DNA Rekombinan

 Teknologi dna  Teknologi dna rek rekombinan ombinan (GENETIC ENGINEERING)

DR.Restu Syamsul Hadi, MKes.

Teknik Rekombinan meliputi: -Teknik untuk mengisolasi DNA -Teknik untuk memotong DNA. -Teknik untuk menggabung atau menyambung DNA. -Teknik untuk memasukkan DNA kedalam sel hidup sehingga DNA rekombinan dapat bereplikasi dan dapat diekspresikan

Organisme transgenik: organisme yang membawa gen yang berasal dari jenis organisme lainnya. Organisme transgenik dihasilkan melalui Rekayasa Genetika Rekayasa Genetika menggunakan menggunaka n Teknologi Teknologi DNA Rekombinan Teknologi Teknologi DN Rekombinan kumpulan teknik atau metoda yang digunakan untuk mengkombinasikan gen-gen secara buatan.

Apa Rekayasa Genetika? Definisi:  !eruba"an

genetik suatu organisme, atau keturunan, teknik untuk meng"ilangkan karakteristik ba"an yang tidak diinginkan atau untuk meng"asilkan ba"an yang baru yang diinginkan.



!enamba"an, peng"apusan, atau manipulasi si#at tunggal dalam organisme untuk men$iptakan peruba"an yang diinginkan

Isolasi dan pemurnian DNA • Isolasi DNA bakteri • Isolasi DNA plasmid • Pemurnian secara kimiai dan en!imatis "erbagai #enis dan karakterisasi $ektor • $ektor plasmid • $ektor %east • $ektor bakterio&ag En!im restriksi dan ligase • 'enis en!im restriksi • aktor %ang berpengaru teradap en!im restriksi • aktor %ang berpengaru teradap en!im

 Teknik Elektro&oresis dan PCR • aktor %ang berpengaru dalam elektro&oresis • aktor %ang berpengaru teradap PCR DNA sekuensing dan ibridisasi • soutern blot • nortern blot • estern blot DNA rekombinan dan  Trans&ormasi • Isolasi • Restriksi • *el kompeten • Trans&ormasi

Reka%asa genetik pada + • Reka%asa genetik pada ean • Reka%asa genetik pada tumbuan • Reka%asa genetika pada manusia Produk transgenik, keamanan dan bioetika • "iosa&et% • bioetika • G-. dan genetically modofed oods

Rekayasa

genetika juga dikenal sebagai teknologi DNA rekombinan berarti mengubah gen dalam organisme hidup untuk menghasilkan Genetically Modified Organism (GMO) dengan genotipe baru "erbagai #enis modi/kasi genetik %ang mungkin+ memasukkan gen asing dari satu spesies men#adi 0 spesies lain, 0 membentuk organisme transgenik1 0 menguba gen %ang ada seingga produkn%a beruba, 0 menguba ekspresi gen seingga ditranslasikan lebi sering atau tidak sama sekali

)*NGA%A +,)AN )*NG*)/ANG(AN R*(A0A1A G*N*T+(A..2

 Awalnya manipulasi genetik secara tradisional

seperti ! pemuliaan selekti" untuk meningkatkan nilai gi#i tanaman $ terlalu lambat %engenalan gen dari satu spesies yang berasal dari organisme ke organisme

dari spesies yang berbeda &organisme transgenik' • (loning gen untuk menentukan "ungsinya • )engubah "enotip suatu organisme untuk meningkatkan si"at yang diinginkan  Rekayasa genetika dengan teknik molekuler

• •

)emungkinkan untuk menciptakan perubahan genetik lebih besar pada kecepatan yang jauh lebih cepat %roduksi bahan "armasi dalam jumlah besar 

Teknik Dasar Rekayasa Genetika Selective

reeding

 Tanaman atau ean dengan karakteristik %ang diinginkan paling ban%ak digunakan untuk pemuliaan lebi lan#ut !y"ridi#ation

($ross"reeding)

-enggabungkan strain %ang berbeda spesies untuk menggabungkan karakteristik terbaik dari keduan%a2 (burung dara 3 perkutut 4 sinom) Recom"inant D%A Tec&nologies

Transformasi

asic steps in genetic engineering 1. 2. 3. ". #.

Isolasi gen Insersi ke dalam host menggunakan vector Perbanyak copy D! sebanyak mungkin Pemisahan produk gen yang dihasilkan $kstraksi produk gen yang diinginkan

'lorescent proteins are a sefl tool in "iotec&nology 

-en#adi petanda adan%a ekspresi gen dan protein target dalam sel0sel idup suatu organisme



Paling ban%ak digunakan adala green 5uorescent protein (GP) pertama kali diisolasi dari 6ictoria aequorea (ubur0ubur), dapat dilekatkan ke ampir semua protein dan %ang menarik dan masi dapat men#adi fluorescent molecule.



Dapat digunakan untuk melokalisasi protein %ang sebelumn%a belum di0karakterisasi untuk mem$isualisasikan dan melacak protein untuk lebi memaami peristia selular2



Dapat digunakan untuk melihat proses perkembangan

!ean Transgenik   Tikus

transgenik dapat digunakan untuk mempela#ari sistem kekebalan tubu dan pen%akit genetik



"abi + aktor 6III pada pembekuan dara, organ0organ untuk transplantasi



7ean lain + ormon pertumbuan I809 (kanker), albumin

Organisme rekom"inan  

  

Tanaman tahan hama  %agung &gen toksin dari 'acillus thuringiensis  yang dapat membunuh serangga( Tanaman tomat )olden rice &beta*carotene( Plant*based vaccines

Genetically Modified Organisms  

 

Tanaman tahan hama +agung 't &mengandung gen toksin dari 'acillus thuringiensis yang membunuh hama ( )olden rice &mengandung beta*carotene( Tanaman sebagai vaksin

Genetic engineering of t*resistant corn (t*corn) 

-lone 't toin gene from bacteria and epress in plants



't*transgenic plants are resistant to insects, no need for spraying insecticide Tanaman jagung tidak perlu lagi insektisida serangga3ulat akan mati bila memakan jagung

$onto& penerapan rekayasa genetika pada tanaman +Golden Rice, mengandng gen ntk meng&asilkan vitamin A



'i%i beras &endosperm( kekurangan senya/a essential seperti vitamin ! dan precursornya &0*carotene(.  Defisiensi itamin ! dapat meyebabkan kebutaan dan penurunan sistem imun tubuh.

7:-AN GENETIC ENGINEERING  Reka%asa

genetika manusia berarti menguba gen dalam sel manusia %ang idup

 -isaln%a

pada penderita pen%akit paru0paru %ang disebabkan disebabkan ole gen %ang cacat dalam sel paru0paru2 Dengan cara memperbaiki gen0gen memungkink memungkinkan an akan sembu .

 -enguba

gen dalam sel idup dengan menempatk menempatkan an gen baru %ang diinginkan ke $irus %ang diperbolekan untuk masuk ke sel0sel manusia dan %ang memasukkan gen baru ke dalam sel bersama bersama dengan sebelumn%a

HUMAN GENETIC ENGINEERING

"Somatic genetic engineering "

Reka%asa

genetika %ang menargetkan gen di organ tertentu dan #aringan tubu orang %ang ada tanpa mempengarui gen dalam telur atau sperma2 Percobaan trans&er gen somatik sedang men#alani u#i klinis, dengan asil %ang beragam sampai saat ini2 *uatu ari nanti mungkin akan dapat digunakan dengan e&ekti& e&ekti& 

"Germ line" genetic engineering R eka%asa eka%asa genetika %ang menargetkan gen dalam

telur, sperma, atau embrio sangat aal Perubaan %ang mempengarui setiap sel dalam tubu indi$idu %ang diasilkan, dan diariskan kepada semua generasi berikutn%a

[note: The term "somatic" comes from the Greek "soma" for "body" The term "!ermine" refers to the "!erm" or

-rodk D%A Recom"inant ntk terapi pada mansia • Insulin &diabetics( • actor III &males /hemophilia !( • actor I4 &hemophilia '( • 5uman gro/th hormone • $rythropoietin &anemia( • !ngiostatinendostatin&anti*cancer drugs( • leptin

%E&IGNE R 'A'( 

.eslitan pada Rekayasa Genetika Mansia 

Inserting gene in correct cells  Inserting gene so it is epressed correctly

6 7rientation 6 8egulation 

-ontrolling virus vector  $thical issues

)onin! * de+nisi Dari

Bahasa Yunani - klon, ranting Kumpulan turunan suatu individu  yang dihasilkan tanpa melalui perkawinan; kumpulan replika sebagian atau seluruh makromolekul (contoh, DN atau antibodi! "uatu individu yang tumbuh dari satu sel somatik induknya serta memiliki identitas genetik yang sama dengan induknya   Klon: Koleksi molekul atau sel yang semua identitasnya sama dengan molekul atau sel penurunnya

Kloning DN  #etoda untuk memurnikan atau mengidenti$kasi dan memperbanyak suatu potongan DN tertentu (klon! yang dikehendaki dari campuran potonganpotongan DN yang kompleks%

)onin! Gen Ketika

keseluruhan DN dari suatu organisme diekstraksi, akan diperoleh seluruh gen yang dimiliki organisme tersebut &ada kloning gen, hanya gen (DN! tertentu yang diisolasi, dimurnikan, dan diperbanyak (diklon!

T,-,an men!kon Gen #enentukan

urutan basa nukleotida penyusun gen tersebut #enganalisis atau mengidenti$kasi urutan basa nukleotida pengendali gen tersebut #empela'ari ungsi )N * protein*en+im  yang disandi gen tersebut #engidenti$kasi mutasi yang ter'adi pada kecacatan gen yang mengakibatkan penyakit bawaan #erekayasa organisme untuk tu'uan tertentu, misalnya memproduksi insulin, ketahanan terhadap hama, dll%

&,mber %NA ,nt,k dikon  



DN kromosom cDN (complementary DN! yang disintesis menggunakan m)N sebagai cetakan (template! DN yang dihasilkan dari perbanyakan menggunakan &) 

'ahan . Aat ,nt,k Men!kon n+im

endonuklease restriksi n+im ligase   .ektors /nang (  Host! #etoda untuk memasukkan DN ke dalam sel inang

Memoton! %NA #enggunakan

en+im endonuklease restriksi 0'ung

1lengket2 (sticky

ends! 0'ung 1tumpul2 (blunt ends! &enamaan

en+im

  Eco)/   E  3

genus ( Escherichia! co 3 species (coli! ) 3 strain / 3 4 o en+yme

/enyamb,n!an 0 pasting1 %NA &embentukan 

ikatan-5 pada u'ung-u'ung yang komplemen (sticky ends! 6igase

membentuk ikatan osodiester untuk merekatkan benang-benang DN 

2ektor ,nt,k Men!kon

Diperlukan suatu wahana (vehicle! untuk memasukkan suatu potongan DN ke dalam sel agar DN tersebut dapat disimpan dan diperbanyak di dalam sel tersebut

/asmid DN bukan kromosom (extrachromosomal  DNA) yang secara alami dimiliki suatu  jasad Bentuknya benang ganda (doule strands  DNA! dsDNA! sirkular  &lasmid buatan ( Arti"cial plasmids! dapat dibuat dengan menambahkan potonganpotongan DN lain

2ektor ,nt,k Men!kon &lasmid dapat dimodi$kasi untuk mampu membawa potongan DN lain ke dalam sel bila memiliki7 )eplikator

(origin o replication! &enanda (  #arker ! yang mudah diseleksi (misalnya gen ketahanan terhadap antibiotik! "itus untuk mengklon (potongan DN  yang memiliki urutan basa nukleotida  yang men'adi sasaran en+im restriksi tetapi tidak terletak di dalam daerah replikator atau penanda

&lasmid yang Dimiliki oleh  Escherichia coli Berasal dari plasmid alam Potongan DNA tambahan Potongan DNA tambahan

/asmid )himera 0Chimeric Plasmids1

 Khimera berasal dari mitologi Yunani, makhluk dengan tubuh gabungan dari bagian-bagian makhluk binatang lain "etelah pemotongan plasmid menggunakan suatu en+im restriksi, potongan DN asing yang memiliki u'ung pemotongan yang sama dapat disisipkan "etelah u'ung-u'ung plasmid dan potongan DN asing disambung, akan dihasilkan 8plasmid rekombinan8 &lasmid rekombinan dapat bereplikasi dalam sel inang yang sesuai

)onin! Terorientasi Bila diinginkan untuk menginsersikan potongan DN asing dengan orientasi tertentu Dilakukan dengan memotong DN  vektor maupun DN sumber gen  yang dikehendaki menggunakan dua en+im restriksi yang berbeda

2ektor ,nt,k Men!kon 9 .ektor berupa plasmid : .ektor berupa bakterioaga  osmid < Bs (Bacterial rti$cial hromosome! = Y (Yeast  rti$cial hromosome!

2ektor ber,$a /asmid 9% #emiliki origin o replication dari inang yang ditu'u, sehingga memungkinkan replikasi secara independen terhadap genom inang% :% #emiliki penanda selekti7 #emudahkan seleksi sel pembawa plasmid tersisipi DN asing ketahanan terhadap antibiotik ganda penapisan biru-putih % #emiliki banyak situs pengkloningan (multiple cloning sites, #"!

M,ti$e Conin! &ite 0MC&1

 .ektor berupa &lasmid

2ektor ber,$a /asmid   Keunggulan: Kecil,

mudah penger'aannya "trategi seleksi mudah Berguna untuk mengklon potongan DN ukuran kecil (> 9?kbp!   Kelemahan: Kurang

bermanaat untuk mengklon potongan DN ukuran besar (@ 9?kbp!

'akteriofa!a 0  phage1

2ektor ber,$a bakteriofa!a 0 vectors1   $engan

kiri7 &rotein penyusun kepala = ekor    $engan kanan7 "intesis DN  &engendalian 6isis inang   Daerah yang dihilangkan: integrasi = eksisi &engendalian

 .ektor berupa bakterioaga ( vectors!

 2ektor ber,$a 'akteriofa!a   Keunggulan: Bermanaat

untuk mengklon potongan DN ukuran besar (9? - : kbp! "eleksi berdasar ukuran   Kelemahan: 6ebih

sulit penger'aannya

2ektor Eabungan Cosmid siat vektor plasmid dan siat berguna dari situs cos (dihilangkan pada vektor !   Keunggulan: Bermanaat

untuk mengklon potongan DN berukuran sangat besar (: -
terlalu mudah untuk menger'akan plasmid dengan ukuran sangat besar (C ? kbp!

 .ektor osmid

2ektor 'AC )eplikasi

dimediasi ori" dan ori par    and par B mengendalikan agar hanya terdapat satu  vektor dalam sel #enggunakan penanda ketahanan terhadap Khloramenikol) 

2ecktor (AC large inserts  ARS

URA3

 HIS3

telomere centromere markers replication origin

Dapat

telomere

disisipi gen asing :?? - :??? kbp dan dimasukkan ke dalam yeast

'ACs dan (ACs  %A&s 7 Bacterial rti$cial hromosomes 'A&s 7 Yeast rti$cial   Keunggulan: hromosomes  Dapat digunakan untuk mengklon potongan DN dengan ukuran sangat besar (9?? - :,??? kbp! &enting digunakan dalam proyek penetapan urutan basa nukleotida total genom   Kelemahan: idak

mudah menger'akan molekul DN dengan ukuran sangat besar 

Shuttle Vector   .ektor

yang dapat digunakan untuk dua macam inang (memiliki origin o replication dari masing-masing inang!

Memiih 2ektor 0kuran

DN yang disisipkan 0kuran vektor "itus en+im restriksi yang tersedia   Fumlah salinan (copy number! $siensi kloning Kemampuan untuk menapis DN sisipan )encana penelitian selan'utnya



Cara Men!kon %NA 031 /solasi vektor kloning

(plasmid acterial! = DN sumber gen  &emotongan DN sumber gen = vektor kloning menggunakan en+im restriksi yang sama  &enyisipan potongan DN sumber gen ke dalam  vektor kloning yang telah dipotong menggunakan en+im restriksi yang sama; potongan disambung dengan bantuan en+im DN ligase

Cara Men!kon %NA 041  .ektor

kloning yang telah tersisipi potongan DN dimasukkan ke dalam sel inang (transormasi sel inang!  &enapisan sel pengklon (dan gen  yang dimasukkan!  /denti$kasi sel pengklon pembawa gen yang dikehendaki

Transformasi &e Inan! #emasukkan plasmid (yang merupakan vektor yang telah disisipi gen! ke dalam sel inang

Transformasi &)-/NK0B"/

"el E coli calon penerima plasmid dipaparkan kepada ion positi kalsium klorida (al:!% &erlakuan ini memberikan cekaman kepada bakteri  yang mengakibatkan membran sel dan dinding sel bakteri tersebut men'adi permeabel terhadap plasmid donor% &roses ini mengakibatkan E coli men'adi 1kompeten8 untuk menerima plasmid %

Transformasi /NK0B"/

&lasmid

ditambahkan ke dalam suspensi sel E coli kompeten% "uspensi sel E coli kompeten lainnya yang tidak ditambah plasmid digunakan sebagai kontrol%

Transformasi KF0N

&N" ( HEA *H+&K ! "el kompeten (baik yang diberi plasmid maupun kontrol! dipaparkan se'enak (G? detik! kepada suhu <: o% 6angkah ini memaksimumkan masuknya plasmid menembus membran dan dinding sel%

Transformasi &NY#B05N

( ,E&+-E,' ! "el kompeten (baik yang diberi plasmid maupun kontrol! ditumbuhkan dalam medium kaya nutrisi untuk memberi kesempatan penyembuhan setelah mengalami cekaman dan ke'utan% #asa penyembuhan biasanya berlangsung satu waktu generasi (untuk E coli berkisar antara ? hingga < menit!

Transformasi &N&/"N

(*&,EEN.N/! "el kompeten yang telah mengalami penyembuhan ditapis pada medium padat yang mengandung senyawa penapis berdasarkan penanda yang dibawa oleh plasmid%

)ooni E. coli  yan! memba5a $asmid den!an $enanda !en $endar 6,or 0$G781

E. coli  yan! Memba5a /asmid $Go

/ena$isan )on #edium

pertumbuhan diberi antibiotik yang sesuai dengan siat ketahanan yang digunakan sebagai penanda, misalnya Kanamisin Bakteri di paruh cawan petri sebelah kanan memiliki plasmid dengan penanda ketahanan terhadap Kanamisin(Kan r !, yang di sebelah kiri tidak memilikinya

Man#aat Teknologi DNA rekombinan telah memberikan man"aat dibidang ilmu pengetahuan maupun dibidang terapan. %onto": Bidang Kesehatan: Insulin manusia telah diproduksi secara massal menggunakan bakteri untuk mengobati penyakit diabetis. Merekdagang: HumulinR

E.coli

dan telah diperdagangkan

Hormon tumbuh manusia (GH) diproduksi menggunakan E.coli dan digunakan untuk mengobati kelainan pertumbuhan (misal: cebol). Vaksin hepatitis B digunakan untuk mencegah infeksi virus hepatitis. Telah diproduksi secara komersial menggunakan S.cereviciae dalam skala industri