MANUAL DE QUIMICA CLINICA

EMPRESA SOCIAL DEL ESTADO HOSPITAL SAN RAFAEL YOLOMBÓ - ANTIOQUIA

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MANUAL DE QUIMICA CLINICA

Versión: 1.0 Página 1 de 83


ELABORADO POR: CAROLINA HOYOS VELASQUEZ BACTERIOLOGA COOPERATIVA COOMAN

LABORATORIO CLINICO EMPRESA SOCIAL DEL ERSTADO HOSPITAL SAN RAFAEL DE YOLOMBO YOLOMBO 2008

EMPRESA SOCIAL DEL ESTADO HOSPITAL SAN RAFAEL YOLOMBÓ - ANTIOQUIA MANUAL DE QUIMICA CLINICA

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ACIDO URICO 1. Metodo Análisis enzimático colorimétrico por ácido urico con factor aclarante de lípidos (LCF) (PAP) 2. Fundamento Determinación del Acido Urico por la reacción con la uricasa. El peróxido de hidrógeno formado reacciona por la acción catalítica de la peroxidasa con ácido 3,5-dicloro-2-hydroxybenzenesulfónico (DCHBS) y 4-aminofenazona (PAP) para producir un complejo rojo-violeta de quinonemina como indicador. 3. Muestras Suero o plasma con heparina o EDTA, orina. Diluir la orina 1 + 10 con agua destilada. 4. Condiciones del paciente Para determinación en suero. Antes: • Explicar el procedimiento al paciente. • Llevar estrictamente los siguientes puntos. • Suspender la medicación de drogas como: alopurinol, salicilatos, fenilbutazona, calmantes o analgésicos, ácido ascórbico (vitamina C), buscapina, diuréticos de la trazida, tioles libres, purinas metiladas, ácido homogentístico y altas cantidades de glucosa. • Dos días antes del examen evitar ejercicios violentos.



ACIDO URICO 1. Metodo Análisis enzimático colorimétrico por ácido urico con factor aclarante de lípidos (LCF) (PAP) 2. Fundamento Determinación del Acido Urico por la reacción con la uricasa. El peróxido de hidrógeno formado reacciona por la acción catalítica de la peroxidasa con ácido 3,5-dicloro-2-hydroxybenzenesulfónico (DCHBS) y 4-aminofenazona (PAP) para producir un complejo rojo-violeta de quinonemina como indicador. 3. Muestras Suero o plasma con heparina o EDTA, orina. Diluir la orina 1 + 10 con agua destilada. 4. Condiciones del paciente Para determinación en suero. Antes: • Explicar el procedimiento al paciente. • Llevar estrictamente los siguientes puntos. • Suspender la medicación de drogas como: alopurinol, salicilatos, fenilbutazona, calmantes o analgésicos, ácido ascórbico (vitamina C), buscapina, diuréticos de la trazida, tioles libres, purinas metiladas, ácido homogentístico y altas cantidades de glucosa. • Dos días antes del examen evitar ejercicios violentos.



24 horas antes del examen, el paciente debe abstenerse de ingerir carnes rojas, mariscos y frijoles ya que contienen altos contenidos de purina. 48 horas antes de la venoclisis suspender el consumo de alcohol. Durante: Recoger 5 - 7 ml de sangre venosa en un tubo de tapón rojo. • Retomar nuevamente la ingesta de cualquier medicamento que pueda alterar los resultados. Después: • Aplicar presión en el sitio de punción. Para determinación en Orina: •

Orina de 24 horas, teniendo en cuenta las indicaciones anteriores.

Nota Las muestras lipémicas generalmente generan turbidez en la mezcla del reactivo con la muestra, lo que lleva a resultados elevados falsos. El LCF aclara completamente la turbidez causada por muestras lipémicas. Los valores en sangre total varían con la proporción de células en la sangre debido a que las células también contienen muchas más sustancias que interfieren en la reacción. 5. Condición de la muestra La sangre debe recogerse en tubos limpios, libres de metales pesados, ya que estos y los cianuros son inhibidores enzimáticos. La prueba no se ve influenciada por valores hasta 100mg/dl de hemoglobina o por valores de bilirrubina hasta 20mg/dl. La estabilidad de la muestra es: Temperatura ambiente  3 días Refrigerado  2 - 8°C por 5 días. Congelado 20°C, seis se is meses. m eses.  20°C, En orina de 24 horas con preservativos y a temperatura ambiente → 2 días. 6. Metodo de determinacion Longitud de onda: 520nm, Hg 546 nm. Paso de luz: 1 cm Temper Tem peratu atura: ra: 20 - 25 °C ó 37°C 37°C Medir: frente a blanco de reactivos



7. Tecnica Pipetear: Blanco Estándar Muestra Blanco ---------Muestra ------25λ Estándar ------25λ Solución Reactiva 1000λ 1000λ 1000λ Mezclar, incubar a 20-25°C durante 20-50 minutos, leer las extinciones frente a blanco de reactivos. Límite de dilución 15 mg/dl, con concentraciones superiores diluir la muestra 1 + 1 con solución de cloruro sódico al 0.9% y repetir la determinación, el resultado multiplicarlo por 2.

8. Valores de referencia Hombres: 3.7 - 7.0 mg/dl. Mujeres: 2.4 - 5.7 mg/dl. 9. Interferentes de la prueba El ácido ascórbico en concentraciones terapéuticas no interfiere en la prueba, pero en cantidades excesivas puede dar resultados elevados. Sustancias químicas con efecto antiuricosúrico. Acido etacrínico, furosemida, diuréticos de la benzotiacida. Sustancias que inhiben competitivamente la secreción tubular del urato. El p- aminohipurato, lactato, acetoacetato y B. hidroxibutírico. Por otra parte, ciertos fármacos como los salicilatos, fenilbutazona entre otros, inhiben la secreción de ácido úrico a dosis bajas, pero causan un efecto urosúrico intenso a dosis altas, debido a que estos fármacos pueden inhibir reabsorción tubular a niveles altos. El exceso del lactato también se asocia con la hiperuricemia en los casos de ejercicio fuerte y toxemia del embarazo.

Notas El etanol altera el metabolismo del ácido úrico aumentando la producción de urato y por la supresión de la excreción renal de ácido ácido úrico. Esta última es el resultado



del exceso de lactato producido por la oxidación del etanol a acetaldehído, que inhibe competitivamente la secreción tubular renal del urato.

10. Control de calidad • Cada vez que se determine ácido úrico correr con las muestras un estándar acuoso y dos suero control liofilizado. • Asegurarse que la lectura del blanco esté dentro del rango permitido. • Almacenamiento adecuado de los cartuchos reactivos. • Evaluación permanente de resultados. • Adecuada extracción y manipulación de muestras límites aceptables en los controles. Correlacion clinico patologica Numerosas enfermedades, alteraciones fisiológicas, cambios bioquímicos e incluso factores sociales y de comportamiento se asocian a modificaciones de la concentración de ácido úrico en el plasma. El aumento del ácido úrico es mucho más frecuente y clínicamente más significativo que su disminución. Entre las etiologías más comunes de hiperuricemia se cuentan el fallo renal, la cetoácidosis, el exceso de lactato y el uso de diuréticos. La hiperuricemia tiene también una relación positiva con la hiperlipidemia, obesidad, aterosclerosis, diabetes mellitus, hipertensión. En los pacientes hipertensos la reducción del flujo sanguíneo renal y el aumento de la resistencia vascular pueden ser responsables de la disminución de la fracción de filtración del urato. La ingestión de alimentos ricos en purinas, por ejemplo carnes, vísceras y levaduras producen una hiperuricemia leve. Es de mucha importancia la determinación de ácido úrico, pues los valores altos son diagnóstico de “gota”. La gota es un trastorno del metabolismo de purinas o de la excreción renal de ácido úrico caracterizado por: Hiperuricemia. Precipitación de urato monosódico en forma de depósitos (tofos) por todo el cuerpo, excepto por el SNC, aunque presenta predilecciones por articulaciones, tejido subcutáneo y bolsas sinoviales. Ataques clínicos recidivantes de artritis. Nefropatía y a menudo nefrolitiasis. Las reservas de ácido úrico pueden superar los 30 g.



Se han identificado dos defectos enzimáticos ligados al cromosoma sexual como etiología de la gota primaria: Una deficiencia de (H 6 PRT) hipoxantin guanin - fosforrobosil transferasa. Una hiperactividad de fosforribosil - fosfato La presencia de amonio en cualquiera de los reactivos, anticoagulantes o agua destilada aumentan los valores.

ALBUMINA 1. Metodo Prueba fotometrica colorimetrica para Albumina Metodo BCG 2. Fundamento. El verde de bromocresol forma con la albumina en buffer de citrata un complejo coloreado. La absorbancia de este complejo es directamente proporcional a la concentracion de albumina en la muestra. 3. Muestras Suero ó plasma con EDTA ó heparina. Estable 1 mes a 2-8 grados y 1 semana entre 15 y 25 grados 4. Condiciones del paciente El paciente debe tener un ayuno de por lo menos 8 horas y durante este periódo no hacer esfuerzoz corporales intensos, ya que esto puede aumentar la concentración de proteínas. El uso del torniquete no ha de execeder los 30 segundos, su prolongación tiende a aumentar los niveles de proteínas en la muestra de suero. 5. Condiciones de la muestra No usar plasma heparinizado porque se puede alterar el valor. Patron de albúmina y el RGT son estables hasta la fecha de vencimiento cuando se almacenan de 2 a 25 grados centigrados, despues de abierto debe evitarse la contaminación.



6. Metodo de determinacion Longitud de onda: Hg 546 nm, 578 nm Paso de luz: 1 cm Temperatura: 20 a 25 Medición: frente a blanco de reactivo por serie.

7. Tecnica Pipetear en tubos de ensayo: Patrón albúmina Muestra Reactivo

blanco ---------1,0 ml

patrón 10 ul ---1,0 ml

muestra ---10 ul 1,0 ml

Mezclar bien y dejar los tubos durante 5 minutos a temperatura ambiente. Leer la absorbancia del patrón y de la muestra frente al blanco de reactivo. El color es estable durante al menos 30 minutos. ABS muestra ____________ X 4 g/dl albúmina ABS patrón

8. Valores normales 3.8 – 5.1 g/dl en hombres y mujeres. 9. Interferencias La prueba no es influenciada por valores de Bilirrubina hasta 20mg/d. Hemoglobina (1 g/L). La reacción de la albúmina con el verde de bromocresol es inmediata. Otras proteinas reaccionan lentamente, por lo que es conveniente no demorar la lectura. 10. Correlacion clinicopatologica. Hay 3 factores que pueden disminuir su concentración:



1) Pérdidas cuantiosas o frecuentes, (hemorragias, albúminuria persistente, paracentesis, catabolismo excesivo). 2) Por síntesis defectuosa como ocurre en la mayor parte de las hepatopatías. 3) Por carencia de materia prima como en la hipoalimentacion.

Otras: Trastornos pulmonares. Anemia persistente Neoplasia nefrosis lipoidea. Edemas carenciales. La manifestacion clínica mas llamativa es el edema. MICROALBUMINURIA 1. Metodo Prueba de turbidimetría para la cuantificación de microalbúmina en orina humana. 2. Fundamento Las partículas de látex con anticuerpos anti-albúmina humana, son aglutinadas por uALB presente en la muestra del paciente. El proceso de aglutinación provoca un cambio de absorbancia proporcional a la concentración de uALB de la muestra, y por comparación conocida se puede determinar el contenido de uALB en la muestra ensayada. 3. Muestra Orina fresca. 4. Condiciones de la muestra La orina debe ser lo más fresca posible, y se debe ajustar su pH a 7.0 con NaOH/HCl 1 mol/L. Es estable por 7 días cuando se le añade azida sódica para prevenir posibles contaminaciones. 5. Metodo de determinacion Longitud de onda: 540 nm (530-550 nm) Paso de luz: 1 cm Temperatura: 37°C Medición: frente a agua destilada



6. Tecnica Reactivo de trabajo muestra

1000 ul 7 ul

Mezclar y leer la absorbancia frente a agua destilada y leer a los dor minutos después y se multiplica el valor por la concentración del calibrador.

7. Valores de referencia Hasta 15 mg/L 8. Interferencias No interfieren valores de Glucosa 2 g/L, hemoglobina 10g/L, creatinina 3 g/L. La urea > de 1g/L y bilirrubina > 10mg/dl interfieren. Correlacion diagnostica Se define la microalbúmina como la tasa de excresión de albúmina en orina entre 20 y 200 ug/min, concentración que, siendo superior al valor normal, esta aun por debajo de la concentración considerada como una proteinuria convencional. La microalbuminuria es un marcador del riesgo de la nefropatía diabética, así como de alteraciones cardiovasculares en pacientes que sufren diabetes mellitus insulinodependientes o bien insulina no-dependiente.





BILIRRUBINA TOTAL Y DIRECTA. Generalidades La bilis se forma en el hígado y presenta muchos componentes, incluyendo sales biliares, fosfolípidos, colesterol, bicarbonato, agua y bilirrubina. El metabolismo de la bilirrubina proviene en un 80% de la descomposición de los hematíes envejecidos en el sistema retículo endotelial (bazo, hígado y medula ósea). Un 5% de los citocromos citoplasmáticos y mitocondriales hepáticos; y el otro porcentaje de los eritrocitos defectuosos destruidos en la medula ósea antes de ser liberados. La hemoglobina es liberada desde los hematíes y descompuesta en moléculas de Heme y globina. El heme es catabolizado después para formar biliverdina que se transforma en bilirrubina.

Hem hem oxigenasa

Biliverdina Biliverdina reductasa

Bilirrubina.

Esta forma de bilirrubina se denomina no conjugada (indirecta) que es transportada en el plasma en forma libre unida a la albúmina, hasta las células hepáticas en donde es conjugada con el ácido glucoronico; conjugación catalizada por la enzima Bilirrubin - glucoronil - transferasa. La bilirrubina conjugada se excreta después por las células hepáticas hacia los canalicemos intrahepáticos, que acaban conduciéndola a los conductos hepáticos, el conducto biliar común y el intestino. El riñón no excreta bilirrubina no conjugada puesto que es insoluble en agua y en general se encuentra unida a la albúmina, por tanto no atraviesa la membrana glomerular. La orina normalmente contiene una pequeña cantidad de urobilinógeno, pero no de bilirrubina, esta solo aparece cuando la concentración en plasma se encuentra aumentada y siempre es de bilirrubina conjugada. El examen de la orina para los pigmentos biliares (bilirrubina) y urobilinógeno se emplea en la investigación de la ictericia. La bilirrubina total del suero incluye la bilirrubina libre o no conjugada (reacción indirecta) y una pequeña cantidad de bilirrubina conjugada o de reacción directa. El nivel de la bilirrubina serica total, es útil para evaluar la extensión y el progreso de la ictericia.



La designación de Bilirrubina como directa e indirecta deriva de observaciones, llevadas a cabo por Van Den Berg en 1913, de que parte de la bilirrubina reacciona directamente con el reactivo de Erlich, mientras que la otra hay que adicionarle alcohol.

1. Metodo Método modificado de Jendrassik/Gróf. 2. Fundamento La Bilirrubina reacciona con al ácido sulfanílico diazotado (DSA) formando un color rojo. La absorbancia de este color a 546 nm es directamente proporcional a la concentración de bilirrubina en la muestra. Los glucoronidos de la bilirrubina solubles en agua reaccionan directamente con DSA mientras la bilirrubina indirecta conjugada con albumina reacciona sólo en la presencia de un acelerador. Bilirrubina total = bilirrubina directa + bilirrubina indirecta. 3. Muestra Suero o Plasma con heparina. Evitar muestras hemolizadas, y deben estar protegidas de la luz. La muestra es estable por 3 días a una temperatura de 2 a 8 grados, alajada de la luz. 4. Condiciones del paciente Reposo de 15 minutos antes de la toma de muestra. Ayuno de ocho horas. El ayuno prolongado produce aumento de bilirrubina ya que parte de esta se almacena en el tejido adiposo y al suceder la lipolisis se libera y sale a la circulación. El uso de torniquete no debe prolongarse más de 30 segundos. 5. Condiciones de la muestra No agitar el tubo, ya que en caso contrario los resultados de la prueba podrían ser inexactos. Proteger la muestra de sangre de la luz brillante. Mencionar en el volante del laboratorio cualquier fármaco que pudiera afectar los resultados de la prueba. Debe procesarse la muestra el mismo día.



6. Metodo de determinacion Longitud de onda: 546 nm Paso de luz: 1 cm Temperatura: 20 a 25 grados C Medición: frente a blanco de muestra.

7. Tecnica Bilirrubina total Pipetear en tubos oscuros o protegidos de la luz: Reactivo TBR Reactivo TNR

Blanco 1 ml ....

Muestra 1 ml 1 gota

Mezclar cuidadosamente e incubar por 5 minutos. Muestra 100 ul 100 ul Mezclar e incubar a temperatura ambiente de 10 a 30 min. Leer la absorbancia de la muestra frente al blanco.

Bilirrubina directa Pipetear en tubos oscuros o protegidos de la luz: Reactivo DBR Reactivo DNR

Blanco 1 ml ....

Muestra 1 ml 1 gota

Mezclar cuidadosamente e Incubar por 2 minutos. Muestra 100 ul 100 ul Mezclar e incubar a temperatura ambiente exactamente por 5 minutos. Leer la absorbancia frente al blanco.



8. Valores de referencia Bilirrubina total: 0.1 - 1.0 mg/dl o 5.1 - 17.0 umol/l. Bilirrubina indirecta: 0.2 - 0.8 mg/dl o 3.4 - 12.0 umol/l. Bilirrubina directa: 0.1 - 0.3 mg/dl o 1.7 - 5.1 umol/l. Bilirrubina total en el recién nacido: 1 a 12 mg/dl ó 17.1 - 20.5 umol/l. Para obtener la concentración de la Bilirrubian indirecta se resta o establece la diferencia de la concentración de la Bilirrubina total y Bilirrubina directa. Bilirrubina indirecta = B. total - B. directa.

9. Interferentes La exposición prolongada (más de 1 hora) a la luz solar directa o artificial puede causar disminución de la bilirrubina en un 50%. La hemólisis de la sangre y la lipemia pueden producir resultados erróneos. Entre los fármacos que pueden causar niveles aumentados de bilirrubina total se incluyen: Esteroides, anabolizantes, antibióticos (Eritromicina), antipalúdicos, ácido ascórbico, diuréticos, morfina, anticonceptivos orales, salicilatos y vitamina A, etc. Entre los fármacos que reducen los niveles de bilirrubina total se incluyen barbitúricos, cafeína, penicilinas y salicilatos (dosis elevadas). 10. Estabilidad No es muy estable, se altera rápidamente con la luz, por lo tanto, debe procesarce la muestra lo más rápido posible. El almacenamiento no es conveniente, si se necesita debe refrigerarse por pocos días (3 días a 2-8 °C) protegida de la luz. 11. Linealidad La prueba es lineal hasta 25 mg/dl, si la concentración es mayor de 25 mg/dl, diluir la muestra 1 + 4 con solución fisiológica y repetir la prueba. Multiplicar el resultado por 5. Correlacion diagnostica La determinación de bilirrubina total es útil para evaluar la extensión y progreso de la ictericia en problemas hepatocelulares, obstructivos y prehepáticos. La ictericia es una coloración amarillenta de los tejidos corporales (piel, membranas mucosas y escleróticas), causada por niveles sanguíneos de bilirrubina anormalmente altos; el color amarillo se aprecia cuando la bilirrubina serica total



supera los 2.5 mg/dl. La ictericia se debe a un defecto en el metabolismo o la excreción normales de bilirrubina, defecto que puede ocurrir en cualquier fase del metabolismo de la bilirrubina desde su formación hasta su excreción intestinal.

Ictericia pre – hepatica Hay aumento de la bilirrubina indirecta. No hay bilirrubinuria. Causas: Metabolismo aumentado del Heme: esferocitosis hereditaria, enfermedad drepanocitica, policitemia, etc. Eritropoyesis ineficaz acelerada: Anemia megaloblástica, talasemia intoxicación por plomo.  Destrucción prematura de eritrocitos defectuosos.  Hiperbilirrubinemia por derivación. Cirrosis. Insuficiencia cardiaca congestiva.  Síndrome de Gilbert  Recién Nacidos. Síndrome de Cliger - Najjan I y II. Ictericia hepatocelular Hay aumento mayor de la bilirrubina directa y puede haber aumentos menores de B. indirecta o estar normal y la bilirrubina total aumentada. En general hay bilirrubinuria. Causas: Shock por hipoxia. Hepatitis viral, alcohol y tóxica.  Cirrosis por alcohol. Ictericia post - hepatica o colestasica Hay aumento de bilirrubina directa y se presenta Bilirrubinuria. Causas:  Obstrucción intrahepática: debido a obstrucción por fármacos, hormonas esteroideas, hepatitis aguda, virica o alcohólica, cirrosis biliar primaria, atresia de conductos, tumores metastásicos etc.





Colestasis extrahepática o quirúrgica: debido a carcinoma en conducto, vesícula biliar, páncreas o ampolla de Vater; cálculos biliares, por edema en la cabeza del páncreas.

Nota La bilirrubina directa diferencia la ictericia Pre-hepática de la hepatocelular y obstructiva y la bilirrubina indirecta hace la diferenciación entre la hepatocelular obstructiva y las Pre-hepáticas.



PERFIL LIPIDICO MINIMO Generalidades de lipidos Los lípidos constituyen la principal reserva energética de los seres vivos y también forman parte de la membrana celular y regulan la actividad de la célula y tejidos. Los lípidos totales están compuestos por: colesterol libre, esteres de colesterol, triglicéridos, fosfolípidos y ácidos grasos libres. Todos estos lípidos con excepción de los ácidos grasos que están ligados a la albúmina, se encuentran en el plasma como lipoproteínas. Perfil lipidico minimo El dato del colesterol total y los triglicéridos da una información global de los lípidos que circulan en el organismo, pero sí se requiere tener un concepto claro de cómo están incidiendo los lípidos en el aparato circulatorio, se debe tener un estudio fraccionado de las lipoproteínas que es lo que se conoce como perfil lipídico. En el estudio del perfil lipídico mínimo se deben tener en cuenta los siguientes parámetros: Aspecto del suero: se realiza la prueba en frío en caso de obtener sueros lechosos, se coloca el suero durante 12 horas en refrigeración (4ºC) esto con el objeto de ayudar a clasificar las trigliceridemias así:  Capa cremosa en la superficie y nadante transparente, significa presencia de triglicéridos exógenos (quilomicrones).  Capa cremosa en la superficie y nadante turbio significa triglicéridos exógenos y endógenos (quilomicrones y VLDL). Aspecto uniformemente lechoso significa presencia de triglicéridos endógenos (VLDL). El aspecto del suero no indica que el paciente este normal, porque valores de colesterol aumentados no producen ninguna turbidez. El colesterol total del cuerpo: comprende el colesterol libre y esterificado. 70% esterificado, 30% libre. Transportado principalmente por LDL, HDL, IDL y VLDL. Triglicéridos HDL colesterol VLDL colesterol: se evalúa mediante la formula trigliceridos/5, cuando estos son < 400 mg/ml. LDL colesterol: se determina con la formula de Friedewald


LDL C = CT- (VLDL C + HDL C ). Indice arterial se determina mediante la formula CT/HDLC ö


LDLC / HDLc.

Interpretacion del perfil lipidico mínimo Lípido mg/dl Colesterol Total LDL Colesterol HDL hombres HDL mujeres Trigliceridos Indice arterial:

Deseable <200 <130 >35 >45 <200

Riesgo potencial 200-239 130-159 25-35 40-45 >200

Riesgo alto >=240 >=160 <25 <40 >200

Hombres <=5 Mujeres <=4.5

Estas cifras nos indican que la arteriosclerosis se esta verificando en forma normal. Cifras superiores establecen un alto riesgo de enfermedad coronaria.



COLESTEROL TOTAL 1. Metodo Prueba enzimática colorimétrica para colesterol con factor aclarante de lípidos (LCF) CHOD-PAP 2. Fundamento El colesterol se determina después de la hidrólisis enzimática y la oxidación. El indicador es la quinonemina formada por el peróxido de hidrógeno y 4aminoantipirina en presencia de fenol y peroxidasa. 3. Muestra Suero o plasma con heparina o EDTA. 4. Condiciones del paciente Esta prueba no necesita de ayuno pero como generalmente se realiza con el resto del perfil lipídico, se deben seguir los requerimientos que para este se indiquen. No se debe ingerir alcohol 24 horas antes de la prueba. 5. Condiciones de la muestra La muestra ideal es suero ó plasma heparinizado ó con EDTA. Extraer 5-10 ml de sangre en un tubo seco. Anotar cualquier fármaco que pueda modificar los valores de Colesterol. Separar el suero de los glóbulos rojos en la media hora siguiente a la extracción, para evitar la redistribución del Colesterol entre las diversas lipoproteínas. 6. Metodo de determinacion Longitud de onda 500 nm, 546 nm Paso de luz: 1 cm Temperatura: 25 ó 37 grados C. Medición: frente a blanco de reactivo.



7. Tecnica Pipetear Blanco Estándar Muestra Rvo Color

Blanco ---------1000 µl

Estándar ---10 µl ---1000 µl

Muestra ------10 µl 1000 µl

Mezclar, incubar 10 minutos a 20 ó 25 grados, o 5 minutos a 37 grados C. Leer la absorbancia frente a blanco de reactivo.

8. Valores de referencia Varían con la edad y el laboratorio. RECIEN NACIDOS LACTANTES NIÑOS ADULTOS/ ANCIANOS

53 – 135 mg/dl 70 – 175 mg/dl 120- 200 mg/dl < 220 mg/dl Sospechoso mayor de 220 Elevado mayor de 260

9. Interferencias La Ovariectomía aumenta los niveles de Colesterol. Hay fármacos que elevan los niveles de Colesterol como: Hormona adrenocorticotrópica, Esteroides anabólicos, Corticosteroides, bloqueadores beta-adrenérgicos, Adrenalina, Anticonceptivos orales, sulfamidas, Diuréticos tiacídicos, Vitamina D. Hay otros que disminuyen los valores como: Andrógenos, Allopurinol, Quelantes de las sales biliares, Captopril, Niaciana, Nitratos, Colchicina, Colestipol, Eritromicina, Isoniacida, Liotironina (Cytomel), Lovastatina (Mevacor), Neomicina (oral).

Notas El test no se afecta con valores de hemoglobina inferiores a 200 mg/dl, ni de Bilirrubina menor a 5 mg/dl. Evitar el contacto con los reactivos ya que son muy corrosivos.



Muestras lipémicas usualmente generan turbidez en la muestra que se va a analizar, generando resultados falsamente elevados

9. Linealidad El test es lineal hasta una concentración de Colesterol de 750 mg/dl (19.3 mmol/l). Para concentraciones mayores diluir la muestra con solución salina al (0.9%), 1 + 2 y repetir la determinación, multiplicar el resultado por 3. 10. Control de calidad Hacer control periódico a equipos y reactivos para evitar resultados falsos positivos ó falsos negativos. Para la técnica se debe montar un control Normal y uno Patológico. Correlacion diagnostica  Niveles sospechosos: 220 mg/dl ó 5.7 mmol/l  Niveles elevados: 260 mg/dl ó 6.7 mmol/l  Niveles superiores: 300 mg/dl Necesitan tratamiento. Resultados anormales Niveles aumentados en: Hipercolesterolemia, Hiperlipemias, Hipotiroidismo, Síndrome nefrótico, embarazo, Hipertensión, Xantomatosis, Colestasis hepática, Dieta rica en Colesterol, Infarto de miocardio, aterosclerosis, Cirrosis biliar, Estrés, nefrósis, Diabetes Mellitus descontrolada. Niveles disminuidos en: Sepsis, Desnutrición, Mala absorción, Hipertiroidismo, Enfermedad hepática, Anemia hemolítica, Anemia perniciosa, Medicación hipocolesterolemiante.



COLESTEROL HDL 1. Metodo Colesterol precipitnte. 2. Fundamento Los quilomicrones, VLDL y LDL se precipitan por adición de ácido fosfotúngstico y cloruro de magnesio. Despúes de centrifugar, el sobrenadante contiene las HDL que se van a determinar.

3. Muestra Suero o plasma con anticoagulante EDTA o heparina. 4. Condiciones del paciente Ayuno de 12-14 horas previas a la extracción de sangre. Debe señalarse que si bien la falta de ayuno no afecta los niveles de HDLc sanguíneo, en la mayoría de las personas la lipemia posprandial interfiere con muchos de los métodos analíticos. Abstenerse de no ingerir alcohol por 72 horas antes de la toma de la muestra (no es necesario). 5. Condiciones de la muestra La muestra debe separarse del coagulo dentro de las dos horas de la extracción y conservarse a 4ºC a menos que se analice de inmediato. HDL es estable en la muestra de suero durante 7 días a 4ºC o durante 4 meses a –20ºC. 6. Metodo de determinacion Longitud de onda 500 nm, 546 nm Paso de luz: 1 cm Temperatura: 25 ó 37 grados C. Medición: frente a blanco de reactivo



7. Tecnica A. Precipitación pipetear muestra precipitante

Macro 500 ul 1000 ul

Micro 200 ul 500 ul

Mezclar bien, incubar por 10 minutos a temperatura ambiente. Centrifugar por 2 minutos a 10000 rpm ó 10 minutos a 4000 rpm. Despúes de centrifugar, separar el sobrenadante claro del precipitado dentro de 1 hora y determinar la concentración del colesterol HDL con el reactivo de Colesterol total. B. Determinación

Agua destilada Estándar Sobrenadante Reactivo de color

Blanco 100 ul ------1ml

Estándar

Problema

100 ul ---1ml

---100 ul 1ml

Mezclar, incubar todos los tubos a temperatura ambiente por 10 minutos ó a 37ºC por 5 minutos. Leer la absorbancia de la muestra y el estándar frente al blanco de reactivo antes de una hora.

Notas El sobrenadante debe ser claro. En las muestras con un contenido de triglicéridos altos se pueden presentar precipitaciones incompletas de las lipoproteínas o flotación por parte de las mismas sobre él liquido, observando un sobrenadante turbio, en ese caso, se hace una dilución 1: 1 con solución cloruro de sodio al 0.9% y se repite la precipitación de la muesta diluida. El resultado se multiplica por dos. El ácido ascórbico disminuye los valores. Limite de dilución 310 mg/dl.



8. Valores de referencia Mujeres > 45mg/dl Hombres > 35mg/dl 9. Correlacion diagnostica La HDL contrarresta la acción nociva que puede tener la LDL sobre nuestro organismo, al evitar la arteriosclerosis excesiva porque remueve y elimina a través de la bilis cantidades considerables de LDL en forma de ácidos biliares y esteroides neutros. La LDL juega un papel muy importante en el funcionamiento arterial y por esto debemos tratar que el organismo tenga estrictamente la cantidad necesaria que requieren sus funciones, para evitar la arteriosclerosis prematura, complementada con un nivel de HDL lo más elevado posible, siendo esta la mejor forma de luchar contra este mecanismo fisiológico.

Resultados Anormales. Niveles aumentados de HDL correlacionan con disminución en el desarrollo de enfermedad cardiocirculatoria. Se observa en: mayor producción de Apo I y Apo II y actividad física fuerte. Niveles disminuidos de HDL correlacionan con riesgo aumentado de enfermedad cardiocirculatoria, obesidad, sedentarismo, hipertriglicéridemia, deficiencia familiar de Apo I y Apo II, deficiencia de LPL1 con afectación del metabolismo de quilomicrones y VLDL.



TRIGLICERIDOS 1. Metodo Prueba enzimática colorimétrica para triglicéridos con factor aclarante de lípidos. GPO-PAP 2. Fundamento Los triglicéridos son determinados después de hidrólisis enzimática con lipasa. El indicador es Quinineimina formada a partir de peróxido de hidrógeno, 4aminoantipirina y 4-chlorofenol bajo la influencia catalítica de peroxidasa. 3. Muestra Suero o plasma heparinizado o palsma con EDTA 4. Condiciones del paciente El ayuno debe ser entre 12 y 14 horas. No hacer ejercicio fuerte antes de la prueba. No se debe ingerir alcohol 24 horas antes de la prueba. No consumir grandes cantidades de Carbohidratos y grasas 48 horas antes de la prueba. 5. Condiciones de la muestra La muestra ideal es suero ó plasma heparinizado ó con EDTA. Extraer 5-10 ml de sangre en tubo seco y separar el suero de los glóbulos rojos en la media hora siguiente a la extracción, para evitar la redistribución de los Triglicéridos entre las diferentes lipoproteínas. Notas La lipemia, la hemólisis hasta 10 mg/dl ó 170 mmol/l, metabólitos y una serie de fármacos de uso común NO interfieren con el método. Los volúmenes de la reacción sugeridos se pueden modificar sin ningún cambio en los cálculos. Los Triglicéridos permanecen estables 3 días a 4ºC, la temperatura de 25ºC permite la liberación de glicerol de los fosfolipídos y produce un incremento aparente del valor de los Triglicéridos. Es importante describir el aspecto del suero. Antes de procesar la muestra se debe observar y anotar el aspecto del suero ya que si este está lechoso, se le debe hacer la prueba en frío, que consiste en



colocarlo en la nevera por 12 horas, luego de las cuales se observa las características que presenta el nadante y el sobrenadante. Los Triglicéridos no permanecen en el suero a 25ºC, debido a que fácilmente se libera el glicerol; a 4ºC son estables por 3 días.

6. Metodo de determinacion Longitud de onda: 500 nm, 546 nm Paso de luz: 1 cm Temperatura: 20, 25 ó 37 grados C Medición: frente a blanco de reactivo 7. Tecnica Pipetear: Blanco Estándar Muestra Control Reactivo

Blanco ------------1000 µl

Estándar ---10 µl ------1000 µl

Muestra ------10 µl ---1000 µl

Control ---------10 µl 1000 µl

Mezclar, e incubar por 10 minutos a 25ºC o por 5 minutos a 37 grados C, leer con Blanco de reactivo. Estabilidad de la reacción 1 hora.

Linealidad El método es lineal hasta 1000 mg/dl (11.3 mmol/l) de Triglicéridos. Para concentración superior diluir la muestra 1+5, con solución salina al 0.9%, repetir la determinación y multiplicar el resultado por 6.

8. Valores de referencia EDAD 0 – 5 años 6 – 11 años 2 – 15 años 16 – 19 años Adultos / ancianos

HOMBRES 30 – 86 mg/dl 31 – 108 mg/dl 36 – 138 mg/dl 40 – 163 mg/dl 40 – 160 mg/dl

MUJERES 32 – 99 mg/dl 35 – 114 mg/dl 41 – 138 mg/dl 40 – 128 mg/dl 25 – 135 mg/dl



9. Interferencias Elevando los valores Colestiramina, Estrógenos y anticonceptivos orales. Disminuyendo los valores Acido ascórbico, Asparraginasa, Clofibrato y colestipol. 10. Correlacion diagnostica

Niveles aumentados en: Hiperlipemias, Hipotiroidismo, Dieta rica en carbohidratos, Diabetes mal controlada, Riesgo de enfermedad coronaria y vascular, Hipertensión, Embarazo, Infarto de miocardio, Cirrosis alcohólica, Síndrome nefrótico, Enfermedad con almacenamiento de glucógeno. Niveles disminuidos en: Síndrome de mala absorción, Desnutrición, Hipertiroidismo. Nota: Los trigliceridos elevados afectan el cálculo de las LDL, por lo tanto cuando esto sucede las LDL no se deben reportar.



CREATININA Generalidades Sus aumentos suelen ser proporcionales con respecto a los de la urea, aun cuando en general son más tardíos. Tiene particular interés diagnostico y pronóstico en los siguientes casos: Nefropatías: Cuando en una insuficiencia renal con uremia, se observan cifras superiores a 5mg/100ml, él pronostico es fatal a corto plazo. Esto solo sucede en las fases avanzadas, ya que en las precoces, dada la facilidad de eliminación de la creatinina solo aumentan el ácido úrico y la úrea. En las nefritis agudas generalmente no hay elevación; en los casos en que existe (40%) es un cambio reversible y de escaso valor pronostico. En las nefrósis por tóxicos (Hg y Ag.) es donde se observan mayores elevaciones; en la insuficiencia cardiaca avanzada puede originarse una retención discreta o moderada de creatinina aunque no exista verdadera nefropatía.  En obstrucciones urinarias (Afecciones de próstata, vejiga, uréter, etc.) y en la anuria refleja (cálculos uretrales), se producen así mismo elevaciones marcadas de creatinina incluso 30 mg o más, igualmente reversibles con la reparación de la obstrucción.  En el gigantismo y acromegalia se observan discretas elevaciones. 

Cada 24 horas se transforma un 2% de creatina en creatinina. La cantidad de creatinina por unidad de masa muscular es constante y por lo tanto la degradación espontanea es constante. Como resultado de este fenómeno la concentración plasmatica de creatinina es estable y varia en menos de 10% diario en individuos normales.

1. Metodo Reacción de Jaffe Prueba fotométrica colorimértica para mediciones de punto final desproteinización.

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2. Fundamento La creatinina en solución alcalina forma un complejo coloreado rojo-naranja con ácido picrico. La absorbancia de este complejo es directamente proporcional a la creatinina en la muestra. 3. Muestra Suero o plasma heparinizado u orina 4. Condiciones del paciente La muestra de sangre no requiere ayuno previo ya que la excreción de creatinina depende muy levemente de la alimentación y de la diuresis. Por lo menos 8 horas antes del examen no realizar esfuerzos corporales intensos. 5. Condiciones de la muestra La muestra de suero para creatinina es inestable a temperatura ambiente, refrigerada de 2 – 4 ºC por 24 horas. horas. Congelada a –20 ºC es estable por 6 meses La creatinina puede ser determinada en cualquier líquido biológico, pero las muestras mas usadas son suero, plasma y orina. 6. Metodo de determinacion Longitud de onda: Paso de luz: Temperatura: Temper atura: Medición:

546 nm (500-550 nm) 1 cm 25° C frente a blanco de reactivo

7. Tecnica Solución Trabajo Estándar Suero

Estándar 500λ 50λ ----

Muestra 500λ ---50λ

Mezclar y poner en marcha el cronómetro y leer la absorbancia a los 30 segundos y a los 90 segundos. A2-A1= Creatinina



8. Valores de referencia Creatinina en suero o plasma

Mujeres Hombres

0.5 – 1.0 mg/dl. 0.7 – 1.2 mg/dl.

Estos valores están influenciados por el sexo (siendo menor en la mujer), masa muscular del individuo.

9. Interferentes de la muestra y la reaccion • Interferentes positivos: Acido ascórbico, piruvato, acetona, ácido acetoacético, levulosa, glucosa, ácido úrico, proteínas, barbitúricos y antibióticos de la cefalosporina. Las temperaturas altas y los prolongados tiempos de reacción (> a 5 minutos), aumentan esta interferencia. El piruvato, acetona, ácido acético, aminoácidos y proteínas o cualquier compuesto con un grupo metilo o metileno activo, introduce errores debido a su acoplamiento con el picrato por un mecanismo análogo al de la creatinina; todos estos compuestos pueden producir sustancias coloreadas que aumentan la absorbancia en la reacción del complejo coloreado. La bilirrubina y otros productos de degradación de la Hb, causan una interferencia negativa probablemente por su oxidación en medio básico fuerte a compuestos incoloros, dando como resultado una disminución de la absorbancia, lo que se interpreta como una menor concentración de creatinina. Esta interferencia negativa se observa con frecuencia en el análisis cinético de la creatinina.

10. Correlacion diagonstica El nivel de creatinina en suero depende de 2 factores: La velocidad de producción. La velocidad de filtración. Dado que la fuente de creatinina serica es la creatina muscular y la fosfocreatina, una mayor cantidad de masa muscular produce un aumento de la creatinina serica. Los valores de creatinina exhiben una respuesta escasa o nula a las modificaciones dietéticas o a las alteraciones del equilibrio electrolitico.



La concentración de creatinina en sangre, como la de la urea, se aumenta con el descenso de la función renal y el principal empleo de la determinación de creatinina serica esta en la evaluación de la función renal. En nefritis crónica cuando la concentración de BUN esta muy por encima de 50 mg/dl, el aumento de la creatinina es proporcional y las concentraciones de creatinina mayores a 5 mg/dl se consideran de importancia diagnostica grave. Niveles disminuidos se encuentran en la distrofia muscular.

Notas La especificidad de la reacción depende del pH, temperatura y tiempo. Los volúmenes de reacción podrán aumentarse o disminuirse del fotómetro, sin que se alteren los resultados finales. El ácido pícrico es tóxico. Evite la inhalación, ingestión y contacto con la piel, lavar enseguida con polietilenglicol 400, con abundante agua.



DEPURACION DE CREATININA Generalidades Es un método útil para seguir el progreso de una enfermedad renal evolutiva, porque nos da información de cómo esta la filtración glomerular. La relación entre la concentración de una sustancia en orina y sangre es el mejor índice de función renal, que la concentración de dicha sustancia aislada en sangre o en orina. La depuración de la creatinina endògena es un método útil para seguir el progreso de una enfermedad renal evolutiva, siempre y cuando los resultados se interpreten en forma comparativa y no absoluta.

1. Muestra Técnica para el suero, el mismo procedimiento de creatinina en suero. Técnica para la orina: Diluir 1:100 con Solución Salina 0.9%. Valores de referencia: Hombres: 98 – 156 ml/minuto Mujeres: 95 – 160 ml/minuto Limite de dilución:

500 mg/dl

2. Condiciones del paciente La muestra de sangre debe obtenerse durante el periodo de recolección de la orina. La muestra de orina se recoge durante un periodo determinado, generalmente 24 horas aunque es posible reducirlo a 4, 8 ó 12 horas. El control cronológico de la recolección de las muestras es esencial para la realización correcta de la prueba. 

   

Para la recolección de la orina el paciente debe fijar una hora cero. Descartar la orina de esa hora y a partir de entonces recoger todo el volumen de orina, inclusive la muestra del tiempo fijado para la recolección. Marcar en el frasco la hora de iniciación de la recolección. Guardar refrigerada y en frasco bien tapado. El paciente debe abstenerse de ingerir carne, té y café durante las 24 horas anteriores a la recolección. Debe seguir tomando agua, para asegurar un volumen urinario de 1 ml por minuto cuando menos.





Interrumpir toda terapia diurética.

3. Condiciones de la muestra Muestra de suero libre de hemólisis fuerte y de ictericia (ya que una ligera hemólisis no afecta la determinación). La muestra de orina debe refrigerarse o agregarse un inhibidor bacteriano. La concentración de creatinina debe determinarse antes de las 24 horas de recogida la muestra, ya que los gérmenes producen variación en el pH promoviéndose así la conversión de creatinina en creatina, la cual no puede medirse por la reacción de Jaffé, además producen creatininasas que destruyen la creatinina. 4. Metodo de determinacion Longitud de onda: 546 nm (500-550 nm) Paso de luz: 1 cm Temperatura: 25° C Medición: frente a blanco de reactivo 5. Tecnica Pipetear: Solución Trabajo Estándar Orina diluida

Estándar 500λ 50λ ----

Muestra 500λ ---50λ

Dilución de la orina * Hacer una dilución de la orina de 1: 50. 10 ml de orina + 490 ml de agua destilada; el resultado se multiplica por 50. Calculo Creatinina en Orina* x Volumen (ml) ________________ _________ Creatinina en suero 1140 (Constante)



6. Valores de referencia Creatinina en suero o plasma Creatinina en orina Depuración de Creatinina:

Mujeres Hombres Mujeres Hombres

0.8 – 1.2 mg/dl. 0.9 – 1.4 mg/dl. 1900 mg/24 h. 75 – 115 ml/min. 16 – 22 mg/Kg peso/24 h 85 – 125 ml/min. 21 – 26 mg/Kg peso/24 h

7. Interferencias Los mismos de la guía anterior.

Notas Los volúmenes de reacción podrán aumentarse o disminuirse proporcionalmente según las necesidades del fotómetro, sin que se alteren los resultados finales. Entre las causas de error están: mal cronometrado o recogida inadecuada de la muestra de orina, ejercicio fuerte durante la prueba, lo cual aumenta los niveles urinarios, la hidratación inadecuada del paciente, que seria una fuente de error negativa.

8. Correlacion diagnostica En enfermedades renales avanzadas la excreción urinaria de creatinina excede a la velocidad de filtración glomerular a causa de la secreción tubular, por lo que el verdadero valor de filtración glomerular esta por debajo de la depuración de la creatinina.



El filtrado glomerular disminuye notablemente en G.N.A. y crónica; disminuciones se observan en pielonefritis crónica e hipertensión.

ligeras

La filtración glomerular normal es en un adulto de 125 ml/min. Si la depuración plasmatica de una sustancia es mayor que la filtración glomerular debe interpretarse como que esta sustancia es secretada por el túbulo y si por el contrario, la depuración es menor que la filtración, podemos concluir que esta sustancia es reabsorbida. La depuración de creatinina disminuye en personas de edad, en niños y personas de baja estatura por esto se hace necesario realizar la corrección del valor obtenido, multiplicando el resultado por 1.73/A para obtener el valor real de la depuración en estos pacientes. En las personas obesas la depuración esta alterada por lo tanto se hace necesario la corrección.



GLICEMIA Generalidades Glucemia o glicemia: Este término se refiere a la presencia de la glucosa en sangre. La glucosa sanguínea proviene de dos fuentes: La más importante es la absorción intestinal de glucosa alimenticia que normalmente puede llevar los valores sanguíneos de glucosa hasta 138 -140 mg/dl. La liberación de glucosa por el hepatocito mediante un mecanismo que se acelera al disminuir la glicemia sanguínea. Glucogenesis: Formación de glucógeno (hígado, músculo en mayor proporción y también leucocitos, en el tejido nervioso en muy poca cantidad). Glucogenolisis: Movimiento de glucógeno almacenado para producir glucosa-6fosfato. Glucolisis: Llevar la glucosa-6-fosfato hasta piruvato para producir acétyl Co A (ciclo de krebs). Gluconeogenesis: Formación de glucosa a partir de otro sustrato diferente al glucógeno ejemplo: aminoácidos.

1. Metodo Prueba enzimática colorimétrica por glucosa. Metodo con desproteinización. GOD-PAP.

2. Fundamento La glucosa de determina despúes de la oxidación enzimática en presencia de glucosa oxidasa. El peróxido de hidrógeno formado reacciona bajo la catálisis de la peroxidasa con fenol y 4-aminofenazona produciendo un complejo rojo-violeta usando la quinonemina como indicador.



3. Muestra Sangre total, suero o plasma

4. Condiciones del paciente No se requiere preparación dietética especial, a menos que el paciente consuma diariamente menos de 150grs. de hidratos de carbono. Ayuno de diez a doce horas. No tomar café, ni haber fumado antes o durante la prueba. No realizar ejercicio antes o durante la prueba. No presenta glucosuria positiva antes de dar la carga de glucosa. Umbral renal (T.M.) 160-180 mg/dl. En el momento de la toma de la muestra el paciente debe estar sentado erguido.

5. Condiciones de la muestra La separación del suero debe hacerse dentro de los 20 o 30 minutos de la extracción. La estabilidad de la muestra es de 8 horas.

6. Metodo de determinacion Longitud de onda: Paso de luz: Temperatura: Medición:

500 nm 546 nm 1 cm 20. 25 ó 37 °C frente a blanco de reactivo

7. Tecnica Pipetear: BLANCO PATRON MUESTRA RVO. COLOR

Blanco ---------1000λ

Patron ---10λ ---1000λ

Muestra ------10λ 1000λ

Mezclar, incube a temperatura de 20 - 25°C por 10 minutos ó 5 minutos a 37°C. Leer la absorbancia de la muestra y el patrón contra el blanco de reactivo.



8. Valores de referencia

Criterios de diagnóstico para DM por PTOG

Ayunas P.T.O.G.

Normal Adulto Niño < 115 < 130 < 140 < 140

Diabetes mellitus Adulto Niño >= 140 >= 140 >= 200 >= 200

Intol. A la glucosa Adulto Niño 115 - 139 130 – 139 140 - 199 140 – 199

9. Carga de glucosa Niños: 1.75 gr de dextrosa por kilogra la prueba tamiz consiste en administrar la carga de dextrosa y tomar una muestra después de una hora post-ingesta. Para la P.O.T.G, 100 gr. de dextrosa en 300 ml.de agua. Nota El tiempo máximo para ingerir la carga de glucosa oral es de 5 minutos, a partir de los cuales se empezara tomar los tiempos para la toma de las muestras asi: Gestantes 1-2 y 3 horas, no Gestantes 2 horas postcarga. Utilizar métodos de laboratorio previamente estandarizados y sueros control Diagnostico de diabetes mellitus El principal objetivo de diagnóstico es la indentificación de pacientes con riesgo de hiperglicemia sintomática de cetoacidosis diabetica (CAD) o coma hiperosmolarno no cetónico (CHNC) o de complicaciones clínicas tardías, descartando aquellos pacientes que presentan fluctuaciones en el límite superior de la concetracion plásmatica normal, que pueden no entrañar los riesgos asociados a la DM. En los pacientes asintomáticos el diagnóstico de DM se establece cuando se cumplen los criterios diagnósticos de los valores de glicemia recomendado por diferentes asociaciones o grupos de estudio de diabetes asï:

National diabetes data group Basal >= a 140 mg/dl en dos ocasiones consecutivas sea en adultos o en niños. La prueba de tolerancia oral a la glucosa (P.T.O.G.) tiene como finalidad la de descartar o de diagnósticar una diabetes mellitus tipo 2 (D.M.tipo 2.), cuando se sospecha una diabetes a pesar de la ausencia de hiperglicemia en ayunas o sistomática, por ejemplo en aquellos paciente que presentar trastornos clínicos



que pudieran deberse a una DM no diagnósticada ejemplo: polineuropatía, retinopatía y nefropatia, etc. Los criterios diagnósticos por P.T.O.G. solo son válidos para individuos sanos que no presentan infecciones, enfermedades cardiovasculares o vasculares Cerebrales agudas, enfermedades endocrinas que deterioren la tolerancia a la glucosa o enfermedades hepáticas, renales o del S.N.C., tampoco pacientes tratados con fármacos que alteren la prueba de tolerancia oral a la glucosa (tiazidas, glucocorticoides, ac. Nicotinico, anticonceptivos orales que contengan estrógenos sintéticos). No se debe realizar la P.T.O.G. a los pacientes que presenten naúseas, vómito, sudoración, desmayos o palidéz durante la realización de la prueba. En la P.T.O.G., por lo menos dos valores deben ser > = 200 mg/dl. Adultos: dos horas y en cualquier otro momento de la P.T.O.G... Niños: asintomaticos deben ser mas estricto en diagnóstico por P.T.O.G.,(dado el mayor riesgo de un exceso de diagnóstico de DM). La P.T.O.G, debe repetirse para corroborar el diagnóstico de DM, tanto en niños como en adultos. Los pacientes con intolerencia a la glucosa pueden presentar mayor riesgo de hiperglicemia en ayunas o sintomatica, pero en muchos casos la intolerencia a la glucosa no progresa, o puede también revertir a la normalidad.

Valores normales Después de un ayuno de 10 a 12 horas los valores de glicemia deben estar ubicados entre 70-110 mg/dl (según el método utilizado). Los valores de glicemia posprandial pueden ir hasta 160 mg/dl. (Guillermo Farias quimica clínica, décima edición). *Criterios diagnosticos reportados por el comite de expertos en el diagnostico y clasificacion de diabetes mellitus. sintomas de diabetes, acompañados de una glicemia a cualquier hora mayor o igual a 200 mg/dl. Los sintomas clásicos incluyen poliuria, polidipsia y pérdida de peso. 2. Glicemia en ayunas mayor o igual a 126 mg/dl. Ayunas se define como la no ingesta calórica al menos por 8 horas.



3. Dos horas poscarga durante una prueba de tolerancia oral a la glucosa (PTOG) mayor o igual a 200 mg/dl. Para ello se utiliza 75 gramos de glucosa anhidra disueltos en 300 cc de agua. En la ausencia de hiperglicemia inequívoca con descompensación aguda, estos criterios deben ser confirmados por otra prueba realizada un día diferente. Los valores normales para la glicemia en ayunas, se han establecido en 110 mg/dl, la razón para ello es la perdida de la primera fase de secreción de insulina a partir de esta cifra. La prueba de tolerancia utilizaba valores a la hora, hora y media y a las dos horas. De acuerdo a los nuevos criterios solo se tiene en cuenta los valores a las 2 horas. Se han establecido tres criterios para el diagnostico de diabetes, cada uno de ellos debe ser confirmado con una prueba posterior. Por ejemplo, síntomas con una glicemia al azar > de 200 mg/dl, debe ser confirmado subsecuentemente por una glicemia en ayunas ≥ a 126 mg/dl, una glicemia 2 horas postcarga ≥ a 200 mg/dl, o una glicemia al azar ≥ a 200 mg/dl. Las categorias para la glicemia en ayunas quedan establecidas de esta foma: * Glicemia normal: Menor a 110 mg/dl. * Hiperglicemia en ayunas: Entre 110 mg/dl y 126 mg/dl. * Diagnostico provisional de diabetes (debe ser confirmado): ≥ a 126 mg/dl. Para la prueba de tolerancia a la glucosa, las categorias, son: * Glucemia normal: Menor de 140 mg/dl, 2 horas poscarga. * Disminución de la tolerancia a la glucosa: Entre 140 mg/dl y 200 mg/dl, 2 horas poscarga. * Diagnostico provisional de diabetes (debe ser confirmado): ≥ a 200 mg/dl. El comité no recomienda la utilización de los niveles de hemoglobina glicada para el diagnostico de la diabetes, si bien los niveles de hemoglobina glicada presentan una distribución similar a la glicemia, las pruebas utilizadas para ella no estan estandarizadas, por lo cual asignar un valor diagnostico es difícil; por el momento solo continua como prueba para el control y no para el diagnostico.

Diagnostico de hipoglicemia Depende si el paciente presenta manifestaciones del sistema nervioso central (S.N.C) inexplicadas o sintomas adrenergicos inexplicables.



En ambos casos para el diagnóstico se requiere valores plásmaticos anormalmente bajos, los cuales se corrigen al aumentar la glucosa sanguínea. Por lo general una glucosa plásmatica anormalmente baja se define menor de 50mg/dl en el varón, menor de 45mg/dl en la mujer, y en lactante y niños menor de 40mg/dl . (Se pueden encontrar valores menores de los expuestos en un ayuno de 72 horas). El paciente con deterioro de la conciencia o crisis convulsiva debe efectuarse la glucosa con tirilla y gota de sangre obtenida al colocar un aguja para iniciar la perfusión de líquido; si se obtiene un valor anormalmente bajo, se perfunde glucosa de inmediato. La mejoría inmediata de los sintomas del S.N.C., tras un aumento de glucosa, confirman el diagnóstico de hipoglicemia de ayuno o inducida por fármacos. El diagnóstico debe completarse con valoraciones de insulina proinsulina y peptido C y también la busqueda de drogas que puedan estar ocasionando la hipoglicemia (insulina alcohol, sulfas que producen un 50% de las hipoglicemias. Otros fármacos como salicilatos, propanolol etc.)

Criterios diagnosticos para diabetes gestacional Ayunas >= 105 mg/dl 1 hora >= 190 mg/dl 2 horas >= 165 mg/dl 3 horas >= 145 mg/dl

Normal: Hasta 135 mg/dl. Anormales: Valores de glicemia entre 135 - 180 mg/dl sugieren la realización de una P.T.O.G. de 3 horas con una carga de dextrosa de 100 gramos. Valores de glicemia > 180 mg/dl en más de una oportunidad son diagnósticos de D.M.G



UREA 1. Metodo Metodo completamente enzimático para determinación cinética de urea. GLDH.

2. Fundamento La urea es hidrolizada en presencia de agua y ureasa para producir amonio y dióxido de carbono. El amonio producido en esta reacción se combina con 2oxoglutarato y NADH en presencia de glutamato-deshidrogenasa (GLDH) para formar glutamato y NAD+. La prueba ha sido mejorada de forma que la GLDH es la enzima límite. La disminución de la absorbancia es proporcional a la concentración de urea dentro de los intervalos de tiempo dados. Ya que la prueba cinética es muy rápida, ha sido diseñada para ser realizada preferiblemente en analizadores.

3. Muestra Suero o plasma, orina diluida 1:1000 con agua destilada.

4. Condiciones del paciente 24 horas antes de tomar la muestra, el paciente debe llevar una dieta pobre en proteínas y 12 horas de ayuno total.

5. Condiciones de la muestra Por acción bacteriana se puede perder la urea, por lo tanto debe analizarse pocas horas despúes de recogida o conservarse en refrigeración. Sueros lipémicos causan turbidez en la solución final.



6. Metodo de determinación Logitud de onda: Paso de luz: Temperatura: Medición:

340 nm, 334 nm, 365 nm 1 cm 25°C, 30°C ó 37°C Lectura contra blanco de reactivo

7. Tecnica Pipetear Muestra Patrón Reactivo

Blanco ------1ml

Patrón ---10 ul 1ml

Muestra 10 ul ---1ml

Mezcle, lea la absorbancia de la muestra y el estandar despúes de 30 segundos y lea nuevamente al minuto, calcule la diferencia

8. Valores de referencia Suero 10-55 mg/dl 1, 7-9, 1 mmo1/1 Orina 20-35 mg/24 horas 333-583 mmo1/24 horas El método es lineal hasta 200 mg/dl (33, 3 mmo1/1) de urea para suero o plasma y 200 g/L (330 mmol/L) para la orina. Para concentraciones más altas mezclar un volumen de la muestra con un volumen igual de agua destilada, repetir el ensayo y multiplicar el resultado por dos. El patrón, la muestra y la solución 1 deben pipetear en el fondo de los tubos de ensayo y mezclarse cuidadosamente.



9. Interferencias La prueba no es influenciada por hemoglobina hasta 500 mg/dl, triglicéridos hasta 2000 mg/dl, bilirrubina hasta 60 mg/dl, glucosa hasta 500 mg/dl y ácido ascórbico hasta 30 mg/dl.

10. Correlacion diagnostica La urea se encuentra aumentada por encima de los valores normales en caso de insuficiencia renal u obstrucción de vías urinarias, nefritis aguada, TBC renal, Gota Crónica y en todas aquellas entidades donde el volumen del filtrado glomerular se ha reducido una quinta parte de lo normal. Cuando existe uremia los síntomas incluyen letargo, anorexia, náusea y vómito, deterioro mental y confusión, sacudidas musculares, convulsiones y coma. La anemia es un carácter prominente en la uremia crónica porque está deprimida la eritropoyesis. El nitrógeno uréico de la sangre, el nitrógeno no proteico y la creatinina están elevados y los niveles sanguíneos de estas sustancias se emplean como índice de la gravedad de la uremia. Los valores de la urea pueden disminuirse en alteraciones hereditarias de la síntesis de urea o cuando existe una ingesta inadecuada de proteínas, o una enfermedad hepática grave.

Determinacion de nitrogeno ureico El nitrogeno ureico se saca de dividir el valor de la urea por un factor que es 2.14.

PROTEINAS TOTALES Generalidades. La cifra normal de las proteinas totales del suero está comprendida entre 6 y 8 mg/ ml encontrándose de 1 gramo menos en los pacientes que guardan cama por mas de dos semanas las proteínas totales están integradas por la fracción albúmina y bla fraccion globulina. La priemera regula la presión osmótica coloidal de la sangre, aporta la nutricion celular, interviene en el equilibrio ácido-básico, transporta los lipidos originando los compuesos que se denominan, lipo-proteínas y sirve de medio de transporte a multitud de elemntos como esteroides, hierro, cobre, vitaminas liposolubles. La fracción globulina se sintetiza especialmente en las células plasmáticas y tienen como misión principal fabricar anticuerpos, de donde se origianan el nombre de inmunoglobulinas. 1. Metodo Prueba colorimétrica fotométrica para proteínas totales (Biuret) 2. Fundamento Los iones cúpricos con las proteínas y peptidas en solución alcalina forman un complejo púrpura. La absorbancia de este complejo es proporcional a la concentración de proteínas en la muestra. 3. Muestras. Suero y plasma heparinizado. Estable 8 dias a 2-8 C. Los anticoagulantes quelantes interfieren. 4. Condiciones del paciente La muestra ha de tomarse con 8 horas de ayuno. Evitar todo esfuerzo corporal intenso por lo menos 8 horas antes de la toma de la muestra. El ejercicio causa aumento de la concentración de proteínas en un 6 a 12%. El uso de torniquete no ha exceder los 30 segundos, su prolongación tiende a aumentar los niveles de proteínas en la muestra de suero en aproximadamente 0.5 g/dl.

5. Metodo de determincion Longitud de onda: 340 nm, 334 nm ó 365 nm Paso de luz: 1 cm Temperatura: 25°C, 30°C ó 37°C Medición: frente a blanco de reactivo 6. Tecnica Pipetear en tubos de ensayo: Agua destilada Patrón proteina Muestra Reactivo

Blanco

Patrón

Muestra

10 ul ------1,0 ml

----10 ul ----1,0 ml

--------10 ul 1,0 ml

Mezcle, lea la absorbancia de la muestra y estándar despúes de 30 segundos y lea exactamente al minuto despúes calcule la diferencia y multiplique por 80. ABS Muestra ____________ X 80= mg/dL proteína ABS Patrón

7. Valores de referencia Suero: 65 – 80 g/L Plasma: 68 –83 g/L

8. Interferentes La hemoglobina (0,2 g/L). La bilirrubina (15 mg/dl) La lipemia moderada no interfiere. La presencia de dextrano (utilizado como expansor del plasma) ocasiona una floculación de la mezcla de reacción que puede separarse por centrifugación sin que afecte los resultados.

9. Corelacion clinicopatologica Cuando hay hemoconcentración por shock, vómitos, diarreas profusas, quemaduras, sudoracion excesiva, fistulas digestivas etc. Se obtienen falsas hiperproteinemias. Las cifras bajas generalmene corresponden a malnutricion, tambien puede estar disminuida en: Nefrosis lipoidea. Edemas carenciales. Neoplasias. Afecciones hépaticas crónicas. Anemia persistente. De la cifra total que integran las proteínas, entre 3.5 y 5.5 g/ml corresponden a la albúmina y entre 1.5 y 3g/ml a la globulina.

PROTEINURIA

Generalidades. Tambien conocida como albúminuria, es la cantidad de proteína excretada por la orina. Normalmente es de 40 a 80 mg con límite máximo, 150/24 horas, cantidad no detectable por los sistemas habituales para dosificarla. Es el indicador más importante de enfermedad renal complementado con el sedimento microscópico. La albúmina constituye entre un 60 y un 90 % de la prteína excretada y el resto está por globulinas principalmente globulina Alfa- 1 y Alfa –2. Tiene como mecanismo el aumento de la permeabilidad de las membranas glomerulares, reabsorción tubular disminuida, aumento de la filtración glomerular o alteraciónes en la composicion proteíca que la hace filtrar más facilmente. La cantidad no permite valorar la gravedad de la afección, pero su dosificacion periódoca si valora el progreso o regresión de la lesión.

1. Metodo Metodo colorimétrico cuantitativo para determinación de proteínas en orina y líquido cefalorraquideo.

2. Fundamento. La proteina presente en la muestra reacciona en medio ácido con el complejo Rojo rojo de pirogalol y el molibdato originando un complejo coloreado que se cuantifica por espectofotometria.

3. Muestras. Orina de 24 horas, orina ocasional ó líquido cefalorraquideo. Recoger la orina, medir el volumen y conservarla a 2-8 C. Estable 8 dias.

4. Condiciones de la muestra Se debe recoger orina de 24 horas u orina ocasional. En caso de orinas muy turbias es conveniente centrifugarlas.

5. Metodo de determinacion Longitud de onda: Paso de luz: Temperatura: Medicion:

580 nm, 600 nm ó 620 nm 1 cm 37 °C frente a blanco de reactivo

6. Tecnica Patron Muestra reactivo

Blanco ------1 ml

patron 20 ul ---1 ml

muestra ---20 ul 1 ml

Mezclar e incubar durante 10 minutos a 37 °C leer la absorbancia contra el blanco Calculos: Proteinas de 24 horas: Proteina en orina ocasional:

Muestra Patron x volumen x 100 Muestra Patron x 100

Proteínas en líquido cefalorraquideo: Muestra Patron x 100

7. Valores de referencia Orina de 24 horas 30 – 140 mg/24 h (hasta 160mg/24h en mujeres embarazadas) Orina ocasional 25 mg/dl Líquido cefalorraquideo 15 – 45 mg/dl (en adultos de más de 60 años se extiende a 60 mg/dl)

8. Interferencias La hemolisis puede ser causa de resultados falsamente aumentados tanto en orina como en LCR. Los conservantes para orina como ácido clorhídrico,, ácido benzoíco o timol pueden causar resultados falsamente disminuidos. Algunas drogas o medicamentos pueden interferir en la reacción.

9. Correlacion diagnostica Hay condiciones fisiológicas o benignas deonde se puede observar un aumento en la excresión urinaria de proteínas como el ejercicio violento, la fiebre, hipotermia, el embarazo. La determinación de proteínas es importante en la detección de patologías renales, como en la disfunción glomerular. El LCR es útil para evaluar la permeabilidad de la barrera hematoencefálica en muchas enfermedades inflamatorias o infecciosas del SNC, como ocurre en la meningitis bacteriana, viral o de otros origenes.

TRANSAMINASAS

Generalidades El hígado contiene un gran numero de enzimas, de todas ellas las de mayor importancia clínica son la fosfatasa alcalina (Pa), las transaminasas (GOT ó ASAT Y GPT ó ALAT) y la CGT (gamaglutamiltranspeptidasa o γGT). Las transaminasas son enzimas que catalizan las reacciones de transferencia de grupos aminos de un aminoácido a un cetoácido, para la síntesis de aminoácidos distintos a los originales. Existen dos tipos de transaminasas, la transaminasa glutamicopirúvica ó Alaninoaminotranferasa y la transaminasa glutamicooxaloacética ó Aspartatoaminotransferasa , estas enzimas están localizadas particularmente en el hígado, corazón, etc; la GPT es una enzima exclusivamente citoplasmática, en tanto que la GOT es una enzima binocular, es decir, que esta constituida por dos isoenzimas, una citoplasmática y otra mitocondrial; se van a diferenciar por su movilidad elctroforética, pH óptimo de acción, propiedades cinéticas e inmunológicas y a.a. que la componen. En los eritrocitos se encuentra la GOT soluble y en los leucocitos y reticulocitos están los dos tipos enzimáticos. La GPT es un enzima que también se encuentra en riñón, corazón, músculo esquelético pero en mayor concentración en el Hígado, la GPT se puede encontrar en plasma, orina, LCR, y en eritrocitos pero en bajas concentraciones.

ASPARTATO AMINOTRASFERASA (GOT) 1. Metodo Prueba liquiUV

2. Fundamento Metodo cinético para la determinación de la actividad de ASAT o GOT de acuerdo a las recomendaciones del panel de expertos de la IFCC. Sin activación por piridoxalfosfato.

3. Muestra Suero o plama con heparina o EDTA.

4. Condiciones del paciente Tener en cuenta que los sueros hemolisados pueden alterar el resultado. Los sueros muy lipémicos o ictéricos tambien pueden alterar el resultado.

5. Condiciones de la muestra Sueros que pueden ser recolectados con EDTA o Heparina, se debe tener en cuenta que los sueros hemolisados pueden alterar el resultado. Se debe tener un ayuno mínimo de 8 horas. Se recomienda analizarlas después dé una hora de tomada la muestra


365 nm, 340 nm, 334 nm 1 cm 25, 30 ó 37°C frente a aire

7. Tecnica Temperatura Muestra Reactivo de trabajo

25-30 C 200λ 1000λ

37 C 100λ 1000λ

º

º

Mezclar y leer la absorbancia despúes de un minuto y leer exactamente al minuto a los 2 y los 3 y hacer los cálculos

8. Valores de referencia Hombres hasta Mujeres hasta

25 ºC 18 U/L 15 U/L

30 ºC 25 U/L 21 U/L

37 ºC 37 U/L 31 U/L

9. Interferencias Se deben descartar la muestras hemolizadas porque la GOT puede aumentar la actividad de la muestra. Las muestras de plasma tienden a ser más turbias que las de suero por lo tanto pueden causar resultados erráticos en la absorbancia. El oxalato inhibe la actividad de la enzima, no se debe usar como anticoagulante. La temperatura de incubación tiene gran importancia en la determinación enzimática por lo cual de se recomienda utilizar la de 37°C Cuando los valores de la GOT están aumentados se recomienda realizar un perfil para función cardíaca y hepática.

Linealidad En caso de sobrepasar la linealidad diluir 0.1ml mas 0.9ml de solución salina y multiplicar por 10. En casos de baja absorbancia es debido a que por ser una reacción enzimática se consume el NADH en la incubación, en estos casos también se debe diluir.

10. Correlacion diagnostica Los valores aumentados de esta enzima suceden cuando hay muerte en las células del miocardio (infarto al miocardio), en las próximas 6-12h después de la oclusión de una arteria coronaria; el grado del aumento es proporcional a la

magnitud del daño, osea que una lesión grande puede hacer elevar los valores >200 unidades, los valores máximos se ven en al cabo de 48h y recupera sus valores normales de 3-5 días. Las cifras de GOT también se ven aumentadas en lesiones agudas de las células hepáticas como en las hepatitis virales y lesiones por intoxicación con fármacos o tóxicos como tetracloruro de carbono. Los aumentos moderados se observan en las etapas finales de la cirrosis, ictericias obstructivas.

ALANINA AMINOTRANSFERASA (GPT) 1. Metodo Prueba liquiUV para alanina aminotransferasa.

2. Fundamento Es un método cinético para la determinación de la actividad de la GPT de acuerdo con las recomendaciones del panel de expertos de la IFCC sin activación por piridoxalfosfato. Los métodos para la medición de GPT son muy semejantes a los de la GOT; el ácido pirúvico producido por la enzima a partir de alanina y ácido alfacetoglutarato se transforma en ácido láctico por efecto de la deshidrogenasa láctica. La transformación simultánea de NADH en NAD va seguida por una disminución de la absorbancia a 340nm. 3. Muestra Suero o plasma con EDTA o heparina.

4. Condiciones del paciente Tener en cuenta que los sueros hemolisados pueden alterar el resultado. Los sueros muy lipémicos o ictéricos tambien pueden alterar el resultado.

5. Condiciones de la muestra Sueros que pueden ser recolectados con EDTA o Heparina, se debe tener en cuenta que los sueros hemolisados pueden alterar el resultado. Se debe tener un ayuno mínimo de 8 horas. Se recomienda analizarlas después dé una hora de tomada la muestra


365 nm, 340 nm, 334 nm 1 cm 25, 30 ó 37°C frente a aire

7. Tecnica Temperatura Muestra Reactivo de trabajo

25-30 C 200λ 1000λ

37 C 100λ 1000λ

º

º

Mezclar y leer la absorbancia despúes de un minuto y leer exactamente al minuto a los 2 y los 3 y hacer los cálculos

Linealidad Hasta 154mmol/L o 9gm/L (según el Kit utilizado). Si sobrepasa la linealidad diluir 1 + 10 y multiplicar por 11

8. Valores de referencia 25 C 5-23U/L 5-19U/L º

Hombres hasta Mujeres hasta

30 C 7-32U/L 7-26U/L º

37 C 9-43U/L 9-36U/L º

Precauciones El Buffer/sustrato esta compuesto con sodio de azida 0.095% evitar contacto con mucosas y piel.

9. Interferencias Se deben descartar la muestras hemolizadas porque la GOT puede aumentar la actividad de la muestra. Las muestras de plasma tienden a ser más turbias que las de suero por lo tanto pueden causar resultados erráticos en la absorbancia. El oxalato inhibe la actividad de la enzima, no se debe usar como anticoagulante. La temperatura de incubación tiene gran importancia en la determinación enzimática por lo cual de se recomienda utilizar la de 37°C Cuando los valores de la GOT están aumentados se recomienda realizar un perfil para función cardíaca y hepática.

10. Correlacion diagnostica Las cifras de GPT pueden estar también ligeramente aumentadas en el infarto al miocardio, pero esto se debe posiblemente al daño del hepatocito secundario por alteración en la circulación. Los niveles sericos de GPT se encuentran considerablemente aumentados en las lesiones agudas de las células hepáticas, a veces es mayor el aumento que la de la GOT, por esta razón se considera más específica la GPT en patologías del hígado. La determinación de la GOT y GPT se encuentran aumentadas en las insuficiencias cardiacas y como consecuencia del estasis Hepático, si la insuficiencia es aguda se pueden elevar los valores de 1000 a varios miles U/L, lo que nos puede ayudar a diagnosticar un infarto del miocardio teniendo muy en cuenta no llegar a confundirse con una hepatitis viral ya que en estas también aumentan, se debe analizar todos los datos clínicos posibles para hacer un buen diagnostico y reconfirmar con enzimas como γGT, CHE y GPT que son hepatoespecificas. En la ictericia hepática (hepatocelular) y la post-hepática se utilizan la GOT y GPT para diferenciarlas. En la post-hepáptica es difícil encontrar valores superiores a 200U/L, en colestasis intra-hepática los niveles de GOT y GPT son análogos a los de la ictericia post-hepática. En la hepatitis viral se observa una elevación de ambas enzimas, en contraste con la cirrosis hepática que se elevan poco las GOT y disminuyen las GPT. El análisis de estas dos enzimas es de útil ayuda para detectar daño a nivel del hígado y determinar una hepatitis ya sea viral o por tóxicos como drogas. Los valores de La GPT, GOT, y la determinación de la fosfatasa alcalina son los de mayor utilidad para el diagnóstico de las hepatitis, los valores elevados de estas tres enzimas son característicos de las hepatitis agudas y enfermedades necrotizantes del hígado en contraste con la elevación de la fosfatasa alcalina y disminución de GOT y GPT que nos da indicios de una ictericia obstructiva.

Nota Gran parte del éxito de obtener buenos resultados en este tipo de determinaciones enzimáticas esta en el correcto manejo del tiempo a la hora de la lectura (pues las enzimas actuaran hasta consumir el substrato), un buen trabajo organizado, un buen lavado del material y no dejar de lado el uso de los controles.

AMILASA GENERALIDADES Las amilasas son enzimas contenidas en la secreción pancreática las cuales catalizan la hidrólisis de los polisacáridos tales como : El almidón, amilopeptina, glucógeno y sus productos parcialmente hidrolizados. Actua sobre las uniones 1-4 de las cadenas rectas del almidón y también sobre las uniones 1-6 glucosídicas de las cadenas ramificadas como las de amilopeptina y glicógeno. La α - amilasa es una endoenzima que se denominaasí porque todos los productos de la hidrólisis tienen la configuración (α) en el C1 de la unidad de la glucosa reductora. La α - Amilasa suele estar presente en el páncreas ( 200 mg/kg ) glándulas salivales, hígado, músculo, tejido adiposo, orina, sangre, heces, leche, semen, riñón, cerebro, trompas de falopio, pulmón, intestino, bazo y corazón.

1. Metodo Prueba colorimétrica para amilasa alfa-1,4-glucan-4-glucanohidrolasa.

2. Fundamento La prueba colorimétrica utiliza un nuevo substrato, 2-cloro-4-nitrofenilmaltotriósido. Este substrato reacciona directamente con la amilasa y no requiere de enzimas de restricción. La liberación de 2-cloro-4-nitrofenol del substrato y el resultante incremento de absorbancia por minuto es directamente proporcional a la actividad de la amilasa en la muestra.

3. Muestra Suero o plasma heparinizado, orina No hay pérdida de la actividad en 5 días a 4°C.

4. Condiciones del paciente No requiere ayuno. Evitar la utilización del torniquete por más de 30 segundos.

5. Condiciones de la muestra Puede utilizarse plasma heparinizado. No utilizar citrato, oxalato o EDTA porque inhiben la actividad de la enzima. Se recomienda el uso de pipetas automáticas para la medición de las soluciones para evitar la contaminación de las mezclas con saliva. Si la determinación excede el valor diluir la muestra con 500 ul de solución salina y 100 ul de muestra y multiplicar por 6.

6. Metodo de determinación Longitud de onda: Paso de luz: Temperatura: Medición:

Hg 405 nm, 400 nm ó 410 nm 1 cm 25 °C ó 37°C frente a agua destilada

7. Tecnica Temperatura Muestra reactivo factor

25°C 20 ul 1000 ul 9864

37°C 10 ul 1000 ul 24820

Mezclar bien incubar por un minuto a la temperatura deseada. Leer la absorbancia a los 1, 2 y 3 minutos Y multiplicar por el factor correspondiente.

8. Valores de referencia Temperatura Suero, plasma Orina espontánea Orina 24 horas

25°C 120 U/l 600 U/l 450 U/24h

37°C 220 U/l 1000 U/l 900 U/24h

IFCC 28-100 U/l <460 U/l <410 U/l

9. Correlacion diagnostica Los nivele elevados en el suero son siempre transitorios. Corresponden a episodios agudos y sólo duran 3 días, pero en la orina persisten hasta por 10 días. Cuando hay ruptura del embarazo ectópico, se libera una gran cantidad de amilasay se produce una hiperamilasemia, dato útil para su diagnóstico. La úlcera péptica perforada, aumenta los niveles de amilasa. En la pancreatitis aguda, sus niveles aumentan en las primeras 24 a 36 horas, obteniendo niveles normales al 3 día.

10. Interferencias La aplicación de morfina produce contracción del esfinter de Oddi y eleva los niveles hasta 900 unidades, dato que se debe tener en cuenta cuando se dosifica en pacientes con posible pancreatitis aguda y han recibido este analgésico.

AMILASURIA

En condiciones normales se elimina una cantidad de amilasa por la orina, comprendida entre 35 y 250 unidades, con cifras estremas en las 24 horas de 835 a 6150 unidades. Este factor hay que tenerlo en cuenta y valorar el tiempo que ha durado la recolección. La dosificación urinaria a veces es más ventajosa que la hemática pues el suero solo se eleva durante unas 72 horas y en la orina persiste por varios días. También se eleva en la parotiditis y litiasis parotidea y marcada disminución en su eliminación en el carcinoma pancreático, insuficiencia renal y pancreatitis crónica.

FOSFATASA ALCALINA

1. Metodo Metodo espectofotómetro con tampon AMP

2. Fundamento La fosfatasa alcalina cataliza en medio alcalino la transferencia del grupó fosfato del 4-nitrofenilfosfato al 2-amino-2-metil-1-propanol (AMP), liberando 4-nitrofenol. La concentración catalítica se determina a partir de la velocidad de formación del 4-nitrofenol, medido a 405 nm.

3. Muestra Suero o plasma Es estable al menos por 7 días a una temperatura de 2 a 8 °C.

4. Condiciones del paciente El paciente debe tener un ayuno minimo de 8 horas. Debe permanecer en reposos 15 minutos antes de la toma de la muestra. El ejercicio puede alterar el resultado.

5. Condiciones de la muestra Puede trabajarse con plasma, pero este no debe contener floruros ni oxalatos. La utilización de EDTA inhibe la reacción. El mejor anticoagulante es la heparina, los valores obtenidos en plasma y suero siempre son iguales


405 nm 1 cm 37°C frente a vacio

7. Tecnica Reactivo de trabajo muestra

1000 ul 20 ul

Leer la absorbancia inicial y efectuar lecturas cada minuto por 3 minutos y promediar los resultados y multiplicar por el factor 2764.

8. Valores de referencia Adultos: 26 – 117 U/l

9. Interferencias Los anticoagulantes como el floruro, EDTA, oxalato y citrato interfieren en la reacción. Las muestras hemolizadas interfieren por la fosfatasa alcalina eritrocitaria.

10. Correlacion diagnostica Se origina principalmete en los huesos y en el higado, por lo tnto esta bien establecida su relación con la formación osea, por eso cuando el crecimiento disminuye sus niveles bajan a cifras similares al del adulto. Cuando hay deficiencia de vitamina D, raquitismo, enfermedad de Paget, hiperparatiroidismo, fracturas en consoliación y en metastasis óseas, sus niveles aumentan. También aumentan en la ictericia, en el abseso hepático.

CALCIO 1. Metodo Determinación cuantitativa para calcio

2. Fundamento El calcio en medio neutro, forma un complejo de color azul con arsenazo III (ácido 1,8-dihidroxi-3,6-disulfo-2,7-naftalenen-bis (azo)-dibenzenarsónico). La intensidad de color es directamente proporcional a la cantidad de calcio existente en la muestra.

3. Muestra Suero o plasma

4. Condiciones del paciente No requiere ayuno.

5. Condiciones de la muestra Debe ser separado lo antes posible de los hematíes. No usar oxalato o EDTA como anticoagulante ya que interfieren en la determinación de calcio. Orina efectuar la recogida de orina de 24 horas en recipientes libres de calcio. Antes de la recogida adicionar al contenedor 10 ml de ácido nítrico al 50% Diluir la orina ½ en agua destilada para el análisis y multiplicar por dos.


650 nm 1 cm 37°C frente a agua destilada

7. Tecnica blanco ----1000 ul

Estándar Muestra reactivo

estándar 10 ul --1000 ul

muestra --10 ul 1000 ul

Mezclar e incubar 2 minutos. Leer la absorbancia frente a blanco de reactivo. El color es estable como minimo una hora.

8. Valores de referencia Suero o plasma: Adultos Niños Recién nacidos

8.5 – 10.5 mg/dl 10 - 12 mg/dl 8.0 – 13 mg/dl

Orina: Adultos Niños

50 – 300 mg/24h 80 –160 mg/24h

2.1 –2.6 mmol/l 2.5 – 3 mmol/l 2.0 – 3.2 mmol/l

9. Interferencias Se recomienda utilizar material de plástico, si se utiliza material de vidrio debera lavarse con ácido nítrico diluido con agua destilada. La mayoria de los detergentes destinados al uso del laboratorio contienen agentes quelantes. Trazas de los mismos, invalidan la determinación.

10. Correlacion diagnostica El calcio es el mineral más abundante e importante del cuerpo humano, el 99% se halla en los huesos. Una disminución de los niveles de albúmina causa una disminución del calcio en suero. Niveles bajos de calcio pueden atribuirse ahipoparatiroidismo, pseudohipoparatiroidismo, deficit de vitamina D, mal nutrición o mala absorción. La mayoria de las causas de hipercalcemia son debidas a enfermedades oncológicas, intoxicación por vitamina D, aumento de la retención renal, osteoporosis, sarcosidosis, tirotoxicosis e hiperparatiroidismo.

MAGNESIO

1. Metodo Metodo colorimétrico – calmagita.

2. Fundamento El magnesio forma un complejo de color púrpura al reaccionar con la calmagita en medio alcalino. La intensidad del color es proporcional a la concentración de magnesio.

3. Muestra Suero o plasma heparinizado Orina. Diluida 1:10 con agua destilada acidificada hasta 3.4 con HCL.

4. Condiciones del paciente No requiere ayuno

5. Condiciones de la muestra Utilizar material limpio


520 nm 1 cm 25 °C frente a blanco de reactivo.

7. Tecnica Estándar Muestra reactivo

blanco ----1000 ul

estándar 10 ul --1000 ul

muestra --10 ul 1000 ul

Mezclar e incubar por 5 minutos La coloración es estable por 30 minutos.

8. Valores de referencia 1.6 – 2. 5 mg/dl

9. Correlacion diagnostica La hipomagnesemia implica manifestaciones similares a la hipocalcemia. Niveles bajos son propios de trastornos gastrointestinales con malaabsorción, perdida anormal de líquidos, tratamiento insulínico del coma diabetico, hipertiroidismo, tratamientos con diuréticos, glomerulonefritis, pielonefritis entre otros. Los niveles altos implican una depresión del sistema nervioso central y la excitabilidad neuromuscular.

FOSFORO 1. Metodo Análisis fotométrico UV para la determinación de fosforo.

2. Fundamento El fosforo reacciona con molibdato en un medio fuertemente ácido para la formación de un complejo. La absorbancia de este complejo leido en Uvcercano es directamente proporcional a la concentración de fósforo.

3. Muestra Suero.

4. Condiciones del paciente No requiere ayuno.

5. Condiciones de la muestra No se debe usar plasma. Los anticoagulantes pueden causar resultados falsamente bajos.


340 nm, Hg 334 nm 1 cm 20...25°C frente a blanco de reactivo

7. Tecnica Blanco Estándar muestra reactivo

blanco ---------1000 ul

estándar ---10 ul ---1000 ul

muestra ------10 ul 1000 ul

Mezclar e incubar por lo menos 1 minuto a temperatura ambiente. Leer la absorbancia de la muestra frente a blanco de reactivo antes de 1 hora.

8. Valores de referencia Adultos Niños:

2.5 – 5.0 mg/dl 4.0 – 7.0 mg/dl

9. Interferencias Muestras ictéricas y lipémicas requieren un blanco de muestra. Sueros lipémicos o hemolízados no deben ser usados. La contaminación del material de vidrio es la mayor fuente de error en este análisis. Por lo tanto se recomienda material de plástico.

10. Correlacion diagnostica Esta regulado por la hormona paratiroidea, la cual controla la excreción urinaria y su movilización osea por medio de la vitamina D. Los valores elevados se encuentran en la insuficiencia renal crónica, la acromegalia, hipoparatiroidismo, fracturas evolutivas y la enfermedad de Addison. Las valores bajos se encuentran en el raquitismo, osteomalacia, infecciones de flora cocoide gram negativa en su forma septicémica y en la hipervitaminosis D.

CREATINCINASA (Ck)

Generalidades. Normalmente los músculos estriados tienen una alta concentración, y muy poca se encuentra en el miocardio y el cerebro (CK). En el infarto de miocardio sus unidades se elevan entre 3 y 6 horas, despúes de iniciado. Tiene su máxima concentración entre las 24 y 48 horas, empezando a descender despúes de dicho tiempo, lentamente, para retornar a la normalidad entre 3 y 6 dias despúes. 1. Metodo Prueba líquida UV activada por NAC creatin kinasa.

2. Fundamento La cratina quinasa (CK) cataliza la fosforilación del ADP por el fosfato de creatina, obteniéndose creatina y ATP. La concentración catalítica se determina, empleando las reacciones acopladas de la hexoquinasa y glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, apartir de la velocidad de formación del NADPH, medido a 340 nm. Método estándar modificado de acuerdo con las recomendaciones del cómite ECCLS.

3. Muestra Suero o plasma heparinizado o con EDTA.

4. Condiciones del paciente Evitar actividad corporal intensa 48 horas antes de la extracción de la muestra, porque produce una considerable elevación de la concentración enzimática en plasma. En el momento de la extracción evitar la contaminación con el líquido del tejido muscular que puede elevar los valores de la CK.

5. Condiciones de la muestra La muestra de suero o plasma para Creatina quinasa es estable al menos 7 días a 2-8 Centigrados.


Hg 365 nm, 340 nm o Hg 334 nm 1 cm 25, 30 ó 37°C contra aire

7. Tecnica Precalentar el reactivo de trabajo a la temperatura ambiente minutos. 25°C ó 30°C 50 ul 1000 ul

Muestra Reactivo

durante unos

37°C 25 ul 1000 ul

Mezclar y transferir de inmediato a una cubeta. Insertarla en el portacubetas termotizado. Poner el cronómetro en marcha. A los 3 minutos, anotar la absorbancia inicial y efectuar nuevas lecturas cada minuto durante tres minutos. Comprobar que las diferencias entre absorbancias sean sensiblemente iguales. Calcular el incremento de absorbancia por minuto promedio.

Calculos. Considerando que el coeficiente de absorción molar del NADPH a 340 nm es 6300, se deducen las siguientes fórmulas para calcular la concentración catalítica: Macro: Micro:

A/min x 4127 = U/L A/min x 3333 = U/L

8. Valores de referencia Temperatura de reaccion 25 °C 30 °C 37 °C

Hombres U/l 10-80 15-125 24-195

Mujeres U/l 10-70 15-110 24-170

9. Interferencias La hemólisis

10. Correlacion diagnostica Se encuentra elevada en la distrofia muscular progresiva. Traumatismos musculares, por aplicación de inyecciones y relajantes musculares, e intervenciones quirurjicas elevan sus cifras ligeramente. El valor cliníco está en una elevación manifiesta y su relación con el CK-MB y las otras enzimas que se alteran en el infarto.

CREATINCINASA FRACCION MB Generalidades. Estudios electroforeticos demostraron que tiene dos cadenas M y B . la cadena M deriva su nombre del músculo esquelético y la B de Brain ( cerebro ), tejido nervioso. la combinación de las cadenas origina la CK-MB, reconociendose 3 isoenzimas, que toman el nombre según el sitio donde predomina. Musculo esqueletico Cerebro Miocardio

CK-MM. CK-BB. CK-MB.

La CK-MB predomina en el miocardio y sus niveles se elevan cuando existe proceso necrótico del músculo cardíaco. Tanto la enzima original CK como su isoenzima CK-MB, se elevan desde las 3 hasta las 6 horas post-infarto, las concentraciones máximas son a las 12-24 horas, recuperándose los valores normales entre las 24 y 72 horas. La CK-MB aumenta notablemente en el infarto. Cardíaco y lo hace progresivamente según su extensión y evolución clínica.

Metodo Prueba Humazym M-test Método por inmunoinhibición para CK-MB.

Fundamento La prueba se basa en una determinación enzimática de CK acompañada de un método de inmunoinhibición. Un anticuerpo es incoroporado al reactivo el cual se une especificamente a la subunidad M, inhibiendo la actividad enzimática de esta subunidad B. Debido a que la concentración de CK-BB en circulación es mínima, la actividad remanentre multiplicado por el factor 2, representa la actividad de la izoenzima CK-MB.

Muestra Suero, o plasma heparinizado o con EDTA.

Condiciones del paciente Evitar actividad corporal intensa 48 horas antes de la extracción de la muestra, porque produce una considerable elevación de la concentración enzimática en plasma. En el momento de la extracción evitar la contaminación con el líquido del tejido muscular que puede elevar los valores de la CK-MB

Condiciones de la muestra La Concentracion de CK total en la muestra debe ser inferior o igual a 1000 U/L. Si es superior, diluir el suero con NaCl 150 mmol/L. La CK-MB en suero es estable al menos 7 dias a 2-8 C.

Metodo de determinacion Longitud de onda: Paso de luz: Temperatura: Medición:

Hg 334 nm, 340 nm, HG 365 nm 1 cm 25°C, 30°C ó 37 °C contra aire.

Tecnica muestra Reactivo

40 ul 1000 ul

Mezcle e incube por 10 minutos a temperatura ambiente lea la abosorbancia y luego lea exactamente a los 5 minutos. Calcular la diferencia y multiplicar por el factor 8254.

Valores de referencia CK total hombres mujeres CK-MB

25 °C

30°C

37°C

>80 U/l >70 U/l >10 U/l

>130 U/l >110 U/l >16 U/l

>195 U/l >170 U/l >25 U/l

La actividad CK-MB esta en un rango entre 6 y 25 % de la actividad de la CK total.

Correlacion diagnostica Presta una gran utilidad en los casos en que la CK se encuentra notablemente aumentada por causas ajenas al infarto y la CK-MB esta dentro de los límites normales. Esta aumenta notablemente en los infartos cardiácos.

LACTATO DESHIDROGENASA (LDH) 1. Metodo Prueba líquida para deshidrogenasa láctica.

2. Fundamento Método modificado basado en las recomendaciones del SCE.

3. Muestra Suero o plasma con EDTA o heparinizado.

4. Condiciones del paciente Extraer la sangre después de 8 horas de ayuno para evitar muestras lipémicas. Seperar el suero antes de los 30 minutos. El uso de torniquete no se debe prolongar de 60 segundos.

5. Condiciones de la muestra No se recomienda congelar la muestra, por pérdida de la actividad.


Hg 334 nm, 340 nm, HG 365 nm 1 cm 25°C, 30°C ó 37 °C contra aire.

7. Tecnica muestra reactivo

25°C ó 30°C 20 ul 1000 ul

37°C 10 ul 1000 ul

Mezclar y leer la absorbancia después de 1 minuto y leer luego a los 1, 2 y 3 minutos hacer un promedio y multiplicar por el factor 16345

8. Valores de referencia temperatura 25°C adultos 120-240 U/l hombres mujeres Niños 12meses Hasta 500 U/l

30°C 160-320 U/l

37°C 225-450U/l

IFCC <243 <244

9. Interferencias El oxalato y el citrato interfieren en la reacción.

10. Correlacion diagnostica En el infarto al miocardio sus niveles se aumentan entre las 24 ó 48 horas y tiene su máxima concentración a los 2 ó 4 días, permaneciendo elevada hasta por 8 ó 14 días.

TROPONINA 1. Metodo Prueba inmunocromatográfica en un paso para la detección de la troponina I cardíaca humana en el suero o plasma.

2. Fundamento La prueba emplea un conjugado de anticuerpo monoclonal anti cTnl y colorante en fase móvil, anticueropos anti-cTnl (ratón), fijados en la línea de prueba, y anticuerpos anti-ratón IgG (cabra) en la línea de control. Como la muestra fluye por la almohadilla absorbente, la troponina humana I se une al conjugado anti-cTnl-colorante para formar un inmunocomplejo, el cual se liga a los anticuerpos anti-cTnl en la línea de prueba y produce una línea de prueba rojo-violeta(T). El exceso de conjugado reacciona en la línea de control formando una segunda línea rojo-violeta de control C, para demostrar el correcto funcionamiento.

3. Muestra Suero o plasma

4. Condiciones del paciente Extraer la sangre después de 8 horas de ayuno para evitar muestras lipémicas. Seperar el suero antes de los 30 minutos. El uso de torniquete no se debe prolongar de 60 segundos.

5. Condiciones de la muestra Las muestras que contienen partículas de turbidez pueden dar resultados inconsistentes. Muestras lipémicas o hemolíticas no deben ser procesadas.

6. Tecnica Lleve el test a temperatura ambiente Dispense 2 gotas de la muestra enla ventana S.

Evite la formación de búrbujas en la ventana. Lea los resultados a los 15 minutos. Las muestras positivas desarrollan una línea de prueba T en los primeros minutos. No lea después de 15 minutos para evitar errores.

7. Valores de referencia Negativo Positivo

8. Interferencia La prueba no puede determinar niveles inferiores a 0.5 ng/ml de troponina I. El resultado negativo no excluye la posibilidad de un infarto al miocardio. Debe considerarse repetir la prueba después de 12 horas de iniciado el dolor.

HEMOGLOBINA GLICOSILADA 1. Metodo Método rápido de separación por resina de intercambio iónico.

2. Fundamento La formación de glicohemoglobina ocurre irreversible y progresivamente en los eritrocitos a través de los 120 días de vida normal de estas células. Dado que la concentración de glicohemoglobina en el eritrocito refleja el nivel promedio de glucosa en la sangre de las 4 a 6 semanas anteriores y es estable por la vida de los eritrocitos, la medición es proporciona una prueba de gran valor para evaluar el control a largo plazo de los pacientes diabéticos.

3. Muestra Sangre total con EDTA.

4. Condiciones del paciente Ayuno de 8 horas.

5. Condiciones de la muestra No debe utilizarse muestras hemolizadas para no alterar el resultado.


415 nm ó Hg 405 nm 1 cm 25°C frente a agua destilada.

7. Tecnica Etapa de hemólisis Reactivo lisante 500 ul Mezclar e incubar por 5 min Determinación de HbA1 Pipetear 100 ul de hemolisado Tapar a 1 cm aproximadamente Mezclar por 5 min Leer la absorbancia Determinación de Hb total Pipetear 20 ul de hemolisado Mezclar cuidadosamente Leer la absorbancia

Muestra 100 ul 15°C ó 25°C reactivo

5 ml de agua destilada

HbA1= F X HbA1 muestra Hb total

8. Valores de referencia pacientes Metabolismo normal Diabéticos descontrolados

%HbA1 4.5 – 7.0 % >8.5%

9. Correlacion diagnostica La dosificación de la hemoglobina glicosilada es importante en un diabético como la glucosa.

BIBLIOGRAFIA •

Manual de quimica clinica. Colegio mayor de Antioquia

•

Insertos de las técnicas.

Elaboró

Revisó

Aprobó

Carolina Hoyos Velásquez Cargo: Bacterióloga

XXXXXXXXXXXXXXXXXX Cargo: XXXXXXXXXXXX

XXXXXXXXXXXXXXXXX Cargo: XXXXXXXXXXXX

FECHA: XXXXXXXXXXXX

Fecha: XXXXXXXXXXXXXX Fecha: XXXXXXXXXXXX

MANUAL DE QUIMICA CLINICA

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