EJEMPLOS DE FASES LIGADAS
CARACTERÍSTICAS DE LA FASE MÓVIL
Fuerza
CARACTERÍSTICAS DE LA FASE MÓVIL
Fuerza
CARACTERÍSTICAS CARACTERÍSTICAS DE LA FM: FUERZA Y SELECTIVIDAD Existen varios índices para cuantificar la polaridad de los solventes: Parámetro de solubilidad de Hildebrand (δ) Índice de polaridad de Snyder (P´)
CARACTERÍSTICAS DE LA FASE MÓVIL: POLARIDAD La interacción total entre una molécula de FM y una mólecula de soluto es el resultado de las siguientes interacciones:
CARACTERÍSTICAS DE LA FASE MÓVIL: POLARIDAD
La polaridad de los solventes se ha definido de varias maneras. En HPLC el parámetro más usado es P' , basado en datos experimentales de solubilidad reportados por Rohrschneider.
El número de polaridad de Snyder ( P´) se define como:
A través de cada una de las constantes de reparto se mide la tendencia a recibir protones (basicidad), a darlos (acidez) y a generar momentos dipolares.
FUERZA Y SELECTIVIDAD DE SOLVENTES
TRIÁNGULO DE SELECTIVIDADES DE SNYDER
Los mayores cambios en la selectividad de la FM resultan cuando las propiedades de los solventes cambian fuertemente.
En cada caso, las moléculas que desarrollen mayor interacción con la FM, disminuirán su valor de k´(menor retención).
SELECTIVIDAD DE SOLVENTES
Selectividad por tipos de solventes en RPLC (a) 50% MeOH-agua; (b) 25% THF-agua. Compuestos: (1), p-nitrofenol; (2), p-dinitrobenceno; (3), nitrobenceno; (4), benzoato de metilo
PARÁMETRO DE POLARIDAD P´
Un
cambio
de
P' de dos unidades provoca (aproximadamente) una variación de 10 veces en el valor de k’, lo cual permite calcular su variación en
NPLC con la siguiente expresión:
Para RPLC esta expresión se transforma en:
k 1 y k 2 son los valores inicial y final de k' para un dado soluto, y P 1 y P 2 se refieren a los valores iniciales y finales de P ´
OTROS PARÁMETROS DE POLARIDAD
PROPIEDADES DE LAS FM MÁS COMUNES EN HPLC
Modo de separación más empleado en HPLC
CROMATOGRAFÍA EN FASE INVERSA (RPLC)
CROMATOGRAFÍA EN FASE INVERSA (RPLC)
•
•
RETENCIÓN EN CROMATOGRAFÍA EN FASE INVERSA
FM Polar
FE No Polar
Hidrofóbico (No Polar)
EFECTOS DE LA FASE MÓVIL
ELECCIÓN DEL % DE B.
ELECCIÓN DEL % DE B
ELECCIÓN DEL % DE B kw es el valor teórico de k´ para agua pura como FM, S es una constante para un compuesto dado φ es la fracción
en volumen de solvente orgánico en la FM.
Para compuestos de PM<500 Da, S = 4.
k´ aumenta por un factor de 2 a 3 por una disminución del 10% B.
FUERZA DE LA FASE MÓVIL No sólo hay que tener en cuenta la fuerza del solvente con respecto a su influencia sobre %B sino que también tiene importancia el tipo de solvente utilizado.
DIAGRAMA DE COMPARACIÓN DE SOLVENTES EN RPLC
EFECTO DE LA FE Aparte de la fase móvil, las retenciones presentan dependencia respecto a la fase estacionaria.
La retención de los analitos depende de tres características de la columna: tipo de fase enlazada, concentración y superficie.
Si se analiza el tipo de fase enlazada la retención de analitos no polares y no iónicos sigue el siguiente orden:
Sílica desnuda (débil) < < ciano < C1 (TMS) < C3 < C4 < fenilo < C8 ≈ C18 (fuerte)
EFECTO DE LA LONGITUD DE LA CADENA EN LA EFICIENCIA DE UNA COLUMNA DE RPLC
CROMATOGRAFÍA DE FASE NORMAL (NPLC)
ASPECTOS GENERALES
La retención en NPLC se describe bien por un proceso de desplazamiento Se basa en que la superficie de la sílice está inicialmente cubierta por una monocapa de moléculas de FM adsorbida. Para que una molécula de soluto pueda quedar retenida, deberá desplazar previamente e las moléculas de FM adsorbida. El equilibrio vendrá dado por:
Y(m) + nM(s) ⇔ Y(s)+ nM(m)
MECANISMO DE RETENCIÓN
La figura muestra el desplazamiento de un soluto relativamente no polar (clorobenceno) en una FM menos polar (cloruro de metileno). Una o más moléculas pre-adsorbidas de CH2Cl2 son desplazadas de la FE y regresan a la FM.
MECANISMO DE RETENCIÓN
Snyder obtuvo una expresión para la retención en NPLC en función de la "fuerza del solvente":
es un parámetro que refleja la polaridad de la FM. As es el área superficial del soluto. β es la relación de fases. Δ2 es un parámetro de segundo orden que sirve para corregir por falta de linealidad del modelo asumido.
PAPEL DEL SOLVENTE
log
K ´ solv1 K ´ solv2
=
As ε
°
solv2
−ε °
solv1
PAPEL DEL SOLVENTE
⊠
⊠
⊠
⊠
SELECTIVIDAD DE LA FM El parámetro eº para mezclas se puede calcular a partir de los valores de eº para los solventes puros. Para la obtención de FM de diferente selectividad y similares valores of k´ existen nomógrafos. A diferencia de RPLC, estos nomógrafos dependen de la FE.
Nomógafos para NPLC y sílice “desnuda” como FE.
SELECTIVIDAD DE LA FE
(1) 2-aminonaftaleno (2) 2,6-dimetilquinoleína (3) 2,4-dimetilquinoleína (4) 4-nitrofenol (5) quinoleína (6) isoquinoleína
Condiciones: Columna de 150 × 4.6-mm de sílica (FE) (dp = 5-μm) FM: acetato de etilo (B)-ciclohexano (A) Temperatura ambiente Caudal: 2.0 mL/min.
HPLC
(problemas)
HPLC: BOMBAS
HPLC: INYECTORES
HPLC: COLUMNAS
PRE-COLUMNAS
RF
La caracterización de los componentes separados se lleva a cabo por el denominado d R
distancia recorrida por el soluto =
distancia recorrida por el frente del solvente
=
d M
Los valores de RF pueden variar desde 1, para los analitos que no se retrasen, hasta valores próximos a cero. Ayudan a la identificación de una determinada especie, si bien, la coincidencia en los R F no deberá tomarse como prueba inequívoca de identificación
Con objeto de minimizar las diferencias entre los valores de los RF, se ha propuesto utilizar el parámetro R X
distancia recorrida por el soluto =
distancia recorrida por el patrón
d R =
d P
A pesar de la coincidencia en los valores de R x, la identificación plena de un compuesto deberá hacerse de forma específica, con técnicas auxiliares, como espectroscopia IR, espectrometría de masas, RMN, etc.
PRINCIPIOS BÁSICOS
k = ´
t R ´
t M
=
1
´
RF RF
N = 16
d R W
2
