Penentuan Kadar Protein Secara Biuret

I.

Nomor Percobaan

: VI

II.

Nama Percobaan

: Penentuan Kadar Protein Secara Biuret

III.

Tujuan Percobaan

: Untuk mengetahui kadar protein dalam suatu sampel berdasarkan serapan cahaya melalui uji biuret.

IV.

Landasan Teori Protein adalah salah satu biomolekul raksasa yang berperan sebagai

komponen utama penyusun makhluk hidup. Protein membawa kode-kode genetik berupa DNA dan RNA. Beberapa makanan yang dapat menjadi sumber protein adalah: daging, telur, ikan, susu, biji-bijian, kentang, kacang, dan polongpolongan. Protein merupakan polimer alam yang tersusun dari asam-asam aminomelaluiikatan peptida, sehingga protein juga disebut sebagai polipeptida.Di dalam tubuh kitaprotein berfungsi sebagai zat pembangun, pengatur pertahanan, dan sebagai sumber energi setelah karbohidrat dan lemak.Protein dapat digolongkan berdasarkanstrukturnya, bentuknya, dan fungsinya. Protein Menunjukkan Berbagai Fungsi Biologi Deret asam amino dari berjenis-jenis protein memungkinkan molekul ini menjalankan berbagai fungsi, antara lain : 1.

Enzim Protein yang paling bervariasi dan mempunyai kekhususan tinggi adalah

protein yang mempunyai aktivitas katalisa, yakni enzim. Hampir semua reaksi kimia biomolekul organic didalam sel dikatalisa oleh enzim. Lebih dari 2000 jenis enzim, masing-masing dapat mengkatalisa reaksi kimia yang berbeda, telah ditemukan didalam berbagai bentuk kehidupan. 2.

Protein Transport Protein transport didalam plasma darah mengikat dan membawa molekul

atau ion spesifik dari satu organ ke organ lain. Hemoglobin pada sel darah merah mengikat oksigen ketika darah melalui paru-paru, dan membawa oksigen ini ke jaringan periferi. Disini oksigen dilepaskan untuk melangsungkan oksidas nutrien yang menghasilkan energi. Plasma darah mengandung lipoprotein, yang membawa lipid dari hati ke ogan lain. Protein tranport lain terdapat didalam

membran sel dan menyesuaikan

strukturnya untuk mengikat dan membawa

glukosa, asam amino, dan nutrien lain melalui membran menuju kedalam sel. 3.

Protein Nutrien dan Penyimpan Biji berbagai tumbuhan menyimpan protein nutrien yang dibutuhkan untuk

perumbuhan embrio tanaman. Terutama, contoh yang telah dikenal adalah protein biji dari gandum, jagung, dan beras. Ovalbumin protein utama putih telur, dan kasein, protein utama susu merupakan contoh lain dari protein nutrien. Ferritin jaringan hewan merupakan protein penyimpan besi. 4.

Protein Kontraktil atau Motil Beberapa protein memberikan kemampuan kepada sel dan organisme untuk

berkontraksi, mengubah bentuk atau bergerak. Aktin dan miosin adalah protein filamen yang berfungsi didalam sistem kontraktil otot kerangka dan juga didalam banyak sel bukan otot. Contoh lain adalah tubulin, protein pembentuk mikrotubul. Mikrotubul merupakan komponen penting dari fagela dan silia, yang dapat menggerakkan sel. 5.

Protein Struktural Banyak protein sebagai filamen, kabel, atau lembaran penyanggah untuk

memberikan struktur biologi kekuatan atau proteksi. Komponen utama dari urat dan tulang rawan adalah protein serabut kolagen, yang mempunyai daya tenggang yang amat tinggi. Hampir semua komponen kulit adalah kolagen murni. Persendian menganmdung elastin, suatu protein struktural yang mampu meregang ke dua dimensi. Rambut, kuku, dan bulu burung/ayam terdiri terutama dari protein tidak larut, yang liat, keratin. Komponen utama dari serat sutra dan jaring labahlabah adalah protein fibroin. 6.

Protein Pertahanan Banyak protein mempertahankan organism dalam melawan serangan oleh

spesies lain atau melindungi organisme tersebut dari luka. Imunoglobulin atau antibody pada vertebrata adalah protein khusus yang dibuat oleh limposit yang dapat mengenali dan mengendapkan atau menetralkan serangan bakteri, virus, atau protein asing dari spesies lain. Fibrinogen dan trombin merupakan protein penggumpal darah yang menjaga kehilangan darah jika system pembuluh terluka.

Bisa ular, toksin bakteri, dan protein tumbuhan beracun, seperti risin, juga tampaknya berfungsi didalam pertahanan tubuh. 7.

Protein Pengatur Beberapa protein membantu mengatur aktivitas seluler atu fisiologi.

Diantara jenis ini terdapat sejumlah hormon, seperti insulin, yang mengatur metabolisme gula, dan kekurangannya, menyebabkan penyakit diabetes, hormon pertumbuhan dari pituitary dan hormon paratiroid, yang mengatur transport Ca2+ dan fosfat. Protein pengatur lain, yang disebut repressor mengatur biosintesa enzim oleh sel bakteri. 8.

Protein Lain Terdapat banyak protein lain yang fungsinya agak eksotik dan tidak mudah

diklasifikasikan. Monelin, suatu protein tanaman dari afrka mempunyai rasa yang amat manis. Protein ini sedang dipelajari sebagai pemanis makanan yang tidak menggemukkan dan tidak beracun, untuk manusia. Plasma darah beberapa kan Antartika mengandung protein antibeku yang melindungi darah ikan dari pembekuan. Persendian sayap beberapa insekta dibuat dari protein resilin, yang bersifat sempurna elastis.

Struktur Protein Protein merupakan polipeptida yaitu hasil dari kondensasi dua molekul asam α amino. Asam amino mengandung gugus amino (-NH2) dan karboksil (COOH). Gugus karboksil bersifat asam karena dapat melepas proton (H+), sedangkan gugus amino bersifat basa karena dapat mengikat proton (H+) membentuk –NH3+. Oleh karena itu, asam amino bersifat amfoter. Dalam larutan asam amino membentuk ion zwitter (bermuatan ganda). Denaturasi Protein Denaturasi protein merupakan perubahan struktur protein akibat pengaruh dari perubahan suhu, perubahan pH, radiasi, deterjen, dan perubahan jenis pelarut. Protein yang terdenaturasi hamper selalu mengalami kehilangan fungsi biologis. Hal ini paling mudah diperlihatkan oleh sifat protein. Jika larutan protein secara

perlahan-lahan dipanaskan sampai kira-kira 60 atau 70oC, larutan tersebut lambat laun akan menjadi keruh dan membentuk koagulasi berbentuk seperti tali. Produk yang terjadi tidak akan melarut lagi dengan pendinginan dan tidak membentuk larutan jernih seperti semula sebelum dipanaskan. Pengaruh panas terjadi pada semua protein globular, tanpa memandang ukuran atau fungsi biologinya, walaupun suhu yang tepat bagi fenomena ini mungkin bervariasi . Protein dalam keadaan alamiahnya disebut protein asli (natif); setelah perubahan menjadi protein terdenaturasi. Denaturasi protein dapat diakibatkan bukan hanya oleh panas, tetapi juga pH ekstrim; oleh beberapa pelarut organic seperti alcohol atau aseton; oleh zat terlarut tertentu seperti urea; oleh detergen; atau hanya dengan pengguncangan intensif larutan protein dan bersingungan dengan udara sehingga berbentuk busa. Protein Homolog dari Berbagai Spesies Mengandung Deret Homolog Protein homolog adalah protein yang menjalankan fungsi yang sama pada berbagai spesies; contohnya hemoglobin yang berfungsi melangsungkan transport oksigen pada berbagai jenis vertebrat. Protein homolog dari berbagai spesies biasanya mempunyai rantai polipeptida yang identik atau hamper identik panjangnya. Banyak posisi di dalam deret asam amino dari protein homolog yang ditempati oleh asam amino yang sama pada semua spesies, dan karenanya di sebut residu tetap. Pada posisi lain, terdapat variasi asam amino yang cukup besar dari spesies satu ke yang lain; asam amino ini disebut residu tak tetap. Serangkaian persamaan di dalam deret asam amino pada protein homolog seperti itu disebut homologi deret; hal ini menunjukkan bahwa hewan yang mengandung protein homolog tersebut mungkin mempunyai asal usul yang sama, tetapi mengalami perubahan pada saat spesies berkembang selama evolusi. Kesimpulan yang serupa diperoleh dari hasil penelitian spesifisitas antibody terhadap antigen dari spesies homolog. Protein Globular Dalam protein globular, rantai polipeptida berlipat menjadi suatu bentuk globular yang kompak. Konformasi globular lebih kompleks dibandingkan

dengan golongan protein serat, fungsi biologinya lebih beragam, dan aktivitasnya pun tidak statis, tetapi bersifat dinamis. Hampir semua dari 2000 atau lebih enzim merupakan protein globular. Protein globular yang lain berfungsi di dalam transport oksigen, sari makanan dan ion inorganic di dalam darah; beberapa protein globular bekerja sebagai antibody, yang lain merupakan hormone dan yang lain lagi sebagai komponen membrane dan ribosom. Terdapat dua bukti penting yang menunjukkan bahwa rantai polipeptida protein globular berlipat-lipat dengan erat dan bahwa konformasi yang berlipatlipat itu penting bagi fungsi biologinya, yaitu: 1.

Bahwa protein natif mengalami denaturasi dengan pemanasan, di dalam lingkungan pH yang ekstrim, atau dengan penambahan urea. Jika suatu protein globular mengalami denaturasi, struktur kerangka kovalen tetap utuh, tetapi rantai polipeptidanya membuka membentuk acak, tidak teratur, dan mengalami perubahan konformasi dalam ruang.

2.

Berlipatnya protein globular dating dari perbandingan panjang rantai polipeptida dengan ukuran makromolekular sebenarnya seperti diperlihatkan oleh pengukuran fisiokimia.

Pada penentuan kadar protein secara biuret ini menggunakan dasar pengukuran serapan cahaya oleh ikatan kompleks yang ungu warnanya. Pengukuran serapan cahaya tersebut dengan menggunakan metode spektroskopi. Spektroskopi adalah studi mengenai cahaya dengan atom dan molekul. Radiasi cahaya atau lektromagnet dapat dianggap menyerupai gelombang atau korpuskular. Beberapa sifat fisika cahaya paling baik diterangkan dengan sifat partikel. Jadi, cahaya dapat dikatakan bersifat ganda. Warna-warna yang nampak dan fakta bahwa orang bisa melihat, adalah akibat-akibat absorbsi energi oleh senyawaan organik maupun organik. Penangkapan energi matahari oleh tumbuhan dalam proses fotosintesis adalah suatu aspek lain dari antaraksi senyawaan organik dengan energi cahaya. Yang merupakan perhatian primer bagi ahli kimia organik ialah fakta bahwa panjang gelombang pada mana suatu senyawaan organik menyerap energi cahaya, bergantung pada struktur senyawaan itu. Oleh

karena itu, teknik-teknik spektroskopi dapat digunakan untuk menentukan struktur senyawaan yang tak diketahui dan untuk mempelajari karakteristik ikatan (dari) senyawaan yang diketahui.

Radiasi Elektromagnetik Radiasi elektromagnetik adalah energi yang dipancarkan menembus ruang dalam bentuk gelombang-gelombang. Energi radiasi dapat dibayangkan sebagai medanmedan listrik dan magnet yang berosilasi (bergoyang bolak-balik secara berirama) secara tegak lurus pada arah rambatan. Cahaya nampak merupakan salah satu dari beberapa jenis energi radiasi. Panjang gelombang cahaya nampak berkisar antara 400 sampai 750 nm (1nm = 10-9 m). Semua jenis energi radiasi merambat dengan kecepatan cahaya yang sama, c, sebesar 3,00 x 108 m/s, tetapi frekuensi dan panjang gelombangnya berlainan. Frekuensi,  , didefinisikan sebagai berapa daur gelombang melewati suatu titik dalam suatu satuan waktu. Radiasi elektromagnetik dipancarkan dalam bentuk paket-paket energi yang menyerupai partikel, yang disebut foton atau kuantum. Energi suatu foton berbanding terbalik dengan panjang gelombang (secara sistematis : E = hv

 ),

dengan h = tetapan Planck). Radiasi dengan panjang gelombang lebih pendek mempunyai energi yang lebih tinggi; oleh karena itu sebuah foton cahaya ultraviolet berenergi lebih tinggi daripada sebuah foton cahaya nampak dan jauh lebih tinggi daripada sebuah foton gelombang radio. Sebaliknya, energi sebuah foton suatu radiasi berbanding lurus dengan frekuensinya. Molekul menyerap hanya radiasi elektromagnetik dengan panjang gelombang yang khusus (spesifik untuk molekul itu). Adsorbsi cahaya ultraviolet (radiasi berenergi tinggi) mengakibatkan pindahnya sebuah elektron ke orbital dengan energi yang lebih tinggi. Sedangkan adsorbsi radiasi cahaya inframerah hanya mengakibatkan membesarnya amplitudo getaran atom-atom yang terikat satu sama lain.

Karena dasar dari analisis spektroskopi itu sendiri adalah interaksi radiasi dengan spesies kimia. Maka radiasi suatu sampel dibagi menjadi : adsorbsi, pemendaran, emisi, dan penghamburan yang cara interaksinya tergantung pada sifat materi tersebut. 1. Adsorbsi : yaitu suatu berkas radiasi elektromagnetik, bial dilewatkan melalui sampel kimia, sebagian akan teradsorbsi. Energi elektromagnetik ditransfer ke atom atau molekul dalam sampel, berarti partikel dipromosikan dari tingkat yang lebih rendah ke tingkat energi yang lebih tinggi, yaitu tingkat terksitasi. 2. Emisi radiasi: radiasi elektromagnetik dihasilkan bila ion, atom atau molekul terksitasi kembali ke tingkat energi lebih rendah atau energi dasar. 3. Pendar Fluor atau pendar-fosfor, merupakan salah satu jenis proses emisi. Atom atau molekul tereksitasi dengan adsorbsi radiasi elektromagnetik dan suatu emsisi terjadi jika spesies tereksitasi kembali ke keadaan dasar. 4. Penghamburan : seperti pada proses adsorbsi emisi dan pemendaran maka penghamburan radiasi elektromagnetik tidak memerlukan energi transisi.

Hukum Dasar Spektroskopi Adsorbsi Jika suatu berkas sinar melewati suatu medium homogen, sebagian dari cahaya datang (Po) diadsorbsi sebanyak (Pa), sebagian dapat diabaikan dipantulkan (Pr), sedangkan sisanya ditransmisikan (Pt) dengan efek intensitas murni sebesar : Po = Pa + Pt + Pr, Dimana : Po = intensitas radiasi yang masuk, Pa = intensitas cahaya yang diadsorbsi Pr = intensitas bagian cahaya yang dipantulkan Pt = intensitas cahaya yang ditransmisikan.

Dalam hal ini berlaku hubungan Hukum Beer-Lambert : T=

Pt  10  abc Po

b = jarak tempuh optik, c = konsentrasi  Pt  log (T) = log     abc  Po 

a = tetapan absortivitas, T = transmitansi 1  Po  log    log    abc  A T   Pt 

A = adsorbansi - log (T) i.e. A = abc 1 1    T opasitas (tidak tembus cahaya) T  

A = abc A = absorpsivitas (yakni tetap) Hukum di atas dapat ditinjau sebagai berikut : 1. Jika suatu berkas radiasi monokromatik yang sejajar jatuh pada medium pengadsorbsi pada sudut tegak lurus setiap lapisan yang sangat kecilnya akan menurunkan intensitas berkas. 2. Jika suatu cahaya monokromatis mengenai suatu medium yang transparan, laju pengurangan intensitas dengan ketebalan medium sebanding dengan intensitas cahaya. 3. Intensitas berkas sinar monokromatis berkurang secara eksponensial bila Konsentarsi zat pengadsorbsi bertambah. Hal di atas, adalah persamaan yang mendasar untuk spektroskopi adsorbsi, dikenal dengan hukum Beer’s Lambert atau Hukum Beer Bougar. Karena :

A = abc, A  c bila ab konstan A  b bila ac konstan A  bc bila a konstan.

Penyimpangan Dari Hukum Beer Jika hukum Beer diikuti, maka kita akan menmperoleh garis lurus. Hal ini terjadi bila, digunakan sinar yang monokromatis. Bila menggunakan sinar yang polikromatis, maka akan menyebabkan melebarnya pita radiasi sehingga akan

terjadi penyimpangan yang besar. Penyimpangan juga jelas teramati pada konsentrasi lebih besar pada kurva absorbansi terhadap konsentrasi. Kurva akan mulai melengkung pada konsentrasi yang tinggi. Bila kurva absorbsi yang diperoleh pada berbagai panjang gelombang yang digunakan bersifat datar, maka diharapkan Hukum Beer berlaku. Penyimpangan negatif dari hukum Beer menyebabkan kesalahan relatif yang makin membesar dari konsentrasi sebenarnya.

V.

Alat dan Bahan Alat – alat : 1. Pipet tetes 2. Beker gelas 3. Tabung reaksi 4. Rak tabung reaksi 5. Gelas ukur 6. Spektrofotometri UV Bahan – bahan : 1. Reagen Biuret 2. Larutan standar Protein 3. Aquades 4. Larutan sampel

VI.

Prosedur percobaan Mempipetir ke dalam tabung reaksi 1 ml larutan protein yang mengandung

1 – 10 mg/ml. Menambahkan 4 ml reagen biuret. Mengocok dan mendiamkan selama 30 menit pada suhu kamar. Membaca serapannya pada 540 nm. Untuk blanko dipakai campuran 1 ml air dan 4 ml reagen biuret yang juga didiamkan selama 30 menit pada suhu kamar. Untuk sampel adalah larutan putih telur dengan perlakuan yang sama. Hukum Lambert-Beer berlaku untuk larutan-larutan protein antara 1 – 10 mg/ml.

VII.

Hasil Pengamatan

Data absorban dengan spektrometer UV dengan λ = 540 nm

Tabung

Konsentrasi

Absorban

(mg/ml) 1

1

0.026

2

2

0,070

3

3

0,093

4

4

0,143

5

5

0,158

6

6

0,179

7

7

0,225

8

8

0,337

9

9

0,537

10

10

0,585

Sample

VIII.

0,275

Persamaan Reaksi O

O

- C – N – CH – C – N – CH H

R

H

R

+ Cu2+

OH

O=C

C=O

HN

NH

RCH

HCR Cu2+

O=C HN RCH

C=O NH HCR

Kompleks Ungu

IX.

Analisa Data

Membuat Kurva Standar Konsentrasi Protein Vs Absorban Dengan : X = Konsentrasi protein (c) Y = Absorbansi (A) X

Y

XY

X2

1

0,026

0,026

1

2

0,070

0,14

4

3

0,093

0,279

9

4

0,143

0,572

16

5

0,158

0,79

25

6

0,179

1,074

36

7

0,225

1,575

49

8

0,337

2,696

64

9

0,537

4,833

81

10

0,585

5,85

100

 = 55

2,353

17,835

385

n . ΣXY – ΣX . ΣY Slope (A)

=

10 (17,835) – 55(2,353) =

n . ΣX2 – (ΣX)2

10 (385) – (55)2

= 178,35 - 129,415 825 = 0,059 ΣY . ΣX2 – ΣXY . ΣX Intersept (B) =

2,353 (385) – 17,835 (55) =

n . ΣX2 – (ΣX)2 = 905,905 – 980,925 825 = -0,09

10 (385) – (55)2

Persamaan Regresi Linier :Y = 0,059X - 0,09 Kurva standar : Y = 0,059X - 0,09 X Y

0

2

4

6

8

-0,09 0,028 0,146 0,264 0,382

Konsentrasi protein yang sebenarnya dalam kasein : 

Konsentrasi protein pada saat 1 mg/ml Y = 0,026 0,026 = 0,059X - 0,09 X



= 1,966 mg/ml




= 2,711 mg/ml

Konsentrasi protein pada saat 3 mg/ml Y = 0,093 mg/ml 0,093 = 0,059X - 0,09 X



= 3,101 mg/ml




= 3,949 mg/ml




= 4,203 mg/ml

Konsentrasi protein pada saat 6 mg/ml Y = 0,179 0,179= 0,059X - 0,09 X



= 4,449 mg/ml

Konsentrasi protein pada saat 7 mg/ml

10 0,5

Y = 0,225 0,225= 0,059X - 0,09 X 

= 5,338 mg/ml




= 7,237 mg/ml




= 10,62 mg/ml

Konsentrasi protein pada saat 10mg/ml Y = 0,585 0,585 = 0,059X - 0,09 X = 11,44 mg/ml



Konsentrasi sample Y = 0,275 0,275 = 0,059X -0,09 X = 6,186

Kurva Konsentrasi vs Absorbansi 0.7 0.6 0.5 0.4 Y-Values

0.3 0.2 0.1 0 0

2

4

6

8

10

12

14

X.

Pembahasan Percobaan kali ini berjudul penentuan kadar protein secara biuret yang

tujuannya untuk menentukan kadar protein dalam suatu larutan dengan menggunakan pereaksi reagen biuret. Pada percobaan ini yang digunakan sampel dan larutan standar protein. Protein yang digunakan pada percobaan ini adalah Kasein. Pada percobaan ini digunakan larutan protein dengan konsentrasi yang berbeda beda, yaitu dari 1-10mg/ml. Setelah masing-masing larutan standar dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan ditambahkan reagen biuret dan larutan NaOH maka larutan-larutan ini dibiarkan selama 30 menit. Ini bertujuan agar proses pembentukan senyawa kompleks berwarna dapat berlangsung dengan benar-benar sempurna. Setelah senyawa kompleks berwarna terbentuk, baru dilakukan pengukuran dengan spektrometer UV. Senyawa kompleks ini terlihat segera setelah penambahan reagen biuret dan NaOH dengan terbentuknya warna ungu pada larutan. Warna ungu ini terbentuk akibat reaksi antara Cu2+ dalam reagen biuret dengan ikatan peptida dari protein dalam larutan kasein tadi , tepatnya ikatan dengan –NH dari protein dalam suasana basa (dengan adanya ion OH- dari NaOH) seperti dalam persamaan reaksi. Pada percobaan ini digunakan metode spektroskopi yaitu pengidentifikasi suatu objek dengan menggunakan kriteria warna. Dalam percobaan ini, kita menggunakan kriteria warna ungu dari protein. Untuk mendapat warna, maka larutan protein direaksikan dengan unsur tembaga dalam reagen Biuret dalam lingkungan alkali. Sehingga didapatkan larutan protein yang berwarna ungu pada masing-masing konsentrasi. Warna dari larutan protein berbeda-beda dari berbagai konsentrasi. Semakin besar konsentrasi yang digunakan maka semakin pekat warna yang terbentuk, dan sebaliknya. Karena kita menggunakan panjang gelombang pada daerah 540 nm, maka raddiasi sinar yang kita pakai adalah sinar UV_Visual. Di dalam spektrofotometer, larutan protein mengadsorbsi cahaya yang diberikan kepadanya. Hal ini merupakan wujud dari interaksi suatu atom dengan cahaya. Dimana energi elektromagnetiknya ditransfer ke atom atau molekul

sehingga partikel dalam protein dipromosikan dari tingkat energi yang lebih rendah ke tingkat energi yang lebih tinggi, yaitu tingkat tereksitasi. Dari hasil pengidentifikasian pada spektrofotometer, didapatlah harga absorbansi pada masing-masing konsentrasi. Semakin besar konsentrasi maka semakin banyak protein yang diserap atau diabsorbsi, sehingga harga absorbansi yang didapat semakin besar juga. Dari hasil data yang diperoleh, akan didapatkan suatu kurva antara adsorbansi larutan protein dengan konsentrasinya. Kurva tersebut membentuk suatu garis lurus yang linear. Ini dikarenakan larutan protein yang digunakan merupakan larutan encer dengan konsentrasi yang kecil. Penyimpangan Hukum Beer akan berlaku jika larutan protein yang digunakan mempunyai konsentrasi yang besar, artinya apabila konsentrasi proteinnya besar, maka garis linear akan membelok. Namun, pada saat perbandingan antara larutan sampel dengan larutan standar protein, menunjukkan perbedaan, hal ini mungkin dapat disebabkan akibat dari kesalahan pengenceran pada larutan sampelnya, atau kesalahan pada penggunaan alat spectrometer. Sample seharusnya menunjukkan konsentrasi ~8 mg/ml , tetapi pada kurva yang didapat, sample menunjukkan konsentrasi 6,186 mg/ml.

XI.

Kesimpulan a. Semakin tinggi konsentrasi protein yang terdapat dalam larutan maka semakin pekat pula kompleks warna ungu yang dihasilkan. b. Adsorban suatu larutan berbanding lurus dengan konsentrasinya, sehingga semakin besar konsentrasi yang digunakan, maka semakin besar pula adsorban yang digunakan. c. Jika konsentrasi larutan yang digunakan besar akan terjadi penyimpangan Hukum Beer, dimana kurva yang terbentuk tidak lagi linear.

XII.

Daftar Pustaka

Lehninger, Albert. 1995. Dasar-dasar Biokimia Jilid 1. Jakarta: Erlangga. Wirahadikusumah, Muhammad. 1985. Biokimia Protein, Enzim, dan Asam Nukleat. Bandung: ITB. Fessenden dan Fessenden. 1999. Kimia Organik Edisi ketiga Jilid 2. Jakarta: Erlangga.

XIII.

Gambar Alat

Pipet Tetes

Beker gelas

Gelas Ukur

Tabung dan Rak Tabung Reaksi

Spektrofotometri UV

XIV.

Pertanyaan Dan Jawaban  Pertanyaan:

1.

Buatlah standar kurva dan tetapkan kadar protein larutan protein yang diberikan?

2.

Berikan penjelasan tentang hukum lambert-beer!

3.

Senyawa apa yang dapat mengganggu cara biuret seperti diatas

4.

Mengapa reaksi tersebut disebut reaksi biuret?

5.

Senyawa kompleks apa yang sebenarnya terjadi?

6.

Apakah peptide juga memberi reaksi biuret. jika memberikan, berikalah penjelasan dan bagaimana cara menentukan kadar protein yan tercampur dengan peptide?  Jawaban 1. Membuat Kurva Standar Konsentrasi Protein Vs Absorban Dengan : X = Konsentrasi protein (c) Y = Absorbansi (A) Y

XY

X2

1

0,026

0,026

1

2

0,070

0,14

4

3

0,093

0,279

9

4

0,143

0,572

16

5

0,158

0,79

25

6

0,179

1,074

36

7

0,225

1,575

49

8

0,337

2,696

64

9

0,537

4,833

81

10

0,585

5,85

100

 = 55

2,353

17,835

385

X

n . ΣXY – ΣX . ΣY Slope (A)

=

10 (17,835) – 55(2,353) =

n . ΣX2 – (ΣX)2

10 (385) – (55)2

= 178,35 - 129,415 825 = 0,059 ΣY . ΣX2 – ΣXY . ΣX Intersept (B) =

2,353 (385) – 17,835 (55) =

n . ΣX2 – (ΣX)2

10 (385) – (55)2

= 905,905 – 980,925 825 = -0,09

Persamaan Regresi Linier :Y = 0,059X - 0,09 Kurva standar : Y = 0,059X - 0,09 X

0

Y

2

4

6

8

-0,09 0,028 0,146 0,264 0,382

10 0,5

Kurva Standar Konsentrasi Protein Vs Absorban 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 -0.1 -0.2

0

2

4

6

8

10

12

Konsentrasi protein yang sebenarnya dalam kasein : 




= 1,966 mg/ml




= 2,711 mg/ml

Konsentrasi protein pada saat 3 mg/ml Y = 0,093 mg/ml 0,093 = 0,059X - 0,09 X



= 3,101 mg/ml




= 3,949 mg/ml




= 4,203 mg/ml




= 4,449 mg/ml




= 5,338 mg/ml

Konsentrasi protein pada saat 8 mg/ml

Y = 0,337 0,337 = 0,059X - 0,09 X 

= 7,237 mg/ml




= 10,62 mg/ml

Konsentrasi protein pada saat 10mg/ml Y = 0,585 0,585 = 0,059X - 0,09 X

= 11,44 mg/ml

2. Penjelasan Hukum Lambert – Beer : Hukum Lambert – Beer dengan mudah digabungkan menjadi pernyataan yang sesuai. Diketahui bahwa dalam mempelajari akibat perubahan konsentrasi terhadap absorbsi jarak jalan lewat larutan harus dibuat tetap. Tetapi hasil-hasil yang diukur akan tergantung pada besarnya harga tetapan. Dengan kata lain dalam hukum Beer seperti K4 = f(b). Demikian dalam hukum Lambert K2 = f(c). Dimana kemudian substitusi hubungan dasar ini ke dalam hukum Lambert-Beer:

log Po/P = f(c) b dan log Po/P = f(b) c Kedua Hukum harus diberlakukan bersamaan pada setiap titik, sehingga f (b) = f(b) c . Atau kalau dipisahkan variabelnya f(c)/c = f(b)/b Agar dua fungsi variabel tak bergantungan dapat menjadi sama, adalah bahwa keduanya sama dengan suatu tetapan. F(c) / c = f(b) b = K

Substitusi ke dalam pernyataan Lambert-Beer menghasilkan pendapat yang sama yaitu: log Po/P = f(c) b = K.b.c log Po/P = f(b) c = K.b.c

3. Senyawa yang dapat mengganggu yaitu senyawa yang membentuk endapan hitam atau merah pada reagen biuret yaitu garam Amonia.

4. Reaksi ini disebut dengan reaksi biuret karena pada penentuan kadar protein ini digunakan reagen biuret yang mana biuret memberikan warna violet dengan CuSO4. Dan pada reaksi ini terbentuk kompleks ungu yaitu antara Cu2+ dengan –NH dari rantai peptida dalam suasana basa.

5. Senyawa kompleks yang terbentuk : O

O

- C – N – CH – C – N – CH H

R

H

R

+ Cu2+

OH

O=C

C=O

HN

NH

RCH

HCR 2+

Cu O=C HN RCH

C=O NH HCR

6. Peptida juga memberi reaksi biuret karena adanya –NH pada ikatan pepetida sehingga dapat membentuk ion kompleks seperti di atas. Dengan menambahkan reagen Biuret pada larutan protein dan pengukuran adsorbansi larutan tersebut dan dibandingkan dengan sampel, dicari yang sama adsorbansinya maka akan diketahui berapa kadar proteinnya.

Penentuan Kadar Protein Secara Biuret

Recommend Documents