mekanisme perbaikan DNA (DNA repair) dan rekombinani DNA (DNA recombination), yang meliputi :
3
BAB II PEMBAHASAN
A. Mekanisme Perbaikan DNA (DNARepair )
Pemeliharaan integritas informasi di dalam molekul DNA sangat penting bagi kelangsungan hidup spesies. Jadi dapat disimpulkan bahwa spesies yang bertahan hidup berhasil menjalankan mekanisme untuk memperbaiki kerusakan DNA-nya yang terjadi akibat kesalahan replikasi atau gangguan dari lingkungan. DNA
bukanlah substansi yang lemah,
telah dilengkapi dengan mekanisme
tertentu yang mampu menetralisasi “gangguan-gangguan” yang terjadi sehingga tidak membawa efek negatif. Mekanisme yang dimiliki DNA tersebut adalah mekanisme DNA
repair (perbaikan DNA) yang terjadi pada fase tertentu dalam siklus sel. DNA repair merupakan suatu mekanisme perbaikan DNA yang mengalami kerusakan/kesalahan yang diakibatkan oleh proses metabolisme yang tidak normal, radiasi dengan sinar UV, radiasi ion, radiasi bahan kimia atau dikarenakan adanya kesalahan dalam replikasi DNA.
Gambar 1. Proses kerusakan dan perbaikan DNA
Pada fase G1 (Gap 1) terdapat check point yaitu suatu tempat dimana susunan DNA akan dikoreksi dengan seteliti-telitinya. Apabila ada kesalahan, sel mempunyai dua 4
pilihan : Pertama, kesalahan tersebut diperbaiki dengan cara mengaktifkan DNA repair. Namun, apabila kesalahan yang ada sudah tidak mampu lagi ditanggulangi, sel memutuskan untuk mengambil pilihan kedua yaitu “dimatikan” daripada hidup membawa pengaruh buruk bagi lingkungan sekelilingnya, saat itulah keputusan untuk berapoptosis diambil. Sel dengan DNA normal akan meneruskan perjalanan untuk melengkapi siklus yang tersisa yaitu S (Sintesis), G2 (Gap 2) dan M (Mitosis). Kerusakan DNA akibat bahan kimia, fisik, dan lingkungan diklasifikasikan menjadi empat tipe, yaitu: 1. Perubahan satu basa a. Depurinasi b. Deaminasi sitosin menjadi urasil c. Deaminasi adenine menjadi hipoxantin d. Alkilasi basa e. Insersi atau delesi nukleotida f. Penyertaan analog basa 2. Perubahan dua basa a. Dimmer antartimin (pirimidin) yang diinduksi oleh sinar UV b. Ikatan silang agen pengalkil bifungsional 3. Pemutusan rantai a. Radiasi pengionan b. Disintegrasi elemen rangka (tulang punggung) oleh radioaktivitas c. Pembentukan radikal bebas oksidatif 4. Ikatan silang a. Antara basa di untai yang sama atau berlawanan b. Antara DNA dan molekul protein (mis. Histon)
1. Komponen yang Terlibat dalam Perbaikan DNA
Proses perbaikan DNA itu harus melibatkan berbagai macam komponen, yang sangat berperan penting dalam mekanisme perbaikan DNA tersebut. Tabel 1. Komponen yang terlibat dalam perbaikan DNA Sistem perbaikan
Base excision
Enzim / Protein
Exicion
Enzim / Protein
DNA glycosylase
Dam methylase
AP endonuklease DNA polymerase I
MutS, MutH,MutL Exonuclease
DNA Ligase Nucleotid
Sistem perbaikan
UVrA, UvrB,UvrC
Mismatch
DNA Helicase II DNA Polimerase
DNA Polymerase I DNA Ligase
DNA Ligase 5
2. Mekanisme Perbaikan DNA
Pada dasarnya perbaikan DNA dikelompokkan menjadi 3 yaitu damage reversal,
damage removal dan terakhir damage tolerance
a. Damage Reversal (Direct Damage Reversal/Perbaikan Langsung DNA) Kebanyakan kerusakan DNA diperbaiki dengan membuang bagian basa yang rusak diikuti oleh resintesis dari bagian yang telah dibuang. Bagaimanapun, ada beberapa bagian pada DNA yang dapat diperbaiki secara langsung karena lebih efisien. Hanya beberapa tipe kerusakan DNA yang diperbaiki dengan cara ini, khususnya dimer pirimidin akibat terpapar sinar ultraviolet (UV) dan residu
alkilasi guanine yang telah berubah oleh penambahan dari kelompok methyl atau ethyl pada posisi O6 dari cincin purin. 1) DNA photolyase Sinar UV merupakan salah satu sumebr yang paling banyak menyebabkan kerusakan pada DNA. Telah dibuktikan bahwa sinar UV dapat menyebabkan kanker kulit pada manusia. Kerusakan paling sering akibat sinar UV adalah terbentuknya dimer pirimidin, dimana pirimidin yang berdekatan pada untai yang sama pada DNA bergabung. Dimer ini akan mengubah struktur rantai DNA dan menghambat transkripsi atau replikasi melalui bagian yang rusak. Dimer timin akan melahkan ikatan hydrogen yang akan merubah struktur double helix sehingga proses replikasi terganggu dan akan menyebabkan timbulnya mutasi. Adanya dimer pirimidin ini akan mengaktifkan suatu proses perbaikan dimana suatu kompleks protein enzim fotoreaktif yang dinamakan
DNA photolyase akan memutuskan dimer pirimidin ini tetapi tanpa memutuskan ikatan fosfodiester antar nukleotida. Perubahan urutan akan diperbaiki dengan pergantian sesama nukleotida dengan basa pirimidin, dan akan diikuti proses penangkupan kembali celah yang semula tercipta. Proses ini dinamakan dengan photoreactivation. Mekanisme ini tidak umum didaptkan pada semua jenis makhluk hidup. Banyak spesies termasuk manusia tidak mempunyai mekanisme ini dalam perbaikan DNA.
6
Gambar 2. Photoreactivation
2) O6-methylguanine-DNA-alkyltransferase Bentuk lain dari direct repair adalah perbaikan karena kerusakan dari reaksi antara agen alkilasi dan DNA. Alkylating agent adalah senyawa reaktif yang dapat mentransfer kelompok methyl atau ethyl ke dalam basa DNA, oleh karena itu merubah basa secara kimia. Jenis kerusakan ini khususnya methylation dari posisi O6 pada guanine. Karena produk O6-mehylguanine, membentuk pasangan basa komplementer dengan timin bukan dengan sitosin. Kerusakan ini dapat diperbaiki dengan sebuah enzim yang dinamakan O6-
methylguanine methyltransferase yang mentransfer kelompok methyl dari O 6methylguanine ke sebuah cystein dalam active site.
7
Gambar 3. O6-methylguanine-DNA-alkyltransferase
b. Damage Removal (E xcision Repair) Walaupun perbaikan langsung (direct repair) merupakan cara yang efisien untuk memperbaiki kerusakan DNA, excision repair (mekanisme perbaikan dengan pemotongan) merupakan perbaikan yang paling umum pada berbagai kerusakan DNA. Oleh karena itu, berbagai tipe excision repair merupakan mekanisme paling penting baik pada sel prokariot maupun eukariot. Pada excision repair, kerusakan DNA ditemukan dan dibuang, baik itu basa maupun nukleotida. Bagian yang hilang kemudian akan diisi dengan sintesis untai DNA yang baru menggunakan untai komplementer yang tidak rusak sebagai template. Ada tiga tipe dari excision
repair yaitu base excision repair, nucleotide excision repair dan mismatch repair.
8
1) Base Excision Repair Depurinasi DNA, yang terjadi secara spontan karena labilitas termal ikatan Nglikosida purin, terjadi dengan kecepatan 5.000-10.000/sel/hari pada suhu 370 C. Enzim-enzim spesifik mengenali bagian yang
mengalami
depurinasi
dan
menggantikannya dengan purin yang secara langsung,
tanpa
interupsi
pada
tulang
punggung phospodiester. Basa sitosin, adenine, dan guanine di DNA secara spontan membentuk, masingmasing, urasil, hipoxantin, xantin. Karena tidak ada satupun dari ketiga basa tersebut yang terdapat di DNA pada keadaan normal, tidaklah mengherankan jika N-glikosilase spesifik
dapat
mengenali
basa-basa
abnormal ini yang mengeluarkan sendiri basa dari DNA. Pengeluaran ini menandai letak
kecacatan
endonuklase
dan
apurinik
memungkinkan atau
apirimidinik
memotong gula tanpa basa. Basa yang sesuai kemudian memotong gula tanpa basa ini. Basa yang sesuai kemudian dipasang
Gambar 4. Base excision repair
oleh DNA polymerase, dan ligase memperbalikkan DNA ke keadaannya semula. Rangkaian kejadian ini disebut base excision repair (perbaikan dengan memotong basa). Dengan rangkaian langka serupa yang mula-mula melibatkan defek, basa teralkilasi dan analog basa dapat dikeluarkan dari DNA dan DNA dipulihkan kebentuknya semula. Mekanisme ini cocok untuk menggantikan basa tunggal, tetapi tidak efektif untuk mengganti region DNA yang rusak. Basa-basa DNA dapat dirusak melalui deamination atau alkylation. Tempat kerusakan basa tersebut disebut dengan "abasic site" atau "AP site". Pada E.coli, enzim DNA glycosylase dapat mengenal AP site dan membuang 9
basanya. Kemudian AP endonuclease membuang AP site dan
nucleotida
sekitarnya. Kekosongan akan diisi dengan bantuan DNA polymerase I dan DNA ligase.
Gambar 5. Base Excison-repair DNA, enzim urasil DNA glikosilasil membuang urasil yang terbentuk dari deaminasi spontan sitosin di DNA. Suatu endonuklease memotong kerangka utama untai di dekat defek; lalu setelah endonuklease mengeluarkan beberapa basa, defek tersebut diisi melalui kerja polimerasi dan untai tersebut kembali dihubungkan oleh suatu ligase.
2) Nucleotide Excision Repair Mekanisme ini digunakan untuk menggantikan suatu regio DNA dengan panjang 30 bp yang mengalami kerusakan. Penyebab umum kerusakan DNA semacam ini adalah sinar ultraviolet (UV), yang memicu pembentukan dimmer antarpirimidin siklobutan, dan merokok, yang menyebabkan pembentukan adduct (addition product) benzo [a]pirenguanin. Radiasi pengion, obat kemoterapi kanker, dan berbagai bahan kimia yang terdapat dilingkungan yang dan dapat menyebabkan modifikasi basa, putusnya untai, ikatan silang antara basa di untai yang berhadapan atau DNA dan protein, dan berbagai defek lain. Cacat-cacat ini diperbaiki oleh suatu proses yang disebut perbaikan yang disebut eksisi nukleotida. 10
Proses rumit, yang melibatkan lebih banyak produk gen dibandingkan dengan dua tipe perbaikan sebelumnya, pada dasar mencakup hidrolisis dua ikatan phospodiester di untai yang mengandung kecacatan. Suatu nuclease eksisi khusus (eksonuklease), yang terdiri dari paling sedikit tiga subunit pada E. coli dan 16 polipeptida pada manusia, melaksanakan tugas ini. Di sel eukariot, enzim-enzim memotong antara ikatan phospodiester ketiga dan kelima 3’ dari lesi, dan dari sisi 5’ potongan terletak di suatu tempat antara ikatan keduapuluh satu dan keduapuluh lima. Karena itu, terjadi eksisi suatu fragmen DNA dengan panjang 27-29 nukleotida. Untai yang dikeluarkan kemudian diganti, juga pembentukan pasangan basa yang tepat, melalui kerja polymerase lain yang belum diketahui ( / pada manusia), dan ujung-ujung untai disatukan dengan untai yang sudah ada oleh DNA ligase. Pada E. coli, protein UvrA, UvrB, dan UvrC berperan dalam membuang nukleotida (dimer akibat UV light). Kemudian kekosongan akan diisi dengan bantuan enzim DNA polymerase I dan DNA ligase. Pada yeast,
proteins Uvr's dikenal dengan nama RADxx ("RAD"
kependekan dari "radiation"), seperti RAD3, RAD10, dan lain-lain.
Gambar 6. Nucleotide excision repair
11
Gambar 7. Perbaikan-eksisi nukleotida (nukleotida excision repair). Mekanisme ini digunakan untuk memperbaiki defek besar DNA dan umumnya melibatkan lebih banyak protein disbanding mismatch repair atau perbaikan eksisi basa. Setelah kelainan dideteksi (ditandai oleh XXXX) dan DNA yang mengandung kelainan tersebut diraikan/(unwinding), suatu nuclease eksisi (eksinuklease) memotong DNA disebelah hulu dan hilir dari bagian yang cacat. Celah ini kemudian diisi oleh polymerase dan disambung kembali.
3) Mismatch Repair Mismatch repair, memperbaiki kesalahan yang dibuat ketika DNA disalin. Contohnya, C dapat terselip berhadapan dengan A, atau polymerase dapat “tergelincir” atau “tersendat” dan menyisipkan dua sampai lima basa tambahan yang tidak berpasangan. Protein-protein yang spesifik memindai DNA yang baru dibentuk menggunakan methylasi adenine di dalam sekuens GATC sebagai titik referensi. Untai cetakan mengalami methylasi, dan untai yang baru dibentuk tidak demikian. Perbedaan ini tidak memungkinkan enzim perbaikan mengidentifikasi untai yang mengandung kesalahan nukleotida dan memerlukan pergantian. Jika ditemukan ketidakcocokan atau lengkung kecil, suatu GATC endonuklease memotong untai yang mengandung mutasi di tempat yang berkorespondensi dengan GATC. Suatu eksonuklease kemudian mencerna untai ini dari GATC dan melalui mutasi sehingga DNA yang
12
cacat tersebut dapat dibuang. Hal ini dapat berlangsung dari kedua ujung jika cacat tersebut diapit oleh dua tempat GATC. Cacat ini kemudian di isi oleh enzim sel normal sesuai aturan pembentukan pasangan basa. Untuk memperbaiki basa yang tidak berpasangan harus diketahui pasangan basa mana yang salah. Pada E. coli, ini dapat diketahui oleh methylase yang disebut dengan
“Dam methylase”, dimana dapat
memethylasi adenines yang terdapat pada urutan (5’) GATC. Segera sesudah replikasi DNA, template strand dimethylasi, tetapi strand yang baru disintesa belum dimethylasi. Jadi antara template strand dan new strand akan berbeda. Pada E. coli , diperlukan tiga protein (Mut S, Mut C, dan Mut H) untuk mengenali mutasi dan memotong untai. Enzim lain di dalam sel, termasuk ligase, 13olymerase, dan SSB mengeluarkan dan mengganti untai.
Gambar 8. Mismatch repair
Dimulai dengan berikatannya protein MutS pada mismatched base
pairs. Kemudian MutL mengaktifkan MutH untuk bergabung bersama pada urutan GATC. MutH akan membelah strand yang tidak dimethylasi 13
pada tempat GATC . Selanjutnya, segment dari tempat pembelahan akan dibuang oleh enzim exonuclease (dengan bantuan enzim helicase II dan SSB proteins). Bila pembelahannya pada bagian 3' dari kerusakan, maka akan dipotong oleh enzim exonuclease I dan bila pada bagian 5' oleh enzim exonuclease VII atau RecJ untuk mendegradasi single tranded DNA. Kekosongannya akan diisi dengan bantuan enzim DNA polymerase III dan DNA ligase. Jarak antara tempat GATC dengan kerusakan bisa mencapai sepanjang 1,000 base pairs .
Gambar 9. Mismatch repair DNA. Mekanisme ini memperbaiki kesalahan pembentukan satu pasangan basa (mis. C dengan A, bukannya T dengan A) atau sepotong pendek DNA yang tidak berpasangan. Bagian yang cacat dikenali oleh suatu endonuklease yang melakukan pemotongan untai-tunggal di sekuens GATC termethylasi. Untai DNA dikeluarkan melalui mutasi, diganti, lalu disambung kembali.
14
c. Damage Tolerance Pada excision repair, kerusakan yang terjadi hanya pada salah satu strand atau untai DNA, sehingga kerusakan yang terjadi dikelompokkan dalam Single Strand
Break dan untuk memperbaiki kerusakan tersebut juga hanya dilakukan pada untai yang mengalami kerusakan (Single Strand Break repair) baik dengan pembuangan basa atau nukleotida. Pada kasus kerusakan DNA yang berat dapat terjadi pemutusan dua untai sekaligus (Double Strand Breaks) dan untuk memperbaiki ini ada dua cara yang dilakukan yaitu Non homologous End Joining
(NHEJ) dan Homologous Recombination (HR) 1) Non Homologous End Joining (NHEJ) Perbaikan kerusakan untai ganda merupakan bagian dari proses fisiologis tata ulang gen imunoglobulin. Perbaikan ini merupakan mekanisme penting untuk memperbaiki DNA yang rusak, seperti yang terjadi akibat radiasi pengion atau pembentukan radikal bebas oksidatif. Sebagian obat kemoterapi merusak sel dengan merusak untai ganda atau perbaikannya. Mula-mula terdapat dua protein yang berperan dalam penyatuan kembali non homolog suatu kerusakan untai ganda. Ku, suatu heterodimer subunit 70 kDa dan 86 kDa, berikatan dengan ujung-ujung bebas DNA aktivitas helikase dependen-ATP laten. Heterodimer Ku yang berikatan dengan DNA merekrut suatu protein kinase unit, protein kinase dependen DNA (DNA PK). DNA-PK memiliki satu ikatan bagi ujung-ujung bebas DNA dan satu tempat ikatan untuk dsDNA tepat di bagian dalam ujung-ujung unit. Karena itu, enzim-enzim ini memungkinkan aproksimasi kedua ujung yang terpisah. Ujung bebas kompleks DNA-Ku-DNA-PK membangkitkan aktivitas kinnase pada ujung-ujung yang terpisah. DNA-PK secara timbale balik memphosporilasi KU dan molekul DNA-PK lain di untai yang berlawanan, ditrans. DNA-PK kemudian kemudian terlepas dari DNA dan KU, menyebabkan aktivasi Ku helikase. Hal ini menyebabkan penguraian kedua ujung DNA. DNA yang telah di urai dan sudah diaproksimasi kemudian membentuk pasangan basa; kelebihan ekor nukleotida dibuang oleh eksonuklease; dan celah yang ada di isi dan ditutup oleh DNA ligase.
15
Gambar10. Perbaikan kerusakan untai ganda DNA. Protein Ku dan protein kinase dependen-DNA berikatan untuk mendekatkan kedua untai dan menguraikannya. Fragmen-fragmen yang telah berjajar membentuk pasangan basa; kelebihan ujung dikeluarkan, mungkin oleh endonuklease atau eksonuklease terkait DNA-PK, dan celah kemudian diisi; dan kontinuitas untai dipulihkan oleh ligase. 2) Homologous recombination (HR) Pada perbaikan rangkaian
rekombinasi tergantung donor
yang
homolog, pada
proses
keberadaan
homolog
(sister
kromatid, kromosom homolog atau rangkaian lainnya)
yang
dapat
digunakan
untuk
mengganti secara tepat rangkaian yang hilang dari DNA yang rusak. Rekombinasi homolog digunakan
untuk
perbaikan
rekombinasi miosis (meiotic
DNA
dan
. recombination)
HR akan dibahas lebih lanjut pada bagian Rekombinasi DNA (DNA Recombination)
Gambar 11. Homologous recombination
16
Gambar12. Perbandingan Double Strand Break (DSB) repair Non Homologous End Joining (NHEJ) dan Homologous Recombination (HR) 3. Kegagalan Perbaikan DNA
Kadang-kadang mekanisme perbaikan DNA tidaklah cukup. Mutasi terkadang tetap bertahan tidak terkoreksi sampai langkah selanjutnya dari replikasi DNA. Pada titik ini (tergantung dari sifat alami dari mutasi), mutasi tersebut akan secara permanen bergabung ke dalam genom. Ketika DNA melakukan sintesis protein dari gen yang mengandung mutasi (melalui transkripsi dan translasi), protein mutan mungkin akan berisi satu asam amino yang tidak tepat. Ini mungkin bukan masalah besar, tetapi jika asam amino tersebut krusial (mis: katalisis residu pada sisi aktif dari enzim) kemungkinan akan menghasilkan protein yang tidak aktif. Malfungsi tersebut akan menyebabkan masalah besar seperti kematian organism, penyekit genetic seperti cystic fibrosis atau sickle cell anemia atau carcinogenic lesion.
17
Gambar 13. Kegagalan Perbaikan DNA Secara singkat mekanisme perbaikan DNA dapat Anda lihat pada table berikut: Tabel 2. Mekanisme perbaikan DNA Mekanisme
Mismatch repair (Perbaikan ketidakcocokan)
Base excision repair (Perbaikan dengan memotong basa)
Nucleotide excision repair (Perbaikan dengan memotong nukleotida)
Masalah Kesalahan penyalinan (lengkung tak berpasangan dengan dua sampai lima basa atau satu basa)
Kerusakan satu basa yang timbul spontan akibat bahan kimia atau radiasi
Solusi Pemotongan untai yang diarahkan oleh metal, pencernaan oleh eksonuklease, dan penggantian Pengeluaran basa oleh Nglikosilase, pengeluaran gula tanpa basa, penggantian
Kerusakan suatu segmen DNA secara spontan akibat bahan kimia atau radiasi
Pengeluaran oligomer sekitar 30 nukleotida dan penggantian
Doublestrand break repair Radiasi pengionan, (Perbaikan kerusakan untai ganda)
kemoterapi, radikal bebas oksidatif
Sinapsis, penguraian, penyusunan, dan ligasi.
18
B. DNA Rekombinan
Rekombinasi genetik adalah proses pertukaran elemen genetik yang dapat terjadi antara untaian DNA yang berlainan (interstrand), atau antara bagian-bagian gen yang terletak dalam satu untaian DNA (intrastrand). Dalam pengertian yang lebih sederhana, rekombinasi genetik didefinisikan menjadi penggabungan gen dari satu atau lebih sel ke sel target. Sel yang disisipi atau dimasuki gen dari luar atau dari sel lain disebut biakan rekombinan. Penyusunan kembali informasi genetik dalam dan antara molekul DNA yang meliputi berbagai macam proses yang terletak secara kolektif dibawah rekombinasi genetik.
1. Fungsi Rekombinasi Genetik
Fungsi dari rekombinasi genetik bervariasi tergantung mekanismenya. Beberapa fungsi rekombinasi genetik antara lain : a. Memelihara perbedaan genetik b. Sistem perbaikan DNA khusus c. Regulasi ekspresi gen tertentu d. Penyusunan kembali genetik yang diprogram selama perkembangan.
2. Tipe Rekombinasi Genetik
Secara garis besar ada tiga tipe rekombinasi genetik yang sudah banyak diketahui, yaitu, (a) rekombinasi homolog/ umum, (b) rekombinasi khusus (site-specific rekombination), dan (c) rekombinasi transposisi/ replikatif. a. Rekombinasi Homolog/ Umum
Rekombinasi homolog menyebabkan terjadinya pertukaran antarmolekul DNA yang merupakan homologi urutan nukleotida cukup besar. Ciri khusus rekombinasi homolog adalah bahwa proses tersebut dapat terjadi setiap titik di daerah homologi. Rekombinasi terjadi melalui tahap pemotongan untaian DNA yang kemudian diikuti dengan proses penggabungan kembali. Rekombinasi antarkromosom melibatkan proses pertukaran secara fisik antara bagian-bagian kromosom. Proses rekombinasi terjadi secara akurat sehingga tidak ada satupun pasangan basa nukleotida yang hilang atau ditambahkan ke dalam kromosom rekombinan. Proses pertukaran tersebut menyebabkan terbentuknya struktur yang dapat terlihat sebagai kiasma (chiasma) pada waktu meiosis. Kiasma merupakan tempat pemotongan dan penggabungan kembali untai DNA, yaitu ketika dua kromatid yang berbeda (non19
sister chromatids) terpotong dan tergabungkan satu sama lain. Proses rekombinasi dimulai dengan terjadinya pemotongan untai DNA kedua kromosom pada tempat yang sama oleh aktivitas nuklease. Rekombinasi homolog dimulai ketika dua kromosom homolog terletak berdekatan satu sama lain sehingga urutan nukleotida yang homolog dapat dipertukarkan. Kontak antara dua pasang kromosom tersebut, disebut sebagai proses sinapsis, terjadi pada awal meiosis yaitu pada profase.
Pada bakteri escherichia coli enzim nuklease tersebut dikode oleh gen recB dan recC yang masing-masing bertanggung jawab dalam sintesis eksonuklease V (135 kDalton) dan eksonuklease V (kDalton). Pemotongan tersebut hanya pada salah satu untai DNA dari kedua DNA untai ganda kromosom. Dengan adanya aktivitas nuklease tersebut maka untai DNA akan mengalami terbuka dan menjadi untai tunggal. Protein SBB (single-stranded binding poptein ) akan menstabilkan bagian DNA untai tunggal yang telah terbuka. Protein gen regA juga dapat mengkode protein lain selain protein SBB yang dapat berikatan dengan bagian untai tunggal tersebut. Bagian-bagian untai tunggal kemudian akan meninggalkan untai DNA pasangannya yang kemudian menuju untaian DNA yang komplementer (renaturasi) untuk berpasangan sehingga terjadi pindah silang (crossing-over). Protein gen regA berfungsi sebagai pengkatalisis pada proses penemuan untaian DNA yang komplementer dan renaturasi DNA untai-tunggal menjadi untai tunggal yang juga diikuti oleh proses hidrolisis ATP. Jika untaian-untaian DNA sudah terjadi pertukaran, maka untaian DNA tersebut dapat berjalan bergerak sepanjang untaian ganda DNA dan menggantikan salah satu untai DNA sehingga terjadi migrasi cabang (branch migration). Proses migrasi ini juga dikatalisis oleh hidrolisis DNA oleh protein regA.
Setelah terjadi migrasi cabang, struktur molekul kroomosom yang mengalami rekombinasi
harus
diuraikan
lagi
sehingga
dapat
menghasilkan
molekul
rekombinan. Hal ini terjadi dengan adanya pemotongan kedua kali oleh aktivitas nuklease yang hasilnya direparasi sehingga terbentuk molekul rekombinan.
Eksonuklease VIII diperkirakan dapat menggantikan aktivitas eksonuklease V (regBC) sehingga diperoleh dua jalur jalur rekomendasi yaitu jalur regBC dan jalur 20
regF. Proses rekomendasi yang tergantung pada produk gen recF diketahui terjadi dengan frekuensi yang lebih tinggi pada mutan gen regBC yang juga mempunyai mutasi lain pada gen sbcB (gen struktural eksonuklease I).
Model mengenai mekanisme rekombinasi yang banyak dipakai saat ini dan banyak diterima adalah model yang diajukan oleh Robin Holliday (model holliday), yang memiliki asumsi bahwa terjadi dua pemotongan pada posisi yang tepat saling berhadapan pada untaian DNA homolog. seperti gambar dibawah ini.
Gambar 14. Skema rekombinasi merurut model Holiday
21
Selain model Holliday, dikenal jugan model lain yaitu Rekombinasi Model Meselson-Radding. Model ini mengasumsikan bahwa rekombinasi model yang
disampaikan oleh Robin Holliday (model holliday) nampaknya sulit untuk terjadi mengingat kemungkinan untuk terjadi kedua pemotongan seperti tersebut sangat kecil, sehingga Matthew Meselson dan Charles Radding pada tahun 1975 mengusulkan model alternatif dalam menjelaskan proses rekombinasi. Model ini menjelaskan bahwa terjadi replikasi pada daerah takik (nick) salah satu untaiian DNA yang menyebabkan terjadinya penggusuran untaian DNA, yang kemudian untaian DNA yang tergusur tersebut selanjutnya dapat menginvasi DNA homolog dan berpasangan dengan salah satu untaian DNA sekaligus menggusur untaan DNA homolog yang lain. DNA yang tergusur tersebut akan membentuk D-loop, yang selanjutnya akan dihilangkan sehingga terjadi migrasi cabang. Setelah terjadi migrasi cabangbarulah terbentuk persimpangan Holliday ( Holliday junction).
Selain mekanisme tersebut, Radding juga mengusulkan bahwa terdapat mekanisme alternatif lain yaitu adanya celah (gap) pada salah satu untaian DNA menyebabkan terjadinya pasangan antara DNA dupleks yang mempunyai celah dengan salah satu untaian DNA dupleks yang lain. Invasi salah satu untaian DNA ke untaian DNA homolog tersebut kemudian diikuti dengan replikasi. Setelah terjadi replikasi kemudian akan diikuti oleh migrasi cabang dan akhirnya terbentuk persimpangan Holliday, seperti gambar dibawah ini.
22
Gambar 15. Skema rekombinasi menurut model Meselson - Radding
23
b. Rekombinasi khusus (Site-Specific Rekombination)
Rekomendasi khusus (Site-Specific Rekombination) hanya terjadi pada tempat khusus didalam segmen molekul DNA. Pertukaran materi genetik dilakukan ileh protein khusus yang mengkatalisis pemotongan dan penggabungan molekul DNA secara tepat pada tempat terjadinya rekombinasi. Proses rekomendasi khusus ini tidak tergantung pada protein recA. Terdapat beberapa ciri dari rekomendasi khusus ini, yaitu : 1. Proses rekomendasi terjadi ditempat khusus pada kedua fragnmen DNA 2. Rekomendasi berlangsung timbal balik (reciprocal) yaitu kedua hasil pertukaran genetik tersebut dapat diperoleh kembali 3. Rekomendasi terjadi secara konservatif, yaitu proses pertukaran genetik tersebut dilakukan melalui pemotongan dan penyambungan kembali bagian DNA yang berekomendasi tanpa ada sintesis nukleotida baru 4. Bagian yang mengalami rekomendasi tersebut mempunyai homologi dalam hal nukleotida
Proses rekombinasi khusus dimulai dengan terjadinya pemotongan bagian DNA yang akan berekomendasi pada daerah yang mempunyai homologi sehingga dihasilkan ujung lekat ( sticky end). Kedua ujung lekat pada kedua fragmen DNA yang berkombinasi tersebut kemudian mengalami pertukaran untai DNA sehingga akan terbentuk konfigurasi rekombinan.
Salah satu contoh penting rekomendasi khusus adalah integrasi dan pemotongan materi genetik bakteriofag lisogenik, misalnya bakteriofag lambda, kedalam dan keluar dari kromosom bakteri inang. Dalam siklus lisogenik bakteriofag lambda, molekul DNA lambda disisipkan atau diintegrasikan ke dalam kromosom bakteri sehingga terbentuk proofag. Tahap tersebut kemudian diikuti dengan represi untuk mencegah sintesis protein bakteriofag yang dapat menghambat atau mematikan bakteri inang. Integrasi DNA lambda tersebut ke dalam kromosom Escherichia coli terjadi pada tempat khusus yaitu diantara operon gal dan operon bio (biotin) yang biasa disebut dengan tempat pengikatan lambda (lambda attachment site, att). Skema dasar mekanisme DNA lambda ke dalam kromosom E. coli seperti gambar dibawah ini
24
Bacteriofag lambda
E. coli
Gambar 16. Skema dasar mekanisme integrasi DNA lambda kedalam kromosom E. coli
Bagian kromosom E. coli yang menjadi tempat integrasi lambda adalah attB, sedangkan bagian DNA lambda tempat terjadinya rekomendasi disebut sebagai
attP. Pada bakteriofag, daerah integrasi tersebut dikenal sebagi fragmen POP’, yaitu terdiri atas segmen O yang diapit oleh dua urutan nukleotida yang berbeda (P dan P’). sedangkan pada bakteri daerah tersebut dikenal sebagai fragmen BOB”. Kedua tempat att tersebut mempunyai homologi yang terdiri atas 15 nukleotida (disebut sebagai segmen O baik pada bakteriofag maupun pada bakteri inang) yang merupakan urutan nukleotida inti (core sequence). Urutan nukleotida pada daerah att adalah sebagai berikut :
att pada lambda
TTCAGCTTT TT TATACTAA GTTG AAGTCGAAA AA ATATGATT CAAC POP’
att pada bakteri
GCCTGCTT
TTTTAT ACTAACTTG
CGGACGAA AAAATA TGATT GAAC BOB’
25
Jika terjadi rekomendasi maka akan dihasilkan rekomendasi sebagai berikut :
GCCTGCTTTT TTATA CTAA
GTTG… TTCA GCT TT TTTATACTAA CTTG
CGGACGAAAAAATAT GATT CAAC… AAGT
CGA AA AAATATGATT
GAAC
Profag
Setelah terintegrasikan ke dalam kromosom bakteri, maka DNA lambda (profag) tersebut akan diapit oleh dua att, yaitu attL dan attR, yang masingmasing merupakan hibrid antara attP dan attB. Poses integrasi tersebut dikatalisis oleh enzim yang merupakan produk gen int pada lambda yaitu protein int yang dikenal sebagai integrase. Enzin ini mempunyai aktivitas untuk mengikat DNA (DNA-binding activity) dan merupakan topoisomerase I. selain integrase, proses integrasi juga memerlukan protein yang sintesisnya dikode oleh sel inang yaitu protein IHF (Integration host factor ). Protein IHF terdiri atas dua polipeptida yang dikode oleh gen himA dan gen hip. Baik integrase maupun IHF adalah protein yang berikatan dengan DNA pada tempat tertentu, yaituu pada daerah att. Integrase akan berikatan baik dengan attP maupun attB, sedangkan IHF hanya akan berikatan dengan attP. Suatu kompleks yang terdiri atas integrase, IHF, dan daerah att adalah satu kesatuan tempat berlangsungnya rekombinasi.
Jika bakteri lisogenik (membawa DNA lambda) tersebut mengalami kerusakan, misalnya karena radiasi ultraviolet, maka genoom profag tersebut akan dipotong dari kromosom bakteri inang (induksi profag) sehingga bakteriofag akan memulai siklus hidup litik. Pemotongan genom profag dilakukan dengan melalui rekombinasi khusus antara bagian att hibrid, yaitu attL dan attR. Pemotongan tersebut memerlukan protein integrase (Int), IHF, dan protein lain yang sintesisnya dikode oleh bakteriofag yaitu protein Xis (eksisionase). Xis juga memerlukan protein yang berikatan dengan DNA pada daerah tertentu, yaitu pada attL dan attR. Proses pemotongan tersebut sebenarnya merupakan kebalikan dari proses integrasi, yaitu dalam hal ini rekomendasi antara attL dan attR untuk menghasilkan kembali
attP dan attB. Meskipun demikian, secara mekanistik proses pemotongan tersebut
26
merupakan proses yang analog dengan proses rekomendasi integratif. Dengan demikian reaksi yang terjadi pada att dapat dituliskan sebagai berikut :
Int
BOB’ + POP’ BOP’ + POB’ Int, Xis
Xis yang membentuk kompleks dengan Int tidak dapat mengkatalisis reaksi ke kanan, sehingga Xis ada dalam jumlah berlebihan maka pemotongan merupakan reaksi yang tidak dapat balik. Hasil pemotongan profag dari kromosom E. coli adalah satu kromosom utuh dan satu molekul DNA lambda lingkar.
Dalam beberapa genom, rekombinasi khusus digunakan untuk mengendalikan ekspresi gen, misalnya dalam sintesis flagelin (subunit prptein pembentuk flagel) pada Salmonella typhimurium. Banyak spesies Salmonella bersifat difasik (diphasic) karena mempunyai dua gen nonalel yang bertanggung jawab terhadap sintesis flagelin. Flagelin yang disintesis dapat berupa tipe H1 jika bakteri tersebut berada dalam fase 1, atau flagelin tipe H2 pada fase 2. Transisi antara fase 1 dan fase 2 (variasi fase) terjadi sekali setiap 1.000 kali pembelahan sel. Gen H2 terletak didekat gen represor untuk sintesis H1 tidak akan terekspresikan karena ada sintesis represor H1. Sebaliknya, pada fase 1, tidak ada sintesis H2 maupun represor H1 sehingga gen H1 akan terekspresikan.
Mekanisme pengaturan sintesis flagelin H1 dan H2 tersebut ditentukan oleh suatu segmen nukleotida (gen hin, 995 bp) yang diapit oleh dua urutan nukleotida berulang ( inverted repeats, 14 bp) yaitu IRL dan IRR. Segmen nukleotida tersebut disebut sebagai daerah inversi. Dengan adanya rekombinasi antara IRL dan IRR yang dikatalisis oleh protein Hin, maka akan terjadi inversi. Inversi tersebut akan menyebabkan pembalikan orientasi promotor sehingga promotor tersebut tidak lagi mengendalikan sintesis H2 dan represor H1. Dengan demikian gen flagelin H1 akan terekspresikan karena tidak ada represor.
27
Konversi Gen
Jika suatu fungsi mengalami sporulasi, misalnya pada Neurospora crassa, maka akan terjadi proses fusi (peleburan) dua inti haploid menjadi inti diploid. Inti diploid tersebut jika mengalami meiosis akan menghasilkan empat inti haploid lagi. Jika keempat inti itu mengalami pembelahan mitosis, maka akan dihasilkan delapan inti haploid pada spora fungi. Secara teoritis, hasil mitosis tersebut akan menghasilkan jumlah alel yang sama jika kedua alel tersebut berbeda. Misalnya, jika salah satu alel adalah A dan alel lainnya adalah a, maka seharusnya alel A akan berjumlah empat, demikian juga alel a. hasil eksperimen menunjukan bahwa sel semacam ini tidak selalu terjadi karena seringkali terdapat jumlah alel A dan alel a yang tidak sama, misalnya lima alel A dan tiga alel a. fenomena tersebut terjadi karena adanya perubahan (konversi) dari alel a menjadi alel A sehingga nisbah (rasio) kedua alel tersebut tidak 1 : 1. Fenomena perubahan alel (urutan nukleotida) inilah yang di sebut sebagai konversi gen.
Pada N. crassa, konversi gen terjadi pada saat kromosom mengalami rekombinasi (pertukaran untaian DNA dan migrasi cabang) sehingga menghasilkan DNA heterodupleks yang urutan DNA-nya mengalami perubahan pada daerah tertentu sehingga terjadi perbedaan satu basa DNA antara alel A dan alel a. sebelum terjadi replikasi DNA, salah satu untaian DNA mengalami reparasi untuk memperbaiki DNA heterodupleks yang mempunyai kesalahan dalam urutan DNA nya. Reparasi tersebut menyebabkan bagian salah satu alel, misalnya a, berubah menjadi A, sedangkan untaian DNA yang lain tidak mengalami reparasi. Untaian DNA yang mengalami reparasi maupuun yang tidak di reparasi selanjutnya akan di replikasi. Dengan demikian, maka akhirnya jumlah alel A akan menjadi lebih banyak daripada alel a karena adanya penambahan alel A dari hasil konversi gen tersebut.
28
A A
Reparasi
Replikasi
A a
A
A Tidak direparasi
Replikasi
a a
Gambar 17. Skema proses konversi gen
Rekombinasi Meitotik
Rekombinasi meitotik adalah proses rekombinasi yang terjadi pada jasad eukaryot pada saat terjadi proses meiosis. Proses rekombinasi meiotik memiliki kemiripan dengan proses rekombinasi homolog pada beberapa hal meskipun pada beberapa tahap awalnya berbeda. Proses rekombinasi meiotik pada eukaryot dimulai dengan adanya pemotongan dua untai DNA ( double-strand break) yang ada pada salah satu kromosom. Ujung-ujung 5’ yang terbentuk karena pemotongan tersebut kemudian dipotong oleh eksonuklease dengan arah 5’
3’ sehingga terbentuk
ujung 3’ yang terbuka. Salah satu ujung 3’ tersebut kemudian menginvasi DNA dupleks yang lain sehingga terbentuk D-loop. Sementara ujung 3’ yang lain diperpanjang dengan proses sintesis dengan orientasi 5’ 3’ sebagai proses reparasi untuk mengisi celah yang terbentuk akibat pemotongan kedua untai DNA. Pada saat yang brersamaan terjadi pembesaran ukuran D-loop. Ujung 3’ yang menginvasi dupleks yang lain kemudian diperpanjang dengan proses sintesis. Setelah itu terjadi migrasi cabang kedua arah sehingga terbentuk persimpangn Holliday. Persimpangan Holliday tersebut akhirnya akan diuraikan sehingga dihasilkan rekombinan.
Perlu diketahui bahwa sebagian besar tahapan yang dikemukakan dalam mdel hipotetik tersebut didukung oleh bukti eksperimental, namum beberapa hal bertentangan dengan hasil pembuktian eksperimental. Sebagai contoh, model rekombinasi meiotik yang dikemukakan menyebutkan bahwa DNA hibrid akan 29
dihasilkan pada kedua untai DNA yang mengalami pemotongan kedua untainya tersebut. Meskipun demikian, bukti eksperimental dengan pendekata genetis membuktikan bahwa DNA hibrid hanya terbentuk pada salah satu untai DNA yang mengalami pemotongan kedua untainya. Dalam beberapa kasus, hibrid DNA terbentuk pada kedua untai DNA yang mengalami pemotongan, tetapi hal ini hanya terjadi pada kromatid yang sama, bukan pada kedua kromatid seperti yang diramalkan oleh model hipotetik tersebut.
Gambar 18. Skema transposisi meiotik
c. Rekombinasi Transposisi/Replikatif
Selain melalui mekanisme rekombinasi homolog dan rekombinasi khusus, rekomebinasi genetik juga dapat terjadi melalui proses transposisi. Transposisi adalah suatu proses perpindahan elemen genetik dari satu lokus dalam suatu kromosom, plasmid, atau genom virus, kebagian lain suatu kromosom yang sama, atau bahkan ke dalam suatu lokus kromosom yang lain. Elemen genetik yang 30
berpindah tersebut dapat berupa satu gen atau beberapa gen yang bertaut (lingked) dan dikenal sebagai elemen genetik yang dapat bertransposisi. Elemen genetik yang dapat bertransposisi tersebut ditemukan baik dalam prokariot, eukariot, maupun dalam bakteriofag. Semua transposon membawa kode genetik untuk satu atau lebih dari satu protein yang diperlukan untuk transposisi. Disamping itu, beberapa transposon juga membawa gen lain yang menghasilkan fenotipe tertentu, misalnya ketahanan terhadapantibiotik tertentu.
Pengelompokan Transposon
Transposon merupakan DNA segmen, yang ditemukan hampir pada semua sel, yang berpindah atau “loncat” dari satu tempat di kromosom (tempat donor) ke tempat yang lain pada kromosom yang sama atau berebeda (tempat target). Berdasarkan atas mekanisme perpindahan (transposisi), transpososn dibedakan menjadi tiga kategori, yaitu : 1. Transposon potong-tempel (cut and paste transposon) Tranpososn ini dapat berpindah dari satu lokus ke lokus lain dengan cara dipotong dari suatu lokus pada kromosom dan ditempelkan pada lokus yang lain yang dapat terletak pada kromosom yang berbeda.
Gambar 19. Transposon potong-tempel 31
2. Transpon replikatif (replicatif transposon) Transposon ini mengalami transposisi dengan melibatkan proses replikasi elemen DNA transposon. Enzim transposase yang dikode oleh elemen genetik tersebut berperan didalam proses interaksi dengan sisi tempat penyisipan transposon. Dalam interaksi tersebut elemen DNA transposon di replikasi dan salah satu turunan (copy) disisipkan pada sisi baru sedangkan elemen DNA aslinya tetap berada disisi semula.
Gambar 20. Transposon replikatif (replicatif transposon)
3. Retrotransposon Transposon ini dapat mengalami transposisi dengan cara melakukan proses transkripsi balik (reverse transcription) untuk mengubah elemen genetik berupa RNA menjadi DNA. Proses ini dikatalisis oleh enzim transkriptase balik (reverse transcriptase). Setelah DNA terbentuk, dilakukan penyisipan kedalam sisi target. Beberapa elemen genetik yang mengalami transposisi dengan cara ini mempunyai kaitan dengan retrovirus sehingga transposon seperti ini juga sering disebut elemen yang mempunyai retrivirus (retrovirus like elements).
32
Gambar 21. Retrotransposon
Transposon pada Prokaryot
Pada jasat prokaryot (E. coli) deketahui terdapat empat komponen elemen genetik yang dapat bertransposisi, yaitu : 1. Sekuens penyisip (insertion sequences, IS) Merupakan suatu urutan nukleotida yang tidak mempunyai fungsi lain untuk proses transposisi sekuense itu sendiri. Sekuens penyisip merupakan transposon paling sederhana. Sekuens semacam ini memiliki urutan nukleotida berulang-balik (inverted repeat) pada kedua ujungnya yang berukuran sekitar 9-40 nukleotida, dan satu gen yang mengkode sintesis enzim transposase yang mengkatalisis proses transposisi. Elemen IS biasanya berukuran kurang dari 2.500 pasangan basa. Elemen IS yang paling kecil yang diketahui atas 768 pasangan nukleotida. Pada waktu elemen IS menyisip kedalam DNA target , akan terjadi duplikasi sebagian urutan DNA pada sisi penyisipan. Satu turunan hasil duplikasi terletak dikedua ujung elemen IS. Hasil duplikasi tersebut berupa urutan nukleotida pendek, sekitar 2-13 pasangan nukleotida yang berpupa urutan berulang-langsung
33
(direct repeat), dan disebut sebagai duplikasi sisi target ( target site duplication). Dibawah ini skema proses duplikasi sisi target pada elemen IS.
ACCGTCGGCAT CA TGGCAGCCGTAGT
Kedua untaian DNA dipotong pada titik yang berbeda
Elemen IS disisipkan pada daerah diantara titik pemotongan
IS ACGGTCGGCAT TG
CA GCAGCCGTAGT
Sintesis DNA untuk mengisi celah (huruf bergaris bawah)
IS ACGGTCGGCAT TGCCAGCCGTA
CGTCGGCATCA GCAGCCGTAGT
Gambar 22. Skema proses duplikasi sisi target pada elemen IS
Jika elemen IS terdapat pada plasmid dan kromosom bakteri, maka hal ini memungkinkan terjadinya rekomendasi homolog antar DNA yang berbeda. Rekomendasi seperti itilah yan berperan dalam proses integrasi plasmid F ke dalam kromosom bakteri. Jika plasmid dan kromosom mengalami rekombinasi, maka plasmid yang berukuran lebih kecil akan terintegrasi kedalam kromosom.
2. Transposon komposit (diberi simbol Tn) Merupakan suatu transposon yang selain membawa fungsi transposisi, juga membawa gen lain, misalnya gen ketahanan terhadap antibiotik. Transposon ini juga termasuk tipe transposon potong-tempel. Transposon komposit tersusun atas dua duplikat elemen IS yang identik atau hampir identik yang mengapit bagian sentral. Bagian sentral suatu transposit kemudian merupakan segmen DNA yang merupakan penanda genetik tertentu. Elemen-elemen IS pada transposon komposit dapat berupa urutan nukleotida berulang dengan orientasi yang sama (nukleotida berulang-langsung, direct
repeat), atau berupa urutan nukleotida berulang-balik (inverted repeat). Kemampuan untuk transposisi ditentukan oleh elemen ID tersebut. Pada Tn9, elemen IS yang mengapit bagian sentral mempunyai orientasi yang sama, sedangkan pada Tn5 dan Tn10 orientasi elemen IS nya berkebalikan. Terkadang elemen IS yang mengapit
34
bagian sentral tersebut tidak sepenuhnya identik. Perbedaan tersebut disebabkan oleh adanya perbedaan satu nukleotida diantara kedua elemen tersebut. 3. Elemen Tn3 Merupakan kelompok transposon yang berukuran lebih besar daripada elemen IS dan pada umumnya membawa gen lain yang tidak berperan dalam proses transposisi, misalnya pada transposisi komposit. Elemen Tn3 berbeda dari transposon komposit karena Tn3 tidak mempunyai elemen IS pada keduua ujungnya, melainkan berupa skuens berulang-nalik sederhana berukuran sekitar 3040 nukleotida. Selain itu, Tn3 juga menghasilkan duplikassi sisi target pada waktu menyisip ke bagian target. Pada elemen Tn3 terdapat tiga gen, yaitu tnpA mengkode transposase, tnpR mengkode resolvase/represor, dan bla mengkode beta laktamase.
Proses
transposisi
Tn3
dilakukan
dengan
mekanisme
replikasi
melalui
pembentukan struktur cointegrate. Selama proses ini transposon direplikasi dan salah satu turunannya disisipkan pada sisi target.pada tahapan kedua proses transposisi, enzim resolvase yang dikode oleh tnpR mengkatalisis prpses rekombinasi khusus (site-specific recombination) diantara kedua elemen Tn3. Kejadian ini berlangsung didaerah res (resolution site). Pada akhirnya, dihasilkan dua urutan transposon. Produk gen tnR juga memiliki fungsi lain, yaitu sebagai represor untuk transposase dan resolvase. Proses penekanan sintesis protein tersebut terjadi karena sisi res terletak didaerah antara gen tnpA dan tnpR. Adanya pengikatan represor pada daerah res menyebabkan transkripsi kedua gen tersebut ditekan sehingga elemen Tn3 cenderung bersifat tidak aktif. Transposisi pada bakteri memiliki makna yang penting dari sisi media karena banyak transpon yang membawa gen resistensi terhadap antibiotik. Jika transpon yang membawa gen resistensi terhadap antibiotik tersebut menyisip kedalam molekul DNA yang lain, misalnya plasmid, hal ini akan menyebabkan resistensi baik secara horisontal maupun vertikal ke sel atau populasi bakteri yang lain. 4. Bakteriofag Mu (Mutator) Merupakan suatu bakteriofag lisogenik yang menggunakan proses transposisi sebagai cara hidupnya.bakteriofag Mu merupakan virus temperate yang genomnya mempunyai banyak kesamaan dengan elemen IS. DNA bakteriofag Mu dapat menyisip secara acak disalam genom bakteri atau plasmid. Jika DNA Mu tersebut 35
menyisip kedalam genom bakteri, maka akan terjadi mutassi seperti apa yang terjadi jika elemen IS menyisip kedalam suatu genom. Dalam keadaan normal, mutasi semacam ini tidak dapat dikembalikan ke struktur tipe alami (wild type). DNA bakteriofag Mu yang ada dalam keadaan bebas (tidak berada didalam inang) mengandung sepotong DNA dari inang sebelumnya pada kedua ujungnya, namun DNA tambahan tersebut tidak akan disisipkan kedalam genom jika bakteriofag Mu menginfeksi inang yang baru. Bakteriofag Mu juga mempunyai kemampuan sebagai perantara untuk penyisipan DNA dari jasad lain ke dalam suatu inang, misalnya penyisipan bakteriofag lambda kedalam genom bakteri.
Dalam beberapa hal, proses transposisi mirip dengan proses rekombinasi khusus yaitu melibatkan proses pemotongan untai DNA baik pada molekul DNA donor maupun pada DNA target pada tempat khusus. Proses tersebut kemudian diikuti dengan penggabungan ujung-ujung transposon ke molekul DNA target yang sudah terpotong. Meskipun demikian, ada perbedaan mendasar antara proses transposisi dengan proses rekombinasi khusus. Ciri penting dari prose stranspsisi adalah bahwa proses ini tidak bergantung pada ada atau tidaknya hubunga antara urutan nukleotida pada DNA donor dengan DNA target, baik hubungan fungsional maupun, misalnya hubungan asal-usul. Dalam proses rekombinasi khusus, pemotongan dan penyambungan molekul DNA donor dan DNA target tidak disertai dengan sintesis meolekul DNA baru. Sebaliknya, proses transposisi melibatkan sintesis molekul DNA baru yang dikendalikan oleh sistem reparasi atau replikasi. Disamping itu, selama transposisi, molekul DNA donor tidak disusun kembali seperti bentuk tipe alami pra-transposisi.
Transposisi dapat menyebabkan terjadinya penyusunan kembali ( rearrangment) genom suatu jasad. Hal ini dapat terjadi misalnya karena ada dua duplikat (copy) transposon yang sama pada lokasi kromosom yang berbeda sehingga dapat menyebabkan
terjadinya
rekombinasi
antarduplikat
transposon
tersebut.
Rekombinasi seperti ini dapat membawa implikasi terjadinya delesi, penyisipan, inversi, atau translokasi. Transposisi mempunyai peranan dalam proses evolusi beberapa plasmid bakteri. Sebagai contoh, integrasi plasmid F yang berasal dari E.
coli kedalam kromosom bakteri seringkali terjadi melalui proses rekombinasi
36
antara suatu transposon yang ada didalam plasmid dengan transposon yang homolog didalam kromosom bakteri.
Transposisi pada Eukaryot
Elemen transposon juga ditemukan pada jasad eukaryot, misalnya pada jagung, khamir
Saccharomyces
cerevisiae, lalat
buah
Drosophila sp., nematoda
Caenorhabditis elegans, bahkan manusia. Sebenarnya elemen genetik yang dapat berpindah (transposon) pertama kali ditemukan pada jasad eukaryot yaitu pada jagung.
Mekanisme Transposisi
Detail mekanisme transposisi sampai saat ini belum diketahui dengan jelas, namun pada prokaryot, misalnya pada E. coli, transposisi diketahui terjadi melalui dua
macam cara, yaitu : 1. Replikatif Transposisi secara replikatif akan dibentuk duplikat elemen transposon sehingga pada akhir transposisi akan dihasilkan satu duplikat transposon pada tempat yang baru dan satu duplikat transposon pada tempat yang lama. Proses transposisi replikatif ini misalnya terjadi pada bakteriofag Mu dan Tn3. Ada dua model yang diajukan mengenai mekanisme transposisi secara replikatif antara dua plasmid, yaitu model simetris (model shapiro) dan model asimetris. Pada model simetris, transposisi terjadi dengan cara melalui pembentukan elemen genetik lingkar yang merupakan gabungan antara kedua plasmid ( cointegrate) dan mengandung dua duplikat transposon dengan orientasi yang sama.
Cointegrate tersebut kemudian akan diuraikan lebih lanjut sehingga akan dihasilkan dua elemen plasmid yang baru yang masing-masing akan mengandung satu transposon. Pembentukan suatu cointegrate merupakan suatu keharusan pada model simetris ini. Sedangkan pada model asimetris, pembentukan cointegrate
tidak merupakan suatu keharusan namun hanya
merupakan salah satu kemungkinan hasil antara yang dapat terjadi.
37
Gambar 23. Model transposisi replikatif 2. Konservatif (nonreplikatif) Transposisi secara konservatif (nonreplikatif) tidak terjadi proses replikasi, melainkan transposisi terjadi dengan cara pemotongan elemen transposon pada elemen
kromosom
atau
plasmid
dan
transposon
tersebut
kemudian
diintegrasikan ketempat yang baru. Beberapa transposon, misalnya Tn10, dapat diintegrasikan kedalam materi genetik baru tanpa proses replikatif. Dalam hal ini elemen transposon akan dipotong dari DNA donor (misalnya kromosom) kemudian diintegrasikan kedalam materi genetik lain sehingga pada akhir transposisi DNA donor tersebut akan kehilangan elemen transposon. Dalam proses penyisipan elemen transposon, akan terjadi pemotongan juga pada DNA target sehingga proses transposisi nonreplikatif tersebut akan diiukuti denga proses reparasi DNA untuk mengisi celah antara transposon dan DNA target. Studi in vitro pada bakteriofag Mu menunjukan bahwa disamping menggunakan mekanisme replikatif, bakteriofag tersebut juga menggunakan mekanisme nonreplikatif sebagai alternatif untuk melakukan proses transposisi. 38
Gambar 24. Model transposisi secara nonreplikatif
2 39
BAB III PENUTUP
Kesimpulan yang diperoleh dari penjelasan diatas, antara lain : 1. Mekanisme perbaikan DNA (DNA repair), merupakan merupakan suatu mekanisme perbaikan DNA yang mengalami kerusakan/kesalahan yang diakibatkan oleh proses metabolisme yang tidak normal, radiasi dengan sinar UV, radiasi ion, radiasi bahan kimia atau dikarenakan adanya kesalahan dalam replikasi DNA. Dalam memperbaiki DNA terdapat beberapa kelompok mekanisme yang mengaturnya, yaitu damage reversal,
damage removal dan terakhir damage tolerance. Terkadang mekanisme perbaikan DNA tidaklah cukup. Mutasi terkadang tetap bertahan tidak terkoreksi sampai langkah selanjutnya dari replikasi DNA. Pada titik ini (tergantung dari sifat alami dari mutasi), mutasi tersebut akan secara permanen bergabung ke dalam genom. Ketika DNA melakukan sintesis protein dari gen yang mengandung mutasi (melalui transkripsi dan translasi), protein mutan mungkin akan berisi satu asam amino yang tidak tepat dan berakibat pada seperti kematian organism, penyekit genetic seperti cystic fibrosis atau sickle cell anemia atau carcinogenic lesion.
2. Rekombinasi DNA (DNA recombination), merupakan proses pertukaran elemen genetik yang dapat terjadi antara untaian DNA yang berlainan (interstrand), atau antara bagianbagian gen yang terletak dalam satu untaian DNA (intrastrand). Dalam pengertian yang lebih sederhana, rekombinasi genetik didefinisikan menjadi penggabungan gen dari satu atau lebih sel ke sel target. Mekanisme rekombinasi DNA ini bervariasi tergantung mekanismenya antara lain : memelihara perbedaan genetik, sistem perbaikan dna khusus, regulasi ekspresi gen tertentu, dan penyusunan kembali genetik yang diprogram selama perkembangan. Terdapat beberapa Tipe Rekombinasi Genetik yang dianut dalam perkembangan ilmu pengetahuan sampai saat ini, yaitu rekombinasi homolog/ umum, rekombinasi khusus (site-specific rekombination), dan rekombinasi transposisi/ replikatif.
403
DAFTAR PUSTAKA
Albert, Bruce dkk. 2008. Molecular Biology of the Cell Fifth Edition. Science, Taylor & Francis Group
USA: Garland
Champe, Pamela C, dkk. 2010. Biokimia Ulasan Bergambar (Edisi 3). Jakarta : EGC Cooper, Geoffrey M & Hausman, Robert E. 2013. The Cell: A Molecular Approach Sixth Edition. USA: Sinauer Associates. Friedberg, Errol C. 2006. DNA Repair and Mutagenesis. USA: American Society for Microbiology (ASM) Press. Murray, Robert K, dkk. 2009. Biokimia Harper (Edisi 27). Jakarta : EGC Plopper, George dkk. 2015. Lewin’s Cell Third Edition. USA: Jones & Bartlett Learning Tropp, Burton T. 2012. Molecular Biology Fourth Edition: Genes to Proteins . USA: Jones & Bartlett Learning
4
