BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN A.Hasil dan Evaluasi Adapun kegiatan yang dilakukan pada praktik kerja lapang di Balai Besar Karantina Ikan (BBKI) Hasanuddin Makassar, terdiri dari sterilisasi alat dan bahan, pembuatan media tumbuh, isolasi bakteri, Pemurnian bakteri, uji bio kimia bakteri dan identifikasi bakteri. B.Sterilisasi Alat dan Bahan Sterilisasi
adalah
suatu
proses
atau
kegiatan
yang
bertujuan
untuk
membebaskan suatu alat atau bahan dari segala bentuk kehidupan. Sterilisasi alat bahan yang dilakukan di Balai Besar Karantina Ikan Hasanuddin Makassar ada dua cara yaitu: a. Sterilisasi kering Dalam sterilisasi kering ini alat yang digunakan yaitu oven. Sterilisasi ini dilakukan untuk mensterilkan alat yang terbuat dari kaca atau gelas seperti tabung reaksi, cawan petri, erlenmeyer, pipet dan sebagainya. Alat yang akan disterilkanterlebih dahulu dibungkus dengan kertas bersih. Dalam sterilisasi ini suhu yang digunakan 160°C selama 2 jam, hal ini dimaksudkan untuk mengoksidasi cairan yang terdapat pada tubuh bakteri sehingga terjadi suatu dehidrasi dan akhirnya dapat membunuh bakteri tersebut.
Gambar 4. Sterilisasi kering
15
b.Sterilisasi basah Dalam sterilisasi basah alat yang digunakan yaitu autoclave, alat ini umumnya digunakan untuk mensterilkan bahan atau media tumbuh, adapun suhu yang digunakan dalam sterilisasi ini yaitu 121°C selama 15 menit dengan tekanan 1 atm. Suhu ini merupakan ke tetapan karena umumnya organisme tidak dapat bertahan hidup pada suhu dalam waktu tersebut. Setelah 15 menit autoclave dapat dimatikan (biarkan tekanannya menjadi 0 atm dan suhu kurang dari 100°C).
Gambar 5. Sterilisasi basah C.Pembuatan Media Tumbuh Media tumbuh merupakan suatu zat yang digunakan untuk menumbuhkan jasad renik seperti bakteri, fungsi dari suatu media tumbuh adalah memberikan tempat dan kondisi yang mendukung pertumbuhan dan perkembangbiakan dari mikroorganisme yang ditumbuhkan. Oleh sebab itu setiap media harus memenuhi nutrient yang dibutuhkan
oleh
bakteri
agar
dapat
berkembangbiak.
Mikroorganisme
dapat
berkembangbiak dengan alami atau dengan bantuan manusia. Pengembangbiakan mikroorganisme yang diakukan oleh manusia diantarnya melalui substrat yang disebut media. Untuk melakukan hal ini haruslah dimengerti jenis-jenis nutrient yang diisyaratkan oleh bakteri dan juga macam lingkungan fisik yang menyediakan kondisi optimum bagi pertumbuhannya.
16
Mikroorganisme atau bakteri yang diisolasi harus diketahui jenis media yang disukai atau media yang cocok digunakan dalam perkembangbiakannya sehingga dapat tumbuh dengan baik pada media tersebut. Dalam hal ini media yang akan digunakan oleh mikroorganisme atau bakteri berfungsi sebagai sumber energi untuk melakukan pertumbuhan dan perkembangbiakan sehingga harus sesuai dengan komposisi bahan media
tumbuh.
Adapu
media
yang
digunakan
dalam
pengembangbiakan
mikroorganisme atau bakteri yaitu media tumbuh TSA (Tryptic Soya Agar), TSA NacL, TCBS (Thiosulphate Citate Bile Sukrose). Media tersebut dilarutkan dengan aquadest dan dihomogenkan diatas hot plate dan stirrer, kemudian disterilkan dengan menggunakan autoclave dalam suhu 121°C selama 15 menit (kecuali media TCBS). Hal ini dilakukan agar media tumbuh steril dan terhindar dari kontaminasi lingkungan luar. Setelah proses sterilisasi selesai, maka media tersebut dituang ke dalam cawan petri (petri disk), proses kegiatan ini dilakukan di dalam Laminary flow, sebelum melakukan penuangan Laminary flow terlebih dahulu disterilkan dengan menggunakan Alkohol berkadar 70%. Setelah penuangan selesai maka dilakukan sterilisasi kembali menggunakan sinar Ultra Violet (UV).
Gambar 6. Pembuatan Media Tumbuh D. Pembuatan Media Uji Media uji adalah suatu zat yang digunakan untuk menguji jasad renik seperti bakteri. Hal ini dilakukan untuk mengetahui sifat dari suatu bakteri, sifat baktei dapat dilihat dari kemampuannya merombak media uji. Adapun media uji yang dibuat di BBKI Hasanuddin Makassar yaitu, MIO, MRVP, OF, LIA, KIA, TSIA, Gelatin, Urea, SCA, Glukosa, Malonat, Nitrat, serta berbagai jenis
17
Glukosa lainya. Syarat dan cara pembuatan media ini sama dengan pembuatan media tumbuh, yang membedakan hanyalah wadah yang digunakan, khusus media ini menggunakan tabung reaksi. Selebihnya proses pembuatan dan penuangan sama dengan media tumbuh. E. Isolasi Bakteri Isolasi merupakan suatu kegiatan yang dilakukan untuk memisahkan atau memindahkan suatu organisme tertentu dari lingkungannya, seperti yang terdapat pada organisme (ikan) khususnya kerapu, adapun organisme yang diisolasi yaitu organism yang berukuran mikro sepertihalnya bakteri. Hal ini dilakukan untuk dapat memperoleh kultur murni atau biakan murni bakteri.
Kegiatan pengisolasian bakteri dilakukan
didalam Laminary flow yang sebelumnya telah di sterilkan dengan menggunakan alkohol 70%. Pengisolasian dilakukan secara aseptik dan teliti. Tehnik isolasi bakteri terdiri dari dua cara yaitu tehnik ulas dan tehnik gores. a. Tekhnik ulas Tekhnik ini digunakan apabila biota yang akan diisolasi dalam bentuk larva, cara pengisolasianya yaitu menggerus larva tersebut sehingga halus lalu menambahkan pengencer berupa aquadest 2 ml, hasil dari campuran tersebut diambil menggunakan pipet kemudian dimasukkan ke dalam media tumbuh lalu diulas secara merata. b.Tekhnik gores tekhnik ini dilakukan apabila melakukan pengisolasian bakteri pada ikan berukuran kecil hingga besar. Bakteri diisolasi menngunakan jarum inokulum (ose) yang terlebih dahulu dipanaskan di api Bunsen, hal ini dilakukan agar tidak terjadi kontaminasi bakteri dari udara. Jarum ose yang telah dipanaskan terlebih dahulu didinginkan kemudian ditusukkan ke organ target yang diduga mengandung patogen/bakteri dan selanjutnya digoreskan kepermukaan media tumbuh secara zig-zag dan hati-hati.
18
Setelah proses isolasi bakteri selesai, maka hasil pengisolasian tersebut dimasukkan kedalam incubator dengan suhu 27°C - 30°C dan diinkubasi selama 24-28 jam.
Gambar 7. Isolasi Bakteri
F. Pemurnian Bakteri Kultur murni ialah kultur yang sel-sel mikrobanya berasal dari pembelahan dari satu sel tunggal. Pemurnian dilakukan dari isolasi bakteri yang telah diinkubasi selama 24-48 jam, bakteri yang telah diinkubasi biasanya terdiri dari beberapa koloni bakteri. Sehingga diperlukan pemurnian bakteri secara aseptic agar kita hanya memperoleh satu jenis bakteri saja dalam media tumbuh tersebut. Bakteri yang dimurnikan adalah bakteri yang dominan tumbuh pada media dan terpisah. Pemurnian dilakukan dengan empat goresan, bakteri diambil dari media tumbuh secara aseptic dan digoreskan pada media kultur murni, setelah goresan pertama selesai, lalu jarum ose dipanaskan dan setelah dingin dilakukan goresan kedua, dari goresan kedua ke goresan ketiga tidak perlu memanaskan jarum ose, hal ini dimaksudkan jumlah koloni bakteri dari goresan kedua sudah mulai sedikit, sedangkan goresan keempat terpisah dari goresan1, 2, dan 3. Setelah kultur murni selesai, bakteri tersebut diinkubasi dengan suhu 27°C - 30°C selama 24-48 jam di incubator. Proses pemurnian bakteri ini dilakukan untuk mendapatkan koloni bakteri yang benar-benar murni. Umumnya bakteri yang akan dimurnikan yaitu bakteri yang koloninya terpisah dan tumbuh pada hasil isolasi.Setiap koloni dalam media tumbuh
19
yang berlainan dapat mewakili macam organisme yang bebeda-beda, setiap koloni merupakan biakan murni satu macam mikroorganisme.
Gambar 8. Pemurnian Bakteri
G. Uji Biokimia Bakteri Uji biokimia dilakukan untuk dapat mengidentifikasi bakteri yang menyerang ikan, selain dengan melihat bentuk dan warna koloni bakteri, kita perlu melakukan uji biokimia agar proses identifikasi lebih akurat.
Gambar 9. Uji Biokimia Adapun uji biokimia yang dilakukan di BBKI Hasanuddin Makassar untuk dapat mengidentifikasi bakteri yang terdapat pada sampel uji yaitu sebagai berikut: 1. Uji Pewarnaan Gram Salah satu tekhnik perwarnaan diferensial yang paling penting dan paling luas digunakan untuk bakteri ialah pewarnaan gram. Uji pewarnaan gram dilakukan untuk mengetahui bentuk dari koloni bakteri tersebut dan untuk menentukan warna bakteri apakah termasuk dalam gram negative atau gram positif. Dalam proses ini olesan bakteri yang terfiksasi dikenai larutan-larutan antara lain Kristal violet, larutan yodium,
20
alcohol (bahan pemucat), dan safranin atau babarapa pewarna tandingan lain yang sesuai. Beberapa proses pewarnaan gram yaitu menganbil biakan bakteri, lalu digoreskan diatas objek glass dan diratakan tipis-tipis agar bakteri tersebut tidak menumpuk sehingga mudah diamati, setelah kering lalu difiksasi diatas api Bunsen agar bakteri tersebut benar-benar melekat pada objek glass, tetapi perlu diingat bahwa proses fiksasi jangan terlalu lama dan panas karena dapat menyebabkan bakteri rusak. Setelah fiksasi dilakukan pewarnaan yaitu gram A (Kristal violet) yang menberikan warna ungu pada bakteri dan dilakukan selama 1 menit, kemudian dicuci atau dibilas dan dikeringkan. Setelah gram A dilanjutkan pada gram B (iodine) selama 1 menit, lalu dibilas dengan air mengalir dan dikeringkan. Setelah kering dilanjutkan pada gram C (ethanol) selama 30 detik, lalu dibilas dan dikeringkan, dan yang terakhir adalah gram D (safaranin) selama 2 menit lalu dibilas dan dikeringkan. Setelah kering lalu diamati dibawah mikroskop.
Gambar 10. Uji Pewarnaan Gram 2.Uji Katalase Uji katalase dilakukan untuk mengetahui ada tidaknya enzim katalase pada bakteri. Pengujian ini dilakukan dengan cara mengambil biakan bakteri lalu diletakkan ke objek glass yang telah diberi H2O2, jika tercipta gelembung gas maka uji katalase positif, sedangkan jika tidak tercipta gelembung maka uji katalase negatif.
Gambar 11. Uji Katalase
21
3.Uji Oksidase Uji oksidase dilakukan untuk mengetahui ada tidaknya enzim oksidase pada bakteri tersebut. Uji ini dilakukan dengan cara mengambil biakan bakteri dan diletakkan pada kertas oksidase, jika kertas oksidase berwarna biru maka uji oksidase positif, sedangkan apabila tidak terjadi perubahan warna maka uji oksidase negatif.
Gambar 12. Uji Oksidase
4.Uji MIO Uji MIO terdiri terdiri dari motil, indol dan ornithin yang dimana uji MIO dimaksud untuk melihat pergerakan bakteri apakah motil atau tidak motil. Biakan bakteri diambil menggunakan jarum ose lurus dan tusukan secara vertical dan diinkubasi selama±24 jam, lalu dilihat perubahan yang terjadi. Apabila biakan bakteri menyebar dari garis tusukan maka motil positive, sedangkan apabila terjadi perubahan warna menjadi ungu maka ornithin positive dan apabila terjadi cincin merah setelah pemberian larutan kovak’s maka indol positive.
Gambar 13. Uji MIO
22
5.Uji OF Uji OF ini dilakukan untuk mengetahui sifat oksidatif dan fermentative suatu bakteri terhadap glukosa. Uji dilakukan dengan cara mengambil biakan bakteri menggunakan jarum ose dan ditusukkan secara vertikal ke dalam 2 buah tabung yang berisi media OF dan salah satu dari tabung tersebut diberi parafin cair. Adapun pembacaan uji OF yaitu apabila terjadi perubahan warna pada kedua tabung tersebut maka uji OF fermentative atau positive, sedangkan jika hanya terjadi perubahan warna pada satu tabung (tidak memiliki parafin) maka uji OF oksidatif dan apabila sama sekali tidak terjadi perubahan warna pada kedua tabung tersebut maka uji OF negative.
Gambar 14. Uji OF 6.Uji TSIA (Triple Sugar Agar) Uji TSIA ini bertujuan untuk melihat perubahan warna yang terjadi pada goresan miring dan tusukan tegak dan melihat reaksi bakteri terhadap asam dan basa, serta kemampuan bakteri menghasilkan gas dan H2S. Apabila terjadi perubahan warna merah pada goresan miring dan tusukan tegak maka bakteri bersifat K/K (basa), jika perubahan warna menjadi merah pada goresan miring dan warna kuning pada tusukan tegak maka bakteri bersifat K/A (basa-asam), sedangkan apabila perubahan warna kuning pada goresan miring dan warna merah pada tusukan tegak maka bakteri bersifat A/K (asam-basa). Selain itu apabila tercipta warna hitam, maka bakteri menghasilkan H2S dan apabila ada gas, maka bakteri mampu menghasilkan gas.
23
Gambar 15. Uji TSIA 7.Uji Arginine dihydrolisis Uji Arginine dihydrolisis dilakukan dengan cara mengambil biakan bakteri dengan menggunakan jarum ose lurus, lalu ditusukkan secara vertical ke media Arginine dan diinkubasi selama ±24 jam. Jika terjadi perubahan warna dari kuning menjadi merah muda berarti uji Arginine positive, sedangkan apabila tidak terjadi perubahan warna maka uji Arginine negative.
Gambar 16. Uji Arginin
8.Uji Novobiosin Uji
Novobiosin
bertujuan untuk
melihat
sensitivitas
bakteri
terhadap
Novobiosin atau tingkat kerentanan bakteri terhadap suatu zat mikroba seperti antibiotic. Uji ini dilakukan dengan cara mengambil biakan bakteri dan digoreskan kemedia baru dan diberi Novobiosin dan diinkubasi selama ±24 jam. Setelah itu dilakukan pengamatan, apabila bakteri manghindari Novobiosin maka hasilnya positive
dan
sebaliknya
hasilnya negative.
apabila
bakteri
tidak
menghindari
Novobiosin
maka
24
Gambar 17. Uji Novobiosin 9.Uji MRVP Uji ini dilakukan untuk mengetahui perubahan warna setelah pemberian regent Methyl Red (MR) dan Vogest Proskauer (VP). Penbacaan MR yaitu positif apabila terjadi paerubahan warna manjadi merah setelah pemberian Regent MR dan negative apabila berwarna kuning. Sedangkan untuk VP yaitu apabila terjadi perubahan warna menjadi merah setelah pemberian VP maka VP positif dan negative apabila perubahan warna menjadi kuning.
Gambar 18. Uji MRVP 10. Uji Nitrate Uji ini bertujuan untuk mengetahui kemampuan bakteri untuk mengubah nitarat
menjadi
nitrit.
Jika
penambahan sulfanik acid positif
terjadi
perubahan
warna
menjadi
merah
setelah
dan a-napthylamine sebanyak 5 tetes maka uji nitrat
dan apabila perubahan warna menjadi kuning maka hasilnya negatif.
Gambar 19. uji Nitrat
25
11. Uji Malonate Uji ini dilakukan untuk melihat perubahan malonate, mengambil biakan bakteri lalu memasukkan biakan ke dalam media malonate. Jika terjadi perubahan warna dari hijau maenjadi biru, maka uji malonate positif dan jika malonate tidak berubah warna maka uji malonate negative.
Gambar 20. Uji Malonat 12. Uji KIA (Kligler Iron Agar) Uji KIA ini terdiri dari goresan miring/slant (diaminase) dan tusukan/butt (decarboxylase). Dilakukan dengan cara mengambil biakan bakteri menggunakan jarum ose lalu goreskan pada slant dan ditusukkan pada butt, setelah itu di inkubasi selama ±24 jam. Jika terjadi perubahan pada slant dari warna merah menjadi kuning, berarti diaminase positif, dan apabila terjadi perubahan warna pada butt dari merah menjadi kuning berarti decarboxylase positif, sedangkan apabila tidak terjadi perubahan pada slant dan butt maka maka uji KIA ini negative. Apabila terjadi perubahan warna menjadi hitam berarti bakteri tersebut mampu menghasilkan gas (H2S).
Gambar 21. Uji KIA
26
13. Uji SCA (Simons Citrate Agar) Uji SCA dilakukan dengan cara mengambil biakan bakteri mengunakan jarum ose, lalu digoreskan pada media SCA dan diinkubasi ±24 jam. Setelah diinkubasi, diamati perubahan warna yang terjadi. Jika terjadi perubahan warna dari hijau menjadi biru maka uji SCA positif, sedangkan apabila tidak terjadi perubahan warna maka uji SCA negative.
Gambar 22. Uji SCA 14. Uji LIA (Lysin Iron Agar) Media
LIA
terdiri dari
goresan
miring/slant
(diaminase)
dan
tusukan
lurus/butt (decarboxylase), uji ini dilakukan dengan cara mengambil biakan bakteri dengan menggunakan jarum ose kemudian ditusukkan pada butt dan digoreskan pada slant kemudian diinkubasi selama ±24 jam. Jika terjadi perubahan warna pada slant dan butt menjadi ungu tua maka uji LIA ini positif, dan apabila tidak terjadi perubahan warna maka
pembacaannya negative. Media akan berubah
warna menjadi hitam apabila bakteri yang diuji mampu menghasilkan gas (H 2S).
Gambar 23. Uji LIA 15. Uji Urease Uji urease ini bertujuan untuk mengetahui kemampuan bakteri menghasilkan enzim Urease. Uji ini dilakukan dengan cara mengambil biakan bakteri dengan jarum ose lalu digoreskan pada media urea kemudian diinkubasi selama ±24 jam. Jika terjadi perubahan warna dari kuning kuning menjadi merah muda, maka uji
27
Urase positif dan apabila tidak terjadi perubahan warna pada media urea maka uji Urease negative. 16. Uji Glukosa dan Gas Uji ini bertujuan untuk mengetahui kemampuan bakteri memfermentasi glukosa dan menghasilkan gas. Uji dilakukan dengan cara mengambil biakan bakteri dengan jarum ose kemudian dimasukkan kedalam media glukosa yang didalamnya diberi tabung durham, adapun tujuan dari pemberian tabung durham ini adalah untuk mengetahui apakah bakteri yang sedang diuji mampu menghasilkan gas, setelah itu diinkubasi selama ±24 jam. Jika terjadi perubahan warna dari ungu menjadi ungu tua atau kuning maka uji glukosa positif, jika tidak terjadi perubahan warna maka uji glukosa negative. Apabila didalam tabung durham terdapat gelembung maka bakteri tersebut mampu menghasilkan gas (H2S), jika tidak terdapat gelembung di dalam tabung durham maka bakteri tidak menghasilkan gas.
Gambar 25. Uji Glukosa 17. Uji Sukrosa, D-Xylose, Laktosa, Maltosa, Rhamnosa, Trehalose, D-Manitol, LArabinose, Dextrose, Dulcitol, Tryptosa, DL-Phenylalanine, Sorbitol, Inositol, dan Raffinose, Esculin, Inulin. Uji gula-gula ini dilakukan untuk mengetahui kemampuan bakteri melakukan fermentasi karbohidrat. Uji ini dilakukan dengan cara mengambil biakan bakteri dengan jarum ose lalu
dimasukkan ke
dalam media
gula-gula
setelah
itu
diinkubasi selama ±24 jam. Jika terjadi perubahan warna maka pengujian tersebut positif dan apa bila tidak terjadi perubahan warna maka pengujian tersebut hasilnya negative.
28
Gambar 26. Uji Gula-gula
F. Identifikasi Bakteri
Identifikasi bakteri adalah membandingkan bakteri yang belum diketahui dengan bakteri yang sudah diketahui identitasnya, sehingga bakteri yang belum diketahui dapat dikatakan “seperti” bakteri A bukan “seperti” bakteri B-Z. Adapun literatur yang digunakan dalam identifikasi pada Balai Besar Karantina Ikan Hasanuddin Makassar diantaranya adalah : 1. Bacteria from Fish and Other Aquatic Animals A Practical Identification Manual (N B. Buller, 2004) 2. Bacterial Fish Pathogens Diseases Of Farmed And Wild Fish (Austin, B. and Austin, D.A. (2007) 3. Manual for the identification of medical bacteria (Cowan And Steel's, 1993)
29
Gambar 27. Identifikasi bakteri Tabel 1. Jenis-jenis Hama dan Penyakit Ikan Karantina (HPIK) Golongan Bakteri Golongan I
Golongan II
Renibacterium salmonicida
Aeromonas salmonicidae
Nocardia seriolae
Mycobacterium marinum
Nocardia campachi
Mycobacterium chelonei
Nocardia asteroids
Mycobacterium fortuitum
Edwardsiella ictaluri
Edwarsiella tarda
Aerococcus viridians var homeri
Streptococcus iniae
Pseudomonas anguilaaseptica
Pasteurella piscicida Yersinia ruckeri
