NORMA TÉCNICA COLOMBIANA
NTC 5733 2009-12-16
MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS Y PRODUCTOS DE ALIMENTACIÓN ANIMAL. MÉTODOS HORIZONTALES PARA LA DETECCIÓN Y ENUMERACIÓN DE ENTEROBACTERIAS. ENTEROBACTERIAS. PARTE 2: MÉTODO DE RECUENTO DE COLONIAS
E:
MICROBIOLOGY MICROBIOLOGY OF FOOD AND ANIMAL FEEDING STUFFS. HORIZONTAL METHODS FOR THE DETECTION AND ENUMERAT ENUMERATION ION OF ENTEROBA ENTEROBACTER CTERIACE IACEAE. AE. PART 2: COLONY. COUNT METHOD
CORRESPONDENCIA:
esta norma es una adopción idéntica (IDT) respecto a su documento de referencia, ISO 21528-2:2004.
DESCRIPTORES:
microbiología microbiología de alimentos; alimentación animal; método horizontal; método de recuento de colonias; enterobacterias. enterobacterias.
I.C.S.: 07.100.01 Editada por el Instituto Colombiano de Normas Técnicas y Certificación (ICONTEC) Apartado 14237 Bogotá, D.C. - Tel. (571) 6078888 - Fax (571) 2221435
Prohibida su reproducción
Editada 2009-12-24
PRÓLOGO
El Instituto Colombiano de Normas Técnicas y Certificación, ICONTEC, es el organismo nacional de normalización, según el Decreto 2269 de 1993. ICONTEC es una entidad de carácter privado, sin ánimo de lucro, cuya Misión es fundamental para brindar soporte y desarrollo al productor y protección al consumidor. Colabora con el sector gubernamental y apoya al sector privado del país, para lograr ventajas competitivas en los mercados interno y externo. La representación de todos los sectores involucrados en el proceso de Normalización Técnica está garantizada por los Comités Técnicos y el período de Consulta Pública, este último caracterizado por la participación del público en general. La NTC 5733 fue ratificada por el Consejo Directivo de 2009-12-16. Esta norma está sujeta a ser actualizada permanentemente con el objeto de que responda en todo momento a las necesidades y exigencias actuales. A continuación se relacionan las empresas que colaboraron en el estudio de esta norma a través de su participación en el Comité Técnico 25 Microbiología. 3 M COLOMBIA ALGARRA S.A. ALPINA PRODUCTOS ALIMENTICIOS S.A. BIOQUILAB LTDA. BIOTRENDS LABORATORIOS LTDA. CARULLA VIVERO S.A. CASA LUKER S.A. ENZIPÁN LABORATORIOS S.A. IVONNE BERNIER LABORATORIO LTDA. KOYOMAD S.A. LABCONTROL E.U. LABORATORIO SFC LTDA. LABORATORIOS ERMA S.A.
LABORATORIOS GRAM LABORATORIOS MICROLAB LTDA. MERCADEO DE ALIMENTOS DE COLOMBIA S.A. MULTIDIMENSIONALES NULAB LTDA. PURIFICACIÓN Y ANÁLISIS DE FLUIDOS LTDA. QUALA S.A. UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA VECOL S.A.
Además de las anteriores, en Consulta Pública el Proyecto se puso a consideración de las siguientes empresas: ABASTICO DEL VALLE ACEGRASAS S.A. ACUAGYR S.A. E.S.P. ALIMENTOS POLAR COLOMBIA S.A. ANNAR DIAGNOSTICA IMPORT LTDA. AQUALAB ARCHIVO DE BOGOTÁ AREPAS DOÑA ALEJA ASBIOQUIM LTDA. ASEBIOL
ASINAL ASOCIACIÓN COLOMBIANA DE MICROBIOLOGÍA BAVARIA S.A. BECTON DICKINSON DE COLOMBIA LTDA. BIANÁLISIS BIOCONTROL LTDA. CALIDAD INDUSTRIAL LTDA. CERVECERÍA LEONA S.A.
COLOMBIANA S.A. COMPAÑÍA NACIONAL DE CHOCOLATES S.A. CONGELAGRO S.A. CORPOLAC CORPORACIÓN PARA EL AVANCE DE LA MICROBIOLOGÍA Y LA MICROSCOPIA MICROS DUPONT QUALICON EMPRESA DE ACUEDUCTO Y ALCANTARILLADO DE BOGOTÁ E.S.P. FABRICA DE ESPECIAS Y CONDIMENTOS EL REY S.A. FRUGAL S.A. INDUSTRIA PRODUCTORA DE ACEITES RENOVABLES. INDUSTRIAS ALIMENTICIAS ZENÚ S.A. INSTITUTO DE GENÉTICA UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA. JOHNSONDIVERSEY KLIK S.A LA CAMPIÑA LABFARVE LABORATORIO DE FARMACOLOGÍA VEGETAL
LABORATORIO A.B.B.A. LABORATORIO DE GENÉTICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR. LABORATORIO EMICAL LESNIAK E.U. MICROBIOLOGOS ASOCIADOS LTDA. NESTLÉ DE COLOMBIA S.A. PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA PRODUCTOS NATURALS DE LA SABANA S.A. -ALQUERÍAQUIK LTDA. ROCHE DIAGNOSTICS SECRETARIA DISTRITAL DE SALUD DE BOGOTÁ. SERVICIOS DE LABORATIO CLINICO LTDA. UNIVERSIDAD DE LOS ANDES UNIVERSIDAD DEL VALLE UNIVERSIDAD MANUELA BELTRÁN VILASECA LTDA. VITROFARMA S.A.
ICONTEC cuenta con un Centro de Información que pone a disposición de los interesados normas internacionales, regionales y nacionales y otros documentos relacionados. DIRECCIÓN DE NORMALIZACIÓN
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CONTENIDO Página INTRODUCCIÓN......................................................................................................................1 1.
ALCANCE.....................................................................................................................1
2.
REFERENCIAS NORMATIVAS ...................................................................................2
3.
TÉRMINOS Y DEFINICIONES .....................................................................................2
4.
PRINCIPIO....................................................................................................................3
4.1
PREPARACIÓN DE LA SUSPENSIÓN INICIAL Y LAS DILUCIONES DECIMALES.................................................................................................................3
4.2
AISLAMIENTO .............................................................................................................3
4.3
CONFIRMACIÓN..........................................................................................................3
4.4
CÁLCULO.....................................................................................................................3
5.
DILUYENTE, MEDIO DE CULTIVO Y REACTIVO ......................................................3
5.1
DILUYENTE..................................................................................................................3
5.2
MEDIO DE CULTIVO....................................................................................................3
5.3
REACTIVO DE OXIDASA ............................................................................................6
6.
EQUIPOS Y MATERIAL DE VIDRIO ...........................................................................6
7.
MUESTREO..................................................................................................................7
8.
PREPARACIÓN DE LA MUESTRA DE ENSAYO.......................................................7
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Página 9.
PROCEDIMIENTO........................................................................................................7
9.1
INFORMACIÓN GENERAL..........................................................................................7
9.2
PORCIÓN DE ENSAYO, SUSPENSIÓN INICIAL Y DILUCIONES .............................7
9.3
INOCULACIÓN E INCUBACIÓN .................................................................................7
9.4
RECUENTO Y SELECCIÓN DE LAS COLONIAS PARA LA CONFIRMACIÓN ........8
9.5
SUBCULTIVO DE LAS COLONIAS SELECCIONADAS ............................................8
9.6
ENSAYOS DE CONFIRMACIÓN BIOQUÍMICA ..........................................................8
10.
EXPRESIÓN DE RESULTADOS .................................................................................9
10.1
TUBOS POSITIVOS CONFIRMADOS .........................................................................9
11.
INFORME DE ENSAYO ...............................................................................................9
BIBLIOGRAFÍA......................................................................................................................11 DOCUMENTO DE REFERENCIA..........................................................................................12 ANEXOS ANEXO A (Normativo) LÍMITES DE CONFIANZA PARA LA ESTIMACIÓN DE CANTIDADES PEQUEÑAS DE COLONIAS..................................................................................................10
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MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS Y PRODUCTOS DE ALIMENTACIÓN ANIMAL. MÉTODOS HORIZONTALES PARA LA DETECCIÓN Y ENUMERACIÓN DE ENTEROBACTERIAS. PARTE 2: MÉTODO DE RECUENTO DE COLONIAS
INTRODUCCIÓN Esta norma está destinada a brindar unas directrices generales para el examen de los productos que no son tratados en normas técnicas colombianas existentes y para ser tomada en consideración por organizaciones que preparen métodos de ensayo microbiológico para la aplicación en alimentos o productos alimenticios para animales. Debido a la gran variedad de productos dentro de este campo de aplicación, estas directrices pueden no ser apropiadas en todo detalle para algunos productos y para algunos otros puede ser necesario usar métodos diferentes. No obstante, se espera que en todos los casos se hagan todos los intentos para aplicar las directrices suministradas en la medida de lo posible y que las desviaciones con respecto a ellas únicamente se lleven a cabo si es absolutamente necesario por razones técnicas. En la próxima revisión de esta norma, se tomará en consideración toda la información que esté disponible con respecto a la extensión en la cual las directrices se han cumplido y las razones para las desviaciones en el caso de productos particulares. La armonización de los métodos de ensayo no puede ser inmediata y para algunos grupos de productos pueden existir ya normas nacionales o internacionales, o ambas que no cumplen con este método horizontal. Se espera que cuando se revisen tales normas se les realicen cambios para satisfacer esta norma de tal manera que, eventualmente, las únicas desviaciones de éste método horizontal serán aquellas necesarias y bien establecidas por razones técnicas. 1.
ALCANCE
Esta norma específica un método sin pre-enriquecimiento para la enumeración de enterobacterias. Se aplica a: -
productos destinados para consumo humano y alimentación de animales, y
-
muestras ambientales en el área de producción y manipulación de alimentos.
La enumeración se realiza mediante el recuento de las colonias en un medio sólido después de la incubación a 37 °C (o 30 °C) 1). 1)
La temperatura de 37 °C se usa generalmente cuando la enumeración de enterobacterias es para un indicador higiénico. Como alternativa se puede seleccionar la temperatura de 30 °C cuando la enumeración de enterobacterias se ejecuta con propósitos tecnológicos e incluye enterobacterias psicotrópicas.
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Esta técnica se recomienda cuando se espera que la cantidad de colonias que se busca sea superior a 100 UFC (unidades formadoras de colonia) por ml o por gramo de muestra de ensayo. 2.
REFERENCIAS NORMATIVAS
Los siguientes documentos de referencia son indispensables para la aplicación de esta norma para referencias con fecha, únicamente se aplica la edición citada. Para referencias sin fecha, se aplica la última edición del documento citado (incluyendo todas las enmiendas). NTC 4092, Microbiología de alimentos y de alimentos para animales. Reglas generales para el análisis microbiológico. NTC 4491-1, Microbiología de alimentos y alimentos para animales. Preparación de muestras para ensayo, suspensión inicial y diluciones decimales para análisis microbiológico. Parte 1: Reglas generales para la preparación de la suspensión inicial y de diluciones decimales. NTC 4491-2, Microbiología de alimentos y alimentos para animales. Preparación de muestras para ensayo. Suspensión inicial y diluciones decimales para análisis microbiológico. Parte 2. Reglas especificas para la preparación de carne y productos cárnicos. NTC 4491-3, Microbiología de alimentos y alimentos para animales. Preparación de muestras para ensayo, suspensión inicial y diluciones decimales para análisis microbiológico. Parte 3. Reglas especificas para preparación de muestras de pescado y productos de la pesca. NTC 4491-4, Microbiología de alimentos y alimentos para animales. Preparación de muestras para ensayo, suspensión inicial y diluciones decimales para análisis microbiológico. Parte 4: Reglas especificas para la preparación de productos diferentes de leche, productos lácteos, carne, productos cárnicos, pescados y productos de la pesca. NTC 4491-5, Microbiología de alimentos y alimentos para animales. Preparación de muestras para ensayo, suspensión inicial y diluciones decimales para análisis microbiológico. Parte 5: Reglas especificas para la preparación de productos la de leche y derivados lácteos. GTC 78, Microbiología de alimentos y alimentos para animales. Guía para la preparación y producción de medios de cultivo. Guía general para el aseguramiento de la calidad para la preparación de los medios de cultivo en el laboratorio. DE 205-06, Microbiología de alimentos y alimentos para animales. Guía para la preparación y producción de medios de cultivo. Guía general para los ensayos de desempeño de medios de cultivo. 3.
TÉRMINOS Y DEFINICIONES
Para los propósitos de este documento, se aplican los siguientes términos y definiciones. 3.1 Enterobacterias. Microorganismos que forman colonias características sobre agar violeta rojo bilis glucosa que fermentan la glucosa y presentan una reacción negativa a la oxidasa, cuando los ensayos se realizan según los métodos que se especifican en esta norma. 3.2 Recuento de enterobacterias. Cantidad de enterobacterias que se encuentran por mililitro o por gramo de muestra de ensayo, cuando el ensayo se realiza de acuerdo con el método que se especifica en esta norma. 2
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4.
PRINCIPIO
4.1
PREPARACIÓN DE LA SUSPENSIÓN INICIAL Y LAS DILUCIONES DECIMALES
Se prepara una suspensión inicial y diluciones decimales a partir de la muestra de ensayo (véase la serie de normas NTC 4491, Parte 1, 2, 3, 4 y 5). 4.2
AISLAMIENTO
El agar violeta rojo bilis glucosa que se encuentra en dos cajas de Petri (técnica de siembra en caja) se inocula con una cantidad específica de la muestra de ensayo, si el producto es líquido, o con la suspensión inicial en el caso de otros productos. Se adiciona una capa del mismo medio. Otros pares de cajas se preparan bajo las mismas condiciones, utilizando diluciones decimales de la muestra de ensayo o de la suspensión inicial. Las cajas se incuban a 37 °C (o 30 °C) 1 durante 24 h ± 2 h. 4.3
CONFIRMACIÓN
Subcultivo de colonias de enterobacterias presuntivas sobre un medio no selectivo y confirmación por medio de ensayos para la fermentación de glucosa y la presencia de oxidasa. 4.4
CÁLCULO
La cantidad de enterobacterias por ml o por g de muestra de ensayo se calcula a partir del número confirmado de colonias típicas por cada caja. 5.
DILUYENTE, MEDIO DE CULTIVO Y REACTIVO
Para la práctica actual del laboratorio, véase NTC 4092, GTC 78 y GTC 171. 5.1
DILUYENTE
Véase la NTC 4491-1. 5.2
MEDIO DE CULTIVO
5.2.1 Agar violeta rojo bilis glucosa (VRBG) 5.2.1.1 Composición Producto de digestión enzimática de tejidos animales
7,0 g
Extracto de levadura
3,0 g
Sales de bilis No. 3
1,5 g
Glucosa
10,0 g
Cloruro de sodio
5,0 g 3
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Rojo neutro
0,03 g
Cristal Violeta
0,002 g
Agar
9 g a 18 ga)
Agua
1 000 ml
5.2.1.2 Preparación Disuelva los componentes o el medio completo deshidratado en agua mediante ebullición. Ajuste el pH, si es necesario, de manera tal que después de la ebullición esté en 7,4 ± 0,2 a 25 °C. Dispense el medio de cultivo en tubos o frascos estériles (véase el numeral 6.5) con capacidad no superior a 500 ml. No esterilice el medio. Prepare el medio inmediatamente antes del uso. Utilice el medio fundido dentro de un periodo de cuatro horas a partir de su preparación. 5.2.1.3 Ensayo de desempeño para aseguramiento de la calidad del medio de cultivo Para la definición de selectividad y productividad, consulte la GTC 78. Para los criterios de desempeño, consulte la GTC 171, Tabla B.1. 5.2.2 Agar nutritivo 5.2.2.1 Composición Extracto de carne
3,0 g
Producto de digestión enzimática de tejidos animales
5,0 g
Cloruro de sodio
5,0 g
Agar
9 g a 18 ga)
Agua
1 000 ml
5.2.2.2 Preparación Disuelva los componentes o el medio completo deshidratado en agua, mediante calentamiento, si es necesario. Ajuste el pH, si es necesario, de manera tal que después de la esterilización esté en 7,3 ± 0,2 a 25 °C. Dispense el medio de cultivo en tubos o frascos estériles (véase el numeral 6.5) con capacidad no superior a 500 ml. Esterilice durante 15 min en autoclave (véase el numeral 6.1) ajustado a 121 °C. a)
Dependiendo de la potencia de gelificación del agar.
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5.2.2.3 Preparación de las cajas de agar Transfiera porciones de 15 ml aproximadamente del medio de cultivo, fundido y enfriado hasta aproximadamente 47 °C, a cajas de Petri (véase el numeral 6.7) y permita que se solidifique. Inmediatamente antes del uso, seque las cajas, de preferencia sin las tapas y con la superficie de agar hacia abajo, en una superficie lisa y en condiciones asépticas (véase el numeral 6.3) hasta que el agar esté seco. Si se preparan con anticipación, las cajas sin secar se pueden almacenar en condiciones que no cambien su composición hasta durante dos semanas a 5 °C ± 3 °C. 5.2.2.4 Ensayo de desempeño para aseguramiento de la calidad del medio de cultivo Para la definición de selectividad y productividad, consulte la GTC 78. Para los criterios de desempeño, consulte la GTC 171, Tabla D.6. 5.2.3 Agar de glucosa 5.2.3.1 Composición Producto de digestión enzimática de tejidos animales
10,0 g
Extracto de levadura
1,5 g
Glucosa
10,0 g
Cloruro de sodio
5,0 g
Púrpura de bromocresol
0,015 g
Agar
9 g a 18 ga)
Agua
1 000 ml
5.2.3.2 Preparación Disuelva los componentes o el medio completo deshidratado en agua, mediante calentamiento, si es necesario. Ajuste el pH, si es necesario, de manera tal que después de la esterilización esté en 7,0 ± 0,2 a 25 °C. Dispense el medio de cultivo en tubos o frascos estériles (véase el numeral 6.6) con capacidad adecuada. Esterilice durante 15 min en autoclave (véase el numeral 6.1) ajustado a 121 °C. Deje los tubos en posición vertical. El medio se puede almacenar hasta por una semana a 5 °C ± 3 °C.
a)
Dependiendo de la potencia de gelificación del agar.
5
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Inmediatamente antes del uso, caliente el medio en agua hirviendo o en un flujo de vapor durante 15 min, luego enfríe rápidamente hasta la temperatura de incubación. 5.3
REACTIVO DE OXIDASA
5.3.1 Componentes N,N,N’,N’-Tetrametil-p-fenilenediamina dihidrocloruro
1,0 g
Agua
100 ml
5.3.2 Preparación Disuelva el componente en agua fría. Prepare el reactivo inmediatamente antes del uso. Se pueden utilizar las tiras o discos disponibles en el comercio. En este caso, siga las recomendaciones del fabricante. 6.
EQUIPOS Y MATERIAL DE VIDRIO
Equipos comunes para el laboratorio microbiológico y, en particular los siguientes (véase la NTC 4092). 6.1
Equipos para esterilización seca (horno) o esterilización húmeda (autoclave).
Véase la NTC 4092. 6.2
Incubadora, con capacidad para operar a 37 °C ± 1 °C.
6.3 Estufa de secado (ventilado por convección) o incubadora con capacidad para operar a una temperatura entre 37 °C y 55 °C. 6.4 Baño de agua/maría o equipo similar con capacidad de mantener una temperatura entre 44 °C y 47 °C. 6.5 Recipientes (por ejemplo tubos de ensayo), con dimensiones de 16 mm x 150 mm y 20 mm x 200 mm y frascos o botellas con capacidad entre 150 ml y 500 ml, adecuados para esterilizar y almacenar el medio de cultivo. 6.6
Cajas de P e t r i , de vidrio o plástico con diámetro de 90 mm a 100 mm.
6.7 Asas redondas (con diámetro aproximado de 3 mm) y asas rectas elaboradas de platino/iridio o níquel/cromo y/o rastrillos de vidrio, o asas desechables estériles equivalentes o agujas de inoculación. 6.8 Pipetas graduadas de entrega total, de 1 ml de capacidad nominal graduadas en divisiones de 0,1 ml y con una abertura de salida de flujo de 2 mm a 3 mm de diámetro. NOTA
6.9
Pueden utilizarse pipetas automáticas debidamente calibradas.
Medidor de pH con una exactitud de ± 0,1 unidad de pH a 25 °C. 6
NORMA TÉCNICA COLOMBIANA 6.10
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Homogeneizador
Véase la NTC 4092. 7.
MUESTREO
Es importante que el laboratorio reciba una muestra que sea verdaderamente representativa del producto y que no se haya deteriorado ni haya cambiado durante el transporte o el almacenamiento. El muestreo se debería realizar de acuerdo con la norma específica para el producto en cuestión. Si no existe tal norma, se recomienda que las partes interesadas logren un acuerdo con respecto a este tema. 8.
PREPARACIÓN DE LA MUESTRA DE ENSAYO
Prepare la muestra de ensayo de acuerdo con la NTC 4491 partes 1, 2, 3, 4 y 5, y/o la norma específica adecuada para el producto en cuestión. Si no existe tal norma, se recomienda que las partes interesadas logren un acuerdo con respecto a este tema. 9.
PROCEDIMIENTO
9.1
INFORMACIÓN GENERAL
Para obtener directrices sobre la realización del procedimiento véase la NTC 4092. 9.2
PORCIÓN DE ENSAYO, SUSPENSIÓN INICIAL Y DILUCIONES
Véanse la colección de la NTC 4491 partes 1, 2, 3, 4 y 5. Prepare una sola serie de diluciones decimales a partir de la muestra de ensayo, si el producto es líquido o a partir de la suspensión inicial en el caso de otros productos. 9.3
INOCULACIÓN E INCUBACIÓN
9.3.1 Tome dos cajas de Petri estériles (véase el numeral 6.6). Utilizando una pipeta estéril (véase el numeral 6.8), transfiera a cada caja 1 ml de la muestra de ensayo, si el producto es líquido o 1 ml de la suspensión inicial en el caso de otros productos. Tome otras dos cajas de Petri estériles. Utilizando una pipeta estéril nueva, transfiera a cada caja 1 ml de la primera dilución decimal (10 -1) de la muestra de ensayo, si el producto es líquido o 1 ml de la primera dilución decimal de la suspensión inicial (10 -2) en el caso de otros productos. Repita el procedimiento descrito con las diluciones adicionales, utilizando una pipeta estéril nueva para cada dilución. 9.3.2 Vierta en cada caja de Petri aproximadamente 10 ml del medio de violeta rojo bilis glucosa (véase el numeral 5.2.1) el cual se ha preparado y luego enfriado hasta 44 °C a 47 °C en el baño de agua o maría (véase el numeral 6.4). El tiempo transcurrido entre la inoculación de las cajas de Petri y el momento en que el medio se vierte en las cajas no debe exceder 15 min. 7
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Mezcle cuidadosamente el inóculo con el medio mediante movimientos horizontales y permita que el medio se solidifique, con las cajas de Petri en reposo sobre una superficie fría. 9.3.3 Después de terminar la solidificación de la mezcla, añada una capa de cubierta de aproximadamente 15 ml del medio de violeta rojo bilis glucosa (véase el numeral 5.2.1), preparado y luego enfriado tal como se describe en el numeral 9.3.2, para evitar el crecimiento disperso y lograr condiciones semianaeróbicas. Permita que se solidifique tal como se describió anteriormente. 9.3.4 Invierta las cajas preparadas e incúbelas en la incubadora (véase el numeral 6.2) ajustada en 37 °C durante 24 h ± 2 h. 9.4
RECUENTO Y SELECCIÓN DE LAS COLONIAS PARA LA CONFIRMACIÓN
Las colonias características son de color rosa a rojo o púrpura (con o sin halos de precipitación). Seleccione las cajas (véase el numeral 9.3.4) que contengan menos de 150 colonias características, cuente estas colonias. Después seleccione al azar cinco de tales colonias para subcultivo (véase el numeral 9.5) para los ensayos de confirmación bioquímica (véase el numeral 9.6). Considere el análisis nulo, si la mitad o más de la mitad del área superficial de una caja tienen exceso de crecimiento. Si menos de la mitad de la superficie de la caja tiene exceso de crecimiento, cuente las colonias en la parte transparente y extrapole de tal manera que el número corresponda al área superficial total de la caja. Algunas enterobacterias pueden ocasionar decoloración de sus colonias o del medio. Por lo tanto, cuando no están presentes colonias características, seleccione cinco colonias amarillentas para la confirmación. 9.5
SUBCULTIVO DE LAS COLONIAS SELECCIONADAS
Siembre en las cajas de agar nutritivo (véase el numeral 5.2.2) cada una de las colonias seleccionadas para la confirmación (véase el numeral 9.4.). Incube estas cajas a 37 °C durante 24 h ± 2 h. Seleccione una colonia bien aislada de cada una de las cajas incubadas para los ensayos de confirmación bioquímica (véase el numeral 9.6). 9.6
ENSAYOS DE CONFIRMACIÓN BIOQUÍMICA
9.6.1 Reacción de oxidasa Utilizando un asa redonda o un asa recta (véase el numeral 6.7), tome una porción de cada una de las colonias bien aisladas (véase el numeral 9.5) y siembre sobre papel filtro humedecido con el reactivo de oxidasa (véase el numeral 5.3) o sobre un disco de los que se encuentran en el comercio. No se debe utilizar un asa ni de alambre de níquel/cromo (utilizar asas desechables plásticas). El ensayo se considera negativo si el color del papel filtro no se torna oscuro en un lapso de 10 s.
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Consulte las instrucciones del fabricante para la utilización de las tiras o los discos listos para usar. 9.6.2 Ensayo de fermentación Utilizando un asa (véase el numeral 6.7), introduzca las mismas colonias seleccionadas en el numeral 9.5 que dieron un ensayo negativo para oxidasa en tubos que contenga agar de glucosa (véase el numeral 5.2.3). Incube estos tubos a 37 °C durante 24 h ± 2 h. Si se presenta color amarillo en todo el contenido del tubo, considere la reacción como positiva. 9.6.3 Interpretación de los ensayos bioquímicos Las colonias que son negativas para oxidasa y positivas para glucosa se confirman como enterobacterias. 10.
EXPRESIÓN DE RESULTADOS
10.1
TUBOS POSITIVOS CONFIRMADOS
Véase la NTC 4092. 11.
INFORME DE ENSAYO
El informe de ensayo debe especificar: -
toda la información necesaria para la identificación completa de la muestra;
-
el método de muestreo utilizado, si se conoce;
-
el método de ensayo utilizado, con referencia a esta norma;
-
la temperatura de incubación utilizada;
-
todos los detalles operativos que no se especifican en ésta norma o que se consideran opcionales, junto con los detalles de todos los incidentes que pueden haber tenido influencia en los resultados de ensayo;
-
los resultados de ensayo obtenidos.
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NTC 5733 ANEXO A (Normativo)
LÍMITES DE CONFIANZA PARA LA ESTIMACIÓN DE CANTIDADES PEQUEÑAS DE COLONIAS Los límites de confianza en el nivel de 95 % para la estimación de cantidades pequeñas, cuando la cantidad de colonias retenidas es inferior a 15, se indican en la Tabla A.1. Tabla A.1. Límites de confianza para la estimación de cantidades pequeñas de colonias
Número de microorganismos
Límites de confianza en el nivel de 95% Inferior
Superior
1
<1
2
2
<1
4
3
<1
5
4
1
6
5
2
9
6
2
10
7
2
12
8
3
13
9
4
14
10
4
16
11
5
18
12
6
19
13
7
20
14
7
21
15
8
23
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NORMA TÉCNICA COLOMBIANA
NTC 5733 BIBLIOGRAFÍA
[1]
Cowell N.D. and Morisetti M.D. J.Sci. Fd. Agric., 20, 1969, p.573.
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DOCUMENTO DE REFERENCIA INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR STANDARDIZATION. Microbiology of food and animal feeding stuffs. Horizontal Methods for the Detection and Enumeration of Enterobacteriaceae. Part 2: Colony. Count Method . Geneva: ISO, 2004, 10 p (ISO 21528-
2:2004 (E)).
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