TECNICAS DE SIEMBRA UNIVERSIDAD DE NARIÑO FACULTAD DE INGENIERIA AGROINDUSTRIAL INGENIERIA AGROINDUSTRIAL LAB MICROBIOLOGIA
JUSTIFICACION: La importancia de esta práctica es aprender a manipular adecuadamente adecuadamente los
cultivos puros y aplicar las técnicas de siembra, tales como Siembra en medio líquidas, medio semisólido, en agar inclinado, masiva (antibiograma). El tipo de microorganismo que será utilizado en este laboratorio serán bacterias aureus. Las bacterias se cultivan sobre materiales conocidos como medios de cultivo. La composición química o nutricional de los medios es extremadamente variada (Práctica Medios de Cultivo). Los medios más comunes son los caldos (medios líquidos), tubos con agar inclinado, tubos con agar y cajas de Petri con agar o placas de agar. El agar es una sustancia derivada de un alga marina que se solidifica como un semisólido tipo gelatina. Cuando se añaden nutrientes y otros factores de crecimiento, muchos tipos de bacterias pueden cultivarse en él. Para Sembrar es necesario colocar una muestra de inóculo, en un medio de cultivo para obtener el crecimiento de los microorganismos. Para ello se extiende la muestra sobre caja de Petri, que contiene un gel (Agar) al que se han añadido las substancias que necesitan los microorganismos para crecer. La siembra se puede hacer en otros tipos de medios de cultivo, como tubos de vidrio con gel, frascos con líquidos nutritivos para los microorganismos y posterior a ello se procede a la "incubación" del medio ya sembrado. En cada caso se hace en condiciones particulares de presión de oxígeno, temperatura, agitación, duración, etc. Muchas de las bacterias patógenas crecen bien a temperaturas cercanas a los 37ºC habituales de nuestro organismo. Si el cultivo bacteriano tiene éxito, crecerán "colonias" de bacterias en el medio de cultivo. Estas colonias tienen características de color, forma, tamaño etc. propias de cada bacteria y esto nos ayuda a identificarlas. Dependiendo del carácter del material para la siembra de los fines de investigación del medio de cultivo utilizado existen varios métodos de siembra. Todos ellos cumplen con un fin; instalar microorganismos. Por eso se requiere trabajar rápido, pero sin movimiento brusco y durante el proceso de siembra.
PROCEDIMIENTOS Primero se Limpiar y esterilizar el área de trabajo, se Prende los mecheros, ajustar la flama hasta que ésta presente un cono azul bien marcado en lo cual se Identifica y
organiza el material dentro del área de trabajo. Luego se Marca el material con iniciales de la cepa a sembrar, fecha y grupo.
1. Siembra tioglicolato.
en
medio
liquido:
caldo
Se toma una muestra de los microorganismos del tubo con el material problema y se translada al tubo con medio de cultivo estéril. Enseguida incubar el tubo recién sembrado durante 10 a 20 minutos a 37 grados centígrados.
.
3. Técnicas de estriado: Estriado simple: EMB o McConkey (medio selectivo).Se realiza la siembra en una placa con agar esteril y con cuidado de no dañarlo se inucula la muestra en un extremo de la placa y con el asa realiza las estrias. Siembra
para
aislamiento
por
estrias:
de
siembra
(cuadrante) agar sangre. Al
realizar
esta
técnica
extendemos lo más posible en inoculo para obtener colonias aisladas .Primer paso: estriar un borde de la caja. Segundo paso: estriar el segundo plano perpendicular y repetir el ejercicio hasta ocupar toda la caja.
2. Siembra en medio semisólido: SIM (medio de movilidad.) Esta siembra se lleva a cabo con un hilo de siembra (asa recta) con el que se toma la muestra.
El
medio
queda
inoculado
introducir el hilo hasta el fondo del tubo.
al
Disco de plata: con un inoculo normalizado sobre la superficie de un medio sólido, colocando en ella discos de papel de un determinado antibiótico. Marcar la caja e incubar.
4. Siembra en agar inclinado: TSI Se toma una colonia del cultivo puro con el asa recta y se introduce en el tubo con agar inclinado,picando el fondo y al retirar el asa se desliza por la superficie haciendo un zig-zag. Esto ayuda a identificar bacterias -En superficie: aerobias -En la profundidad: anaerobias
VERIFICAR QUE TODAS LAS CAJAS ESTEN MARCADAS E INCUBAR A 37 GRADOS CENTIGRADOS DURANTE 24 HORAS RESULTADOS Bacteria sembrada:
Staphylococcus
aureus
(pronunciación:
/ˌstafiloˈkokus ˈawrews/), conocido como estafilococo
áureo,
o
estafilococo
dorado,
es
anaerobia
5. Siembra masiva: antibiograma (mueller hinton) MH.
facultativa,
comúnmente una gram
bacteria positiva,
productora de coagulasa, catalasa, inmóvil y no esporulada que se encuentra ampliamente
distribuida por todo el mundo, estimándose
Con
que una de cada tres personas se hallan
nutrientes (Caseína, extractos de Levadura y
colonizadas, aunque no infectadas, por ella.1
Carne, Vitaminas, etc.), el medio permite el
Puede
producir
una
amplia
gama
de
enfermedades, que van desde infecciones
el
agregado
de
muchos
factores
desarrollo de la mayor parte de las bacterias patógenas.
cutáneas y de las mucosas relativamente
En nuestro caso el cambio de color fucsia a
benignas, tales como foliculitis, forunculosis o
transparente turbio como se muestra en la
conjuntivitis, hasta enfermedades de riesgo
figura nos indica la probabilidad de que el
vital, como celulitis, abscesos profundos,
microorganismo que se sembró en este medio
osteomielitis, meningitis, sepsis, endocarditis
es patógeno y que es anaerobio.
o neumonía. Además, también puede afectar al
aparato
gastrointestinal,
ya
sea
por
presencia física de Staphylococcus aureus o por la ingesta de la enterotoxina estafilocócica
2. RESULTADO DE Siembra en medio semisólido: (SIM o MIO cualquier medio de movilidad).
secretada por la bacteria. 1. Resultado Siembra en medio liquido:
Caldo tioglicolato
Como él (SIO o MIO) Es un medio semisólido destinado a verificar la movilidad, producción de indol y de sulfuro de hidrógeno en un mismo tubo. Con base a si toma o no alguno de los siguientes resultados: Como el Medio liquido es el caldo de enriquecimiento
más
utilizado
en
Microbiología pues contiene 0,075 % de Agar
-Cepas móviles: producen turbidez del medio, que se extiende más allá de la línea de siembra.
para evitar que las corrientes de convección
-Cepas inmóviles: el crecimiento se observa
transporten el oxígeno de la superficie a toda
solamente en la línea de siembra.
la masa del caldo. El ácido tioglicólico actúa como agente reductor, disminuyendo aún
-Cepas SH2 positivas: ennegrecimiento a lo
más el potencial de óxido-reducción del
largo de la línea de siembra o en todo el
medio.
medio.
-Cepas SH2 negativas: el medio -permanece sin cambio de color.
Consistencia=mantecosa Borde=entero
-Cepas indol positivas: desarrollo de color rojo luego de agregar el reactivo de Kovac´s o de
4. resultado Siembra en agar inclinado TSI.
Erlich. -Cepas indol negativas: sin cambio de color. -En nuestro caso las cepas son móviles pues pueden apreciarse en este medio, por la turbidez que producen alrededor de la punción de siembra, y no son productoras de sulfhídrico por que no hubo formación de un precipitado negro de sulfuro de hierro a partir del tiosulfato.
Como el TSI es un medio universalmente
3. Resultado Técnica de estriado.
empleado para la diferenciación de entero bacterias, en base a la fermentación de glucosa, lactosa, sacarosa y a la producción de ácido sulfhídrico. se empleó este medio e identificando que si: 1-Pico alcalino/fondo ácido (pico rojo/fondo amarillo):
el
microorganismo
solamente
fermenta la glucosa. 2-Pico ácido/fondo ácido (pico amarillo/fondo amarillo): Con el fin de obtener colonias aisladas y así
el
microorganismo
fermenta
glucosa, lactosa y/o sacarosa.
poder realizar un análisis determinado de
3-Pico
estas, se emplea esta técnica de siembra;
rojo/fondo rojo): el microorganismo es no
obtuvimos algunas colias aisladas y se pudo
fermentador de azúcares.
alcalino/fondo
alcalino
(pico
realizar la siguiente descripción de la (S. 4-La presencia de burbujas, o ruptura del
Aureus)
medio
de
cultivo,
indica
que
el
Elevación =planas
microorganismo produce gas.
Forma =regular redondeada
5-El ennegrecimiento del medio indica que el
Aspecto=
áspera
irregularidades Color= beige
con
pequeñas
microorganismo produce ácido sulfhídrico. Y obteniendo los siguientes resultados:
Pico
acido/
fondo
acido:
nuestro
microorganismo fermenta los tres azucares. Por fermentación de azúcares, se producen ácidos, que se detectan por medio del indicador rojo de fenol, el cual vira al color amarillo como se muestra en la figura anexada y nos muestra que se está en presencia de un medio ácido.
1. Cuándo tomas un inoculo de un cultivo bacteriano. ¿Por qué es necesario tocar una parte estéril con el asa antes de tocar el crecimiento bacteriano? Para que no se infecte el inoculo y para obtener los resultados esperados. La esterilización con calor seco y húmedo son los procedimientos de
El tiosulfato de sodio se reduce a sulfuro de
mayor utilización en microbiología. El
hidrógeno el que reacciona luego con una sal
calor seco desnaturaliza las enzimas y
de hierro proporcionando el típico sulfuro de
destruye a los microorganismos por
hierro de color negro en el fondo del tubo.
oxidación, por ejemplo al ponerlos directamente
a
la
flama
de
un
No hubo presencia de burbujas lo que nos
mechero.
indica que no se produjo gas.
principalmente en la esterilización de
5. resultado Siembra masiva (antibiograma): Mueller Hinton (MH).
asas de inoculación y todo tipo de
Estos
métodos
aplican
material de vidrio y quirúrgico.
2. ¿Por qué el asa debe ser flameada antes y después de todos los procedimientos de siembra? La llama de un mechero también se utiliza para esterilizar. Cada vez que un matraz o un tubo de ensayo se abre para añadir o sacar material, se pasa la boca del mismo a través de la llama de un mechero, a fin de destruir cualquier microorganismo que pueda haberse depositado allí. Este procedimiento
Como el Agar Mueller-Hinton es específico
disminuye la probabilidad de que las
para la realización de antibiogramas más el
células
sistema disco-placa se puede medir la eficacia
recipiente y contaminen su contenido.
de los antimicrobianos en nuestro caso 3 tipos
Las asas e hilos de siembra, que los
de antibióticos; de los cuales al disco 3 el s.
microbiólogos
aureus presento sensibilidad con un radio de
microorganismos
sensibilidad superior a los 10 ml y mostrando
llevarlos a otro, también se esterilizan
resistencia a los discos 1 y 2.
flameándolos en la llama de un
Radio de sensibilidad al disco 3= 20 ml.
CUESTIONARIO:
mechero
microbianas
utilizan de
Bunsen
incandescencia.
caigan
Este
para un
en
el
tomar
medio
y
hasta
la
método
de
esterilización es rápido y cómodo,
pero peligroso cuando se trabaja con microorganismos
Para que exista una siembra adecuada
de
de microorganismos debe existir una
calentamiento
buena esterilización de los materiales
repentino en una llama puede formar
y manejo de ello juega un papel
un aerosol (suspensión de pequeñas
importante de la cual depende el buen
gotas de líquido) que contenga células
desarrollo de los microorganismos.
enfermedad.
causantes
El
microbianas y que puede ser inhalado
Mantener un medio de trabajo donde
por la persona que esté trabajando en
se realiza la técnica de siembra y
el laboratorio. La utilización de un
también de nuestras manos para
pequeño horno para esterilizar las asas
reducir la probabilidad de esparcir
evita este riesgo.
microorganismos al ambiente.
3. ¿Por qué las placas de agar deben
mantenerse invertidas durante la incubación?
CONCLUSIÓNES
Una vez que se ha colocado la
Se estudia o analiza y diferencia a
suspensión de bacterias en la placa, se
todos los tipos de siembra que puedan
debe dejar que se evapore una parte
realizarse explicados en teoría.
antes de comenzar la incubación
Se
realiza
experimentalmente
el
durante toda la noche. Sin embargo,
ensayo de siembra de cultivos que se
quedará una cantidad moderada de
pueden realizar en el laboratorio
humedad. Si la placa no es invertida
dependiendo del tipo de medio de
durante la incubación, la bacteria no
cultivo y del tipo de microorganismo a
podrá
sembrar.
colonizar
el
agar
apropiadamente, lo que evitará que crezca
y
forme
adecuadamente,
o
colonias
puede realizarse por métodos de
el
dilución, en medios sólidos a través de
otros
estría en placa o en medios líquidos.
microorganismos. Cualquiera de estas
Esto nos permite apreciar que cada
dos
el
célula bacteriana que se separe dará
Además,
la
origen a una población que formara
humedad
puede
crecimiento
de
consecuencias
experimento. condensación
estimulará
El aislamiento de cultivos microbianos
o
invalidarán
una colonia.
causar vetas, lo que hará que elegir y analizar colonias separadas sea mucho más difícil. Una vez que la bacteria ha formado colonias, la placa también debe ser almacenada hacia abajo para mantener los niveles de humedad.
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