METODE RFLP

METODE RFLP (RESTRICTION FRAGMENT LENGTH POLYMORPHISM) DNA (deoxyribonucleic acid) dalam bahasa Indonesia lebih dikenal dengan asam deoksiribonukleat. Itu merupakan jenis asam nukleat yang menyimpan semua informasi genetika manusia. DNA merupakan blueprint segala aktivitas sel yang nanti diturunkan ke generasi berikutnya. Jadi secara g aris besar, peran DNA di dalam sebuah sel adalah sebagai materi genetik. DNA umumnya terletak di dalam inti sel. Sehingga DNA juga berperan dalam menentukan jenis rambut, warna kulit, kulit, dan sifat-sifat khusus khusus manusia. Jadi, seorang anak pasti memiliki ciri tidak jauh berbeda dengan orang tuanya. Hal ini disebabkan karena komposisi DNA-nya sama dengan sang orang tua. Struktur DNA terdiri atas dua untai yang berpilin membentuk struktur double helix. Satu untai berasal dari ibu dan satu untai lagi dari ayah. Masing-masing untai terdiri atas rangka utama dan basa nitrogen yang menyatukan dengan untai DNA lain. DNA merupakan polimer yang terdiri dari tiga komponen utama, yaitu gugus fo sfat, gula deoksiribosa, dan basa nitrogen. Sebuah unit monomer DNA yang terdiri dari ke tiga komponen tersebut dinamakan nukleotida, sehingga DNA tergolong sebagai polinukleotida. Rangka utama untai DNA terdiri dari gugus fosfat dan gula yang berselang-seling. Gula pada DNA adalah gula pentosa (berkarbon lima), yaitu 2deoksiribosa. Dua gugus gula terhubung dengan fosfat melalui ikatan fosfodiester antara atom karbon ketiga pada cincin satu gula dan atom karbon kelima pada gula lainnya. Salah satu perbedaan utama DNA dan RNA adalah gula penyusunnya, gula RNA adalah ribosa. Empat basa yang ditemukan pada DNA adalah adenin (dilambangkan A), sitosin (C, dari cytosine), guanin (G), dan timin (T). Adenin berikatan hidrogen dengan timin, sedangkan guanin berikatan dengan sitosin. DNA fingerprinting adalah teknik untuk mengidentifikasi seseorang berdasarkan pada profil DNAnya. Ada 2 aspek DNA yang digunakan dalam DNA fingerprinting, yaitu di dalam satu individu terdapat DNA yang seragam dan variasi genetik terdapat ter dapat diantara individu. Prosedur DNA fingerprinting memiliki kesamaan dengan mencocokkan sidik jari seseorang dengan orang lain. Hanya saja perbedanya adalah proses ini dilakukan tidak menggunakan sidik jari, tetapi menggunakan DNA individu karena secara individu DNA seseorang itu unik. Digunakan DNA karena DNA memiliki materi hereditas yang berfungsi untuk menentukan suatu urutan keturunan dalam suatu keluarga secara turun-menurun dengan pola yang acak (karena berasal dari fusi inti ovum dan sperma) sehingga se hingga dapat digunakan untuk identifikasi pelaku kejahatan walaupun telah berganti wajah. Metode DNA fingerprinting dapat diaplikasikan untuk keperluan sebagai berikut: ·

Menentukan paternity

·

Untuk keperluan forensik

·

Untuk identifikasi pelaku ataupun korban kejahatan

·

Untuk memprediksi apakah ada hereditary desease yang bisa diantisipasi untuk masa mendatang.

Pada umunya DNA yang digunakan untuk analisis adalah DNA mitokondria dan DNA inti sel. DNA yang paling akurat untuk tes adalah DNA inti sel karena inti sel tidak bisa berubah, sedangkan DNA mitokondria dapat berubah karena berasal dari garis keturunan ibu sehingga dapat berubah seiring dengan perkawinan. Dalam bidang forensik, penggunaan kedua tes DNA tergantung pada barang bukti apa yang ditemukan di TKP (Tempat Kejadian Perkara). Untuk kasus pemerkosaan diambil sampel dari spermanya tetapi yang lebih utama adalah kepala spermatozoanya, karena terdapat DNA inti sel didalamnya. Namun bila di TKP ditemukan satu helai rambut, sampel ini dapat diperiksa asal ada akarnya. Namun untuk DNA mitokondria tidak harus ada akar, cukup potongan rambut karena diketahui bahwa pada ujung rambut terdapat DNA mitokondria sedangkan akar rambut terdapat DNA inti sel. Pada umunya bahan kimia yang digunakan untuk isolasi adalah Phenolchloroform dan Chilex. Phenolchloroform berfungsi untuk mengisolasi darah yang berbentuk cairan sedangkan Chilex digunakan untuk mengisolasi barang bukti berupa rambut. Lama dari waktu proses tergantung pada kemudahan suatu sampel di isolasi. Tahap isolasi bisa selesai hanya dalam beberapa hari atau bahkan berbulan-bulan. DNA fingerprinting bergantung pada sebagian kecil dari genom. Setiap DNA te rsusun dari ekson yang merupakan daerah yang mengkode protein dan intron yang berupa daerah non-coding, biasanya disebut junk DNA. Dalam DNA kromosom terdapat sekuens berukuran 20-100 bp yang berulang. Potongan pengulangan ini dikenal sebagai VNTRs (Variable Number Tandem Repeats) yang dapat diisolasi dari DNA seseorang. Setiap individu memiliki VNTRs yang diturunkan oleh ayah dan ibu sehingga tidak ada individu yang memiliki VNTRs sama persis. Perbedaan VNTRs dari setiap individu terletak dalam pada berapa kali sequence ini diulang dalam daerah VNTRs. Perbedaan jumlah pengulangan ini akan menyebabkan setiap individu memiliki panjang VNTRs yang berbeda sehingga memungkin untuk mengetahui indentitas seseorang me lalui profil DNAnya. Ada 2 prinsip utama dalam menganalisa data VNTRs, yaitu: Ø Identity Matching. Jika dua sample memiliki pola alel VNTRs yang sama, maka dapat disimpulkan kedua sample tersebut berasal dari individu yang sama. Ø Inheritance Matching. Alel VNTR harus mengikuti pola keturunan. Seorang anak harus

memiliki sebuah alel yang cocok

dengan salah satu dari masing-masing orang tuanya. Berikut ini adalah macam-macam metode untuk melakukan DNA fingerprint, yaitu: 1.

Analisa menggunakan PCR atau dot blot (slot blot)

DNA fingerprint dengan menggunakan PCR, kelebihannya yaitu kemampuan untuk membedakannya lebih akurat dan dapat digunakan untuk menganalisa sampel yang tersedia dalam jumlah kecil maupun yang telah terdegradasi oleh cahaya matahari. PCR mampu mengamplifikasi sejumlah daerah spesifik

yang terdapat pada DNA menggunakan primer oligonukleotida dan DNA polimerase yang termostabil. Salah satu contoh DNA profilling menggunakan PCR adalah dengan HLA-DQ alpha reverse dot blot strips. Pada teknik ini digunakan strips yang mengandung titik (dot) dimana setiap dot mengandun DNA probe yang berbeda dari DNA manusia (HLA). Probe DNA berupa dot pada strip nitroselulosa ditempeli dengan enzim yang dapat merubah substrat yang tidak berwarna menjadi berwarna ketika probe berikatan dengan DNA. Jika DNA hasil PCR berikatan dengan probe yang komplemen pada strip, maka titik (dot) pada strip akan berwarna. 2.

Analisa STR (Short Tandem Repeats)

STR merupakan polimorfisme DNA yang terjadi karena adanya 2 at au lebih nukleotida yang berulang. Pola pengulangannya adalah terdiri dari 2-10 bp dan terjadi pada daer ah intron dari DNA. Dengan menganalisa loci dari STR dan menghitung berapa banyak perulangan dari sekuens STR yang t erjadi di setiap locus, maka dapat terbaca profil genetik yang unik dari setiap individu. Analisa dengan STR memerlukan teknik PCR dan elektroforesis gel agarosa. Dengan PCR daerah polimorfik dari DNA diamplifikasi dan kemudian fragmen STR dipisahkan dengan elektroforesis agarosa sehingga jumlah perulangan yang terjadi dapat dihitung dengan membandingkan perbedaan ukuran dengan alelic ladder. Analisa dengan STR ini tidak dapat dilakukan apabila 2 individu merupakan kembar monozigot. 3.

AmpFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism)

DNA profilling dengan menggunakan teknik AmpFLP memiliki beberapa keunggulan, yaitu lebih cepat daripada analisa dengan RFLP dan biaya yang dibutuhkan lebih murah. Teknik ini berdasarkan pada polimorfisme VNTR untuk membedakan alel yang berbeda. Teknik ini menggunakan PCR untuk mengamplifikasi daerah VNTR dan kemudian hasil amplifikasi dipisahkan dengan gel poliakrilamid dan diwarnai dengan teknik silver stained. Salah satu locus yang sering digunakan dlam teknik ini adalah locus D1S80. Contoh hasil amplifikasi locus D1S80 :

4.

Analisa kromosom Y

DNA profilling dengan teknik analisa kromosom Y menggunakan primer spesifik yang akan mengamplifikasi daerah polimorfisme pada kromosom Y (Y-STR). Pada kasus pemerkosaan, teknik ini menghasilkan resolusi yang lebih baik karena biasanya DNA sampel yang didapat dalam keadaan tercampur dengan DNA korban (wanita). Kromosom Y diturunkan oleh ayah sehingga analisa kromosom Y juga dapat digunakan untuk mengidentifikasi hubungan paternal seorang pria. 5.

Analisa DNA mitokondria.

DNA mitokondria terdapat dalam jumlah banyak dalam sel, tidak seperti DNA kromosom yang hanya terdapat 1 atau 2 dalam setiap sel. Hal ini memungkinkan apabila sampel yang ada telah rusak DNA kromosomnya, maka dengan DNA mitokondriapun DNA profilling te tap dapat dibuat. Dalam pembuatan DNA profilling dengan DNA mitokondria, bagian yang diamplifikasi adalah daerah HV1 dan HV2 dari DNA

mitokondria dimana sekuens hasil amplifikasi yang didapat dapat dibandingkan dengan pola band referensi. DNA mitokondria ini diturunkan oleh ibu. 6.

Analisa RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)

RFLP adalah ukuran fragmen DNA yang diperoleh oleh pemotongan sequence VNTRs sampai 30 urutan dengan enzim restriksi di situs spesifik. VNTRs bervariasi antara spesies tanaman, seperti me lakukan nomor dan lokasi antara enzim restriksi dan situs pengenalan. Prinsip dasar dari analisa RFLP ini adalah enzim restriksi akan memotong DNA pada sekuens yang spesifik dimana hasil pemotongan tersebut kemudian dianalisa dengan elektoforesis gel agarosa. Sekuens RFLP ini berbeda pada setiap individu sehingga enzim restriksi akan memotong pada daerah yang berbeda untuk setiap individu. Ukuran fragmen yang dihasilkan bergantung pada alel yang dimiliki individu tersebut dan panjang sekuens VNTR sehingga analisa menggunakan RFLP ini dapat digunakan untuk analisa genetik. Pada sebuah gel agarose, RFLPs dapat terlihat menggunakan radiolabel yang komplemen dengan sequence D NA. Tidak memerlukan teknik PCR untuk amplifikasi DNA dalam metode ini.

Permasalahan yang umum RFLP pada metode DNA fingerprinting adalah sebagai berikut: ·

Hasil tidak secara spesifik menunjukkan kesempatan kecocokan antara

dua organisme ·

Proses yang melibatkan banyak uang dan tenaga kerja, banyak laboratorium yang tidak mampu.

Teknik yang digunakan dalam analisa DNA fingerprinting adalah dengan menggunakan teknik RFLP. Pembuatan DNA fingerprinting dengan taknik analisa RFLP meliputi dua tahap, yaitu : 1.

Pemotongan DNA dengan enzim restriksi

Tabung eppendorf yang berisi larutan DNA ditambahkan buffer restriksi dan BSA (Bovine Se rum Albumin). Buffer restriksi (RE buffer) berfungsi untuk membuat dan mempertahankan suasana pH, ionic strength, dan kation yang sesuai (optimum) dengan kerja enzim restriksi sehingga enzim restriksi dapat bekerja secara optimal. Sedangkan BSA berperan sebagai stabilisator bagi enzim restriksi serta mencegah terjadinya adesi antara enzim dengan dinding tabung reaksi. BSA t idak akan berpengaruh pada enzim yang tidak membutuhkan stabilisator. 2.

Pemisahan hasil pemotongan dengan elektroforesis gel agarosa.

Setelah DNA dipotong dengan enzim restriksi, DNA dianalisis dengan gel elektroforesis. Gel elektroforesis merupakan salah satu metode yang digunakan untuk pemisahan, pendeteksian dan pemurnian molekul-molekul Biologi, seperti asam nukleat dan protein. Pemisahan dilakukan pada matriks yang berupa gel. Sampel DNA yang terpotong akan bergerak dalam gel agarosa yang telah dialiri listrik bertegangan ± 90mV. Kemudian DNA tersebut akan membentuk band-band yang dapat dilihat menggunakan alat berupa transiluminator UV. Kemudian akan nampak band-band, dari band tersebut

dapat dibuat peta restriksi DNA plasmid dari ukuran fragmen-fragmen DNA yang dihasilkan pada pemotongan dengan enzim restriksi dan jarak antara sisi pengenalan enzim. Enzim restriksi yang digunakan terdiri dari campuran EcoRI dan PstI. Enzim EcoRI berasal dari bakteri Eschericia coli, sedangkan enzim PstI berasal dari bakteri Providencia stuartii. Enzim EcoRI akan memotong pada sekuens GAATTC . Gambar sisi pemotongan enzim EcoRI adalah sebagai berikut :

Enzim EcoRI diisolasi pertama kali oleh Herbert Boyer pada tahun 1969 dari bakte ri Escherichia coli. Enzim EcoRI memotong DNA pada bagian yang urutan basanya adalah GAATTC ( sekuens pengenal bagi EcoRI adalah GAATTC ). Didalam sekuens pengenal tersebut, Enzim EcoRI memotongnya tidak pada sembarang situs tetapi hanya memotong pada bagian atau situs antara G dan A. Potongan-potongan DNA untai ganda yang dihasilkan akan memliki ujung beruntai tunggal. Ujung seperti ini yang dikenal dengan istilah sticky end. Sedangkan enzim PstI akan memotong pada sekuens sebagai ber ikut : 5'

- CTGCAG - 3' 3' - GACGTC - 5'

5'

- CTGCA|G - 3' 3' - G|ACGTC - 5'

5' -CTGCAG- 3' 3' -GACGTC- 5' Kerja dari enzim restriksi dapat dipengaruhi oleh faktor-faktor sebagai berikut : ► Komposisi Buffer

Enzim restriksi yang berbeda membutuhkan ionic strength (konsentrsi garam) dan kation yang berbeda pula. Beberapa enzim tidak dapat bekerja bila komposisi buffernya tidak sesuai. Penggunaan buffer yang berbeda akan menyebabkan kerja enzim dalam memotong menjadi tidak optimal. ► Adanya DNA yang termetilasi

Sebagian besar enzim restriksi tidak dapat memotong DNA yang termetilasi karena enzim tersebut tidak mampu mengenali sisi pemotongannya, hal ini disebabkan oleh adanya modifikasi atau metilasi. ► Suhu inkubasi

Suhu inkubasi suatu enzim bergantung pada asal enzim restriksi tersebut diambil. Suhu inkubasi enzim restriksi umumnya adalah 37oC. Namun apabila enzim restriksi tersebut diperoleh dari bakteri termofil, suhu inkubasinya adalah sekitar 50  – 65oC. Dalam pemotongan DNA dengan enzim restriksi sering terjadi kesalahan positif yang disebut star activity. Star activity adalah suatu kondisi dimana enzim restriksi kehilangan spesifisitasnya dalam memotong suatu rantai DNA pada sekuens tertentu dimana sekuens yang dipotong menjadi berbeda dengan sekuens canonicalnya sehingga enzim akan memotong DNA pada tempat yang salah dan abnormal. Adanya star activity ditunjukkan oleh adanya smear ataupun jumlah band yang terlalu

berlebih pada visualisasi hasil elektroforesis. Star activity ini dapat disebabkan oleh berbagai faktor sebagai berikut: v Inkubasi yang terlalu lama Bila inkubasinya terlalu lama, maka enzim akan memotong sisi lain selain sisi spesifiknya, sehinga fragmen yang terbentuk menjadi kecil  – kecil. Sehingga ketika divisualisasi menyebabkanband yang terlihat smear. v Konsentrasi enzim yang terlalu tinggi Konsentrasi enzim yang terlalu tinggi akan menyebabkan enzim memotong secara berlebihan sehingga fragmen yang terbentuk menjadi sangat kecil dan ketika divisualisasi akan terlihat bertumpuk dan banyak. v Konsentrasi gliserol yang terlalu tinggi Konsentrasi gliserol dalam buffer RE terlalu tinggi dapat menghambat kerja enzim karena larutan menjadi sangat viscous sehingga enzim sulit untuk bekerja. v Kekuatan ionik (ionic strength) pada buffer reaksi Kekuatan ionik dari buffer dapat berubah ketika diinkubasi. Hal ini disebabkan oleh adanya sebagian dari air yang menguap sehingga kekuatan ionik dari buffer menjadi turun. v pH buffer reaksi yang suboptimal v Penggantian Mg2+ dengan ion divalen lain seperti Mn2+ atau Co2+. v Adanya pelarut organik seperti etanol, DMSO, dll yang dapat menghambat kerja dari enzim. (Kresna,2009).

RESTRICTION FRAGMENT LENGTH POLYMORPHISM (RFLP) Analisis Restriction fragment length polymorphism (RFLP) adalah salah satu teknik pertama yang secara luas digunakan untuk mendeteksi variasi pada tingkat sekuen DNA. Deteksi RFLP dilakukan berdasar pada adanya kemungkinan untuk membandingkan profil pita-pita yang dihasilkan setelah dilakukan pemotongan dengan enzim restriksi terhadap DNA target/dari individu yang berbeda. Berbagai mutas i yang terjadi pada suatu organisma mempengaruhi molekul DNA dengan berbagai cara, menghasilkan fragmen-fragmen dengan panjang yang berbeda. Perbedaan panjang fragmen ini dapat dilihat setelah dilakukan elektroforesis pada gel, hibridisasi dan visualisasi. Aplikasi teknik RFLP biasa digunakan untuk mendeteksi diversitas genetic, hubungan kekerabatan, sejarah domestikasi, asal dan evolusi suatu spesies, genetic drift dan seleksi, pemetaan keseluruhan genom, tagging gen, mengisolasi gen-gen yang berguna dari spesies liar, mengkonstruksi perpustakaan DNA.

Langkah-langkah kerja untuk mendeteksi RFLP di laboratorium meliputi : -

Isolasi DNA

-

Pemotongan dengan enzim restriksi (digesti restriksi) dan elektroforesis gel

-

Transfer DNA dengan Southern blotting

-

Hibridisasi DNA