ADN COMO MATERIAL GENÉTICO Maribeb Castro González, MSc, PhD
HISTORIA 30’s. Los cromosomas tienen ADN y proteínas, cada proteína es responsable de un carácter biológico o función en el metabolismo. Proteínas con secuencias de a.a. y diferentes estructuras y por ende con muchas funciones biológicas. Relación gen-proteínas, porque cada mutación se correspondía con una alteración enzimática.
La hipótesis era que el cromosoma tenía moléculas de ADN (considerado el esqueleto) y sobre él estaban las proteínas génicas.
Transformación 1928
de
neumococos,Grifith
transformación permanente y hereditaria a muchas generaciones. Pueden transformar no virulentos en virulentos, introduciendo “el material genético patógeno” aun estando muertas!.
Cuál era el principio transformante? Delbruck 1930, Fagos Avery, MacLeod & McCarthy 1944 eliminaron enzimas, RNA y quedo ADN Hotchkiss, 1949, transformó caracteres no relacionados con cápsula, resistencia Antibioticos. Hersey & Check 1952, virus bacteriófagos líticos T2 que atacan a E. coli demostrando que: El material genético del fago es DNA Que el DNA-fago se reproduce dentro de las bacterias atacadas y las proteínas-fago quedan fuera de las células
Mirsky & Ris 1950 Midieron cantidad de DNA en células somáticas y gametos: cantidad-ADN era kte y que hay el doble en somáticas vs.gametos. Gierer & Schram 1956 Probaron que algunos virus tienen RNA como material genético. Fraenkel-Conrad & Singer 1957 construyeron virus híbridos in vitro de RNA-proteìnas. VMT –RNA.
EL ADN-BIOPOLIMERO Kossell & Neumann 1894 bases nitrogenadas. Bases púricas A-G(2 anillos) Bases pirimidínicas C,T,U ( 1 anillo) A, G, C, T = ADN A, G, C, U = ARN
Hammersten 1900, Levene 1929: Pentosas: desoxiribosa ribosa, nucleósido nucleótido Polímeros de nucleótidos monofosfato = ADN ácida
Estructura en escalera: Los peldaños y el pasamanos
Estructura en escalera: Los peldaños y el pasamanos
Desoxiribonucleótidos del DNA
Ribonucleótidos del RNA
Regla de Chargaff, 1950 Las bases se encuentran en proporciones iguales A = T, G = C, A/T = G/C = 1, (A+G) = (T+C ), A+G/T+C =1 El cociente (A+T)/(G+C) es típico y constante para cada especie.
La variación es mayor entre las bacterias (26% Welchia perfringens, 74% streptococcus griseus) que en los eucariotas (G+C ≈ 50%)
DIFERENCIAS ENTRE DNA Y RNA DNA Azúcar: Desoxiribosa Bases nitrogenadas: ACGT Cadena doble
RNA
A
Azúcar: Ribosa Bases nitrogenadas: ACGU Cadena sencilla
La hebra está polarizada: 5’-P(fosfato) y 3’OH(hidroxilo) y al formarse la hebra las bases N que son planas se apilan como monedas.
WilliamAstbury 1950, Rosalin Franklin 1952. Aislamiento y cristalizaciónDNA con patrón de difracción. Idéntico: fagos a mamíferos. Molécula larga fina de 20Å y 2 hebras enrolladas helicoidalmente dando una vuelta a la hélice c/34Å.
ADN con formas tautoméricas de acuerdo a la posición de los dobles enlaces y átomos de H. Existen 28 posibles pares de bases nitrogenadas en forma tautomérica mayoritaria. Los cambios tautoméricos mutaciones puntuales Par de bases A=T de tipo WatsonCrick reverso. En azul el donador de hidrógenos y en rojo el aceptor. Nótese que la pirimidina ha sufrido un giro de 180º sobre el eje del carbono 6.
Par de bases A=T de tipo WatsonCrick. En azul el donador de hidrógenos y en rojo el aceptor.
Carácterísticas doble hélice: -Antiparalela -Hebras complementarias -Estable: enlaces H y uniones hidrofóbicas -Diámetro constante -Helicoidal -Tridimensionales -Molécula ácida -Superenrollamiento -Diferentes formas
Forma Alfa: más compacta que Beta con 11 pb por vuelta y 23Å. Forma Beta: Dextrógira con 10 pb/giro, forma+natural y estable Forma Z: levógira, 12pb/giro, 18 Å, se encuentra en algunas regiones pequeñas de los cromosomas y sin función clara.
ADN cuadruplex por repetición en telomeros
Estructura secundaria del ADN
Formada por pb dentro de una hebra simple de ADN. Stem and loops en RNA ribosomal “stems y loops” Hairping: Algunos ADN linear tienen estructuras que se forman desde moléculas con repeticiones invertidas.
ADN superenrollado
En E.coli el ADN es 1000 veces > que el tamaño de la propia célula . Cómo sucede? En Eucaria la formación de nucleosoma introduce SE-. En bacterias es la DNA girasa ó topoisomerasa II que da SE- en varios pasos El ácido nalidíxico, novobiocina y topoisomerasa I inhiben la girasa en bacterias. Ventaja o no? Algunos genes se transcriben más activamente con ADN-SE, mientras la de otros se inhibe.
Interacciones de químicos con el ADN Algunos químicos se insertan o intercalan entre pb. sin dañar los enlaces H, pero sí los enlaces fosfato-azúcar alterando la forma de la hélice. Acridinas: acriflavina, acridina naranja, bromuro de etidio, agentes cancerígenos o mutagénicos. Antibióticos (actinomicinas), benzopirona, se intercalan y enlazan a la garganta mayor inhibiendo la replicación y la transcripción
EFECTO DE TEMPERATURA SOBRE ACIDOS NUCLEICOS Enlaces H se rompen por calor, los covalentes no >T° de fusión > GC. A medida que se funde la molécula cambia la absorbancia a 260 nm. Tm = es el punto medio de la transición a la fusión y depende de la cantidad GC. T denaturación = 85-95°C T de fusión aumenta 0.4°C por c/1% más de GC-ADN. P.e ADN con un 40% de G+C = Tm 87°C, 60% G+C = Tm 95°C bajo las mismas condiciones experimentales.
Las curvas COT Cinética de la reacción de renaturalización del ADN bajo condiciones físicoquímicas estándar (fuerza iónica, [cationes], etc.) que permite comparar organismos. Mide el tiempo entre pasar de una [ ]inicial = 100% de hebras simples a una [ ]final de 0% de hebras simples: moles/L/s. < complejidad > reasociación p.e virus vs. Bacteria. Pero, el ADN eucariota aunque complejo se reasocia rápido (COT bajos) porque tiene 3 tipos de secuencias:
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Tipos de Secuencias: Clase homogénea:1vez/genoma, alto COT. Ternera 60% genoma. Clase muy hetereogénea: repiten 100’s o 1000’s de veces (moderadamente repetidas), Ternera 20% genoma. ADN inestable
Secuencias altamente repetitivas o de reasociación muy rápida COT <10-2 , secuencias de 4-6 pb, que se repiten en tandem hasta 1 millón de veces en una zona concreta del genoma intercalados en las regiones no codificantes: minisatélites y microsatélites. Número de repeticiones y longitud difiere entre individuos.
Palíndromos: Secuencias que se leen igual en cualquier dirección COT = 10-2 ó 10-4 o renaturalizan en tiempo 0, MADAM I’M ADAM, Renaturalizan por debajo de la T de fusión y existen miles de palíndromos en el genoma.
Los genes, unidades de información La secuencia del ADN está estructurada en codones de 3 nucleótidos. Se pueden distinguir: •Genes o secuencias codificantes, que contienen la infomación para sintetizar proteínas, EXONES. •Secuencias no codificantes, que incluyen secuencias reguladoras de la expresión (promotores, INTRONES) Genoma es el conjunto de todos los genes de un organismo.
Tamaño del genoma en diferentes especies Especie
No. nucleotidos
No. genes
Phi-X 174/ virus
5,386
10
Bacilus subtilis / bacteria
4,214,814
4,779
Escherichia coli / bacteria
4,639,221
4,377
Caenorhabditis elegans / gusano
100,258,171
~19,000
Drosophila melanogaster / insecto
122,653,977
13,379
Homo sapiens / hombre
3.3 x 109
~25,000
Arabidopsis thaliana/ brasicacea
115,409,949
25,498
Oryza sativa / arroz
4.3 x 108
~60,000
5
75 310MY 450MY 600-1200MY?
40
human chimp mouse rat chicken fish worm
?
bee 370MY
fruit fly
250MY Human: Nature Feb 2001, 2008 Mosquito: Science Oct 2002 mosquito Chimp: Nature Sep 2005 Mouse: Nature Dec 2002 Chicken: Nature Dec 2004 Honey bee: in preparation Rat: Nature Apr 2004
Variación entre individuos La variación individual solo representa el 0,01%=1,250 letras Single nucleotide polymorphisms (SNPs)
El ADN es la molécula de la vida
Compartimos el 98.4% del DNA con los chimpances. El genoma del bonobo (Junio 2012) y del chimpance son idénticos en el 99,6% y bonobo y humano somos idénticos en el 98,7% de los nucleótidos. El genoma del bonobo muestra que más del 3% del genoma humano está más cercanamente relacionado con el de bonobos y con el de los chimpancés que el genoma de estos entre sí.
