Laporan Mikrob Pewarnaan Gram

Laporan Praktikum Mikrobiologi

Nama

:

NIM

:

Hari/Tanggal

:

Waktu

:

Asisten

: 1. 2.

PJP

:

PEWARNAAN MIKROBA ( Pewarnaan Gram dan Pewarnaan Spora ) Pendahuluan Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur dan sifatsifat yang khas, termasuk bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan. Salah satu cara untuk melihat dan mengamati bentuk sel bakteri dalam keadaan hidup sangat sangat sulit, sehingga untuk diidentifikasi ialah dengan metode pengecatan atau pewarnaan sel bekteri, sehingga sel dapat terlihat jelas dan mudah diamati. Hal tersebut juga berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding sel bakteri melalui serangkaian pengecatan. Oleh karena itu teknik pewarnaan sel bakteri ini merupakan salahsatu cara yang paling utama dalam penelitian-penelitian mikrobiologi (Jawetz 2008). Struktur di dalam sel pada tempat-tempat yang dibentuk oleh spesies ini, disebut endospora. Endospora dapat bertahan hidup dalam keadaan kekurangan nutrien, tahan terhadap panas, kekeringan, radiasi UV serta bahan-bahan kimia. Ketahanan tersebut disebabkan oleh adanya selubung spora yang tebal dan keras. Sifatsifat ini menyebabkan dibutuhkannya perlakuan yang keras untuk mewarnainya. Hanya bila diperlukan panas yang cukup, pewarna yang sesuai dapat menembus endospora. Tetapi sekali pewarna memasuki endospora, sukar untuk dihilangkan. Ukuran dan letak endospora di dalam sel merupakan ciri-ciri yang digunakan untuk membedakan spesiesspesies bakteri yang membentuknya (Prescott 2008). Teknik pewarnaan warna pada bakteri dapat dibedakan menjadi empat macam yaitu pengecatan sederhana, pengecatan negatif, pengecatan diferensial dan pengecatan struktural. Pemberian warna pada bakteri atau jasad- jasad renik lain dengan menggunakan larutan tunggal suatu pewarna pada lapisan tipis, atau olesan, yang sudah difiksasi, dinamakan pewarnaan sederhana. Prosedur pewarnaan yang menampilkan perbedaan di antara sel-sel microbe atau bagian-bagian sel microbe

Trusted by over 1 million members

Try Scribd FREE for 30 days to access over 125 million titles without ads or interruptions! Start Free Trial Cancel Anytime.









disebut teknik pewarnaan diferensial. Sedangkan pengecatan struktural hanya mewarnai satu bagian dari sel sehingga dapat membedakan bagian-bagian dari sel. Termasuk dalam pengecatan ini adalah pengecatan endospora, flagella dan pengecatan kapsul (Bailey 2007). Cara pewarnaan Gram diciptakan pertama kali tahun 1884 oleh seorang ahli bakteriologi yang bernama Christian Gram. Cara pewarnaan ini merupakan cara pewarnaan diferensial, dimana dengan cara ini bakteri dapat dibedakan menjadi dua grup yaitu bakteri gram positif dan bakteri gram negatif (Fardiaz, 1989). Kebanyakan sel bakteri tidak berwarna, sehingga jika dilarutkan di dalam air dan dilihat di bawah mikroskop tidak memperlihatkan warna yang kontras dengan medium di sekelilingnya (Sacher dan McPherson, 2004). Sebelum dilakukan pewarnaan, maka sel-sel bakteri harus terlebih dahulu difiksasi pada gelas objek. Jika kultur diambil dari medium cair, maka penyebaran dapat langsung dilakukan diatas kaca objek yang bersih menggunakan jarum loop atau jarum ose. Tetapi jika kultur diambil dari agar padat, maka sebelumnya diatas kaca objek harus diberi setetes air, kemudian kultur diambil sedikit menggunakan jarum ose yang telah dipijarkan, dan diratakan di atas kaca objek sehingga terbentuk lapisan tipis. Bakteri Lactobacillus, Streptococcus, Staphylococcus dan Steptococcus merupakan bakteri yang termasuk bakteri gram positif. Sedangkan bakteri E. coli, Enterobacter aerogenes, dan Pseudomonas tergolong tergolong bakteri gram negatif (Fardiaz, 1989). Pada proses ini yang harus dihindari adalah fiksasi panas berlebihan, yang dapat merusak integritas struktural bakteri dan morfologi sel. Alasan keberhasilan metode pewarnaan Gram adalah bahwa mikroorganisme yang tidak diwarnai, dan bakteri terwarnai dapat dibedakan berdasarkan perbedaan struktur dinding selnya. Bakteri gram positif terwarnai ungu memiliki dinding sel yang tebal, dan bakteri gram negatif yang terwarnai merah memiliki dinding sel yang relatif tipis, dilapisi oleh membran luar yang mengandung lipopolisakarida. Etanol merupakan decolorizer yang lebih lambat dibandingkan dengan aseton (Sacher dan McPherson, 2004). Bakteri gram positif adalah bakteri yang memepertahankan zat warna gram A yang mengandung kristal violet sewaktu proses pewarnaan Gram. Bakteri negatif akan berwarna merah atau merah muda, karena warna ungu dapat dilunturkan kemudian mengikat warna gram D (safranin) (Brooks et al., 2001). Ada banyak perbedaan dalam ukuran panjang dan lebar di antara berbagai spesies basilus. Ujung beberapa basilus tampak persegi, yang lain bundar, dan yang lain lagi meruncing atau lancip seperti ujung cerutu. Kadang-kadang basilus tetap saling melekat satu dengan lainnya, ujung dengan ujung, sehingga memberikan penampilan rantai. Kokus memperlihatkan penataan yang berbeda-beda, diplokokus : sel membelah diri pada satu bidang pada satu bidang dan tetap saling melekat terutama berpasangan. Streptokokus : sel membelah diri pada satu bidang dan tetap melekat membentituk rantai, tetrakokus : sel membelah diri pada dua bidang dan membentuk kelompok yang









terdapat dalam berbagai bentuk : basilus (seperti batang), kokus (bentuk bulat), spirilus (spiral), spiroketa (ulir atau heliks) dan bercabang. Karena sel-sel individual bakteri terlampau kecil, sehingga memiliki variasi dalam bentuk dan ukuran (Elrod dan Stansfield, 2006). Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode empiris untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, gram positif dan gram negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram (1853 –1938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae. Prinsip dasar dari pewarnaan adalah adanya ikatan ion antara komponen selular dari bakteri dengan senyawa aktif dari pewarna yang disebut kromogen. Terjadi ikatan ion karena adanya muatan listrik baik pada komponen seluler maupun pada pewarna. Berdasarkan adanya muatan ini maka dapat dibedakan pewarna asam dan pewarna basa. Pembuatan film / apusan bakteri dilakukan sebelum proses pewarnaan gram. Beberapa langkah dalam pembuatan film ini diantaranya pembersihan gelas objek dengan kapas yang sudah diberi alkohol 70%. Pembersihan ini dimaksudkan agar gelas objek steril dan tidak ada mikroorganisme lain yang menempel pada gelas objek tersebut. Kemudian gelas objek yang sudah disterilkan tersebut dikeringkan dengan cara di angin-anginkan. Langkah selanjutnya yaitu pengambilan Öse suspense bakteri secara aseptis. Pengambilan dilakukan secara aseptis agar bakteri yang akan diamati tidak mengalami kontaminasi dengan mikroorganisme lain yang ada di sekitarnya. Kemudian bakteri yang telah diambil tadi dioleskan pada gelas objek dengan penyebaran setipis mungkin. Proses pewarnaan Gram memiliki beberapa tahap. Pertama, pemberian pewarna kristal violet pada bakteri yang diletakkan di atas gelas objek tadi. Pewarna kristal violet ini berguna sebagai indikator bakteri gram positif. Setelah ditetesi pewarna kristal violet, objek glas dibilas dengan air aquades, gelas objek dipegang pada posisi miring kemudian dikeringkan dengan menempelkan kertas serap yaitu kertas tissue pada bakteri tanpa mengelapnya. Kedua, pemberian Gram Iodium (lugol) yang berfungsi sebagai pembentuk kompleks ungu kristal-yodium (UK-Y), kemudian diamkan selama satu menit lalu dibilas kembali dengan air aquades dan dikeringkan seperti tadi. Ketiga, pemberian alkohol 95% untuk menghilangkan warna pada gelas objek sampai warna tidak luntur lagi (± 20 detik) lalu dibilas dan dikeringkan lagi. Keempat, pewarnaan dengan larutan









warna yang khas, warna ungu kebiruan untuk bakteri Gram positif yang menyerap pewarna kristal violet dan warna kemerahan untuk bakteri Gram negatif yang menyerap larutan safranin. Bakteri gram positif adalah bakteri yang mempertahankan zat warna metil ungu sewaktu proses pewarnaan Gram. Bakteri jenis ini akan berwarna biru atau ungu di bawah mikroskop. mi kroskop. Sedangkan bakteri gram negatif akan berwarna merah atau merah muda karena tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Perbedaan klasifikasi antara kedua jenis bakteri ini terutama didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel bakteri. Bakteri gram positif dinding selnya tersusun oleh peptidoglikan dalam jumlah besar. Sedangkan bakteri bakteri gram negatif mengandung mengandung lebih sedikit peptidoglikan namun strukturnya lebih kompleks, dimana bagian terluarnya tersusun atas lipopolisakarida (rantai karbohidrat dan lipid). Bakteri gram negatif lebih berbahaya karena lipopolisakarida bersifat racun. membran terluar bakteri gram negatif nemberikan perlindungan kepada bakteri gram negatif terhadap bertahan dari sel inang. Berdasarkan pengamatan dengan perbesaran mikroskop 100 kali yang dilakukan ketika praktikum dari sampel yang diberikan kepada k epada praktikan adalah sampel C diperoleh bakteri dengan warna ungu kebiruan, berbentuk basil, dan bergerombol. Bakteri tersebut merupakan bakteri gram positif dan merupakan bakteri Lactobacillus sp, yaitu lebih tepatnya bakteri Lactobascillus bulgaricus. Bakteri ini tidak berspora, berbentuk batang yang panjang, anaerobik fakultatif dan katalase negatif. Bakteri ini menyerupai streptokoki dalam kebutuhannya akan nutrien (Fardiaz, 1992).

Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode untuk membedakan membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni gram-positif dan gram-negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram (1853 – 1938) 1938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae (Iud W 2008). Dengan metode pewarnaan Gram, bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua, yaitu bakteri Gram positif dan Gram negatif berdasarkan reaksi atau sifat bakteri terhadap cat tersebut. Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya. Oleh karena itu, pengecatan Gram tidak bisa dilakukan









Mycobacterium dan beberapa spesies tertentu dari genus Nocardia. Bakteribakteri dari kedua genus ini diketahui memiliki sejumlah besar zat lipodial (berlemak) di dalam dinding selnya sehingga menyebabkan dinding sel tersebut relatif tidak permeabel terhadap zat-zat warna yang umum sehingga sel bakteri tersebut tidak terwarnai oleh metode pewarnaan biasa, seperti pewarnaan sederhana atau Gram (Entjang I 2003). Zat warna adalah senyawa kimia berupa garam-garam yang salah satu ionnya berwarna. Garam terdiri dari ion bermuatan positif dan ion bermuatan negatif. Senyawa-senyawa kimia ini berguna untuk membedakan bakteri-bakteri karena reaksinya dengan sel bakeri akan memberikan warna berbeda. Perbedaan inilah yang digunakan sebagai dasar pewarnaan bakteri. Sel-sel warna dapat dibagi menjadi dua golongan yaitu asam dan basa. Jika warna terletak pada muatan positif dari zat warna, maka disebut zat warna basa. Jika warna terdapat pada ion negatif, maka disebut zat warna asam. Contoh zat warna basa adalah methylen blue, safranin, netral red, dan lain-lain. Sedangkan anionnya pada umumnya adalah Cl-, SO4 -, CH3COO-, COOHCOO. Zat warna asam umumnya mempunyai sifat dapat bersenyawa lebih cepat dengan bagian sitoplasma sel sedangkan zat warna basa mudah bereaksi dengan bagianbagian inti sel. Pewarnaan bakteri dipengaruhi dipengaruhi oleh faktor-faktor seperti : fiksasi, peluntur warna, substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup. Pada bakteri gram positif menunjukkan warna biru ungu dan bakteri gram negatif berwarna merah. Dalam pewarnaan gram diperlukan empat reagen yaitu : 1. Zat warna utama (violet kristal) 2.

Mordan (larutan Iodin) yaitu senyawa yang digunakan untuk mengintensifkan warna utama

3.

Pencuci / peluntur zat warna (alcohol / aseton) yaitu solven organic yang digunakan uantuk melunturkan zat warna utama

4.

Zat warna kedua / cat penutup (safranin) digunakan untuk mewarnai kembali sel-









mempertahankan zat warna metil ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram-negatif tidak. Pada uji pewarnaan Gram, suatu pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu, yang membuat semua bakteri gram-negatif menjadi berwarna merah atau merah muda. Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur dinding sel mereka. Pengecatan gram dilakukan dalam 4 tahap yaitu : 1. Pemberian cat warna utama (cairan kristal violet) berwarna ungu. 2. Pengintesifan cat utama dengan penambahan iod. 3. Pencucian (dekolarisasi) (dekolarisasi) dengan larutan alkohol 96%. 4. Pemberian cat lawan yaitu cat warna safranin. Pada proses pewarnaan gram, harus gelas obyek yang bersih. Pembersihan ini dilakukan supaya gelas obyek bebas lemak dan debu. Pembersihan biasanya biasanya menggunakan menggunakan alkohol . Setelah di cuci kemudian di beri satu tetes aquades pada permukaan gelas obyek. Kultur bakteri murni diambil dan diratakan diatas kaca obyek. Pengambilan kultur bakteri tidak diambil terlalu banyak, karena jika terlalu banyak akan sulit diratakan dan apabila kultur bakteri tidak dapat diratakan tipis-tipis maka bakteri akan tertimbun hal ini akan mengakibatkan mengakibatkan pemeriksaan bentuknya satu per satu menjadi tidak ti dak jelas. Apabila sudah kering, dilakukan fiksasi dengan cara melewatkan diatas nyala api. Proses fiksasi dilakukan supaya bakteri benar-benar melekat pada kaca obyek sehingga olesan bakteri tidak akan terhapus apabila dilakukan pencucian. Yang perlu diperhatikan dalam proses fiksasi adalah bidang yang mengandung bakteri dijaga agar tidak terkena nyala api. Setelah dilakukan fiksasi kemudian ditetesi dengan kristal violet dan dibiarkan. Kemudian dicuci dengan air mengalir dan dibiarkan sampai kering (dengan cara dianginkan). Pencucian dengan air bertujuan untuk mengurangi kelebihan zat warna dari violet kristal. Setelah kelebihan zat warna dicuci dengan air kemudian diberi larutan iodin dan dibiarkan sehingga terbentuk suatu kompleks antara violet kristal dan iodin. Olesan bakteri











Pewarnaan selanjutnya dengan menggunakan safranin dan diamkan. Kemudian cuci dengan air mengalir dan kering dianginkan, kemudian diamati dibawah mikroskop. Pemberian kristal violet pada bakteri gram positif akan meninggalkan warna ungu muda. Perbedaan respon terhadap mekanisme pewarnaan gram pada bakteri adalah didasarkan pada struktur dan komposisi dinding sel bakteri. Bakteri gram positif mengandung protein dan gram negative mengandung lemak dalam persentasi lebih tinggi dan dinding selnya tipis. Pemberian alkohol (etanol) pada praktikum

pewarnaan

bakteri,

menyebabkan

terekstraksi

lipid

sehingga

memperbesar permeabilitas dinding sel. Pewarnaan safranin masuk ke dalam sel dan menyebabkan sel menjadi berwarna merah pada bakteri gram negatif sedangkan sedangkan pada bakteri gram positif dinding selnya terdehidrasi t erdehidrasi dengan perlakuan alkohol, pori – pori mengkerut, daya rembes dinding sel dan membran menurun sehingga pewarna safranin tidak dapat masuk sehingga sel berwarna ungu. Perbedaan dasar antara bakteri gram positif dan negatif adalah pada komponen dinding selnya. Kompleks zat iodin terperangkap antara dinding sel dan membran sitoplasma organisme gram positif, sedangkan penyingkiran zat lipida dari dinding sel organisme gram negatif dengan pencucian alcohol memungkinkan hilang dari sel. Bakteri gram positif memiliki membran tunggal yang dilapisi peptidohlikan yang tebal (25-50nm) sedangkan bakteri negative lapisan peptidoglikogennya peptidoglikogennya tipis (1-3 nm). Sifat bakteri terhadap pewarnaan Gram merupakan sifat penting untuk membantu determinasi suatu bakteri. Beberapa perbedaan sifat yang dapat









5.

Pertumbuhannya tidak begitu dihambat oleh zat warna dasar misalnya kristal violet.

6. Komposisi nutrisi yang dibutuhkan relatif sederhana. sederhana. 7. Tidak resisten terhadap gangguan fisik. 8. Resistensi terhadap alkali (1% KOH) lebih pekat. 9. Peka terhadap streptomisin. 10. Toksin yang dibentuk Endotoksin.

Ciri-ciri bakteri gram positif yaitu: 1. Struktur dinding selnya tebal, sekitar 15-80 nm, berlapis tunggal atau monolayer. 2.

Dinding selnya mengandung lipid yang lebih normal (1-4%), peptidoglikan ada yang sebagai lapisan tunggal. Komponen utama merupakan lebih dari 50% berat ringan. Mengandung asam tekoat.

3. Bersifat lebih rentan terhadap penisilin. 4. Pertumbuhan dihambat dihambat secara nyata oleh zat-zat warna seperti ungu kristal. 5. Komposisi nutrisi yang dibutuhkan lebih rumit. 6. Lebih resisten terhadap gangguan fisik. 7. Resistensi terhadap alkali (1% KOH) larut. 8. Tidak peka terhadap streptomisin. 9. Toksin yang dibentuk Eksotoksin Endotoksin Berdasarkan pengamatan pada sampel 1 morfologi sel berbentuk bacil dan morfologi koloni streptobasil, sampel 2 morfologi sel berbentuk cocus dan morfologi koloni streptococus, sampel 3 morfologi sel berbentuk bacil dan morfologi koloni streptobacil, sampel 4 morfologi sel berbentuk bacil dan









morfologi sel berbentuk bacil dan morfologi koloni streptobasil dan sampel 5 morfologi sel berbentuk bacil dan morfologi koloni streptobasil.

Daftar Pustaka th

Microbiolog y 12 edition. Mosby Elsevier : Houston. Bailey and Scott’s. 2007. Diagnostic Microbiology Entjang I. 2003. Mikrobiologi dan Parasitologi Untuk Akademi Keperawatan. Jakarta : PT. Citra Aditya Bakti Iud W. 2008. Teknik dan Metode Dasar Dalam Mikrobiologi. Malang : UMM Press Jawetz, Melnick, Adelberg. 2008. Mikrobiologi Kedokteran Edisi 23. Jakarta : Penerbit Buku Kedokteran EGC Prescott, Harley, Klein’s. 2008. Microbiology 7 th edition. Boston : Published by McGraw-Hill

Berdasarkan hasil pengamatan terhadap pewarnaan Gram yang dilakukan terhadap kultur padat Lactobacillus acidophillus dan Streptococcus Streptococcus thermophilus dengan perbesaran 100x, diperoleh hasil sebagai berikut : Ilustrasi 1. Struktur Lactobacillus acidophillus Bentuk : bacillus (batang) Koloni : berkelompok Warna : biru gelap Gram : positif Bentuk : bacillus (batang) Koloni : berkelompok Warna : biru keunguan Gram : positif Sumber : Data Primer Praktikum Sumber : sitemaker.umich.edu Mikrobiologi, 2011. Berdasarkan pewarnaan pewarnaan Gram pada Lactobacillus acidophillus, diperoleh hasil :









Bentuk : coccus (bulat) Koloni : berkelompok Warna : biru gelap Gram : positif Bentuk : coccus (bulat) Koloni : berkelompok Warna : biru gelap Gram : positif Sumber : Data Primer Praktikum Sumber : picazilla.co.cc Mikrobiologi, 2011. Berdasarkan pewarnaan pewarnaan Gram pada Streptococcus thermophilus, diperoleh hasil : bentuk bakteri coccus (bulat), jumlah koloni TBUD dan warna dinding selnya biru gelap. Hal ini sesuai dengan pendapat Fardiaz (1989) yang menyatakan bahwa bakteri Lactobacillus, Streptococcus, Staphylococcus dan Steptococcus Steptococcus merupakan bakteri yang termasuk bakteri gram positif. Pada hasil pengamatan, bakteri Streptococcus thermophilus tampak bulat dan tidak menggerombol, hal ini menunjukkan bahwa bentuknya berpasangan berpasangan (diplokokus). Hal ini sesuai dengan pendapat yang dikemukakan oleh Pelczsar dan Chan (1986) yaitu kokus memperlihatkan penataan yang berbeda-beda, berbeda-beda, diplokokus : sel membelah diri pada satu bidang pada satu bidang dan tetap saling melekat terutama berpasangan. berpasangan. DAFTAR PUSTAKA Brooks, G. F., Janet, S. B., dan Stephen A. M. 2001. Mikrobiologi Kedokteran Penerbit Salemba Medika, Jakarta. Campbell, N.A., J. B. Reece, dan L. G. Mitchell. 2002. Biologi Jilid 1 Edisi Kelima. Erlangga, Jakarta. Darmadi. 2008. Infeksi Nosokomial. Penerbit Salemba Medika, Jakarta. Elrod, S. L. dan W. D. Stansfield. 2006. Genetika Edisi Keempat. Erlangga, Jakarta.









Sacher, R. A. dan R. A. McPherson. 2004. Tinjauan Klinis Hasil Pemeriksaan Laboratorium. Penerbit Buku Kedokteran EGC, Jakarta. Schlegel, H. G. 1994. Mikrobiologi Umum. Gadjah Mada University Press, Yogyakarta. Suriawiria, U. 1993. Mikrobiologi Air. Penerbit Alumni, Bandung. Suwahyono, Suwahyono, U. 2009. Biopestisida. Penebar Swadaya, Jakarta. J akarta. www.sitemaker.umich.edu www.picazilla.co.cc Yuwono, T. 2008. Boiologi Molekuler. Erlangga, Jakarta. DAFTAR PUSTAKA Fardiaz, S. 1989. Mikrobiologi Pangan. Pusat Antar Universitas Pangan dan Gizi IPB. Bogor Fardiaz, S. 1992. Mikrobiologi pangan I. Gramedia Pustaka Utama, Jakarta. Frazier, W. C. and D. C. Westhoff. 1978. Food Microbiology. Microbiology. 3th edition. Tata McGraw-Hill New Delhi. Halferich,W. dan D.C. Westhoff. 1980. All About Yogurt. Prentice Hall. Inc New York Pelczar, Michael J. Dan E. C. S. Chan. 2006. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Mikrobiologi. Penerbit Universitas Indonesia (UI-Press). Jakarta. Sumanti, Debby M. dkk. 2009. Diktat Penuntun Praktikum Mikrobiologi Pangan. Jurusan Teknologi Industri Pangan Fakultas Teknologi Industri Pertanian Universitas Pasjadjaran Robert Wayne Hutkins. 2006. Microbiology and Technology of Fermented Foods. Wiley-Blackwell. Anonima. 2011. Gambar Lactobascillus bulgaricus. http://www.novinite.com/media/ http://www.novinite.com/media/images/200 images/2004-04/33678.jp 4-04/33678.jpgg diakses tanggal 4 Maret 2011











http://www.deanza.edu/faculty/mccauley/6a_site_imag http://www.deanza.edu/faculty/mcc auley/6a_site_images/fungiimages/ es/fungiimages/ saccharomyces-400.jpg saccharomyces-400.jpg diakses pada 5 Maret 2011 Jenis Lactobacillus dapat dibedakan atas dua kelompok, yaitu: 1. Bersifat homofermentatif homofermentatif Bakteri homofermentatif memecah gula menjadi asam laktat dan dapat tumbuh pada suhu 370C atau lebih. Spesies yang tergolong homofermentatif misalnya: a. Lactobacillus bulgaricus b. Lactobacillus lactis c. Lactobacillus acidophilus d. Lactobacillus thermophilus e. Lactobacillus delbrueckii 2. Bersifat heterofermentatif Bakteri heterofermentatif memecah gula menjadi asam laktat dan produk-produk lain seperti alkohol, asetat dan karbondioksida. Spesies yang tergolong heterofermentatif misalnya Lactobacillus fermentatum dan Lactobacillus brevis. (Fardiaz, 1992). Bakteri yang diamati pada praktikum ini selain bakteri Lactobascillus bulgaricus adalah bakteri Lactobacillus acidophilus, Streptococcus thermophilus dan Bifidobacterium bifidum. Bakteri Lactobacillus acidophilus merupakan bakteri gram positif karena setelah diberi pewarnaan gram dan diamati di amati di bawah mikroskop bakteri ini berwarna ungu kebiruan, berbentuk basil atau batang, bersifat









Sampel lain yang digunakan dalam praktikum ini adalah sampel D yang merupakan bakteri Streptococcus thermophilus. Bakteri jenis ini memiliki bentuk kokus atau bulat, bergerombol dan merupakan bakteri gram positif. Namun, pada praktikum kali ini, i ni, praktikan menemukan bahwa bakteri ini merupakan bakteri gram negatif. Kesalahan ini mungkin disebabkan karena perlakuan fiksasi yang terlalu lama ataupun karena agar yang tidak sengaja terambil pada saat pengambilan sampel. Selain itu, juga bisa disebabkan karena terkotaminasi. Kemungkinan lain yang dapat menyebabkan kesalahan ini adalah kotornya lensa pada mikroskop yang digunakan untuk mengamati bakteri tersebut. Berikut ini merupakan bakteri Streptococcus thermophilus Gambar 5. Streptococcus thermophilus (sampel D) Perbesaran 16 x 40 Sedangkan gambar berdasarkan literatur adalah sebagai berikut: Gambar 6. Streptococcus Streptococcus thermophilus (buyprobiotics, 2011) Streptococcus Streptococcus memiliki karakteristik berbentuk bulat, hidup berpasangan dengan rantai pendek atau panjang yang tergantung pada spesies dan kondisi pertumbuhannya, dan semuanya bersifat homofermentatif (Frazier dan Westhoff, 1978, Pelczar dan Chan, 1988). Streptococcus Streptococcus memiliki diameter yang kurang dari 2μm, membutuhkan kondisi nutrisi yang kompleks dengan suhu pertumbuhan Nova Nurfauziawati 240210100003 Kelompok 1A









Bifidobacterium adalah 37-41 °C dan pH optimum antara 6,5-7. Dari 30 spesies Bifidobacterium yang ditemukan, beberapa di antaranya digunakan sebagai probiotik, yaitu Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium lactis, Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium animalis, dan Bifidobacterium thermophilum. Bakteri ini telah digunakan secara komersial sebagai probiotik dalam pembuatan yogurt dan produk olah susu lainnya. Pada praktikum kali ini, setelah pengamatan di bawah mikroskop, praktikan menemukan bahwa bakteri Bifidobacterium bifidum ini berbentuk coccus, padahal seharusnya bakteri jenis ini berbentuk basil. Kesalahan ini mungkin disebabkan karena perlakuan fiksasi yang terlalu lama ataupun karena agar yang tidak sengaja terambil pada saat pengambilan sampel. Selain itu, juga bisa disebabkan karena terkotaminasi. Kemungkinan lain Nova Nurfauziawati 240210100003 Kelompok 1A yang dapat menyebabkan kesalahan ini adalah kotornya lensa pada mikroskop yang digunakan untuk mengamati bakteri tersebut. Berikut ini merupakan bakteri Bifidobacterium bifidum Gambar 7. Bifidobacterium bifidum (sampel B) Perbesaran 100 kali Berdasarkan hasil pengamatan Bifidobacterium bifidum berbentuk coccus, padahal seharusnya berbentuk basil sesuai dengan gambar berdasarkan literatur sebagai berikut:









dapat menggunakan pewarna basa pada umumnya, antara lain : kristal violet, metylen blue, karbol fuchsin, dan safranin. 2. Pewarnaan Gram Pewarnaan gram merupakan pewarnaan yang digunakan untuk mengelompokkan bakteri gram positif dan bakteri gram negatif. Pewarna yang digunakan antara lain : kristal violet sebagai gram A, iodine sebagai gram B, alkohol sebagai gram C, serta safranin sebagai gram D. 3. Pewarnaan Kapsul Pewarnaan ini mengunakan dua reagen, yaitu: kristal violet sebagai dekolorisator (penghapus warna utama) serta kopper sulfat sebagai pewarna tandingan teradsorbsi bahan kapsular yang mengalami dekolorisasi. Hasil pewarnaannya ialah kapsul akan berwarna biru terang kontras dengan warna ungu gelap dari sel. 4. Pewarnaan Spora Pewarnaan spora merupakan pewarnaan dengan menggunakan malchit green dan safranin, yang dalam hasil pewarnaanya akan muncul warna hijau hi jau pada sporanya, serta warna merah pada sel vegetatifnya, yaitu pada Bacillus subtilis. Teknik- teknik pewarnaan secara umum, antara lain : A. Pewarnaan Sederhana Pewarnaan ini digunakan untuk visualisasi bentuk morfologis yang berupa basil, kokus, basil, vibrio dan spiral), dan susunan (rantai, gerombol, berpasangan, dan tetrad). B. Pewarnaan diferensial Pewarnaan ini digunakan untuk pemisahan dalam kelompok yang terbagi menjadi dua, yaitu pewarna gram dan pewarna tahan asam. Selain itu juga digunakan untuk visualisasi struktur yang dibedakan menjadi empat, yaitu pewarna kapsul, pewarna flagel, pewarna









12. Memberi minyak minyak emersi di atas cover cover glass pada objek yang akan kita amati, 13. Mengamati slide tersebut. B. Pewarnaan Gram 1. Mensterilkan objek glass dengan melakukan preparasi slide; 2. Mensterilkan jarum ose dengan dilewatkan pada api bunsen; 3. Memberi setetes setetes akuades akuades dengan dengan kondisi tidak perlu tebal dan juga tidak perlu tipis pada objek glass; 4. Mengambil biakan dengan dengan menggunakan menggunakan jarum ose yang sudah steril, dengan satu arah, dari baewah ke atas. Cukup satu ose saja dan tidak boleh terlalu jauh dari api bunsen; 5. Menyebarkan jarum ose ose yang berisi mikroba mikroba tersebut tersebut dengan merata, persis persis di atas genangan air pada objek glass tadi. Setelah pengambilan, ose disterilkan kembali; 6. Melewatkan objek glass glass yang berisi mikroba tersebut pada api bunsen hingga kering; 7. Meneteskan kristal violet hingga menutupi permukaan bakteri; 8. Mendiamkannya selama 1 menit; 9. Membilas pewarna kristal violet dengan akuades; 10. Meneteskan iodine hingga menutupi permukaan bakteri kemudian mendiamkannya selama kurang lebih 1-2 menit; 11. Membilas biakan tadi dengan air akuades; 12. Meneteskan alkohol 95% 95% ke atas bakteri kemudian mendiamkannya selama 30 detik; 13. Membilasnya dengan air akuades; 14. Meneteskan safranin ke atas bakteri dan mendiamkannya mendiamkannya selam selam kurang lebih 1











8. Melewatkan objek glass tersebut di atas api bunsen dengan tidak terlalu sering, dan jika pewrana sudah kering, perlu ditambhkan lagi pewarna tersebut tersebut (diusahakan selama 10 menit tersebut malachit green tidak kering); 9. Setelah 10 menit, mencuci objek glass glass dengan dengan akuades hingga warna hilang; 10. Mengeringkan sisa pencucian tado dengan tisue kering; 11. Merendam dengan safranin selama 1 menit; 12. Mencuci kembali dengan akuades; 13. Mengeringkan slide dengan dilewatkan pada api bunsen; 14. Menutup dengan cover glass; 15. Memberi minyak minyak emersi di atas cover cover glass pada objek yang akan kita amati; 16. Mengamati slide tersebut. VI. HASIL PENGAMATAN No Bakteri Pewarnaan Sederhana Pewarnaan Gram Pewarnaan spora 1 Bacillus subtilis Strukutr morfologinya morfologinya berbentuk batang (bacil), susunan bekterinya berantai. Termasuk gram positif. Memiliki endospora. 2 Staphylococcus Staphylococcus aureus









sebelumnya objek glass sudah diberi air sedikit. Kemudian setelah mikroba dan air dicampur, dilakukan metode smear yaitu meratakan mikroba kira-kira membentuk sebuah bentuk koin. Kemudian dilakukan fiksasi yaitu dengan melewatkan smear secara cepat di api bunsen, lalu dikering-anginkan. Setelah melakukan metode smear, selanjutnya adalah metode pengecatan. Objek glass yang sudah di titrasi diberi pewarna kristal violet (selama 60 detik). Kemudian diberi air aquades untuk m embersihkan kelebihan warna. Sisa-sisa air yang ada di objek glass dibersihkan dengan tissue. Terakhir objek glass ditutup dengan cover glass, dan diletakkan di mikroskop cahaya untuk diamati dengan perbesaran 1000 X dengan catatan menggunakan minyak emersi setelah menemukan titik fokus perbesaran 40 X. 3. Pewarnaan sederhana pada Staphylococcus aureus Kaca preparat diberi setetes air dan diberi bakteri Stapylococcus aureus, kemudian dipaskan di atas api bunsen, dari sini akan nampak lapisan putih yang tipis, semitransparan, dan rata yang menunjukkan adanya bakteri. Setelah smear difiksasi, smear kemudian diberi pewarna basa yaitu metilen blue. Dalam pemberian metilen blue ini, diusahakan agar menutupi semua lapisan tipis smear. Pewarnaan dengan









secara tipis di atas akuades. Smear yang tipis memberikan hasil pada gelas objek dan dihomogenkan .Selanjutnya dilanjutkan dengan tehnik pewarnaan. Pertama, menggunakan Gram A yaitu kristal violet, bakteri tampak terwarnai ungu. Fungsi dari gram A adalah sebagai pewarna utama yaitu pewarna yang pertama kali digunakan. Baik bakteri gram positif maupun gram negatif memberikan warna yang sama pada pewarnaan dengan Gram A. Setelah itu, diberikan perlakuan dengan Gram B yaitu iodin. Fungsi dari iodin adalah sebagai mordant atau penguat warna. Kompleks UK-Y dapat terbentuk di dalam sel. Dengan begitu, warna dari kristal violet tetap terjaga. Kemudian dilanjutkan dengan pemberian Gram C yaitu alkohol, yaitu berfungsi sebagai peluntur warna (dekolorisasi) dan dehidrasi sel. Pada saat itu, di dalam dinding sel bakteri Pseudomonas yang tersusun atas selapis sel yang tersusun atas lipid. Lipid tereksitasi dari dinding sel,pori-pori dinding sel bakteri mengembang. Kompleks UK-Y keluar dari sel sehingga sel menjadi tidak berwarna. Terakhir diberi pewarna tandingan yaitu yaitu safranin. Pewarna tandingan tandingan dapat masuk masuk apabila pewarna utamanya telah keluar dari dari sel bakteri. Bakteri pseudomonas dapat terwarnai merah. Dari uraian di atas, dapat dilihat bahwa Pseudomonas putida memiliki karateristik mikroskopik sebagai berikut yang









yang tidak akan melarutkan CV-iodine secara sempurna sehingga sel gram negatif seperti gram positif. 2. Preparasi pewarnaan gram terbaik adalah menggunakan kultur muda muda yang tidak lebih lama dari 24 jam. Umur kultur akan berpengaruh pada kemampuan sel menyerap warna utama (CV), khususnya pada gram positif. Mungkin akan menampakkan gram variabel yaitu satu jenis sel, sebagian berwarna ungu dan sebagian merah karena pengaruh umur. C. Pewarnaan Spora 1. Pewarnaan Spora pada Bacillus subtilis Endosopora tidak mudah diwarnai dengan zat pewarna pada umumnya, akan tetapi apabila sekali diwarnai, zat warna tersebut akan sulit hilang. Hal inilah yang y ang menjadi dasar dari metode pengecatan spora secara umum. Pada metode Schaeffer-Fulton yang banyak dipakai dalam pengecatan endospora, endospora endospora diwarnai pertama dengan malachite green dengan proses pemanasan. Larutan ini merupakan pewarna yang kuat yang dapat berpenetrasi ke dalam endospora. Setelah perlakuan malachite green, biakan sel dicuci dengan air lalu ditutup dengan cat safranin. Teknik ini akan









7. Pada bakteri Bacillus subtilis dan Staphylococcus aureus termasuk dalam gram positif dikarenakan bakteri tersebut berwarna biru atau ungu pada pewarnaan safranin. Sedangkan bakteri Pseudomonas putida termasuk dalam gram negatif dikarenakan bakteri tersebut berwarna merah pada pewarnaan safranin. IX. DAFTAR PUSTAKA Anonim. 2009.http://www.microbiolog 2009.http://www.microbiologybytes.com/vid ybytes.com/video/Pputida.html. eo/Pputida.html. Diakses pada tanggal 28 Oktober 2010 20:09. Dwidjoseputro, D., 1989. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Malang : Djambatan. Ekmon, 2008. http://ekmon-saurus.blogspot.c http://ekmon-saurus.blogspot.com/2008/0 om/2008/09/kunci-awal-identifikasi9/kunci-awal-identifikasibakteri.html) diakses pada 29 Oktober 2010 13:28. Jimmo., 2008. http ://Pembuatan PreParAT dannn PengeCaTAnnyA__ BloG Kita.mht ,. diakses pada tanggal 28 Oktober 2010 20:29. Nurodin, Ade., 2009. http://adenurodin.blogspot.co http://adenurodin.blogspot.com/2009/12 m/2009/12/pembuatan-preparat/pembuatan-preparatbakteri-pewarnaan.html diakses pada 29 Oktober 2010 13:17. Schlegel, Hans. 1994. Mikrobiologi Umum Edisi Keenam. Yogyakarta: Gajah Mada

Laporan Mikrob Pewarnaan Gram

Recommend Documents