LABORATORIO DE BIOQUÍMICA
PROFESORA CLAUDIA SAAVEDRA SÁNCHEZ 1
INTRODUCCIÓN SOLUCIONES Una Una solu soluci ción ón es una una mezc mezcla la homogé homogénea nea de dos o más más comp compon onent entes. es. El com compone ponent nte e que que est esta en mayo mayorr pro proporc porciión se llama lama solv solven ente te y el o los los componentes componentes que están están en menor proporción proporción se llaman llaman solutos. solutos. En soluciones soluciones líquidas, el solvente es un líquido, mientras que los solutos pueden ser sólidos, líquidos o gases. La gran mayoría de las soluciones usadas en bioquímica son soluciones acuosas (solvente agua). Para caracterizar una solución no basta con indicar sus componentes sino que también la proporción en que estos están presentes en la solución, es decir, la concentración de cada uno de los solutos en la solución.
UNIDADES DE CONCENTRACIÓN Las más usadas en la práctica son de dos tipos: • Unidades de concentración referidas a volumen: indican cantidad de soluto disuelto por unidad de volumen de solución. Ejemplo: la molaridad, la normalidad, normalidad, porcentaje p/v, g/l, etc.
• Unidades de concentración referidas a peso: indican cantidad de soluto disuelto por unidad de peso de solución o de solvente. Ejemplo: % p/p, molalidad. 1.
Molaridad (M): número de moles de soluto por litro de solución .
Para preparar una solución de molaridad dada es necesario conocer el peso molecular (PM) del soluto. Peso soluto (g) = número de moles de soluto PM ( g/mol)
M = moles de soluto / volumen de solución (L) (1) Ejemplo: Una solución 1 M ( 1 molar) de NaCl contienen 1 mol (58.44 g) de NaCl por litro. Un mol de NaCL corresponde a un valor igual al número de Avogadro de moléculas, que es 6.023 x 10 23. La concentración de iones en solución también se indica en unidades molares, en este caso el ión es la molécula. Ejemplo: Consideremos la solución 1 M de NaCl. Los enlaces iónicos de la red cristalina de cloruro de sodio se rompen al disolverse la sal.
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INTRODUCCIÓN SOLUCIONES Una Una solu soluci ción ón es una una mezc mezcla la homogé homogénea nea de dos o más más comp compon onent entes. es. El com compone ponent nte e que que est esta en mayo mayorr pro proporc porciión se llama lama solv solven ente te y el o los los componentes componentes que están están en menor proporción proporción se llaman llaman solutos. solutos. En soluciones soluciones líquidas, el solvente es un líquido, mientras que los solutos pueden ser sólidos, líquidos o gases. La gran mayoría de las soluciones usadas en bioquímica son soluciones acuosas (solvente agua). Para caracterizar una solución no basta con indicar sus componentes sino que también la proporción en que estos están presentes en la solución, es decir, la concentración de cada uno de los solutos en la solución.
UNIDADES DE CONCENTRACIÓN Las más usadas en la práctica son de dos tipos: • Unidades de concentración referidas a volumen: indican cantidad de soluto disuelto por unidad de volumen de solución. Ejemplo: la molaridad, la normalidad, normalidad, porcentaje p/v, g/l, etc.
• Unidades de concentración referidas a peso: indican cantidad de soluto disuelto por unidad de peso de solución o de solvente. Ejemplo: % p/p, molalidad. 1.
Molaridad (M): número de moles de soluto por litro de solución .
Para preparar una solución de molaridad dada es necesario conocer el peso molecular (PM) del soluto. Peso soluto (g) = número de moles de soluto PM ( g/mol)
M = moles de soluto / volumen de solución (L) (1) Ejemplo: Una solución 1 M ( 1 molar) de NaCl contienen 1 mol (58.44 g) de NaCl por litro. Un mol de NaCL corresponde a un valor igual al número de Avogadro de moléculas, que es 6.023 x 10 23. La concentración de iones en solución también se indica en unidades molares, en este caso el ión es la molécula. Ejemplo: Consideremos la solución 1 M de NaCl. Los enlaces iónicos de la red cristalina de cloruro de sodio se rompen al disolverse la sal.
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NaCl
Na+ + Cl -
Por cada mol de NaCl sólido se formó 1 mol de Na + y 1 mol mol de de Cl- . Luego: Concentración de Na + = 1 mol Concentración de Cl = 1 mol Ejemplo: Para moléculas distintas, como MgCl 2 MgCl2 Mg+2 + 2 ClUna solución de cloruro de magnesio 1 M contiene: Concentración de Mg +2 = 1 mol Concentración de Cl = 2 mol La concentración de soluciones diluidas se suele expresar en unidades que son submúltiplos de M: 1 Milimolar (mM) significa : 1 mmol en 1 L de solución ( 1 mmol = 10 -3 moles) 1 Micromolar ( µ M) significa : 1 µ mol en 1 L de solución (1 µ Mol = 10-6 moles) 1 Nanomolar (nM) significa : 1 nmol en 1 L de solución (1 nMol = 10 -9 moles) 1 Picomolar (pM) significa : 1 pmol en 1 L de solución (1 pMol = 10 -12 moles)
2.
Normalidad: Núme Número ro de pesos pesos equi equiva valen lente tess (PE) (PE) de solu soluto to por por litr litro o de solución. Solamente para algunos compuestos se define un P eq y este siempre tiene relación con la reactividad del compuesto. En general : Peq = PM / n
Para ácidos y bases n = número de protones que puede ceder (el ácido) o captar (la base) por molécula. Para compuestos que sufren reacciones redox n = N° de electrones captados (agente oxidante) o cedidos (agente reductor) por molécula. 3.
Peso de soluto / volumen de solución en g/l, mg/l, etc.: es la forma más sencilla de indicar la concentración de una solución es la forma más usual, además de la molaridad.
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4. Porcentaje peso / volumen (% p/v) : peso de soluto en gramos por 100 ml de solución (% g). Se habla de porcentaje, ya que 100 ml de una solución acuosa relativamente diluída pesan aproximadamente 100 gr. Para soluciones muy diluídas se usa el submúltiplo mg % = peso del soluto en mg por 100 ml de solución. 5. Porcentaje peso / peso ( % p/p): peso en gramos de soluto por 100 gramos de solución. La concentración de la mayoría de los ácidos comerciales viene dada en % p/p. Aquí la proporción de soluto puede ser mayor que la proporción de solvente. Ejemplo: H2 SO4 al 96%. Para transformar % p/p a concentración molar o normal es necesario conocer la densidad de la solución. Ejemplo: Calcular la molaridad de HCl comercial de 28 % densidad 1.15 (kg. / L). 1. Calculamos cuanto pesa un litro de la solución: 1 L x 1.15 ( kg. / L) =1.15 kg. = 1.150 g. 2. Ahora calculamos el peso de HCl ( HCl puro ) contenido en este litro: 100 g de solución contienen 28 g., 1.150 g. de solución contienen: 1.150 g. x 0.28 = 322 g. 3. Finalmente, calculamos a cuantos moles corresponde este peso de HCl: 322 g. / 36.5 (g. / mol) = 8.82 moles Hemos calculado que el litro del ácido comercial contiene 8.82 moles de HCl, es decir, es 8.82 M. 6. Molalidad (m): número de moles de soluto por 1000 g de solvente. Esta unidad de concentración se usa solamente para ciertos cálculos físico – químicos. Expresar la concentración en estas unidades presenta la ventaja de que se hace independiente de la temperatura. Al contrario, una concentración expresada en unidades referidas a volumen, como la molaridad, varía con la temperatura, ya que esta afecta el volumen. En soluciones acuosas diluidas m es prácticamente igual a M.
PREPARACIÓN DE SOLUCIONES
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Para preparar una solución de un soluto dado se puede usar el soluto puro (generalmente sólido) o una solución concentrada de él en el mismo solvente (solución stock). Este último caso constituye una dilución. Para diluciones rige la relación:
V1 x C1 = V2 x C2 (balance de masa soluto) V1= volumen de la solución concentrada C1= concentración de la solución concentrada V2 =Volumen de la solución diluída C2 = concentración de la solución diluída C1 y C2 pueden ser unidades de concentración de cualquier sistema referido a volumen. Ejemplo: En un matraz aforado de 100 ml se colocaron 10 ml de una solución 2M de cloruro de sodio y se aforó con agua. ¿ Cuál será la concentración de la solución resultante? Nuestro sentido común nos dice que la respuesta será 0.2 M, ya que la solución se diluyó 10 veces. El cálculo según la relación dad sería: C2 = V1 x C1 / V2 = 10 ml x 2M / 100 ml 10 ml x 2M = 100 ml x XM donde X = 0.2 M
II pH Y TAMPONES ÁCIDOS Y BASES De acuerdo a la definición de Bronsted: 1. ÁCIDO: es un compuesto que tiende a ceder protones al medio. 2. BASE: es un compuesto que tiende a captar protones del medio. En medio acuoso, la reacción correspondiente de un ácido HA será:
HA + H2O
H3O + A-
U obviando la participación del agua:
HA
H+ + A-
(1)
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Considerando esta reacción en el sentido inverso, la especie A - puede captar protones. A- es la base conjugada de HA. Similarmente para una base B: B + H+ BH+ (2) BH+ es el ácido conjugado de B. Ejemplos de bases según Bronsted: los compuestos orgánicos básicos que deben su basicidad al grupo funcional amino.
FUERZA DE ÁCIDOS Y BASES Un ácido o una base fuerte es el que esta completamente disociado en solución. En cambio en ácido débil esta solamente parcialmente disociado y la base parcialmente protonada. Ácidos fuertes: HCl, HNO 3, HClO4, H 2SO4 (ambos protones), H3PO4 (solamente el primer protón que se disocia). Bases fuertes: NaOH, KOH, etc. Ácidos y bases débiles: prácticamente todos los ácidos y bases orgánicos pertenecen a este grupo.
ÁCIDOS Y BASES DÉBILES a. ÁCIDOS DÉBILES Consideramos a modo de ejemplo el ácido acético, HOAC. Fórmula estructural: CH3 - COOH Este ácido débil posee un solo protón ácido. En solución acuosa coexisten en equilibrio moléculas de la especie protonada con moléculas del anión acetato (Oac-) y protones. La relación entre la concentración de las especies nombradas a una temperatura determinada está dada por la constante de equilibrio de la reacción de disociación, llamada constante de acidez, K a:
HOAc
OAc-
Ka = [ OAc- ] [ H+ ] / [HOAc ]
+ H+
(3)
(4)
Ka del ácido acético a 25° C: 1.78 x 10 -5
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Se suele expresar la acidez a través del pK a en vez de usar Ka: pKa = - log Ka Ka de HOAc (25° C) = 4.75 Con el fin de comprender mejor el significado de la constante de acidez calcularemos la concentración de las especies presentes en una solución 0.1 M de HOAc. Según la ecuación 3
[ H+ ] = [ OAc ] = x [HOAc ] = 0.1 - x El valor numérico de K a indica que HOAc estará poco disociado, por lo tanto es lícito efectuar la siguiente aproximación:
[HOAc ] = 0.1 reemplazando en la expresión de K a ( ver recuadro) (4)
Ka = x2 / 0.1 = 1.78 x 10-5 X = 1.33 x 10 -3 M Es decir, en nuestra solución: la [HOAc ] es virtualmente 0.1 M, en tanto que la concentración de [OAc- ] y de [ H+ ] es 1.33 mM. Una vez conocida la concentración de H + se puede calcular el pH de una solución de ácido acético 0.1 M empleando la siguiente fórmula: pH = - log [H+] Por consiguiente, el pH de esta solución será a igual a – log (1.33 x 10 -3), vale decir pH = 2.88.
b. BASES DEBILES Para Una base débil B se puede definir también una constante. En este caso, la llamada constante de basicidad K b Kb = [ BH+ ] / [ B ] [H+ ]
(5)
Sin embargo, lo usual es caracterizar las bases débiles a través de la constante de acidez de su ácido conjugado BH+ ( invirtiendo la reacción 2 ). Para un par ácido / base conjugada se cumple:
Ka x Kb = Kw
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Siendo Kw = constante de disociación del agua
Kw = [H+ ] [OH- ] = 10-14 ( 25° C) ECUACIÓN DE HENDERSON – HASSELBACH En forma análoga a lo visto para el ácido acético ( HOAc), se puede generalizar para un ácido débil que denominaremos HA:
Ka = [A- ] [H+ ] / [HA ] Despejando H+ y aplicando log se obtiene la ecuación de Henderson – Hasselbach
pH = pKa + log [ A- ] / [ HA ]
(6)
Esta ecuación establece la relación entre pH, el pKa y la proporción de la especie protonada (HA) y la desprotonada ( A- ). Se usa para calcular el pH de la mezcla de un ácido débil con un ácido fuerte o una base fuerte de un ácido débil con su sal, mezclas tampón, etc.
SOLUCIONES TAMPÓN Cuando se titula una solución de HOAc con una solución de una base fuerte (NaOH), midiendo el pH después de cada adición se obtiene el siguiente gráfico, llamado curva de titulación : 14
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zona tamponante
0
punto de equivalencia
m l NaOH
Se aprecia que en un rango de pH alrededor de 4.75 (pka) el pH varía muy poco durante la adición de base, se trata de la zona tamponante del par HOAC / OAc- .
Las 3 reacciones involucradas son: 1. NaOH 2. OH- + H+
Na+ + OHH2O
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3. HOAc
OAc- + H+
La suma de las dos primeras reacciones hace disminuir la concentración de protones en la solución. Sin embargo, la tercera reacción simultáneamente repone parte de los protones neutralizados. El equilibrio de disociación de HOAc se desplaza hacia la formación de acetato. Para: pH = pKa ocurre que HOAC = OAc - (verifique esta aseveración) A medida que la concentración de la especie protonada HOAc en la solución se hace pequeña, el pH comienza a aumentar más fuertemente, hasta que la solución pierde su característica de tampón. Al titular una solución básica que contiene el anión acetato con un ácido fuerte se observa el mismo fenómeno. Estaríamos recorriendo nuestra curva de derecha a izquierda. Solución tampón (solución amortiguadora o buffer): es una solución cuyo pH se mantiene prácticamente constante cuando se le agregan pequeñas cantidades de ácido o base. Las soluciones tampón son sistemas formados por un ácido débil y su base conjugada o por una base débil con un ácido conjugado. Rango de un sistema tampón: es el rango de pH en el cual el sistema posee propiedades de tampón, esta dado por el pKa de la especie protonada. Un tampón es “bueno” aproximadamente 0.5 unidades de pH alrededor del pKa. Los valores de pKa para algunos tampones de uso común en bioquímica están contenidos en la tabla 1. También se usan mezclas de dos diferentes sistemas tampón, ejemplos: tampón tris / fosfato, trienolamina / dietalamina, etc. Capacidad de una solución tampón: la capacidad de una solución tampón indica la cantidad de ácido o de base que es capaz de absorber sin cambiar fuertemente su pH y depende de: 1. pH: es máxima para pH = pKa 2. Concentración: a mayor concentración, mayor capacidad tamponante.
TABLA 1
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COMPUESTO
pKa (20° C)
Ácido fosfórico (pKa 1)
1.96
Glicina
2.45
Ácido cítrico (pKa 1)
3.1
Ácido fórmico
3.75
Ácido acético
4.75
Ácido cítrico (pKa 2)
4.75
Ácido cítrico (pKa 3)
5.40
MES (ácido conjugado)
6.15
Imidazol (ácido conjugado)
7.00
Ácido fosfórico (pKa 2)
7.21
HEPES (ácido conjugado)
7.55
Trietanolamina (ácido conjugado)
7.77
TRIS (ácido conjugado)
8.08
Ácido fosfórico (pKa 3)
12.30
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SELECCIÓN DE UN TAMPÓN Para la selección de un sistema buffer adecuado se deben considerar las siguientes variables: a. El pH al cual deseamos trabajar b. La capacidad tamponante requerida Otros aspectos importantes a considerar son: c. Solubilidad de los compuestos Ejemplo: una desventaja de los buffer de fosfato es la baja solubilidad de sus sales. d. Variación del pH con la temperatura Ejemplo: una desventaja de los tampones de Tris es que su pH varía notoriamente con la temperatura. e. Volatilidad: algunos sistemas tampón presentan la desventaja de ser volátiles. Ejemplo: acetato de amonio, bicarbonato de amonio. f. Transparencia a la luz U.V. : cuando se desea detectar un compuesto por absorciometría, es necesario usar un buffer que sea suficientemente transparente (que no absorba) a al longitud de onda de la determinación. g. Interacciones: entre el sistema tampón sobre la actividad de determinada enzima.
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Observación: la concentración de un buffer es la suma de las concentraciones de la especie protonada y de la especie desprotonada. Ejemplo: se desea preparar un litro de buffer acetato 0.1 M de pH = 4.60 a partir de ácido acético 2 M y acetato de sodio. La ecuación de Henderson – Hasselbach permite calcular la razón de las concentraciones de HOAc y OAc - necesaria para que el pH de la solución sea igual a 4.60:
pH = pKa + log [ OAc- ] / [ HOAc ] Reemplazando el pka de HOAc y el pH: 4.60 = 4.75 + log [ OAc- ] / [ HOAc ] log [ OAc- ] / [ HOAc ] = - 0.15 lo que implica : [ OAc - ] / [ HOAc ] = 0.708 Por otra parte:
[ HOAc ] + [ OAc - ] = 0.1
(todas las concentraciones en concentración molar, M) [ HOAc] = 0.1 - [ OAc- ] Remplazando [ HOAc ] = 0.1 – 0.708 x [ HOAc] [ HOAc ] = 0.0585 M y por Resolviendo consiguiente, [ OAc- ] = 0.0415 M
En consideración a que se desea preparar un volumen igual a un litro, se necesitan 0.0415 moles de acetato de sodio. NaOAc : PM = 82 lo que implica que 0.0415 moles = 3.4 g. HOAc : se aplica la relación de las diluciones V1 = 1 L x 0.0585 M / 2 M = 0.0293 L = 29.3 ml Preparación de la solución: en un matraz aforado de 1 litro se colocan 3.4 g. de acetato de sodio más 29.3 ml de HOAc 2 M y se afora con agua destilada.
FOTOMETRIA : ABSORCIOMETRIA MONTAJE DE UNA TÉCNICA FOTOCOLORIMETRICA Principios de absorciometría de UV / visible
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La absorciometría aprovecha la propiedad de ciertos compuestos de absorber radiación electromagnética. Los diferentes tipos de radiación electromagnética: rayos X, luz ultravioleta (UV), luz visible, luz infrarroja, ondas de radio. Etc., se propagan a la misma velocidad, pero difieren en longitud de onda y frecuencia. Para estas radiaciones se cumple la siguiente expresión matemática.
c =
x
c = velocidad de la luz en el vacío λ = longitud de onda ν = frecuencia El ojo humano detecta la radiación en un rango de longitudes de onda de 400 a 800 nm, llamada luz visible ( 1 nm = 10 -9 m ). La luz del espectro visible y del UV cercano (200 a 400 nm) posee la energía necesaria para producir transiciones de electrones desde un orbital molecular de menor energía a otro de mayor energía de ciertos compuestos, llamados cromóforos. Las sustancias coloreadas absorben luz visible, su color corresponde a la radiación no absorbida: la luz solar es blanca, ya que contiene radiación de todo el espectro visible, además de otras radiaciones.
LEY DE LAMBERT - BEER La ley de Lambert – Beer es la ley fundamental de la absorciometría, ya que relaciona la absorción de la luz con la concentración de las soluciones. Consideremos un haz de luz monocromática (luz de una solo longitud de onda) que atraviesa una solución de un compuesto contenido en un recipiente de vidrio.
El siguiente esquema ilustra la situación: Solución conc. c I0 -------------------------------- > Luz incidente
I ----------------------------- > Luz transmitida b
I0.: intensidad de haz incidente I : intensidad de haz transmitido b: camino óptico
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Si el compuesto absorbe a una longitud de onda dada, I es menor que I 0 . Cuanto mayor es el número de moléculas de este cromóforo encontradas por el haz de luz en su camino, menor será la intensidad de la luz transmitida. Dicho número de moléculas depende de la distancia recorrida a través de la solución (camino óptico) y de la concentración. La relación entre estos parámetros esta dada por la ley de Lambert – Beer :
I = I0 x 10-
bc
(1)
La forma de esta ley que se usa en la práctica es mas sencilla y se obtiene aplicando logaritmos y reordenando:
Log I0 / I =
bc
Se define como absorbancia (A) de la solución:
A = Log I0 / I
(2)
Luego:
A= bc (3) Ley de Lambert - Beer Por conveniencia se usa el siguiente sistema de unidades: b = camino óptico en cm. c = concentración en M ε = coeficiente de extinción molar, en cm -1 x M-1 El coeficiente de extinción molar, ε , a una longitud de onda dada es una característica propia del cromóforo y representa la probabilidad de que el cromóforo absorba la radiación. Para explicar el significado de ε se suele señalar que es igual al valor numérico de la absorbancia que tendría una solución 1 M del cromóforo si el camino óptico es igual a 1 cm. Es importante recalcar el carácter hipotético de esta afirmación, ya que normalmente no es posible preparar soluciones de concentración 1 M de los cromóforos ( si el PM es alto, 1 M es una concentración extremadamente alta), y por otra parte el orden de la magnitud de los ε corresponde a valores muy superiores al rango de absorbencias medibles en la practica. Los coeficientes de extinción pueden tomar valores hasta 1000.000 cm –1 M-1 e incluso mayores.
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La ley de Lambert – Beer indica que la absorbancia a una λ dada aumenta en forma lineal con la concentración (con b = cte.), mientras que la transmitancia disminuye en forma exponencial:
A
T
pendiente = 1
T = 10-(cb
C C
Figura N ° 1
El gráfico de la absorbancia de un cromóforo en solución en función de la longitud de onda se denomina espectro de absorción o espectrograma de absorción. Un espectro de absorción se obtiene variando λ para b y c constantes, y por lo tanto representa la variación de A con ε (según (3) ). En la figura N° 2 se muestra el espectro de absorción de la riboflavina. 10
1
Figura N° 2 espectro de absorción de riboflavina(en fosfato de sodio, pH 7.0) El espectro de absorción de UV/ visible es característico para un cromóforo determinado, por lo tanto se puede usar para su identificación. Las características espectroscópicas se pueden resumir indicando la posición de los máximos de las bandas de absorción ( λ máx ) con los correspondientes. Por ejemplo, para riboflavinas a pH 7.0:
máx. 266 373 445
( M-1 cm –1) 31.800 10.400 12.500 15
La riboflavina tiene color amarillo, debido a que su única banda en la región del visible a 445 nm, corresponde a absorción de luz azul.
INSTRUMENTOS DE MEDICIÓN Los componentes básicos de todos los instrumentos que se usan en absorciometría de UV / visible son:
− − − − −
Fuente de luz Filtros o monocromador, que permite seleccionar la longitud de onda. Portador de muestra Detector Dispositivo que permite la lectura de la medida directamente o inscriptor
Se pueden distinguir dos tipos de instrumentos: a. Fotómetros de filtro: la selección de la longitud de onda se realiza mediante filtros intercambiables. b. Espectrofotómetros: poseen un monocromador; son más sofisticados que los fotómetros de filtro. Por otra parte se distinguen instrumentos que operan en el rango visible solamente y otros que abarcan el UV y el visible (tiene 2 fuentes de luz ).
LA FUENTE DE LUZ No existe una fuente de luz que proporcione radiación de todo el rango espectral UV / visible de suficiente intensidad, por consiguiente, se usan fuentes diferentes: Fuente de luz visible: lámpara de tungsteno. Sirve para aproximadamente.
340 – 850 nm
SELECCIÓN DE LA LONGITUD DE ONDA FILTROS
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No proporcionan luz realmente monocromatica, sino que permiten el paso de un cierto rango de longitudes de onda alrededor de la longitud de onda máxima transmitancia del filtro.
MONOCROMADORES Poseen un elemento dispensor, que puede ser un prisma o una red de distracción. El elemento dispensor separa los haces de luz de diferente longitud de onda. Un sistema de espejo permite dirigir el haz de luz de la longitud de onda deseada hacia la ranura de salida. Al cerrar más la ranura aumentará la monocromaticidad de la luz, pero siempre pasara un cierto rango de longitud de onda. En la práctica se considera que un espectrofotómetro opera con luz prácticamente monocromática. La calidad de un espectrofotómetro depende en parte importante de esta característica. Un monocromador permite variar la longitud de onda en forma continua, condición necesaria para obtener espectros de absorción. Con un fotómetro de filtro no es posible obtener espectros de absorción.
PORTADOR DE MUESTRA Allí se ubica la o las cubetas con las soluciones de muestra de referencia. Las cubetas son de vidrio o plástico (para el visible) o cuarzo (para el UV). DETECTOR Los detectores son del tipo fotoeléctrico: al incidir luz producen corriente eléctrica, de intensidad proporcional a la intensidad de la luz. Se distinguen celdas de capa barrera (solamente para fotómetros de filtro). Fototubos y tubos fotomultiplicadores. LECTURA O REGISTRO La mayor parte de los instrumentos indican o registran el valor de la absorbancia. Si el instrumento informa la transmitancia se calcula A usando la ecuación (5). La absorbancia se mide en 3 cifras después de la coma. El rango de A medible es de 0.000 hasta 1.500 o hasta 2.000 o 3.000 (dependiendo del instrumento). APLICACIÓN DE LA ABSORCIOMETRÍA EN EL ANÁLISIS CUANTITATIVO 1. DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE UN CROMOFORO PURO Midiendo la absorbancia de la solución problema en un espectrofotómetro y conociendo el correspondiente se puede calcular la concentración. Normalmente, se usa la longitud de onda del máximo de una banda, cuyo valor se encuentra en la literatura. Un método alternativo es construir una curva de calibración de A en función de C, que será una recta si se cumple la ley de Lambert – Beer (ver Fig. 1). Interpolando en la recta con la absorbancia de la solución problema se puede determinar su 17
concentración. La ventaja del método con curva de calibración es que permite usar también un fotómetro de filtro. 2. DETERMINACIONES A TRAVÉS DE UNA REACCIÓN QUÍMICA O “TEST” Compuestos que no pueden ser determinados en forma directa porque no absorben convenientemente, se hacen reaccionar con un reactivo específico formándose un cromóforo. Se realiza en paralelo el test con la muestra problema y con una o varias soluciones del compuesto a determinar, de concentración conocida (soluciones patrón). Posteriormente, se mide la absorbancia. Esta absorbancia será proporcional a la concentración del compuesto que se va a determinar dentro de cierto rango de concentraciones. Si se usó solamente una solución, se calcula la concentración por proporción directa: C (problema) C (estándar)
=
A (problema) A (estándar)
Si se usaron varias soluciones estándar se construye la curva de calibración del test, y se interpola en ésta. Este grafico será una recta cuya pendiente se ha llamado factor de calibración , k:
A=kxC En forma alternativa a interpolar en la recta se puede calcular C a partir de la absorbancia medida dividiendo por el factor de calibración.
CASOS EN LOS CUALES SE REALIZA UN TEST 1. El compuesto no absorbe en todo el UV – visible: se realiza el test, generándose un cromóforo, el cual generalmente absorbe en el visible (se genera un color) o excepcionalmente solamente en el UV. Ejemplo: determinaciones de azúcares. 2. El compuesto absorbe en una región espectral (generalmente UV) en la cual no se puede efectuar la determinación porque la solución problema es una mezcla que contiene otros compuestos que absorben en la misma región que el compuesto a determinar y / o el instrumento de la mediada permite medir solamente en el rango visible. Ejemplo: determinación de proteínas. Cuando se monta un método fotocolorimétrico, pueden existir tres posibilidades: a. Que la sustancia sea coloreada y que presente un máximo de absorción característico solo para ella y por lo tanto, esta podría usarse para su determinación fotocolorimétrica. b. La sustancia en solución es incolora, y por lo tanto, se aprovecha alguna propiedad química de ella (poder reductor, oxidante, de sustitución de
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grupos, etc. ) para desarrollar una reacción coloreada que sirve entonces para determinar su concentración. c. La sustancia en solución, a pesar de ser incolora, presenta un máximo de absorción característico, generalmente a longitudes de onda cortas (UV) que puede ser usada para su determinación.
BIBLIOGRAFÍA • H. WILLARD, L. MERRIT, J.DEAN “INSTRUMENTAL METHODS OF ANÁLYSIS” • G. EWING “INSTRUMENTAL METHODS OF CHEMICAL ANLYSIS” • A. STROBEL “INSTRUMENTACIÓN QUÍMICA” • S.B. BROWN, ED, “AN INTRODUCTION TO SPECTROSCOPY FOR BIOCHEMISTS”
TRABAJO PRÁCTICO I.- DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS INTRODUCCIÓN Se han descrito un gran número de métodos para la cuantificación de proteínas. Todos representan ventajas y desventajas, la selección de uno en particular va a depender de la proteína que deseamos cuantificar, la sensibilidad deseada, posibles interferencias y la sencillez del método. En general, los métodos están basados en reacciones químicas, absorción ultravioleta, reacciones de fluorescencia y determinación del nitrógeno. 19
METODO TURBIDIMÉTRICO Las proteínas precipitan cuando se mezclan con soluciones diluidas de ácido tricloroacético, sulfosalicílico o ferricianuro de potasio en ácido acético. Este método tiene desventajas ya que no todas las proteínas precipitan en la misma cantidad e interfieren otras sustancias precipitables por ácidos nucleicos. La ventaja que presenta en uso es la rapidez de la determinación. El rango útil de trabajo es entre 0.1 y 0.3 mg de proteínas agregadas. MÉTODOS COLORIMÉTRICOS El método colorimétrico más difundido es el método de Löwry, en que el color final de la reacción, es el resultado de la reacción de Biuret de la proteína con el ión cobre en medio alcalino y la reducción del reactivo fosfomolíbdico – fosfotúngstico por la serina y triptófano presentes en las proteínas. Los métodos de Biuret y Bradford se discutirán más adelante en esta guía y son los que se realizarán en el presente trabajo práctico. MÉTODOS DE ABSORCIÓN ULTRAVIOLETA La mayoría de las proteínas tiene un máximo de absorción a 280 nm, debido primariamente a la presencia de tirosina y triptófano, y secundariamente, la fenilalanina y cisteína. Por consiguiente, el coeficiente de extinción molar a 280 nm varía de una proteína a otra debido a su composición aminoacídica. Más aún, los ácidos nucleicos que muchas veces están como contaminantes en las preparaciones de proteínas, aunque tiene un máximo de absorción a 260, también lo hacen a 280 nm, falseando la lectura de las proteínas. La razón de absorbancia a 280 nm / 260 nm ha sido usada por Wargurg y Christian para eliminar la interferencia de ácidos nucleicos en la determinación de proteínas. El rango útil de trabajo es entre 0.1 y 0.6 mg / ml. Por debajo de 230 nm, la extinción de una solución de proteínas sube precipitadamente alcanzando un máximo a 190 nm, se debe principalmente al enlace peptídico. En la práctica es más conveniente medir la extinción a 210 nm, ya que el coeficiente de extinción molar a esta longitud de onda es de cerca de 200 para la mayoría de las proteínas. Todas tienen una absorción específica similar, pues el contenido de enlaces peptídicos es semejante. Se han descrito una serie de métodos que utilizan absorbancias menores a 240nm, sin embargo, se obtiene mejores resultados con el método de Scopes, en el cual se efectúan lecturas de absorbancia a 205 y 280 nm, pudiéndose calcular el coeficiente de extinción molar de una proteína a 205 nm con bastante precisión.
CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS POR EL MÉTODO DE BIURET El reactivo de Biuret (sulfato cúprico en medio alcalino) reacciona con un compuesto de contiene dos o mas enlaces peptídicos dando una coloración
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violeta. El color desarrollado se debe a un complejo de coordinación entre el Cu y cuatro átomos de nitrógeno que provienen de dos cadenas peptídicas adyacentes. Los dipéptidos y los aminoácidos (excepto la serina y treonina) no dan esta reacción. La reacción no es absolutamente específica para los en laces peptídicos, interfiriendo una serie de compuestos en la determinación de proteínas como por ejemplo, sales de amonio. Mediante este método se pueden valorar proteínas en un rango de 1 a10 mg.
MATERIALES Reactivo Biuret: colocar 1.5 g, de CuSO 4 x H2O y 6 g. de tartrato de sodio y potasio (NAKC4H4O6 x 4 H2O). Agregue alrededor de 500 ml de agua destilada y agitar hasta dilución. Agregue lentamente y agitando constantemente, 300 ml NaOH 2.5 N. Las dos soluciones deben estar a temperatura ambiente. Agregar 1.0 gr., de yoduro de potasio y agitar hasta que este totalmente disuelto. Llevar a un volumen final de 1000 ml y guardar en un frasco de polietileno. Este reactivo es estable indefinidamente. Spectronic 20 (540 nm) Muestra de albúmina: solución patrón de albúmina 10 mg / ml. CURVA DE CALIBRACIÓN PARA PROTEÍNAS 1. Disponga de seis tubos y coloque en ellos volúmenes de solución estándar que contengan 2; 4; 6; 8 y 10 mg de albúmina. El sexto tubo úselo como blanco; 1 ml de agua destilada en vez de albúmina. 2. Enrase a 1 ml de volumen final con agua destilada. 3. Agregue 4 ml a cada tubo del reactivo de Biuret 4. Deje desarrollar el color durante 30 min., luego mida A a 540 nm DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS DE LA MUESTRA PROBLEMA 1. En un tubo coloque un volumen X (hasta 1 ml) de la muestra a determinar y enrasar a 1 ml de volumen final con agua destilada. 2. Agregue 4 ml del reactivo de Biuret 3. Deje desarrollar color durante 30 min. y mida A 540 nm.
CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS POR EL MÉTODO DE BRADFORD Este método utiliza la propiedad del colorante azul de Coomasie G – 250 de unirse a la proteína. El colorante sólo presenta un máximo de absorción a 465 nm mientras que cuando está unido a la proteína el máximo es de 595 nm. La coloración en presencia de proteínas es lineal en el rango de 0 30 µ g, Interfieren en la determinación, detergentes y álcalis. Se recomienda leer a los 10 min. de iniciada la reacción, debido a que el color no es estable en el tiempo, puesto que la proteína comienza a precipitar debido al medio ácido. Este efecto es especialmente significativo a altas concentraciones de proteínas.
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MATERIALES Reactivo de Bradford: disolver 100 mg. de azul de Coomasie G –250 (sigma) en 50 ml de etanol 95 % (siempre queda un ligero residuo insoluble). Agregue lentamente 100 ml de ácido fosfórico 85 % p /v y luego complete a 100 ml con agua destilada. Dejar el reactivo en reposo todo un día y luego filtrar. El reactivo debe filtrarse toda vez que presente residuo o que el blanco de reactivo leído contra agua presente una absorbancia mayor a 0.5. Para 250ml de Bradford: 25 mg de azul de Coomasie, 12.5 ETOH 95 % , 25 ml H3PO4. Solución patrón de albúmina 100 µ g / ml: como se trata de una solución patrón diluido, debe tenerse extremo cuidado en la pesada, y evitar que la albúmina este con humedad. Si este es el caso puede secarse en estufa a temperaturas moderadas (30 °C).
CURVA DE CALIBRACIÓN 1. Disponga de 7 tubos y coloque en cada uno volúmenes adecuados que contengan 5; 10; 15; 20; 25; 30 µ g de albúmina, el séptimo tubo úselo como blanco y agregue 0.8 ml de agua destilada. 2. Complete todos los tubos a 0.8 ml con agua destilada. 3. Agregue 0.2 ml del reactivo de Bradford 4. Espere 10 min. y mida A 595 nm. DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS EN UNA MUESTRA PROBLEMA 1. Coloque en un tubo un volumen X de la muestra a determinar (hasta 0.5 ml) y enrasar a 0.5 ml de volumen final con agua destilada. 2. Agregue 5 ml de reactivo de Bradford. 3. espere 10 min. y lea la A a 595 nm utilizando como blanco el séptimo tubo de la curva de calibración. BIBLIOGRAFÍA − Skoog & West. Análisis Instrumental − Clark, J y Switzer, R. (1977): Experimental Biochemistry. Ed. Freeman & Company 2° Edición Pág. 75 – 77. − Bradford, M (1976) Analytical Biochemistry 72, Pág. 248 – 254. II.- DETERMINACIÓN DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE LA FOSFATASA ÁCIDA DE GERMEN DE TRIGO INTRODUCCIÓN Reacción Enzimática Una enzima es una proteína que cataliza una reacción química específica, es decir, aumenta su velocidad de reacción. La figura 1 muestra la variación de la concentración de producto de una reacción enzimática en el tiempo (cinética), así como también la desaparición de sustrato.
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La pendiente de esta curva corresponde a la velocidad de la reacción . Se aprecia que durante cierto tiempo (inicio) la velocidad se mantiene constante (la curva es una recta) y posteriormente decae.
Figura N° 1. Curva de progreso de la reacción Para el estudio de la reacciones enzimáticas siempre se determinan velocidades iniciales (V0), es decir, se utiliza unánimemente aquel intervalo de tiempo en el cual la velocidad se mantiene constante. La velocidad inicial se define como:
V0 = cantidad de sustrato consumido ( moles) Tiempo (min.) V0 = cantidad de producto formado ( moles) Tiempo (min.) Existen dos tipos diferentes de ensayos enzimáticos: 1. Ensayo de tiempo fijo: se detiene después de un tiempo determinado y se mide la concentración de producto formado o sustrato consumido. 2. Ensayo cinético: se determina la concentración de sustrato o producto en forma continua o a una serie de tiempos muy próximos entre sí, obteniéndose una curva como la figura 1. Una reacción catalizada por una enzima aumenta su velocidad con el incrementos de la concentración de sustrato hasta un nivel en que por más sustrato que se adicione aumentará la velocidad de la misma. Este fenómeno se denomina saturación y alcanza la velocidad inicial máxima V max..
Figura N° 2: Variación de la velocidad inicial ( V 0 ) con la concentración de sustrato (S). En este trabajo práctico se determina la actividad enzimática de una fosfatasa. En general, las fosfatasas son enzimas que catalizan la hidrólisis de fosfatos
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monoésteres con la consecuente liberación de fosfato orgánico. Este tipo de reacciones esta muy distribuido en la naturaleza. La reacción es la siguiente:
O
R
O
P
Ez O-
+
H2O
ROH + Pi
O
Las fosfatasas en general presentan un amplio rango de especificidad de sustrato y se clasifican como ácidas o alcalinas, basándose en su pH óptimo de reacción. Las hojas de las plantas son particularmente ricas en fosfatasas ácidas y su actividad comúnmente aumenta con la germinación, aunque su rol fisiológico no se conoce bien. La enzima a utilizar en el presente trabajo práctico, proviene de una fracción cruda de germen de trigo, la cual será empleada para realizar un ensayo enzimático y en otra oportunidad para estudiar las propiedades cinéticas de ésta. En el ensayo para determinar actividad, se usará un sustrato artificial, el p–nitrofenil fosfato (NPP). El grado de hidrólisis de éste se determinará fotométricamente cuantificando el p-nitrofenol liberado. En solución alcalina el ión p–nitrofenolato absorbe la luz fuertemente en la región de los 405 nm.
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL Materiales − Amortiguador citrato de sodio 0.1 M; EDTA 0.15 M pH 5.0 − Sustrato p–nitrofenil fosfato de sodio (NPP) 2.5 mM − Solución de p–nitrofenol 60 µ M en NaOH 0.02 M − Solución de 0.02 M NaOH − Solución stock de enzima 5 mg / ml en BSA 0.1 % diluída 1:20 − Baño termoregulado a 37° C EXPERIENCIA A Curva de calibración para la formación de p–nitrofenol Prepare 6 tubos que contengan 0; 1.00; 2.00; 3.00; 4.00; 5.00 ml de una solución de p–nitrofenol 60 µ M y enrase cada uno de los tubos con NaOH 0.02 M a 6.00 ml, de volumen final. Mezcle bien, transfiera a la cubeta y lea absorbancia a 405 nm. Como tubo blanco utilice el tubo que no contiene p–nitrofenol y calibre el equipo. Grafique A405 versus los µ moles de p–nitrofenol en cada uno de los tubos. Use esta curva estándar para analizar sus datos cinéticos. EXPERIENCIA B Determinación de la actividad de la fosfatasa ácida de Germen de trigo Ya que el ensayo de la fosfatasa se realiza a tiempo fijo, es necesario determinar la dilución correcta de enzima a usar ó el tiempo de ensayo con una misma dilución de enzima.
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Prepare un tubo que contenga 2.0 ml de amortiguador citrato de sodio 0.1 M; EDTA 0.15 M, pH 5.0 y 2.0 ml de sustrato NPP 2.5 mM. A continuación, preincube el tubo en un baño termoregulado a 37°C por un par de minutos y luego agregue 1.0 ml de la dilución de la enzima (1:20). Mezcle e inmediatamente saque una alícuota de 0.5 ml adiciónelo a un tubo que contenga 5.5 ml de una solución de NaOH 0.1 M. Este es un control denominado tiempo cero de la reacción , que le permite calibrar el equipo de manera que solo mide la absorbancia del producto liberado enzimaticamente. En paralelo prepare otros tubos que contengan la misma mezcla de reacción que el tiempo cero, agregue 1.0 ml de enzima e incube respectivamente 15 y 30 min., luego saque una alícuota de 0.5 ml de cada uno de los tubos y adiciónela a los tubos que contengan 5.5 ml de NaOH 0.1 M. Finalmente determine la absorbancia (405nm) de cada uno de los tubos utilizando como blanco el tiempo cero. Recuerde que el ensayo se realiza en un volumen final de 5 ml y que cada una alícuota de 0.5 ml de cada uno de los ensayos es diluída a 6 ml para medir absorbancia. i)
Una vez realizadas las medidas correspondientes debe completar en forma de tabla, lo siguiente:
N° tubo
A405
1 2 3 4
0.0
moles Pi 0.0
Velocidad ( moles / min.) 0.0
Los µ moles de Pi liberados por la enzima se calcula utilizando la curva estándar para el producto p–nitrofenol. ii)
Además de la actividad de la enzima calcule al actividad especifica. Al actividad específica esta definida como unidades / mg proteína. iii) Calcule la concentración final en el ensayo de cada uno de los componentes (amortiguador, EDTA, NaOH, enzima, etc,).
BIBLIOGRAFÍA − Clark, J y Switzer, R. (1977): Experimental Biochemistry. Ed. Freeman & Company, NY. 2° Edición Pág. 77 – 85; 105 – 108. − Lehninger, A y col. Principios de Bioquímica. − Stryer, A. Bioquímica.
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II.- CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN Es una técnica útil para separar compuestos de diferente peso molecular. La base de la separación del método es la propiedad del gel (Sephadex) de fraccionar solutos de acuerdo a su tamaño molecular. Cuando se coloca una solución acuosa con macromoléculas que difieren en tamaño y se pasa a través de una columna empacada con gel de dextrano (Sephadex) las moléculas más grandes son incapaces de penetrar los poros del gel (se excluyen) y se mueven más rápido a través de la columna (tienen menos trayecto que recorrer) que las pequeñas. Estas últimas, difunden a través de los poros según su tamaño. Las diferentes moléculas eluyen de la columna en una secuencia decreciente en tamaño molecular. MATERIALES − Columna de vidrio 1.3 x 15 cm. − Sephadex G – 75 − Muestra: azul dextrano 0.5% PM (x), y dicromato de potasio (K 2Cr 2O7) al 0.5%.
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MONTAJE DE LA COLUMNA Ponga una mota de lana de vidrio en el fondo de la columna con la ayuda de una bagueta. Mediante una pinza, cierre la salida de la columna y llénela con agua destilada. Soltando la pinza deje escurrir el agua hasta la mitad de la columna. Este procedimiento evita que queden burbujas a la salida de la columna. Si hubiera quedado alguna burbuja de aire, repita el procedimiento de nuevo. A la columna llena hasta la mitad de agua, comience a agregar el Sephadex hasta llenarlo, con la ayuda de una pipeta, usándola en forma invertida. Espere unos minutos hasta que comience a sedimentar el gel. Abra la pinza de salida suavemente hasta obtener un flujo de 1 ml / min. como máximo. Continúe agregando el Sephadex hasta completar una altura de 12 cm en la columna. Equilibre la columna haciéndole pasar 2 volúmenes de tampón pH 7.
COLOCACIÓN DE LA MUESTRA Una vez equilibrada la columna, con ayuda de la pipeta pasteur retire el agua de ella. Cuando está a punto de empezar a secarse la superficie del gel, agregue 0.2 ml de una muestra con una pipeta Pasteur. Una vez que la muestra ha entrado al gel, agregue un poco de tampón lavando las paredes y espere que penetre. Luego agregue más tampón. ELUCIÓN DE LA MUESTRA Eluya la muestra haciendo pasar tampón por la columna igual que cuando la equilibró. Colecte fracciones de aproximadamente 1 ml.
CUESTIONARIO 1. Qué puede concluir de las distintas fracciones que ha colectado? 2. de acuerdo al resultado que Ud. Obtuvo ¿Qué podría decir, en forma comparativa, del peso molecular de los compuestos? 3. Diseñe un método experimental que le permita cuantificar la muestra eluída. BIBLIOGRAFÍA − Clark, J y Switzer, R. (1977): Experimental Biochemistry. Ed. Freeman & Company, NY. 2° Edición Pág. 20 – 27. − Lehninger, A (1982). Principles Biochemistry. Capitulo 6. Pág. 127 – 129.
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III.- CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IONICO La absorción de las proteínas a intercambiadores iónicos de celulosa, involucra principalmente, la formación de uniones iónicas múltiples entre los grupos cargados de la proteína y los grupos disponibles de carga opuesta del absorbente. La separación cromatografíca depende, por lo tanto, de la elución diferencial de las proteínas absorbidas por una variedad de técnicas, basadas ya sea, en la alteración de la carga de la proteína (pH) o, en el uso de agentes capaces de competir con la proteína absorbida por los sitios cargados en el absorbente.
Materiales − Columna de vidrio de 10 ml − DEAE – celulosa (Dietilaminoetil celulosa) − Muestra albúmina 20 mg / ml. − Tampón fosfato de sodio 20 mM pH 7.0 − Soluciones NaCl 0.05 M; 0.1 M; 0.2 M; 0.5 M en tampón fosfato de sodio 20mM pH 7.0 28
MONTAJE DE LA COLUMNA Ponga una mota de lana de vidrio en el fondo de la columna con la ayuda de una bagueta. Mediante una pinza cierre la salida de la columna y llene ésta con tampón fosfato 20 mM pH 7.0. Soltando la pinza, deje escurrir el tampón hasta la mitad de la columna. Este procedimiento evita que queden burbujas a la salida de la columna. Si hubiera quedado alguna burbuja de aire, repita el procedimiento de nuevo. A la columna llena hasta la mitad con tampón, comience a agregar DEAE, previamente equilibrada en el tampón fosfato. Abra la pinza dejando escurrir tampón, sin dejar que se seque el lecho de celulosa que va formando. Continúe agregando celulosa hasta completar un lecho de aproximadamente 4 ml. Haga pasar 20 ml de tampón por la columna con el fin de equilibrarla.
COLOCACIÓN DE LA MUESTRA Una vez equilibrada la columna, deje escurrir el tampón, cuando esté a punto de empezar a secarse la superficie del lecho de la columna, agregue 1 ml de muestra. Una vez que la muestra ha entrado al lecho de la columna, agregue un poco de tampón lavando las paredes y espere a que penetre. Luego lave la columna con 12 –15 ml de tampón recolectando fracciones de aproximadamente 3 ml. ELUCIÓN DE LA MUESTRA Con el fin de eludir la muestra, agregue sucesivamente de 15 ml de las soluciones NaCl en concentraciones crecientes. Colecte el eluído de la columna en fracciones de 3 ml cada una. CUANTIFICACIÓN DE LA MUESTRA EN EL ELUATO La cuantificación de la proteína en las distintas fracciones se realizará por la técnica de Biuret. Para ello tome 1 ml de las fracciones impares y agregue 4 ml de reactivo de Biuret. Prepare el blanco correspondiente y un par de estándares apropiados (4 y 8 mg de albúmina). Con los resultados de concentración de proteínas, construya un gráfico en que en la ordenada se señale el número de fracción y en la abscisa la concentración de proteínas por fracción. Además, indique con una flecha los cambios de solución salina.
CUESTIONARIO 1. Qué puede Ud. concluir del experimento realizado? 2. Qué resultado esperaría, si la columna se equilibrara con tampón fosfato 20 mM pH 7.0 u NaCl 500 mM ? (la muestra aplicada está disuelta en el mismo tampón).
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Qué resultado esperaría Ud. si la columna se equilibrara con tampón pH 5.0? [pI (pto isoeléctrico) de albúmina es 5]. 4. Si se realiza el mismo experimento utilizando leche como muestra, Qué resultados esperaría? (Podría identificar las fracciones que contienen lacto albúmina). Discuta. 5. Se tiene una solución que contiene una enzima más lacto albúmina. Si a Ud. le interesa sólo la enzima y debe remover la lacto albúmina, como realizaría el experimento si no posee columna? 3.
BIBLIOGRAFÍA − Clark, J y Switzer, R. (1977): Experimental Biochemistry. Ed. Freeman & Company, NY. 2° Edición Pág. 16 – 20. − Lehninger, A (1982). Biochemistry. 2° edición. Editores Word. Capitulo 6. Pág. 127 – 129. − Freifelder, D. (1982) Physical Biochemistry . 2a. Edición. Editores Freeman & Company.
IV.-ELECTROFORESIS El término electroforesis describió originalmente la migración de partículas cargadas a través de un medio líquido o semisólido bajo la influencia de un potencial o campo eléctrico. En la actualidad, el término se refiere a cualquier técnica por la cual las macromoléculas se separan unas d otras en gradientes de potencial eléctrico en base a diferencias en sus cargas netas, sin importar el medio de conducción. Las proteínas son polielectrolitos y por lo tanto, son susceptibles de ser analizadas electroforeticamente. Normalmente, las cadenas laterales de ciertos aminoácidos son los sitios ionizables en la proteínas (arginina, pKa = 12; lisina; pKa = 9, 7 – 10, 7; cisteína, pKa = 8, 5 – 9, 5; tirosina, pKa = 8, 5 – 10, 0; histidina, pKa = 6, 0 – 7 , 0; ácido aspartico y glutámico, pKa = 3, 9 – 5, 0) contribuyen a la carga neta de las proteínas, como también algunos grupos prostéticos (ejemplo: NAD+). Otras
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moléculas, además de proteínas, pueden ser separadas por electroforesis después de formar complejos con los iones inorgánicos u otros grupos cargados. Los principios de la electroforesis son simples: si dos electrodos se sumergen en una solución que contiene un electrolito y una suspensión de macromoléculas cargadas, éstas se movilizaran hacia el electrodo de signo opuesto con una fuerza proporcional a la magnitud de la carga en la macromolécula y a la diferencia del potencial eléctrico aplicado. Debido a que cada una de las partículas que migran van a enfrentar una resistencia friccional a su movimiento, cada una alcanzará rápidamente una velocidad máxima de migración. Por lo tanto, si una mezcla de estas macromoléculas se expone a un campo eléctrico constante, se alcanzaran distintas velocidades máximas parta partículas de distintas cargas netas. Además de la carga neta y el campo eléctrico, hay muchos otros factores que influencian la rapidez de la migración electroforética de proteínas, incluyendo tamaño, pH y la naturaleza del medio a través del cual ocurre la migración. La velocidad a la cual la proteína migra hacia uno u otro electrodo durante la electroforesis se llama movilidad electroforética (usualmente expresada en cm 2 seg.-1 volt-1 ) y es dependiente del número relativo de cadenas laterales de aminoácidos cargados positiva y negativamente. El hecho que una cadena lateral de un aminoácido tenga o no carga, es a su vez determinado en parte por el pH de la solución de proteínas. A medida que el pH baja, grupos cargados negativamente como COO - secundarios del ácido aspartico o glutámico y el O - de la tirosina se protonan y por lo tanto, las cargas negativas se neutralizan. Al mismo tiempo, algunos grupos amino secundarios de la lisina y arginina pueden aceptar protones adicionales, aumentando así, el número de cargas positivas asociadas a la proteína. Por el contrario, si el pH aumenta, los protones se disocian de las cadenas laterales y la proteína se hace mas negativa. Por consiguiente, el número y tipo de cargas asociadas a cadenas laterales a aminoácidos de una proteína están determinados por el pH. A bajo pH, las proteínas tienden a llevar más cadenas laterales positivas que negativas, por lo tanto la carga neta será positiva y la migración en una electroforesis será hacia el cátodo (electrodo negativo). A pH alto, las cadena laterales negativas predominan y la proteína migra hacia el ánodo. De lo anterior, se deduce que para cada proteína existirá un pH en el cual el número de cargas positiva y negativas sea igual. Si la electroforesis es realiza a este pH, no habrá migración, debido a que la proteína no tiene carga neta. Valores de pH del solvente por encima del pI (punto isoeléctrico) hacen que la carga neta de la proteína esa más negativa y su movilidad electroforética hacia el ánodo aumenta. En cambio, valores de pH más bajos que el pI hacen que la proteína sea más positiva, por ende, la movilidad electroforética aumenta hacia el cátodo. Debido a que el pH influencia marcadamente la movilidad electroforética, es importante 31
mantener el pH constante durante la electroforesis. Esto se lleva a cabo incluyendo tampones en las soluciones electrolíticas. La electroforesis en geles de poliacrilamida es quizás el sistema electroforético mas útil y versátil en el análisis y separación de proteínas, moléculas pequeñas de RNA y fragmentos de DNA. El soporte poliacrilamida ha reemplazado otros medios debido a que el tamaño del poro del gel se puede controlar variando la concentración de policriamida y además, la absorción de proteínas es despreciable. El gel de poliacrilamida es prepara entrecruzando acrilamida en N, N-metilenbisacrilamida y el resultado es una matriz inerte, ósea un gel continuo a través del cual migran las macromoléculas de interés, hay, básicamente, dos formas de realizar experimentalmente una electroforesis en geles de poliacrilamida: en un tubo cilíndrico de vidrio o bien entre placas planas de vidrio. Los geles en placas han reemplazado casi totalmente a los geles en tubos, debido al gran número de muestras que pueden correrse en forma simultánea. Para una buena resolución, Ornstein y Davis implantaron la electroforesis discontinua, desarrollada alrededor de 1960. el termino discontinuo se refiere a que el sistema usa pH discontinuo. El gel se prepara en un tubo de vidrio cilíndrico o bien entre dos placas planas de vidrio. En ambos casos, existen dos regiones: gel espaciador y gel separador . El gel espaciador tiene una concentración de poliacrilamida menor, por lo que el tamaño del poro es mayor y esta preparado además, en un tampón de menor fuerza iónica y a distinto pH en comparación con el gel separador. El tamaño de poro más grande significa que las moléculas se moverán mas rápido en el gel espaciador. Similarmente, la fuerza iónica menor significa una mayor resistencia eléctrica, de manera que el campo eléctrico ( V/ cm) es mayor en este gel y eso permite a las moléculas desplazarse con mayor velocidad. Este movimiento rápido en el gel espaciador resulta en la acumulación de material entre el gel espaciador y el separador. Sin embargo, por razones que están mas allá del objetivo de este curso, los componentes individuales, aunque muy juntos, se ordenan en “pilas” por orden de movilidad. A medida que las moléculas migran a través del gel separador, las diferentes proteínas se separan en bandas discretas de acuerdo a su movilidad. Al término de la corrida electroforética, las bandas se pueden identificar de varias formas: 1. El gel se puede teñir por inmersión en colorante seguido de lavado exhaustivo para remover colorante no unido. Si es necesaria información cuantitativa, se puede medir la cantidad de colorante unido a cada una de las bandas en un densitrometro. 2. Cuando la proteína en estudio es una enzima, se puede practicar tinción de la actividad enzimática. 3. Si la mezcla de proteínas es radioactiva, las bandas se pueden detectar por autoradiografía o fluorografia. Los principales usos de la electroforesis discontinua son por una parte, determinar pureza de una proteína y en segundo termino para analizar los componentes de 32
una mezcla compleja. La pureza, es por supuesto, un termino relativo, ya que se puede obtener una sola banda en el gel, debido a que las impurezas están a concentraciones muy bajas para ser detectadas.
GELES DE POLIACRILAMIDA EN CONDICIONES DESNATURANTES En 1967, A. Shapiro, E. Viñuela y J. Maizel mostraron que los pesos moleculares para la mayor parte de la proteínas se podían determinara midiendo la movilidad electroforética en geles de poliacrilamida que contiene un poderoso detergente de carga negativa, dodecil sulfato de sodio (SDS). Esta técnica fue perfeccionada dos años después por K. Weber y M. Osborn. A pH cercano al neutro, en 1% SDS y 0.1M β - mercaptoetanol, la mayoría de la proteínas, son cadenas que unen SDS, los puentes S – S se rompen por le β MSH y la estructura segundaria se pierde. Los complejos resultantes que consisten en subunidades proteicas y SDS asumen una configuración en espiral al azar. La proteínas, así tratadas, se comportan como si tuvieran forma uniforme y razón idéntica carga / masa. Esto es debido a que la cantidad de SDS unido por unidad de peso de proteína es constante: 1.4 g. SDS / g. de proteínas. La carga es entonces determinada por SDS unido y no por la carga intrínseca de los aminoácidos. Debido a que los espirales al azar de la proteína recubierto con SDS, tiene igual razón carga a masa, uno puede esperar que la movilidad de cada molécula proteica sea proporcional al número de enlaces peptídicos por moléculas, esto es, la movilidad seria proporcional al peso molecular. El gel se comporta como un “cedazo molecular” a través del cual deben pasar las moléculas. En cuanto mas pequeñas sea la molécula migrara mas rápidamente a través del gel; por lo tanto, la movilidad aumenta con pesos moleculares decrecientes. Weber Y Osborn demostraron que si una serie de proteínas de peso molecular conocido son sometidas a electroforesis en un gel, esta se separan en bandas (ver figura 2 a), y que el grafico: distancia de migración v / s log peso molecular corresponde a una línea recta ( figura 2 b). Por lo tanto, si se somete a electroforesis una proteína de peso molecular de peso desconocido con varias proteínas con PM conocido o estándar, el PM desconocido puede ser calculado con una exactitud que varia entre 5 al 10 %. El procedimiento de electroforesis en geles de poliacrilamida con SDS es una herramienta poderosa para el análisis de proteínas debido a que se usa para separar cualquier proteína sin importar su solubilidad en solución acuosa. Proteína de membrana, componentes proteicos del cito esqueleto y proteínas que forman parte de agregados macromoleculares grandes pueden resolverse en especies separadas.
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Finalmente, debido a que el método separa polipéptidos de acuerdo la tamaño, provee también información acerca de PM y la composición de sus unidades de cualquier complejo proteico.
BIBLIOGRAFÍA − Freifelder, D. (1982) Physical Biochemistry . 2a. Edición. Editores Freeman & Company. − Chrambach, A. & Robbard, D. (1971) Science, 172, 440. − Laemmli, UK (1970) Nature (London) 277, 680 – 685. − Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology Vol. I, T.S. Work + E: Work Editors A:H: Gordon, Pág. 1 –145 (parte I).
ELECTROFORESIS DISCONTINUA DE PROTEÍNAS SERICAS EN GELES DE POLIACRILAMIDA EN CONDICIONES DESNATURANTES PARTE EXPERIMENTAL A.- SOLUCIONES A. Acrilamida – bisacrilamida: 45% - 1.2% ( 46.2 %T – 2.6 %C). Precaución: la acrilamida es neurotóxica. EVITE EL CONTACTO DIRECTO. Agregar a la solución una punta de espátula de carbón activado agitar durante 2 horas, filtrar por papel whatman. Guardar a 4°C. B. Tampón gel separador 1.5 M Tris – HCl pH 8.8, 0.4 % SDS (guardar a 4°C). C. Tampón gel espaciador 0.5 M Tris – HCl pH 6.8, 0.4 % SDS (guardar a 4°C).0.5 M D. Persulfato de amonio 1% Preparar solución fresca; duración una semana (guardar a 4°C) 34
E. Temed ( N; N; N’; N’ – tetrametiletilendiamina) F. Tampón de corrida 4X 0.1 M Tris, 0.768 M glicina, 0.4 % SDS. Diluir con agua antes de usar, no es necesario ajustar pH. (guardar a 4°C). G. SDS 20% P /V (guardar a temperatura ambiente) H. Azul de Bromofenol: 0.2 % azul de Bromofenol en 0.1 M Tris – HCl pH 6.8 I. Tampón de muestra (5X) 0.125 M Tris – HCl pH 6.8, 5 % SDS, 25% glicerol, 0.05% azul de Bromofenol (guardar a -20°C). J. Fijador: 30% etanol, 10% ácido acético K. Solución de teñido 0.3% azul de Coomasie R – 250 en 50% metanol y 10% ácido acético. Se disuelve el azul de Coomasie en metanol (agitar 8 horas), se filtra, se agrega ácido acético y el agua. L. Solución de desteñido: 7% ácido acético – 30% metanol
B.- PREPARACIÓN DE GELES M. Gel separador Acril – Bis 45 – 1.2& Tris – HCl 1.5 M pH 8.8, 1.2% SDS Persulfato 1% Agua TEMED Importante: todas las operaciones se realizan en hielo para evitar polimerización. N. Gel espaciador Acril – Bis 45 – 1.2& Tris – HCl 0.5 M pH 6.8, 0.8 % SDS Persulfato 1% Agua TEMED
PROCEDIMIENTO A. Limpiar las placas de vidrio con acetona y etanol. B. Engrasar los espaciadores (0.15 cm de grosor) y armar la placa fijando pinzas. C. Agregar el volumen necesario de la mezcla del gel separador hasta una altura de 6 cm. D. Borra el menisco, agregando suavemente por las paredes tampón 1.5 M Tris – HCl pH 8.8, 1.2% SDS, diluido 1: 4. E. Dejar gelificar por 20 min. F. Eliminar tampón diluido y lavar la superficie con agua destilada. G. Preparar el gel espaciador H. Agregar el volumen necesario sobre el gel separador. Colocar peineta de 8 ó 10 surcos, evitando que queden burbujas de aire. Dejar gelificar por 20 min. 35
