Microbiologia

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO INSTITUTO DE FÍSICA DE SÃO CARLOS LICENCIATURA EM CIÊNCIAS EXATAS

DISCIPLINA BIOLOGIA 3 BIOLOGIA 3

INTRODUÇ ÃO À MICROB IOLOGIA IOLOGIA

Nelma R. Segnini Bossolan

2002

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO

1

1.1 POSIÇÃO DOS MICRORGANISMOS NO MUNDO VIVO 1.2 DISTRIBUIÇÃO DOS MICRORGANISMOS NA NATUREZA 1.3 ÁREAS DE APLICAÇÃO DA MICROBIOLOGIA 1.4 A EVOLUÇÃO DA MICROBIOLOGIA 1.4.1 GERAÇÃO ESPONTÂNEA VERSUS BIOGÊNESE 1.4.2 TEORIA MICROBIANA DAS DOENÇAS 1.5 CARACTERIZAÇÃO E CLASSIFICAÇÃO DOS MICRORGANISMOS

2 3 4 5 5 7 8

2 BACTÉRIAS

10

2.1 MORFOLOGIA E ULTRA-ESTRUTURA DAS BACTÉRIAS 2.1.1 ESTRUTURAS BACTERIANAS 2.2 CULTIVO DAS BACTÉRIAS 2.2.1 TIPOS NUTRITIVOS DAS BACTÉRIAS 2.2.2 MEIOS BACTERIOLÓGICOS 2.2.3 CONDIÇÕES FÍSICAS NECESSÁRIAS AO CRESCIMENTO 2.3 REPRODUÇÃO E CRESCIMENTO 2.3.1 REPRODUÇÃO 2.3.2 CRESCIMENTO 2.4 PRINCIPAIS GRUPOS DE BACTÉRIAS 2.4.1 BACTÉRIAS PATOGÊNICAS

10 13 17 17 19 20 21 21 23 24 25

3 FUNGOS

28

3.1 INTRODUÇÃO 3.2 CARACTERÍSTICAS PRÓPRIAS DOS FUNGOS 3.2.1 REPRODUÇÃO NOS FUNGOS 3.2.2 FISIOLOGIA E NUTRIÇÃO DOS FUNGOS 3.3 CLASSIFICAÇÃO DOS FUNGOS 3.3.1 ZYGOMYCETES 3.3.2 ASCOMYCETES 3.3.3 BASIDIOMYCETES 3.3.4 DEUTEROMYCETES 3.4 FUNGOS E SUAS ASSOCIAÇÕES COM OUTROS ORGANISMOS 3.4.1 LIQUENS 3.4.2 MICORRIZAS 3.4.3 TRUFAS 3.5 FUNGOS ECONOMICAMENTE IMPORTANTES 3.5.1 FUNGOS PATOGÊNICOS

28 28 30 31 32 33 34 36 37 38 38 39 39 39 40

4 VÍRUS

43

4.1 INTRODUÇÃO 4.2 HISTÓRICO 4.3 ESTRUTURA DOS VÍRUS

43 43 44

4.4 CLASSIFICAÇÃO DOS VÍRUS ANIMAIS E DE PLANTAS 4.5 REPLICAÇÃO DO VÍRUS 4.6 BACTERIÓFAGOS 4.7 ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO DO VÍRUS 4.8 AGENTES INFECCIOSOS SEMELHANTES A VÍRUS

45 47 50 51 51

5 CONTROLE DOS MICRORGANISMOS

53

5.1 FUNDAMENTOS 5.2 CONDIÇÕES QUE INFLUENCIAM A AÇÃO ANTIMICROBIANA 5.3 MODO DE AÇÃO DOS AGENTES ANTIMICROBIANOS 5.4 CONTROLE PELOS AGENTES FÍSICOS 5.4.1 APLICAÇÃO DAS ALTAS TEMPERATURAS 5.4.2 APLICAÇÃO DE BAIXAS TEMPERATURAS 5.4.3 RADIAÇÕES 5.5 CONTROLE PELOS AGENTES QUÍMICOS 5.5.1 ESCOLHA DO AGENTE QUÍMICO ANTIMICROBIANO 5.5.2 PRINCIPAIS GRUPOS DE DESINFETANTES DESINFETANTES E ANTI-SÉPTICOS 5.6 ANTIBIÓTICOS E OUTROS AGENTES QUIMIOTERÁPICOS

53 54 54 54 54 55 56 57 57 58 59

6 BIBLIOGRAFIA

64

IFSC / LCE / Biologia 3 – Microbiologia 1 _____________________________________________________________________________________________

1 Introdução A ciência da Microbiologia [do grego: mikros (“pequeno”), bios (“vida”) e logos (“ciência”)] é o estudo dos organismos microscópicos e de suas atividades. Preocupa-se com a forma, a estrutura, a reprodução, a fisiologia, o metabolismo e a identificação dos seres microscópicos. Inclui o estudo da sua distribuição natural, suas relações recíprocas e com outros seres vivos, seus efeitos benéficos e prejudiciais sobre os homens e as alterações físicas e químicas que provocam em seu meio ambiente. Em sua maior parte, a Microbiologia trata com organismos microscópicos unicelulares. Nas assim chamadas formas superiores de vida, os organismos são compostos de muitas células, que constituem tecidos altamente especializados e órgãos destinados a exercer funções específicas. Nos indivíduos unicelulares, todos os processos vitais são realizados numa única célula. Independentemente da complexidade de um organismo, a célula é, na realidade, a unidade básica da vida. Todas as células vivas são basicamente semelhantes. Conforme já foi visto, elas compõem-se de protoplasma (do grego: a primeira substância formada), um complexo orgânico coloidal constituído principalmente de proteínas, lipídeos e ácidos nucleicos; o conjunto é circundado por membranas limitantes ou parede celular, e todos contêm um núcleo ou uma substância nuclear equivalente. Todos os sistemas biológicos têm as seguintes características comuns: 1) habilidade de reprodução; 2) capacidade de ingestão ou assimilação de substâncias alimentares, metabolizando-as para suas necessidades de energia e de crescimento; 3) habilidade de excreção de produtos de escória; 4) capacidade de reagir a alterações do meio ambiente (algumas vezes chamada de "irritabilidade"), e 5) suscetibilidade à mutação. Os princípios da Biologia podem ser demonstrados através do estudo da Microbiologia, pois os microrganismos têm muitas características que os tornam instrumentos ideais para a pesquisa dos fenômenos biológicos. Os microrganismos fornecem sistemas específicos para a investigação das reações fisiológicas, genéticas e bioquímicas, que são a base da vida. Eles podem crescer, de maneira conveniente, em tubos de ensaio ou frascos, exigindo, assim, menos espaço e cuidados de manutenção do que as plantas superiores e os animais. Além disso, crescem rapidamente e se reproduzem num ritmo muito alto; algumas espécies bacterianas demonstram quase 100 gerações num período de 24 horas. Os processos metabólicos dos microrganismos seguem os padrões que ocorrem nos vegetais superiores e nos animais. As leveduras, por exemplo, utilizam a glicose, basicamente do mesmo modo que as células dos tecidos de mamíferos, revelando que o mesmo sistema enzimático está presente nestes organismos tão diversos. Em Microbiologia pode-se estudar os organismos em grande detalhe e observar seus processos vitais durante o crescimento, a reprodução, o envelhecimento e a morte. Modificando-se a composição do meio ambiente, é possível alterar as atividades metabólicas, regular o crescimento e, até alterar alguns detalhes do padrão genético, tudo sem causar a destruição do microrganismo. Os principais grupos de microrganismos são os protozoários, fungos, algas e bactérias. Os vírus, apesar de não serem considerados vivos, têm algumas características de células vivas e por isso são estudados como microrganismos. Este texto irá abordar


temas sobre bactérias, fungos e vírus, uma vez que algas e protozoários já foram vistos em etapa anterior.

1.1 Posição dos microrganismos no mundo vivo A Microbiologia estuda alguns organismos que são predominantemente semelhantes ao vegetais , outros que são similares aos animais e, um terceiro grupo que tem características aos animais e vegetais. Visto que não existem organismos que não pertencem, naturalmente, a nenhum destes dois reinos, foi proposta a criação de novos reinos que os pudessem incluir. Uma dessas primeiras proposições foi feita em 1866 pelo zoólogo alemão E. H. Haeckel. Este autor sugeriu que um terceiro reino incluísse os microrganismos que, tipicamente não poderiam ser classificados como vegetais ou animais. Esses organismos foram chamados de protistas e colocados no reino Protista, constituído unicamente por seres unicelulares. Assim, ao se falar de modo geral em protistas, compreendem-se bactérias, algas, fungos e protozoários, excluindo-se os vírus que não são organismos celulares. Mediante os progressos do conhecimento da ultra-estrutura celular, os microrganismos puderam ser divididos em duas categorias: procariotos e eucariotos. Esta divisão baseia-se nas diferenças de organização da maquinaria celular, já vistas neste curso. As algas azuis (cianofíceas) e as bactérias são organismos procariotos. Entre os microrganismos eucariotos estão os protozoários, os fungos e as demais algas (as células animais e vegetais são, também eucarióticas). Os vírus, isolados entre os microrganismos, são deixados de lado neste esquema de organização celular. Um outro sistema de classificação, o sistema dos cinco reinos, foi proposto por Robert H. Whittaker (1969), baseado no modo pelo qual o organismo obtém nutrientes de sua alimentação. Este sistema é, agora, amplamente aceito porque considera relações evolutivas e é compatível com os recentes estudos bioquímicos, genéticos e ultraestruturais, os quais sugerem que a endossimbiose (viver junto, um no interior do outro) hereditária levou até a célula eucariótica, tal como ela é conhecida, a partir de uma variedade de unidades procarióticas, desenvolvendo-se desde um ancestral procariótico comum. Os microrganismos, portanto, são encontrados em três dos cinco reinos: reino Monera (bactérias e cianobactérias), reino Protista (algas microscópicas e protozoários) e reino Fungi (leveduras e bolores). Até 1977, a idéia prevalecente era de que os organismos procariotos, por causa da sua simplicidade estrutural, eram os ancestrais de eucariotos mais complexos. Com as pesquisas de Carl Woese e seus colaboradores, ficou comprovado que os procariotos e eucariotos evoluíram por vias completamente diferentes a partir de uma forma ancestral comum, como mostra a figura 1. Estes pesquisadores utilizaram uma técnica que compara o arranjo nucleotídico do RNAr entre diferentes organismos. Por exemplo, se as sequências de ribonucleotídeos de 2 tipos de organismos diferem em grande extensão, a relação entre ambos é muito distante; ou seja, os organismos divergiram há muito tempo de um ancestral comum. Porém, se as sequências mostram mais similaridades, os organismos estão intimamente relacionados e têm um ancestral comum relativamente recente. Os eucariotos possuem um tipo geral de sequência e os


procariotos, um segunto tipo. Dentre os procariotos, alguns têm um terceiro tipo de sequência, que difere dos anteriores. Com isso, concluiu-se que há 2 tipos principais de bactérias, designadas de arqueobactérias e eubactérias. A figura 1 mostra um esquema das vias pelas quais os organismos vivos evoluíram, como deduzido através de estudos comparativos e RNA ribossômico.

Figura 1: Representação das vias pelas quais os organismos vivos evoluíram, como deduzido através de estudos comparativos de RNA ribossômico. As três maiores ramificações evolucionárias são mostradas como arqueobactrérias, eubactérias e eucariotos. Entre as eubactérias pelo menos dez linhas de descendentes distintos ocorrem; nas arqueobactérias, pelo menos três. No caso dos eucariotos, há evidências de que certas eubactérias Gram-negativas invadiram células eucarióticas primitivas e evoluíram como organelas intracelulares chamadas mitocôndrias. Cloroplastos, as organelas fotossintéticas de células de plantas, parecem ter evoluído de maneira similar, a partir de uma cianobactéria. (fonte: Pelczar et al., 1996)

1.2 Distribuição dos Microrganismos na Natureza Os microrganismos se encontram em praticamente todos os lugares da natureza. São transportados por correntes aéreas desde a superfície da Terra até as camadas superiores da atmosfera. Mesmo os microrganismos típicos dos oceanos podem ser achados a muitos quilômetros de distância, no alto de montanhas. São encontrados em sedimentos no fundo do mar, em grandes profundidades. São carregados por correntes fluviais e até mares; e, se dejetos humanos contendo bactérias patogênicas forem despejados em correntes de água, a doença pode disseminar-se de um lugar para outro. Os microrganismos ocorrem mais abundantemente onde puderem encontrar alimentos,

IFSC / LCE / Biologia 3 – Microbiologia 4 __________________________ ________________________________________ ____________________________ ____________________________ ____________________________ _________________________ ___________

umidade e temperatura adequadas adequadas para seu crescimento e multiplicação. Uma vez que as condições que favorecem a sobrevivência e o crescimento de muitos microrganismos são as mesmas sob as quais vivem as populações humanas, é inevitável que vivamos entre grande quantidade de microrganismos. Eles estão no ar que respiramos e no alimento que ingerimos. Estão na superfície de nosso corpo, em nosso trato digestivo, na boca, no nariz e em outros orifícios naturais. Felizmente, a maioria dos microrganismos é inócua para o homem, e este tem meios de resistir à invasão daqueles que são potencialmente patogênicos. patogênicos.

1.3 Áreas de aplicação da Microbiologia Existem numerosos aspectos no estudo da Microbiologia, que são divididos em duas áreas principais: a microbiologia básica e a microbiologia aplicada. aplicada. A microbiologia básica estuda a natureza fundamental e as propriedades dos microrganismos. microrganismos. Preocupa-se com assuntos relacionados aos seguintes temas: morfológicas (forma e tamanho das células, composição química, ! características morfológicas etc.); ! características fisiológicas (necessidades nutricionais específicas e condições necessárias ao crescimento e reprodução); ! atividades bioquímicas (modo de obtenção de energia pelos microrganismos); características genéticas (hereditariedade (hereditariedade e variabilidade das características); ! características ecológicas (ocorrência natural dos microrganismos no ambiente e ! características ecológicas sua relação com outros organismos); ! potencial de patogenicidade dos microrganismos e ! classificação (relação taxonômica entre os grupos do mundo microbiano). Na microbiologia aplicada estuda-se como os microrganismos podem ser usados ou controlados para várias finalidades práticas. Os pricipais campos de aplicação da microbiologia incluem: medicina, alimentos e laticínios, agricultura, indústria e ambiente. Na área industrial, por exemplo, os microrganismos são utilizados na síntese de uma variedade de substâncias químicas, desde o ácido cítrico até antibióticos mais complexos e enzimas. Certos microrganismos são capazes de fermentar material orgânico animal e humano, produzindo gás metano que pode ser coletado e usado como combustível. A biometalurgia explora as atividades químicas de bactérias para extrair minerais, como cobre e ferro de minérios de baixa qualidade. A indústria do petróleo têm utilizado bactérias e seus produtos, como os exopolissacarídeos presentes externamente à célula bacteriana, para aumentar a extração do petróleo de rochas reservatório. Na área ambiental, estuda-se a utilização de microrganismos que podem degradar poluentes específicos, como herbicidas e inseticidas.


A microbiologia microbiologia médica médica trata dos microrganismos causadores de doenças doenças humanas (patogênicos, além de estar relacionada com a prevenção e o controle das doenças. Juntamente com a engenharia genética, têm pesquisado a produção de enzimas bacterianas que dissolvam coágulos sangüíneos, vacinas humanas utilizando vírus de insetos e testes laboratoriais rápidos para diagnóstico de infecção viral, entre tantas outras aplicações possíveis nesta área. A microbiologia dos alimentos está relacionada com as doenças que podem ser transmitidas pelos alimentos, como por exemplo, infecções causadas por salmonelas, intoxicações causadas por estafilococos e clostrídios. Relaciona-se também com aspectos positivos, com a utilização de microrganismos na produção de alimentos/bebidas (queijos, pães, cervejas, etc.).

1.4 A Evolução da Microbiologia A Microbiologia começou quando se aprendeu a polir lentes, feitas a partir de peças de vidro, e a combiná-las até produzir aumentos suficientemente grandes que possibilitassem a visualização dos microrganismos. Durante o século XIII, Roger Bacon postulou que a doença era produzida por seres vivos invisíveis. A sugestão foi novamente feita por Fracastoro de Verona (1483-1553) e por Von Plenciz, em 1762, mas estes autores não dispunham de provas. No início de 1658, um monge chamado Kircher se referiu a "vermes" invisíveis a olho desarmado nos corpos em decomposição, no pão, no leite e em excreções diarréicas. Em 1665, Robert Hooke viu e descreveu células em um pedaço de cortiça. Estabeleceu o fato de que os organismos de "animais e plantas, complexos que sejam, são compostos de algumas partes elementares que se repetem freqüentemente" - citação não devida a Hooke, mas originada da descrição de Aristóteles sobre a estrutura celular das coisas vivas, datadas do século IV a.C. Embora não tenha sido, provavelmente, o primeiro a ver as bactérias e os protozoários, o holandês Antony Van Leeuwenhoek (1632-1723), foi o primeiro a relatar suas observações, com descrições precisas e desenhos. A palavra bactéria vem do termo bacterium , que foi introduzido pelo alemão C.G. Ehrenberg, em 1828, como uma denominação genérica para certos tipos bacterianos representativos. Deriva da palavra grega que significa "pequeno bastão". A palavra micróbio foi introduzida em 1878 pelo cirurgião francês, Charles-Emmanuel Sedillot. 1.4.1 Geração Espontânea versus Biogênese

A descoberta dos microrganismos focalizou o interesse científico sobre a origem dos seres vivos. No que se refere às formas superiores de vida, Aristóteles (384-322 a.C.) pensava que os animais podiam se originar, espontaneamente, do solo, de plantas e de outros animais diferentes, e sua influência ainda atingiu o século XVII. Era aceito como fato, por exemplo, que as larvas podiam ser produzidas pela exposição da carne a o calor e ao ar, embora Francesco Redi (1626-1697) duvidasse do mesmo. Ele realizou uma experiência na qual colocou carne numa jarra coberta com gaze. Atraídas pelo odor da carne, as moscas puseram seus ovos sobre a cobertura e, destes, emergiram as larvas. Esta experiência e outras parecem ter resolvido o assunto,


ao menos no que se referia a tais formas vivas. Com os microrganismos, contudo, era diferente; seguramente eles não tinham pais. Em 1749, John Needham (1713-1781), trabalhando com carne exposta a cinzas quentes, observou o aparecimento de microrganismos que não existiam no início da experiência, concluindo que as bactérias tinham se originado da carne. Quase que ao mesmo tempo, Spallanzani (1729-1799) ferveu caldo de carne durante uma hora, fechando logo a seguir os frascos. Nenhum microrganismo apareceu, mas seus resultados, ainda que repetidos, não convenceram Needham. Este insistia em que o ar era essencial para a produção espontânea dos seres microscópicos, e este ar tinha sido excluído dos frascos pelo fechamento. 60 a 70 anos mais tarde dois pesquisadores responderam a este argumento. Franz Schulze (1815-1873) aerava infusões fervidas, fazendo o ar atravessar soluções fortemente ácidas, enquanto Theodor Schwann (18101882) forçava o ar através de tubos aquecidos ao rubro. Em nenhum dos casos surgiram os micróbios. Os adeptos da geração espontânea não se convenceram, dizendo que o ácido e o calor é que não permitiram o crescimento dos micróbios. Por volta de 1850, Schröder e Von Dush realizaram uma experiência mais convincente, fazendo o ar passar através do algodão para frascos que continham o caldo aquecido. Assim, as bactérias foram retidas pelas fibras de algodão, tanto que não houve seu desenvolvimento. O conceito de geração espontânea foi revivido, pela última vez, por Pouchet, que publicou em 1859, um relatório, provando sua ocorrência. Pouchet foi rebatido por Louis Pasteur (1822-1895). Este preparou um frasco com colo longo, estreito, em pescoço de cisne . As soluções nutritivas foram aquecidas no frasco e o ar - não-tratado e não-filtrado - podia passar para dentro ou para fora. Os micróbios, porém, depositavam-se no pescoço de cisne e não apareciam na solução. Finalmente, John Tyndall (1820-1893) efetuou experiências numa caixa especialmente desenhada para provar que a poeira carrega os micróbios . Se não houver poeira, o caldo estéril ficará livre de crescimento microbiano por períodos de tempo indefinidos. Os aparelhos utilizados nas experiências acima descritas estão ilustrados na figura 2.

Figura 2: Aparelhos utilizados nos experimentos que derrubaram a teoria da geração espontânea (fonte: Pelczar et al., 1980).


1.4.2 Teoria Microbiana das Doenças

Antes de Pasteur ter provado experimentalmente que as bactérias são a causa de algumas doenças, muitos observadores já argumentavam a favor desta teoria. Fracastoro de Verona sugeriu que as doenças podiam ser devidas a organismos invisíveis, transmitidos de uma pessoa para outra. Em 1762, Von Plenciz, de Viena, não apenas estabeleceu que seres vivos eram causas de doenças, como também suspeitou que microrganismos diferentes eram responsáveis por enfermidades diferentes. O médico Oliver W. Holmes (1809-1894) insistia que a febre puerperal era contagiosa e, provavelmente, causada por um germe transmitido de uma mãe para outra por intermédio das parteiras e dos médicos. Quase na mesma época, o médico húngaro Ignaz P. Semmelweis (1818-1865) introduzia o uso de antissépticos na prática obstétrica. Na França, Louis Pasteur estudou os métodos e processos envolvidos na fabricação de vinhos e cervejas. Observou que a fermentação das frutas e dos grãos, resultando em álcool, era efetuada por micróbios. Examinando muitas amostras de "fermentos", isolou micróbios de espécies diferentes. Nos bons lotes, predominava um tipo; nos produtos pobres, outro tipo estava presente. Selecionando adequadamente o microrganismo, o fabricante podia estar seguro de conseguir produtos bons e uniformes. Porém os micróbios já estavam nos sucos; deviam ser removidos e fermentação iniciada com uma cultura proveniente de um tonel que tinha sido satisfatório. Pasteur sugeriu que os tipos indesejáveis de microrganismos deveriam ser eliminados pelo calor, não tão intenso que prejudicasse o gosto do suco de fruta, mas suficiente para tornar inócuo os germes. Observou que, mantendo os sucos a uma temperatura de 62-63 º C, durante uma hora e meia, obtinha o resultado desejado. Este processo tornou-se conhecido como pasteurização e hoje é amplamente utilizado nas indústrias de fermentação, porém é a indústria dos derivados do leite que está mais familiarizada com este método, visando a destruição dos microrganismos patogênicos, presentes no leite. Na Alemanha, o médico Robert Koch (1843-1910) estudou o problema do carbúculo hemático, que é uma doença do gado bovino, caprino e, às vezes, do homem. Ele descobriu os bacilos típicos com extremidades cortadas em ângulos retos, no sangue de animais mortos pela infecção carbunculosa. Inoculou as bactérias em meios de cultura, em seu laboratório, examinou-as ao microscópio para estar seguro de que apenas uma espécie tinha se desenvolvido e injetou-as em outros animais para verificar se estes se tornavam doentes e desenvolviam os sintomas clínicos do carbúnculo hemático. A partir destes animais experimentais, Koch isolou micróbios iguais aos que tinha encontrado originalmente nos carneiros infectados. Esta foi a primeira vez que uma bactéria foi comprovada como causa de uma doença animal. A partir disto foram estabelecidos os postulados de Koch: 1) Um microrganismo específico pode sempre ser encontrado em associação com uma dada doença. 2) O organismo pode ser isolado e cultivado, em cultura pura, no laboratório. 3) A cultura pura produzirá a doença quando inoculada em animal sensível. 4) É possível recuperar o microrganismo, em cultura pura, dos animais experimentalmente infectados.


1.5 Caracterização e Classificação dos Microrganismos A caracterização e a classificação dos organismos vivos são o principal objetivo em todos os ramos da Ciência Biológica. A partir do momento em que um organismo é completamente conhecido, torna-se possível fazer comparações com outros, determinando semelhanças e diferenças. As comparações das características de grande número de microrganismos resultam, eventualmente, num sistema de agrupamento das espécies semelhantes. Por fim, cria-se um grupo com características muito semelhantes, que é considerado como uma espécie e recebe um nome específico, isto é, o microrganismo adquire um nome. Por serem individualmente tão pequenos que não podem ser visualizados sem ajuda de um microscópio, não é prático trabalhar com um único indivíduo. Por esta razão estudam-se culturas, que contêm milhares, milhões e até mesmo bilhões de indivíduos. Uma cultura que consiste em uma única espécie de microrganismo (uma espécie viva), independentemente do número de indivíduos, num ambiente livre de outros organismos vivos, é chamada de cultura axênica. Os microbiologistas usualmente se referem a tais culturas como culturas puras, embora, no sentido técnico estrito, a cultura pura seja aquela que se origina do crescimento de uma única célula. Se dois ou mais tipos (espécies) crescem juntos, como normalmente ocorre na natureza, passam a constituir uma cultura mista. Antes de identificar e classificar um microrganismo, suas características devem ser determinadas com detalhes adequados. As principais incluem as seguintes: 1. Características culturais: os nutrientes exigidos para o crescimento e as condições físicas do ambiente que favorecem o desenvolvimento. 2. Características morfológicas: as dimensões das células, seus arranjos, a diferenciação e a identificação de suas estruturas. 3. Características metabólicas: a maneira pela qual os microrganismos desenvolvem os processos químicos vitais. 4. Características da composição química: a identificação dos principais e típicos constituintes químicos da célula. 5. Características antigênicas: a detecção de componentes especiais da célula (químicos) que fornecem evidências de semelhança entre as espécies. 6. Características genéticas: a análise da composição do ácido desoxirribonucleico (DNA), assim como a determinação das relações entre o DNA isolado de diferentes microrganismos. A maioria das características acima citadas é determinada através de testes laboratoriais, que incluem o uso de diferentes meios e diferentes reações químicas. No entanto, um dos instrumentos mais poderosos na investigação é o microscópio. A tabela 1 resume as características essenciais e aplicações dos diferentes tipos de microscopia.


Tabela 1 : Comparação de diferentes tipos de microscópios (fonte: Pelczar et al.,1996). Tipo de Ampliação máxima Observação do espécime útil microscópio

Aplicações

Campo claro

1.000 – 2.000

Espécimes corados ou descorados; as bactérias, geralmente coradas, aparecem com a cor do corante

Características morfológicas grosseiras de bactérias, leveduras, bolores, algas e protozoários

Campo escuro

1.000 – 2.000

Geralmente descorados; aparecem brilhantes ou iluminados” sobre um campo escuro

Microrganismos que exibem algumas características morfológicas especiais quando vivos e em suspensão fluida; por exemplo, os espiroquetas

Fluorescência

1.000 – 2.000

Luminoso e corado; cor do Técnica de diagnóstico em que o corante fluorescente corante fluorescente fixado ao organismo revela a sua identidade

Contraste de fase

1.000 – 2.000

Graus variáveis de iluminação

Eletrônico

200.000 – 400.000 Observado em tela fluorescente

Exame de estruturas celulares em microrganismos maiores e vivos; por exemplo, leveduras, algas, protozoários e algumas bactérias Exame de vírus e das ultraestruturas das células microbianas


2 BACTÉRIAS 2.1 Morfologia e Ultra-Estrutura das Bactérias Entre as principais características das células bacterianas estão suas dimensões, forma, estrutura e arranjo. Estes elementos constituem a morfologia da célula (fi gura 3). Embora existam milhares de espécies bacterianas diferentes, os organismos isolados apresentam uma das três formas gerais: elipsoidal ou esférica, cilíndrica ou em bastonete e espiralada. As células bacterianas esféricas ou elipsoidais são chamadas de cocos e podem apresentar os arranjos vistos na figura 4. As células bacterianas cilíndricas ou em bastonetes (bacilos) comumente apresentam-se isoladas e ocasionalmente ocorrem aos pares (diplobacilos) ou em cadeias (estreptobacilos) (figura 5). As bactérias espiraladas (singular = spirillum; plural = spirilla) ocorrem, predominantemente, como células isoladas. As células individuais de espécies diferentes exibem, contudo, nítidas diferenças no comprimento, número e amplitude das espirais e na rigidez das paredes celulares. As bactérias curtas com espiras incompletas são conhecidas como bactérias comma ou vibriões (figura 6). A unidade de medida das bactérias é o micrômetro, que equivale a 10 -³ mm. As bactérias mais freqüentemente estudadas em laboratório medem, aproximadamente, 0,5 a 1,0 µm por 2,0 a 5,0 µm. Os estafilococos e estreptococos, por exemplo, têm diâmetros variáveis entre 0,75 e 1,25 µm. As formas cilíndricas, tais como o bacilo da febre tifóide e da disenteria, apresentam uma largura de 0,5 a 1,0 µm e um comprimento de 2 a 3 µm. Algumas formas filamentosas podem exceder os 100 µm de comprimento, mas seu diâmetro está, de modo característico, entre 0,5 e 1,0 µm. A figura 7 mostra o tamanho comparativo de uma célula de uma bactéria, um vírus e um protozoário.

Figura 3: Principais estruturas celulares que ocorrem em células bacterianas. Certas estruturas, como por exemplo, grânulos ou inclusões, não são comuns a todas as células bacterianas (fonte: Pelczar et al, 1996).


Figura 4: Arranjos característicos dos cocos, com ilustrações esquemáticas dos padrões de multiplicação. [ A] Diplococos: as células se dividem em um plano e permanecem acopladas predominantemente em pares (escaneamento por micrografia eletrônica de varredura). [ B] Estreptococus: as células se dividem em um plano e permanecem acopladas para formar cadeias (micrografia eletrônica de varredura). [ C] Tetracocos: as células se dividem em dois planos e caracteristicamente formam grupos de quatro células. As espécimes mostradas são Gaffkya tetragena. [D] Estafilococos: as células se dividem em três planos, em um padrão irregular, formando cachos de cocos. As espécimes mostradas são Staphylococcus aureus. [E] Sarcinas: as células se dividem em três planos, em um padrão regular, formando um arranjo cúbico de células (fonte: Pelczar et al., 1996).

Figura 5: Bactérias tipicamente cilíndricas (bacilos). Observar as variações de comprimento e de largura. (A) Clostridium sporogenes; (B) Pseudomonas sp; (C) Bacillus megaterium; (D) Salmonella typhi (fonte: Pelczar et al ., 1980).


Figura 6: Bactérias espiraladas. (A) célula de Leptospira mostrando o filamento axial típico. Micrografia eletrônica, x 71.526. (B) Spirillum itersonii visto ao microscópio eletrônico, x 33.600. (C) Rhodospirillum rubrum, x 1.220. (D) Spirochaeta stenostrepta, x 23.000. (E) Methanospirillum hungatii, uma nova espécie da bactéria gram-negativa que ocorre em filamentos de até 100 µm de comprimento. (fonte: Pelczar et al ., 1980)

[A]

Unidades de comprimento Micrômetro (µm) Nanômetro (nm) Angström (Å)

Metro (m) 0,000001 10-6 0,000000001 10-9 0,0000000001 10-10

Centímetro (cm) 0,0001 10-4 0,0000001 10-7 0,00000001 10-8

Milímetro (mm) 0,001 10-3 0,000001 10-6 0,0000001 10-7

Micrômetro (µm) 1 0,001 10-3 0,0001 10-4

Nanômetro (nm) 1.000 103 1 0,1 10-1

Figura 7: [A] Uma comparação de tamanhos de microrganismos selecionados. O quadro acima mostra a equivalência no sistema métrico para as unidades usadas para expressar dimensões das células microbianas (modificado de Pelczar et al ., 1996).


2.1.1 Estruturas Bacterianas

O exame da célula bacteriana revela certas estruturas definidas por dentro e por fora da parede celular. Seguem-se breves descrições das estruturas bacterianas de fácil identificação: Flagelos: apêndices muito finos, semelhantes a cabelos, que se exteriorizam através da parede celular e se originam de uma estrutura granular (corpo basal) imediatamente abaixo da membrana citoplasmática, no citoplasma. O flagelo apresenta três partes: uma estrutura basal, uma estrutura semelhante a um gancho e um longo filamento externo à parede celular (figura 8). O seu comprimento é, usualmente, várias vezes o da célula, mas seu diâmetro é uma pequena fração do diâmetro celular (p.e., 10 a 20 nm). Algumas bactérias se movimentam por outros meios, diversos da atividade flagelar, como o deslizamento provocado pelo fluxo protoplasmático ou pela resposta táxica (p.e., fototaxia, quimiotaxia). Pêlos (fímbrias): apêndices filamentosos menores, mais curtos e mais numerosos que os flagelos e que não formam ondas regulares. Estão presentes em muitas bactérias gram-negativas. São encontrados tanto nas espécies móveis como nas imóveis e portanto, não desempenham papel relativo à mobilidade. Podem funcionar como sítios de adsorção de vírus bacterianos, como mecanismo de aderência à superfícies e como porta de entrada de material genético durante a conjugação bacteriana [(pêlo sexual) (figura 9)]. Glicocálice: formado de uma substância viscosa, que forma uma camada de cobertura ou envelope ao redor da célula. Se o glicocálice estiver organizado de maneira definida e estiver acoplado firmemente à parede celular, recebe o nome de cápsula; se estiver desorganizado e sem qualquer forma e anda estiver frouxamente acoplado à parede celular, recebe o nome de camada limosa. O glicocálice pode ter natureza polissacarídica (um ou vários tipos de açúcares como p.e., galactose, ramnose, glicana, etc.) ou polipeptídica (p.e., ácido glutâmico). A principal função do glicocálice é a aderência sobre superfícies; ele pode evitar o dessecamento das bactérias, fornece um envoltório protetor e pode servir, também, como reservatório de alimentos, além de evitar a adsorção e lise da células por bacteriófagos (figura 10). Parede Celular: dá forma à célula e situa-se abaixo das substâncias extracelulares (glicocálice) e externamente à membrana que está em contato imediato com o citoplasma. Sua espessura é calculada, em média, de 10 a 25 nm. A função da parede celular é a de proporcionar uma moldura rígida, ou "colete", que suporta e protege as estruturas protoplasmáticas mais lábeis, em face das possíveis lesões osmóticas; evita ainda a evasão de certas enzimas, assim como o influxo de certas substâncias que poderiam causar dano à célula. Nas eubactérias, o peptideoglicano (ou mureína), um composto polimérico, é o componente da parede celular que determina sua forma. A parede celular das bactérias Gram-positivas é constituída por ácido teicóico, além do peptideoglicano, que corresponde à uma fração maior que a encontrada na parede das bactérias Gram-negativas (figura 11). A parede das bactérias Gram-negativas é mais complexa que a parede das Gram-positivas pois possui uma membrana externa cobrindo uma camada fina de peptideoglicano (figura 12). Esta membrana externa é cosnstituída por fosfolipídeos, proteínas e lipopolissacarídeos (LPSs).


Figura 8: Desenho de um corpo basal ilustrando sua estrutura e a fixação a bactérias Gram-negativas. O flagelo de bactérias Gram-positivas tem somente dois anéis (um par) que fixam o flagelo à membrana celular (fonte: Pelczar et al ., 1996).

Figura 9: Bactérias fimbriadas. (A) Shigella flexneri: bacilos em divisão com numerosas fímbrias ao redor das células (x 20.000). (B) Salmonella typhi: bacilos em divisão com numerosas fímbrias e alguns poucos flagelos (apêndices mais longos), x 12.500 (fonte: Pelczar et al., 1980).


Figura 10: Bactérias capsuladas. (A) Klebsiella pneumoniae. (B) Bactéria capsulada formadora de limo, isolada em uma fábrica de papel. Notar as cápsulas extremamente grandes (áreas claras), ao redor de cada uma das células. (fonte: Pelczar et al., 1980).

Figura 11: Parede celular de bactérias Gram-positivas (fonte: Prescott et al ., 1996).


Figura 12: Parede celular de bactérias Gram-negativas (fonte: Prescott et al ., 1996).

Estruturas internas à parede celular: Protoplastos: quando remove-se a parede celular de uma bactéria, esta torna-se um corpo arredondado, que assume a forma esférica, justamente por não contar com a rígida limitação da parede. A bactéria recebe o nome, então, de protoplasto, que pode ser caracterizado como: imóvel, esférico, não se divide, não forma nova parede celular e não é suscetível, de modo geral, à infecções por bacteriófagos. Membrana citoplasmática: fina membrana situada abaixo da parede celular (figura 13). Sua espessura é da ordem de 7,5 nm e é composta de fosfolipídeos (20 a 30%), que formam uma bicamada que envolve as proteínas (50 a 70%). A membrana é o sítio da atividade enzimática específica e do transporte de moléculas para dentro e para fora da célula. Em alguns casos, a membrana se estende no citoplasma para formar o mesossomo, que participa do metabolismo (através da secreção de certas enzimas, com as penicilinases) e da replicação celular (na formação do septo durante o processo de divisão celular). Citoplasma: o material celular pode ser dividido em: área citoplasmática , que é a porção fluida contendo substâncias dissolvidas e partículas tais como ribossomos, e material nuclear ou nucleóide , rico em DNA. Inclusões citoplasmáticas: depósitos concentrados de certas substâncias, insolúveis, chamados de grânulos, e que podem servir como fonte de material nutritivo de reserva. Os grânulos podem ser constituídos de polissacarídeos (amido, glicogênio), lipídeos, fosfatos e até enxofre, como é o caso das bactérias sulforosas. Material nuclear: as células bacterianas não contêm o núcleo típico das células animais e vegetais. O material nuclear consiste de um cromossomo único e circular e ocupa uma posição próxima do centro da célula. Pode ser chamado de corpo cromatínico, nucleóide, equivalente nuclear ou cromossoma bacteriano.


Endósporos: esporos que se formam dentro da célula. São como um corpo oval de parede espessa (um por célula), altamente resistente e refráteis. Todas bactérias dos gêneros Bacillus e Clostridium produzem endósporos. São constituídos de ácido dipicolínico e por grande quantidade de cálcio. Os esporos representam uma fase latente (repouso) da célula bacteriana; comparados com as células vegetativas, são extremamente resistentes aos agentes físicos e químicos adversos, demonstrando uma estratégia de sobrevivência (figura 14). Figura 13: Interpretação esquemática da estrutura da membrana citoplasmática. Os fosfolipídeos estão arranjados em uma bicamada de tal forma que as partes polares (esferas) estão voltadas para a face externa e as partes não-polares (filamentos) estão voltadas para a face interna. Também são mostrados os componentes protéicos (fonte: Pelczar et al ., 1996).

2.2 Cultivo das Bactérias O cultivo dos microrganismos, em condições laboratoriais, é um pré-requisito para seu estudo adequado. Para que isto possa ser realizado, é necessário o conhecimento de suas exigências nutritivas e das condições físicas requeridas.

2.2.1 Tipos Nutritivos das Bactérias

As bactérias podem ser divididas em grupos com base em suas exigências nutritivas. A principal separação corresponde aos grupos fototróficos (organismos que utilizam a energia radiante como fonte de energia) e quimiotróficos (organismos incapazes de utilizar a energia radiante; dependem da oxidação de compostos químicos para a obtenção de energia) (tabela 2). ♦ Fototróficos: existem bactérias que utilizam o CO2 como principal fonte de

carbono; são as fotolitotróficas. Outras exigem um composto orgânico (álcoois, ácidos graxos, aminoácidos) e são ditas fotorganotróficas.

♦ Quimiotróficos: bactérias que utilizam o CO2 como fonte de carbono e

oxidam compostos inorgânicos (p.e., nitritos) ou elementos químicos (p.e., enxofre) para obtenção da fonte de energia ,são chamadas quimiolitotróficas. As que utilizam compostos orgânicos para obter energia, são chamadas quimiorganotróficas. As bactérias fotolitotróficas e quimiolitotróficas são conhecidas, comumente, como autotróficas, ao passo que as espécies fotorganotróficas e quimiorganotróficas são designadas heterotróficas.


Figura 14: [A] Localização, tamanho e forma dos endósporos em células de várias espécies de Bacillus e Clostridium. [B] Alterações estruturais na célula bacteriana durante a esporulação (fonte: Pelczar et al., 1996).

As bactérias heterotróficas apresentam exigências nutritivas mais simples. O fato de um organismo poder crescer e se reproduzir numa mistura de compostos químicos simples indica que ele possui uma grande capacidade de síntese. As bactérias heterotróficas foram estudadas mais profundamente porque, sob certo aspecto, demonstram um interesse mais imediato. Neste grupo se encontram todas as bactérias patogênicas para o homem, para outros animais e para os vegetais, assim como a maior parte da população microbiana do ambiente humano. As bactérias heterotróficas, embora constituam o principal grupo nutritivo, variam, consideravelmente, quanto aos nutrientes específicos exigidos para o crescimento (tabela 3). As heterotróficas podem ser consumidoras, alimentando-se de outros organismos vivos; saprófitas, que se alimentam de matéria orgânica morta. Outras podem ser simbiontes, ou seja, mantém uma relação estreita com um organismo de espécie diferente. Estas simbiontes podem


ser comensais, que nem ajudam, nem prejudicam seu hospedeiro, ou podem ser parasitas, que causam dano ao hospedeiro (caso das bactérias patogênicas). Tabela 2: Principais tipos nutritivos das bactérias (fonte: Pelczar, 1980).

Tipo

Fonte de Energia Para Crescimento

Fonte de Carbono Para Crescimento

Exemplo de Gênero

Fotolitotrófico (autotrófico)

Luz

CO2

Chromatium

Fotorganotrófico (heterotrófico)

Luz

Composto orgânico

Rhodopseudomonas

Quimiolitotrófico (autotrófico)

Oxidação de composto inorgânico

CO2

Thiobacillus

Quimiorganotrófico (heterotrófico)

Oxidação de composto orgânico

Composto orgânico

Escherichia

Fototrófico:

Quimiotrófico:

Tabela 3: Exigências nutritivas mínimas de algumas bactérias heterotróficas (fonte: Pelczar, 1980). Sais Inorgânicos

Carbono Orgânico

Escherichia coli

X

X

X

Salmonella typhi

X

X

X

X

Proteus vulgaris

X

X

X

X

Staphylococcus aureus

X

X

X

X

Lactobacillus acidophilus

X

X

X

X

Bactérias

Um Dois ou mais Nitrogênio aminoáci aminoáciInorgânico do dos

Uma vitamina

Duas ou mais vitaminas

X X

2.2.2 Meios Bacteriológicos

Para o cultivo rotineiro de microrganismos heterotróficos, utilizam-se certas matérias-primas complexas, tais como as peptonas, os extratos de carne e de levedura (tabela 4), daí resultando um meio que promove o desenvolvimento de grande variedade de bactérias e de outros microrganismos. Quando se deseja um meio sólido, adiciona-se o ágar como agente solidificante. O caldo e o ágar nutritivos são exemplos de meios líquidos e sólidos, relativamente simples, indicados para a cultura de microrganismos heterotróficos comuns. Alguns microrganismos não se desenvolvem bem nestes meios, pois demonstram exigências de nutrientes específicos, como vitaminas e outras substâncias estimulantes. Tais microrganismos são chamados de heterotróficos fastidiosos, e necessitam de meios especiais para seu cultivo, isolamento e reconhecimento.

X


Os meios de cultura, de acordo com a sua aplicação ou função, podem ser classificados, entre outros, como: Meios Enriquecidos: a adição de sangue, soro ou extratos de tecidos animais ou vegetais ao caldo ou ágar nutritivos proporciona nutrientes acessórios, de modo que o meio possa permitir o crescimento de heterotróficos fastidiosos. Meios Seletivos: a adição de certas substâncias químicas específicas ao ágar nutritivo previne o crescimento de um grupo de bactérias sem agir sobre outras. O cristal violeta, por exemplo, em uma dada concentração, impede o crescimento de bactérias gram-positivas, sem afetar o desenvolvimento das bactérias gram-negativas. Meios Diferenciais: a incorporação de certos reagentes ou substâncias químicas no meio pode resultar num tipo de crescimento ou modificação, após a inoculação e a incubação, que permite ao observador distinguir os tipos de bactérias. Por exemplo, inoculando-se uma mistura de bactérias num meio de ágar sangue, algumas das bactérias podem hemolisar (destruir) as células vermelhas e outras não. A zona clara ao redor da colônia é a evidência de ter ocorrido a hemólise. Assim, pode-se estabelecer a distinção entre bactérias hemolíticas e não-hemolíticas, de acordo com o seu desenvolvimento. Tabela 4: Características de vários produtos complexos, usados como ingredientes dos meios de cultura (fonte: Pelczar, 1980).

MATÉRIA PRIMA

CARACTERÍSTICA

VALOR NUTRITIVO

Extrato de carne

Extrato aquoso de tecido muscular, concentrado sob a forma de pasta

Contém as substâncias solúveis dos tecidos animais, incluindo carboidratos, compostos orgânicos de nitrogênio, vitaminas hidrossolúveis e sais

Peptona

Produto que resulta da digestão de materiais protéicos como carne, caseína e gelatina; a digestão protéica é realizada por meio de ácidos ou de enzimas; existem muitas peptonas diferentes (dependendo da proteína usada e do método de digestão) para uso em meios bacteriológicos; as peptonas diferem em suas propriedades de promover o crescimento

Principal fonte de nitrogênio orgânico; pode conter algumas vitaminas e, às vezes, carboidratos, dependendo do tipo de material protéico digerido

Ágar

Carboidrato complexo, obtido de certas algas marinhas; tratado para a remoção de substâncias estranhas

Usado como agente solidificante dos meios; o ágar, dissolvido em soluções aquosas, gelifica quando a temperatura é reduzida a menos de 45ºC; não é considerado como fonte nutritiva para as bactérias

Extrato de levedo

Extrato aquoso de leveduras comercialmente apresentado sob a forma de pó

Fonte muito rica de vitaminas B, também contém compostos orgânicos de nitrogênio e de carbono

2.2.3 Condições Físicas Necessárias ao Crescimento

Assim como as bactérias variam com relação às exigências nutritivas, também demonstram respostas diversas às condições físicas do ambiente.


Temperatura: o crescimento bacteriano pode ter seu ritmo e quantidade determinados pela temperatura, uma vez que esta influencia as reações químicas do processo de crescimento. Cada espécie de bactéria cresce sob temperaturas situadas em faixas características e, sendo assim, são classificadas nos seguintes grupos: 1. Bactérias psicrófilas: são capazes de crescer a 0° C ou menos, embora seu ótimo seja entre 15° C ou 20° C. 2. Bactérias mesófilas: crescem melhor numa faixa de 25 a 40° C. 3. Bactérias termófilas: crescem melhor a temperaturas de 45 a 60° C A temperatura ótima de crescimento é a temperatura de incubação que possibilita o mais rápido crescimento, durante curto período de tempo (12 a 24 horas). Exigências atmosféricas: os principais gases que afetam o crescimento bacteriano são o oxigênio e o dióxido de carbônico. Como as bactérias apresentam grande variedade de resposta ao oxigênio livre, elas são divididas em: 1. Bactérias aeróbias: crescem na presença de oxigênio livre. 2. Bactérias anaeróbias: crescem na ausência de oxigênio livre. 3. Bactérias anaeróbias facultativas: crescem tanto na presença como na ausência do oxigênio livre. 4. Bactérias microaerófilas: crescem na presença de quantidades pequenas de oxigênio livre. Acidez e alcalinidade (pH): para a maioria das bactérias, o pH ótimo de crescimento localiza-se entre 6,5 e 7,5. Embora poucos microrganismos possam desenvolver-se nos limites extremos de pH, as variações mínimas e máximas, para a maior parte das espécies, estão entre pH 4 e pH 9.

2.3 Reprodução e Crescimento O termo crescimento, tal como é comumente aplicado às bactérias e a outros microrganismos, refere-se, usualmente, às alterações ocorridas na cultura das células e não às alterações de um organismo isolado.

2.3.1 Reprodução

Bactérias geralmente reproduzem-se assexuadamente por fissão binária transversa, quando ocorre a replicação do cromossomo bacteriano e a célula desenvolve uma parede celular transversa, dividindo-se então em duas novas células (figura 15). Após a replicação do cromossomo, a parede transversa forma como uma invaginação da membrana plasmática e da parede celular. Quando a nova parede formada não se separa completamente em duas paredes, pode-se formar uma cadeia (ou filamento) de bactérias. A fissão binária não é o único método reprodutivo entre as bactérias. As espécies do gênero Streptomyces produzem muitos esporos reprodutivos


por organismo, cada esporo dando origem a um novo indivíduo. Bactérias do gênero Nocardia produzem extenso crescimento filamentoso, seguido pela fragmentação dos filamentos em pequenas células bacilares ou cocóides. Espécies do gênero Hyphomicrobium podem reproduzir-se por brotamento: desenvolve-se um broto, a partir da célula-mãe e, depois de um período de aumento de tamanho, o broto se separa da célula original, formando um novo indivíduo. Embora não ocorra uma reprodução sexuada complexa nos moneras, algumas vezes as bactérias realizam troca de material genético. Tal recombinação genética pode ocorrer por transformação, conjugação ou transdução. Na transformação, a célula bacteriana "pega" fragmentos de DNA perdidos por outra bactéria que se rompeu. Este mecanismo tem sido usado experimentalmente para mostrar que os genes podem ser transferidos de uma bactéria para outra e que o DNA é a base química da hereditariedade. Na conjugação, duas células bacterianas geneticamente diferentes trocam DNA diretamente. Este processo tem sido extensivamente estudado na bactéria Escherichia coli, que tem linhagens F- e F+. As células F+ são cobertas com pêlos e contêm um plasmídeo conhecido como fator F, ou fator da fertilidade. Quando uma célula F+ entra em contato com uma célula F-, os pêlos organizam um tubo de conjugação, chamado de pêlo sexual ou pêlo F, que conecta a célula F+ à célula F-. O pêlo F é "oco", permitindo que o DNA pase de uma bactéria para outra. Na transdução, genes bacterianos são carregados de uma bactéria para outra, dentro de um bacteriófago (vírus bacteriano). Quando o bacteriófago entra numa célula bacteriana, o DNA do vírus mistura-se com uma parte do DNA bacteriano, de modo que o vírus agora carrega esta parte do DNA. Se o vírus infecta uma segunda bactéria, o DNA da primeira bactéria pode misturar-se com o DNA da segunda bactéria. Esta nova informação genética é então replicada a cada nova divisão.


Figura 15: Multiplicação bacteriana pela fissão binária transversa (fonte: Pelczar et al ., 1996).

2.3.2 Crescimento

Como já foi mencionado, o processo de reprodução prevalecente entre as bactérias é a fissão binária; uma célula se divide, formando duas células. Assim sendo, partindo de uma única bactéria, o aumento populacional se faz em progressão geométrica: 1 - 21 - 22 - 23 - 24 - 25 ... 2n O tempo necessário para que uma célula se divida - ou para que a população duplique - é conhecido como tempo de geração, que não é o mesmo para todas as bactérias. Para algumas, como a Escherichia coli, pode ser de 15 a 20 minutos; para outras pode ser de muitas horas. O tempo de geração está na forte dependência dos nutrientes existentes no meio e das condições físicas de incubação. A figura 16 mostra a curva de crescimento típica das bactérias em um sistema fechado. Na curva, observa-se que há um período inicial no qual não parece haver crescimento (fase lag ou de latência), seguido por um rápido aumento da população (fase logarítmica), que se nivela posteriormente (fase estacionária) e declina quanto ao número de células viáveis (fase de morte ou declínio).


Figura 16: Curva de crescimento típica de uma população bacteriana. A densidade óptica é uma medida da turbidez da cultura bacteriana e é obtida através da análise da cultura em espectrofotômetro (fonte: modificado de Brock et al ., 1994).

2.4 Principais Grupos de Bactérias A referência padrão para a classificação e taxonomia bacterianas é o Bergey's manual of determinative bacteriology (Holt et al., 1993). Este manual divide as bactérias em 19 grupos. Grupo 1: Bactérias fototróficas

Grupo 2: Bactérias deslizantes

Grupo 3: Bactérias com bainha

Grupo 4: Bactérias gemulantes e/ou pedunculadas

Grupo 5: Espiroquetas

Grupo 6: Bactérias espiraladas e encurvadas

Grupo 7: Coco e bacilos gram-negativos aeróbios

Grupo 8: Bacilos gram-negativos facultativos

Grupo 9: Bactérias gram-negativas anaeróbias

Grupo 10: Cocos e cocobacilos gram-negativos

Grupo 11: Cocos gram-negativos anaeróbios

Grupo 12: Bactérias gram-negativas quimiolitotróficas

Grupo 13: Bactérias produtoras de metano

Grupo 14: Cocos gram-positivos

Grupo 15: Bacilos e cocos esporulados

Grupo 16: Bacilos gram-positivos não-esporulados

Grupo 17: Actinomicetos e microrganismos afins

Grupo 18: Rickettsias

Grupo 19: Micoplasmas

Recentemente, Lynn Margulis e Karlene Schwartz (citado por Davis et al ., 1990) propuseram um sistema de classificação útil que divide as bactérias em 16 filos de acordo com algumas de suas características mais significantes. A tabela 5 mostra algumas características de 11 destes grupos.


Tabela 5: Características de alguns grupos de bactérias (Raven & Johnson, 1986).

NOME DO GRUPO

FORMA (a)

MOTILIDADE (b)

METABOLISMO (c)

PAPEL ECOLÓGICO

Metanogênicas

B, E, C

N, F

Q, F

Algumas digerem celulose; outras utilizam metano; outras reduzem enxofre

Omnibactérias ou Eubactérias

B

N, F

H

Saprófitas, patógenas, decompositoras

Cianobactérias

B, C, M

D,N

F

Fixadoras de carbono e nitrogênio

Cloroxibactérias

C

N

F

Simbiose com tunicados

Micoplasmas, espiroplasmas

sem parede (d)

N

H

Patógenos de plantas e animais

Espiroquetas

E

F (e)

H

Decompositores e patógenos

Pseudomonadáceas

B

F

H, Q

Decompositores e patógenos de plantas

Actinomicetos

M, B

N

H

Solo, plantas, decompositores e fixadores de nitrogênio

Mixobactérias

B

D

H

Solo, animais

Aeróbias fixadoras de nitrogênio

B

N, F

H

Vida livre e em nódulos ou raízes de plantas

Q

Estágios no ciclo do nitrogênio; oxidam compostos do enxofre; oxidam metano ou metanol

Quimioautotróficas

B, C

N, F

(a) B = bacilo, C = coco, E = espirilo, M = filamentos ou agregados (b) F = flagelada, N = não-móvel, D = deslizante (c) H = heterotróficas, Q = quimiossintéticas, F = fotossintéticas (d) Mais ou menos esféricas ou alongadas e retorcidas (e) Flagelo inserido abaixo da membrana lipoproteica mais externa da parede celular

2.4.1 Bactérias Patogênicas

Muitas doenças de plantas estão associadas com bactérias; quase todos tipos de plantas são suscetíveis a um ou mais tipos de doenças bacterianas. Os sintomas destas doenças variam, mas elas geralmente se manifestam como manchas de vários tamanhos nos caules, folhas, flores ou frutos; murchidão, definhamento e raízes moles; necrose, ferrugem e cancros também são sintomas observados. Os gêneros descritos a seguir compreendem as bactérias fitopatogênicas: Pseudomonas - causa manchas e estrias nas folhas, definhamento e doenças similares.


- as espécies deste gênero são principalmente fitopatogênicas, responsáveis por processos de necrose. Produzem colônias amarelas, ao lado de outras espécies esbranquiçadas ou de coloração creme. Agrobacterium ssp. - suas espécies vivem no solo ou nas raízes ou caules de plantas, onde desenvolvem galhas. Corynebacterium - é um gênero que compreende espécies parasitas do homem e dos vegetais. As espécies fitopatogênicas são encontradas no solo e nos vegetais doentes, sendo responsáveis por doenças vasculares da alfafa, pela podridão das batatas, dos pastos, dos tomates e doenças de muitas outras plantas. Erwinia - as espécies deste gênero invadem os tecidos das plantas vivas e provocam necroses, galhas, definhamentos e apodrecimentos. Streptomyces - encontram-se espécies responsáveis pela escara da batata e por uma doença das raízes e radicelas da batata-doce. Xilella fastidiosa – responsável pela clorose variegada dos cítricos (ou “Amarelinho”, como a doença é conhecida popularmente no Brasil), que afeta os tecidos vasculares de plantas cítricas, especialmente as laranjeiras, danificando folhas e frutos. Xanthomonas

Bactérias também causam muitas doenças humanas, incluindo cólera, lepra, tétano, pneumonia bacteriana, coqueluche e difteria. Vários gêneros de bactérias patogênicas são de importância particular para o homem. Espécies do gênero Streptococcus estão associadas com a escarlatina, febre reumática e outras infecções. A bactéria da escarlatina produz seus sintomas e toxinas fatais somente se ela estiver infectada com o bacteriófago apropriado. O gênero Staphylococcus é um dos principais responsáveis pela infecções hospitalares. A síndrome do choque tóxico é causada por algumas linhagens de Staphylococcus aureus . Esta doença caracteriza-se por febre, erupções cutâneas, que aparecem primeiro nas palmas das mãos e nas solas dos pés e depois espalham-se para outras partes do corpo, e queda brusca de pressão. Aproximadamente 85% dos casos de síndrome do choque tóxico registrados nos Estados Unidos ocorreram em mulheres menstruadas, que estavam usando absorventes internos na época em que apareceram os sintomas. No entanto, homens e mulheres podem contrair esta doença. Muitas doenças bacterianas são dispersas pelo alimento ou água, como por exemplo a disenteria bacilar, e as febres tifóide e paratifóide. A disenteria bacilar é causada por algumas espécies do gênero Shigella . As febres tifóide e paratifóide são doenças intestinais infecciosas agudas causadas pelas bactérias Salmonella typhi e Salmonella enteridis , respectivamente. A bactéria Brucella abortus causa a doença chamada brucelose, também conhecida como febre ondulante, no homem, e aborto contagioso, no gado. O contágio se dá através da ingestão de leite oriundo de gado contaminado. Como as bactérias são destruídas pelo processo de pateurização do leite, esta doença está se tornando rara. O cólera é uma gastroenterite causada pela bactéria Vibrio cholerae, que é transmitida pelo contato com águas ou alimentos contaminados pelas excreções de pacientes ou de portadores convalescentes. Os sintomas compreendem vômitos e fezes


diarréicas profusas (aspecto de água de arroz), os quais dão lugar a uma severa desidratação, com perdas de eletrólitos e acidose, muitas vezes fatais. A legionelose (ou doença dos Legionários) é uma das doenças bacterianas mais recentemente detectadas, afetando um grande número de pessoas nos Estados Unidos. É causada pela bactéria Legionella pneumophyla e desenvolve-se como uma forma severa de pneumonia. A bactéria Clostridium botulinum é a causadora do botulismo, uma intoxicação alimentar grave, e às vezes fatal. A doença é contraída pela ingestão de alimentos contendo a toxina botulínica (principalmente enlatados, em conserva ou defumados). A cárie dentária é provocada por bactérias, principalmente pela espécie Streptococcus mutans . As lesões cariosas se desenvolvem sob densas massas de bactérias, conhecidas como placas dentais, aderentes à superfície do dente. Algumas doenças bacterianas são sexualmente transmitidas e são chamadas de doenças venéreas. Entre as mais comuns estão a gonorréia, causada pela bactéria Neisseria gonorrhoeae, e a sífilis, causada pela Treponema pallidum , uma espiroqueta. Ambas doenças são facilmente controladas com penicilina. A gonorréia é muito mais comum e menos séria que a sífilis, que pode ser fatal.


3 FUNGOS 3.1 Introdução Os fungos são tão distintos das algas, briófitas e plantas vasculares, quanto o são dos animais. Tradicionalmente são agrupados com as plantas, mas pertencem a um Reino distinto, Fungi, constituindo um dos cinco principais grupos de organismos vivos, como já foi falado. Juntamente com as bactérias, os fungos vêm a ser os seres encarregados da decomposição na biosfera, sendo suas atividades tão necessárias à existência permanente do mundo que conhecemos quanto as dos seres produtores de alimento. A decomposição libera gás carbônico na atmosfera e devolve ao solo compostos nitrogenados e outros materiais, que poderão ser novamente usados por vegetais e eventualmente por animais. Foi estimado que os 20 cm superiores da terra fértil possam conter perto de 5 toneladas de fungos e bactérias por hectare. Os fungos constituem um grupo de microrganismos que tem grande interesse prático e científico para os microbiologistas. Suas manifestações são familiares: crescimentos azuis e verdes em laranjas, limões e queijos; as colônias cotonosas (aspecto de algodão), brancas ou acinzentadas, no pão e no presunto; os cogumelos dos campos e os comestíveis, entre tantos. Todas representam vários organismos fúngicos, morfologicamente muito diversificados. De um modo geral, os fungos incluem os bolores e as leveduras. A palavra bolor tem emprego pouco nítido, sendo usada para designar os mofos, as ferrugens e o carvão (doença de gramíneas). As leveduras se diferenciam dos bolores por se apresentarem sob a forma unicelular. Os fungos podem viver como saprófagos, quando obtêm seus alimentos decompondo organismos mortos; como parasitas, quando se alimentam de substâncias que retiram dos organismos vivos nos quais se instalam, prejudicando-os; ou podem estabelecer associações mutualísticas com outros organismos, em que ambos se beneficiam. Em todos os casos, no entanto, os fungos liberam enzimas digestivas para fora de seus corpos e estas atuam diretamente no meio orgânico no qual eles se instalam, degradando moléculas simples, que são então absorvidas pelo fungo. Os fungos saprófagos são responsáveis por grande parte da degradação da matéria orgânica, propiciando a reciclagem de nutrientes, como já foi comentado. Os fungos são importantes nas fermentações industriais, tais como na fabricação da cerveja, do vinho e na produção de antibióticos (penicilina), de vitaminas e ácidos orgânicos (ácido cítrico). A fabricação de pães e o amadurecimento de queijos também dependem da atividade saprofítica dos fungos. Como parasitas, os fungos causam doenças vegetais, humanas e animais, embora a maior parte das micoses seja menos severa que as bacterioses ou as viroses. A ciência que estuda os fungos recebe o nome de Micologia.

3.2 Características próprias dos fungos Os fungos são microrganismos eucarióticos quimiorganotróficos. Reproduzemse, naturalmente, por meio de esporos, com poucas exceções. Além disso, a maioria das partes de um fungo é potencialmente capaz de crescimento; um minúsculo fragmento é


suficiente para originar um novo indivíduo. Os fungos não têm clorofila, são filamentosos em geral e comumente ramificados. Os filamentos apresentam paredes celulares constituídas por quitina ou celulose, ou ambas. São imóveis, em sua maioria, embora possam demonstrar células vegetativas móveis. A maior parte entre todas as classes de fungos produz esporos de dois modos: sexuada e assexuadamente. Os esporos produzidos sexuadamente têm núcleos derivados das células parentais e estas, como os esporos, são, geralmente, haplóides. Dois núcleos de células parentais se fundem para formar um núcleo diplóide zigótico, do qual, por divisão celular redutora (meiose zigótica), originam-se os núcleos dos esporos haplóides. Os esporos sexuados e as estruturas que os contém são usualmente distinguíveis, sob o ponto de vista morfológico, dos esporos assexuados, os quais são formados por simples diferenciação do talo em desenvolvimento (o talo é o fungo individual completo, incluindo as porções vegetativas ou não-sexuadas e todas as estruturas especializadas). Os esporos são muito importantes na classificação dos fungos, sendo as classes diferenciadas pelas características morfológicas dos estágios sexuados e dos esporos. A figura 17 mostra alguns tipos de esporos fúngicos. Morfologia dos fungos filamentosos: O talo de um fungo é tipicamente composto por filamentos tubulares microscópicos, chamados hifas. O conjunto de hifas tem o nome de micélio. A parede das hifas é semi-rígida, e os fungos podem apresentar três tipos morfológicos de hifas (figura 18). O micélio pode formar uma rede frouxa ou um tecido compacto, como nos cogumelos. Além disso, os micélios podem ser vegetativos ou de reprodução, sendo estes responsáveis pela produção de esporos. As hifas dos micélios de reprodução são, em geral, aéreas, enquanto algumas hifas do micélio vegetativo podem penetrar no meio, em busca de nutrientes.

Figura 17: Diferentes tipos de esporos fúngicos (fonte: Pelczar et al .., 1980).


Figura 18: Tipos morfológicos de hifas nos fungos. A hifa conocítica não apresenta septos transversais. As hifas septadas podem apresentar células mononucleadas (um núcleo por célula) ou multinucleadas (dois ou mais núcleos por célula); os septos transversais apresentam um poro central, através do qual o citoplasma e os nucléolos podem migrar de um compartimento para outro (modificado de Davis et al .., 1990).

3.2.1 Reprodução nos Fungos

As leveduras (fungos unicelulares) reproduzem-se assexuadamente por gemulação ou brotamento, no qual uma pequena protuberância (broto) cresce e eventualmente separa-se da célula-mãe. Cada broto que separa-se, pode tornar-se uma nova levedura (figura 19). Leveduras também podem reproduzir-se assexuadamente por fissão e sexuadamente, através da formação de esporos. As leveduras não são classificadas como um grupo taxonômico único pois muitos fungos diferentes podem ser induzidos a formar um estágio de levedura. Os esporos dos fungos terrestres são células reprodutivas não-móveis, dispersas através do vento ou por animais e, geralmente, produzidos nas hifas aéreas (que se projetam no ar). Este arranjo permite que os esporos sejam "arrastados" por correntes de ar e distribuídos a novas áreas. Em alguns fungos, as hifas aéreas formam estruturas grandes e complexas, onde os esporos são produzidos. Estas estruturas são chamadas esporocarpos ou corpos de frutificação. A parte familiar de um cogumelo, por exemplo, é um grande esporocarpo. Nós normalmente não vemos a maior parte do organismo, uma rede quase invisível de hifas enterradas sobre o material na qual ele cresce. Ao contrário de células animais e vegetais, os fungos normalmente contêm núcleos haplóides. Na reprodução sexuada, os fungos freqüentemente realizam um tipo de conjugação no qual duas hifas geneticamente diferentes juntam-se e seus núcleos fundem-se. Em certos fungos, os núcleos geneticamente diferentes não se fundem imediatamente, mas permanecem separados dentro do citoplasma do fungo pela maior parte de sua vida. Hifas que contêm dois núcleos distintos geneticamente dentro de cada célula são chamadas dicarióticas. Hifas que contêm somente um núcleo por célula são monocarióticas. Quando um esporo fúngico "cai" num substrato apropriado, por exemplo, um pêssego muito amadurecido, o esporo germina e começa a crescer (figura 20). Uma hifa parecida com um fio emerge do pequeno esporo. Assim que uma camada de hifas emaranhadas infiltra-se no pêssego, uma outra hifa estende-se em direção ao ar. Células das hifas secretam enzimas digestivas dentro do pêssego, degradando seus compostos orgânicos em pequenas moléculas que serão absorvidas pelos fungos.


Figura 19: a) Célula de uma levedura comum, mostrando a reprodução por brotamento. b) Fotomicrografia de células da levedura Saccharomyces cerevisiae, utilizado como fermento de pão. Note que muitas das células estão brotando (fonte: Davis, 1990).

Figura 20: Germinação de um esporo e crescimento de um fungo terrestre (fonte: Davis et al.., 1990).

3.2.2 Fisiologia e Nutrição dos Fungos

Fungos crescem melhor em habitats úmidos e escuros, porém são encontrados universalmente onde quer que exista matéria orgânica disponível. Eles necessitam de umidade para crescer e podem obter água da atmosfera, bem como do meio sobre o qual vivem. Quando o ambiente torna-se muito seco, os fungos sobrevivem entrando num estado de repouso ou produzindo esporos, que são resistentes à aridez. Embora o pH ótimo para a maioria das espécies seja ± 5,6, alguns fungos podem tolerar e crescer em


ambientes onde o pH varia de 2 a 9. Muitos fungos são menos sensíveis à altas pressões osmóticas que as bactérias, e podem crescer em soluções de sais concentradas ou soluções de açúcares, que inibem ou previnem o crescimento bacteriano. Os fungos também crescem num amplo intervalo de temperatura (0o a 62o C, estando a temperatura ótima entre 22o e 30o C).

3.3 Classificação dos Fungos A classificação dos fungos é baseada principalmente nas características dos esporos sexuais e dos corpos de frutificação, na natureza de seus ciclos de vida e nas características morfológicas de seus micélios vegetativos ou de suas células. Entretanto, muitos fungos produzem esporos sexuais sob certas condições ambientais. Aqueles que possuem todos os estágios sexuais conhecidos são denominados fungos perfeitos e os que não possuem, fungos imperfeitos. Os fungos imperfeitos são classificados arbitrariamente, num primeiro momento, e são colocados provisoriamente em uma classe especial denominada Deuteromycetes. Quando o seu ciclo sexual é descoberto posteriormente, são então reclassificados entre outras classes e recebem novos nomes. Os micologistas dividem o Reino Fungi em 3 principais grupos: os fungos limosos, os fungos inferiores flagelados e os fungos terrestres. Os fungo limosos são considerados um enigma biológico e taxonômico porque não são nem um fungo típico, nem um protozoário típico. Durante uma de suas etapas de crescimento, assemelham-se aos protozoários porque não possuem parede celular, possuem movimentos amebóides e ingerem nutrientes particulados. Durante a etapa de propagação, formam corpos de frutificação e esporângios apresentando esporos com paredes, como nos fungos típicos. Vivem em água doce, em solo úmido e em vegetais em decomposição. Os fungos inferiores flagelados incluem todos os fungos, com exceção dos limosos, que produzem células flageladas em alguma fase do seu ciclo de vida. Alimentam-se pela absorção dos alimentos. A grande maioria é filamentosa, produzindo um micélio cenocítico. Muitos são unicelulares ou unicelulares com rizóides. A reprodução sexuada pode ocorrer por vários meios; a reprodução assexuada ocorre mediante a produção de zoósporos. Podem ser parasitas ou saprófitas, que vivem no solo ou água doce. Os fungos terrestres são as espécies mais conhecidas entre os fungos. Este grupo inclui as leveduras, bolores, orelhas-de-pau, mofo, fungos em forma de taça, ferrugem, carvão, bufa-de-lobo e cogumelos. Todos caracterizam-se pela nutrição através da absorção e, com exceção das leveduras, a maioria produz um micélio bem desenvolvido constituído de hifas septadas ou cenocíticas. As células móveis não são encontradas nos fungos terrestres. A reprodução assexuada ocorre através de brotamento, fragmentação e produção de esporangióforos ou conídios. A reprodução sexuada envolve a produção de zigósporos, ascósporos ou basidiósporos. Existem 4 principais grupos de fungos terrestres: Zygomycetes, Ascomycetes, Basidiomycetes e Deuteromycetes. A tabela 6 resume esta classificação.


Tabela 6: Classes de Fungos Terrestres (modificado de Davis et al .., 1990).

Classes

TIPOS COMUNS

REPR. ASSEXUADA

REPR. SEXUADA

Zygomycetes

bolor preto do pão

esporos não-móveis

zigósporos

Ascomycetes

leveduras, fungos em forma de taça, trufas.

conídios desprendemse dos conidióforos

ascósporos

Basidiomycetes

cogumelos, fungos da ferrugem e do carvão, bufade-lobo, orelha-de-pau

incomum

basidiósporos

Deuteromycetes (fungos imperfeitos)

Candida albicans, algumas espécies de Penicillium e Aspergillus

conídios

estágio sexual desconhecido

3.3.1 Zygomycetes

Os membros desta classe são chamados de zigomicetos e há cerca de 600 espécies encontradas em todo mundo. Eles produzem esporos sexuais chamados zigósporos, que permanecem dormentes por um tempo. Suas hifas são cenocíticas (não têm septo). Muitos zigomicetos vivem no solo sobre matéria orgânica animal ou vegetal em decomposição; alguns são parasitas de plantas e animais. Alguns zigomicetos são utilizados na elaboração de produtos comercialmente valiosos, como molho de soja, ácidos orgânicos esteróides para drogas contraceptivas e antiinflamatórias. Um zigomiceto comum é o bolor preto do pão, Rhizopus stolonifer . O pão torna-se embolorado quando o esporo do bolor cai sobre ele, germinando e crescendo como uma massa de fios, o micélio. As hifas penetram no pão e absorvem nutrientes. Algumas hifas, chamadas estolões, crescem horizontalmente; outras, chamadas rizóides, ancoram os estolões no pão. Eventualmente, certas hifas crescem para cima e desenvolvem um esporângio, ou saco de esporos, na extremidade. Agregados de esporos esféricos pretos desenvolvem-se dentro do esporângio e são liberados quando este se rompe. A reprodução sexual pode ocorrer quando hifas de dois tipos diferentes (+ e -) crescem em contato uma com a outra (figura 21). Não há diferenciação sexual morfológica, de modo que não é próprio referir-se a linhagens feminina e masculina. Quando as hifas de dois tipos encontram-se, hormônios são produzidos, fazendo com que suas extremidades cresçam juntas. Os núcleos + e - fundem-se e formam um núcleo diplóide, o zigoto, chamado de zigósporo. O zigósporo pode permanecer dormente por vários meses. A meiose provavelmente ocorre no momento ou um pouco antes da germinação do zigósporo. Quando este germina, uma hifa aérea desenvolve-se com um esporângio na extremidade. Cada esporo formado é capaz de tornar-se um novo micélio.


Figura 21: O ciclo de vida do bolor preto do pão, Rhizopus stolonifer . Após ruptura da parede do esporângio, os esporangiósporos são liberados. Um esporangiósporo germina para desenolver um talo micelial, os rizóides penetram no meio e os esporangiósporos dão origem ao esporângio, completando a fase assexuada do ciclo de vida. A reprodução sexuada requer dois mating types (+ e -) sexualmente compatíveis. Quando entram em contato, são formadas ramificações de copulação denominadas progametângio. Eles logo se fundem, os protoplasmas misturam-se (através da plasmogamia) e os núcleos + e – também se fundem (através da cariogamia) para formar muitos núcleos zigotos. A estrutura contendo o núcleo torna-se corada em preto e com aspecto verrugoso, formando o zigósporo diplóide maduro, que repousa em estado dormente por 1 a 3 meses ou mais. O zigósporo germina para formar um novo organismo haplóide e a meiose ocorre durante o processo de germinação (fonte: Pelczar et al .., 1996).

3.3.2 Ascomycetes

Os ascomicetos constituem um grande grupo de mais ou menos 30.000 espécies descritas. Recebem também o nome de fungos de saco pois seus esporos sexuais são produzidos em pequenos sacos chamados ascos. Suas hifas geralmente têm septos, porém as paredes transversais são perfuradas, permitindo o movimento do citoplasma. Os ascomicetos variam na complexidade, desde leveduras unicelulares até mofos multicelulares e fungos em forma de taça. Eles incluem a maioria dos bolores esverdeados, rosas e marrons que estragam os alimentos e as trufas comestíveis. Os ascomicetos desempenham um papel ecológico importante na degradação de moléculas animais e vegetais resistentes como a celulose, lignina e o colágeno. Na maioria dos ascomicetos, a reprodução assexuada envolve a produção de esporos, chamados conídios. Estes esporos desprendem-se das extremidades de certas hifas conhecidas como conidióforos (que contêm os esporos). Algumas vezes chamados


de "esporos de verão", os conídios são um meio de rápida propagação do novo micélio. Eles variam na forma, tamanho e cor, nas diferentes espécies; a cor do conídio é que dá a característica preta, azul, verde, rosa ou outra, a muitos destes bolores. A reprodução sexual ocorre após duas hifas crescerem juntas e unirem seus citoplasmas. Dentro desta estrutura fundida, os dois núcleos ficam juntos, porém não se fundem. Novas hifas desenvolvem-se a partir desta estrutura; as células destas hifas são dicarióticas (2 núcleos). Estas hifas formam o corpo de frutificação conhecido como ascocarpo, onde o asco se desenvolve. Dentro de cada célula que irá se desenvolver num asco, os dois núcleos fundem-se e formam um núcleo diplóide, o zigoto. Cada zigoto sofre meiose e origina 4 núcleos haplóides. Cada um destes passa por uma mitose, resultando na formação de 8 núcleos. Estes, quando separados, formam os ascósporos. Assim, dentro de um asco, há 4 ascósporos, que são liberados quando este se rompe. A figura 22 mostra o ciclo de vida do ascomiceto Neurospora sp.

Figura 22: Ciclo de vida de Neurospora sp. O elemento feminino é representado pelo protoperitécio. Os elementos masculinos são os conídeos, que podem fornecer núcleo para um protoperitécio. Isto resulta na formação de ascos que produzem ascósporos haplóides gerados por fusão sexual do núcleo de duas diferentes cepas. A Neurospora pode também reproduzir-se assexuadamente através de conídios (fonte: Pelczar et al ..,1996).

3.3.2.1 Leveduras As leveduras, que são unicelulares, formam um dos grupos mais importantes e interessantes dos ascomicetos microscópicos. Estão reunidas em torno de 40 gêneros, com aproximadamente 350 espécies. As leveduras possuem a capacidade de fermentar carboidratos, quebrando a glicose para produzir etanol e dióxido de carbono. Este processo é de fundamental importância na produção de pão, cerveja e vinho. Através dos anos, muitas linhagens


diferentes de leveduras têm sido selecionadas para este processo. A levedura de maior importância econômica é espécie Saccharomyces cerevisiae . Outras leveduras são importantes patógenos e causam doenças tais como o "sapinho" e a criptococose, infecção que pode atacar os pulmões, entre outras partes do organismo humano.

3.3.3 Basidiomycetes

Esta divisão tem mais de 25.000 espécies e inclui os fungos mais familiares, como os cogumelos, as orelhas-de-pau, além de importantes parasitas de plantas, como os fungos do carvão e da ferrugem. Os basidiomicetos formam seus esporos sexuais dentro de estruturas chamadas basídios. Na extremidade de cada um destes são formados 4 basidiósporos. Quando são liberados e encontram ambiente apropriado, desenvolvem-se num novo micélio. O corpo vegetativo de um basidiomiceto, tal como o do cogumelo comestível Agaricus campestris , consiste em uma massa de hifas brancas, tipo fios, ramificadas, que fica geralmente abaixo da terra. Massas compactas de hifas, chamadas botões, desenvolvemse ao longo do micélio. Os botões desenvolvem-se numa estrutura que popularmente chamamos de cogumelo, que consiste de uma haste (estipe) e um "chapéu", e que na verdade é o basidiocarpo (figura 23). Os basídios estão localizados em lamelas que existem na superfície inferior dos chapéus. Cada fungo individual produz milhões de basidiósporos, e cada um pode formar, potencialmente, um novo micélio primário. As hifas deste micélio têm células monocarióticas. Quando duas hifas de tipos diferentes se juntam, elas se fundem, porém seus núcleos não. Assim é formado o micélio secundário, com hifas dicarióticas. Estas hifas podem crescer e formar massas compactas, que são os basidiocarpos ou cogumelos. Nas nervuras destes, os núcleos se fundem, formando zigotos diplóides. Estes sofrem meiose e originam 4 núcleos haplóides, que se localizam na superfície do basídio, como dedos, e vão formar os basidiósporos (figura 24).

Figura 23: O cogumelo é um corpo de frutificação, ou basidiocarpo, que é uma massa de hifas compactas (fonte: Davis et al.., 1990).


Figura 24: Ciclo de vida de um cogumelo, um basidiomiceto típico. Um basidiocarpo desenvolve-se a partir do micélio, uma massa de "fios" entrelaçados, que fica abaixo da terra. Na superfície inferior do "chapéu" estão as lamelas, onde se desenvolvem-se os basídios, que irão produzir os basidiósporos. Quando os esporos alcançam um ambiente propício, podem se desenvolver e originar um novo micélio (fonte: Davis et al.., 1990).

3.3.4 Deuteromycetes

Em torno de 25.000 fungos são classificados como deuteromicetos, que também são conhecidos como "fungos imperfeitos". Assim são chamados porque não observa-se o estágio sexuado em seu ciclo de vida. A maioria dos deuteromicetos reproduzem-se somente por esporos assexuais ou conídios (figura 25). Neste aspecto, lembram os estágios assexuais de ascomicetos e basidiomicetos, que também produzem esporos assexuais. Desta forma, acredita-se que alguns deuteromicetos possam ser ascomicetos ou basidiomicetos que perderam a capacidade de formar ascos ou basídios. Entre os gêneros economicamente importantes desta divisão estão o Penicillium e o Aspergillus. Algumas espécies de Penicillium produzem o conhecido antibiótico penicilina, enquanto outras espécies dão sabor e aroma a queijos com Roquefort e Camembert. Espécies de Aspergillus são usadas para fermentar pastas e molhos de soja, além de produzir ácido cítrico comercialmente. Outros fungos imperfeitos são causadores de certas doenças, como Candida albicans , que causa a candidíase, uma doença da mucosa da boca, vagina e trato alimentar.


conídios

Figura 25: Fotomicrografia eletrônica de varredura de conidióforos de Penicillium . O arranjo dos conídios (esporos assexuais) nos conidióforos varia de espécie para espécie e é usado na identificação dos fungos (fonte: Solomon & Berg, 1995).

conidióforos

3.4 Fungos e suas associações com outros organismos Os fungos podem se associar a organismos de diversas formas. Em algumas destas associações os parceiros são mutuamente dependentes e não podem viver isoladamente. Em outras, os indivíduos podem sobreviver por si mesmos. 3.4.1 Liquens

É uma relação simbiótica entre uma alga (ou uma cianobactéria) e um fungo. O fungo geralmente é um ascomiceto. As algas ou cianobactérias encontradas nos liquens também são encontradas livremente na natureza, enquanto que o parceiro fúngico tem sido encontrado somente como parte do líquen. As algas fabricam alimentos pela fotossíntese, usando a água e os minerais obtidos pelos fungos, enquanto estes dependem das algas quanto ao fornecimento de carbono orgânico. Liquens normalmente se reproduzem por simples fragmentação, ou pela produção de propágulos pulvurulentos especiais denominados sorédios, ou por pequenas projeções do talo conhecidas como isídios. Fragmentos, sorédios e isídios contêm tanto hifas do fungo como algas ou cianobactérias; eles atuam como unidades de dispersão que têm a função de estabelecer o liquen em novas localidades. A figura 26 mostra um esquema de uma secção transversal de um liquen. Existem mais ou menos 20.000 espécies de liquens. Eles toleram ambientes extremos de temperatura e umidade e crescem em quase todos os lugares exceto em ambientes muito poluídos, como cidades industriais, por exemplo. Por isso muitas espécies são utilizadas como bioindicadoras de poluição. Os liquens podem crescer sobre troncos de árvore, picos de montanhas e rochas lisas. As cores dos liquens variam do branco ao negro, passando por tonalidades de vermelho, laranja, marrom, amarelo e verde. Esses organismos contêm muitos compostos químicos incomuns. Muitos liquens são utilizados como fontes de corantes e também como medicamentos, bases fixadoras de perfumes ou fontes de alimento de menor importância.


Figura 26: Uma secção transversal do liquen Lobaria verrucosa. Os liquens mais complexos consistem apenas em uma crosta de hifas entrelaçadas envolvendo colônias de algas. Contudo, nos liquens mais complexos, as hifas e as células de algas estão organizadas em um talo com crescimento e forma definidos e uma estrutura interna característica. O liquen mostrado tem 4 camadas distintas: (1) o córtex superior, uma camada protetora constituída de hifas de paredes muito espessadas; (2) a camada de algas, constituída por células de algas e hifas, estas de paredes finas frouxamente entrelaçadas; (3) a medula, que é uma camada espessa de hifas frouxas e de paredes menos espessas. Esta camada, que constitui cerca de dois terços da espessura do talo, parece servir como área de armazenagem, com as células do fungo aumentadas; e (4) o córtex inferior, que é mais fino que o superior e coberto por finas projeções (rizinas) que prendem o liquen ao substrato (fonte: Raven et al., 1 996).

3.4.2 Micorrizas

A micorriza é uma associação benéfica entre um fungo e uma raiz de planta. Este termo é derivado do grego, significando "raiz fúngica". Estas associações são usualmente benéficas para a planta hospedeira, assim como para o simbionte e, algumas vezes, o hospedeiro não pode prosperar sem os benefícios oriundos do fungo, como o caso de certas orquídeas, que são incapazes de germinar e se desenvolver a menos que sejam infectadas por fungos. As micorrizas melhoram a absorção mineral pelas plantas verdes que possuem, geralmente, um sistema de proteção, para impedir que o fungo cause dano às radicelas. As micorrizas ajudam na transferência direta do fósforo, zinco, cobre e outros nutrientes do solo para as raízes. Por outro lado, a planta fornece carbono orgânico ao fungo simbionte. Os parceiros fúngicos são geralmente os zigomicetos e os basidiomicetos. 3.4.3 Trufas

As trufas são corpos frutificantes subterrâneos de certos Ascomycetes que crescem em associação com algumas árvores, entre as quais o carvalho e a faia, que são os parceiros mais comuns. O fungo proporciona certos nutrientes à arvore, a qual, por sua vez, fornece substâncias essenciais para o crescimento do fungo. As trufas consistem em uma massa de ascósporos e micélios, coberta com uma casca espessa e protuberante do micélio. Possuem odor, gosto e textura agradáveis, o que as torna apreciáveis pelos gourmets .

3.5 Fungos economicamente importantes A capacidade das leveduras de produzirem etanol e dióxido de carbono a partir da glicose é de grande importância econômica. O vinho é produzido a partir da


fermentação do açúcar de frutas. A cerveja, a partir da fermentação da cevada. O pão cresce através das bolhas de CO 2 formadas a partir da fermentação. Entre os basidiomicetos existem cerca de 200 tipos de cogumelos comestíveis e cerca de 70 espécies de cogumelos venenosos. Os cogumelos comestíveis e venenosos podem ser muito parecidos e até mesmo pertencerem ao mesmo gênero. Não há um modo fácil para distinguí-los; somente um especialista o deve fazer. Alguns dos cogumelos venenosos pertencem ao gênero Amanita. As espécies mais conhecidas são A. virosa ("anjo destruidor") e A. phalloides ("anjo da morte"). A ingestão de um único cogumelo pode matar um homem de 68 kg. A ingestão de certas espécies de cogumelos pode causar intoxicação e alucinação. Os cogumelos sagrados dos Astecas, Conocybe e Psilocybe , são ainda usados em cerimônias religiosas por índios da América Central e outros, por suas propriedades alucinógenas. A substância química psilocibina, quimicamente relacionada ao ácido lisérgico (LSD), é responsável pelo estado de transe e visões coloridas experimentadas por aqueles que comem estes cogumelos. 3.5.1 Fungos Patogênicos

Os fungos são responsáveis por várias doenças sérias de plantas, incluindo doenças epidêmicas que se espalham rapidamente por plantações, causando grandes prejuízos econômicos. Todas as plantas são aparentemente suscetíveis a infecções fúngicas. Uma planta pode tornar-se infectada após as hifas entrarem pelos estômatos da folha ou do caule ou através de feridas na planta. A tabela 7 mostra alguns efeitos patológicos das micoses de plantas. Alguns fungos podem causar doenças em humanos e outros animais. Podem causar infecções superficiais que atingem somente a pele, cabelos ou unhas. Outros causam infecções sistêmicas, nas quais o fungo infecta tecidos profundos e órgãos internos. Sapinho e pé-de-atleta são exemplos de infecções fúngicas superficiais. Candidíase é uma infecção de membranas mucosas da boca e vagina e está entre as infecções fúngicas mais comuns. Histoplasmose é uma séria infecção fúngica sistêmica que é causada por um fungo que esporula abundantemente em solo que contém fezes de aves; uma pessoa que inala os esporos podem desenvolver a infecção. A tabela 8 relaciona os dermatófitos mais comuns.

IFSC / LCE / Biologia 3 – Microbiologia 41 _____________________________________________________________________________________________ Tabela 7: Alguns efeitos patológicos das micoses de plantas (fonte: P elczar, 1980).

NECROSE: Podridão da raiz

Desintegração ou decomposição de parte ou de todo o sistema e raízes de uma planta

Podridão basal do caule

Desintegração da parte interior do caule

Apodrecimento ( damping-off )

Rápido colapso e morte de mudas muito jovens no leito de sementeira ou no campo

Cancro

Ferida localizada ou lesão necrótica, muitas vezes escavada na superfície do caule de uma planta lenhosa

Antracnose

Lesão semelhante a uma úlcera, necrótica e escavada no caule, na folha ou na flor

Manchas da folha

Lesões localizadas nas folhas do hospedeiro, formadas por células mortas

Escara

Lesões localizadas nos frutos do hospedeiro, nas folhas, nos tubérculos, etc., usualmente com leve elevação ou escavação, com aspecto de uma escara

Mangra

Coloração marrom, geral e extremamente rápida das folhas, dos ramos, dos brotos e dos órgãos florais, resultando em sua morte

Podridão mole e podridão seca

Maceração e desintegração de frutos, raízes, bulbos, tubérculos e folhas carnosas

HIPERTROFIA: Raiz em clava

Raízes intumescidas, com aspecto de fusos ou clavas

Galhas

Porções aumentadas de tamanho, preenchidas com micélio fúngico

Verrugas

Protuberâncias similares a verrugas nos tubérculos e caules

Vassouras de bruxa

Ramificação profusa dos brotos

Encrespamento das folhas

Distorção, espessamento e encrespamento das folhas

geralmente

OUTROS SINTOMAS: Murcha

Usualmente um sintoma secundário generalizado, no qual as folhas perdem seu turgor e caem por causa de um distúrbio no sistema vascular da raiz ou do caule

Ferrugem

Muitas lesões pequenas, sobre as folhas ou o caule, com típica coloração ferruginosa

Míldio

Áreas cloróticas ou necróticas das folhas, dos caules e frutos, usualmente recobertas de micélio e frutificações fúngicas

Tabela 8: Os dermatófitos (fonte: Pelczar, 1980).


GRUPO

MICRORGANISMOS

OCORRÊNCIA E DOENÇA

Epidemophyton

E. floccosum

Causa infecções da pele e das unhas das mãos e dos pés

Microsporum

M. audouini

Causa tinha epidêmica do couro cabeludo em crianças

M. canis

Causa comum de infecções da pele e dos pêlos em gatos, cães e outros animais; causa a tinea capitis em crianças

M. gypseum

Trichophyton

Ocorre como saprófita no solo e como parasita em animais; ocasionalmente encontrado na tinha do couro cabeludo em crianças

Subgrupo gypseum: T. mentagrophytes

Primariamente parasita dos cabelos

T. rubrum

Causa tinhas em muitas partes do corpo; infecta os cabelos e o couro cabeludo

T. tonsurans

Infecta os cabelos e o couro cabeludo

Subgrupo faviforme: T. schoenleini T. violaceum T.ferrugineum T. concentricum

Estes cinco fungos causam tinhas na pele, no couro cabeludo e na pele glabra do homem; o Trichophyton verrucossum também causa infecções no gado

T. verrucossum

Subgrupo rosaceum:

Miscelânea

T. megnini

Causa tinhas do couro cabeludo humano

T. gallinae

Causa infecção em frangos

Piedraia hortai

Trichosporon beigelii

Causa uma infecção do cabelo e do couro cabeludo, caracterizada pela formação de nódulos duros e negros; piedra negra Causa infecção similar à anterior, mas com nódulos brancos; piedra branca

Nocardia minutissima

Causa do eritrasma, uma infecção crônica das axilas e áreas gênito-crurais

Malassezia furfur

Causa a ptiriase versicolor, uma infecção fúngica generalizada da pele que recobre o tronco e , às vezes, outras áreas do corpo

Nocardia

Causa da doença dos pêlos púbicos e axilares, chamada trichomycosis axillaris

Aspergillus Penicillium Mucor Rhizopus

Estes quatro fungos, comumente saprófitas, podem ocasionar otomicoses e produzir, eventualmente, lesões em outras áreas do organismo


4 VÍRUS 4.1 Introdução Os vírus constituem um grupo grande e heterogêneo de agentes infecciosos, semelhantes pelo fato de serem parasitas intracelulares obrigatórios para as células de seus hospedeiros específicos. São tão pequenos que passam através dos filtros cujos poros não permitem a passagem das bactérias. O maior vírus tem menos do que a quarta parte das dimensões de uma salmonela e milhares dos de menor tamanho poderiam ser colocados dentro da parede celular vazia de um estafilococo. Os vírus causam doenças ou infecções em insetos, peixes, microrganismos, plantas, homens e outros animais. Muitas vezes não produzem prejuízos particulares aos seus hospedeiros, embora demonstrem efeitos visíveis; por exemplo, os vírus que infectam as tulipas causam suas cores variegadas, pois as tulipas "sadias" são solidamente monocoradas. Os vírus são "pedaços" de DNA ou RNA protegidos por uma capa proteica; eles não têm capacidade de movimentação nem de metabolismo autônomo. Reproduzem-se por replicação numa célula hospedeira (anima, vegetal ou de um microrganismo), podendo sofrer mutações.

4.2 Histórico Algumas viroses foram clinicamente conhecidas durante séculos. Na verdade, a primeira doença infecciosa para a qual se desenvolveu um método prático e efetivo de prevenção foi uma enfermidade causada por vírus. Em 1796, Edward Jenner, um médico inglês, vacinou, pela primeira vez, um menino de 8 anos de idade, com material removido de uma lesão de varíola bovina da mão de um leiteiro. A prova de que a inoculação havia conferido proteção contra a varíola foi obtida seis semanas mais tarde, quando o rapaz foi inoculado com pus de um varioloso e não desenvolveu a doença. Jenner observou que as pessoas inoculadas intradermicamente com vírus isolados de lesões da varíola bovina desenvolviam, como reação positiva, uma pequena crosta no local da aplicação, a qual caía após cerca de duas semanas, deixando apenas uma pequena escara. Como o material usado era de origem bovina (latim = vaca), o termo empregado passou a ser vacinação, para referir-se a este método. Jenner aprendeu a realizar este processo, desconhecendo a natureza dos anticorpos e dos vírus. As primeiras observações indiretas dos vírus foram feitas quase no final do século 19. Na época, vários grupos de cientistas europeus, trabalhando independentemente, concluíram que os agentes infecciosos associados com uma doença de planta conhecida como mosaico do tabaco e aqueles associados com a doença do casco e boca de gado não eram bactérias. Eles chegaram a esta conclusão pois as unidades infecciosas não eram retidas nos filtros de porcelana, usados para remover bactérias de vários meios. Baseados nestas observações e nas propriedades do material filtrado, Martinus Beijerinck na Holanda, e na mesma época, Friedrich Loeffler e Hans Frosch na Alemanha, concluíram que os vírus não só eram muito menores que qualquer bactéria


como também eram diferentes na estrutura. Os vírus podiam reproduzir-se somente em células vivas de seus hospedeiro e portanto, faltaria algo crítico na sua maquinaria. O próximo e mais importante avanço feito a este respeito ocorreu em 1933. Wendell Stanley do Instituto Rockefeller, preparou um extrato do vírus do mosaico do tabaco e purificou-o, descobrindo que o vírus precipitou na forma de cristais. Alguns anos depois, alguns cientistas demonstraram que o vírus do mosaico do tabaco era constituído de RNA, protegido por uma capa de proteína. Muitos vírus de plantas têm constituição similar, mas a maioria dos outros vírus tem DNA, ao invés de RNA.

4.3 Estrutura dos Vírus Os menores vírus têm somente 17 nm de diâmetro e os maiores chegam a 1000 nm (1 micrômetro). Mesmo os maiores têm uma pobre visibilidade ao microscópio óptico. A maioria dos vírus só pode ser detectada usando microscopia eletrônica de alta resolução. Cada partícula viral (ou vírion) pode ter as seguintes estruturas: Capsídio e Envelope: o capsídio é uma capa protéica que circunda o ácido nucleico, e é composto de subunidades de proteína, os capsômeros , que são responsáveis pela especificidade viral. Todos os vírions possuem uma simetria de estrutura (figura 27), podendo ou não apresentar um envoltório ( envelope) contendo lipídeos ou lipoproteínas. Assim, os vírions com envelope são sensíveis aos solventes de lipídeos, tais como o éter, o clorofórmio e agentes emulsificantes (sais biliares e detergentes). Ácidos Nucleicos: Os vírus podem ter DNA ou RNA, mas nunca são encontrados os dois juntos no mesmo vírion. A estrutura dos ácidos nucleicos nos vírions pode ser linear ou circular. Quanto à forma, os vírions podem ser (figura 28): Icosaédricos: poliedro regular com 20 faces triangulares e 12 ângulos; esta forma é determinada pelo capsídio. O poliovírus e os adenovírus são alguns exemplos. Helicoidais: lembrando longos bastonetes, seus capsídios são cilindros ocos, com estrutura helicoidal . O vírus do mosaico do tabaco é um exemplo. Vírus envelopados: o nucleocapsídio interno desse vírus, que pode ser icosaédrico ou helicoidal, é circundado por uma membrana envoltória. Tais vírions são pleomórficos (têm formas variadas), já que os envoltórios não são rígidos. O vírus do herpes é um vírion icosaédrico envelopado. Vírus complexos: alguns vírions têm uma estrutura muito complicada; o vírus da vacínia (grupo poxvirus ), por exemplo, não possui capsídio claramente identificado, mas apresenta várias camadas em torno do ácido nucleico.


Figura 27: Estrutura geral de um vírion. Desenhos mostram todos os principais componentes que podem fazer parte de um vírion. Um vírion tem um cerne de ácido nucléico envolvido por um capsídeo protéico; esta combinação é denominada nucleocapsídeo. Um vírion pode ter um envelope membranoso (lipoproteína) envolvendo o nucleocapsídeo. O envelope pode ter projeções na sua superfície denominadas espículas (fonte: Pelczar et al .., 1996).

Figura 28: Morfologia de alguns vírus bem conhecidos. Simetria icosaédrica: [ A] pólio, verruga, adeno, rota; [B] herpes. Simetria helicoidal: [C] mosaico do tabaco; [ D] influenza; [E] sarampo, caxumba, parainfluenza; [F] raiva. Simetria incerta ou complexa: [ G] poxvírus; [H] fagos T-pares (fonte: Pelczar et al., 1996).

4.4 Classificação dos vírus animais e de plantas


Os vírus têm sido agrupados ou classificados de várias maneiras. Um dos primeiros sistemas, que ainda tem uso limitado, estabelecia subgrupos de acordo com a espécie do hospedeiro normalmente infectado pelo vírus (animais, vegetais ou microrganismos). Outro método de classificação dos vírus se baseava-se na afinidade tissular dessas partículas infectantes, por exemplo, os vírus que se fixam às células nervosas eram denominados vírus neurotrópicos. À medida que se foi desenvolvendo a análise das características físicas, químicas e biológicas dos vírus, acumulou-se uma informação sobre a qual era possível construir uma classificação de acordo com esses conhecimentos. A tabela 9 resume tais propriedades. A tabela 10 mostra a classificação dos vírus que infectam os animais, agrupados de acordo com a simetria e a ordem decrescente de tamanho. Tabela 9: Propriedades utilizadas para a classificação dos vírus (fonte: Pelczar et al ., 1996).

CARACTERÍSTICAS PRIMÁRIAS Natureza química do ácido nucleíco:

CARACTERÍSTICAS SECUNDÁRIAS Hospedeiro:

RNA ou DNA; fita dupla ou única; Espécie de hospedeiro; tecido específico genoma único ou segmentado; cadeia (+) ou (-); do hospedeiro ou tipos de células peso molecular Estrutura do vírion:

Modo de transmissão:

Helicoidal, icosaédrico ou complexo; nu ou envelopado; complexidade; número de capsômetros para vírion icosaédrico; diâmetro do nucleocapsídeo para vírions helicoidais Local de replicação:

Por exemplo, fezes

Estruturas específicas de superfície:

Núcleo ou citoplasma

Por exemplo, propriedades antigênicas

Tabela 10: Classificação dos vírus que infectam o homem e outros animais (fonte: Pelczar et al., 1996).

Simetria do capsídeo

Envelope (genoma)

Diâmetro do vírion (nm)

Icosaédrico Não (DNAfd1) 70 – 90 Icosaédrico Não (RNAfd) 65 – 75 Icosaédrico Não (DNAfd) 45 – 55

Família

Adenoviridae Reoviridae Papovaviridae

Gênero típico Vírus típicos Local de montagem ou subfamílias (local de envelopamento) Mastadenovi-

Adenovírus

rus

humano 2

Reovirus

Reovírus

Rotavirus

Rotavírus

Polyomavirus

SV 40

Papillomavirus

Vírus da

Núcleo Citoplasma Núcleo

verruga Cont.da tabela 10 Icosaédrico Não (RNAfu2) 30 – 37

Caliciviridae

Icosaédrico Não (RNAfu) 24 – 30

Picornaviridae Enterovirus

Calicivirus

Calicivírus

Citoplasma

Poliomielite

Citoplasma


Coxsackievírus Rhinovirus

Icosaédrico Não (DNAfu) 18 – 26

Parvoviridae

Icosaédrico Sim (DNAfd) 120–200 Herpesviridae

Parvovirus

Resfriado comum Vírus do rato de Kilham

Alphaherpesvi- Herpes rinae

simples

Núcleo (membrana nuclear e/ou citoplasma)

Icosaédrico Sim (RNAfu) 80 – 140 Retroviridae

Oncovirinae

Tumor RNA

Citoplasma (membrana citoplasmática e/ou citoplasma)

Icosaédrico Sim (RNAfu) 40 – 70

Togaviridae

Rubivirus

Rubéola

Citoplasma (membrana citoplasmática e/ou citoplasma

Icosaédrico Sim (DNAfd) 42

Hepadnaviridae

Hepatite B

Núcleo (citoplasma)

Estomatite

Citoplasma (membrana citoplasmática e/ou citoplasma)

Helicoidal

Sim (RNAfu) 130–300 Rhabdoviridae

Vesiculovirus

x50-100

vesicular Lyssavirus

Helicoidal

Sim (RNAfu) 100–150 Paramyxoviri-

Paramyxovirus

Raiva Caxumba

Citoplasma (membrana citoplasmática)

Influenza

Citoplasma (membrana citoplasmática)

dae Helicoidal

Sim (RNAfu) 80 – 120 Orthomyxoviri Influenzavirus dae

(Gripe)

Helicoidal

Sim (RNAfu) 75 – 160 Coronaviridae

Coronavirus

Coronavirus

Citoplasma (citoplasma)

Helicoidal

Sim (RNAfu) 90 – 120 Bunyaviridae

Bunyavirus

Bunyamwera

Citoplasma (citoplasma)

Complexo ou incerto

Sim (DNAfd) 200–350 Poxviridae

Orthopoxvirus

Varíola

Arenavirus

Lassa

Complexo ou incerto

1

Núcleo

x115260 Sim (RNAfu)

fd = fita dupla

Arenaviridae 50 – 300

2

fu = fita única

4.5 Replicação do Vírus

Citoplasma (citoplasma) Citoplasma (membrama citoplasmática e/ou citoplasma)


Antes que qualquer vírus possa infectar uma célula animal, ele primeiro deve ligar-se a um receptor específico na membrana celular, provavelmente uma glicoproteína. Como já foi dito, muitos vírus podem ter um envelope rico em lipídeo envolvendo o capsídio. Do envelope de muitos vírus projetam-se "pontas" que podem conter glicoproteínas e lipídeos. As propriedades das moléculas que constituem o envelope estão relacionadas com a adesão do vírus à vários substratos. Se o envelope não está presente, as propriedades do capsídio determinam as características adesivas do vírus. A multiplicação dos vírus se faz por replicação, no qual as porções protéica e nucleica aumentam no interior das células hospedeiras sensíveis. Este processo pode ser dividido em etapas, que são comuns a todas as infecções virais: 1. Adsorção: envolve a participação de receptores específicos na superfície da célula hospedeira e das macromoléculas do vírion. 2. Penetração e desnudamento: os vírus com envelope unem-se às células hospedeiras, levando à fusão do envoltório lipoproteico dos vírus com a membrana citoplasmática da célula, que resulta na liberação do material nucleocapsídico no citoplasma celular. Os vírus nús (sem envelope) parecem penetrar pelo mecanismo de fagocitose. 3. Replicação bioquímica: a replicação ativa do ácido nucleico e a síntese de proteínas virais começam após a dissociação do capsídio e do genoma. Além do ATP celular, os vírus requerem o uso dos ribossomas da célula, do RNA de transferência, de enzimas e de certos processos biossintéticos para sua replicação. 4. Acoplamento ou maturação: os vírus são capazes de dirigir a síntese dos componentes essenciais para sua progênie e de acoplar estes materiais sob a forma de vírions maduros, no núcleo e/ou no citoplasma da célula infectada. 5. Liberação: este processo varia com o agente viral. Em alguns casos, a lise celular resulta na liberação concomitante das partículas virais. Em outros, a maturação e a liberação são relativamente lentas e os vírions são liberados sem a destruição da célula hospedeira. Como exemplo do processo replicativo dos vírus em células eucarióticas, a figura 29 mostra o que ocorre com o vírus do herpes simples.


Figura 29: Replicação do vírus herpes simples. Glicoproteínas específicas presentes no envelope viral são essenciais para a adsorção nos receptores presentes na membrana citoplasmática da células hospedeiras. O envelope viral e a membrana celular fundem-se e o nucleocapsídeo do vírion é liberado no citoplasma. O vírion é desnudado e o DNA liberado é transportado para o núcleo. A transcrição precoce e o processamento do mRNA são aparentemente catalisados pelas enzimas da célula hospedeira. As enzimas resultantes (proteínas precoces) são utilizadas na replicação do DNA viral. Os RNAs transcritos no núcleo e sintetizados após a replicação do DNA são responsáveis pela síntese de proteínas estruturais que vão formar o capsídeo e o envelope assim como as glicoproteínas da membrana nuclear. As proteínas estruturais entram no núcleo para participar da montagem dos vírions. Os nucleocapsídeos adquirem o envelope durante o processo de brotamento através da membrana nuclear. O vírus é liberado da célula por mecanismos não conhecidos (fonte: Pelczar et al ., 1996).


4.6 Bacteriófagos Bacteriófagos são vírus que infectam bactérias e foram descobertos independentemente por Frederick W. Twort, na Inglaterra, em 1915, e por Felix d’Herelle, no Instituto Pasteur, em Paris, em 1917. Os pesquisadores observaram que colônias bacterianas algumas vezes dissolviam-se e desapareciam devido a uma lise que ocorria nas células; este efeito lítico podia ser transmitido de colônia a colônia. Este agente lítico seria um agente infeccioso filtrável, que parasitava as bactérias e foi denominado de bacteriófago. Os bacteriófagos têm o cerne de ácido nucléico envolvido por um capsídeo de natureza proteica, como os outros vírus. Existem 3 formas básicas de bacteriófagos: cabeça icosaédrica sem cauda, cabeça icosaédrica com cauda (figura 30) e filamentosa. Com relação ao ciclo de vida, os bacteriófagos podem ser líticos (ou virulentos) e temperados (ou avirulentos). No ciclo lítico, os fagos líticos destroem as células hospedeiras bacterianas. No processo infeccioso lítico, após a replicação do vírion, a célula hospedeira rompe-se, liberando nova progênie de fagos para infectar outras células hospedeiras. Os fagos temperados não destroem suas células hospedeiras. Em vez disso, o ácido nucléico viral é integrado ao genoma da célula hospedeira e replica-se na célula bacteriana hospedeira de uma geração a outra, sem que haja lise celular. Este processo é denominado lisogenia e é realizado somente pelos fagos que possuem DNA de fita dupla. O processo de adesão de um bacteriófago a uma célula bacteriana é o mesmo nos 2 tipos de ciclos e é mostrado na figura 31.

Figura 30: Estrutura de um bacteriófago com cabeça icosaédrica e cauda (fonte: Pelczar et al., 1996).


Figura 31: Adsorção de um bacteriófago T4 à parede celular da batéria Escherichia coli e injeção do DNA. (a) fago livre. (b) adsorção à parede celular através das fibras da cauda. (c) fixação pela extremidade da cauda. (d) contração da bainha da cauda e injeção do DNA (fonte: Brock et al., 1994 ).

4.7 Isolamento e identificação do vírus O isolamento e a identificação dos vírus, a partir de espécimes clínicos ou de materiais de pesquisa, podem ser desenvolvidos por meio de numerosos métodos, não havendo contudo, uma técnica única que seja satisfatória para o estudo de todos os vírus. A primeira fase de identificação laboratorial de um vírus é a coleta e manutenção adequadas dos espécimes, até que se possam inocular animais sensíveis, culturas de tecidos, ovos embrionados ou outro tipo adequado de meio. Esta fase inclui a eliminação de bactérias dos produtos em exame, através da filtração, da centrifugação diferencial ou do uso de drogas antimicrobianas. Havendo a presença de vírus, podem ser produzidos e pesquisados anticorpos específicos.

4.8 Agentes infecciosos semelhantes a vírus Os viróides e os prions são considerados como formas mais simples de vida, em relação aos vírus. Os viróides, os menores agentes infecciosos conhecidos, são constituídos de RNA circular de fita única ou de RNA linear de fita dupla, não possuindo qualquer tipo de capa protéica. Até hoje, os viróides só foram encontrados em infecções de plantas, dentre elas a doença do afilamento do tubérculo da batata e da fruta pálida do pepino. Os viróides replicam-se em células de espécies de plantas susceptíveis, mas não são capazes de codificar suas próprias proteínas, mostrando serem dependentes da atividade metabólica do hospedeiro para replicação.


Um outro agente causador de doenças é o prion ou partícula protéica infecciosa, já que a proteína parece ser seu único componente, não possuindo nenhum ácido nucléico detectável. Possui propriedades incomuns, como a alta resistência à radiação ultra-violeta e ao calor, ao contrário dos vírus convencionais; no entanto, são inativados pelo hipoclorito e autoclave. Assim como os vírus, reproduz-se dentro das células. É possível que as proteínas dos prions sejam codificadas por um gene encontrado no DNA de um hospedeiro normal. Existem várias doenças clássicas causadas por prions, todas doenças neurológicas, e ditas “lentas”, pois possuem um longo período de latência, um estabelecimento gradual e uma evolução progressiva e invariavelmente fatal. Das doenças que afetam o homem, destacam-se o kuru (que acontece somente em tribos da Nova Guiné) e a doença de Creutzfeldt-Jacob (encontrada mundialmente), cujos cérebros de pacientes infectados apresentam a aparência espongiforme; esta última doença é rara, caracterizada por demência pré-senil, não é altamente transmissível e, dentre a maioria dos casos, 10% são hereditários. Tem sido sugerido por alguns pesquisadores que a doença de Alzheimer pode ser causada por prion. No animais, os tipos de doença de evolução lenta observados são o scrapie e a visna, doenças de ovinos, e a encefalopatia espongiforme bovina , também conhecida como “doença da vaca louca”. Nesta última o gado é infectado pela ingestão de ração preparada com órgãos de ovinos, por exemplo o cérebro, infectados com o prion do scrapie; é endêmica na Grã-Bretanha e diversos casos da doença de Creutzfeldt-Jacob foram atribuídos à ingestão de carne bovina.


5 CONTROLE DOS MICRORGANISMOS 5.1 Fundamentos A condição sanitária de uma dada população humana é determinada, em larga escala, por sua capacidade de controlar eficazmente as populações microbianas. Os processos podem ser muito específicos, como o fornecimento de medicação eficaz na eliminação dos microrganismos infectantes, ou podem ser mais gerais, como as práticas sanitárias utilizadas no lar e nos hospitais. Cuidados diários, tais como a purificação da água, a pasteurização do leite e a preservação dos alimentos concorrem para o controle das populações microbianas. Não somente torna-se o produto de consumo seguro sob o ponto de vista de saúde pública, como também o processo traz muitos benefícios para o bem-estar da comunidade. As principais razões para desenvolver o controle de microrganismos podem, em resumo, ser: 1) prevenir a transmissão de doenças e infecções; 2) prevenir a contaminação ou crescimento de microrganismos nocivos e 3) prevenir a deterioração e dano de materiais por microrganismos. Os microrganismos podem ser removidos, inibidos ou mortos por agentes físicos ou químicos. Uma grande variedade de técnicas e de agentes pode ser utilizada, agindo de modos diferentes e tendo seu próprio limite de aplicação prática. Os termos a seguir são usados para descrever os processos físicos e os agentes químicos destinados ao controle dos microrganismos: Esterilização: processo de destruição ou remoção de todas as formas de vida microscópica de um objeto ou espécime. Um objeto estéril, no sentido microbiológico, está completamente livre de microrganismos vivos. Este termo refere-se à ausência total ou à destruição de todos os microrganismos. Desinfetante: é um agente, normalmente químico, que mata as formas vegetativas, mas não necessariamente, as formas esporuladas, de microrganismos patogênicos. O termo normalmente refere-se às substâncias utilizadas em objetos inanimados. Anti-séptico: é uma substância que previne o crescimento ou ação de microrganismos, pela destruição dos mesmos ou pela inibição de seu crescimento ou atividade. Usualmente está associado com substâncias aplicadas ao corpo do homem. Bactericida: é um agente que mata as bactérias. De modo similar, os termos fungicida, viricida e esporocida se referem aos agentes que matam os fungos, vírus e esporos, respectivamente. As formas esporulada não são necessariamente eliminadas por estes agentes.


5.2 Condições que influenciam a ação antimicrobiana Na aplicação de qualquer agente físico ou químico destinado a inibir ou destruir populações microbianas, devem ser considerados fatores como: Temperatura: o aumento da temperatura, quando usado em combinação com outro agente, como uma substância química, apressa a destruição dos microrganismos. Tipo de microrganismo: as espécies de microrganismos diferem em sua susceptibilidade aos agentes físicos e químicos. Nas espécies esporuladas, as formas vegetativas são muito mais sensíveis que as formas esporuladas, sendo estas extremamente resistentes. Estado fisiológico das células: células jovens, metabolicamente ativas, são mais facilmente destruídas que as células velhas ou em latência, no caso de o agente nocivo agir através de uma interferência sobre o metabolismo (as células que não estão crescendo não seriam afetadas). Condições ambientais: as propriedades físicas e químicas do meio ou das substâncias que sustentam os microrganismos têm profunda influência sobre o ritmo, assim como sobre a eficácia da destruição microbiana. A eficiência do calor, por exemplo, é muito maior nos meios ácidos do que nos alcalinos. A consistência do material (aquosa ou viscosa) também influi na penetração do agente, e as altas concentrações de carboidratos aumentam, em geral, a resistência térmica dos microrganismos. A presença da matéria orgânica estranha pode reduzir, significativamente, a eficácia de uma droga antimicrobiana, inativando-a ou protegendo o microrganismo. 5.3 Modo de ação dos agentes antimicrobianos A revisão de certas características da célula microbiana pode apontar os possíveis locais de ação de um agente antimicrobiano. Eles podem agir causando lesões na parede celular, alterações na permeabilidade celular, alterações das moléculas de proteínas e de ácidos nucleicos, inibição da ação enzimática, inibição da síntese de ácidos nucleicos, entre outras coisas.

5.4 Controle pelos agentes físicos 5.4.1 Aplicação das altas temperaturas

Os processos práticos, nos quais se emprega o calor, dividem-se em duas categorias: calor úmido e calor seco.

5.4.1.1 Calor úmido a) Vapor d'água sob pressão: é o agente mais prático e seguro para fins de esterilização, proporcionando temperaturas mais elevadas que as obtidas por ebulição. O aparelho que usa o vapor de água sob pressão regulada chama-se autoclave. Consiste em uma câmara de vapor com parede dupla, equipada com dispositivos que permitem o enchimento da câmara com vapor saturado e sua manutenção em determinadas


temperatura e pressão por quaisquer períodos de tempo. Geralmente, embora não sempre, ela é operada numa pressão de aproximadamente 15 libras por polegada quadrada (1 atmosfera=121°C). Esterilização fracionada, água em ebulição e pasteurização são outros processos de calor úmido, empregados no controle de microrganismos.

5.4.1.2 Calor seco a) Esterilização pelo ar quente: é recomendada quando o contato direto ou completo do vapor d'água sob pressão com o material a ser esterilizado é considerado como indesejável ou improvável, o que é verdadeiro para certos tipos de vidraria laboratorial (placas de Petri, tubos de ensaio), óleos, pó e substâncias similares. O aparelho utilizado neste tipo de esterilização pode ser um forno elétrico especial (ou a gás) - estufa - ou mesmo um forno de cozinha, admitindo-se que, para a vidraria de laboratório, uma exposição de 2 horas à temperatura de 160°C seja suficiente para a esterilização. b) Incineração: é usada para a eliminação de carcaças de animais de laboratório infectadas ou de outros materiais contaminados. A destruição de microrganismos pelo calor direto é, também, praticada rotineiramente quando a agulha de inoculação (ou alça de platina) é levada à chama de um bico de Bunsen. 5.4.2 Aplicação de baixas temperaturas

As temperaturas inferiores ao ponto ótimo para o crescimento diminuem o ritmo metabólico e, sendo a temperatura suficientemente baixa, cessa o metabolismo e o crescimento. As temperaturas baixas são úteis na manutenção de culturas, pois os microrganismos apresentam uma capacidade típica de sobrevivência em face do frio; culturas em ágar de algumas bactérias, leveduras e fungos, são usualmente armazenadas durante longos períodos de tempo sob temperatura de refrigerador, ou seja, entre 4° e 7° C. Além disso, muitas bactérias e vírus podem ser mantidos em unidades de alta refrigeração, entre -20° e -70° C. O nitrogênio líquido, em temperaturas de -196° C, é empregado na preservação de culturas de muitos vírus e microrganismos, assim como as fontes de células de mamíferos usadas em virologia. A partir de exposto acima, torna-se aparente que as temperaturas baixas, embora extremas, não podem se indicadas para a desinfecção ou esterilização. Os microrganismos mantidos em temperatura de congelamento ou mesmo inferiores podem ser considerados dormentes; não efetuam atividade metabólica aparente. Esta condição estática é a base da bem sucedida aplicação do frio na preservação dos alimentos. A tabela 11 resume os métodos que usam a temperatura no controle de microrganismos. Tabela 11: O uso da temperatura no controle de microrganismos (fonte: Pelczar et al ., 1996).


Método Calor úmido Autoclave

Água em ebulição

Pasteurização

Calor seco

Temperatura 121,6oC à pressão de 15 lb/pol2, 15 – 30 min

o

100 C, 10 min

o

Limitações

Esterilização de Ineficiente contra instrumentos, bandejas de micorganismos presentes tratamento, tecidos, em materiais impermeáveis utensílios, meios e outros ao vapor; não pode ser líquidos utilizado em materiais termossensíveis

Destruição de células vegetativas em instrumentos, recipientes

Endósporos não são mortos; não pode ser utilizado como esterilizante Não é esterilizante

62,8 C por 30 min, ou 71,7oC por 15 s

Destruição de células vegetativas de microrganismos patogênicos e de muitos outros microrganismos no leite, suco de frutas e em outras bebidas

170 – 180 oC por 1 – 2 h

Esterilização de materiais impermeáveis ou danificáveis pela umidade (óleos, vidrarias, instrumentos cortantes, metais)

Centenas de oC

Esterilização de alças de O tamanho do incinerador semeadura, eliminação de deve ser adequado à carcaças de animais queima rápida e completa infectados, eliminação de da maior carga; apresenta objetos contaminados que potencial de poluição do ar não podem ser reutilizados

Forno de ar quente

Incineração

Aplicações

Baixas temperaturas Congelamento

Menor que 0oC

Nitrogênio líquido

-196oC

Destrói materiais que não suportam altas temperaturas por muito tempo

Preservação de alimentos e Principalmente outros materiais microbiostático em vez de microbicida Preservação dos microrganismos Alto custo do nitrogênio líquido

5.4.3 Radiações

As radiações ionizantes (raios X e raios gama) têm tido aplicação na esterilização de materiais biológicos. Este método é chamado de esterilização fria, porque estas radiações produzem relativamente pouco calor no material irradiado e, assim, é possível esterilizar substâncias termossensíveis, especialmente nas indústrias alimentícia e farmacêutica. A luz ultravioleta é outro tipo de radiação empregada na esterilização de materiais. A porção ultravioleta do espectro inclui todas as radiações compreendidas entre 150 e 3.900 Å, mas a eficácia bactericida mais alta situa-se em comprimentos de onda ao redor de 2650 Å. Embora a energia radiante da luz solar seja parcialmente


composta de luz ultravioleta, a maior parte dos comprimentos mais curtos é filtrada pela atmosfera terrestre (ozônio, nuvens e fumaça). Consequentemente, a radiação ultravioleta, na superfície da Terra, é restrita à faixa de 2.870 a 3.900 Å, do que se conclui que a luz solar, em certas condições, tem capacidade microbicida, embora em grau limitado. A luz ultravioleta é absorvida por muitas substâncias celulares, mas, de modo mais significativo, pelos ácidos nucleicos, onde ocorre o maior dano. Existem muitas lâmpadas que emitem alta concentração de luz UV na região mais efetiva, 2.600 a 2.700 Å. Essas lâmpadas germicidas são amplamente utilizadas para reduzir a população microbiana em salas cirúrgicas de hospitais e em câmaras assépticas de indústrias farmacêuticas, onde são envasados produtos estéreis e, ainda, na indústria alimentícia para o tratamento de superfícies contaminadas. Uma importante consideração prática, referente ao uso deste meio de destruição microbiana, é que a luz UV tem uma capacidade de penetração muito pequena. Mesmo uma fina camada de vidro filtra uma grande parte da luz e, assim sendo, apenas os microrganismos existentes na superfície de um objeto diretamente exposto à radiação UV são susceptíveis à destruição.

5.5 Controle pelos agentes químicos Nenhum agente químico antimicrobiano único é o melhor ou o ideal para qualquer ou todas as finalidades. Algumas especificações podem orientar a preparação de novos compostos e devem ser consideradas nos métodos de avaliação dos desinfetantes destinados ao uso prático. São elas: a atividade microbiana, solubilidade, estabilidade, inocuidade para o homem e os animais, homogeneidade, ausência de combinação com material orgânico estranho, toxicidade para microrganismos em temperatura ambiente ou corporal, poder de penetração, ausência de poderes corrosivos e tintoriais, poder desodorizante e capacidades detergentes. 5.5.1 Escolha do agente químico antimicrobiano

Os fatores que devem ser considerados na escolha de um agente químico antimicrobiano são: 1. Natureza do material a ser tratado : um exemplo extremo pode ser citado - um agente químico usado para desinfetar utensílios contaminados pode ser completamente insatisfatório para aplicação na pele. Conseqüentemente, a substância escolhida deve ser compatível com o material no qual é aplicada. 2. Tipos de microrganismos : os agentes químicos são completamente eficazes sobre bactérias, vírus, fungos e outros microrganismos. Os esporos são mais resistentes que as formas vegetativas. Existem diferenças entre bactérias gram-positivas e gramnegativas, com relação à resistência aos desinfetantes. Sendo assim, o agente escolhido deve ser conhecidamente efetivo contra o organismo a ser destruído. 3. Condições ambientais : fatores com temperatura, pH, tempo, concentração e presença de material orgânico podem influir na taxa e na eficiência da destruição microbiana.


5.5.2 Principais grupos de desinfetantes e anti-sépticos

Alguns dos principais grupos de agentes químicos desinfetantes e anti-sépticos são listados a seguir e a tabela 12 mostra a aplicação destes agentes no controle de microrganismos. 1. Fenol e compostos fenólicos 2. Álcoois 3. Halogênios (iodo e cloro) 4. Metais pesados e seus compostos 5. Detergentes Outros agentes químicos são aplicados na esterilização de materiais e são denominados de esterilizantes químicos. São particularmente utilizados para a esterilização de materiais médicos sensíveis ao calor, como bolsas de sangue para transfusão, seringas plásticas descartáveis e equipamentos de cateterização. Também são utilizados para esterilizar ambientes fechados, incluindo câmaras assépticas utilizadas para procedimentos que devem ser livres de microrganismos. Os principais esterilizantes químicos utilizados são: a) Óxido de etileno: composto orgânico (C 2H4O) que é líquido a temperaturas abaixo de 10,8o C, mas acima desta temperatura torna-se um gás. Tem grande poder de penetração, podendo atravessar e esterilizar o interior de grandes pacotes com objetos, roupas e certos plásticos. Desvantagem: é inflamável e é potencialmente explosivo em forma pura; b) β– Propiolactona: é um composta líquido incolor em temperatura ambiente. Destina-se à esterilização de instrumentos e materiais termossensíveis. Tem baixo poder de penetração e seu uso foi restringido devido a sua provável propriedade carcinogênica. c) Glutaraldeído: é um líquido oleoso e incolor. É utilizado em medicina para esterilizar instrumentos urológicos, lentes de instrumentos, equipamentos respiratórios e outros equipamentos específicos. Como desvantagem, tem uma estabilidade limitada. d) Formaldeído: é um gás que se mostra estável somente em altas concentrações e em temperaturas elevadas. Em temperatura ambiente, ele polimeriza-se formando uma substância sólida incolor, o paraformaldeído. O formaldeído é comercializado em solução aquosa como formalina , que contém 37 a 40% (p/v) da substância. Este é utilizado para a esterilização de instrumentos e a forma gasosa é utilizada para a desinfecção e esterilização de áreas fechadas. Desvantagem: tem fraco poder de penetração, é corrosivo, é extremamente tóxico e seus vapores são irritantes às mucosas.

Tabela 12: Alguns desinfetantes e anti-sépticos comumente utilizados (fonte: Pelczar et al ., 1996).


Desinfetante ou antiséptico

Concentração

Compostos fenólicos Hexilresorcinol,

0,5 – 3,0 %

o-Fenilfenol,

Solução aquosa

cresóis Alcoóis Álcool etílico,

70 – 90 %

Álcool isopropílico Álcool + iodo

Nível de atividade *

Desinfecção de objetos inanimados como instrumentos, superfícies de mesa, assoalhos e termômetros retais (cresóis)

Intermediário a baixo

Anti-sepsia da pele, desinfecção de instrumentos cirúrgicos e termômetros

Intermediário

70% + 0,5–2,0% de iodo

Iodo Iodóforo (polivinilpir-

1,0%

rolidona) Tintura de iodo

iodo a 2% + iodeto de sódio a 2% + álcool 70%

Compostos clorados Hipocloritos cloraminas Compostos quaternários

Anti-sepsia da pele, Intermediário pequenos cortes e abrasões; utilizado também para desinfecção de água potável e de piscinas

Desinfecção de água, Baixo superfícies não metálicas, e 0,5 – 5,0g de cloro livre equipamentos de laticínios, por litro utensílios de restaurantes, materiais domésticos 0,1 – 0,2%

Compostos mercuriais Mertiolate, cromo

Aplicações

Mercúrio 1,0%

Saneamento ambiental de Baixo superfícies e equipamentos Anti-sepsia da pele, Baixo desinfecção de instrumentos; utilizado também como preservante em alguns materiais biológicos

* Nível de atividade microbicida: alta = mata todas as formas de vida microbiana, inclusive os esporos bacterianos; intermediário = mata o bacilo da tuberculose, fungos e vírus mas não os esporos bacterianos; baixo = não mata esporos bacterianos, bacilo da tuberculose ou vírus não lipídicos em um tempo aceitável.

5.6 Antibióticos e outros agentes quimioterápicos Os agentes quimioterápicos são substâncias empregadas no tratamento das doenças infecciosas e daquelas que são causadas pela proliferação de células malignas. Estas substâncias são preparadas em laboratórios químicos ou obtidas de microrganismos, algumas plantas e animais. Em geral, as drogas naturais são diferenciadas dos compostos sintéticos pela denominação específica de antibióticos. Alguns destes são preparados por via sintética, mas a maioria é comercialmente produzida por biossíntese. As antitoxinas e outras substâncias formadas pelos organismos de animais infectados não são consideradas como agentes quimioterápicos, o mesmo sendo válido para os compostos que causam a destruição ou inibição de microrganismos in vitro, usualmente classificados como desinfetantes, anti-sépticos ou germicidas.


Um agente quimioterápico satisfatório deve: 1. Destruir ou inibir a atividade de um parasita, sem lesar as células do hospedeiro ou, apenas, com pequenos danos sobre estas células; 2. Ser capaz de entrar em contato com o parasita, atingindo concentrações efetivas nos tecidos e nas células hospedeiras; 3. Deixar inalterados os mecanismos naturais de defesa do hospedeiro, tais como a fagocitose e a síntese de anticorpos. As drogas do tipo sulfa são um dos agentes quimioterápicos sintéticos mais conhecidos e utilizados. A sulfa foi primeiramente obtida pelo químico alemão Gerhard Domagk, em 1935. O tipo mais simples de sulfa é a sulfonamida, que é estruturalmente análoga ao ácido para-aminobenzóico (PABA), que é um precursor na síntese do ácido fólico, dentro da célula bacteriana. A sulfonamida compete com o PABA pelo sítio ativo de uma enzima envolvida na síntese do ácido fólico, provocando uma diminuição na produção do mesmo, que é essencial na síntese de importantes constituintes celulares. As sulfonamidas são particularmente úteis no tratamento de infecções causadas por meningococos e Shigella , de infecções respiratórias por estreptococos e estafilococos e das infecções urinárias devidas a microrganismos Gram-negativos. São importantes na prevenção da febre reumática, da endocardite bacteriana, da infecção de ferimentos e de infecções urinárias, após cirurgia ou cateterismo. Os antibióticos formam um tipo especial de agentes quimioterápicos, geralmente obtidos de organismos vivos. O termo antibiótico designa um produto metabólico de um organismo que é prejudicial ou inibidor para certos microrganismos, em concentrações muito pequenas. Propriedades de um antibiótico útil: 1. Atividade letal ou inibitória sobre muitas espécies diferentes de microrganismos patogênicos, ou seja, devem representar o que se denomina antibióticos de largo espectro . 2. Capacidade de prevenir o desenvolvimento fácil de formas microbianas resistentes. 3. Ausência de efeitos colaterais indesejáveis, tais como reações alérgicas ou de sensibilidade, lesões nervosas, irritação renal ou do trato gastrointestinal. 4. Ineficácia sobre a flora microbiana normal, evitando-se assim, a perturbação do equilíbrio natural e, consequentemente, impedindo o estabelecimento de infecções por germes totalmente não-patogênicos ou, especialmente, por formas patogênicas habitualmente controladas pela flora normal.

Os antibióticos podem inibir ou destruir os microrganismos de diversos modos: 1. Inibindo a formação da parede celular.


2. Lesando a membrana citoplasmática. 3. Interferindo com a síntese protéica. 4. Inibindo o metabolismo dos ácidos nucleicos. A sensibilidade dos microrganismos aos antibióticos pode variar. Bactérias Gram-positivas são geralmente mais sensíveis a antibióticos que as Gram-negativas, embora alguns antibióticos atuem somente sobre estas últimas. Um antibiótico que age sobre as bactérias Gram-positivas e Gram-negativas é dito antibiótico de largo espectro . Um antibiótico de espectro restrito age somente sobre um único grupo de microrganismos. No entanto, este último pode ser valioso no controle de microrganismos resistentes a outros antibióticos. Certos microrganismos, porém, são resistentes a alguns antibióticos. Esta resistência pode ser uma propriedade inerente do microrganismo ou pode ser adquirida (através da mutação ao acaso dos genes cromossômicos). A resistência devida à propriedade inerente do microrganismo pode ter várias razões: (1) o organismo pode não ter a estrutura sobre a qual o antibiótico atua inibindo; por exemplo, algumas bactéria tais como os micoplasmas, não possuem uma parede celular típica bacteriana, sendo assim resistentes à penicilina; (2) o organismo pode ser ‘impermeável’ ao antibiótico; (3) o organismo pode ser capaz de alterar o antibiótico, tornando-o inativo; (4) o organismo pode modificar o “alvo” do antibiótico; (5) o organismo pode alterar, através de modificação genética, a via metabólica que o antibiótico bloqueia; (6) o organismo pode ser capaz de eliminar o antibiótico, “jogando-o” para fora da célula (efluxo). A penicilina foi o primeiro dos antibióticos modernos e ainda é um dos mais úteis. Juntamente com a sulfa, só passou a ser largamente utilizada no início dos anos 40, em plena Segunda Guerra Mundial. É produzida pelo fungo Penicillium notatum , Penicillium chrysogenium e outras espécies de bolores. P. notatum foi isolado pela primeira vez pelo médico inglês Alexander Fleming, em 1929. A penicilina é seletiva para bactérias Gram-positivas, alguns espiroquetas e os diplococos Gram-negativos ( Neisseria ). A tabela 13 mostra alguns dos principais antibióticos utilizados. Embora a penicilina seja, ainda, um dos antibióticos mais valiosos, a busca da droga ideal continua. Entre os compostos aceitáveis, estão aqueles que atuam sobre os microrganismos patogênicos insensíveis ou que se tornaram resistentes à penicilina. As drogas mais importantes são produzidas por quatro gêneros de microrganismos: Bacillus, Penicilium, Streptomyces e Cephalosporium , normalmente existentes no solo. Assim sendo, o solo tem sido profundamente pesquisado na procura de micróbios capazes de produzir novos antibióticos.

Tabela 13: Produtos metabólicos de bactérias e fungos, usados como antibióticos (fonte: Pelczar, 1980).


ANTIBIÓTICO (PRODUTO)

FONTE MICROBIANA

ESPECTRO PRIMÁRIO

MODO DE AÇÃO

Ampicilina

Penicillium sp.

Bactérias gram-positivas e Inibe a síntese da parede negativas celular

Anfotericina B

Streptomyces nodosus

Fungos, agentes de várias Interfere com a função da micoses membrana citoplasmática

Bacitracina

Bacillus subtilis

Bactérias gram-positivas

Carbomicina (Magnamicina)

Streptomyces halstedii

Rickettsias; bactérias gram- Inibe a síntese protéica positivas

Cefalosporina C

Cephalosporium sp.


Ciclohexamida (Actidione)

Streptomyces griseus

Fungos, especialmente Inibe a síntese protéica fitopatogênicos

Ciclosserina

Streptomyces orchidaceous Mycobacterium tuberculosis e Streptomyces lavendulae

Cloranfenicol (Cloromicetina)

Streptomyces venezuelae

Largo espectro

Interfere protéica

com

a

síntese

Clortetraciclina (Aureomicina)

Streptomyces aureofaciens

Largo espectro

Interfere protéica

com

a

síntese

Colistina (Colimicina)

Bacilus colistinus

Pseudomonas

Dimetiltetraciclina


Largo espectro

spp.

(mutante)

Inibe a síntese da parede celular



Deteriora a citoplasmática

membrana

Interfere protéica

com

a

síntese

com

a

síntese

Eritromicina (Iloticina)

Streptomyces erythraeus

Rickettsias; bactérias gram- Interfere positivas protéica

Estreptomicina


Bactérias gram-positivas e Induz a síntese de proteínas gram-negativas; anormais Mycobacterium tuberculosis

Fumagilina (Amebacilina)

Aspergillus fumigatus

Amebas

Interfere protéica

com

a

síntese

Griseofulvina


Fungos patogênicos

Interfere com a parede celular fúngica e com a síntese de ácidos nucleicos

Kanamicina

Streptomyces kanamyceticus

Mycobacterium tuberculosis

Induz a síntese de proteínas anormais

Lincomicina

Streptomyces lincolnensis


Inibe a síntese protéica

Meticilina

Penicillium sp.

Estafilococos


Neomicina

Streptomyces fradiae

Bactérias gram-positivas e Induz a síntese de proteínas gram-negativas; anormais Mycobacterium tuberculosis

Cont. da tabela 13

Nistatina

Streptomyces noursei

Candida intestinal; micoses

Danifica a citoplasmática

membrana


Novobiocina (Catomicina)

Streptomyces griseus; Streptomyces niveus; Streptomyces spheroides


Inibe a polimerização do ADN

Oleandomicina

Streptomyces antibioticus

Rickettsias; bactérias gram- Inibe a síntese protéica positivas

Oxitetraciclina (Terramicina)

Streptomyces rimosus

Largo espectro

Interfere protéica

Penicilina G

Penicillium chrysogenum



Polimixina B

Bacillus polymyxa

Bactérias gram-negativa

Deteriora a citoplasmática

membrana

Tetraciclina


Largo espectro

Interfere protéica

a

Vancomicina

Streptomyces orientalis

Bactérias

gram-positivas; Inibe a síntese da parede Neisseria, Clostridium tetani celular

Viomicina

Streptomyces floridae

Mycobacterium tuberculosis

Interfere protéica

com

com

com

a

a

síntese

síntese

síntese

Microbiologia

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