Praktikum isolasi DNA kromosom bertujuan untuk memahami metode isolasi DNA kromosom dari sel prokariot berupa bakteri Gram negatif menggunakan GeneJETTM Genomic DNA Purification Kit. Bakteri yang digunakan adalah E. coli Top 10. Satu koloni bakteri E. coli Top 10 diinokulasikan dalam 5 mL medium Lurea Bertani (LB) cair steril yang telah ditambahkan antibiotik ampisilin dan diinkubasi pada suhu 370C selama 12-16 jam. Medium Lurea Bertani adalah medium dehidrasi yang biasa digunakan untuk menumbuhkan strain rekombinan dari Escherichia coli dalam prosedur biologi molekular. Medium LB untuk satu liter terdiri dari tryptone 10 gram, ekstrak ragi 5 gram, dan natrium klorida 5 gram. pH akhir dari medium ini adalah 7,0±0,2. Medium LB menyediakan semua nutrisi yang dibutuhkan untuk pertumbuhan Escherichia coli. Tryptone menyediakan sumber nitrogen dan karbon, ekstrak ragi menyediakan vitamin dan unsur-unsur lain termasuk vitamin B, sedangkan ion natrium dari natrium klorida berperan untuk proses transport dan keseimbangan osmosis. Suspensi Escherichia coli yang dibuat mengandung gen resistensi terhadap ampisilin. Suspensi E. coli sebanyak 1000 μL dimasukkan ke dalam tabung eppendorf 1,5 mL, disentrifugasi dengan kecepatan 5000 g selama 5 menit, lalu supernatannya dibuang. Sebanyak 1000 μL suspensi bakteri ditambahkan ke dalam pelet bakteri, disentrifugasi dengan kecepatan 5000 g selama 5 menit, lalu supernatannya dibuang. Hal ini dilakukan sebanyak 5 kali dan didapatkan pelet bakteri dari 5000 μL suspensi bakteri. Pelet bakteri dicuci dengan 500 μL ddH 2O steril sebanyak dua kali dengan cara disentrifugasi dengan kecepatan 5000 g selama 5 menit, lalu supernatannya dibuang. Aqua bidestillata atau aqua ddH 2O adalah air yang sangat murni dan steril yang didestilasi sebanyak dua kali dengan menghilangkan ion-ion yang ada di dalamnya. Pencucian ini berfungsi untuk pemurnian pelet bakteri. Tahap pertama dalam proses isolasi DNA kromosom adalah pemecahan sel menggunakan digestion solution sebanyak 45 μL. Digestion solution berfungsi untuk merusak sel bakteri sehingga komponen-komponen dalam sel keluar dari
dalam sel dan dinding sel bakteri hancur. Campuran ini dipipeting dengan mikropipet agar pelet bakteri tersebar merata dalam digestion solution dan terbentuk suspensi yang homogen, sehingga semua sel bakteri akan hancur khususnya dinding sel bakteri. Kemudian ditambahkan 5 μL proteinase K yang berfungsi untuk memutus ikatan peptida dari protein-protein bakteri E. coli. Campuran dalam tabung eppendorf dikocok menggunakan vortex agar pemutusan ikatan peptida berlangsung lebih cepat. Pengocokan dengan vortex dilakukan selama 10 detik. Suspensi kemudian diinkubasi pada suhu 560C dalam shaking water bath selama 30 menit. Hal ini bertujuan agar sel lisis secara sempurna dan mengoptimalkan kerja enzim proteinase K pada suhu tersebut. Selanjutnya, ekstrak sel yang didapat ditambahkan 5 μL RNAse A Solution, lalu dikocok menggunakan vortex selama 10 detik. Kemudian diinkubasi pada suhu ruang selama 10 menit. Penambahan RNAse A Solution berfungsi untuk menghancurkan RNA yang terdapat dalam ekstrak sel sehingga hasil isolasi yang didapat akan murni berupa DNA saja. Vortex berguna untuk menghomogenkan ekstrak. Inkubasi selama 10 menit pada suhu ruang berfungsi untuk menginaktifasi enzim yang mendegradasi DNA (DNase) dan proses pemecahan dinding sel dan membran inti secara fisik. Setelah diinkubasi, Lysis Solution kemudian ditambahkan ke dalam campuran, lalu dikocok menggunakan vortex selama 15 detik dan hingga diperoleh campuran yang homogen. Penambahan Lysis Solution ini bertujuan untuk memecah sel agar isi dari sel keluar dan DNA di dalamnya bisa diisolasi. Kemudian etanol 50 % sebanyak 200 μL ditambahkan ke dalam campuran, lalu dikocok menggunakan vortex selama 10 detik untuk menghomogenkan campuran. Fungsi dari penambahan etanol yaitu untuk mengikat strandDNA yang telah terkumpul. Strand-strand DNA yang terikat oleh etanol akan nampak sebagai benang-benang putih yang terapung diatas filtrat. Selain itu etanol juga berfungsi mempertifikasi DNA. Pemekatan dengan etanol pada lapisan atas sampel sehingga terjadi presipitasi DNA pada perbatasan kedua larutan. Etanol yang digunakan pada praktikum ini adalah etanol 50%.
Pada saat penambahan etanol, larutan akan tampak terbalik untuk beberapa saat, dan pada akhirnya ethanol akan berada di bagian atas tabung, sementara filtrat berada dibagian dasar tabung karena etanol memiliki kerapatan yang lebih kecil dibandingkan air. Kemudian lisat dituangkan ke GeneJET TM (Genomic DNA Purification Column) dalam tabung kolektor. Lalu kolom disentrifugasi selama 1 menit pada kecepatan 7.000 rpm (6.000 x g). Hal ini bertujuan untuk memisahkan kontaminan yang mungkin masih terdapat pada supernatan. Kemudian supernatan dalam tabung kolektor dibuang. Dan kolom dimasukkan kembali ke dalam tabung kolektor yang sama.
Selanjutnya sebanyak 50 μL wash buffer I ditambahkan kedalam kolom kemudian disentrifugasi selama 1 menit pada kecepatan 8000g. Dengan penambahan wash buffer I untuk membuat pH menjadi 12-12,5. Pada pH 12 -12,5 ikatan hidrogen dari DNA kromosom non supercoiled akan terdenaturasi, heliks ganda terurai dan kedua rantai polipeptida memisah. Supernatan dalam tabung kolektor dibuang,lalu kolom purifikasi ditempatkan pada tabung yang sama. Selanjutnya sebanyak 500 μL wash buffer II yang telah ditambahkan etanol 50% ditambahkan kekolom lalu disentrifugasi selama 3 menit pada kecepatan 12000g . Hal ini dilakukan Untuk memastikan dan menyempurnakan denaturasi pada penambahan wash buffer 1 telah berhasil dengan sempurna. Fungsi etanol disini adalah untuk menghilangkan sisa protein yang mungkin masih ada. Lalu supernatant pada tabung kolektor dibuang dan kolom dipindah ke tabung eppendorf 1,5 mL baru. Lalu sebanyak 200 μL Elution Buffer ditambahkan kebagian tengah membran kolom plasmid (tip mikropipet tidak boleh menyentuh membrane kolom). Hal ini dilakukan agar Elution Buffer menyebar rata pada kolom plasmid dan tidak merusak kolom. Lalu kolom di inkubasi dalam suhu kamar selama 2 menit pada suhu ruang, hal ini mungkin agar DNA terikat dengan Elution Buffer untuk mengembangkan silika sehingga proses elusi dapat berjalan dengan baik. Lalu disentrifugasi pada kecepatan 8000g selama 1 menit. Proses ini dilakukan 2 kali agar DNA yang ikut terelusi semakin banyak karena elution buffer yang ditambahkan semakin banyak dan proses elusi berjalan sempurna. Selanjutnya
kolom purifikasi dilepaskan dan DNA pada tabung eppendorf disimpan dalam suhu -200 C agar tidak terjadi denaturasi yang akan merusak DNA.
