MỤC LỤC CHƯƠNG I. SƠ LƯỢC VỀ ENZYME CHITINASE Phân loại: I.1.1 .1.1.. Dựa Dựa vào cấu cấu trúc phân tử I.1.2 .1.2.. Dựa Dựa và vào tr trình tự tự am amino ac acid I.1.3 .1.3.. Dựa Dựa vào phả phản ứng phân cắt I.2. Các nguồn th thu nhận enzyme chitinase: I.2.1. I.2.1. Chitin Chitinase ase vi khuẩn khuẩn I.2.2 I.2.2.. Chit Chitin inas asee nấm nấm I.2.3. I.2.3. Chitin Chitinase ase thực thực vật vật I.2.4. I.2.4. Chitin Chitinase ase động động vật I.3. Các đặc tính cơ bản của enzyme chitinase • Trọng lượng phân tử • Điểm đẳng điện - Phổ hấp thụ - Hằng số Michaelis • Ảnh hưởng của nhiệt độ Ảnh hưởng của pH • • Chất tăng hoạt - chất ức chế • Sự ổn định I.4. Các loại cơ chất của enzyme Chitinase • Chitin • Các dẫn xuất của chitin I.5. Cơ chế tác động của các loại enzyme chitinase CHƯƠNG II. QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT, THU NHẬN, TINH SẠCH ENZYME CHITINASE THÔ TỪ MỦ CAO SU 2.1. .1. Sơ đồ quy trình 2.2. Qúa trình trình ly tâm tâm tách tách mủ, thu thu hồi lutoid lutoid và phá phá vỡ lutoid lutoid để giải giải phóng phóng chitinase chitinase 2.3. Quá trình tủa để thu nhận chitinase thô 2.3.1. Tủa bằng cồn 80% 2.3.2. Tủa bằng acetone 2.3. 2.3.3. 3. Tủa Tủa bằng bằng mu muối ối ammo ammoni nium um sulf sulfat atee 2.4. 2.4. Quá trình trình tinh tinh sạch sạch chit chitina inase se bằng bằng phương phương pháp pháp lọc gel gel sepha sephadex dex
I.1.
CHƯƠNG III. PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH ENZYME CHITINASE 3.1. Nguyên tắc 3.2. Ảnh hưởng các thông số lên hoạt tính của enzyme chitinase 3.2.1. Nhiệt độ 3.2.2. pH 3.2.3. Nồng độ cơ chất CHƯƠNG IV. ỨNG DỤNG CỦA ENZYME CHITINASE TRONG VIỆC THU NHẬN OLYGO – CHITIN
Chương I. Sơ lược về enzyme chitinase: Chitinase còn gọi là [poly β-1,4-(2- acetamido-2-deoxy)-D-glucosid glucanohydrolase]. Là enzyme thuỷ phân chitin thành các đơn phân N-acetylglucosamine, chitobiose hay chitotriose qua việc xúc tác sự thuỷ giải liên kết β-1,4-glucoside giữa C1 và C4 của 2 phân tử N-acetylglucosamine liên tiếp nhau trong chitin. Chitinase thương phẩm có giá rất đắt, đặc biệt là chitinase đã tinh sạch. Vì thế việc sử dụng enzyme thô trở thành thay thế thú vị trong việc tạo ra GlcNAc và các oligomer có nguồn gốc chitin.
I.1.
Phân loại enzyme chitinase: I.1.1.
Dựa vào cấu trúc phân tử:
Chitinase được sắp xếp vào 2 họ Glycohydrolase (enzyme thuỷ phân đường):
-
Họ glycohydrolase 18: là họ chitinase lớn nhất với khoảng 180 chi, có cấubtrúc xác định gồm 8 xoắn
α/β cuộn tròn, được tìm thấy ở nhiều loại vi sinh vật như vi khuẩn, nấm, thực vật, côn trùng, hữu nhũ và virus. trong họ này, chitinase từ các prokaryote chỉ có 2 motif trình tự ngắn được bảo tồn cao giống với enzyme của eukaryote. Tuy nhiên, cả 2 loại chitinase đều có cùng domain xúc tác barrel (βα)8. Khác với các glycoside hydrolase khác, chitinase họ 18 có cơ chế phản ứng bất thường bao gồm việc tác động lên nhóm N- acetyl của cơ chất trên nguyên tử C anomer.
-
Họ glycohydrolase 19: thường thấy chủ yếu ở thực vật như cà chua, cải, đậu Hà Lan, ngoài ra còn có
ở xạ khuẩn Streptomyces gricues, vi khuẩn Haemophilus influenzae… chúng có cấu trúc hình cầu có cuộn giống lysozyme của động vật và phage, bao gồm motif cuộn α + β và hoạt động thong qua cơ chế nghịch chuyển.
I.1.2.
Dựa vào trình tự amino acid:
Dựa vào trình tự đầu amin (N), sự định vị của enzyme, điểm đẳng nhiệt, peptid nhận biết và vùng cảm ứng, người ta phân loại enzyme chitinase thành 5 nhóm:
-
Nhóm I: Là những đồng phân enzyme trong phân tử có vùng đầu N giàu cysteine chứa khoảng 40
acid amin nối với tâm xúc tác thong qua một đoạn giàu glycin hoặc prolin ở đầu carboxyl ( C) ( peptid nhận biết).
-
Nhóm II.: Là những đồng phân enzyme trong phân tử chỉ có tâm xúc tác có trình tự amino acid
tương tự ở chitinase nhóm I, thiếu đoạn giàu cysteine ở đầu N và peptid nhận biết ở đầu C. Chitinase nhóm II có ở thực vật, nấm và vi khuẩn. chúng được cảm ứng bởi các tác nhân bên ngoài. ở thực vật, các protein nhóm II thuộc loại protein kháng bệnh và được tế bào tiết ra dưới nhiều điều kiện stress khác nhau.
-
Nhóm III: Trình tự amino acid hoàn toàn khác với chitinase nhóm I và II, nhưng rất giống về trình
tự với lysozyme ở Hevea brasiliensis, vì thế chúng mang hoạt tính lysozyme. ở thực vật, các chitinase nhóm III là các protein kháng bệnh và được tiết ra ngoại bào.
-
Nhóm IV: Là những đồng phân enzyme chủ yếu có ở lá cây hai lá mầm, 41-47% trình tự amino acid
ở tâm xúc tác của chúng tương tự như chitinase nhóm I và khá giống với chitinase vi khuẩn. trong phân tử cũng có đoạn giàu cysteine nhưng kích thước phân tử nhỏ hơn đáng kể so với chitinase nhóm I.
-
Nhóm V: Dựa trên những dữ liệu về trình tự, người ta nhận thấy vùng gắn chitin (vùng giàu
cysteine) có thể đã giảm đi nhiều lần trong quá trình tiến hoá ở thực vật bậc cao. I.1.3.
Dựa vào phản ứng phân cắt:
Enzyme phân giải chitin bao gồm endochitinase, chitin-1,4-β-chitobiosidase, N-acetyl-β-Dglucosaminidase (exochitinase) và chitobiase.
Endochitinase là enzyme phân cắt nội mạch chitin một cách ngẫu nhiên tạo các đoạn oligosaccharide, đã được nghiên cứu từ dịch chiết môi trường nuôi cấy nấm mốc Trichoderma harzianum (2 loại endochitinase: M1= 36kDa, pI1= 5,3±0,2 và M2= 40kDa, pI2= 3,9), Gliocladium virens (M= 41kDa, pI= 7,8). Chitin-1,4-β-chitobiosidase là enzyme phân cắt chitin (exochitinase) từ đầu không khử tạo thành các sản phẩm chính là các chhitobiose, cụ thể enzyme này được thu từ Trichoderma harzianum (M= 36kDa, pI= 4,4±0,2). N-acetyl-β-D-glucosaminidase (exochitinase) (EC 3.2.1.30) là enzyme phân cắt chitin từ một đầu cho sản phẩm chính là các monomer N-acetyl-D-glucosamin. Chitobiase là enzyme phân cắt chitobiose thành 2 đơn phân N-acetyl-D-glucosamin. Ngoài ra, đối với chitosan – dẫn xuất deacetyl hóa của chitin, chitosanase (EC 3.2.2.132) xúc tác thủy phân chitosan tạo thành các oligosaccharide tương ứng. I.2.
Các nguồn thu nhận enzyme chitinase: I.2.1.
Chitinase vi khuẩn
Enzyme chitinase được tìm thấy trong vi khuẩn: Chromobacterium, Klebsiella, Pseudomonas, Clostridium, Vibrio
I.2.2.
và đặc biệt là ở nhóm Streptomycetes.
Chitinase nấm
Chitinase cũng được tạo ra bởi các loài nấm sợi. Các chủng nấm mốc cho enzyme chitinase cao như: Trichoderma, Gliocladium, Calvatia,… đặc biệt là ở các loài nấm lớn như Lycoperdon, Coprinus …
I.2.3.
Chitinase thực vật
Các thực vật bậc cao có khả năng tạo enzyme chitinase như: cao su (Hevea brasiliensis), thuốc lá (Nicotiana sp ,)
lúa, lúa mì, lúa mạch (Hordeum vulgare), lúa mạch đen, cà rốt, bắp cải, bắp, khoai tây, đậu Hà
Lan, đậu nành, củ từ…và đặc biệt một số loài tảo biển cũng là nguồn cung cấp enzyme chitinase. I.2.4.
Chitinase động vật
Từ một số động vật nguyên sinh và từ các mô, tuyến khác nhau trong hệ tiêu hóa của nhiều loài động vật không xương: ruột khoang, giun tròn, thân mềm, chân đốt. Đối với động vật có xương sống, enzyme chitinase được tiết ra từ tuyến tụy và dịch dạ dày của các loài cá, lưỡng cư, bò sát ăn sâu bọ, trong dung dịch dạ dày của những loài chim, thú ăn sâu bò. Ngoài ra, enzyme chitinase còn được thu nhận từ dịch biểu bì của giun tròn trong suốt quá trình phát triển và dịch tiết biểu bì của các loài chân đốt vào thời điểm thay vỏ, lột da. Enzyme chitinase giúp côn trùng tiêu hóa màng ngoài (cuticle) trong quá trình biến thái hay lột xác.
1.3.
Các đặc tính cơ bản của enzyme chitinase 1.3.1.
Trọng lượng phân tử:
Enzyme chitinase tìm thấy ở thực vật bậc cao và tảo biển có trọng lượng phân tử khoảng 25-40 kDa. Một số chitinase có trọng lượng phân tử khoảng 40-90 kDa. Enzyme chitinase của các loài thân mềm, chân đốt, động vật có xương (cá, lưỡng cư, thú) có trọng lượng phân tử cao hơn, khoảng 120 kDa. Trọng lượng phân tử của enzyme chitinase thu nhận từ nấm và vi khuẩn có khoảng biến đổi rộng, từ 30 đến 120 kDa. Một số enzyme chitinase có trọng lượng phân tử thấp có thể được tạo ra từ một enzyme lớn hơn bằng cách phân cách một phần protein. 1.3.2.
−
Điểm đẳng điện – Phổ hấp thu - Hằng số Michaelis:
Enzyme chitinase có giá trị pI thay đổi rộng: 3,0 -10,0 ở thực vật bậc cao và tảo, 4,7-9,3 ở côn trùng,
giáp xác, thân mềm và cá, 3,5-8,8 ở vi sinh vật. −
Hệ số hấp thu E280mg/ml=1,24; phổ hấp thu chỉ là bước sóng đơn 280μm.
Hằng số Michaelis: 0,010-0,011 (g/100ml).
−
1.3.3.
Ảnh hưởng của nhiệt độ:
Nhìn chung, nhiệt độ tối ưu cho enzyme chitinase ở vi sinh vật hoạt động là 40 0C, ngoại trừ Aspergillus niger tổng
hợp enzyme chitinase hoạt động trên cơ chất là glycol chitin có nhiệt độ tối thích là 50 oC. Tuy
nhiên, tùy theo nguồn gốc thu nhận mà enzyme chitinase có thể có những nhiệt độ tối ưu khác nhau. Thí dụ, nhiệt độ tối ưu của chitinase từ khoai tây ngọt là 25 oC. Các enzyme chitinase thực vật thuộc nhóm III và các chitinase từ Bacillus licheniformis phân lập trong suối nước nóng cho thấy có khả năng chịu đựng nhiệt độ cao đến 80 0C. Mặt khác, chitinase từ côn trùng (tằm…) không ổn định ở nhiệt độ 40oC vì côn trùng phát triển ở nhiệt độ 25oC. Do đó, nhiệt độ tối ưu của enzyme chitinase côn trùng không cao. 1.3.4.
Ảnh hưởng của pH:
Giá trị tối ưu của enzyme chitinase từ 4-9 đối với các chitinase ở thực vật bậc cao và tảo, enzyme chitinase ở động vật có vú là 4,8-7,5 và ở vi sinh vật là 3,5-8,0. Theo các nhà khoa học, pH tối thích của enzyme chitinase có thể có sự phụ thuộc vào cơ chất được sử dụng. Đa số các enzyme chitinase đã được nghiên cứu có pH tối ưu khoảng 5,0 khi cơ chất là chitin. Enzyme chitinase của Streptomyces grieus có pH tối ưu khoảng 6,3, giá trị này ở khoai tây ngọt Ipomoea batatas là 5,0 . Ở các enzyme từ củ từ Diosscorea opposita pH tối ưu là 3,5-4,0. Tùy mục đích phân tích, những cơ
chất hòa tan như glycol chitin và N-acetyl-chitooligosaccharide được sử dụng thay thế cho chitin. pH tối ưu của enzyme chitinase khi cơ chất là glycol chitin thuộc khoảng pH kiềm yếu. Hoạt tính enzyme chitinase sẽ nhanh chóng bị ức chế ở pH < 4,5, ngoại trừ chitinase trong dạ dày của động vật có xương sống vẫn hoạt động ở pH 3,0.
1.3.5.
Chất tăng hoạt- chất ức chế:
a. Allosamidin Allosamidin là một
Seudotri saccharide
gồm 2 đơn vị N-acetylallosamin gắn với nhau nhờ liên kết
β-1,4 và một nhóm allosamizoline. Nhóm allosamizoline tương tự như chất trung gian phản ứng oxocarbonium, cấu tạo bao gồm 1 cyclopentane và một vòng allosamizoline . Về cấu tạo, allose chỉ khách glucose ở C3 trong đó nhóm hydroxyl nằm thẳng trong allose và nằm ngang trong glucose. Allosamidin là chất ức chế chitinase đầu tiên được phân lập từ khuẩn ty của Streptomyces sp. No.1713. Allosamidin và những dẫn xuất của nó ức chế enzyme chitinase được tổng hợp từ tằm, tôm he và một số vi sinh vật (Piromyces communis, Streptomyces sp vaø Streptomyces olivaceoviridis). Ngoài ra, allosamidin cũng được phát hiện có khả năng gắn kết với các enzyme chitinase thực vật như jevamine và ức chế các enzyme chitinase thực vật (đa số thuộc họ Glycohydrolase ). Điển hình nó ức chế các chitinase H ở cây củ cải với ID (liều lượng 50% chất ức chế là 44,7 μM). Nói chung, allosamidin ức chế mạnh chitinase họ 18 và không ức chế protein lòng trắng trứng gà hay lysozyme người. Về cơ chế ức chế, allosammidine ức chế chitinase theo cơ chế cạnh tranh nhóm allosamizoline gắn vào tâm của trung tâm hoạt động chitinase, giả làm chất trung gian phản ứng oxacarbonium nằm giữa C1 của Nacetyl-zD-glucosamin và oxy carbonyl của nhóm N-acetyl ở C2 trong quá trình thủy giải. Trong đó điện tích dương ở C1 được ổn định bằng oxy carbonyl của nhóm N-acetyl ở C2. Allosamidin khá đắt và khó tổng hợp. Mặc dù các oligomer carbohydrate và những dẫn xuất của chúng có thể dùng để thiết kế chất ức chế glycoside hydrolase, chúng thường khó tổng hợp và quá lớn để đi qua màng tế bào. b. Các ion kim loại:
Các ion kim loại Hg2+, Ag+ là những chất ức chế. Đối với ion Cu+, có 2 dạng enzyme chitinase: một ức chế và một được tăng cường nhờ Cu+ được tìm thấy ở một số loài cá và vi sinh vật như Pseudomonas aeruginosa.
c. Các chất khác Dipeptide CI-4 [cyclo-(L-Arg-D-Pro)] là một sản phẩm tự nhiên được tổng hợp từ vi khuẩn nước mặn Pseudomonas IZ208. CI-4 ức chế việc phân tách tế bào Saccharomyce cerevisiae và ngăn cản sự tạo khuẩn ty của nấm bệnh Candida algicans ở người. Về cơ chế, CI-4 ức chế chitinase họ 18 vì chúng có cấu trúc giống chất trung gian phản ứng. Các chất ức chế chittinise họ 18 có ảnh hưởng đến chu trình sống của nhiều loại năm và ngăn cản sự truyền kí sinh trùng sốt rét (Plasmodium falciparum) từ vật chủ đến côn trùng. 2 peptide ức chế glycoside hydrolase khác là argifin và argadin có thể ức chế chitinase ở nồng độ nano hay micro mole. Các peptide này gắn trực tiếp lên các gốc ở tâm hoạt động của enzyme và chiếm các vị trí -1,+1 và +2. Mặc dù những chất ức chế này là peptide nhưng chúng có nhiều nhánh bên bất thường như acetyl hay vòng thơm. Ngược lại, huyết thanh albumin có vai trò làm tăng hoạt động của enzyme chitinase nhưng sự ảnh hưởng này chỉ rõ ràng sau 2-3 giờ đầu của phản ứng. 1.3.6.
Sự ổn định
Enzyme chitinase thô hoặc tinh sạch ổn định trong trạng thái đông lạnh khoảng 2 năm. Sự ổn định của enzyme chitinase sẽ cao hươn khi có mặt của cơ chất là chitin. Chúng bị khử hoạt tính nhanh chóng ở 37 0C trong trường hợp không có mặt chitin. Chu kỳ bán thủy phân ở 37 oC là 40 ngày và ở 5 oC là 230 ngày. Enzyme chitinase bất hoạt bởi oxygen, hằng số bất hoạt ở 20oC là k=0,145/h
Các loại cơ chất của enzyme chitianase 1.4.1.
Chitin:
Cơ chất chủ yếu của enzyme chitinase là chitin. Ở lớp vỏ côn trùng và giáp xác, chitin được gắn kết với protein. Trong một vài trường hợp, lớp biểu bì này được làm cứng bởi các liên kết chéo với polysaccharide khác (cellulose, mannan, glucan…) Ngoài ra, chitin cũng có cấu trúc liện hệ với murein, cấu trúc polymer hiện diện ở vách tế bào vi khuẩn. 1.4.2.
Dẫn xuất của chitin:
Enzyme chitinase có thể tác động lên một số dẫn xuất của chitin như glycol-chitin, carboxymethylchitin, chitosan, chitinsulfate, 4-methylumbellferyl-tri N -acetylchitotrioside (MUC- phát huỳnh quang) Enzyme chitinase không hoạt động trên các cơ chất: chitin nitrat, cellulose, hyaluronic, alginic acid hoặc mucin.
Cơ chế tác động của các loại enzyme chitinase Endochitinase phân cắt ngẫu nhiên trong nội mạch của chitin và chitooligomer, sản phẩm tạo thành là một hỗn hợp các polymer có trọng lượng phân tử khác nhau, nhưng chiếm đa số là các diacetylchitobiose (GlcNAc)2 do hoạt tính endochitinase không thể phân cắt thêm được nữa. Hầu hết chitinase thuộc loại này. Chitin 1,4-chitobiosidase phân cắt chitin và chitooligomer ở mức trùng hợp lớn hơn hay bằng 3 [(GlcNAc)n với n≥ 3] từ đầu không khử và chỉ phóng thích diacetylchitobiose (GlcNAc)2 β - N -acettlhexosaminidase phân cắt các chitooligomer hay chitin một cách liên tục từ đấu không khử và
chỉ phóng thích các đơn phân N -acetylglucosamin. Ngoài ra, để khảo sát kiểu phân cắt, người ta sử dụng N-acetyl-chitooligosaccharide làm cơ chất. Các oligosaccharide thường được thủy phân bên trong trên một vài vị trí xác định hoặc một cách ngẫu nhiên. Một
số enzyme chitinase có khả năng thủy phân trisaccharide, một số khác thì không. Cũng có 2 dạng chitinase thủy phân pentasaccharide: một phân cắt bên trong tạo disaccharide và trisaccharide, một phân cắt bên ngoài tạo các monosaccharide và tetrasaccharide. Tóm lại, chitinase thực chất là enzyem cắt ngẫu nhiên.
Chương II. Quy trình tách chiết, thu nhận, tinh sạch enzyme chitinase thô từ mủ cao su Sơ đồ quy trình Mủ cao su tinh khiết Ly tâm 2 lần với tốc độ 6000vòng/phút trong 20 phút Phân loại thể lutoid Nghiền bằng cát thủy tinh, lọc sạch Dịch lọc Tủa bằng (NH4)2SO4 95% bão hòa, hòa tủa vào đệm citrate pH5, thẩm tích
Kiểm tra hàm lượng, hoạt tính chitinase (55 0C, pH4.5, 70mg/ml chitin)
Dung dịch chitinase thô Lọc gel Sephadex G-50, kiểm tra hoạt tính phân đoạn (550C, pH4.5, 70mg/ml chitin
Kiểm tra hàm lượng protein, khối lượng phân tử bằng SDS-PAGE
Dung dịch chitinase tinh khiết
PAGE và kiểm tra hàm lượng chitinase
Hình 2.1. Sơ đồ quy trình sơ bộ thu nhận chitinase từ mủ cao su
Quy trình ly tâm tách mủ, thu hồi lutoid và phá vỡ lutoid để giải phóng chitinase Mủ cao su tinh khiết được thu gom từ vườn cao su. Mủ được lọc sơ để loại côn trùng, ướp lạnh và chuyển về phòng thí nghiệm. Mủ cao su tươi được ly tâm ở tốc độ 6000vòng/phút trong thời gian 20 phút. Sau khi ly tâm, tách bỏ lớp mủ kem tạo thành lớp trắng dẻo trên bề mặt ống ly tâm. Sau đó cho thêm vào ống ly tâm nước cất lạnh và ly tâm lần thứ 2 để lại hoàn toàn phần cao su. Phần lutoid thu được đem nghiền bằng cối có chứa cát thủy tinh, rồi lọc sạch.
2.3.
Quy trình tủa để thu nhận chitinase thô : 2.3.1. Tủa bằng cồn 80% để thu chitinase thô :
Ta tiến hành tủa dịch lọc protein từ lutoid trong mủ cao su bằng cồn lạnh với tỉ lệ 1: 4 (thể tích dịch lọc : thể tích cồn) rồi xác định hàm lượng protein theo phương pháp Lowry và xác định hoạt tính theo phương pháp định lượng đường khử bằng DNS với đường chuẩn N- acetylglucosamin. Ở tỷ lệ 1:4 ta có hàm lượng protein đạt 4,45mg/ml, hoạt tính chitinase 5,17U/ml và hoạt tính riêng là 1,16U/mg protein. 2.3.2. Tủa bằng acetone để thu chitinase thô : Cách tiến hành và cách tính tương tự phần cồn ở trên, chỉ khác thay cồn bằng acetone với tỉ lệ 1: 4 ( thể tích dịch lọc : thể tích acetone) Ở tỷ lệ 1:4 ta có hàm lượng protein đạt được là 2,46mg/ml, hoạt tính chitinase là 5,92 U/ml và hoạt tính riêng của chitinase là 2,4 U/mg protein 2.3.3. Tủa bằng muối ammonium sulfate để thu chitinase thô :
Sử dụng muối ammonium sulfate (NH4)2SO4 để tủa dịch lọc lutoid từ mủ cao su. Muối ammonium sulfate đem tủa ở các nồng độ bão hòa 95% nhiệt độ 5 0C ( để tủa trong ngăn tủ lạnh). Nồng độ phần trăm bão hòa khác nhau của ammonium sulfate sẽ cho hiệu quả kết tủa khác nhau. Ở nồng độ bão hoà 95% thì hàm lượng protein là 4,35 mg/ml và hoạt tính chitinase là 13,08U/ml
So sánh giữa các phương pháp kết tủa :
-
Hàm lượng protein cao nhất có được với cồn tỉ lệ 1: 4, tiếp đến là (NH4)2SO4 95%.
-
Tác nhân tủa cho hoạt tính chitinase tốt nhất là tủa bằng ammonium sulfate (NH 4)2SO4 95%.
Đối với một tác nhân dùng để tủa, yếu tố hoạt tính là yếu tố hang đầu để đánh giá khả năng tủa. Vì vậy có thể kết luận, ammonium sulfate (NH 4)2SO4 95% độ bão hóa là tác nhân tủa thích hợp nhất khi kết tủa enzyme chitinase trong lutoid từ mủ cao su.
2.4. Quy trình tinh sạch chitinase bằng phương pháp lọc gel sephanex : Nguyên tắc: Kỹ thuật sắc ký lọc gel dùng để tách những phân tử có kích thước , trọng lượng phân tử khác nhau bằng cách cho chúng đi qua cột gel. Những phân tử có kích thước đủ nhỏ để lọt vào bên trong lỗ gel sẽ bị trì hoãn và di chuyển chậm qua cột. Trong khi những phân tử lớn hơn di chuyển bên ngoài các hạt gel nên sẽ di chuyển nhanh và được thoát khỏi cột sớm hơn các phân tử nhỏ.
Chương III. Phương pháp xác định hoạt tính enzyme chitinase: 3.1. Nguyên tắc: Xây dựng đường chuẩn glucosamine qua đó định lượng glucosamine trong dịch thuỷ phân theo phương pháp của Elson – Morgan. Xác định hàm lượng glucosamine theo phương pháp so màu. Xác định hoạt tính chitinase: Một đơn vị hoạt tính (đvht) enzyme chitinase tương đương với 1 μg glucosamin tạo thành trong thời gian thủy phân chitin là 1 phút ở nhiệt độ phản ứng. Xác định độ ẩm: Phương pháp sấy đến trọng lượng không đổi. Xác định độ tan: Phương pháp xác định hàm lượng các chất không tan.
3.2. Ảnh hưởng của các thông số lên hoạt tính của enzyme chitinase: 3.2.1. Nhiệt độ: Nhiệt độ tối ưu cho hoạt tính chitinase từ mủ cao su là 55 0C
3.2.2. pH : pH tối ưu cho họat tính chitinase từ mủ cao su là trong khoảng pH 4-5.
3.2.3. Nồng độ cơ chất : Dịch enzyme từ cao su được cho phản ứng với cơ chất ở các nồng độ khác nhau trong điều kiện nhiệt độ và pH tối ưu, cùng với sự tăng nồng độ cơ chất chitin, lượng đường khử tạo ra cũng tăng đều làm cho hoạt tính của enzyme cũng tăng lên ở các nồng độ Nồng độ chitin thích hợp cho hoạt tính chitinase từ mủ cao su là 60-70mg/ml.
Chương IV. Ứng dụng của chitinase trong việc thuỷ phân chitin thu nhận oligo- chitin: 4.1. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thuỷ phân chitin: • Nồng độ chế phẩm enzyme chitinase (CPE) bổ sung 0,2% là thích hợp nhất. nồng độ CPE càng tăng tốc độ
thuỷ phân tăng, nhưng vì nồng độ CPE cao (>0,2%) cho lượng olygo-chitin thu được tăng nhưng mức tăng chậm. • Nhiệt độ thuỷ phân thích hợp là 300C. • pH thích hợp là 5,5. • Chitin ở dạng huyền phù với nồng độ tối ưu 0,75-1%.
4.2. Hiệu suất thuỷ phân chitin: Đánh giá hiệu suất thuỷ phân chitin của chitinase theo nồng độ CPE, nhiệt độ, pH, nồng độ chitin. Mặc dù hiệu suất thuỷ phân chitin của chitinase thấp chỉ đạt 16,69 -22,15% so với thuỷ phân bằng cellulose, hemicellase, papain thương mại nhưng giá trị của các sản phẩm thương mại này rất cao và phải nhập khẩu nên việc sử dụng enzyme chitinase tách chiết từ mủ cao su sẽ tốt hơn. Nguồn chitin từ tự nhiên
Thuỷ phân
Enzyme chitinase
Dịch thuỷ phân
Lọc
Cô đặc
Sấy khô
Oligochitin
TÀI LIỆU THAM KHẢO Nguyễn Đức Lượng, Cao Cường (2003), Thí nghiệm
1.
công nghệ sinh học, tập 1, Nhà xuất bản Đại học Quốc Gia, Tp Hồ Chí Minh. 2.
Lê Ngọc Tú, La Ăn Chứ, Đặng Thị Thu, Phạm Quốc Thắng, Nguyễn Thị Thịnh, Bùi Đức Hợi, Lưu Duẩn, Lê Doãn Biên (2000), Hoá sinh học công nghiệp, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội.
3.
