UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERIA FACULTAD DE INGENIERÍA AMBIENTAL
IDENTIFICACIÓN DEL GRUPO COLIFORME SEXTO LABORATORIO DEL CURSO MICROBIOLOGÍA – SA323K
PERALES MARTINEZ ALEC ANDRE- 20164132A DOCENTE: ING. JORGE GILBERTO TELLO CEBREROS CEBREROS
Lima, Perú 2017
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INDICE INTRODUCCIÓN................................................................................................................... 4 OBJETIVOS GENERALES ....................................................................................................... 5 FUNDAMENTO TEÓRICO..................................................................................................... 5
PARTE I TÉCNICA DE FERMENTACIÓN EN TUBOS MÚLTIPLES: FASE PRESUNTIVA Y RECUENTO DE BACTERIAS HETEROTRÓFICAS 1.1.
OBJETIVOS................................................................................................. 12
1.2.
REACTIVOS Y MEDIOS DE CULTIVO ........................................................... 12
1.3.
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL............................................................. 12
1.4.
RESULTADOS ............................................................................................. 12
1.5.
DISCUSIONES............................................................................................. 12
1.6.
CONCLUSIONES ......................................................................................... 12
1.7.
RECOMENDACIONES ................................................................................. 12
PARTE II ............................................................................................................................. 12 TÉCNICA DE FERMENTACIÓN EN TUBOS MÚLTIPLES: ...................................................... 12 FASE CONFIRMATIVA Y PRUEBA PARA COLIFORMES FECALES......................................... 12 2.1. OBJETIVOS.............................................................................................................. 12 2.2. REACTIVOS Y MEDIOS DE CULTIVO........................................................................ 12 2.3. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL .......................................................................... 12 2.4. RESULTADOS .......................................................................................................... 12 2.5. DISCUSIONES.......................................................................................................... 12 2.6. CONCLUSIONES ...................................................................................................... 12 2.7. RECOMENDACIONES .............................................................................................. 12 PARTE III ............................................................................................................................ 12 TÉCNICA DE FERMENTACIÓN EN TUBOS MÚLTIPLES: ...................................................... 12 PRUEBA COMPLEMENTARIA ............................................................................................. 12 PARTE IV ............................................................................................................................ 13 PRUEBA IMVIC .................................................................................................................. 13 PARTE V ............................................................................................................................. 13 FILTRO DE MEMBRANA PARA COLIFORMES TOTALES...................................................... 13 CONCLUSIONES GENERALES ............................................................................................. 14 BIBLIOGRAFÍA.................................................................................................................... 15 1.
FUENTES DE INFORMACIÓN ............................................................................. 16
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2.
ANEXOS ............................................................................................................. 17
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INTRODUCCIÓN
La calidad del agua se define como: el conjunto de caracteres físicos químicos y biológicos que deben satisfacerse con el fin de que el agua que se suministra sea segura para el fin destinado En las últimas décadas el rápido aumento de la densidad poblacional y el crecimiento industrial hace necesario e indispensable tratar las aguas residuales para que, de esta manera puedan servir para diversos usos, considerándolas como un recurso adicional. Así mismo, las aguas residuales especialmente las de origen doméstico, albergan bacterias, virus y otros organismos microscópicos, convirtiéndose en un vehículo de transmisión de enfermedades. El aislamiento de patógenos de muestras de aguas residuales, aunque posible, no es accesible a todos los laboratorios por su alto costo y necesidad de personal especializado. Se hace necesario el examen rutinario de estas aguas y determinar su grado de seguridad desde el punto de vista microbiológico. Para evaluar las condiciones sanitarias del agua se utilizan bacterias del grupo Coliforme, que actúan como indicadores de contaminación fecal, y se encuentran en gran número en la flora intestinal del hombre y de animales de sangre caliente.
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OBJETIVOS GENERALES
Evaluar la calidad sanitaria de muestras de agua previamente seleccionadas mediante la búsqueda de microorganismos Coliformes totales y Coliformes fecales.
Diferenciar los organismos Coliformes totales de los microorganismos Coliformes fecales.
Organizar e interpretar correctamente los resultados de la práctica de laboratorio.
FUNDAMENTO TEÓRICO GRUPO COLIFORME El grupo Coliforme incluye todos los bacilos Gram-negativos aerobios o anaerobios facultativos no esporulados, que fermentan la lactosa con producción de gas, dentro de 24-48 horas a 35°C. Dentro del grupo de los coliformes totales existe un subgrupo que es el de los Coliformes fecales. Los coliformes fecales son coliformes totales que además fermentan la lactosa con producción de ácido y gas en 24-48 horas a temperaturas comprendidas entre 44 y 45ºC en presencia de sales biliares. Los coliformes fecales comprenden principalmente Escherichia coli y algunas cepas de Enterobacter y Klebsiella. Su origen es principalmente fecal y por esos se consideran índices de contaminación fecal. Pero el verdadero índice de contaminación fecal es Escherichia coli tipo I ya que su origen fecal es seguro. Desde el punto de vista metodológico Escherichia coli es el Coliforme ás.
MÉTODO DEL NÚMERO MÁS PROBABLE (NMP) La determinación del NMP de bacterias Coliformes en una muestra se hace a partir de la técnica de los tubos múltiples, en el cual volúmenes decrecientes de la muestra (diluciones decimales consecutivas) son inoculadas en un medio de cultivo adecuado.
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La combinación delos resultados positivos y negativos es usada en la determinación del NMP.
RECUENTO DE BACTERIAS HETEROTRÓFICAS Los heterótrofos constituyen un grupo diverso y ampliamente definido de organismos que requieren carbono orgánico para crecer. A lo largo de los años, se ha presentado una gran variedad de tests sencillos basados en cultivos diseñados para recuperar un amplio espectro de microorganismos de origen hídrico. Estos tipos de tests se denominan tests de “recuento heterotrófico en placas”
Por ejemplo, se utiliza para:
Indicar la eficacia de los procesos de tratamiento de aguas como indicador indirecto de la eliminación de patógenos.
Como comprobación de la presencia y el número de organismos de un rebrote que puede o no tener trascendencia Sanitaria.
Como comprobación de la posibilidad de que exista una interferencia en las mediciones de Coliformes en medios de lactosa.
TÉCNICA DE FERMENTACIÓN EN TUBOS MULTIPLES Él método consta de tres etapas: Prueba presuntiva, Prueba confirmativa y Prueba complementaria.
1. Prueba presuntiva: Consiste en colocar volúmenes determinados de muestra en una serie de tubos conteniendo caldo lauril triptosa y son incubados a 35°C ± 0.5°C durante 24-48 horas. En esta prueba presuntiva la actividad metabólica de las bacterias es estimulada vigorosamente y ocurre una selección inicial de organismos que fermentan la lactosa con producción de gas. La formación de gas a 35°C ± 0.5°C dentro de las 24-48 horas, constituye una prueba presuntiva positiva para la presencia de bacterias del grupo
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Coliforme. La prueba presuntiva no debe usarse rutinariamente sin confirmación para el análisis de agua y aguas residuales.
2. Prueba confirmativa: La prueba confirmativa consiste en transferir todos los tubos positivos de la prueba presuntiva a tubos conteniendo caldo lactosado verde brillante bilis y son incubados durante 24-48 horas a 35°C ± 0.5°C. Esta prueba reduce la posibilidad de resultados falsos gas-positivos que pueden ocurrir por la actividad metabólica de los organismos formadores de esporas o por la producción sinergística de gas debido a que algunas cepas bacterianas no pueden, individualmente, producirlo a partir de la fermentación de la lactosa. El caldo lactosado verde brillante bilis contiene agentes selectivos e inhibidores que suprimen el desarrollo de todos los organismos no Coliformes. La producción de gas a a 35°C después de las 24-48 horas constituye una prueba confirmativa positiva.
Prueba para Coliformes fecales: El grupo de Coliformes fecales, está constituido por bacterias Gram negativas capaces de fermentar la lactosa con producción de gas a las 48 horas de incubación a 44.5 ± 0.1°C. Este grupo no incluye una especie determinada, sin embargo, la más prominente es Escherichia coli. La determinación del número más probable de microorganismos Coliformes fecales se realiza a partir de los tubos positivos de la prueba presuntiva inoculadas en el medio caldo EC y se fundamenta en la capacidad de las bacterias para fermentar la lactosa y producir gas cuando son incubados a una temperatura de 44.5 °C ± 0.1°C por un periodo de 24 a 48 h. Finalmente, la búsqueda de Escherichia coli se realiza a partir de los tubos positivos de caldo EC, los cuales se siembran por agotamiento en medios selectivos y diferenciales (Agar Endo o Agar Eosina Azul de Metileno) y posteriormente realizando las pruebas bioquímicas básicas (IMVIC) a las colonias típicas.
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3. Prueba complementaria: La prueba complementaria consiste en transferir por inoculación en estrías, las bacterias a partir de los tubos de caldo lactosado verde brillante bilis positivos, a placas de Agar endo o Agar eosina azul de metileno (E.A.M), luego son incubadas a 35°C ± 0.5°C durante 24 ± 2 horas. Se consideran positivas las colonias típicas que son nucleadas con o sin brillo metálico y las colonias atípicas que son opacas, anucleadas, mucoides y de color rosado. Colonias típicas y atípicas son transferidas a tubos con caldo lauril triptosa y tubos con agar inclinado. Será prueba complementaria positiva cuando haya producción de gas a partir de la fermentación de la lactosa y por el examen microscópico, sea demostrada la presencia de bacilos Gram-negativos no esporulados, en las bacterias desarrolladas en el agar inclinado. Esta prueba se aplica en el examen de muestras de agua, si los resultados son aplicados en el control de la calidad del agua potable. También se recomienda cuando existe alguna sobre la validez de la prueba confirmativa.
PRUEBA IMVIC Son cuatro pruebas bioquímicas. Se emplean fundamentalmente para la identificación de las Enterobacterias (bacilos Gram negativos, anaerobios facultativos con metabolismo fermentador). Se compone de cuatro pruebas:
Indol
Rojo de metilo
Voges-Proskauer
Citrato
El resultado de este test se expresa mediante símbolos de positivo o negativo (+ o -) según el resultado de cada prueba, siguiendo siempre el orden establecido por las iniciales del método.
1. Indol Consiste en cultivar al microorganismo en estudio en un caldo rico en triptófano; después de 24-48 horas de crecimiento se adiciona al tubo sobre el caldo xilol, para conseguir separar el indol producido, y tras agitar
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se incorpora el reactivo de Kovacs un resultado positivo mostrará la formación de un anillo de color rojo sobre el caldo de cultivo, lo cual pondrá de manifiesto la presencia de Indol debido a la utilización del triptófano por el microorganismo (la molécula de tritófano se rompe y uno de esos productos es el Indol), un resultado negativo solo mostrara un anillo de color amarillo propio del reactivo de Kovacs.
2. Rojo de metilo El rojo de metilo es un indicador de pH. Por lo tanto, permite determinar la formación de ácidos orgánicos que se producen durante la fermentación de un carbohidrato. El microorganismo en estudio se cultiva en un caldo de cultivo con algún carbohidrato fermentable, el más común es la glucosa, aunque se pueden utilizar otros carbohidratos como lactosa, sacarosa, manitol, etc, adicionado con el rojo de metilo como indicador de pH. Una reacción positiva, es decir, el viraje del medio a un color rojo, indica que el microorganismo realiza la fermentación de la glucosa por la vía ácido-mixta y el pH del medio se torna hasta 4.2 por la gran cantidad de ácidos orgánico producidos. Una prueba negativa no cambia el color del medio (color amarillo).
3. Voges-Proskauer Esta prueba caracteriza a ciertas especies de las Enterobacteriaceae, e indicará que la glucosa es fermentada por la vía butanodiólica. La prueba detecta
la
fermentación
butanodiólica
producida
por
ciertos
microorganismos. En esta fermentación se producen menor cantidad de ácidos que en la fermentación ácido-mixta, y una gran cantidad de butanodiol. Mediante un reactivo, (alfa-naftol y KOH al 40%), se detecta la presencia de un precursor del butanodiol (acetilmetilcarbinol o acetoína).
4. Citrato Sirve para determinar si un microorganismo puede crecer utilizando citrato como única fuente de carbono debido a la síntesis de la enzima citrato permeasa la cual permite la introducción del citrato al interior de la célula, una vez dentro, el citrato es incorporado al ciclo de Krebs. La prueba consiste en hacer crecer al microorganismo en estudio en caldo citrato. Un
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resultado positivo es cuando se observa turbidez en el tubo, debido al crecimiento bacteriano. Un resultado negativo es cuando no se observa crecimiento.
MÉTODO DE FILTRO DE MEMBRANA
Filtro de membrana: Los filtros de membrana son filtros de superficie, que muestran una estructura microporosa precisa. Durante la filtración las partículas mayores que los poros de la membrana son retenidas de forma fiable en la superficie de la misma. Las partículas más pequeñas pueden pasar el filtro.
Filtración a través de membrana: El número de Coliformes totales presentes en el agua se determina mediante la filtración de volúmenes específicos de la muestra a través de filtros de membrana. Por lo general, están compuestos de ésteres de celulosa, típicamente con poros de 0,45 mm de diámetro que retienen los Coliformes totales y otras clases de bacterias presentes en la muestra. Después se incuban las membranas vueltas hacia arriba en un medio selectivo. En la práctica, la técnica de filtración de membrana ofrece resultados comparables a los que se obtienen con el método de tubos múltiples. Una de las ventajas del método de filtración a través de membrana es la prontitud con que pueden obtenerse los resultados y, en consecuencia, se pueden llevar a cabo rápidamente acciones correctivas y operar en la planta de agua de nuevo en forma normal. Esta técnica puede aplicarse en el análisis de casi todos los tipos de agua, también se utiliza en el análisis de leche y otros alimentos líquidos.
Expresión de los resultados: Cuando se obtienen recuentos de más de 200 colonias sobre una misma membrana pueden dar resultados erróneos debido a la superpoblación, ya que lo que aparece como una colonia puede ser originado por varias bacterias bajo condiciones de hacinamiento. En estos casos debemos volver a muestrear el agua y analizar muestras más diluidas.
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Por otra parte, un número de colonias inferior a 10 ó 20 por membrana es poco fiable como base para establecer cuantitativamente la concentración bacteriana de la muestra. Por ejemplo, la obtención de 2 colonias a partir del análisis de 1 ml de un agua, no nos permite afirmar que esa agua contenía 200 colonias en 100 ml. En estos casos conviene repetir el análisis filtrando un volumen de muestra mayor. Cuando el recuento de colonias está entre 20-200, los resultados se expresan: o
Si hemos analizado una muestra sin diluir: Recuento de colonias = UFC / volumen de muestra filtrada.
o
Si hemos analizado una muestra diluida: Recuento de colonias x Factor de dilución = UFC/ volumen de muestra filtrada.
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PARTE I TÉCNICA DE FERMENTACIÓN EN TUBOS MÚLTIPLES: FASE PRESUNTIVA Y RECUENTO DE BACTERIAS HETEROTRÓFICAS 1.1. 1.2. 1.3. 1.4. 1.5. 1.6. 1.7.
OBJETIVOS REACTIVOS Y MEDIOS DE CULTIVO PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL RESULTADOS DISCUSIONES CONCLUSIONES RECOMENDACIONES
PARTE II TÉCNICA DE FERMENTACIÓN EN TUBOS MÚLTIPLES: FASE CONFIRMATIVA Y PRUEBA PARA COLIFORMES FECALES 2.1. OBJETIVOS 2.2. REACTIVOS Y MEDIOS DE CULTIVO 2.3. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL 2.4. RESULTADOS 2.5. DISCUSIONES 2.6. CONCLUSIONES 2.7. RECOMENDACIONES
PARTE III TÉCNICA DE FERMENTACIÓN EN TUBOS MÚLTIPLES: PRUEBA COMPLEMENTARIA 3.1. OBJETIVOS 3.2. REACTIVOS Y MEDIOS DE CULTIVO 3.3. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL 3.4. RESULTADOS 3.5. DISCUSIONES 3.6. CONCLUSIONES 3.7. RECOMENDACIONES
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PARTE IV PRUEBA IMVIC 4.1. OBJETIVOS 4.2. REACTIVOS Y MEDIOS DE CULTIVO 4.3. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL 4.4. RESULTADOS 4.5. DISCUSIONES 4.6. CONCLUSIONES 4.7. RECOMENDACIONES
PARTE V FILTRO DE MEMBRANA PARA COLIFORMES TOTALES 5.1. OBJETIVOS 5.2. TOMA DE MUESTRAS 5.3. REACTIVOS Y MEDIOS DE CULTIVO 5.4. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL 5.5. RESULTADOS 5.6. DISCUSIONES 5.7. CONCLUSIONES 5.8. RECOMENDACIONES
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CONCLUSIONES GENERALES
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BIBLIOGRAFÍA
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1. FUENTES DE INFORMACIÓN
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2. ANEXOS
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