HPLC LENGKAP HPLC ADALAH HPLC (High Performance Liquid Chromatography

HPLC LENGKAP

HPLC ADALAH
HPLC (High Performance Liquid Chromatography) atau biasa juga disebut dengan Kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) dikembangkan pada akhir tahun 1960-an dan awal tahun 1970-an. Saat ini, HPLC merupakan teknik pemisahan yang diterima secara luas untuk analisis bahan obat, baik dalam bulk atau dalam sediaan farmasetik. 

SISTEM PERALATAN HPLC
Instrumentasi HPLC pada dasarnya terdiri atas: wadah fase gerak, pompa, alat untuk memasukkan sampel (tempat injeksi), kolom, detektor, wadah penampung buangan fase gerak, dan suatu komputer atau integrator atau perekam.
Diagram skematik sistem kromatografi cair seperti ini :

1. Wadah Fase gerak dan Fase gerak
Wadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert). Wadah pelarut kosong ataupun labu laboratorium dapat digunakan sebagai wadah fase gerak. Wadah ini biasanya dapat menampung fase gerak antara 1 sampai 2 liter pelarut(1).
Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi. Daya elusi dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan sifat komponen-komponen sampel. Untuk fase normal (fase diam lebih polar daripada fase gerak), kemampuan elusi meningkat dengan meningkatnya polaritas pelarut. Sementara untuk fase terbalik (fase diam kurang polar daripada fase gerak), kemampuan elusi menurun dengan meningkatnya polaritas pelarut.

Fase gerak sebelum digunakan harus disaring terlebih dahulu untuk menghindari partikel-partikel kecil ini. Selain itu, adanya gas dalam fase gerak juga harus dihilangkan, sebab adanya gas akan berkumpul dengan komponen lain terutama di pompa dan detektor sehingga akan mengacaukan analisis.

Elusi dapat dilakukan dengan cara isokratik (komposisi fase gerak tetap selama elusi) atau dengan cara bergradien (komposisi fase gerak berubah-ubah selama elusi) yang analog dengan pemrograman suhu pada kromatografi gas. Elusi bergradien digunakan untuk meningkatkan resolusi campuran yang kompleks terutama jika sampel mempunyai kisaran polaritas yang luas.4)
 
Fase gerak yang paling sering digunakan untuk pemisahan dengan fase terbalik adalah campuran larutan bufer dengan metanol atau campuran air dengan asetonitril. Untuk pemisahan dengan fase normal, fase gerak yang paling sering digunakan adalah campuran pelarut-pelarut hidrokarbon dengan pelarut yang terklorisasi atau menggunakan pelarut-pelarut jenis alkohol. Pemisahan dengan fase normal ini kurang umum dibanding dengan fase terbalik.2)

2. Pompa
Pompa yang cocok digunakan untuk HPLC adalah pompa yang mempunyai syarat sebagaimana syarat wadah pelarut yakni: pompa harus inert terhadap fase gerak. Bahan yang umum dipakai untuk pompa adalah gelas, baja tahan karat, Teflon, dan batu nilam. Pompa yang digunakan sebaiknya mampu memberikan tekanan sampai 5000 psi dan mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan alir 3 mL/menit. Untuk tujuan preparatif, pompa yang digunakan harus mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan 20 mL/menit.
Tujuan penggunaan pompa atau sistem penghantaran fase gerak adalah untuk menjamin proses penghantaran fase gerak berlangsung secara tepat, reprodusibel, konstan, dan bebas dari gangguan. Ada 2 jenis pompa dalam HPLC yaitu: pompa dengan tekanan konstan, dan pompa dengan aliran fase gerak yang konstan. Tipe pompa dengan aliran fase gerak yang konstan sejauh ini lebih umum dibandingkan dengan tipe pompa dengan tekanan konstan.6)

3. Tempat penyuntikan sampel
Sampel-sampel cair dan larutan disuntikkan secara langsung ke dalam fase gerak yang mengalir di bawah tekanan menuju kolom menggunakan alat penyuntik yang terbuat dari tembaga tahan karat dan katup teflon yang dilengkapi dengan keluk sampel (sample loop) internal atau eksternal.

Posisi pada saat memuat sampel Posisi pada saat menyuntik sampel

4. Kolom dan Fase diam
Ada 2 jenis kolom pada HPLC yaitu kolom konvensional dan kolom mikrobor. Kolom merupakan bagian HPLC yang mana terdapat fase diam untuk berlangsungnya proses pemisahan solut/analit.

Kolom mikrobor mempunyai 3 keuntungan yang utama dibanding dengan kolom konvensional, yakni:
Konsumsi fase gerak kolom mikrobor hanya 80% atau lebih kecil dibanding dengan kolom konvensional karena pada kolom mikrobor kecepatan alir fase gerak lebih lambat (10 -100 μl/menit).
Adanya aliran fase gerak yang lebih lambat membuat kolom mikrobor lebih ideal jika digabung dengan spektrometer massa.
Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solut lebih pekat, karenanya jenis kolom ini sangat bermanfaat jika jumlah sampel terbatas misal sampel klinis.
Meskipun demikian, dalam prakteknya, kolom mikrobor ini tidak setahan kolom konvensional dan kurang bermanfaat untuk analisis rutin.3]
Kebanyakan fase diam pada HPLC berupa silika yang dimodifikasi secara kimiawi, silika yang tidak dimodifikasi, atau polimer-polimer stiren dan divinil benzen. Permukaan silika adalah polar dan sedikit asam karena adanya residu gugus silanol (Si-OH).
Silika dapat dimodifikasi secara kimiawi dengan menggunakan reagen-reagen seperti klorosilan. Reagen-reagen ini akan bereaksi dengan gugus silanol dan menggantinya dengan gugus-gugus fungsional yang lain.

Oktadesil silika (ODS atau C18) merupakan fase diam yang paling banyak digunakan karena mampu memisahkan senyawa-senyawa dengan kepolaran yang rendah, sedang, maupun tinggi. Oktil atau rantai alkil yang lebih pendek lagi lebih sesuai untuk solut yang polar. Silika-silika aminopropil dan sianopropil (nitril) lebih cocok sebagai pengganti silika yang tidak dimodifikasi. Silika yang tidak dimodifikasi akan memberikan waktu retensi yang bervariasi disebabkan karena adanya kandungan air yang digunakan. 

5. Detektor HPLC
Detektor pada HPLC dikelompokkan menjadi 2 golongan yaitu: detektor universal (yang mampu mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat spesifik, dan tidak bersifat selektif) seperti detektor indeks bias dan detektor spektrometri massa; dan golongan detektor yang spesifik yang hanya akan mendeteksi analit secara spesifik dan selektif, seperti detektor UV-Vis, detektor fluoresensi, dan elektrokimia.

Idealnya, suatu detektor harus mempunyai karakteristik sebagai berikut:
Mempunyai respon terhadap solut yang cepat dan reprodusibel.
Mempunyai sensitifitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi solut pada kadar yang sangat kecil.
Stabil dalam pengopersiannya.
Mempunyai sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan pelebaran pita.
Signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solut pada kisaran yang luas (kisaran dinamis linier).
Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak.2)
Beberapa detektor yang paling sering digunakan pada HPLC dengan karakteristik detektor seperti berikut :
Detektor
Sensitifitas (g/ml)
Kisaran linier
Karakteristik
Absorbansi Uv-vis
Fotometer filter
Spektrofotometer
spektrometer photo-diode array

5 x 10-10
5 x 10-10
> 2 x 10-10

104
105
105

Sensitivitas bagus, paling sering digunakan, selektif terhadap gugus-gugus dan struktur-struktur yang tidak jenuh.
Fluoresensi
10-12
104
Sensitifitas sangat bagus, selektif, Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak.
Indeks bias
5 x 10-7

104
Hampir bersifat universal akan tetapi sensitivitasnya sedang. Sangat sensitif terhadap suhu, dan tidak dapat digunakan pada elusi bergradien
Elektrokimia
Konduktimetri
Amperometri

10-8
10-12

104
105

Peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak, tidak dapat digunakan pada elusi bergradien. Hanya mendeteksi solut-solut ionik. Sensitifitas sangat bagus, selektif tetapi timbul masalah dengan adanya kontaminasi elektroda.

JENIS HPLC
Pemisahan dengan HPLC dapat dilakukan dengan fase normal (jika fase diamnya lebih polar dibanding dengan fase geraknya) atau fase terbalik (jika fase diamnya kurang non polar dibanding dengan fase geraknya). Berdasarkan pada kedua pemisahan ini, sering kali HPLC dikelompokkan menjadi HPLC fase normal dan HPLC fase terbalik.
Selain klasifikasi di atas, HPLC juga dapat dikelompokkan berdasarkan pada sifat fase diam dan atau berdasarkan pada mekanisme sorpsi solut, dengan jenis-jenis HPLC sebagai berikut:
1. Kromatografi Adsorbsi
Prinsip kromatografi adsorpsi telah diketahui sebagaimana dalam kromatografi kolom dan kromatografi lapis tipis. Pemisahan kromatografi adsorbsi biasanya menggunakan fase normal dengan menggunakan fase diam silika gel dan alumina, meskipun demikian sekitar 90% kromatografi ini memakai silika sebagai fase diamnya. Pada silika dan alumina terdapat gugus hidroksi yang akan berinteraksi dengan solut. Gugus silanol pada silika mempunyai reaktifitas yang berbeda, karenanya solut dapat terikat secara kuat sehingga dapat menyebabkan puncak yang berekor.3)

2. Kromatografi fase terikat
Kebanyakan fase diam kromatografi ini adalah silika yang dimodifikasi secara kimiawi atau fase terikat. Sejauh ini yang digunakan untuk memodifikasi silika adalah hidrokarbon-hidrokarbon non-polar seperti dengan oktadesilsilana, oktasilana, atau dengan fenil. Fase diam yang paling populer digunakan adalah oktadesilsilan (ODS atau C18) dan kebanyakan pemisahannya adalah fase terbalik.
Sebagai fase gerak adalah campuran metanol atau asetonitril dengan air atau dengan larutan bufer. Untuk solut yang bersifat asam lemah atau basa lemah, peranan pH sangat krusial karena kalau pH fase gerak tidak diatur maka solut akan mengalami ionisasi atau protonasi. Terbentuknya spesies yang terionisasi ini menyebabkan ikatannya dengan fase diam menjadi lebih lemah dibanding jika solut dalam bentuk spesies yang tidak terionisasi karenanya spesies yang mengalami ionisasi akan terelusi lebih cepat.3)

3. Kromatografi penukar ion
KCKT penukar ion menggunakan fase diam yang dapat menukar kation atau anion dengan suatu fase gerak. Ada banyak penukar ion yang beredar di pasaran, meskipun demikian yang paling luas penggunaannya adalah polistiren resin.
Kebanyakan pemisahan kromatografi ion dilakukan dengan menggunakan media air karena sifat ionisasinya. Dalam beberapa hal digunakan pelarut campuran misalnya air-alkohol dan juga pelarut organik. Kromatografi penukar ion dengan fase gerak air, retensi puncak dipengaruhi oleh kadar garam total atau kekuatan ionik serta oleh pH fase gerak. Kenaikan kadar garam dalam fase gerak menurunkan retensi solut. Hal ini disebabkan oleh penurunan kemampuan ion sampel bersaing dengan ion fase gerak untuk gugus penukar ion pada resin.

4. Kromatografi Pasangan ion
Kromatografi pasangan ion juga dapat digunakan untuk pemisahan sampel-sampel ionik dan mengatasi masalah-masalah yang melekat pada metode penukaran ion. Sampel ionik ditutup dengan ion yang mempunyai muatan yang berlawanan.2)

5. Kromatografi Eksklusi Ukuran
Kromatografi ini disebut juga dengan kromatografi permiasi gel dan dapat digunakan untuk memisahkan atau menganalisis senyawa dengan berat molekul > 2000 dalton.
Fase diam yang digunakan dapat berupa silika atau polimer yang bersifat porus sehingga solut dapat melewati porus (lewat diantara partikel), atau berdifusi lewat fase diam. Molekul solut yang mempunyai BM yang jauh lebih besar, akan terelusi terlebih dahulu, kemudian molekul-molekul yang ukuran medium, dan terakhir adalah molekul yang jauh lebih kecil. Hal ini disebabkan solut dengan BM yang besar tidak melewati porus, akan tetapi lewat diantara partikel fase diam. Dengan demikian, dalam pemisahan dengan eksklusi ukuran ini tidak terjadi interaksi kimia antara solut dan fase diam seperti tipe kromatografi yang lain.

6. Kromatografi Afinitas
Dalam kasus ini, pemisahan terjadi karena interaksi-interaksi biokimiawi yang sangat spesifik. Fase diam mengandung gugus-gugus molekul yang hanya dapat menyerap sampel jika ada kondisi-kondisi yang terkait dengan muatan dan sterik tertentu pada sampel yang sesuai (sebagaimana dalam interaksi antara antigen dan antibodi).
Kromatografi jenis ini dapat digunakan untuk mengisolasi protein (enzim) dari campuran yang sangat kompleks.2)

DERIVATISASI PADA HPLC
Derivatisasi melibatkan suatu reaksi kimia antara suatu analit dengan suatu reagen untuk mengubah sifat fisika-kimia suatu analit. Tujuan utama penggunaan derivatisasi pada HPLC adalah untuk:
Meningkatkan deteksi
Merubah struktur molekul atau polaritas analit sehingga akan menghasilkan puncak kromatografi yang lebih baik
Merubah matriks sehingga diperoleh pemisahan yang lebih baik
Menstabilkan analit yang sensitif.5)
Detektor yang paling banyak digunakan dalam HPLC adalah detektor UV-Vis sehingga banyak metode yang dikembangkan untuk memasang atau menambahkan gugus kromofor yang akan menyerap cahaya pada panjang gelombang tertentu. Di samping itu, juga dikembangkan suatu metode untuk menghasilkan fluorofor (senyawa yang mamapu berfluoresensi) sehingga dapat dideteksi dengan fluorometri.7)
Suatu reaksi derivatisasi harus mempunyai syarat-syarat sebagai berikut, yakni: produk yang dihasilkan harus mampu menyerap baik sinar ultraviolet atau sinar tampak atau dapat membentuk senyawa berfluoresen sehingga dapat dideteksi dengan spektrofluorometri; proses derivatisasi harus cepat dan menghasilkan produk yang sebesar mungkin (100 %); produk hasil derivatisasi harus stabil selama proses derivatisasi dan deteksi; serta sisa pereaksi untuk derivatisasi harus tidakmenganggu pemisahan kromatografi.7)

Berbagai macam bahan penderivat telah tersedia antara lain :
Gugus fungsional
Reagen untuk dapat dideteksi dengan UV-Vis
Reagen untuk dapat dideteksi dengan Fluoresen
Asam-asam kaboksilat; asam-asam lemak;asam-asam fosfat
p-nitrobenzil-N,N'-diisopropilisourea (PNBDI); 3,5-dinitrobenzil-N,N'-diisopropilisourea (DNBDI); p-bromofenasil bromida (PBPB)
4-bromometil-7-asetoksikumarin;
4-bromometil-7-metoksikumarin;
Alkohol
3,5-dinitrobenzil klorida (DNBC); 4-dimetilaminiazobenzen-4-sulfinil (Dabsyl-Cl); 1-naftilisosianat (NIC-1).

Aldehid; keton
p-nitrobenziloksiamin hidroklorida (PNBA); 3,5-dinitrobenziloksiamin hidroklorida (DNBA);
Dansil hidrazin
Amin primer

Fluoresamin
o-ftalaldehid (OPA)
Amin primer (1o) dan sekunder (2o)
3,5-dinitrobenzil klorida (DNBC); N-suksinimidil-p-nitrofenilasetat (SNPA); N-suksinimidil-3,5-dinitrofenilasetat (SDNPA); 4-dimetilaminiazobenzen-4-sulfinil (Dabsyl-Cl); 1-naftilisosianat (NIC-1).
7-kloro-4-nitrobenzo-2-oksa-1,3-diazol (NBD-Cl); 7-fluoro-4-nitrobenzo-2-oksa-1,3-diazol (NBD-F); Dansil klorida
Asam-asam amino (peptida)
4-dimetilaminiazobenzen-4-sulfinil (Dabsil-Cl)
Fluoresamin
o-ftalaldehid (OPA)
7-kloro-4-nitrobenzo-2-oksa-1,3-diazol (NBD-Cl); 7-fluoro-4-nitrobenzo-2-oksa-1,3-diazol (NBD-F);
Derivatisasi ini dapat dilakukan sebelum analit memasuki kolom (pre-column derivatization) atau setelah analit keluar dari kolom (post-column derivatization).


Referensi:
Settle, F (Editor), 1997, Handbook of Instrumental Techniques for Analytical Chemistry, Prentice Hall PTR, New Jersey, USA.
Meyer, F.R., 2004, Practical High-Performance Liquid Chromatography, 4th Ed., John Wiley & Sons, New York.
Kealey, D and Haines, P.J., 2002, Instant Notes: Analytical Chemistry, BIOS Scientific Publishers Limited, New York.
Kenkel, J., 2002, Analytical Chemistry for Technicians, 3th. Edition., CRC Press, U.S.A.
Snyder, L. R., Kirkland, S.J., and Glajch, J.L., 1997, Practical HPLC Method Development, John Wiley & Son, New York.
Munson, J.W., 1981, Phrarmaceutical Analysis: Modern Methods, Part A and B, diterjemahkan oleh Harjana dan Soemadi, Airlangga University Press, Surabaya.
Cserhati, T. And Forgacs, E., 1999, Chromatography in Food science and Technology, Technomic Publishing, Lancaster, Basel.

Prinsip dasar HPLC sebenarnya adalah dinamika dan migrasi dengan menggunakan dua fasa. HPLC biasanya digunakan untuk senyawa untuk yang berberat molekul tinggi dan tidak menguap, dimana penyerapan semakin baik jika molekul berada pada bentuk terkecil sehingga pemisahan pun juga akan semakin baik. Setelah pemisahan ini, selanjutnya diidentifikasikan secara kualitatif dan dihitung berapa konsentrasi dari masing-masing komponen tersebut secara kuantitatif.
Penentuan Kualitatif
HPLC digunakan untuk analisa kualitatif didasarkan pada waktu retensi untuk identifikasi. Identifikasi dapat diandalkan apabila waktu retensi sampel dibandingkan dengan larutan standar.
Penentuan Kuantitatif
Beberapa hal yang harus diperhatikan agar HPLC dapat dipergunakan untuk penentuan secara kuantitatif adalah:
Parameter percobaan sama antara standar dan sampel
Penentuan berdasarkan waktu retensi sampel dan standar yang sama
Penentuan kadar dilakukan berdasarkan hubungan (korelasi) dengan menggunakan larutan standar seri pada waktu retensi tertentu.
Berdasarkan area kromatogram
Berdasarkan tinggi puncak kromatogram
Umumnya hasil analisis HPLC diperoleh dalam bentuk signal kromatogram. Dalam kromatogram akan terdapat peak-peak yang menggambarkan banyaknya jenis komponen dalam sample.
Sample yang mengandung banyak komponen didalamnya akan mempunyai kromatogram dengan banyak peak. Bahkan tak jarang antar peak saling bertumpuk (overlap). Hal ini akan menyulitkan dalam identifikasi dan perhitungan konsentrasi. Oleh karena itu biasanya untuk sample jenis ini dilakukan tahapan preparasi sample yang lebih rumit agar sample yang siap diinjeksikan ke HPLC sudah cukup bersih dari impuritis.


« Isolasi Etil p-metoksi Sinamat Dari Rimpang Kencur (Kaempferia galanga)
Skenario Pembelajaran »
HPLC
September 5, 2012 oleh TEweWe
Pengertian HPLC
Kromatografi Cair Berperforma Tinggi (high performance liquid chromatography, HPLC) merupakan salah satu teknik kromatografi untuk zat cair yang biasanya disertai dengan tekanan tinggi. Seperti teknik kromatografi pada umumnya, HPLC berupaya untuk memisahkan molekul berdasarkan perbedaan afinitasnya terhadap zat padat tertentu. Cairan yang akan dipisahkan merupakan fasa cair dan zat padatnya merupakan fasa diam (stasioner). Teknik ini sangat berguna untuk memisahkan beberapa senyawa sekaligus karena setiap senyawa mempunyai afinitas selektif antara fasa diam tertentu dan fasa gerak tertentu. Dengan bantuan detektor serta integrator kita akan mendapatkan kromatogram. Kromatorgram memuat waktu tambat serta tinggi puncak suatu senyawa.

Menurut JULIA K., 1996 dalam ISMAIL HENDRA, 2007, HPLC adalah alat untuk mengalisa kandungan bahan kimia, baik secara kualitatif maupun secara kuantitatif. HPLC sendiri singkatan dari High Performance Liquid Chromatography. Mulanya HPLC digunakan untuk mengidentifikasi kandungan antibiotik pada susu dan daging udang, terutama kroramfenikol. Tetapi HPLC kini digunakan pula untuk kegiatan perikanan lainnya.
Kromatografi cair kinerja tinggi (High Performance Liquid Chromatography, HPLC) Metode pemisahannya didasarkan pada perbedaan keseimbangan distribusi komponen sampel antara dua fasa: diam (kolom) dan gerak (sistem pelarut yang mengalir). Tekanan tinggi diperoleh dari pompa, meningkatkan mobilitas eluant. Tipe-tipenya adalah absorpsi, partisi, pertukaran ion dan permeasi gel. Deteksi yang digunakan al. spektrofotometrik (absorpsi sinar UV atau "tampak", fluorometri, penggunaan senyawa pendar/fluoresen, senyawa elektrokhemis yang dapat teroksidasi atau tereduksi).
Prinsip Dasar HPLC
HPLC adalah alat yang sangat bermanfaat dalam analisis. Prinsip dasar dari HPLC adalah memisahkan setiap komponen dalam sample untuk selanjutnya diidentifikasi (kualitatif) dan dihitung berapa konsentrasi dari masing-masing komponen tersebut (kuantitatif). Sebetulnya hanya ada dua hal utama yang menjadi krusial point dalam metode HPLC. Yang pertama adalah proses separasi/pemisahan dan yang kedua adalah proses identifikasi. Dua hal ini mejadi faktor yang sangat penting dalam keberhasilan proses analisa.
Menurut JULIA K., 1996 dalam ISMAIL HENDRA, 2007, prinsip kerja dari HPLC adalah pemisahan absoprsi dan desorpsi yang berulang kali dari komponen yang dipisahkan. Pada saat komponen tersebut dibawa oleh fase gerak mengalir sepanjang kolom. Pemisahan ini terjadi karena adanya perbedaan kecepatan migrasi dari masing-masing komponen yang didasarkan oleh adanya perbedaan koofisien distribusi dari komponen tersebut antara kedua fasa.
HPLC secara mendasar merupakan perkembangan tingkat tinggi dari kromatografi kolom. Selain dari pelarut yang menetes melalui kolom dibawah grafitasi, didukung melalui tekanan tinggi sampai dengan 400 atm. Ini membuatnya lebih cepat.
HPLC memperbolehkan penggunaan partikel yang berukuran sangat kecil untuk material terpadatkan dalam kolom yang mana akan memberi luas permukaan yang lebih besar berinteraksi antara fase diam dan molekul-molekul yang melintasinya. Hal ini memungkinkan pemisahan yang lebih baik dari komponen-komponen dalam campuran.
Perkembangan yang lebih luas melalui kromatografi kolom mempertimbangkan metode pendeteksian yang dapat digunakan. Metode-metode ini sangat otomatis dan sangat peka.
HPLC berbeda dari kromatografi cair klasik. HPLC menggunakan kolom dengan diameter umumnya kecil, 2-8 mm dengan ukuran partikel penunjang 50µm sedangkan laju aliran dipertinggi dengan tekanan yang tinggi. Aplikasi analisis HPLC adalah untuk penentuan kualitatif dan penentuan kuantitatif.
Prinsip dasar HPLC sebenarnya adalah dinamika dan migrasi dengan menggunakan dua fasa. HPLC biasanya digunakan untuk senyawa untuk yang berberat molekul tinggi dan tidak menguap, dimana penyerapan semakin baik jika molekul berada pada bentuk terkecil sehingga pemisahan pun juga akan semakin baik. Setelah pemisahan ini, selanjutnya diidentifikasikan secara kualitatif dan dihitung berapa konsentrasi dari masing-masing komponen tersebut secara kuantitatif.
Penentuan Kualitatif
HPLC digunakan untuk analisa kualitatif didasarkan pada waktu retensi untuk identifikasi. Identifikasi dapat diandalkan apabila waktu retensi sampel dibandingkan dengan larutan standar.
Penentuan Kuantitatif
Beberapa hal yang harus diperhatikan agar HPLC dapat dipergunakan untuk penentuan secara kuantitatif adalah:
Parameter percobaan sama antara standar dan sampel
Penentuan berdasarkan waktu retensi sampel dan standar yang sama
Penentuan kadar dilakukan berdasarkan hubungan (korelasi) dengan menggunakan larutan standar seri pada waktu retensi tertentu.
Berdasarkan area kromatogram
Berdasarkan tinggi puncak kromatogram
Umumnya hasil analisis HPLC diperoleh dalam bentuk signal kromatogram. Dalam kromatogram akan terdapat peak-peak yang menggambarkan banyaknya jenis komponen dalam sample.
Sample yang mengandung banyak komponen didalamnya akan mempunyai kromatogram dengan banyak peak. Bahkan tak jarang antar peak saling bertumpuk (overlap). Hal ini akan menyulitkan dalam identifikasi dan perhitungan konsentrasi. Oleh karena itu biasanya untuk sample jenis ini dilakukan tahapan preparasi sample yang lebih rumit agar sample yang siap diinjeksikan ke HPLC sudah cukup bersih dari impuritis.

 Komponen Instrumen HPLC
Komponen instrumen yang sangat berperan penting dalam kinerja HPLC adalah sebagai berikut:
Fasa gerak
HPLC adalah suatu teknik kromatografi yang menggunakan fasa gerak cair, dapat digunakan untuk pemisahan sekaligus untuk analisis.
Berdasarkan kekuatan / kepolaran fasa geraknya KCKT dibagi menjadi:
Fasa normal : Fasa gerak kurang polar dibandingkan fasa diam
Fasa Terbalik : Fasa gerak lebih polar dibandingkan fasa diam
Fase normal HPLC
Kolom diisi dengan partikel silika yang sangat kecil dan pelarut non polar misalnya heksan. Sebuah kolom sederhana memiliki diameter internal 4.6 mm (dan mungkin kurang dari nilai ini) dengan panjang 150 sampai 250 mm.
Senyawa-senyawa polar dalam campuran melalui kolom akan melekat lebih lama pada silika yang polar dibanding degan senyawa-senyawa non polar. Oleh karena itu, senyawa yang non polar kemudian akan lebih cepat melewati kolom.
Fase balik HPLC
Dalam kasus ini, ukuran kolom sama, tetapi silika dimodifikasi menjadi non polar melalui pelekatan rantai-rantai hidrokarbon panjang pada permukaannya secara sederhana baik berupa atom karbon 8 atau 18. Sebagai contoh, pelarut polar digunakan berupa campuran air dan alkohol seperti metanol.
Dalam kasus ini, akan terdapat atraksi yang kuat antara pelarut polar dan molekul polar dalam campuran yang melalui kolom. Atraksi yang terjadi tidak akan sekuat atraksi antara rantai-rantai hidrokarbon yang berlekatan pada silika (fase diam) dan molekul-molekul polar dalam larutan. Oleh karena itu, molekul-molekul polar dalam campuran akan menghabiskan waktunya untuk bergerak bersama dengan pelarut.
Senyawa-senyawa non polar dalam campuran akan cenderung membentuk atraksi dengan gugus hidrokarbon karena adanya dispersi gaya van der Waals. Senyawa-senyawa ini juga akan kurang larut dalam pelarut karena membutuhkan pemutusan ikatan hydrogen sebagaimana halnya senyawa-senyawa tersebut berada dalam molekul-molekul air atau metanol misalnya. Oleh karenanya, senyawa-senyawa ini akan menghabiskan waktu dalam larutan dan akan bergerak lambat dalam kolom. Ini berarti bahwa molekul-molekul polar akan bergerak lebih cepat melalui kolom.
Di dalam kromatografi cair komposisi dari solven atau rasa gerak adalah salah satu dari variabel yang mempengaruhi pemisahan. Terdapat variasi yang sangat luas pada solven yang digunakan untuk KCKT, tetapi ada beberapa sifat umum yang sangat disukai, yaitu rasa gerak harus :
1. Murni, tidak terdapat kontaminan
2. Tdak bereaksi dengan wadah (packing)
3. Sesuai dengan defektor
4. Melarutkan sampel
5. Memiliki visikositas rendah
6. Bila diperlukan, memudahkan "sample recovery"
7. Diperdagangan dapat diperoleh dengan harga murah (reasonable price)
Umumnya, semua solven yang sudah digunakan langsung dibuang karena prosedur pemumiannya kembali sangat membosankan dan mahal biayanya. Dari semua persyaratan di atas, persyaratan 1) s/d 4) merupakan yang sangat penting.
Pompa
Fase gerak dalam KCKT adalah suatu cairan yang bergerak melalui kolom. Ada dua tipe pompa yang digunakan, yaitu kinerja konstan (constant pressure) dan pemindahan konstan (constant displacement). Pemindahan konstan dapat dibagi menjadi dua, yaitu:
Pompa reciprocating.
Pompa reciprocating menghasilkan suatu aliran yang berdenyut teratur (pulsating), oleh karena itu membutuhkan peredam pulsa atau peredam elektronik untuk menghasilkan garis dasar (base line) detektor yang stabil, bila detektor sensitif terhadapan aliran. Keuntungan utamanya ialah ukuran reservoir tidak terbatas.
Pompa syringe
Memberikan aliran yang tidak berdenyut, tetapi reservoirnya terbatas.
Injektor (injector)
Sampel yang akan dimasukkan ke bagian ujung kolom, harus dengan disturbansi yang minimum dari material kolom. Sampel yang akan dipisahkan dimasukkan ke dalam kolom secara otomatis atau manual melalui injeksi. Volume injeksi sangat tepat karena mempunyai sampel loop dengan variabel volume (misalnya 20 – 500 μL).
Ada tiga tipe dasar injektor yang dapat digunakan :
a) Stop-Flow: Aliran dihentikan, injeksi dilakukan pada kinerja atmosfir, sistem tertutup, dan aliran dilanjutkan lagi. Teknik ini bisa digunakan karena difusi di dalam cairan kecil clan resolusi tidak dipengaruhi
b) Septum: Septum yang digunakan pada HPLC sama dengan yang digunakan pada Kromtografi Gas. Injektor ini dapat digunakan pada kinerja sampai 60-70 atmosfir. Tetapi septum ini tidak tahan dengan semua pelarut-pelarut Kromatografi Cair. Partikel kecil dari septum yang terkoyak (akibat jarum injektor) dapat menyebabkan penyumbatan.
c) Loop Valve: Tipe injektor ini umumnya digunakan untuk menginjeksi volume lebih besar dari 10 μ dan dilakukan dengan cara automatis (dengan menggunakan adaptor yang sesuai, volume yang lebih kecil dapat diinjeksifan secara manual). Pada posisi LOAD, sampel diisi kedalam loop pada kinerja atmosfir, bila VALVE difungsikan, maka sampel akan masuk ke dalam kolom.
Berikut digambarkan sampel injektor pada HPLC yaitu

Injektor :
Dapat memasukkan sampel ke dalam kolom dalam bentuk sesempit mungkin
Mudah digunakan
Keberulangn tinggi
Dapat bekerja walaupun ada tekanan balik
Kolom (Column)
Kolom adalah jantung kromatografi. Berhasil atau gagalnya suatu analisis tergantung pada pemilihan kolom dan kondisi percobaan yang sesuai. Kolom dapat dibagi menjadi dua kelompok :
Kolom analitik : Diameter dalam 2 -6 mm. Panjang kolom tergantung pada jenis material pengisi kolom. Untuk kemasan pellicular, panjang yang digunakan adalah 50 -100 cm. Untuk kemasan poros mikropartikulat, 10 -30 cm. Dewasa ini ada yang 5 cm.
Kolom preparatif: umumnya memiliki diameter 6 mm atau lebih besar dan panjang kolom 25 -100 cm.
Kolom umumnya dibuat dari stainlesteel dan biasanya dioperasikan pada temperatur kamar, tetapi bisa juga digunakan temperatur lebih tinggi, terutama untuk kromatografi penukar ion dan kromatografi eksklusi. Pengepakan kolom tergantung pada model HPLC yang digunakan Liquid Solid Chromatography, (LSC), Liquid Liquid Chromatography (LLC) Ion Exchange Chromatography(IEC), Exclution Chromatography (EC).

Interpretasi output dari detektor
Output akan direkam sebagai rangkaian puncak-puncak, dimana masing-masing puncak mewakili satu senyawa dalam campuran yang melalui detektor dan menerap sinar UV. Sepanjang anda mengontrol kondisi kolom, anda dapat menggunakan waktu retensi untuk membantu mengidentifikasi senyawa yang diperoleh, tentunya, anda (atau orang lain) sudah mengukur senyawa-senyawa murninya dari berbagai senyawa pada kondisi yang sama.

Anda juga dapat menggunakan puncak sebagai jalan untuk mengukur kuanti?tas dari senyawa yang dihasilkan. Mari beranggapan bahwa tertarik dalam senyawa tertentu, X.

Jika anda menginjeksi suatu larutan yang mengandung senyawa murni X yang telah diketahui jumlahnya pada instrumen, anda tidak hanya dapat merekam waktu retensi dari senyawa tersebut, tetapi anda juga dapat menghubungkan jumlah dari senyawa X dengan puncak dari senyawa yang dihasilkan.

Area yang berada dibawah puncak sebanding dengan jumlah X yang melalui detektor, dan area ini dapat dihitung secara otomatis melalui layar komputer. Area dihitung sebagai bagian yang berwarna hijau dalam gambar (sangat sederhana).

Jika larutan X kurang pekat, area dibawah puncak akan berkurang meskipun waktu retensi akan sama. Misalnya,

Ini berarti dimungkinkan mengkalibrasi instrumen sehingga dapat digunakan untuk mengetahu berapa jumlah substansi yang dihasilkan meskipun dalam jumlah kecil.

Meskipun demikian, harus berhati-hati. Jika anda mempunyai dua substansi yang berbeda dalam sebuah campuran (X dan Y), dapatkah anda mengatakan jumlah relatifnya? Anda tidak dapat mengatakannya jika anda menggunakan serapan UV sebagai metode pendeteksinya.

Dalam gambar, area di bawah puncak Y lebih kecil dibanding dengan area dibawah puncak X. Ini mungkin disebabkan oleh karena Y lebih sedikit dari X, tetapi dapat sama karena Y mengabsorbsi sinar UV pada panjang gelombang lebih sedikit dibanding dengan X. Ini mungkin ada jumlah besar Y yang tampak, tetapi jika diserap lemah, ini akan hanya memberikan puncak yang kecil.