LAPORAN PRAKTIKUM IMMUNOBLOTTING
DAN DOT BLOT WESTERN BLOT DAN
Oleh : Putri Primawardani Primawardani
PROGRAM MAGISTER ILMU KEDOKTERAN BIOMEDIK FAKULTAS KEDOKTERAN UNIERSITAS BRA!I"A#A MALANG $%&'
BAB I PENDA(ULUAN &)& Latar Bela*an+ Immunoblotting atau protein blotting merupakan teknik utama dalam biologi molekuler dan biologi sel. Pada dasarnya, teknik ini digunakan untuk mendeteksi keberadaan suatu protein spesifik dalam campuran kompleks yang diekstraksi dari sel. Sampel protein yang belum mengalami purifikasi terdiri dari beberapa jenis protein yang berbeda. Protein tersebut bila diseparasi pada gel poliakrilamid akan menghasilkan beberapa band sehingga tidak memungkinkan melakukan chemical assay untuk protein tertentu. Sifat enzimatik dan pengikatan dari suatu protein juga tidak dapat terukur karena interferensi substansi lain pada sampel. Sementara itu, pewarnaan dengan Coomasie blue atau perak nitrat tidak dapat secara spesifik mendeteksi protein tertentu. Untuk itulah diperlukan imunodeteksi guna mengetahui keberadaan protein tertentu dalam gel dengan menggunakan antibodi. Teknik western blot , atau juga disebut sebagai imunoblot telah sering digunakan untuk menganalisis protein spesifik pada sampel. Western blot menggunakan gel elektroforesis untuk memisahkan protein berdasarkan panjang polipeptida. Protein tersebut akan ditransfer ke nitroselulosa atau PV! " polyvinylidene difluoride# dan diberi antibody spesifik untuk identifikasi protein target "$urnette, %&'%#. Saat ini, telah banyak reagen antibody baik poliklonal maupun monoklonal untuk %(.((( jenis protein. Sehingga western blot sangat bermanfaat untuk digunakan bersama antibody tersebut "Towbin et al.,%&)&#. ot $lot adalah sebuah teknik untuk mendeteksi, menganalisis, dan mengidentifikasi protein. Teknik ini menyerupai Western Blot namun perbedaannya adalah protein sampel tidak dipisahkan melalui elektroforesis akan tetapi ditandai dengan template sirkuler secara langsung pada substrat kertas. *onsentrasi protein dalam preparasi mentah atau kasar "misalnya
kultur
supernatan#
dapat
diperkirakan
secara
semikuantitatif
dengan
menggunakan teknik ini jika dimiliki protein yang terpurifikasi dan antibodi untuk protein tersebut. ot blot dapat digunakan untuk perhitungan kualitaif pada rapid screening dari jumlah sampel yang besar atau sebagai tehnik kuantitatif, dan terutama berguna untuk menguji kesesuaian parameter desain eksperimental "Smith +, et al., (%#. &)$ Tu,uan -engetahui prosedur immunoblotting yaitu estern $lot dan ot $lot serta memiliki kompetensi untuk melakukannya
BAB II TIN"AUAN PUSTAKA $)& !e-tern Bl.t Western Blot "$# merupakan suatu teknik untuk menandai suatu protein pada membran nitroselulosa, nilon, atau membran transfer lain setelah protein tersebut terpisahkan melalui elektroforesis "/ttwood et al., ((0#. -etode ini awalnya ditemukan oleh 1eorge stark pada Uni2ersitas Stanford. 3ama western blot diberikan pada teknik tersebut oleh 3eal $urnette and Sushant $hat, merupakan nama yang dimiripkan dengan teknik deteksi 3/ southern blot yang ditemukan 4dwin southern dan 3orthern blot yang digunakan deteksi 53/ "Towbin et al.,%&)&#. Western Blot dilakukan melalui beberapa tahap. Tahap pertama, elektroforesis. Tahap kedua, elektrotransfer. Tahap ketiga, deteksi "1ambar %# "*indt et al ., (()#.
Gam/ar &. "%# elektrophoresis, "# electrotransfer, "6# deteksi Pada tahap pertama, protein yang diinginkan dipisahkan dari sampel secara elektroforesis. 4lektroforesis merupakan pemisahan protein berdasarkan ukuran molekul dalam suatu tegangan listrik tertentu. alam elektroforesis, sampel yang mengandung protein dicampur dengan SS. SS merupakan suatu detergen yang memiliki muatan negatif. -uatan negatif SS tersebut mengganggu kestabilan protein, sehingga protein mengalami denaturasi. Suatu protein multimer juga akan terurai menjadi monomer penyusunnya. /kibatnya, protein7protein yang ada dalam sampel membentuk suatu rantai polipeptida lurus. Semakin besar berat molekul suatu protein, maka rantai polipeptida tersebut semakin panjang. Sampel dengan protein rantai polipeptida lurus dimasukkan dalam suatu membran poliakrilamid yang dialiri arus listrik. Protein yang telah bermuatan
negatif akan bergerak dari kutub negatif menuju kutub positif. 8aju pergerakan protein dalam membran poliakrilamid tersebut berbeda7beda tergantung pada daya hambat antara protein dan membran. Protein yang berukuran lebih besar akan memiliki daya hambat lebih besar sehingga pergerakannya menjadi lebih lambat dibandingkan dengan pergerakan protein yang berukuran lebih kecil. Setelah dialiri arus listrik selama beberapa waktu, masing7 masing protein akan terpisah berdasarkan ukuran molekulnya. Protein yang lebih kecil atau memiliki berat molekul rendah akan bergerak lebih jauh dibanding protein yang lebih besar. alam gel poliakrilamid tersebut akan terbentuk pita7pita yang merupakan protein7protein yang telah terpisah berdasarkan berat molekul "1ambar # "*oolman dan 5oehm, ((9#. Tahap kedua dalam $ yaitu pemindahan protein dari gel poliakrilamid menuju gel transfer. Tahap pemindahan tersebut menggunakan arus listrik sebagai faktor pendorong transfer protein. :leh karena itu, proses pemindahan tersebut disebut juga elektrotransfer. 4lektrotransfer dapat dilakukan dengan dua metode, yaitu "$ollag et al., %&&0#; %. $lotting semikering $lotting semikering menggunakan kertas saring yang telah dibasahi dengan buffer transfer. *ertas saring tersebut diletakkan di antara gel poliakrilamid dan gel transfer. Transfer seperti ini dapat dilakukan selama %(76( menit dengan arus lstrik tertentu. . $lotting basah $lotting basah tidak menggunakan kertas saring diantara gel poliakrilamid dan gel transfer, tetapi kedua gel tersebut diimpitkan dan direndam dalam buffer transfer. Susunan lapisan7lapisan pada blotting basah diperlihatkan pada 1ambar 6 "enk dan !ernandis, (()#. Transfer dengan blotting basah dapat dilakukan <9 menit hingga % malam. -etode blotting basah lebih umum digunakan karena fleksibilitas metode tersebut yang lebih baik.
Gam/ar $. Transfer gel 1el transfer yang umum digunakan pada $ ada dua, yaitu nitroselulosa dan nilon. Pada sebagian besar aplikasi, nitroselulosa lebih umum digunakan karena relatif tidak mahal dan bloking mudah dan cepat dilakukan. 3ilon juga digunakan terutama pada beberapa keadaan khusus. Pertama, kapasitas pengikatan dengan protein yang dibutuhkan jauh lebih besar dari kapasitas pengikatan nitroselulosa dan protein. *edua, protein terikat sangat lemah
pada nitroselulosa. *etiga, adanya kebutuhan resistensi terhadap tekanan mekanik "$ollag et al., %&&0#. Transfer protein dari gel poliakrilamid menuju gel transfer merupakan tahap yang sangat penting dalam $. :leh karena itu, ada beberapa faktor yang harus diperhatikan dalam proses transfer protein tersebut. %. /rus listrik yang digunakan harus diperhatikan karena arus yang terlalu tinggi dapat menghasilkan panas selama transfer yang dapat menimbulkan masalah. . *ekuatan ion yang rendah buffer transfer yang rendah dapat digunakan pada tegangan listrik yang tinggi tanpa perlu dikhawatirkan menghasilkan panas yang tinggi. 6. Salah satu arus listrik yang dapat digunakan adalah (( m/ selama jam. <. Untuk transfer protein dengan ukuran molekul besar, penggunaan gel dengan konsentrasi poliakrilamid yang rendah. Tahap ketiga merupakan deteksi protein yang telah dipindahkan ke membran transfer. eteksi protein tersebut memanfaatkan interaksi antara antigen dan antibodi yang bersifat spesifik. Variasi metode7metode tersebut terutama terletak pada penggunaan antibodi primer dan sekunder, serta penggunaan molekul penanda. $erdasarkan penggunaan antibodi primer dan antibodi sekunder, ada dua metode deteksi, yaitu; metode langsung dan metode tidak langsung. -etode langsung menggunakan antibodi primer yang telah terkonjugasi dengan molekul marker. -etode tidak langsung menggunakan antibodi primer dan antibodi sekunder. /ntibodi primer berfungsi mengikat protein target, sedangkan antibodi sekunder berfungsi mengikat antibodi primer dan terkonjugasi dengan molekul penanda. -olekul penanda yang digunakan juga ber2ariasi. -olekul penanda yang umum digunakan diantaranya adalah enzim alkalin fosfatase "/P#, enzim horsedish peroksidase "=5P#, immunogold, dan
%9
>. -asing7masing molekul penanda tersebut memiliki kelebihan
dan kekurangan. -olekul penanda immunogold memiliki sensitifitas paling tinggi, yaitu immunogold "%79 pg#. =5P, /P dan
%9
> memiliki sensiti2itas relatif rendah yaitu %(7( pg,
%(79( pg, dan 9(7%(( pg "$ollag et al., %&&0#. $)$ D.t Bl.t ot $lot adalah sebuah teknik untuk mendeteksi, menganalisis, dan mengidentifikasi protein. Teknik ini menyerupai Western Blot namun perbedaannya adalah protein sampel tidak dipisahkan melalui elektroforesis akan tetapi ditandai dengan template sirkuler secara langsung pada substrat kertas. *onsentrasi protein dalam preparasi mentah atau kasar "misalnya
kultur
supernatan#
dapat
diperkirakan
secara
semikuantitatif
dengan
menggunakan teknik ini jika dimiliki protein yang terpurifikasi dan antibodi untuk protein tersebut. ot blot dapat digunakan untuk perhitungan kualitaif pada rapid screening dari jumlah sampel yang besar atau sebagai tehnik kuantitatif, dan terutama berguna untuk menguji kesesuaian parameter dalam desain eksperimental "Smith +, et al., (%#.
Gam/ar 0) Protokol ot $lot. Setelah pengikatan protein, dilakukan blocking untuk mengurangi ikatan nonspesifik /b pada setiap wilayah membran yang kosong, untuk langkah pencucian dilakukan melalui filtrasi 2akum "Smith +, et al., (%#. Teknik Dot blot memiliki efisiensi waktu yang signifikan, dimana prosedur blotting yang kompleks untuk transfer gel tidak diperlukan. 3amun, kekurangan metode dot blot adalah tidak dapat digunakan untuk mengetahui ukuran molekul target. Selain itu, jika dua molekul yang berbeda ukuran terdeteksi, mereka akan tetap muncul sebagai satu titik. :leh karena hal tersebut, dot blot hanya dapat digunakan untuk mengkonfirmasi ada atau tidak adanya molekul "yang dapat dideteksi oleh probe 3/ atau antibodi#.
Gam/ar 1. =asil akhir Dot Blot
$eberapa langkah yang harus dikerjakan dalam proses ot $lot adalah menyiapkan membran, dan menandainya dengan grid menggunakan pensil untuk mengindikasikan daerah yang akan di blot. Sampel yang akan diuji diteteskan pada membran nitroselulosa pada bagian tengah kisi "grid# yang telah digambar pada membran tersebut dan dibiarkan kering. Situs yang tidak spesifik kemudian diblok dengan merendam membran dalam Bovine Serum lbumin "$S/# dan diinkubasi dalam antibodi primer selama 6( menit suhu ruang. 8angkah berikutnya adalah pencucian dengan P$S7T selama kurang lebih 6 kali masing7masing 9 menit dan dinkubasi pada antobodi sekunder yang terkonjugasi dengan =5P. Pencucian dilakukan kembali setelah proses tersebut selesai dan dipaparkan pada film ?7ray pada ruang gelap
Gam/ar '. ot $lot pparatus
BAB III MATERI DAN METODE 0)&)
L.*a-i dan !a*tu Pra*ti*um Praktikum
ini
dilaksanakan di 8aboratorium $iomedik !akultas *edokteran
Uni2ersitas $rawijaya -alang pada Selasa, % /pril (%9. 0)$) !e-tern Bl.t &) Tran-2er Pr.tein •
Pita protein dari gel SS7P/14 ditransfer ke membran !itrocellulose dengan menggunakan Semi Dry "rans Blot #$uipment dengan susunan dari bawah ke atas sebagai berikut ; a. kertas saring yang telah dibasahi larutan transfer buffer b. membran !itrocellulose yang telah direndam dalam larutan transfer buffer selama 6( menit. c. gel SS7P/14 yang telah direndam dalam larutan transfer buffer d. kertas saring yang telah dibasahi larutan transfer buffer di7runing selama
jam, ( V, 6(( m/ $) Bl.3*in+ N.n S4e-i2i3 Area • • •
/ngkat membran dan cuci dengan a@uadest "6A# -arker dipotong iinkubasi dalam larutan T$S7skim milkBblotto 9C pada suhu < D, overnight ᵒ
0) In*u/a-i Anti/.di Primer •
-embran segera dikeluarkan dan diadaptasikan pada suhu ruang $uang larutan skim, cuci dengan larutan T$S7Tween ( (.(9C, 6A9 menit
•
sambil digoyang7goyang hingga skim bersih >nkubasi antibodi primer "dengan rasio pengenceran %;(( E %;9((# dalam
•
pelarut T$S >nkubasi jam "5T# atau < D "overnight #
•
ᵒ
1) In*u/a-i Anti/.di Se*under •
Washing membran 6A9 menit dengan larutan T$S7Tween ( (.(9C sambil
•
dishaker pelan >nkubasi antibodi sekunder "dengan rasio pengenceran %;%((( E %;9((# dalam
•
pelarut T$S >nkubasi jam dalam suhu ruangan
') In*u/a-i En5im SA6(RP 7Stre4a8idin6(.r-e Radi-h Per.9ida-e ; AP 7Al*aline Ph.-4ata-e •
Washing membran 6A9 menit dengan larutan T$S7Tween ( (.(9C sambil
•
dishaker pelan >nkubasi enzim "dengan rasio pengenceran %;%(((# dalam pelarut T$S >nkubasi <( E 0( menit
•
<) In*u/a-i Su/-trat •
Washing membran 6A9 menit dengan larutan T$S7Tween ( (.(9C sambil
•
dishaker pelan -embran direndam dalam substrat T-$ "untuk peroksidase konjugat# atau Western Blue "untuk alkaline fosfatase konjugat#, dark condition >nkubasi selama 6( menit atau sampai muncul pita protein pada membran Stop reaksi dengan a@uadest *ering anginkan membran
• • •
0)0) D.t Bl.t %. -embran !itrocellulose "3D# direndam dalam a@uadest selama 6( menit. . -embran 3D diletakkan dalam Dot Blotter pparatus "$io5ad#, basahi membran 3D dengan T$S "9( F8Bwell# 0) In*u/a-i Anti+en • •
• •
$uang larutan T$S dan tapping pada tissue 8oad antigen "yang telah diencerkan dengan sodium azida "3a3 6# (.(C dengan perbandingan %;<# ke masing7masing well "9( F8Bwell# egas hingga tidak ada larutan yang tersisa pada membran >nkubasi overnight pada suhu < D ᵒ
<. Bl.3*in+ N.n S4e-i2i3 Area •
-embran diinkubasi dalam larutan T$S7skim milkBblotto 9C atau T$S7$S/ C "9( F8Bwell# pada suhu < D overnight ᵒ
9. In*u/a-i Anti/.di Primer •
Pada hari berikutnya,
membran segera dikeluarkan dan diadaptasikan pada
•
suhu ruang $uang larutan T$S7skimBT$S7$S/, cuci dengan larutan T$S7Tween ( (.(9C "9( F8Bwell#, kemudian ditapping dengan tissue hingga tidak ada larutan yang
•
tersisa, ulangi langkah ini sebanyak 6A6 menit >nkubasi antibodi primer "dengan rasio pengenceran %;(( E %;9((# dalam
•
pelarut T$S7$S/ %C "9( F8Bwell# >nkubasi jam "5T# atau < D overnight ᵒ
<) In*u/a-i Anti/.di Se*under cuci membran dengan larutan T$S7Tween ( (.(9C "9( F8Bwell#, kemudian ditapping dengan tissue hingga tidak ada larutan yang tersisa, ulangi langkah ini •
sebanyak 6A6 menit >nkubasi antibodi sekunder "dengan rasio pengenceran %;%((( E %;9((# dalam
•
pelarut T$S >nkubasi jam dalam suhu ruangan
). In*u/a-i En5im SA6(RP 7Stre4a8idin6(.r-e Radi-h Per.9ida-e ; AP 7Al*aline Ph.-4ata-e
•
Washing membran 6A6 menit dengan larutan T$S7Tween ( (.(9C "9( F8Bwell#,
•
kemudian ditapping dengan tissue hingga tidak ada larutan yang tersisa >nkubasi enzim "dengan rasio pengenceran %;%(((# dalam pelarut T$S >nkubasi <( E 0( menit
•
'. In*u/a-i Su/-trat •
Washing membran 6A6 menit dengan larutan T$S7Tween ( (.(9C "9( F8Bwell#,
•
kemudian ditapping dengan tissue hingga tidak ada larutan yang tersisa -embran direndam dalam substrat T-$ "untuk peroksidase konjugat# atau Western Blue "untuk alkaline fosfatase konjugat# masing7masing 9( F8Bwell,
• • •
dark condition >nkubasi selama 6( menit hingga membran berubah warna "menjadi keunguan# Stop reaksi dengan a@uadest *ering anginkan membran
BAB I (ASIL DAN PEMBA(ASAN
estern $lot adalah metode untuk mengidentifikasi antibodi spesifik pada protein yang telah dipisahkan antara satu dengan yang lain lewat elektroforesis gel. 4lektroforesis
merupakan
suatu
metode
pemisahan
komponen
atau
molekul
bermuatan
berdasarkan tingkat migrasinya dalam suatu medan listrik. =asil elektroforesis akan didapatkan pita7pita protein yang terpisahkan berdasarkan berat molekulnya. Tebal tipisnya pita yang terbentuk dari pita protein menunjukkan kandungan atau banyaknya protein yang mempunyai berat molekul yang sama yang berada pada posisi pita yang sama. Sedangkan dari western blot akan didapatkan pita protein yang bereaksi spesifik dengan antibodi yang digunakan. Sampel pada praktikum yakni preparat /g6' produk purifikasi. Seperti dijelaskan sebelumnya, tahap awal western blot adalah sampel protein terlebih dahulu di running dengan SS E P/14, dimana p rotein dengan berat molekul kecil akan bergerak
terlebih dahulu dengan cepat melewati pori sampai batas di mana pori tidak cukup besar untuk melewati pori gel. $atas tersebut lah yang terlihat sebagai band pada gel. $erikut merupakan hasil SS7P/14 protein /g 6'.
Gam/ar <) SS7P/14 protein /g6'
/pabila akan dilanjutkan pemeriksaan western blot, maka hasil SS7P/14 tidak perlu dilakukan staining karena dapat mengurangi efektifitas pengikatan antibodi terhadap antigen sasaran. Setelah dirunning dengan SS7P/14, protein lagsung ditransfer ke membran secara elektroforesis. *emudian dilakukan langkah blocking untuk mengurangi ikatan nonspesifik /b pada setiap wilayah membran yang kosong, selanjutnya membran di probe dengan antibodi primer baik monoclonal maupun poliklonal, pada praktikum ini menggunakan /nti/g6' monoclonal dan sali2a "G# T$, yang jumlahnya meningkat dibanding antigen. Setelah pencucian yang sekuensial, membran kemudian
diinkubasi dengan antibody sekunder yang dikonjugasi dengan enzim yang sifatnya reaktif terhadap antibodi. /kti2itas dari enzim horseradish peroAidase "=5P# penting untuk pengeluaran sinyal. Pada akhirnya, membran dicuci kembali dengan substrat dari enzim yang tepat akan memproduksi sinyal yang dapat direkam. =asil akhir didapatkan band protein yang terbentuk,seperti terlihat pada gambar ) dan '.
Gam/ar =. /g6' dengan antibodi /nti/g6' monoclonal pada Western Blot
Gam/ar >. /g6' dengan antibodi sali2a "G# T$ pada Western Blot apat diamati pada gambar ) dan ' adanya band yang terbentuk. $and yang yang terlihat pada membran nitroselulose mengidentifikasikan bahwa terdapat protein /g6' yang mampu untuk berikatan dengan antibody spesifik yang diberikan yakni antibodi /nti/g6' monoclonal pada gambar ) dan antibodi sali2a "G# T$ pada gambar '. Sali2a pada pasien T$ "tuberculosis# mengandung antibodi secretory >g/ "s>g/# yang berperan sebagai pertahanan pertama pada daerah mukosa. 1ambar ' menunjukkan bahwa protein /g6' bereaksi spesifik dengan s>g/ T$, hal ini berarti bahwa protein /g6' merupakan manifestasi
protein dari infeksi tuberculosis. $ila diamati lebih rinci, pada bagian kiri dari gambar ) dan ' yang merupakan tempat marker menunjukkan warna band yang berbeda, hal ini mungkin disebabkan karena adanya perbedaan perlakuan, dimana membran pada kolom kiri dipotong dan tidak dilakukan pencucian sehingga terjadi perbedaan elastisitas membran. Praktikum yang dilakukan hanya untuk mengetahui adanya reaksi antigen terhadap antibodi yang diberikan pada gel. 3amun, analisis western blot secara umum yakni dapat mendeteksi protein yang diinginkan dari campuran protein dalam jumlah besar, memberikan informasi tentang ukuran dari protein "dengan perbandingan ukuran marker dalam satuan kilodalton# dan juga memberi informasi tentang ekspresi protein "dengan perbandingan dengan kontrol# seperti pada sampel yang tidak diberi perlakuan atau sel atau jaringan tipe lain. ot $lot merupakan metode immunoblotting dengan cara memaparkan langsung protein pada suatu membran. Praktikum dot blot yang dilakukan hanya sebatas membahas prosedur dan mengetahui hasil yang diperoleh, tanpa menginterpretasikan hasil tersebut. Tahap awal yang harus dilakukan adalah mempetakan sampel yang akan dimasukkan pada dot blot apparatus, misalkan pada baris pertama dimasukan antigen saja dengan konsentrasi semakin meningkat "dari kiri ke kanan#, dan pada kolom pertama dimasukkan antibodi saja dengan dosis yang semakin meningkat "dari atas ke bawah#, pada kolom dan baris lainya dimasukkan sampel sesuai dengan konsentrasi /g dan /b yang telah ditentukan di kolom dan baris pertama, untuk kemudian diamati hasilnya. Sampel yang terlarut, ditarik melalui membran dengan cara membuat suatu keadaan 2akum, protein kemudian akan berikatan dengan membran sedangkan komponen sampel yang lain melewati membran. Protein yang berada pada membran yang kemudian dapat dianalisis. =asil dot blot dapat dilihat pada gambar &.
Gam/ar ?. /g6' dengan antibodi /nti/g6' monoclonal pada Dot Blot
BAB KESIMPULAN
Teknik western blot dan dot blot dapat digunakan untuk menganalisis protein spesifik pada sampel.
BAB I DAFTAR PUSTAKA $urnette 3. %&'%. HIestern blottingI; electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfateJpolyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein /H. nalytical Biochemistry %% "#; %&9E(6. Towbin =, Staehelin T, 1ordon +. %&)&. H4lectrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets; procedure and some applicationsH.%roceedings of the !ational cademy of Sciences &S )0 "&#; <69(E9< /ttwood, T.*., P.3. Dampbell, +.=. Parish, /.. Smith, +.8. Stirling dan !. Vella "4d#, ((0, :Aford ictionary of $iochemistry and -olecular $iology, 5e2ised 4dition, :Aford Uni2ersity Press. $ollag, .-., -.. 5ozycki, S.+. 4delstein, %&&0, Protein -ethod, iley78iss, >nc *indt, T.+., 5./.1oldsby, $./. :sborne, +. *uby, ((), *uby >mmunology, .=. !reeman, 3ew Kork. *oolman, +. dan *. 5oehm, ((9, Dolor /tlas of $iochemistry, Second edition, re2ised and enlarged, Thieme. enk, -.5. dan /.L. !ernandis, ((), -anuals in $iomedical 5esearch ; / -anual !or $iochemistry Protocols, orld Scientific Publishing Do. Pte. 8td. Smith +., -abuchi -., 3adler T., et al. (%. 5apid Screening of the 4pidermal 1rowth !actor 5eceptor Phosphosignaling Pathway 2ia -icroplate7$ased ot $lot /ssays. >nternational +ournal of Proteomics. Volume (% "(%#. iakses tanggal %( /ptil (%9. iunduh dari http;BBwww.hindawi.comBjournalsBijproB(%B<)6'<6Bfig.
