PRAKTIKUM BIOMOLEKUL ANALISIS PROTEIN
Disusun Oleh :
Kelompok 5 : Ferlia Suci Ramadhani
NIM 121810301007 121810301007
Agus Wedi Pratama
NIM 121810301016 121810301016
Lailatul Badriyah
NIM 121810301036 121810301036
Dewi Adriana Putri
NIM 121810301053 121810301053
LABORATORIUM BIOKIMIA JURUSAN KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS JEMBER 2014
BAB I. PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang Protein merupakan salah satu unsur terpenting penyusun makhluk hidup. Seperti halnya unsur lainnya seperti karbohidrat, protein juga memiliki sifat dan fungsi. Sifat-sifat dan fungsi protein ditentukan oleh jenis dan urutan asam amino. Beberapa fungsi utama protein dalam organisme kehidupan antara lain; sebagai bahan penyusun selaput sel dan dinding sel, jaringan pengikat, pembentuk membran sel, mengangkut molekul-molekul lain (hemoglobin) dan sebagai zat antibodi. Pada kehidupan, protein memegang peranan yang penting pula. Proses kimia dalam tubuh dapat berlangsung dengan baik karena adanya enzim, suatu protein yang berfungsi sebagai biokatalisator. Protein merupakan persenyawaan kompleks yang dihasilkan dari polimerisasi asam asam amino yang terikat satu sama lain melalui ikatan peptide(-CO-NH-). Protein merupakan senyawa yang sangat penting dalam sistem kehidupan karena protein memainkan peran yang sangat vital dalam semua aktivitas sel-sel tubuh makhluk hidup. Protein digunakan untuk dukungan struktural, penyimpanan, transport substansi lain, pergerakan dan pertahanan melawan substansi asing. Sebagai contoh, fibrosa mempunyai peran yang sangat penting dalam menyangga atau melindungi tubuh, sedangkan protein globuler seperti albumain memiliki peranan dalam aliran darah untuk penahan tekanan osmosis. Semua protein terdiri dari rantai polipeptida yang memiliki struktur tertentu dalam tiga dimensi. Struktur protein terdiri dari 3 macam yaitu sekunder, tersier, dan kuartener. Pada struktur tersier, terdapat ikatan hidrogen, ikatan disulfida atau ikata ionik. Struktur pada protein menentukan sifat-sifat protein baik daya larutnya maupun peranannya sebagai enzim suatu reaksi. Jika dari ketiga ikatan itu pecah maka rantai polipeptida akan diubah bentuknya yang mempunyai sifat berbeda. Proses yang terjadi ini disebut dengan dinaturasi dan disebabkan oleh pemanasan, larutan asam atau basa atau dengan molekul polar. Kebenaran teori tersebut dapat untuk membuktikan kebenarannya maka dilakukanlah percobaan uji protein dengan metode identifikasi secara kualitatif dengan menggunakan beberapa prinsip.
1.2 Rumusan Masalah Adapun rumusan masalah dari percobaan analisis protein yaitu : - Bagaimana cara menentukan jumlah atau kandungan protein dalam bahan pangan? - Bagaimana cara menentukan tingkat kualitas protein dari sudut gizi? - Mengapa suatu protein dikatakan sebagai suatu bahan kimia, misalnya secara biokimia, fisiologis,reotologis, dll?
1.3 Tujuan Adapun tujuan dari percobaan analisis protein yaitu : - Menentukan jumlah atau kandungan protein dalam bahan pangan? - Menentukan tingkat kualitas protein dari sudut gizi? - Menelaah protein dikatakan sebagai suatu bahan kimia, misalnya secara biokimia, fisiologis,reotologis, dll?
1.4 Manfaat Adapun manfaat dari percobaan analisis protein yaitu : 1. Dapat mengetahui kandungan protein dalam bahan pangan 2. Dapat membedakana kualitas protein dan yang buruk
BAB II. TINJAUAN PUSTAKA
Kata protein berasal dari kata protos atau proteos yang berarti pertama atau utama. Protein merupakan komponen penting sel hewan atau manusia sehingga fungsi utama protein yaitu sebagai zat pembentukan dan pertumbuhan tubuh. Protein adalah komponen yang terdiri atas atom karbon, hidrogen, oksigen, nitrogen, dan beberapa ada yang mengandung sulfur dan fosfor. Tersusun dari serangkaian asam amino dengan berat molekul yang relatif sangat besar, yaitu berkisar 8.000 sampai 10.000. Protein yang tersusun dari hanya asam amino disebut protein sederhana. Protein yang mengandung bahan selain asam amino, seperti turunan vitamin, lemak, dan karbohidrat, disebut protein kompleks secara biokimiawi, 20% dari susunan tubuh orang dewasa terdiri dari protein. Kualitas protein ditentukan oleh jumlah den jenis asam aminonya (Devi, 2010). Protein merupakan suatu zat makanan yang sangat penting bagi tubuh karena zat ini berfungsi sebagai sumber energi dalam tubuh serta sebagai zat pembangun dan pengatur. Protein ialah polimer alami yang terdiri atas sejumlah unit asam amino yang berikatan satu dengan lainnya melalui ikatan amida atau peptida. Protein juga dapat diartikan sebagai senyawa organik kompleks dengan bobot molekul tinggi yang merupakan polimer dari monomer-monomer asam amino yang dihubungkan satu sama lain dengan ikatan peptida. Protein dapat digolongkan berdasarkan bentuk dan sifat-sifat fisik tertentu, yaitu protein globular dan protein serat. Protein serat merupakan material struktural hewan dan bersifat tidak larut air. Protein globular cenderung larut air dan bentuknya hampir bulat. Protein globular memainkan peranan penting dalam aktivitas biologis. Protein globular lebih kompleks dan reaktif seperti hemoglobin, mioglobin, atau sitokrom sedangkan protein serat digunakan untuk pertahanan luar seperti keratin, kolagen, miosin, dan aktin (Hart 2003). Keistimewaan dari protein ini ialah bahwa strukturnya yang mengandung N disamping C, H, O ( seperti juga karbohidrat dan lemak ), S edan kadang-
kadang P, Fe,dan Cu (sebagai senyawa kompleks dengan protein). Protein dalam bahan makanan tertentu sangat penting dalam proses kehidupan organisme yang heterotrof seperti hewan dan manusia. Protein alamiah mula-mula dibentuk dari asam-asam amino yang dirakit sama sekali baru oleh organisme autrotofdari unsure-unsur anorganik C, H, O, N, dan S yang ada dalam tanah atau udara. Molekul protein yang besar menyebabkan protein mudah sekali mengalami perubahan bentuk fisik ataupun aktivitas biologisnya. Banyak agensia yang yang dapa menyebabakan perubahan sifat alamiah protein misalnya panas, asam, basa, solven organic,garam, logam berat, radiasi sinar radioaktiv.Perubahan sifat fisik yang mudah diamati, adalah terjadinya penjedalan . dalam bahan makanan tertentu bahan yang digunakan untuk menguji kandungan protein meliputi putih telur, larutan KOH dan larutan CuSO 4. (Slamet Sudarmaji, 1996). Protein murni tidak berwarna dan tidak berbau. Jika protein tersebut dipanaskan, warnanya berubah menjadi coklat dan baunya seperti bau bulu atau bau rambut terbakar. Keratin misalnya, yaitu protein yang monomernya banyak mengandung asam amino sistein. Jika keratin dibakar, timbul bau yang tidak enak. Protein alam yang murni juga tidak memiliki rasa, tetapi hasil hidrolisis protein, yaitu proteosa, pepton, dan peptida, mempunyai rasa pahit. Pada umumnya, protein terdapat dalam bentuk amorf dan hanya sedikit sekali yang terdapat dalam bentuk Kristal. Protein nabati umumnya lebih mudah membentuk Kristal dibandingkan dengan protein hewani. Protein hewani seperti hemoglobin mudah membentuk suatu Kristal, sedangkan albumin sukar. Kandungan protein pada setiap bahan berbeda-beda. Beberapa protein enzim, seperti tripsin, pepsin, urease, dan katalase juga dapat membentuk Kristal (Sumardjo, 2008). Viskositas larutan protein dipengaruhi oleh jenis dan konsentrasi protein. Pada konsentrasi yang sama, larutan protein fibrosa mempunyai viskositas yang lebih tinggi dibandingkan dengan protein globular. Jadi, pada konsentrasi yang sama, larutan protein bermolekul besar mempunyai viskositas yang lebih tinggi dibandingkan dengan larutan protein bermolekul kecil. Viskositas protein paling rendah yaitu pada titik isoelektriknya. Kelarutan protein dalam berbagai pelarut (air, alcohol, dan garam encer) berlainan. Protein yang kaya akan radikal-radikal
nonpolar bebas lebih mudah larut dalam campuran alcohol-air dari pada dalam air. Protein yang miskin akan radikal-radikal polar bebas cenderung untuk mengendap dengan penambahan sedikit alcohol atau aseton. Protein tidak larut dalam air, tetapi kaya akan radikal-radikal yang bermuatan, dan mudah larut dalam garamgaram netral. Tinggi rendahnya suhu dapat memengaruhi kelarutan protein dalam larutan garam. Larutan garam fosfat misalnya karboksi hemoglobin kuda pada o
o
suhu 0 C mempunyai kelarutan sepuluh kali lebih besar dari pada suhu 25 C. Protein yang terdapat pada biji-biji tanaman lebih mudah larut dalam larutan garam pada suhu tinggi dibandingkan dengan suhu rendah namun, kenaikan suhu tidak banyak memengaruhi kelarutan albumin telur dalam larutan garam (Sumardjo, 2008). Adanya gugus amino dan karboksil bebas pada ujung-ujung rantai molekul protein, menyebabkan protein mempunyai banyak muatan (polielektrolit) dan bersifat amfoter (dapat bereaksi dengan asam maupun dengan basa). Dalam kimia, amfoter merujuk pada zat yang dapat bereaksi sebagai as am atau basa. Perilaku ini dapat terjadi karena memiliki dua gugus asam dan basa sekaligus atau karena zatnya sendiri mempunyai kemampuan seperti itu. Zat amfoter yang klasik adalah asam amino, protein, dan air. Beberapa logam, seperti seng, timah, aluminium, dan berilium, dapat membentuk oksida amfoterik. Gejala ini dapat dimanfaatkan untuk memisahkan kation dalam larutan, misalnya seng dari mangan (Linggih, 2004). Berdasarkan bentuk molekulnya protein dibagi menjadi dua, yaitu protein fibrosa, adalah protein yang bentuknya memanjang, misalnya kolagen fibrin,
miyosin dan keratin; dan protein
globuler, yaitu protein yang rantai
polipeptidanya melinhkar sehingga membentuk molekul membulat, misalnya albumin, globulin, protein, enzim dan protein hormon. Berdasarkan elemen penyusunnya, terbagi menjadi dua yaitu protein sederhana adalah protein yang apabila terhidrolisis sempurna menghasilkan alfa asam amino saja; dan protein majemuk adalah protein ynang mengandung gugus non protein atau prostetik di
dalamnya.Uji kualitatif protein dapat dilakukan berdasarkan uji warna atau melalui ujiendapan. Uji warna meliputi Ninhidrin, Biuret, Reduksi Sulfur,
Xantroprotein, dan Millon Nasse. Sedangkan untuk uji pengendapan biasanya menggunakan garam logam (Elizabeth, 2010), Beberapa jenis protein sangat peka terhadap perubahan lingkungannya. Suatu protein memiliki arti bagi tubuh jika melakukan aktivitas biokimiawi yang menunjang bagi kebutuhan tubuh. Aktifitas ini mengandung struktur dan konformasi protein yang tepat apabila konformasi protein berubah. Misalnya karena perubahan suhu, pHatau karena reaksi dengan senyawa lain, ion-ion logammaka aktifitas biokimianya akan berkurang. Enzim merupakan salah satu contoh protein yang memiliki aktivitas katalis reaksi didalam tubuh. Ion logam berat yang masuk ke dalam tubuh akan bereasi dengan sebagian enzim ditubuh sehingga menyebabkan koagulasi atau penggumpalan(Poedjiadi, 1994) Peptide sederhana mengandung dua, tiga, empat, atau lebih residu asam amino, masing-masing disebut dipeptida, tripeptida, tetrapeptida, dan seterusnya. Peptide didapatkan dari hidrolisis rantai panjang suatu polipeptida (protein). Sebagaimana asam amino, peptide memiliki pH isolistrik (pHI). Reaksi kimia peptide disebabkan karena adanya gugus junh –NH2, R, dan –COOH. Seperti pada asam amino, gugus -NH2 pada peptide dapat direaksikan dengan 2,4 dinitrofenil florobenzene fenilisotianat dan gugus –COOH. Dapat diesterfikasi dengan dan direduksi. Cara reaksi berwarna yang lain untuk pepetida dan protein tetapi tidak untuk asam amino bebas, adalah reaksi biuret. Reaksi ini terjadi antara pepetida atau protein dengan CuSO4 dan alkali, yang menghasilkan senyaw kompleks berwarna ungu (Wirahardikusumah, 2008).
BAB 3. METODOLOGI 3.1 Alat dan Bahan
3.1.1 Alat Alat-alat yang digunakan meliputi : 1. Beaker glass 2. Penangas 3. Pipet tetes 4. Botol semprot 5. Labu ukur 6. Buret 7. Erlenmeyer 8. Statif 9. Corong 10. Termometer 11. Spektrofotometer 12. Labu Kjeldahl 13. Karet penghisap 14. Set alat Kjeldahl
3.1.2 Bahan Bahan/ reagen yang digunakan meliputi : 1. Sampel 2. Asam sulfat pekat 3. Campuran Na2SO4 dan HgO (20:1) 4. K 2SO4 5. CuSO4 6. NaOH 7. HCl 8. Asam borat 40% 9. Protein
10. Reagen Biuret 11. Protein serum albumin (BSA, bovine serum albumin) 12. Campuran CuSO4 : Na2SO4 (1:8) 13. Aquades 14. Indikator campuran merah metil dan metil biru
3.2 Prosedur Kerja
3.2.1 Metode kjeldahl 1. Tahap Destruksi Sampel - dipanaskan dalam asam sulfat pekat sehingga bahan terdestruksi menjadi unsur-unsurnya dan terbentuk amonium sulfat - ditambahkan katalisator (Campuran Na2SO4 dan HgO (20:1), K 2SO4, CuSO4) untuk mempercepat destruksi
Hasil
2. Tahap Destilasi Amonium Sulfat - dipecah menjadi amonia (NH3) dengan menambahkan NaOH - dipanaskan - ditangkap dengan larutan asam standar (HCl, atau asam borat 4%) sampai destilat tidak bereaksi basis
Hasil
3. Tahap Titrasi
HCL (Sebagai penampung destilat) HCl yang tidak bereaksi dengan NH3 - dititrasi dengan NaOH (0,1 N)
Hasil
Asam Borat (Sebagai penampung destilat) Asam Borat yang bereaksi dengan NH3 - dititrasi dengan HCl (0,02-0,1 N)
Hasil
3.2.2 Matode Biuret 4 mL Protein
-
ditambahkan 6 mL pereaksi (reagen Biuret).
-
didiamkan selama 10 menit pada suhu 37ºC atau 30 menit pada suhu kamar (30ºC).
-
diukur absorbansi dari intensitas warna ungu larutan dengan Spektofotometer pada panjang gelombang 540 nm.
-
dibuat kurva standar menggunakan larutan protein serum albumin (BSA, bovine serum albumin) secara seri.
-
dihitung kadar protain berdasarkan rumus yang ada pada buku petunjuk.
Hasil-
3.2.3 Metode Lowry 0,3 g sampel kering -
dimasukkan labu kjeldahl.
-
ditambahkan 5 mL asam pekat menggunakan pipet yang dilengkapi karet penghisap.
-
ditambahkan juga 10 g campuran CuSO 4: Na2SO4 (1:8).
-
dilakukan destruksi sampai larutan berwarna biru datu hijau jernih.
-
didinginkan labu kjeldahl pada suhu kamar.
-
diencerkan larutan yang didapat dengan sedikit air.
-
ditambahkan NaOh 40% sampai terbentuk larutan coklat.
-
didestilasi dengan rangkaian alat destilasi kjeldahl.
-
ditangkap destilat dengan asam borat yang telah ditetesi indikator campuran metil merah dan metil biru.
-
dihentikan destilasi setelah destilat berubah warna.
-
dititrasi destilat yang diperoleh dengan HCl 0,1 N yang telah distandarisasi.
-
dibuat blanko dengan cara yang sama tanpa menggunakan sampel.
Hasil
3.2.4
Kadar Nitrogen (Metode Kjeldahl) Sampel kering
− 0,3 gram sampel kering dimasukkan dalam labu Kjeldahl. − Ditambahkan secara hati-hati 5 mL asam sulfat pekat (H2SO4) menggunakan pipet yang dilengkapi karet penghisap.
− Ditambahkan 10 gram campuran CuSO 4: Na2SO4 (1:8). − Dilakukan destruksi dalam lemari asam hingga cairan berwarna biru atau hijau jernih.
− Dinginkan labu kjeldahl dengan air (suhu <25 0C). − Larutan yang telah jernih diencerkan dengan sedikit aquades. − Ditambahkan NaOH 40% sampai terbentuk larutan coklat. − Sampel didestilasi dengan rangkaian alat ke destilasi kjeldahl. − Destilat ditangkap dengan asam borat yang telah ditambahkan 2 tetes indikator campuran metil merah dan metil biru.
− Destilasi dihentikan hingga destilat berubah warna. − Distilat yang diperoleh dititrasi dengan HCl 0,1 N yang telah distandarisasi.
− Dibuat blangko dengan cara yang sama tanpa menggunakan sampel. Hasil
