Ririn Vidiastuti Liquid Solid Chromatography (LSC)
LSC adalah kromatografi penyerapan. Sebagai adsorben digunakan silika gel, alumina, penyaring molekul atau gelas berpori dipakai dalam sebuah kolom dimana komponen-komponen campuran dipisahkan dengan adanya fase gerak. Kromatografi kolom dan kromatografi lapis tipis (TLC) merupakan teknik pemisahan yang masuk golongan ini. Teknik ini tergantung pada teradsorpsinya zat padat pada adsorben yang polar seperti silika gel atau alumina. Kromatografi lapisan tipis (TLC) adalah salah satu bentuk dari LSC. Dalam KCKT kolom dipadati atau dipak dengan partikel-partikel micro or macro particulate or pellicular (berkulit tipis 37 -44
μ).Sebagian
besar dari KCKT sekarang ini dibuat untuk mencapai partikel-partikel
microparticulate microparticulate lebih kecil dari 20 μ . Teknik ini biasanya digunakan untuk zat padat yang mudah larut dalam pelarut organik dan tidak terionisasi. Teknik ini terutama sangat kuat untuk pemisahan isomer-isomer. Fase diam adalah adsorben dan pemisahan didasarkan pada adsorpsi berulang dan desorpsi bahan terlarut (analit). Bahan terlarut ditambahkan ditambahkan ke sistem padat (misal silika) cair (misal aseton). Fasa geraknya adalah cairan Fasar diamnya adalah padat
Pemilihan fase gerak dalam kromatografi padat cair (adsorpsi) akan dengan baik tercapai dengan menggunakan parameter kekuatan pelarut e
0
berdasarkan pada pekerjaan Hildebrand dan baru-baru
ini diubah oleh Snyder. Kekuatan pelarut ditemukan dengan mengukur panas yang dihasilkan oleh pelarut per unit area materi pengadsorbsi (adsorbat) selama pelarut teradsorbsi pada adsorbat Semakin aktif suatu pelarut maka semakin tinggi level panas yang dihasilkan (atau energi bonding pelarut untuk adsorbat) dan secara konsekuen kekuatan pelarut semakin tinggi. Oleh karena itu pelarut non-polar seperti alkana sederhana memiliki kekuatan pelarut yang sangat rendah. Pentana 0
dalam skala kekuatan pelarut Snyder adalah nol. Tabel kekuatan pelarut (e ) disusun dengan urutan meningkat, berdasarkan pada deret Eluotropic. Alkohol dan air memiliki nilai kekuatan pelarut yang tinggi berkaitan dengan gugus hidroksil aktif yang tinggi.
Kekuatan pelarut mengontrol rasio partisi k’. Peningkatan e semakin kecil untuk semua pita sampel.
0
berarti pelarut lebih kuat dan nilai k’
Campuran biner digunakan pada hampir semua kasus untuk menyediakan kekuatan pelarut yang
tepat sehingga dapat memberikan nilai rasio partisi k’ yang tepat. Tabel 18.6. Beberapa pelarut sebagai fase gerak
Ririn Vidiastuti
Mekanisme pemisahan yang dapat digunakan pada kromatografi cair – padat ini antara lain : 1. Adsorpsi 2. Pertukaran Ion 3. Saringan Molekular 4. Reaksi Selektif Teknik yang dapat digunakan antara lain : 1. Kolom 2. Planar Metode yang digunakan dalam kromatografi cair –padat : 1. Kromatografi Kromatografi Cair – Padat Klasik(LSC) 2. KCKT (Kromatografi Cair Kinerja Tinggi) / HPLC 3. KLT ( Kromatografi lapis Tipis) / TLC 4. KLTKT (Kromatografi Lapis Tipis Kinerja Tinggi) / HPTLC 5. Kromatografi Pertukaran Ion 6. Kromatografi Kromatografi Ekslusi 7. Kromatografi Kromatografi Afinitas
Metode kromatografi ini banyak digunakan untuk analisis biokimia dan organik. Teknik pelaksanaanya dilakukan dengan kolom kaca, dimana fasa diam dapat dipilih silica gel atau alumina.
Kekurangan metode ini ialah: a. pilihan fasa diam (adsorben) yang digunakan terbatas; b. koefisien diatribusi untuk serapan seringkali tergantung pada kadar total, sehingga pemisahannya kurang sempurna.
Ririn Vidiastuti
KROMATOGRAFI KOLOM Kromatografi Kromatografi
kolom kolom
merupakan digunakan
metode untuk
kromatografi
memisahkan
klasik
yang
senyawa-senyawa
masih dalam
banyak jumlah
digunakan.
yang
banyak
berdasarkan adsorpsi dan partisi. Kemasan adsorben yang sering digunakan adalah silika gel G-60, kieselgur, Al2O3, dan Diaion. Cara pembuatannya ada dua macam :
Cara kering yaitu silika gel dimasukkan ke dalam kolom yang telah diberi kapas kemudian ditambahkan cairan pengelusi. Cara basah yaitu silika gel terlebih dahulu disuspensikan dengan cairan pengelusi yang akan digunakan kemudian dimasukkan ke dalam kolom melalui dinding kolom secara kontinyu sedikit demi sedikit hingga masuk semua, sambil kran kolom dibuka. Eluen dialirkan hingga silika gel mapat, setelah silika gel mapat eluen dibiarkan mengalir sampai batas adsorben kemudian kran ditutup dan sampel dimasukkan yang terlebih dahulu dilarutkan dalam eluen sampai diperoleh kelarutan yang spesifik. Kemudian sampel dipipet dan dimasukkan ke dalam kolom melalui dinding kolom sedikit demi sedikit hingga masuk semua, dan kran dibuka dan diatur tetesannya, serta cairan pengelusi ditambahkan. Tetesan yang keluar ditampung sebagai fraksi-fraksi. Kromatografi Kolom Isap : Suction Colomn
Isolasi
komponen
kimia
dalam
jumlah
yang
banyak,
berdasarkan
absorpsi
dan
partisi,
dimana kolom diisi dengan fase diam divakumkan dengan suatu pompa vakum agar eluen dapat turun mengelusi komponen kimia yang selanjutnya keluar sebagai fraksi-fraksi. Rapid-Sigel
Isolasi komponen kimia dalam jumlah yang sedikit berdasarkan absorpsi dan partisi, dimana kolom diisi dengan fase diam divakumkan dengan suatu pompa vakum agar eluen dapat turun mengelusi komponen kimia yang selanjutnya keluar sebagai fraksi-fraksi. Press Colomn
Kromatografi kolom sederhana di mana fase gerak bergerak dengan cepat karena penggunaan tekanan positif dari tabung nitrogren. Udara yang ditekan mengandung O2 dan uap air yang dapat menyebabkan peruraian produk dari ekstrak dan berubah saat pemisahan kromatografi.
Ririn Vidiastuti
KROMATOGRAFI PLANAR Kromatografi planar mempunyai dua bentuk, yaitu: 1.kromatografi kertas Berdasarkan mekanismenya, tergolong ke dalam kromatografi partisi, dimana fasa diamnya adalah air yang terikat pada selulosa kertas sedangkan fasa geraknya adalah pelarut organik yang bersifat nonpolar.
2.kromatografi lapis tipis. Berdasarkan mekanismenya, tergolong ke dalam kromatografi adsorpsi. Medium pemisahannya berupa lapisan tipis zat padat adsorben (alumina, silica gel) pada lempeng kaca, plastik, atau alumunium. Cara melakukannya banyak persamaannya dengan kromatografi kertas. Kedua teknik kromatografi ini digunakan untuk memisahkan dan identifikasi komponen analit dalam jumlah kecil.
Pada kromatografi planar :
dalam ruang pengembang.
Ririn Vidiastuti
KROMATOGRAFI ADSORPSI 2.1 Pengertian kromatografi adsorpsi
Adsorpsi ialah gejala timbulnya konsentrasi zat yang lebih besar pada bidang perbatasan antara dua fasa daripada dalam masing-masing fasa. Terjadinya pemisahan ialah akibat gaya tarik fasa stasioner yang kuat terhadap komponen – komponen yang harus dipisahkan. Gaya tarik yang kuat ini disebabkan oleh interaksi kimiawi dan atau interaksi Van Der Walls Kromatografi adsorpsi adalah teknik kromatografi tertua dioperasikan berdasarkan retensi terlarut pada permukaan adsorben. Adsorben yang umum digunakan adalah silika gel dan alumina karena mereka dimiliki daerah yang besar permukaan dan banyak situs aktif. Terlarut dan pelarut dalam cairan dapat bersaing satu sama lain untuk mendapatkan situs yang aktif. Karena ini, memilih pelarut yang tepat sangat penting untuk mendapatkan adsorpsi maksimum zat terlarut pada situs aktif permukaan. Pada kromatografi adsorpsi, fasa stasionernya terdiri atas zat padat dan fasa mobilnya terdiri atas zat gas atau zat cair. 2.2 Contoh – contoh yang termasuk kromatografi adsorpsi
• Kromatografi kolom Adsorpsi • Kromatografi gas • Kromatografi lapis tipis 2.2.1. Kolom kromatografi Adsorpsi
a. Prinsip Prinsip yang mendasari kromatografi kolom adsorpsi ialah bahwa komponen – komponen dalam zat contoh yang harus diperiksa mempunyai afinitas yang berbeda-beda terhadap adsorben dalam kolom. Apabila kita mengalirkan cairan ( elutor ) secara kontinyu melalui kolom yang berisi zat contoh yang telah diadsorpsikan oleh penyarat kolom, maka yang pertama – tama dihanyutkan elutor ialah komponen yang paling lemah terikat kepada adsorben. Komponen –komponen lainnya akan dihanyutkan menurut urutan afinitasnya terhadap adsorben, sehingga terjadi pemisahan daripada komponen – komponen tersebut.
Ririn Vidiastuti
b. Penyarat kolom Pola kecepatan arus elutor pada tiap irisan kolom yang dipilih di sembarang tempat suddah tentu sedapat mungkin harus sama. Keseragaman ini dapat dicapai dengan memilih adsorben yang ukuran butir – butirnya sama ( diayak ) dan dengan cara penyaratan yang baik. Makin kecil ukuran butir adsorben, makin cepat keseimbangan adsorpsi akan tercapai, dan makin besar pula kecepatan elusi yang boleh dipergunakan. Tetapi dilain pihak, makin kecil butir adsorben, makin besar hambatan bagi cairan yang harus mengalir melalui kolom. Apabila kecepatan lintas bagi cairan elutor terlalu kecil, dapat dipergunakan pompa vakum yang menimbulkan tekanan rendah dalam ruang di bawah kolom sehingga cairan dapat mengalir lebih cepat melalui kolom. Cara yang lain ialah menambahkan tekanan dalam ruang di atas kolom dengan menggunakan pompa pneumatic. c. Bentuk kolom penempatan adsorben dalam kolom secara uniform betul sangat sukar dilaksanakan. Sebagai akibatnya, zona – zona komponen yang dipisahkan menjadi kurang teratur bentuknya. Bagi kolom yang lebar hal ini dapat menyebabkan pembauran. Tetapi bagi kolom kecil bahaya ini seberapa besar. Namun di lain pihak, kolom yang lebar dan pendek itu lebih memudahkan dalam pemakaiannya. Oleh karena itu, tinggi kebanyakan kolom ialah ± 20 kali diameternya. Di bawah tabung yang umumnya terbuat dari gelas terdapat lempengan meduk yang terbuat dari porselen atau dari serbuk gelas yang dipanaskan hingga melengket jadi satu. Lempengan yang berbentuk cakram ini bergawai sebagai penahan fasa yang stasioner. Di bagian tabung yang paling bawah terdapat kapiler penyulur dilengkapi dengan pancur. Kapiler beserta pancur dirakitkan dengan kolom memakai suku asah sehingga mudah dilepaskan guna membersihkan kolom dan untuk meniup kolom sehingga menjadi bersih dari cairan. Ruang antara pancur dan cakram penyaring harus sekecil mungkin supaya tidak terjadi pembauran antara cairan – cairan yang keluar dari kolom. d. Kecepatan arus Semakin rendah kecepatan arus cairan, semakin baik akibatnya bagi tercapainya keseimbangan adsorpsi dan akan semakin baik pula pemisahannya. Bentuk zona pun menjadi lebih teratur. Tetapi kecepatan arus yang terlalu rendah dapat menimbulkan efek difusi axial dalam fasa mobil yang harus dihindarkan sejauh mungkin. Jadi dapat dikatakan bahwa pemisahan yang terbaik dapat dicapai dengan mempergunakan kolom yang panjang dan sempit, diisi dengan adsorben yang berbutir halus, dan arus yang lambat. Elusi dapat dimulai apabila campuran yang harus dipisahkan sudah dimasukan dalam kolom. Elusi ini dilakukan dengan memasukan cairan elutor berenyai – renyai melalui kolom dan harus dijaga supaya arusnya tidak berhenti. Komponen – komponen yang telah diadsorpsikan oleh adsorben akan bergerak dalam bentuk gelang – gelang atau zona dengan kecepatan yang berbeda – beda melalui kolom dan ditampung di bawah kolom secara terpisah memakai beberapa tabung yang dibubuhi
Ririn Vidiastuti
tanda – tanda. Tabung – tabung ini ditempatkan dalam sebuah fraksikolektor. Setelah itu fraksi – fraksi yang diperoleh mulai dapat diselidiki. 2.2.2. Kromatografi gas
Kromatografi Gas adalah metode kromatografi pertama yang dikembangkan pada jaman instrument dan elektronika yang telah merevolusikan keilmuan selama lebih dari 30 tahun. Sekarang kromatografi gas dipakai secara rutin di sebagian besar laboratorium industri dan perguruan inggi. kromatografi gas dapat dipakai untuk setiap campuran yang komponennya atau akan lebih baik lagi jika semua komponennya mempunyai tekanan uap yang berarti pada suhu yang dipakai untuk pemisahan. Campuran gas dapat dipisahkan dengan kromatografi gas. Fasa stationer dapat berupa padatan (kromatografi gas-padat) atau cairan (kromatografi gas-cair). Umumnya, untuk kromatografi gas-padat, sejumlah kecil padatan inert misalnya karbon teraktivasi, alumina teraktivasi, silika gel atau saringan molekular diisikan ke dalam tabung logam gulung yang panjang (2-10 m) dan tipis. Fasa mobil adalah gas semacam hidrogen, nitrogen atau argon dan disebut gas pembawa. Pemisahan gas bertitik didih rendah seperti oksigen, karbon monoksida dan karbon dioksida dimungkinkan dengan teknik ini. Dalam kasus kromatografi gas-cair, ester seperti ftalil dodesilsulfat yang diadsorbsi di permukaan alumina teraktivasi, silika gel atau penyaring molekular, digunakan sebagai fasa diam dan diisikan ke dalam kolom. Campuran senyawa yang mudah menguap dicampur dengan gas pembawa disuntikkan ke dalam kolom, dan setiap senyawa akan dipartisi antara fasa gas (mobil) dan fasa cair (diam) mengikuti hukum partisi. Senyawa yang kurang larut dalam fasa diam akan keluar lebih dahulu. Metoda ini khususnya sangat baik untuk analisis senyawa organik yang mudah menguap seperti hidrokarbon dan ester. Analisis minyak mentah dan minyak atsiri dalam buah telah dengan sukses dilakukan dengan teknik ini. Efisiensi pemisahan ditentukan dengan besarnya interaksi antara sampel dan cairannya. Disarankan untuk mencoba fasa cair standar yang diketahui efektif untuk berbagai senyawa. Berdasarkan hasil ini, cairan yang lebih khusus kemudian dapat dipilih. Metoda deteksinya, akan mempengaruhi kesensitifan teknik ini. Metoda yang dipilih akan bergantung apakah tujuannya analisik atau preparatif. 2.2.3. Kromatografi lapis tipis
Kromatografi lapis tipis merupakan kromatografi adsorpsi dan adsorben (silika gel (asam silikat), alumina (aluminium oxide), kieselguhr (diatomeous earth), dan selulosa) bertindak sebagai fase stasioner. Dalam kromatografi lapis tipis, bahan penyalut yang digunakan beraneka macam. Silika gel yang paling banyak dipakai (Djide , 2003). Teknik ini dikembangkan tahun 1938 oleh Ismailoff dan Schraiber. Adsorbent dilapiskan pada lempeng kaca yang bertindak sebagai fase diam. Fase bergerak (Untuk senyawa organik yang polar akan lebih mudah larut dengan air dari pada pelarut organik, dan hendaknya untuk senyawasenyawa tertentu menggunakan pelarut sesuai dengan kepolaran pelarut yang digunakan dan pembuatan fase mobil harus hati-hati karena sulitnya keterulangan dalam campuran serta pelarut jangan digunakan dalam selang yang lama) akan merayap sepanjang fase diam dan terbentuklah kromatogram.
Ririn Vidiastuti
Dikenal juga sebagai kromatografi kolom terbuka. Metode ini sederhana, cepat dalam pemisahan dan sensitif. Kecepatan pemisahan tinggi dan mudah untuk memperoleh kembali senyawa-senyawa yang dipisahkan (Petrucci, 1987). Pelarut-pelarut yang digunakan biasanya berupa campuran satu komponen organik yang utama, air dan berbagai tambahan seperti asam-asam, basa-basa atau pereaksi komplek, utk memperbesar atau mengurangi kelarutan untuk zat-zat tertentu (Ganiswarna, 1995). Hal-hal yang perlu diperhatikan dalam teknik kromatografi adalah metode (penaikan, penurunan, mendatar), macam kertas, pemilihan dan pembuatan eluen (fase mobil), kesetimbangan dari bejana yang dipilih, pembuatan cuplikan, waktu pengembangan, metode deteksi dan identifikasi (Petrucci, 1987)
Read more: http://susanblogs18.blogspot.com/2012/11/makalah-kromatografiadsorpsi.html#ixzz2RHJoMGu3
KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS Kromatografi lapis tipis merupakan kromatografi adsorpsi dan adsorben (silika gel (asam silikat), alumina (aluminium oxide), kieselguhr (diatomeous earth), dan selulosa) bertindak sebagai fase stasioner. Dalam kromatografi lapis tipis, bahan penyalut yang digunakan beraneka macam. Silika gel yang paling banyak dipakai (Djide , 2003). Teknik ini dikembangkan tahun 1938 oleh Ismailoff dan Schraiber. Adsorbent dilapiskan pada lempeng kaca yang bertindak sebagai fase diam. Fase bergerak (Untuk senyawa organik yang polar akan lebih mudah larut dengan air dari pada pelarut organik, dan hendaknya untuk senyawasenyawa tertentu menggunakan pelarut sesuai dengan kepolaran pelarut yang digunakan dan pembuatan fase mobil harus hati-hati karena sulitnya keterulangan dalam campuran serta pelarut jangan digunakan dalam selang yang lama) akan merayap sepanjang fase diam dan terbentuklah kromatogram. Dikenal juga sebagai kromatografi kolom terbuka. Metode ini sederhana, cepat dalam pemisahan dan sensitif. Kecepatan pemisahan tinggi dan mudah untuk memperoleh kembali senyawa-senyawa yang dipisahkan (Petrucci, 1987). Pelarut-pelarut yang digunakan biasanya berupa campuran satu komponen organik yang utama, air dan berbagai tambahan seperti asam-asam, basa-basa atau pereaksi komplek, utk memperbesar atau mengurangi kelarutan untuk zat-zat tertentu (Ganiswarna, 1995). Hal-hal yang perlu diperhatikan dalam teknik kromatografi adalah metode (penaikan, penurunan, mendatar), macam kertas, pemilihan dan pembuatan eluen (fase mobil), kesetimbangan dari bejana yang dipilih, pembuatan cuplikan, waktu pengembangan, metode deteksi dan identifikasi (Petrucci, 1987)
Read more: http://susanblogs18.blogspot.com/2012/11/makalah-kromatografiadsorpsi.html#ixzz2RHJDetat
Ririn Vidiastuti
Salah satu metode pemisahan yang sederhana ialah kromatografi lapis tipis. Pada dasarnya prinsip pada
KLT
sama
dengan
kromatografi
kertas
hanya
KLT
mempunyai
kelebihan
yang
khas
dibandingkan dengan kromatografi kertas yaitu keserbagunaan, kecepatan, dan kepekaannya. KLT dapat dipakai dengan dua tujuan. Pertama, dipakai sebagai metode untuk mencapai hasil kualitatif, kuantitatif, ataupun preparatif. Kedua, dipakai untuk menjajaki sistem pelarut dan sistem penyangga yang akan dipakai pada kromatografi kolom atau kromatografi cair kinerja tinggi/KCKT. Analisis dari KLT dapat membantu menentukan pelarut terbaik apa yang akan dipakai dan berapa perbandingan antar pelarut yang akan digunakan sebagai fasa gerak pada kromatografi kolom. Kromatografi lapis tipis sangat berhubungan dengan kromatografi kolom, hal ini karena fasa-fasa senyawa yang digunakan dalam teknik keduanya sama. Alumina dan silika gel adalah fasa diam yang biasa digunakan, dan fasa geraknya menggunakan eluen yang sama. Walaupun demikian, tetap
terdapat
perbedaan
antara
KLT
dan
kromatografi
kolom.
Fasa
gerak
(cair)
di
dalam
kromatografi kolom bergerak turun, sedangkan dalam KLT bergerak naik. Bahan fasa diam yang digunakan
dalam
(tebalnya 100
kromatografi
μm)
kolom
yang
berupa
kolom
digantikan
dengan
suatu
lapisan
tipis
pada KLT, yang merata pada seluruh bagian permukaannya. Bahan-bahan dari
gelas atau lembaran-lembaran plastik dapat digunakan sebagai bahan pendukung fasa diam untuk lapis
tipisnya.
Sangat dimungkinkan bagi kita untuk menyiapkan lembaran KLT yang dari gelas, tetapi untuk yang bahan pendukungnya plastik hanya tersedia secara komersil. Lembaran yang pendukungnya plastik sangat menarik karena dapat dipotong dengan gunting menjadi lembaran-lembaran yang lebih kecil dengan berbagai ukuran. Biasanya lembaran kecil itu berukuran 1×3 inci tetapi untuk lembaran yang lebih
kecil
dapat
disesuaikan.
KLT mempunyai beberapa keuntungan, diantaranya: waktu yang dibutuhkan tidak lama (2 – 5 menit)
dan
sampel
yang
dipakai
hanya
sedikit
sekali
(2 –
20
μg).
Kerugiannya
dengan
menggunakan KLT adalah tidak efektif untuk skala industri. Walaupun lembaran KLT yang digunakan lebih lebar dan tebal, pemisahannya sering dibatasi hanya sampai beberapa miligram sampel saja . Larutan cuplikan atau sampel ditotolkan pada plat dengan pipet mikro atau injektor pada jarak 1 – 2 cm dari batas plat. Setelah kering plat siap untuk dikembangkan dengan fasa gerak sampai pada batas
tertentu.
Proses pengembangan dikerjakan dalam wadah tertutup yang diisi eluen dan telah dijenuhi uap eluen
agar
dihasilkan
pemisahan
yang
baik.
Langkah selanjutnya yaitu mengeringkan sisa eluen dalam plat, kemudian melakukan identifikasi yang dapat dilakukan dengan beberapa cara, yaitu: pengamatan langsung (untuk noda/bercak yang tampak),
dengan
lampu
ultraviolet,
atau
dengan
pereaksi
semprot
penelitian ini menggunakan pereaksi yangdigunakan adalah Dragendorff.
KROMATOGRAFI CAIR TINGKAT TINGGI
penimbul
warna
.
Dalam
Ririn Vidiastuti
Kromatografi
Cair
Kinerja
Tinggi
(KCKT)
atau
High
Pressure
Liquid
Chromatography
(HPLC) merupakan salah satu metode kimia dan fisikokimia. KCKT termasuk metode analisis terbaru yaitu suatu teknik kromatografi dengan fasa gerak cairan dan fasa diam cairan atau padat. Banyak kelebihan metode ini jika dibandingkan dengan metode lainnya (Done dkk, 1974; Snyder dan Kirkland, 1979; Hamilton dan Sewell, 1982; Johnson dan Stevenson, 1978). Kelebihan itu antara lain:
• • • • • • • •
mampu memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran mudah melaksanakannya kecepatan analisis dan kepekaan yang tinggi dapat dihindari terjadinya dekomposisi / kerusakan bahan yang dianalisis Resolusi yang baik dapat digunakan bermacam-macam detektor Kolom dapat digunakan kembali mudah melakukan "sample recovery"
DETECTOR 3. 4. Detektor (Detector) .
Suatu
detektor
dibutuhkan
untuk
mendeteksi
adanya
komponen
sampel
di
dalam
kolom
(analisis kualitatif) dan menghitung kadamya (analisis kuantitatif).Detektor yang baik memiliki sensitifitas yang tinggi, gangguan (noise) yang rendah, kisar respons linier yang luas, dan memberi respons untuk semua tipe senyawa. Suatu kepekaan yang rendah terhadap aliran dan fluktuasi temperatur sangat diinginkan, tetapi tidak selalu dapat diperoleh. Detektor
KCKT
yang
umum
digunakan
adalah
detektor
UV
254
nm.
Variabel
panjang
gelombang dapat digunakan untuk mendeteksi banyak senyawa dengan range yang lebih luas. Detektor indeks refraksi juga digunakan secara luas, terutama pada kromatografi eksklusi, tetapi umumnya kurang sensitif jika dibandingkan dengan detektor UV. Detektor-detektor lainnya antara lain: Detektor Fluorometer -Detektor Spektrofotometer Massa Detektor lonisasi nyala -Detektor Refraksi lndeks Detektor Elektrokimia -Detektor Reaksi Kimia
Ririn Vidiastuti Types of detector
1. 2. 3. 4. 5.
UV-visible absorbance detector : for aromatic compounds. Nonionic surfactant RI (Refractive Index) Fluorescence Electrochemical 2+ Conductivity: for inorganic ions eg. Cl , So4 , Na ,anionic and cationic surfactant
KROMATOGRAFI PENUKAR ION
Ion-exchange chromatography
Teknik ini menggunakan zeolitas, resin organik atau anorganik sebagai penukar ion. Senyawaan yang mempunyai ion-ion dengan afinitas yang berbeda terhadap resin yang digunakan dapat dipisahkan. Kromatografi pertukaran ion (ion-exchange chromatography) biasa digukanan untuk pemurnian materi biologis, seperti asam amino, peptida, protein. Metode ini dapat dilakukan dalam dua tipe, yaitu dalam kolom maupun ruang datar (planar). Terdapat dua tipe pertukaran ion, yaitu pertukaran kation (cation exchange) dan pertukaran anion (anion exchange). Pada pertukaran kation, fase stasioner bermuatan negatif; sedangkan pada pertukaran anion, fase stasioner bermuatan positif. Molekul bermuatan yang berada pada fase cair akan melewati kolom. Jika muatan pada molekul sama dengan kolom, maka molekul tersebut akan terelusi. Namun jika muatan pada molekul tidak sama dengan kolom, maka molekul tersebut akan membentuk ikatan ionik dengan kolom. Untuk mengelusi molekul yang menempel pada kolom diperlukan penambahan larutan dengan pH dan kekuatan ionik tertentu. Pemisahan dengan metode ini sangat selektif dan karena biaya untuk menjalankan metode ini murah serta kapasitasnya tinggi, maka metode ini biasa digunakan pada awal proses keseluruhan.
Prinsip kerja kromatografi adsorpsi
Didasarkan pada retensi zat terlarut oleh adsorpsi permukaan
Berguna pada pemisahan senyawa-senyawa non polar dan konstituen yang sukar menguap
Pemisahan bergantung kesetimbangan yang terbentuk pada : permukaan butiran fasa diam dan fasa cair yang bergerak, serta kelarutan realtif zat terlarut pada fasa geraknya
Terjadi kompetisi antara molekul zat terlarut dan pealrut dengan permukaan adsorben.
Prinsip kerja kromatografi penukar ion
Ririn Vidiastuti
Terjadi
pertukaran
kation
atau
anion
antara
zat
terlarut
dalam
fasa
gerak
garam
total;
dengan kation atau anion dalam fasa diam.
Biasa
digunakan
untuk
penentuan
konsentrasi
asam,
basa,
pengeluaran ion-ion pengganggu.
Prinsip kerja kromatografi partisi
Contoh : - Kromatografi kertas
- Kromatografi lapis tipis
Pemisahan dipengaruhi oleh distribusi sampel dalam zat cair fasa gerak dan dalam zat cair fasa diam. (partisis zat terlarut dalam fasa diam dan fasa gerak)
Prinsip kerja kromatografi gas (GC)
Fasa gerak : gas Zat terlarut : gas * Fasa diam : gas * *bisa dimodifikasi
Sampel diinjeksikan dalam injection part, senyawa-senyawa dalam sample akan menguap dan akan dibawa oleh gas pengemban menuju kolom.
PROSEDUR PEMISAHAN TEKNIK KROMATOGRAFI KOLOM
1. elusi 2. frontal 3. pergeseran (displacement)
Elusi
→
Eluent dilewatkan melalui kolom yang dapat menyebabkan differential migration dengan laju
aliran tertentu. Frontal
→
Sampel dialirkan secara kontinyu melalui pengadsorpsi
Komponen yang sukar teradsorpsi akan keluar terlebih dulu Pergeseran
→
pengaliran suatu reagen yang teradsorpsi lebih kuat
Ririn Vidiastuti
Analisis Kuantitatif
Untuk menjamin kondisi yang digunakan dalam analisis kuantitatif stabil dan reprodusibel, baik pada penyiapan sampel atau proses kromatografi, berikut beberapa syarat yang harus dipenuhi dalam analisis kuantitatif: a. Analit (solut) harus telah diketahui dan terpisah sempurna dari komponen-komponen lain dalam kromatogram b. Baku dengan kemurnian yang tinggi dan telah diketahui harus tersedia c. Prosedur kalibrasi yang sudah diketahui harus digunakan. Untuk kromatografi yang melibatkan kolom, kuantifikasi dapat dilakukan dengan luas puncak atau tinggi puncak. Tinggi puncak atau luas puncak berbanding langsung dengan banyaknya solut yang dikromatografi, jika dilakukan pada kisaran detektor yang linier (Johnson dan Stevenson, 1991). 1. Metode tinggi puncak Metode yang paling sederhana untuk pengukuran kuantitatif adalah dengan tinggi puncak. Tinggi puncak diukur sebagai jarak dari garis dasar ke Universitas Sumatera Utara
Ririn Vidiastuti
puncak maksimum seperti puncak 1, 2, dan 3 pada gambar 3. Penyimpangan garis dasar diimbangi dengan interpolasi garis dasar antara awal dan akhir puncak.
Gambar 1. Pengukuran tinggi puncak
Metode tinggi puncak hanya digunakan jika perubahan tinggi puncak linier dengan konsentrasi analit. Kesalahan akan terjadi jika metode ini digunakan pada puncak yang mengalami penyimpangan (asimetris) atau jika kolom mengalami kelebihan muatan. 2. Metode luas puncak Prosedur penentuan luas puncak serupa dengan tinggi puncak. Suatu teknik untuk mengukur luas puncak adalah dengan mengukur luas puncak sebagai hasil kali tinggi puncak dan lebar pada setengah tinggi (W1/2). Teknik ini hanya dapat digunakan untuk kromatografi yang simetris atau yang mempunyai bentuk serupa (Johnson dan Stevenson, 1991). Baik tinggi puncak maupun luasnya dapat dihubungkan dengan konsentrasi. Tinggi puncak mudah diukur, akan tetapi sangat dipengaruhi perubahan waktu retensi yang disebabkan oleh variasi suhu dan komposisi pelarut. Oleh karena itu, luas puncak dianggap merupakan parameter yang lebih akurat untuk pengukuran kuantitatif (Ditjen POM, 1995).
Identifikasi signal kromatogram HPLC
Prinsip dasar dari HPLC, dan semua metode kromatografi adalah memisahkan setiap komponen dalam sample untuk selanjutnya diidentifikasi (kualitatif) dan dihitung berapa konsentrasi dari masing-masing komponen tersebut (kuantitatif). Sebetulnya hanya ada dua hal utama yang menjadi krusial point dalam metode HPLC. Yang pertama adalah proses separasi/pemisahan dan yang kedua adalah proses identifikasi. Dua hal ini mejadi faktor yang sangat penting dalam keberhasilan proses analisa. Yang berperan dalam proses separasi pada system HPLC adalah kolom. Ada kolom yang digunakan untuk beberapa jenis analisa, misalnya kolom C18 yang dapat digunakan untuk analisa carotenoid, protein, lovastatin, dan sebagainya. Namun ada juga kolom yang khusus dibuat untuk tujuan analisa tertentu, seperti kolom Zorbax carbohydrat (Agilent) yang khusus digunakan untuk analisa karbohidrat (mono-, di-, polysakarida). Keberhasilan proses separasi sangat dipengaruhi oleh pemilihan jenis kolom dan juga fasa mobil. Setelah komponen dalam sample berhasil dipisahkan, tahap selanjutnya adalah proses identifikasi. Hasil analisa HPLC diperoleh dalam bentuk signal kromatogram. Dalam kromatogram akan terdapat peak-peak yang menggambarkan banyaknya jenis komponen dalam sample.
Ririn Vidiastuti
Sample yang mengandung banyak komponen didalamnya akan mempunyai kromatogram dengan banyak peak. Bahkan tak jarang antar peak saling bertumpuk (overlap). Hal ini akan menyulitkan dalam identifikasi dan perhitungan konsentrasi. Oleh karena itu biasanya untuk sample jenis ini dilakukan tahapan preparasi sample yang lebih rumit agar sample yang siap diinjeksikan ke HPLC sudah cukup bersih dari impuritis. Sample farmasi biasanya jauh lebih mudah karena sedikit mengandung komponen selain zat aktif. Sample ini umumnya hanya melalui proses pelarutan saja.
Contoh kromatogram dengan banyak peak Kesulitan biasanya dihadapi ketika akan mengidentifikasi suatu kromatogram yang terdiri atas banyak peak. Untuk mengetahui peak mana yang merupakan milik analat (zat target analisa) kromatogram dibandingkan dengan kromatogram standard. Nah disinilah kadang analis sedikit ceroboh. Cara yang paling umum untuk mengidentifikasi adalah dengan melihat Retention time (RT). Peak yang mempunyai RT yang sama dengan standard umumnya akan langsung di vonis sebagai peak milik analat. Memang senyawa/zat yang sama akan mempunyai RT yang juga sama, dengan catatan sample dan standard dijalankan dengan kondisi dan sistem HPLC yang sama. Namun bukan berarti RT yang sama pasti merupakan zat/senyawa yang sama. Disinilah para analis biasanya terkecoh. Saya pernah mengalami hal ini. Ketika bermaksud ingin melihat kandungan Lovastatin dalam suatu sample hasil fermentasi dari Monascus, sejenis fungi, Kromatogram yang saya peroleh mengandung banyak peak yang membuat saya kesulitan untuk menentukan yang manakah dari peak-peak tersebut yang merupakan peak milik Lovastatin. Setelah jalan standard Lovastatin, saya temukan satu peak pada sample yang memilki RT yang sama dengan peak pada Standard. Awalnya saya mengira bila peak tersebut adalah peak Lovastatin, sehingga dari sini saya menyimpulkan bahwa sample yang saya analisa betul mengandung Lovastatin. Namun setelah saya bandingkan spektrum 3D untuk kedua peak, ternyata keduanya memilki spektrum 3D yang berbeda. Sehingga meskipun
Ririn Vidiastuti
peak tersebut keluar pada RT yang sama dengan standard Lovastatin, namun itu bukanlah Lovastatin karena spektrum 3D berbeda dengan spektrum Lovastatin. Jadi, melihat RT sebetulnya belumlah cukup untuk mengidentifikasi suatu zat. Hal lain yang perlu dilihat adalah spektrum 3D dari signal kromatogram. Zat yang sama akan mempunyai spektrum 3D yang juga sama. Sehingga jika spektrum 3D antara dua zat berbeda, maka kedua zat tersebut juga dipastikan adalah zat yang berlainan, meskipun memiliki RT yang sama. Lantas bagaimana bila sistem HLC yang digunakan tidak dapat memunculkan spektrum 3D? Spektrum 3D hanya dapat ditampilkan oleh HPLC yang telah menggunakan DAD (Diode Array Detector) sebagai detektor. Sedangkan HPLC yang masih menggunakan detektor UV tidak dapat melihat spektrum 3D. Namun, konfirmasi masih dapat dilakukan dengan melihat spektrum UV. Prinsipnya sama. Jika spektrum UV kedunya sama, maka keduanya adalah zat yang sama. Tapi jika spektrum UV sample berbeda dengan standard, maka keduanya zat yang berbeda sekalipun memiliki RT yang sama.
Analisa Kuantitatif Kromatografi Kata Kunci: Analisa Kuantitatif , Kurva Gaussian
Ditulis oleh Adam Wiryawan pada 14-03-2011 Hubungan Dasar
Dengan komatrogram yang diperoleh dari detektor diferensial yang mana memiliki respon linier, penggantian/jarak dari garis belakang pada saat tertentu adalah suatu ukuran konsentrasi dari komponen dari gas pembawa di saluran keluar kolom. Kurva integral dihasilkan yakni area puncak dari puncak adalah sebanding dengan jumlah komponen yang ada. Dalam kromatogram yang ideal dimana puncak merupakan kurva Gaussian simetrik lalu ketinggian puncak akan sebanding dengan. Area puncak adalah a konsentrasi komponen bila Gaussian maka area a ke tinggi puncak. Kalibrasi
Oleh karena itu kalibrasi dapat dicapai dengan menjalankan satu rangkaian standar yang diketahui konsentrasinya dan membandingkan respon area yang dihasilkan antara standar dan sampel. Sejumlah metode lainnya digunakan oleh para peneliti dalam menghitung kuantitas komponen dalam sampel. Hal ini termasuk
Ririn Vidiastuti Normalisasi Internal
Area dari setiiap puncak sesuai dengan komponen spesifik dalam sampel telah terbentuk kemudian ditambahkan untuk memberi suatu total area yang ditetapkan pada 100%. Masing-masing area komponen kemudian dinyatakan sebagai persen dari nilai ini.
Akan tetapi senyawa-senyawa yang berbeda akan memberikan respon berbeda terehadap detektor, oleh karena itu perlu ditentukan faktor koreksi. Karena detektor yang berbeda akan beroperasi pada prinsip yang berbeda maka perlu dihitung faktor yang berbeda untuk tiap detektor yang berbeda.
Faktor dapat ditentukan berdasarkan berat atau molar.
Ririn Vidiastuti
Plate Theory and Rate Theory Plate theory and Rate theory are two theories that are applicable to chromatography. Plate theory describes a chromatography system as being in equilibrium between the stationary and mobile phases. This views the column as divided into a number of imaginary theoretical plates. This is significant because as the number of plates in a column increases or the height equivelant theoretical plates or HETP increases, so does the separation of components. It also provides an equation that describes the elution curve or the chromatogram of a solute it can also be used to find the volume and the column efficiency. HETP = L/N ; where L= column length and N= number of theoretical plates The Rate theory on the other hand describes the migration of molecules in a column. This included band shape, broadening, and the diffusion of a solute. Rate theory follows the Van Deemter equation, which is the most appropriate for prediction of dispersion in liquid chromatography columns. It does this by taking into account the various pathways that a sample must travel through a column. Using the Van Deemter equation, it is possible to find the optimum velocity and and a minimunm plate height.
H=A+B u =Cu Where:
Ririn Vidiastuti
A = Eddy-Diffusion, B = Longitudinal Diffusion, C = mass transfer, u = linear velocity Instrumentation This schematic is of the basic instrumentation of a liquid-solid chromatograph. The solvent inlet brings in the mobile phase which is then pumped through the inline solvent filter and passed through the injection valve. This is where the mobile phase will mix with the injected sample. It then gets passed through another filter and then passed through the column where the sample will be separated into its components. The detector detects the separation of the analytes and the recorder, or usually a computer will record this information. The sample then goes through a backpressure filter and into waste.
A basic LC system consists of (a) a solvent inlet filter, (b) pump, (c) inl ine solvent filter, (d) injection valve, (e) precolumn filter, (f) column, (g) detector, (h) recorder, (i) backpressure regulator, and a (j) waste reservoir.
Advantages / Disadvantages Liquid-solid column chromatography is an effective separation technique when all appropriate parameters and equipment are used. This method is especially effective when the compounds within the mixture are colored, as this gives the scientist the ability to see the separation of the bands for the components in the sample solution. Even if the bands are not visible, certain components can be observed by other visualization methods. One method that may work for some compounds is irradiation with ultraviolet light. This makes it relatively easy to collect samples one after another. However, if the components within the solution are not visible by any of these methods, it can be difficult to determine the efficacy of the separation that was performed. In this case, separate collections from the column are taken at specified time intervals. Since the human eye is the primary detector for this procedure, it is most effective when the ban ds of the distinct compounds are visible. Liquid-solid column chromatography is also a less expensive procedure than other methods of separation (HPLC, GC, etc.). This is because the most basic forms of column chromatography do not require the help of expensive machinery like high pressure solvent pumps used in HPLC. In methods besides flash chromatography, the flow of the mobile phase, the detection of each separation band, and the collection of each component, are all done manually by the scientist. Although this introduces many potential instances of experimental error, this method of separation can be very effective when done correctly. Also, the glass wear used for liquid-solid column chromatography is relatively inexpensive and readily available in many laboratories. Burets are commonly used as the separating column, which in many cases will work just as well as an expensive pre-prepared column. For smaller scale chromatography, Pasteur pipettes are often used.
Ririn Vidiastuti Flash chromatography has the potential to be more costly than the previous methods of separation, especially when sophisticated air pumps and vacuum pumps are needed. When these pieces of machinery are not needed, 2 however, a vacuum line can be instead connected to an aspirator on a water faucet. Also, home-made pressurized air flow controllers can be made as shown previously.
