LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA PENENTUAN KADAR PROTEIN TOTAL, ALBUMIN, DAN GLOBULIN SERUM DENGAN METODE KINGSLEY
KELOMPOK 5 Erlisa Devi S.P.
(082010101053) (082010101053)
Mustika Ayu
(082010101054) (082010101054)
Jarwoto Roestanadjie
(082010101055) (082010101055)
Sheilla Rahmania
(082010101056) (082010101056)
Muhammad Afiful Jauhani
(082010101057) (082010101057)
Indri Noor Hidayati
(082010101058) (082010101058)
Robiatul Adawiyah
(082010101059) (082010101059)
Yoga Wahyu Pratiwi
(082010101060) (082010101060)
Sastra Wira P.
(082010101063) (082010101063)
Alfa Rianul
(082010101064) (082010101064)
FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS JEMBER 2008/2009
A. LANDASAN TEORI
Protein adalah senyawa organik kompleks yang terdiri atas unsur C, H, O, N dan pada beberapa jenis protein mengandung unsur S (belerang) dan F (fosfor). Zat yang disintesis di hati ini penting untuk menyusun sel, keratin, kolagen, hormone, enzyme, dan juga protein transporter seperti hemoglobin dan mioglobin. Dalam darah manusia, Albumin merupakan jenis protein yang penting untuk menjaga tekanan onkotik. Protein tersusun atas beberpa subunit yang yang disebut asam amino(Mckee and McKee, 1996: 78). Antara asam amino yang satu dengan lainnya digabungkan melalui ikatan peptida. Dua puluh asam amino yang saat ini umum dikenali berbeda satu sama lain tergantung dari rantai sampingnya. Kedua puluh asam amino yang terdapat pada protein bersifat esensial bagi kesehatan. Dari 12 asam amino yang secara nutrisional nonesensial, 9 buah di antaranya dibentuk dari zat amfibolik dan 3 buah (sistein, tirosin, dan hidroksilin) dibentuk dari asam amino yang esensial secara nutrisional. Identifikasi 12 asam amino yang dapat disintesis oleh manusia terutama didasarkan pada data yang berasal dari diet dengan protein yang digantikan oleh asam amino murni. Untuk dapat berfungsi secara fisiologis, suatu protein minimal harus bersifat 3 dimensi (tersier). Beberapa molekul asam amino berikatan membentuk protein. Protein protein yang saling berikatan akan membentuk ikatan primer. Dua ikatan primer protein akan membentuk ikatan sekunder (2-dimensi), dan apabila antarrantai samping tiap protein tersebut saling berikatan, dia akan membentuk protein 3 dimensi atau protein tersier. Protein tersier yang berikatan dengan mineral makro akan membentuk protein kuartener. Misalnya hemoglobin, protein tersier yang berikatan dengan Fe. Pengukuran kadar protein sangatlah penting untuk menentukan kondisi kesehatan seorang pasien, karena minimnya jumlah protein dalam tubuh seseorang dapat menjadi indicator dari penyakit-penyakit, seperti penyakit hati. Pada percobaan ini, total protein dan albumin ditentukan secara spektrofotometrik dengan mereaksikan dengan reagen biuret. Kadar albumin ditentukan sesudah globulin dipisahkan dengan mengendapkannya memakai larutan Na 2SO4 23% dan selanjutnya digumpalkan dengan dietileter. Pemberian dietileter juga dimaksudkan untuk menghilangkan kekeruhan yang mungkin terjadi oleh karena adanya lipid di dalam serum. Kekeruhan akan mempengaruhi pembacaan.
B. ALAT DAN BAHAN
Tabung reaksi
Blue Tip
Pipet ukur dan Bubble
Sentrifuge
Vortex
Spektrofotometer
Kuvet
Pipet
Serum vena brachialis
Reagen: o
Na2SO4 23% : larutkan 230 g Na 2SO4 anhydr. dalam aquadest panas. Kemudian tambahkan H 2O (aquadest) 1 L. Simpan dalam botol yang tertutup rapat dalam suhu kamar.
o
Reagens biuret : masukkan ke dalam Erlenmeyer 500 ml sebanyak 300 ml NaOH 5,7 N (95 ml NaOH jenuh diencerkan sampai 300 ml) dengan 100 ml CuSO4 1%. Campur dengan baik, simpan didalam botol dengan tutup karet .
o
Larutan standard protein yang diketahui kadarnya (ditentukan dengan cara Kjehldahl). Sebaiknya larutan standard ini mengandung kira-kira 6 g protein per 100 ml larutan.
C. LANGKAH KERJA a. Total protein Pipet 0,5 ml serum dan masukkan dalam tabung pemusing (15 ml), tambahkan 7,5 ml larutan Na2SO4 23%, campur baik-baik lalu ambil 2 ml dari campuran tersebut dan masukkan ke dalam tabung. Tambahkan 4 ml reagen biuret dan biarkan selama 10 menit pada suhu kamar. Tentukan bacaannya dengan spektrofotometer pada gelombang 545 nm. b. Albumin 1. Pada sisa campuran 6 ml, tambahkan 3 ml dietileter dan sumbat baik-baik. Kocok agak kuat dengan sekali-sekali membuka tutupnya untuk mengurangi tekanan yang terdapat dalam tabung tersebut.
2. Pusingkan selama 10 menit Harus terlihat 3 fase berbatasan jelas dari masing-masing campuran yang terdapat dalam tabung pemusing tersebut. Fase yang teratas adalah eter yang mengandung lipid, fase yang di tengah merupakan cincin endapan globulin dan fase yang terbawah merupakan larutan yang terjernih dari albumin. 3. Miringkan hati-hati tabung sehingga cincin globulin terlepas dari dinding tabung. Masukkan hati-hati sebuah pipet 2 ml dengan ujung atas pipet ditutup jari waktu pipet menembus lapisan eter. 4. Isaplah larutan albumin itu dengan tersebut lalu bersihkan ujung pipet yang basah dengan kertas pembersih dan turunkan permukaan larutan sampai pada garis tanda dari pipet. 5. Masukkan larutan albumin ini ke dalam tabung reaksi. 6.
Tambahkan 4 ml reagen biuret dan biarkan selama 10 menit pada suhu kamar.
7. Tentukan bacaannya dengan spektrofotometer pada gelombang 545 nm.
Perhitungan :
TP =
Alb =
Globulin = TP – Alb
Keterangan :
AbsTP = absorbance TP AbsA
= absorbance albumin
AbsS
= absorbance standard
CS
= kadar protein standard dalam g/100 ml
D. HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil Perhitungan :
AbsTP - AbsB T.P
= -------------------------------- X CS ( gr % ) AbsS - AbsB 0,747 – 0,252 = -------------------------------- X 6,42 gr %
0,611 – 0,252
0,495 = --------- X 6,42 gr % = 8,85 gr% 0, 359
AbsA - AbsB Alb
= ------------------------------ X CS gr % AbsS – AbsB
0,566 – 0,252 = -------------------------------- X 6,42 gr % 0,611 – 0,252
0,314 = --------- X 6,42 gr % = 5,62 gr% 0,359
Standart harga normal: Total Protein = 6 – 8 gr % Albumin
= 3,5 – 5 gr %
Pada percobaan ini, diperoleh hasil total protein yang jumlahnya lebih besar dibandingkan jumlah albumin, tetapi hasil tersebut melebihi 0,85 gr% dari harga standart.
Sedangkan harga albumin, diperoleh hasil 0,62 melebihi 0,62 gr% dari harga standart normal.
Pembahasan :
Jumlah total protein yang lebih 0,85 gr% dan jumlah albumin lebih 0,62 gr% dari harga standart tersebut disebabkan oleh beberapa factor yaitu :
1. Kesalahan dalam pembacaan spektrofotometer 2. Kurang bersih dalam membersihkan tabung kuvet, sehingga terjadi kesalahan dalam pembacaan spektrofotometer, sehingga apabila tersentuh oleh jari tangan maka lipid/minyak pada permukaan kulit jari akan menempel pada tabung kuvet yang mempengaruhi pambacaan. Reagen Biuret direaksikan dengan campuran larutan total protein dan albumin untuk memudahkan pembacaan pada spektrofotometer. Reagen Biuret ini dibentuk dari 300 ml NaOH 5,7 N ( 95 ml NaOH jenuh diencerkan sampai 300 ml) dengan 100 ml CuSO 4 1%. Kadar albumin ditentukan sesudah globulin dipisahkan dengan mengendapkannya memakai larutan Na2SO4 23% dan selanjutnya digumpalkan dengan dietileter. Pemberian dietileter juga dimaksudkan untuk menghilangkan kekeruhan yang mungkin terjadi oleh karena adanya lipid di dalam serum. Kekeruhan akan mempengaruhi pembacaan.
Albumin adalah protein utama dalam plasma darah Albumin (69 kDa) adalah protein utama dalam plasma manusia (3,4-4,7 g/dL) dan membentuk sekitar 60% protein plasma total. Sekitar 40% albumin terdapat dalam plasma, dan 60% sisanya terdapat di ruang ekstrasel. Hati menghasilkan sekitar 12 g albumin per hari, yaitu sekitar 25% dari semua sintesis protin oleh hati dan separuh jumlah protein yang disekresikannya. Sintesis albumin berkurang pada beragam penyakit, terutama penyakit hati. Plasma protein dengan penyakit hati sering memperlihatkan penurunan rasio albumin terhadap globulin. Pembentukan albumin mengalami penurunan relative dini pada kondisi-kondisi malnutrisi protein, misalnya kwashiorkor.
Albumin manusia terdiri dari satu rantai polipeptida dengan 585 asam amino dan mengandung 17 ikatan disulfide. Albumin berbentuk elips yang berarti bahwa albumin tidak meningkatkan viskositas plasma sebanyak peningkatan yang dilakukan oleh molekul panjang seperti fibrinogen. Karena massa molekulnya yang relative rendah dan
konsentrasinya yang tinggi, albumin diperkirakan menentukan sekitar 75-80% tekanan osmotic plasma manusia. Ada beberapa orang yang dalam plasma nya tidak terdapat albumin disebut analbuminemia. Penyebab nya adalah mutasi yang mempengaruhi penggabungan ( splicing ). Orang dengan albuminemia memperlihatkan edema sedang. Fungsi penting albumin lainnya adalah: kemampuannya mengikat berbagai ligan . Ligan-ligan tersebut mencakup asam lemak bebas (FFA), kalsium, hormone steroid tertentu,bilirubin, dan sebagian triptofan plasma. Selain itu, albumin juga nampaknya berperan penting dalam mengangkut tembaga dalam tubuh manusia.
Kaitan dengan klinis: Jika jumlah albumin menurun, misalnya pada pasien sirosis hati maka sel-sel hepatosit dalam hati akan mengkerut kemudian ruang-ruang kosong dalam sel hepatosit itu diisi dengan jaringan fibrotic yang akan membentuk jaringan parut, seperti yang diterangkan di atas bahwa albumin menentukan tekanan osmotic dan onkotik plasma manusia menurun sehingga terjadi penurunan cairan yang terjadi secara berlebihan di rongga peritoneum yang disebut sebagai ascites.
E. KESIMPULAN
Percobaan kali ini menggunakan metode Kingsley, dan hasil yang didapatkan adalah kurang akurat untuk kedua naracoba. Hal ini dapat disebabkan oleh kesalahan pengambilan serum, penambahan reagen, maupun kesalahan pada pembacaan spektrofotometer. Kadar normal untuk Total Protein adalah 6-8 gr%, Albumin 3,5-5 gr%, dan Globulin 1-2 gr%, sementara hasil yang didapatkan pada percobaan kali ini sedikit di atas normal. Protein sangat penting untuk menyusun sel-sel tubuh, keratinisasi, pembentukan kolagen, hormone, enzyme, maupun protein transporter sehingga kebutuhan akan protein merupakan suatu kebutuhan yang harus dicukupi. Kadar protein pada diri seseorang dapat dipengaruhi oleh asupan makanan dan karena protein disintesis di hati, kondisi hati seseorang dapat sangat mempengaruhi kadar protein dalam darah. Minimnya kadar protein dapat menandakan kerusakan atau malfungsi dari hati seseorang, sehingga pengukuran kadar protein merupakan hal yang sangat penting untuk diketahui.
