Laporan Penelitian

LAPORAN PENELITIAN

PRODUKSI ENZIM SELLULASE DARI KULIT JAGUNG  Zea  (Zea mays)

 M ULTI TI STAG ST AG E F E R ME NTA NT A TI ON  MENGGUNAKAN DENGAN MUL  MENGGUNAKAN KAPANG  Asp  A spe er gillu gi lluss niger  niger 

Oleh: LYAN DEA SAGITA

21030113120056

MUH. FATHURRAZAN FATHURRAZA N

21030113140167

DEPARTEMEN DEPARTEMEN TEKNIK KIMIA FAKULTAS TEKNIK UNIVERSITAS DIPONEGORO SEMARANG 2017

HALAMAN PENGESAHAN LAPORAN PENELITIAN

 Nama/NIM

: Lyan Dea Sagita

21030113120056 21030113120056

 Nama/NIM

: Muh. Fathurrazan

21030113140167 21030113140167

Judul

: Produksi Enzim Selulase dari Kulit Jagung ( Zea mays) mays) dengan  Multistage Fermentation Menggunakan Fermentation Menggunakan Kapang Aspergillus Kapang  Aspergillus niger

Semarang, 4 Mei 2017 Telah menyetujui, Dosen Pembimbing

Ir. Danny Soetrisnanto, M.Eng.  NIP 19541211 19541211 197901 1 001

ii

HALAMAN PENGESAHAN LAPORAN PENELITIAN

 Nama/NIM

: Lyan Dea Sagita

21030113120056 21030113120056

 Nama/NIM

: Muh. Fathurrazan

21030113140167 21030113140167

Judul

: Produksi Enzim Selulase dari Kulit Jagung ( Zea mays) mays) dengan  Multistage Fermentation Menggunakan Fermentation Menggunakan Kapang Aspergillus Kapang  Aspergillus niger

Semarang, 4 Mei 2017 Telah menyetujui, Dosen Pembimbing

Ir. Danny Soetrisnanto, M.Eng.  NIP 19541211 19541211 197901 1 001

ii

RINGKASAN

Enzim selulase merupakan tipe enzim hidrolisis yang berperan dalam degradasi bahan selulotik menjadi glukosa. Enzim selulase dapat diproduksi dari mikroba selulotik baik kapang maupun bakteri.  Aspergillus niger  dipilih   dipilih sebagai agen untuk mengkonversi bahan berselulosa menjadi glukosa karena kapang jenis ini mampu memproduksi enzim lebih tinggi ti nggi daripada produksi enzim oleh bakteri. Produksi enzim selulase memerlukan substrat yang mengandung selulosa. Pada  penelitian ini, substrat yang digunakan adalah limbah kulit jagung karena kandungan selulosa kulit jagung mencapai 42%. Limbah kulit jagung ini perlu ditreatment  ditreatment  terlebih   terlebih dahulu guna menghilangkan kandungan lignin dalam bahan, sebab lignin dapat menghambat penetrasi kapang sebelum proses hidrolisis  berlangsung. Prosesnya dinamakan delignifikasi. Metode yang digunakan dalam  produksi enzim selulase dalam penelitian ini adalah metode multistage  fermentation atau fermentasi secara  sequential , yaitu proses fermentasi dimana  pada tahap  preculture   preculture  digunakan metode  solid state fermentation, fermentation, kemudian dilanjutkan dengan proses produksi enzim dengan metode SmF. Tujuan dari  penelitian ini adalah untuk mengkaji pengaruh perlakuan delignifikasi, pengaruh waktu fermentasi, pengaruh suhu fermentasi, serta pengaruh penggunaan metode  sequential fermentation  fermentation  dalam produksi ekstrak kasar enzim selulase dari kulit  jagung. Proses delignifikasi dilakukan dengan variasi konsentrasi 0; 3; 6 dan 9 %b/v. Waktu fermentasi dilakukan selama 7 hari dengan variasi 2 hari SSF, 5 hari SmF; 3 hari SSF, 4 hari SmF; dan 4 hari SSF, 3 hari SmF. Sedangkan suhu fermentasi divariasi 25; 30 dan 35 oC. Hasil ekstrak kasar enzim selulase tertinggi diperoleh dengan perlakuan delignifikasi 9% b/v; waktu fermentasi 2 hari SSF, 5 hari SmF; dan suhu fermentasi 30 oC dengan aktivitas enzim sebesar 0,07634 IU/ml dan konsentrasi protein terlarut sebesar 2,83259 mg/ml. Kata Kunci:  Aspergillus niger; enzim selulase; kulit jagung;  sequential  fermentation

iii

SUMMARY

 Enzyme cellulase is a type of enzyme hydrolysis that plays a role in degradation of celulotic substrate become glucose. Enzyme cellulase can be  produced from celulotic microbe both fungi and bacteria. Aspergillus niger was choosen as agent to convert cellulose materials become glucose because this kind of fungi can produce enzyme higher than bacteria. Production of enzyme cellulose need a substrate that contain cellulose. In this study, substate used was cornhusk because it contain 42% cellulose. The cornhusk needs to be treated first to remove the lignin in the material, because lignin may inhibit the penetration of fungi before the hydrolysis process undergo. The process is called delignification. The method used in the production of cellulase enzymes in this study is multistage  fermentation or sequential fermentation, i.e. the fermentation process which in the  preculture used solid state fermentation, then proceed with the production of the enzyme by the method of SmF. The purpose of this study was to assess the effect of delignification, fermentation time, fermentation temperature, and the effect of using sequential fermentation method in the production of cellulase enzyme crude extract from cornhusk. Delignification process was carried by varying the concentration of 0; 3; 6 and 9% w/v. Fermentation conducted for 7 days with variation 2 days SSF, 5 days SmF; 3 days SSF, 4 days SmF; and 4 days SSF, 3 days SmF. While the fermentation temperature was varied 25; 30 and 35 oC. The result of the highest cellulase enzyme crude extract obtained by delignification treatment 9% w/v; fermentation time of 2 days SSF, 5 days SmF; and fermentation temperature 30 oC with the enzyme activity of 0,07634 IU/ml and the concentration of soluble protein of 2,83259 mg/ml. Keywords:  Aspergillus niger;  fermentation.

cellulase

enzyme;

cornhusk;

sequential

iv

PRAKATA

Puji dan syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT yang telah memberikan segala rahmat dan karunia-Nya sehingga laporan penelitian dengan  judul “Produksi Enzim Sellulase dari Kulit Jagung ( Zea mays L.) dengan  Multistage Fermentation  Menggunakan Kapang  Aspergillus niger ” ini dapat diselesaikan. Dalam penyusunan proposal ini tidak terlepas dari bantuan pihak pihak lain. Oleh karena itu, dalam kesempatan ini penulis ingin mengucapkan terima kasih kepada: 1. Dr. Nat. tech. Siswo Sumardiono, S.T., M.T., selaku Ketua Departemen Teknik Kimia Universitas Diponegoro. 2. Dr. Andri Cahyo Kumoro, S.T., M.T., sebagai koordinator penelitian yang telah memberikan izin untuk melakukan penelitian. 3. Ir. Danny Soetrisnanto, M.Eng., selaku dosen pembimbing. 4. Semua pihak yang tidak bisa disebutkan sati persatu yang telah membantu terselesaikannya proposal penelitian ini. Disadari bahwa laporan Oleh karena itu,

penelitian ini masih jauh dari kata sempurna.

diharapkan kritik dan saran yang bersifat membangun demi

sempurnanya penelitian ini. Semoga penelitian ini dapat terlaksana dengan baik sehingga dapat memberikan manfaat bagi peneliti dan para pembaca dalam  pengembangan ilmu pengetahuan.

Semarang,

Mei 2017

Penyusun

v

DAFTAR ISI

HALAMAN PENGESAHAN ................................................................................. ii RINGKASAN ........................................................................................................ iii SUMMARY ........................................................................................................... iv PRAKATA .............................................................................................................. v DAFTAR ISI .......................................................................................................... vi DAFTAR TABEL .................................................................................................. ix DAFTAR GAMBAR .............................................................................................. x BAB I PENDAHULUAN ....................................................................................... 1 1.1.

Latar Belakang ......................................................................................... 1

1.2.

Perumusan Masalah .................................................................................. 5

1.3.

Tujuan Penelitian ...................................................................................... 5

1.4.

Manfaat Penelitian .................................................................................... 6

BAB II TINJAUAN PUSTAKA............................................................................. 7 2.1.

Enzim Selulase ......................................................................................... 7

2.2.

Tanaman Jagung ....................................................................................... 8

2.3.

Lignoselulosa.......................................................................................... 10

2.3.1.

Selulosa ........................................................................................... 10

2.3.2.

Hemiselulosa ................................................................................... 12

2.3.3.

Lignin .............................................................................................. 12

2.4.

Delignifikasi ........................................................................................... 14

2.4.1.

Pretreatment dengan CaOH, NaOH, dan KOH ............................... 15

2.4.2.

Pretreatment dengan amonia ........................................................... 16

2.4.3.

Pretreatment dengan sulfat (proses Kraft)...................................... 17

2.5.

Aspergillus niger .................................................................................... 17

2.5.1.

Nutrisi Pertumbuhan Mikroba ........................................................ 18

2.5.2.

Pertumbuhan Mikroba..................................................................... 19

2.6.

Sequential Fermentation ........................................................................ 21

2.7.

Faktor-faktor yang Mempengaruhi Proses Fermentasi .......................... 24

2.8.

Penelitian Terdahulu............................................................................... 26

BAB III METODOLOGI PENELITIAN.............................................................. 29

vi

3.1.

Rancangan Percobaan ............................................................................. 29

3.1.1

Inokulasi Mikroba dan Penyiapan Inokulum .................................. 29

3.1.2

Pretreatment Substrat ...................................................................... 29

3.1.3

Delignifikasi Substrat ...................................................................... 30

3.1.4

Produksi Enzim Selulase dengan Sequential Fermentation ............ 31

3.2

Alat dan Bahan ....................................................................................... 32

3.2.1

Bahan............................................................................................... 32

3.2.2

Alat .................................................................................................. 32

3.3

Variabel Percobaan ................................................................................. 32

3.3.1

Variabel tetap .................................................................................. 32

3.3.2

Bariabel bebas ................................................................................. 32

3.3.3

Rancangan variabel percobaan ........................................................ 33

3.4

Respon yang Dicari ................................................................................ 33

3.5

Cara Kerja ............................................................................................... 33

3.5.1

Pemilihan Mikroba .......................................................................... 33

3.5.2

Inokulasi .......................................................................................... 33

3.5.3

Penyiapan Larutan Nutrisi .............................................................. 34

3.5.4

Penyiapan Inokulum........................................................................ 34

3.5.5

Penyiapan Substrat secara Mekanik ................................................ 34

3.5.6

Delignifikasi dengan Larutan NaOH .............................................. 35

3.5.7

Produksi Enzim Selulase secara Sequential  .................................... 35

3.5.8

Analisa Hasil ................................................................................... 36

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN .............................................................. 39 4.1.

Pengaruh Delignifikasi Terhadap Aktivitas Enzim Kulit Jangung ........ 39

4.2.

Pengaruh Waktu Fermentasi Terhadap Aktivitas Enzim Kulit Jagung .. 40

4.3.

Pengaruh Suhu Fermentasi Terhadap Aktivitas Enzim Kulit Jagung .... 42

4.4.

Pengaruh Perlakuan Delignifikasi, Waktu Fermentasi, dan Suhu

Fermentasi Secara Sequential Terhadap Aktivitas Enzim dan Kadar Protein Enzim Selulase .................................................................................................. 43 BAB V PENUTUP................................................................................................ 47 5.1 Kesimpulan .................................................................................................. 47 5.2 Saran ............................................................................................................ 47

vii

DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................... 48 LAMPIRAN .......................................................................................................... 52

viii

DAFTAR TABEL

Tabel 1.1 Kandungan lignoselulosa tanaman jagung (Yilmaz 2013) ..................... 1 Tabel 1.2 Produksi enzim selulase oleh kapang dan bakteri (Bakti 2012) ............. 3 Tabel 1.3 Perbandingan aktivitas endoglukanase pada produksi enzim selulase ... 4 Tabel 2.1 Sifat kimia selulosa, hemiselulosa, dan lignin ...................................... 14 Tabel 2.2 Nutrien dalam proses fermentasi (Sanjaya and Adrianti 2012) ............ 19 Tabel 3.1 Rancangan variabel percobaan.............................................................. 33 Tabel 4.1 Nilai rata-rata kadar protein terlarut filtrat kasar enzim selulase (mg/ml) ............................................................................................................................... 46

ix

DAFTAR GAMBAR

Gambar 2.1 Struktur selulase .................................................................................. 7 Gambar 2.2 Tanaman jagung .................................................................................. 9 Gambar 2.3 Konfigurasi sederhana jaringan kayu ................................................ 10 Gambar 2.4 Struktur tunggal selulosa ................................................................... 11 Gambar 2.5 Struktur unit-unit penyusun hemiselulosa ......................................... 12 Gambar 2.6 Unit-unit penyusun lignin.................................................................. 13 Gambar 2.7 Reaksi delignifikasi dengan NaOH ................................................... 16 Gambar 2.8 Aspergillus niger ............................................................................... 18 Gambar 2.9 Fase pertumbuhan mikroba ............................................................... 21 Gambar 2.10 Hubungan metode fermentasi dengan aktivitas endoglucanase ...... 23 Gambar 3.1 Rancangan pengembangbiakan inokulum  Aspergillus niger  ............ 29 Gambar 3.2 Pretreatment substrat secara mekanik ............................................... 29 Gambar 3.3 Proses delignifikasi substrat .............................................................. 30 Gambar 3.4 Proses fermentasi secara sequential  .................................................. 31 Gambar 4.1 Pengaruh delignifikasi (%b/v) terhadap aktivitas endoglukonase substrat kulit jagung .............................................................................................. 39 Gambar 4.2 Pengaruh waktu fermentasi terhadap aktivitas endoglukanase substrat kulit jagung ........................................................................................................... 41 Gambar 4.3 Pengaruh suhu fermentasi terhadap aktivitas enzim selulase............ 43 Gambar 4.4 Aktivitas enzim dengan metode sequential fermentation ................. 44 Gambar 4.5 Konsentrasi protein dengan metode sequential fermentation ........... 45

x

BAB I PENDAHULUAN 1. BAB I PENDAHULUAN 1.1. Latar Belakang Jagung merupakan salah satu komoditi agrobisnis di Indonesia yang

 jumlahnya sangat melimpah ruah. Daerah-daerah utama penghasil tanaman  jagung di Indonesia adalah Jawa Tengah, Jawa Barat, Jawa Timur, Madura, Yogyakarta, Nusa Tenggara Timur, Sulawesi Utara, Sulawesi Selatan, dan Maluku. Salah satu daerah yang tingkat pengembangan jagungnya dilakukan secara intensif adalah Jawa Tengah, khususnya di daerah Grobogan dengan luas lahan pertanian jagung yang sudah digunakan sebesar 98.909 Ha dan  produksi mencapai 518.677 ton (BPS 2015). Tanaman jagung memiliki daur hidup yang relatif pendek berkisar 80-150 hari dan dapat dipanen dalam  jumlah yang besar. Tingginya tingkat produksi jagung dan waktu panen yang relatif singkat memungkinkan dihasilkan limbah tanaman jagung meliputi  batang jagung, tongkol jagung, dan kulit jagung (klobot jagung) yang  jumlahnya tidak sedikit. Selama ini, limbah jagung hanya dimanfaatkan sebagai

makanan

ternak,

pembungkus

rokok,

pembungkus

makanan

tradisional, kerajinan tangan berupa bunga-bungaan hias, digunakan sebagai  bahan bakar, maupun dibakar begitu saja (Ningsih 2012). Padahal, sebagian  besar limbah jagung adalah bahan berlignoselulosa. Tabel 1.1 Kandungan lignoselulosa tanaman jagung (Yilmaz 2013) Bagian

Selulosa (% wt)

Hemiselulosa (% wt)

tanaman

Batang jagung Tongkol

Lignin (% wt)

45

16,8

14

33,7

31,9

6,1

42

27

13

 jagung Kulit jagung

Lignoselulosa terdiri atas tiga komponen fraksi serat yaitu selulosa, hemiselulosa, dan lignin. Dari komponen-komponen tersebut, selulosa merupakan komponen yang paling banyak digunakan dalam industri kertas,  pulp dan produk turunannya. Selulosa yang terdapat dalam kulit jagung dapat

1

digunakan sebagai bahan baku pembuatan enzim selulase, yaitu enzim yang  berperan dalam hidrolisis selulosa untuk menghasilkan glukosa, yang laku di  pasaran dan dibutuhkan untuk berbagai keperluan pembuatan zat-zat kimia lain yang berniali ekonomis tinggi seperti etanol, aseton, dan asam-asam organik (Gunam, Buda and Guna 2010). Namun dalam proses konversinya memerlukan beberapa tahapan, agar dapat diubah menjadi enzim selulase. Berbagai metode untuk mengkonversi lignoselulosa telah dilakukan,  baik secara fisik maupun kimia. Salah satu metode yang cukup efektif adalah melalui reaksi hidrolisis (Bakti 2012). Pada umumnya hidrolisis bahan lignoselulosa dapat dilakukan dengan dua cara, yaitu hidrolisis asam dan hidrolisis enzimatis. Hambatan proses hidrolisis selulosa baik secara asam maupun enzimatis adalah adanya struktur kristalin dan lignin yang berfungsi sebagai pelindung selulosa. Masalah tersebut dapat diatasi dengan pemberian  perlakuan pendahuluan terhadap bahan yang akan dihidrolisis. Salah satu metode perlakuan pendahuluan secara kimia adalah perlakuan delignifikasi menggunakan NaOH (Gunam, Buda and Guna 2010). Proses ini penting dilakukan sebelum hidrolisis bahan selulotik, sebab lignin dapat menghambat  penetrasi asam sebelum proses hidrolisis berlangsung. Dengan pemberian  perlakuan delignifikasi pada substrat maka selulosa alami diharapkan menjadi mudah dihidrolisis. Enzim selulase dapat diproduksi dari mikroba selulotik baik kapang maupun bakteri. Kapang selulotik yang sering digunakan berasal dari jenis Trichoderma, Aspergillus,  dan  Penicillium. Sedangkan bakteri yang bisa menghasilkan

selulase

adalah  Pseudomonas,

Cellulomonas,

Bacillus,

 Micrococcus, Cellovibrio dan Sporosphytophaga  (Wahyuningtyas, Argo and  Nugroho 2013). Akan tetapi, kapang selulotik lebih banyak digunakan untuk  produksi enzim secara komersial, karena tingkat produksi enzim oleh kultur tersebut lebih tinggi daripada produksi enzim oleh yeast  dan bakteri.

2

Tabel 1.2 Produksi enzim selulase oleh kapang dan bakteri (Bakti 2012) Aktivitas Mikroorganisme

 Aspergillus niger A 20

Cellobiase 27,5 U/ml

 Aspergillus niger NRRL3

Cellobiase 215 IU/g cellulose

Trichoderma reesei  Bacillus pumilus

FPAse 108 U/g cellulose CMCase 1,9 U/ml, Cellobiase 1,2 U/ml

 Bacillus sp. KSM N252

CMCase 0,17 U/mg protein

 Bacillus subtilis

FPAse 1,08 U/mg protein

Semua jenis kapang dari genus  Aspergillus  mampu mensintesis enzim selulase, oleh karena itu kapang jenis ini berpotensi mendominasi industri enzim.  Aspergillus  dan Trichoderma sp. diketahui sebagai penghasil enzim selulase yang cukup efisien. Enzim selulase saat ini banyak diproduksi baik menggunakan  solid state fermentation (SSF) maupun  submerged fermentation  (SmF). SSF menggunakan substrat padat, seperti sekam padi, ampas tebu, bubur kertas, sedangkan SmF menggunakan substrat cair yang mudah mengalir, seperti molases dan broth. Keuntungan utama fermentasi menggunakan media padat adalah limbah kaya nutrisi dapat dengan mudah dimanfaatkan menjadi substrat. Selain itu, SSF mampu menyediakan kondisi pertumbuhan yang sama seperti lingkungan dimana jamur tumbuh secara alami. SSF sangat cocok

diterapkan

untuk

fermentasi

yang

menggunakan

kapang

dan

mikroorganisme yang membutuhkan tingkat kelembaban yang rendah, akan tetapi kelemahan utamanya adalah pengaturan temperatur, pH dan nutrien yang sulit dilakukan dalam media padat. Submerged Fermentation (SmF) atau  Liquid Fermentation  (LF) cocok digunakan untuk mikroorganisme seperti  bakteri

yang membutuhkan tingkat

kelembaban

yang cukup tinggi.

Keuntungan menggunakan SmF adalah recovery  produk yang cukup mudah (Virmala and Ravichandran 2012), selain itu juga pengontrolan temperatur,  pH maupun nutrien mudah dilakukan dalam medium cair. Kombinasi dari kedua metode tersebut dikenal sebagai  sequential fermentation (Cunha, et al.

3

2012). Dengan metode  sequential fermentation  produksi enzim selulase mampu mencapai taraf yang lebih menjanjikan. Tabel 1.3 Perbandingan aktivitas endoglukanase pada produksi enzim selulase Metode

Aktivitas

Fermentasi

Endoglukanase

Cellulase Production by Aspergillus niger

SSF

6 U/gr

on Different Natural Lignocellulosic

SmF

0,45 U/ml

 Liquid Hot Water and Steam Explosion

Sequential

1,26 IU/ml

 Pretreatment of Sugarcane Bagasse for

 fermentation

Judul Penelitian

Substrates (Reddy et al., 2015)

 Enzyme Production by a Sequential SolidState and Submerged Method (Cunha et al., 2014) Sequential Solid-State and Submerged Cultivation

of

Aspergillus

niger

Sequential

on  fermentation

1,052 ± 0,034 IU/ml

Sugarcane Bagasse for the Production of Cellulase (Cunha et al., 2012) Pada penelitian yang dilakukan oleh (F. M. Cunha 2014) mengenai  produksi enzim menggunakan ampas tebu yang di  pretreatment  menggunakan  Liquid Hot Water   (LHW) dan Steam Explosion  (SE) melalui metode  sequential solid state fermentation  dan  submerged fermentation  diperoleh  Aspergilus niger   memiliki aktivitas endoglucanase sebesar 1,26 IU/mL, aktivitas xylanase sebesar 26,25 IU/mL, aktivitas β-glucosidase sebesar 3,70 IU/mL, dan aktivitas β-xilosidase sebesar 0,58 IU/mL dengan  pretreatment  LHW. Pretreatment menggunakan LHW dan SE yang notabene bukan bahan kimia memungkinkan hasil yang diperoleh kurang optimum. Oleh karena itu, diperlukan  pretreatment   menggunakan

bahan

kimia

agar

aktivitas

enzimatiknya lebih optimal. Salah satu prosesnya adalah delignifikasi menggunakan NaOH. Pada penelitian ini, dilakukan pengkajian mengenai  pengaruh waktu fermentasi, suhu fermentasi, dan perlakuan delignifikasi substrat dalam produksi enzim selulase dari limbah kulit jagung menggunakan

4

metode fermentasi berurutan ( sequential fermentation) dalam bioreaktor guna menghasilkan enzim selulase dengan bantuan Aspergillus niger .

1.2. Perumusan Masalah Produksi enzim selulase dapat dilakukan dengan metode  solid state

 fermentation  (SSF) dan  submerged fermentation  (SmF). Kekurangan dari metode SSF adalah pengaturan temperatur, pH dan nutrien yang sulit dilakukan dalam media padat (Cunha et al., 2012). Kekurangan ini dapat tertutupi dengan penggunaan metode SmF karena pengontrolan temperatur,  pH maupun nutrien mudah dilakukan dalam medium cair. Kombinasi dari kedua metode tersebut dikenal sebagai  sequential fermentation (Cunha et al., 2012). Penggunaan limbah tongkol jagung sebagai substrat dalam produksi crude enzim selulase secara fermentasi sudah dilakukan oleh Susiany dkk, (2013) sedangkan untuk limbah kulit jagung belum pernah dilakukan. Penggunaan metode sequential fermentation untuk produksi crude enzim juga menghasilkan aktivitas enzim yang lebih baik. Oleh karena itu perlu dilakukan  penelitian lebih lanjut mengenai produksi crude enzim selulase dengan bahan  baku limbah kulit jagung secara  sequential   beserta variabel-varabel yang mempengaruhi sehingga dapat diketahui kondisi terbaik dalam proses  produksinya.

1.3. Tujuan Penelitian 1. Mengkaji pengaruh delignifikasi limbah kulit jagung terhadap hasil

sintesis enzim selulase dari limbah kulit jagung 2. Mengkaji pengaruh waktu fermentasi terhadap hasil sintesis enzim selulase dari limbah kulit jagung yang sudah dilakukan delignifikasi 3. Mengkaji pengaruh suhu fermentasi terhadap hasil sintesis enzim selulase dari limbah kulit jagung yang sudah dilakukan delignifikasi 4. Mengkaji pengaruh penggunaan metode  sequential fermentation  terhadap aktivitas enzim selulase dan kadar protein terlarut ekstrak kasar enzim selulase.

5

1.4. Manfaat Penelitian 1. Mengurangi limbah kulit jagung dengan memanfaatkannya sebagai

substrat dalam produksi enzim selulase. 2. Dengan

metode

 sequential

fermentation 

diharapkan

dapat

mengoptimalkan proses produksi enzim selulase dari limbah kulit jagung 3. Dengan berbagai variabel operasi yang digunakan diharapkan dapat mengetahui kondisi optimum dalam produksi enzim selulase oleh  Aspergilus niger  menggunakan substrat yang mengandung selulosa; dalam  penelitian ini berupa kulit jagung.

6

BAB II TINJAUAN PUSTAKA 2. BAB II TINJAUAN PUSTAKA 2.1. Enzim Selulase Selulase merupakan enzim yang diproduksi terutama oleh jamur,

 bakteri dan protozoa yang mengkatalis proses hidrolisis selulosa. Enzim ini merupakan tipe enzim hidrolisis. Selulase juga dapat dihasilkan oleh beberapa organisme tipe lain seperti termit (mikroba parasit) yang hidup bersimbiosis di dalam perut organisme lainnya. Beberapa jenis selulase telah diketahui memiliki struktur dan mekanisme yang berbeda (Bakti 2012). Selulase merupakan biokatalis (protein) berbobot molekul besar. Salah satu sifat unik enzim sebagai biokatalis adalah selektifitas yang sangat tinggi. Reaksi yang dikatalisis oleh enzim sangat spesifik baik produk maupun substratnya, bahkan juga spesifik stereokimia apabila substratnya tersedia dalam dua bentuk isomer (Galbe and Zacchi 2007). Selulase dihasilkan mikroorganisme di luar tubuhnya (eksoenzim). Selulase mengandung gugus ikatan karbohidrat non-katalitik (CBMs) dan/atau gugus fungsional yang lain, yang dapat terletak pada ikatan  –   N atau ikatan – C dari gugus katalitik (Yang, El-Enshasy and Thongchul 2013).

Gambar 2.1 Struktur selulase (Zhong, Du and Xi 2013) Untuk mendegradasi selulosa menjadi glukosa, terdapat tiga jenis enzim utama yang bekerja. Konversi efektif dari selulosa menjadi monosakarida hanya dimungkinkan oleh kerja sinergis dari ketiga sub- group selulase berikut (Bakti 2012):

7

1. Endo-β Endo-β-1,4-Dglukanase yang memecah ikatan internal glukosidik yang  berasal diantara rantai glukan yang utuh 2. Exo-β Exo-β-1,4-Dglukanase/Exo- β-1,4-Selobiohidrolase yang memecah dimer selobiosa dari rantai glukan yang melepaskannya kedalam larutan 3. β-glucosidase yang menyempurnakan hidrolisis selulosa menjadi glukosa dengan memecah selobiosa menjadi monomer glukosa. Selulase banyak digunakan untuk beragam keperluan industri, seperti industri tekstil, industri kertas dan pulp, industri makanan, dan banyak digunakan sebagai aditif detergen, serta untuk pakan ternak. Saat ini enzim selulase tercatat sebagai salah satu enzim yang sangat penting dalam pasar industri enzim dunia. Berkurangnya minyak mentah dan munculnya emisi gas rumah kaca membuat peneliti mengembangkan produksi bioetanol dari bahan  berlignoselulosa, melalui proses hidrolisis enzimatik dari bahan tersebut (Yang, El-Enshasy and Thongchul 2013).

2.2. Tanaman Jagung Tanaman jagung termasuk dalam keluarga rumput-rumputan dengan

spesies Zea spesies  Zea mays L. mays L. tanaman ini berasal dari Amerika yang tersebar ke Asia dan Afrika melalui kegiatan bisnis orang-orang Eropa. Sekitar abad ke-16 orang Portugal menyebarluaskannya ke Asia termasuk Indonesia. Orang  belanda menamakan jagung dengan mais  mais  dan orang Inggris menamakannya corn. corn. Jagung merupakan tanaman semusim (annual), satu siklus hidupnya diselesaikan dalam 80 –  80  –  150   150 hari. Paruh pertama dari siklus merupakan tahap  pertumbuhan vegetatif dan paruh kedua untuk tahap pertumbuhan generatif (Samin 2014).

8

Gambar 2.2 Tanaman jagung (Balitsereal 2011) Tanaman jagung sangat bermanfaat bagi kehidupan manusia dan hewan karena hampir semua bagian tanaman dapat dimanfaatkan. Bagian  jagung yang dapat dimanfaatkan adalah batang, daun, biji, tongkol dan rambut  jagung. Batang dan daun muda digunakan sebagai pakan ternak, sedangkan  batang dan daun tua (setelah panen) digunakan sebagai pupuk hijau atau kompos. Biji jagung yang sudah tua dapat digunakan pada industri makanan,  bahan baku industri bir, industri farmasi, dextrin, perekat, dan industri tekstil (Samin 2014). Sedangkan bagian tongkol dan kulit jagung dimanfaatkan sebagai

makanan

ternak,

pembungkus

rokok,

pembungkus

makanan

tradisional, dan kerajinan tangan (Ningsih 2012). Secara komersial biji jagung merupakan bagian terpenting yang  pemanfaatnya sudah sangat beragam di dunia Industri. Hal tersebut tentunya menimbulkan masalah lain berupa limbah batang jagung, bonggol jagung maupun kulit jagung yang jumlahnya tidak sedikit. Limbah tanaman jagung dapat dimanfaatkan sebagai sumber bioethaol. Limbah batang jagung, bonggol  jagung, dan kulit jagung termasuk biomassa yang mengandung lignoselulosa sehingga sangat dimungkinkan untuk dimanfaatkan menjadi bioethaol karena memiliki kandungan selulosa yang cukup tinggi (Yonas, Isa and Iyabu 2011). Kandungan selulosa pada tanaman jagung dapat dilihat pada Tabel 1.1. Kulit jagung atau klobot jagung merupakan kulit ter luar yang menutupi  bulir jagung. Kulit jagung ini belum banyak dimanfaatkan secara spesifik, akan tetapi dengan kandungan selulosa yang cukup tinggi yaitu 42 % maka kulit jagung berpotensi untuk digunakan sebagai bahan baku pembuatan enzim

9

selulase yang bermanfaat untuk menghidrolisis bahan berlignoselulosa menjadi monosakarida yang dapat digunakan sebagai bahan baku pembuatan etanol generasi kedua.

2.3. Lignoselulosa Bahan-bahan

organik

atau

biomassa

seperti

tanaman

jagung

mengandung komponen-komponen komponen-komponen karbon dan energi ener gi seperti minyak, protein, gula, pati, dan lignoselulosa ( fiber ) sebagai komponen terbesar. Lignoselulosa tersusun dari mikrofibril-mikrofibril selulosa yang membentuk kluster-kluster, dengan ruang antar mikrofibril terisi dengan hemiselulosa, dan kluster-kluster tersebut terikat kuat menjadi satu kesatuan oleh lignin (Octa 2013).

Gambar 2.3 Konfigurasi sederhana jaringan kayu (Isroi 2008) 2.3.1. Selulosa

Selulosa ((C6H10O5)n) merupakan homopolimer linear berbobot molekul besar yang terdiri dari unit selobiosa berulang-ulang (dua cincin glukosa anhidrat bergabung melalui ikatan β-1,4-glikosidik). β -1,4-glikosidik). Polimer rantai panjang selulosa terikat bersama oleh ikatan hidrogen dan ikatan van der walls, yang menyebabkan selulosa terpaket dalam mikrofibril. Karena membentuk ikatan hidrogen, rantai tersebut tersusun paralel dan membentuk struktur kristalin. Mikrofibril selulosa memiliki bagian kristalin yang besar (2/3 dari total selulosa) dan bagian yang kecil yang tak berbentuk (amorphous (amorphous). ). Semakin kristalin selulosa, maka semakin susah selulosa tersebut untuk larut dan terdegradasi (Mussatto and Teixeira 2010).

10

Gambar 2.4 Struktur tunggal selulosa (Updegraff 1969) Selulosa tidak berwarna, tidak mempunyai rasa dan bau, tidak larut dalam air atau larutan basa, relatif stabil terhadap panas, tidak meleleh jika dipanaskan, mulai terurai (dekomposisi) pada temperatur 260  –   270 oC, tahan terhadap hidrolisis, dan stabil terhadap oksidasi. Tetapi selulosa akan larut dalam larutan asam mineral dengan konsentrasi tinggi (akibat hidrolisis), dan jika hidrolisisnya belum  berlangsung terlalu jauh maka selulosa dapat diendapkan kembali membentuk fragmen-fragmen padatan polimer dengan berat molekul yang lebih kecil melalui pengenceran larutan dalam asam kuat tersebut dan air. Selulosa baru mengalami hidrolisis dalam asam mineral encer  pada temperatur yang tinggi (>100 oC) (Octa 2013). Selulosa merupakan jenis polisakarida yang paling melimpah dan merupakan konstituen utama pada setiap struktur tanaman serta diproduksi juga oleh sebagian binatang dan sebagian kecil oleh bakteri. Tidak hanya pada material organik yang masih hidup, limbah atau sampah organik juga mengandung banyak sekali selulosa. Selain dijadikan sebagai bahan kertas dan produk-produk industri lain yang membutuhkan serat, selulosa dapat dikonversikan menjadi bahan baku  pembuatan bioetanol, yaitu monosakarida (glukosa). Pengkonversian tersebut memerlukan asam pekat dan suhu operasi yang tinggi terkait dengan sifatnya yang sangat polar dan sulit untuk didegradasi secara kimia. Namun, karena proses ini membutuhkan energi yang besar dan tidak ramah lingkungan, maka pengkonversian selulosa menjadi glukosa  biasanya dilakukan oleh enzim selulase (Bakti 2012).

11

2.3.2. Hemiselulosa

Hemiselulosa termasuk dalam kelompok polisakarida heterogen yang dibentuk melalui jalan biosintesis yang berbeda dari selulosa. Hemiselulosa relatif mudah dihidrolisis oleh asam menjadi komponenkomponen monomer hemiselulosa yang terdiri dari D-glukosa, Dmanosa, D-galaktosa, D-xilosa, L-arabinosa, dan sejumlah kecil Lramnosa disamping menjadi asam D-glukuronat, asam 4-O-metil-Dglukuronat,

dan

asam

D-galakturonat.

Kebanyakan

hemiselulosa

mempunyai derajat polimerisasi hanya 200. Hemiselulosa mempunyai rantai polimer yang pendek dan tak berbentuk, oleh karena itu sebagian  besar dapat larut dalam air. Rantai utama dari hemiselulosa dapat berupa homopolimer (umumnya terdiri dari satu jenis gula yang berulang) atau  juga heteropolimer (campurannya beberapa jenis gula) (Octa 2013).

Gambar 2.5 Struktur unit-unit penyusun hemiselulosa (Isroi 2008) Hemiselulosa relatif mudah dihidrolisis oleh asam menjadi komponen-komponen

monomernya.

Hemiselulosa

dapat

diisolasi

dengan cara ekstraksi menggunakan dimetilsulfoksida dan alkali (KOH dan NaOH). Namun ekstraksi alkali mempunyai kerugian yaitu deasetilasi hemiselulosa yang hampir sempurna (Octa 2013). 2.3.3. Lignin

Struktur

molekul

lignin

sangat

berbeda

berbeda

bila

dibandingkan polisakarida karena terdiri atas sistem aromatik yang

12

tersusun atas unit-unit fenilpropana: unit  guaiacyl   (G) dari prekursor trans-koniferil alkohol, unit  syringyl   (S) dari prekursor trans-sinapil alkohol, dan p-hidroksipenil (H) dari prekursor trans-p-koumaril alkohol (Octa 2013). Unit-unit fenilpropana ini kemudian berikatan dengan struktur-struktur minor sehingga membentuk suatu jaringan polimer yang dikenal dengan nama lignin.

Gambar 2.6 Unit-unit penyusun lignin (Moore 2011) Lignin adalah polimer berkadar aromatik-fenolik yang tinggi,  berwarna kecoklatan, dan relatif lebih mudah teroksidasi. Lignin memiliki berat molekul yang bervarisai antara 1000 sampai 20.000, tergantung pada sumber biomassanya. Lignin relatif stabil terhadap aksi kebanyakan larutan asam mineral, tetapi larut dalam larutan basa panas dan larutan ion bisulfit (HSO 3-) panas. Lignin mempunyai titik  pelunakan dan titik leleh yang rendah, lignin kayu berdaun jarum (pohon spruce) melunak pada 80 -90 oC (basah) dan 120 oC (kering) dan meleleh  pada 140 –  150 oC (Octa 2013). Selulosa sebagai komponen terbesar dari biomassa dapat digunakan sebagai bahan baku pembuatan enzim selulase melalui proses fermentasi. untuk

menghidrolisis

selulosa

dalam

lignoselulosa

jauh

lebih

sulit

dibandingkan hidrolisis selulosa yang bebas, karena lignoselulosa merupakan  bahan yang sangat rapat sehingga pada kondisi biasa bersifat inert dan tak bisa ditembus oleh air apalagi enzim (Octa 2013). Oleh karena itu, diperlukan suatu proses awal ( pretreatment ) untuk mempersiapkan bahan agar dapat difermentasi oleh mikroorganisme yang bebas dari lignin dan hemiselulosa.

13

2.4. Delignifikasi Delignifikasi merupakan suatu proses pembebasan lignin dari suatu

senyawa kompleks. Proses ini penting dilakukan sebelum hidrolisis bahan selulotik, sebab lignin dapat menghambat penetrasi asam atau enzim sebelum  proses hidrolisis berlangsung. Delignifikasi ini merupakan suatu proses awal ( pretreatment ) untuk mempersiapkan bahan yang bebas dari lignin dan hemiselulosa agar dapat disakarifikasi oleh enzim dan difermentasi oleh mikroorganisme. Tanpa adanya  pretreatment , glukosa yang dihasilkan dari hidrolisis kurang dari 20%, sedangkan dengan adanya  pretreatment   hasilnya meningkat menjadi 90% bahkan lebih. Untuk meningkatkan luas permukaan dari bahan  berlignoselulosa dilakukan proses pengecilan ukuran ( size reduction) sebagai langkah awal pengolahan. Pada banyak proses digunakan bahan lignoselulosa yang berukuran ≤ 3 mm  (Octa 2013). Oleh karena itu, dalam penelitian ini digunakan substrat berukuran 1 mm. Tabel 2.1 Sifat kimia selulosa, hemiselulosa, dan lignin No

Selulosa

Hemiselulosa

Lignin

1

Tidak larut dalam air

Sedikit larut dalam air

Tidak larut dalam air

2

Larut dalam larutan asam

Larut dan terhidrolisis

Tidak larut dalam

 pekat, seperti H2SO4 72%,

dalam asam mineral

asam mineral kuat

Tidak larut dalam asam

Larut dan terhidrolisis

Larut parsial dalam

organik

dalam asam organik

 berbagai senyawa

 pekat

organik teroksigenasi

Tidak larut dalam larutan

Larut dalam larutan

Larut dalam larutan

alkali hidroksida

alkali

alkali encer

HCl 40%, atau 85% H3PO4. Terhidrolisis lebih cepat pada temperatur yang lebih tinggi 3

4

Sejumlah teknologi  pretreatment   yang sudah banyak dikembangkan meliputi  pretreatment   fisik, kimia, dan biologis, yang mampu merusak struktur lignoselulosa dan menghilangkan lignin. Karbohidrat kompleks seperti selulosa dan hemiselulosa yang telah bebas dari lignin kemudian

14

dihidrolisis menjadi glukosa. Proses  pretreatment   yang efektif memiliki  beberapa keuntungan yaitu (Chaturvedi and Verma 2013): 1. Melindungi

selulosa

dan

mendekristalisasi

selulosa,

serta

mendepolimerisasi hemiselulosa 2. Membatasi

pembentukan

inhibitor

yang

menghambat

hidrolisis

karbohidrat 3. Memiliki energi input yang rendah, karena dapat dilakukan recovery  produk yang memiliki nilai tambah seperti lignin 4. Biaya efektif Berdasarkan Tabel 2.1 pretreatment  yang sesuai untuk menghilangkan lignin adalah pretreatment  dibawah kondisi alkali. Dalam hal ini, biomassa ditreatment   menggunakan alkali seperti natrium hidroksida, kalium hidroksida, kalsium hidroksida dan amonium hidroksida pada suhu dan tekanan standar. Keuntungan utama proses ini adalah penghilangan lignin dari biomassa  berlangsung efektif. Banyak laporan yang menyatakan bahwa proses ini menghilangkan gugus asetil dan gugus asam uronic yang terdapat dalam hemiselulosa dan meningkatkan aksesibilitas enzim untuk mendegradasi selulosa. Dalam treatment   alkali, gugus ester yang bergabung dengan xylan dan residu hemiselulosa juga terhidrolisis (Chaturvedi and Verma 2013). Treatment   delignifikasi secara kimiawi dibagi dalam tiga jenis, dua jenis diantaranya dalam kondisi alkali dan salah satunya dalam kondisi as am, yaitu: 2.4.1. Pretreatment dengan CaOH, NaOH, dan KOH

Kalsium hidroksida dan natrium hidroksida merupakan dua jenis larutan alkali yang banyak digunakan dalam proses delignifikasi. Kondisi reaksi umumnya standart, sehingga mencegah kondensasi lignin yang berimbas  pada tingkat kelarutan yang tinggi dan lignin yang hilang lebih banyak. Pada kondisi ini, degradasi gula minimal. Penambahan udara atau oksigen menunjukkan peningkatan yang signifikan dalam proses delignifikasi (Chaturvedi and Verma 2013). Pada proses ini lignin akan bereaksi dengan  NaOH membentuk Na-lignat.

15

Gambar 2.7 Reaksi delignifikasi dengan NaOH (Permatasari et al., 2014) Penelitian sekarang ini mengusulkan bahwa  pretreatment   dalam kondisi alkali dengan menggunakan kalsium hidroksida, natrium hidroksida, dan kalium hidroksida memberikan  yield   gula pereduksi yang lebih tinggi. Selain itu juga ketiga bahan tersebut tidak mahal ketika digunakan sebagai agen delignifikasi. Akan tetapi proses tersebut membutuhkan air dalam  jumlah besar untuk mencuci garam dari kalsium dan natrium, yang bersatu dengan biomassa dan sulit untuk dihilangkan. Selain itu, proses  pretreatment   dalam kondisi alkali juga menghasilkan inhibotor selama  peoses depolimerisasi lignin yang harus dihilangkan melalui tahap hidrolisis (Chaturvedi and Verma 2013). 2.4.2. Pretreatment dengan amonia

 Pretreatment   menggunakan amonia sudah terbukti sebagai metode yang efektif untuk biomassa dengan kandungan lignin yang rendah (Bradshaw, et al. 2007). Proses ini menghasilkan tingkat penghilangan lignin yang tinggi.  Pretreatment   biomassa dengan mengaplikasikan amonia dalam  prosesnya meliputi SAA, ARP, AFEX telah menunjukkan hasil yang menjanjikan dalam depolimerisasi liginin. Kekurangan utama penggunaan amonia adalah biaya proses  pretreatment yang sangat tinggi. Selain itu,  penggunaan amonia juga berpengaruh terhadap lingkungan. Karena amonia bersifat racun terhadap lingkungan, maka strategi yang sesuai harus dikembangkan untuk mencegah kerusakan lingkungan. Hal ini tentunya juga meningkatkan biaya operasi (Chaturvedi and Verma 2013).

16

2.4.3. Pretreatment dengan sulfat (proses Kraft)

Perlakuan menggunakan asam terlarut merupakan metode  pretreatment  yang murah dan efektif karena asam merupakan bahan yang murah dan  banyak tersedia di pasaran (Sang and Holtzapple 2005).  Pretreatment  dengan menggunakan asam dilakukan menggunakan konsentrasi asam yang tinggi maupun rendah, serta pada temperatur tinggi dan temperatur rendah. Pada temperatur tinggi,  pretreatment   biomas dijalankan pada temperatur yang lebih tinggi dari 160 oC dalam proses kontinyu yang mengandung konsentrasi biomas yang rendah (konsentasi substrat 5  –  10%). Biasanya, jenis asam sulfur digunakan dalam proses ini. Sedangkan  pada temperatur rendah, prosesnya dijalankan pada temperatur dibawah suhu 160 oC dalam proses batch dengan konsentrasi biomasa yang tinggi (10  –   40% substrat). Dalam proses ini, asam kuat seperti H 2SO4  sering digunakan untuk mengkonversi bahan berlignoselulosa karena H 2SO4 merupakan bahan yang sangat kuat untuk menghidrolisis selulosa. Dengan kehadiran asam ini, hemiselulosa dan selulosa dapat terhidrolisa secara sempurna, sementara lignin tidak terhidrolisis sama sekali. Kelemahan menggunakan metode ini adalah sifat dari asam yang korosif dan perlu untuk me-recycle  asam yang telah digunakan guna mempermurah biaya  pretreatment  (Chaturvedi and Verma 2013).

2.5. Aspergillus niger  Aspergillus niger   merupakan salah satu jamur berfilamen yang dapat

memproduksi enzim selulase. Aspergillus niger  tumbuh pada keadaan aerobik  pada bahan organik. Di alam,  Aspergillus niger   banyak ditemukan di tanah dan sampah, kompos dan bagian tanaman busuk.  Aspergillus niger   mampu tumbuh dalam rentang suhu yang bervariasi (Dijck, et al. 2002). Suhu optimum pertumbuhannya adalah 35  –  37 oC, sedangkan suhu minimumnya 6  –  8 oC, dan maksimumnya 45  –  47 oC. Aspergillus niger  mampu tumbuh pada medium dengan batas aktivitas air (water activity) 0,88, relatif lebih tinggi dibandingkan spesias Aspergillus lain. Aspergillus niger   juga mampu tumbuh dalam rentang pH ekstrim sekitar 1,4 –  9,8 (Dijck, et al. 2002).

17

Gambar 2.8 Aspergillus niger  (Barron 2013)  Aspergillus niger   merupakan mikroorganisme kaya enzim. Pektin, Protease, dan Amiloglucosidase merupakan beberapa enzim yang pertama kali diambil dari mikroorganisme ini. Beberapa jenis enzim lain seperti selulase dan hemiselulase dihasilkan menggunakan  Aspergillus niger . Untuk proses  produksi beberapa produk, misalnya pati; salah satu jenis karbohidrat yang  jumlahnya berlimpah, harus dihidrolisis menjadi sirup yang mengandung glukosa, maltosa dan dextrin dengan bobot molekul rendah. Industri sirup glukosa dan alkohol merupakan konsumen utama enzim amiloglucosidase yang diproduksi oleh Aspergillus niger  (Dijck, et al. 2002). 2.5.1. Nutrisi Pertumbuhan Mikroba

Mikroorganisme membutuhkan nutrisi untuk pertumbuhan dan  pemeliharaan fungsi metabolis. Jumlah dan tipe nutrisi yang dibutuhkan oleh mikroorganisme tergantung pada mikroorganisme itu sendiri. Komposisi nutrien di dalam substrat sangat penting untuk keberhasilan  proses fermentasi. Nutrisi yang dibutuhkan oleh mikroba terbagi menjadi dua, yaitu (Soetrisnanto 2015): 1.  Nutrien Makro, yaitu nutrisi yang dibutuhkan dalam jumlah banyak oleh mikroorganisme. Contohnya adalah unsur karbon (C), hidrogen (H), nitrogen (N), dan oksigen (O). Unsur-unsur ini dapat diperoleh dari bahan alami/nabati, misalnya pati, gula, dan selulosa.

18

2.  Nutrien Mikro, yaitu nutrisi yang dibutuhkan dalam jumlah kecil dan harus diketahui konsentrasi maksimalnya karena beberapa mikroba sensitif terhadap mineral tertentu. Contohnya adalah phosphor (P),  berbagai macam mineral, seperti tembaga (Cu), zink (Zn), boron (B), kalsium (Ca), magnesium (Mg), kalium (K), sulfur (S), dan lain-lain. Tabel 2.2 Nutrien dalam proses fermentasi (Sanjaya and Adrianti 2012) No

Unsur

Peranan

1

Karbon

Unsur utama dalam pembentukan sel

2

Nitrogen

Pembentukan asam amino, DNA, RNA, dan ATP

3

Hidrogen

Pembentukan sel

4

Oksigen

Pembentukan sel

5

Phosphor

Kofaktor enzim dan pembentukan asam nukleat

6

Sulfur

Kofaktor enzim

7

Kalium

Kofaktot enzim

8

Magnesium

9

Kalsium

Menjaga kestabilan ribosom, membran sel dan asam nukleat, dan sebagai kofaktor enzim Sebagai kofaktor enzim

2.5.2. Pertumbuhan Mikroba

Proses pertumbuhan mikroba sangat dinamik dan kinetikanya dapat digunakan untuk meramal produksi biomassa dalam suatu proses fermentasi.

Faktor-faktor

yang

mempengaruhi

pertumbuhan

mikroorganisme tardiri atas faktor Intrinsik dan faktor Ekstrinsik. Faktor intrinsik meliputi pH, moisture content, potensial oksidasi-reduksi, kandungan nutrisi, kandungan antimikroba, dan struktur biologi. Sedangkan faktor ekstrinsik meliputi temperatur, kelembaban relatif lingkungan, serta konsentrasi gas di lingkungan (Wibowo 2013). Proses pertumbuhan mikroba merupakan proses yang memiliki  batas tertentu. Pada saat tertentu, setelah melewati tahap minimum, mikroba akan mengalami fasa kematian. Pertumbuhan kultur mikroba umumnya dapat digambarkan dalam suatu kurva pertumbuhan. Pertumbuhan mikroba dapat terbagi dalam beberapa tahap seperti ditunjukkan pada Gambar 2.9, antara lain (Pratiwi 2012):

19

1. Fasa stasioner adalah fasa yang disebut fasa adaptasi (lag phase) yang ditunjukkan oleh angka 1 pada gambar 2.9. Pada saat ini mikroba telah berusaha menyesuaikan diri dengan lingkungan dan medium baru daripada tumbuh ataupun berkembang biak. Pada saat ini mikroba berusaha merombak materi-materi dalam medium agar dapat digunakan sebagai nutrisi untuk pertumbuhannya. Bila dalam medium ada komponen yang tidak dikenal mikroba, mikroba akan memproduksi enzim ekstraseluler untuk merombak komponen tersebut. Fasa ini juga berlangsung seleksi, hanya mikroba yang dapat mencerna nutrisi dalam medium pertumbuhannya lah yang dapat bertahan hidup. 2. Fasa pertumbuhan dipercepat adalah fasa dimana mikroba sudah dapat menggunakan nutrisi dalam medium fermentasinya. Fase ini ditunjukkan oleh angka 2 pada gambar 2.9. Pada fase ini mikroba  banyak tumbuh dan membelah diri sehingga jumlahnya meningkat dengan cepat. 3. Fase eksponensial adalah akhir fasa pertumbuhan dipercepat. Pada fasa ini, laju pertumbuhan tetap pada laju pertumbuhan maksimum (µmaks) seperti yang ditunjukkan oleh angka 3 pada gambar 2.9. 4. Fase pertumbuhan diperlambat mulai pada akhir fasa eksponensial seperti yang ditunjukkan oleh angka 4 pada gambar 2.9. Pertumbuhan mikroba yang begitu cepat tidak diimbangi tersedianya nutrisi yang cukup. Jika fermentasi dilakukan secara batch, dimana umpan nutrisi dimasukkan hanya pada awal proses fermentasi, pada waktu tertentu saat jumlah mikroba yang mengkonsumsi nutrisi tersebut melebihi daya dukung nutrisi akan terjadi kekurangan nutrisi. Hal lain yang memperlambat pertumbuhan mikroba adalah terjadinya

inhhibisi

ataupun

represi

yang

terjadi

karena

terakumulasinya produk metabolit sekunder hasil aktivitas fermentasi mikroorganisme. 5. Fase kematian terjadi apabila nutrisi sudah benar-benar tidak dapat lagi mencukupi kebutuhan mikroorganisme. Fase ini ditunjukkan

20

oleh angka 5 pada gambar 2.9. Keadaan ini diperparah oleh akumulasi produk metabolit primer dan sekunder yang tidak dipanen sehingga terus menginhibisi ataupun merepresi pertumbuhan sel mikroorganisme. Selain itu umur sel yang sudah tua, sehingga  pertahanan sel terhadap lingkungan yang berbeda dari kondisi  biasanya juga berkurang.

Gambar 2.9 Fase pertumbuhan mikroba (Bayu and Fitria 2009) 2.6. Sequential F ermentation Fermentasi  berasal

dari

bahasa

Latin

‘fervere’

yang

berarti

mendidihkan. Seiring perkembangan teknologi, definisi fermentasi meluas, menjadi semua proses yang melibatkan mikroorganisme untuk menghasilkan suatu produk yang disebut metabolit primer dan sekunder dalam suatu lingkungan yang dikendalikan. Pada mulanya istilah fermentasi digunakan untuk menunjukkan proses pengubahan glukosa menjadi alkohol yang  berlangsung secara anaerob. Namun, kemudian istilah fermentasi berkembang lagi

menjadi

seluruh

perombakan

senyawa

organik

yang

dilakukan

mikroorganisme yang melibatkan enzim yang dihasilkannya. Dengan kata lain, fermentasi adalah perubahan struktur kimia dari bahan-bahan organik dengan memanfaatkan agen-agen biologis terutama enzim sebagai biokatalis (Pratiwi 2012). Fermentasi telah banyak digunakan untuk produksi berbagai macam  bahan yang memiliki manfaat yang besar untuk manusia dan industri. Aplikasi

21

di industri yang semakin luas berakibat pada pergeseran teknik fermentasi yang digunakan skala laboratorium menjadi skala besar. Pengembangan teknik fermentasi

seperti

Solid

State

Fermentation  (SSF)

dan

Submerged

 Fermentation (SmF) telah mengubah teknik fermentasi ke level produksi skala industri senyawa bioaktif (Virmala and Ravichandran 2012). Solid State Fermentation  (SSF) menggunakan substrat padat, seperti sekam padi, ampas tebu, dan bubur kertas. Beberapa keuntungan penggunaan metode SSF antara lain (Iyrata 2011): 1. Biasanya menggunakan substrat tunggal, seperti limbah padat yang mengandung karbohidrat, protein, lemak, dan mineral. Oleh karena itu tambahan lain yang diperlukan biasanya hanya air. 2. Persiapan inokulum lebih sederhana 3. Menghasilkan kepekatan produk yang lebih tinggi 4. Kontrol terhadap kontaminan lebih mudah 5. Memiliki

produktivitas

yang

tinggi

karena

interaksi

tempat

tumbuh

antara

mikroorganisme dengan substrat lebih efektif 6. Kondisi

medium

mendekati

keadaan

alamiah

mikroorganisme 7. Aerasi optimum Pada metode fermentasi ini, substrat digunakan dengan sangat lambat, sehingga substrat yang sama dapat digunakan untuk periode fermentasi yang cukup lama. Oleh karena itu, metode SSF ini mampu mengontrol pelepasan nutrien. SSF sangat sesuai digunakan sebagai teknik fermentasi yang melibatkan

jamur

dan

mikroorganisme

yang

membutuhkan

tingkat

kelembaban rendah (Virmala and Ravichandran 2012). Kekurangan utama metode SSF adalah pengontrolan suhu, pH, dan nutrien yang lebih susah karena medianya padat (Cunha, et al. 2012). Submerged

Fermentation 

(SmF)/ Liquid

Fermentation 

(LF)

menggunakan substrat cairan yang mudah mengalir, seperti molases (tetes tebu) dan broth. Dalam SmF substrat digunakan dengan sangat cepat, oleh karena itu medium fermentasi harus secara konstan di- suplay dengan nutrien. Teknik fermentasi ini sangat sesuai untuk mikroorganisme seperti bakteri yang

22

membutuhkan tingkat kelembaban yang tinggi. Keuntungan metode ini adalah  proses recovery produk lebih mudah (Virmala and Ravichandran 2012). Selain itu, metode SmF memiliki kemudahan dalam pengontrolan suhu, pH, maupun nutrien sehingga operasi proses fermentasi yang optimum bisa dicapai. Proses fermentasi yang menggabungkan keuntungan dari SSF dan SmF dikenal sebagai Sequential Fermentation. (Cunha, et al. 2012) telah melakukan penelitian menggunakan metode Sequential Fermentation  dan mendapatkan hasil produksi enzim selulase yang lebih tinggi daripada menggunakan metode SSF saja maupun SmF saja, seperti ditunjukkan pada Gambar 9.

Gambar 2.10 Hubungan metode fermentasi dengan aktivitas endoglucanase (Cunha et al., 2012) Maksud dari  sequential fermentation  adalah gabungan antara metode SSF dan SmF dimana pada tahap pre- culture  digunakan metode SSF, kemudian dilanjutkan dengan proses produksi enzim dengan metode SmF (Cunha, et al. 2012). Penggunaan metode SSF pada proses pre- culture  akan mendorong pertumbuhan filamen dari  Aspergillus niger   sehingga interaksi antara substrat dengan mikroba menjadi lebih baik dan menghasilkan endoglukanase yang lebih banyak (Cunha, et al. 2012). Pada penelitian yang dilakukan oleh (Cunha, et al. 2012) dan (F. M. Cunha 2014) mengenai Sequential fermentation, proses pre-culture  dengan metode SSF dilakukan selama 24 jam, kemudian dilanjutkan dengan metode SmF untuk produksi enzim selama 96 jam. Oleh karena itu, pada penelitian ini proses fermentasi

23

dilakukan selama 7 hari dimana proses pre-culture  dengan metode SSF divariasi dan dilangsungkan dalam waktu 48 jam, 72 jam, dan 96 jam serta sisanya dilangsungkan secara SmF.

2.7. Faktor-faktor yang Mempengaruhi Proses Fermentasi Faktor yang menentukan keberhasilan proses fermentasi antara lain

(Iyrata 2011): 1. Air Mikroba tidak akan tumbuh tanpa adanya air. Air bertindak sebagai pelarut dan sebagian besar aktivitas metabolik dalam sel dilakukan dalam lingkungan air. Air merupakan faktor yang paling berpengaruh terhadap  pertumbuhan mikroba dan kelangsungan proses fermentasi. 2. Konsentrasi Substrat dan Nutrien Fardiaz (1989; (Iyrata 2011)) menyatakan bahwa pertumbuhan kapang akan optimal jika nutrien yang diperlukan dan kondisi media sesuai. Semua mikroba memerlukan nutrien dasar untuk kehidupan dan  pertumbuhannya sebagai sumber karbon, nitrogen, energi, serta faktor  pertumbuhannya seperti vitamin dan mineral. 3. Derajat Keasaman (pH)  pH merupakan petunjuk aktivitas ion H + dalam suatu larutan. Pada proses fermentasi, pH sangat berpengaruh terhadap laju pertumbuhan mikroba, dan berhubungan erat dengan suhu. Menurut Fardiaz (1989; (Iyrata 2011)),  jika suhu naik, maka pH optimum untuk pertumbuhan juga naik.  Aspergillus niger   juga mampu tumbuh dalam rentang pH ekstrim sekitar 1,4 –  9,8. 4. Suhu Suhu merupakan salah satu faktor penting dalam mempengaruhi  pertumbuhan

mikroba.

Masing-masing

mikroba

mempunyai

suhu

optimum, minimum, dan maksimum untuk pertumbuhannya. Suhu akan  berpengaruh terhadap ukuran sel, produk metabolik seperti pigmen dan toksin, kebutuhan zat gizi, reaksi enzimatik, dan komposisi kimia sel. Suhu optimum pertumbuhan  Aspergillus niger   adalah 35  –  37

o

C,

sedangkan suhu minimumnya 6 –  8 oC, dan maksimumnya 45 –  47 oC. 24

5. Konsentrasi Inokulum Dalam lingkungan tertentu, konsentrasi inokulum yang digunakan menentukan panjang pendeknya waktu inkubasi untuk mendapatkan hasil fermentasi

yang

baik.

Inokulum

mengandung

spora

yang

pada

 pertumbuhannya menghasilkan enzim yang dapat menguraikan substrat menjadi komponen yang lebih sederhana, lebih mudah latut serta menghasilkan rasa dan aroma yang khas. Jumlah spora yang terlalu sedikit akan memperlambat laju pertumbuhan sehingga memberikan kesempatan kepada mikroba lain yang mampu bersaing dengan mikroba yang ada. Jumlah mikroba yang terlalu banyak akan menyebabkan sporulasi yang terlalu

cepat

sehingga

sebagian

energi

tidak

digunakan

untuk

memperbanyak sel. Jumlah koloni mikroba yang optimal untuk fermentasi adala 1x107 (Tanuwidjadja, 1975; (Iyrata 2011)). 6. Lama Inkubasi Setyawan (2007; (Iyrata 2011)) menyatakan bahwa lama inkubasi  berkaitan erat dengan waktu yang dapat digunakan oleh mikroba untuk tumbuh dan berkembang biak. Semakin lama waktu fermentasi maka semakin

banyak

kandungan

zat

yang

digunakan

kapang

untuk

metabolismenya sehingga kandungan zat makanan yang tersisa semakin sedikit. 7. Aerasi Aerasi bertujuan untuk mensuplai oksigen dan membuang karbon dioksida  pada fermentasi aerobik. Oksigen diperlukan untuk mendapatkan energi melalui oksidasi CO2 dan air. Aerasi yang baik adalah mengalirnya udara ke seluruh bagian media. Aspergillus niger   merupakan jenis kapang aerob fakultatif, karena itu aerasi pada substrat perlu diperhatikan. 8. Bentuk dan Ukuran Partikel Keseragaman partikel substrat akan mempermudah penyebaran spora yang diinokulasikan dalam substrat tersebut. Untuk meningkatkan luas  permukaan dari substrat dilakukan proses pengecilan ukuran ( size reduction)

sebagai

langkah

awal

pengolahan.

Sedangkan

untuk

25

menyeragamkan ukuran partikel dilakukan proses pengayakan atau  screening .

2.8. Penelitian Terdahulu Fermentasi

Bahan

 No

Judul Penelitian

1

Liquid Hot Water

Sequential

Ampas

Jenis mikroba

Aspergillus

and Steam

Fermentation

tebu

yang

niger A12

Explosion

digunakan

menghasilkan

Pretreatment of

yaitu

aktivitas enzim

Sugarcane Bagasse

 Aspergillus

 paling tinggi,

for Enzyme

niger  A12,

yaitu

Production by a

 Aspergillus

endoglucanase

Sequential Solid-

oryzae

1,26 IU/mL,

State and

P27C3, dan

xylanase 26,25

Submerged Method

 Aspergillus

IU/mL, β-

(Cunha et al., 2014)

niger  3T5B8

glucosidase

Baku

Variabel

Hasil

3,70 IU/mL, βxylosidase 0,58 IU/mL pada substrat dengan  perlakuan LHW 2

Sequential Solid-

Sequential

Ampas

Perbedaan

Aktivitas

State and

Fermentation

tebu

metode yaitu

endoglucanase

Submerged

SmF

sebesar 57±13

Cultivation of

konvensional

IU/L/h

 Aspergillus niger  on

dan

menggunakan

Sugarcane Bagasse

Sequential

bubble column

for the Production of

fermentation

reactor ; 3 kali

Cellulase (Cunha et

dalam bublle

lebih besar

al., 2012)

column

daripada

reactor

metode SmF konvensional

3

Production of

Submerged

Limbah

Suhu operasi

 pH optimal 6,

Cellulase by

Fermentation

Sabut

(20 –  40 oC)

suhu optimal 30

 Aspergillus niger 

& Solid-State

kelapa

 pH (4,5 - 8)

Under Submerged

Fermentation

lama

o

C, lama

fermentasi SSF

26

and Solid-State

fermentasi

72 jam, lama

Fermentation Using

SSF (24 – 

fermentasi SmF

Coir Waste as a

120 jam) &

96 jam.

Substrate (Mrudula

SmF (24 – 

Aktivitas

& Murugammal,

192 jam)

enzimatik pada

2011)

SSF yaitu CMCase 8,89 U/g dry mycelial bran; FPAse 3,56 U/g dry mycelial  bran. Aktivitas enzimatik pada SmF yaitu CMCase 3,29 U/mL culture  broth; FPAse 2,3 U/mL culture broth.

4

Cellulase Production

Submerged

Kulit

Perbandingan

Kombinasi kulit

 by Aspergillus niger 

Fermentation

 padi,

konsentrasi

 padi dan kulit

on Different Natural

& Solid-State

sebuk

kulit padi :

gandum

Lignocellulosic

Fermentation

gergaji,

substrat lain

memberikan

Substrates (Reddy et

ampas

= 1 : 1 b/b

aktivitas

al., 2015)

tebu,

enzimatik

kulit

tertinggi yaitu

kacang

FPAse 2,632

tanah,

U/mL; CMCase

kulit

2,478 U/mL;

gandum,

dan β-

tongkol

glucosidase

 jagung

2,984 U/mL  pada SmF, serta FPAse 29,81 U/g DS; CMCase 25,2 U/g DS dan βglucosidase

27

32,18 U/g DS  pada SSF. 5

Pengaruh Perlakuan

Submerged

Jerami

Variasi pH

Kondisi

Delignifikasi dengan

Fermentation

 padi

(5, 6 dan 7)

optimum

Larutan NaOH dan

Lama

 produksi enzim

Konsentrasi Substrat

fermentasi (7,

selulase pada

Jerami Padi terhadap

9 dan 11 hari)

lama fermentasi

Produksi Enzim

Delignifikasi

9 hari dengan

Selulase dari

dengan

 pH awal media

Aspergillus niger

 NaOH (2, 4

6. Aktivitas

 NRRL A-II 264

dan 6%)

enzim tertinggi

(Gunam et al., 2010)

Konsentrasi

diperoleh dari

substrat (1, 2

 perlakuan

dan 3 % b/v)

delignifikasi dengan NaOH 6% dan konsentrasi substrat 2% yaitu menghasilkan aktivitas enzim endoglucanase 0,037 U/mL, aktivitas filter  paperase 0,033 U/mL, protein terlarut 0,362 mg/mL, dan aktivitas spesifik filter  paperase 0,123 U/mg.

28

BAB III METODOLOGI PENELITIAN 3. BAB III METODOLOGI PENELITIAN 3.1. Rancangan Percobaan 3.1.1 Inokulasi Mikroba dan Penyiapan Inokulum Bibit Aspergillus niger

Mediatepung jewawut

Inkubasi pada suhu ±28 oC selama 7 hari Media cair 100 mL: (NH4)2SO4, NPK, CaCl2, MgSO4.7H2O, dan larutan garam (MnSO4.H2O dan ZnSO4.7H2O)

Spora tersuspensi

Inkubasi pada suhu ±28 oC selama 2 hari

Gambar 3.1 Rancangan pengembangbiakan inokulum  Aspergillus niger

3.1.2

Pretreatment Substrat Kulit jagung cacah

Pengeringan selama 12 jam

Sinar Matahari

Penggilingan

Ayakan lolos di 18 mesh, tertahan di 20 mesh

Substrat ukuran ± 1 mm

Gambar 3.2 Pretreatment substrat secara mekanik

29

3.1.3

Delignifikasi Substrat 30 gram substrat ukuran ± 1 mm

400 ml a uadest

Erlenmeyer 500 ml

 NaOH (w/v) 0%, 3%, 6%, 9%

Pemanasan dan Pengadukan (80oC, 4 jam)

Pompa vacum

Filtrat

Substrat

Aquades

Pembilasan sampai pH 7 dalam pompa vacum

Sisa air  bilasan

Substrat pH netral

Pengovenan (100 oC, 10 jam)

Penyimpanan dalam kemasan

Gambar 3.3 Proses delignifikasi substrat

30

3.1.4

Produksi Enzim Selulase dengan Sequential Fermentation Substrat sesuai variabel

 Nutrisi 12 ml:  pH=6 dengan CH3COOH

Erlenmeyer 250 ml

(NH4)2SO4, NPK, CaCl2, MgSO4.7H2O, dan larutan garam (MnSO4.H2O & ZnSO4.7H2O)

Autoclave (121 oC; 15 men)

Didinginkan

 Nutrisi 100 ml: Suspensi s ora 1 ml

Fermentasi statis (48; 72 dan 96 jam, 28 oC)

(NH4)2SO4, NPK, CaCl2, MgSO4.7H2O, dan larutan garam (MnSO4.H2O & ZnSO4.7H2O)

Fermentasi pada Inkubator goyang (200 rpm)

Autoclave (121oC; 15 men)

Menyaring medium fermentasi

Padatan

Filtrat

Centrifuge (2500 rpm; 15 menit)

Cairan bening hasil centrifuge

Analisa Hasil (analisa protein dan uji aktivitas enzim yaitu aktivitas enzim endoglukonase)

Gambar 3.4 Proses fermentasi secara sequential  31

3.2 Alat dan Bahan

3.2.1

Bahan 1. Kulit jagung 2. Aquadest 3.  NaOH 4. (NH4)2SO4 5. CaCl2 6. MgSO4.7H2O 7. MnSO4.H2O 8. ZnSO4.7H2O

3.2.2

Alat 1.  Autoclave 2. Spektrofotometer 3. Centrifuge 4. Inkubator goyang 5. Timbangan digital 6. Lemari aseptis

3.3 Variabel Percobaan

3.3.1

Variabel tetap 1. Jenis substrat kulit jagung 2.  Aspergillus niger 

3.3.2

Bariabel bebas 1. Proses delignifikasi dengan variasi konsentrasi NaOH (0%, 3%, 6%, 9%) 2. Proses fermentasi dengan variasi suhu fermentasi (25 oC, 30 oC, dan 35 oC) 3. Proses fermentasi dengan variasi waktu fermentasi (2 hari SSF; 5 hari SmF, 3 hari SSF; 4 hari SmF, 4 hari SSF; 3 hari SmF)

32

3.3.3

Rancangan variabel percobaan Tabel 3.1 Rancangan variabel percobaan Variabel Run

Delignifikasi (w/v)

Waktu (hari)

Suhu (oC)

3 SSF; 4 SmF

35

0% 3%

1

6% 9% Delignifikasi

2

terbaik

Delignifikasi

3

terbaik Delignifikasi

4

terbaik

2 SSF; 5 SmF 3 SSF; 4 SmF

35

4 SSF; 3 SmF 25 Waktu terbaik

30 35

Waktu terbaik

Suhu terbaik

3.4 Respon yang Dicari

Respon yang dicari dalam penelitian ini adalah kandungan protein ekstrak kasar enzim selulase serta aktivitas enzimatik berupa aktivitas endoglukonase.

3.5 Cara Kerja

3.5.1

Pemilihan Mikroba Mikroba yang digunakan dalam pembuatan enzim selulase adalah  Aspergillus niger   dari Laboratorium Mikrobiologi Industri Jurusan Teknik Kimia Universitas Diponegoro Semarang.

3.5.2

Inokulasi Inokulasi (pengembangbiakan) mikroba dilakukan pada media Jewawut secara zig-zag dengan bantuan kawat ose dan api bunsen didalam cawan petri yang dilakukan dalam ruangan steril (lemari

33

aseptis). Biakan diinkubasi pada suhu ± 28 oC di lemari aseptis selama 7 hari, kemudian hasil biakan disimpan di dalam lemari aseptis. 3.5.3

Penyiapan Larutan Nutrisi Larutan nutrisi merupakan larutan yang berfungsi untuk menyediakan unsur-unsur yang diperlukan untuk pertumbuhan mikroba. Larutan nutrisi yang digunakan dalam pre-culture dan selama  proses produksi enzim selulase diadaptasi dari nutrisi medium yang dideskripsikan oleh Cunha et al. (2012), dan mengandung (w/v): 0,14% (NH4)2SO4, 0,20% NPK, 0,03% CaCl 2, 0,02% MgSO 4.7H2O, dan 0,10% larutan garam (1,6 mg/L MnSO 4.H2O, dan 1,4 mg/L ZnSO4.7H2O). Larutan nutrisi kemudian diaduk hingga homogen.

3.5.4

Penyiapan Inokulum 1. Menyiapkan 100 ml media cair (larutan nutrisi) dalam erlenmeyer 250 ml, api bunsen, dan kawat ose. 2.  pH media cair diatur pada pH= 6 dengan menggunakan HCl. 3. Ujung kawat ose dicelupkan ke dalam H 2SO4  96% kemudian dipanaskan pada api bunsen sampai warna merah. 4. Biakan  Aspergillus niger   dari media jewawut diambil dengan menggunakan kawat ose kemudian dicelupkan beberapa saat dalam media cair hingga tampak keruh. 5. Media cair ditutup dengan kapas dan diinkubasi pada suhu ± 28 oC selama 2 hari.

3.5.5

Penyiapan Substrat secara Mekanik 1. Kulit jagung yang masih basah dicacah dengan ukuran sembarang 2. Pengeringan kulit jagung dibawah sinar matahari selama 12 jam 3. Menggiling kulit jagung kering dengan mesin penggiling 4. Mengayak kulit jagung dengan menggunakan screener (lolos di 18 mesh tertinggal di 20 mesh) 5. Mengambil substrat yang tertinggl ayakan 20 mesh (ukuran ± 1 mm)

34

3.5.6

Delignifikasi dengan Larutan NaOH Delignifikasi merupakan suatu proses pembebasan lignin dari suatu senyawa kompleks. Proses ini penting dilakukan sebelum hidrolisis  bahan selulotik, sebab lignin dapat menghambat penetrasi asam atau enzim sebelum proses hidrolisis berlangsung. Dengan pemberian  perlakuan delignifikasi pada substrat maka selulosa alami diharapkan menjadi

mudah

dihidrolisis

oleh

enzim

selulotik.

Substrat

didelignifikasi dengan larutan NaOH dengan cara: 1. Menimbang 30 gram serbuk kulit jagung yang tertinggal ayakan 20 mesh dan memasukkan kedalam erlenmeyer 500 ml 2. Memasukkan 400 ml aquadest ke dalam erlenmeyer dan menambahkan NaOH 0%, 3%, 6%, 9% (w/v) ke dalam erlenmeyer 3. Memanaskan dan mengaduk dengan stirer selama 4 jam pada suhu 80 oC 4. Larutan dipisahkan dengan pompa vakum dan kertas saring sehingga diperoleh padatan dan filtrat 5. Padatan kulit jagung yang telah terpisah lalu dibilas dengan air hangat sampai pH 7 dalam pompa vakum 6. Padatan kulit jagung pH netral di oven pada suhu 100 oC selama 10  jam 7. Padatan kulit jagung yang sudah halus disimpan dalam kemasan tertutup 3.5.7

Produksi Enzim Selulase secara Sequential  1. Menimbang substrat yaitu kulit jagung sebanyak 5 gr dan memasukkannya ke dalam erlenmeyer 250 ml 2. Menambahkan 25 ml larutan media fermentasi ke dalam erlenmeyer tersebut dan mengatur pH medium menjadi pH 6 dengan menggunakan CH 3COOH 3. Mensterilisasi

erlenmeyer

yang

berisi

medium

fermentasi

menggunakan Autoclave pada suhu 121 oC selama 15 menit setelah itu didinginkan

35

4. Menginokulasi spora tersuspensi  Aspergillus niger   sebanyak 1 ml ke dalam erlenmeyer 5. Fermentasi statis erlenmeyer yang berisi  Aspergillus niger   pada suhu dan waktu sesuai variable penelitan 6. Menambahkan 100 ml larutan nutrisi yang telah disterilisasi menggunakan  Autoclave  pada suhu 121 oC selama 15 menit ke dalam erlenmeyer dan melanjutkan proses fermentasi pada inkubator goyang dengan kecepatan 200 rpm selama waktu dan suhu tertentu sesuai variabel 7. Menyaring medium fermentasi guna memisahkan miselium jamur  Aspergillus niger  dengan kultur filtrat 8. Mensentrifugasi filtrat yang diperoleh selama 15 menit dengan kecepatan 2500 rpm. Supernatan yang diperoleh digunakan seba gai ekstrak enzim kasar. 9.

Ekstrak enzim kasar disimpan dalam lemari es hingga siap digunakan untuk pengukuran (analisa) selanjutnya

3.5.8

Analisa Hasil 

Uji aktivitas enzim Aktivitas enzim diuji dengan metode CMCase menggunakan reagen Dinitrosalicylic Acid (DNS) (Miller, 1959). Menurut Acharya (2008) untuk menentukan aktivitas enzim, mula-mula ambil 1 ml crude enzim dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi. Kemudian tambahkan CMC 1% b/v dan 0,1 ml larutan penyangga natrium sitrat (pH 4,8). Campuran tersebut diinkubasikan pada 40 o

C selama 30 menit. Untuk mengetahui ada atau tidaknya enzim

selulase maka perlu dilakukan uji aktivitas enzim dengan menentukan kadar glukosa sebagai hasil hidrolisa dengan tahapan analisa sebagai berikut: 1. Pembuatan kurva standar  a. 1 ml aquadest dimasukkan ke dalam tabung reaksi kosong dan 5 tabung reaksi kosong lainnya diisi dengan 1 ml larutan glukosa standart (0,25-1,5 mg/ml)

36

 b. 1 ml reagen DNS dan 2 ml aquadest ditambahkan pada tiap tabung reaksi menggunakan pipet c. Semua tabung reaksi dipanaskan di dalam water bath selama 5 menit agar terjadi reaksi antara glukosa dengan DNS d. Tabung reaksi didinginkan dan ditambah dengan aquadest hingga volumenya menjadi 10 ml kemudian dikocok agar  bercampur  e. Absorbansi

tiap

larutan

diukur

menggunakan

spektrofotometer pada 540 nm (Ceirwyn, 1995) f.

Konsentrasi glukosa standar ditunjukkan dengan kurva standar 

2. Analisa glukosa a. 1 ml sampel enzim kasar diambil dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi  b. 1 ml reagen DNS dan 2 ml aquadest ditambahkan pada tiap tabung reaksi menggunakan pipet c. Tabung reaksi dipanaskan di dalam water bath  selama 5 menit agar terjadi reaksi antara glukosa dengan DNS d. Tabung reaksi didinginkan dan ditambah dengan aquadest hingga volumenya menjadi 10 ml kemudian dikocok agar  bercampur  e. Absorbansi

tiap

larutan

diukur

menggunakan

spektrofotometer pada 540 nm (Ceirwyn, 1995) f.  Nilai absorbansi yang diperoleh diplotkan pada kurva standar untuk mengetahui konsentrasi glukosa pada sa mpel 

Penentuan kadar protein Analisa protein dilakukan menggunakan metode Absorbansi Langsung dimana larutan sampel diukur absorbansinya secara langsung pada 280 nm (panjang gelombang maksimal dari protein) dan 260 nm (faktor koreksi untuk serapan dari asam nukleat). Tahapan analisa:

37

1. Menyiapkan aquades dan memasukannya kedalam cuvet sebagai larutan blanko 2. Menyiapkan

crude 

enzim

hasil

sentrifugasi

dan

memasukkannya kedalam cuvet 3. Absorbansi crude enzim diukur menggunakan spektrofotometer  pada 280 nm dan 260 nm 4. Kadar protein dapat ditentukan melalui Persamaan Groves: Protein (mg/mL) = 1,55 A 280 –  0,76 A 260

38

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN 4. BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1. Pengaruh Delignifikasi Terhadap Aktivitas Enzim Kulit Jangung

Penelitian ini dilakukan dengan memanfaatkan limbah pertanian yaitu kulit jagung sebagai substrat dalam produksi enzim kasar selulase oleh  Aspergillus niger . Dalam produksi enzim selulase dari kulit jagung, terlebih dahulu dilakukan pengecilan ukuran substrat menjadi ukuran kurang dari sa ma dengan 1 mm. Selanjutnya dilakukan proses delignifikasi yaitu penghilangan lignin dari suatu senyawa kompleks guna memudahkan penetrasi asam dalam  proses hidrolisis sehingga enzim yang di hasilkan semakin optimal. Penelitian tahap pertama ini bertujuan untuk mengetahui konsentrasi delignifikasi terbaik untuk produksi ekstrak kasar enzim selulase dengan aktivitas yang maksimal dari kapang  Aspergillus niger . Proses delignifikasi dilakukan menggunakan  NaOH melalui beberapa perlakuan yaitu 0% b/v, 3% b/v, 6% b/v, dan 9% b/v serta dikombinasikan dengan waktu fermentasi konstan 7 hari (3 hari SSF, 4 hari SmF) dah suhu konstan 35 oC. Berdasarkan hasil analisa, delignifikasi substrat berpengaruh terhadap aktivitas enzimatik enzim endoglukanase seperti terlihat pada Gambar 4.1. 0.08 0.07    )    l   m    / 0.06    U    I    ( 0.05   m    i   z   n0.04    E   s   a0.03    t    i   v    i    t 0.02    k    A 0.01 0 0

2

4

6

8

10

Delignifikasi (%b/v)

Gambar 4.1 Pengaruh delignifikasi (%b/v) terhadap aktivitas endoglukonase substrat kulit jagung 39

Berdasarkan

hasil

analisa

menggunakan

spektrofotometer

menunjukkan bahwa perlakuan delignifikasi substrat menggunakan NaOH  berpengaruh terhadap aktivitas endoglukanase kulit jagung. Semakin besar konsentrasi NaOH dalam proses delignifikasi maka semakin besar juga aktivitas endoglukonase yang dihasilkan. Sesuai dengan penelitian yang dilakukan oleh Gunam dkk., (2010) yang mengkaji interaksi perlakuan delignifikasi dan konsentrasi substrat jerami padi terhadap aktivitas endoglukanase dengan variasi konsentrasi delignifikasi (b/v) 0%, 2%, 4%, dan 6%, sedangkan variasi konsentrasi substrat sebesar (b/v) 1%, 2%, dan 3%, diperoleh bahwa nilai rata-rata aktivitas endoglukanase paling tinggi didapat dari interaksi perlakuan delignifikasi dengan NaOH 6% dengan konsentrasi substrat 2% yaitu sebesar 0,0365 unit/ml. Sedangkan nilai rata-rata terendah diperoleh dari interaksi perlakuan tanpa delignifikasi dengan konsentrasi substrat 3% yaitu 0,0191 unit/ml. Hal ini disebabkan semakin tinggi konsentrasi larutan NaOH, kemampuan untuk melarutkan lignin dan merusak struktur selulosa akan semakin bertambah, yang mengakibatkan serat-serat selulosa akan semakin longgar sehingga semakin mudah dihidrolisis oleh mikroorganisme baik untuk pertumbuhannya maupun untuk produksi enzim selulase (Gunam, 1997; Gunam et al., 2004; Lee et al., 2009). Dari Gambar 4.1 dapat diketahui bahwa nilai aktivitas enzim endoglukanase yang paling tinggi didapat dari perlakuan delignifikasi dengan NaOH 9% b/v yaitu sebesar 0,0721 IU/ml. Sedangkan nilai aktivitas enzim endoglukanase yang paling rendah didapat dari perlakuan tanpa delignifikasi yaitu 0,0328 IU/ml.

4.2. Pengaruh Waktu Fermentasi Terhadap Aktivitas Enzim Kulit Jagung

Peneltian tahap kedua bertujuan untuk mengetahui waktu fermentasi terbaik dalam produksi ekstrak kasar enzim selulase dari kulit jagung. Pada tahap ini dicobakan tiga variasi waktu fermentasi yaitu 2 hari SSF 5 hari SmF, 3 hari SSF 4 hari SmF, dan 4 hari SSF 3 hari SmF. Sementara, variable lain  berupa perlakuan delignifikasi dan suhu fermentasi dibuat konstan. Suhu yang di gunakan adalah 35 oC, sedangkan hasil perlakuan delignifikasi terbaik dari  penelitian tahap pertama yaitu 9% b/v digunakan dalam tahap-tahap

40

selanjutnya. Berdasarkan hasil analisa, variasi waktu fermentasi memberikan hasil sebagai berikut: 0.06    )    l0.05   m    /    U    I    (0.04   m    i   z   n0.03    E   s   a    t    i0.02   v    i    t    k 0.01    A

0 0

1

2 3 4 Waktu Fermentasi (SSF) (hari)

5

Gambar 4.2 Pengaruh waktu fermentasi terhadap aktivitas endoglukanase substrat kulit jagung Berdasarkan hasil analisa menggunakan spektrofotometer, perlakuan waktu fermentasi dengan metode  sequential   memberikan hasil yang nyata terhadap aktivitas endoglukonase ekstrak kasar kulit jagung. Waktu fermentasi terbaik dalam menghasilkan enzim selulase dengan aktivitas enzim tertinggi adalah 7 hari terdiri dari 2 hari SSF 5 hari SmF. Maksud dari  sequential  fermentation adalah gabungan antara metode SSF dan SmF dimana pada tahap  pre-culture  digunakan metode SSF, kemudian dilanjutkan dengan proses  produksi enzim dengan metode SmF (Cunha, et al. 2012). Penggunaan metode SSF pada proses pre-culture  akan mendorong pertumbuhan filamen dari  Aspergillus niger   sehingga interaksi antara substrat dengan mikroba menjadi lebih baik dan menghasilkan endoglukanase yang lebih banyak (Cunha, et al. 2012). Ketika nutrisi pada metode SSF telah banyak digunakan oleh mikroorganisme untuk menghasilkan endoglukanase, proses fermentasi dilanjutkan ke tahap SmF dimana nutrisi kembali ditambahkan kedalam medium fermentasi agar kebutuhan makanan mikroorganisme tetap terpenuhi. Penelitian yang dilakukan oleh Cunha et al. (2012) mengenai proses  produksi enzim selulase dengan metode sequential fermentation menggunakan

41

 Aspergillus niger   dengan substrat limbah batang tebu menunjukkan bahwa aktivitas endoglukanase paling tinggi dicapai menggunakan  sequential  fermentation yang terdiri dari 1 hari SSF dan 2 hari SmF dengan aktivitas sebesar 1,052 ± 0,034 IU/ml, daripada fermentasi menggunakan metode SmF konvensional yang menghasilkan aktvitas endoglukanase sebesar 0,824 ± 0,044 IU/ml. Hal ini menunjukkan bahwa metode fermentasi secara sequential  memberikan pengaruh positif terhadap aktivitas endoglukanase ekstrak kasar enzim selulase (Cunha et al., 2012). Pada penelitian ini digunakan waktu fermentasi konstan selama 7 hari dengan variasi waktu perpindahan dari SSF ke SmF yaitu 2 hari SSF 5 hari SmF; 3 hari SSF 4 hari SmF; dan 4 hari SSF 3 hari SmF, dengan asumsi  bahwa hari pertama fermentasi merupakan fase lag (fase adaptasi) dimana mikroorganisme mulai menyesuaikan diri dengan medium yang baru sehingga  periode SSF paling kecil dipilih 2 hari. Dari hasil penelitian diperoleh variasi  perpindahan waktu fermentasi dari SSF ke SmF paling baik yaitu 2 hari SSF 5 hari SmF dengan aktivitas endoglukanase sebesar 0,05301 IU/ml. Hal ini  berkaitan dengan metode SmF yang memiliki kemudahan dalam pengontrolan suhu, pH, maupun nutrien sehingga operasi proses fermentasi yang optimum  bisa dicapai (Virmala and Ravichandran 2012). Oleh karena itu, ketika waktu fermentasi dengan metode SmF lebih lama dibandingkan dengan waktu fermentasi metode SSF maka fermentasi yang optimum akan lebih mudah dicapai.

4.3. Pengaruh Suhu Fermentasi Terhadap Aktivitas Enzim Kulit Jagung

Penelitian tahap ketiga bertujuan untuk mengetahui suhu fermentasi yang baik untuk produksi enzim selulase dari kulit jagung. Pada tahap ini dicobakan tiga variasi suhu yaitu 25

o

C, 30

o

C, dan 35

o

C serta

dikombinasikan dengan perlakuan delignifikasi terbaik dan waktu fermentasi terbaik dari penelitian tahap pertama dan tahap kedua. Berdasarkan hasil analisa, pengaruh perlakuan suhu fermentasi memberikan hasil sebagai  berikut:

42

0.09 0.08

   )    l   m0.07    /    U    I    ( 0.06   m    i   z 0.05   n    E0.04   s   a    t    i 0.03   v    i    t 0.02    k    A

0.01 0 20

25

30 Suhu (˚C)

35

40

Gambar 4.3 Pengaruh suhu fermentasi terhadap aktivitas enzim s elulase Berdasarkan hasil analisa menggunakan spektrofotometer, variasi  perlakuan

suhu

memberikan

hasil

yang

berbeda

terhadap

aktivitas

endoglukanase ekstrak kasar enzim selulase dari kulit jagung. Suhu inkubasi mempunyai

peranan

yang

penting

dalam

aktivitas

metabolisme

mikroorganisme. Hasil penelitian menunjukkan suhu optimum untuk mendapatkan aktivitas endoglukanase terbaik dicapai pada 30

o

C dengan

aktivitas endoglukanase sebesar 0,0774 IU/ml. Hasil ini sesuai dengan  penelitian yang dilakukan oleh Mrudula dan Murugammal (2011), yang mengkaji

tentang

produksi

enzim

selulase

oleh  Aspergillus

niger 

menggunakan limbah sabut kelapa sebagai substrat melalui metode Solid State  Fermentation  dan Submerged Fermentation  dan diperoleh bahwa suhu optimum untuk produksi enzim secara maksimal diperoleh pada 30 oC dengan aktivitas endoglukanase sebesar 3,4 U/ml.

4.4. Pengaruh Perlakuan Delignifikasi, Waktu Fermentasi, dan Suhu Fermentasi Secara Sequential Terhadap Aktivitas Enzim dan Kadar Protein Enzim Selulase

Inkubasi yang dilakukan selama tujuh hari secara sequential dimaksudkan untuk mengecek aktivitas enzim selulase dan kadar protein yang dihasilkan. Aktivitas enzim diukur dari jumlah glukosa yang dihasilkan oleh

43

enzim ekstrak kasar karena enzim selulase bekerja untuk memutus ikatan glikosidik pada selulosa menjadi glukosa; dimana selulosa adalah polimer dengan monomernya yaitu selobiase yang merupakan gabungan dari dua unit glukosa. Setiap hari dilakukan pengambilan sample sebanyak 8 ml dari medium fermentasi dengan kondisi operasi terbaik berdasarkan run penelitian 1 sampai run ke-3, selanjutnya disentrifuse pada 2500 rpm selama 15 menit. Sampel enzim yang telah disentrifuse tersebut merupakan ekstrak kasar enzim yang akan dianalisis aktivitas enzim dan kadar proteinnya. Sentrifuse dilakukan untuk memisahkan bakteri dari supernatannya. Enzim selulase merupakan enzim ekstraseluler sehingga yang diambil adalah supernatant dari proses sentrifuse. Hasil perhitungan aktivitas enzim endoglukanase ekstrak kasar enzim selulase dapat dilihat pada Gambar 4.4. 0.09 0.08    )    l   m 0.07    /    U    I    (0.06   m    i   z0.05   n    E0.04   s   a    t    i 0.03   v    i    t0.02    k    A 0.01 0 0

1

2 3 Waktu Fermentasi (hari)

4

5

Gambar 4.4 Aktivitas enzim dengan metode sequential fermentation Berdasarkan Gambar 4.4 dapat diketahui bahwa aktivitas enzim meningkat seiring bertambahnya waktu fermentasi. Aktivitas enzim tertinggi diperoleh pada hari terakhir fermentasi (hari ke-7) yaitu sebesar 0,07634 IU/ml. Hal ini sesuai dengan penelitian yang dilakukan oleh Idiawati dkk. (2014) yang menyatakan bahwa peningkatan aktivitas enzim selulase terjadi  pada hari ke-4 hingga hari ke-8. Aktivitas enzim endoglukanase terus mengalami peningkatan karena adanya interaksi antara enzim selulase dengan

44

selulosa dalam sampel. Interaksi antara enzim selulase dengan selulosa akan membentuk kompleks enzim-substrat yang menghasilkan glukosa sebagai  produk (Idiawati dkk., 2014). Menutut persamaan aktivitas enzim: Aktivitas Enzim (IU/ml) =

µ    ×

Dimana: BM glukosa

= 180,1559 gr/mol

Ekstak enzim

= 1 ml

Waktu inkubasi

= 30 menit

Seperti yang telah dijelaskan sebelumnya, aktivitas enzim diukur dari  jumlah glukosa yang dihasilkan oleh enzim ekstrak kasar akibat interaksi kompleks enzim-substrat yang menghasilkan glukosa sebagai produk. Ketika  jumlah glukosa yang dihasilkan pada setiap waktu fermentasi meningkat maka aktivitas enzim juga meningkat sesuai dengan persamaan aktivitas enzim. Selain dilakukan analisa terhadap aktivitas enzimatik, juga dilakukan analisa terhadap kadar potein yang terdapat dalam ekstrak kasar enzim selulase. Kadar protein terlarut dalam filtrat enzim kasar diasumsikan sebagai  protein enzim selulase. Hasil analisa kadar protein dengan metode Absorbansi Langsung ditunjukkan pada Gambar 4.5. 3

   )    l   m2.5    /   g   m    (   n 2    i   e    t   o   r 1.5    P    i   s   a   r 1    t   n   e   s   n 0.5   o    K 0

0

1

2 3 Waktu Fermentasi (hari)

4

5

Gambar 4.5 Konsentrasi protein dengan metode sequential fermentation Hardjo et al., (1989) dalam Gunam dkk., (2010) menyatakan bahwa  Aspergillus niger   dalam media pertumbuhan yang mengandung molekul

45

kompleks dapat mengeluarkan enzim ekstraseluler seperti: α-amilase, βamilase, glukoamilase, protease dan selulase. Berdasarkan hasil penelitian diperoleh

bahwa

kenaikan

aktivitas

enzim

selulase

(endoglukanase)

 berbanding lurus dengan kenaikan kadar protein terlarut. Fenomena ini sesuai dengan hasil penelitian yang dilakukan oleh Gunam dkk., (2010) dengan menggunakan substrat jerami padi dengan variasi konsentrasi substrat dan  perlakuan delignifikasi seperti ditunjukkan pada Tabel 4.1. Tabel 4.1 Nilai rata-rata kadar protein terlarut filtrat kasar enzim selulase (mg/ml) Konsentrasi

Delignifikasi dengan NaOH

Substrat

0%

2%

4%

6%

1%

0,215

0,237

0,243

0,321

2%

0,228

0,246

0,250

0,362

3%

0,170

0,189

0,192

0,208

Hal ini dapat diindikasikan bahwa sebagian besar protein terlarut dalam filtrat enzim kasar terdiri dari enzim selulase (Gunam dkk., 2010).

46

BAB V PENUTUP

5.1 Kesimpulan

1. Kulit jagung yang di pretreatment   menggunakan NaOH menghasilkan aktivitas enzim selulase yang dihasilkan oleh kapang  Aspergilus niger  lebih tinggi daripada kulit jagung tanpa  pretreatment . Aktivitas enzim selulase paling tinggi diperoleh dari pretreatment menggunakan NaOH sebesar 9% b/v. 2. Variasi perpindahan waktu dari Solid State Fermentation  (SSF) ke Submerged Fermentation  (SmF) terbaik yang memberikan hasil nilai aktivitas enzim selulase yang dihasilkan oleh kapang  Aspergilus niger   paling tinggi adalah 2 hari SSF 5 hari SmF dengan aktivitas sebesar 0,053 IU/ml. 3. Suhu fermentasi terbaik dalam produksi enzim selulase secara  sequential  diperoleh pada suhu 30 oC. 4. Fermentasi secara  sequential   dengan kombinasi perlakuan delignifikasi terbaik, waktu fermentasi terbaik, dan suhu terbaik memberikan hasil aktivitas enzim selulase dan kadar protein terlarut yang berbanding lurus. Semakin lama waktu fermentasi, semakin tinggi aktivitas enzim selulase dan semakin tinggi pula kadar protein terlarut pada ekstrak kasar enzim selulase. Aktivitas enzim dan kadar protein tertinggi diperoleh pada hari terakhir fermentasi yaitu sebesar 0,07634 IU/ml dan 2,83259 mg/ml.

5.2 Saran

1. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut mengenai penggunaan mikroba  jenis lain dalam produksi enzim selulase dari limbah kulit jagung. 2. Perlu dilakukan penelitain lebih lanjut mengenai perlakuan konsentrasi delignifikasi agar diperoleh konsentrasi optimum delignifikasi substrat. 3. Karakterisasi terhadap enzim selulase yang dihasilkan perlu dilakukan. 4. Perlu dilakukan pengujian enzim selulase yang telah dikarakterisasi untuk  proses sakarifikasi bioetanol dari kulit jagung.

47

DAFTAR PUSTAKA

Bakti, Chandra Paska. Optimasi Produksi Enzim Selulase Dari Bacillus sp. BPPT CC RK2 Dengan Variasi pH Dan Suhu Menggunakan Response Surface  Methodology. Skripsi, Jakarta: Universitas Indonesia, 2012. Balitsereal. Jagung Hibrida. Sulawesi Selatan, January 11, 2011. Barron, George.  Aspergillus niger - Scanning Electron Micrograph. October 14, 2013. https://atrium.lib.uoguelph.ca (accessed January 15, 2016). Bayu, and Fitria. Wordpress.  Juni 7, 2009. https://biobakteri.wordpress.com (accessed Januari 15, 2016). BPS. "Berita Resmi Statistik BPS Provinsi Jawa Tengah."  No. 48/07/33/Th. IX , Juli 1, 2015: 1-5. Bradshaw, T. C., H. Alizadeh, F. Teymouri, V. Balan, and B. E. Dale. "Ammonia Fiber Expansion Pretreatment And Enzymatic Hydrolysis On Two Different Growth Stages Of Reed Canary Grass."  Applied Biochemical  Biotechnology, No. 140, 2007: 395-405. Chaturvedi, Venkatesh, and Pradeep Verma. "An Overview Of Key Pretreatment Processes Employed For Bioconversion Of Lignocellulosic Biomass Into Biofuels And Value Added Products."  Biotech Vol. 3 No. 5, 2013: 415431. Cunha, F. M., M. N. Esperanca, T. C. Zangirolami, and C. S. Farinas. "Sequential Solid-State And Submerged Cultivation Of Aspergillus niger On Sugarcane Bagasse For The Production Of Cellulase."  Bioresource Technology, 2012: 270-274. Dijck, P. W. M. van, J. C. Frisvad, N. Dunn Coleman, and E Schuster. "On The Safety Of Aspergillus niger - A Review."  Applied Microbiology And  Biotechnology, No. 59, 2002: 426-435. F. M. Cunha, A. Badino, C. S. Farinas, E. Ximenes, and M. R. Ladisch. "Liquid Hot Water And Steam Explosion Pretreatment Of Sugarcane Bagasse For Enzyme Production By A Sequential Solid-State And Submerged Method." Congresso Brasileiro de Engenharia Quimica. Brazil, 2014.

48

Galbe, M., and G. Zacchi. "Pretreatment Of Lignocellulosic Materials For Efficient Bioethanol Production."  Adv Biochem Engin/Bioethanol, 108, 2007: 41-65. Gunam, I.B.W., Hardiman, T. Utami. 2004. Chemical Pretreatments on Bagasse to Enhance Hydrolysis of Its Cellulose Enzimatically.  The 3th  Hokkaido Indonesian Student Association Scientific Meeting (HISAS 3): Sapporo Gunam, Ida Bagus Wayan, Ketut Buda, and I Made Yoga Semara Guna. "Pengaruh

Perlakuan

Delignifikasi

Dengan

Larutan

NaOH

Dan

Konsentrasi Substrat Jerami Padi Terhadap Produksi Enzim Selulase Dari Aspergillus niger NRRL A-II, 264."  Jurnal Biologi Vol. XIV No. 2 , 2010: 55-61. Idiawati, N., Harfinda, E.M., Arianie, L. 2014.  Produksi Enzim Selulase oleh  Aspergillus niger pada Ampas Sagu. Jurnal Natur Indonesia 16 (1). ISSN 1410-9379 Isroi. Karakteristik Lignoselulosa. November 28, 2008. http://isroi.com (accessed January 15, 2016). Iyrata, Frenda. "Proses Produksi Bioetanol Dari Tanaman Ketapang Dengan Metode Solid State Fermentation Oleh Aspergillus niger ." Tugas Akhir, 2011. Lee, SH. T.V. Doherty, R.J. Linhardt, J.S. Dordick. 2009.  Ionic Liquid-Mediated Selective Extraction of Lignin from Wood Leading to Enhanced Enzymatic Cellulose Hydrolysis. Biotechnol. and Bioeng, Vol. 102, No. 5:1386-1376 Miller, G. L. Use of Dinitrosalicylic Acid Reagent for Determination of Reducing Sugar. Anal Chem. 1959; 31: 426 –  428. Moore, Davis.  Lignin Structure.  2011. http://www.cambridge.org (accessed January 15, 2016). Mrudula, Soma, and Rangasamy Murugamamal. "Production Of Cellulase by Aspergillus niger Under Submerged And Solid State Fermentation Using Coir Waste As A Substrate."  Brazilian Journal Of Microbiology Vol. 42  No. 3, 2011.

49

Mussatto, S. I., and J. A. Teixeira. "Lignocellulose As Raw Material In Fermentation

Processes."

 Applied

Microbiology

And

Microbial

 Biotechnology, 2010: 897-907.  Ningsih, Eva Rahayu. Uji Kinerja Digester Pada Proses Pulping Kulit Jagung  Dengan Variabel Suhu Dan Waktu Pemasakan.  Tugas Akhir, Semarang: Universitas Diponegoro, 2012. Octa, Widya. Komponen Dan Struktur Lignoselulosa. Skripsi, Jakarta: Universitas Indonesia, 2013. Pandey, Ashok. Enzyme Technology. New York: Springer, 2006. Harry Rizka Permatasari, Fakhili Gulo, Bety Lesmini. Pengaruh Konsentrasi  H 2SO4  Dan NaOH Terhadap Delignifikasi Serbuk Bambu (Gigantochloa  Apus).Program Studi Pendidikan Kimia FKIP Universitas Sriwijaya.2014 Pratiwi, Widya. Teknik Fermentasi. Bandung, Maret 19, 2012. Samin, Adias. "Aktivitas Antioksidan Rambut Jagung (Zea mays L.) Yang Tumbuh di Daerah Gorontalo." Skripsi, Gorontalo, 2014. Sanjaya, Wayan, and Shelyria Adrianti. Optimasi Hidrolisis Jerami Padi Menjadi Glukosa Untuk Bahan Baku Biofuel Menggunakan Selulase Dari Trichoderma reesei Dan Aspergillus niger.  Skripsi, Surabaya: Institut Teknologi Sepuluh Nopember, 2012. Saropah, Dyah Ayu, Akyunul Jannah, and Anik Maunatin. "Kinetika Reaksi Enzimatis Ekstrak Kasar Enzim Selulase Bakteri Selulolitik Hasil Isolasi Dari Bekatul." Alchemy, Vol. 2 No. 1, 2012: 34-45. Serealia, Balai Penelitian. Jagung Hibrida. Sulawesi Selatan, January 11, 2016. Soetrisnanto, Danny. Teknologi Fermentasi. Semarang, September 4, 2015. Updegraff, D. M. "Semimicro Determination Of Cellulose In Biological Material." Analytical Biochemistry, Vol. 3 No. 32, 1969: 420-424. Virmala, and Subramaniyam Ravichandran. "Solid State And Submerged Fermentation

For

The

Production

Of

Bioactive

Substances:

A

Comparative Study."  International Journal Of Science And Nature Vol. 3  No. 3, 2012: 480-486. Wahyuningtyas, Puspita, Bambang Dwi Argo, and Wahyunanto Agung Nugroho. "Studi Pembuatan Enzim Selulase Dari Mikrofungi Trichoderma reesei Dengan Substrat Jerami Padi Sebagai Katalis Hidrolisis Enzimatik Pada

50

Produksi Bioetanol."  Jurnal Bioproses Komoditas Tropis Vol. 1 No. 1, 2013: 21-25. Wibowo, Marlia Singgih.  Faktor-faktor Yang Mempengaruhi Pertumbuhan  Mikroorganisme. Bandung, September 5, 2013. Yang, Shang Tian, Hesham A El-Enshasy, and Nuttha Thongchul. "Cellulases: Characteristics, Sources, Production, And Applications." In  Bioprocessing Technologies In Biorefinery For Sustainable Production Of Fuels, Chemicals, And Polymers, First Edition, by Xiao Zhou Zhang and YiHeng Percival Zhang, 131-146. John Wiley & Sons Inc., 2013. Yilmaz, Nazire Deniz. "Effect Of Chemical Extraction Parameters On Corn Husk Fibres Characterisrics."  Indian Journal Of Fibre & Textile Research, 2013: 29-34. Yonas, Mohammad Ikbal, Ishak Isa, and Hendri Iyabu.  Pembuatan Bioetanol  Berbasis Sampah Organik Batang Jagung.  Tugas Akhir, Gorontalo: Universitas Negeri Gorontalo, 2011. Zhong, Linghao, Wenjian Du, and Jun Xi. "Probing The Interaction Between Cellulose And Cellulase With A Nanomechanical Sensor."  International  Journal Of Science, Technology, And Medicine, 2013.

51

LAMPIRAN A. Pembuatan Kurva Standar

Kurva standar diperoleh dari larutan glukosa dengan konsentrasi 0 mg/ml  –  0.625 mg/ml yang dianalisa menggunakan spektrofotometer. Absorbansi yang terbaca pada alat di plotkan ke grafik. 0.14 0.12 y = 0.1745x R² = 0.9644

0.1       i      s      n 0.08      a        b      r      o      s        b0.06       A

0.04 0.02 0 0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

Konsentrasi (mg/mL)

Dari kurva standar diperoleh persamaan: y = 0,1745 x Dimana: y = absorbansi x = konsentrasi glukosa (mg/ml) Persamaan kurva standar di atas digunakan untuk menentukan konsentrasi glukosa yang terlepas pada tiap variabel hasil run peneliti an.

B. Perhitungan Aktivitas Endoglukanase Ekstrak Kasar Enzim Selulase

Aktivitas enzim dihitung menggunakan persamaan:

IU =

konsentrasi glukosa volume enzim × t 

Dimana: Aktivitas Enzim

= IU/ml

Konsentrasi glukosa

= µmol

t

= waktu inkubasi (menit)

52

a. Run variabel perlakuan delignifikasi substrat; waktu fermentasi 7 hari (3 hari SSF, 4 hari SmF), suhu 35 oC 

Delignifikasi 0% Absorbansi

= 0,031

BM glukosa

= 180,1559 gr/mol

Konsentrasi glukosa

=

, ,

= 0,17765 /

   ×     ×    , 

,

Aktivitas enzim

=

 × 

= 0,03287 / 

Delignifikasi 3% Absorbansi

= 0,042

BM glukosa

= 180,1559 gr/mol

Konsentrasi glukosa

=

, ,

= 0,24068 /

   ×     ×    , 

,

Aktivitas enzim

=

 × 

= 0,04453 / 

Delignifikasi 6% Absorbansi

= 0,053

BM glukosa

= 180,1559 gr/mol

Konsentrasi glukosa

=

, ,

= 0,30372 /

   ×     ×    , 

,

Aktivitas enzim

=

 × 

= 0,05619 / 

Delignifikasi 9% Absorbansi

= 0,068

BM glukosa

= 180,1559 gr/mol

Konsentrasi glukosa

=

, ,

= 0,38968

 

   ×     ×    , 

,

Aktivitas enzim

=

 × 

= 0,07210 /

53

Delignifikasi (%b/v)

Absorbansi

Konsentrasi

Aktivitas enzim

glukosa (mg/ml)

(IU/ml)

0

0,031

0,17765

0,03287

3

0,042

0,24068

0,04453

6

0,053

0,30372

0,05619

9

0,068

0,38968

0,07210

 b. Run variabel waktu fermentasi; delignifikasi 9% b/v, suhu 35 oC 

2 hari SSF, 5 hari SmF Absorbansi

= 0,05

BM glukosa

= 180,1559 gr/mol

Konsentrasi glukosa

=

, ,

= 0,28653

 

   ×     ×    , 

,

Aktivitas enzim

=

 × 

= 0,05301 / 

3 hari SSF, 5 hari SmF Absorbansi

= 0,039

BM glukosa

= 180,1559 gr/mol

Konsentrasi glukosa

=

, ,

= 0,22349

 

   ×     ×    , 

,

Aktivitas enzim

=

 × 

= 0,04135 / 

4 hari SSF, 5 hari SmF Absorbansi

= 0,026

BM glukosa

= 180,1559 gr/mol

Konsentrasi glukosa

=

, ,

= 0,14899

 

   ×     ×    , 

,

Aktivitas enzim

=

 × 

= 0,0275 / Waktu

Absorbansi

Konsentrasi

Aktivitas enzim

54

fermentasi

glukosa (gr/ml)

(IU/ml)

(SSF/SmF) 2/5

0,05

0,28653

0,05301

3/4

0,039

0,22349

0,04135

4/3

0,026

0,14899

0,0275

c. Run variabel suhu fermentasi; delignifikasi 9% b/v, waktu fermentasi 7 hari (2 hari SSF, 5 hari SmF) 

Suhu 25 oC Absorbansi

= 0,042

BM glukosa

= 180,1559 gr/mol

Konsentrasi glukosa

=

, ,

= 0,24068

 

   ×     ×    , 

,

Aktivitas enzim

=

 × 

= 0,04453 / 

Suhu 30 oC Absorbansi

= 0,073

BM glukosa

= 180,1559 gr/mol

Konsentrasi glukosa

=

, ,

= 0,41833

 

   ×     ×    , 

,

Aktivitas enzim

=

 × 

= 0,07740 / 

Suhu 35 oC Absorbansi

= 0,05

BM glukosa

= 180,1559 gr/mol

Konsentrasi glukosa

=

, ,

= 0,28653

 

   ×    ×    , 

,

Aktivitas enzim

=

 × 

= 0,05301 / Suhu (oC)

Absorbansi

Konsentrasi

Aktivitas enzim

55

glukosa (mg/ml)

(IU/ml)

25

0,042

0,24068

0,04453

30

0,073

0,41833

0,07740

35

0,05

0,28653

0,05301

d. Run variabel terbaik fermentasi secara sequential  

Hari ke-3 Absorbansi

= 0,021

BM glukosa

= 180,1559 gr/mol

Konsentrasi glukosa

=

, ,

= 0,12034

 

   ×     ×    , 

,

Aktivitas enzim

=

 × 

= 0,02226 / 

Hari ke-4 Absorbansi

= 0,051

BM glukosa

= 180,1559 gr/mol

Konsentrasi glukosa

=

, ,

= 0,29226

 

   ×     ×    , 

,

Aktivitas enzim

=

 × 

= 0,05407 / 

Hari ke-5 Absorbansi

= 0,059

BM glukosa

= 180,1559 gr/mol

Konsentrasi glukosa

=

, ,

= 0,33810

 

   ×     ×    , 

,

Aktivitas enzim

=

 × 

= 0,06255 / 

Hari ke-6 Absorbansi

= 0,065

BM glukosa

= 180,1559 gr/mol

56

Konsentrasi glukosa

=

, ,

= 0,37249

 

   ×     ×    , 

,

Aktivitas enzim

=

 × 

= 0,06892 / 

Hari ke-7 Absorbansi

= 0,072

BM glukosa

= 180,1559 gr/mol

Konsentrasi glukosa

=

, ,

= 0,41260

 

   ×     ×    , 

,

Aktivitas enzim

=

 × 

= 0,07634 / Hari ke-n SmF

Absorbansi

Konsentrasi

Aktivitas enzim

glukosa (mg/ml)

(IU/ml)

3

0,021

0,12034

0,02227

4

0,051

0,29226

0,05408

5

0,059

0,33810

0,06256

6

0,065

0,37249

0,06892

7

0,072

0,41260

0,07634

C. Perhitungan Protein Terlarut Ekstrak Kasar Enzim Selulase

Konsentrasi

protein

terlarut

ekstrak

kasar

enzim

selulase

dihitung

menggunakan persamaan: Protein (mg/mL) = 1,55 A 280 –  0,76 A 260 

Hari ke-3 Protein = (1,55 × 3,07) –  (0,76 × 3,49) = 2,10610 mg/ml



Hari ke-4 Protein = (1,55 × 3,293) –  (0,76 × 3,667) = 2,31723 mg/ml



Hari ke-5 Protein = (1,55 × 3,171) –  (0,76 × 3,271) = 2,42909 mg/ml



Hari ke-6

57

Protein = (1,55 × 3,472) –  (0,76 × 3,671) = 2,59164 mg/ml 

Hari ke-7 Protein = (1,55 × 3,777) –  (0,76 × 3,976) = 2,83259 mg/ml

Hari ke-n SmF

Absorbansi pada

Absorbansi pada

Konsentrasi

280 nm

260 nm

 protein (mg/ml)

3

3,07

3,49

2,10610

4

3,293

3,667

2,31723

5

3,171

3,271

2,42909

6

3,472

3,671

2,59164

7

3,777

3,976

2,83259

D. Dokumentasi Penelitian

Kulit jagung basah

Kulit jagung kering

58

Delignifikasi substrat

Pembilasan hasil delignifikasi

Kulit jagung setelah delignifikasi dan

Fermentasi variabel delignifikasi

 size reduction

Pengenbangbiakan mikroba

Inokulum

59