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PRUEBAS BIOQUÍMICAS
INDOL Introducción El indol es uno de los productos de degradación metabólica del aminoácido triptofano. triptofano. Las bacterias que poseen la triptofanasa son capaces de hidrolizar y desaminar el triptofano con producción producción de indol, ácido pirúvico y amoníaco. amoníaco. La producción de indol es una característica característica importante para la identificación de muchas especies de m.o.
Principio La prueba de indol está basada en la formación formación de un complejo rojo cuando el indol reacciona con el grupo aldehído del p-dimetilaminobenzald p-dimetilaminobenzaldehído. ehído. Este es el principio activo del reactivo de Kovacs Kovacs descrito más adelante. El medio de cultivo utilizado debe ser rico en triptofano.
Medios y reactivos Caldo triptofano
Peptona eptona o diger digerido ido pancr pancreá eátic tico o de de case caseína ína Cloruro de sodio
0,5 g
Agua destilada
100 ml
Reactivo de Kovacs
Alcohol amílico o isoamílico
150 ml
p-d p-dime imetila tilam mino inobenz benzal ald dehíd ehído o
10 g
HCl conc.
2g
50 ml
Procedimiento Inocular el caldo triptofano con el m.o. en estudio e incubar a 35°C durante 18 a 24 horas. Al finalizar este período, añadir 5 gotas de reactivo por la pared interior del tubo. Interpretación El desarrollo de un color rojo intenso en la interfase del reactivo y el caldo, segundos después de añadir el reactivo indica la presencia de indol y un resultado de la prueba positiva.
Controles Escherichia coli: positivo Klebsiella pneumoniae: negativo (mayoría de las cepas)
ROJO DE METILO - VOGES-PROSKAUER (RM VP) Principio Una de las características taxonómicas taxonómicas que se utilizan para identificar los diferentes géneros de enterobacterias lo constituyen el tipo y la proporción de productos de fermentación que se originan por la fermentación de la glucosa. Se conocen dos tipos generales: la fermentación ácido-mixta y la fermentación fermentación del 2,3 butanodiol. En E n la fermentación fermentación ácido mixta se forman fundamentalmente fundamentalmente láctico, acético y succínico, además de etanol, H 2 y CO2. En la vía del butanodiol se forman cantidades menores menores de ácido (acetato y succinato) y los principales productos son el butanodiol, etanol, H2 y CO2. El rojo de metilo es un indicador de pH con un intervalo de viraje entre 6,0 (amarillo) y 4,4 (rojo), que se utiliza para visualizar la producción de ácidos por la vía de fermentación ácido mixta. El acetil-metil-carbinol (o acetoína) es un producto intermediario intermediario en la producción de butanodiol. En medio alcalino y en presencia de oxígeno la acetoína es oxidada a diacetilo. Este se revela en presencia de alfa-naftol dando un color rojo-fucsia
Medios y reactivos Caldo RM/VP
Peptona
7g
Glucosa
5g
Fosfa Fosfato to dipo dipotás tásico ico 5 g Agua destilada
1L
pH = 6,9 ± 0,1
Indicador de pH rojo de metilo
Rojo de de me metilo
0,1 g en 30 300 mL mL de de et etanol 95 95°
Agua destilada
200 ml
Revelador VP
alfa-naftol (solución al 5% en etanol 95°) Solución de KOH al 40% en agua destilada
Procedimiento Inocular el caldo RMVP con un cultivo puro de no más de 24 horas del m.o. en estudio. Incubar a 35°C durante 48 horas. Luego de finalizado el tiempo de incubación transferir 1 mL del caldo a un tubo limpio para VP. En el caldo restante revelar RM agregando unas 4 - 8 gotas del indicador rojo de metilo. Para revelar VP agregar 0,6 ml (10 gotas) de alfa-naftol al 5% y 1 gota de KOH al 40%. Agitar cuidadosamente para exponer el medio al oxígeno atmosférico y dejarlo reposar durante 10 a 15 minutos.
Interpretación La prueba RM es positiva si se desarrolla un color rojo estable. Esto indica que la producción de ácido es suficiente para producir el viraje del indicador y el m.o. fermentó la glucosa por la vía de ácido mixta. Un color anaranjado, intermedio entre el rojo y el amarillo no es considerado como positivo. La prueba VP es positiva si se desarrolla un color rojo-fucsia luego de 15 minutos, que indica la presencia de diacetilo, producto de oxidación de la acetoína.
Controles RM positivo, VP negativo: Escherichia coli RM negativo, VP positivo: Enterobacter aerogenes
UTILIZACIÓN DE CITRATO Introducción La utilización de citrato como única fuente de carbono es una prueba útil en la identificación de enterobacterias.
Principio La utilización de citrato como única fuente de carbono se detecta en un medio de cultivo con citrato como única fuente de carbono mediante el crecimiento crecimiento y la alcalinización del medio. Este aumento de pH se visualiza con el indicador azul de bromotimol bromotimol que vira al alcalino a pH 7,6.
Medios y reactivos Medio de Simmons
Fosfato diácido de amonio Fosfato dipotásico
1g
Cloruro de sodio
5g
1g
Citrato de sodio
2g
Sulfato de magnesio
0,2 g
Agar
15 g
Azul de bromotimol
0,08 g
Agua destilada c.s.p.
1L
pH = 6,9
Procedimiento Se inocula la superficie del agar inclinado i nclinado con una sola estría en el pico. Utilizar un cultivo de 24 horas en un medio sólido y cuidando no arrastra a rrastrarr medio de cultivo, ya que se pueden producir falsos positivos positivos por crecimiento crecimiento a partir del medio de cultivo del inóculo. Incubar a 35°C durante 4 días.
Interpretación El ensayo es positivo cuando se observa crecimiento a lo largo de la estría, acompañado o no de un viraje del indicador i ndicador al azul.
Controles Positivo: Klebsiella spp. Negativo: E.coli
DESCARBOXILACIÓN DE LISINA Y ORNITINA Introducción La descarboxilación de aminoácidos es llevada a cabo por descarboxilasas y se forman aminas y CO 2. Cada descarboxilasa es específica para un aminoácido y la reacción es completa e irreversible. Los aminoácidos
ensayados habitualmente habitualmente para la identificación son lisina, ornitina y arginina.
Principio El caldo descarboxilasa de Moeller es el medio base más comúnmente usado para la determinación de las descarboxilasas en enterobacterias. Se prepara un tubo con el medio conteniendo el aminoácido a ensayar y un tubo control con medio base sin aminoácido. Se cubren con una capa de aceite mineral (vaselina líquida) para hacer el medio anaerobio de manera que ocurra la fermentación de la glucosa gl ucosa que contiene. Durante las primeras etapas de la incubación incubación en ambos tubos se observará observará viraje del del indicador de pH del medio al ácido, por la fermentación de la glucosa. Luego, si el aminoácido es descarboxilado, se forman aminas que provocan un retorno al color original del medio o un viraje al alcalino.
Medios y reactivos Base de Moeller
Peptona
5g
Extracto de carne
5g
Glucosa
0,5 g
Piridoxal
0,005 g
Púrpu Púrpura ra de Bro Bromoc mocre reso soll 0,01 0,01 g Rojo de cresol
0,005 g
Agua destilada c.s.p.
1L
pH final = 6,0
Caldo Lisina o Ornitina de Moeller: Preparar igual al medio base y agregar 10 g del aminoácido (1% de concentración final de la forma levo, utilizar el doble si se usa la forma dl del aminoácido ya que solo la levo es activa). Agregar aceite mineral para formar una capa de 1 cm de espesor.
Procedimiento Inocular con un cultivo puro de 24 horas un tubo de base de Moeller con el aminoácido a estudiar (lisina u ornitina) y un tubo de la base (control sin aminoácido). Incubar a 35°C durante 18 a 24 horas.
Interpretación El ensayo puede ser leído si en el tubo control se observa crecimiento y viraje del indicador al amarillo indicando que se dio di o la fermentación de la glucosa y un descenso de pH que permite la activación de las descarboxilasas. El retorno al color azul-violeta en el tubo que contiene el aminoácido indica una reacción positiva debida a la liberación de aminas por descarboxilación.
Controles Descarboxilación Descarboxilación de lisina positiva: Enterobacter aerogenes Descarboxilación Descarboxilación de lisina negativa: Enterobacter Enterobacter cloacae Descarboxilación Descarboxilación de ornitina positiva: Serratia spp Descarboxilación Descarboxilación de ornitina negativa: Klebsiella spp.
FENILALANINA DESAMINASA Introducción La fenilalanina es un aminoácido que por desaminación oxidativa forma un cetoácido, el ácido fenilpirúvico. Sólo los géneros Proteus y Providencia poseen la fenilalanina desaminasa, lo que permite diferenciarlas diferenciarlas del resto de las Enterobacterias.
Principio La prueba de la fenilalanina se basa en la detección del ácido fenilpirúvico luego del desarrollo del m.o. en un medio que contiene fenilalanina. Para eso se agrega cloruro férrico que forma un complejo de color verde con el ácido fenilpirúvico. El medio de cultivo no puede contener extractos extractos de carne o peptonas por su contenido variable en fenilalanina.
Medios y reactivos Agar fenilalanina
DL fenilalanina
2g
Extracto de levadura
3g
Cloruro de de so sodio
5g
Fosfato de sodio
1g
Agar
12 g
Agua destilada c.s.p.
1L
pH = 7,3
Cloruro férrico Cloruro férrico
10 g
HCl concetrado Agua destilada c.s.p.
2,5 g 100 ml
Procedimiento Inocular el agar en pico de flauta con un cultivo puro de 24 horas e incubar a 35°C durante 18-24 horas. Luego de transcurrido el período de incubación, agregar 4 o 5 gotas de reactivo de cloruro férrico, directamente sobre la superficie del agar.
Interpretación La aparición inmediata de un color verde intenso indica la presencia de ácido fenilpirúvico y una prueba positiva.
Controles Positivo: Proteus Negativo: Escherichia coli
TSI (TRIPLE SUGAR IRON) Introducción El agar triple azúcar hierro es un medio nutriente y diferencial diferencial que permite estudiar la capacidad de producción de ácido y gas a partir de glucosa, sacarosa y lactosa en un único medio. También permite la detección de la producción de H2S. Es un medio útil para la identificación de enterobacterias.
Principio El agar se prepara en forma de pico de flauta. Esto determina que existan dos cámaras de reacción dentro del mismo tubo. La porción inclinada (pico) expuesta en toda su superficie al oxígeno es aerobia y la porción inferior (fondo) está protegida del aire y es relativamente anaerobia.
Al crecer un m.o. en el TSI, el pico tiende a virar al pH alcalino (color rojo por el rojo fenol) por la producción de aminas, debido a la utilización aerobia de las peptonas. En el fondo del tubo -donde no hay oxígeno- la degradación de peptonas es menor y no se generan aminas, de manera que se pueden detectar la producción de pequeñas cantidades de ácido (color amarillo por el rojo fenol). Si se inoculan m.o. no fermentadores no se formarán ácidos, pero por la producción de aminas en el pico, todo el medio quedará rojo.
La glucosa en el TSI está en una proporción 10 veces menor que la lactosa y la sacarosa. Si el TSI es inoculado con una bacteria fermentadora de glucosa pero no de lactosa ni de sacarosa, la cantidad de ácido producida por fermentación fermentación será baja (porque la cantidad de glucosa inicial es baja). En las primeras horas (10 a 16 hs) de incubación se producirá viraje del indicador al amarillo en todo el tubo (pico y fondo), pero al continuar la incubación, el pico del tubo retornará al rojo por la producción de aminas debida a la degradación aerobia aerobia de las peptonas antes descrita. Si el m.o. fermenta la lactosa y/o la sacarosa, como las concentraciones de estos azúcares son 10 veces mayores a la glucosa, se producirá gran cantidad de ácido (que no puede ser neutralizado por la producción de aminas en la superficie), por lo tanto todo el tubo (pico y fondo) virará al color amarillo (ácido).
La producción de H2S a partir de tiosulfato se pone en evidencia por precipitación del sulfuro ferroso (negro). Como esta reacción se da preferencialmente preferencialmente en medio ácido, un ennegrecimiento ennegrecimiento del fondo del tubo (que puede cubrir todo el fondo del tubo y enmascarar el color amarillo) se lee como fermentación de algunos de los azúcares del medio. Además puede observarse la producción de gas (H 2 y CO2), ya sea como burbujas en el fondo del tubo, por ruptura del agar o desplazamiento del mismo hacia la superficie.
Medios y reactivos
TSI
Extr Extrac acto to de car carne 3 g Extracto de levadura Peptona
3g
15 g
Proteo oteosa sa pept pepton ona a 5g Lactosa
10 g
Sacarosa
10 g
Glucosa
1g
Cloruro de sodio
5g
Sulfato ferroso
0,2 g
Tiosulfato Tiosulfato de sodio 0,3 g Agar
12 g
Rojo fenol
0,024 g
Agua destilada
1L
pH = 7,4 ± 0,2
Procedimiento Inocular los tubos de TSI con punta (alambre recto). Para eso introducir la punta hasta 3 a 5 mm del fondo del tubo. Tras retirar la punta del fondo, estriar el pico con un movimiento hacia uno y otro lado. Incubar a 35 °C durante 18-24 hs, pero no más de 24 hs..
Interpretación y Controles Para el TSI siempre se informa el resultado en el siguiente orden: pico, fondo, producción de gas y H 2S. Pico alcalino/fondo alcalino (Alc/Alc/gas-/H2S-)
No hay fermentación de azúcares. Característica de bacterias no fermentadoras como Ej. Pseudomonas sp
Pico alcalino/fondo ácido (Alc/A/gas-/ H2S-)
Glucosa fermentada, ni lactosa ni sacarosa fermentadas. No hay producción de gas ni de H 2S. Ej. Shigella spp.
Pico alcalino/fondo ácido (Alc/A/gas-/ H2S+) Glucosa fermentada, ni lactosa ni sacarosa fermentadas. No hay producción de gas, si de H 2S. Ej. Salmmonella typhi. Pico alcalino/fondo negro (Alc/A/gas+/H2S+) Glucosa fermentada, ni lactosa ni sacarosa fermentadas, producción de gas y producción de ácido sulfhídrico. Ej. Salmonella spp. (la mayoría de las especies de Salmonella).
Pico ácido/fondo ácido (A/A) Glucosa y lactosa y/o sacarosa fermentadas. Puede producirse H 2S o no. E.coli (A/A/H2S -) A estos resultados se les agrega el resultado de la producción de gas. Ej. A/A/gas+/H2S-.
LIA (LYSINE IRON AGAR) Introducción Este ensayo permite diferenciar los m.o. que producen descarboxilación o desaminación de la lisina. Se puede detectar además la producción de H2S. Es muy utilizado en las técnicas de búsqueda de Salmonella, principalmente para descartar otras bacterias que dan colonias de aspecto similar en los medios diferenciales utilizados durante el aislamiento selectivo.
Principio Durante las primeras etapas de la incubación el fondo virará el indicador de pH del medio al ácido (amarillo) por la fermentación fermentación de glucosa. Luego, si el aminoácido es descarboxilado se formarán aminas que provocan un retorno al color original del medio o hacia un viraje al básico (color violeta). En la desaminación se produce un ácido carboxílico y NH3 y se visualiza en la superficie la aparición de un color c olor rojo intenso. intenso. La producción de H2S a partir de tiosulfato se visualiza por la precipitación de sulfuro ferroso de color negro.
Medios y reactivos Peptona
5g
Extracto de levadura
3g
Glucosa
1g
L-lisina HCl
10 g
Citrato férrico amónico Tiosulfato de sodio
0,5 g 0,04 g
Púrpu Púrpura ra de brom bromocr ocreso esoll 0,02 0,02 g Agar
15 g
Agua destilida
pH = 6,7
±
1L
0,2
Interpretación y controles pico alcalino/fondo alcalino/H2S +, descarboxilación de lisina positiva. Ej.: Salmonella choleraesuis.
pico rojo/fondo ácido/H2S-, desaminación de lisina positiva, descarboxilación de lisina negativa. Ej.: Proteus mirabilis.
pico alcalino/fondo ácido/H2S- descarboxilación descarboxilación de lisina l isina negativa. Ej. E. coli pico alcalino/fondo ácido/H2S+ descarboxilación descarboxilación de lisina negativa, producción de H2S. Ej. Citrobacter freundii.
PRODUCCIÓN DE PIGMENTOS PARA PSEUDOMONAS SP . Introducción La capacidad para producir pigmentos como pioverdina (fluoresceína) y piocianina es una característ c aracterística ica importante para la identificación de especies de Pseudomonas. Algunas de ellas elaboran sólo fluoresceína (ej. Ps. fluorescens) y otras ambos pigmentos (ej. Ps. aeruginosa). La piocianina solamente es producida por Ps. aeruginosa aunque no todas las cepas de esta especie la producen. Se han diseñado medios de cultivo que potencian la elaboración de uno de los pigmentos e inhiben la formación del otro.
Principio El medio King A (o Pseudomonas Pseudomonas Agar P) potencia la elaboración de piocianina mientras que el King B (o Pseudomonas Pseudomonas Agar F) potencia la elaboración de fluoresceína e inhibe parcialmente la de piocianina. Estos pigmentos son solubles en agua y difunden al medio. La piocianina es un pigmento azul-verde mientras que la fluoresceína es amarillo-verdoso y fluoresce cuando es expuesto a la luz UV ( λ=254 nm). Existen pigmentos amarillo-verdosos producidos por algunas especies de Pseudomonas que no fluorescen.
Medios y reactivos King A
Peptona
King B
20 g
Proteosa Peptona 20 g
Glicerol
10 g
Glicerol
K 2SO4
10 g
K2HPO 4
10 g 1,5 g
MgCl2
1,4 g
MgSO4.7H2O
1,5 g
Agar
15 g
Agar
15 g
Agua
1L
Agua
1L
Los medios se reparten en tubos, se esterilizan a 121ºC durante 15 minutos y se dejan solidificar inclinados.
Procedimiento Inocular los tubos por estrías. Incubar a 35ºC durante 24 hs.
Interpretación Observar al UV, la producción de pigmento azul-verdoso azul-verdoso en el medio King A y la de pigmento amarillo-verdoso, en el King B
Controles Pseudomonas aeruginosa: King A + P. fluorescens: King A P. fluorescens: King B + P. stutzeri stu tzeri : King B -
DNASA - DESOXIRRIBONUCLEASA Introducción La actividad desoxirribonucleasa (DNAsa) se ha demostrado fundamentalmente en los géneros Staphylococcus y Serratia y consiste en la propiedad de degradar el ADN a fracciones de menor peso molecular. Esta característica se ha utilizado para identificar las especies de Serratia marcescens y Staphylococcus aureus. Weckman y Catlin demostraron la estrecha correlación entre la producción de DNAsa de los cultivos de Staphylococcus aureus con la producción de coagulasa.
Principio Los m.o. DNAsa positivos degradan el DNA cuando son incubados en un medio que lo contiene. Esto puede ser visualizado de diferentes maneras: maneras: ya sea inundando las placas crecidas con HCl 0,1 N y observando zonas transparentes transparentes alrededor de las estrías o incorporando al medio indicadores como azul de toluidina o verde de metilo (viran a rosado cuando el test es positivo).
Medios y reactivos DNAsa agar
Triptosa
20 g
ADN
2g
NaCl
5g
Agar
15 g
Azul Azul de tolu toluidi idina na** 0,1 0,1 g Agua c.s.p.
* o verde de metilo
1L
Procedimiento Estriar la superficie de la placa e incubar a 35°C durante 18-24 horas. Observar el viraje del indicador a rosado alrededor de las estrías.
Interpretación Un resultado positivo está dado por el viraje del indicador en la zona de la estría a rosado.
Controles
Positivo: S.aureus y Serratia marcescens Negativo: S.epidermidis:
COAGULASA Introducción La coagulasa es una enzima proteica con actividad semejante a la protrombina, capaz de transformar el fibrinógeno en fibrina, provocando la formación formación de un coágulo visible en un sistema analítico adecuado. Se cree que la coagulasa funciona in vivo, produciendo una barrera en el sitio de infección estafilocóccica. En el laboratorio, la prueba de coagulasa se utiliza más comúnmente para diferenciar al Staphylococcus aureus (coagulasa positivo) de otros Staphylococcus.
Principio La coagulasa se halla presente en dos formas, “libre” y “fija”, cada una de las cuales posee diferentes propiedades que requieren el uso de técnicas de determinación diferentes: Coagulasa fija (prueba en portaobjetos): portaobjetos): la coagulasa fija está unida a la pared celular bacteriana. Los hilos de fibrina formados entre las células suspendidas en plasma (que contiene fibrinógeno) provocan provocan su aglutinación, indicada por la presencia de agregados agregados visibles en el portaobjetos. Coagulasa libre (prueba en tubo): la coagulasa libre es una enzima extracelular extracelular que se halla presente en los filtrados de cultivos. Cuando una suspensión de bacterias productoras de coagulasa se mezcla en partes iguales con plasma en un tubo de ensayo, se forma un coágulo visible como consecuencia de la utilización de los factores de coagulación del plasma de manera similar a cuando se añade trombina.
Medios y reactivos Plasma coagulasa (Difco, o BBL) Cultivo de Staphylococcus de 24 horas en un agar nutriente o caldo nutriente.
Procedimiento Prueba en portaobjetos
Colocar una gota de agua destilada sobre un portaobjetos Emulsionar suavemente el organismo en estudio en la gota de agua de manera de obtener una suspensión cargada homogénea. Agregar una gota de plasma reconstituido junto a la gota de la suspensión del m.o. Mezclar bien con el ansa. Inclinar el portaobjetos hacia uno y otro lado, observando observando la formación inmediata de un precipitado p recipitado granular o de grumos blancos.
Prueba en tubo
Colocar asépticamente asépticamente 0,5 ml de plasma reconstituido en el fondo de un tubo estéril. Añadir 0,5 ml de cultivo de 24 horas (o suspensión en suero fisiológico de un cultivo en placa). Mezclar por rotación el tubo, evitando remover o agitar el contenido. Colocar en baño de agua a 37°C y observar cada hora hasta 4 horas y luego a las 24 horas, la formación de un coágulo visible.
Interpretación Prueba en portaobjetos: una reacción positiva se detecta usualmente en 15 a 20 segundos por la aparición de un precipitado granular. La prueba se considera negativa si no se observa aglutinación en 2 a 3 minutos. Esta prueba es solo presuntiva y todos los cultivos que den resultados resultados negativos o positivos tardíos deben verificarse mediante la prueba en tubos ya que algunas cepas de Staphylococcus aureus no producen coagulasa fija.
Prueba en tubos:
1+: pequeños coágulos no organizados. organizados. 2+: pequeños coágulos c oágulos organizados. 3+: gran coágulo organizado. 4+: todo el contenido aparece coagulado y se mantiene cuando se invierte el tubo. Se consideran positivos los grados 3+ y 4+
Controles
Positivo: S.aureus Negativo: S.epidermidis:
PRUEBA DE LA BILIS ESCULINA Introducción La prueba de la bilis-esculina está basada en la capacidad de ciertas bacterias, particular particularmente mente los estreptococos del grupo D, de hidrolizar la esculina en presencia de bilis al 1 o 4%. La esculina es, químicamente, un derivado de la cumarina (6-b-glucósido-7-hidroxicumarina), (6-b-glucósido-7-hidroxicumarina), que por su estructura pertenece a los glucósidos. Por definición, éstos están constituídos por dos restos unidos por un puente de oxígeno. En el caso de la esculina, uno de los restos es una glucosa y el otro la 7-hidroxicumarina (que no es un hidrato h idrato de carbono, y es denominado aglucona).
Principio Las bacterias capaces de desarrollar en bilis y también hidrolizar esculina, producen glucosa y esculetina (7,7 dihidroxicumarina) dihidroxicumarina) y ésta puede visualizarse en un medio con una sal de hierro, por formación formación de un complejo marrón oscuro o negro.
Algunos medios bilis-esculina incluyen también azida sódica para inhibir el desarrollo de organismos Gram negativos, transformándose en selectivos para estreptococos.
Medios y reactivos Medio bilis-esculina
Peptona
5g
Extr Extrac acto to de car carne 3 g Bilis de buey
40 g
Esculina
1g
Citrato férrico Agar Agua destilada
0,5 g 15 g 1L
Procedimiento Se estría el organismo en estudio en placas o tubos en pico de flauta del medio bilis-esculina. Se incuba a 37°C durante 24 horas.
Interpretación La esculetina difunde hacia el medio de agar por ser hidrosoluble. La reacción es positiva si se observa un ennegrecimiento ennegrecimiento difuso del tubo o un halo marrón oscuro o negro alrededor de las colonias en placa.
Controles Positivo: streptococo del grupo D Negativo: estreptococo no del grupo D
UREASA Introducción La urea es una diamida del ácido carbónico que puede ser hidrolizada con liberación de amoníaco y dióxido de carbono.
Principio La ureasa es una enzima que poseen muchas especies de m.o. que pueden hidrolizar urea de acuerdo a la siguiente reacción química: Urea + 2H 2O
CO2 + H2O + 2NH3
El amoníaco reacciona en solución para formar carbonato de amonio, produciéndose produciéndose alcalinización y aumento de pH del medio.
Medios y reactivos El caldo urea y agar urea de Christensen son los dos medios mas comúnmente usados en los laboratorios para la detección de la ureasa de m.o.
Caldo de Stuart
Extracto de levadura
0,1 g
Fosfato monop nopotásico
9,1 g
Fosfato di disódico
9,5 g
Urea
20 g
Rojo fenol
0,01 g
Agua
1L
pH = 6,8
Agar urea de Christensen
Peptona
1g
Glucosa
1g
Cloruro de sodio
5g
Fosfato monopotásico
2g
Urea
20 g
Rojo fenol
0,012 g
Agar
15 g
Agua
1L
pH = 6,8
Procedimiento Inocular el caldo con una ansada cargada con el cultivo puro del m.o. o estriar la superficie del agar. Incubar a 35°C durante 24 hs.
Interpretación Los m.o. que hidrolizan urea rápidamente pueden producir reacciones positivas en 1 a 3 hs. Las L as especies mas lentas pueden requerir 3 o mas días. Caldo: una coloración rojiza indica alcalinazación e hidrólisis de urea
Agar: una coloración rojiza en el medio indica hidrólisis de urea positiva. Los degradadores degradadores lentos producen producen coloración parcial (generalmente el pico), los rápidos producen coloración coloración en todo el tubo. Si no hay hidrólisis el medio permanece con el colo original (amarillo) y se observa crecimiento.
Controles Positivo: Proteus sp Negativo: Escherichia coli
Introducción Las pruebas bioquímicas consisten en distintos test químicos aplicados a medios biológicos, los cuales, conocida su reacción, nos permiten identificar distintos microorganismos presentes. Su sistema de funcionamiento generalmente consiste en determinar la actividad de una via metabólica a partir de un sustrato que se incorpora en un medio de cultivo y que la bacteria al crecer incorpora o no. Para realizar las pruebas bioquímicas se dispone de multiples medios, los cuales se deben aplicar de acuerdo a las exigencias del microorganismo en estudio. De la amplia variedad de pruebas bioquímicas, nosotros en laboratorio utilizaremos 10, aplicados a 5 especies de microorganisos. Además estudiaremos los resultados que estos test a rrojan, comparando resultados experimentales entre los distintos grupos de trabajo de nuestro laboratorio.
Objetivos Realizar el experimento adecuadamente y poder identificar −aplicando éste método− distintos microorganismos. •
Debemos conocer cual de los test que componen las pruebas bioquímcas es o son el (los) adecuado(s) de acuerdo a la circunstancia que necesitemos estudiar.
• •
Entender los principios bioquimicos de las pruebas. • Ser capaces de interpretar adecuadamente los resultados entregados por laspruebas bioquímias • Conocer el uso de las pruebas bioquímicas para la identificación de microorganismos Identificar errores de procedimiento en el laboratorio al realizar los experimentos y poder reconocer en que partes del procedimiento se cometió el o los errores, para así, mediante el desarrollo experimental conocer mas profundamente las pruebas bioquímicas. Internet: • http://bilbo.edu.uy/~microbio/RMVP.html • http://bilbo.edu.uy/~microbio/indol.html • http://bilbo.edu.uy/~microbio/citrato.html http://edicion−micro.usal.es/web/identificacion/A /identificacion/AyudaPruebas.html yudaPruebas.html • http://edicion−micro.usal.es/web •
Prueba MIO (Motility−Indole−Ornitine ó Motilidad−Indol−Ornitina)
Esta prueba bioquímica permite identificar bacterias de acuerdo a su motilidad a la reacción de Indol a la descarboxilación de la ornitina. Procedimiento: Inocular en picada las cepas de micro organimos en el medio de cultivo e incubar por 24 horas a 37° . Interpretación y Resultados: Reacción Interpretación Enturbiamiento del Agar. Hay movilidad Agar transparente de− sarrollo solo en picada No hay movilidad Azul (alcalino) Descarboxila ornitina Coloración Amarilla (ácido) No descarboxila Rojo (anillos) Indol (+) Amarillo (anillos) Indol ( − ) •
Prueba TSI (Triple (Triple Sugar Iron ó Triple Azúcar Hierro)
El TSI es un medio nutriente y diferencial que permite estudiar la capacidad de producción de ácido y gas a partir de glucosa, sacarosa y lactosa en un único medio. Tambien permite la identificación de la producción de SH2. Esta es una prueba específica para la identificación a nivel de género en la familia Enterobacteriaceae, con objetivo de diferenciar entre: • bacterias fermentadoras de la glucosa • bacterias fermentadoras de la lactosa • bacterias fermentadoras de sacarosa • bacterias aerogénicas • bacterias productoras de SH2 a partir de sustancias orgánicas •
Prueba MIO (Motility−Indole−Ornitine ó Motilidad−Indol−Ornitina)
Esta prueba bioquímica permite identificar bacterias de acuerdo a su motilidad a la reacción de Indol a la descarboxilación de la ornitina. Procedimiento:
Inocular en picada las cepas de micro organimos en el medio de cultivo e incubar por 24 horas a 37° . Interpretación y Resultados: Reacción Interpretación Enturbiamiento del Agar. Hay movilidad Agar transparente de− sarrollo solo en picada No hay movilidad Azul (alcalino) Descarboxila ornitina Coloración Amarilla (ácido) No descarboxila Rojo (anillos) Indol (+) Amarillo (anillos) Indol ( − ) •
Prueba TSI (Triple (Triple Sugar Iron ó Triple Azúcar Hierro)
El TSI es un medio nutriente y diferencial que permite estudiar la capacidad de producción de ácido y gas a partir de glucosa, sacarosa y lactosa en un único medio. Tambien permite la identificación de la producción de SH2. Esta es una prueba específica para la identificación a nivel de género en la familia Enterobacteriaceae, con objetivo de diferenciar entre: • bacterias fermentadoras de la glucosa • bacterias fermentadoras de la lactosa • bacterias fermentadoras de sacarosa • bacterias aerogénicas • bacterias productoras de SH2 a partir de sustancias orgánicas que contengan azufre. Prodedimiento: Inocular los tubos de TSI con punta (alambre recto). Para eso introducir la punta hasta 3 a 5 mm. del fondo del tubo. Tras retirar el alambre del fondo, estriar el pico con un movimiento hacia uno y otro lado. Incubar a 35° durante 24 horas. Posteriormente se debe medir el pH de los cultivos. Resultados: Pico alcalino/fondo alcalino : no hay fermentación de azucares. Característica de bactrias no fermentadoras como Pseudomonas sp. • •
Pico alcalino/fondo ácido : Glucosa fermentada,lactosa ni sacarosa fermentadas. Shigella spp .
4 alcalino/fondo negro : Glucosa fermentada, ni lactosa ni sacarosa fermentadas, producción de ácido sulfhídrico. Salmonela spp. •
Pico ácido/fondo ácido: Glucosa y lactosa y/o sacarosa fermentadas. Puede producirse SH2 o no. Escherichia coli. •
A estos resultados se les agrega el resultado de la producción de gas. •
Prueba LIA (Lysine Iron Agar ó Agar Lisina Hierro)
Esta prueba permite diferenciar los microorganimos que producen descarboxilación o desaminación de la lisina. Se pude detectar ademas la produccion de SH2 y es más sensible que el TSI para la detección de SH2.
Es muy utilizado par descartar Salmonella de aislamientos primaros. Procedimiento: Inocular en forma de estría las cepas de micro organimos en el medio de cultivo e incubar por 24 horas a 37° . Interpretación y Resultados: Reacción Interpretación Azul (alcalino) Hay movilidad Rojo No hay movilidad Engrecimiento Descarboxila ornitina Ruptura del Agar No descarboxila Fondo Amarillo y Tendido púrpura Descarboxilación de lisina
Pruebas Bioquímicas IMViC: • Agar Citrato La utilización de citrato como única fuente de carbono es una prueba útil en la identificación de enterobacterias. La utilización de citrato como única fuente de carbono se detecta en un medio de cultivo con citrato como única fuente de carbono mediante el crecimiento y la alcalinización del medio. Este aumento de pH se visualiza con el indicador azul de bromotimol que vira al alcalino a pH 7,6. Procedimiento: Se inocula el agar inclinado en una sola estría en el pico. Utilizar un cultivo de 24 horas en un medio sólido y cuidando no arrastrar medio de cultivo, ya que se pueden producir falsos positivos por crecimiento a partir del medio de cultivo del inóculo. Incubar a 35°C durante 4 días. El ensayo es positivo cuando se observa crecimiento a lo largo de la estría, acompañado o no de un viraje del indicador al azul. Resultados: (+)Klebsiella spp. ( − ) Escherichia Coli •
Indol
•
Debemos conocer cual de los test que componen las pruebas bioquímcas es o son el (los) adecuado(s) de acuerdo a la circunstancia que necesitemos estudiar. • •
Entender los principios bioquimicos de las pruebas. • Ser capaces de interpretar adecuadamente los resultados entregados por laspruebas bioquímias • Conocer el uso de las pruebas bioquímicas para la identificación de microorganismos Identificar errores de procedimiento en el laboratorio al realizar los experimentos y poder reconocer en que partes del procedimiento se cometió el o los errores, para así, mediante el desarrollo experimental conocer mas profundamente las pruebas bioquímicas. •
UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE CHILE FACULT FACULTAD TECNOLOGICA TECNOLOG ICA TECNOLOGÍA DE ALIMENTOS Microbiología
Pruebas Bioquímicas
Autor: Lab N° 4 Cod. 06 1
Bibliografía • Microbiología / Thomas D. Brock, Michael T. T. Madigan 2a. ed. en español, 1993. México ; Englewood Cliffs : Ed. Prentice Hall Hispanoamericana. •
Microbiología / Michael J. Pelczar, Jr., Jr., Roger D. Reid
2a. ed. en español., 1982. México : Ed. McGraw−Hill.
Tratado de microbiología : con inclusión de inmunología in munología y genética molecular / Bernard D. Davis
•
2a. ed., 1978. Barcelona : Ed. Salvat. Internet: • http://bilbo.edu.uy/~microbio/RMVP.html • http://bilbo.edu.uy/~microbio/indol.html • http://bilbo.edu.uy/~microbio/citrato.html http://edicion−micro.usal.es/web/identificacion/A /identificacion/AyudaPruebas.html yudaPruebas.html • http://edicion−micro.usal.es/web •
Prueba de la Oxidasa
El objetivo de la prueba Oxidasa es buscar la presencia de la enzima Citocromo C oxidasa. Se trata de un enzima que oxida el citocromo C de la cadena transportadora de e−. Este se detecta utilizando el tetra para fenilendiamina: el reactivo de oxidasa contiene este compuesto que va a ser oxidado por la citocromo C oxidasa. En estado reducido es incolora, pero cuando se oxida vira a púrpura. Procedimiento: Con un pequeño papel de filtro añadimos reactivo de Kovacs, lo impregnamos y a partir del tubo con la bacteria problema tomamos un poco con el asa de platino y ponemos en el papel. Tras unos 30 segundos, observamos si ha ocurrido algún cambio. Las bacterias que dan positivo a esta prueba tienen generalmente un ciclo respiratorio oxidativo. Se considera positva esta prueba cuando toma un color púrpura la muestra. Resultados: (+) Pseudomonas aeruginosa ( − ) Escherichia coli •
Prueba de la Catalasa
2 El Objetivo es buscar la presencia de la enzima catalasa El peróxido de hidrógeno se produce al utilizar la bacteria el azúcar por vía oxidativa. Al ser éste un compuesto muy oxidante las bacterias la eliminan mediante la producción de la enzima catalasa (H2O2 −> H2O + ½ O2). Prodecimiento: Agregamos aproximadamente 5 ml. de peróxido de hidrógeno al 3% a un tubo de ensayo previamente esterilizado a continuacion tomamos una muestra de la cepa del microorganismo a estudiar y la introducimos por el tubo de ensayo, la muestra solamente debe acercrse a la muestra de la solucion liíquida de peróxido de hidrogeno y debemos observar la reacción de esta. La prueba se considera como positiva si observamos burbujas de oxígeno. Resultados: (+) Staphylococcus aureus
( − ) Streptococcus spp. •
Prueba de la Coagulasa
La coagulasa es un enzima capaz de desnaturalizar la bibrina del plasma. El objetivo es buscar en factor de aglutinación de los microorganismos cuando estos se mezclan con el plasma. Esta prueba se utiliza para diferenciar microorganismos del genero Staph ylococcus. Procedimiento: Preparamos una mezcla de 0,1 ml. de CCC (caldo cerebro corazon) y 0,3 ml. de plasma de conejo en un tubo de ensayo previamente esterilizado. La muestra ya contiene cepas de St. Aureus. Tapamos Tapamos el tubo de ensayo con algodón hidrofílico y lo llevamos a baño María a 37° C durante una hora, observando la muestra cada 15 minutos. Al completa la hora, sacamos las muestras y observamos sus resultados. Resultados: Estratificaremos los resultados en 4 distintos niveles: 1: pequeños coágulos no oganizados 2: pequeños coágulos oganizados 3: gran coágulo organizado 4: todo el contenido aparece coagulado y se mantiene cuando invierte el tubo. Se consideran positivos los niveles 3 y 4. (+) Staphylococcus aureus 3 ( − ) Staphylococcus epidermis. •
Prueba MIO (Motility−Indole−Ornitine ó Motilidad−Indol−Ornitina)
Esta prueba bioquímica permite identificar bacterias de acuerdo a su motilidad a la reacción de Indol a la descarboxilación de la ornitina. Procedimiento: Inocular en picada las cepas de micro organimos en el medio de cultivo e incubar por 24 horas a 37° . Interpretación y Resultados: Reacción Interpretación Enturbiamiento del Agar. Hay movilidad Agar transparente de− sarrollo solo en picada No hay movilidad Azul (alcalino) Descarboxila ornitina Coloración Amarilla (ácido) No descarboxila Rojo (anillos) Indol (+) Amarillo (anillos) Indol ( − ) •
Prueba TSI (Triple (Triple Sugar Iron ó Triple Azúcar Hierro)
El TSI es un medio nutriente y diferencial que permite estudiar la capacidad de producción de ácido y gas a partir de glucosa, sacarosa y lactosa en un único medio. Tambien permite la identificación de la producción de SH2. Esta es una prueba específica para la identificación a nivel de género en la familia Enterobacteriaceae, con objetivo de diferenciar entre: • bacterias fermentadoras de la glucosa
• bacterias
fermentadoras de la lactosa • bacterias fermentadoras de sacarosa • bacterias aerogénicas • bacterias productoras de SH2 a partir de sustancias orgánicas que contengan azufre. Prodedimiento: Inocular los tubos de TSI con punta (alambre recto). Para eso introducir la punta hasta 3 a 5 mm. del fondo del tubo. Tras retirar el alambre del fondo, estriar el pico con un movimiento hacia uno y otro lado. Incubar a 35° durante 24 horas. Posteriormente se debe medir el pH de los cultivos. Resultados: Pico alcalino/fondo alcalino : no hay fermentación de azucares. Característica de bactrias no fermentadoras como Pseudomonas sp. • •
Pico alcalino/fondo ácido : Glucosa fermentada,lactosa ni sacarosa fermentadas. Shigella spp .
4 Pico alcalino/fondo negro : Glucosa fermentada, ni lactosa ni sacarosa fermentadas, producción de ácido sulfhídrico. Salmonela spp. •
Pico ácido/fondo ácido: Glucosa y lactosa y/o sacarosa fermentadas. Puede producirse SH2 o no. Escherichia coli. •
A estos resultados se les agrega el resultado de la producción de gas. •
Prueba LIA (Lysine Iron Agar ó Agar Lisina Hierro)
Esta prueba permite diferenciar los microorganimos que producen descarboxilación o desaminación de la lisina. Se pude detectar ademas la produccion de SH2 y es más sensible que el TSI para la detección de SH2. Es muy utilizado par descartar Salmonella de aislamientos primaros. Procedimiento: Inocular en forma de estría las cepas de micro organimos en el medio de cultivo e incubar por 24 horas a 37° . Interpretación y Resultados: Reacción Interpretación Azul (alcalino) Hay movilidad Rojo No hay movilidad Engrecimiento Descarboxila ornitina Ruptura del Agar No descarboxila Fondo Amarillo y Tendido púrpura Descarboxilación de lisina
Pruebas Bioquímicas IMViC: • Agar Citrato La utilización de citrato como única fuente de carbono es una prueba útil en la identificación de enterobacterias. La utilización de citrato como única fuente de carbono se detecta en un medio de cultivo con citrato como única fuente de carbono mediante el crecimiento y la alcalinización del medio. Este aumento de pH se visualiza con el indicador azul de bromotimol que vira al alcalino a pH 7,6. Procedimiento: Se inocula el agar inclinado en una sola estría en el pico. Utilizar un cultivo de 24 horas en un medio sólido y
cuidando no arrastrar medio de cultivo, ya que se pueden producir falsos positivos por crecimiento a partir del medio de cultivo del inóculo. Incubar a 35°C durante 4 días. El ensayo es positivo cuando se observa crecimiento a lo largo de la estría, acompañado o no de un viraje del indicador al azul. Resultados: (+)Klebsiella spp. ( − ) Escherichia Coli •
Indol
5 El indol es uno de los productos de degradación metabólica del aminoácido triptofano. Las bacterias que poseen la triptofanasa son capaces de hidrolizar y desaminar el triptofano con producción de indol, ácido pirúvico y amoníaco. La producción de indol es una característica importante para la identificación de muchas especies de microorganismos. La prueba de indol está basada en la formación de un complejo rojo cuando el indol reacciona con el grupo aldehído del p−dimetilaminobenzaldehído. Este es el principio activo de los reactivos de Kovacs y Ehrlich. El medio de cultivo utilizado debe ser rico en triptofano. Procedimiento: Inocular el caldo triptofano con el organismo en estudio e incubar a 35°C durante 18 a 24 horas. Al finalizar este período, añadir 5 gotas de reactivo de Kovacs por la pared interior del tubo. El desarrollo de un vivo color rojo fucsia en la interfase del reactivo y el caldo, segundos después de añadir el reactivo indica la presencia de indol y una prueba positiva. Resultados: (+) Escherichia coli ( − ) Klebsiella pneumoniae •
Rojo Metilo
Una de las características taxonómicas que se utilizan para identificar los diferentes géneros de enterobacterias lo constituyen el tipo y la proporción de productos de fermentación que se originan por la fermentación de la glucosa. Se conocen 2 tipos generales: La fermentación ácido−mixta y la fermentación del 2,3 butanodiol. En la fermentación ácido mixta se forman fundamentalmente láctico, acético y succínico, además de etanol, H2 y CO2. En la vía del butanodiol se forman cantidades menores de ácido (acetato y succinato) y los principales productos son el butanodiol, etanol, H2 y CO2. El rojo de metilo es un indicador de pH con un intervalo entre 6,0 (a marillo) y 4,4 (rojo), que se utiliza para visualizar la producción de ácidos por la vía de fermentación ácido mixta. Procedimiento: Inocular el caldo Rojo Metilo con un cultivo puro de no más de 24 horas del microorganismo en estudio. Incubar a 35°C durante 48 horas. Luego de finalizado el tiempo de incubación agregar unas gotas del reactivo de rojo de metilo. La prueba es positiva si se desarrolla de un color rojo estable. Esto indica que la producción
de ácido es suficiente para producir el viraje del indicador y el microorganismo fermentó la glucosa por la vía de ácido mixta. Un color anaranjado, intermedio entre el rojo y el amarillo no es considerado como positivo. Resultados: (+) Escherichia coli ( − ) Enterobacter aerogenes •
Vogues Proskauer
En la prueba de Voges−Proskauer Voges−Proskauer se determina la vía de fermentación del butanodiol descripta en la prueba de rojo de metilo. El acetil−metil−carbinol (o acetoína) es un producto inter mediario en la producción de butanodiol. En medio alcalino y en presencia de oxígeno la acetoína es oxidada a diacetilo. Este se revela en presencia de alfa−naftol dando un color rojo−fucsia. 6 Procedimiento: Inocular el caldo RMVP con un cultivo puro de no más de 24 horas del microorganismo en estudio. Incubar a 35°C durante 24 horas. Luego de finalizado el tiempo de incubación transferir 1 ml del caldo RM/VP a un tubo limpio y agregar 0,6 ml de alfa−naftol al 5% y 0,2 ml de KOH al 40%. Agitar el tubo cuidadosamente para exponer el medio al oxígeno atmosférico y dejarlo reposar durante 10 a 15 minutos. El desarrollo de un color rojo−fucsia luego de 15 minutos indica la presencia de diacetilo, producto de oxidación de la acetoína y por lo tanto una prueba VP positiva. Resultados: (+) Enterobacter aerogenes (−)Escherichia coli Diagrama de flujo realización de Pruebas Bioquímicas
RECOLECCIÓN DE MATERIALES MATERIALES A UTILIZAR EN PRUEBAS BIOQUÍMICAS PREPARACION DE MATERIAL DE LABORATORIO REALIZACION DEL PROCEDIMINTO PARA PRUEBAS BIOQUIMICAS INCUBACION DE MUESTRAS ANOTAR RESULT R ESULTADOS ADOS ANALISIS DE RESULTADOS 9
COMPARACION DE RESULTADOS EXPERIMENTALES Y TEORICOS EVALUACION Y RESULTADOS FINALES DE PRUEBAS BIOQUIMICAS 10
