CARÁCTER ANFOTÉRICO Y PUNTO ISOELÉCTRICO DE AMINOÁCIDOS
RESUMEN Los aminoácidos son moléculas orgánicas las cuales permite la unión entre sí para formar un enlace amida conocido como enlace peptídico. Todos los aminoácidos componentes de las proteínas son L-alfa-aminoácidos. Durante el desarrollo de la práctica se desarrollaron dos titulaciones con diferentes aminoácidos, como es el caso de la Alanina y la Lisina, las cuales sirvieron para analizar el comportamiento de estos, en medios acuosos y con variación diferentes de pH que permitieron evidenciar el comportamiento tampón de estos dos aminoácidos.
INTRODUCCIÓN
principalmente como un ion dipolar neutro (zwitterion).2
Todas las proteínas están constituidas por aminoácidos unidos en una secuencia lineal mediante un tipo específico de enlace covalente (enlace peptídico) formado entre el grupo amino de un aminoácido (—NH2) y el grupo carboxilo (—COOH) del aminoácido precedente. A partir de estas combinaciones, las células tienen la capacidad de sintetizar proteínas, como anticuerpos, enzimas, hormonas, proteínas estructura- les y más. Todos los aminoácidos que se hallan en las proteínas son alfa aminoácidos; es decir, en todos ellos el carbono α (alfa) es
asimétrico y está unido a cuatro grupos diferentes: el grupo carboxilo, el grupo amino, un grupo R y un átomo de H. Todos los aminoácidos de las proteínas tienen configuración L y difieren entre sí
por la estructura de sus cadenas laterales o grupos R. 1 En disolución ácida, el aminoácido es protonado y existe principalmente como un catión. En disolución básica, el aminoácido es desprotonado y existe principalmente como un anión. Entre las dos está a un pH intermedio en el que el aminoácido está balanceado exactamente entre las formas aniónica y catiónica y existe
TABLA 1.Estructura de los aminoácidos mas comunes Este pH se llama punto isoeléctrico (pI) del aminoácido y tiene un valor de 6.01 para la alanina. Más específicamente, el pI de cualquier aminoácido es el promedio de las dos constantes ácidas de disociación que involucran al ion dipolar neutro. 2
con NaOH 0,05M a la cual se le aplicaron primeramente alícuotas de 0,2 mL hasta completar 1 Ml, luego alícuotas de 0.5 ml y por ultimo de 1ml hasta completar la titulación.
Titulación de aminoácido L-lisina En este caso tomaron 5mL de l-lisina para la titulación, En el cual se utilizó inicialmente alícuotas de 0.1 ml después se usaron alícuotas de 0.5 ml hasta llegar a un (pH) de 11.35 y de 1ml para finalizar, esto para tener un conjunto de datos más completo a la hora de graficar.
RESULTADOS Y ANÁLISIS
TABLA 2. Valores de pKa de los aminoácidos.
METODOLOGIA Para el desarrollo de la práctica se dividió en dos partes, en donde la primera parte se realizó un trabajo teórico en casa, el cual fue indispensable para realizar la parte experimental. Para la segunda parte de la práctica se tomaron soluciones acuosas 0,05M de los aminoácidos L-alanina y L-lisina
Para el caso de la titulación de la L-alanina los valores obtenidos para el ácido HCl y la base NaOH se encuentran en la tabla 3. Con los valores obtenidos en la titulación se hicieron los cálculos de la concentración de H+ del ácido HCl: 1 ∗
,
= 0, 5 Moles
Seguidamente de obtener las moles se realizaron los cálculos pertinentes para el desarrollo de la gráfica de la titulación; pH vs Equivalentes de H+ 8
Titulación de aminoácido L-alanina Para el desarrollo de la titulación se tomaron 5 mL de la solución acuosa del aminoácido L-alanina 0,05M en un vaso de precipitado de 50mL. Seguidamente se atendieron las indicaciones para el uso de pH-metro para iniciar con la medición de pH inicial de la solución. Luego se realizaron dos titulaciones a la solución. La primera con HCl 0,05M usando alícuotas de 0.5 mL y la segunda
6 H4 p
2 0 0
0.0002
0.0004
0.0006
0.0008
Equivalentes de H+
FIG1. Gráfico de la curva de titulación obtenida para la alanina con solución 0,05M y solución acida de HCl 0,05M.
Tabla 3. Titulación de la L-alanina con NaoH y HCl
Vln de NaOH
pH
0,2
8,139
0,4
8,553
0,6
8,767
0,8
Vln de HCL
pH
Para el caso de la L-alanina titulada con NaOH la gráfica obtenida se puede observar en la figura 2, para la cual se hizo el mismo procedimiento de la titulación con HCl pero hallando los equivalentes de OH presentes en la base.
0,5
3,364
1
2,955
8,919
1,5
2,754
1
9,05
2
2,61
1,5
9,244
2,5
2,439
2
9,379
3
2,238
2,5
9,53
3,5
2,177
3
9,591
4
2,078
3,5
9,732
4
9,845
4,5
2,01
4,5
9,976
5
1,952
pH VS Equivalentes de OH 14
5
10,098
5,5
1,888
12
5,5
10,233
6
1,839
10
6
10,372
6,5
1,783
6,5
10,534
7
1,754
7
10,745
7,5
1,719
7,5
10,995
8
11,201
8
1,683
8,5
11,388
8,5
1,679
9
11,49
9
1,65
9,5
11,58
9,5
1,618
10
11,646
10
1,59
10,5
11,699
10,5
1,564
11
11,732
11
1,55
12
11,776
11,5
1,54
13
11,853
14
11,887
12
1,531
15
11,928
12,5
1,519
16
11,971
13
1,489
17
11,986
18
11,999
H p
8 6 4 2 0 0
0.0005
Equivalentes de OH-
0.001
Fig2. Gráfico de la curva de titulación obtenida para la alanina con solución 0,05M y solución básica de NaOH 0,05M. La Unión de estas dos graficas estaría gobernada por dos sitios en los cuales el aminoácido presenta comportamiento de tampón como se observa el figura 3.
actúa químicamente como una base, al igual que la arginina esto se debe a que tiene una cadena lateral la cual contiene un grupo amino protonable que por lo general participa en puentes de hidrógeno y como base general en catálisis3. En la figura 4 se puede observar la estructura de la lisina en la cual se evidencia los dos grupos aminos.
Fig3. Curva de calibración de la alanina al aumentar la concentración de OH. Para el caso de la primera parte de la titulación el grupo carboxilo del aminoácido tiene un valor aproximados de pKa de 2,34 el cual al aumentar el pH se desprotona obteniéndose una mezcla del aminoácido protonado y desprotonado en el carbonilo. Es decir que a partir de pH 2,34 (p K 1) el carboxilo se disocia (-COO-) y el amino sigue protonado (-NH3+). Cuando el aminoácido tiene una carga simultáneamente positiva y negativa (zwitterion) podemos observar que el aminoácido tiene un punto de equivalencia al cual se le conoce como punto isoeléctrico en el cual la carga neta es igual a cero. • A partir de pH 9,60 (p K 2) el carboxilo sigue disociado (-COO-) y el amino pierde el protón (-NH2). El aminoácido queda con una carga negativa neta y un pH básico. Titulación de a Lisina La segunda parte de la experimentación se tituló la lisina, que es un aminoácido el cual presenta tres pka diferentes y
Fig 4. Molécula de la Lisina Para el caso de la titulación de la L-lisina los valores obtenidos para el ácido NaoH se encuentran en la tabla 4. Tabla 4. Titulación de la L-lisina con NaOH Vln de OH pH 0,1 7,284 0,2 7,612 0,3 7,757 0,4 7,862 0,5 7,943 0,6 8,012 0,7 8,105 0,8 8,165 0,9 8,214 1 8,285 1,5 8,594 2 8,789 2,5 8,943 3 9,116 3,5 9,26
4 4,5 5 5,5 6 6,5 7 7,5 8 8,5 9 9,5 10 10,5 11 12 13 14 15 16 17 18 20
0,05M y solución básica de NaOH 0,05M. La representación gráfica de la lisina proporciona información sobre la medida de los pK de los grupos ionizabes que en este caso se localizan en el punto medio de la zona tampón. Además las form as io ni za ble s del am inoácido en cada rango de pH y la carga eléctrica del aminoácido encada rango del pH. Cabe recalcar que en disolución ácida, los aminoácidos están protonados y en disolución básica, el aminoácido es desprotonado y existe principalmente como un anión. Cuando ese tiene carga cero, el pI de cualquier aminoácido es el promedio de las dos constantes ácidas de disociación que involucran al ion dipolar neutro. 3
9,396 9,872 10,049 10,14 10,271 10,411 10,443 10,654 10,773 10,883 10,982 11,064 11,153 11,251 11,352 11,493 11,6 11,669 11,749 11,806 11,853 11,882 11,99
Para el caso de la lisina el punto isoeléctrico es de 9,74 debido a su carácter básico y se pude observar los dos puntos cercanos de taponamiento en el pKa 9,16 y pK 10,67. CUESTIONARIO
Luego de hacer los cálculos pertinentes se graficó el pH con los equivalentes de OH.
pH vs Equivalentes OH 14 12 10 H p
8 6 4 2 0 0
0.00001
0.00002
0.00003
Equivalenes de OH-
Fig 4. Gráfico de la curva de titulación obtenida para la lisina con solución
¿Pueden comportarse los aminoácidos como un buffer intracelular? ¿Por qué? Los aminoácidos tienen carácter anfótero PORQUE pueden ceder protones y también captarlos ya que poseen radicales comunes en todos los aminoácidos: el grupo NH2 y el grupo COOH. Estos radicales, al estar en contacto con el agua, se presentan ionizados o protonados; actuando los dos como donantes o aceptores de protones. ¿En qué rangos de pH? Argumente su respuesta. Tenga en cuenta el rango de valores del pKa de los grupos carboxilo y amino de los 20 aminoácidos. Para un pH ácidos el NH2 capta un protón NH3+ (el pka para este radical es 9) y En pH
básicos El COOH pierde un protón: COO- (el pKa para este radical es 2).
En el punto de pKa del grupo amino existe el 50 % de radicales amino protonados (NH3+) y el otro 50 % de radicales amino desprotonados (NH2). En este punto, la variación de pH, si adicionamos NaOH a la solución, es mínima. Por lo tanto, en este punto la capacidad amortiguadora es máxima. En el punto de pKa para el grupo carboxilo existe el 50 % de radicales carboxilo protonados (COOH) y el otro 50 % de radicales carboxilo desprotonados (COO-). En este nivel de pH el aminoácido también es buen amortiguador. 2. ¿Cómo separaría los aminoácidos R, H, D y E de una mezcla a pH 7? Para hacer la separación se necesitó conocer los diferentes pk de los aminoácidos R(Argenina), H(Histina), D(Aspartato) y E(Glutamato) y analizarlos cuando la mezcla estuviera en pH 7. Haciendo los análisis pertinentes se pudo observar que la Argenina en pH 7 presenta una carga neta de +1 el cual en presencia de electroforesis su corrimiento es rápido mientras que a Histina en un pH 7 tiene un carga neta de cero e cual va a generar muy poco movimiento el cual con lleva una mala separación. Para el casa del Aspartato y Glutamato en pH 7 poseen una carga neta de -1 el cual en la separación va hacer que fluya rápidamente hacia cátodo. 3. Calcule el PI del péptido N-E-A-L.
Para calcular el PI del péptido primeramente se desarrolló el enlace peptídico de los aminoácidos mencionados (N-Asparagina, EGlutamato, AAlanina, L-leucina), seguidamente se observaron os sitios de interés, es decir donde la sustancia estaba cargada o poseía diferentes pKa, en el cual se pudo observar 3 puntos de interés NH 3+ con un pk de 8,8, COO - con pk de 4,35 y un grupo COOH con pK de 2,36 e cual a medida que se agregaba equivalentes de OH se pudo observar la desprotonación y la carga neta en cada punto dando como resultado final que entre 2,36 y 4,35 el péptido tiene un carga neta cero el cual utilizando la formula +2 PI = se pudo obtener que el valor 2 del punto isoeléctrico es igual a 3,36.
CONCLUSIONES Utilizando el pH- metro se pudo comprobar el carácter anfótero de la solución de aminoácido L-alanina que tiene la capacidad de donar o aceptar protones gracias a sus grupos amino y carboxilo. Las curvas de titulación muestran los puntos más sobresalientes en la reacción de los aminoácidos, como lo son los pka ya que cerca de estos puntos los aminoácidos presentan carácter tampón, que son importantes para la neutralización y utilización de procesos biológicos. El comportamiento zwitterion del aminoácido se puede observar notoriamente al agregar equivalentes de OH, ya que cerca al punto isoeléctrico la variación de pH es aproximadamente superior e inferior a uno con solo agregar un ml en ambos casos.
BIBLIOGRAFÍA
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MCMURRY, JOHN. QUÍMICA ORGÁNICA, CENGAGE learning 7a. edición,2008.
