PENGAMATAN MORFOLOGI BAKTERI DENGAN PENGECATAN GRAM BAB I Tujuan Praktikum 1.1 Tujuan Praktikum Adapun tujuan dari praktikum yang dilakukan adalah: Untuk membedakan bakteri yang bersifat Gram positif dan Gram negative BAB II TEORI Christ Chri stia ian n Gr Gram am (1 (188 884) 4) me mene nemu muka kan n pr pros osed edur ur pe peng ngec ecat atan an Gr Gram am.. Pe Peng ngec ecat atan an in inii merupakan salah satu prosedur yang amat penting dan paling banyak digunakan untuk klasifikasi bakteri. Dengan menggunakan metode ini, bakteri dapat dipisahkan secara umum menjadi dua kelompok besar, yaitu: 1. Organism yang dapat menahan kompleks pewarna primer gentian violet sampai pada akhir prosedur (sel-sel tampak biru gelap atau ungu), disebut Gram positif; 2. Org Organi anism sm yan yang g keh kehila ilanga ngan n kom komple pleks ks war warna na ung ungu u Kri Krista stall pad pada a wak waktu tu pem pembil bilasa asan n dengan alcohol (sehingga bila diperiksa ternyata kosong) namun demikian terwarnai oleh pewarn pew arna a ta tandi ndinga ngan, n, fuc fuchsi hsin/s n/safr afrani anin n (s (selel-se sell tam tampak pak me merah rah mu muda) da),, dis disebu ebutt Gra Gram m negative. Diketahui bahwa komposisi dinding sel bakteri Gram positif berbeda dari bakteri Gram nega ne gati tive ve.. Di Dind ndin ing g se sell ya yang ng le lebi bih h te teba ball pa pada da ba bakt kter erii Gr Gram am po posi siti tiff me meny nyus usut ut ol oleh eh perlak per lakuan uan alc alcoho oholl kar karena ena ter terjad jadiny inya a deh dehidr idrasi asi,, me menye nyebab babkan kan por pori-p i-pori ori din dindin ding g se sell menu me nutu tup p se sehi hing ngga ga me menc nceg egah ah la laru rutn tnya ya ko komp mple leks ks ge gent ntia ian n vi viol olet et pa pada da la lang ngka kah h pemucatan. Di lain pihak, sel-sel Gram negative mempunyai kandungan lipid yang lebih tinggi pada dinding selnya dan lipid pada umumnya larut dalam alcohol dan aseton. Laru La rutn tnya ya li lipi pid d ol oleh eh pe pem muc ucat at ya yang ng di digu guna naka kan n da dala lam m pe pewa warn rnaa aan n Gr Gram am di didu duga ga memper mem perbes besar ar por pori-p i-pori ori din dindin ding g sel seh sehing ingga ga pro proses ses pem pemuca ucatan tan pad pada a sel sel-se -sell Gra Gram m negative berlangsung lebih cepat. Contoh-contoh bakteri Gram positif antara lain Bacillus subtilis, Streptococcus lactis, dan Staphylococcus aureus, sedangkan bakteri Gram negative antara lain Corynebacterium diptheri, E. coli, dan Salmonella typhosa. typhosa. Gambar perbedaan bakteri Gram positif dan Negatif Beberapa ciri bakteri gram positif dan negative Ciri Struktur Dinding Sel
Gram Positif Tebal (15 – 80nm)
Komposisi dinding sel
Berlapis tunggal (mono) Kandungan lipid rendah
Gram Negatif Tipis (10 – 15nm) Berlapis tiga (multi) Kandungan lipid tinggi
Pept Peptid idog ogli lika kan n ada ada seba sebaga gaiiPept Peptid idog oglik likan an ada ada di dala dalam m lapi lapisa san n tung tungga gal; l; komp kompon onen enlapisa lapisan n kaku kaku sebela sebelah h dalam dalam;;
utama merupakan >50% jumlahnya sedikit, merupakan berat kering pada beberapasekitar 10% berat kering sel bakteri Tidak ada asam tekoat Asam tekoat terhadap Lebih rentan Kurang rentan
Kerentanan penisilin Pertumbuhan dihambat oleh Pertumbuhan dihambatPertumbuhan tidak zat-zat warna dasar, dengan nyata dihambat misalnya ungu kristal Persyaratan nutrisi Relative rumit pada banyakRelative sederhana spesies Resistensi terhadap Lebih resisten Kurang resisten gangguan fisik
begitu
Dinding sel bakteri gram negative mengandung peptidoglikan jauh lebih sedikit, dan peptidoglikan ini mempunyai ikatan silang yang jauh kurang ektensif dibandingkan dengan yang dijumpai pada dinding bakteri gram positif. Karenanya, maka pori-pori pada peptidoglikan bakteri gram negative tetap cukup besar sekalipun setelah perlakuan etanol sehingga memungkinkan ekstraksi kompleks UK-Y (Ungu Kristal Yodium). UK-Y terperangkap di dalam dinding, yang tampaknya mengurangi diameter pori-pori pada peptidoglikan dinding sel. Bila sel-sel gram positif diberi perlakuan dengan enzim lisozim untuk menyingkirkan dinding sel setelah pewarnaan dengan kompleks UK-Y, maka struktur yang dihasilkannya itu akan terwarnai oleh kompleks UK-Y. namun, mereka tidak mudah dipucatkan oleh etanol. Semua ini merupakan bukti bahwa dinding sel pada bakteri gram positif merupakan situs tempat zat warna ungu Kristal tertahan. BAB III Alat & Bahan 3.1 Alat dan Bahan 1. Biakan murni Azotobacter chroococcum dan Bacillus subtilis 2. Zat warna karbol gentian violet, fuchsin/safranin 3. Larutan lugol (I + K + air), alcohol 95%, minyak imersi 4. Gelas objek, Ose, Lampu spiritus, kertas saring 5. Mikroskop BAB IV Cara Kerja 4.1 Cara Kerja 1. Buat film seperti pada praktikum I 2. Tambahkan karbol gentian violet selama 3 menit
3. Cuci dengan air dengan mengalirkan air dari botol semprot 4. Tambahkan larutan lugol selama 1 menit 5. Tambahkan 2 – 3 tetes alcohol biarkan 30 detik sampai tidak ada zat warna yang larut 6. Cuci dengan air, tambahkan fuchsin/safranin selama 1 – 2 menit 7. Cuci dengan air, keringkan dengan kertas saring 8. Amati di bawah mikroskop dengan perbesaran lensa objek 100x 9. Catat dan gambar morfologi dan warna sel. Bakteri gram positif akan berwarna ungu, sedangkan gram negative akan berwarna merah. BAB V Hasil Pengamatan Pengecatan gram Spesies bakteri: Azotobacter chroococcum Bentuk: kokus Zat warna yang digunakan: (1) carbol gentian violet, (2) fuchsin Jenis gram: bakteri gram negative Hasil warna setelah dilihat dengan mikorskop: merah Bakteri hasil praktikum Bakteri dari website Spesies bakteri: Baccilus subtilis Bentuk bakteri: basilus Zat warna yang digunakan: (1) carbol gentian violet, (2) fuchsin Jenis gram: bakteri gram positif Hasil warna setelah dilihat dengan mikorskop: ungu Bakteri praktikum Bakteri dari website Dari hasil pengamatan di atas bakteri Azotobacter chroococcum memiliki bentuk kokus setelah diamati dengan mikroskop. Jika diambil dari website, bakteri Azotobacter chroococcum juga memiliki bentuk kokus, sehingga dapat diambil kesimpulan bahwa bakteri Azotobacter chroococcum memiliki bentuk kokus. Sedangkan dari hasil pengamatan bakteri Baccilus subtilis memiliki bentuk batang/basilus setelah diamati dengan mikroskop. Dibandingkan dengan yang diambil dari website, dapat dilihat bahwa bakteri Baccilus subtilis juga berbentuk batang/basilus sehingga dapat diambil kesimpulan bahwa bakteri Baccilus subtilis memiliki bentuk batang.
Dalam praktikum ini dapat juga kita ketahui jenis gram pada bakteri tersebut, apakah gram negative atau gram positif. Pada bakteri Azotobacter chroococcum, jenis gram-nya adalah gram negative. Hal ini disebabkan warna pada bakteri tersebut adalah merah. Padahal, jika kita dilihat pada cara kerja, pewarnaan yang pertama kali adalah penggunaan zat warna carbol gentian violet. Hal ini terjadi karena kehilangan warna carbol gentian violet ketika dicuci dengan dengan alcohol, dan sewaktu diberi pewarna kedua dengan zat warna fuchsin, tampak berwarna merah. Dapat diambil kesimpulan bakteri Azotobacter chroococcum termasuk bakteri gram negative karena bakteri tersebut tidak mampu mempertahankan warna ungu ketika dicuci dengan alcohol. Hal ini disebabkan oleh dinding sel bakteri tersebut yang lebih sedikit mengandung peptidoglikan dan dinding selnya lebih tipis, tetapi bakteri gram negative mengandung lipid, lemak atau substansi seperti lemak dalam persentase lebih tinggi. Perlakuan dengan alcohol terhadap bakteri gram negative menyebabkan terekstraksinya lipid sehingga memperbesar daya rembes atau permeabilitas dinding sel sel bakteri, sehingga zat warna ungu tidak dapat ditahan dan kahirrnya keluar dan tercuci alcohol. Hal yang berbeda terjadi pada bakteri Bacillus subtilis Pada bakteri Bacillus subtilis, jenis gram-nya adalah gram positif. Hal ini disebabkan warna pada bakteri tersebut adalah ungu. Hal ini terjadi karena warna ungu dapat ditahan saat pencucian dengan alkohol, dan sewaktu diberi pewarna kedua dengan zat warna fuchsin, bakteri tetap berwarna ungu. Dapat diambil kesimpulan bakteri Bacillus chroococcum termasuk bakteri gram positif karena bakteri tersebut mampu mempertahankan warna ungu ketika dicuci dengan alcohol. Hal ini disebabkan oleh dinding sel bakteri tersebut yang lebih banyak mengandung peptidoglikan dan dinding selnya lebih tebal, tetapi bakteri gram positif mengandung lipid, lemak atau substansi seperti lemak dalam persentase lebih rendah. Karena kandungan lipidnya lebih rendah, dinding sel bakteri gram positif menjadi terdehidrasi selama perlakuan dengan alcohol. Akibatnya ukuran pori-pori mengecil, permeabilitas berkurang, dan zat warna carbol gentian violet tidak dapat diekstraksi. Karena itu, pada pemberian zat warna yang kedua, yaitu fuchsin, zat warna tidak dapat memasuki dinding sel bakteri, sehingga bakteri tetap berwarna ungu. Dari hasil pengamatan, dapat kita lihat pola penataan pada bakteri. Pada bakteri Azotobacter chroococcum, pola penataan dari hasil praktikum adalah diplokokus, karena bakteri-bakteri tersebut berpasangan, hal ini sama dengan gambar yang diambil dari website, pola penataannya juga diplokokus. Dapat kita dilihat pada gambar dibawah bagaimana pola penataan diplokokus (gambar 1). Sedangkan pada bakteri Baccilus subtilis pola penataannya adalah rantai, karena bakteri tersebut berpasangan dan membentuk rantai. Sedangkan pada gambar yang diambil dari website, pola penataannya lebih mirip dengan pagar. Dapat dilihat pada gambar di bawah (gambar 2 dan 3) bagaimana pola penataan rantai dengan pagar pada bakteri berbentuk batang. Gambar 1 Gambar 2 Gambar 3 BAB VI Kesimpulan Bakteri Azotobacter chroococcum pada hasil praktikum termasuk bakteri gram negatif, sedangkan bakteri Bacillus subtilid termasuk bakteri gram positif. Bakteri Azotobacter chroococcum pada hasil praktikum memiliki bentuk kokus, sedangkan bakteri Bacillus subtilid memiliki bentuk batang. Bkteri Azotobacter chroococcum pada hasil praktikum memiliki pola penataan diplokokus, sedangkan bakteri Bacillus subtilid memiliki pola penataan rantai.
PENGAMATAN MORFOLOGI BAKTERI DENGAN PENGECATAN TUNGGAL BAB I Tujuan Praktikum 1.1 Tujuan Praktikum Adapun tujuan dari praktikum yang dilakukan adalah: Untuk melihat morfologi (bentuk susunan) bakteri dengan menggunakan satu macam zat warna BAB II TEORI 2.1 Morfologi Kasar Bakteri Sel bakteri amat beragam panjangnya; sel beberapa spesies dapat berukuran 100 kali lebih panjang daripada sel spesies yang lain. 2.1.1 Ukuran Satuan ukuran bakteri ialah micrometer yang setara dengan 1/1000mm. bakteri yang paling umum dipelajari di dalam praktikum mikrobiologi dasar berukuran kira-kira 0,5 – 1 x 2 – 5 µm. sebagai contoh, bakteri stafilokokus dan streptokokus yang berbentuk bola mempunyai diameter yang berkisar dari 0,75 sampai 1,25 µm. bentuk batang yang berukuran rata-rata seperti bakteri tifoid dan disentri mempunyai lebar 0,5 – 1 µm dan panjang 2 – 3 µm. Sel beberapa spesies bakteri amat panjang; panjangnya dapat melebihi 100 µm dan diameternya berkisar daro 0,1 – 0,2 µm. sekelompok bakteri yang dikenal sebagai mikoplasma, ukurannya khas amat kecil – demikian kecilnya sehingga hamper-hampir tak tampak di bawah mikroskop cahaya. Mereka juga pleomorfik; yaitu morfologinya amat beragam. Ukurannya berkisar dari 0,1 – 0,3 µm. Walaupun bakteri amat kecil ukurannya, namun dapat diukur dengan relative mudah serta tepat. Untuk tujuan ini, mikroskop dilengkapi dengan mikroskop ocular, suatu piringan yang diukir dengan garis-garis berjarak sama. Jarak antara garis-garis tersebut ditentukan sebelumnya dengan berpedomankan micrometer pentas, suatu alat yang berfungsi sebagai mistar pada kerja mikroskopis. Pemeriksaan bakteri melalui mikroskop yang dilengkapi mikroskop ocular akan menampakkan garis-garis yang sudah diketahui ukurannya di atas mikroorganisme yang diperiksa sedemikian rupa sehingga panjang dan lebar sel dapat ditentukan dengan mudah.
2.1.2 Bentuk Sel-sel individu bakteri dapat berbetnuk seperti elips, bola, batang, atau spiral. Masingmasing cirri ini penting dalam mencirikan morfologi suatu spesies. Sel bakteri yang berbentuk seperti bola atau elips dinamakan kokus. Kokus mucul dalam beberapa penataan yang khas tergantung pada spesiesnya. Sel berbentuk silindris atau batang dinamakan basilus. Ada banyak perbedaan dalam ukuran panjang dan lebar di antara berbagai spesies basilus. Ujung beberapa basilus tampak persegi, yang lain bundar, dan yang lain lagi meruncing atau lancip seperti ujung cerutu. Kadang-kadang basilus tetap saling melekat satu sama lainnya, ujung dengan ujung, sehingga memberikan penampilan rantai. Bakteri berbentuk spiral terutama dijumpai sebagai individu-individu sel yang tidak saling melekat. Tercakup di dalam kelompok morfologis ini adalah spiroketa, beberapa diantaranya menyebabkan penyakit yang berbahaya bagi manusia. Individu-individu sel dari spesies yang berbeda-beda menunjukkan perbedaan-perbedaan yang mencolok dalam hal panjang, jumlah, dan amplitudo spiralnya serta kekakuan dinding selnya. Sebagai contoh, beberapa spirilum berukuran pendek, spiralnya berpilin ketat; yang lain sangat panjang dan menunjukkan sederetan pelintiran dan lengkungan. Spiral yang pendek dan tidak lengkap disebut sebagai bakteri koma, atau vibrio. 2.2.3 Penataan Spesies-spesies tertentu bakteri menunjukkan adanya pola penataan sel, seperti berpasangan, gerombol, rantai atau filament. Pola penataan bakteri berbentuk spiral Pola Penataan Sel Bakteri Berbentuk Kokus Pola Penataan Sel Bakteri Berbentuk Batang Bakteri bersifat transparan dan berukuran sangat kecil sehingga tidak dapat dilihat dengan mata telanjang. Untuk mengetahui struktur, morfologi, dan sifat kimia bakteri, harus dilakukan pengecatan sel bakteri. Zat warna yang biasa dijadikan untuk mengecat bakteri adalah methylene blue, basic fuchsin, dan crystal violet. Zat warna ini menghasilkan ion warna (chromophore) yang bermuatan positif, sehingga bakteri yang bermuatan negative menarik chromophore kationik. Terdapat dua jenis zat warna yaitu zat warna asam dan basa. Zat warna basa, contohnya methylene blue (methylene+ chloride) sedangkan zat warna asam yang mempunyai chromophore anionic seperti eosin(sodium+ eosinate). Zat warna ini tidak dapat dipakai untuk mengecat bakteri. Waktu pengecatan bakteri antara 30 detik – 2 menit, tergantung pada afinitas zat warna. Beberapa pengecatan yang kita kenal ialah pengecatan tunggal atau sederhana dan pengecatan majemuk. Pengecatan tunggal ialah pengecatan yang menggunakan satu macam zat warna saja, misalnya fuchsin, crystal violet, atau methylene blue, sedangkan pengecatan majemuk ialah pengecatan yang menggunakan lebih dari satu macam zat warna. Dalam pengecatan majemuk kita kenal pengecatan Gram, Ziehl-Nielsen, Klein, Burn Gins, dan lain-lain. Pengecatan tunggal hanya bertujuan untuk melihat bentuk sel sedangkan pengecatan majemuk dapat membedakan karakteristik suatu morfologi. Sebelum melakukan pengecatan bakteri, dibuat terlebih dahulu film di atas gelas objek dari suspense bakteri. Tujuan pembuatan film adalah mematikan sel bakteri dengan cepat tanpa merusak morfologinya dan melekatkan sel bakteri ke permukaan objek.
BAB III Alat & Bahan 3.1 Alat dan Bahan 1. Biakan bakteri Azotobacter chroococcum & Bacillus subtilis 2. Zat warna carbol fuchsin/carbol gentian violet/methylene blue 3. Gelas objek, Ose, Lampu spiritus, Botol Semprot 4. Kertas saring 5. Minyak imersi 6. Mikroskop BAB IV Cara Kerja 4.1 Cara Kerja Pelaksanaan praktikum ini meliputi dua langkah, yaitu pembuatan film dan pengecatan. A. Pembuatan Film Pembuatan film berperan penting dalam pengamatan morfologi. Bakteri yang terlalu bertumpuk atau terlalu tipis di atas gelas objek akan menghasilkan gambaran yang kurang jelas di bawah mikroskop. Cara membuat film: 1. Bersihkan gelas objek dengan kapas beralkohol untuk menghasilkan lemak dan mikroba yang menempel, lalu keringkan di udara. 2. Buat lingkaran kecil di bagian bawah gelas objek untuk membatasi film dengan pensil gelas. 3. Ambil satu ose suspense bakteri secara aseptic, yaitu dengan membakar ose di atas lampu spiritus sampai memijar, kemudian dinginkan sebentar, lalu tempelkan pada bagian dalam dan tabung biakan sebelum mengambil suspense bakteri. 4. Buat film setipis mugnkin di atas gelas objek di dalam batasan lingkaran tadi. 5. Lakukan fiksasi dengan cara melakukan film langsung di atas api secara cepat dua sampai tiga kali. Maksudnya ialah untuk membunuh bakteri secara cepat sehingga tidak mengalami perubahan bentuk. Di samping itu fiksasi dapat melekatkan bakteri pada gelas objek. Langkah-langkah pembuatan film di atas senantiasa dilakukan sebelum kita melakukan pengecatan. B. Pengecatan:
1. Tambahkan salah satu zat warna di atas film dengan waktu yang sesuai, yaitu untuk carbol fuchsin 15 – 20” (detik), carbol geantin violet 30 – 45”, dan methylene blue 3- 5‘ (menit). 2. Buang zat warna tersebut lalu cuci dengan mengalirkan air menggunakan botol semprot untuk menghilangkan zat warna yang tidak terpakai, 3. Keringkan dengan kertas saring dengan cara ditempelkan perlahan ke atas film yang telah diwarnai. Jangan menggosok film tadi dengan kertas saring. 4. Tambahkan satu tetes minyak imersi 5. Amati di bawah mikroskop dengan perbesaran kuat (lensa objektif 100x) 6. Catat dan gambar morfologi bakteri. BAB V Hasil Pengamatan Pengecatan tunggal Spesies bakteri: Azotobacter chroococcum Zat warna yang digunakan untuk pengecatan tunggal pada bakteri ini adalah fuchsin Bakteri yang dilihat dengan mikroskop berwarna merah Bentuk bakteri: kokus Bakteri hasil praktikum Bakteri dari website Spesies bakteri: Baccilus subtilis Zat warna yang digunakan untuk pengecatan tunggal pada bakteri ini adalah carbol gentian violet Bakteri yang dilihat dengan mikroskop berwarna ungu Bentuk bakteri: basilus Bakteri praktikum Bakteri dari website Dari hasil pengamatan di atas bakteri Azotobacter chroococcum memiliki bentuk kokus setelah diamati dengan mikroskop. Jika diambil dari website, bakteri Azotobacter chroococcum juga memiliki bentuk kokus, sehingga dapat diambil kesimpulan bahwa bakteri Azotobacter chroococcum memiliki bentuk kokus. Sedangkan dari hasil pengamatan bakteri Baccilus subtilis memiliki bentuk batang/basilus setelah diamati dengan mikroskop. Dibandingkan dengan yang diambil dari website, dapat dilihat bahwa bakteri Baccilus subtilis juga berbentuk batang/basilus sehingga dapat diambil kesimpulan bahwa bakteri Baccilus subtilis memiliki bentuk batang.
Yang menjadi perbedaan di antara hasil pengamatan di praktikum dengan gambwr yang diambil dari website adalah warna bakteri. Hal ini dikarenakan penggunaan zat warna yang digunakan. Pada praktikum, bakteri Azotobacter chroococcum diberi pewarnaan dengan zat warna fuchsin sehingga pada saat diamati dengan mikroskop, warna bakteri tersebut adalah merah, karena zat warna fuchsin memberikan pengaruh warna merah pada proses pengecatan bakteri. Sedangkan dari gambar yang diambil dari website, warna bakteri adalah ungu, kemungkinan zat warna yang digunakan adalah carbol gentian violet. Hal yang sama terjadi pada warna bakteri Baccilus subtilis hasil pengamatan di praktikum dan gambar yang diambil dari website. Warna bakteri hasil pengamatan di praktikum adalah ungu karena zat warna yang digunakan untuk pengecatan bakteri tersebut adalah carbol gentian violet. Seperti yang kita ketahui, zat warna carbol gentian violet akan memberikan pengaruh warna ungu pada proses pengecatan. Sedangkan warna bakteri pada gambar dari website adalah merah. Hal ini disebabkan penggunaan zat warna berbeda. Pada gambar website, zat warna pada bakteri yang digunakan fuchsin yang memberikan pengaruh warna merah pada proses pengecatan, sehingga bakteri tersebut berwarna merah. Dari hasil pengamatan, dapat kita lihat pola penataan pada bakteri. Pada bakteri Azotobacter chroococcum, pola penataan dari hasil praktikum adalah diplokokus, karena bakteri-bakteri tersebut berpasangan, hal ini sama dengan gambar yang diambil dari website, pola penataannya juga diplokokus. Dapat kita dilihat pada gambar dibawah bagaimana pola penataan diplokokus (gambar 1). Sedangkan pada bakteri Baccilus subtilis pola penataannya adalah rantai, karena bakteri tersebut berpasangan dan membentuk rantai. Sedangkan pada gambar yang diambil dari website, pola penataannya lebih mirip dengan pagar. Dapat dilihat pada gambar di bawah (gambar 2 dan 3) bagaimana pola penataan rantai dengan pagar pada bakteri berbentuk batang. Gambar 1 Gambar 2 Gambar 3 BAB VI KESIMPULAN Bakteri Azotobacter memiliki bentuk bulat, sedangkan bakteri Bacilluc subtilis memiliki bentuk batang. Pola penataan pada bakteri berbeda-beda, pada bentuk kokus pola penataan ada lima, yaitu diplokokus, streptokokus, tetrakokus, stafilokokus, dan sarsina. Sedangkan pada bakteri berbentuk batang, pola penataan ada tiga, yaitu berbentuk rantai, pagar, dan roset.
Pengecatan Gram Pada Bakteri Kebanyakan sel bakteri tidak berwarna, sehingga jika dilarutkan dalam air dan diperlihatkan di bawah mikroskop tidak memperlihatkan warna kontras dengan medium disekelilingnya. Beberapa zat yang digunakan untuk mengamati struktur bagian dalam sel. Dalam pewarnaan mikroba, dapat digunakan satu jenis warna, cara ini disebut pewarnaan sederhana. Zat-zat warna yang biasa digunakan untuk pewarnaan bekteri dapat dibedakan atas beberapa golongan yaitu: pewarnaan sederhana, pewarnaan diferensial, pewarnaan strukturan dan pewarnaan untuk menguji adanya komponentertentu di dalam sel (Anonim, 2007) Karakteristik taksonomi penting bakteri adalah reaksi mereka terhadap pewarnaan gram. Pewarnaan gram menjadi penting karena reaksi gram berhubungan dengan sifat morfologi lain dalam bentuk hubungan filogenik. Organisme yang berpotensi gram positif mungkin hanya dapat dilihat dengan pewarnaan gram pada kondisi lingkungan yang sesuai dan pada biakan muda. Prosedur pewarnaan gram dimulai dengan pemberian pewarna basa, kristal violet. Larutann iodine kemudian ditambahkan; semua bakteri akan diwarnai biru pada fase ini. Sel kemudian diberi alkohol. Sel gram positif akantetap mengikat senyawa kristal violet-iodine, tetap berwarna biru; sel gram negatif warnanya hilang oleh alkohol. Sebagai langkah terakhir, counterstain (misalnya Safranin pewarna merah) ditambahkan, sehingga sel gram negatif yang tidak berwarna, akan mengambil warna kontras; sedangkan sel gram positif terlihat dalam warna biru (Jawetz, etc. 2001).
Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode empiris untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, gram-positif dan gram-negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram (1853–1938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae. Bakteri gram-negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram-positif akan mempertahankan warna ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram-negatif tidak. Pada uji pewarnaan Gram, suatu pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu, yang membuat semua bakteri gram-negatif menjadi berwarna merah atau merah muda. Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur dinding sel mereka. Banyak spesies bakteri gram-negatif yang bersifat patogen, yang berarti mereka berbahaya bagi organisme inang. Sifat patogen ini umumnya berkaitan dengan komponen tertentu pada dinding sel gram-negatif, terutama lapisan lipopolisakarida (dikenal juga dengan LPS atau endotoksin). *BAB I* *PENDAHULUAN* 1.1 Latar Belakang Bakteri memiliki beberapa bentuk yaitu basil (tongkat), kokus, dan spirilum. Bakteri yang berbentuk tongkat maupun kokus dibagi menjadi beberapa macam. Pada bentuk basil pembagiannya yaitu basil tunggal, diplobasil, dan tripobasil. Sedangkan pada kokus dibagi monokokus (satu buah bakteri berbentuk kotak), diplococcus, sampai staphylococcus (bentuknya mirip buah anggur. Khusus pada spirul hanya dibagi 2 yaitu
setengah melengkung dan tidak melengkung. Bakteri j uga dapat dibedakan melalui teknik pewarnaan gram. Teknik pewarnaan gram tersebut dapat menghasilkan warna merah dan ungu. Bakteri gram negatif ditandai dengan pewarnaan ungu sedangkan yang positif berwarna merah (Textbook, 2008). Hal ini bertujuan untuk memberikan warna pada bakteri pada akhirnya dapat diidentifikasi dengan mudah. Selain itu, ada endospore yang bisa diwarnai. Endospora adalah organisme yang dibentuk dalam kondisi yang stres karena kurang nutrisi, yang memiliki kemungkinan untuk tetap berlanjut di lingkungan sampai kondisi menjadi baik (Ncbi, 2008). Teknik pewarnaan gram haruslah sesuai prosedur karena dapat mengakibatkan kesalahan identifikasi data apakah gram positif atau gram negatif sehingga diperlukan adanya praktikum ini dilakukan agar mengetahui jalannya mekanisme pewarnaan gram. 1.2 Perumusan Masalah Rumusan masalah adalah faktor-faktor apa sajakah yang berpengaruh terhadap keberlangsungan pewarnaan pada bakteri dan endospora, bagaimanakah karakteristik dari ketiga spesimen, serta bagaimana teknik pengecatan
1.3 Tujuan Tujuan praktikum adalah mempelajari proses pewarnaan struktur sel bakteri, mempelajari bentuk-bentuk dan struktur sel bakteri dan memahami pentingnya setiap langkah dalam prosedur pewarnaan dan memahami reaksi kimia di dalam prosedur tersebut *BAB II* *TINJAUAN PUSTAKA* Metode pengecatan pertama kali ditemukan oleh Christian gram pada tahun 1884. Dengan metode ini, bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua, yaitu bakteri gram positif dan gram negatif yang didasarkan dari reaksi atau sifat bakteri terhadap cat tersebut. Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya sehingga pengecatan gram tidak bisa dilakukan pada mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma sp. (Tryana, S.T, 2008). Struktur bakteri terbagi menjadi dua yaitu: 1. Struktur dasar (dimiliki oleh hampir semua jenis bakteri) Meliputi: dinding sel, membran plasma, sitoplasma, ribosom, DNA, dan granula penyimpanan 2. Struktur tambahan (dimiliki oleh jenis bakteri tertentu) Meliputi kapsul, flagelum, pilus, fimbria, klorosom, Vakuola gas dan endospora Gambar Bakteri Gram Positip dan Bakteri Gram Negatif (Edukasi, 2008). Staphylococcus adalah bakteri Gram-positif yang berbentuk bola. Bakteri ini ada yang berkoloni dan berbentu seperti buah buah anggur. Pada tahun 1884, Rosenbach menjelaskan ada dua jenis warna staphylococci yaitu: Staphylococcus Aureus yang berwarna kuning dan Staphylococcus albus yang berwarna putih. Beberapa karakterististik yang dimiliki Staphylococcus Aureus diantaranya hemolytic pada darah agar, catalase-oxidase-positif dan negatif, dapat tumbuh pada suhu berkisar 15 sampai 45 derajat dan lingkungan NaCl pada konsentrasi tinggi hingga 15 persen dan
menghasilkan enzim coagulase. Selain itu,biasanya S. Aureus merupakan patogen seperti bisul, styes dan furunculosis beberapa infeksi (radang paru-paru, radang kelenjar dada, radang urat darah, meningitis, saluran kencing osteomyelitis dan endocarditis serta menyebabkan keracunan makanan yaitu dengan melepakan enterotoxins menjadi makanan sehingga menjadi toksik dengan melepasan superantigens ke dalam aliran darah (Kenneath, 2008). Bacillus subtilis merupakan bakteri gram-positif yang berbentuk batang,dan secara alami sering ditemukan di tanah dan vegetasi. Bacillus subtilis tumbuh di berbagai mesophilic suhu berkisar 25-35 derajat Celsius. Bacillus subtilis juga telah berevolusi sehingga dapat hidup walaupun di bawah kondisi keras dan lebih cepat mendapatkan perlindungan terhadap stres situasi seperti kondisi pH rendah (asam), bersifat alkali, osmosa, atau oxidative kondisi, dan panas atau etanol Bakteri ini hanya memilikin satu molekul DNA yang berisi seperangkat set kromosom. DNAnya berukuran BP 4214814 (4,2 Mbp) (TIGR CMR). 4,100 kode gen protein. Beberapa keunggulan dari bakteri ini adalah mampu mensekresikan antibiotik dalam jumlah besar ke luar dari sel (Scetzer, 2006). Menurut Kenneath tahun (2008), Escherichia coli termasuk dalam famili Enterobacteraceae yang termasuk gram negatif dan berbentuk batang yang fermentatif. E. coli hidup dalam jumlah besar di dalam usus manusia, yaitu membantu sistem pencernaan manusia dan melindunginya dari bakteri patogen. Akan tetapi pada strain baru dari E.coli merupakan patogen berbahaya yang menyebabkan penyakit diare dan sindrom diare lanjutan serta hemolitik uremic (hus). Peranan yang mengguntungkan adalah dapat dijadikan percobaan limbah di air, indikator pada level pencemaran air serta mendeteksi patogen pada feses manusia yang disebabkan oleh Salmonella typhi. (Mikrolibrary, 2008). Endospore adalah organisme yang dibentuk dalam kondisi yang stres karena kurang nutrisi, yang memiliki kemungkinan untuk tetap berlanjut di lingkungan sampai kondisi menjadi baik (Ncbi, 2008). Bakteri juga dapat dibedakan melalui teknik pewarnaan gram. Teknik pewarnaan gram tersebut dapat menghasilkan warna merah dan ungu. Bakteri gram negatif ditandai dengan pewarnaan ungu sedangkan yang positif berwarna merah (Textbook, 2008). BAB III *METODE PENELITIAN* 3.1 Waktu dan Tempat Praktikum “Pewarnaan Sel (Bakteri dan Jamur) dan Pewarnaan dan Endospora” dilaksanakan pada hari Rabu 24 September 2008 pukul 13.00-16.00 WIB di Laboratorium Mikrobiologi, Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Brawijaya, Malang.
*3.2 Cara Kerja*
*3.2.1 Pewarnaan Bakteri* Gelas objek dan gelas penutup dibersihkan dengan alkohol 70% kemudian ditetesi dengan aquades steril. Kemudian dibuat apusan dari biakan miring dan disuspensikan sampel sampai homogen, lalu difiksasi di atas api bunsen. Apusan bakteri yang telah jadi
ditetesi gram A selama 1 menit, dicuci denan air mengalir, dan dikeringanginkan. Kemudian ditetesi gram B selama 1 menit, dicuci dengan air mengalir, dan dikeringanginkan. Kemudian ditetesi gram D selama 30 detik, dicuci dengan air mengalir, dan dikeringanginkan. Lalu diamati dengan mikroskop dengan perbesaran 1000 x, kemudian dicatat bentuk dan warna sel bakteri
*3.2.2 Pewarnaan Endospora* Gelas objek dan gelas penutup dibersihkan dengan alkohol 70% kemudian ditetesi dengan aquades steril. Kemudian dibuat apusan dari biakan miring dan disuspensikan sampel sampai homogen, lalu difiksasi di atas api bunsen. Apusan bakteri digenangi dengan pewarna malakit hijau lalu dipanaskan preparat di atas penangas air mendidih sampai muncul uap air (10 menit) dan dijaga jangan sampai pewarna kering. Kemudian dicuci dengan air mengalir, dikeringanginkan, diwarnai dengan safranin (1-2 menit) lalu dicuci dengan air mengalir dan dikeringanginkan lagi. Kemudian diamati ada tidaknya spora dalam sel (bentuk, letak, ukuran terhadap sel vegetatif) menggunakan mikroskop dengan perbesaran. BAB IV *HASIL DAN PEMBAHASAN* Pewarnaan Bakteri dan Endospora dilakukan dengan menggunakan 8 isolat bakteri untuk 8 kelompok yang bertujuan untuk mengidentifikasi bentuk kedelapa bakteri tersebut dan termasuk dalam bakteri gram positif atau negatif dan letak endosporanya. Proses perwarnaan dilakukan dengan membersihkan gelas objek dan gelas penutup dengan alkohol 70% untuk sterilisasi agar tidak kontaminasi. Kemudian ditetesi aquades steril untuk meletakkan bakteri dan dibuat preparat apusan dari biakan miring agar mudah diamati dan difiksasi. Sampel disuspensikan sampai homogen agar bakteri dapat menyebar di gelas objek dan tidak menumpuk. Kemudian difiksasi di atas api bunsen yang bertujuan untuk membunuh bakteri secara cepat dengan tidak merubah bentuk dan struktur bakteri,melekatkan bakteri di atas objek gelas dan meningkatkan sifat salinitas pewarna (Tortora, 2002). Proses pewarnaan bakteri dengan cara apusan bakteri yang telah dibuat kemudian ditetesi dengan gram A selama 1 menit, gram B selama 1 menit, gram C selama 1 menit, dan gram D selama 30 detik. Setelah perlakuan pewarnaan, preparat selalu dicuci dengan air mengalir dan dikeringanginkan, kecuali setelah pewarnaan gram B preparat dicuci dengan gram C kemudian dikeringanginkan. Hal ini dilakukan karena gram C mengandung alkohol yang bertujuan untuk melunturkan cat sebelumnya. Gram A mengandung kristal violet yang berwarna ungu merupakan cat primer yang akan mewarnai bakteri, pewarnaan dilakukan 1 menit agar cat ini dapat melekat sempurna pada dinding bakteri. Gram B mengandung garam iodin merupakan cat mordan yang berfungsi melekatkan atau memfiksasi cat primer yang diserap bakteri, dilakukan selama 1 menit agar pengikatan warna oleh bakteri menjadi lebih kuat. Gram C mengandung alkohol sehingga tidak berwarna dan berfungsi untuk melunturkan cat sebelumnya, dilakukan selama 1 menit agar cat dapat luntur secara sempurna dan tidak ada yang tersisa. Gram D mengandung safranin sehingga bewarna merah yang merupakan cat sekunder atau kontras berfungsi untuk memberikan warna bakteri non target, dilakukan selama 30 detik agar bakteri yang catnya telah luntur dapat terwarnai (Heritage, 2000). Pencucian dengan air mengalir dimaksudkan agar cat dapat hilang secara sempurna dan tidak tersisa, dikeringanginkan bertujuan agar warna melekat pada bakteri dan segera kering sehingga bila diwarnai lagi warna sebelumnya tidak tercampur
dengan warna yang baru. Kemudian dilihat di bawah mikroskop dengan perbesaran 1000 x agar dapat mengamati bentuk dan warna sel bakteri. Bakteri gram positif akan berwarna ungu, sedangkan bakteri gram negatif akan berwarna merah. Proses pewarnaan endospora dilakukan setelah fiksasi dan setelah dibuat apusan preparat. Kemudian preparat digenangi malakit hijau yang berfungsi sebagai pewarna primer yang digunakan untuk melumuri fiksasi panas dan dipanaskan sampai menggepul. Preparat dipanaskan di atas penangas air mendidih sampai timbul uap air (10 menit) bertujuan membantu warna menembus dinding endospora dan dijaga jangan sampai pewarna kering. Kemudian dicuci dengan air mengalir dan dikeringanginkan bertujuan menghilangkan malakit hijau dari seluruh bagian sel endospora. Pewarnaaan dengan safrani (1-2 menit) bertujuan sebagai counterstain yang digunakan untuk melumuri bagian warna dari sel yang lain daripada endospora (Prescot, 2002). Kemudian dicuci dengan air mengalir agar warna safranin luntur dan dikeringanginkan agar warna cepat kering.
