incertidumbre fq

IV IBEROLAB

ESTIMACIÓN DE LA INCERTIDUMBRE EN UN MÉTODO DE DETERMINACIÓN MULTIELEMENTAL EN PRODUCTOS AGROALIMENTARIOS POR ESPECTROMETRÍA DE MASAS CON PLASMA ACOPLADO INDUCTIVAMENTE (ICP-MS) 1

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M. Mirat , Mª. Cerezo

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Laboratorio Arbitral Agroalimentario, Crta. Coruña Km. 10.700 28023 Madrid (España),[email protected] (España), [email protected].. Laboratorio Arbitral Agroalimentario, Crta. Coruña Km. 10.700 28023 Madrid (España), [email protected] [email protected].

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1. Resumen La Norma UNE/ISO/IEC17025 UNE/ISO/IEC17025 de “Requisitos generales relativos a la competencia de los laboratorios de ensayo y calibración” (1), pone especial énfasis en la necesidad de estimar la incertidumbre del ensayo, así como en el cálculo de las incertidumbres asociadas con calibraciones internas. En el presente trabajo se describe un procedimiento para para la estimación de la incertidumbre de la medición, aplicado a un método de determinación multielemental (Al, As, Ba, Cd, Co, Cr, Cu, Fe, Mn, Ni, Pb, Se, Sn, V y Zn), en productos agroalimentarios por Espectrometría de Masas con Plasma de Acoplamiento Inductivo (ICP-MS). (ICP-MS). El cálculo de la incertidumbre está basado en el modelo “bottom-up”, que es una aproximación teórica de expresión de la incertidumbre en la medición, recomendado por la Guía EURACHEM (2). Este modelo consiste en la identificación y cuantificación de las distintas fuentes de incertidumbres, tanto internas como externas, que posteriormente se sumarán cuadráticamente para obtener la incertidumbre combinada. El resultado final se compara con el criterio de funcionamiento aplicado a la incertidumbre uf (incertidumbre estándar máxima), del Reglamento 333/2007/CE de la Comisión (3).

•

Documentar de forma transparente el procedimiento de medida. medida. • Permitir la comparación de resultados entre distintos laboratorios. Existen diversos modelos para la estimación de la incertidumbre propuestos por organismos internacionales. Seguidamente se describen brevemente algunos de ellos: 1. Cálculo del equivalente del intervalo de confianza a partir del factor “t de student” aplicado a la desviación estándar de los resultados. 2. La aproximación teórica denominada “bottom-up”, recomendada por la Guía EURACHEM (2), para la Expresión de Incertidumbre en la Medida. 3. La aproximación práctica “Top-down” a partir de la desviación estándar relativa obtenida de estudios interlaboratorio según el protocolo armonizado IUPAC/AOAC o ISO 5725 (5). 4. Aplicación de la fórmula de Horwith, que relaciona la desviación estándar relativa con la concentración expresada como una fracción de masa, basada en una revisión de los resultados de más de 200 ensayos colaborativos independientes, Horwith, (1982) (6). (1-0.5 LogC)

RSDR =2 5.

2. Introducción Según el documento CEA-ENAC-LC/02 (4) “La incertidumbre de una medición es una estimación de la parte del resultado completo que caracteriza el intervalo de valores dentro del cual se encuentra el valor verdadero de las cantidades medidas o mesurando”. La incertidumbre siempre va a estar asociada a una desviación típica. La estimación de la incertidumbre de un procedimiento de ensayo es necesaria por las siguientes razones: • Para la acreditación según la Norma Norma ISO 17025 (1). (1). • Para mejorar el conocimiento del procedimiento de medida. • Demostrar la calidad de los resultados de las mediciones.

A partir de la información obtenida durante el proceso de validación del método analítico se han descrito dos procedimientos distintos: 5.1 Identificación de las fuentes generales de incertidumbre: Falta de exactitud (Sesgo) Precisión (Proceso) Falta de trazabilidad Modelo “caja negra” Es un procedimiento global que consiste en emplear un material de referencia certificado, que debe ser de concentración parecida a la de las muestras analizadas.

Hemos seleccionado la aproximación teórica “Bottomup” como sistema más adecuado para la estimación de la incertidumbre del procedimiento de determinación

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M. Mirat, Mª. Cerezo. Estimación de la incertidumbre en un método de determinación multielemental por ICP-MS.

multielemental en productos agroalimentarios por ICP-MS, debido a que: se analizan distintos elementos, en gran número de matrices y con un amplio rango de concentraciones.

F1: coeficiente de incertidumbre de la solución p atrón certificada comercial (1000 ppm/ 1000 ppm = 1). F2: coeficiente de incertidumbre en el patrón intermedio ([(1000 x 1) /100] /10 =1).

3. Desarrollo

3.3. Identificación de las fuentes de incertidumbre

En la aplicación del modelo “bottom-up” se deben seguir los siguientes pasos: 3.1. Especificación del mesurando. 3.2. Especificación de la expresión matemática para el cálculo del mesurando. 3.3. Identificación de las fuentes de incertidumbre, tanto las asociadas a la expresión matemática del mesurando como las que no aparecen explícitamente en ella. 3.4. Cuantificación de los componentes. 3.5. Calculo de la incertidumbre combinada. 3.6. Calculo de la incertidumbre expandida.

La incertidumbre de una medida está afectada por dos tipos de componentes:

3.1. Especificación del mesurando

3.3.2. Componentes tipo B (Fuentes externas del análisis). Se caracterizan por tener un valor definido, un signo y una magnitud exactamente de la misma forma, están relacionados con los errores sistemáticos y su valor es independiente del número de medidas realizadas. Se evalúan identificando de forma individual las posibles causas de errores sistemáticos que afectan al resultado. Según la expresión matemática del mesurando (Ec.1), se deben tener en cuenta las siguientes contribuciones a la incertidumbre: Fuentes de incertidumbre directas asociadas a la determinación de masas. Error de la balanza utilizada al obtener el peso inicial y final (u bal). Fuentes de incertidumbre directas asociadas a la calibración del equipo. Error de la concentración estimada a partir de la interpolación de la intensidad de la muestra en la curva de calibración (ucal). Fuentes de incertidumbre directas asociadas a la solución patrón certificada comercial (uF1). Error aportado por dicha solución. Fuentes de incertidumbre directas asociadas al patrón intermedio (uF2). Error debido a la preparación de esta solución. Fuentes de incertidumbre asociadas al efecto matriz (um). Se cuantifica en función de la recuperación obtenida. Por otra parte, en el procedimiento de validación del método se debe comprobar la exactitud, estudiando si existen diferencias significativas entre el valor de un material certificado de referencia (MCR) y el valor obtenido en el laboratorio, mediante una prueba t de student. Además, según el documento del CODEX CX/MAS 05/26/4 (7) y El Reglamento 333/2007/CE de la Comisión (3), para las muestras cuyo rango de concentración se encuentra cerca del límite de detección, hay que tener en cuenta la influencia del mismo en el cálculo de la incertidumbre.

Se selecciona el elemento a cuantificar describiendo el proceso de medición y estableciendo las variables de entrada para su obtención. La muestra se prepara por digestión en microondas y posteriormente se cuantifica mediante una curva de calibración que relaciona la respuesta del equipo frente a la concentración. La curva de calibración se obtiene a partir de una solución patrón certificada comercial. Se prepara un patrón intermedio que se diluye para obtener los restantes patrones de la curva de calibración. 3.2. Especificación de la expresión matemática para el cálculo del mesurando Para obtener la expresión matemática necesaria para el cálculo de la concentración final de los elementos en la muestra, aplicando el procedimiento normalizado de trabajo, se debe tener en cuenta el peso de la muestra, las diluciones efectuadas y la concentración de los elementos estimada a partir de la interpolación en la curva de calibración.

Cf =

⎛ (C l x Pf ) ⎞ 1 ⎜⎜ ⎟⎟ x F1 x F2 x R ⎝ Pi ⎠

(Ec.1)

Siendo: Cf : concentración del elemento en la muestra. Cl: concentración del elemento estimada a partir de la interpolación en la curva de calibración. Pf : peso del volumen final de dilución (la dilución se realiza gravimétricamente). Pi: peso de la muestra analizada. R: valor medio de la recuperación en tanto por 1.

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3.3.1. Componentes tipo A (Fuentes internas del análisis). Son aquellos que pueden obtenerse a partir de la distribución estadística de distintas mediciones de un mismo elemento en una muestra y se pueden caracterizar a través de la desviación estándar experimental en condiciones de reproducibilidad (uR ). Están relacionados con los errores aleatorios, las causas son desconocidas y su valor decrece al aumentar el número de medidas.


centro de la recta de calibración, la incertidumbre será menor que cuando se encuentra en los extremos. Por eso es importante conseguir que la dilución aplicada a la muestra nos proporcione concentraciones situadas en el centro de la curva de calibración.

3.4. Cuantificación de los componentes 3.4.1. Fuentes internas Se evalúan mediante el análisis estadístico de una serie de observaciones, calculando la desviación típica en condiciones de reproducibilidad.

uR =

S R

(Ec. 2)

n Siendo: SR : desviación estándar obtenida en las muestras en condiciones de reproducibilidad . n: número de repeticiones que se realizan por cada serie. 3.4.2. Fuentes externas 3.4.2.1. Fuentes de incertidumbre directas asociadas a la determinación de masas, que evalúan el error de la balanza utilizada al obtener el peso inicial y final (u bal). A partir del procedimiento de calibración de la balanza en el que se han tenido en cuenta la incertidumbre de la calibración, la linealidad, la resolución, la deriva diaria, la repetibilidad y los efectos de la densidad, obtenemos la incertidumbre aportada por la balanza en el peso inicial y final de la muestra. 3.4.2.2. Fuentes de incertidumbre directas asociadas a la calibración del equipo. Es el error de la concentración estimada a partir de la interpolación de la intensidad de la muestra en la curva de calibración (ucal). Al obtener la recta de regresión mediante el método de mínimos cuadrados, se considera que la desviación estándar de una concentración es la incertidumbre de la misma.

⎛ S y/x ⎞ Ucal = ⎜ ⎜ b ⎟⎟ x ⎝ ⎠

1 m

+

1 n

+

(X pred - X cal ) 2

∑ (X i - X cal ) 2

(Ec.3)

Siendo: S y/x : desviación estándar de los residuos. pendiente le la recta de calibración. m: número de repeticiones de lecturas de la muestra. n: número de patrones utilizados para obtener la recta de calibración. X pred: concentración del analito leída en la muestra.

b:

Xcal : valor medio de la concentración de los patrones de la curva de calibración. Xi: cada una de las concentraciones de los patrones de la curva de calibración.

3.4.2.3. Fuentes de incertidumbre directas asociadas a la solución patrón certificada comercial (uF1), utilizada para la preparación de los patrones de la curva de calibración. Cuando los datos se expresan asociados a un intervalo de confianza del 95% (como habitualmente viene expresada la incertidumbre en las soluciones certificadas), se obtiene la desviación estándar dividiendo dicho intervalo por el porcentaje adecuado de la curva normal o gaussiana (1,96 ≈2). UF1 uF1= (Ec. 4) 2 3.4.2.4. Fuentes de incertidumbre directas asociadas a la preparación del patrón intermedio de la curva de calibración (uF2). Para calcular la concentración del patrón intermedio de la curva de calibración utilizaremos la siguiente expresión:

C p =

(Va x C sm )

(Ec. 5)

Pf

Siendo: C p: concentración final del patrón. Va: volumen de la alícuota tomada de la solución patrón certificada comercial. Csm: concentración de la solución patrón certificada comercial. Pf : peso del volumen final de dilución (la dilución se realiza gravimétricamente). Identificamos los distintos componentes de incertidumbre que contribuyen al error asociado a la preparación del patrón: la solución patrón certificada comercial, el volumen de la alícuota y la pesada de la dilución final. 3.4.2.5. Fuentes de incertidumbre directas asociadas al efecto matriz (um). Cuando el elemento analizado presenta una sensibilidad diferente en presencia de concomitantes en la muestra en comparación con el elemento analizado en las soluciones patrón, existe una diferencia en la señal debida a una interferencia de matriz. Estas interferencias pueden detectarse comprobando la tasa de recuperación media (R) del elemento añadido a la matriz de la muestra, y se tendrá en cuenta aplicando un factor de corrección (1/R) en la (Ec.1). La incertidumbre aportada por este factor de corrección se obtiene aplicando la siguiente expresión:

En la expresión anterior se observa que si la lectura de la concentración resultado de una observación está en el

3


um=

(1 - R) x Vreal

3.4.2.6. Fuentes de incertidumbre directas asociadas a la existencia de un posible sesgo en el resultado obtenido con el método analítico (ucorr ). Si en el procedimiento de validación se observan diferencias significativas entre el valor de un MCR y el valor obtenido en el laboratorio, se debe aplicar un factor de corrección al resultado final y se deberá tener en cuenta la incertidumbre aportada por este factor aplicando la siguiente ecuación de corrección. E x Vreal

(Ec. 7)

100 x 3

Según el procedimiento para el cálculo de incertidumbre de la Guía EURACHEM (2), una vez identificadas todas las fuentes de incertidumbre y expresadas como desviaciones estándar, es necesario combinarlas adecuadamente utilizando el coeficiente de sensibilidad mediante la siguiente expresión: 2

∑ ci u(xi)

2

Ci=δy/δxi Siendo: ci: coeficiente de sensibilidad. y: deriva parcial de cada valor y con respecto a los demás xi. En general, se utilizan dos simplificaciones para no tener que hacer derivadas parciales. Opción 1: cuando las medidas incluyan solamente operaciones de sumas o diferencias de cantidades y=(p+q+r+…). En este caso todas las unidades son similares y las incertidumbres se combinan directamente (suma cuadrática): 2

u(p) + u(q)

2

Opción 2: las medidas incluyen operaciones de productos o cocientes. En este caso, se suman cuadráticamente las incertidumbres relativas:

4

Una vez que hemos identificado y cuantificado los posibles componentes de la incertidumbre, aplicamos la opción 2 a la expresión matemática para el cálculo del mesurando (Ec.1).

uB= Cf x

⎛ u cal ⎞ ⎜ ⎟ ⎝ Cl ⎠

2

⎛ u bal ⎞ + ⎜ ⎟ ⎝ Pf ⎠

2

⎛ u bal ⎞ + ⎜ ⎟ ⎝ Pi ⎠

2

⎛ u ⎞ ⎟ + ⎜ ⎜ F1 ⎟ ⎝ ⎠ F 1

2

⎛ u ⎞ ⎟ + ⎜ ⎜ F2 ⎟ ⎝ ⎠

2

F 2

⎛ u m ⎞ + ⎜ ⎟ ⎝ R ⎠

2

(Ec. 8)

Para el cálculo de la incertidumbre asociada al patrón intermedio (uF2), se aplica la opción 2 (para obtener la incertidumbre combinada) a la expresión matemática para el cálculo de la concentración del patrón (Ec.5), obteniéndose la siguiente expresión:

uF2=

3.5 Cálculo de la incertidumbre combinada

uc[y(p,q...)] =

2

2

Siendo: E: exactitud. Vreal: valor certificado del MCR.

uc [y(x1,x2,…)]=

⎛ u(p) ⎞ ⎛ u(q) ⎞ ⎜ ⎟ +⎜ ⎟ ⎝ p ⎠ ⎝ q ⎠

uc[y(p,q,…)]=

3

Siendo: R: recuperación en tanto por 1. Vreal: valor obtenido en el análisis de la muestra.

ucorr =

2

(Ec. 6)

Va x Csm Pf

x

⎛ u F ⎞ ⎛ u v ⎞ 2 ⎛ u P ⎞ 2 ⎜ ⎟ + + ⎜ Csm ⎟ ⎜⎝ V ⎠⎟ ⎜⎝ Pf ⎠⎟ ⎝ ⎠ 1

(Ec. 9)

Siendo: uF1: incertidumbre de la solución patrón certificada comercial. uV: la incertidumbre de la pipeta utilizada para tomar la alícuota. Tol. pip x V uV = 3 uP: incertidumbre de la balanza utilizada. Csm: concentración de la solución patrón certificada comercial. V: volumen de la alícuota. Pf : peso final de la dilución. Para el cálculo de la incertidumbre combinada final, también debemos tener en cuenta los componentes de tipo A (uR ) y la posible existencia del sesgo en el método (ucorr ). 2

2

2

uc= u R + u B + u corr

(Ec. 10)

Para las concentraciones cercanas al límite de detección, además, hay que evaluar la posible influencia del mismo en el cálculo de la incertidumbre que se expresa mediante la siguiente función característica: uc=A x C Siendo: A: constante. C: concentración de la muestra.

(Ec. 11)


En este caso, la incertidumbre final se calcula con la siguiente expresión: 2

u=

⎛ C L ⎞ + (AC) 2 ⎜ ⎟ ⎝ 2 ⎠

(Ec. 12)

Siendo: CL= concentración del límite de detección. 3.6. Cálculo de la incertidumbre expandida (U) El último paso es obtener la incertidumbre expandida (U), que se obtiene multiplicando la incertidumbre combinada final (u) por un factor (2), de modo que el resultado se encuentre dentro del intervalo establecido con una probabilidad del 95%. U=2 x u

(Ec. 13)

4. Resultados y discusión Para evaluar los componentes de tipo A que afectan a nuestro procedimiento de trabajo, se ha obtenido la desviación estándar en condiciones de reproducibilidad (SR ), aplicando la (Ec. 2) y realizando cinco series de medidas de cada muestra con dos repeticiones por serie. Para la caracterización de los componentes de tipo B tendríamos que tener en cuenta: - u bal obtenida del certificado de calibración de la balanza. - ucal asociada a la calibración del equipo y obtenida aplicando la (Ec.3). - uF1 obtenida mediante la (Ec. 4). - uF2 obtenida mediante la (Ec. 9). Una vez calculada esta componente, al encontrarse por debajo del límite de detección teórico del método en todos los elementos estudiados, no se tiene en cuenta su contribución a la incertidumbre final. - um obtenida mediante la (Ec. 6). Comprobando que la pendiente de la curva de adición está incluida en el intervalo de confianza del 95% de la pendiente de la curva de calibración y que la media del valor de la recuperación no es significativamente distinta del 100%, se demuestra la no existencia de interferencias de matriz, por lo que no se tendrá en cuenta este componente. Además, en el procedimiento de validación, hemos comprobado que no existen diferencias significativas entre el valor obtenido en el laboratorio y el del MCR, para todos los elementos estudiados. Por lo tanto no será necesario tener en cuenta esta corrección (Ec.7). Según el Reglamento 333/2007/CE de la Comisión (3), la incertidumbre máxima permitida, uf , se debe calcular en función del factor α, que es un factor numérico dependiente del valor de la concentración de la muestra. Los valores que se utilizan se presentan en la tabla 1.

Tabla 1. Factor α en función de la concentración α C (µg/Kg) ≤ 50

0.2 0.18 0.15 0.12 0.1

51-500 501-1000 1001-10000 >10000

En la tabla 2 se muestran las concentraciones bajas, medias y altas de cada elemento, dentro del rango de trabajo del método, para las que se ha calculado la incertidumbre, y en la tabla 3 se compara la incertidumbre obtenida para estas concentraciones con la incertidumbre máxima permitida (uf ), establecida por el citado Reglamento (3). Tabla 2. Concentraciones baja, media y alta estudiadas para cada elemento Elemento Al As Ba Cd Co Cr Cu Fe Mn Ni Pb Se Sn V Zn

C baja (ppb) 480 24 48 12 12 24 60 240 36 96 45 75 600 12 300

C media (ppb) 13590 679 11640 339 2910 679 1698 6780 1018 2716 201 405 2025 2910 406

C alta (ppb) 60000 3000 60000 1500 15000 3000 7500 30000 4500 12000 900 1500 15000 15000 6000

Tabla 3. Incertidumbre obtenida (u) frente a las máxima permitidas (uf ) Elemento

uf (ppb) u (ppb) C alta C baja C media C alta C baja C media Al 87 1359 6000 85 838 3203 As 4.8 136 360 2.4 50 190 Ba 9.6 1164 6000 33* 750 3864 Cd 2.4 61 180 0.48 26 117 Co 2.4 582 1500 39* 270 1385 Cr 4.8 102 360 11* 84 285 Cu 11 204 900 13.6* 99 298 Fe 43 442 3000 15 221 1441 Mn 7.2 122 140 7.8 68.1 118 Ni 17.4 326 2400 5 219 32 Pb 9 36.2 135 2 21 85 Se 14 73 225 10 72 61 Sn 90 243 1500 26 15 561 V 2.5 349 1500 36* 84 138 Zn 54 73 720 47 61 603 *Incertidumbres (u) en las que se supera la incertidumbre máxima (uf ). Se puede observar que corresponden siempre con las concentraciones más bajas.

5. Conclusiones Como muestra la tabla 3, las incertidumbres calculadas para todos los elementos por el método “Bottom-up”, cumplen con el criterio del Reglamento 333/2007/CE de la Comisión (3) (uf ), tanto en las concentraciones altas como en las medias. Sin embargo, se puede observar que para los elementos Ba, Co, Cr, Cu y V, en las concentraciones bajas más cercana al límite de cuantificación, se sobrepasa este valor.

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6. Bibliografía (1) Norma UNE-EN ISO/IEC 17025:2005 Requisitos generales para la competencia de los laboratorios de ensayo y calibración . (2) EURACHEM Guide. The fitness for purpose of analytical methods. A laboratory guide to method validation and related topics. (3) Reglamento (CE) Nº 333/2007 de la Comisión, de 28 de marzo de 2007, por el que se establecen los métod os de muestreo y análisis para el control oficial de los niveles de plomo, cadmio, mercurio, estaño inorgánico, 3-MCPD y benzo(a)pireno en los productos alimenticios . DOCE Nº L 88 de 29/03/2007. (4) Documento CEA-ENAC-LC/02: « Expresión de la Incertidumbre de Medida en las Calibraciones », Entidad Nacional de Acreditación (ENAC), Madrid, 1998. (5) Norma UNE ISO 5725-1. Exactitud (veracidad y precisión) de resultados y métodos de medición , Septiembre de 1998. (6) Horwith, W. (1982) Evaluation of Analytical Methods Used for Regulation. J. Assoc. off Anal. Chem., Vol. 65, Nº 3, 525-530. (7) Documento del CODEX CX/MAS 05/26/4. Proposed Draft Recommendations on the Fitness-for-Purpose Approach to Evaluating Methods of Analysis , Abril, 2005.

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