Teknik Kimia Politeknik Negeri Malang
HPLC (High Performance Liquid Chromatography) Della Fajar P Dinni Hayyu Farid Jatmika Putri Fenny M. Rizky Alfiz Alfiz Retno Sari
Tujuan Praktikum Menganalisa sampel secara kualitatif dan kuantitatif dengan HPLC
Mempelajari cara kerja alat HPLC
Tujuan Praktikum Menganalisa sampel secara kualitatif dan kuantitatif dengan HPLC
Mempelajari cara kerja alat HPLC
Kromatografi
Kromatografi adalah cara pemisahan campuran yang didasarkan atas perbedaan distribusi dari komponen campuran tersebut diantara dua fase, yaitu fase diam (stationary) dan fase bergerak (mobile). Fase diam Padat Cair
Fase gerak Cair Gas
HPLC
Kromatografi cair berperforma tinggi (high performance liquid chromatography , HPLC) merupakan salah satu teknik kromatografi untuk zat cair yang biasanya disertai dengan tekanan tinggi. Seperti teknik kromatografi pada umumnya, HPLC berupaya untuk memisahkan molekul berdasarkan perbedaan afinitasnya terhadap zat padat tertentu. Cairan yang akan dipisahkan merupakan fase cair dan zat padatnya merupakan fase diam (stasioner).
Prinsip dasar dari HPLC, dan semua metode kromatografi adalah memisahkan setiap komponen dalam sample untuk selanjutnya diidentifikasi (kualitatif) dan dihitung berapa konsentrasi dari masing-masing komponen tersebut (kuantitatif). Analisa kualitatif bertujuan untuk mengetahui informasi tentang identitas kimia dari analat dalam suatu sample. Sedangkan analisa kuantitaif untuk mengetahui jumlah dan konsentrasi analat tersebut dalam sample
Komponen HPLC Pompa Botol penampung
Katup
Data Prosesor
Kolom
Detektor
Gerbang suntik
Komponen-komponen HPLC
Botol Penampung
Botol penampung berjumlah 4 buah Berisi fase gerak (Aquabidest dan Methanol) Berfungsi sebagai wadah pencampuran jika memang di perlukan.
Pompa dengan kriteria
:
Tekanan dapat mencapai 400 bar Laju air yang dihasilkan konstan dan tidak berfluktuasi Dapat menghasilkan laju hingga 10 ml/menit Dapat memproduksi laju alir secara tepat Tidak bersifat korosif
Jenis Pompa Reciprocating pump • Tangki dan piston bergerak maju mundur dilengkapi beberapa katup Displacement pump • Batang berulir dan piston Pneumatic pump • Tangki bertekanan yang didalamnya memiliki gelembung fleksibel terbuat dari karet
Katup
Berfungsi mengatur komposisi pelarut yang diperlukan dan mengatur laju alir pelarut.
Kolom
Terbuat dari baja tahan karat dengan permukaan yang sangat halus dan berdinding tebal. Ukurannya biasanya 4.6 mm dan panjang 25 cm. Kolom yang digunakan saat praktikum bersifat nonpolar dari jenis C-18/RP-18
Gerbang suntik
Gerbang suntik didesain sedemikian rupa sehingga mampu membatasi jumlah analit yang masuk kolom pada volum tertentu misalnya 20 mikroliter. Jika analit yang disuntikkan melebihi dari jumlah maka sisanya akan dibuang .
Detektor Kriteria: Mimiliki sensitivitas 0, 1 pikogram hingga 10 nanogram/detik Mampu memberikan respon linier sesuai jumlah yang terdeteksi Respon harus lebih cepat dan tidak tergantung pada laju alir Mudah dioperasikan Dapat mendeteksi beragam senyawa Tidak berifat destruksif Jenis-jenisnya Spektofotometer UV, Fluorometri, Spekrofotometer Infra Merah, Refraktometer, Konduktometer dan Spektogram massa. Yang digunakan pada saat praktikum: Spektofotometer UV yang
merupakan detektor selektif.
Detektor
Banyak senyawa-senyawa organik menyerap sinar UV dari beberapa panjang gelombang. Jika menyinarkan sinar UV pada larutan yang keluar melalui kolom dan sebuah detektor pada sisi yang berlawanan, maka akan mendapatkan pembacaan langsung berapa besar sinar yang diserap. Jumlah cahaya yang diserap akan bergantung pada jumlah senyawa tertentu yang melewati melalui berkas pada waktu itu. Anda akan heran mengapa pelarut
Data Prosesor
Untuk mengubah sinyal dari detektor menjadi data berupa angka-angka yang diperlukan misalnya waktu retensi (Rt), luas kurva, presentase luas kurva dan lainnya.
Data prosesor dapat berupa integrator atau komputer.
Fase Gerak (Mobile Phase)
Berfungsi untuk membawa analit melalui kolom dan mencapai detektor yang harus memiliki syarat : Kemurnian tinggi Mudah didapat dan murah Titik didih 20-50 C diatas suhu kolom Viskositas rendah Tidak bereaksi dengan analit dan fase diam Tidak melarutkan fase diam maupun pelapisnya Sifatnya berbeda dengan analit pada detektor Tidak berbahaya dari segi kebakaran dan keracunan
Tipe Kromatografi HPLC Kromatografi Normal
Kromatografi Reverse
Packing material
Polar
Silica gel Silica NH2 Silica CN
Non Polar
Silica C-18 Silica C-8 Silica Polimer
Mobile Phase
Non polar
Polar
Metanol CH3CN/H2O MeOH/Buffer sol
Didalam kolom terjadi pemisahan komponen-komponen campuran karena perbedaan kekuatan interaksi anata solut-solut terhadap fasa daiam. Solut-solut yang kurang kuat interaksinya dengan fasa diam akan keluar dari kolom terlebih dahulu sehingga waktu retensi yang dicapai lebih cepat. Begitu pula sebaliknya. Waktu retensi adalah w aktu yang dibutuhkan oleh senyawa untuk bergerak melalui kolom menuju detektor disebut sebagai waktu retensi . Waktu retensi diukur berdasarkan waktu dimana sampel diinjeksikan sampai sampel menunjukkan ketinggian puncak maksimum pada grafik dari senyawa itu.
Alat dan Bahan
A. Alat Seperangkat alat HPLC Personal komputer Alat suntik UV-VIS detektor Printer B. Bahan Metanol Air Fenol Toluena
Skema Kerja a. Persiapan Mengisi botol penampung A ; Metanol : Air (15:85) B ; Metanol : Air (85:15) sebagai fase pembawa atau fase gerak
Menghidupkan alat, menekan tombol on/off pada bagian belakang user sebelah kanan
Hidupkan detektor UV-VIS 200, atur panjang gelombang 254 nm, RANGE (AUFS) pada 0,0005 RISE TIME pada 0,1 detik
Hidupkan personal komputer, program windows 3,1 pilih menu Chromatography, klik HPLC, klik OK, ketik Lab. Pada user name, ketik “1” pada password, klik OK, klik HPLC
b. analisis Lakukan “purging” untuk mengeluarkan gas dari saluran, dengan buka tutup HPLC, putar ke kiri (membuka) kran purging, tekan tombol “PURGE” “D”
Tunggu gelembung dan fasa pembawa keluar, tekan “PUMP/STOP”. Tutup kembali kran purging
Atur laju alir fasa pembawa pada3 ml/menit dengan menekan “FLOW” “A” “100” “ENTER”. Tekan kembali “FLOW “3” “ENTER”
Suntikkan sampel (min. 20 mikron) pada posisi tuas “INJECT”
Aur menu mulai merekam monitor, menggerakkan tuas dari INJECT ke LOAD, tekan “PUMP” dan “ENTER” (pada PC) secara serentak. Lihat petunjuk program HPLC
Mengamati signal yang tergambar daam monitor
Lakukan kembali dengan menyuntikkan sampel dan campuran pada langkah 4-6
Tentukan jenis dan kadar sampel setelah proses analisis selesai
Data Pengamatan Inject 1 (Toluen)
Inject 2 (Fenol)
Inject 3(fenol+toluen)
Interpretasi output dari detektor
Output akan direkam sebagai rangkaian puncak-puncak, dimana masing-masing puncak mewakili satu senyawa dalam campuran yang melalui detektor dan menerap sinar UV. Sepanjang anda mengontrol kondisi kolom, anda dapat menggunakan waktu retensi untuk membantu mengidentifikasi senyawa yang diperoleh, tentunya, anda (atau orang lain) sudah mengukur senyawa-senyawa murninya dari berbagai senyawa pada kondisi yang sama.
Dalam gambar, area di bawah puncak Y lebih kecil dibanding dengan area dibawah puncak X. Ini mungkin disebabkan oleh karena Y lebih sedikit dari X, tetapi dapat sama karena Y lebih polar daripada X. Ini mungkin ada jumlah besar Y yang tampak, tetapi kepolaran lemah, ini akan hanya memberikan puncak yang kecil.
Data Pengamatan
Waktu retensi pada 14 menit
Dari data dapat diketahui bahwa sampel yang keluar terlebih dahulu (waktu retensi 9,325) adalah fenol dan yang keluar berikutnya adalah toluena (waktu retensi 11,983). Hal tersebut dapat diperoleh dengan cara membandingkan hasil sampel dengan data inject toluena dan fenol standar. Toluena standar mempunyai peak pada Rt 12,6 menit sehingga pada data peak pada Rt 11,983 menit merupakan toluena. Sedangkan fenol standar memiliki peak pada Rt 9,500 sehingga pada peak 9,325 menit adalah fenol. Sehingga dari data sesuai dengan teori bahwa sampel yang keluar terlebih dahulu adalah sampel yang lebih polar yaitu fenol yang dilanjutkan dengan toluen karena fase diam yang digunakan adalah nonpolar.
Dari data juga dapat diperoleh bahwa jumlah Fenol lebih besar dibandingkan jumlah toluena pada sampel hal tersebut diketahui dari % area Fenol sebesar 48,160 % dan % area Toluen sebesar 20 %. Dan sisa persentasi lainnya yang dapat dilihat dari peak-peak kecil yang muncul merupakan pengotor yang mengontaminasi campuran, yang diakibatkan sample campuran dipakai berulang-ulang untuk berbagai kelompok,juga syringe yang dipakai secara bergantian.
Kesimpulan 1. HPLC (High Performance Liquid Kromatografi) merupakan suatu metode Kromatografi cair-cair berdasarkan tingkat kepolaran 2. Senyawa yang sifatnya sama dengan kolomnya maka interaksinya lebih kuat sehingga lebih lama di kolom, sebaliknya senyawa atau komponen yang sifatnya berbeda dengan fasa diamnya akan lebih cepat keluar dari kolom karena interaksi antara sampel dengan fasa diam 3. Senyawa yang keluar terlebih dahulu (Waktu retensinya lebih pendek) adalah Fenol dengan Rt 9,326 yang lebih polar dibandingkan Toluena dengan Rt 11,983 karena kolom yang digunakan adalah kolom nonpolar 4. Konsentrasi Fenol lebih besar dibandingkan dengan
