Pengantar Biokimia Gizi
Tanggal Mulai : 5 November 2010 Tanggal Selesai : 12 November 2010
PROTEIN DAN ASAM AMINO
Kelompok 5: Endah Fitri Maharani Nurul Fitriyah Resita Nurbayani Stacey Athalia G Yudhi Adrianto
I14104017 I14104018 I14104015 I14104025 I14104004
Asisten Praktikum: Irni Fahriani Yulaika Widhiastuti Penanggung Jawab Praktikum: Ir. Titi Riani M. Biomed
DEPARTEMEN GIZI MASYARAKAT FAKULTAS EKOLOGI MANUSIA INSTITUT PERTANIAN BOGOR 2010
PENDAHULUAN Latar Belakang Protein adalah salah satu bio-makromolekul yang penting peranannya dalam makhluk hidup. Fungsi dari protein itu sendiri secara garis besar dapat dibagi ke dalam dua kelompok besar, yaitu sebagai bahan struktural dan sebagai mesin yang bekerja pada tingkat molekular. Apabila tulang dan kitin adalah beton, maka protein struktural adalah dinding batu batanya. Beberapa protein struktural, fibrous protein, berfungsi sebagai pelindung, sebagai contoh keratin yang terdapat pada kulit, rambut, dan kuku. Sedangkan protein struktural lain ada juga yang berfungsi sebagai perekat, seperti kolagen. Protein dapat memerankan fungsi sebagai bahan struktural karena seperti halnya polimer lain, protein memiliki rantai yang panjang dan juga dapat mengalami cross-linking dan lain-lain. Selain itu protein juga dapat berperan sebagai biokatalis untuk reaksi-reaksi kimia dalam sistem makhluk hidup. Makromolekul ini mengendalikan jalur dan waktu metabolisme yang kompleks untuk menjaga kelangsungan hidup suatu organisme. Suatu sistem metabolisme akan terganggu apabila biokatalis yang berperan di dalamnya mengalami kerusakan. Protein adalah molekul yang sangat vital untuk organisme dan terdapat di semua sel. Protein merupakan polimer yang disusun oleh 20 macam asam amino standar. Rantai asam amino dihubungkan dengan ikatan kovalen yang spesifik. Struktur dan fungsi ditentukan oleh kombinasi, jumlah, dan urutan asam amino, sedangkan sifat fisik dan kimiawi dipengaruhi oleh asam amino penyusunnya (Murray dan Robert 2003). Asam amino merupakan unit pembangun protein yang dihubungkan melalui ikatan peptida pada setiap ujungnya. Protein tersusun dari atom C, H, O, dan N, serta kadang-kadang P dan S. Dari keseluruhan asam amino yang terdapat di alam hanya 20 asam amino yang yang biasa dijumpai pada protein (Murray dan Robert 2003).
Gambar 1 Struktur molekul asam amino
Tujuan Tujuan Umum Tujuan umum dari pembuatan laporan praktikum ini adalah untuk mengetahui beberapa pengujian protein dan asam amino. Tujuan Khusus 1. Mengetahui hasil uji pengendapan oleh logam 2. Mengetahui hasil uji pengendapan oleh garam 3. Mengetahui hasil uji koagulasi 4. Mengetahui hasil uji pengendapan alkohol 5. Mengetahui hasil uji denaturasi protein 6. Mengetahui hasil uji biuret 7. Mngetahui hasil uji millon
METODOLOGI Waktu dan Tempat Praktikum pengujian protein dan asam amino ini dilakukan pada tanggal 05 November 2010 dan 12 November 2010 pada pukul 16.00-18.30 WIB. Tempat praktikum di Laboratorium Biokimia lantai dua Departemen Gizi Masyarakat IPB Darmaga. Alat dan Bahan Pengendapan oleh Logam Pengamatan pengendapan protein oleh logam dapat dilakukan dengan pengamatan langsung pada endapan logam yang terbentuk akibat reaksi protein dengan garam logam berat. Bahan-bahan yang digunakan untuk pengamatan ini adalah larutan albumin telur 2%, larutan Pb-asetat 5%, larutan HgCl2 2%, dan larutan AgNO3 5%. Alat-alat yang digunakan untuk pengamatan ini adalah tabung reaksi, pipet tetes, gelas ukur, dan pipet gondok. Pengendapan oleh Garam Pengamatan pengendapan protein oleh garam dapat dilakukan dengan pengamatan langsung pada endapan yang terbentuk akibat reaksi protein dengan garam anorganik. Hal tersebut dapat terjadi karena kemampuan ion garam terhidrasi sehingga berkompetisi dengan molekul air untuk mengikat air. Bahan-bahan yang digunakan untuk pengamatan ini adalah larutan albumin telur 2%, Kristal (NH4)2SO4, pereaksi Millon, dan pereaksi Biuret. Alat-alat yang digunakan untuk pengamatan ini adalah tabung erlenmeyer, pipet tetes, kertas saring, gelas ukur, corong dan pipet gondok. Uji Koagulasi Uji koagulasi dapat dilakukan dengan pengamatan langsung pada endapan yang terjadi pada titik isoelektrik yang diakibatkan terjadi denaturasi sehingga kelarutan protein tersebut berkurang. Bahan-bahan yang digunakan untuk pengamatan ini adalah larutan albumin telur 2%, larutan asam asetat 1 M, dan pereaksi Millon. Alat-alat yang digunakan untuk pengamatan ini adalah
tabung erlenmeyer, pipet tetes, tabung reaksi, batang pengaduk, penangas air, gelas ukur, gelas kimia 1 L, dan pipet gondok. Pengendapan oleh Alkohol Pengamatan pengendapan protein oleh alkohol dapat dilakukan dengan pengamatan langsung pada endapan yang terbentuk akibat reaksi protein dengan larutan alkohol (larutan organik). Bahan-bahan yang digunakan untuk pengamatan ini adalah larutan albumin, HCL 0,1 M, NaOH 0,1 M, buffer asetat Ph 4,7, etanol 95%. Alat-alat yang digunakan untuk pengamatan ini adalah labu Erlenmeyer, gelas ukur, pipet tetes, pipet gondok,batang pengaduk, dan tabung reaksi. Denaturasi Protein Pengamatan denaturasi protein dapat dilakukan dengan pengamatan langsung pada endapan yang terbentuk. Bahan-bahan yang digunakan untuk pengamatan ini adalah larutan albumin, HCL 0,1 M, NaOH 0,1 M dan buffer asetat Ph 4,7. Alat-alat yang digunakan untuk pengamatan ini adalah labu Erlenmeyer, gelas ukur, pipet tetes, pipet gondok, gelas kimia, penangas air, batang pengaduk, dan tabung reaksi. Uji Millon Pengamatan uji Millon dapat dilakukan dengan pengamatan langsung pada timbulnya warna merah yang terbentuk pada larutan. Warna merah tersebut adalah garam merkuri dari tirosin yang ternitrasi. Bahan-bahan yang digunakan untuk pengamatan ini adalah larutan albumin 2%, larutan kasein 2%, larutan gelatin 2%, dan pereaksi Millon. Alat-alat yang digunakan untuk pengamatan ini adalah labu Erlenmeyer, gelas ukur, pipet tetes, pipet gondok, gelas kimia, penangas air, batang pengaduk, dan tabung reaksi. Uji Biuret Pengamatan uji biuret dapat dilakukan dengan pengamatan langsung pada timbulnya warna violet yang terbentuk pada larutan dengan CuSO4. Bahanbahan yang digunakan untuk pengamatan ini adalah larutan albumin 2%, larutan kasein 2%, larutan gelatin 2%, NaOH 10% dan CuSO4. Alat-alat yang digunakan untuk pengamatan ini adalah labu Erlenmeyer, gelas ukur, pipet tetes, pipet gondok, batang pengaduk, dan tabung reaksi.
Prosedur Percobaan Pengendapan oleh Logam 3 tabung yang berisi 3 mL larutan protein disiapkan masing-masing tabung ditetesi dengan berurutan dengan 5 tetes larutan Pbasetat 5%, larutan HgCl2 2%, dan larutan AgNO3 5% Gambar 2 Prosedur percobaan pengendapan oleh logam Pengendapan oleh Garam 10 mL larutan protein disiapkan Ditambah (NH4)2SO4 sedikit demi sedikit, hingga larutan mencapai titik jenuh Disaring Endapan diuji kelarutannya dengan air Endapan diuji dengan pereaksi millon dan filtrate diuji dengan pereaksi biuret Gambar 3 Prosedur percobaan pengendapan oleh garam Uji Koagulasi 5 mL Larutan albumin protein disiapkan
Ditambah 2 tetes asam asetat 1M Dipanaskan dalam air mendidih selama 5 menit
Endapan diambil dengan batang pengaduk Endapan tersebut diuji kelarutannya dengan air Endapan diuji dengan pereaksi millon
Gambar 4 Prosedur percobaan uji koagulasi Pengendapan oleh Alkohol 3 buah tabung reaksi disiapkan Tabung Larutan albumin HCl 0,1 M NaOH 0,1 M Bufer asetat pH 4,7 Etanol 95 %
1 5 mL 1 mL 6 mL
2 5 mL 1 mL 6 mL
3 5 mL 1 mL 6 mL
Kelarutan dan endapan diamati Gambar 5 Prosedur percobaan pengendapan oleh alkohol Denaturasi Protein 3 buah tabung reaksi disiapkan Tabung Larutan albumin HCl 0,1 M NaOH 0,1 M Bufer asetat pH 4,7
1 9 mL 1 Ml -
2 9 mL 1 mL
Didihkan selama 15 menit Didinginkan pada temperature kamar Diamati Tabung 1 dan 2 ditambahkan 10 mL buffer asetat pH 4,7 Gambar 6 Prosedur percobaan denaturasi protein Uji Millon 3 mL Larutan albumin protein disiapkan
Ditambah 5 tetes pereaksi Millon Dipanaskan
3 9mL -
Diamati Gambar 7 Prosedur percobaan uji Millon Uji Biuret 3 mL Larutan albumin protein disiapkan
Ditambah 1 mL NaOH dan dikocok Ditambah 1 tetes larutan CuSO4 0,1% dan dikocok
Diamati Gambar 8 Prosedur percobaan uji biuret
TINJAUAN PUSTAKA Protein Istilah protein diperkenalkan pada tahun 1830-an oleh pakar kimia Belanda bernama Mulder, yang merupakan salah satu dari orang-orang pertama yang mempelajari kimia dalam protein secara sistematik. Ia secara tepat menyimpulkan peranan inti dari protein dalam sistem hidup dengan menurunkan nama dari bahasa Yunani proteios, yang berarti “bertingkat pertama”. Protein merupakan makromolekul yang menyusun lebih dari separuh bagian dari sel. Protein menentukan ukuran dan struktur sel, komponen utama dari sistem komunikasi antar sel serta sebagai katalis berbagai reaksi biokimia di dalam sel, karena itulah sebagian besar aktivitas penelitian biokimia tertuju pada protein khususnya hormon, antibodi, dan enzim. Semua jenis protein terdiri dari rangkaian dan kombinasi dari 20 asam amino. Setiap jenis protein mempunyai jumlah dan urutan asam amino yang khas. Di dalam sel, protein terdapat baik pada membran plasma maupun membran internal yang menyusun organel sel seperti mitokondria, retikulum endoplasma, nukleus, dan badan golgi dengan fungsi yang berbeda-beda tergantung pada tempatnya. Protein-protein yang terlibat dalam reaksi biokimia sebagian besar berupa enzim banyak terdapat di dalam sitoplasma dan sebagian terdapat pada kompartemen dari organel sel. Protein merupakan kelompok biomakromolekul yang sangat heterogen. Ketika berada di luar makhluk hidup atau sel, protein sangat tidak stabil. Protein merupakan
komponen
utama
bagi
semua
benda
hidup
termasuk
mikroorganisme, hewan dan tumbuhan. Protein merupakan rantai gabungan 22 jenis asam amino. Protein memainkan berbagai peranan dalam benda hidup dan bertanggung jawab untuk fungsi dan ciri-ciri benda hidup. Keistimewaan lain dari protein yaitu strukturnya yang mengandung N (15,30-18%), C (52,40%), H (6,907,30%), O (21-23,50%), S (0,8-2%), disamping C, H, O (seperti juga karbohidrat dan lemak), dan S atau P, Fe, dan Cu (sebagai senyawa kompleks dengan protein). Salah satu cara terpenting yang cukup spesifik untuk menentukan jumlah protein secara kuantitatif adalah dengan penentuan kandungan N yang ada dalam bahan makanan atau bahan lain (Sudarmaji 1989).
Menurut Lehninger (1982), protein diperkenalkan sebagai molekul makro pemberi keterangan,
karena urutan asam
amino dari protein tertentu
mencerminkan keterangan genetik yang terkandung dalam urutan basa dari bagian yang bersangkutan dalam DNA yang mengarahkan biosintesis protein. Setiap jenis protein ditandai ciri-cirinya oleh: 1. Susunan kimia yang khas 2. Bobot molekular yang khas 3. Urutan asam amino yang khas. Protein memegang peranan penting dalam berbagai proses biologis. Peran-peran tersebut antara lain: 1. Katalisis enzimatik 2. Transportasi dan penyimpanan 3. Koordinasi gerak 4. Penunjang mekanis 5. Proteksi imun 6. Membangkitkan dan menghantarkan impuls saraf 7. Pengaturan pertumbuhan dan diferensiasi (Sloane 2004). Jenis-jenis protein diantaranya adalah: a. Kolagen, protein struktur yang diperlukan untuk membentuk kulit, tulang, dan ikatan tisu b
Antibodi, protein sistem pertahanan yang melindungi badan daripada serangan penyakit
c Dismutase superoxide, protein yang membersihkan darah kita d Ovulbumin, protein simpanan yang memelihara badan. e Hemoglobin, protein yang berfungsi sebagai pembawa oksigen f Toksin, protein racun yang digunakan untuk membunuh kuman g Insulin, protein hormon yang mengawal aras glukosa dalam darah h Tripsin, protein yang mencernakan makanan protein (Girindra 1993). Menurut Lehninger (1982), fungsi protein dibagi menjadi dua kelompok besar, yaitu sebagai bahan struktural dan sebagai mesin yang bekerja pada tingkat molekuler. protein dapat memerankan fungsinya sebagai bahan struktural karena seperti halnya polimer lain, protein memiliki rantai yang panjang dan juga dapat mengalami cross-linking dan selain itu juga dapat berperan sebagai biokatalis untuk reaksi-reaksi kimia dalam sistem makhluk hidup. Struktur protein terdiri dari empat macam struktur :
1. Struktur primer (struktur utama) Struktur ini terdiri dari asam-asam amino yang dihubungkan satu sama lain secara kovalen melalui ikatan peptida. Struktur ini terdiri atas asam amino yang dihubungkan satu sama lain secara kovalen melalui ikatan peptida. Ujung dari polipeptida yang terbentuk ini memiliki sifat kimia yang berbeda, yaitu mempunyai gugus amino bebas (ujung N atau amino, NH2-) dan mempunyai gugus karboksil bebas (ujung C atau karboksil, COOH-). Oleh karena itu arah polipeptida dan dituliskan baik N→C (kiri ke kanan) maupun C →N (kanan ke kiri).
Gambar 9 Struktur primer protein 2. Struktur sekunder Protein sudah mengalami interaksi intermolekul, melalui rantai samping asam amino. Ikatan yang membentuk struktur ini, didominasi oleh ikatan hidrogen antar rantai samping yang membentuk pola tertentu bergantung pada orientasi ikatan hidrogennya. Ada dua jenis struktur sekunder, yaitu: α-heliks dan β-sheet. Ikatan yang membentuk struktur ini didominasi oleh ikatan hidrogen antara rantai samping yang membentuk pola tertentu bergantung pada orientasi ikatan hidrogennya.
Gambar 10 Struktur sekunder protein 3. Struktur Tersier Struktur tersier terbentuk karena adanya lipatan yang membentuk struktur yang kompleks. Lipatan distabilkan oleh ikatan hidrogen, ikatan disulfida, interaksi ionik, ikatan hidrofobik, dan ikatan hidrofilik. Interaksi intra molekuler yang terjadi seperti ikatan hidrogan, ikatan ion, van der waals, dan hidropobik yang turut menentukan orientasi struktur tiga dimensi dari protein.
Gambar 11 Struktur tersier protein 4. Struktur Kuartener Struktur Kuartener terbentuk dari beberapa bentuk tersier, dengan kata lain multi subunit. Interaksi intermolekul antar subunit protein ini membentuk struktur keempat atau kuartener. Interaksi intermolekul antar subunit protein ini membentuk struktur keempat/kwaterner. Setiap subunit protein dapat melakukan komunikasi dan saling mempengaruhi satu sama lain melalui interaksi intermolekuler. Beberapa struktur protein terikat dengan jembatan disulfida antara polipeptida yang berbeda, tetapi banyak protein terdiri dari asosiasi subunit yang lebih lemah yang dihubungkan dengan ikatan hidrogen dan efek hidrofobik. Protein ini dapat kembali pada komponen polipeptidanya atau berubah komposisi subunitnya tergantung pada kebutuhan fungsinya.
Gambar 12 Struktur kuartener protein Asam Amino Asam amino merupakan unit pembangun protein yang dihubungkan melalui ikatan peptida pada setiap ujungnya. Protein tersusun dari atom C, H, O, dan N, atau P dan S. Asam amino yang terdapat di alam hanya 20 asam amino yang yang biasa dijumpai pada protein.
Gambar 13 Struktur molekul asam amino Asam amino mempunyai dua gugus pada tiap molekulnya, yaitu gugus amino dan gugus karboksil, yang digambarkan sebagai struktur ion dipolar. Gugus amino dan gugus karboksil pada asam amino menunjukkan sifat-sifat spesifik. Sebagai contoh adalah reaksi asetilasi dan esterifikasi. Asam amino juga bersifat amfoter, yaitu dapat bersifat sebagai asam dan memberikan proton kepada basa kuat, atau dapat bersifat sebagai basa dan menerima proton dari basa kuat. Semua asam amino yang ditemukan pada protein mempunyai ciri yang sama, gugus karboksil dan amino diikat pada atom karbon yang sama. Masing-masing berbeda satu dengan yang lain pada gugus R-nya, yang bervariasi dalam struktur, ukuran, muatan listrik, dan kelarutan dalam air. Beberapa asam amino mempunyai reaksi yang spesifik yang melibatkan gugus R-nya (Lehninger 1982). Melalui reaksi hidrolisis protein telah didapatkan 20 macam asam amino yang dibagi berdasarkan gugus R-nya, berikut dijabarkan penggolongan tersebut yaitu asam amino non-polar dengan gugus R yang hidrofobik, antara lain Alanin, Valin, Leusin, Isoleusin, Prolin, Fenilalanin, Triptofan, dan Metionin. Golongan kedua yaitu asam amino polar tanpa muatan pada gugus R yang beranggotakan Lisin, Serin, Treonin, Sistein, Tirosin, Asparagin, dan Glutamin. Golongan ketiga yaitu asam amino yang bermuatan positif pada gugus R dan golongan keempat yaitu asam amino yang bermuatan negatif pada gugus R. Dari ke-20 asam amino yang ada, dijumpai delapan macam asam amino esensial yaitu Valin, Leusin, Isoleusin, Metionin, Fenilalanin, Triptofan, Treonin, dan Lisin. Asam amino essensial ini tidak bisa disintesis sendiri oleh tubuh manusia sehingga harus didapatkan dari luar seperti makanan dan zat nutrisi lainnya (Girindra 1993).
HASIL DAN PEMBAHASAN Protein Larutan protein yang digunakan dalam praktikum ini adalah larutan albumin. Albumin adalah protein yang dapat larut dalam air serta dapat terkoagulasi oleh panas. Albumin terdapat dalam serum darah dan putih telur (Poedjiadi 1994). Denaturasi, koagulasi, dan redenaturasi dapat dibedakan sebagai berikut. Denaturasi protein adalah suatu keadaan telah terjadinya perubahan struktur protein yang mencakup perubahan bentuk dan lipatan molekul, tanpa menyebabkan pemutusan atau kerusakan lipatan antar asam amino dan struktur primer protein. Koagulasi adalah denaturasi protein akibat panas dan alkohol (Winarno
2002). Redenaturasi adalah denaturasi protein yang berlangsung
secara reveresibel (Poedjiadi 1994). Uji Pengendapan oleh Logam Garam logam berat seperti Ag, Pb, dan Hg akan membentuk endapan logam proteinat. Ikatan yang terbentuk amat kuat dan akan memutuskan jembatan garam, sehingga protein mengalami denaturasi. Secara bersama gugus -COOH dan gugus -NH2 yang terdapat dalam protein dapat bereaksi dengan ion logam berat dan membentuk senyawa kelat. Ion-ion tersebut adalah Ag+, Ca++, Zn++, Hg++, Fe++, Cu++, Co++, Mn++, dan Pb++. Selain gugus -COOH. dan gugus -NH2, gugus -R pada molekul asam amino tertentu dapat pula terjadi reaksi dengan ion atau senyawa lain. Gugus sulfihidril (-SH) pada molekul sistein akan bereaksi dengan ion Ag+ atau Hg++ (Poedjiadi 1994). No 1 2 3
Tabel 1 Hasil uji pengendapan oleh logam Larutan Campuran Hasil Larutan protein+HgCl2 2% Warna bening, terdapat endapan Larutan protein+AgNO3 5% Warna putih (+++), terdapat endapan Larutan protein+Pb-asetat 5% Warna putih (++), terdapat endapan Hasil percobaan diketahui bahwa reaksi antara logam berat dan albumin
menghasilkan endapan, endapan yang paling banyak dihasilkan oleh AgNO3 diikuti Pb-asetat dan HgCl2. Logam Ag dan Pb lebih reaktif daripada Hg karena kedua logam tersebut merupakan logam transisi pada sistem periodik unsur.
Garam logam berat sangat berbahaya bila sampai tertelan karena garam tersebut akan mendenaturasi sekaligus mengendapkan protein sel-sel tubuh. Uji Pengendapan oleh Alkohol Protein dapat diendapkan dengan penambahan alkohol. Pelarut organik akan mengubah (mengurangi) konstanta dielektrika dari air, sehingga kelarutan protein berkurang, dan juga karena alkohol akan berkompetisi dengan protein terhadap air (Poedjiadi 1994). No 1 2 3
Tabel 2 Hasil uji pengendapan oleh alkohol Larutan campuran Larut Tidak larut Larutan albumin+HCl 0,5 M+etanol 95% Larutan albumin+NaOH 0,1 M+etanol 95% Larutan albumin+buffer asetat pH 4,7+etanol 95% Pada uji pengendapan protein oleh alkohol, endapan hanya dihasilkan
oleh buffer asetat, tetapi pada HCl dan NaOH tidak terdapat endapan. Buffer asetat menghasilkan endapan karena memiliki pH 4,7 yang sama dengan pH isolistrik albumin (4,55-4,90). Pada HCL dan NaOH tidak terdapat endapan karena HCl merupakan asam kuat dan NaOH adalah basa kuat, jadi pH yang terlalu asam atau terlalu basa akan membuat larutan albumin menjadi larut dan tidak terjadi endapan. Uji Pengendapan oleh Garam Kelarutan protein akan berkurang bila ke dalam larutan protein ditambahkan garam-garam anorganik, akibatnya protein akan terpisah sebagai endapan. Peristiwa pemisahan protein ini disebut salting out. Bila garam netral yang ditambahkan berkonsentrasi tinggi, maka protein akan mengendap. Pengendapan terus terjadi karena kemampuan ion garam untuk menghidrasi, sehingga terjadi kompetisi antara garam anorganik dengan molekul protein untuk mengikat air. Karena garam anorganik lebih menarik air maka jumlah air yang tersedia untuk molekul protein akan berkurang (Winarno 2002). Larutan albumin dalam air dapat diendapkan dengan penambahan amoniumsulfat ((NH4)2SO4) hingga jenuh (Poedjiadi 1994). No a. b. c.
Tabel 3 Hasil uji pengendapan oleh garam Pereaksi Hasil Larutan albumin+(NH4)2SO4 Endapan dilarutkan dengan air Terbentuk endapan, warna bening Endapan dilarutkan dengan Millon Terbentuk endapan, warna bening Endapan dilarutkan dengan Biuret Tidak terbentuk endapan, warna
bening kebiruan Setelah larutan albumin dijenuhkan dengan (NH4)2SO4, uji kelarutan endapan yang terjadi dengan air menunjukkan hasil positif (endapan larut membentuk butiran). Kemudian butiran direaksikan dengan pereaksi Millon, dan bereaksi positif dengan ditandai endapan dan tidak berwarna. Uji filtrat dengan pereaksi biuret menunjukkan hasil negatif yang ditandai dengan tidak terbentuknya endapan dan memiliki warna bening kebiruan. Pengujian endapan yang dihasilkan dengan pereaksi Millon bertujuan untuk mengetahui ada tidaknya kandungan tirosin, sedangkan pengujian filtrat dengan pereaksi biuret bertujuan untuk mengetahui ada tidaknya gugus amida pada filtrat yang dihasilkan. Uji Denaturasi Protein Denaturasi protein meliputi gangguan dan kerusakan yang mungkin terjadi pada struktur sekunder dan tersier protein. Sejak diketahui reaksi denaturasi tidak cukup kuat untuk memutuskan ikatan peptida, dimana struktur primer protein tetap sama setelah proses denaturasi. Denaturasi terjadi karena adanya gangguan pada struktur sekunder dan tersier protein (Ophart 2003). Panas dapat digunakan untuk mengacaukan ikatan hidrogen dan interaksi hidrofobik non polar. Hal ini terjadi karena suhu tinggi dapat meningkatkan energi kinetik dan menyebabkan molekul penyusun protein bergerak atau bergetar sangat cepat sehingga mengacaukan ikatan molekul tersebut.
Protein
telur
mengalami
denaturasi
dan
terkoagulasi
selama
pemasakan. Beberapa makanan dimasak untuk mendenaturasi protein yang dikandung supaya memudahkan enzim pencernaan dalam mencerna protein. Pemanasan akan membuat protein bahan terdenaturasi sehingga kemampuan mengikat airnya menurun. Hal ini terjadi karena energi panas akan mengakibatkan terputusnya interaksi non kovalen yang ada pada struktur alami protein tapi tidak memutuskan ikatan kovalennya yang berupa ikatan peptida. Proses ini biasanya berlangsung pada kisaran suhu yang sempit (Ophart 2003). No 1 2 3
Tabel 4 Hasil uji denaturasi protein Larutan campuran Hasil Larutan albumin 9 mL+NaOH 1 Tidak larut, endapan yang terbentuk mL paling banyak Larutan albumin 9 mL+bufer Tidak larut, endapan yang terbentuk asetat pH 4,7 banyak Larutan albumin 9 mL+HCl 0,1 M Tidak larut, endapan yang terbentuk sedikit
Pada uji denaturasi, larutan albumin yang dipanaskan pada air mendidih yang ditambahkan dengan NaOH membentuk endapan paling banyak. Karena NaOH merupakan basa kuat, sehingga panas mampu memutuskan ikatan hidrogen dan akan menyebabkan penggumpalan lebih banyak daripada larutan yang memiliki pH sedang seperti buffer asetat dan pada asam kuat (HCl). Uji Koagulasi Seperti asam amino, protein yang larut dalam air akan membentuk ion yang mempunyai muatan positif dan negatif. Dalam suasana asam molekul protein akan membentuk ion positif, sedangkan dalam suasana basa akan membentuk ion negatif. Pada titik isolistrik protein mempunyai muatan positif dan negatif yang sama, sehingga tidak bergerak ke arah elektroda positif maupun negatif apabila ditempatkan di antara kedua elektroda tersebut. Protein mempunyai titik isolistrik yang berbeda-beda. Titik isolistrik protein mempunyai arti penting karena pada umumnya sifat fisika dan kimia erat hubungannya dengan pH isolistrik ini. Pada pH di atas titik isolistrik protein bermuatan negatif, sedangkan di bawah titik isolistrik, protein bermuatan positif. Titik isolistrik pada albumin adalah pada pH 4,55-4,90 (Poedjiadi 1994). Adanya gugus amino dan karboksil bebas pada ujung-ujung rantai molekul protein, menyebabkan protein mempunyai banyak muatan (polielektrolit) dan bersifat amfoter (dapat bereaksi dengan asam maupun basa). Daya reaksi berbagai jenis protein terhadap asam dan basa tidak sama, tergantung dari jumlah dan letak gugus amino dan karboksil dalam molekul. Dalam larutan asam (pH rendah), gugus amino bereaksi dengan H+, sehingga protein bermuatan positif. Sebaliknya, dalam larutan basa (pH tinggi) molekul protein akan bereaksi sebagai asam atau bermuatan negatif. Pada pH isolistrik muatan gugus amino dan karboksil bebas akan saling menetralkan sehingga molekul bermuatan nol (Winarno 2002). No 1 2
Tabel 5 Hasil uji koagulasi Larutan campuran Hasil Larutan albumin+larutan asetat 1 M+Millon Terjadi endapan Larutan albumin+larutan asetat 1 M+Millon+air Tidak terjadi endapan Pada uji koagulasi, penambahan asam asetat bertujuan agar larutan
albumin mencapai pH isolistriknya sehingga bisa terkoagulasi. Hasil uji kelarutan endapan dengan air menunjukkan hasil negatif. Setelah endapan diuji dengan pereaksi Millon, warna berubah menjadi merah bata yang artinya terjadi reaksi positif. Pengujian endapan yang dihasilkan dengan pereaksi Millon bertujuan untuk mengetahui ada tidaknya kandungan tirosin.
Asam amino Uji Millon Pada percobaan kedua, dilakukan uji protein dengan pereaksi Millon untuk mendeteksi adanya raksa dan asam amino untuk mendeteksi adanya gugus fenil. Protein adalah bahan organik kompleks yang terdiri daripada satu atau lebih rangkaian subunit asam amino. Molekul protein mempunyai banyak asam amino. Sel dalam tubuh memerlukan protein untuk menjalankan berbagai fungsi. Fungsi protein yang paling penting ialah sebagai enzim, molekul struktur, hormon, dan molekul pengangkut oksigen. Selain itu, protein juga adalah bahan utama untuk sintesis antibodi dan protein plasma darah (Winarno 2002). Uji Millon merupakan uji untuk mengetahui keberadaan protein pada suatu bahan makanan. Pereaksi Millon adalah larutan merkuro dan merkuri nitrat dalam asam nitrat. Apabila pereaksi ini ditambahkan pada larutan protein, akan menghasilkan endapan putih yang dapat berubah menjadi merah oleh pemanasan.
Larutan
Kelompok 1
Kasein
Merah Muda (+)
Albumin
Tabel 6 Hasil uji Millon Warna Kelompok 2 Kelompok 3 Keruh (+) Merah (ada Muda (+) gumpalan merah muda) Merah Merah Muda (+) Muda (+)
Kelompok 4 Merah Muda (+)
Kelompok 5 Merah Muda (+)
Kuning Merah Merah Keruh (-) Muda (+) Muda (++) (berbuih di bagian atasnya) Gelatin Kuning Kuning Kuning Kuning Kuning Bening (-) Bening (-) Muda (-) Muda (-) Bening (-) Protein adalah polimer asam amino. Protein mempunyai unsur C, H, O
dan N. Semua asid amino (asam amino) mempunyai struktur yang sama, yaitu karbon utama yang mempunyai ikatan kepada 4 jenis kumpulan, kumpulan tersebut ialah (i)kumpulan amino (-NH2), (ii)kumpulan karboksil (-COOH), (iii)satu hydrogen, dan (iv)satu kumpulan variabel, diwakili dengan R. Struktur dan fungsi protein adalah ditentukan oleh kelainan pada kumpulan R ini. Adapun ciri-ciri dari molekul protein adalah berat molekulnya besar, ribuan sampai jutaan, sehingga merupakan suatu makromolekul. Umumnya terdiri dari 20 macam asam amino. Terdapat ikatan kimia lain, yang menyebabkan terbentuknya lengkungan-
lengkungan rantai polipeptida menjadi struktur tiga dimensi protein. Strukturnya tidak stabil terhadap beberapa faktor: pH, radiasi, temperatur, medium pelarut orgenik, dan detergen. Percobaan uji dengan peraksi Millon menandakan protein yang mengandung
triosin
atau
triptofan,
penambahan
pereaksi
Millon
akan
memberikan warna merah. Pereaksi yang digunakan dalam uji Millon adalah larutan merkuri dan ion merkuro dalam asam nitrat dan asam nitrit. Warna merah yang terbentuk adalah garam merkuri dari tirosin yang ternitrasi. Pada kasein dan albumin terbentuk warna merah muda, hal ini menandakan bahwa kasein dan albumin ternitrasi serta memiliki atau mengandung tirosin. Sedangkan pada gelatin setelah di teteskan pereaksi millon menghasilkan warna kuning, hal ini menandakan bahwa gelatin tidak ternitrasi dan tidak mengandung tirosin. Uji Biuret Uji Biuret merupakan uji biokimia untuk mendeteksi protein dalam larutan, dinamai menurut senyawa biuret (H2NCONHCONH2) yang terbentuk jika urea dipanaskan. Natrium hidroksida dicampur dengan larutan uji dan kemudian tetesan larutan CuSO4 1% ditambahkan perlahan-lahan. Hasil positif dinyatakan oleh
warna
violet.
Pada reaksi
ini
kemungkinan
terbentuk
senyawa
kompleks antara Cu2+ dengan pasangan elektron bebas dari gugus -NH ataupun gugus -CO dari rantai polipeptida. Syarat untuk dapat terjadi reaksi ini adalah adanya minimal dua ikatan peptida. Senyawa Biuret dihasilkan dengan cara memanaskan urea di atas penangas air. Dalam larutan basa, biuret memberikan warna violet dengan CuSO4. Reaksi ini disebut reaksi Biuret. Reaksi positif akibat pembentukan senyawa kompleks Cu++ gugus -CO dan -NH dari rantai peptida dalam suasana basa. Dipeptida dari asam-asam amino histidin, serin, dan treonin tidak memberikan reaksi positif untuk uji ini (Winarno 1992).
Larutan
Kelompok 1
Kasein
Ungu Bening (7 tetes)
Albumin
Ungu Bening (6 tetes) Ungu
Gelatin
Tabel 7 Hasil uji biuret Warna Kelompok Kelompok 2 3 Ungu Ungu Bening Bening (6 tetes) (5 tetes) Ungu Bening (6 tetes) Ungu
Ungu Bening (5 tetes) Ungu
Kelompok 4 Ungu Bening (4 tetes) Ungu Bening (4 tetes) Ungu Muda
Kelompok 5 Ungu Kemerah Mudaan (8 tetes) Ungu Bening (10 tetes) Ungu
Bening (6 tetes)
Bening (6 tetes)
Bening (9 tetes)
(3 tetes)
Bening (5 tetes)
Perubahan pada warna sampel uji akan memberikan hasil yang positif atau negatif. Ketika sampel berubah menjadi ungu itu berarti bahwa sampel mengandung protein, untuk menentukan konsentrasi sampel reaksi biuret protein dapat digunakan. Jika konsentrasi yang lebih, sampel akan berubah menjadi lebih ungu. Terdapat banyak kesamaan antara asam amino dan molekul biuret dan keduanya bereaksi dengan cara yang sama. Reaktan biuret adalah solusi biru muda, yang dapat berwarna ungu bila dicampur dengan larutan yang mengandung protein. Sebuah kompleks warna ungu terbentuk ketika ion tembaga dari biuret bereaksi dengan ikatan peptida pada rantai polipeptida. Karena protein dibuat dari asam amino, adanya ikatan peptida selama uji Biuret untuk protein akan selalu memberikan hasil positif untuk semua jenis makanan atau bahan makanan berbasis protein. Pada larutan kasein, konsentrasi biuret minimum yang membentuk warna sampel menjadi ungu adalah 4 tetes dan konsentrasi biuret maksimum yang membentuk warna sampel menjadi ungu adalah 8 tetes dengan hasil warna ungu kemerahmudaan. Pada larutan albumin konsentrasi biuret minimum yang membentuk warna sampel menjadi ungu adalah 4 tetes, dan konsentrasi biuret maksimum yang membentuk warna sampel menjadi ungu adalah 10 tetes. Pada larutan gelatin konsentrasi biuret minimum yang membentuk warna sampel menjadi ungu adalah 3 tetes, dan konsentrasi biuret maksimum yang membentuk warna sampel menjadi ungu adalah 9 tetes. Pada ketiga larutan kasein, albumin dan gelatin, masing-masing senyawa atau larutan tersebut mengandung protein, hal ini ditandai dengan terjadinya perubahan warna sampel larutan menjadi ungu setelah ditetesi pereaksi biuret.
KESIMPULAN DAN SARAN Kesimpulan Garam logam berat seperti Ag, Pb, dan Hg akan membentuk endapan logam proteinat. Ikatan yang terbentuk amat kuat dan akan memutuskan jembatan garam, sehingga protein mengalami denaturasi. Reaksi antara logam berat dan albumin menghasilkan endapan, endapan yang paling banyak dihasilkan oleh AgNO3 diikuti Pb-asetat dan HgCl2. Garam logam berat sangat berbahaya bila sampai tertelan karena garam tersebut akan mendenaturasi sekaligus mengendapkan protein sel-sel tubuh. Buffer asetat menghasilkan endapan karena memiliki pH 4,7 yang sama dengan pH isolistrik albumin (4,55-4,90). Pada HCL dan NaOH tidak terdapat endapan karena HCl merupakan asam kuat dan NaOH adalah basa kuat, jadi pH yang terlalu asam atau terlalu basa akan membuat larutan albumin menjadi larut dan tidak terjadi endapan. Uji kelarutan endapan yang terjadi dengan air menunjukkan hasil positif. Kemudian direaksikan dengan pereaksi Millon, dan bereaksi positif. Uji filtrat dengan pereaksi biuret menunjukkan hasil negatif. Pengujian endapan yang dihasilkan dengan pereaksi Millon bertujuan untuk mengetahui ada tidaknya kandungan tirosin, sedangkan pengujian filtrat dengan pereaksi biuret bertujuan untuk mengetahui ada tidaknya gugus amida pada filtrat yang dihasilkan. Pada uji denaturasi, larutan albumin yang dipanaskan pada air mendidih yang ditambahkan dengan NaOH membentuk endapan paling banyak. Karena NaOH merupakan basa kuat, sehingga panas mampu memutuskan ikatan hidrogen dan akan menyebabkan penggumpalan lebih banyak daripada larutan yang memiliki pH sedang seperti buffer asetat dan pada asam kuat (HCl). Penambahan asam asetat pada uji koagulasi bertujuan agar larutan albumin mencapai pH isolistriknya sehingga bisa terkoagulasi. Hasil uji kelarutan endapan dengan air menunjukkan hasil negatif. Setelah endapan diuji dengan pereaksi Millon, terjadi reaksi positif. Pengujian endapan yang dihasilkan dengan pereaksi Millon bertujuan untuk mengetahui ada tidaknya kandungan tirosin. Percobaan uji dengan peraksi Millon menandakan protein yang mengandung
triosin
atau
triptofan,
penambahan
perekasi
Millon
akan
memberikan warna merah. Pada kasein dan albumin terbentuk warna merah muda, hal ini menandakan bahwa kasein dan albumin ternitrasi serta memiliki atau mengandung tirosin. Sedangkan pada gelatin setelah di teteskan pereaksi Millon menghasilkan warna kuning, hal ini menandakan bahwa gelatin tidak ternitrasi dan tidak mengandung tirosin. Pada uji biuret larutan kasein, konsentrasi biuret minimum untuk membentuk warna sampel menjadi ungu adalah 4 tetes, dan maksimum 8 tetes. Larutan albumin konsentrasi biuret minimum untuk membentuk warna sampel menjadi ungu adalah 4 tetes, dan maksimum 10 tetes. Larutan gelatin konsentrasi biuret minimum untuk membentuk warna sampel menjadi ungu adalah 3 tetes, dan maksimum 9 tetes. Pada ketiga larutan kasein, albumin dan gelatin, masing-masing senyawa atau larutan tersebut mengandung protein, hal ini ditandai dengan terjadinya perubahan warna sampel larutan menjadi ungu setelah ditetesi pereaksi biuret. Saran Sebaiknya pada uji pengendapan oleh logam dan uji denaturasi protein pengamatan yang dilakukan lebih diperhatikan karena hasil yang didapat berbeda dengan literatur. Selain itu, konsentrasi albumin yang digunakan terlalu encer sehingga endapan yang dihasilkan terlalu sedikit.
DAFTAR PUSTAKA Girindra A. 1993. Biokimia. Jakarta: PT. Gramedia Pustaka Utama. K. Murray dan Robert, dkk. 2003. Biokimia Harper. Jakarta: Penerbit Buku Kedokteran EGC. Lehninger AL. 1982. Dasar-Dasar Biokimia Jilid 1. Suhartono MT, penerjemah. Jakarta: Erlangga. Ophart C.E. 2003 .Virtual Chembook. Jakarta: Elmhurst College. Poedjiadi A. 1994. Dasar-Dasar Biokimia. Jakarta: Penerbit UI-Press. Sloane E. 2004. Anatomi dan Fisiologi untuk Pemula. Penerbit Buku. Jakarta: Penerbit Buku Kedokteran EGC. Sudarmaji, S, dkk. 1989. Analisa Bahan Makanan dan Pertanian. Yogyakarta: Penerbit Liberty. Winarno. 1992. Kimia Pangan dan Gizi. Jakarta: PT. Gramedia Pustaka Utama. . 2002. Kimia Pangan dan Gizi. Jakarta: PT. Gramedia Pustaka Utama.
LAMPIRAN
Gambar 14 Hasil uji pengendapan oleh logam
Gambar 15 Hasil uji denaturasi protein
Gambar 16 Bahan uji pengendapan oleh alkohol
Gambar 17 Hasil uji pengendapan oleh alkohol
Gambar 18 Hasil uji pengendapan oleh garam (albumin+(NH4)2SO4+air+Millon)
Gambar 19 Hasil uji pengendapan oleh garam (albumin+(NH4)2SO4+air+biuret)
Gambar 20 Hasil uji pengendapan oleh garam (albumin+(NH4)2SO4+air)
Gambar 21 Hasil uji koagulasi (albumin+larutan asetat+air)
Gambar 22 Hasil uji koagulasi (albumin+larutan asetat+air+Millon)
Gambar 23 Hasil uji biuret
Gambar 24 Hasil uji Millon
